Klinische Chemie Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostikund LaboratoriumsdiagnostikggVorlesung: Chromatographie und Vorlesung: Chromatographie und MassenspektrometrieMassenspektrometrie

Dr. rer. nat. Frank Kannenbergg Zentrale Einrichtung Labor

– UKM Labor –Universitätsklinikum MünsterAlbert-Schweitzer-Campus 1

D 48149 MünsterD-48149 MünsterTel.: 0251 83-47227Fax: 0251 83-47225

www.klichi.uni-muenster.defrank.kannenberg@ukmuenster.de

Wintersemester 2020/21

Säulenchromatographieg pPetroleum ether Farbe

h“chroma”schreiben

“ h i ”Chlorophyll-Extrakt “graphein”

CaCO3

Was ist Chromatographie?g pTrennung ähnlicher Moleküle aus komplexen Gemischen

• Die Analyte werden in einer mobilen Phase gelöst und y gdarin durch eine stationäre Phase transportiert.

• Die Phasen werden so gewählt, dass sich die Analyte unterschiedlich in ihnen verteilen.

• Durch die dadurch entstehenden Mobilitätsunterschiede trennen sich die Probe Komponenten in Banden a ftrennen sich die Probe-Komponenten in Banden auf.

Trennprinzipp pmobile Phase

Säulenanfang Säulenende• Stoffgemisch

StationärePhase

• Stoffgemisch• Komponenten

wechseln ständigzwischen mobiler

Zeitund stationärerPhasePhase

• Gleichgewicht(V t il(Verteilung,Adsorption)

• Trennung

Trennprinzipp pIInjektorInjektor

SSäuleSäule

DDDetektor

CCChromato-gramm

Dünschichtchromatographie (DC)• stationäre Phase:

B Ki l l ( l ) f– z.B. Kieselgel (polar) aufGlasplatte oder Alufolie

• mobile Phase:mobile Phase:– Laufmittel, z.B. Ethanol

• DC-Chromatogramm:DC Chromatogramm:– Auftragen (man./autom.)– Entwickeln („DC-Lauf“)– Trocknen, Detektieren

(ggf. Anfärben)P l ität b ht !• Polaritäten beachten!- polare (hydrophile)

Analyten laufen“ aufAnalyten „laufen aufKieselgel nicht

Retentionsfaktor (R Wert)Retentionsfaktor (Rf –Wert)

Laufstrecke SubstanzR

• Substanzspezifisch (bei gleichen chromat

Laufstrecke LösungsmittelRf

(bei gleichen chromat.Bedingungen)

Eintauch- 1 2Eintauchtiefe

HPLC (HighPerformanceLiquidChromatography)( )

Pumpe

PumpeTrennsäuleTrennsäule

EluentDetektor

EinspritzventilSäulennofen

RP-HPLC: Medikamentenanalyse

• Detektion + QuantifizierungQuantifizierung– Photometrie

(„UV-/vis Detektor“)(„ )– auch andere

Detektoren• Peak

– Retentionszeitsubstanzspezifischsubstanzspezifisch

– Höhe, Fläche proportional zur Konzentration

– KalibrationQuantifizierung– Quantifizierung

Gaschromatographie: Vgl. HPLC• HPLC: Mobile Phase flüssig (Laufmittel)• GC: Mobile Phase gasförmig (Trägergas)

GC– Vorteile GC:• Trennleistung (v.a. kleine, unpolare Moleküle)g ( p )• Empfindlichkeit

Nachteile GC:– Nachteile GC:• Verbindungen müssen flüchtig oder leicht

d fb i ( f D i ti i )verdampfbar sein (ggf. Derivatisierung)• Apparativer Aufwand (Gasleitungen)

GC: Schematischer AufbauReservoir für Probenaufgabe Chromatogr. Detektormobile Phase Trennsäule Schreiber, EDV

Gasflaschemit Vorreinigung

InjektorAutosamplerHeadspace-

f

gepackte SäuleKapillarsäule

FIDWLDMSD

Aufgabe AEDNPDECD

10.06.2011 11

GC-Anwendung: Toxikologie Blutalkohol Methanol-VergiftungBlutalkohol, Methanol-Vergiftung

Blood Alcohols

Column: Econo-Cap™ EC-WAX , 30m x 0.32mm x 0.25um Temp: 50°CCarrier: Helium at 1.08mL/min (22.5 cm/sec) D t t FID t 300°CDetector: FID at 300°C

Peak Identification1 Acetaldehyde1 . Acetaldehyde2 . Acetone3 . Methanol4 . 2-Propanol4 . 2 Propanol5 . Ethanol

GC-Anwendung: StoffwechseldiagnostikGC Anwendung: StoffwechseldiagnostikSmith-Lemli-Opitz Syndrom

• SLO-Syndrom– vererbbarer Defekt in der Cholesterolbiosynthese– vererbbarer Defekt in der Cholesterolbiosynthese– schwere Missbildungen– Cholesterin stark erniedrigt

