Relative und absolute Proteinquantifizierung in Bakterien

Relative und absolute Proteinquantifizierung

in Bakterien

Inauguraldissertation

zur

Erlangung des akademischen Grades

doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

vorgelegt von

Sandra Maaß

geboren am 14.05.1983

in Görlitz

Greifswald, den 23.01.2014

Dekan: Prof. Dr. Klaus Fesser (Universität Greifswald)

1. Gutachter: Prof. Dr. Dörte Becher (Universität Greifswald)

2. Gutachter: Prof. Dr. Andreas Tholey (Universität Kiel)

Tag der Promotion: 09.05.2014

“All das Zählen und Sortieren scheint der einzige Weg zu sein, um endlich die Frage zu

beantworten, deren Wichtigkeit gar nicht überschätzt werden kann.“

Gregor Mendel

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ....................................................................................................................... 5

Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................................ 11

Zusammenfassung .................................................................................................................... 13

1 Einleitung ........................................................................................................................ 17

1.1 Proteine - Funktionelle Grundbausteine der Zelle ........................................................... 17

1.2 Proteomanalyse durch 2D PAGE ..................................................................................... 18

1.3 Proteomanalyse durch Massenspektrometrie ................................................................... 19

1.4 Proteinquantifizierung ...................................................................................................... 21

1.5 Relative Proteinquantifizierung........................................................................................ 22

1.5.1 Relative Proteinquantifizierung durch 2D PAGE ........................................................22

1.5.2 Gelfreie relative Proteinquantifizierung durch Markierung von Peptiden ..................23

1.5.3 Gelfreie relative Proteinquantifizierung durch Spectral Counting ..............................24

1.6 Absolute Proteinquantifizierung ...................................................................................... 25

1.6.1 Ziele der absoluten Proteinquantifizierung ..................................................................25

1.6.2 Methoden zur absoluten Quantifizierung ....................................................................26

1.7 Umfassende absolute Proteinquantifizierung ................................................................... 28

1.8 Zielstellung der Arbeit ..................................................................................................... 31

2 Material und Methoden ................................................................................................. 32

2.1 Bakterienstämme .............................................................................................................. 32

Inhaltsverzeichnis

2.2 Wasser .............................................................................................................................. 32

2.3 Chemikalien ..................................................................................................................... 32

2.4 Medien.............................................................................................................................. 34

2.4.1 LB-Medium .................................................................................................................34

2.4.2 Minimalmedium für die Batchfermentation ................................................................34

2.4.3 M9-Minimalmedium für Hungerexperimente .............................................................36

2.4.4 Belitzky-Minimalmedium für Hitzestressexperimente ................................................37

2.5 Verbrauchsmaterialien ..................................................................................................... 38

2.6 Geräte ............................................................................................................................... 38

2.7 Computerprogramme ....................................................................................................... 39

2.8 Methoden zum Arbeiten mit bakteriellen Zellen ............................................................. 40

2.8.1 Stammhaltung ..............................................................................................................40

2.8.2 Zellkultivierung und Probennahme .............................................................................40

2.8.3 Zellaufschluss ..............................................................................................................42

2.8.4 Bestimmung der Zellgröße ..........................................................................................43

2.9 Methoden zur Proteinanalyse ........................................................................................... 43

2.9.1 Gewinnung von Proteinextrakten ................................................................................43

2.9.2 Proteinbestimmung ......................................................................................................44

2.9.3 Eindimensionale Gelelektrophorese (1D PAGE) ........................................................45

2.9.4 Quantitative Western Blots ..........................................................................................47

2.9.5 Zweidimensionale Gelelektrophorese (2D PAGE) ......................................................48

2.9.6 Massenspektrometrische Analysen ..............................................................................52

Inhaltsverzeichnis

3 Ergebnisse und Diskussion............................................................................................. 60

3.1 Gelfreie relative Proteinquantifizierung durch Spectral Counting .................................. 60

3.2 Optimierung der Probenvorbereitung für die absolute Proteinquantifizierung ................ 60

3.3 Umfassende absolute Quantifizierung durch Kalibration von 2D Gelen ......................... 63

3.3.1 Gelbasierte absolute Quantifizierung zur Untersuchung der generellen

Stressantwort in Bacillus subtilis .................................................................................73

3.3.2 Gelbasierte absolute Quantifizierung zur Untersuchung der spezifischen

Glukosehungerantwort in Bacillus subtilis ..................................................................81


Hitzestressantwort in Bacillus subtilis .........................................................................88

3.4 Umfassende absolute Quantifizierung mittels MSE ......................................................... 95

3.5 Zusammenfassung und Ausblick ..................................................................................... 97

4 Quellenangaben .............................................................................................................. 99

5 Publikationsliste ............................................................................................................ 114

5.1 Originalarbeiten und Beiträge der Autoren .................................................................... 114

5.2 Poster .............................................................................................................................. 116

5.3 Vorträge auf internationalen Tagungen.......................................................................... 116

Anhang ..................................................................................................................................... 117

Abkürzungsverzeichnis


Folgende Abkürzungen finden im einleitenden Teil dieser Arbeit häufige Verwendung:

2D zweidimensional, analog 1D für eindimensional

APS Ammoniumperoxodisulfat

ATP Adenosintriphosphat

B. subtilis Bacillus subtilis

B. pertussis Bordetella pertussis

CID collision-induced dissociation, kollisionsinduzierte Dissoziation

DNA deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure

DTT Dithiothreitol

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

ESI Elektrosprayionisation

GRAVY grand average of hydropathicity, Maß für die Löslichkeit eines Proteins

GTP Guanosintriphosphat

HPE High Performance Electrophoresis, Hochleistungselektrophorese

IEF isoelektrische Fokussierung

IPG immobilisierter pH-Gradient

LC liquid chromatography, Flüssigkeitschromatographie

MALDI matrix-assisted laser desorption ionisation, matrix-unterstützte

Laserdesorptionsionisation

MS Massenspektrometrie

MS/MS das Erzeugen von Fragmentionenspektren für die Proteinidentifizierung

NAD+/NADH oxidierte/ reduzierte Form von Nicotinamidadenindinukleotid

NADP+/NADPH oxidierte/ reduzierte Form von Nicotinamidadenindinukleotid-phosphat

OD optische Dichte

PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese

ppGpp Guanosin-3′,5′-bispyrophosphat

PTS Phosphotransferase System

Q1, Q2, Q3 Quadrupole in einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer

RNA ribonucleic acid, Ribonukleinsäure

RSC relative Spectral Counts

S. aureus Staphylococcus aureus


S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

SDS sodium dodecyl sulfate, Natriumdodecylsulfat

SRM Selected Reaction Monitoring, Messung ausgewählter Reaktionen

TEMED Tetramethylethylendiamin

TOF time of flight, Flugzeit

Zusammenfassung

13

Zusammenfassung

Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Etablierung von Methoden zur absoluten und

relativen Proteinquantifizierung. In darauf aufbauenden Studien sollten diese Methoden für die

Untersuchung physiologisch relevanter Fragestellungen in Bakterien genutzt werden.

Im Gegensatz zum statischen Genom ist das Proteom eines Organismus stark reguliert und dessen

Zusammensetzung je nach vorherrschender Umweltbedingung sehr variabel. Dabei ist es für die

Zelle entscheidend, welche Proteine an welcher Stelle in der Zelle in welchen Mengen vorliegen.

Zum tieferen Verständnis der Bakterienphysiologie ist es deshalb unabdingbar,

Mengenänderungen von Proteinen hochaufgelöst darstellen zu können. Relative

Proteinquantifizierung erlaubt dabei die Untersuchung von Änderungen der Menge eines Proteins

zwischen verschiedenen Proben eines Experiments. Im Rahmen der hier vorgelegten Arbeit

wurden 2D PAGE und gelfreie massenspektrometrische Methoden in einer Studie (Tefon et al.

2011, Artikel I) angewendet, um Oberflächen- und Immunoproteine zweier Vakzinationsstämme

des humanpathogenen Bakteriums Bordetella pertussis zu charakterisieren. Dabei konnten 226

Proteine gelfrei identifiziert werden, 45 weitere Proteine wurden mit Hilfe des 2D Gels

identifiziert. Spectral Counting erlaubte die Quantifizierung von 16 in den unterschiedlichen

Stämmen differentiell exprimierten Proteinen, von denen bisher nur einige als Virulenzfaktoren

beschrieben waren.

Die relative Proteinquantifizierung erlaubt zwar Rückschlüsse auf die Mengenänderung eines

Proteins zwischen verschiedenen Bedingungen, ermöglicht aber nur bedingt Aussagen über die

absolute Menge der Proteine. Gerade absolute Proteinmengen und damit Proteinkonzentrationen

sind jedoch Grundvoraussetzung für ein zielorientiertes Verwenden der gewonnenen Daten nicht

nur im Kontext der Systembiologie. Die bestimmten Proteinmengen erlauben Rückschlüsse auf

Stöchiometrien innerhalb verschiedener Proteinkomplexe und auf das Zusammenspiel von

Proteinen innerhalb eines metabolischen oder regulatorischen Netzwerkes. Außerdem sind diese

Zusammenfassung

14

Daten unerlässlich für ein erfolgreiches bioinformatisches Modellieren physiologischer

Zusammenhänge. Die so erstellten Modelle können zur Ableitung neuer Fragestellungen und

regulatorischer Beziehungen innerhalb der Bakterienphysiologie führen und so den Weg zu neuen

Erkenntnissen in der Biologie ebnen.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, in der durch Kombination zweier

etablierter Proteomik-Methoden die absolute Quantifizierung für einen großen Teil der

cytosolischen Proteine eines Organismus ermöglicht wird. In dieser Methode werden ausgewählte

Proteine, deren genaue Konzentration durch gerichtete Massenspektrometrie bestimmt wurde, für

die Kalibration von hoch auflösenden 2D Gelen genutzt (Maass et al. 2011, Artikel II). Um das

Potential dieses Verfahrens zu verdeutlichen, wurde es für die Analyse der Anpassung von

Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus an Glukosehunger angewendet. Dabei konnten für

467 Proteine von B. subtilis in drei Zeitpunkten Proteinkonzentrationen bestimmt werden. Für die

Etablierung der Methoden waren verschiedene Vorarbeiten nötig: I) Selektion geeigneter

Kalibrationsproteine, II) Selektion geeigneter Standardpeptide und Optimierung der

massenspektrometrischen Parameter zu deren absoluten Quantifizierung, III) Selektion eines

geeigneten, proteinunspezifischen und hoch sensitiven Gelfarbstoffes, IV) Testung verschiedener

Zellaufschlussmethoden und Etablierung einer Methode zur Bestimmung der

Zellaufschlusseffizienz, V) Testung verschiedener Proteinbestimmungsmethoden zur genauen

Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration im komplexen cytosolischen Extrakt und VI)

Optimierung der vollständigen enzymatischen Spaltung aller Proteine vor der

massenspektrometrischen Analyse.

Zur Überprüfung des Grades der Genauigkeit der neu entwickelten Methode zur absoluten

Proteinquantifizierung wurde die Bootstrap-Technik angewendet. Die unabhängige

Quantifizierung metabolischer Enzyme mittels der QCat-Technik und der Vergleich mit Daten,

die durch quantitative Western Blots generiert wurden, erlaubte die Bestimmung der Exaktheit der

Methode. Weitere Beweise für die Funktionalität des neuen Verfahrens lieferte die Analyse der

dynamischen Änderung des Proteinmusters in glukosehungernden Zellen von B. subtilis und

Zusammenfassung

15

S. aureus. Auch bekannte stöchiometrische Verhältnisse innerhalb von Proteinkomplexen dienten

als Anhaltspunkte für die Genauigkeit der neuen Methode.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass sich die Kalibration der 2D Gele

für die Ermittlung absoluter Daten zwischen Gelen übertragen lässt, was den Aufwand für große

Zeitreihenexperimente deutlich reduziert.

Die Genauigkeit und der dynamische Bereich 2D-gelbasierter relativer und absoluter

Proteinquantifizierung kann durch eine erhöhte Reproduzierbarkeit, Auflösung und Sensitivität

der Gele verbessert werden. Die Etablierung von HPE-Gelen führte zu 25 % mehr detektierbaren

und damit quantifizierbaren Proteinspots und Proteinen bei deutlich erhöhter Reproduzierbarkeit

(Moche et al. 2013, Artikel III). Die zusätzlich höhere Anzahl von Gelen mit quantifizierbarer

Qualität verringert außerdem den Zeit- und Kostenaufwand vor allem für komplexe

experimentelle Ansätze.

Die neue Methode zur gelbasierten absoluten Proteinquantifizierung wurde in einer Folgestudie

angewendet, um die Konzentrationen von mehr als 700 Proteinen von B. subtilis während der

physiologisch relevanten Anpassung an verschiedene Stressbedingungen, nämlich Glukosehunger

und Hitzestress, zu bestimmen (Maaß et al. 2014, Artikel IV). Der Vergleich der beiden

Stressbedingungen ermöglicht eine Unterscheidung der generellen von der spezifischen

Stressantwort, wobei die Analyse der Daten durch Berechnung der Proteinkosten und der

Ressourcenverteilung auf verschiedene metabolische Pfade und regulatorische Einheiten

unterstützt wurde. Innerhalb dieser Studie konnten Stöchiometrien glykolytischer Enzyme und der

Kernenzyme des Zitronensäurezyklus bestimmt werden. Unterschiedliche Abundanzen der

verschiedenen Enzyme eines metabolischen Weges deuten dabei auf zusätzliche Funktionen oder

abweichende Enzymaktivität einzelner Enzyme hin. Auch die generelle Stressantwort scheint

abhängig vom Stressfaktor unterschiedlich ausgeprägt zu sein. Während unter Glukosehunger die

Stringent Response die Anpassung des Proteinmusters beherrscht, wird die Hitzeantwort

hauptsächlich durch den alternativen Sigmafaktor σB gesteuert. Obwohl σB-abhängige Proteine

auch während des Glukosehungers transient induziert werden, werden sie nicht signifikant

Zusammenfassung

16

akkumuliert. Im Gegensatz dazu ist nach Hitze eine Anreicherung dieser Proteine deutlich

messbar.

Da die Nutzung von 2D PAGE zur Proteinquantifizierung auf im Gel detektierbare Proteine

beschränkt ist, ist es für eine höhere Proteomabdeckung sinnvoll, gelbasierte Methoden mit

gelfreien Methoden zu ergänzen. Deshalb wurde eine Methode zur labelfreien MS-basierten

absoluten Quantifizierung von Proteinen im großen Maßstab entwickelt und etabliert. In dieser

gel- und labelfreien Quantifizierungstechnik wurde datenunabhängige, parallele Fragmentierung

aller zeitgleich eluierenden Vorläufermoleküle (LC-MSE) genutzt. Auch für diese Methode der

absoluten Proteinquantifizierung bildeten die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten

Probenaufbereitungsverfahren die Grundlage (Muntel et al. 2014, Artikel V). Die Überprüfung

der Genauigkeit der Methode erfolgte durch unabhängige parallele absolute Quantifizierung

ausgewählter Proteine mit der AQUA-Methode.

In B. subtilis konnten so für 1.250 cytosolische Proteine unter zwei verschiedenen metabolischen

Bedingungen die absoluten Proteinmengen ermittelt werden. Diese erlaubten nicht nur die

Validierung der Anpassung der Proteinmenge durch bekannte regulatorische Netzwerke, sondern

auch die Berechnung der „Kosten“ für die Proteinsynthese in zellulären Prozessen und die

Analyse der Ressourcennutzung während der Adaptation an veränderte Umweltbedingungen.

Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit die Grundsteine für verschiedene gelbasierte und

gelfreie Methoden zur absoluten Proteinquantifizierung gelegt. Dabei wurden die Verfahren zur

Probenaufarbeitung für eine umfangreiche absolute Proteinquantifizierung entwickelt, optimiert

und etabliert. Darüber hinaus wurde eine Methode zur gelbasierten absoluten

Proteinquantifizierung entwickelt und verifiziert, die Anwendung bei der Untersuchung

physiologisch relevanter Stresssysteme fand. Durch die entwickelten Methoden können nun

qualitativ hochwertige Daten generiert werden, die für eine systembiologische Verwendung

geeignet sind. Schon jetzt ermöglichen die bestimmten Proteinkonzentrationen die Berechnung

von Proteinkosten und die Analyse der Verteilung und Nutzung zellulärer Ressourcen und

erlauben so einen neuen, tieferen Einblick in die Physiologie von Bakterien.

Einleitung

17

1 Einleitung

1.1 Proteine - Funktionelle Grundbausteine der Zelle

Alle biologischen Systeme sind durch das Zusammenspiel von DNA, RNA, Proteinen und

Metaboliten charakterisiert. Im Gegensatz zum statischen Genom, der Gesamtheit aller Gene eines

Organismus, kann sich die Zusammensetzung des Proteingemisches einer Zelle unter

verschiedenen Umweltbedingungen ändern.

Die Erforschung von Proteinen begann im Wesentlichen 1975 mit der Einführung der

zweidimensionalen Polyacrylamidgelelektrophorese (2D PAGE) (O’Farrell 1975; Klose 1975).

Zu dieser Zeit war die Zuordnung von Spots zu den entsprechenden Proteinen eines Organismus

nur durch N-terminale Proteinsequenzierung möglich (Edman et al. 1950; Niall 1973). Ein

deutlicher Fortschritt wurde durch die Verfügbarkeit milder Ionisierungsmethoden zur

massenspektrometrischen Identifizierung von Proteinen (Karas und Hillenkamp 1988; Hillenkamp

et al. 1991) und der Verfügbarkeit vollständiger Genomsequenzen erreicht (Fleischmann et al.

1995; Kunst et al. 1997; Venter et al. 2001). Der Ausdruck „Proteom“ für die Gesamtheit der

Proteine eines Organismus wurde 1995 etabliert (Wasinger et al. 1995; Wilkins et al. 1996).

Die Anzahl der Proteinspezies eines Proteoms kann aufgrund von posttranslationalen

Modifikationen oder alternativem Spleißen die Anzahl der Gene eines Genoms übersteigen.

Solche modifizierten und differentiell exprimierten Proteine bilden zusammen mit den

sogenannten Housekeeping-Proteinen die Grundlage für das Überleben der Zelle unter

veränderten Umweltbedingungen, da sie den Bauplan des Genoms in zelluläre Funktionen

übersetzen.

Das anfängliche Ziel der Proteomforschung war die Identifizierung und der damit verbundene

Nachweis der Expression möglichst vieler Proteine. Mittlerweile stehen aber deren Sequenz,

Struktur und Lokalisation genauso im Fokus wie ihre Modifikation, Synthese, Stabilität und

Einleitung

18

Aktivität. Von besonderem Interesse ist dabei, vor allem bei zeitaufgelösten Analysen und im

Kontext der Systembiologie, die Quantifizierung von Proteinen.

1.2 Proteomanalyse durch 2D PAGE

Das Prinzip der zweidimensionalen Polyacrylamidgelelektrophorese (2D PAGE) basiert auf der

Trennung eines Proteingemisches in Abhängigkeit vom isoelektrischen Punkt (pI) (1. Dimension)

und Molekulargewicht (2. Dimension) der darin enthaltenen Proteine. Dafür wird die Probe in der

ersten Dimension denaturiert, disaggregiert, reduziert und gelöst bevor die isoelektrische

Fokussierung (IEF) durchgeführt wird. Anschließend erfolgt die Trennung der Proteine in der

zweiten Dimension im Polyacrylamidgel. Durch Fixierung und anschließender Färbung mit einem

geeigneten Farbstoff werden die getrennten Proteine, die nun in Spots vorliegen, sichtbar

gemacht. Die qualitative und quantitative Auswertung der Gelbilder erfolgt computergestützt mit

Hilfe spezieller Computerprogramme. Parallel dazu kann Peptide Mass Fingerprinting

(PMF) (Pappin et al. 1993) mittels Matrix-unterstützter Laserdesorptionsionisations-

Massenspektrometrie (MALDI-MS) zur Identifizierung der einzelnen Proteinspots genutzt

werden.

Theoretisch eignen sich traditionelle, vertikale 2D Gele für Proteine mit einem Molekulargewicht

zwischen 10 und 150 kDa und einem GRAVY-Index von unter 0,3 (Eymann et al. 2004). Die

Verwendung von IEF-Streifen in einem pH-Bereich von 4-7 erlaubt also theoretisch die Trennung

von 1.544 cytosolischen Proteinen aus Bacillus subtilis und von 1.359 cytosolischen Proteinen aus

Staphylococcus aureus. Während Membranproteine aufgrund ihrer hohen Hydrophobizität bisher

generell nicht abbildbar sind, kann der pH-Bereich von 2D Gelen durch Nutzung angepasster

Chemikalien und Materialien für die IEF erweitert werden (z. B. pH 3-10).

Mittels verschiedener Färbungen sind im 2D Gel Proteinkonzentrationen mit einem dynamischen

Bereich von 3-4 Größenordnungen darstellbar, wobei ein Spot mit weniger als 1 ng Protein noch

detektierbar ist (Görg et al. 2004). Dies ist jedoch nicht für alle Anwendungen ausreichend, da

Einleitung

19

z. B. die Proteinkonzentrationen im menschlichen Blut einen dynamischen Bereich von

mindestens 9 Größenordnungen umfassen (Adkins et al. 2002).

Eine der großen Stärken der 2D PAGE ist die Darstellung von Proteinisoformen, die sich

aufgrund von Modifikationen in pI oder Molekulargewicht voneinander unterscheiden. Während

Änderungen des pI, z. B. durch Phosphorylierungen, eine horizontale Verschiebung des

Proteinspots verursachen, führen Modifikationen in der Masse des Moleküls, z. B. durch partielle

Proteolyse, zu einer vertikalen Positionsänderung.

Ein wichtiger Vorteil von 2D Gelen ist die nahezu vollständige Visualisierung der zentralen

Stoffwechselwege, die einen Überblick über das Geschehen in der Zelle ermöglicht und so die

Grundlage für weiterführende Experimente bildet. So können 2D Gele in Kombination mit

radioaktiver Markierung zur Untersuchung der Proteinsynthese und –stabilität genutzt werden

(Bernhardt et al. 1997; Gerth et al. 2008).

Einen häufigen Schwachpunkt stellt dagegen die Reproduzierbarkeit der Trennung in den

2D Gelen dar. Die Einführung von DIGE (differential gel electrophoresis) sowie die fortlaufende

Verbesserung von Materialien und Chemikalien für die Gelpräparation haben dieses Problem

jedoch deutlich vermindert.

Zusammenfassend liegen die Stärken der 2D PAGE also nicht in der Identifizierung möglichst

vieler Proteine, sondern v. a. darin, einen quantitativen Blick auf interessante biologische Prozesse

oder Proteinmodifikationen werfen zu können (Rabilloud 2002). Vor allem die Limitation der

2D PAGE bei der Darstellung von Proteinen mit Extremen in Molekulargewicht, pI und

Hydrophobizität führen jedoch dazu, dass in der Proteomanalyse vermehrt gelfreie, auf

Massenspektrometrie basierende Techniken Anwendung finden.

1.3 Proteomanalyse durch Massenspektrometrie

Die Entwicklung milder Ionisierungsmethoden wie der Elektrosprayionisation (ESI) und der

Matrix-unterstützten Laserdesorptionsionisation (MALDI) in den 1980er Jahren ermöglicht die

Einleitung

20

Anwendung der Massenspektrometrie (MS) in der Proteomanalyse. Heute wird die

MS für die Proteinidentifizierung (Kühner et al. 2009; Becher et al. 2009; Schrimpf et al. 2009)

und -sequenzierung (Küster et al. 2001; Oshiro et al. 2002) ebenso genutzt wie für relative

(Bantscheff et al. 2012; Otto et al. 2012) und absolute (Ishihama et al. 2005b; Malmström et al.

2009) Quantifizierung von Proteinen, die Untersuchung von posttranslationalen Modifikationen

(Mann und Jensen 2003) und Protein-Protein-Interaktionen (Rappsilber et al. 2000; Ashman et al.

2001).

Der übliche Arbeitsablauf für die Proteomanalyse mittels Massenspektrometrie beginnt mit einer

optionalen Trennnung des Proteingemisches einer Zelle. Dabei können die Proteine einzelner

subzellulärer Fraktionen angereichert oder nach ihren physikochemischen Eigenschaften selektiert

werden. Die Proteine werden dann mit einer spezifischen Protease (wie z. B. Trypsin) verdaut.

Nach weiteren optionalen Fraktionierungen des Peptidgemisches findet i. d. R. eine

Flüssigkeitschromatographie (LC) statt, bevor die ionisierten Moleküle im MS analysiert werden.

Die Auswertung der erzeugten Daten erfolgt computergestützt mit Hilfe geeigneter Software.

Bei massenspektrometrischen Proteomuntersuchungen mit dem Ziel der Expressionsanalyse gibt

es hauptsächlich zwei Vorgehensweisen: die sogenannte Shotgun Proteomics und die

zielgerichtete (targeted) Analyse (Maiolica et al. 2012). Shotgun Proteomics ermöglicht Aussagen

über die Probenkomplexität, den dynamischen Bereich der Menge sowie relative und absolute

Häufigkeiten identifizierter Proteine, ohne diese vor dem Experiment zu kennen. Dafür werden im

ersten Schritt, dem sogenannten Übersichtsscan, die Masse-zu-Ladungs-Verhältnisse (m/z-Ratios)

der Peptide bestimmt. Daraus werden anschließend Peptidionen intensitätsabhängig selektiert,

isoliert und fragmentiert. Das entstandene Fragmentionenspektrum (MS2) kann zur

Sequenzbestimmung und Identifizierung des Peptids bzw. Proteins genutzt werden.

Bei der Methode der zielgerichteten MS-Analyse wird nur ein vordefiniertes Set von Peptiden

identifiziert und analysiert. Die am weitesten verbreitete Technik ist dabei das Selected Reaction

Monitoring (SRM). Dieser Ansatz nutzt die Fähigkeit von Triple-Quadrupol-

Massenspektrometern, als Ionenfilter zu wirken. Im ersten Quadrupol (Q1) werden die Peptide mit

Einleitung

21

den gesuchten Massen selektiert und anschließend in Q2 fragmentiert. Die entstandenen

Fragmentionen werden in Q3 analysiert (Abb. 1). Für die zielgerichtete MS werden bereits vor

Messbeginn genaue Kenntnisse über den Ladungszustand, die chromatographische Retentionszeit

und die relative Produktionenintensität benötigt (Lange et al. 2008; Picotti und Aebersold 2012).

Abb. 1: Selected Reaction Monitoring (SRM). Molekülionen eines spezifischen Analyten werden in Q1

selektiert und in Q2 fragmentiert. Spezifische Fragmentionen des Zielanalyten (Übergang) werden in Q3

selektiert und an den Detektor weitergeleitet. Die Anzahl der Fragmentionen wird über die Zeit

aufgezeichnet, was zu einem SRM-Chromatogramm für jeden Übergang führt.

