ElektrophoreseTeil 1

Skript zur Vorlesung „Grundlagen der Analytik I“im MSc-Studiengang Analytik

Prof. C. Vogt, Leibniz Universität Hannover 11.1.2007

Literatur

„Analytical Isotachophoresis“P. Bocek, M. Deml, P. Gebauer, V. Dolnik, VCH, Weinheim, 1988

„Gelelektrophorese“R. Westermeier, In Analytiker Taschenbuch, Bd. 7, Springer-Verlag, Berlin

„Isoelektrische Fokussierung“R. Westermeier, In Analytiker Taschenbuch, Bd. 7, Springer-Verlag, Berlin

„Capillary Electrophoresis: Principle and Practice“R. Kuhn, S. Hoffstetter-Kuhn, Springer Laboratory, Berlin, 1993

„Handbook of Capillary Electrophoresis“Ed. J. P. Landers, CRC Press, Boca Raton, 1997

“Advances in Electrophoresis”, Serie, Band 1, 2 und 6Eds. A. Chrambach, M. J. Dunn, B. J. Radola, VCH, Weinheim, 1987-1993

Gliederung

Grundlagengeschichtlicher Überblickwichtige GrößenTrennprinzipien

Zonenelektrophorese (ZE)Isotachophorese (ITP)Isoelektrische Fokussierung (IEF)

technische Realisierungen

KapillarelektrophoreseAufbau, apparative KomponentenPuffersysteme und AdditiveMizellare Elektrokinetische Kapillarchromatographie (MEKC)

Gelelektrophorese

Historische Entwicklung1791 Faraday Elektrolysegesetze

1853 Hittorf Überführungszahlen

1877 Helmholtz Elektroosmose

1887 Arrhenius Dissoziationstheorie

1897 Kohlrausch Regulierungsfunktion

1930 Tiselius Versuche zur Elektrophorese der wandernden Grenzflächen / erste reproduzierbar arbeitende Apparatur durch Kühleinheit / 1948 Nobelpreis

1960 Hjerten Elektrophorese der wandernden Grenzflächen erstmals in Kapillaren (i.D. 0,3 cm)

1967 Hjerten Theorie der trägerfreien Zonenelektrophorese

1968 Everaerts erste kommerzielle Isotachophoreseapparatur

1979 Mikkers Kapillarzonenelektrophorese

1987 Fa. Beckman erste kommerzielle Kapillarzonenelektrophorese-apparatur

Elektrophoretische Trennverfahren

Wanderung geladener Teilchen in einem elektrischen Feld

Mobilität eines Teilchens hängt von Ladung und Radius ab

Analyten mit unterschiedlichen Mobilitäten im Feld wandernunterschiedlich schnell und werden dadurch getrennt

Trenneffekte sind vom Medium (Trennpuffer) abhängig

Möglichkeit der Analyse neutraler Verbindungen durch WWmit geladenen Pufferzusätzen

Einteilung elektrophoretischer Verfahren

Einteilungskriterium

Getrennte Stoffmenge analytisch, mikropreparativ, preparativ

Trennprozess kontinuierlich, Stufenweise

Stabilisierungsmethoden tragerfrei, mit Trägermedium, Kapillare,Gele

Trennprinzip nur MigrationMigration und WW mit TrägermediumMigration, WW mit Trägermedium undDiffusionMigration und Verteilung

Potentialgradient Hochspannung, Niederspannung

Trenntechnik Zonenwandernde GrenzflächenIsotachophoreseFokussierung

Einteilung elektrophoretischer Verfahren

Zonenelektrophorese

Methode der wandernden Grenzflächen / Isotachophorese

Isoelektrische Fokussierung

Kombinationen mit weiteren TrenneffektenMizellare Elektrokinetische KapillarchromatographieGelelektrophorese

