Ruhr-Universität Bochum PD Dr. med. Dirk Theegarten ...€¦ · Koreferent: Prof. Dr. med. J....

Ruhr-Universität Bochum

PD Dr. med. Dirk Theegarten

Dienstort: Universitätsklinikum Essen

Institut für Pathologie und Neuropathologie

Nachweis von Chlamydophila spp. bei der equinen

Recurrent Airway Obstruction (RAO)

- Ähnlichkeiten zu der humanen COPD -

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin

einer

Hohen Medizinischen Fakultät

der Ruhr-Universität-Bochum

Vorgelegt von

Britta Mentrup

Marl

2007

Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr

Referent: PD Dr. med. D. Theegarten

Koreferent: Prof. Dr. med. J. Guzman y Rotaeche

Tag der mündlichen Prüfung: 20.05.2008

Meinen Eltern und Geschwistern

gewidmet

4

IV. Inhaltsverzeichnis

I. Deckblatt

II. Blatt II

III. Widmung

IV. Inhaltsverzeichnis

V. Abkürzungsverzeichnis

VI. Tabellenverzeichnis

VII. Abbildungsverzeichnis

1. Einleitung S. 12

2. Grundlagen S. 14

2.1 Anatomie der Lunge eines Pferdes S. 14

2.2 Histologie der Lunge eines Pferdes S. 15

2.3 Physiologie der Atmung S. 17

2.3.1 Grundlagen der Atmung S. 17

2.3.2 Ventilation und Lungenvolumina S. 19

2.3.3 Atemmechanik S. 22

2.3.4 Gastransport und Gasaustausch S. 23

2.3.5 Regulation der Atmung S. 24

2.4 Obstruktive Lungenerkrankungen S. 26

2.5 Pathologie der RAO S. 27

2.5.1 Definition S. 27

2.5.2 Ätiologie S. 28

2.5.3 Pathogenese S. 30

2.5.4 Pathologische Anatomie S. 30

2.6 Therapie der RAO S. 32

2.6.1 beim Pferd S. 32

2.6.2 beim Menschen S. 33

2.7 Chlamydien S. 34

2.7.1 Morphologie und Lebenszyklus S. 34

2.7.2 Genetik und Taxonomie S. 35

2.7.3 Vorkommen wichtiger Chlamydiosen S. 36

5

2.7.4 Diagnostik der Chlamydieninfektion S. 38

3. Material und Methoden S. 40

3.1 Patientengut S. 40

3.2 Einschlusskriterien S. 40

3.3 Ausschlusskriterien S. 43

3.4 Materialentnahme und Verarbeitung S. 44

3.5 Histologie S. 45

3.5.1 Histologische Bearbeitung und Auswertung der Proben S. 45

3.6 Immunhistochemie S. 46

3.6.1 Durchführung der Immunhistochemie S. 46

3.7 Immunfluoreszenzmikroskopie S. 47

3.7.1 Durchführung der Immunfluoreszenzmikroskopie S. 48

3.8 PCR S. 48

3.8.1 Durchführung der PCR S. 49

4. Ergebnisse S. 51

4.1 Ergebnisse der Klinik S. 51

4.2 Ergebnisse der Histologie S. 53

4.3 Ergebnisse der Immunhistochemie S. 55

4.4 Ergebnisse der Immunfluoreszenzmikroskopie S. 61

4.5 Ergebnisse der PCR S. 67

4.6. Statistik S. 68

4.7 Sonderfall MPf 9 S. 71

5. Diskussion S. 73

6. Zusammenfassung S. 76

7. Literaturverzeichnis S. 78

8. Anhang S. 89

8.1 Verwendete Reagentien S. 89

8.2 Arbeitsprotokolle S. 92

8.2.1 Arbeitsprotokoll Immunhistochemie S. 92

8.2.2 Arbeitsprotokoll Immunfluoreszenz S. 94

8.3 Markierungsprotokolle S. 95

8.3.1 Markierungsprotokoll Immunhistochemie S. 95

6

8.3.2 Markierungsprotokoll Immunfluoreszenz S. 96

8.4 RAO-Fragebogen S. 98

8.5 Tabellenanhang S. 100

VIII. Danksagung

IX. Lebenslauf

7

V. Abkürzungsverzeichnis

a. andere Ursachen für respiratorische Insuffizienz

AA Atemarbeit

AaDO2 alveolo-arterielle Sauerstoffpartialdruckdifferenz [mm Hg]

abs. absolut

AMV Atemminutenvolumen [l/min]

bp Basenpaare

bzgl. bezüglich

bzw. beziehungsweise

ca. circa

Chl. Chlamydia

Chl.ps. Chlamydia psittaci

CP Chlamydia psittaci

CPP Chlamydophila psittaci

CPA Chlamydophila abortus

Ck Cytokeratin

COB Chronisch obstruktive Bronchitis

COPD chronic obstructive pulmonary disease, auch: chronisch-obstruktive Bronchitis

DAPI 4’, 6 Diamidino-2-Phenylindol

dkl. braun dunkelbraun

EHV equines Herpesvirus

evtl. eventuell

Fa. Firma

FEF forced expiratory flow, forcierter exspiratorischer Fluss

ff. und folgende

For. Formalinmaterial

Geschl. Geschlecht

IFT Immunfluoreszenzmikroskopie (engl. immunfluorescence test)

IHC Immunhistochemie

Inc. Incorporated

lfd. Nr. laufende Nummer

8

li links

Kg Kilogramm

KM Körpermasse

Min. Minute

MPf Nummernvergabe des Materialeingangs

neg. negativ

P-Ak Primärantikörper

PBS Phosphat buffered Saline

PCR Polymerasekettenreaktion

pos. positiv

re rechts

resp. respiratorisch

S-Ak Sekundärantikörper

SF Sigma Formalin

Std. Stunde

Sum Summe

TEM Transmissinselektronenmikroskopie

Trpf. Tropfen

z. B. zum Beispiel

9

VI. Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Taxonomische Einteilung der Familie Chlamydiaceae

Tab. 2: Auswertung Immunhistochemie MPf9

Tab. A 1: Markierungsprotokoll Immunhistochemie

Tab. A 2: Markierungsprotokoll Immunfluoreszenz

Tab. A 3: Auswertung des Fragebogens

Tab. A 4: Auswertung Immunhistochemie

Tab. A 5: RAO-Pferde Einteilung

Tab. A 6: RAO Pferde Gesamttabelle

Tab. A 7: Ergebnis klinisch gesunde Pferde vs. klinisch kranke Pferde

Tab. A 8: Ergebnis Tötungsgrund RAO im Vergleich zu anderen Tötungsgründen

Tab. A 9: Vergleich der Ergebnisse nach Einteilung der Pferde in Gruppen, entsprechend

der klinischen und histologischen Zeichen

Tab. A10: Korrelation zwischen histologischen Score und immunhistochemischen Ergebnis

10

VII. Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Hypertrophie des M.rectus abdominis eine an RAO erkrankten

Pferdes

Abb. 2: Weitstellung der Nüstern,bei Ruheatmung eines RAO kranken Pferdes

Abb. 3: Entnahmeschema

Abb. 4: Makroskopische Aufsicht auf die Pleura der Lunge eines RAO

kranken Pferdes.

Abb. 5: Schnittfläche einer formalinfixierten Probe aus der Lunge eines RAO erkrankten

Pferdes.

Abb. 6: Schnittfläche einer formalinfixierten Probe aus der Lunge eines RAO erkrankten

Pferdes.

Abb. 7: HE, Lichtmikroskopie, Bronchioli eines

RAO-erkrankten Tieres.

Abb. 8: HE, Lichtmikroskopie, Bronchioli eines

RAO-erkrankten Tieres.

Abb. 9: HE, Lichtmikroskopie, Abbildung eines

Bronchiolus aus der Lunge eines RAO kranken Pferdes.

Abb. 10: IHC, MPf 7, Antikörper Chl. ps.,100x Verg., Abbildung zweier Bronchioli

Abb. 11: IHC, MPf 34, Antikörper Chl. ps., 200x Verg., perinukleäre Anfärbung im

Bronchiolusepithel


Brochiolusepithel.

Abb. 13: IHC, MPf 45, Antikörper Chl. ps., 400x Verg., Ansicht eines

Bronchiolus

Abb. 14: IHC, MPf 45, Antikörper Chl. ps., 400x Verg., Ausschnitt eines

Bronchiolus

Abb. 15: IHC, MPf 7, Antikörper Chl. ps., 200x Verg., Ausschnitt eines

Bronchiolus

Abb. 16: IHC, MPf 7, Antikörper Chl. ps., 400x Verg., Darstellung alveolärer Strukturen

Abb. 17: IHC, MPf 21, Antikörper Chl. ps., 100x Verg., Darstellung

eines Bronchiolus und umgebenden alveolärem Gewebe

11

Abb. 18: IHC, MPf 27, Antikörper Chl. ps., 100x Verg., Darstellung

eines Bronchiolus und umgebenden alveolärem Gewebe

Abb. 19: MPf 8, Anti-Chl. LPS, Orginalvergrösserung 40x , rot fluoreszierende Spots im

Bronchiolusepithel

Abb. 20: MPf 22, Anti-Chl. LPS, Orginalvergrösserung 40x, deutlich rot fluoreszierende

Spots

Abb. 21: MPf 27, Anti-Chl. LPS, Orginalvergrösserung 40x, RAO-gesundes Pferd

Abb. 22: MPf8, Anti-Chl. Psittaci, Orginalvergrösserung 40x, Anschnitt eines Bronchiolus

Abb. 23: MPf 22, Anti-Chl. Psittaci, Orginalvergrösserung 40x, Anschnitt eines

Bronchiolus

Abb. 24: MPf 22, Anti-Chl. psittaci, Orginalvergrösserung 40x, Anschnitt eines

Bronchiolus eines Tieres der Kontrollgruppe

Abb. 25: MPf 8, Negativkontrolle durch Ersatz des Primärantikörpers mit PBS, Orginal-

vergrösserung 40x, Position 2 des

Markierungsprotokolls der IFT

Abb. 26: MPf 8, Negativkontrolle durch Ersatz des Primärantikörpers mit PBS, Orginal-

vergrösserung 40x, Position 3 des Markierungsprotokolls der IFT

12

1. EINLEITUNG

Im Jahre 1879 beschrieb Ritter eine Erkrankung der Atemwege des Menschen, die er als

Pneumotyphus bezeichnete. Dieses ist die erste Beschreibung einer Psittakose bzw.