7-Dehydrocholesterin (7-DHC) und 8-DHC stark– 7-Dehydrocholesterin (7-DHC) und 8-DHC starkerhöht (Marker)

• AnalytikRoutine Cholesterin Analytik ungeeignet– Routine Cholesterin-Analytik ungeeignet

– GC zur Quant. von Cholesterin, 7-DHC, 8-DHC– 22 Fälle seit 1995 hier entdeckt, davon 2 pränatal

SLO: Häufige Missbildungeng g• Schädeldeformierung (Mikrozephalie)• breite Nasenwurzel• hoher Gaumenhoher Gaumen• abnorm kleiner Oberkiefer (Mikrognathie)

H bhä d Lid lt (Pt i )• Herabhängen der Lidspalten (Ptosis)• Verwachsungen an Fingern + Zehen (Syndaktylie)• Minderwuchs• geistige Retardierung• geistige Retardierung• Muskelschwäche• Entwicklungsanomalie der Genitalien

Cholesterinvorläufer & Defekte• Endogenes Cholesterol

Biosynthese (Leber)

Lanosterol

Biosynthese (Leber)• Precurser

Lanosterol Cholestenol– Lanosterol, Cholestenol,Lathosterol, 7-DHC, 8-DHC

– DesmosterolCHILD-Syndrom

• Enzymdefekte– hereditär CHH-Syndrom

– schwere Erkrankungen

• Marker für die Lathosterolose

CholesterolsyntheseSLO-Syndrom

DesmosteroloseCholesterol

Quelle: Herman, Hum Mol Genet. 2003 15

SLO: GC-Chromatogrammg80

wl200195 ard

60

ster

ol

ster

ol

Cho

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a

40

ehyd

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mV

20

8-D

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7-D

Resp

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0

R

0 10 20 30

0

Retentionszeit in min

GC-Chromatogramm der Plasma-Neutralsterolfraktion eines SLO-Patienten.

GC/MS-Kopplung• GC

Ch t hi h– ChromatographischeGemisch-Trennung

• MS• MS– Detektor– Ionisation durchIonisation durch

Elektronenstoß (EI)– Massenspezifische

Trennung– Massenspektrum

substanzspezifischsubstanzspezifisch

Quelle der Animation: Trace GC. Thermo-Finnigan, 2002

Warum GC (oder HPLC) + MS?• alle GC-Methoden (FID) auch GC/MS tauglich

vielfältige Anwendungsbereiche– vielfältige Anwendungsbereiche– Medizin, Lebensmittel, Umwelt, Industrie, Gericht

höhere Empfindlichkeit• höhere Empfindlichkeit– mind. Faktor 100 im Vergleich zu GC (FID)

• NWG Dioxin: 1967 GC FID 500 pg; 1992 GC/HRMS 0 005 pg• NWG Dioxin: 1967 GC-FID 500 pg; 1992 GC/HRMS 0,005 pg• z.B. Drogennachweis in Haaren („Drogenkarriere“ über Jahre)

• qualitativ besseres Messergebnisqualitativ besseres Messergebnis– mehr Informationen (Massenspektrum)– höhere Sicherheit bei der Substanzidentifizierunghöhere Sicherheit bei der Substanzidentifizierung

(z.B. Doping-Kontrolle)– Analyse unbekannter Verbindungen

(S )(Spektren-Bibliotheken)

Grundprizip der MSp p• geladene Teilchen (Ionen) können unter Vakuum

in einem Magnetfeld von ihrer Flugbahn abgelenkt werdeng

• Abhängig vonMasse (m)– Masse (m)

– Ladung (z)– Geschwindigkeit– Magnetfeldstärkeg

• massenabhängige Selektion von Ionen m/z

GC/MS: schematischer Geräteaufbau

• Verbindung zum GC:I t f T f LiInterface, Transfer Line

• Ionenerzeugung:Q ll I i i kQuelle, Ionisierungskammer

• massenspezifische Trennung der Ionen:MS-Analysator, Magnetfeld

• Detektion der Ionen:Detektor, Multiplier

• Datenaufnahme und Auswertung:gPC, EDV

Quelle der Animation: T.G. Chasteen 1996 (www.shsu.edu)

GC/MS: Dopingkontrolle

Urin Isolierung GC/MS-AnalyseUr n rung G /M na y

GC/MS-Gerät

LaborAnalyse

2 412.422.43

CoffeinInterner

x 10 6Standard

Positiver Dopingbefund

1 00 2 00 3 00 4 00 5 00 6 00 7 00 8 00 9 00

2.382.392.402.41

Ti >

Amphetamin Positiver Dopingbefund

1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00Time ->

Quelle: „Doping im Sport“; W. Schänzer; Institut für Biochemie, DSHS Köln, 2000

Sitosterolämie (Phytosterolämie)• Klinik:

– Xanthome, Xanthelasmen

Cholesterin

– Gelenkschmerzen, Arthritis– frühe Arteriosklerose + KHK

• Serum:

HO

Sitosterin

• Serum:– Cholesterin norm bis leicht – Phytosterine (pflanzl.Kost)

