Proteinsekretion bei Bakterien

Die Zellhülle gramnegativer Bakterien setzt sich zusammen aus zweiMembranschichten, der zytoplasmatischen Membran und der äußeren Membran.Beide Membranen sind durch den periplasmatischen Raum getrennt. Ob diesebeiden Membranen an bestimmten Stellen adhärieren ("Adhesion"-Stellen odersog. "Bayer bridges") wird immer noch heiß debattiert. Auf alle Fälle muß einProtein, das normalerweise in der äußeren Membran lokalisiert ist, zuerst diezytoplasmatische Membran passieren. Das Durchschleusen eines Proteins durchdie zytoplasmatische Membran wird als "Translokation" bezeichnet. Imfolgenden soll geschildert werden, wie sekretorische Proteine bei Escherichiacoli zur Innenseite der Zytoplasmamembran dirigiert wird und welcheKomponenten am Translokationsprozeß beteiligt sind.

Einige Beispiele für die Lokalisation von Proteinen in Bakterien ist in dernachfolgenden Tabelle gegeben.

Protein-Sortierung bei Bakterien

Lokalisation Beispiele Bakterien

Cytoplasma Glycolyseenzyme alleCytoplasmamembran Cytochrome allePeriplasma MalE, Bla, APase Gram-

Äussere Membran OmpA, C, F Gram-

Medium Hämolysin, IgA-Protease Gram-

Medium Hydrolasen, viele andere Gram+

Ankerproteine:Cytoplasmamembran Lipoproteine Gram-/+

Murein Fn-BP, IgG-BP Gram+

Zellhülle Autolysine Gram+

Flagellum Flagellin Gram-/+

Translokation in Wirtszelle:tierische/pflanzliche Yop-Proteine Gram-Zellen Typ III Sekretion (pathogene)

Die Sec-abhängige Proteinsekretion in Bakterien:Die Sec-abhängige Proteintranslokation durch die Cytoplasmamembran ist beiweitem die häufigste Weise auf die Pre-proteine durch die bakterielle CMgeschleust werden. Das System besteht aus verschiedenen Komponenten (s.Tabelle):

2

NSecB(GroEL)

SecA

mRNA

SP

Sec G Y E

Lep(Lsp)

NAATP

G Y E

NA

ADP + Pi

Pore

D F

+++ ++ +

PERIPLASMA

CM

COO-

ca 20 AS

pro Trans-lokations-schritt

Schema der Sec-abhängigenProteinsekretionSecA,B,D,E,F,G,Y

Sec E,G,Y =

∆∆∆∆p

Sec-Komponenten der bakteriellen ProteintranslakationSec-Proteine Lokalisation /

GrößeFunktion

SecA Cytoplasmatischlöslich;100 kD, 2-mer

SecA hilft bei derTranslokation des Pre-proteinsüber die CM, unter Beteiligungdes SecYEG Kanals

SecB Cytoplasmatisch,Löslich;17 kD; 4-mer

Neu synthetisierte Proteinewerden von SecB zur Innenseiteder CM eskortiert; Chaperon

SecE Membrankanal,9 kD

Transportkanal

SecG Membrankanal,11 kD

Transportkanal

SecY Membrankanal,47 kD; mit 2periplasmatischeDomänen

Transportkanal

SecD/F Refaltung von ProteinenSignal-peptidase I(SP-I)

Ragt in dasPeriplasma;verankert in CMmin N-terminus

Spaltet Signalpeptid ab;typische Spaltsequenz ist Ala-X-Ala;Wenn Spaltsequenz fehlt bleibtdas Protein in der CM stecken(eventuell Zelllyse, Zelltod)

Faktoren, die an der Proteintranslokation über die Cytoplasmamembranbeteiligt sind.

3

Genetische Analysen bei E. coli an ausgewählten exportierten Proteinen habengezeigt, dass ein bestimmter Satz von sog. "Sec"-Proteinen ("Sec" steht für"Sekretion") eine entscheidende Rolle spielen. Die meisten Erkenntnisse wurdedabei mit dem Precursorprotein (preOmpA) gewonnen.

SecB: Ein "Chaperone", das Proteine an die Membran hinführtSecB ist ein 17 kDa lösliches Protein, das als Tetramer vorliegt.Eine SecBnull-Mutation hemmt den Export folgender Proteine: a)Maltosebindeprotein (MBP), OmpF, Lambda-Rezeptor (LamB), OmpA, undPhoE. Die Mutation hat keinen Einfluß auf: alkalische Phosphatase, Lipoprotein,Robsebindeprotein, und ß-Laktamase.

SecB ist nur für E. coli-Zellen wichtig, die auf reichem Medium wachsen.SecB erkennt die Signalsequenz und Regionen außerhalb der Signalsequenzdes zu exportierenden Proteins.Sogar nichtsekretorische Proteine treten im Wechselwirkung mit SecB, wenn siein einer nichtnativen Konformation sind (Randall, 1992).Die Spezifizität von SecB für exportierte Protein erklärt man sich durch dieverringerte Faltungskinetik von signalsequenztragenden Proteinen (Hardy undRandall, 1991; MacIntyre et al., 1991).Die selektive Bindung von SecB an entstehende Precursors von MBP, LamB,OmpA, und OmpF konnte gezeigt werden (Kumamoto und Francetic, 1993).

Die Funktion von SecB:SecB besitzt eine Antifaltungsaktivität ("chaperoning-activity"). InAbwesenheit von SecB haben bestimmte Precursorproteine eine Tendenz, rascheine transportinkompetente Struktur anzunehmen (Collier und Bassford, 1989;Liu et al., 1989; Weiss et al., 1988). Bei dem Exoprotein PhoE hat die Bindungvon SecB an prePhoE wenig Einfluß auf die Faltung, aber es verhindert damitdie Aggregation des Precursors (Breuking et al., 1992).Im Gegensatz zu SecB ist der allgemeine Faltungsmodulator, GroEL, nichtspezifisch für exportierte Proteine. Nur der Export der ß-Laktamase wird vonGroEL-Mutanten beeinflußt.Es hat sich herausgestellt, dass SecB und das eukaryontische Signal-recognitionparticle (SRP) miteinander konkurrieren. Man hat deshalb angenommen, dassSecB eine Signalerkennungsfunktion besitzt (Watanabe und Blobel, 1989).Neuere Arbeiten lassen vermuten, dass die Hauptfunktion von SecB darinbesteht, dass es Precursorproteine an die Innenseite der Membran hinführt, ander die Translokation stattfindet (Swidersky et al., 1990; Hartl et al., 1990; deCock und Tommassen, 1992).Wenn SecB den Kontakt zwischen Precursorprotein und Membran herstellt,dann trägt dies dazu bei, eine vorschnelle Faltung des Precursorproteins zuverhindern.