Ornithose. Der für diese Erkrankung verantwortliche Erreger wurde früher als Chlamydia

psittaci (CP) und heute, entsprechend der 1999 von Everett et al. revidierten Chlamydien-

taxonomie, als Chlamydophila psittaci (CPP) bezeichnet.

Viele respiratorische Erkrankungen sowohl beim Menschen als auch bei unterschiedlichen

Tieren werden durch CPP ausgelöst (Sachse et al., 2002, Theegarten et al., 2000,

Theegarten et al., 2004). Theegarten et al.( 2000, 2004) konnten bei Patienten mit COPD,

die sich aufgrund eines Lungenemphysems einer volumenreduzierenden Operation unter-

ziehen mussten, zu 38% CPP im Bronchiolusepithel, in Makrophagen, im Interstitium und

an der Oberfläche von Pneumozyten Typ II nachweisen.

Des Weiteren konnten Anhenn et al. (2003) in Sputumproben von Patienten mit chronisch

obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) CPP und Chlamydophila abortus (CPA)

nachweisen. Das Lungenemphysem ist als Endstadium einer COPD aufzufassen (Barnes

et al., 2000). Diese Ergebnisse unterstützen die These von Theegarten (2000), die den

Chlamydien eine relevante Rolle in der Entstehung der COPD zumessen.

Chlamydia psittaci (CP) konnte bei Tieren, insbesondere auch bei Pferden mit

respiratorischen Infekten entdeckt werden (Moorthy et al., 1978, McChesney et al., 1982).

Mair and Wills (1992) fanden eine 5%ige Prävalenz kultivierbarer CP, aber keine

Assoziation zwischen der Isolation des Erregers und klinischen Erkrankungszeichen.

Histologisch und mikrobiologisch konnte eine Infektion bestätigt werden.

2000 gelang Henning et al. der Nachweis von CPP in einem Stutenabort. Dieses Pferd war

respiratorisch symptomatisch.

Thurlbeck et al. beschrieben 1964 die Pathologie der Lungen von Pferden, die an einer

chronisch obstruktiven Bronchitis (COB) oder anders genannt recurrent airway obstruction

13

(RAO) litten. Dieses Krankheitsbild ist charakterisiert durch eine Bronchiolitis (Robinson et

al., 1996, Winder and von Fellenberg, 1987, Winder et al., 1989, Kaup et al., 1990). Ein

vergleichbares histologisches Bild zeigt sich in der Pathologie der humanen COPD.

Aus diesem Grund schienen Untersuchungen hinsichtlich einer CPP Infektion bei der

equinen RAO viel versprechend zu sein, zumal die Pathogenese der RAO als häufige und

bedeutende Atemwegserkrankung des Pferdes in der Vergangenheit von vielerlei Seiten

beleuchtet worden ist (Mirbahar and Eyre, 1986, Thurlbeck and Lowell, 1963, Clarke, 1987,

Robinson et al., 1996), jedoch bisher noch keine umfassende ätiologische Klärung

möglich war.

Vor diesem Hintergrund wurde Lungengewebe von RAO erkrankten Tieren hinsichtlich

einer Chlamydieninfektion mit unterschiedlichen Untersuchungsmethoden getestet.

14

2. Grundlagen

2.1 Anatomie des Respirationstraktes eines Pferdes

Gebräuchlich ist die Einteilung der anatomischen Strukturen in die luftleitenden und

respiratorischen Abschnitte. Zu den Erstgenannten gehören Nasenhöhle, Nasopharynx,

Larynx, Trachea, Bronchi, Bronchioli und Bronchioli terminalis.

Zu den respiratorischen Abschnitten zählt der Bereich der Bronchioli respiratorii bis hin zu

allen Teilen des Alveolarbaums.

Die Lungen haben, außer der im ventralen Lungenrand liegenden Incisura cardiaca

pulmonalis dextra und sinistra, keine Einschnitte und erscheinen daher äusserlich kaum

gegliedert.

Beide Lungen bestehen aus einem Lobus cranialis und einem Lobus caudalis. Angefügt an

den Lobus caudalis pulmonalis dextri ist medial der Lobus accesorius. Die Läppchenzeich-

nung tritt nur wenig hervor. Es schimmern kleine, unregelmäßige polyglonale Felder

schwach auf der Schnittfläche und sind durch die Pleura zu erkennen.

Der Bronchus lobularis cranialis teilt sich in den beiden Lungen in einen dorsalen und

einen kranialen Bronchus segmentalis. Der Bronchus segmentalis cranialis besitzt

4-5 dorsale und ventrale Äste. Die ventralen Äste sind deutlich größer als die dorsalen

Äste.

Der Bronchus lobularis caudalis versorgt den Lobus caudalis. Dieser Bronchus unterteilt

sich in 4 ventrale und 5-7 dorsale Bronchi segmentales. Er läuft als Bronchus segmentalis

caudalis aus.

Die Pulmonalarterien verlaufen, wie beim Mensch, mit ihren Verzweigungen innerhalb der

Segmente dem Bronchialbaum folgend. Dieses nennt man einen bronchoarteriellen

15

Versorgungstyp. Die Venen verlaufen zwischen den Segmenten. Sie führen das Blut aus

zwei benachbart liegenden Segmenten ab. Als Bronchialarterien gehen drei Gefäße aus

der A. broncho-oesophagea hervor.

Die hilusnahen Abschnitte der Lobi cranialis und die Lymphonodi tracheobronchales

werden aus den Aa. Bronchales craniales dextra und sinistra versorgt.

Die Lobi caudales werden aus der unpaaren A bronchalis media versorgt, die sich zuvor an

der Luftröhrenbifurkation teilt. Der Blutabfluss erfolgt über die Kapillaren der Bronchien und

der Alveolen durch die Vv. Pulmonalis (Nickel et al., 1999).

2.2. Histologie der Lunge eines Pferdes

Der Histologische Aufbau der Lunge eines Pferdes entspricht dem Aufbau der humanen

Lunge.

Allgemeiner Aufbau des luftleitenden Systems

Dieses System ist aus respiratorischem Epithel, glatter Muskulatur, elastischen Fasern und

Knorpel aufgebaut. Das respiratorische Epithel ist ein mehrreihiges Flimmerepithel mit

Becherzellen.Elektronenmikroskopisch sind kinozilientragende Zellen, Becherzellen,

Epithelzellen mit Mikrovilli, Sinneszellen und endokrine Zellen nachweisbar. Die glatte

Muskulatur umgibt ringförmig die luftleitenden und teilweise die respiratorischen

Abschnitte.

Die Flexibilität ermöglichen die elastischen Fasern. In den Bronchiolen ist der Anteil der

elastischen Fasern am größten. Der Knorpel befindet sich am äußeren Rand der Wände

der luftleitenden Abschnitte. Überwiegend handelt es sich um hyalinen Knorpel. In den

Bronchien liegt dieser als einzelne Platte oder nur noch als Stück vor. Die Bronchioli

enthalten keinen Knorpel.

16

Respiratorischen Abschnitt

Die Bronchioli respiratorii bestehen aus einschichtig kubischem Epithel, welches kino-

zilienfrei ist. Vereinzelt treten Clara-Zellen auf. Vorwölbungen der Bronchialwand, die mit

Alveolarepithel ausgekleidet ist, sind ein Charakteristikum für die Bronchioli respiratorii.

Das kubische Epithel geht am Eingang in die Alveolen in plattes Alveolarepithel über.

Die Alveolen sind kleine Ausstülpungen der Bronchioli respiratorii. Im Durchschnitt beträgt

der Durchmesser einer Alveole 250-290µm. Benachbarte Alveolen sind durch Septa

interalveolaria voneinander getrennt. Auf beiden Seiten dieser Septen besteht die

Oberfläche aus Alveolarepitel. Zudem enthält das Septum zahlreiche Kapillaren.

Auch Makrophagen befinden sich in den interalveolären Septen. Ein Teil von ihnen ver-

bleibt dort, der andere Teil wandert als Alveolarmakrophagen in das Alveolarlumen. Unter-

brochen wird das Septum durch Poren.

Das Volumen der Alveolen kann durch kontaktile Zellen verkleinert werden. Diese Zellen

sind gekennzeichnet durch das Vorkommen von Aktin und Myosin. Die Kapillaren der

Lunge werden von nicht fenestriertem Kapillarendothel ausgekleidet.

Das Alveolarepithel besteht aus

- Pneumozyten (Alveolarepithelzellen), Typ I

- Pneumozyten (Alveolarepithelzellen), Typ II

Pneumozyten Typ I sind sehr zarte Zellen. Sie sind sehr flach und ausgezogen und bilden

den größten Teil der Oberfläche. Oftmals können sie nur elektronenmikroskopisch wahr-

genommen werden. Sie gehen aus den Pneumozyten Typ II hervor.

Pneumozyten Typ II liegen zwischen den Pneumozyten Typ I. Diese beiden sind durch

Desmosomen und Tight junktions miteinander verbunden. Die meisten dieser Zellen sind

kubisch und ragen in das Lumen der Alveolen vor.

17

Bei diesen Zellen handelt es sich um sezernierende Zellen. Surfactant wird von Ihnen ge-

bildet. Dieser Proteinphospholipidfilm setzt die Oberflächenspannung herab (Schiebler et

al., 1996).

2.3 Physiologie der Atmung

2.3.1 Grundlagen der Atmung:

1. Durch Strömung gelangt O2 aus der Umgebungsluft in die Alveolen und CO2 wird an

die Umgebungsluft abgegeben. Diesen Vorgang nennt man Ventilation.

2. Der Gastransport von O2 u. CO2 erfolgt aus dem Gasraum der Alveole in das Blut

der Alveolarkapillaren über die alveolo-kapilläre Barriere. Diesen Vorgang nennt

man Diffusion.