1.4 Proteinquantifizierung

Die Untersuchungen umfangreicher Datensätze von Transkripten, Proteinen oder Metaboliten

einer Zelle erfordert nicht nur die qualitative Analyse der zellulären Prozesse, sondern macht eine

quantitative Bewertung der Änderung eben dieser Bausteine notwendig. Nur durch hoch sensitive

Quantifizierung können kleine Änderungen im Transkriptom, Proteom oder Metabolom detektiert

und Ergebnisse statistisch abgesichert werden. Darüber hinaus ermöglicht die Verfügbarkeit

quantitativer Daten, die verschiedenen Anpassungen an veränderte Bedingungen qualitativ und

quantitativ in einen Kontext zueinander zu bringen.

Gelbasierte Methoden für die Proteinquantifizierung stützen sich auf die Trennung des

Proteingemisches in einem SDS Gel (ein- oder zweidimensional) und der quantitativen

Markierung der Proteine durch Radioaktivität oder geeignete Farbstoffe. Im Gegensatz dazu

werden die Proteine bei gelfreien Methoden nach einer optionalen Vorfraktionierung mit Hilfe der

Massenspektrometrie analysiert und die quantitative Information aus den Massenspektren

Einleitung

22

extrahiert. Die Proteinquantifizierung kann hierbei mit Hilfe von chemischer, enzymatischer oder

metabolischer Markierung oder zugesetzten markierten Protein- oder Peptidstandards erfolgen.

Eine weitere Möglichkeit ist die labelfreie Quantifizierung, die entweder auf der Anzahl der

zugeordneten Massenspektren oder der Intensität der Vorläuferionen basiert (Abb. 2).

Abb. 2: Methoden der Proteinquantifizierung. Stark vereinfachte Übersicht über gelbasierte und gelfreie

Methoden der Proteinquantifizierungen.

1.5 Relative Proteinquantifizierung

1.5.1 Relative Proteinquantifizierung durch 2D PAGE

Die Charakterisierung und Identifizierung von Proteinen mit Hilfe von 2D Gelen wurde vor

Jahrzehnten eingeführt und unterliegt bis heute weiteren Entwicklungen (Bossinger et al. 1979;

Lipkin und Lemkin 1980; Aittokallio et al. 2005).

Die Kombination von 2D PAGE, MALDI-MS und hochentwickelter Gelanalysesoftware, wie

z. B. Delta2D (DECODON GmbH, Greifswald), erlaubt aufgrund der hohen Auflösung und

Sensitivität die zeitgleiche Identifikation und Quantifzierung hunderter Proteine und ermöglicht so

einen umfangreichen Überblick über das zentrale Stoffwechselgeschehen in der Zelle. In einem

Standard-2D Gel von B. subtilis können derzeit mit traditionellen Verfahren mindestens 700

Proteine identifiziert werden (Eymann et al. 2004), was eine Quantifizierung und damit das

Erstellen von Expressionsprofilen für jedes dieser Proteine erlaubt.

Einleitung

23

Um Proteine mittels 2D PAGE quantifizieren zu können, muss zunächst ein digitales Bild des

Gels erzeugt werden, in dem die quantitativen Informationen der Spots erhalten bleiben (Berth et

al. 2007; Bandow et al. 2008). Beim anschließenden Warping der Bilder werden Laufunterschiede

zwischen verschiedenen Gelen ausgeglichen. Im nächsten Schritt kann ein Fusionsgel erstellt

werden, das eine repräsentative Proteinkarte für das gesamte Experiment darstellt (Luhn et al.

2003). Dieses Gelbild wird dann zur Spotdetektion genutzt. Die so erzeugten Konsensus-

Spotgrenzen können im Anschluss auf alle Gelbilder des Projekts übertragen werden. Im letzten

Schritt erfolgt die Extraktion quantitativer Daten innerhalb der Konsensus-Spotgrenzen durch

Graustufenintegration auf jedem Gelbild. Aus den so erhaltenen Werten können

Expressionsprofile erstellt werden, die die Grundlage für weitere Analysen, Identifikationen und

Interpretationen bilden.

Ordnet man nun den 2D Gelbildern verschiedener Bedingungen eine Falschfarbe zu, kann man

diese durch Dual Channel Imaging vergleichen und so Unterschiede im Proteomprofil auf eine

komfortable und zweckmäßige Weise sichtbar machen (Bernhardt et al. 1999).

Diese gut etablierte Technik wird in vielen Laboren standardmäßig eingesetzt, um die Quantitäten

von Proteinen relativ zu vergleichen.

1.5.2 Gelfreie relative Proteinquantifizierung durch Markierung von Peptiden

Die klassischen gelbasierten Methoden, bei denen die Proteinquantifizierung auf Färbung oder

Radioaktivität beruht, gewährleisten eine hohe Sensitivität und Linearität sowie einen großen

dynamischen Bereich der bestimmbaren Mengenänderungen. Gleichzeitig sind diese

Trennungstechniken aber auf dort abbildbare Proteine beschränkt und erlauben nicht zwangsläufig

Rückschlüsse auf die Proteinidentität.

Durch die Nutzung massenspektrometrischer Techniken können diese Beschränkungen in der

Zugänglichkeit ganzer Proteingruppen überwunden werden. Die dafür verfügbaren Methoden sind

jedoch nicht prinzipiell quantitativ, da die verschiedenen physikochemischen Eigenschaften von

proteolytischen Peptiden (u. a. Größe, Ladung, Hydrophobizität, Protonenaffinität) zu

Einleitung

24

Unterschieden in den Signalintensitäten von Proteinen gleicher Konzentration während der

massenspektrometrischen Analyse führen können.

Das am weitesten verbreitete Vorgehen zur Berücksichtigung dieser unterschiedlichen

Eigenschaften von Peptiden bei der gelfreien relativen Proteinquantifizierung beruht auf der

Einführung einer Markierung mit stabilen schweren Isotopen wie beispielsweise Wasserstoff,

Kohlenstoff, Stickstoff oder Sauerstoff. Nach dieser Markierung liegen Peptide vor, die chemisch

identische Eigenschaften im Vergleich zu unmarkierten, natürlich vorkommenden Peptiden

gleicher Aminosäuresequenz haben und so nahezu gleiche chromatographische und

massenspektrometrische Eigenschaften aufweisen. Solche Isopeptide können allerdings aufgrund

der Massendifferenz in der MS unterschieden werden, was eine Quantifizierung durch den

Vergleich der gemessenen Signalintensitäten der natürlichen und der zugegebenen markierten

Peptide erlaubt. Protein- bzw. Peptidmarkierungen mit stabilen Isotopen können metabolisch,

chemisch oder enzymatisch in die Probe eingebracht werden. Auch der Zusatz synthetischer

schwerer Peptide zu einem Peptidgemisch ist möglich. Je früher dabei die Zugabe der markierten

Proteine/Peptide zu den zu analysierenden Proteinproben erfolgt, desto früher können technische

Unterschiede während der Probenaufbereitung ausgeglichen werden, was die Genauigkeit der

Quantifizierung entsprechend erhöht.

1.5.3 Gelfreie relative Proteinquantifizierung durch Spectral Counting

Da die Markierung von Proteinen für die relative Quantifizierung nicht für jeden Organismus und

jede untersuchte Bedingung praktikabel ist und abhängig von den verwendeten Chemikalien teuer

sei kann, wurden labelfreie Methoden zur MS-basierten relativen Quantifizierung entwickelt.

Das Spectral Counting ist eine dieser Methoden. Sie basiert auf der empirischen Beobachtung,

dass die Anzahl der Fragmentionenspektren von Peptiden eines Proteins abhängig von dessen

Abundanz ist (Washburn et al. 2001; Liu et al. 2004). Durch den Vergleich der Anzahl dieser

Spektren innerhalb eines Datensets wird der relative Vergleich zwischen verschiedenen

Bedingungen ermöglicht.

Einleitung

25

Die Genauigkeit und Qualität der Quantifizierung ist im Wesentlichen von experimentellen

Parametern wie z. B. dem dynamischen Ausschluss von Ionen, die bereits für die Fragmentierung

selektiert wurden, der chromatographischen Peakbreite und der Scangeschwindigkeit des

Massenspektrometers (Liu et al. 2004) abhängig. Außerdem bestimmt die Länge eines Proteins,

wie viele seiner Peptide innerhalb des Massebereichs des Massenspektrometers detektierbar sind.

Da von kleinen Proteinen (< 20 kDa) statistisch weniger proteolytische Peptide messbar sind, ist

die relative Quantifizierung kleiner Proteine in der Konsequenz variabler als die von gleichen

Mengen größerer Proteine (Bantscheff et al. 2012). Darüber hinaus haben Old und Mitarbeiter

(Old et al. 2005) gezeigt, dass die Anzahl der für den Nachweis von geringen Änderungen in der

Proteinabundanz benötigten MS-Spektren exponentiell steigt. Gleichzeitig treten für höhere

Anzahlen von Spectral Counts Sättigungseffekte auf, die je nach Peptid unterschiedlich

ausgeprägt sein können. Dies beschränkt den dynamischen Bereich der Quantifizierung über

Spectral Counting. Ein Vergleich von Spectral Counting mit verschiedenen metabolischen und

chemischen Labelingtechniken ergab, dass die labelfreie Methode die höchste quantitative

Proteomabdeckung zeigt, während die Labelingansätze in Genauigkeit und Reproduzierbarkeit

überlegen sind (Li et al. 2012).

Dennoch gehört das Spectral Counting zu einer viel genutzten Methode, die in den letzten Jahren

häufig verbessert und für die Proteomanalyse von Mikroorganismen (Lu et al. 2007; Tefon et al.

2011; Li et al. 2012), Pflanzen (Weiss et al. 2010; Neilson et al. 2011), höheren Organismen

(Weiss et al. 2010; Gilchrist et al. 2006) und humanen Proben (Pang et al. 2002; Rao et al. 2009)

verwendet wurde.

1.6 Absolute Proteinquantifizierung

1.6.1 Ziele der absoluten Proteinquantifizierung

Relative Proteinquantifizierung ermöglicht den Vergleich von Proteinmengen zwischen zwei

Proben, indem abundanzbeschreibende Parameter der Proteine, wie Färbungsintensität oder

Einleitung

26

Anzahl der detektierten Massenspektren, zueinander ins Verhältnis gesetzt werden. Dies

ermöglicht die Berechnung der Änderung der Proteinmenge im Vergleich zwischen den Proben,

erlaubt jedoch nur bedingt Rückschluss auf das Mengenverhältnis der verschiedenen Proteine

innerhalb einer Probe.

Dagegen ermöglicht absolute Proteinquantifizierung die genaue Bestimmung der Konzentration

von Proteinen im komplexen Gemisch. Die Verfügbarkeit absoluter Proteinmengen als Anteil am

Gesamtprotein, als Konzentration oder als Molekülzahl in der Zelle ist Grundvoraussetzung für

die Nutzung der Daten im Kontext der Systembiologie. Die ermittelten Quantitäten ermöglichen

ein bioinformatisches Modellieren physiologischer Zusammenhänge, so dass die so erstellten

Modelle zur Ableitung neuer regulatorischer Beziehungen von Proteinen führen können.

Zusätzlich ermöglichen Daten zur Proteinabundanz Rückschlüsse auf Stöchiometrien innerhalb

verschiedener Proteinkomplexe und auf das Zusammenspiel von Proteinen innerhalb eines

metabolischen oder regulatorischen Netzwerkes. Die Verfügbarkeit von quantitativen

metabolischen Daten in Kombination mit Proteinkonzentrationen ermöglicht die Bestimmung von

Enzymeffizienzen ohne „klassische“ biochemische Methoden, die ohnehin nicht für jedes Enzym

verfügbar sind. Darüber hinaus erlaubt die zeitaufgelöste Bestimmung von absoluten

Proteinmengen die Berechnung von Proteinsyntheseraten auch ohne das zusätzliche

Vorhandensein von Daten, die in der Regel durch den Einsatz von radioaktiver Markierung

gewonnen werden.

1.6.2 Methoden zur absoluten Quantifizierung

Die derzeit angewendeten Techniken zur absoluten Proteinquantifizierung basieren im

Wesentlichen auf drei unterschiedlichen Prinzipien: I) Immunreaktionen durch die Verwendung

von Antikörpern, II) Markierung mit stabilen Isotopen, gekoppelt mit MS, III) radioaktive

Markierung.

Jahrelang waren ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, enzymgekoppelter

Immunadsoptionstest) bzw. quantitative Westernblots für die Bestimmung von absoluten

Einleitung

27

Proteinkonzentrationen das Mittel der Wahl. So wurde 2003 jedes offene Leseraster (engl. open

reading frame, ORF) der Hefe Saccharomyces cerevisiae mit einer hochaffinen Epitopmarkierung

versehen, die die Aufreinigung und Detektion des gesamten Hefeproteoms mit Hilfe von

spezifischen Antikörpern erlaubte (Ghaemmaghami et al. 2003). Für 75 % aller offenen Leseraster

konnten Genprodukte nachgewiesen werden, die Mengen von 50-1.000.000 Moleküle pro Zelle

umfassten. Wenig später wurde das Grundprinzip großer Bibliotheken mit Klonen für markierte

Proteine für die quantitative Einzelzellproteomik angepasst. Die Expression jedes Hefeproteins als

carboxyterminale GFP-Fusion (GFP = grün fluoreszierendes Protein) erlaubte die Quantifizierung

von 2.500 Proteinen auf Einzelzellebene (Newman et al. 2006). Die minimale Probenaufbereitung

in dieser Methode (es werden ganze Zellen vermessen) resultierte darüber hinaus in einer sehr

hohen Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Die Nachteile solcher globaler absoluter Immuntests

sind der hohe Zeitaufwand und die hohen Kosten, da für jedes quantifizierte Protein ein gesamtes

Experiment benötigt wird.

Deshalb wurden bald mit stabilen Isotopen markierte Standards für die absolute Quantifizierung

von Einzelproteinen verwendet. Die ersten Versuche zur Bestimmung absoluter Mengen eines

spezifischen Proteins durch MS unter Verwendung der Isotopen-Mischungs-Theorie wurden

bereits 1996 beschrieben (Barr et al. 1996). In jüngerer Zeit profitiert diese Idee vor allem durch

die schnelle Entwicklung von Massenspektrometern und neuen Technologien für die Analyse von

Proteomen. 2003 nutzen Gerber und Mitarbeiter (Gerber et al. 2003) mit schweren Aminosäuren

markierte proteotypische Peptide und gerichtete MS für die Untersuchung von posttranslationalen

Modifikationen humaner Proteine und prägten die Bezeichnung AQUA (absolute Quantifizierung)

für die von ihnen angewendete Methode. Da die markierten Peptidstandards synthetisch

hergestellt werden, lässt sich deren genaue Menge zuverlässig durch Aminosäureanalyse

bestimmen. Damit ermöglicht die Zugabe einer bekannten Menge von markiertem (schwerem)

Referenzpeptid zu einer Probe die absolute Quantifizierung des nativen (leichten) Peptids durch

Vergleich der MS-Signale beider Moleküle (Abb. 3). Um interne Standardpeptide aus dem

Zielprotein abzuleiten, sind Vorkenntnisse über dessen Aminosäuresequenz und

Einleitung

28

physikochemische Eigenschaften vonnöten. So müssen die gewählten Peptide im

Massenspektrometer detektierbar und für das untersuchte Protein einzigartig sein. Außerdem

sollten diese idealerweise keine Aminosäuren oder Aminosäurekombinationen enthalten, die

leicht modifizierbar sind. Zusätzlich sollten die verwendeten Peptide keiner anderen bekannten in

vivo Modifikation als der untersuchten unterliegen (Mayya et al. 2006; Malmström et al. 2007).

Abb. 3: Prinzip der AQUA-Methode. Das im ersten Schritt abgeleitete optimale tryptische Peptid wird

synthetisch hergestellt und dabei mit stabilen Isotopen markiert. Anschließend werden die

Probenaufbereitung und die MS-Methode für dieses Peptid (rot) optimiert. Im dritten Schritt werden die

nativen Proteine (blau) aus der biologischen Probe extrahiert und mit einer bekannten Menge synthetischem

AQUA-Peptid gemischt. Nach dem tryptischen Verdau und der MS-Analyse können MS-Signale beider

Moleküle verglichen werden, um die Konzentration des nativen (leichten) Peptids/Proteins zu bestimmen.

Abbildung adaptiert nach SIGMA-ALDRICH®.

1.7 Umfassende absolute Proteinquantifizierung

Die zuvor beschriebenen Methoden zur Bestimmung von Proteinkonzentrationen im komplexen

Gemisch sind auf einzelne Proteine beschränkt. Eine umfassende absolute Proteinquantifizierung

ist mit diesen Techniken aufgrund des hohen Arbeitsaufwandes und der enormen Kosten nur

schwer zu erreichen.

Aufgrund ihrer hohen Auflösung und großen Abdeckung von Enzymen zentraler

Stoffwechselwege eignet sich die traditionelle 2D Gelelektrophorese für die absolute

Proteinquantifizierung im großen Maßstab. 2009 nutzte eine französische Arbeitsgruppe

(Baudouin-Cornu et al. 2009) die radioaktive Markierung von Proteinen mit anschließender

Trennung durch 2D PAGE für die absolute Quantifizierung von 65 Proteinen des

Schwefelstoffwechsels der Hefe S. cerevisiae. Dafür wurden Methionin oder Methionin und

Cystein während der Kultivierung mit 35S radioaktiv markiert und der gewonnene Proteinextrakt

Einleitung

29

durch 2D PAGE aufgetrennt. Die zu quantifizierenden Spots wurden zusammen mit mehreren

Referenzspots zur Bestimmung des Hintergrunds aus dem Gel ausgeschnitten und deren

Radioaktivität bestimmt. Parallel dazu wurde die Spotintensität aller anderen Proteine mittels

Autoradiographie bestimmt. Unter der Annahme, dass die Radioaktivität jedes Spots direkt

proportional zur Proteinmenge (korrigiert für die Anzahl markierter Aminosäuren pro Protein) ist,

konnten absolute Proteinmengen für alle detektierten Spots bestimmt werden. Um mit dieser

Methode verlässliche quantitative Aussagen über die Gesamtmenge eines Proteins zu bekommen,

muss die radioaktive Markierung der Proteine ausreichend lang erfolgen um möglichst vollständig

zu sein. Dies und die umständliche Handhabung von Radioaktivität limitiert die Anwendung der

Methode.

Aufgrund der höheren Anzahl analysierbarer Proteine wurden in den letzten Jahren vermehrt auch

gelfreie, ausschließlich auf MS basierende Strategien für eine globale absolute Quantifizierung

entwickelt. Diese Verfahren vergleichen z. B. Proteinabundanzindizes, die die Anzahl der

sequenzierten Peptide pro Protein berücksichtigen (Ishihama et al. 2008), nutzen Spectral Counts

als Maß für die Proteinmenge (Lu et al. 2007) oder stellen die mittleren Ionenintensitäten der drei

höchstabundanten Peptide eines Proteins gegenüber (Silva et al. 2006).

Die letztgenannte labelfreie Quantifizierung von Proteinen wird aufgrund fehlender Zusatzkosten

und der einfachen Anwendung immer häufiger genutzt, um Proteome unterschiedlicher

Organismen ausführlich zu charakterisieren. Dabei spielt eine datenunabhängige MS-Methode,

bei der alternierende Spektren nach Gering- und Hochenergiekollisionen aufgenommen werden,

eine zunehmend wichtige Rolle. Bei dieser MS-Technik, die als MSE (E für engl.: elevated

energy, erhöhte Energie) bezeichnet wird, erfolgt die Fragmentierung aller Peptide ohne vorherige

Selektion von Vorläuferionen. So kann bei der Proteinidentifizierung ein niedrigeres

Detektionslimit bei gleichzeitig erhöhter Proteomabdeckung und größerem dynamischen Bereich

erreicht werden. Für die Zuordnung der Fragmentionenspektren zu ihren Vorläufermolekülen ist

jedoch ein spezieller Alignmentalgorithmus notwendig, der das m/z-Ratio und die Retentionszeit

für die Zuweisung identischer Komponenten nutzt (Silva et al. 2005). Die Notwendigkeit der

Einleitung

30

Verwendung der Elutionscharakteristik für die Zuordnung von Fragmentionen zu ihren

Vorläuferionen macht eine reproduzierbare LC für die Proteinquantifizierung unabdingbar.

Für die Bestimmung von Proteinmengen mittels MSE werden die Peakflächen der drei

höchstabundanten Peptide eines Proteins integriert. Die absolute Proteinquantifzierung erfolgt

dann durch den Vergleich der Summe der Peakflächen der drei höchst abundanten Peptide eines

Proteins mit der Peakflächensumme der drei höchst abundanten Peptide eines Standardproteins,

das in bekannter Menge zur Probe gegeben wurde. Von besonderer Bedeutung ist dabei die

Balance zwischen niedrigenergetischem Übersichtsscan für die Quantifizierung und

hochenergetischen Fragmentionenspektren für die Identifizierung von Proteinen. Im Anschluss an

ein solches MS-Experiment erfolgt die Datenbanksuche unter Nutzung von Algorithmen zur

Bilanzierung von Ionen (Li et al. 2009).

MSE als Aufnahmemodus ist bisher nur für Quadrupol-TOF-Massenspektrometer der Firma

WatersTM verfügbar (Neilson et al. 2011). Dabei verfügen die neuesten Modelle der SYNAPT®-

Reihe über eine hohe Auflösung bei der exakten Messung von komplexen Daten (Blackburn et al.

2010b).

Die Vorteile von MSE wurden bisher vor allem für die Analyse geringabundanter Proteine

genutzt, die mit datenabhängigen MS-Aufnahmemodi nicht identifiziert werden konnten

(Blackburn et al. 2010a). Während die Fragmentionenspektren abundanter Proteine nach

datenabhängiger und datenunabhängiger Messung vergleichbar sind, zeigen die

Fragmentionenspektren gering abundanter Proteine nach der datenunabhängigen Fragmentierung

eine höhere Qualität. Die rekonstruierten Fragmentionenspektren sind außerdem sauberer als die

Spektren, die nach herkömmlicher datenabhängiger Dissoziation aufgenommen werden, da

Kontaminationen durch gering abundante Vorläuferionen bei der Datenanalyse nach MSE ihren

richtigen Vorläufermolekülen zugeordnet werden.

Die Nutzung von MSE erhöht die Intensität im Übersichtsscan im Vergleich zu datenabhängigen

MS-Methoden signifikant, da bei datenabhängigen MS-Akquisitionsmethoden die meiste Zeit

innerhalb eines Scanzyklus auf das Erzeugen von Fragmentionen verwendet wird. Eine höhere

Einleitung

31

Intensität der Vorläuferionen bewirkt eine Erhöhung der absoluten Anzahl detektierbarer

Fragmentionen und somit gleichzeitig eine Verbesserung des Signal-zu-Rauschen-Verhältnisses

auf Vorläufer- und Fragmentionenebene (Geromanos et al. 2009). Zusätzlich ist für das

datenunabhängige Aufzeichnen von Massenspektren eine höhere Reproduzierbarkeit zwischen

technischen Replikaten und eine höhere Sequenzabdeckung bei der Proteinidentifizierung

beschrieben (Blackburn et al. 2010b; Patel et al. 2009).

1.8 Zielstellung der Arbeit

Ziel dieser Arbeit war es, die gut etablierte 2D gelbasierte Methode zur relativen

Proteinquantifizierung als Grundlage für die Entwicklung, Optimierung und Anwendung einer

Strategie zur umfassenden absoluten Proteinquantifizierung zu nutzen. Dazu sollte nicht nur eine

neue Methode entwickelt und validiert werden, sondern auch viele bestehende grundlegende

Techniken, wie z.B. der tryptische Verdau vor der massenspektrometrischen Analyse, an die

Anforderungen der absoluten Quantifizierung angepasst werden. Ziel der anschließenden Studien

war es, die gelbasierte umfassende absolute Proteinquantifizierung für die Untersuchung

physiologisch relevanter Fragestellungen zu nutzen, um einerseits das Potenzial dieser Methode

abschätzen zu können und andererseits neue Einblick in die Baktereinphysiologie zu erhalten.

Material und Methoden

32

2 Material und Methoden

2.1 Bakterienstämme

Tab. 1: Übersicht über die verwendeten Bakterienstämme.

Stammbezeichnung Genotyp Referenz

Bacillus subtilis 168 trp+

Jules et al. 2009

Bacillus subtilis BSG112 168 trp+ spoIVCB::erm Maass et al. 2011

2.2 Wasser

In dieser Arbeit wurden folgende Wasserqualitäten verwendet: I) Reinstwasser aus der

Aufbereitungsanlage der Fa. Grünbeck, im Folgenden a. dest. genannt, II) destilliertes a. dest. aus

dem Wasserdestilliergerät der Fa. Marienfeld, hier a. bidest. genannt und III) Reinstwasser

AriumProUV von Sartorius (Göttingen).

2.3 Chemikalien

Tab. 2: Übersicht über die verwendeten Chemikalien.

Chemikalie Hersteller

Acetonitril AppliChem, Darmstadt, GER

Acrylamid AppliChem, Darmstadt, GER

Ameisensäure AppliChem, Darmstadt, GER

Ammoniumbicarbonat Fluka AG, Buchs, CH

Ammoniumchlorid Fluka AG, Buchs, CH

Ammoniumsulfat Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

APS (Ammoniumperoxodisulfat) Sigma-Aldrich, Steinheim, GER

Bisacrylamid AppliChem, Darmstadt, GER

Bromphenolblau Sigma-Aldrich, Steinheim, GER

BSA (Bovines Serumalbumin ) Sigma-Aldrich, Steinheim, GER

Calciumchlorid Fluka AG, Buchs, CH

CDP-Star Roche Diagnostics, Rotkreuz, CH

CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)-

dimethylammonio]-1-propane sulfonate) Merck KGaA, Darmstadt, GER

Cobalt(II)chlorid Fluka AG, Buchs, CH


33

Tab. 2: fortlaufend.