SecA: Ein autoregulierter Targeting FactorSecA ist ein 102 kDa Protein; es ist in leicht abtrennbarer Form an die Innenseiteder Cytoplasmamembran gebunden und es ist assoziiert mit Ribosomen (Oliveret al., 1990b, Review article).SecA-Mutanten sind letal und konditionale SecA-Mutanten weisen eine SecA-Abhängigkeit für den Export aller periplasmatischer und äußererMembranproteine auf.

4

SecA besitzt eine relativ niedrige ATPase-Aktivität, die durch Precursorproteineund Cytoplasmamembranvesikel stimuliert wird.Blockiert man die ATP-Bindestelle von SecA durch 8-azido-ATP oderNatriumazid, erlischt die Translokationsaktivität von SecA. SecA bindet an dieSignalsequenz exportierter Proteine und tritt in Wechselwirkung mit dem in derMembran eingebetteten SecY-Protein (Hartl et al., 1990; Bieker-Brady undSilhavy, 1992).Saure Phospholipide tragen dazu bei, SecA an der Plasmamembran zu fixieren(Hendrick und Wickner, 1991; Ulbrandt et al., 1992).Die Konzentration von SecA wird durch die Proteinexportkapazität der Zellereguliert. SecA wirkt dabei als ein autogener Repressor, der ATP-abhängig mitseiner eigenen mRNA interagiert (Schmidt et al., 1991; Dolan und Oliver, 1991).SecA erfüllt in der Zelle drei wesentliche Funktionen:1. Es reguliert seine Synthese durch die ATP-abhängige RNA-

Helikaseaktivität (Koonin und Gorbalenya, 1992).2. Es dirigiert die Precursorproteine an das SecY der Membran. Dabei übt es

ähnlich wie SecB eine gewisse "Chaparoningfunktion" aus. Dies konntedadurch gezeigt werden, dass ein SecA-Defekt durch GroE supprimiertwerden kann (Ueguchi und Ito, 1992).

3. Es ist am Transfer eines Proteins durch die Cytoplasmamembran beteiligt, indem es die Reversetranslokation hemmt (Schiebel et al., 1991).

Eine funktionelle Kartierung des SecA-Proteins ergab Bindestellen für ATP, fürPrecursormoleküle, für die Membranen und mRNA.

SecY: Eine Hauptkomponente der TranslokationsporeSecY ist ein 49 kDa Protein, das im Lipid bilayer der Cytoplasmamembraneingebettet ist. Es ist für den Export periplasmatischer und äußererMembranproteine bei E. coli notwendig.Mutationen im SecY-Gen resultieren im temperatursensitiven Exportdefekt.Unter bestimmten in-vitro-Bedingungen ist SecY entbehrlich (Watanabe et al.,1990). Ein Modell seiner Membrantopographie postuliert 10 hydrophobeTransmembransegmente mit einem kurzen amino- und karboxyterminalenBereich, die in das Cytoplasma ragen.

Diese Art der Transmembranorientierung bei SecY läßt auf eine hydrophile Poredurch die Membran schließen, die die Translokation exportierter Proteineermöglicht. Diese Translokations- porenbildende Funktion von SecY konnte vorallem untermauert werden durch selektive Quervernetzung einertranslozierenden Polypeptidkette an SecY (Joly und Wickner, 1993).Die in das Cytoplasma hineinragenden Schleifen des Moleküls zusammen mitdem amino- und C-terminalen Peptiden sind an der Bindung desPrecursorproteins beteiligt. Die Hinführung der Precursormoleküle an SecY wirddurch SecA vermittelt, da es einige Evidenzien gibt für die Interaktion zwischenSecY und SecA. Ob SecY direkt mit der Signalsequenz in Wechselwirkung tritt,ist immer noch umstritten. Bestimmte SecY-Mutationen (PrlA-Mutationen)ermöglichen den Export von Proteinen, denen die Signalsequenz fehlt (Dermanet al., 1993).Die Funktion der Signalsequenzen wird jedoch nicht eine Konsensussequenzvermittelt, sondern durch eine gemeinsame Tertiärstruktur (Bieker et al., 1990;Ito, 1990).

5

Es wird auch diskutiert, dass das Signalpeptid in der Lage ist, durch direkteBindung an die Porenproteine SecY/SecE die Transmembrankanäle zu öffnen(Simon und Blobel, 1992). SecY und SecE-Protein werden meist gemeinsamgereinigt, so dass man eine funktionelle Interaktion vermutet.

SecE:Das SecE-Gen wurde identifiziert durch Mutationen, die einen pleiotropenDefekt im Proteinexport und einen kältesensitiven Wachstumsdefekt aufwiesen(Riggs et al., 1988).

SecE ist ein 13.6 kDa Protein, das in der Cytoplasmamembran über dreitransmembrane Segmente integriert ist. Ein bestimmtes Transmembransegmentscheint für die Aktivität von SecE ausreichend zu sein. Ähnlich wie bei SecY, sowird auch bei SecE angenommen, dass es mit der Signalsequenz interagiert. Eswird angenommen, dass SecE einen Schritt früher als SecY während desProteinexports in Aktion tritt.

SecD/SecF:Mutationen im SecB-Locus resultieren in einem schweren Proteinexportdefektund in kältesensitivem Wachstum. Die beiden Gene SecD und SecE werdenkotranskribiert, beide Gene kodieren für integrale Membranproteine mit großenperiplasmatischen Domänen (Gardel et al., 1990). SecD und SecF interagierenauch mit SecY. Blockiert man SecD durch spezifische Antikörper, so kann z.B.MBP und OmpA nicht freigesetzt werden, was dann zu einer Akkumulationbeider Proteine in der Zelle führt (Matsuyama et al., 1993). SecD und SecFinteragieren vermutlich mit SecY.