3. Über den Blutkreislauf gelangen O2 u. CO2 zu den O2 verbrauchenden Geweben

bzw. zurück zu den Lungenkapillaren. Diesen Vorgang nennt man Verteilung.

4. Der Übertritt von O2 aus dem Blut in die Zellen der Gewebe, bis hin zu den O2-

verbrauchenden und CO2-produzierenden Mitochondrien erfolgt erneut durch

Diffusion.

Die Atemwege

Die luftleitenden Atemwege beginnen an der Trachea und enden in den Alveolen. Im

Bereich der Trachea, Bronchien, Bronchiolen und Terminalbronchiolen findet kein Gasaus-

tausch statt. (Totraum). Die Respirationszone umfasst Ductuli u. Sacculi alveolares.

Neben dem Atemgastransport gehört die Reinigung, Erwärmung u. Anfeuchtung der Atem-

luft zu den wichtigen Aufgaben der Atemwege.

Inspiration u. Expiration

Die Ventilation kommt durch Volumenänderungen des intrathorakalen Raums zustande.

Diese entstehen durch Rippenbewegungen (Brustatmung) und durch Zwerchfell-

kontraktionen (Bauchatmung).

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Brustatmung: Die Anhebung der Rippenbögen durch die Mm. intercostales externi u.

interni intercartilaginei u. Mm.scaleni verursacht eine Vergrößerung des Thorax-

querschnittes nach lateral und ventral und führt damit zu einer Inspiration.

Bauchatmung: Die Erweiterung des Thoraxraums in Richtung Bauchraum erfolgt durch die

Kontraktion des Zwerchfells. Hierdurch wird ebenfalls eine Inspiration ausgelöst. Die

Bauchatmung ist der wirkungsvollere der beiden Inspirationsmechanismen.

Die Expiration erfolgt durch Erschlaffung des Zwerchfells bzw. durch die Senkung der

Rippenbögen. In Ruhe erfolgt die Expiration passiv. Sie kann aber bei Belastung durch die

Kontraktion der Mm. intercostales interni unterstützt werden.

Des Weiteren kann sowohl die Inspiration als auch die Expiration durch den Einsatz der

Atemhilfsmuskulatur unterstützt werden (Pectoralis major u. minor, Scaleni, Sternocleido-

mastoideus und Serrati sind Hilfseinatmer. Hilfsausatmer sind die Bauchmuskeln).

Pleura

Der Pleuraspalt enthält einen dünnen Flüssigkeitsfilm und ist vollkommen luftfrei. Da dieser

Flüssigkeitsfilm weder komprimierbar noch dehnbar ist, folgt die Lunge allen Thorax-

bewegungen und die Lungenoberfläche ist verschieblich mit der Thoraxinnenwand.

Als Besonderheit beim Pferd gelten die Gravitationsbedingten Schwankungen des inter-

pleuralen Druckes, die dazu führen, daß in dorsalen Lungenbezirken der interpleurale

Druck etwas negativer als in ventralen Bereichen ist. Dadurch kommt es zu einer ver-

mehrten Belüftung der dorsalen Lungenbezirke.

Alveolo-kapilläre Barriere

Als Alveolo-kapilläre Barriere bezeichnet man den Bereich zwischen Alveole und Alveolar-

kapillaren der von O2 und CO2 während des Diffusionsprozesses überwunden wird. Sie ist

mit <1µm extrem dünn, obwohl sie aus Alveolarepithel, interstitiellem Raum und Kapillar-

endothel besteht. Die Kontaktfläche zwischen Alveole und Alveolarkapillaren ist sehr groß.

Es herrschen ideale Diffusionsverhältnisse für O2 u. CO2 (Gros et al. 2000).

19

2.3.2 Ventilation und Lungenvolumina

Die Ventilation beschreibt das Volumen, das in die Lunge hinein oder aus ihr heraus

strömt.

Lungenvolumina sind Teilvolumen des in der Lunge enthaltenen Gesamtvolumens.

Lungenkapazitäten beschreiben das Volumen, welches sich aus zwei oder mehr Volumen

zusammensetzt (Engelhardt and Breves, 2000).

Volumina und Kapazitäten

Atemfrequenz = AF : Wechsel zwischen Inspiration und Exspiration pro Minute.

Mensch in Ruhe ca.12-18/min Pferd 8-16/min

Atemzugvolumen = AZV, Ve: Pro Atemzug inspiriertes od. exspiriertes Volumen.

Mensch in Ruhe ca. 0,5 l Pferd (550Kg KM) ca. 6 l

Inspiratorisches Reservevolumen: Beschreibt das Volumen, das am Ende einer normalen

Inspiration, bei maximaler Anstrengung noch inspiriert werden kann.

Exspiratorisches Reservevolumen: Beschreibt das Volumen, das am Ende einer normalen

Expiration, bei maximaler Anstrengung noch exspiriert werden kann.

Zusammen beschreiben das Atemzugvolumen, in- und exspiratorisches Reservevolumen

das maximal mögliche Atemzugvolumen.

Residualvolumen: Das Volumen, das nach maximaler Exspiration noch in der Lunge ver-

bleibt.

Inspirationskapazität: Beschreibt, ausgehend von der Atemmittellage, das maximal

mögliche Inspirationsvolumen. Ergibt sich aus der Addition von dem Atemzugvolumen und

inspiratorisches Reservevolumen.

20

Funktionelle Residualkapazität, FRC: Ergibt sich aus der Addition von des Residual-

volumens und dem exspiratorisches Reservevolumen. (gemessen durch die Helium-

einwaschmethode).

Mensch ca.3 l Pferd ca.16 l

Vitalkapazität: Ergibt sich aus der Addition von dem Atemzugvolumen. In- und Ex-

spiratorischem Reservevolumen gibt das maximale Atemzugvolumen an.

Totalkapazität, TC: Ergibt sich aus der Addition sämtlicher Lungenvolumina und entspricht

damit dem maximalen Gasvolumen, das die Lunge aufnehmen kann.

In der Humanmedizin können Lungenvolumina und Lungenkapazitäten mit dem Spirometer

oder mit dem Pneumotachographen gemessen werden.

Die Lungenfunktionsprüfung des Pferdes stellt eine Sammlung von zum Teil technisch

aufwendiger Methoden dar, die objektive Parameter liefern und so die Einschätzung der

funktionellen Beeinträchtigung der Lunge vergleichbar machen. Sie umfasst Untersungs-

techniken wie die Spirometrie (Buess et al. 1993, Jansen 1996, Herholz et al. 2001c,

Bertram 2001), Kapnographie (Jansen 1996, Trötschel 1996, Ohnsorge et al. 1998,

Herholz et al.2001a, b, c), Stickstoffeinwaschungstest (Spröti et al 1970) Interpleural-

druckmessung (Deegen et al. 1987) im Stand der Ruhe oder unter bzw. nach Belastung

(Buess et al. 1993, Art et al. 2002, Müller et al. 1983) und Impulsoszillometrie (Klein and

Reinhold, 2001, Klein et al. 2003).

Der Totraum

Der anatomische Totraum ist der Raum des Respirationstraktes, der belüftet ist, aber an

dem kein Gasaustausch möglich ist. Das ist der Raum von der Nase bzw. Maul bis zu den

Terminalbronchien. Er variiert geringfügig mit dem Atemzyklus.

21

Der funktionelle Totraum ist der Raum des Respirationstraktes, der belüftet ist und in dem

kein Gasaustausch stattfindet. Er ist mindestens so groß wie der anatomische Totraum.

Bei Lungenerkrankungen können Alveolarbereiche auftreten, die zwar belüftet, aber nicht

durchblutet sind und damit nicht zum Gasaustausch beitragen (Riede and Schaefer,

1999/2001).

Ventilation

Die Gesamtventilation entspricht dem Atemzeitvolumen und ergibt sich aus dem Produkt

des Atemzeitvolumens und der Atemfrequenz.

Atemminutenvolumen AMV = Pro Minute in- oder expiriertes Volumen

Atemminutenvolumen = Atemzugvolumen x Atemfrequenz

Mensch 0,5l x 12/min=6l Pferd (550 kg KM) 6l x 10/min =60l

Einen erhöhten CO2-Partialdruck im Blut nennt man Hyperkapnie. Sie entsteht durch eine

zu niedrige alveoläre Ventilation. Diese nennt man Hypoventilation.

Definitionen:

P CO2, a = 40 ± 5mmHG = Normoventilation

P CO2, a = < 35 mmHG = Hyperventilation

= Hypokapnie

P CO2, a = >45 mmHG = Hypoventilation

= Hyperkapnie

Hypo- bzw. Hyperventilation bedeutet, dass die Ventilation in der Relation zur CO2-

Produktionsrate oder Stoffwechselsituation zu niedrig bzw. zu hoch ist.

Abzugrenzen davon sind die Begriffe Eupnoe und Hyperpnoe. Die Eupnoe ist die normale

Ruheventilation. Die Hyperpnoe ist die gesteigerte Ventilation.

Eine Hyperpnoe liegt bei körperlicher Belastung physiologisch vor.

22

Ein weiterer Begriff ist die Dyspnoe. Diese beschreibt das subjektive Empfinden der

Atemnot. Im Allgemeinen geht diese mit einem erniedrigten arteriellen P O2 einher.

2.3.3 Atemmechanik

Bei der Atmung sind mechanische Widerstände zu überwinden. Man unterscheidet

elastische Atmungswiderstände und visköse Atemwegswiderstände.

Elastische Atmungswiderstände sind bei ruhendem Lungen-Thorax-System wirksam und

beruhen auf:

- elastischen Strukturen (elastische Fasern)

- Oberflächenkräften an der Gas-Wasser-Phasengrenze der Alveolen

Visköse Atemwegswiderstände werden nur wirksam, wenn Atemgas durch die Atemwege

strömt. Sie sind bedingt durch den

- Atemwegswiderstand (Strömungswiderstand)

Compliance

Die Compliance ist ein Maß für die Volumendehnbarkeit der Lunge. Es gibt Angaben für

die Compliance der Lunge, des Thorax und von Lunge und Thorax gemeinsam. Sie ist ein

Maß für die Gesamtheit der elastischen Atemwegswiderstände. Bei restriktiven Atemwegs-

erkrankungen sind die Compliance und auch die Vitalkapazität vermindert.