Coomassie Brilliantblau G-250 Sigma-Aldrich, Steinheim, GER

Diethanolamin AppliChem, Darmstadt, GER

Dikaliumhydrogenphosphat Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

Dinatriumhydrogenphosphat Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

DTT (Dithiothreitol) GE Healthcare, Chalfont St Giles, UK

EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)-

Dinatriumsalz AppliChem, Darmstadt, GER

Eisen(III)chlorid Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

Eisensulfat Serva Electrophoresis, Heidelberg, GER

Essigsäure Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

Ethanol Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

Ethylenglykol Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

Flamingo Bio-Rad Laboratories GmbH, München, GER

Formaldehyd Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

Glukose Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

Glutaminsäure Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

Glycerin Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

Glycin Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

Harnstoff Merck KGaA, Darmstadt, GER

Iodacetamid Sigma-Aldrich, Steinheim, GER

Kaliumcarbonat Sigma-Aldrich, Steinheim, GER

Kaliumchlorid Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

Kaliumdihydrogenphosphat Merck KGaA, Darmstadt, GER

Krypton Thermo Fisher Scientific, Bremen, GER

Kupferchlorid Merck KGaA, Darmstadt, GER

Kupfersulfat Sigma-Aldrich, Steinheim, GER

LB Broth Base Invitrogen, Carlsbad, CA, USA

L-Malat Merck KGaA, Darmstadt, GER

LysC Wako Chemicals GmbH, Neuss, GER

Magnesiumsulfat Merck KGaA, Darmstadt, GER

Manganchlorid Merck KGaA, Darmstadt, GER

Mangansulfat Merck KGaA, Darmstadt, GER

Mercaptoethanol Merck KGaA, Darmstadt, GER

Methanol Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

monoklonales anti-Kaninchen IgG Sigma-Aldrich, Steinheim, GER

Nanoquant-Lösung Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

Natriumacetat Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

Natriumazid AppliChem, Darmstadt, GER

Natriumcarbonat Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

Natriumchlorid Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

Natriumcitrat Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

Natriumdihydrogenphosphat Merck KGaA, Darmstadt, GER

Natriumhydroxid Sigma-Aldrich, Steinheim, GER

Natriummolybdat Sigma-Aldrich, Steinheim, GER


34



Natriumsulfat Merck KGaA, Darmstadt, GER

Natriumthiosulfat Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

Ninhydrin Sigma-Aldrich, Steinheim, GER

ortho-Phosphorsäure Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

Pharmalyte 3-10 GE Healthcare, Chalfont St Giles, UK

Polypropylenglykol P2000 Sigma-Aldrich, Steinheim, GER

RapiGest Waters, Milford, MA, USA

Reinstwasser für MALDI-Analysen Sartorius, Göttingen, GER

Salzsäure Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

SDS (sodium dodecyl sulfate,

Natriumdodecylsulfat) AppliChem GmbH, Darmstadt, GER

Silbernitrat Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

TCEP (Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

TEAB (Triethylammoniumbicarbonat) Sigma-Aldrich, Steinheim, GER

TEMED (Tetramethylethylendiamin) AppliChem GmbH, Darmstadt, GER

Thioharnstoff Merck KGaA, Darmstadt, GER

Trifluoressigsäure AppliChem, Darmstadt, GER

Tris Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

Trypsin Promega, Madison, USA

Trypsin-Aktivierungspuffer Promega, Madison, USA

vorgefärbter Größenstandard für 1D PAGE Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GER

Zinkchlorid Sigma-Aldrich, Steinheim, GER

Zinksulfat Merck KGaA, Darmstadt, GER

Zinnchlorid Sigma-Aldrich, Steinheim, GER

α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure Bruker, Bremen, GER

2.4 Medien

2.4.1 LB-Medium

Für dieses Medium wurden 20 g/l LB Broth Base in a. bidest gelöst und der pH mit NaOH auf 7,5

eingestellt. Für die erforderliche Sterilität wurde das Medium bei 121 °C autoklaviert.

2.4.2 Minimalmedium für die Batchfermentation

Dieses Medium wurde für die Batchfermentationen im Rahmen des Big Experiment als Teil des

SysMo-Projektes verwendet, die in der Arbeitsgruppe von Prof. Reuss an der Universität Stuttgart

durchgeführt wurde. Die Ergebnisse dieser Experimente flossen in die Publikation mit dem Titel


35

„Efficient, global-scale quantification of absolute protein amounts by integration of targeted mass

spectrometry and two-dimensional gel-based proteomics“ ein (Artikel II; Maass S, Sievers S,

Zühlke D, Kuzinski J, Sappa PK, Muntel J, Hessling B, Bernhardt J, Sietmann R, Völker U,

Hecker M, Becher D. 2011. Anal Chem 83: 2677–2684).

Supplementiertes Minimalmedium: 1,4 M Na2SO4 * 10 H2O

84 mM K2HPO4

44 mM Glukose * H2O

25 mM NaH2PO4 * 2 H2O

20 mM (NH4)2SO4

19 mM NH4Cl

2 mM MgSO4 * 7 H2O

0,3 mM CaCl2 * 2 H2O

2,4 µM Na2MoO4 * 2 H2O

3 ml Spurensalze-Stammlösung pro l Medium

in a. bidest.

pH 7,0

Spurensalze-Stammlösung: 62 mM FeCl3 * 6 H2O

54 mM Na2EDTA

0,75 mM CoCl2 * 6 H2O

0,69 mM CuSO4 * 5 H2O

0,63 mM ZnSO4 * 7 H2O

0,59 mM MnSO4 * H2O

in a. bidest.

MgSO4 (Stammlösung 1 M), Spurensalze und Glukose waren nicht Teil des Grundmediums und

wurden erst beim Vorbereiten des Mediums zugegeben. Das Grundmedium sowie die

Stammlösung von MgSO4 und die Spurensalze wurden zum Sterilisieren bei 121 °C autoklaviert.

Glukose (Stammlösung 20 % [w/v]) wurden sterilfiltriert.


36

2.4.3 M9-Minimalmedium für Hungerexperimente

Die Ergebnisse der Experimente mit diesem Medium flossen in die Publikation mit dem Titel

„Absolute protein quantification of stress and starvation responses in Bacillus subtilis“ ein

(Artikel IV; Maaß S, Wachlin G, Bernhardt J, Eymann C, Fromion V, Riedel K, Becher D,

Hecker M. 2014. Mol Cell Proteomics, in Revision [MCP/2013/035741]).

Supplementiertes M9-Minimalmedium: 0,1 % (w/v) Glukose

0,1 % (w/v) L-Malat

47 mM Na2HPO4 * 2 H2O

22 mM KH2PO4

19 mM NH4Cl

8,5 mM NaCl

1 mM MgSO4 * 7 H2O

0,1 mM CaCl2 * 2 H2O

10 ml Spurensalze-Stammlösung pro l Medium

1 ml Eisenchlorid-Citrat-Lösung pro l Medium

in a. bidest.

pH 7,0

Eisenchlorid-Citrat-Lösung: 100 mM Natriumcitrat * 2 H2O

50 mM FeCl3 * 6 H2O

in a. bidest.

Spurensalze-Stammlösung: 1 mM ZnCl2

0,5 mM MnCl2 * 4 H2O

0,25 mM CuCl2 * 2 H2O

0,25 mM CoCl2 * 6 H2O

0,25 mM Na2MoO4 * 2 H2O

in a. bidest.


37

MgSO4 (Stammlösung 1 M), CaCl2 (Stammlösung 100 mM), Spurensalze, Glukose, L-Malat

sowie Eisenchlorid und Citrat waren nicht Teil des Grundmediums und wurden erst beim

Vorbereiten des Mediums zugegeben. Das Grundmedium sowie die Stammlösungen von MgSO4

und CaCl2 wurden zum Sterilisieren bei 121 °C autoklaviert und alle weiteren Supplemente

sterilfiltriert.

2.4.4 Belitzky-Minimalmedium für Hitzestressexperimente

Die Ergebnisse der Experimente mit diesem Medium flossen in die Publikation mit dem Titel

„Absolute protein quantification of stress and starvation responses in Bacillus subtilis“ ein

(Artikel IV; Maaß S, Wachlin G, Bernhardt J, Eymann C, Fromion V, Riedel K, Becher D,

Hecker, M. 2014. Mol Cell Proteomics, in Revision [MCP/2013/035741]).

Supplementiertes Minimalmedium: 50 mM Tris

27 mM KCl

15 mM (NH4)2SO4

8 mM MgSO4 * 7 H2O

7 mM Natriumcitrat * H2O

4,5 mM Glutaminsäure

2 mM CaCl2 * 2 H20

0,6 mM KH2PO4

10 µM MnSO4 * 4 H20

1 µM FeSO4* 7 H20

0,2 % (w/v) Glukose

pH 7,5

in a. bidest.

CaCl2, KH2PO4, FeSO4, MnSO4, Glukose und Glutaminsäure waren nicht Teil des Grundmediums

und wurden erst beim Vorbereiten des Mediums zugegeben. Das Grundmedium sowie die


38

Stammlösungen von KH2PO4 und CaCl2 wurden zum Sterilisieren bei 121 °C autoklaviert und

alle weiteren Supplemente sterilfiltriert.

2.5 Verbrauchsmaterialien

Tab. 3: Übersicht über die benutzten Verbrauchsmaterialien.

Verbrauchsmaterial Hersteller

Blotmembran Immobilion Transfer

Membran Millipore Corporation, Billerica, MA, USA

Eppendorf-Reaktionsgefäße Eppendorf, Hamburg, GER

Eppendorf-Reaktionsgefäße Prelubicated Sorenson BioScience Inc., Salt Lake City, UT, USA

Glasperlen (Durchmesser: 0,1-0,11 mm) Sartorius, Göttingen, GER

IPG-Streifen (pH 4–7) Amersham Bioscience, Uppsala, SWE

Mikroeinsatz für MS-Vials VWR, Hannover, GER

Mikrotiterplatten Greiner, Frickenhausen, GER

Photometer-Küvetten Sarstedt, Nümbrecht, GER

Pipettenspitzen (1 ml) Sarstedt, Nümbrecht, GER

Pipettenspitzen (2,5 µl) Biozym, Hessisch Oldendorf, GER

Pipettenspitzen (200 µl) Sarstedt, Nümbrecht, GER

Stammhaltungsröhrchen Sarstedt, Nümbrecht, GER

Zentrifugenröhrchen Sarstedt, Nümbrecht, GER

2.6 Geräte

Tab. 4: Übersicht über die verwendeten Geräte.

Gerätebezeichnung Hersteller

1D Gelelektrophoresekammern Bio - Rad Laboratories GmbH, München, GER

2D Gelelektrophoresekammern Genomic Solutions, Cambridgeshire, UK

Blotapparatur, Mini Trans Blot Bio - Rad Laboratories GmbH, München, GER

Brutschrank, Heraeus B-12 Thermo Fisher Scientific, Bremen, GER

Digitalkamera ProgRes C5 Jenoptik AG, Jena, GER

Etagenschüttler HAT-Fors Infors AG, Hamburg, GER

Ettan Spot Handling Workstation Amersham Biosciences, Uppsala, SWE

Ettan Spot Picker Amersham Biosciences, Uppsala, SWE

Feinwaage Precision Plus Ohaus Europa, Nänikon, CH

IEF-Kammer MultiphorII Amersham Biosciences, Uppsala, SWE

LC Ettan™ MDLC GE Healthcare, Chalfont St Giles, UK

LC nanoACQUITY UPLC Waters, Milford, MA, USA

Lichtmikroskop Axiolab re Carl Zeiss AG, Jena, GER


39


Gerätebezeichnung Hersteller

Lumi-Imager F1 Roche Diagnostics, Rotkreuz, CH

Massenspektrometer LTQ Orbitrap Thermo Fisher Scientific, Bremen, GER

Massenspektrometer Q-Trap 4000 Applied Biosystems, Foster City, CA, USA

Massenspektrometer Synapt G2 Waters, Milford, MA, USA

Proteome-Analyzer 5800 Applied Biosystems, Foster City, CA, USA

Ribolyser Fast-Prep – 24 MP Biomedicals, Eschwege, GER

Sterilbank Hera Safe Thermo Fisher Scientific, Bremen, GER

Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, GER

Thermoshaker Universal Universal Labortechnik, Leipzig, GER

Typhoon 9400 Multimode Scanner GE Healthcare, Chalfont St Giles, UK

UV-Spektrometer 2100Pro General Electric Company, Frankfurt a. M., GER

Vakuumzentrifuge Concentrator 5301 Eppendorf, Hamburg, GER

Vakuumzentrifuge Concentrator Plus Eppendorf, Hamburg, GER

Wasserbad GFL – 1086 GFL, Burgwedel, GER

Wasserbad Innova 3100 New Brunswick Scientific, Hamburg, GER

Zentrifuge (15/50 ml) Heraeus Primo R Thermo Fisher Scientific, Bremen, GER

Zentrifuge (2 ml) Heraeus Fresco Thermo Fisher Scientific, Bremen, GER

2.7 Computerprogramme

Tab. 5: Übersicht über die verwendeten Computerprogramme.

Software Herausgeber

Analyst Applied Biosystems, Foster City, CA, USA

Delta 2D DECODON GmbH, Greifswald, GER

GPS Explorer Applied Biosystems, Foster City, CA, USA

ImageJ http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html

Mascot Matrix Science Ltd, London, UK

MeV MultiExperiment Viewer Dana-Farber Cancer Institut, Boston, USA

Microsoft Office Microsoft Co., Redmond, USA

MultiQuant Applied Biosystems, Foster City, CA, USA

Scaffold Proteome Software, Portland, USA

Sorcerer Sage-N Research, Milpitas, USA

Xcalibur Thermo Fisher Scientific, Bremen, GER


40

2.8 Methoden zum Arbeiten mit bakteriellen Zellen

2.8.1 Stammhaltung

Alle verwendeten Bakterienstämme wurden als Glycerinkulturen gelagert. Dafür wurden in LB-

Medium exponentiell wachsende Zellen steril mit Glycerin gemischt und so eine 25 %ige (v/v)

Suspension erzeugt. Diese wurde als 1 ml Aliquots in Stammhaltungsröhrchen bei -80 °C

gelagert.

2.8.2 Zellkultivierung und Probennahme

2.8.2.1 Batchfermentation in Minimalmedium

Die Batch-Fermentationen wurden im Rahmen des Big Experiment als Teil des SysMo-Projektes

in der Arbeitsgruppe von Prof. Reuss an der Universität Stuttgart durchgeführt.

B. subtilis BSG112 wurde in einem 30 l Bioreaktor im Minimalmedium für die Batch-

Fermentation (vgl. Abschnitt 2.4.2) kultiviert. Folgende Prozessparameter wurden angelegt:

Konzentration des gelösten Sauerstoffs >50 % Sättigung, pH 7, 0,5 bar Druck, 37 °C. Der

Gaseinstrom von 10 l/min wurde mit einem Durchflussmesser (Bioengineering AG, Wald, CH)

kontrolliert und die Schaumbildung bei Bedarf durch Zugabe von Polypropylenglykol

unterdrückt. Die Proben wurden während des exponentiellen Wachstums (t0, optische Dichte

OD600nm 1,7) sowie 1,5 h (t1, OD600nm 5,0) und 5 h (t2, OD600nm 2,9) nach dem vollständigen

Verbrauch von Glukose, gemessen mit einem reflektometrischen Glukoseteststreifen (Merck

KGaA, Darmstadt, GER), gewonnen (Abb. 4).

20-30 OD-Einheiten der Kultur wurden durch das Auslassventil des Fermenters entnommen und

für 10 min bei 10.000 x g und 4 °C zentrifugiert. Das Zellpellet wurde anschließend zweimal bei

4 °C in TE-Puffer gewaschen und anschließend ohne Überstand bei -70 °C gelagert. Der

Zellaufschluss fand wie in Abschnitt 2.8.3 beschrieben in Greifswald statt. Die gewonnenen


41

Proben wurden für die Entwicklung einer 2D-gelbasierten Methode zur umfassenden absoluten

Proteinquantifizierung genutzt und flossen in die Publikation mit dem Titel „Efficient, global-

scale quantification of absolute protein amounts by integration of targeted mass spectrometry and

two-dimensional gel-based proteomics“ ein (Abschnitt 3.3; Artikel II; Maass S, Sievers S, Zühlke

D, Kuzinski J, Sappa PK, Muntel J, Hessling B, Bernhardt J, Sietmann R, Völker U, Hecker M,

Becher D. 2011. Anal Chem 83: 2677–2684).

TE-Puffer: 1 mM EDTA

10 mM Tris

pH 7,5

Abb. 4: Wachstumskurve von B. subtilis während der Batchfermentation. Das Wachstum der

bakteriellen Zellen wurde durch das Aufzeichnen der OD bei 600 nm verfolgt. Die Zeitpunkte der

Probenentnahme (exponentielles Wachstum, 1,5 h und 5 h stationäre Phase durch Glukosehunger) sind

durch Punkte gekennzeichnet. Die Phase des Hungers ist durch den grauen Bereich markiert.

2.8.2.2 Kultivierung für Stressexperimente

Für die Hungerexperimente wurden drei unabhängige biologische Replikate B. subtilis 168 trp+ in

M9-Minimalmedium (vgl. Abschnitt 2.4.3) bei 37 °C unter kräftigem Schütteln bei 300 rpm

(Wasserbad Innova 3100) kultiviert. Die Proben wurden während der exponentiellen Phase (t1,

OD600nm 0,5), in der transienten Phase (t2), zum Zeitpunkt der maximalen OD (t3, OD600nm~1,5)


42

sowie 60, 120, 180 und 240 min (t4-t7) nach Eintritt in die stationäre Phase, die durch den

Verbrauch von Glukose verursacht wurde, gewonnen (Abb. 5).

Für die Hitzestressexperimente wurden drei unabhängige biologische Replikate B. subtilis

168 trp+ in Belitzky-Minimalmedium (vgl. Abschnitt 2.4.4) kultiviert und durch eine plötzliche

Temperaturänderung auf 52 °C gestresst. Die Zellen wurden kurz vor dem Stress (Kontrolle,

OD600nm 0,5) sowie 10, 30 und 60 min nach kontinuierlichem Hitzestress geerntet (Abb. 5).

Die Zellernte für beide Stressexperimente erfolgte wie in Abschnitt 2.8.2.1 beschrieben. Die

gewonnenen Proben wurden für die absolute Proteinquantifizierung während der Stressantwort

von B. subtilis genutzt und die Ergebnisse flossen in die Publikation mit dem Titel „Absolute

protein quantification of stress and starvation responses in Bacillus subtilis“ ein (Abschnitt 3.3.1

bis 3.3.3; Artikel IV; Maaß S, Wachlin G, Bernhardt J, Eymann C, Fromion V, Riedel K, Becher

D, Hecker M. 2014. Mol Cell Proteomics, in Revision [MCP/2013/035741]).

Abb. 5: Wachstumskurve von B. subtilis während Glukosehunger und Hitzestress. Das Wachstum der

bakteriellen Zellen wurde durch das Aufzeichnen der OD bei 600nm verfolgt. Die Zeitpunkte der

Probennahme sind durch Punkte gekennzeichnet. Die Proben wurden zu folgenden Zeitpunkten gewonnen:

Glukosehunger: exponentielles Wachstum, transiente Phase, maximale OD, 60, 120, 180, 240 min

stationäre Phase; Hitzestress: Kontrolle (OD600nm 0,5), 10, 30, 60 min bei 52 °C Hitze. Die Phasen von

Hunger und Hitzestress sind durch den grauen Bereich markiert.

2.8.3 Zellaufschluss

Vor dem Aufschluss wurden je 500 µl in TE-Puffer (vgl. Abschnitt 2.8.2.1) resuspendierter Zellen


43

auf 500 µl Glasperlen mit einem Durchmesser von 0,1-0,11 mm pipettiert und mit Hilfe eines

Ribolysers für 30 s bei 6,5 m/s aufgeschlossen. Dies wurde dreimal wiederholt, wobei die Zellen

zwischen den einzelnen Schritten des Aufschlusses für 5 min auf Eis gelagert wurden.

Um die Zellaufschlusseffizienz zu berechnen, wurde die Anzahl intakter Zellen direkt nach der

Zellernte und nach dem Zellaufschluss mit einem Lichtmikroskop (Axiolab re) bestimmt.

2.8.4 Bestimmung der Zellgröße

Um die Zellgröße von B. subtilis zu bestimmen, wurden die Zellen unter Nutzung einer

Maßstabsanzeige mit einem Lichtmikroskop (Axiolab re), das an eine digitale Kamera (ProgRes

C5) gekoppelt war, fotografiert. Die Längen- und Breitenbestimmung der Zellen erfolgte mit Hilfe

der Software ImageJ (Version 1.3) auf den Fotografien. Für die Berechnung der Zellvolumina

nach Gleichung 1 wurde für die stäbchenförmigen Zellen von B. subtilis die Form eines Zylinders

mit zwei Halbkugeln angenommen, wobei der Radius r der ermittelten Breite der Zellen und die

Höhe h der ermittelten Länge der Zellen entsprach. Für jede Probe wurden mindestens 100 Zellen

vermessen, um die Standardabweichungen für jede analysierte Population bestimmen zu können.

2.9 Methoden zur Proteinanalyse

2.9.1 Gewinnung von Proteinextrakten

Nach dem Zellaufschluss (vgl. Abschnitt 2.8.3) wurden die Glasperlen für 10 min bei 30.000 x g

bei 4 °C pelletiert und der proteinhaltige Überstand durch zwei weitere gleiche

Zentrifugationsschritte von den Zelltrümmern getrennt. Der Überstand konnte aliquotiert bis zur

Weiterverarbeitung bei -70 °C eingefroren werden.

V = (π * r² * h) + (4/3 * π * r³) (Gleichung 1)


44

2.9.2 Proteinbestimmung

2.9.2.1 Bradford

Für alle Versuche, bei denen die Proteine nicht absolut quantifiziert werden sollten, wurde die

Proteinbestimmung nach Bradford durchgeführt. Dafür wurde eine genaue Menge des

Proteinextraktes mit a. bidest. auf 200 µl aufgefüllt und dann mit 800 µl einer 20 %igen (v/v)

Nanoquant-Lösung gemischt. Nach 5 min bei Raumtemperatur wurde die Extinktion der Probe bei

590 und 450 nm gegen den Leerwert a. bidest. gemessen. Aus dem Quotienten der Messwerte

konnte anhand der mitgeführten Eichreiche (BSA, 0,25-50 µg/µl in TE-Puffer) die

Proteinkonzentration berechnet werden.

2.9.2.2 Ninhydrin

Bei allen Extrakten, deren Proteine absolut quantifiziert werden sollten, wurde die

Proteinbestimmung mit der Ninhydrin-Methode durchgeführt. Dafür wurden 20 µl Probe mit

20 µl 12 N Salzsäure gemischt und für 24 h bei 100 °C inkubiert. Die hydrolysierten

Proteinextrakte wurden in zwei Schritten insgesamt 200fach verdünnt und dann 400 µl dieser

Verdünnung mit 600 µl frischem Ninhydrin-Reagenz versetzt. Der Ansatz wurde anschließend

10 min bei 100 °C gekocht und nach Abkühlen die Extinktion bei 575 nm gemessen. Als Leerwert

dienten 400 µl a. bidest., die ebenso wie die Proben mit Ninhydrin-Reagenz gemischt und gekocht

wurden. Anhand der mitgeführten Eichreiche (BSA, 0,25-10 µg/µl in TE-Puffer) konnte die

Proteinkonzentration der Proben bestimmt werden.

Ninhydrin-Reagenz: 110 mM Ninhydrin

73,2 % (v/v) Ethylenglykol

24,4 % (v/v) 4 N Natriumacetatpuffer

2,4 % (v/v) zinnhaltige Chloridlösung


45

4 N Natriumacetatpuffer: 272 g C2H3NaO2 * 3 H20 in 100 ml Essigsäure lösen

ad 500 ml mit a. bidest.

pH 5,5

zinnhaltige Chloridlösung: 440 mM SnCl2 in Ethylenglykol

2.9.3 Eindimensionale Gelelektrophorese (1D PAGE)

Für die relative Proteinquantifizierung mittels Spectral Counting, die Erstellung quantitativer

Western Blots oder die Kontrolle der Verdauoptimierung wurden protein- bzw. peptidhaltige

Proben mittels 1D PAGE aufgetrennt. Dabei wurden 12 %ige Trenngele verwendet. Die Proben

wurden vor dem Auftragen auf das 4 %ige Sammelgel mit einem Volumen SDS-Probenpuffer

gemischt und die Elektrophorese in SDS-Laufpuffer mit einer konstanten Spannung von 160 V

bei Raumtemperatur durchgeführt.

Trenngel: 400 mM Tris, pH 8,8

12 % (v/v) Acrylamid/Bisacrylamid (37,5:1)

0,1 % (w/v) SDS

0,1 % (v/v) TEMED

0,1 % (w/v) APS

in a. bidest.

Sammelgel: 100 mM Tris, pH 6,8

4 % (v/v) Acrylamid/Bisacrylamid (37,5:1)

0,1 % (w/v) SDS

0,2 % (v/v) TEMED

0,1 % (w/v) APS

in a. bidest.


46

SDS-Probenpuffer: 62,5 mM Tris, pH 6,8

20 % (v/v) Glycerin

5 % (v/v) Mercaptoethanol

2 % (w/v) SDS

0,025 %Bromphenolblau

in a. bidest.

SDS-Laufpuffer: 25 mM Tris

192 mM Glycin

0,1 % (w/v) SDS

in a. bidest.

Die Gele für die relative Proteinquantifizierung durch Spectral Counting (vgl. Abschnitt 3.1)

wurden mit kolloidalem Coomassie gefärbt. Dafür wurden die Gele in 40 % (v/v) Ethanol und

10 % (v/v) Essigsäure und für mindestens 1 h fixiert, zweimal für 10 min mit a. dest. gewaschen

und anschließend für mindestens 2 h unter kontinuierlichem Schwenken in Färbelösung gefärbt.

Das Entfärben des Hintergrundes erfolgte in a. dest. für mindestens 30 min und gegebenenfalls

unter mehrfachem Wechseln des Lösemittels.

Färbelösung: 80 % (v/v) Färbestammlösung

20 % (v/v) Ethanol

Färbestammlösung: 750 mM Ammoniumsulfat

1 % (v/v) ortho-Phosphorsäure

2 % (v/v) Coomassie-Stammlösung

in a. dest.

Coomassie-Stammlösung: 5 % (w/v) Coomassie Brilliantblau G-250

in a. dest.

Die 1D-Gele zur Optimierung der Verdauparameter (vgl. Abschnitt 3.2) wurden mit Silbernitrat

gefärbt. Dabei wurden alle Versuchsschritte bei Raumtemperatur und unter kontinuierlichem


47

Schwenken der Gele durchgeführt. Zuerst wurden die Gele für mindestens 1 h fixiert. Nach

zweimaligem Waschen für 20 min mit 50 % (v/v) Ethanol wurden die Gele für 1 min in 0,8 mM

Natriumthiosulfat sensitiviert und nach dreimaligem kurzem Waschen in a. dest. für 20 min mit

Silbernitratlösung gefärbt. Die Gele wurden zweimal kurz mit a. dest. gewaschen und bis zur

gewünschten Färbeintensität, aber maximal 5 min, mit Entwicklerlösung behandelt. Die

Fällungsreaktion wurde mit 1 % (w/v) Glycin in a. dest für 30 s gestoppt. Nach einem kurzen

zusätzlichen Waschschritt in a. dest. wurde das Stoppen der Reaktion für 10-30 min wiederholt.

Anschließend wurde die Stopplösung durch Waschen mit a. dest. entfernt und die Gelbilder

dokumentiert.

Fixierlösung: 50 % (v/v) Ethanol

12 % (v/v) Essigsäure

0,05 % (v/v) Formaldehyd

in a. dest.

Silbernitratlösung: 10 mM Silbernitrat


in a. dest.

Entwicklerlösung: 220 mM Kaliumcarbonat

15 µM Natriumthiosulfat


2.9.4 Quantitative Western Blots

Quantitative Western Blots wurden zur Validierung der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten

Methode zur umfassenden absoluten Proteinquantifizierung durch Kalibration von 2D Gelen

genutzt (vgl. Abschnitt 3.3).

Dafür wurden je 5 µg der Proben sowie eine Verdünnungsreihe (5-200 ng/Spur) des

aufgereinigten ClpC-Proteins (zur Verfügung gestellt durch die AG Gerth, Institut für


48

Mikobiologie und Molekularbiologie, Universität Greifswald) und ein Größenstandard mittels

1D PAGE aufgetrennt (vgl. Abschnitt 2.9.3) und das Gel auf eine für 1 min in 60 % (v/v)

Methanol aktivierte PVDF-Membran geblottet. Dies geschah in Transferpuffer bei einer

konstanten Stromstärke von 250 mA für 1 h.