Energetisierung der ProteintranslokationDer Exportprozeß kann unterteilt werden in einzelne Schritte, von denen jederSchritt eine individuelle Energieform benötigt. Die Membranbindung desPrecursorproteins erfolgt in Abwesenheit von ATP. Die Translokation der ersten40 bis 50 Aminosäuren, die zur Ausbildung einer Haarnadelstruktur führen,benötigt ATP aber kein PMF. Die Vervollständigung der Translokation erfordertweitere Schritte, die ATP-Hydrolyse und/oder PMF erfordern.SecA-vermittelte ATP-Hydrolyse ist nicht unmittelbar gekoppelt mit derProteintranslokation. Die ATP-Hydrolyse durch SecA geht vermutlich einher mitder Dissoziation des Precursors von SecA, um weitere Translokation zuermöglichen.

Offene Fragen:1. Die Translokationseffizienz bei in-vitro-Versuchen mit dem beschriebenen

Sec-Komponenten ist niedrig; man vermutet, dass zusätzlicheKomponenten eine Rolle spielen, die man allerdings erst noch finden muß.

2. SecY und SecE funktionieren nur im Zusammenwirken mit anderenMembranproteinen wie dem Ydr (Ito, 1992).

3. Bestimmte Precursorproteine werden in Membranvesikel transportiert inAbwesenheit von SecY (Watanabe et al., 1990).

4. Der Signalerkennungsvorgang ist wenig verstanden. Während SecA diepositiven Ladungen der Signalsequenz erkennt (Akita et al., 1990),erkennt das eukaryontische SRP die hydrophobe Domäne.

5. E. coli besitzt ein Ribonukleoprotein, das Analogien zum SRP aufweist.Dieses Ribonukleoprotein ist jedoch noch wenig untersucht.

6

6. Die meisten Precursorproteine können posttranslational in E. colitransloziert werden. Es ist jedoch noch wenig untersucht, welcheKomponenten des Exports mit dem naszierenden Precursormolekül inWechselwirkung treten.

Übersichtsartikel:"The Sec protein-translocation pathway"Hiroyuki Mori and Koreaki ItoTrends in Microbiology 2001, 9:494-500

Das bakterielle "signal recognition particle" (SRP)

de Gier, J. W., Scotti, P. A., Saaf, A., Valent, Q. A., Kuhn, A., Luirink, J., and vonHeijne, G. (1998). Differential use of the signal recognition particle translocasetargeting pathway for inner membrane protein assembly in Escherichia coli. ProcNatl Acad Sci U S A 95, 14646-51.

Assembly of several inner membrane proteins-leader peptidase (Lep), a Lepderivative (Lep-inv) that inserts with an inverted topology compared with thewild-type protein, the phage M13 procoat protein, and a procoat derivative(H1-procoat) with the hydrophobic core of the signal peptide replaced by astretch from the first transmembrane segment in Lep-has been studied in vitroand in Escherichia coli strains that are conditional for the expression of eitherthe 54 homologue (Ffh) or 4.5S RNA, which are the two components of the E.coli signal recognition particle (SRP), or SecE, an essential core component ofthe E. coli preprotein translocase. Membrane insertion has also been tested in aSecB null strain. Lep, Lep-inv, and H1-procoat require SRP for correctassembly into the inner membrane; in contrast, we find that wild-type procoatdoes not. Lep and, surprisingly, Lep-inv and H1-procoat fail to insert properlywhen SecE is depleted, whereas insertion of wild-type procoat is unaffectedunder these conditions. None of the proteins depend on SecB for assembly.These observations indicate that inner membrane proteins can assemble eitherby a mechanism in which SRP delivers the protein at the preprotein translocaseor by what appears to be a direct integration into the lipid bilayer. The observedchange in assembly mechanism when the hydrophobicity of the procoat signalpeptide is increased demonstrates that the assembly of an inner membraneprotein can be rerouted between different pathways.

de Leeuw, E., Graham, B., Phillips, G. J., ten Hagen-Jongman, C. M., Oudega, B.,and Luirink, J. (1999). Molecular characterization of Escherichia coli FtsE andFtsX. Mol Microbiol 31, 983-93.The genes ftsE and ftsX are organized in one operon together with ftsY. FtsYcodes for the receptor of the signal recognition particle (SRP) that functionsin targeting a subset of inner membrane proteins. We have found noindications for a structural relationship between FtsE/X and FtsY. Evidence ispresented that FtsE and FtsX form a complex in the inner membrane that bearsthe characteristics of an ATP-binding cassette (ABC)-type transporter. FtsE is ahydrophilic nucleotide- binding protein that has a tendency to dimerize andassociates with the inner membrane through an interaction with the integralmembrane protein FtsX. An FtsE null mutant showed filamentous growth and

7

appeared viable on high salt medium only, indicating a role for FtsE in celldivision and/or salt transport.

1. SRP: "signal recognition particle" ist einRNA-Protein Komplex

2. bakterielles SRP-Protein ist homolog zum eukaryotischen SRP 54

3. Untersucht: E. coli + B. subtilis

4. bakterielles SRP setzt sich zusammen aus: Protein (Ffh) + RNA (4,5S RNA)

5. Funktion in E. coli: Einlagerung von CM-Proteinen, wie z.B.

Signalpeptidase (Lep) Dirigiert Membranproteine zur Translocase

(Protein-Transportpore) SecA unterstützt SRP

2. SRP- abhängige Sekretion in Bakterien(SRP-Pathway)

de Gier et al. (1998). Differential use of the signalrecognition particle translocase targeting pathwayfor inner membrane protein assembly in E. coli.PNAS 95, 14646-51.

von Heijne, G. (1998). Life and death of a signal peptide.Nature 396, 111, 113.

8

N C

SRP in E. coli

Ffh (48 kDa )

M NG

Bindung an4,5 S RNA

-GTPase-Bindung an FtsY (SRP Rezeptor)

4,5S RNA:5' 3'

-bindet an EF-G und 70 S Ribosom-bindet an Ffh

Typ I, II, III, IV und V Proteinsekretion

Die Sekretionssysteme kann man in 2 Gruppen eiteilen:a) die Sec-abhängigen undb) die Sec-unabhängingen

A) Sec-abhängige Sekretionssysteme sind der Typ II und Typ VMechanismus:

Typ II (ca 12 unterschiedliche Proteine sind beteiligt):1. Proteine werden an die Cytoplasmamembran hingeführt und2. mittels der Sec-Maschinerie transloziert, prozessiert und schließlich sekretiertBeispiele für Typ II – Sekretion sind: Maltose-Bindeprotein, ß-Lactamase,

Phosphatase und viele mehr werden in das Periplasma transloziert;Pullulanase bei Klebsiella wird über eine Pore der äusseren Membranweiter in das Medium sekretiert.