Trennprinzipien

IEF

Zonenelektrophorese IsotachophoreseIsoelektrischeFokussierung(C)ZE ITP

Puffer homogene ZSS Gemisch von Ampholyten

Zwei Elektrolyte

E / pH homogen KontinuierlicherGradient

StufenförmigerGradient

Probe Keine BegrenzungFür Molekular-gewichtKationen, Anionen,Neutralverbindungen

Ampholyte, pI µT < µS < µL

nur eine Ionenart

Wichtige Verfahren in kapillaren Trennsystemen:Kapillarzonenelektrophorese (CZE), Micellare Elektrophoretische Kapillarchromatographie (MEKC), Kapillargelelektrophorese (CGE)

Zonenelektrophorese

Trägermaterial → Papier oder Dünnschicht Celluloseacetat (Filterpapier)NitrocelluloseIonenaustauscherAluminiumoxid, Titaniumoxid

Trägerfrei → Kapillare

eindimensional / zweidimensional

vom Trägermaterial verursachte EffekteJoul´sche WärmeElektroosmoseAdsorptionDiffusion

Trägermaterialien für die ZonenelektrophoresePapier

Papier- und Dünnschichtelektrophoreseheute kaum noch gebräuchlich (bessere Trennung und höhere Beladbarkeitvon Agarose- und PAA-Gelen)Silikagel-Platten in Puffertanks

FilmeCelluloseacetatmembran (große Poren, daher schlechte Auftrennung für Proteine) – Trenneffekt basiert vollständig auf Ladungsdichte; aber einfaches Handling

GeleIdeal – einstellbare, regelmäßige Porengröße, chemische Inertheit, keine ElektroosmoseStärke (seit 1955) – 5-10 mm dick, geringe Reproduzierbarkeit, unpraktisches Handling der GeleAgarose – charakterisiert durch Schmelzpunkt und Ausmaß der auftretenden Elektroosmose, Porengröße abhängig von Konzentration (150-500 nm)Polyacrylamid – seit 1959, chemisch inert, mechanisch stabil, wenig ElektroosmoseKontrolle der Porengröße bei Synthese möglich

Zonenelektrophorese

Trennprinzip für Trägersysteme (schematisch)

Euv ii ⋅=

Zonenelektrophorese

Trennprinzip für trägerfreie Systeme (Kapillare)

Euv ii ⋅=

Isotachophorese

zwei Puffer - Leitelektrolyt (L) / Terminator (T)

µL,eff > µi,eff > µT,eff

L

GL

Gx

xLx cc

µµ−µ

⋅µ−µ

µ⋅=Gesetz von Kohlrausch

X … Probeion, G … Gegenion, L … Leition

je geringer die Mobilität von x, desto geringer ist auch seine Konzentration in der entsprechenden Zone

die Konzentration des Probeions in seiner Zone richtet sich nach der Konzentration des Leitions

das Gegenion G ist in jeder Zone in entsprechender Menge vorhanden

.konst1c1c1cT,T

T,GT,G

X,X

X,GX,G

L,L

L,GL,G =⎟

⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛

µ

µ−⋅=⎟

⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛

µ

µ−⋅=⎟

⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛

µ

µ−⋅

Isotachophorese

Löslichkeit und Stabilität1-10 mM (wasserlöslich), alternativ Zugabe organischer LMAuswahl Gegenion – Redoxprozesse, Fällung vermeiden

Auswahl der Elektrolytlösungen

Ionisierung und PufferungDissoziationsgrad ≥ 10 % notwendig für ausreichenden µeff-Effektsinnvolle Grenze pHLE ≈ pKA±1 und pKB±1

Isotachophorese

Euv ii ⋅=

Isotachophorese

Trennung der Lanthaniden

Elektrolytsystem:Leitelektrolyt: 2.7 mM KOH + 1.5 mM α-Hydroxyisobuttersäure + Essigsäure (pH 4.92) + 0.0025 % PVATerminator: β-Alanin

