Raffinose + Raffinase = Raffinade: Raffiniert!

190 © 2014 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim Chem. Unserer Zeit, 2014, 48, 190 – 199

Raffinose + Raffinase = Raffinade: Raffiniert!

DOI: 10.1002/ciuz.201400672www.chiuz.de

Meist hat der Volksmund ja recht: „JedesBöhnchen – ein Tönchen…“. Aber warum nursetzen uns Hülsenfrüchte derart unter Druck?Das liegt am reichlich enthaltenen Trisaccha-rid Raffinose. Für uns ist es unverdaulich, weilwir nicht über das Enzym α-Galactosidaseverfügen. So wird Raffinose zu einem gefun-denen Fressen für Darmbakterien, die sie ver-gären können, wobei aber Gase wie Methanentstehen. Raffinose steht über das EnzymRaffinase in enger Beziehung zu Saccharose,der weltweit in größter Menge durch Kristalli-sation gereinigten „Chemikalie“: 175 Mio.Tonnen/Jahr. Es ist der „Raffinade-Zucker“,den wir verzehren. Wir beschreiben Raffinosein der Welt der Saccharide, die Isolierung ausLupinensamen und alle analytischen Spektren.

Dieser Beitrag zurIsolierung undSpektroskopie vonNaturstoffen warGegenstand einerBachelor arbeit. Ersetzt die Arbeitenfort, die zu Kapitelnim Buch „Classicsin Spectroscopy“ von S. Berger undD. Sicker (Wiley-VCH 2009) führten.

S T EC K B R I E F R A F F I N OS E

β-D-Fructofuranosyl-O-α-D-galactopyranosyl-(1→6)-α-D-glucopyranosidSynonym: D-(+)-Raffinose, Melitose, Melitriose, GossyposeAus den Samen der Blauen Lupine Lupinus angustifolius L. (Fabaceae)C18H32O16, Molmasse 504,42 g/molCAS Registry Number: 512-69-6 Farblose Kristalle, Schmp. 80–82 °C (Pentahydrat)Spezifische Drehung [αD

20] = +105° (c = 100 mg/mL, H2O) für das Pentahydrat

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Abb. 1 Formelder Raffinose.

Abb. 2 Blaue Lupinen auf Island.

MARKUS WINKLER | KATRIN STEINKE | RAMONA OEHME | STEFAN BERGER | DIETER SICKER | HANS-ULLRICH SIEHL | KLAUS-PETER ZELLER*

Smauri war ein typischer Isländer mit einem Winterberufin einer Bank und einem Sommerjob in der Natur. Im

Sommer 2010, nach dem Ausbruch des Vulkans Eyjafjalla-jökull, lenkte er den Kleinbus als Reiseleiter schwungvollüber die noch mit feinster brauner Asche bedeckte Piste.„Hier werdet ihr über unser verschiedenes Blau staunenkönnen, das Wasser der heißen Blauen Lagune, das Glet-schereis vom Vatnajökull und etwas, das ihr bestimmt nichterwartet: Millionen blaue Lupinen!“ (Abbildung 2).

Ja, so eine hübsch anzusehende Monokultur kam wirk-lich unerwartet. Die endlosen Flächen voller Alaska-Lupinen(Lupinus nootkatensis) waren eine blaue Augenweide. Da-bei stammt die Pflanze gar nicht aus Island. Sie wurde im19. Jahrhundert als Neophyt aus Nordamerika eingeführt,um etwas gegen die Erosion des überweideten Landes zutun. Mit Erfolg! Aber so eine biologische Invasion hat eineKehrseite. Wo die Lupine wächst, hat Anderes keine Chan-ce. Woran liegt es, dass sie, wie alle Hülsenfrüchtler (Faba-ceae, syn. auch Leguminosae) eine Pflanze ist, die nichtleicht unterzukriegen ist? Sie hat ihre eigene „Stickstoff-versorgung“. Luftstickstoff spaltende Knöllchenbakterien,die in Symbiose an den Wurzeln leben, liefern ihr Ammo-niak im Austausch gegen Zucker.

Die bodenverbessernden Eigenschaften von Lupinenwaren schon in der Antike bekannt. Die UniversalgelehrteHildegard von Bingen erwähnt Lupinen im 12. Jahrhundertals „Feigbohnen“. Friedrich der Große, Herr über reichlichmagere Sandböden, bemühte sich 1781, die Lupine in Preu-ßen einzuführen, um die Bodenfruchtbarkeit der kargenSandböden zu verbessern. Dass das so klappen könnte, waraus Frankreich bekannt. Es scheiterte zunächst, da die vomMittelmeer stammende Weiße Lupine das raue Klima desNordens nicht vertrug. Erst mit dem Anbau der Gelben Bit-terlupine um 1860 wendete sich das Blatt. Lupinen warennun ein stickstoffliefernder Gründünger im Sinne der sichentwickelnden Agrikulturchemie. Auch unsere Landwirt-schaft nutzt heute Lupinen als Gründüngung, da sie bis zu100 kg Stickstoff / ha liefern können.

Allen Hülsenfrüchtlern, dazu zählen auch Erbsen, Lin-sen, Bohnen und Bäume wie der Goldregen (Bohnenbaum,Abbildung 3), die Robinie (Silberregen) oder die Glyzinie(Blauregen, Abbildung 4), verleiht diese reiche Stickstoff-versorgung gemeinsame Merkmale. Das sind zum einenproteinreiche Samen – kein Wunder bei der Möglichkeit,reichlich Aminosäuren aus Ammoniak herstellen zu kön-nen – und zum anderen auch giftige Alkaloide, wie das Cy-tisin des Goldregens, das Spartein des Besenginsters odergiftige Lektine, wie bei Robinie und Glycinie. Lektine alsKohlenhydratstrukturen erkennende und bindende Pro-teine können für uns giftig sein, da sie z.B. rote Blutkör-perchen verklumpen und Gefäße verstopfen lassen kön-nen. Wer sich Bohnen kocht, tut das eigentlich, um sie zuentgiften, Kochen desaktiviert die Lektine der roh giftigenBohnen.