Typ V: Autotransporter mit selbstprozessierender Protease (bei Gram-negativen Bakterien)Der erste Schritt, die Translokation durch die Cytoplasmamembran in das

Periplasma erfolgt Sec-abhängig;

9

Der zweite Schritt, die Translokation durch die äussere Membran, erfolgtautokatalytisch unter Beteiligung der im Protein enthaltenenProteaseaktivität.

Beispiel: IgA-Protease bei Neisserien

B) Sec-unabhängige Sekretionssysteme sind der Typ I, III (Mischfunktion)und Typ IV Mechanismus:

Typ I:Sind ABC-Transporter, bei denen das Protein in einem Schritt durch diecytoplasmatische- und äussere Membran transportier werdenBeispiel: Hemolysinsekretion bei E. coli und Serratia

Typ III:Kontakt-abhängige Sekretion am Beispiel der Yop Sekretion bei Yersinien: EinTeil der Sekretion erfordert TypII Sekretionskomponenten die eigentlicheTranslokation erfolgt über die Ausbildung eines Pilus-ähnlichenSekretionsapparates der sowohl cytoplasmatische- und äussere Membrandurchspannt und letztlich auch die Membran der Wirtszelle. Die Sekretionerfordert den Kontakt mit der Wirtszelle, wodurch die äussere Membranpore fürden Proteintransport in die Wirtszelle geöffnet wird.

Typ IVHier handelt es sich um die Ausbildung eines Konjugations-ähnlichenPilusapparates der die Bakterienzelle mit der Wirtszelle verbindet. Durch dieseKonjugationsbrücke kann sowohl einzelsträngige DNA (wie z.B. Ti-Plasmid beiAgrobakterium tumefaciens) oder Proteine (z.B. Bordetella pertussis Toxin)vom Bakterium in die Wirtszelle übertragen werden.

Table. Bacterial secretion systems and associated surface appendages

Surface appendageSecretion

system

Prototype Species

Prototype Species

Type I a-Hemolysin E. coli – b -

Type II Pullulanase Klebsiella

oxytoca

Type IV pili Pseudomonas

aeruginosa

Type III Yersinia outer

proteins (Yops)

Yersinia spp. Flagella Salmonella

typhimurium

Needle complex Salmonella

typhimurium

Hrp pili Pseudomonas

syringae

Type IV Pertussis toxin Bordetella

pertussis

T pilus Agrobacterium

tumefaciens

F pilus Escherichia coli

10

Type V a IgA1 protease Neisseria

gonorrhoeae

- -

Chaperone/

usher pathway

P pili Escherichia coli P pili Escherichia coli

aType V system includes the autotransporter family and a similar pathway that requires asingle accessory factor (e.g. Serratia marcescens hemolysin ShlB).b indicates that no appendage has been identified in this system.From: The role of bacterial pili in protein and DNA translocationRalf Koebnik. Trends in Microbiology 2001, 9:586-590

Typ I Proteinsekretion (am Beispiel von E. coli αααα-Hämolysin)

ADP ATP

OM

CM

TolC

HlyB

HlyD

N

N

Das α-Hämolysin wird über einen sog. ABC-Transporter unter ATP-spaltungdurch die beiden Membranen von E. coli und Serratia in das Mediumsekretiert. Der Sec-Sekretionsapparat ist nicht beteiligt.

Typ II Sekretionsapparat

11

SecD-F, V

PulC

E-O

PulD

S

N

C

SecA

SecB

ATPADP

Lsp

Die Pullunase von Klebsiella wird über das Sec-System in das Periplasmatranloziert und dann über eine äussere Membranpore (PulD) und unterMitwirkung weiteren Pul-Proteine in das umgebende Medium sekretiert.

Typ III Sekretionssystem

12

YscC

YscD,FI - LO - ULcrD

YscN

N

C

Syc

ATPADP

VirG

Beim Typ III

Bei diesem Sekretionssystem am Beispiel von Yersinia werden die Yop Proteineüber einen Porenapparat der sich über die beiden bakteriellen Membranen undschließlich über die Wirtsmembran erstreckt in die Wirtszelle eingeschleust.

Yop proteine und ihre FunktionenAlle 3 Yersinia Arten sind gegen die primären Immunabwehrsysteme resistent.Sie hemmen über das Typ III Sekretionssystem ihre eigene Phagozytoxe durch

professionelle Phagozyten. Aus diesem Grund sind diese Pathogenewährend einer Infektion vorzugsweise extrazellulär.

Typ III Sekretionssystem wird durch Kontakt mit einer eukaryotischen Zelleinduziert.

YopH Tyrosin phosphatase; ist für die Antiphagozytose verantwortlich

YopE Cytotoxin; Zerstörung von F-Aktin

YpkA Ser-Thr-Kinase; wirkt zu einem späteren Stadium der Infektion

YopM Thrombin-Bindeprotein

13

YopK Erhöht Translokation

YopB Porenbildende Translokase

YopJ/P Induktion der Apoptose

Weitere Typ III Sekretionssysteme:

Pseudomonas aeruginosa

ExoS und ExoT: ADP-RibosyltransferaseShigella flexneri

IpaA: bindet an VinculinIpaB-D: binden an a5ß1-Integrin

Pflanzenpathogene:Pseudomonas syringiae:

Auslösung von Wirtsanworten (Elizitoren)Erwinia amylovora:

Auslösung von Wirtsanworten (Elizitoren)

Typ IVAm Beispiel des VirB-Systems von Agrobacterium tumefaciens

Bakterielle Kolonisierung

Induktion der vir-Gene

Bildung des T-DNA-Transfer-Komplexes

T-DNA-Transport in Pfl.Zellen

Integration in Pflanzengenom

Expression von Onkogenen

Folge: „crown gall“ Tumore

VirB-Systemvon Agrobacterium tumefaciens

14

�Wird von 11 Genen codiert

�10 davon substantiell für T-DNA-Transfer (VirB2-virB11).