Transferpuffer: 15 mM Glycin

2 mM Tris

20 % (v/v) Methanol

in a. bidest.

pH 8,1-8,3

Nach dem Trocknen der Membran wurde diese mit dem primären ClpC-Antikörper, gelöst im

Verhältnis 1:30.000 in Blotto, bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Um die Bindung des

primären Antikörpers und damit die Menge von ClpC zu detektieren, wurde die Membran

anschließend für mindestens 1 h in Blotto mit dem 1:100.000 verdünnten sekundären Antikörper

(monoklonales anti-Kaninchen IgG), der an eine alkalische Phosphatase gekoppelt ist, inkubiert.

Vor der Detektion erfolgte die Äquilibrierung der PVDF-Membran in 99,9 % (v/v) Diethanolamin

(pH 9,5). Anschließend wurde für die Phosphatasereaktion das 1:200 in 99,9 % (v/v)

Diethanolamin (pH 9,5) verdünnte Chemilumineszenz-Reagenz CDP-Star auf die Membran

gegeben und diese für 4 min im Dunkeln inkubiert Die Detektion der getrockneten Membran

erfolgte am Lumi-Imager F1.

Blotto: 2,5 % (w/v) Magermilchpulver

0,3 mM Natriumazid

2.9.5 Zweidimensionale Gelelektrophorese (2D PAGE)

Für eine Trennung des Proteingemisches im pH-Bereich von 4 bis 7 in der ersten Dimension,

wurden die IPG-Streifen (IPG für immobilisierter pH-Gradient) mit 100 µg Proteingemisch

beladen. Dafür wurde das entsprechende Volumen des Proteinextraktes (unter 40 µl) mit 400 µl


49

Rehydratisierungslösung gemischt und zweimal für 30 min bei 19.000 x g und 20 °C zentrifugiert.

Die Überstände wurden in Rehydratisierungskammern gefüllt und luftblasenfrei mit der Gelseite

der IPG-Streifen bedeckt. Die Rehydratisierung erfolgte für 20-24 h bei Raumtemperatur.

Die isoelektrische Fokussierung erfolgte im MultiphorII-System unter Nutzung des folgenden

Spannungsprofiles:

Phase 1: Gradient 500 V 500 Vh 1 mA 5 W 2 h

Phase 2: Stufe 500 V 2500 Vh 1 mA 5 W 5 h

Phase 3: Gradient 3500 V 10 kVh 1 mA 5 W 5 h

Phase 4: Stufe 3500 V 35 kVh 1 mA 5 W 10 h

Für die Trennung der Proteine in der 2. Dimension wurden 12,5 %ige Trenngele verwendet. Nach

der Polymerisation des Trenngels unter a. dest. wurde ein 4 %iges Sammelgel direkt auf das

Trenngel gegossen und ebenfalls polymerisiert. Die fertigen Gele wurden in die

Elektrophoresekammer eingespannt und mit Laufpuffer überschichtet.

Rehydratisierungslösung: 8M Harnstoff

2M Thioharnstoff

1 % (w/v) CHAPS

20 mM DTT

0,5 % Pharmalyte 3-10

Spatelspitze Bromphenolblau

Trenngel: 12,5 % (v/v) Acrylamid

0,34 % (v/v) Bisacryamid

375 mM Tris-HCL, pH 8,8

0,05 % (v/v) TEMED

0,025% (w/v) APS

in a. dest.


50

Sammelgel: 4 % (v/v) Acrylamid

0,135 % (v/v) Bisacryamid

187,5 mM Tris-HCL, pH 6,8

0,1 % (v/v) TEMED

0,05% (w/v) APS

in a. dest.

Laufpuffer: 25 mM Tris

192 mM Glycin

0,1 % (w/v) SDS

in a. dest.

Vor dem Aufbringen der IPG-Streifen auf das Trenngel erfolgte deren Äquilibrierung leicht

schwenkend für 15 min in Äquilibrierungslösung A und anschließend für 15 min in

Äquilibrierungslösung B. Nach der Äquilibrierung wurden die Streifen direkt auf das Sammelgel

aufgelegt und der Gellauf bei 300 mA und 500 V mit 4 W/Gel gestartet. Nachdem die Proteine

ins Gel gewandert waren, wurde die Leistung je nach Laufpufferstand und –qualität auf 1,5

bis 2 W/Gel eingestellt. Die Trennung der Proteine in der zweiten Dimension erfolgte über

Nacht bei einer Puffertemperatur von 12 °C.

Äquilibrierungslösung: 50 mM Tris-HCL, pH 6,8

6 M Harnstoff

30 % (v/v) Glycerol

4 % SDS

A: 0,35 %(w/v) DTT

B: 4,5 % (w/v) Iodacetamid

B: Spatelspitze Bromphenolblau

Nach der 2D PAGE wurden die Gele in 40 % (v/v) Ethanol und 10 % (v/v) Essigsäure für


51

mindestens eine Stunde fixiert und anschließend mit Flamingo oder Krypton gefärbt. Dafür

wurden die Färbelösungen 1:10 mit a. dest. verdünnt. Nach der Färbung mit Krypton wurden die

Gele für 5 min mit 5 % (v/v) Essigsäure entfärbt und zweimal für 15 min mit a. dest. gewaschen.

Alle Gele wurden mit dem Typhoon 9400-Scanner mit einer Auflösung von 200 microns

gescannt, wobei mit dem grünen Laser bei 532 nm angeregt und bei 560 nm detektiert wurde.

Wenn die resultierenden 2D Gele für die gelbasierte absolute Quantifizierung (vgl. Abschnitt 3.3)

genutzt werden sollten, wurden 3-5 technische Replikate jeder Probe erzeugt.

Die Bildanalyse erfolgte mit Delta2D (Version 3.4 und höher) nach dem in Abschnitt 1.5.1

beschriebenen Arbeitsfluss. Als Grundlage für jede Art der Quantifizierung dienten die

normalisierten Spotvolumina. Für die absolute Quantifizierung wurden die normalisierten

Spotvolumina von multiplen Spots aufaddiert. Die Standardabweichung (SD) zwischen

technischen Replikaten für solche Proteine wurde wie in Gleichung 2 beschrieben berechnet.

22

2

2

1 )...()()( nSDSDSDSD (Gleichung 2)

Die finale Standardabweichung der absoluten Proteinmengen ergab sich aus der Kombination der

3-5 technischen und 3 biologischen Replikate und wurde durch Nutzung eines

Zufallseffektmodells, wie in Gleichung 3 beschrieben, berechnet.

SD2=

(Gleichung 3)

Dabei gilt:

mit i=1..p und j=1..n

mit k=1..p und l=1..n


52

2.9.6 Massenspektrometrische Analysen

2.9.6.1 MALDI-TOF-MS zur Identifizierung von 2D Gelspots

Die Proteinspots wurden mit Hilfe des Ettan Spotpickers, ausgestattet mit einem Pickerkopf mit

2 mm Durchmesser, aus dem gefärbten 2D Gel ausgeschnitten und, sortiert nach ihrer

Färbungsintensität, in 96-Well-Mikrotiterplatten mit je 100 µl a. bidest. transferiert. Der Verdau

mit Trypsin und das anschließende Platzieren der Peptidlösung auf dem MALDI-Target erfolgte

automatisch mit der Ettan Spot Handling Workstation, wobei ein modifiziertes Standardprotokoll

verwendet wurde. Dabei wurden die Gelstücke zweimal für 30 min mit jeweils 100 µl

Waschlösung und einmal für 10 min mit 75 % (v/v) Acetronitril gewaschen. Nach einer

Trocknungszeit von 17 min bei 37 °C wurden 10 µl Trypsinlösung hinzugegeben und das

Gemisch für 120 min bei 37 °C inkubiert. Dabei wurde die Konzentration des Trypsins an die

Färbeintensität der Proteinspots angepasst. Die intensivsten Spots wurden mit 4 ng/µl Trypsin (in

Reinstwasser) verdaut. Schwächere Spots, die im Gelbild ohne Verstärkung des Kontrastes

sichtbar waren, wurden mit 2 ng/µl Trypsin und gering abundante Proteine, deren Spots nur nach

Kontrastverstärkung sichtbar waren, wurden mit 1 ng/µl Trypsin verdaut. Für die Extraktion der

Peptide wurden die Gelstücken mit 60 µl Extraktionslösung bedeckt und für 30 min bei

Raumtemperatur inkubiert. Der peptidhaltige Überstand wurde in neue Mikrotiterplatten

transferiert und die Extraktion mit 40 µl Extraktionslösung wiederholt. Die Überstände wurden

bei 40 °C für 220 min eingetrocknet und die Peptide anschließend in 0,9 µl Spotterlösung mit

3,3 mg/ml α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure aufgenommen. 0,7 µl dieses Gemisches wurden direkt

auf das MALDI-Target übertragen. Nach 10 bis 15 min Trocknungszeit konnten die Proben

mittels MALDI-TOF-MS analysiert werden.

Waschlösung: 50 mM Ammoniumbicarbonat

50 % (v/v) Methanol


53

Extraktionslösung: 50 % (v/v) Acetonitril

0,1 % (w/v) Trifluoressigsäure

Spotterlösung: 50 % (v/v) Acetonitril

0,5 % (w/v) Trifluoressigsäure

Die MALDI-TOF-MS der gespotteten Peptidlösung erfolgte am Proteome-Analyzer 5800. Dabei

wurden Spektren im Massenbereich von 900 bis 3.700 Da mit einer Fokusmasse von 1.700 Da

aufgezeichnet. Die fünf höchstabundanten Peptide eines MS-Spektrums wurden für ein

nachfolgendes MS/MS-Experiment ausgewählt. Die Massengenauigkeit lag üblicherweise

zwischen 10 und 30 ppm. Die Peaklisten für die MS-Experimente wurden mit der Software GPS

Explorer Version 3.6 (build 332) mit folgenden Einstellungen erstellt: Massenbereich 900-

3700 Da, Pickdichte 20 Peaks pro 200 Da, minimales Signal-zu-Rauschen-Verhältnis 15, maximal

65 Peaks pro Spots. Für die Peaklisten der MS/MS-Experimente wurde ein minimales Signal-zu-

Rauschen-Verhältnis von 10 festgelegt. Die resultierenden Sequenzdaten wurden in die

Datenbanksuche mittels der Mascot Suchmaschine (Version 2.4.0) gegen den entsprechenden

Organismus integriert, um die Vertrauenswürdigkeit der Proteinidentifikation zu erhöhen.

Proteine mit einem Mowse-Wert von mindestens 49 für B. subtilis und 55 für B. pertussis wurden

als positive Identifikationen gewertet.

2.9.6.2 GeLC-MS und Spectral Counting

Für die Identifikation und die relative Quantifizierung von Proteinen durch Spectral Counting

wurden die Proben in einem 1D-SDS Gel aufgetrennt und jede Gelspur in 12 gleichgroße Teile

geschnitten. Die weiter zerkleinerten Gelstücke wurden bis zur vollständigen Entfärbung

mehrmals mit 200 µl Gelwaschlösung bei 37 °C gewaschen bevor sie in einer Vakuumzentrifuge

getrocknet wurden. Anschließend wurde Trypsinlösung zu den Gelstücken gegeben, bis diese

erneut gequollen waren. Der Verdau erfolgte über Nacht bei 37 °C. Zur Extraktion der Peptide

wurden die Gelstücke mit 15 µl 5 % Ameisensäure bedeckt und für 20 min in einem


54

Ultraschallbad behandelt. Der peptidhaltige Überstand wurde in MS-Fläschchen überführt und in

der Vakuumzentrifuge auf ein Volumen von 10 µl eingeengt.

Gelwaschlösung: 20 mM Ammoniumbicarbonat

50 % (v/v) Acetonitril

Trypsinlösung: 20 ng/µl Trypsin

in 20 mM Ammoniumbicarbonat

Die LC-MS/MS-Analyse erfolgte mit einer nanoACQUITY UPLC gekoppelt an eine LTQ-

Orbitrap. Hierbei wurden die Peptide mit einer Flussrate von 10 µl/min auf eine Vorsäule

(nanoAcquity Symmetry UPLC column, C18, 5 µm, 180 µm i.d. x 20mm; Waters, Milford, MA,

USA) geladen und für 3 min mit 99% (v/v) Puffer A gewaschen. Die Peptide wurden

anschließend mit einer analytischen Säule (nanoAcquity BEH130 UPLC column, C18, 1,7 µm,

100 µm i.d. x 100mm; Waters, Milford, MA, USA) unter Verwendung eines 80 min Gradienten

(Tab. 6) mit einer Flussrate von 400 nl/min getrennt.

Puffer A: 0,1 % (v/v) Essigsäure

in a. bidest.

Puffer B: 0,1 % (v/v) Essigsäure

in Acetonitril

Tab. 6: Lösemittelgradient an der nanoACQUITY UPLC.

Zeit (min) Anteil Puffer B (%)

0 1

1 5

50 25

79 50

80 99

85 99

86 1

Der Übersichtsscan in der Orbitrap erfolgte im Massenbereich m/z 300-2000 bei einer Auflösung

von 30.000. Anschließend wurden die fünf höchst abundanten Vorläuferionen in der linearen


55

Ionenfalle (LTQ, linear ion trap) mittels kollisionsinduzierter Dissoziation (CID, collision-

induced dissociation) fragmentiert und so die MS/MS-Spektren erzeugt. Dabei wurden einfach

geladene Ionen sowie innerhalb der vorangegangenen 30 s bereits fragmentierte

Vorläufermoleküle von der Fragmentierung ausgeschlossen. Die Proteine wurden mittels einer

automatisierten Datenbanksuche durch das Programm Sorcerer-SEQUEST (Version v.27, rev. 11)

in Verbindung mit Scaffold (Version 2.02.01) identifiziert. Folgende Parameter wurden in die

Suche miteinbezogen: Die Massentoleranz bei den Vorläuferionen betrug 10 ppm, zwei

ausgelassene Enzymschnittstellen wurden erlaubt und Methioninoxidation (+15.99 Da) wurde als

variable Modifikation gesucht. Proteinidentifikationen wurden akzeptiert, wenn sie auf

mindestens 2 Peptiden basierten und den folgenden Filterkriterien entsprachen: ΔCn 0,1; XCorr

(z=+2) 2,2; XCorr (z=+3) 3,3; XCorr (z=+4) 3,75.

Die relativen Spectral Counts (RSC) zur Quantifizierung der Abundanzunterschiede von Proteinen

verschiedener Proben wurden wie in Gleichung 4 berechnet. Hierbei steht n für die dem Protein

zugeordneten Spectral Counts in den jeweiligen Proben, t für die Summe aller Spectral Counts der

Proben (repräsentativ für die Probentiefe) und f für einen Korrekturfaktor. Für die Berechnung der

RSC zum Vergleich verschiedener Oberflächenproteine in B. pertussis wurde dieser

Korrekturfaktor auf 1,25 festgelegt (Tefon et al. 2011, Artikel I). Mehr als zweifache Änderungen

im RSC wurden als signifikant bewertet.

RSC=log2

+log2

(Gleichung 4)

2.9.6.3 Flüssigverdau für die absolute Quantifizierung

Die Parameter für den quantitativen Flüssigverdau löslicher Proteine von B. subtilis wurden im

Rahmen dieser Arbeit optimiert (vgl. Abschnitt 3.2) und das fertige Protokoll wird im Folgenden

beschrieben.

Die Proteinlösung wurde in 50 mM TEAB-Puffer (pH 8,0), der 0,1 % (w/v) RapiGest enthielt, auf

eine Endkonzentration von 1 µg/µl verdünnt. Nach der Reduktion der Proteine mit 2,5 mM TCEP


56

bei 60 °C für 45 min erfolgte die Alkylierung der Sulfhydrylgruppen mit 5 mM Iodacetamid für

15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. Für den Verdau der Proteine wurde anschließend

Trypsin im Enzym-Substrat-Verhältnis von 1:20 zugegeben. Alle Ansätze mit AQUA-Peptiden

wurden zu diesem Zeitpunkt außerdem mit den internen Standards gemischt. Die

Endkonzentrationen der genutzten Peptide sowie deren Proteinzugehörigkeit ist in Tab. 7

aufgeführt. Der Verdauansatz wurde unter leichtem Schütteln für 5 h bei 37 °C inkubiert und der

Verdau durch Zugabe von 1-2 µl konzentrierter Salzsäure, mit dem Ziel den pH des Verdauanatz

auf <pH 2 zu senken, gestoppt. Nach einer weiteren Inkubation ohne Schütteln bei 37 °C für

30 min wurde das hydrolysierte RapiGest durch dreimalige Zentrifugation bei 4 °C für 30 min bei

30.000 x g aus dem Peptidgemisch entfernt.

Für die labelfreie umfassende absolute Quantifizierung mittels MSE (vgl. Abschnitt 3.4) wurde auf

die zugegebenen AQUA-Peptide verzichtet. Das Protokoll wurde jedoch um einen

Aufreinigungsschritt mit C18-Stage Tips (Thermo Fisher Scientific, Bremen, GER) erweitert und

die Peptidlösung anschließend mit einem fertigen Verdau der Alkoholdehydronase aus Hefe

(ADH1_Yeast, Waters, Milford, MA, USA) in einer Endkonzentration von 50 fmol/µl versetzt.

Tab. 7: Übersicht der verwendeten AQUA-Peptide. Angegeben sind die Sequenz der Zielpeptide, die

mit schweren Isotopen markierte Aminosäure, die Zugehörigkeit der Peptide zu den Proteinen des

entsprechenden Organismus sowie die Endkonzentration der AQUA-Peptide im Verdauanatz in fmol/µl.

Peptidsequenz

markierte

Aminosäure

(Position)

Protein Organismus Konzentration

(fmol/µl)

EAAVPQEIIEHFK F (12) CitZ B. subtilis 10,37

VPGLVAAFSR F (8) CitZ B. subtilis 12,81

IEDIVTSEK V (5) CitZ B. subtilis 10,17

GPLTTPVGGGIR L (3) Icd B. subtilis 19,53

VVTYDFAR A (7) Icd B. subtilis 21,15

YFTGVPSPVK V (5) Icd B. subtilis 20,34

TPPELSADIIDR R (12) Mbl B. subtilis 5,08

HVYLEEEPK L (4) Mbl B. subtilis 5,08

GIVLNEPSVVALDK A (11) Mbl B. subtilis 5,08

TPPELSADIIDR R (12) Mbl B. subtilis 5,08

HVYLEEEPK L (4) Mbl B. subtilis 5,08

GIVLNEPSVVALDK A (11) Mbl B. subtilis 5,08


57


Peptidsequenz

markierte

Aminosäure

(Position)

Protein Organismus Konzentration

(fmol/µl)

GADIPVDITDQK K (12) PyR B. subtilis 5,08

AVILDEQAIR A (8) PyR B. subtilis 5,08

GADIPVDITDQK P (5) PyR B. subtilis 5,08

VILVDDVLYTGR V (7) PyR B. subtilis 5,08

YPAYGNLVPR R (10) SdhA B. subtilis 10,17

TPEGLLDFR R (9) SdhA B. subtilis 10,17

ININDTTK K (8) SdhA B. subtilis 10,17

GYIVPGLGDAGDR R (13) Upp B. subtilis 10,17

LPSDVEER L (1) Upp B. subtilis 10,17

GYIVPGLGDAGDR A (10) Upp B. subtilis 10,17

LGVVPILR V (4) Upp B. subtilis 10,17

LDELLENFK K (9) YkrZ B. subtilis 7,63

LNPGDLISVPENIR R (14) YkrZ B. subtilis 7,63

QQILDTFETEIK L (4) YkrZ B. subtilis 7,63

AQDVISLSDSNP L (7) YkrZ B. subtilis 7,63

VGAASETELK L (9) GroEL S. aureus 10,17

IEDALNSTR L (5) GroEL S. aureus 10,17

GVDQLANAVK L (5) GroEL S. aureus 10,17

AEEISALLR L (7) AtpA S. aureus 10,17

TTIAIDTILNQK I (8) AtpA S. aureus 10,17

GYLDDIPVVDITR V (8) AtpA S. aureus 10,17

DHEALEIK L (5) RplJ S. aureus 10,17

GLTVAEVTDLR V (7) RplJ S. aureus 10,17

LPQDITER I (5) Upp S. aureus 10,17

AYITPGLGDAGDR L (7) Upp S. aureus 10,17

DLELQDVDIETPVTK I (9) Upp S. aureus 10,17

DEFETPILK I (7) SACOL2053 S. aureus 10,17

LGFGGNDLGSDALK L (8) SACOL2053 S. aureus 10,17

ETEQFVADLIK V (6) SACOL2053 S. aureus 10,17

2.9.6.4 LC-SRM

Für die LC-SRM-Analyse der AQUA-Ansätze wurde eine Umkehrphasen-nano-Hochdruck-LC

(Ettan MDLC) an eine QTRAP 4000 gekoppelt. Diese war mit einer NanoSpray II Ionenquelle

ausgestattet und wurde durch die Software Analyst (Version 1.4.1 und 1.5.1) gesteuert. Die

Vorsäule (nano-Precolumn, PepMap, C18, 300 μm i.d. x 5 mm, LC Packings, Sunnyvale, CA,

USA) wurde in 10 min mit 500 ng Peptidlösung unter Verwendung einer Flussrate von 10 µl/min

mit Puffer A (vgl. Abschnitt 2.9.6.2) beladen. Die Trennung der Peptide erfolgte auf einer


58

analytischen Säule (PepMap, C18, 75 μm i.d. x 15 cm, LC Packings, Sunnyvale, CA, USA) unter

Verwendung eines 115 min Gradienten (Tab. 8) mit einer Flussrate von 250 nl/min. Das

Elektrospray wurde an einem Picotip Emitter (SilicaTip™, FS360-20-10-N, New Objective,

Woburn, MA, USA) und einer angelegten Spannung von 2,8 kV erzeugt.

Puffer A: 0,1 % (v/v) Essigsäure

in a. bidest.

Puffer B: 0,1 % (v/v) Essigsäure

in Acetonitril

Tab. 8: Lösemittelgradient an der Ettan MDLC.

Zeit (min) Anteil Puffer B (%)

0.0 1

10,0 10

35,0 15

70,0 25

100,0 40

115,0 60

115,1 99

130,0 99

130,1 1

145,0 1

Vor der SRM-Analyse wurde das Eingangspotential (EP), das Declustering Potential (DP), die

Kollisionsenergie (CE für engl. collision energy) und das Kollisionszellenaustrittspotential (CXP

für engl. collision cell exit potential) für jedes der Zielpeptide und die optimalen Fragmentionen

durch direkte Infusion von 400 fmol/µl reinem schweren Peptid optimiert. Eine detaillierte

Übersicht der optimierten Übergangsparameter ist im Anhang (Anh. 1, Anh. 2) zu finden.

Bei allen Messungen wurden folgende Parameter angelegt: Curtain Gas 10 psi, Ionenquellengas

Nr.1 8 psi, Interfacetemperatur 150 °C, CID Druck: 4.0 – 4.3 * 10-5 Torr, Q1 und Q3 in Unit

Auflösung (Halbwertsbreite 0.6 – 0.8 Da). Wenn termingemäße SRM nicht möglich waren, wurde

die Anzahl einzelner SRMs pro LC-SRM-Lauf so beschränkt, dass Nachhaltezeiten von

mindestens 16 ms und eine maximale Zykluszeit von 1,6 s möglich waren. Bei termingemäßen


59

SRM wurde ein Retentionszeitfenster von 300 s verwendet. Die Richtigkeit der drei

aufgezeichneten Übergänge pro Peptid wurde durch den Vergleich der Retentionszeit kontrolliert.

Alle Messungen wurden in drei technischen Replikaten durchgeführt. Die Datenanalyse erfolgte

mit der MultiQuant-Software (Version 1.1 und höher). Das bestimmte Verhältnis von nativer und

markierter Peptidspezies basierte auf drei Übergängen, die abhängig von Ihrem Signal-zu-

Rauschen-Verhältnis gewichtet wurden, bevor der Mittelwert aus den drei Peptiden eines Proteins

gebildet wurde. Mit Hilfe der bekannten Menge schweren Peptides in der Probe konnte so die

absolute Menge der nativen Zielproteine berechnet werden.

Ergebnisse und Diskussion

60

3 Ergebnisse und Diskussion

3.1 Gelfreie relative Proteinquantifizierung durch Spectral Counting

Im Rahmen dieser Arbeit wurde Spectral Counting genutzt, um Oberflächen- und Immunproteine

zweier Stämme des humanpathogenen Bakteriums Bordetella pertussis relativ zu quantifizieren.

In der resultierenden Studie konnten 226 Proteine gelfrei identifiziert und quantifiziert werden. 45

dieser Proteine wurden auch mit Hilfe des 2D Gels identifiziert und lagen dort in insgesamt 125

Spots vor. 48 der identifizierten Oberflächenproteine waren bereits in vorhergegangenen Studien

beschrieben worden, wohingegen 38 bereits beschriebene Oberflächenproteine nicht detektiert

werden konnten (Bottero et al. 2007; Serra et al. 2008). Die Kombination aus gelbasierten und

gelfreien Techniken erlaubte jedoch erstmals die Identifzierung von 178 neuen

Oberflächenproteinen. Darüber hinaus konnten durch Spectral Counting erstmals für alle 226

identifzierte Proteine quantitative Daten erzeugt werden, die neue Einblicke in das

Oberflächenproteom von B. pertussis erlauben. Die Quantifizierung ergab 16 in den

unterschiedlichen Stämmen differentiell exprimierte Proteine, von denen bisher nur einige als

Virulenzfaktoren beschrieben waren.

Diese Ergebnisse wurden im Rahmen einer Publikation mit dem Titel „A comprehensive analysis

of Bordetella pertussis surface proteome and identification of new immunogenic proteins.“

veröffentlicht (Artikel I; Tefon BE, Maass S, Ozcengiz E, Becher D, Hecker M, Ozcengiz G.

2011. Vaccine 29: 3583–3595).

3.2 Optimierung der Probenvorbereitung für die absolute Proteinquantifizierung

Um absolute Proteinkonzentrationen zu bestimmen, ist es essentiell, jeden Mengenverlust

während der Probenaufbereitung zu vermeiden oder genau zu quantifizieren. Wenn absolute

Mengen mit Hilfe radioaktiver Markierung ermitteln werden, kann dies leicht durch

Szintillationszählung geschehen (Baudouin-Cornu et al. 2009). Bei anderen Methoden müssen


61

Proteinverluste während der Probenaufbereitung durch geeignete Kontrollen bestimmt oder durch

Optimierung des Arbeitsprotokolls vermieden werden. Daher war die Optimierung von

Zellaufschluss und Proteinverdau vor der MS-Analyse im Rahmen dieser Arbeit eine

Grundvoraussetzung für alle hier entwickelten Methoden zur absoluten Proteinquantifizierung.