Und noch etwas ist den Hülsenfrüchtlern gemeinsam.Sie haben, was ihre Kohlenhydrate angeht, einen anderen

Energiespeichermodus als Pflanzen wie Mais, Weizen oderKartoffeln, die Stärke bilden. Sie speichern stattdessen Mit-glieder der Raffinose-Familie. Mit denen haben wir danntrotz des Kochens zu kämpfen. Denn Blähungen nach demEssen von Erbsen oder Bohnen bekommen wir z.B. durchdas Trisaccharid Raffinose. Das ist ein für uns unverdauli-ches Kohlenhydrat, also ein Ballaststoff, um den es in die-sem Kapitel geht.

Zu Bohnen siehe auch http://www.youtube.com/watch?v=QvpBBLn1Hn4 (Jan. 2014).

Raffinose wurde erstmals 1876 aus Melasse von Zu-ckerrüben gewonnen [1]. Melasse ist ein dunkelbrauner Zu-ckersirup, der bei der Raffination, also wörtlich übersetztder „Verfeinerung“ von Zucker, anfällt. Zucker meint hierexakt das Disaccharid Saccharose (Sucrose). Durch Raffi-nation wird Rohzucker zu kristallinem, raffiniertem Weiß-zucker, der nach der Zuckerartenverordnung den NamenRaffinade tragen darf. Während Saccharose exzellent was-serlöslich ist (fast 2 g in 1 ml Wasser bei Raumtemperatur)ist das bei Raffinose nicht der Fall, von ihr lösen sich nur50 mg in 1 ml Wasser. Raffinose hat auch nur ein Fünftelder Süßkraft von Zucker. Wichtiger aber ist: Raffinose störtbei der Gewinnung von Raffinade. Wir werden gleich se-hen, durch welchen eleganten Verfahrensschritt man sichheute ihrer entledigt.

Chem. Unserer Zeit, 2014, 48, 190 – 199 © 2014 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim 191

N AT U R S TO F F E I S O L I E R E N U N D C H A R A K T E R I S I E R E N R A F F I N O S Ewww.chiuz.de

Alle zwei Jahre lass nach der Ernte ruhen das Brachfeldund den ermüdeten Boden durch Liegen sich härten und stärken,hat sich gewandelt des Jahres Gestirn, so säe den gelbenSpalt dort, wo du Hülsenfrucht sonst mit rasselnder Schoteoder zierlicher Wicken Frucht und herbe Lupinenbargest, zerbrechliche Halme und dichte rauschende Büschel.

Publius Vergilius Maro (70–19 a. D.) Georgica, I, 71–76.

Abb. 3 Goldregen. Abb. 4 Blauregen (Glycinie).

Damals aber stieß man noch anderswo auf das neueSaccharid, z.B. in Samen der Baumwolle (Gossypium), wes-halb es auch Gossypose genannt wurde [2]. Der neue „Zu-cker“ erschien der Fachwelt ganz offensichtlich reizvoll,weswegen es nicht ohne persönlichen Ingrimm abging. Tol-lens zeigte 1885, dass Raffinose, Gossypose und Melitose(gefunden in Eucalyptus-Manna) identisch sind [3]. Verbit-tert beklagte sich Scheibler 1886, dass er als eigentlicherRaffinose-Entdecker zu gelten hätte [4] und versuchte, denTrivialnamen Melitriose durchzusetzen, was ihm aber nichtgelang. In einer umfassenden Untersuchung werden 1909als weitere Pflanzen, die bei der Hydrolyse Galactose erge-ben, u.a. Erbsen, Bohnen und Lupinen genannt. Das ist dererste Hinweis auf Raffinose in Lupinensamen (Abbildung 5)[5].

Raffinose ist eine Kombination von drei der vier wich-tigsten in der Natur vorkommenden Hexosen, nämlich D-Glucose, D-Fructose und D-Galactose, nur die ebenfalls häu-fige D-Mannose ist nicht darin enthalten. Das Schema derRaffinose-Oligosaccharid-Familie (RFO) Raffinose, Stachyo-se, Verbascose, Ajugose und höhererHomologer zeigt, dass es sich um zu-nehmend galactosylierte Saccharo-sen handelt (Abbildung 6). Diese Oli-gosaccharide ersetzen in bestimmtenPflanzen Stärke als Speicherkohlen-hydrat. Dass nicht Saccharose, son-dern Mitglieder der Raffinose als Photosyntheseprodukte durch dasPhloem, das Gefäßleitbündel derPflanzen, transportiert werden, istfür viele Pflanzenfamilien typisch.

Was hat es nun mit der im Titelerwähnten Raffinase auf sich? In derRaffination des Zuckers aus Zucker-rüben reichert sich Raffinose im Zu-

ckersirup an und wird zu einem Störenfried bei der Kris-tallisation der gewünschten Saccharose. Was ist dagegen zutun? Heute wird ein biotechnologischer Trick genutzt.Durch ein immobilisiertes hydrolytisches Enzym, das dieFähigkeiten einer α-Galactosidase hat, wird von Raffinosedie Galactose abspalten. Dabei entsteht weitere Saccharo-se. Das Enzym heißt Raffinase (EC Nr. 3.2.1.22). Es wird gen-technologisch gewonnen oder es ist Teil eines nichtpatho-genen Schimmelpilzes (Morteriella vinacea), dessen Prä-parationen mit dem Zuckerrübensaft gleich zu Beginn derZuckergewinnung gerührt werden, um alle Raffinose kom-plett abzubauen: Eine raffinierte Sache! Die anfallende Ga-lactose wird im weiteren Verfahren chemisch abgebaut undstört nicht, die Melassemenge sinkt, die Zuckerausbeuteund damit die Produktivität steigen.

Galactose abspalten …? War da nicht noch was? WennSie sich beim Lesen dieser Zeilen an lactosefreie Milch er-innert fühlen, so liegen Sie richtig. Bei ihrer Herstellung

wird für diejenigen etwa 10 % un-serer Bevölkerung, die als Erwach-sene lactoseintolerant sind und denMilchzucker Lactose nicht mehr sowie die Kinder spalten können, dieLactose in der Milch durch das im-mobilisierte Enzym Lactase, eine β-Galactosidase, gespalten. Die Milchwird vor dem Verkauf sozusagen„partiell“ vorverdaut.

Werfen wir nun einen Blick aufdie Biosynthese von Sacchariden derRaffinose-Familie. Pflanzenzellensynthetisieren im Calvin-Zyklus derPhotosynthese in den Chloroplastenzunächst Glycerinaldehyd-3-phos-



Abb. 5 Süßlupi-nensamen, ausdenen die Raffi-nose isoliert wurde.

