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Allergene in Lebensmitteln / …Analytik the SureFood Company Quantitative Allergen-Analytik als Voraussetzung für harmonisierte ‚action-level‘ (EU-VITAL) Matthias Kuhn

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Allergene in Lebensmitteln / …Analytik the SureFood Company

Quantitative Allergen-Analytik als Voraussetzung für harmonisierte ‚action-level‘ (EU-VITAL)

Matthias Kuhn

Allergene in Lebensmitteln / …Analytik the SureFood Company

• Warum quantitative Allergen-Analytik?

• Wer benötigt die quantitative Information?

• EU: Allergen Nulltoleranz (technische Null; kleiner LOD)

• Codex: Gluten Free <20 ppm; low Gluten <100ppm

• Reicht größer bzw. kleiner 20 ppm als Information?

Zukunft:

• Grenzwerte bzw. 'action levels' in Bezug auf Deklaration

(Beispiel: EU-VITAL (basierend auf VITAL))

• Verlässliche quantitative Analytik

• Referenzmaterial

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Initiative for harmonized action levels for the declaration of food allergens

EU

VITAL

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EU- VITAL Konzept

VITAL = Voluntary Incidental Trace Allergen Labelling

→ Festlegung von “Action levels” (AL) Standardisierung für die Deklaration

AL 1: keine DeklarationAL 2: kann Spuren von … enthaltenAL 3: enthält …. als Zutat

→ Dimensionierung

mg Protein/ kg Lebensmittel

EU-VITAL = Vorschlag europäische Umsetzung

→ alle in Richtlinie 2007/68 genanntenAllergene enthalten

→ Dimensionierung

mg allergener Bestandteil/ kg Lebensmittel

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• Die Unterschiede

• (1) Das VITAL-Modell listet weniger/andere zu kennzeichnende Allergene als in der EU beschrieben

• Ein hier vorgestelltes EU-VITAL Modell enthält alle Allergene gemäß der europäischen Richtlinie (s.u.).

• (2) Die Grenzwerte sind im VITAL-Modell als allergenesProtein/Gesamtlebensmittel [ppm] dimensioniert.

• Das EU-VITAL Modell listet die Grenzwerte wie in Europa bereits normiert (DIN EN 15634-1) auf:

mg allergene Bestandteile/kg Lebensmittel [ppm]

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Problematik der praktischen Umsetzung

Referenzmaterial→ kein standardisiertes Referenzmaterial

Konsequenz:Uneinheitliche Herstellung interner Vergleichsmaterialien

Uneinheitliche Dotierungsmaterialien (Samen, Blatt, Mehl, etc…)

• Grenzwerte→ Nulltoleranz laut EG Richtlinie

→ Nachweis von „Null“ nicht möglich ('technische Null')Konsequenz:Nachweisgrenzen variieren je Nachweissystem und HerstellerPositive Ergebnisse ohne Gehaltsbestimmung 1 ppm oder 1000 ppm (0,1%)→ kann Spuren von …. Enthalten

• normierte Verfahren § 64 LFGB/DIN→ 4 von 20 allergenen Bestandteilen (Soja, Erdnuss, Haselnuss, Sellerie)

Konsequenz:Verwendung verschiedenster (quantitativer) Nachweismethoden, -verfahren

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Quantitative Methoden

•ELISA

•real time PCR

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Sandwich ELISA

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Sandwich ELISA:

The higher the conc. the higher is the absorbance.

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Competitive ELISA

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competitive ELISA:

The higher the conc. the lower is the absorbance.

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Quantitative Methoden

•ELISA

•real time PCR

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Verbundprojekt QUALLITÄT

Verbundvorhaben AllergenanalytikCVUA Freiburg, LGL Oberschleißheim, Congen

Biotechnogie

Teilprojekt II

Simultaner Schnell-nachweis (LPA-Technik)

Teilprojekt III

Quantifizierung mittels

real-time PCR

Teilprojekt I

Vergleichs-materialienausgewählter

Matrices

Beispielhaft:

Brühwurst,

Kekse

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• Quantitativer Allergennachweis über die qPCR

Voraussetzungen

• quantitatives Referenzmaterial

• 'process efficiency' Referenzmaterial

• Standard/Referenz DNA

• Korrelation mit 'ppm' Gehalt über Rerenzmaterial Food

Beispiele GMO: relative Quantifizierung (% GMO)

Pathogene: Absolute Quantifizierung (Zellzahl)

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standard with known copy numbers

sampleunknown concentration

X101 103 105

fluorescence

CtCt105

Ct103

Ct101

Ct X

SureFood®

QUANTARDknown concentration and

expected copy number

40

ppm

Ct40 ppm

threshold

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Teilprojekt III-Quantifizierung mittels real-time PCR

Bestimmung der Nachweisgrenze am Beispiel Nuss in Brühwurst

20,0

22,0

24,0

26,0

28,0

30,0

32,0

34,0

36,0

38,0

40,0

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

log ppm

Ct-W

ert

Cashew

Erdnuss

Haselnuss

Macadamia

Mandel

Paranuss

Walnuss

Linear (Paranuss)

Linear (Walnuss)

Linear(Haselnuss)Linear (Cashew)

Linear (Mandel)