Um möglichst alle löslichen Proteine aus der Bakterienzelle zu extrahieren, wurde in einem ersten

Schritt der Zellaufschluss optimiert. Um ein Maß für den Erfolg der Zelllyse zu erhalten, musste

eine Methode zur Bestimmung der Zellaufschlusseffizienz entwickelt werden. Es zeigte sich, dass

lichtmikroskopische Bilder der Bakterien in einer Zählkammer vor und nach dem Zellaufschluss

geeignet sind. So kann im Falle von unvollständigem Zellaufschluss ein Korrekturfaktor bestimmt

werden. Im Rahmen einer von Jörg Bernhardt betreuten Diplomarbeit konnte gezeigt werden, dass

der mechanische Aufschluss durch Glasperlen mit dem Ribolyzer in dreimaliger Wiederholung

sowohl für Bacillus subtilis als auch für Staphylococcus aureus die Methode mit den besten

Zellaufschlusseffizienzen war (Baronick 2008). Obwohl der Aufschluss für Bacillus-Zellen noch

effektiver war, lag die Zellaufschlusseffizienz auch für S. aureus unter Hungerbedingungen immer

über 95 %.

Auch die Bestimmung des Proteingehalts im Gesamtzellextrakt sollte mit einer sensitiven und

proteinunspezifischen Technik erfolgen, um weitere mögliche Fehler bei der absoluten

Proteinquantifizierung zu vermeiden. Der Vergleich des standardmäßigen verwendeten Bradford-

Assays zum aufwendigeren Ninhydrinassay im Rahmen der Diplomarbeit von Judith Kuzinski

ergab, dass Letzteres die zuverlässigeren Ergebnisse liefert (Kuzinski 2007).

Um die bestimmten absoluten Proteinmengen nicht nur als Fraktion an der Gesamtmenge, sondern

in Molekülzahlen pro Zelle angeben zu können, muss die Zellzahl in der Probe korrekt bestimmt

werden. Im Rahmen dieser Arbeit zeigte sich, dass die Zellzahlen in einer Kultur und ihre

optische Dichte nur während des exponentiellen Wachstums linear korrelieren, diese Korrelation

unter Stress- und Hungerbedingungen jedoch nicht mehr existiert. Daher war es unabdingbar, die

Zellzahl für jede untersuchte Probe zu bestimmen. Dies erfolgte mit einer Bakterienzählkammer.

Das Erstellen lichtmikroskopischer Bilder durch Fotografie ermöglichte nicht nur ein


62

zeiteffizientes Bestimmen der Zellzahl, sondern konnte zusätzlich für die Bestimmung der

Zellgröße genutzt werden. So war es in allen weiterführenden Analysen möglich auch

Proteinmengen pro Zellvolumen anzugeben und Änderungen der Proteinkonzentration, die sich

durch die Änderung des Zellvolumens ergeben, zu erkennen (Maaß et al. 2014, Artikel IV).

Abb. 6: Optimierung der Verdauparameter für die absolute Proteinquantifizierung. Dargestellt sind

die Ergebnisse der Optimierung von Verdaupuffer und Enzymkonzentration (A), der verwendeten

Proteasen (B), der Inkubationstemperatur (C) und der Inkubationsdauer (D). Auf der y-Achse der

Diagramme ist jeweils die Anzahl der identifizierten Proteine aufgetragen. K = unverdaute Kontrolle, Tryp

= Trypsin.

Da die vollständige tryptische Spaltung aller Proteine im Extrakt die Voraussetzung für eine

quantative MS-Analyse ist, wurden in einem zweiten Schritt die Verdauparameter für lösliche

bakterielle Proteine optimiert. Im Laufe der Optimierung des Verdauprotokolls wurden

verschiedene Kombinationen von Proteasen und der Einfluss des Detergens RapiGest getestet

sowie die Konzentration der Protease, die Inkubationstemperatur und die Dauer des Verdaus

angepasst (Abb. 6). Das daraus resultierende optimierte Protokoll für den Flüssigverdau löslicher


63

Proteine aus B. subtilis und S. aureus bildet die Grundlage für alle Analysen der absoluten

Proteinmengen, die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurden.

Diese Ergebnisse wurden im Rahmen einer Publikation mit dem Titel „Efficient, global-scale

quantification of absolute protein amounts by integration of targeted mass spectrometry and two-

dimensional gel-based proteomics.“ veröffentlicht (Artikel II; Maass S, Sievers S, Zühlke D,

Kuzinski J, Sappa PK, Muntel J, Hessling B, Bernhardt J, Sietmann R, Völker U, Hecker M,

Becher D. 2011. Anal Chem 83: 2677–2684).

3.3 Umfassende absolute Quantifizierung durch Kalibration von 2D Gelen

Bislang war die absolute Proteinquantifizierung mit Hilfe von 2D Gelen nur nach radioaktiver

Markierung der Proteine möglich (vgl. Abschnitt 1.7) (Baudouin-Cornu et al. 2009). Die fehlende

Möglichkeit der Identifikation der radioaktiven Proteine durch MS ist jedoch ein limitierender

Faktor für die Anwendung dieser Methode. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deshalb eine Methode

entwickelt, mit der in traditionellen 2D Gelen fast 1.000 Proteine zweier Bakterienspezies absolut

quantifiziert werden konnten.

Um die Konzentration aller Proteine, die auf den analysierten 2D Gelen sichtbar sind, bestimmen

zu können, wurden ausgewählte Proteine mit Hilfe von AQUA-Peptiden und SRM absolut

quantifiziert. Diese Proteine wurden anschließend für die Kalibration von 2D Gelen der exakt

gleichen Proteinextrakte genutzt. Durch den Vergleich der Spotintensität eines Proteins zu den

Intensitäten der Spots der Kalibrationsproteine, deren Menge bekannt ist, lässt sich folglich die

Proteinkonzentration für alle detektierbaren Proteine eines 2D Gels bestimmen (Abb. 7).

Die Auswahl der Kalibrationsproteine und ihre Quantifizierung bestimmen die Genauigkeit der

Methode an sich, weshalb bei der Auswahl dieser Proteine verschiedene Kriterien beachtet

wurden: I) Kalibrationsproteine sollten unter allen untersuchten Bedingungen auf dem 2D Gel

präsent sein und gut separierte Spots formen, die verlässlich zu detektieren sind. II) Die

Gesamtheit aller Kalibrationsproteine sollte den Bereich der separierten Proteine hinsichtlich MW


64

und pI möglichst breit abdecken. III) Kalibrationsproteine müssen darüber hinaus geeignete

Peptide für die AQUA-Technik und SRM enthalten. Geeignete Peptide haben eine Länge von 8-

20 Aminosäuren und enthalten keine bekannten Modifikationen, wie z. B. Phosphorylierungen,

oder leicht modifizierbare Aminosäuren (Mayya et al. 2006; Malmström et al. 2007). Basierend

auf diesen Merkmalen wurden CitZ, Icd, Mbl, PyrR, SdhA, Upp und YkrZ von B. subtilis sowie

AtpA, GroEL, RplJ, Upp und SACOL2053 von S. aureus als Kalibrationsproteine ausgewählt

(Abb. 8, Tab. 7, Anh. 1, Anh. 2).

Abb. 7: Arbeitsablauf für die umfassende absolute Proteinquantifizierung durch Kalibration von

2D Gelen. (A) alle Schritte für die Probenaufarbeitung; (B) teilweise parallele Analyse von Proben durch

zielgerichtete MS und 2D PAGE für die absolute Quantifizierung.


65

Die absolute Quantifizierung der Peptide der Kalibrationsproteine in mindestens drei technischen

Replikaten mittels SRM zeigte eine hohe Reproduzierbarkeit. Nur für wenige Peptide in einigen

Proben wurde eine Standardabweichung größer als 15 % bestimmt, was zum Ausschluss der

zugehörigen Proteine von der Liste der Kalibrationsproteine für diese Proben führte. Auch

Proteine, deren Standardabweichung innerhalb von mindestens drei technischen 2D Gelreplikaten

größer als 35 % war, wurden nicht als Kalibrationsproteine genutzt.

Abb. 8: Das Aussehen und die Lokalisation der gewählten Kalibrationsproteine von B. subtilis und

S. aureus auf dem 2D Gel.

Damit die Kalibration von 2D Gelen verlässliche Ergebnisse liefert, muss die Färbung der

Proteine in den 2D Gelen proteinunspezifisch und linear über einen möglichst großen Bereich

sein. Die Testung verschiedener kommerziell erhältlicher Farbstoffe durch Judith Kuzinski und

Jörg Bernhardt ergab, dass sich die Fluoreszenzfarbstoffe Flamingo und Krypton am besten

eignen (Maass et al. 2011, Artikel II).

Um das Potenzial der neu entwickelten Methode besser abschätzen zu können, wurde die

gelbasierte absolute Quantifizierung für die Untersuchung der Anpassung von B. subtilis an

Glukosehunger angewendet. Parallel dazu wurde die Glukosehungerantwort von S. aureus durch

Susanne Sievers und Daniela Zühlke mit der gleichen Methode analysiert. Dabei wurden die


66

Proteinkonzentrationen an drei verschiedenen Zeitpunkten während des Wachstums bestimmt:

während der exponentiellen Wachstumsophase und in der frühen und späten stationären Phase, die

durch Glukosehunger ausgelöst wurde (vgl. Abschnitt 2.8.2.1). Die Bildanalyse und

anschließende Kalibration der 2D Gele ermöglichte die sichere Mengenbestimmung von 467

Proteinen aus B. subtilis und von 482 Proteinen aus S. aureus. Diese Anzahl ist vergleichbar mit

449 Escherichia coli Proteinen, die in der Arbeitsgruppe von Edward M. Marcotte absolut

quantifiziert worden sind (Lu et al. 2007), aber deutlich geringer als 1.100 E. coli Proteine, deren

Mengen durch Ishihama und Mitarbeiter bestimmt wurden (Ishihama et al. 2008). Dabei nutzen

beide E. coli-Studien rein massenspektrometrische Methoden, die im Wesentlichen auf dem

Prinzip des Spectral Countings beruhten.

Obwohl die für die Entwicklung der gelbasierten absolute Quantifizierungsmethode verwendeten

2D PAGE nur lösliche Proteine in einem pH-Bereich von 4 bis 7 umfassten und hydrophobe

Membranproteine generell nicht darstellbar sind, konnten so gut wie alle Enzyme der

Hauptstoffwechselwege abgebildet und somit wertvolle Informationen für die Simulation

biologischer Prozesse gewonnen werden. Darüber hinaus können Proteine, deren isoelektrischer

Punkt außerhalb des Standardbereichs von 4 bis 7 liegt, durch die Nutzung verschiedener IPG-

Streifen (z. B. pH 3-10 oder pH 6-11) detektiert und quantifiziert werden. Mit einem erweiterten

Satz Kalibrationsproteine wäre sogar die absolute Proteinquantifizierung auf Zoom-Gelen

innerhalb eines engen pH-Bereichs denkbar. Der große Vorteil der gelbasierten Strategie zur

absolute Proteinquantifizierung liegt in der Möglichkeit, die Konzentrationen einzelner

Proteinisoformen zu bestimmen, die durch pI oder das Molekulargewicht beeinflussende

posttranslationale Modifikation entstehen und daher in Form multipler Spots auftreten.

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass der Elongationsfaktor Ef-Tu mit rund

100.000 Molekülen pro Zelle das höchst abundante Protein während der exponentiellen Phase in

B. subtilis ist. Eine vorangegangene Publikation über E. coli, einem Bakterium mit einer ähnlichen

Zellgröße und einem ähnlich umfassenden Proteom, konnte für diesen Elongationsfaktor 90.000

zelluläre Kopien bestimmen (Ishihama et al. 2008). Mit der im Rahmen dieser Arbeit


67

entwickelten gelbasierten Methode zur absoluten Proteinquantifizierung konnten auch Mengen

von Proteinen in deutlich geringerer Konzentration bestimmt werden. So wurde berechnet, dass

die DNA-Polymerase X (PolX) in B. subtilis während des exponentiellen Wachstums mit rund

100 Molekülen pro Zelle vorliegt. Somit konnten Proteinkonzentrationen über einen dynamischen

Bereich von drei Größenordnungen bestimmt werden.

Um die neu entwickelte Methode qualitativ zu bewerten, wurde die Bootstrap-Technik

angewendet. Dafür wurde die durch SRM und AQUA bestimmte absolute Proteinmenge jedes

Kalibrationsproteins mit der Menge verglichen, die mit Hilfe der Kalibration der 2D Gele unter

Nutzung der anderen Kalibrationsproteine bestimmt wurde (Abb. 9). Der so bestimmte

durchschnittliche Fehler lag bei 1,8fach für B. subtilis und 1,4fach für S. aureus, wobei die

maximale Abweichung zwischen realen Mengen (SRM) und berechneten Mengen (2D PAGE) bei

2,5fach (Mbl in der exponentiellen Phase t0) und 2,0fach (RplJ in der exponentiellen Phase t0)

lagen.

Abb. 9: Quantitativer Fehler der Kalibrationsproteine. Die durch SRM und AQUA bestimmte absolute

Proteinmenge eines Kalibrationsproteins wurde gegen die Menge verglichen, die mit Hilfe der Kalibration

der 2D Gele unter Nutzung der anderen Kalibrationsproteine bestimmt wurde. Das Verhältnis dieser beiden

Werte (reale Menge (SRM)/ berechnete Menge (2D PAGE)) und damit die Abweichung der gelbasierten

Berechnung vom direkten SRM-Ergebnis wurde für alle Kalibrationsproteine aller drei Probenzeitpunkte

für B. subtilis (blau) und S. aureus (rot) im Diagramm dargestellt. t0=exponentielle Phase, t1= frühe

stationäre Phase, t2= späte stationäre Phase.


68

Eine zusätzliche Evaluation der neu entwickelten Methode wurde durch die absolute

Quantifizierung von glykolytischen Enzymen mit Hilfe der QCAT-Methode ermöglicht (Beynon

et al. 2005). Dabei werden alle AQUA-Peptide von Interesse als artifizielles Protein expremiert

und während der Synthese mit stabilen Isotopen markiert. Beim tryptischen Verdau einer genauen

Menge des gereinigten QCAT-Proteins im Verdauansatz des nativen Proteingemisches entstehen

dann die AQUA-Peptide, die zur absoluten Quantifizierung der Zielproteine benötigt werden. Für

die Verifizierung der Ergebnisse der gelbasierten absoluten Quantifizierung wurde ein QCAT-

Protein benutzt, das die Quantifizierung von sechs glykolytischen Enzymen und allen

Untereinheiten des Pyruvatdehydrogenasekomplex aus B. subtilis erlaubt. Dieses QCAT-Protein

wurde freundlicher Weise von Herrn Prof. Völker (Interfakultäres Institut für Genetik und

Funktionelle Genomforschung, Ernst-Moritz-Arndt Universität Greifswald) zur Verfügung

gestellt. Die absoluten Proteinmengen der zehn Proteine, die mittels SRM bestimmt wurden,

wurden mit den Werten aus der gelbasierten absoluten Quantifizierung verglichen und zeigten

einen durchschnittlichen Fehler von unter 2fach. Damit konnte für die neue

Quantifizierungsstrategie eine Genauigkeit nachgewiesen werden, die mit der anderer verfügbarer

Methoden zur umfassenden absoluten Proteinquantifizierung vergleichbar ist.

Eine weitere Validierung der neuen Methode erfolgte über den Vergleich mit bereits publizierten

absoluten Proteinmengen, die durch quantitative Western Blots bestimmt wurden. Zur Zeit der

Entwicklung der Methode zur gelbasierten absoluten Quantifzierung, waren nur wenige

Konzentrationen für B. subtilis-Proteine veröffentlicht. Daher konnten nur die Mengen von ClpC

verglichen werden. Bereits publizierte Daten bestimmten 1.500 Moleküle ClpC pro Zelle (Gerth et

al. 2004). Mit der gelbasierten Methode konnten 700 Moleküle pro Zelle berechnet werden, was

innerhalb des Fehlerbereichs diese Methode liegt.

Weitere Hinweise für die Genauigkeit der neuen Methode lieferte die Analyse des dynamischen

Proteinmusters in wachsenden und glukosehungernden Zellen von B. subtilis und S. aureus. Wie

bereits früher beschrieben, waren das Abschalten der Glykolyse mit der zeitgleichen Aktivierung

der Glukoneogenese und des Zitronensäurezyklus am deutlichsten messbar (Bernhardt et al. 2003;


69

Kohler et al. 2005). Eine Auswahl einiger regulierter Proteine ist in Abb. 10 dargestellt und

verdeutlicht die Übereinstimmung der gelbasierten absoluten Quantifizierung und der

traditionellen visuellen Darstellung in 2D Gelen.

Abb. 10: Vergleichende Darstellung der traditionellen Visualisierung durch 2D Gele und der

absoluten Quantifizierung durch Kalibration von 2D Gelen. Um die Leistungsfähigkeit der gelbasierten

absoluten Quantifizierung zu demonstrieren, sind die Daten für vier Proteine des zentralen

Kohlenstoffstoffwechsels (Triosephosphatisomerase [TpiA], Phosphoglyceratkinase [Pgk],

Succinatdehydrogenase Flavoproteinuntereinheit [SdhA], α-Ketogluteratdehydrogenase E1 Untereinheit

[OdhA/SucA]) aus B. subtilis und S. aureus beispielhaft dargestellt. Das Erscheinungsbild der Proteinspots

auf den 2D Gelen ist als vergrößerter Ausschnitt der Falschfarbenbilder in Spotalben abgebildet. Dabei ist

die Probe aus exponentiell wachsenden Zellen in grün dargestellt, die Proben aus der stationären Phase in

rot. Gelbe Spots repräsentieren daher ähnliche Proteinmengen in den verglichenen Proben, während

Abstufungen von grün oder rot eine erhöhte Proteinmenge in der jeweiligen Probe kennzeichnen.

Zusätzlich sind die absoluten Proteinkonzentrationen in ng pro µg Gesamtprotein und in Molekülen pro

Zelle (gerundet) für die vier Proteine in wachsenden Zellen (t0) und in der frühen (t1) und späten (t2)

stationären Phase angegeben.

Einige der im Rahmen dieser Arbeit quantifizierten Proteine sind Bestandteile bekannter

Proteinkomplexe, von denen bereits stöchiometrische Informationen verfügbar sind. Um

zusätzliche Aussagen über die Genauigkeit der gelbasierten absolute Quantifizierung machen zu

können, wurde das Mengenverhältnis von Komponenten einiger solcher Komplexe bestimmt und

mit bereits veröffentlichen Werten verglichen (Tab. 9).


70

Tab. 9: Stöchiometrische Informationen einiger ausgewählter Proteinkomplexe. Die stöchiometrische

Zusammensetzung von bekannten Proteinkomplexen wurde mit den Ergebnissen der gelbasierten absoluten

Quantifizierung bestimmt und mit bereits veröffentlichten Daten (Spalte „Literatur“) verglichen. Die

Literaturergebnisse wurde aus den angegebenen Publikationen extrahiert und stammen aus den gelisteten

Organismen.

B. subtilis S. aureus Literatur Organismus

OdhA : OdhB 1,0 : 2,4

1,0 : 2,7 1 : 2 E. coli (Pettit et al. 1973)

SucA : SucB

PdhA : PdhB : PdhC 0,6 : 1,0 : 1,0 1,0 : 1,3 : 1,0 1 : 1 : 1

Gram-positive (Neveling

et al. 1998)

RplJ : RplL 1,0 : 4,0 1,0 : 4,0 1 : 4 E. coli (Hardy 1975; Tal

et al. 1990) RpsB : RpsF 2,4 : 1,0 1,2 : 1,0 1 : 1

Die Mengenverhältnisse für Bestandteile des α-Ketogluteratdehydrogenase- und des

Pyruvatdehydrogenasekomplexes wurden genauso bestimmt, wie sie in der Literatur beschrieben

wurden. Die Stöchiometrie des α-Ketogluteratdehydrogenasekomplex konnte später in einer

zweiten Arbeit zur Stressanpassung in B. subtilis zusätzlich bestätigt werden (Maaß et al. 2014,

Artikel IV). Auch das beobachtete Mengenverhältnis von 1:4 für die Proteine RplJ und RplL der

großen ribosomalen Untereinheit stimmt mit früher veröffentlichen Daten überein. Für die

untersuchten Proteine RpsB und RpsF der kleinen ribosomalen Untereinheit ist das Ergebnis

weniger konsistent. Während die Mengenverhältnisse in S. aureus mit 1,2:1,0 nahezu mit den für

E. coli beschriebenen Stöchiometrien übereinstimmen, wurde das Verhältnis von RpsB zu RpsF in

B. subtilis auf 2,4:1 bestimmt. Dies könnte auf eine Besonderheit in B. subtilis hindeuten. Dies ist

jedoch rein spekulativ und erfordert weiterführende unterstützende Experimente.

Die zuvor beschriebenen Vergleiche mit Ergebnissen orthogonaler Methoden verdeutlichen die

gute Qualität der absoluten Quantifizierungsdaten, die mit Hilfe der neu etablierten gelbasierten

Methode erzeugt werden konnten. Diese nicht-radioaktive Strategie erlaubt jedoch nicht nur die

Bereitstellung hochqualitativer absoluter Proteinmengen, sondern bietet darüber hinaus weitere

Vorteile. Der Wichtigste könnte in der Möglichkeit des Transfers absoluter Daten zwischen

verschiedenen 2D Gelen liegen, wobei dazu die Intensitäten von übereinstimmenden Spots

verglichen werden müssten. Damit könnten Proteine in ganzen Zeitreihenexperimenten mit wenig


71

Aufwand quantifiziert werden, wobei nur wenige Gele über Kalibrierproteine kalibriert werden

müssten. Um diese Möglichkeit zu prüfen, wurde angenommen, dass MS-kalibrierte 2D Gele nur

für einen Zeitpunkt vorhanden waren. Die Gele der anderen Probenzeitpunkte wurde mit diesen

verglichen und alle Proteinspots relativ zu denen auf dem kalibrierten Gel quantifiziert, was

indirekt die absolute Quantifizierung für die Proteine der beiden anderen Probenzeitpunkte

ermöglichte (Intergel-Quantifizierung). Da in der methodischen Studie auch eine MS-Kalibration

für die beiden anderen Probenzeitpunkte stattfand, waren die genauen Proteinmengen für diese

Zeitpunkte bekannt (Intragel-Quantifizierung). Die Korrelation von Intergel- und Intragel-

Quantifizierung ist in Abb. 11 dargestellt.

Abb. 11: Korrelation zwischen Intragel- und Intergel-Quantifizierung. Vergleich der absoluten

Proteinmengen bestimmt durch direkte Kalibration von 2D Gelen (Intragel-Quantifizierung, x-Achse) mit

den Proteinmengen bestimmt durch Gel-zu-Gel-Vergleich (Intergel-Quantifizierung, y-Achse). Dargestellt

sind die Ergebnisse für zwei Probenzeitpunkte in B. subtilis (links, A und C) und S. aureus (rechts, B und

D). Die erwartete perfekte Korrelation wird durch die rote Linie gekennzeichnet.


72

Die gute Korrelation beider Quantifizierungsstrategien mit nur leichten Abweichungen für den

letzten Probenzeitpunkt in B. subtilis aufgrund von technischen Fehlern zeigt, dass der Transfer

von Kalibrationspunkten und damit die indirekte absolute Quantifizierung von vollständigen

Gelserien tatsächlich möglich ist. Darüber hinaus können technische Fehler durch die

Verwendung zusätzlicher Replikate minimiert werden.

Mit dieser einfachen und kostengünstigen Methode können die Proteinkonzentrationen für einen

Großteil der metabolischen Enzyme bestimmt werden, wobei die Genauigkeit mit der aus rein

MS-basierten Methoden vergleichbar ist.

Die Ergebnisse der Methodenentwicklung wurden im Rahmen einer Publikation mit dem Titel

„Efficient, global-scale quantification of absolute protein amounts by integration of targeted mass

spectrometry and two-dimensional gel-based proteomics.“ veröffentlicht (Artikel II; Maass S,

Sievers S, Zühlke D, Kuzinski J, Sappa PK, Muntel J, Hessling B, Bernhardt J, Sietmann R,

Völker U, Hecker M, Becher D. 2011. Anal Chem 83: 2677–2684).

Da die Ergebnisse der vorgestellten neuen Methode im Wesentlichen von der Reproduzierbarkeit,

der Auflösung und der Sensitivität der 2D Gele abhängen, war die weitere Verbesserung der 2D

Elektrophorese zur zusätzlichen Optimierung der Datenabdeckung und -genauigkeit ein logischer

Schritt. Die Etablierung von HPE-Gelen ermöglichte die Identifizierung von 1.759 Spots von 868

cytosolischen Proteinen aus B. subtilis bei deutlich erhöhter Reproduzierbarkeit. Dies stellt

gegenüber traditionellen Gelen eine Steigerung von fast 25 % dar. Dabei gehören die zusätzlich

identifizierten Proteinspots v. a. zu Proteinen mit geringem Molekulargewicht, geringer Abundanz

oder Proteinen mit sehr ähnlichem Molekulargewicht bei gleichem pI.

Der erhöhte Anteil von Gelen mit quantifizierbarer Qualität verringert außerdem den Zeit- und

Kostenaufwand v. a. für komplexe experimentelle Ansätze. So waren bei traditionellen, vertikalen

2D Gelen nur etwa 61 % der Gele für die gelbasierte absolute Quantifizierung geeignet,

wohingegen HPE-Gele von nicht-quantifizierbarer Qualität eher eine Ausnahme bilden. Weniger

als 4 % der HPE-Gele werden aufgrund von unzureichender Reproduzierbarkeit und Qualität nicht

verwendet.


73

Die Verwendung von HPE-Gelen reduziert darüber hinaus den Arbeitsaufwand von 2D PAGE

beträchtlich, da: I) sie auch von weniger erfahrenen Personen verwendet werden können, II) die

Laufzeit der Elektrophorese auf ein Drittel verringert ist und III) die bessere Reproduzierbarkeit

der Trennung den manuellen Aufwand bei der computergestützten Auswertung signifikant senkt.

Diese Ergebnisse wurden im Rahmen einer Publikation mit dem Titel „The new horizon in 2D

electrophoresis -new technology to increase resolution and sensitivity“ veröffentlicht (Artikel III;

Moche M, Albrecht D, Maaß S, Hecker M, Westermeier R, Büttner K. 2013. Electrophoresis 34:

1510–1518).

3.3.1 Gelbasierte absolute Quantifizierung zur Untersuchung der generellen

Stressantwort in Bacillus subtilis

Während des Lebens von B. subtilis in seiner natürlichen Umgebung, den oberen Bodenschichten,

wechseln sich Phasen des Wachstums mit Zeitspannen des Wachstumsstillstands, bedingt durch

Stress und Hunger, ab. Die Anpassung an diese wechselnden Umweltbedingungen ist der

Schlüssel für das Überleben bakterieller Zellen in ihren Habitaten. Die im Rahmen dieser Arbeit

entwickelte Methode zur gelbasierten absoluten Proteinquantifizierung ermöglichte erstmals die

Bestimmung von Proteinkonzentrationen in einem physiologischen Kontext. Die Verfügbarkeit

von molaren Proteinmengen in den Modellsystemen Hitzestress und Glukosehunger gestattete

neue Einsichten in die Stress- und Hungerantwort von Bacillus subtilis. Dabei wurden

Proteinkonzentrationen für sieben Zeitpunkte während des Wachstums und des Eintritts in die

stationäre Phase, bedingt durch Glukosehunger, und für vier Probenzeitpunkte zur Untersuchung

der zellulären Hitzestressantwort bestimmt (vgl. Abschnitt 2.8.2.2, Abb. 5). Insgesamt konnten so

773 Proteine (465 Proteine in den Hunger- und 691 Proteine in den Hitzestressexperimenten) in

mindestens einem Probenzeitpunkt zuverlässig quantifiziert werden.