Nach wenigen Augenblicken war ein leises, leises Rauschen zu ver-nehmen, fast wie wenn ein Luftzug durch den Wald streicht. DiesesGeräusch näherte sich und fand sein Ende gerade vor der Buche,hinter welcher Samuel Barth steckte. Dann flüsterte Jemand in englischer Sprache und mit amerikanischem Jargon:»Jetzt riecht man es deutlich.«»Ja,« antwortete eine andere, ebenso leise Stimme. »Man machtsich einen Braten.«»Wovon?«»Hm! Der Geruch ist mir fatal. Ich glaube, man findet ihn nur da,wo gewisse Thiere, von deren Verstand man nicht viel hält, mit Lupinen gefüttert werden.«»Also Schaf?«»Ja, gewiß.«»Ich bin derselben Ansicht. Aber, höre, mir kommt die Geschichteverdächtig vor. Schaffleisch im Urwalde!«»Es ist gestohlen.«»Natürlich! Wir haben es also mit Dieben zu thun.«»Vielleicht mit noch schlimmeren Leuten.«»O, es können auch Greenhorns sein!«

Karl May: Deutsche Herzen – Deutsche Helden. 3. Der Fürst derBleichgesichter – Kapitel 2

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n = 0: Saccharosen = 1: Raffinosen = 2: Stachyosen = 3: Verbascosen = 4: Ajugose

A B B . 6 D I E R A F F I N OS E- FA M I L I E

phat und Dihydroxyacetonphosphat als direkte Produkteder CO2-Fixierung und -Reduktion. Diese können in Chlo-roplasten zu Stärke als Polysaccharidgemisch umgesetztoder ins Cytosol gebracht werden. Dort entstehen zunächstdie beiden Hexosevorstufen für Saccharose, nämlich Fructo-se-6-phosphat und UDP-Glucose als aktivierte Glucose. DasEnzym Saccharose-phosphat-Synthase katalysiert dann dieKondensation beider Hexose-Bausteine zu Saccharose-6-phosphat. Am Ende spaltet das Enzym Saccharose-phosphat-Phosphatase das Phosphat ab, und es liegt Saccharose vor.Dieses nichtreduzierende Disaccharid ist strukturell stabil.Es kommt nicht, wie bei Glucose, Lactose oder Maltose alsreduzierenden Zuckern, zu einer reversiblen cyclischen Hal-bacetal-Bildung mit verschiedenen Konstitutions- und Ste-reoisomeren. Damit liegt intermediär auch keine Aldehyd-form vor. Anders gesagt, Saccharose ist chemisch stabiler alsdie genannten reduzierenden Zucker. Offenbar prädesti-niert sie das als Transportform. Gleiches gilt für Raffinose,die als substitutierte Saccharose in Lösung ebenso struktu-rell fixiert ist und nicht tautomerisiert.

Raffinose und die höheren Mitglieder der Raffinose-Fa-milie entstehen nun durch aufeinanderfolgende Galactosy-lierungen (Abbildung 7). So setzt Raffinose-Synthase, eineGalactinol-Saccharose-6-galactosyltransferase, Saccharosemit dem Galactose-Donor Galactinol (und nicht etwa UDP-Galactose!) zu Raffinose um. Aus Raffinose entstehen dannalle höheren Mitglieder der RFO durch aufeinanderfolgen-de Galactosylierung(en) mittels Stachyose-Synthase, einerGalactinol-Raffinose-6-galactosyl-transferase, und wiederumGalactinol als Galactose-Quelle. Galactinol ist 3-O-α-D-Ga-lactopyranosyl-D-myo-inositol, ein Glykosid aus D-Galacto-se und einem Stereoisomeren des Cyclohexanhexols, das imZuge der Galactosylierung frei wird. Die Galactose wird da-bei stets α-1,6-glykosidisch übertragen.

Was macht die Essbaren unter den Hülsenfrüchten fürden Menschen so interessant? Sie enthalten deutlich mehrEiweiß als Getreidekörner. Seit Jahrtausenden stellen sie soeine deutlich preiswertere Proteinquelle als Fleisch dar, dasfür die einfache Bevölkerung überall ein Luxusgut war, undin vielen Teilen der Welt noch ist. Das war in Lateinameri-ka bekannt (Bohnen!), ebenso in Indien (Linsen!) und inEuropa (Erbsen!). Es ist auch heute die Proteinbasis für Ve-

getarier. Die Gehalte der Samen an Proteinen und Kohlen-hydraten in Prozent sind laut wikipedia (Eintrag: Hülsen-früchtler) etwa so: Bohnen, reif (25/50), Erbsen, reif(23/53), Linsen (26/53), Sojabohnen (34/27) und Lupinen38/25.

Tatsächlich sind Lupinen, aus deren Samen wir Raffi-nose isoliert haben, nicht nur hübsche Blumen sondernauch von Interesse als Tierfutter und sogar für die mensch-liche Ernährung. Zur Gattung Lupinen gibt es zwei geogra-fisch zuzuordnende Untergattungen mit hunderten von Ar-ten. In Europa und Afrika kennt man z.B. die Weiße, die Gel-be und die Blaue Lupine. In Amerika, dem anderenVerbreitungsgebiet, kommen z.B. die Anden-Lupine und dieAlaska-Lupine vor.

Das interessante Inhaltsstoffprofil ist es, das die Kör-nerleguminosen zum Gegenstand aktueller Forschungmacht, die nach den physiologischen Wirkungen und einermöglichen Anwendung sucht [6]. Die Gesellschaft zur För-derung der Lupinen (GFL) kümmert sich um die Nutzungund Züchtung dieser Pflanzen [7a]. Es gab auch ein EU- finanziertes Forschungsprojekt Healthy-Profood [7b], indem „wirtschaftlich wettbewerbsfähige Verfahren zur Vor-bereitung von Proteinisolaten aus Lupinen entwickelt“ wur-den. „Dabei wurden die optimalen technologischen, sen-sorischen und nährstoffbezogenen Eigenschaften von Lupinensamen sichergestellt.“ Es ist gewiss sinnvoll, Neuesfür die Ernährung zu suchen. Bei allem Verständnis für einegewisse Lupinen-Euphorie kann man sich aber über Sätzein einem projektnahen Flyer wie „Lupinen und Lupinen-produkte gehören traditionell zur menschlichen Ernährung“



GalactinolSaccharose

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Raffinose

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nur wundern, denn das ist mit Sicherheit nicht so. Es konn-te gar nicht so sein! Auch heute sollte niemand bedenken-los die Samen seiner Lupinen aus dem Garten essen. So ein-fach ist die Sache nämlich nicht.