�Substrat nicht nur ssDNA, sondern Proteine

Drei funktionelle Gruppen von VirB Proteinen:

���� Proteine die exozelluläre adhäsive Strukturen bilden

���� Paarungskanalkomponenten

���� CM-ATPasen

Das VirB-System

VirB5

Chaperon?Piluskomponente?

VirB1

Peptidoglycanlyse

VirB1*

Interaktion mit Wirt?

15

Mechanismus des DNA-Transfers

1. Kotransportierte Proteine Prozessieren die DNA am OriT2. Transesterase initiiert und wird dann am 5' Ende der ssDNA

gebunden3. VirD2 Transesterase + DNA wird in Wirtszelle geschleust4. VirD2 besitzt eine nukleäre Lokalisationssequenz � Transport der DNA in den Kern (z.B. KKRKK motif)

Typ VI DNA-Transfersystem ist also:

Proteinsekretionsmaschinerie, die an einen "Piloten" gebundene ssDNA durch den Translokastionskanal schleust.

Genetic transformation of HeLa cells by AgrobacteriumTalya Kunik* et al.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 98, 1871-1876, 2001http://www.pnas.org/cgi/reprint/98/4/1871

Agrobacterium tumefaciens is a soil phytopathogen that elicits neoplasticgrowths on the host plant species. In nature, however, Agrobacterium also mayencounter organisms belonging to other kingdoms such as insects andanimals that feed on the infected plants. Can Agrobacterium, then, also infectanimal cells? Here, we report that Agrobacterium attaches to and geneticallytransforms several types of human cells. In stably transformed HeLa cells, theintegration event occurred at the right border of the tumor-inducing plasmid'stransferred-DNA (T-DNA), suggesting bona fide T-DNA transfer and lendingsupport to the notion that Agrobacterium transforms human cells by amechanism similar to that which it uses for transformation of plants cells.Collectively, our results suggest that Agrobacterium can transport its T-DNA tohuman cells and integrate it into their genome.

Typ VThe autotransporters, a family of secreted proteins from Gram-negative bacteria,possess an overall unifying structure comprising three functional domains: theamino-terminal leader sequence, the secreted mature protein (passenger domain)and a carboxy-terminal (-) domain that forms a -barrel pore to allow secretion ofthe passenger protein. Members of this family have been implicated as importantor putative virulence factors in many Gram-negative pathogens.

See review:The great escape: structure and function of the autotransporter proteins

16

Ian R. Hendersona, Fernando Navarro-Garciab and James P. NataroaA. Trends inMicrobiology 1998, 6:370-378

The autotransporter secretion mechanism

The autotransporter secretion system, as distinct from the mechanisms detailedabove, was first described for the IgA1 proteases of Neisseria gonorrhoeae byPohlner et al.16, who elegantly elucidated the fundamental mechanism. (Theterm `type IV secretion' has been proposed for the autotransporter proteins4. Wefavor the use of this term; however, autotransporter is a more descriptivedesignation and will be used throughout this review.) During secretion, the Igapolyprotein precursor is processed at both the amino- and carboxy-terminalends. Export of this precursor through the inner membrane occurs via the Secpathway and is coupled to the cleavage of a 27-amino-acid signal peptide at itsamino terminus. Passage of the protein through the outer membrane is mediatedby its carboxy-terminal domain; no energy coupling or accessory factors areknown to be required for the translocation process. Pohlner et al. were the firstto suggest that the carboxy-terminal portion of the Iga precursor could form anintegral membrane structure similar to that of the general porins, comprisingantiparallel -sheets arranged in a hypothetical -barrel conformation (see below).It is assumed that the signal-cleaved amino-terminal domain is then translocatedthrough the -barrel pore to the bacterial cell surface, where the IgA1 proteaseuses its autocatalytic activity to cleave and release itself from the -barrelstructure.

17

Autotransporter secretion. The autotransporter polyprotein is synthesized andexported through the cytoplasmic membrane via what is thought to be a Sec-dependent mechanism (depicted by gray ovals). The three domains of thepolyprotein are shown: the leader sequence, the amino-terminal passengerdomain and the carboxy-terminal ß-barrel-forming domain (-domain). The leadersequence is cleaved at the membrane by a signal peptidase, releasing the maturepolyprotein into the periplasm. Once in the periplasm, the -domain of the proteininserts into the outer membrane to form a ß-barrel structure. After formation ofthe -barrel pore, the passenger domain is translocated to the cell surface throughthe pore. Once at the cell surface, several possibilities may occur: (1) the proteinremains intact as a large polyprotein that has a carboxy-terminal membrane-bound domain and an amino-terminal domain extending into the environment;(2) the protein either gains autoproteolytic activity and cleaves itself or it iscleaved by an outer membrane protease, but in this case the passenger domainremains in contact with the cell surface via noncovalent interactions with the ß-domain; or (3) the passenger domain gains its autoproteolytic activity or iscleaved by an outer membrane protease and is released into the environment.

18

Topology of an autotransporter. The polyprotein precursors of theautotransporters share some similarities. In most cases, the polyprotein possessesa signal sequence that could target the protein to the Sec inner membranesecretion system. The passenger domains possess functional motifs, includingthe serine protease sites, Arg–Gly–Asp (RGD) motifs and P-loop motifs, whichare assumed to play roles in the phenotypes and/or the biogenesis of theseproteins. The -domain possesses an amphipathic -sheet structure, which isthought to allow formation of a 14-stranded ß-barrel structure within the outermembrane. The hydrophobic residues of these strands are projected into thehydrophobic lipid bilayer, while the hydrophilic side chains project into anaqueous environment in the center of the barrel, forming a pore. The strandshown is from TcfA of Bordetella pertussis. The carboxy-terminal stretches ofthe -domains possess a common motif and all end with three residuesconforming to the motif (Y/V/I/F/W)-X-(F/W). The most common three-residuemotif (YSF) is indicated.