Im Ergebnis der absoluten Proteinidentifizierung dieser Arbeit zeigt sich, dass bakterielle Zellen

auch unter Stressbedingungen die Basalfunktionen des Stoffwechsels und grundlegende zelluläre


74

Prozesse aufrechterhalten. So sind etwa 60 % der 100 höchst abundanten Proteine einer Zelle

sowohl in der exponentiellen Wachstumsphase als auch während Hitzestress und Glukosehunger

vorhanden (Abb. 12, dunkelblau). Dabei scheint der Einfluss der verschiedenen Stressstimuli auf

die Proteinmenge überraschend gering zu sein. Nur rund 10 % der 100 höchst abundanten

Proteine werden im Rahmen der Anpassung an Hitzestress oder Glukosehunger verstärkt

angereichert (Abb. 12, rot, gelb, orange). Dies lässt eine sehr hohe funktionelle Effizienz der

Proteine während der Stressantwort vermuten. Der Einfluss der generellen Stressproteine auf die

Gesamtproteinmenge ist dementsprechend noch geringer, nur für 1 % der 100 höchst abundanten

Proteine konnte unter beiden untersuchten Stressbedingungen eine erhöhte Menge bestimmt

werden (Abb. 12, orange).

Abb. 12: Aufteilung der Proteinmengen der 100 höchst abundanten Proteine aus der exponentiellen

Wachstumsphase, sowie unter Hitzestress und Glukosehunger. Proteinmengen (Moleküle pro Zelle) der

100 höchst abundanten Proteine während der exponentiellen Phase (erste Säule), nach 60 min Hitzestress

(zweite Säule) und nach 120 min Glukosehunger (dritte Säule) wurden für die Berechnung der relativen

Mengen stabiler und neu angereicherter Proteine innerhalb der 100 höchst abundanten Proteine der Zelle

genutzt.

Im Rahmen der Stressantwort werden in B. subtilis eine Reihe globaler Regulatoren durch

verschiedenste Stimuli aktiviert. Diese sind Teil komplexer regulatorischer Netzwerke, in denen

die spezifischen oder generellen Antworten einzelner Regulons eng miteinander verknüpft sind.


75

Die generellen Stressregulons in B. subtilis werden durch die alternativen Sigmafaktoren σB und

σH, den stringent Faktor RelA und den Transkriptionsfaktor CodY kontrolliert. Für die im Rahmen

dieser Arbeit untersuchten Modellstresssysteme Glukosehunger und Hitzestress konnte gezeigt

werden, dass die σB-Antwort und die Stringent Response den Hauptanteil der Regulation für die

generelle Stressanpassung vermitteln.

Die RelA-vermittelte Stringent Response ist verantwortlich für ein Abschalten vieler Reaktionen

der wachsenden Zelle (z. B. Proteinsynthese) bei zeitgleicher Induktion von

Nährstoffmangelantworten, um so der Verschwendung von Nährstoffen vorzubeugen (Eymann et

al. 2002). Deshalb wird sie durch Aminosäure- oder Glukoselimitation besonders stark aktiviert

(Nishino et al. 1979; Lopez et al. 1981), wobei rund 100 Gene reprimiert und etwa 60 induziert

werden (Mäder et al. 2007). Die negative Stringent Response kontrolliert vor allem Komponenten

der Translationsmaschinerie, Nukleotidbiosynthese, DNA-Replikation, Zellwandsynthese sowie

den RNA- und Energiestoffwechsel. In den Glukosehungerexperimenten dieser Arbeit wirkte sich

die Stringent Response besonders deutlich auf die molaren Mengen des ribosomalen Proteins

RpsB, des Elongationsfaktors FusA, der Adenylatkinase Adk, der Phosphoribosylpyrophosphat-

synthetase Prs und des DNA-Einzelstrangbindenden Proteins SsbA aus (Tab. 10). Auch für das

zellformbestimmende Protein Mbl und Proteine mit Funktionen in der ATP-Synthese und der

Atmung (AtpA und AtpD) konnten verringerte Proteinkonzentrationen nach Glukosehunger

bestimmt werden (Tab. 10).

Der alternative Sigmafaktor σB kontrolliert mit mehr als 150 Genen eines der umfangreichsten

Regulons der generellen Stressantwort in B. subtilis. Die Aktivität dieses Regulons stattet nicht

wachsende Zellen mit einer multiplen, unspezifischen und vorbeugenden Stressresistenz aus, die

hungernde Zellen gegen zukünftigen Stress schützt. Die dafür notwendigen Stimuli umfassen

hohe und niedrige Temperatur, durch Antibiotika verursachten Zellwandstress, Salz-, Ethanol-

und Säurestress, genauso wie Glukose-, Phosphat- und Sauerstofflimitation (Klose 1975; Hecker

et al. 2007).

Während aktiv wachsende Zellen nur etwa 1 % ihrer Translationskapazität für die Produktion


76

genereller Stressproteine verwenden, nutzen gestresste oder hungernde B. subtilis Zellen einen

großen Teil (bis zu 40 %) ihrer gesamten Proteinsynthesekapazität für die Produktion dieser

Proteine (Bernhardt et al. 1997). Dieses lässt eine entscheidende Rolle der σB-abhängigen Proteine

bei der generellen Stressantwort vermuten.

Tab. 10: Proteinmengen (in Molekülen pro Zelle) für ausgewählte Proteine der generellen

Stressantwort von B. subtilis nach Glukosehunger und Hitzestress. *: In der Spalte „Stress“ sind die

maximalen Proteinmengen angegeben. Die korrespondieren Zeitpunkte sind dem Text zu entnehmen.

Moleküle/Zelle

Protein Funktion exp. Phase Stress

GLUKOSEHUNGER

Stringent Response

RpsB ribosomales Protein 16.000 8.600

FusA Elongationsfaktor 67.000 37.000

Adk Adenylatekinase 11.000 4.700

Prs Biosynthese von Histidin 3.500 1.300

SsbA DNA Replikation 9.000 4.200

Mbl Bestimmung der Zellform 3.100 960

AtpA Untereinheit der ATP-Synthase 31.000 16.000

AtpD Untereinheit der ATP-Synthase 30.000 14.000

σB-Regulon*

YdbD generelles Stressprotein 190 4.000

YdaD generelles Stressprotein 150 1.200

YdaG generelles Stressprotein 7.600 38.000

YfkM generelles Stressprotein 1.600 4.400

KatE Katalase, generelles Stressprotein 1.300 2.700

Ctc generelles Stressprotein 9.200 20.000

McsB Proteinargininkinase 4.300 12.000

HITZESTRESS

σB-Regulon

YhdN generelles Stressprotein 100 5.800

YvyD generelles Stressprotein 200 9.500

GsiB generelles Stressprotein 3.900 151.000

Die durch einen Partner-Wechsel-Mechanismus aktivierte σB –vermittelte Stressantwort ist

schnell, intensiv und transient. So wird die Transkription des σB -Regulons während Hitzestresses

schnell, aber nur vorübergehend angeschaltet, so dass die mRNA-Level bereits zehn Minuten nach

dem Beginn des Stresses wieder das Basalniveau erreichen (Helmann et al. 2001). Im Rahmen


77

dieser Arbeit konnten insgesamt 44 Proteine des σB –Regulons absolut quantifiziert werden, von

denen 33 mehr als 2fach akkumuliert gefunden wurden. Im Gegensatz zu den Transkriptmengen

lagen die Proteine σB –abhängiger Gene bis mindestens eine Stunde nach dem Beginn des Stresses

in deutlich erhöhten Mengen vor. Besonders deutlich akkumulierten dabei die generellen

Stressproteine YhdN, YvyD und GsiB (mehr als 30fach). Während Hitzestress waren das

generelle Stressprotein GsiB, der Anti-anti-Sigmafaktor RsbV und die Protease ClpP die

abundantesten σB-abhängigen Proteine (150.000, 135.000 bzw. 98.000 Moleküle pro Zelle nach

60 Minuten Hitzestress, Tab. 10).

Trotz der generellen Funktion, die σB-abhängige Proteine bei der Stressantwort ausüben, scheint

die Intensität und Dauer der Induktion σB-abhängiger Gene für verschiedene Stimuli

unterschiedlich zu sein. So konnten nur 19 σB-abhängige Proteine während Glukosehunger

quantifiziert werden. Nur sieben dieser Proteine wurden in mindestens einem Probenzeitpunkt

statistisch (p=0,05, ANOVA) signifikant akkumuliert (>2fach). Hierbei zeigten die generellen

Stressproteine YdbD, YdaD, YdaG und YfkM die höchsten Akkumulationsraten nach 240 min

stationärer Phase (Tab. 10). Diese waren mit maximal 20fach jedoch deutlich geringer als nach

Hitzestress. Mit 20.000-57.000 Molekülen pro Zelle waren die Protease ClpP und die generellen

Stressproteine YvgN und YvaA die abundantesten σB-abhängigen Proteine. Fünf der sieben

signifikant veränderten Proteine, namentlich die generellen Stressproteine YdbD, YdaD, YdaG,

YfkM und die Katalase KatE, akkumulierten erst in der späten stationären Phase. Im Gegensatz

dazu wurden Proteinmengen des generellen Stressproteins Ctc und der σB- und CtsR-abhängigen

Argininkinase McsB nur transient angereichert. Während Ctc während der transienten Phase in

höchster Menge vorlag, konnte die maximale Menge für McsB nach 120 min hungerbedingter

stationärer Phase bestimmt werden.

Unterstützende gelbasierte Analysen durch radioaktive Markierung erlaubten die relative

Quantifizierung der Proteinsynthese von 37 σB-abhängigen Proteinen. Davon waren bei 27

Proteinen die Mengen in mindestens einem Probezeitpunkt signifikant erhöht (p=0,05, ANOVA,


78

>3fach). Die Induktion der generellen Stressproteine erreichte ihren Höchststand 30 min nach

Eintritt in die stationäre Phase. Nach 120 min stationärer Phase waren die Proteinmengen dann

wiederum vergleichbar mit denen des Kontrollzeitpunktes während des exponentiellen

Wachstums. Trotz dieser transienten Induktion der Proteinsynthese konnte nur eine geringe

Akkumulation einiger weniger Stressproteine beobachtet werden (Abb. 13). Durchschnittlich

reicherten sich σB-abhängige Proteine nach 240 min Glukosehunger 1,8fach an, wohingegen die

Akkumulation nach 60 min Hitzestress 5,2fach betrug und damit mehr als dreimal so hoch war.

Ähnliche Ergebnisse, nämlich eine durchschnittliche Anreicherung um Faktor 3,2, wurden in

früheren Arbeiten zur Analyse der bakteriellen Salzstressantwort in B. subtilis beschrieben (Hahne

et al. 2010). Dabei lagen die maximalen Induktionsraten bei 5,4 für Salzstress (Höper et al. 2006),

8,0 für Glukosehunger und 52,4 für Hitzestress, was auf deutliche Unterschiede in der σB-

abhängigen Regulation während der Adaptation an verschiedene Stressstimuli hindeutet.

Die Zuordnung der quantifizierten Proteine zu verschiedenen Regulons ergab, dass Proteine,

deren Expression durch die Regulatoren PerR (Anpassung an Peroxid) und Spx (Antwort auf

thiolspezifischen oxidativen Stress) reguliert wird, nach Hitzestress angereichtert wurden, was die

überlappende Reaktion auf Hitze- und oxidativen Stress betont. Da sekundärer oxidativer Stress

vor allem nach Umweltstress beschrieben ist (Höper et al. 2005; Reder et al. 2012), wurden die

quantitativen Daten für Proteine mit Funktionen in der Anpassung an oxidativen und elektrophilen

Stress aus dieser Arbeit genauer überprüft. In der Tat waren die Proteinmengen für 25 von 35

quantifizierten oxidativen Stressproteinen mindestens 2fach erhöht (Anh. 3). Die Anzahl der

Moleküle von YvyD, OhrB, SigB und Dps pro Zelle erhöhte sich nach 60 min Hitzestress um

mehr als das Zehnfache (Anh. 3). Da die Expression der korrespondierenden Gene dieser Proteine

durch σB kontrolliert sind, ist diese hohe Akkumulation höchstwahrscheinlich durch additive

Effekte der generellen Stressantwort und der Antwort auf oxidativen Stress verursacht. Dies wird

durch die Beobachtung gestützt, dass die Konzentrationen von Proteinen ohne zusätzliche

Regulation durch die generelle Stressantwort, wie der Nitro/- Flavinreduktase NfrA, der

möglichen Thiolperoxidase Tpx, der Alkylhydroperoxidreduktase AhpC/AhpF und der


79

Abb. 13: Dynamik des Proteinmusters ausgewählter σB-abhängiger Proteine in wachsenden und

gestressten Zellen. Die Proteinmuster ausgewählter σB-abhängiger Proteine im 2D Gel sind für

exponentiell wachsende Zellen (grün) und gestresste Zellen (rot) während verschiedener Wachstumsphasen

dargestellt. Dabei korrespondieren die Spalten mit denen in Abschnitt 2.8.2.2 beschriebenen

Probezeitpunkten (exp. = exponentielles Wachstum, trans.= transiente Phase K.= Kontrolle). Unter jedem

Gelausschnitt ist die absolute Proteinmenge in Molekülen pro Zelle angegeben. Die Diagramme zeigen die

log2-Verhältnisse der Proteinmengen verglichen mit der Proteinmenge der Kontrollprobe (exp. bzw. K.) für

Glukosehunger (blau) und Hitzestress (orange). Für das Hungerexperiment sind diese Verhältnisse darüber

hinaus für akkumulierte (hellblau) und synthetisierte (dunkelblau) Proteine dargestellt.


80

Superoxiddismutase SodA, um nicht mehr als das Fünffache anstiegen.

In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass oxidativer Stress zur Derepression MgsR-

regulierter Gene führt (Reder et al. 2008). MgsR kontrolliert ein Unterregulon der generellen

Stressantwort, von dem 23 Proteine innerhalb dieser Arbeit nach Hitzestress absolut quantifiziert

werden konnten. 13 dieser Proteine zeigten ein Expressionsmuster wie es bereits für Ethanolstress

beschrieben wurde, was auf eine regulatorische Funktion von MgsR auch nach Hitzestress

hindeutet. Im Gegensatz dazu scheint sekundärer oxidativer Stress bei der Anpassung der

Genexpression an Glukosehunger keine wichtige Rolle zu spielen. In dieser Arbeit konnten für

nur 2 Proteine mit Funktionen gegen oxidativen und elektrophilen Stress (KatE, YbdD)

mindestens zweifach erhöhte Mengen während Glukosehungers detektiert werden. Da beide

Proteine durch σB reguliert werden, könnte ihre Akkumulation möglicherweise eher ein Effekt

dieses regulatorischen Mechanismus sein. Weitere 16 Proteine mit Funktionen bei der Anpassung

an oxidativen Stress konnten im Rahmen dieser Arbeit während Glukosehungers quantifiziert

werden. Keines dieser Proteine wurde während der stationären Phase in erhöhter Kopienzahl

gefunden. Dies wird auch in einer früheren Publikation bestätigt (Otto et al. 2010). Dort konnten

24 σB-unabhängige cytosolische Proteine mit Funktionen bei der Resistenz gegen oxidativen

Stress relativ quantifiziert werden. Nur drei dieser Proteine wurden in signifikant erhöhten

Mengen gefunden, was möglicherweise durch andere direkte oder indirekte regulatorische Effekte

verursacht worden sein könnte und nicht durch sekundären oxidativen Stress.

Die in diesem Abschnitt beschriebenen Ergebnisse sollen im Rahmen einer Publikation mit dem

Titel „Absolute protein quantification of stress and starvation responses in Bacillus subtilis“

veröffentlicht werden (Artikel IV; Maaß S, Wachlin G, Bernhardt J, Eymann C, Fromion V,

Riedel K, Becher D, Hecker M. 2014. Mol Cell Proteomics, in Revision [MCP/2013/035741]).


81


Glukosehungerantwort in Bacillus subtilis

Glukosehunger ist eines der am besten untersuchten Stresssysteme in B. subtilis. In den letzten

Jahren wurden verschiedenste Methoden genutzt, um die Hungeranpassung auf Transkriptom- und

Proteomebene zu untersuchen. So existieren Ergebnisse zur Anpassung der Genexpression

(Koburger et al. 2005) und der Proteinsynthese (Bernhardt et al. 2003) genauso wie Studien zur

Proteinstabilität (Gerth et al. 2008) oder der zeitaufgelösten Änderung von Proteinmengen

innerhalb verschiedener Subproteome (Otto et al. 2010). Im Rahmen dieser Arbeit konnten die

vorhandenen ausführlichen Ergebnisse um hoch qualitative und zeitaufgelöste absolute

Quantifizierungsdaten ergänzt werden. Dafür wurde das lösliche intrazelluläre Proteom von

B. subtilis zu sieben Zeitpunkten entlang der bakteriellen Wachstumskurve vor und während

Glukosehunger untersucht (vgl. Abschnitt 2.8.2.2) und dabei 465 Proteine absolut quantifiziert,

von denen 219 signifikant (p=0,05, ANOVA) veränderte Mengen zeigten. 427 der quantifizierten

Proteine wurden bereits in vorausgegangenen Studien relative quantifiziert (Otto et al. 2010).

Während die Anzahl der quantifizierbaren Proteine in dieser Arbeit auf cytosolische Proteine, die

mit 2D PAGE detektiert werden können, beschränkt ist, konnten Otto und Mitarbeiter durch

Nutzung MS-basierter Methoden quantitative Daten für 890 weitere Proteine bestimmen. Trotz

dieser deutlich höheren Proteomabdeckung konnten Otto et al. mit ihrer Methodik nur relative

Quantifizierungsdaten erzeugen, während im Rahmen dieser Arbeit erstmalig physiologisch

relevante absolute Proteinkonzentrationen von B. subtilis unter Glukosehunger bestimmt wurden.

Für das 87 kDa schwere Protein mit unbekannter Funktion YobO konnte dabei die geringste

Proteinmenge bestimmt werden (13 Moleküle pro Zelle nach 120 min stationärer Phase). IlvC, ein

Protein mit Funktion bei der Biosynthese verzweigtkettiger Aminosäuren und der

Elongationsfaktor Tu (TufA) waren mit rund 20.000 Molekülen die höchst abundanten Proteine in

der Zelle (nach 60 min stationärer Phase).

Die hohe Anzahl absolut quantifizierter Proteine ermöglicht neue Einblicke in die


82

Glukosehungeranpassung von B. subtilis. Die bevorzugte Kohlenstoffquelle Glukose wird nach

der Aufnahme über die Glykolyse verstoffwechselt. Diese erzeugt Vorläufermoleküle für den

Anabolismus, erlaubt aber auch die Energieerhaltung durch Substratkettenphosphorylierung. Bei

Glukoseüberschuss wird ATP fast ausschließlich über die Substratkettenphosphorylierung der

Glykolyse erzeugt. Durch absolute Proteinquantifizierung konnte im Rahmen dieser Arbeit das

molekulare Verhältnis glykolytischer Enzyme zueinander wie folgt bestimmt werden:

10 Moleküle Pgi : 38 Moleküle FbaA : 5 Moleküle GapA : 10 Moleküle Pgk : 4 Moleküle Pgm :

40 Moleküle Eno. Die unterschiedlichen Konzentrationen für die verschiedenen Enzyme eines

metabolischen Weges weisen auf eine unterschiedliche Enzymaktivität oder Substrataffinität hin

und konnten auch in anderen Arbeiten nachgewiesen werden (Muntel et al. 2014, Artikel V).

Auch eine Funktion der Enzyme außerhalb des spezifischen Stoffwechselweges wäre denkbar.

Das stöchiometrische Verhältnis innerhalb des Kernkomplexes des Zitronensäurezyklus,

bestehend aus der Isocitratdehydrogenase Icd, der Malatdehydrogenase Mdh und der

Citratsynthase CitZ (Meyer et al. 2011), wurde wie folgt bestimmt: 4 Moleküle Icd :

4 Moleküle Mdh : 1 Molekül CitZ. Da sowohl Mdh als auch Icd mit einer Vielzahl anderer

Proteine des Zitronensäurezyklus und assoziierter metabolischer Wege interagieren, könnten die

berechneten Stöchiometrien aus cytoplasmatischen Proteinextrakten jedoch vom tatsächlichen

Mengenverhältnis innerhalb des temporären Proteinkomplexes abweichen.

Der Übergang von wachsenden zu hungernden Zellen geht mit einer weitläufigen Umorganisation

des Genexpressionsmusters einher. So wird nach dem Übergang in die stationäre Phase aufgrund

von Glukosehunger die Synthese von mehr als 400 Proteinen abgeschaltet, während mehr als 150

Proteine induziert werden (Bernhardt et al. 2003). DNA Arrays ergaben sogar, dass fast 1.000

Gene reprimiert werden und etwa dieselbe Zahl neu exprimiert wird (Blencke et al. 2003;

Koburger et al. 2005). Dabei wird der zentrale Kohlenstoffmetabolismus am offensichtlichsten

reguliert. Die Glykolyse wird nach dem Verbrauch von Glukose repremiert, da das gapA-Operon

zur Expression hohe Glukosekonzentrationen benötigt (Tobisch et al. 1999; Fillinger et al. 2000;

Ludwig et al. 2001). Eine alleinige Repression der Genexpression in nicht-wachsenden Zellen


83

würde zu stabilen Proteinmengen führen. Halbierte Proteinmengen für glykolytische Enzyme nach

180 min Glukosehunger weisen daher auf eine zusätzliche proteolytische Degradation

unbeschäftigter Enzyme hin (Tab. 11). Zeitgleich werden die Schlüsselenzyme der

Glukoneogenese, GapB und PckA, deutlich induziert (Bernhardt et al. 2003; Koburger et al. 2005;

Otto et al. 2010). Die Proteinmenge dieser Enzyme konnte im Rahmen dieser Arbeit auf 1.700

(GapB) und 3.700 (PckA) Moleküle pro Zelle während des exponentiellen Wachstums sowie

4.400 (GapB) und 5.200 (PckA) Moleküle pro Zelle nach vier Stunden Glukosehunger bestimmt

werden (Tab. 11).

Darüber hinaus wird der Zitronensäurezyklus, der für die vollständige Oxidation von Glukose

über Acetyl-Coenzym A benötigt wird, dereprimiert, was den Überflussmetabolismus nicht länger

nötig macht (Bernhardt et al. 2003; Koburger et al. 2005; Otto et al. 2010). Wie erwartet, deuten

die im Rahmen dieser Arbeit bestimmten absoluten Enzymmengen auf einen erhöhten Bedarf an

Zwischenprodukten des Zitronensäurezyklus während Glukosehungers hin. So erhöhte sich die

Anzahl zellulärer Kopien der Citratsynthase CitZ, einer Unterheinheit der α-

Ketogluteratdehydrogenase (OdhA), beider Untereinheiten der Succinyl-CoA-synthetase (SucC,

SucD) und einer Untereinheit der Succinatdehydrogenase (SdhA) um mindestens Faktor 1,7

(Tab. 11).

Weitere hungerspezifische Regulationen gewährleisten die CcpA-vermittelte Aufnahme und

Nutzung alternativer Kohlenstoffquellen und die Bewegung von Zellen in Richtung neuer

Nährstoffquellen durch Chemotaxis. So konnten in dieser Arbeit für die Untereinheiten der

Acetoindehydrogenase (AcoABC) signifikant erhöhte Proteinmengen bestimmt werden. Dies traf

auch auf die Acetyl-CoA-synthetase AcsA sowie die 6-Phospho-α-glukosidase MalA und IolD zu

(Tab. 11); Enzyme, die für den Katabolismus von sekundären Kohlenstoffquellen wie Acetat,

Maltose und Myo-Inositol benötigt werden. Dies deutet auf eine Derepression CcpA-abhängiger

kataboler Gene auch ohne die Anwesenheit eines ersichtlichen externen Induktors hin. Im Falle

von AcsA kann die Akkumulation des Proteins durch einen möglichen internen Induktor erklärt

werden, da der Abbau von Lipiden während der hungerbedingten stationären Phase (Koburger et


84

al. 2005) eine zusätzliche Quelle für Acetyl-Coenzym A bilden könnte.

Der Vergleich der absoluten Proteinmengen dieser Arbeit mit den Ergebnissen der relativen

Proteinquantifizierung von Otto und Mitarbeitern (Otto et al. 2010) ergab, dass die Anreicherung

von Enzymen des Zitronensäurezyklus, der Glukoneogenese und für die Verstoffwechselung

sekundärer Kohlenstoffquellen weniger signifikant war. Hier ist zu berücksichtigen, dass während

der relativen Quantifizierung Proteinmengen zweier Bedingungen verglichen werden, ohne die

tatsächliche Konzentration in der Zelle zu berücksichtigen. Im Gegensatz dazu bezieht die

absolute Quantifizierung dieser Arbeit die Anzahl der bakteriellen Zellen einer Probe und deren

Größe in die Berechnung der Kopienanzahl mit ein. Daher verursacht eine reduzierte Zellgröße,

wie z. B. während Glukosehungers, eine verringerte Kopienzahl pro Zelle bei gleichbleibender

Proteinkonzentration im Gesamtproteinextrakt. Dies verstärkt die quantitativen Effekte negativer

Regulationen und schwächt die Effekte positiver Regulationen ab. Da diese Arbeit absolute

Proteinmengen als Anzahl der Moleküle in einer Zelle betrachtet, ist dies die Erklärung für die

scheinbar geringere Anreicherung verschiedener Proteine.

Während der Anpassung an Glukosehunger konnte schon mit Eintritt in die stationäre Phase eine

deutlich verringerte Menge von Proteinen mit Funktionen in der Aminosäurebiosynthese

beobachtet werden. Dieser Effekt verstärkte sich nach 240 min Glukosehunger noch einmal

deutlich. Die auffälligsten Änderungen der Proteinmenge wurden dabei für die biosynthetischen

Wege von Methionin, Arginin und verzweigtkettiger Aminosäuren festgestellt. So sank die Menge

der Cystathionin-β-lyase MetC und der Methioninsynthase MetE mehr als 3fach. Dies trifft auch

auf Proteine mit Funktionen in der Biosynthese von Arginin, wie der N-acetyl-g-

glutamylphosphatreduktase ArgC und der Acetylornithintransaminase ArgD zu. Ähnliche

Ergebnisse konnten für Biosyntheseenzyme verzweigtkettiger Aminosäuren wie der

Threonindehydratase IlvA, der Aminotransferase YwaA und der 2-Isopropylmalatsynthase LeuA

beobachtet werden (Tab. 11). Dies unterstützt die Annahme, dass der Abbau ungenutzter Enzyme

unter Hungerbedingungen helfen kann, den Bedarf an Aminosäuren zu decken, was die

Notwendigkeit von Aminosäureneusynthesen reduzieren würde.


85

Tab. 11: Proteinmengen (in Molekülen pro Zelle) für ausgewählte Proteine der spezifischen

Stressantwort von B. subtilis nach 240 min Glukosehunger.