Problematisch für alle, die Lupinen-Produkte essen wol-len, sind zwei Aspekte. Der erste ist: Es dürfen keine Alka-loide enthalten sein, die giftig sind. Lupinen können aberals Fraßschutz bis zu 4% Alkaloide enthalten, wie das Chi-nolizidin-Alkaloid Lupinin [8] und Lupanin, das das 2-Oxo-Derivat des bekannten Sparteins ist, welches im Besen-ginster vorkommt (Abbildung 8). Auch Bitterstoffe und Tri-terpene wie Lupeol sind in Essbarem unerwünscht.

Durch Züchtung gelang es in den 1920er Jahren sehr al-kaloidarme Sorten der Gelben Lupine zu selektieren. Die Ar-beit an diesen Süßformen wurde nach 1945 vor allem inAustralien fortgesetzt. Solche essbaren Süßlupinen mögendie meisten von uns noch als exotisch ansehen. Aber manbaut sie auch bei uns an (seit 1997 auch die ersten bitter-stoffarmen Sorten der Blauen Lupine), und das auf immer-hin ca. 40.000 ha, was einer Ernte von ca. 100.000 TonnenLupinensamen entspricht. Davon werden etwa 10 % als pro-teinreiche Lebensmittelzusatzstoffe verwendet. Die Haupt-menge wird als Tierfutter eingesetzt. Australien dagegenerntet jährlich schon über 1 Mio. Tonnen.

Der zweite zu beachtende Aspekt ist tückischer – unddamit rechneten wohl die wenigsten, die Lupinen als Nah-rungsmittel propagieren. Die Erfahrung zeigt, dass auch mitallergischen Reaktionen mancher Menschen auf Lupinen-eiweiß in Lebensmitteln gerechnet werden muss. DieseKehrseite der Medaille darf nicht vernachlässigt werden.Lesen wir, was das Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR)2011 dazu schreibt [9]: „Lupinen sind als Gartenblumen be-kannt. Die Hülsenfrucht wird aber auch als Zusatz in ver-schiedenen Speisen verwendet. Sie enthält viel Eiweiß, wes-wegen sie gern in Speisen für Milcheiweißallergiker undVegetarier verarbeitet wird. Lupinenmehl eignet sich zu-dem für die Herstellung von glutenfreien Backproduktenund Mahlzeiten für die Ernährung von Zöliakie-Patienten,die in Getreide vorkommendes Gluten nicht vertragen. Indiesen Produkten ist Lupine als Zutat deklariert. Die Samender gezüchteten Süßlupine haben günstige ernährungs-physiologische Eigenschaften. Sie sind kalorienarm und mi-

neralstoffreich, reich an Eiweiß und Ballaststoffen sowiearm an verdaulichen Kohlenhydraten. Der Gehalt an Harn-säure bildenden Purinen ist bei Lupinen sehr gering, undsie sind cholesterinfrei. Bestimmte Eiweiße in Lupinen kön-nen allerdings allergische Reaktionen auslösen.“ Weiterheißt es: „Genaue Zahlen über die Häufigkeit der Verwen-dung von Lupinenprodukten liegen dem Bundesinstitut fürRisikobewertung nicht vor. Lupinenmehl, Lupineneiweiß-konzentrat, Lupinenkleie oder Lupinenballaststoffkonzen-trate werden für die Herstellung von glutenfreien Back-produkten und Mahlzeiten für die diätetische Behandlungvon Zöliakie-Patienten angeboten. Sie werden zahlreichenFertigprodukten wie Quark, Tofu, Würstchen, Flüssigwür-ze, Schnitzel, Bratlingen, Aufstrichen, Nudeln, Backwarenjeder Art, Kaffeeersatz zugesetzt, die überwiegend für Ve-getarier gedacht sind und in Reformhäusern angeboten wer-den. Bei diesen Fertigprodukten wird werbend hervorge-hoben, dass Lupine, anders als Sojabohnen, garantiert gen-technisch unverändert, gluten- und cholesterinfrei sowiepurinarm sei. Es wird auch behauptet, dass Lupine wenigerallergen als Soja sei und sich deswegen für die Ernährungvon Milcheiweiß- und Sojaallergikern eigne.“

Über reale Allergiefälle wird dies berichtet: „Bestimm-te Lupineneiweiße sind allergen. Lupineneiweiße, die Im-munglobuline E (IgE) binden können, sind vor allem in derγ -Conglutin- und α-Conglutin-Fraktion zu finden. Beide kön-nen Kreuzreaktionen mit Allergenen aus Sojabohnen, Erd-nüssen, grünen Bohnen und Erbsen aufweisen. Eine Sensi-bilisierung kann isoliert auftreten oder als Kreuzreaktionbei vorheriger Sensibilisierung gegen andere Hülsenfrüch-te.“ Das zu zitieren heißt nicht, Panik zu verbreiten, aberUmsicht ist bei neuen Nahrungsquellen wohl geboten. DasBfR kommt zu folgendem wohlabgewogenen Fazit: „Lupi-neneiweiß enthält nachweislich weitgehend hitzestabile all-ergene Eiweiße, die Kreuzreaktionen mit den Allergenen an-derer Hülsenfrüchte zeigen und zu Kreuzallergien führenkönnen. Daneben sind auch isolierte Sensibilisierungen undAllergien gegen Lupineneiweiß beschrieben. Auf die (…)seit 2006 bestehende besondere Kennzeichnungspflicht beiVerwendung von Lupinen und Lupinenerzeugnissen als Zu-tat zu Lebensmitteln wird hingewiesen.“