Verankerung von Proteinen in der Bakteriellen Membran (Lipoprotein)

Lipoprotein

19

a) in der äusseren Membran (Braun'sches Lipoprotein)The structure of the lipid modification in the case of major outer membraneprotein of E. coli was elucidated chemically in 1973. It was shown thatSulphydryl group of N-terminal Cysteine was modified with a diacylglycerylgroup attached through a thioether linkage and the amino group was acylatedwith a fatty acid [1] (shown in figure). The acyl group composition was found tobe same as that of membrane phospholipids [1] and therefore membranephospholipids were suspected to be the lipid donors for the modification.

In another important finding it was shown that the precursor for this outermembrane lipoprotein was actually a pre-protein with an N-terminal extension of20 amino acids possessing the characteristics of a typical signal peptide [2].Naturally, the interest in the biosynthesis of this lipoprotein started immediately.Firstly the origin of the lipid in the molecule was traced to phospholipids assuspected earlier [3]. Phosphatidylglycerol was shown to be specificallyrequired for the initial modification of Cys of the lipoproteins withdiacylglycerol, catalyzed by the enzyme phosphatidylglycerol-prolipoproteindiacylglyceryl transferase[4,5]. N-acylation was shown to be achieved with anyof the phospholipids [4]. Discovery of Globomycin, a cyclic pentapeptide

20

antibiotic that specifically inhibited the maturation of lipoproteins led to theidentification of a signal peptidase specific for lipoproteins [6].

This signal peptidase called signal peptidase II required diacylglycerylmodification prior to cleavage [7,8]. This meant that diacylglyceryl modificationpreceded cleavage of the signal peptide. The final modification i.e. after thecleavage of the signal peptide, fatty acylation of the amino group of the N-terminal diacylglyceryl modified Cys to form N-acyl diacylglyceryl Cysteine wassubsequently identified [9,10]. The pathway [5] is shown in the figure below.The genes for these enzymes have been identified by Wu et. al. in a variety ofbacteria and they are found to be highly conserved [11, 12].

Hantke, K. and Braun, V., Covalent binding of lipid to protein. Diglyceride andamide-linked fatty acid at the N-terminal end of the murein lipoprotein ofthe Eschericia coli outer membrane, Eur. J. Biochem., 34, 284, 1973.

21

Sankaran, K. and Wu, H. C. Lipid Modification of Bacterial Prolipoproteins, J.Biol. Chem., 269, 19701, 1994

Inukai, M., Takeuchi, M., Shimizu, K., and Arai, M., Mechanism of action ofglobomycin, J. Antibiot. (Tokyo), 31, 1203, 1978.

Hussain, M., Ichihara, S., and Mizushima, S., Accumlation of glyceride containingprecursor of the outer membrane lipoprotein in the cytoplasmic membraneof E.coli treated with globomycin, J. Biol. Chem., 255, 3707, 1980.

Dev, I. K. and Ray, P. H., Rapid assay and purification of a unique signalpeptidase that processes the prolipoprotein from E.coli, J. Biol. Chem.,259, 11114, 1984.

Sankaran, K., Gupta, S. D. and Wu, H. C., Modification of Bacterial Lipoproteins,Methods in Enzymol. 250, 683, 1995.

Qi, H-Y., Sankaran, K., Gan, K., and Wu, H. C., Structure-Function relationship ofBacterial Prolipoprotein Diacylglyceryl Transferase: Functionallysignificant Conserved Regions, J. Bacteriol, 177, 6820, 1995.

Covalente Verknüpfung des Lipoproteins an das Peptidoglycan

22

Proteinsekretion Teil II

Integrale CytoplasmamembranproteineIntegrale Membranproteine (IMP) weisen mehrere hochhydrophobeSequenzbereiche auf, die mit 20 Aminosäurenresten lang genug sind, um dieCytoplasmamembran zu durchspannen. Diese Transmembransegmenteverankern das Protein innerhalb des Lipidbilayers der Membran. DieTopographie des jeweiligen IMPs wird durch die Zahl derTransmembransegmente festgelegt. Bezüglich der Orientierung des Amino- undC-Terminus unterscheidet man Transorientierung und Cisorientierung. Bei derTransorientierung (Klasse I-IMP) ragt der Aminoterminus in das Cytoplasma undder C-Terminus in das Periplasma. Bei der Cisorientierung (Klasse II-IMP) ragenbeide Enden in das Cytoplasma. Mechanistische Untersuchungen zurIntegration von IMPs in die Cytoplasmamembran sind im allgemein sehrschwierig, da ein direkter Nachweis der korrekten Integration von IMPs in diebakterielle Cytoplasmamembran experimentell sehr aufwendig ist.

Methodische Strategien, um die Topographie bakterieller IMPs zuuntersuchenEin integrales Membranprotein ist normalerweise geschützt durchproteindenaturierende Agentien wie z.B. NA2CO3 bei alkalischem pH odergegenüber 0,1 NAOH. Die das Protein umgebende Phospholipide schützen dasProtein vor diesen Agentien.5- bis 6M-Harnstoff setzt peripher assoziierte Membranproteine frei.Lipideingebettete Proteine werden jedoch nicht freigesetzt. Um diesefreizusetzen, muß man die Harnstoffkonzentration auf 9M erhöhen, dannwerden sogar lipidverankerte Proteine herausgelöst. (Tatros et al., 1989) Dieentsprechende Konzentration an Harnstoff muß allerdings für jedes individuelleProtein bestimmt werden.

Bereiche, die aus der Membran herausragen, sind proteolytischem Abbauzugänglich. Auf diese Weise kann man auch feststellen, welche Bereiche nichtintegral in der Membran verankert sind. (Werner et al., 1992). Denproteolytischen Ansatz kann man in vitro von beiden Seiten derCytoplasmamembran durchführen, entweder mit "Right-side-out"-Membranvesikeln oder "Inside-out"-Plasmamembranvesikeln.