Moleküle/Zelle

Protein Funktion exp. Phase Glukosehunger

Glykolyse

Pgi Glukose-6-phosphatisomerase 35.600 14.400

PfkA Phosphofruktokinase 8.100 4.300

FbaA Fructose-1,6-phosphataldolase 120.000 69.900

GapA Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase 19.300 13.600

Pgk Phosphoglyceratkinase 28.900 21.100

Pgm Phosphoglyceratmutase 12.300 7.800

Eno Enolase 140.000 71.000

Glukoneogenese und Nutzung alternativer Kohlenstoffquellen

GapB Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase 1.700 4.400

PckA Phosphoenolpyruvatcarboxykinase 3.700 5.200

PycA Pyruvatcarboxylase 2.800 3.600

AcoA Untereinheit der Acetoindehydrogenase 6.300 24.000

AcsA Acetyl-CoA Synthetase 4.100 8.400

MalA 6-Phospho-alpha-glucosidase 1.200 3.100

IolD Myoinositolstoffwechsel 160 410

Zitronensäurezyklus

CitZ Citratsynthase 21.300 34.300

OdhA Untereinheit der α-Ketoglutaratdehydrogenase 4.000 7.900

SucC Untereinheit der Succinyl-CoA-Synthetase 17.300 28.700

SucD Untereinheit der Succinyl-CoA-Synthetase 4.900 11.500

SdhA Untereinheit der Succinatdehydrogenase 4.500 7.600

Aminosäuresynthese

MetC Cystathionin-β-lyase 4.900 1.600

MetE Methioninsynthase 67.400 21.700

ArgC N-acetyl-g-glutamylphosphatreduktase 2.800 800

ArgD Acetylornithintransaminase 4.300 1.400

IlvA Threonindehydratase 2.400 180

YwaA Aminotransferase der verzweigtkettigen Aminosäuren 15.300 5.800

LeuA 2-Isopropylmalatsynthase 7.500 3.000

Nur die Verfügbarkeit von absoluten Proteinmengen ermöglicht die Untersuchung der Verteilung

eben dieser Mengen auf die wesentlichen Lebensabläufe in B. subtilis. Dabei scheint die

Verteilung der Ressourcen und v. a. der Proteine innerhalb der Zelle wesentlich das Wachstum der

Population zu beeinflussen (Scott et al. 2010; Shachrai et al. 2010; Goelzer et al. 2011). Der

Hauptaspekt liegt dabei im sparsamen Umgang mit Nährstoffen vermittelt durch verschiedene

Regulationsmechanismen wie z. B. der Repression spezieller Stoffwechselwege. Diese gesparten


86

Nährstoffe können dann in biologische Prozesse für eine Steigerung des Zellwachstums investiert

werden, wie z. B. durch Erhöhung der Translationskapazität. Das Wissen über die Kosten eines

biologischen Prozesses, definiert als die investierte Gesamtproteinmenge, ist daher besonders

wichtig für das physiologische Verständnis der Stressanpassung. Dabei sind die Kosten eines

biologischen Prozesses als Summe der Kosten der einzelnen involvierten Proteine zu verstehen,

wobei die Kosten einzelner Proteine aus deren absoluter Menge und dem Molekulargewicht

berechnet werden (Muntel et al. 2014, Artikel V).

Eine Analyse der Proteinmengenverteilung und damit der Proteinkosten ergab, dass ein

erheblicher Teil der dem Aminosäurestoffwechsel zugeordneten Proteinmasse während

Glukosehungers dem zentralen Kohlenstoffwechsel überlassen wird (Abb. 14). Der erhöhte

Bedarf an Proteinmenge im zentralen Kohlenstoffwechsel wird mit hoher Wahrscheinlichkeit

durch die Induktion des Zitronensäurezyklus, der Glukoneogenese und der Wege zur Aufnahme

sekundären Kohlenstoffquellen verursacht und kann nicht allein durch die verringerten

Proteinmengen glykolytischer Enzyme gedeckt werden.

Abb. 14: Verteilung der Proteinmengen zwischen den Lebensprozessen in B. subtilis während des

Glukosehungers. Die relative Verteilung der Proteinmasse auf wesentliche Lebensprozesse sind in den

Balken wie folgt dargestellt (von links nach rechts): während des exponentiellen Wachstums (exp.),

während der transienten Phase (trans.), zum Zeitpunkt der maximalen optischen Dichte (max. OD), sowie

nach 60 min, 180 min und 240 min stationäre Phase bedingt durch Glukosehunger.

Die gute Datenlage dieser Arbeit führt auf die Frage hin, wie lange es dauert, bis Änderungen in

der Proteinsynthese auf Ebene der akkumulierten Proteinmengen messbar werden. Um diese


87

Frage zu beantworten, wurden die absoluten Proteinmengen während Glukosehunger mit älteren

Daten zur Proteinsynthese verglichen (Bernhardt et al. 2003). Da nur die Proteine mit einem

veränderten Expressionsmuster für diese Art der Analyse von Interesse sind, wurden gemeinsam

Abb. 15: Verteilung der Dauer von Proteinan- und –abreicherung nach Induktion und Repression

der Synthese während Glukosehungers. Gemeinsam quantifizierte Proteine dieser Arbeit und einer

Arbeit zur Proteinsynthese (Bernhardt et al. 2003) wurden verglichen. Die Zeitpunkte, an denen die ersten

Mengenänderungen messbar waren, wurden gegenübergestellt und die Zeitspanne zwischen Synthese- und

Mengenänderung berechnet. Diese bildet die Grundlage für den verwendeten Farbcode in den Voronoi-

Karten. Die ersten drei Karten (von oben links nach unten rechts) zeigen die Hierarchie der analysierten

Proteine. In der vierten Karte (unten rechts) sind induzierte/ akkumulierte Proteine in Orange,

repremierte/abgereicherte Proteine in Blau dargestellt. Je schneller die Änderung der Proteinmenge

detektiert wurde, desto weniger grau erscheint die Farbe (siehe Farbcode unter der Karte unten rechts).


88

quantifizierte Proteine beider Studien, die eine mindestens zweifach veränderte Proteinsynthese

zeigten, gegenübergestellt. Dies führte zur genaueren Analyse von 41 induzierten und 100

repremierten Proteinen. Für etwa die Hälfte der induzierten Proteine konnten gesteigerte

Proteinmengen im selben Probenzeitpunkt detektiert werden, was auf eine zeitnahe

Proteinexpression und –anreicherung hindeutet (Abb. 15).

Diese Proteine erfüllen Funktionen in der Verarbeitung genetischer Informationen, wie z. B. das

Paralog ribosomaler Proteine Ctc, der transkriptionale Elongationsfaktor GreA oder der

alternative Sigmafaktor σB, oder werden für die Nutzung alternativer Kohlenstoffquellen benötigt

(AcsA, LicH, AcoB). Die Akkumulation anderer induzierter Proteine benötigte mindestens 60 min

(Abb. 15). Die Funktionen der Proteine, deren Mengen sich erst sehr spät anreicherten

(>240 min), sind sehr unterschiedlich und können nicht ohne Weiteres zusammengefasst werden.

Dem gegenüber steht, dass 80 % der repremierten Proteine länger als 240 min nach Beginn der

Repression ihrer Synthese in der Zelle stabil sind (Abb. 15). Die meisten dieser Proteine (62,5 %)

erfüllen Aufgaben im zentralen Kohlenstoffstoffwechsel und bei der Biosynthese von

Nukleotiden, Aminosäuren und Kofaktoren. Nur drei Proteine konnten als sehr instabil

klassifiziert werden. Diese waren das Translationsenzym Tgt, CarB, involviert in die Biosynthese

von Arginin und ein Enzym des Schwefelmetabolismus (Sat).






Hitzestressantwort in Bacillus subtilis

Hitzestress in B. subtilis ist einer der bestuntersuchten Modellansätze für die Anpassung dieses

Bakteriums an sich ändernde Umweltbedingungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das lösliche


89

intrazelluläre Proteom von B. subtilis unter Kontrollbedingungen und nach 10, 30 und 60 min

Hitzestress bei 52 °C untersucht (vgl. Abschnitt 2.8.2.2) und dabei 701 Proteine absolut

quantifiziert, von denen 287 signifikant (p=0,05, ANOVA) veränderte Mengen zeigten. Bis zu

dieser Arbeit waren nur relative Quantifizierungsdaten für 246 cytosolische Proteine verfügbar

(Wolff et al. 2006). Mit dieser Studie konnte die Proteomabdeckung um 455 Proteine erweitert

werden, wobei für alle 701 Proteine, die während Hitzestress identifiziert wurden, auch absolute

Quantifizierungsdaten bereitgestellt werden konnten. Als Protein mit der geringsten

intrazellularen Konzentration konnte dabei die DNA-Exonuklease SbcC bestimmt werden

(7 Moleküle pro Zelle nach 60 min Hitzestress). Das Chaperonin GroES war mit

500.000 Molekülen pro Zelle (nach 30 min Hitzestress) das höchst abundante Protein in der Zelle.

Die Gene und Proteine, die nach Hitzestress induziert werden, gehören verschiedenen Regulons

an. Der transkriptionale Repressor HrcA, der spezifisch auf Hitze reagiert, bindet an konservierte

regulatorische Sequenzen, die sogenannten CIRCE-Elemente (Kurzform für engl.: controlling

inverted repeat of chaperone expression, kontrollierende, sich gegenläufig wiederholende DNA-

Sequenzen für die Chaperonexpression). Das HrcA-Regulon umfasst zwei Operons: Eines

beinhaltet neben anderen Genen auch die Gene für den Regulator HrcA, das Chaperon DnaK und

dessen Regulatorprotein GrpE (Schulz und Schumann 1996; Homuth et al. 1997). Es ist

beschrieben, dass die ersten drei Gene des HrcA-Operons, dnaK, grpE und hrcA, nach moderatem

Hitzestress (48 °C) stark induziert werden, während die Expression nachgeordneter Gene (dnaJ,

yqeT, yqeU, yqeV) maximal verdoppelt wird (Helmann et al. 2001). Im Gegensatz dazu konnte

unter den wachstumshemmenden Bedingungen bei 52 °C, die in dieser Arbeit verwendet wurden,

eine 4-5fache Anreicherung des molekularen Chaperons DnaK und dessen Aktivators GrpE

gemessen werden (Tab. 12). Im zweiten Operon sind die Gene groEL und groES organisiert, die

ebenfalls für Chaperone kodieren (Li und Wong 1992; Schmidt et al. 1992). Im Rahmen dieser

Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich die Mengen von GroEL und GroES unter Hitzestress um

mehr als das 10fache erhöhen (Tab. 12). GroES war mit etwa 7 % der Gesamtmasse der

detektierten Proteine das höchst abundante Protein während des Hitzestresses.


90

Tab. 12: Proteinmengen (in Molekülen pro Zelle) für ausgewählte Proteine der spezifischen

Stressantwort von B. subtilis nach 60 min Hitzestress. * aufgrund einer transienten Regulation ist der

Wert für 30 min Hitzestress angegeben.

Moleküle/Zelle

Protein Funktion exp. Phase Hitzestress

Chaperone und Proteasen

ClpC ATPase der ClpC-ClpP-Protease 1.100 11.200

ClpE ähnlich zur ATP-abhängigen Clp-Protease 850 890

ClpP proteolytische Untereinheit der Clp-Proteasen 12.500 97.800

DnaK molekulares Chaperon 11.000 51.100

GrpE Aktivierung von DnaK 2.000 8.400

GroEL Chaperonin 20.000 190.000

GroES Chaperonin 37.000 500.000

HtpG molekulares Chaperon 1.200 17.000

LonA Protease 250 680

hitzeinduzierbare Proteine

NfrA Stressprotein 400 2.000

AhpC Untereinheit der Alkylhydroperoxidreduktase 56.000 250.000

AhpF Untereinheit der Alkylhydroperoxidreduktase 7.800 33.000

Proteine mit abnehmender Menge

HisH Tyrosintransaminase 1.000 600

MetE Methioninsynthase 70.800 42.600

ThiF Biosynthese von Thiamin 370 200

HisF Biosynthese von Histidin 4.200 2.700*

ArgB N-acetylglutamat- 5-phosphotransferase 470 150*

PatB Cystathion-β-lyase 3.800 2.600*

MoeA Molybdopterinbiosyntheseprotein 730 290*

Weitere hitzeinduzierte Gene werden durch den negativen Regulator CtsR kontrolliert und

kodieren für Proteasen und Chaperone wie ClpP, ClpC und ClpE (Krüger und Hecker 1998; Derré

et al. 1999a, 1999b). Da die Gene dieses Regulons zumindest teilweise auch durch σB reguliert

werden, können sie zeitgleich dem σB-Regulon zugeordnet werden. Dies erklärt auch, warum die

Expression dieser Enzyme zusätzlich durch eine Reihe weiterer Stressoren verstärkt werden kann.

Transkriptionsstudien der Hitzestressantwort in B. subtilis zeigen eine starke Induktion des CtsR-

Operons, die ihr Maximum zehn Minuten nach Beginn des Stresses und damit erst nach der

Aktivierung des σB-Regulons erreicht (Helmann et al. 2001).

Im Rahmen dieser Arbeit konnten für die ATPasen ClpC und ClpE sowie für die Protease ClpP

signifikant gesteigerte Proteinkonzentrationen nachgewiesen werden. Schon nach 10 min


91

Hitzestress stieg die Menge ClpE um das siebenfache an (6.000 Moleküle pro Zelle). Nach 30 min

Hitzestress erreichte die Proteinmenge von ClpE jedoch schon wieder fast das Basalniveau von

850 Kopien pro Zelle, was auf eine geringe Proteinstabilität von ClpE hinweist. Ähnliche

Beoachtungen wurden bereits von Gerth und Mitarbeitern gemacht (Gerth et al. 2004). Im

Gegensatz dazu wurden ClpC und ClpP nach 10 min Hitzestress um das 4-8fache angereichert

(Tab. 12) und die erhöhte Proteinmenge war anschließend während des gesamten Experiments

(bis 60 min Hitzestress) messbar. Dabei gehören ClpP und ClpC mit 98.000 und

12.000 Molekülen pro Zelle nach 30 min Hitzestress zu den 100 abundantesten Proteinen in

B. subtilis. Auch eine Analyse der Verteilung der Proteinmassen, die nur durch absolute

Quantifizierung möglich ist, verdeutlichte die ausgeprägte Anreicherung von Chaperonen und

Proteasen während des Hitzestresses. Diese Proteine bildeten 4 % der gesamten Proteinmasse

während des exponentiellen Wachstums bei 37 °C, ihr Anteil erhöhte sich jedoch nach Hitzestress

auf 13 %. Die Abnahme der relativen Proteinmenge von Enzymen der Aminosäurebiosynthese

von 22 % unter Kontrollbedingungen auf 13 % unter Hitzestress zeigt, dass die benötigten

Ressourcen für die deutlich erhöhte Menge von Chaperonen und Proteasen höchstwahrscheinlich

durch den Abbau von Enzymen der Aminosäurebiosynthese gewonnen werden.

Weitere hitzeinduzierte Gene gehören zum monocistronischen HtpG-Operon (Schumann 2003)

oder werden durch das Zweikomponentensystem CssRS kontrolliert (Darmon et al. 2002). Auf

Transkriptionsebene konnte 1997 eine zehnfache htpG-Induktion beim Übergang von 37 °C zu

48 °C bestimmt werden (Schulz et al. 1997). Die deutlich höhere Proteinanreicherung von HtpG,

die in dieser Arbeit bestimmt wurde (14fach, Tab. 12), ist daher höchst wahrscheinlich durch die

höhere Kultivierungstemperatur von 52 °C verursacht. Trotz der beschriebenen

Hitzeinduzierbarkeit konnte in dieser Arbeit kein Mitglied des CssRS-Regulons quantifiziert

werden. Dies liegt wahrscheinlich darin begründet, dass diese Proteine, mit Ausnahme von CssR,

membranverankert sind und daher nicht durch 2D PAGE erfasst werden können.

Zusätzlich sind hitzeinduzierte Proteine beschrieben, die keinem der zuvor beschriebenen

regulatorischen Einheiten angehören. Zu ihnen zählen FtsH (Deuerling et al. 1997), SacB


92

(Schumann et al. 2002), LonA (Riethdorf et al. 1994), AhpC, AhpF (Antelmann et al. 1996),

NfrA, YwcH (Moch et al. 2000) und Mitglieder des SigI-Regulons (Zuber et al. 2001). Obwohl

LonA während Hitzestress um das Dreifache angereichert wurde, konnte im ANOVA-Test keine

statistische Signifikanz nachgewiesen werden (p=0,05). Die Proteinmenge von NfrA wurde um

das Fünffache gesteigert, während sich die Konzentrationen von AhpC und AhpF um Faktor 4

erhöhten (Tab. 12).

Vergleiche der Daten dieser Arbeit mit bereits publizierten relativen Proteinquantifizierungen

(Wolff et al. 2006) zeigten eine gute Übereinstimmung. 23 von 46 hitzeinduzierten Proteinen

wurden auch in der Studie von Wolff und Mitarbeitern induziert gefunden.

Im Rahmen dieser und früherer Arbeiten konnten jedoch auch Proteine mit abnehmender Menge

während des Hitzestresses detektiert werden. Diese Proteine erfüllen überwiegend Funktionen

während des Zellwachstums. Zu Ihnen gehören ribosomale Proteine und Elongationsfaktoren,

aber auch Enzyme mit Aufgaben im Nukleotidstoffwechsel und der Biosynthese von

verschiedenen Aminosäuren (Wolff et al. 2006). Die absolute Quantifizierung ergab besonders

deutliche Effekte der negativen Regulation für die Tyrosintransaminase HisH, die

Methioninsynthase MetE und ThiF, ein Enzyme mit Funktion in der Thiaminbiosynthese

(Tab. 12). Die Menge dieser Proteine wurde während des Hitzestresses konstant gesenkt. Im

Gegensatz dazu sanken die Konzentrationen des zyklaseähnlichen Proteins HisF, der N-

acetylglutamat 5-phosphotransferase ArgB, der Cystathion-β-lyase PatB und des Molybdopterin-

biosyntheseproteins MoeA bis 30 min Hitzestress und erreichten bereits nach 60 min Hitzestress

wieder das Kontrolllevel (Tab. 12), was die globale Koordination verschiedener Regulationen als

Reaktion auf die Änderung der Wachstumsrate während des Hitzestresses unterstreicht. Auch für

die Proteine mit reduzierten Mengen nach Hitzestress konnte eine gute Übereinstimmung der

Daten dieser Arbeit mit bereits veröffentlichen Ergebnissen (Wolff et al. 2006) erreicht werden.

Von 38 Proteinen, die in einer der beiden Arbeiten negativ reguliert waren, zeigten 27 ein

ähnliches Regulationsmuster in beiden Studien.

Die im Rahmen dieser Arbeit umfassend ermittelten Proteinkonzentrationen erlaubten


93

weiterführend die Analyse von dynamischen Aspekten der Proteinsynthese während der

Stressanpassung auch ohne die Verfügbarkeit von „klassischen“ quantitativen Synthesedaten. So

konnte berechnet werden, dass 38 % der nach 60 min Hitzestress in der Zelle vorhandenen

Gesamtproteinmasse während der Stressphase neu gebildet wurde. Um diesen Aspekt genauer zu

untersuchen, wurde die Verteilung der zwischen den Probenzeitpunkten gebildeten Proteinmasse

auf funktionelle Gruppen analysiert (Abb. 16).

Abb. 16: Dynamische Aspekte der Verteilung der Proteinmasse in B. subtilis während Hitzestresses.

Die relative Verteilung der neu gebildeten Proteinmasse auf wesentliche Lebensprozesse sind im

Balkendiagramm wie folgt dargestellt (von links nach rechts): für Zellen während des exponentiellen

Wachstums (exp.), sowie in der ersten Phase (0 bis 10 min), der zweiten Phase (10 bis 30 min) und der

dritten Phase (30 bis 60 min) des Hitzestresses. Die Größe der Kreise darunter repräsentiert die relative

Menge der zwischen den verschiedenen Zeitpunkten akkumulierten Proteine (prozentuale Angaben als Zahl

in den Kreisen).

In den ersten 10 min des Hitzestresses sind 22 % der neu gebildeten Proteine Chaperone. In der

zweiten Stressphase, zwischen 10 und 30 min Hitze, stellt diese Proteingruppe den Hauptteil der

neu gebildeten Proteinmasse dar. Der Anteil der neu angereicherten Proteine mit Funktionen im

Aminosäurestoffwechsel ist in dieser Phase kleiner als 1 %. In der letzten untersuchten Phase des

Stresses, zwischen 30 und 60 min Hitze, scheint die Anpassungsreaktion der Zelle beendet zu


94

sein. Eine signifikante Menge der neu angereicherten Proteinmasse wird nun wieder von Enzymen

der Aminosäurebiosynthese gebildet. Diese Ergebnisse lassen zusammenfassend darauf schließen,

dass die Ressourcen für die Synthese dringend benötigter neuer Proteine unter Hitzestress, ähnlich

wie unter Glukosehunger, aus den biosynthetischen Enzymen für verschiedene Aminosäuren

gewonnen werden.

Obwohl diese Analysen wertvolle Einblicke in die Zellphysiolgie erlauben, setzt die Berechnung

voraus, dass die untersuchten Proteine in der Stressphase stabil sind. Dies mag für das

vergleichbar kurze Hitzestressexperiment (bis 60 min Stress) eine annehmbare Voraussetzung

sein, muss aber nicht zwangsläufig auf die Daten des Glukosehungerexperiments (bis 240 min

Hunger) anwendbar sein. Da die Menge eines Proteins immer die Balance zwischen

Proteinproduktion und –degradation darstellt, sind fast alle verringerten Proteinmengen während

der exponentiellen Phase eine direkte Folge des Verdünnungseffekts, der durch das Zellwachstum

verursacht wird. Das bedeutet, dass die Proteinproduktion in balancierten Systemen leicht zu

berechnen ist, da sie der Menge entspricht, die benötigt wird um den Verdünnungseffekt

auszugleichen. Deshalb ist die Proteinproduktion für jedes Enzym das Produkt seiner

Gleichgewichtsmenge und der Wachstumsrate. Auch in einem nicht-balancierten System, wie

z. B. der transienten Phase während eines Stresses, lässt sich die Proteinproduktion bestimmen,

allerdings nur unter der Voraussetzung, dass eine Verringerung der Proteinmenge nur auf den

Verdünnungseffekt zurückzuführen ist. In diesem Falle würde eine mögliche Proteolyse einiger

Proteine dazu führen, dass die Proteinproduktion unterschätzt wird. Obwohl die berechneten

Werte zur Proteinsynthese deshalb nur eine Abschätzung der Mengen angereicherter Proteine sein

können, gewähren sie wichtige Einblicke in die regulatorischen Aspekte während der

Stressanpassung von B. subtilis.






95

3.4 Umfassende absolute Quantifizierung mittels MSE

Da die in dieser Arbeit etablierte Methode der gelbasierten absoluten Proteinquantifizierung auf

im Gel abbildbare Proteine limitiert ist, ist die Entwicklung einer gelfreien Technik zur

Bestimmung molarer Proteinmengen der logisch nachfolgende Schritt. Mit Hilfe der Erkenntnisse

aus der Optimierung der Methode der Kalibration von 2D Gelen konnte eine solche gelfreie

absolute Quantifizierungstechnik für cytosolische Proteine von B. subtilis durch Jan Muntel

etabliert werden.

Für die absolute Quantifizierung von Proteinen mittels MSE wird die durchschnittliche

Signalintensität der drei höchstabundanten Peptide eines Standardproteins (hier die

Alkoholdehydrogenase aus Hefe) für die Bestimmung eines universellen Umrechnungsfaktors

genutzt. Dieser wird dann für alle identifizierten Proteine im Gemisch angewendet, um für

Proteine in einen dynamischen Bereich von bis zu vier Größenordnungen die Konzentration zu

berechnen (Silva et al. 2006). Mit Hilfe der gelfreien umfassenden Quantifizierung konnten

Proteinmengen von 20 bis 150.000 Molekülen pro B. subtilis-Zelle bestimmt werden. Die

Genauigkeit der MSE-Methode zur absoluten Quantifizierung (durchschnittlicher Fehler 1,4fach)

wurde durch SRM-Analysen ausgewählter Proteine und der zugehörigen AQUA-Peptide

bestimmt und ist vergleichbar mit oder sogar besser als bei anderen labelfreien Methoden zur

umfassenden absoluten Proteinquantifizierung.

Die neu etablierte Methode konnte für die absolute Quantifizierung von mehr als 1.000

cytosolischen Proteinen von B. subtilis unter zwei verschiedenen metabolischen Bedingungen

genutzt werden und dabei eine überdurchschnittliche Sequenzabdeckung von 40 % erreichen. Die

Abweichung innerhalb technischer Replikate war kleiner als 30 %, für mehr als die Hälfte der

quantifizierten Proteine sogar kleiner als 20 %, was einer geeigneten Reproduzierbarkeit für

umfassende absolute Quantifizierungsansätze entspricht.

Im Vergleich der umfassenden absoluten Quantifizierung mittels MSE mit der absoluten

gelbasierten Quantifizierung (Maass et al. 2011, Artikel II) konnte der dynamische Bereich von


96

drei auf vier Größenordnungen erweitert und gleichzeitig die Anzahl der quantifizierten Proteine

etwa verdreifacht werden. Trotz dieser deutlich erhöhten Proteinabdeckung ist die Quantifizierung

kleiner Proteine mit einem Molekulargewicht von unter 8 kDa auch mit der gelfreien Strategie

problematisch. Dies ist höchstwahrscheinlich darin begründet, dass von diesen Proteinen nicht

ausreichend viele tryptische Peptide innerhalb des analytischen Fensters der MS erzeugt werden.

Vergleichbare Studien an E. coli konnten mit einer Methode, die auf Spectal Counting basiert,

1.103 Proteine absolut quantifizieren (Ishihama et al. 2005a). Diese Proteinabdeckung ist

vergleichbar mit der in der Studie von Muntel und Mitarbeitern, basiert aber auf der

Vorfraktionierung des Peptidgemisches durch Kationenaustauschchromatographie, was

wiederrum die Genauigkeit der absoluten Proteinquantifizierung negativ beeinflussen kann (vgl.

Abschnitt 3.2).

Um die umfassende absolute Proteinquantifizierung mittels MSE auf ihre biologische Relevanz

hin zu überprüfen, wurden einige physiologische Aspekte von B. subtilis unter

Wachstumsbedingungen, die entweder Aminosäuresynthese oder Aminosäuredegradation

erfordern, untersucht. Die hohe Anzahl quantifizierter Proteine durch MSE ermöglichte dabei u. a.

die genaue Betrachtung der Mengen von Proteinen, die demselben Operon angehören. Dabei

wurden in der Arbeit von Jan Muntel und Kollegen nur gut beschriebene Operons des zentralen

Stoffwechsels und der Kofaktorsynthese mit mindestens drei quantifizierten Proteinen untersucht.