A B B . 9 L I N S E N U N D E R B S E N

„Du hast mich dieses Mal drangekriegt, Bübin; aber sieh dich vor;denn bei der ersten Wäsche wirst du mit eingeseift.“ Indem nun dieHexe so die Gelegenheit, Parmetella aufzufressen, wie mit Kerzensuchte, nahm sie eines Tages zwölf Säcke verschiedener Hülsen-früchte, als Erbsen, Kichern, Linsen, Wicken, Fisolen, Bohnen, Reisund Lupinen, mengte sie untereinander und sprach zu ihr: „Hiernimm diese Hülsenfrüchte, du schändliches Weibsbild, und lies siemir dergestalt aus, daß jede Fruchtart gesondert liegt; wenn duaber bis heute abend nicht fertig bist, so verzehre ich dich wie eineDreiersemmel.“ Die arme Parmetella setzte sich neben die Säckehin und sprach weinend: „O du lieber Gott, wie ist mir doch die gol-dene Wurzel zur Wurzel so großer Drangsal geworden; diesmal istes mit mir vorbei; und weil ich ein schwarzes Gesicht weiß gesehenhabe, wird mir jetzt dafür ganz schwarz vor den Augen.“

Giambattista Basile (1575–1632): Das Pentameron – Kapitel 49

Fassen wir unser neu gewonnenes Lupinen-Wissen zu-sammen. Lupinensamen enthalten wie auch Bohnen, Erb-sen oder Linsen (Abbildung 9) reichlich Proteine, was fürLeguminosen kein Wunder ist. Dieser Proteinreichtummacht sie für neue Anwendungen in der Lebensmittelher-stellung interessant, speziell für Menschen mit Zöliakie, diedas Klebereiweiß Gluten aus Getreide nicht vertragen. Lu-pinen enthalten außerdem als Speicher-Kohlenhydrate nichtStärke, sondern vorwiegend Oligosaccharide aus der Raffi-nose-Familie [10]. Wenn wir solche Kohlenhydrate zu unsnehmen, dann sind Blähungen unvermeidlich. Das liegt da-ran, dass wir nicht, wie der eingangs erwähnte Schimmel-pilz über eine α-Galactosidase verfügen, die bei der Ver-dauung der Raffinose als erste Reaktion Galactose abspal-ten kann. So wird Raffinose zu einem „gefundenen Fressenfür Darmbakterien“, die sie anaerob vergären können, wo-bei aber leider Gase wie Methan entstehen. Wir geraten un-ter Druck. – Wie raffiniert ist es da, dass unsere Raffinadeaus der Zuckertüte dank Raffinase gänzlich frei von Raffi-nose ist.

Das 1H NMR-Spektrum des Trisaccharids Raffinose ist inAbbildung 10 gezeigt und lässt sofort die Signale der beidenanomeren Protonen H-1 sowie H-1' links vom Wassersignalerkennen. Beide zeigen eine geringe J-Kopplung von 3,9bzw. 3,8 Hz, und dies beweist entsprechend der Karplus-gleichung die äquatorielle Stellung dieser beiden Protonen.Durch Vergleich mit dem Spektrum der Sucrose darf mandas Signal bei δH = 5,42 H-1 der Glucose und das Signal beiδH = 4,21 mit der großen Kopplung von 8,9 Hz dem ProtonH-3'' der Fructose zuweisen. Damit verbleibt für das Signalbei δH = 4,98 H-1' der Galactose übrig. Alle anderen Signa-le der Raffinose erscheinen auf engem Raum von nur 0,6 ppm zwischen δH = 4,1 und 3,5. Trotzdem ist die NMR-Spektroskopie in der Lage, eindeutige Zuordnungen durch-zuführen. Dies gelingt durch die selektive TOCSY-Technik,bei der jeweils ein separates Proton selektiv angeregt wirdund dann die Magnetisierung entlang einer ununterbro-chenen Kopplungskette mittels eines Spin-Locks weiterge-leitet wird. Dieses Verfahren hat sich daher vor allem beiPeptiden und Kohlenhydraten etabliert und soll hier exem-

plarisch an den drei Bausteinen der Raffinose gezeigt wer-den.

Wir beginnen mit der Abbildung 11 und der Anregungvon H-1 der Glucoseeinheit. Die unterste Spur zeigt dasnormale Spektrum in diesem Bereich. Mit steigender Spin-Lock-Länge erscheinen die einzelnen Signale der Gluco-seeinheit, zunächst nur H-2, dann H-3, H-4, H-5 undschließlich H-6. Bei diesem letzten Signal ist zu bemerken,dass diese Methylengruppe im Gegensatz zur Sucrose hierin der Raffinose eine ausgeprägte Diastereotopie aufweist,da die CH2-Gruppe 6 noch mit der Galactoseeinheit ver-knüpft ist.



Wir wollen auf Erden glücklich sein, Und wollen nicht mehr darben; Verschlemmen soll nicht der faule Bauch Was fleißige Hände erwarben.Es wächst hienieden Brot genug Für alle Menschenkinder, Auch Rosen und Myrten, Schönheit und Lust, Und Zuckererbsen nicht minder.Ja, Zuckererbsen für jedermann, Sobald die Schoten platzen! Den Himmel überlassen wir Den Engeln und den Spatzen.

Heinrich Heine (1797–1856) aus „Deutschland. Ein Wintermär-chen“, Caput I

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Referenzierung auf DSS = 0.

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1H-NMR

A B B . 1 1 S E L E K T I V E S TO C S Y VO N R A F F I N OS E , A N R EG U N G VO N H - 1

In Abbildung 12 wird das Gleiche für die Galactoseein-heit wiederholt. Hier fällt auf, dass in der vierten Spur vonunten H-4' fast als Singulett erscheint, da H-4' sowohl zu H-3' wie auch zu H-5’ eine ea-Beziehung aufweist. Die jetztendständige CH2-Gruppe H-6 zeigt keine ausgeprägte Dia-stereotopie mehr.

Auch für die Fructoseeinheit gelingtdie Einzelzuordnung problemlos auf die-se Weise. Natürlich wird das Singulett vonH-1'' vom Spin-Lock nicht erreicht. Beidem zuletzt erscheinenden Signal derCH2-Gruppe H-6'' fällt auf, dass nur einesder beiden Protonen mit H-5'' koppelt,was eine konformative Aussage ermög-licht (Abbildung 13).

Nachdem hier mit einer einzigenTechnik alle Raffinoseprotonen zugeord-net werden konnten, können wir die Ana-lyse der 13C-NMR-Spektren in die sup-porting information verschieben, dadurch die festgelegten Protonenresonan-zen eine Zuweisung der 13C-Signale durch

das HSQC-Spektrumzwanglos folgt.