Resistance

Die Resistance stellt den Strömungswiderstand der Atemwege dar. Bei obstruktiven

Atemwegserkrankungen ist die Resistance erhöht. (Riede and Schaefer, 1999/2001,

Engelhardt and Breves, 2000).

23

2.3.4 Gastransport und Gasaustausch

Durch die Ventilation soll O2 in die Alveolen gebracht werden. Dieses soll durch den

pulmonalen Gasaustausch ins Blut gebracht werden. Sowohl Sauerstoff als auch Kohlen-

dioxid liegen im Blut in gelöster und gebundener Form vor. Die gebundene Form überwiegt

mengenmäßig im Blut. Jedoch ist die gelöste Form sehr wichtig. Diese Form diffundiert

durch Flüssigkeiten und über Zellmembranen. Die Konzentration der physikalischen ge-

lösten Gase ist proportional zu dem Gaspartialdruck. Bei gleichem Partialdruck ist 20 Mal

mehr CO2 als O2 gelöst.

Sauerstofftransport

98% des O2 im Blut liegen gebunden an das Hämoglobin vor, 2% physikalisch gelöst. Ein

Hämoglobin-Tetramer kann vier O2-Moleküle binden, bzw. 1 g Hämoglobin bindet 1,34 ml

O2.

Die O2-Bindungskurve des Hömoglobins verläuft S-förmig. Diese liegt an der Kooperativität

der O2-Bindung der vier Hämoglobin-Untereinheiten. Die dadurch zustande kommende

Verschiebung des steilen Mittelteils der O2-Bindungskurve nach rechts ermöglicht eine O2-

Abgabe an das Gewebe bei relativ hohem O2-Partialdrücken.

Zu einer Rechtsverschiebung der O2-Bindungskurve führen ein Anstieg der Temperatur,

Abfall des ph-Wertes (Bohr-Effekt), ein Anstieg der CO2-Partialdrucks und ein Anstieg der

intraerythrocytärem Konzentration von 2,3 Bisphosphoglycerat.

CO2-Transport

CO2 liegt im Blut in drei Formen vor. Es liegt 5% physikalisch gelöst, 90% chemisch ge-

bunden als Bicarbonat und 5% chemisch gebunden als Carbamat vor.

Die CO2-Bindungskurve des Blutes zeigt, dass der CO2-Gehalt des arteriellen Blutes etwa

doppelt so groß ist wie sein O2-Gehalt. Die Kurve verläuft im physiologischen Partialdruck-

bereich zwischen 40 und 46 mmHg praktisch linear. Des Weiteren ist zu erwähnen, dass

die Bindungskurven für oxygeniertes Blut und deoxygeniertes Blut unterschiedlich ver-

laufen. Deoxygenation des Blutes erhöht dessen Aufnahmefähigkeit für CO2. Dieses nennt

24

man Christiansen-Douglas-Haldane-Effekt. Der physiologische Nutzen stellt sich im Ge-

webe ein, wenn die O2-Abgabe an das Gewebe die CO2-Aufnahme aus dem Gewebe

erleichtert. Umgekehrt wird in der Lunge die CO2-Abgabe durch die gleichzeitig erfolgte O2-

Aufnahme erleichtert (Thews and Vaupel, 1997).

Pulmonaler Gasaustausch

O2 und CO2 diffundieren über die alveolo-kapilläre-Barriere. Nur gelöste Stoffe können die

Barriere durch Diffusion überwinden.

Abhängig ist die Diffusion von den vorhandenen

- Gaspartialdrücken

- der individuellen Diffusionskapazität der Lunge (Die Diffusionskapazität beschreibt die

Diffusionseigenschaften einer Lunge. Vermindert kann die Diffusionskapazität sein durch

eine Lungenfibrose oder auch durch ein Lungenemphysem)

- der Kontaktzeit der Erythrocyten in der Lungenkapillare

- Lungendurchblutung (Die Abstimmung der Perfusion und Ventilation im Lungengewebe

wird durch den Euler-Liljestrand-Mechanismus vermittelt) (Thews and Vaupel, 1997,

Hörnicke et al.1983).

2.3.5 Regulation der Atmung

Rhythmogenese

Der Atemrhythmus mit einem Wechsel von Inspiration und Exspiration wird durch Neurone

(Atemzentrum) in der Medulla oblongata reguliert.

Respiratorische Reflexe

- Hering-Breuer-Reflex, Lungendehnungsreflex:

Lungendehnungsrezeptoren liegen im Bronchialbaum. Deren Afferenzen verlaufen im

N.vagus.

25

Dieser Reflex dient dazu, die inspiratorische Atemexkursion zu begrenzen und die Lunge

vor Überdehnung zu schützen.

- Schutzreflexe (Hustenreflex, Niesreflex):

Durch diesen Reflex wird die Tätigkeit des Atemzentrums moduliert (Thews and Vaupel,

1997, Hörnicke et al.1983).

Chemische Atmungsregulation

Sie passt die Tätigkeit des Atemzentrums (und der Ventilation) an die Stoffwechselbedürf-

nisse an. Periphere und zentrale Chemorezeptoren liefern über Afferenzen Signale an das

Atemzentrum.

Atmungsregulation bei Arbeit:

- zentrale Mitinnervation: Bei Arbeitsbeginn wird das Atemzentrum durch Aktivierung des

sensomotorischen Systems mitinnerviert.

- Reafferenzsystem: Rückmeldungen aus der arbeitenden Muskulatur dienen der Fein-

einstellung von Ventilation und Kreislauf (Thews and Vaupel, 1997, Hörnicke et al.1983).

Die oben genannten Mechanismen zur Atemregulation gelten sowohl für den Menschen

als auch für das Pferd. Als wichtige Besonderheit beim Pferd gilt folgender Punkt:

Synchronisation von Atmung und Lokomotion beim Pferd

Beim galoppierenden Pferd liegt eine besondere Form der Steuerung der Atmung vor. Es

liegt eine 1:1 Synchronisation von Fußungs- und Atemfrequenz vor. Im Schritt und Trab ist

dieses nicht oder nicht so deutlich ausgeprägt. Zwischen der Galoppsprunglänge und dem

Atemzugvolumen liegt eine lineare Beziehung. Ebenfalls linear ist die Kopplung von der

Laufgeschwindigkeit und der Ventilation. Dieses ist sehr sinnvoll, da zwischen der Laufge-

schwindigkeit und dem O2 –Verbrauch auch ein linearer Zusammenhang besteht. Ein

Pferd in Ruhe hat ein Atemminutenvolumen von 60 l/min. Die Atemfrequenz liegt bei

12/min. Im Galopp kann sowohl das Atemminutenvolumen als auch die Frequenz

26

beträchtlich steigen. Das Atemminutenvolumen kann auf 1400 l/min. und die Frequenz auf

120/min. steigen.

Damit diese Synchronisation erreicht wird, ist es notwendig, dass das Pferd im Zeitintervall

eines Schrittes die Exspiration beendet. Bei gesunden Pferden ist dieses Zeitintervall voll-

kommen ausreichend. Bei RAO- erkrankten Pferden ist die Exspiration aufgrund des

erhöhten Atemwegswiderstandes deutlich verlängert. Folglich ist bei diesen Pferden die

maximale Atemfrequenz und somit auch die maximale Schrittfrequenz und Laufgeschwin-

digkeit vermindert (Hörnicke et al.1983, Bertram, 2001).

2.4 Obstruktive Lungenerkrankungen

Es gibt unterschiedliche Ursachen für Atemwegsobstruktionen:

- Intraluminale Ursachen:

Hauptsächlich verlegt Mucus das Bronchiallumen, z. B. bei COPD/RAO.

- Intramurale Ursachen:

Die Ursache liegt in der Wand des Bronchialsystems. Sie kann auf starker Konstriktion der

glatten Bronchialmuskulatur beruhen (= Bronchospasmus), auf Hypertrophie der Schleim-

drüsen wie bei COPD/RAO oder auf Verdickung der Larynx- oder Bronchialwände durch

Entzündung und Ödem bei Laryngitis oder Bronchitis. Man vermutet, dass der Broncho-

spasmus durch die gleichzeitige Einwirkung, einmal direkt durch Mediatoren und einmal

indirekt durch das autonome Nervensystem auf die Muskulatur zustande kommt

(Robinson et al. 1996).

- Extraluminale Ursachen:

Beim Lungenemphysem, bei dem Lungengewebe eingeschmolzen ist, wird durch den

Verlust von elastischen Fasern eine geringere radiale Zugspannung ausgeübt. Folge sind

verkleinerte Atemwegslumina. Eine weitere hier bedeutsame Erkrankung ist die COPD/

RAO. Durch die erschwerte Exspiration wird ein erhöhter Druck in der Lunge aufgebaut.

27

Dieses führt zu einer Kompression der intrathorakalen Atemwege. Folglich ist die Exspira-

tion noch weiter als zuvor erschwert.

Konsequenz obstruktiver Lungenerkrankungen ist die erhöhte Resistance, das vergrößerte

Residualvolumen, verkleinerte Vitalkapazität bei unveränderter Totalkapazität.

Eine andere Einteilung in Obstruktionen der oberen und unteren Atemwege ist möglich.

Die COPD/RAO ist eine Erkrankung der unteren Atemwege (Robinson et al. 1996).

2.5 Pathologie der COPD/ RAO

2.5.1 Definition der COPD/ RAO

In der Humanmedizin ist die COPD klinisch definiert.

Unter dem Begriff COPD ("cronic obstructive pulmonary disease") ist eine Symptomatik

und funktionelle Beeinträchtigung der Lunge zu verstehen, die charakterisiert ist durch eine

Kombination aus chronischem Husten, gesteigerter Sputumproduktion, Atemnot, Atem-

wegsobstruktion und eingeschränktem Gasaustausch. Klinisch äußert sich die COPD

durch eine progrediente, nach Anwendung von Bronchodilatatoren oder Glukokortikoiden

nicht vollständig reversible Atemwegsobstruktion, der eine chronische Bronchitis oder eine

Lungenemphysem zugrunde liegt (Vogelmeier et al., 2002).