Topogene Sequenzen, die die Integration der Proteine in dieCytoplasmamembran festlegenDie Signale, die verantwortlich sind für die Insertion von IMPs werden als"topogene Sequenzen" bezeichnet. Sie liegen innerhalb und um dieTransmembransegmente des Membranproteins. (Saier et al., 1989; Boyd undBeckwith, 1990; Dalbey, 1990) Es handelt sich um bestimmte Regionen, die dieInitiation (Signalsequenzen) und die Termination (Stop-Transfersequenzen)einer translozierenden Polypeptidkette bestimmen. Eine Stop-Transfersequenzführt immer zu Verankerung der Polypeptidkette in die Lipidbilayerschicht. EineSignalsequenz führt nur zur Verankerung, wenn sie nicht abgespalten wird(z.B. durch die Signalpeptidase I beim gleichzeitigen Fehlen einer

23

Prozessierungsstelle Ala-X-Ala). Die endgültige Topographie eines IMPs,dasdie Membran verschieden Male durchspannt, ergibt sich aus der Lage deralternierenden Sequenzen, die Signalanker- und Stop-Transfersequenzendarstellen. Die Signalankersequenz führt zum Einsetzen der Translokation unddie Stop-Transferesequenz führt zum Anhalten des Translokationsprozesses. DieSequenzen, die dazwischen liegen, ragen entweder in das cytoplasmatischeLumen oder in den periplasmatischen Raum. Die Funktionalität der topogenenSequenzen bei integralen Membranproteinen kann man untersuchen, indem manbestimmte Reporterproteine an entsprechende Sequenzen fusioniert.Die Orientierung einer topogenen Sequenz innerhalb der Membran istnormalerweise dergestalt, dass positiv geladene Reste auf der Cis-Seite sind (dercytoplasmatischen Seite der Membran). Dies haben statistische Analysen derVerteilung geladener Aminosäuren innerhalb der Cis- und Trans-Schleifen vonIMPs ergeben (sogenannte positive-inside Regel, von von Heijne 1986aufgestellt). Dies wird vor allem auch durch die spaltbaren Signalsequenzenoffensichtlich, wo der positiv geladene Aminoterminus im cytoplasmatischenBereich verbleibt. (Puziss et al., 1989, Summers et al. 1989, Summers undKnowles 1989)Im allgemeinen kann man sagen, dass die Verteilung positiv geladener Gruppenum die Transmembransegmente die Orientierung festlegen. Vorausgehendepositive Ladungen machen das anschließende Transmembransegment zu einerSignalsequenz, die entweder spaltbar oder integral sein kann. AnschließendeCluster von basischen Aminosäuren vermitteln eine Stop-Transferinformation andas vorausgehende Transmembransegment. Dies wurde experimentell festgelegt,indem man positiv geladene Aminosäuren vor und nach denTransmembransegmenten prokaryontischer Proteine einbaute. (Nilsson und vonHeijne 1990L; Yamane et al. 1990) Besitzt ein Transmembransegment auf beidenSeiten positiv geladene Aminosäuren, dann bestimmt die am positivstengeladene Seite die Orientierung. Jene Seite, die die höhere positive Nettoladungaufweist, und die mehr Arginin- als Lysinreste enthält, ist auf dercytoplasmatischen Seite. Dies beinhaltet die sog. "Ladungs-Differenzregel", dievon Hartmann et al. 1989, Nilsson und von Heijne 1990 und McGovern et al.1991 experimentell untermauert wurde.Die Distanz zwischen dem Hydrophobenbereich und den basischenAminosäuren beeinflußt die Stärke des topogenen Signals. Je weiter diebasischen Aminosäuren entfernt sind, um so schwächer ist das topogene Signal.(Boyd und Beckwith 1990) Allerdings sollte erwähnt werden, dass es von dieserRegel Ausnahmen gibt. (Andrews et al., 1992) C-terminal gelegeneTransmembransegmente besitzen topogene Informationen, die anders abgelesenwerden als die vorausgehenden topogenen Sequenzen. Starke topogeneSequenzen am C-terminalen Ende können vorausgehende topogene Sequenzenumkehren.

Long proteins self-insertionThe set of proteins which can self-insert into the membrane which are longerthan normal self-insertion proteins segments exhibit other characteristic whichare vital to their translocation. This set includes a long 180 residue stretch ofMalF and 100 amino acid N-terminus of ProW. These proteins have the specialability to insert themselves into the membrane in spite of their length.

Proton-motive force aids in the translocation of negatively charged amino acids,and hinders positively charged amino acids. This could be one way the extra

24

long loop of ProW translocates itself across the membrane. A mechanism of self-insertion of Sec-independent proteins is suggested which is dependent on aidfrom neighbouring hydrophobic, transmembrane regions.

ProW has a 100-residue N-terminus periplasmic segmentwhich exhibits Sec independence.It follows the positive-inside rule,but also has an abnormally largenumber of negatively chargedamino acids on the periplasmicloop. Inserting positively chargedamino acids into the periplasmicsegment of the protein inhibitstranslocation.

Inserting positively chargedamino acids into the periplasmicsegment of the protein inhibitstranslocation.

Ist die Integration von Proteinen in die cytoplasmatische Membran bei E.coli von den Sec-Proteinen abhängig?In secAts-Mutanten ist die Integrationsgeschwindigkeit neusynthetisierterProteine in die äußere und innere Membranfraktion um ungefähr 70 %verringert. Eine Sec-abhängige Integration wurde untersucht für authentischeIMPs von E. coli: a) SPase I, b) Laktosepermease (LacY), Maltosepermease(MalF), Mannitolpermease (MtlA) und SecY zu Signalpeptidase I.Der N-Terminus von SPase I ragt in das Periplasma. Dann folgt eine hydrophobeTransmembranregion, eine 25-aminosäurelange cytoplasmatische Schleife, einezweite Transmembranregion und eine große periplasmatische Domäne, die etwazwei Drittel des Proteins ausmacht. (San Millan et al., 1989) DieMembraninsertion ist SecA- und SecY-abhängig. Interessanterweise wird dieInsertion von SPase I Sec-unabhängig, wenn die Orientation des Proteinsumgekehrt ist. (von Heijne 1990) Die Umkehrung kann erreicht werden, wennman die positive Nettoladung der cytoplasmatischen Schleife des Proteinserniedrigt. (Nilsson und von Heijne, 1990) In diesem Fall bleibt die großeperiplasmatische Domäne im Cytoplasma. Solche Konstrukte mit umgekehrterTopographie können wiederum Sec-abhängig gemacht werden, wenn der jetztperiplasmatisch lokalisierte Abschnitt zwischen den beidenTransmembransegmenten in seiner Größe erhöht wird. Dies SecA- und SecY-Abhängigkeit nimmt linear zu mit der Länge dieses Abschnitts in einem Bereichvon 25-55 Aminosäuren. (Andersson und von Heijne, 1993) Aus diesenUntersuchungen kann man ableiten, dass die Sec-Abhängigkeit der Integrationvon IMPs in die Cytoplasmamembran und der Länge der Extramembrandomäneabhängig ist. Bei kurzen Extramembrandomänen (< 25 Aminosäuren) ist dieIntegration Sec-unabhängig. Ähnliche Ergebnisse wurden auch für die IMPsvon LacY, MalF, Mannitolpermease und SecY berichtet. Zusammenfassendkann man sagen, dass die Integration von vor allem sehr hydrophoben IMPs in