NMR-chemischeVerschiebungen für

Molekülstrukturen kön-nen mit quantenchemi-

schen Methoden als zweite Ableitung der Energie nach denKernkoordinaten und dem äußeren Magnetfeld berechnetwerden. Ausgehend von der durch Röngtenstrukturanalyse[17] bestimmten Kristallstruktur wurde die geometrischeStruktur von Raffinose mit der Dichtefunktional-Hybridme-thode B3LYP und einem triple ς Basissatz (TZVP) berech-net. Die berechnete Struktur (Abbildung 14) zeigt eine sehrgute Übereinstimmung mit der experimentell ermitteltenStruktur im Kristall. Die Vorzugskonformation von 6-glied-rigen Alicyclen wird bestimmt durch Minimierung der 1,3-diaxialen sterischen Wechselwirkung der Substituenten.In den Pyranosen wird diese durch günstige n→σ*-Wechsel -wirkung der antibindenden σ*-Orbitale der axialen α-O-gly-cosidischen Bindungen C1’-O- sowie C1-O- und den n-Elek-tronenpaaren der Pyranring-Sauerstoff-Atome kompensiert(anomerer Effekt).

Aus der berechneten Raffinose-Struktur wurden die mag-netischen Abschirmungstensoren mit der GIAO-Methode mitB3LYP/TZVP quantenchemisch berechnet. Die NMR-che-mischen Verschiebungen ergeben sich als Differenz zur denmagnetischen Abschirmungstensoren von Tetramethylsilan(TMS) (siehe supporting information, Zuordnungstabelle,Spalte 8). Der Vergleich der berechneten 13C-NMR-chemi-schen Verschiebungen mit den experimentell in D2O ge-messenen 13C-NMR-Verschiebungen zeigt für alle Signale Abweichungen in gleicher Richtung (~ +2 bis + 5 ppm). Lö-sungsmitteleffekte, H-Brückenbindungen und unterschied-liche Referenzierung wurden bei der Berechnung nicht be-rücksichtigt. Für ein Molekül mit 34 Atomen größer als Was-serstoff ergeben DFT-Rechnungen mit vertretbaremZeitaufwand somit recht gute Übereinstimmung mit den ge-

messenen experimentellen Daten. Deut-lich größere Abweichungen von den experimentellen Daten (bis zu 14 ppm)werden für die berechneten 13C-NMR-che-mischen Verschiebungen des energierei-cheren Konformationsisomeren mit β-gly-kosidischer Verknüpfung beobachtet.

Empirische Vorhersagen der 13C-NMRchemischen Verschiebungen mit demProgramm ChemBioDraw führen zwarauch zu befriedigenden Übereinstim-mungen mit den experimentellen Daten(siehe supporting information, Zuord-nungstabelle, Spalte 7). Solche Program-me berücksichtigen jedoch i. A. keineKonformationsisomerie.



4' 5' 3' 2' 6'

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1H-NMR

A B B . 1 2 S E L E K T I V E S TO C S Y VO N R A F F I N OS E , A N R EG U N G VO N H - 1 ’

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1H-NMR

3'' 4'' 5'' 6a'' 6b''

A B B . 1 3 S E L E K T I V E S TO C S Y VO N R A F F I N OS E , A N R EG U N G VO N H - 3 “

Abb. 14 Mit B3LYP berechnete3D Stereoformel von Raffinose.

Abb. 15 JungeLupinen -pflanze, ausden Samen von Abb. 5 im Frühjahr 2014gezogen.

Die experimentell gemessenen Verschiebungsdiffe-renzen für einzelne Signale sind z.T. kleiner als 1 ppm. Da-her ist nicht zu erwarten, dass quantenchemische Rech-nungen in allen Fällen die Reihenfolge der Signale richtigwiedergeben. Experimentelle NMR-Methoden zur Ver-schiebungskorrelation sind daher für die sichere Signal-zuordnung von Molekülen dieser Größenordnung uner-lässlich.

ESI-MassenspektrenDie Abbildung 16 zeigt das Elektrospray (ESI)-Massenspek-trum der Raffinose im positiven Modus. In diesem Spek-trum sieht man nur [M+Na]+-Ionen als Ergebnis der Solva-tisierung unabsichtlich vorhandener Spuren von Na+-Ionendurch Raffinose. Die sonst häufig zu beobachtende Proto-nierung zu [M+H]+-Ionen wird dadurch vollständig unter-drückt. Im negativen Modus bilden sich [M-H]–-Ionen, diedurch Deprotonierung einer der zahlreichen OH-Gruppenentstehen. Darüber hinaus werden Addukte der Raffinosemit unterschiedlichen Anionen [M+A]- beobachtet (s. sup-porting information).

Da die ESI-Massenspektrometrie stabile closed shell Io-nen liefert, ist es normal, dass im Falle der Raffinose keineFragment-Ionen auftreten. Zu Fragmenten gelangt man erstdurch Selektion der Quasi-Molekülionen, Stoßaktivierungund erneute Aufnahme eines Massenspektrums (MS/MSoder MS2).

In Abbildung 17 ist das MS2-Spektrum des [M-H]–-Ions(m/z = 503) der Raffinose abgebildet. HervorstechendesMerkmal ist der Verlust von zwei C6H10O5-Einheiten (Δm = 162) unter Bildung von m/z = 341 und 179. Im ers-ten Schritt entspricht dies der Abspaltung eines der beidenrandständigen Hexose-Resten durch Heterolyse der C-O-Bin-dung unter Lokalisierung der negativen Ladung am Di -saccharid-Fragment. Wie eine einfache Überlegung zeigt,

muss dazu die negative Ladung in der Raffinose an jenemHexose-Rest sitzen, der als neutrales Molekül abgespaltenwird.



A B B . 1 6 ESI-(+) MASSENSPEKTRUM DER RAFFINOSE A B B . 1 7 M S 2- E X PE R I M E N T N AC H I S O L AT I O N VO N [ M - H ] –

O

O

OH

HO

O

O

OH

HOHO

OH

O

OH

OH

OH

OH

O

H

−

OHO

HO

OH

O

OH

OH

OH

OH

O

O

O

O

OH

HO

OH

O

OH

HOHO

OH

O

O

OH

OH

OH

O

H

O

O OH

OH

HO

H−

O

O

OH

HO

OH

O

OH

HOHO

OHOA Bm/z = 341

O

OH

HO

O

OH

[M−H]−, m/z = 503

A B B . 1 8 D I SAC C H A R I D - A N I O N E N

Bildung von Disaccharid-Anionen (m/z = 341) aus [M-H]–- Ionen der Raffinose im MS2-Experiment.