Unter einer chronischen Bronchitis versteht man eine Atemwegserkrankung mit

persistierendem oder immer wieder auftretendem Husten und Auswurf an den meisten

Tagen von wenigstens zwei aufeinander folgenden Monaten während mindestens zwei

aufeinander folgenden Jahren (Riede and Schaefer, 1999/2001).

Das Lungenemphysem wird pathologisch/ anatomisch definiert als irreversible Erweiterung

und Destruktion der Lufträume distal der terminalen Bronchiolen (Riede and Schaefer,

1999/2001). Gillespie and Tyler beschrieben 1969 das Emphysem beim Pferd.

Im Bezug auf ein Pferd ist die Definition, dieser häufig auftretenden Krankheit (Brachter et

al., 1991), schon weniger einheitlich. Das hier als RAO bezeichnete Krankheitsbild

28

gestaltet sich in der Namensgebung schon unterschiedlich. Es wird als „Lungendampf“,

„Lungendämpfigkeit“, im Englischen als „broken wind“ und „heaves“ oder als „chronisches

Lungenemphysem“, „asthmatoides Syndrom“ und „chronische Bronchitis“ bezeichnet.

Mittlerweile tendiert man dahin, die Begriffe COPD (chronic obstructive pulmonary disease)

und RAO (recurrent airway obstruction) zu benutzen.

Bei der RAO des Pferdes handelt es sich um eine chronische Erkrankung der tiefen Atem-

wege des Pferdes mit primär bronchitischer Symptomatik.

- Dyskrinie

- Bronchospasmen

- lumeneinengende Bronchialwandprozesse mit und ohne

emphysematösem Charakter

(Schoon et al. 1983).

2.5.2 Ätiologie der COPD/ RAO

Bei der COPD ist von einer multifaktoriellen Genese auszugehen (Riede and Schaefer,

1999/2001)

Beim Menschen begünstigen endogene Faktoren, wie der Alpha-1-Antithrypsinmangel

und ein IgA-Mangel das Krankheitsbild, entscheidend sind jedoch exogene Faktoren,

insbesondere Zigarettenrauchexposition. Industrieabgase, berufliche Hitzeexposition, kli-

matische Belastungen in Form von Nebel und feuchter Kälte, Staub, sowie Infektionen mit

Haemophilus influenza und Streptococcus pneumoniae sind bedeutend (Riede and

Schaefer, 1999/2001).

Anerkannt ist der Zusammenhang bakterieller Endotoxine bei vermehren respiratorischen

Problemen in der Landwirtschaft (Vogelzang et al., 1998).

Des Weiteren ist eine chronische Chlamydieninfektion als Auslöser oder Kofaktor in der

Ätiologie anzunehmen (Theegarten, 2000).

Bei der equinen RAO handelt es sich ebenso wie bei der COPD des Menschen um ein

multifaktorielles Geschehen (Mirbahar et al., 1986).

29

Im Einzelnen werden folgende Faktoren angeschuldigt:

Aspergillus fumigatus,, Faenia retivirgula, Thermouctinomyces vulgaris, Mikropolyspora

faeni. Die Erreger kommen unter anderem in schimmeligem Heu, Stroh und unsachgemäß

gelagerten Futtermitteln vor (Thurlbeck et al. 1963, Clarke, 1987, Robinson et al., 1996).

Ein hyperreagibles Bronchialsystem ist prädisponierend (Mirbahar et al., 1986, Gerber,

1973). Pollen, Impfreaktionen, Staub und genetische Faktoren (Robinson et al., 1996, Marti

et al., 1991) sollen eine Rolle bei der Entstehung einer RAO spielen. 3-Methyl-indol ist ein

weiterer ätiologischer Faktor (Mirbahar et al., 1986).

Staub- und Endotoxineexposition sind relevante Faktoren die zu einer Schwächung der

Lungenfunktion führen und in experimentellen Studien genutzt werde, um eine Exazer-

bation auszulösen (Pierie et al., 2003, Simonen-Jokinen et al., 2005).

Virale und bakterielle Infektionen sind, genauso wie beim Menschen, eine zu beachtende

Ursache hier z. B. EHV-1 und EHV4, akute Bronchitis, Influenza A. (Mirbahar et al., 1986,

Gerber, 1973). Auch genetische Polymorphismen sind sicher relevant (Robinson et al.,

1996, Clarke, 1987).

In Anbetracht der Tatsache, dass Chlamydien bei der humanen COPD eine Rolle spielen

(Theegarten, 2000) kann auch bei der equinen RAO von einem Zusammenhang ausge-

gangen werden, zumal Chlamydien beim Pferd gefunden werden.

30

2.5.3 Pathogenese der RAO

Die humane und equine Pathogenese der RAO/COPD verläuft nach den gleichen

Prinzipien.

Die Erkrankung beginnt mit einem Untergang der Flimmerephithelzellen, die durch Becher-

zellen ersetzt werden. Es kommt zur Absonderung eines viskösen Schleims (= Dyskrinie),

der letztendlich die Bronchiolen verstopft.

Der Selbstreinigungsmechanismus des Bronchialsystems wird gestört.

Neutrophile Granulozyten, Makrophagen, Fibroblasten, Mastzellen, T-Lymphozyten und

Bakterien geben Proteasen ab, die normalerweise durch Inhibitoren weitgehend inaktiviert

werden.

Das Proteasen-Antiproteasen-Gleichgewicht sowie Oxidation und Antioxidation sind bei

der RAO gestört. Die Proteasen gewinnen die Oberhand und führen zu einem gestörten

Gewebeab- und -aufbau. Eine chronisch destruktive Bronchiolitis und Peribronchiolitis ist

die Folge. Durch Fibrosierung kommt es zur Obstruktion und chronischen Entzündung der

Bronchien. Im Spätstadium kann bei der humanen COPD ein Emphysem entstehen

(Theegarten, 2000, Riede et al., 1999/2001), wobei dieses bei der equinen RAO eher

zweifelhaft ist.

2.5.4 Pathologische Anatomie

Makroskopisch erkennt man eine mehr oder minder ausgeprägte Überblähung. Die Lungen

sind groß, hell und von puffiger Konsistenz.

Die deutliche Volumenzunahme beruht auf der mangelhaften Retraktionsfähigkeit.

31

Die Schleimhaut der großen Bronchien ist regelrecht. Das Bronchiallumen kann durch

Exsudat verlegt sein.

Ein grundlegendes Charakteristikum der equinen RAO ist exzessive muköse Schleim-

produktion.

Teilweise sind auf der Schnittfläche der Lunge kleine trübglasige Knötchen zu erkennen.

Hierbei handelt es sich um Bronchien oder Bronchiolen mit peribronchiti-

schen/peribronchiolitischen Infiltraten. In ausgeprägten Fällen kann die Lungenschnitt-

fläche mit diesen Knötchen übersät sein. Trachea und Hauptbronchien sind unauffällig

(Schoon et al., 1983, Geisel et al., 1987).

Das histologische Bild zeigt regelmäßig entzündliche Veränderungen in den Endver-

zweigungen des Bronchialbaums. Die Bronchiolitis ist bei der equinen RAO dominierend.

Der Charakter der Entzündung, der Ausbreitungsgrad und die Intensität sind von Fall zu

Fall verschieden (Dahmer et al., 1983).

Folgende Veränderungen können einzeln oder kombiniert auftreten:

Als Zeichen der equinen Hyperkrinie/ Dyskrinie ist eine vollständige oder partielle Ver-

legung kleinerer Bronchialäste, der Bronchioli terminalis und Bronchioli respiratorii durch

Schleim zu erkennen. Diesem Exsudat sind Granulozyten beigemischt. Des Weiteren

können Makrophagen und desquamierte Epithelzellen enthalten sein.

Bei der humanen mukösen Hyperskrinie dominieren die neutrophilen Granulozyten ledig-

lich bei einer Exazerbation (Barnes, 2000). Diese Exazerbationen sind hauptsächlich mit

viralen Infekten assoziiert (Rohde et al., 2003).

Es treten Epithelhyperplasien und Metaplasien der alterierten Bronchien und Bronchioli

auf. Die Zahl der Becherzellen ist erhöht. Die Bronchialepithelien erscheinen aufgelockert.

Es bestehen intra- und subepitheliale Infiltrate, die sich vorwiegend aus neutrophilen

Granulozyten und Lymphozyten zusammensetzen. Lymphohistiozytäre Infiltrate finden sich

sowohl bronchial als auch peribronchial.

32

Die Bronchialmuskulatur erscheint teilweise hypertrophiert, teilweise atrophiert. Die

Alveolarsepten sind teilweise dünn, zerrissen und atrophisch. Dies ist eine Folge der Über-

blähung der Lunge.

Zu den seltenen Befunden zählt eine bronchiale und peribronchiale Fibrose (Schoon et al.,

1983, Geisel et al., 1987).

2.6 Therapie

2.6.1 der RAO beim Pferd

Der wichtigste Punkt in der Therapie ist das Meiden antigenwirksamer Substanzen. Das

bedeutet, die erkrankten Pferde sollten überwiegend außerhalb eines Stalls, beispielsweise

auf einer Weide, gehalten werden. Ist dies nicht möglich, so sollten die klimatischen

Bedingungen in den Stallungen verbessert werden. Konkret bedeutet dies, eine aus-

reichende Frischluftzufuhr in den Stallungen zu gewährleisten. Die Stallungen sollten

sauber sein und regelmäßig entmistet werden, damit keine höheren Ammoniakkonzentra-

tionen entstehen, die zu 3-Methyl-Indol umgesetzt werden.

Des Weiteren ist auf die Qualität der Futtermittel zu achten. Dazu gehört auch die sach-

gemässe Lagerung des Futters. Heu ist am besten durch Grassilage, Heucobs oder so-

genannte Alleinfuttermittel, die einen ausreichenden Rauhfaseranteil beinhalten, zu er-

setzen. Als Einstreu der Boxen sollten statt Stroh alternative Einstreumaterialien wie

Hobelspäne, Torf, Leinenstroh oder Papierschnitzel benutzt werden.