Linear (Erdnuss)

10 ppm 20 ppm 100 ppm

→ nicht alle Verfahren für Quantifizierung im unteren ppm Bereich geeignet,

Optimierung der Nachweissysteme erforderlich

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Teilprojekt III-Quantifizierung mittels real-time PCR

Quantitative Bestimmung am Beispiel Senf in Brühwurst

→ DNA Extraktion unproblematisch, 5 -10 ppm detektierbar

→ Linerarität gegeben

→ quantitative Bestimmung von Proben mit unbekanntem Gehalt möglich

Real-time PCR zum Nachweis von SenfM atrix: Brühwurst; 10 - 320 mg Senf/kg

y = -3 ,1188x + 38 ,581

R 2 = 0 ,9841

30,0

32,0

34,0

36,0

0,80 1,30 1,80 2,30 2,80

Log conc

Ct

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'Matrix adaptierte' Quantifizierung von allergenenBestandteilen mittels real-time PCR

Durchführung

Extraktion von Probe und Referenzmaterial mit bekannten Gehalt an allergenem Bestandteil in einer Lebensmittelmatrix

z.B. 4 mg Senf / kg LM

40 mg Senf / kg LM

400 mg Senf / kg LM

real-time PCR mit Probe und Referenzmaterial, Referenzmaterialien definiert als Standards mit bekannten Konzentrationen

Quantitatives Ergebnis des allergenen Bestandteils im LM

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Quantifizierung von Senf in einer Gewürzmischung mittels SureFood Quantard Allergen Mustard

SF Quantard 400 ppm

SF Quantard 40 ppm

SF Quantard 4 ppm

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Quantifizierung von Senf in einer Gewürzmischung mittels SureFood Quantard Allergen Mustard

SF Quantard 400 ppm

SF Quantard 40 ppm

Gewürzprobe

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Teilprojekt III-Quantifizierung mittels real-time PCR

Quantitative Bestimmung am Beispiel Senf in Brühwurst

→ DNA Extraktion unproblematisch, 5 -10 ppm detektierbar

→ Linerarität gegeben

→ quantitative Bestimmung von Proben mit unbekanntem Gehalt möglich

Real-time PCR zum Nachweis von SenfM atrix: Brühwurst; 10 - 320 mg Senf/kg

y = -3 ,1188x + 38 ,581

R 2 = 0 ,9841

30,0

32,0

34,0

36,0

0,80 1,30 1,80 2,30 2,80

Log conc

Ct

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Quantifizierung von Senf in einer Gewürzmischung mittels SureFood Quantard Allergen Mustard

Ergebnis

• Abschätzung

→ 40 ppm > Gewürzprobe < 400 ppm

• Quantitatives Ergebnis

→ 89 mg allergener Bestandteil / kg Lebensmittel

Zusammenfassung

- einheitliche DNA Extraktion für Referenzmatrix und Probe

- Quantifizierung über Referenzproben mittels real-time PCR möglich

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standard with known copy numbers

sampleunknown concentration

X101 103 105

fluorescence

CtCt105

Ct103

Ct101

Ct X

SureFood®

QUANTARDknown concentration and

expected copy number

40

ppm

Ct40 ppm

threshold

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Vorteile

• Berücksichtigt Effizienz der DNA Extraktion

• leicht adaptierbar (Schwellenwerte)

• einsetzbar für alle qPCR Systeme

• einsetzbar für alle Probenaufbereitungssysteme

• keine aufwendigen DNA Standard nötig

Limitierungen

• Matrixeffekte könne unterschiedlich sein (Mischung!)

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Vergleich immunologische Verfahren und PCR

Anhang III a (Richtlinie 2003/89/EG)

ELISAPCRPCR oder ELISA

• Glutenhaltiges Getreide (Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Dinkel, Kamut)• Krebstiere• Eier• Fisch• Erdnüsse• Soja• Milch (einschließlich Laktose)• Schalenfrüchte, d. h. Mandel, Haselnuss, Walnuss, Cashewnuss,

Pecannuss, Paranuss, Macadamianuss• Sellerie• Senf • Sesamsamen• Schwefeldioxid und Sulfite (bei mehr als 10 mg/kg od. 10 ml/l)• Lupine• Weichtiere (Schnecken, Muscheln, Kopffüßer)

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Erfahrungen aus der Praxis

• Untersuchung einer Produktionsstrasse

Herstellung von Haselnussschokolade

im Anschluss Herstellung von Mandelschokolade

→ Probennahme Ende Haselnussschokoladenproduktion bis Beginn Mandelschokoladenproduktion

→ Punkt 0 Abschluss Haselnuss

→ Punkt 1 Abschluss Ausschuss (Festlegung durch Hersteller)

→ Punkt 2 Fertigung Mandelschokolade

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1

10

100

1000

10000

100000

-1 0 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

Zeit der Probennahme [min]

DNA Kopien pro PCR-Ansatz

• dunkle Haselnuss-Schokolade

• dunkle Mandel-Schokolade Ausschuss

• dunkle Mandel-Schokolade 1. Ware verpackt

ca. 100 ppm

ca. 5 ppm

Erfahrungen aus der Praxis-Verschleppung von Haselnuss in der Schokoladenproduktion

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