Dies kann aber nicht die einzige Bedingung für die Bil-dung von Anionen mit m/z = 341 sein, denn nur durch dieheterolytische Spaltung der C-O-Bindung zum benachbartenZuckerrest kann kein stabiles Neutralteilchen austreten. Wiein Abbildung 18 ausgeführt, ist die Abspaltung von Δm =162 als Anhydroketose möglich, wenn die Deprotonierungentweder im Galactose- oder im Fructoseteil an der OH-Gruppe stattgefunden hat, die zum jeweiligen anomeren C-Atom benachbart steht. Jetzt kann in einer pinakolarti-gen Umlagerung unter 1,2-Hydridverschiebung und Elimi-nierung eines negativ geladenen Disaccharid-Fragments alsnucleofuge Abgangsgruppe eine Anhydroketose als stabilesNeutralmolekül entstehen. Wie in den Strukturformeln er-sichtlich, befinden sich das H-Atom und die nucleofugeGruppe zueinander in der für anionotrope Umlagerungenerforderlichen anti-Stellung.

Der Verlust eines zweiten Moleküls C6H10O5 aus Aund/oder B nach dem gleichen Mechanismus ist nicht oh-ne weiteres möglich, da das anionische Zentrum jeweils am„falschen“ O-Atom sitzt. Dieser Prozess wird nur möglich,wenn H+-Wanderungen, die für die C6H10O5-Eliminierunggeeigneten Anionen A',B' hervorbringen. Ausgehend von Bgibt es hierzu eine Alternative, denn hier kann der Gluco-

se-Baustein aus der cyclischen in die offenkettige Form über-gehen, aus der durch eine intramolekulare nucleophile Sub-stitution (SNi) ein neutrales Oxiran und ein Anion der Ga-lactose generiert werden können (Abbildung 19).

Das Anion bei m/z = 341 spaltet unter Stoßaktivierungaußer C6H10O5 auch H2O und zwei C2H4O2-Einheiten ab.Bei letzterem handelt es sich vermutlich um Glykolaldehydbzw. dessen Enol. In Abbildung 20 wird ein Vorschlag ge-macht, wie das Disaccharid Anion A' durch Cycloeliminie-rung zwei C2H4O2-Moleküle unter Bildung von m/z = 221verlieren kann. Dies ist aber nur eine von mehreren Mög-lichkeiten, wobei – wie das Auftreten eines Peaks bei m/z = 281 zeigt – auch zweistufige Fragmentierungen in Frage kommen.

Wie die vorstehende Diskussion zeigt, gibt es stets meh-rere Möglichkeiten, die bei der Stoßaktivierung des Anionsdes Oligosaccharids Raffinose erhaltenen Fragmente zu er-klären. Dies ist darin begründet, dass der Zucker aus dreiisomeren Hexosen aufgebaut ist, weshalb aus den Frag-mentmassen nicht erkennbar ist, welcher Strukturteil vonden Zerfallsprozessen betroffen ist. Dies gilt auch für dieStoßaktivierungen im positiven Modus. Interessanterweisefinden wir hier dieselben Massendifferenzen wieder, dieuns bereits in den ESI-minus-Spektren begegnet sind. Wiedies zu erklären ist, wird in der supporting information be-sprochen.

FragenA. Formulieren Sie die Oxo-Cyclo-Tautomerie von D-Glu-

cose und erklären Sie, was man unter Mutarotation ver-steht.

B. Wie kommt es, dass unter den Aldohexosen gerade D-Glucose, D-Mannose und D-Galactose die am häu-figsten natürlich vorkommenden Monosaccharide sind?Erklären Sie es strukturell.

C. Woran liegt es, dass unter diesen die D-Glucose der inder Photosynthese synthetisierte Zucker ist? ErklärenSie auch das strukturell.

D. Was unterscheidet einen reduzierenden von einemnicht reduzierenden Zucker? Womit weist man redu-zierende Zucker nach?

E. Was ist der Grund, dass die selektiven TOCSY-Spektrennur immer genau eine Zuckereinheit abbilden?

F. Die Reihenfolge der chemischen Verschiebungen deranomeren Kohlenstoffatome 1 und 1' ist genau umge-



O

O

OH

HO

OH

O

OH

HOHO

OHO

B

O

O

OH

HO

O

O

OH

HOHO

OHOH

B'

H− O

OH

HO

O

OH

O

OHOHO

OHOHm/z = 179

O

O

OH

HO

OH

O

OH

HOHO

OHO

OHO

HO

OHO

−

O

O

OH

HO

OH

OH

m/z = 179

m/z = 341

OHOHO

OH

O

OH

OH

OH

OH

O

O

A m/z = 341

OHOHO

O

O

OH

OH

OH

OH

O

OH

A'

H

O

OH

OH

OH

OH

O

OHOHO

O

OH

−

m/z = 179

A B B . 1 9

Alternative Wege zur Bildung von m/z = 179-Ionen aus m/z = 341.

OHOHO

O

O

OH

OH

OH

OH

O

OH

A'

H

OH

HO

O

OH+ + O

OH

OH

OH

OH

O

Om/z = 221

A B B . 2 0

Vorschlag zur Bildung des Anions bei m/z = 221.

kehrt wie die der zugehörigen anomeren Protonen 1und 1'. Warum?

G. Für die Aufnahme des ESI-minus-Massenspektrums wur-de eine Lösung der Raffinose in Methanol/Wasser ein-gesetzt. Wie ist es möglich, dass unter neutralen Bedin-gungen [M-H]–-Ionen durch Deprotonierung gebildetwerden?

H. Warum haben wir die neutralen Moleküle der Zusam-mensetzung C6H10O5, die bei der Fragmentierung derQuasi-Molekül-Ionen der Raffinose eliminiert werden,als Anhydroketosen bezeichnet?