Da auch Infektionen, wie die Influenza oder EHV 1 eine Rolle in der Pathogenese spielen,

sind Impfungen als Prävention zu empfehlen.

Als medikamentöse Therapie stehen mehrere Medikamente unterschiedlicher Wirkgruppen

zur Verfügung. Häufig werden Anticholinergika verabreicht. Atropin wirkt im Bezug auf die

Lunge sekretionsmindernd und bronchodilatorisch. Antihistaminika kommen zum Einsatz.

Ihre Wirkung beruht auf der Blockade von H1 Rezeptoren. Beta2 selektive Sympatho-

mimetika, dazu gehören Salbutamol, Terbutalin und Clenbuterol, haben mehrere

33

Wirkungen. Zum einen wirken sie bronchdilatorisch, zum anderen hemmen sie die Ent-

zündungsmediatoren. Indirekte Sympathomimetika wie Theophyllin oder Aminophyllin

werden eingesetzt.

Glucocortikoide wirken sehr gut auf die frühen Entzündungsreaktionen und die späteren

Veränderungen. Jedoch kehren unter diesem Medikament die Krankheitserscheinungen

früher oder später zurück.

Auch die Chromoglinsäure kann nützlich sein. Sie schützt vor Bronchospasmen und

Ödembildung. Des Weiteren stehen Expektorantien zur Verfügung. Acetylcystein ist in aus-

reichender Dosierung wirksam.

Bei eitrigen Infektionen ist die antibiotische Therapie indiziert (Mirbahar et al., 1986, Clarke,

1987, Cook, 1976).

2.6.2 der COPD beim Menschen

Auch hier ist die erste Maßnahme das Meiden der auslösenden Agentien. Beim Raucher

handelt es sich um eine Nikotinkarenz.

Anticholinergika, Beta2 selektive Sympathomimetika, indirekte Sympathomimetika, Gluko-

cortikoide werden je nach Schwere der Erkrankung einzeln oder in Kombination eingesetzt.

Leitlinien der Therapie in Form eines Stufenschemas sind vorhanden. Die O2-Langzeit-

therapie, Atemgymnastik und operative Verfahren sind weitere Therapiemöglichkeiten.

Bei eitrigen Infektionen ist auch hier die antibiotische Therapie indiziert. Zur Anwendung

kommen unterschiedliche Antibiotika. Bei Tetracyclinen, die Anwendung bei Atemwegs

infektionen finden, ist die Wirksamkeit gegen Chlamydien bekannt (Mutschler et al., 2001,

Karow et al., 2004). Auch Gyrasehemmer werden bei Atemwegsinfektionen angewandt.

Eine tägliche Gabe von 1000 mg Levofloxacin wird von Conte et al. 2007 als geeignet

beschrieben.

34

2.7 Chlamydien

2.7.1 Morphologie und Lebenszyklus

Chlamydien sind obligat-intrazelluläre Prokaryonten mit einer Zellmembran. Ihre Hülle

besteht aus einer äußeren und inneren Membran. Lipopolysaccharid (LPS) ist ein

charakteristischer Bestandteil der Außenmembran. Sachse et al. (2002) beschrieben, daß

bis zu 60% der Proteinfraktion der äußeren Membran das Major Outer Membrane Protein

(MOMP) macht.

Chlamydien treten in zwei Erscheinungsformen auf:

a) relativ kleine Elementarkörperchen (EK; 0,2-0,6µm Durchmesser), welche extra-

zellulär vorkommen. Sie sind metabolisch inaktiv.

EK sind infektiös.

b) vergleichsweise größeren Retikularkörperchen

(RK; bis 1,5 µm Durchmesser)

Diese RK existieren in zytoplasmatischen Einschlüssen. Dort vermehren sie sich und sind

metabolisch aktiv. RK sind verantwortlich für persistierende Infektionen. Hier liegen sie als

strukturell anormales Körperchen vor. Man nennt sie dann atypische RK. Es scheint, als

könnten diese abberanten Chlamydien durch erneute Zellteilung bisher nicht infizierte

Zellen befallen (Moulder, 1980).

Vom Zeitpunk des Eindringens eines EK in die Wirtszelle bis zur Freisetzung der ver-

mehrungsfähigen EK vergehen je nach Chlamydienart 48-72 Std. Dazwischen liegen

wiederkehrende Vorgänge der Translokation ins Zytoplasma, der strukturellen Reorgani-

sation EK→RK→EK sowie Wachstum, Zellteilung und schließlich die Öffnung der Ein-

schlussmembran. Ihre Energie holen sich die Chlamydien aus der Wirtszelle in Form von

Adenosin-triphosphat und anderen Nukleotiden. (Sachse et al., 2002).

35

2.7.2 Genetik und Taxonomie der Chlamydien

Bis 1999 erfolgte die taxonomische Einteilung der Erreger in die Gattung Chlamydia (C),

mit einer Untergruppierung in vier Arten: C. trachomatis, C.psittaci, C.pneumoniae und

C.pecorum.

Chlamydien sind sehr heterogene Spezies. Sie kommen in unterschiedlichen Sero-

varietäten vor. Die Verwandtschaftsgrade von Chlamydien-Stämmen aus unterschiedlichen

Wirtstieren sind sehr variabel. Bei C. psittaci-Stämmen liegt die Homologie zwischen

30-93 % (Sachse et al., 2002).

Nach der neueren Einteilung (Everett et al., 1999) umfasst die Familie Chlamydiaceae zwei

Gattungen (Chlamydia und Chlamydiaceae) mit insgesamt 9 Spezies:

Tab.1: Taxonomische Einteilung der Familie Chlamydiaceae

Neue Spezies Wirtsspezifität* Chlamydia trachomatis Mensch Chlamydia muridarum Maus , Hamster

Alte Spezies Chlamydia tra-chomatis Chlamydia suis Schwein

Chlamydophila psittaci Vögel , Wiederkäuer, Pferd, Mensch

Chlamydophila abortus Schaf, andere Wiederkäuer, Schwein, Vögel

Chlamydophila caviae Meerschweinchen

Chlamydia psitta-ci Chlamydophila felis Hauskatze Chlamydia peco-rum

Chlamydophila pecorum Rind, Schaf, Ziege, Schwein, Koala

Chlamydia pneumoniae

Chlamydophila pneumo-niae

Mensch, Koala, Pferd, Reptili-en

(Sachse et al., 2002)

* mit einer Erweiterung des Wirtspektrums kann, aufgrund weiterer Spezies-spezifischer Nachweise in Zukunft gerechnet werden (Sachse et al., 2002).

Durch neuere DNA-Diagnostische Verfahren sind weitere Erreger als „Chlamydia-like“

36

Organismen charakterisiert worden. Zu diesen zählen die Familien der Waddliacace oder

Simkaniaceae und weitere, die nicht klassifiziert sind (Sachse et al., 2002)

2.7.3 Vorkommen wichtiger Chlamydiosen

Erkrankungen bei Vögeln:

Die Ornithose / Psittakose (auch als Papageienkrankheit bezeichnet) ist eine Erkrankung,

die durch Chlamydophila psittaci ausgelöst wird. Die Erkrankung ist auf den Menschen

übertragbar, kommt aber selten vor (1:1Mio pro Jahr) und ist durch entsprechende Anti-

biotika gut behandelbar (Chlamydiae Biology, 2006).

Erkrankungen bei kleinen Wiederkäuern:

Bei Ziegen und besonders Schafen treten Infektionen durch Chlamydien häufig als Abort

oder Reproduktionstörung in Erscheinung. Zudem werden Pneumonien, Enteritiden Poly-

arthritiden bei Schafen teilweise auf Infektionen durch Chlamydien zurückgeführt.

Möglicherweise bestehen Parallelen zwischen den abortiven Erkrankungen bei Schafen

und Erkrankungen von schwangeren Frauen, die zu Fehlgeburten führten. Als Erreger

gelten Chlamydophila psittaci und Chlamydophila abortus (Chlamydiae Biology, 2006).

Erkrankungen bei Rind:

Unterschiedlichste Erkrankungen, wie Infektionen des Respirations- und Urogenitaltraktes,

Keratokonjunktivitiden, Enteritiden, Arthritiden, und Enzephalomyelitiden werden mit

Chlamydophila psittaci in Zusammenhang gebracht. Der Zusammenhang zum Abort wird

diskutiert.

Eine Übertragung auf den Menschen ist sowohl aerogen durch infiziertes Material, als auch

durch direkten Kontakt möglich (Chlamydiae Biology, 2006). Der Einsatz einer Vakzine in

Rinderbeständen/ Milchkühen mit Chlamydienproblematik zeigt erste positive Ergebnisse

(Zehle et al., 2002, Uhe and Hehnen, 2002).

37

Erkrankungen beim Schwein:

Aborte, Polyarthritis bei Ferkeln, Genitalerkrankungen bei Ebern, Pneumonien, chronische

Endometritiden werden mit Infektionen durch Chlamydophila suis, Chlamydophila abortus

und Chlamydophila pecorum in Verbindung gebracht (Chlamydiae Biology, 2006).

Experimentelle aerogene Infektionen von Schweinen mit Chlamydophila suis zeigen eine

Erregerpersistenz über einen längeren Zeitraum (Berndt et al., 2002). Bei klinisch unauf-

fälligen Sauen konnten Chlamydiaceae in Gewebeschnitten der Lunge und Aorta nachge-

wiesen werden (Melzer et al., 2005)

Erkrankungen bei anderen Tierarten:

Bei Katzen gibt es Erkrankungen, die auf Infektionen mit Chlamydophila felis zurück-

zuführen sind. Endokarditiden und atypische Pneumonien wurden auf den Menschen

durch chlamydieninfizierte Katzen übertragen (Chlamydiae Biology, 2006).

Bei Pferden konnte Chlamydophila psittaci teilweise im Abortmaterial nachgewiesen

werden. Chlamydiale Infektionen des Genitaltraktes beim Pferd könnten möglicherweise

für Reproduktionsprobleme verantwortlich sein (Szeredi et al., 2005).