25

der E. coli Cytoplasmamembran SecA unabhängig ist. Die Abhängigkeit vonSecY variiert von Protein zu Protein. Die Translokation von großen hydrophilenDomänen scheint jedoch immer Sec-Funktionen zu erfordern.Das kleine Haupthüllprotein des bakteriophagen M13 inseriert in dieCythoplasmamembran von E. coli unabhängig von SecA SecY. Das Protein ist73 Amonisäuren lang und inseriert in die Membran in folgender Topographie:Die N-termionale Region bleibt im Cytoplasma, dann folgt ein hydrogphobesKernstück der Signalsequenz, das die Membran durchspannt, dann ein 20Aminosäuren langer periplasmatischer Abschnitt oder Schleife, eine Stop-Transfersequenz und ein kurzes positiv geladenes C-terminales Peptid, das indas Cytoplasma ragt. Es konnte gezeigt werden, dass die Insertion diesesPrecurserproteins Sec-abhängig wird, wenn die periplasmatische Schleife durch173 Aminosäuren verlängert wird. (Kuhn, 1988) Man nimmt an, dass dieseskleine Hüllprotein spontan in die Cytoplasmamembran inseriert, ohne dassandere Proteine diese Integration vermitteln. (Wickner, 1988)Das erste Transmembransegment der SPase 1 und die anschließend positivgeladenen Cluster vermitteln ein Sec-unabhängiges Insertionssignal. (Lee et al.,1992) Der anschließende Anteil der SPase1-Proteins erfordert jedoch SecA undSecY für seine Faltung. Bei dem SecA und SecY unabhängigenTranslokationsvorgang wird die Beteiligung von Translokatoren (poren- oderkanalbildende Membranstrukturen) diskutiert. Beim ER hat man solchePorenproteine, solche Translokatoren offensichtlich nachgewiesen. (Simon undBlobel, 1991). Ähnliche Poren wurden kürzlich auch bei der E. coliCytoplasmamembran entdeckt. (Simon und Blobel, 1992)

Äußere Membranproteine bei E. coliDie äußere Membran von drei negativen Bakterien besitzt nur eine geringe Zahlan integralen Membranproteinen, meist handelt es sich dabei um Proteine, derenFunktion die Aufnahme von Nährstoffen ist (siehe review von Nikaido, 1992)Mit Ausnahme des Murein-Lipoproteins, das das Murein mit der äußerenMembran verknüpft, sind die äußeren Membranproteine polytopeTransmembranproteine, die in der Regel als Trimer vorliegen. Jedes Monomerdurchspannt die Membran mehrfach durch antiparallele ß-Strecken. Dabeikommt es zur Ausbildung von amphiphilen ß-Faltblattstrukturen, die einestrukturelle Grundlage für die Porenfunktion darstellen.

Topogene Sequenzen äußerer MembranproteineDie Translokation wurde bei folgenden äußeren Membranproteinen untersucht:PhoE, OmpA, TonA, OmpF, LamB. Obwohl diese äußeren Membranproteinekonservierte Amoinosäuresequenzen aufweisen, hat man bislang doch keinrichtiges Sortierungssignal ausmachen können.Durch Fusionstudien weiß manbei OmpA, dass der C-terminaleß-Strang eine wichtige Rolle für die Zusammenlagerung dieses Proteins in deräußeren Membran spielt. (Klose et al, 1989) Bei LamA und PhoE hat man eineganze Reihe verschiedener Aminosäuren durch andere ersetzt, die meistenAminosäureaustausche hatten jedoch meist keinen wesentlichen Einfluß aud dieMembranintegration. Führt man jedoch ein strang-brechendes Prolin in den C-terminalen ß-Strang von OmbA ein, wird die Memnbraninkorporation gehemmt.Das Gleiche hat man festgestellt, wenn man ein turn-bildendes Glycin in PhoEintegriert. (de Cock et al. 1991). Dieser Glycinrest ist die einzige striktkonservierte Aminosäure innerhalb eines Segments hoher Homologieverschiedener äußerer Membranproteine. Neben Glycin spielt auch bei vielen

26

Membranproteinen auch noch ein Phenylargininrest am C-terminalen Ende einewichtige Rolle, der wenn er ausgetauscht wird zu einer Abnahme derMembranintegration führt. (Stryvé et al.,1991).

Zusammenlagerung der äußeren MembranproteineDie äußeren Membranproteine werden zunächst als lösliche periplasmatischeIntermediäre gebildet bevor sie ihre richtige Konfirmation innerhalb der äußerenMembran einehmen. Der Übergang vom löslichen Intermediär zu dem in dieäußere Membran eingebetteten PhoE erfolgt über die Ausbildung eines Dimersund Trimers. Während dieser Weg durch PhoE beschritten wird, lagert sichLamB zuerst in der Cytoplasmamembran bei E. coli ein und von hier erreicht esdie äußere Membran vermutlich durch laterale Diffusion über die Kontaktstellen.

LipoproteineDas Braun'sche Lipoprotein in E. coli, ein Prototyp von lipid-modifiziertenProteinen der Bakterienzellhülle wird Sec-abhängig durch dieCytoplasmamembran transloziert. Von der Spaltstelle der Signalsequenz wirddas Precursorprotein an einem konservierten Cysteinrest modifiziert. DieProzessierung erfolgt durch die Signal Peptidase II (Müller.1992), welche durchGlobomycin gehemmt wird. (Hayashi und Wu, 1990) Interessanterweise sindProteinvorstufen, die in verschiedenen Sec-Mutanten akkumulieren nicht mitGlycerid modifiziert, was darauf schließen läßt, dass Sec-abhängige Schritte denModifikations Reaktionen vorausgehen (Sugai und Wu, 1992).