HO

y (p )bes. Sitosterin, Capesterin;)

– Sitostanol, CampestanolGallensäure CDCA– Gallensäure CDCA

• Nachweis:– GC, GC/MS,– Gen-Sequenzierung

• genetischer Defekt:– autosomal rezessiv– Mutation ABC G5, ABC G8 Quelle : www.meded.ucsd.edu

LC/MS• HPLC (LC)

– ChromatographischeTrennung

• MS– Problem: Lösungsmittel– Problem: Lösungsmittel– Ionisation: Elektrospray (ESI)

f– Massenspezifische Trennung– „Sanfte Ionisierung“

• Analyse großer Moleküle und Proteine

Quelle: “MASSENSPEKTROMETRIE gestern - heute – morgen”; Dr. Stefan Schürch, Universität Bern, 2004

Tandem-Massenspektrometrie• Kopplung von Massenspektrometern (MS)• „mehrdimensionale Massenspektrometrie“• Tandem-Massenspektrometrie = MS/MS• MS1: massenspezifisches Clean up“• MS1: massenspezifisches „Clean up

– Substanzgemisch– Matrix (Blut, Serum, Urin)

MS2 D t kti d A l t• MS2: Detektion der Analyten

MS/MS: Prinzip MS/MS: Drogen in Haaren• Nachweis von Drogen in Haaren

GC/MS (SIM)– GC/MS (SIM)– Signal: Analyt (Konzentration)– S/N durch clean up“ besserS/N durch „clean up besser

• höhere Empfindlichkeit• qualitativ besseres Messergebnisqualitativ besseres Messergebnis

– Informationsgehalt 1000x höherim Vergleich zu GC/MS

– höhere Sicherheit bei der Substanzidentifizierung(z B Doping-Kontrolle)(z.B. Doping Kontrolle)

– Analyse unbekannter Verbindungen(Spektren-Bibliotheken)

Isotopen-Verdünnungs-Analyse (ID/MS)

• Zugabe eines isotopenmarkierten Standardsisotopenmarkierten Standards(gleiches Verhalten wie Analyt)E t h h• Extrem hoheRichtigkeit/Präzision

f f• Referenzmethode fürKreatinin, Cholesterin, T t t GlTestosteron, Glucose,Harnsäure, Harnstoff, M dik tMedikamente.....

LCMS/MS: Immunsuppressiva• Kontrolle nach

OrgantransplantationenOrgantransplantationen– Enges therapeutisches Fenster– Zu niedrig: Organ-AbstoßungZu niedrig: Organ Abstoßung– Zu hoch: Nebenwirkungen (z.B.

Nierenversagen)• hohe Empfindlichkeit• qualitativ bessere Messergebnisse

im Vergleich zu Immunoassays– Bestimmung der „Muttersubstanz“

M t b lit k i K kti ität– Metaboliten: keine Kreuzreaktivität

MS/MS: Neugeborenen-Screening• Phenylketonurie (PKU)• Ahornsirupkrankheit (Leu, Ile, Val) • Homocystinurie• Glutarsäure Acidämie• Methylmalonsäure Acidämie• Propionsäure Acidämie• Tyrosinämie• Nicht-ketotische Hyperglyzinämie• Argininbernsteinsäure-Krankheit

H li ä i• Hyperprolinämie• Hypermethioninämie

ProNeugeborenen-Screening: PKU

PheAla KontrollePräparation und MS/MS-Analyse

Leu

Leu + Ile

Tyr

Phe

Kontrolle• Blutspot auf Filterpapier (3 mm )

MikrotiterplatteZ b M th l l i t

140 160 180 200 220 240 260 280

Gly

Ala

Val MetCit

Tyr

GluGly Ser

ValGlny

GluAsp

• Zugabe von Methanol plus isotopen-markierter interner StandardB t li ll A i i ä (AS) 140 160 180 200 220 240 260 280

Pro

Phe interner, isotopen-markierter Standard

• Butylierung aller Aminisäuren (AS)• Injektion und Ionisierung der Probe

keine Chromatographie !

AlaPKU

keine Chromatographie !• MS/MS-Analyse der AS-Produkte

(Neutralverlust Analyse)

AlaLeu

Cit

Phe

TyrVal

Leu + Ile

Gln Glu

(Neutralverlust-Analyse)• Quantifizierung der AS durch

Standard

140 160 180 200 220 240 260 280

GlyAla

Val MetCit Tyr

GluGly Ser

ValTyr

GluAsp

m/z

Standard

MALDI TOF MS:MALDI-TOF MS:Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry

ion detector

field free+ +

++

field-freedrift range

id l t d

acceleration

grid electrode

+

+

accelerationzone

matrix/analytecrystals

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template

Mikobiologie: Identifizierung von Keimen

• SpektrenbibliothekenId tifi i d• Identifizierung desStammes und der S iSpezies

• z.B. auch „EHEC“ ((enterohämorrhagischeEscherichia coli)

(Abb. : Fa. Shimadzu)