Erkrankungen des Menschen:

Die Ursache von 10-15 % der ambulant behandelten Pneumonien ist eine Infektion mit

Clamydia pneumoniae (Dalhoff et al., 2000). Des Weiteren gehören Sinusitiden und

Bronchitiden zu den Erkrankungen, dessen Erregern Chlamydien sind. Häufiger verlaufen

diese Infektionen jedoch asymptomatisch.

Der Morbus Alzheimer könnte auch seine Ursache in einer solchen Infektion haben.

Zudem gibt es bei Arteriosklerose eine Chlamydienassoziation, deren Bedeutung stark

umstritten ist (Campbell et al., 2004, Sachse et al., 2002). Neuerdings wird eine C. psittaci-

Infektion auch im Zusammenhang mit verschiedenen Lymphomformen diskutiert (Canudet

et al., 2006).

Der Erregernachweis beim Menschen ist bei einem Hinweis auf eine akute Infektion

meldepflichtig ( Robert Koch-Institut, 2001).

38

Viele weitere, vor allem chronische Erkrankungen, werden mit Chlamydieninfektionen in

Zusammenhang gebracht. Chlamydieninfektionen sind bekannt als Trigger akuter Exa-

zerbationen der chronischen Bronchitis (Smieja et al., 2002). Der Nachweis einer

Chlamydieninfektion bei Menschen, die an COPD erkrankt sind, ist erbracht. Und zwar

zum einen beim Lungenemphysem und in induziertem Sputum (Theegarten, 2000, Anhenn

et al., 2003). Bexten (2006) konnte C. psittaci Antigene in unterschiedlichen Zelltypen

beim Emphysem nachgewiesen. Dabei sind bei den verschiedenen Emphysemformen in

unterschiedlichen Zellen variierende Detektionsraten gefunden worden. Gleichzeitig konnte

durch die Immunofluorenszenz morphologischer Bezug zum Entzüdnungsprozess darge-

stellt werden. Diese Daten geben einen Hinweis auf die pathogenetische Relevanz der C.

psittaci Infektion.

2.7.4 Diagnostik der Chlamydieninfektion

Kultureller Nachweis

Chlamydien lassen sich in geeigneten Zellinien wie BGM, McCoy und auch das bebrütete

Hühnerei anzüchten. Durch diese Methode lässt sich die Lebensfähigkeit der Erreger

beweisen.

Einige der Spezies lassen sich sehr einfach züchten. Andere sind schwer kultivierbar und

benötigen die sehr aufwendige Bruteitechnik. Der kulturelle Nachweis wird zunehmend

durch die PCR verdrängt.

Mikroskopische Nachweismethoden

In der Giemsa Färbung lassen sich in Ausstrichpräparaten von Patienten mit

Einschlusskonjunktividen intrazytoplasmatische Einschlüsse von C. trachomatis

finden (Woods and Walker, 1996) Eine klassische Färbemethode in der Veterinärmedizin

ist die Gimenez Färbung (World organisation for animal health, 2006). Eine weitere

einfache Färbemethode stellt auch die DNA-Markierung mit 4’,6-Diamidino-2-phenylindol

(DAPI) dar, in welcher fluoreszenzmikroskopisch intrazelluläre Einschlüsse zu erkennen

sind (Theegarten et al., 1998).

39

Antigen-Nachweis- Methoden

Hierbei handelt es sich um die Immunhistochemie und die Immunfluoreszenz.

Durch die Immunhistochemie ist ein Direkt-Nachweis chlamydialer Einschlüsse möglich.

Erfolg verspricht diese Methode bei hohem Antigengehalt im Untersuchungsmaterial.

Sensitiver als die Immunhistochemie ist die Immunfluoreszenz. Um die Spezifität dieser

Methode zu erhöhen, ist eine sorgfältige Auswahl der monoklonalen Antikörper und Anti-

seren notwendig. Genauere Angaben zum Ablauf der Immunhistochemie und der Immun-

fluoreszenz sind den Kapiteln 5.2 und 5.3 der vorliegenden Arbeit zu entnehmen.

Antikörper-Nachweis-Methoden

Antigen-ELISA-Kits (Enzyme-linked immunosorbent assay) beruhen meist auf dem

Nachweis von Lipopolysacchariden (LPS). Durch diesen Test ist nur der Nachweis der

Gattung Chlamydia möglich. Hierbei treten häufiger als bei anderen Methoden falsch

positive Ergebnisse auf.

Ein Antikörper-ELISA-Test kommt hier ebenso wie die Komplementbindungsreaktion

(KBR) zur Anwendung. Der Antiköper-ELISA-Test ist sensitiver und schneller durchführbar

als die KBR. Probleme dieser Untersuchungsmethoden entstehen bei niedrigen oder erst

spät erscheinenden Antikörpertitern. Insgesamt betrachtet ist die ELISA- Serologie

problematisch (Peter et al., 2002).

Nukleinsäure-Aplifikationstests

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion (LCR) und die Real-Time-

PCR sind Methoden der Nukleinsäure-Amplifikationstests.

Die PCR ist eine relativ schnell durchführbare Methode (1 Tag). Durch die Auswahl der

gewünschten Primer ist die Spezifität sehr hoch. Hierdurch ist eine Differenzierung der

unterschiedlichen Spezies möglich.

40

3. Material und Methoden

3.1 Patientengut

Zwischen Oktober 2002 und Januar 2004 wurden 984 Pferde an unterschiedlichen

Schlachthöfen und Reitställen in Nordrhein-Westfalen, in den Kreisen Recklinghausen,

Gelsenkirchen, Dortmund, Lünen, hinsichtlich des Vorliegens einer RAO begutachtet.

Hierbei handelte es sich um Pferde, die aus unterschiedlichen Gründen getötet werden

sollten.

3.2 Einschlusskriterien

Die Auswahl erfolgte anhand von Ein- und Ausschlusskriterien in standardisierter Form,

durch Befragung der Besitzer/Halter oder der behandelnden Tierärzte nach der Kranken-

geschichte und den Symptomen. Es wurde ein standardisierter Fragebogen verwendet

(Fragebogen 8.4 im Anhang). Eingeschlossen wurden nur Tiere, bei denen alle abge-

fragten Symptome des Fragebogens vorhanden waren. Zudem wurde vor der Euthanasie

bzw. Schlachtung eine klinische Untersuchung bei allen Pferden durchgeführt. Als

Kontrollgruppe dienten nur Pferde die weder Symptome noch sonstige Hinweise auf eine

pulmonale Erkrankung zeigten. Die Kriterien wurden in Absprache mit PD Dr. K. Fey von

der Justus-Liebig-Universität Giessen (Klinik für Pferde/ Innere Medizin) festgelegt.

Klinische Zeichen:

- Dyspnoe

- deutliches biphasisches Expirium (passives Exspirium gefolgt von

aktivem Exspirium)

- Atemfrequenz > 20 pro min. in Ruhe

- Hypertrophie des M. rectus abdominis als sogenannte „Dampfrinne“

- geblähte Nüstern

41

- evtl. Afteratmung

- Nasenausfluss (in Ruhe wenig, nach Belastung schaumig, weißlicher,

blasiger Ausfluss)

- Auskultatorisch: giemen, brummen, pfeifen, verschärftes Inspirium und in

Hauch von Exspirium.

Abb. 1: Hypertrophie des M.rectus abdominis eine an RAO-erkrankten Pferdes

42

Abb. 2: Weitstellung der Nüstern, bei Ruheatmung eines RAO-kranken Pferdes

Anamnestisch

- anhaltender oder rezidivierender Husten länger als 3 Monate

- Dyspnoe

- Leistungsverminderung (leichte Ermüdbarkeit, vermehrtes Schwitzen)

- Verschlechterung der Symptomatik bei Kontakt zu potentiell antigenwirk-

samer Substanzen, wie z.B. Heustaub

- Pilzsporen

- Futtermilben

- schlechte Stallhygiene, Ammoniak wird zu 3-Methyl-indol umgesetzt

- mangelnde Stallbelüftung

Hilfreich wären Antworten auf die Frage nach folgenden Symptomen gewesen; diese

Angaben konnten jedoch nur selten gemacht werden:

- Besserung der Symptomatik durch Beta2- Agonisten (Clenbuterol)

od. Kortikosteroide (Prednisolon od. Dexamethason)

43

- Hypoxie bei normalem CO2 bzw. AaDO2 > 7 besser > 14

- Kein Nachweis pathologischer Erreger im Bronchialsekret

Je nach Schweregrad ist es möglich, dass die Symptome einzeln oder kombiniert

vorkommen.

3.3 Ausschlusskriterien

Die Pferde wurden ausgeschlossen, wenn eine Anamnese nicht möglich war. Ebenfalls

wurden die Pferde ausgeschlossen, bei denen der Verdacht auf eine der folgenden

differentialdiagnostischen Erkrankungen bestand:

- akutes Asthma

- Lungenwürmer (Dictyocaulus arnfieldi)

- Pneumonien

- Pulmonale oder mediastinale Neoplasien

- Erkrankungen der oberen Atemwege

- Pleuritis

44

3.4 Materialentnahme und Verarbeitung

Die Lungen der euthanisierten oder geschlachteten Pferde wurden entnommen. An-

schliessend erfolgte aus den Lungen die Entnahme von 8 Proben entsprechend dem

unten beschriebenem Schema.

Abb. 3: Entnahmeschema

Es folgt die Fixation in Ethanolessigsäure und gepufferter 3% Formalinlösung (Sigma,

Taufkirchen). Ferner wurde Material duch Schockgefrierung bei -80°C konserviert.

Nach 24-48 Std. wurden die in Ethanolessigsäure und gepufferter 3% Formalinlösung

fixierten Proben in Paraffin eingebettet. Dieses erfolgte entsprechend der gängigen

Technik.