Es konnten zwei verschiedene Arten von Operons unterschieden werden: Für einige Operons, wie

z. B. dem his-Operon, sind die Proteinmengen für alle Gene etwa gleich hoch, während Proteine

mit deutlich unterschiedlichen Konzentrationen für andere Operons, wie dem ilv-leu-Operon,

gefunden wurden. Diese unterschiedlichen Proteinmengen könnten durch posttranskriptionale

Modifikationen verursacht worden sein (Mäder et al. 2004), was verdeutlicht, dass umfassende

absolute Quantifizierung neue Möglichkeiten zur systematischen Charakterisierung

posttranskriptionaler Regulationen und damit tiefere Einblicke in die Zellphysiologie eröffnet.

Darüber hinaus konnte in der Arbeit von Jan Muntel gezeigt werden, dass die Verfügbarkeit einer

großen Menge hochqualitativer absolute Proteinmengen nicht nur die Validierung der Anpassung


97

der Proteinmenge durch bekannte regulatorische Netzwerke, sondern auch die Berechnung von

Proteinkosten für zelluläre Prozesse und die Analyse der Ressourcennutzung während der

Adaptation an veränderte Umweltbedingungen erlaubt.


Titel „Comprehensive absolute proteome quantification of Bacillus subtilis by multiplexed LC/MS

(LC/MSE)“ veröffentlicht werden (Artikel V; Muntel J, Fromion V, Goelzer A, Maaß S, Mäder U,

Büttner K, Hecker M, Becher D. 2013. Mol Cell Proteomics, in Revision [MCP/2013/032631]).

3.5 Zusammenfassung und Ausblick

Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine kostengünstige gelbasierte Methode zur umfassenden

absoluten Proteinquantifizierung entwickelt und etabliert werden. Dies ermöglichte die Erzeugung

hochqualitativer Daten, die für den Einsatz in der Systembiologie geeignet sind und so neue

Einblicke in die Zellphysiologie erlauben. Auf Grundlage absoluter Proteinmengen können

Stöchiometrien in Proteinkomplexen und innerhalb metabolischer Netzwerke bestimmt,

Berechnungen von Proteinkosten und der Ressourcenverteilung innerhalb einer Zelle durchgeführt

und Aussagen über die Regulation von Proteinsynthese und –anreicherung getroffen werden, ohne

dabei auf traditionelle radioaktive Techniken zugreifen zu müssen. Die eingehende Optimierung

der Probenaufbereitung für eine absolute Proteinquantifizierung im Rahmen dieser Arbeit bildet

die Grundlage für die gelbasierte absolute Quantifizierung und weiterführenden Arbeiten mit dem

Ziel gelfreie Methoden zur absoluten Proteinquantifizierung zu entwickeln.

Die Anwendung der umfassenden absoluten Proteinquantifizierung durch Kalibration von

2D Gelen auf verschiedene Modellsysteme führte zu einer Erweiterung vorhandener Datensätze

um Proteinkonzentrationen und gewährte so wesentliche Einblicke in die unterschiedliche

Regulation der generellen Stressantwort und der Ressourcenverteilung und –nutzung während der

Stressanpassung von B. subtilis an Glukosehunger und Hitzestress.

In weiterführenden Arbeiten kann die gelbasierte Methode zur absoluten Quantifizierung von


98

Proteinisoformen oder der genaueren Untersuchung von Proteinkomplexen genutzt werden. Auch

eine Anwendung zur Analyse anderer Wachstums- und Stressbedingungen ist denkbar.

Quellenangaben

99

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Publikationsliste

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5 Publikationsliste

5.1 Originalarbeiten und Beiträge der Autoren

Artikel I: Tefon BE, Maass S, Ozcengiz E, Becher D, Hecker M, Ozcengiz G. 2011. A

comprehensive analysis of Bordetella pertussis surface proteome and identification of new

immunogenic proteins. Vaccine 29: 3583–3595.

Das experimentelle Konzept dieser Arbeit wurde von BET, EO und GO erarbeitet. BET führte die

Experimente und Datenanalyse durch. SM und DB waren verantwortlich für die

Proteinidentifizierung und –quantifizierung. Das Manuskript schrieben BET, OE, MH und OG.

Alle Autoren bewerteten und kommentierten das Manuskript.

Artikel II: Maass S, Sievers S, Zühlke D, Kuzinski J, Sappa PK, Muntel J, Hessling B, Bernhardt

J, Sietmann R, Völker U, Hecker M, Becher D. 2011. Efficient, global-scale quantification of

absolute protein amounts by integration of targeted mass spectrometry and two-dimensional gel-

based proteomics. Anal Chem 83: 2677–2684.

Das experimentelle Konzept dieser Arbeit wurde durch MH, UV und DB erstellt. SM, SS, JM und

BH führten die Experimente sowie die massenspektrometrische Analyse und

Proteinquantifizierung durch. DZ war für die 2D Gelanalyse von S. aureus verantwortlich. JK und

JB führten die Farbstofftests durch und RS unterstützte bei der mikroskopischen Analyse für die

Bestimmung der Zellgrößen. PKS führte die QCAT-Analysen zur Methodenevaluation durch. An

der Publikation arbeiten SM, SS, MH, UV und DB. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und

kommentierten das Manuskript.

Artikel III: Moche M, Albrecht D, Maaß S, Hecker M, Westermeier R, Büttner K. 2013. The

new horizon in 2D electrophoresis -new technology to increase resolution and sensitivity.

Electrophoresis 34: 1510–1518.

Publikationsliste

115

Das experimentelle Konzept dieser Arbeit wurde von MH, RW, MH und KB erarbeitet. MM

erstellte die HPE-Gele, SM führte die traditionelle 2D PAGE durch. AD identifizierte die

ausgeschnittenen Proteinspots. Das Manuskript schrieben MM, SM, RW und KB. Alle Autoren

bewerteten und kommentierten das Manuskript.

Artikel IV: Maaß S, Wachlin G, Bernhardt J, Eymann C, Fromion V, Riedel K, Becher D,

Hecker M. 2014. Absolute protein quantification of stress and starvation responses in Bacillus

subtilis. Mol Cell Proteomics, in Revision (MCP/2013/035741).

Das experimentelle Konzept dieser Arbeit wurde durch MH, DB und SM erstellt. GW führte die

Experimente zum Hitzestress durch und erstellte die dazugehörigen 2D Gele. CE führte die Pulse-

Chase-Experimente unter Glukosehunger durch, erstellte die Autoradiogramme und analysierte

die Synthesedaten für Proteine des σB-Regulons. SM führten die Experimente für den

Glukosehunger durch und erstellte die zugehörigen 2D Gele. Alle massenspektrometrischen

Analysen und Proteinquantifizierungen wurden durch SM durchgeführt. JB und VF bearbeiteten

die erhaltenen Daten mit bioinformatischen Methoden und erstellten gemeinsam mit SM die

Abbildungen. An der Publikation arbeiteten SM, JB, KR, DB und MH. Alle Autoren diskutierten

die Ergebnisse und kommentierten das Manuskript.

Artikel V: Muntel J, Fromion V, Goelzer A, Maaß S, Mäder U, Büttner K, Hecker M, Becher D.

2014. Comprehensive absolute proteome quantification of Bacillus subtilis by multiplexed LC/MS

(LC/MSE). Mol Cell Proteomics, in Revision (MCP/2013/032631).

JM führte die Kultivierungen und MSE-Messungen für diese Arbeit durch. SM quantifizierte die

Proben mit Hilfe des AQUA-Ansatzes. Statistische Analysen und die bioinformatische

Verarbeitung der Daten erfolgte durch VF und AG. UM und KB trugen zur Analyse des

Aminosäurestoffwechels bei. JM, AG, SM, UM, KB, MH und DB arbeiteten an der Publikation.

Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und kommentierten das Manuskript.

Publikationsliste

116

5.2 Poster

Kühnel S, Becher D, Bernhardt J, Hildisch H, Völker U, Hecker M. 2008. Quantitative proteomics

of stationary phase adaptation in Bacillus subtilis. Evaluationsmeeting SysMo, Bad Honnef.

Kühnel S, Hartmann A, Becher D, Völker U, Hecker M. 2009. Relative and absolute proteomics

monitoring Bacillus subtilis during Batch-Fermentation. Evaluationsmeeting SysMo, Wien,

European Summer School „Proteomics Basics“, Brixen.

Maaß S, Sievers S, Zühlke D, Muntel J, Heßling B, Kuzinski J, Bernhardt J, Sietmann R, Völker

U, Hecker M, Becher D. 2010. Proteome-wide absolute quantification of proteins using targeted

mass spectrometry and 2-D PAGE. Tagung “Systems Biology of Microorganisms”, Paris.

Maaß S, Sievers S, Zühlke D, Kuzinski J, Sappa PK, Muntel J, Heßling B, Bernhardt J, Sietmann

R, Völker U, Hecker M, Becher D. 2011. Global scale quantification of absolute protein

amounts by integration of targeted mass spectrometry and 2-D gel-based proteomics. VAAM –

Jahrestagung, Karlsruhe.

Moche M, Albrecht D, Maaß S, Hecker M, Westermeier R, Büttner K. 2013. New Technology to

Increase Reproducibility, Resolution and Sensitivity in 2D Electrophoresis. Proteomic Forum,

Berlin.

5.3 Vorträge auf internationalen Tagungen

Kühnel S, Becher D, Hecker M. 2009. A proteomic view on the Big Experiment. SysMo-Meeting

im Rahmen der BACELL-Tagung, Kopenhagen.

Maaß S, Kohlstedt M, Völker U, Wittmann C, Becher D, Hecker M. 2010: Relative and absolute

protein quantification in BaCell SysMO 2. SysMo-Meeting, Göttingen.

Maaß S, Kohlstedt M, Völker U, Wittmann C, Becher, D, Hecker M. 2011. A proteomic view on

Chemostat experiments, SysMo-Meeting im Rahmen der BACELL-Tagung, Göttingen.

Anhang

117

Anhang

Anh. 1: Sequenzen der quantifizierten Peptide aus B. subtilis und ihre optimierten SRM-Parameter.

Die quantifizierten Peptide der Kalibrationsproteine sind mit ihrer Vorgängerionenmasse (Q1 m/z),

ihrer Fragmentionenmassen (Q3 m/z) sowie den korrespondierenden Übergangsparametern

Eingangspotential (EP), Declustering Potential (DP), Kollisionsenergie (CE) und

Kollisionszellenaustrittspotential (CXP) aufgeführt. Die markierte, 13

C und 15

N enthaltende Aminosäure ist

fett gedruckt.

Protein Peptidsequenz Q1 m/z Q3 m/z Ion DP (V) EP (V) CE (V) CXP (V)

CitZ EAAVPQEIIEHFK 507,61 575,81 y9 103,0 6,4 18,5 8,50






CitZ VPGLVAAFSR 513,81 561,32 y5 100,0 8,2 30,0 8,00






CitZ IEDIVTSEK 520,28 797,42 y7 102,0 6,2 24,0 13,75

CitZ IEDIVTSEK 520,28 926,47 y8 102,0 5,9 24,0 14,25

CitZ IEDIVTSEK 520,28 464,23 y4 102,0 6,0 34,5 14,25

CitZ IEDIVTSEK 517,27 791,41 y7 102,0 6,2 24,0 13,75

CitZ IEDIVTSEK 517,27 920,45 y8 102,0 5,9 24,0 14,25

CitZ IEDIVTSEK 517,27 464,23 y4 102,0 6,0 34,5 14,25

Icd GPLTTPVGGGIR 566,33 655,38 y7 58,0 7,5 31,0 10,00






Icd VVTYDFAR 487,75 776,36 y6 92,0 12,8 21,5 14,75

Icd VVTYDFAR 487,75 512,25 y4 92,0 13,0 28,0 14,50

Icd VVTYDFAR 487,75 397,23 y3 92,0 15,0 37,0 9,00

Icd VVTYDFAR 485,75 772,36 y6 92,0 12,8 21,5 14,75

Icd VVTYDFAR 485,75 508,25 y4 92,0 13,0 28,0 14,50

Icd VVTYDFAR 485,75 393,22 y3 92,0 15,0 37,0 9,00

Icd YFTGVPSPVK 550,80 790,47 y8 93,5 14,5 28,0 12,50

Icd YFTGVPSPVK 550,80 689,42 y7 93,5 14,5 31,5 7,50

Icd YFTGVPSPVK 550,80 527,32 y5 93,5 14,5 27,5 21,50

Icd YFTGVPSPVK 547,80 784,46 y8 93,5 14,5 28,0 12,50

Anhang

118

Anh. 1: fortlaufend.


Icd YFTGVPSPVK 547,80 683,41 y7 93,5 14,5 31,5 7,50

Icd YFTGVPSPVK 547,80 527,32 y5 93,5 14,5 27,5 21,50

Mbl TPPELSADIIDR 668,85 799,42 y7 106,0 12,0 35,0 8,00






Mbl HVYLEEEPK 575,79 1013,52 y8 110,0 6,0 30,0 9,50

Mbl HVYLEEEPK 575,79 914,45 y7 110,0 6,0 29,0 8,25

Mbl HVYLEEEPK 575,79 751,39 y6 110,0 6,0 29,0 9,00

Mbl HVYLEEEPK 572,28 1006,50 y8 110,0 6,0 30,0 9,50

Mbl HVYLEEEPK 572,28 907,44 y7 110,0 6,0 29,0 8,25

Mbl HVYLEEEPK 572,28 744,37 y6 110,0 6,0 29,0 9,00

Mbl GIVLNEPSVVALDK 729,42 832,48 y8 100,0 8,5 32,0 16,00






PyR GADIPVDITDQK 640,34 923,49 y8 100,0 12,0 28,0 13,00






PyrR AVILDEQAIR 566,32 961,54 y8 98,0 9,5 25,0 9,00






PyrR GADIPVDITDQK 639,33 921,49 y8 80,0 11,0 28,0 16,00






PyrR VILVDDVLYTGR 684,89 1156,62 y10 124,5 5,1 28,5 11,25






Anhang

119



SdhA YPAYGNLVPR 580,31 665,40 y6 105,0 10,0 32,0 8,00






SdhA TPEGLLDFR 529,28 730,41 y6 102,0 8,0 30,0 10,00

SdhA TPEGLLDFR 529,28 859,45 y7 102,0 8,0 29,0 12,00

SdhA TPEGLLDFR 529,28 332,20 y2 102,0 8,0 35,0 8,00

SdhA TPEGLLDFR 524,28 720,40 y6 102,0 8,0 30,0 10,00

SdhA TPEGLLDFR 524,28 849,45 y7 102,0 8,0 29,0 12,00

SdhA TPEGLLDFR 524,28 322,19 y2 102,0 8,0 35,0 8,00

SdhA ININDTTK 463,80 813,42 y7 92,5 3,1 26,0 7,00

SdhA ININDTTK 463,80 699,38 y6 90,0 5,8 22,5 6,00

SdhA ININDTTK 463,80 228,13 b2 89,0 7,8 24,0 5,50

SdhA ININDTTK 459,75 805,40 y7 92,5 3,1 26,0 7,00

SdhA ININDTTK 459,75 691,36 y6 90,0 5,8 22,5 6,00

SdhA ININDTTK 459,75 228,13 b2 89,0 7,8 24,0 5,50

Upp GYIVPGLGDAGDR 650,33 433,24 b4 100,0 9,5 25,0 12,50

Upp GYIVPGLGDAGDR 650,33 867,42 y9 100,0 9,5 28,0 14,00





Upp LPSDVEER 476,24 831,38 y7 113,0 9,0 26,0 11,00

Upp LPSDVEER 476,24 734,33 y6 113,0 9,0 29,0 11,00

Upp LPSDVEER 476,24 532,27 y4 113,0 9,0 35,0 11,00

Upp LPSDVEER 472,73 831,38 y7 113,0 9,0 26,0 11,00

Upp LPSDVEER 472,73 734,33 y6 113,0 9,0 29,0 11,00

Upp LPSDVEER 472,73 532,27 y4 113,0 9,0 35,0 11,00







Upp LGVVPILR 436,80 498,34 y4 81,0 4,6 22,5 6,75

Upp LGVVPILR 436,80 603,42 y5 81,0 4,6 23,5 9,00

Upp LGVVPILR 436,80 759,51 y7 81,0 4,5 27,5 11,00

Upp LGVVPILR 433,79 498,34 y4 81,0 4,6 22,5 6,75

Upp LGVVPILR 433,79 597,41 y5 81,0 4,6 23,5 9,00

Upp LGVVPILR 433,79 753,50 y7 81,0 4,5 27,5 11,00

YkrZ LDELLENFK 564,81 900,49 y7 104,0 9,5 24,0 11,00

YkrZ LDELLENFK 564,81 1015,52 y8 104,0 9,5 27,0 10,00

Anhang

120



YkrZ LDELLENFK 564,81 658,37 y5 104,0 9,5 26,0 11,00

YkrZ LDELLENFK 560,80 892,48 y7 104,0 9,5 24,0 11,00

YkrZ LDELLENFK 560,80 1007,50 y8 104,0 9,5 27,0 10,00

YkrZ LDELLENFK 560,80 650,35 y5 104,0 9,5 26,0 11,00

YkrZ LNPGDLISVPENIR 773,93 937,53 y8 105,0 10,0 42,0 13,75






YkrZ QQILDTFETEIK 736,39 1102,57 y9 100,0 3,8 32,0 11,00






YkrZ AQDVISLSDSNP 626,81 726,33 y7 83,5 5,1 21,0 11,25

YkrZ AQDVISLSDSNP 626,81 527,28 b5 83,5 6,4 22,0 7,50



YkrZ AQDVISLSDSNP 623,30 527,28 b5 83,5 6,4 22,0 7,50


Anhang

121

Anh. 2: Sequenzen der quantifizierten Peptide aus S. aureus und ihre optimierten SRM-Parameter.

Die quantifizierten Peptide der Kalibrationsproteine sind mit ihrer Vorgängerionenmasse (Q1 m/z), ihrer

Fragmentionenmassen (Q3 m/z) sowie den korrespondierenden Übergangsparametern Eingangspotential

(EP), Declustering Potential (DP), Kollisionsenergie (CE) und Kollisionszellenaustrittspotential (CXP)

aufgeführt. Die markierte, 13

C und 15

N enthaltende Aminosäure ist fett gedruckt.

Protein Peptidsequenz Q1 m/z Q3 m/z Ion

DP

(V)

EP

(V)

CE

(V) CXP (V)

GroEL VGAASETELK 506,28 713,37 y6 85 9,5 25,0 11,50






GroEL IEDALNSTR 513,27 912,45 y8 95 10,0 30,0 9,00






GroEL GVDQLANAVK 511,29 865,49 y8 90 8,8 23,5 8,00






AtpA AEEISALLR 504,79 808,50 y7 90 6,8 25,0 7,50

AtpA AEEISALLR 504,79 679,46 y6 90 6,8 25,0 6,50

AtpA AEEISALLR 504,79 566,37 y5 90 6,8 25,5 8,25

AtpA AEEISALLR 501,28 801,48 y7 90 6,8 25,0 7,50

AtpA AEEISALLR 501,28 672,44 y6 90 6,8 25,0 6,50

AtpA AEEISALLR 501,28 559,36 y5 90 6,8 25,5 8,25

AtpA TTIAIDTILNQK 669,39 1022,60 y9 110 8,5 32,0 9,75






AtpA GYLDDIPVVDITR 741,40 805,48 y7 115 2,8 29,5 5,25

AtpA GYLDDIPVVDITR 741,40 677,31 b6 115 2,8 26,5 12,00


AtpA GYLDDIPVVDITR 738,39 799,47 y7 115 2,8 29,5 5,25



RplJ DHEALEIK 481,25 382,14 b3 92 7,0 37,5 10,75

RplJ DHEALEIK 481,25 453,17 b4 92 7,0 35,0 12,75

Anhang

122



DP

(V)

EP

(V)

CE

(V) CXP (V)

RplJ DHEALEIK 481,25 253,09 b2 92 7,0 39,0 4,50

RplJ DHEALEIK 477,75 382,14 b3 92 7,0 37,5 10,75

RplJ DHEALEIK 477,75 453,17 b4 92 7,0 35,0 12,75

RplJ DHEALEIK 477,75 253,09 b2 92 7,0 39,0 4,50

RplJ GLTVAEVTDLR 590,33 809,44 y7 95 6,3 31,5 13,25






Upp LPQDITER 489,77 768,40 y6 70 4,0 31,0 12,00

Upp LPQDITER 489,77 640,34 y5 70 4,0 32,0 9,00

Upp LPQDITER 489,77 525,31 y4 70 4,0 37,5 7,75

Upp LPQDITER 486,26 761,38 y6 70 4,0 31,0 12,00

Upp LPQDITER 486,26 633,32 y5 70 4,0 32,0 9,00

Upp LPQDITER 486,26 518,29 y4 70 4,0 37,5 7,75

Upp AYITPGLGDAGDR 656,83 965,48 y10 78 5,0 30,0 15,50


Upp AYITPGLGDAGDR 656,83 449,24 b4 78 5,0 27,0 12,75



Upp AYITPGLGDAGDR 653,33 449,24 b4 78 5,0 27,0 12,75

Upp DLELQDVDIETPVTK 861,45 1123,60 y10 110 6,0 40,0 19,00






SACOL2053 DEFETPILK 549,79 854,51 y7 85 10,0 22,5 14,50






SACOL2053 LGFGGNDLGSDALK 685,86 1053,53 y11 108 9,5 37,0 10,00






SACOL2053 ETEQFVADLIK 649,85 811,50 y7 110 8,0 31,5 13,50



Anhang

123



DP

(V)

EP

(V)

CE

(V) CXP (V)




Anhang

124

Anh. 3: Sekundärer oxidativer Stress. Gelistet sind die absoluten Proteinmengen in Molekülen pro Zelle und die relativen quantitativen Änderungen nach Hitzestress

für Proteine mit einer Funktion bei der Anpassung an oxidativen und elektrophilen Stress. Für alle aufgeführten Proteine ist eine σB-abhängige Regulation sowie eine

bekannte Induktion nach Hitze- und oxidativem Stress (Reder et al. 2012) vermerkt. Fett gedruckte Proteinnamen kennzeichnen quantitative Änderungen um mindestens

Faktor 4 und werden im Haupttext diskutiert.

Moleküle pro Zelle relative Änderung

Protein

BSU-

Nummer σB-abhängig

induziert

nach Hitze

und oxid.

Stress Funktion Kontrolle 10‘ 30‘ 60‘ 10‘ 30‘ 60‘

YvyD BSU35310 x x generelles Stressprotein 207 681 3.262 9.540 3,29 15,76 46,09

OhrB BSU13160 x x generelles Stressprotein 1.457 12.252 26.988 20.433

8,41 18,52 14,02

SigB BSU04730 x x RNA Polymerase Sigmafaktor SigB 53 227 459 676

4,28 8,66 12,75

YsnF BSU28340 x x generelles Stressprotein, Überleben nach

Ethanolstress

115 986 509 256 8,57 4,43 2,23

Dps BSU30650 x - generelles Stressprotein 1.657 11.213 14.860 17.867

6,77 8,97 10,78

SodA BSU25020 x - generelles Stressprotein, Superoxidmutase 50.924 110.342 179.084 224.860

2,17 3,52 4,42

TrxA BSU28500 x - antioxidative Funktion 9.490 23.432 36.874 36.691

2,47 3,89 3,87

YraA BSU27020 x - generelles Stressprotein 1.373 4.051 5.061 4.852

2,95 3,69 3,53

KatE BSU39050 x - generelles Stressprotein, Katalase 570 1.028 1.269 1.855

1,80 2,23 3,25

YvgN BSU33400 x - generelles Stressprotein, Glyoxalreduktase 22.012 38.419 44.612 54.906

1,75 2,03 2,49

YdbD BSU04430 x - generelles Stressprotein 2.088 3.282 3.989 3.890

1,57 1,91 1,86

KatX BSU38630 x - generelles Stressprotein, Katalase 414 577 361 242

1,39 0,87 0,58

NfrA BSU38110 - - Stressprotein, Nitro/Flavinreduktase 394 1.102 1.623 2.015

2,80 4,12 5,11

Tpx BSU29490 - - mögliche Thiolperoxidase 7.703 16.365 26.057 35.678

2,12 3,38 4,63

AhpC BSU40090 - - Alkylhydroperoxidereduktase (kleine Untereinheit) 56.404 122.829 179.490 253.482

2,18 3,18 4,49

AhpF BSU40100 - - Alkylhydroperoxidereduktase (große Untereinheit) 7.753 14.286 21.777 33.379

1,84 2,81 4,31

OhrA BSU13140 - - Peroxidase 502 877 1.239 1.958

1,75 2,47 3,90

AzoR1 BSU19230 - - Azoreduktase 3.013 5.211 11.391 11.585

1,73 3,78 3,85

AzoR2 BSU33540 - - ähnlich zu NAD(P)H-Dehydrogenase 4.564 7.377 8.379 15.738

1,62 1,84 3,45

Anhang

125


Moleküle pro Zelle relative Änderung

Protein

BSU-

Nummer σB-abhängig

induziert

nach Hitze

und oxid.

Stress Funktion Kontrolle 10‘ 30‘ 60‘ 10‘ 30‘ 60‘

MsrA BSU21690 - - Peptidmethioninsulfoxidreduktase 164 249 481 562

1,52 2,93 3,43

MhqA BSU12870 - - Hydroquinon-spezifische Dioxygenase 519 986 1.398 1.658

1,90 2,69 3,19

YgaF BSU08720 - - ähnlich zu bacterioferritin comigrierendem Protein 1.278 2.110 2.346 4.000

1,65 1,84 3,13

HypO BSU07830 - - NAD(P)H-flavinoxidoreduktase 979 1.402 1.631 3.062

1,43 1,67 3,13

YwbC BSU38370 - - mögliche Methylglyoxalase 3.854 6.778 8.080 11.618

1,76 2,10 3,01

MrgA BSU32990 - - DNA-bindendes Stressprotein 808 1.210 1.279 2.321

1,50 1,58 2,87

CatR BSU33680 - - unbekannte Funktion 105 287 316 300

2,73 3,01 2,86

YodC BSU19550 - - ähnlich zu Nitroreduktase 3.942 5.772 6.104 10.996

1,46 1,55 2,79

YqjM BSU23820 - - NADPH-abhänginge Flavinoxidoreduktase 957 1.532 1.805 2.209

1,60 1,89 2,31

MhqD BSU19560 - - möglicherweise involviert in Schutz gegen Methyl-

hydroquinon

2.156 2.889 2.322 4.354 1,34 1,08 2,02

BshA BSU22460 - - ähnlich zu Protein in Verbindung mit Lipopoly-

saccharidbiosynthese

312 444 678 612 1,42 2,17 1,96

MsrB BSU21680 - - Peptidmethioninsulfoxidreduktase 775 1.264 1.520 1.154

1,63 1,96 1,49

BshB1 BSU22470 - - unbekannte Funktion 406 416 349 557

1,02 0,86 1,37

BshC BSU15120 - - unbekannte Funktion 894 1.093 973 1.193

1,22 1,09 1,33

KatA BSU08820 - - vegetative Katalase 1 2.359 2.485 1.720 2.330

1,05 0,73 0,99

HxlA BSU03460 - - 3-Hexulose-6-phosphatsynthase 180 267 87 36 1,48 0,48 0,20

Anhang

126

Relative und absolute Proteinquantifizierung in Bakterien

Documents

Transcript of Relative und absolute Proteinquantifizierung in Bakterien