ZusammenfassungRaffinose wurde aus den Samen der Blauen Süßlupine durchExtraktion mit 50% Ethanol gewonnen und über eine Kat-ionen-Austauschersäule sowie schließlich durch analytischeHPLC mit Hilfe eines RI-Detektors gereinigt. Alle analytischenSpektren sind vollständig entweder im Hauptteil oder in dersupporting information wiedergegeben. Die NMR- sowie dieMassenspektren werden eingehend interpretiert und mit theo-retischen Berechnungen der 13C chemischen Verschiebungenverglichen. Das Projekt stellt eine Fortsetzung des Buches„Classics in Spectroscopy“ von S. Berger und D. Sicker (Wiley-VCH 2009) dar.

SummaryRaffinose has been obtained by extraction with 50% ethanolfrom the seeds of the Sweet Blue Lupine and purified first viaa Cation exchange column and finally by analytical HPLC using a RI-detector. All analytical spectra were recorded andare reproduced either in the main part or in the supportinginformation. The NMR- and mass-spectra have been inter-preted and compared with theoretical calculations of the 13C chemical shifts. The project is a follow up of the recentbook “Classics in Spectroscopy” by S. Berger und D. Sicker (Wiley-VCH 2009).

SchlagwörterNaturstoffisolierung, Spektroskopie, Ab-initio-Berechnung,Raffinose

Literatur[1] D. Loiseau, „Note sur une classe de combinations homologues du

quinoile et de ses derives“, Comptes rendus hebdomadaires desséances de l’Académie des sciences 1876, 82, 1058–1060.

[2] H. Ritthausen, F. Weger, „Ueber Betain aus Pressrückständen derBaumwollsamen“ J. prakt. Chem. 1884, 30, 32–27, darin ist auf S. 37erwähnt, dass Prof. Böhm aus Marburg Gossypose aus diesenRückständen isoliert habe.

[3] B. Tollens, „Ueber Raffinose (Melitose?), eine hoch polarisirendeZuckerart aus der Melasse“, Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1885, 18, 26–28.

[4] C. Scheibler, „Beitrag zur Kenntnis der Melitriose (Raffinose), derenNachweis und quantitative Bestimmung neben Rohrzucker“, Ber.Dtsch. Chem. Ges. 1886, 19, 2868–2874.

[5] E. Schulze, C. Godet, „Untersuchungen über die in den Pflanzen -samen enthaltenen Kohlenhydrate“, Hoppe-Seyler’s Zeitschrift fürphysiologische Chemie 1909, 61, 279–351.

[6] K. Schulz, „Ernährungsphysiologische und biofunktionelle Wirkun-gen von Inhaltsstoffen einheimischer Körnerleguminosen (Erbse,Ackerbohne, Lupine)“, Bachelorarbeit, 2011, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg.

[7] a) Gesellschaft zur Förderung der Lupinen (GFL) homepage:http://lupinenverein.de/b) Healthy Profood, Kurzergebnis im Rahmen eines EU-Projektes„Verfahren zur Herstellung von Proteinisolaten aus Lupinen“,Mitteilung über den Informationsdienst CORDIS:http://cordis.europa.eu/result/brief/rcn/3711_de.html

[8] W. M. Golebiewski, I. D. Spenser, „Biosynthesis of the lupinealkaloids. I. Lupinine“, Can J. Chem. 1985, 63, 2707–2718.

[9] Allergie durch Lupineneiweiß in Lebensmitteln. AktualisierteStellungnahme Nr. 039/2011 des Bundesinstituts für Risikobewer-tung (BfR) vom 26.08.2011. siehe: http://www.bfr.bund.de/cm/343/allergie-durch-lupineneiweiss-in-lebensmitteln.pdf

[10] R. L. Obendorf, R. J. Gorecki, „Soluble carbohydrates in legumeseeds“, Seed Science Research 2012, 22, 2219–242.

[11] M. Muzquiz, C. Burbano, M. M. Pedrosa, W. Folkman, K. Gulewicz,„Lupins as a potential source of raffinose family oligosaccharides.Preparative method for their isolation and purification“ IndustrialCrops and Products 1999, 19, 183–188.

[12] P. Gulewicz, D. Ciesiolka, J. Frias, C. Vidal-Valverde, S. Frejnagel, K.Trojanowska, K. Gulewicz „Simple Method of Isolation and Purifica-tion of α-Galactosides from Legumes“ J. Agric. Food Chem. 2000, 48,3120–3123.

[13] C. Martianez-Villaluenga, J. Frias, K. Gulewicz, C. N. Vidal-Valverde„Improved Method To Obtain Pure α-Galactosides from LupinSeeds“ J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 6920–6922.

[14] K. Schwetlick, H. G. O. Becker, R. Bechert Organikum, Wiley-VCH,Weinheim, 2009.

[15] J. H. Bradbury, J. G. COLLINS „An approach to the structural analysisof oligosaccharides by NMR spectroscopy“ Carbohydrate Research1979, 71, 15–24.

[16] M. Forsgren, P.-E. Jansson, L. Kenne „Nuclear Magnetic ResonanceStudies of 1,6-Linked Disaccharides“ J. Chem. Soc. Perkin Trans. I1985, 2383–2388.

[17] H. M. Berman „The Crystal Structure of a Trisaccharide, RaffinosePentahydrate“ Acta Cryst.B 1970, 26, 290–299.

Die AutorenH.-U. Siehl, K.-P. Zeller und S. Berger studierten zusammen Chemie an derUniversität Tübingen in den Sechzigern des letzten Jahrhunderts. Alle dreiverbrachten Post-Doc-Jahre im Ausland und sind heute an den UniversitätenUlm, Tübingen und Leipzig tätig. D. Sicker studierte Chemie in Leipzig und isthier apl. Professor für Organische Chemie, sein besonderes Interesse gilt denNaturstoffen. M. Winkler war Student an der Universität Leipzig und isoliertebei S. Berger Raffinose im Rahmen seiner Bachelorarbeit. K. Steinke warChemielaborantin im ehemaligen AK Berger, R. Oehme ist Chemielaborantinin der Abteilung Massenspektrometrie des Instituts für Analytische Chemie.

KorrespondenzautorProf. Dr. Klaus-Peter ZellerInstitut für Organische Chemie, Universität TübingenAuf der Morgenstelle [email protected]



Raffinose + Raffinase = Raffinade: Raffiniert!

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