Detektion: PotentialgradientProbe: 5 nmol je Element

t /min

T

L1 2

3

7

10 1112

1314

15

98

65

4

E

Methode des komplexie-renden Gegenions L K+

1 Na+

2 La3+

3 Ce3+

4 Pr3+

5 Nd3+

6 Sm3+

7 Eu3+

8 Gd3+

9 Tb3+

10 Dy3+

11 Ho3+

12 Er3+

13 Tm3+

14 Yb3+

15 Lu3+

T β-Alanin

Elektrolytsysteme

Kontinuierlich Diskontinuierlich

v = µ . E

LT

E1E2

Isoelektrische Fokussierung

Trägermaterial : Polyacrylamid (PAGE), Sephadex

Kovalente Bindung der Ampholyte an die GelmatrixpH bleibt über gesamte Trennung konstantGradient vorausberechenbar - damit anpassbar an Analysenproblemextrem hohe Auflösung erreichbar (bis 0,01 pH/cm)

Trägerfrei : Dichtegradienten (Sucrose), Freie Lösung

Ampholyte mit Isoelektrischem PunktImmobilisiert oder frei

( )BS pKpK21pH +⋅=

Isoelektrische Fokussierung

bei niedrigem pH R-COO- + H+ → R-COOHR-NH2 + H+ → R-NH3

+

bei hohem pH R-COOH → R-COO- + H+R-NH3

+ → R-NH2 + H+

pH = pIB

pH = pIA

Isoelektrische Fokussierung

Entwicklung des pH-Gradienten für die IEF

Isoelektrische Fokussierung

Grundstrukturen von Trägerampholyten

N N

NR2 COOH

Polyamino-Polycarbonsäuren

x = 2 oder 3

COOH

freie Trägerampholyte

CH2NH

O R

Acrylamid-Derivateimmobilisierte Ampholyte

3

CH3

CH3

SO H

COOH

NO

N+ C2H5

C2H5H5C2

R = R =

R = H

x

basischsauer

Isoelektrische Fokussierung

Agarose-IEF mit Elektroden- und Probeaufgabe-Streifen

Struktur der Agaroseund des bei derPolymerisation gebildeten Gels

Isoelektrische Fokussierung

IEF von Isoformen des α-Antitrypsin (Protease-Inhibitor) in immobilisiertem pH-GradientpH 4.0 – 5.0

IEF von Kartoffelsaft unterschiedlicher Kartoffelarten in einem Polyacrylamidgel(angefärbt mit CoomassieBrilliant Blue)

Kombinierte Prinzipien - 2D

Erste Dimension → IEF mit immobilisiertem pH-GradientenpH 3-12 in 24 cm langem Gelstreifen

Zweite Dimension →SDS-PAGEIn 13%igem Gel

Detektion durch Silberfärbung

Erste Dimension

Zwei

te D

imen

sion

SDS-PAGE

Sodium docecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresisPolyacrylamid-Gelelektrophorese nach SDS-Zusatz

SDS überdeckt Eigenladung des Proteinsje Gramm Protein binden ca. 1.4 g SDS → Proteine im Gemisch mit konstanter LadungsverteilungSekundär- und Tertiärstrukturen werden in Vorbehandlung durch Brechen derWasserstoffbrücken und Streckung des Moleküls aufgebrochenDisulfidbrücken werden durch Reduktion gespaltenIn anschließender Trennung spielt nur noch Größe eine Rolle

Trennprinzipien

IEF

Zonenelektrophorese IsotachophoreseIsoelektrischeFokussierung(C)ZE ITP

Puffer homogene ZSS Gemisch von Ampholyten

Zwei Elektrolyte

E / pH homogen KontinuierlicherGradient

StufenförmigerGradient

Probe Keine BegrenzungFür Molekular-gewichtKationen, Anionen,Neutralverbindungen

Ampholyte, pI µT < µS < µL

nur eine Ionenart

Wichtige Verfahren in kapillaren Trennsystemen:Kapillarzonenelektrophorese (CZE), Micellare Elektrophoretische Kapillarchromatographie (MEKC), Kapillargelelektrophorese (CGE)