45

3.5 Histologie

3.5.1 Histologische Bearbeitung und Auswertung der Proben

Mit Hilfe eines rotierenden Mikrotoms (Microm GmbH, Walldorf, Deutschland) wurden 3-

7µm dicke Schnitte angefertigt. Im nächsten Schritt wurden die Schnitte auf beschichtete

Objektträger (Menzel Super Frost Plus®) aufgezogen. Diese wurden nach den gängigen

Methoden mit Haematoxylin-Eosin gefärbt. Anschliessend erfolgte die lichtmikroskopische

Beurteilung. Dabei wurde jeder Schnitt mit einer Punktzahl zwischen 0 und 4 bewertet. Die

Durchführung erfolgte unter den Bedingungen einer blinden Studie.

0 = keine Entzündung

1 = minimal ausgeprägte Entzündung

2 = leicht ausgeprägte Entzündung

3 = mässig ausgeprägte Entzündung

4 = stark ausgeprägte Entzündung

Aus der Gesamtsumme ergibt sich der jeweilige Histo-Score (Tab. A 5, RAO-Pferde

Einteilung).

Insgesamt wurde eine Einteilung in 5 Gruppen vorgenommen:

Tiere mit einem Score von >10 gelten als sicher histologisch krank.

46

3.6 Immunhistochemie

Die Immunhistochemie bietet die Möglichkeit der Darstellung und Identifikation immuno-

logisch reaktiver Strukturen auf oder in Zellen und Geweben. Die Anwendung von immun-

histochemischen Verfahren beruht auf Reaktionen von antikörpertragenden Farb-

komplexen mit den antigentragenden Strukturen. Diese werden durch die Anfärbbarkeit im

histologischen Präparat sichtbar.

3.6.1 Durchführung der Immunhistochemie

Immunhistochemie am Paraffinschnitt

Die Immunhistochemischen Untersuchungen wurden am Paraffinschnitt mit Hilfe der

Histostain®-Bulk Kits (Zymed®Laboratories Inc.) in Form einer ABC-Peroxidase-Methode

durchgeführt.

Die Schnitte wurden Mithilfe eines rotierenden Mikrotoms (Microm GmbH, Walldorf,

Deutschland) in einer Dicke von 3-7 um angefertigt. Anschliessend wurden Schnitte auf

beschichtete Objektträger aufgezogen (Menzel Super Frost Plus®).

Bei 37º Celsius trockneten die Schnitte über Nacht. Folgend mussten die Schnitte ent-

paraffinisiert werden (8.2.1 Arbeitsprotokoll der Immunhistochemie). Die Antigen-

markierung erfolgte nach der Anleitung des Herstellers (Zymed®Laboratories Inc.) mit der

Änderung der Inkubationszeiten (8.2.1 Arbeitsprotokoll der Immunhistochemie).

Die letztendlich benötigte Konzentration wurde durch die Austestung unterschiedlicher

Konzentrationen ermittelt.

Negativ- und Positivkontrollen wurden zur Verhinderung von fehlerhaften Reaktionen

durchgeführt (8.3.1Markierungsprotokoll der Immunhistochemie).

47

Die Auswertung erfolgte durch lichtmikroskopische Begutachtung (Zeiss Axiophot Mikro-

skop, Carl Zeiss, Oberkochem, Deutschland), mit Hilfe eines digitalen Systems (Diskus

Software, Koenigswinter, Deutschland), dreier Gesichtsfelder bei 40-facher Vergrößerung

und quantitativer Auszählung aller existierender Zellen und zusätzlich der befallenen

Zellen. Die Auszählung erfolgte separat für bronchiale Epithelzellen, Pneumozyten Typ II

und Makrophagen.

Die Ergebnisse wurden bei Betrachtung durch ein Mikroskop (Olympus IX-70 Mikroskop,

Olympus Europe, Hamburg, Deutschland) durch abfotografieren mit einer Digitalkamera

dokumentiert (Kappa, Gleichen, Deutschland).

3.7 Immunfluoreszenzmikroskopie

Die Immunfluoreszenzmikroskopie (IFT= immunfluorescence test) ist eine Methode, die

dem Nachweis von Antigenen od. Antikörpern dient. Dieses ist in histologischen und zyto-

logischen Präparaten möglich. Zudem sind eine Zelldifferenzierung und die Differenzierung

von Immunglobulinen möglich.

Zwei unterschiedliche Formen dieser Methode stehen zur Verfügung.

Die eine ist die direkte IFT. Hierbei binden sich fluoreszenzmarkierte Antikörper an das

entsprechende Antigen.

Die andere ist die indirekte IFT. Sie basiert auf der Bindung fluoreszenzmarkierter

Antikörper an Immunkomplexe, die sich zuvor gebildet haben. In der vorliegenden Arbeit

wurde die Methode der indirekten IFT gewählt. Die anschließende Mikroskopie macht die

fluoreszierenden Komplexe sichtbar.

48

3.7.1 Durchführung der Immunfluoreszenz

Die Proben von zwei RAO-erkrankten Tieren und eine Probe aus der Kontrollgruppe

wurden ausgewählt, um daran die IFT durchzuführen. Die Behandlung erfolgte laut 9.2.2

Arbeitsprotokoll Immunfluoreszenz.

Bei der Markierung wurden unterschiedliche Primärantikörper gegen chlamydiales Antigen

eingesetzt. Zum einen wurde ein Antikörper gegen chlamydiales LPS und zum anderen ein

Antikörper gegen Antigen von Chlamydia psittaci eingesetzt (8.3.2 Markierungsprotokoll

Immunfluoreszenz).

Bei beiden Antikörpern zeigten sich Chlamydienspezifische fluoreszierende Spots.

Durch DAPI erscheinen die Zellkerne blau. Cytokeratin fluoresziert grün. Chlamydiales

Antigen zeigt sich in roter Farbe.

3.8 PCR

Die Polymerasekettenreaktion (Polymerase chain reaction= PCR) erlaubt die In-vitro-

Vermehrung einer spezifischen DNA-Sequenz. Katalysiert wird diese Reaktion durch eine

DNA-Polymerase.

Im Prinzip ist die PCR ein Vorgang, der aus der Wiederholung von drei Schritten (Strang-

trennung, Primerhybridisierung und Kettenverlängerung), die zu einer Vermehrung eines

Zielfragmentes führt. Hierdurch können sehr viele Kopien hergestellt werden. (Varsanyi

and Beyer, 1999).

Ein Vorteil der PCR ist, dass die DNA aus verschiedenen Quellen stammen kann. So ist

z.B. die Diagnose der Phenylketonurie aus Blut möglich, oder in der Forensik, der DNA-

Nachweis aus Blut, Sperma, Haaren usw. (genetischer Fingerabdruck).

49

Auch ist die Detektion von Erbkrankheiten möglich. Dabei wird die verursachende Mutation

diagnostiziert.

Ein weiterer großer Einsatzbereich der PCR ist die Viren und Bakteriendiagnostik. Etabliert

hat sich der Nachweis in der HIV-Diagnostik und auch beim Nachweis einer Infektion mit

Mycobakterium tuberkulosis. Eine große Menge weiterer Infektionen ist durch diese

diagnostische Möglichkeit identifizierbar.

Zudem ist die PCR eine schnelle (1 Arbeitstag) und sensitive Nachweismethode. Ihre

Spezifität ist durch die Auswahl des Primers in ihrer Spezifität variabel. Umfangreiche

Untersuchungen zur Validierung stehen aber noch aus (Sachse et al., 2002).

In unserem Fall erlaubt die PCR die Amplifikation der genomischen DNA der Chlamydien

aus wenigen Ausgangs-DNA-Molekülen und damit den entsprechenden Nachweis einer

vorliegenden Infektion mit Chlamydophila.

3.8.1 Durchführung der PCR

Als Material dienten Proben aus den Lungen der Pferde. Dieses Material wurde kurz nach

dem Tod der Tiere entnommen, gekühlt und spätestens nach 2 Std. schockgefroren und

anschliessend bei -80° Celsius gelagert. Der Transport der Proben erfolgte bei ständiger

Kühlung auf Trockeneis. Das Lungenmaterial aller Tiere wurde untersucht.

Die Bundesanstalt für Viruserkrankungen der Tiere / Naumburger Str.96 a/ D-07743 Jena,

führte die PCR durch.

Zur DNA Isolation aus dem Gewebe wurde das High Pure Templete Prepation Kit (Roche

Diagnostics, Mannheim, Deutschland) entsprechend der Anleitung des Herstellers ver-

wendet. 5 µl extrahierte DNA sind als „Template“ für die PCR notwendig.

50

Die Testung des Gewebes erfolgte auf Chlamydia psittaci, Chlamydia abortus und auf

Chlamydia pneumoniae mit Hilfe einer modifizierten Version der „Nested PCR“. Das Vor-

gehen wird von Kaltenböck et al. (1997) beschrieben. Ziel ist das ompA Gen.

Der erste Schritt ist die genusspezifische Amplifikation. Als Primer wurde 191CHOMP (5’-

GCI YTI TGG GAR TGY GGI TGY GCI AC-3’) und CHOMP371 (5’-TTA GAA ICK GAA

TTG ICG RTT IAY GTG IGC IGC-3’)benutzt. Für die zweite Amplifikation wurde 1 µl des

genusspezifischen Produkts und die Primer-Kombination 218PSITT (5’-GTA ATT TCI AGC

CCA GCA CAA TTY GTG-3’) / CHOMP336s (5'-CCR CAA GMT TTT CTR GAY TTC AWY

TTG TTR AT-3') für Chlamydia psittaci, oder 201CHOMP (5'-GGI GCW GMI TTC CAA

TAY GCI CAR TC-3') / PNEUM268 (5'-GTA CTC CAA TGT ATG GCA CTA AAG A-3') für

Chlamydophila pneumoniae.

Die Größe des Genus-spezifischen Produkts beträgt 576-597 bp. Die Größe für Chlamydia

psittaci beträgt 389-404 bp und 244 bp für Chlamydia pneumoniae.

Ein detailliertes Protokoll über das Prozedere ist von Sachse und Hotzel (2002) beschrie-

ben worden.

DNA-Sequenzierung

Fünf µl extrahierte DNA dienten als „Template“ für die Amplifikation der kennzeichnenden

Region der 16S rRNA. Die Amplifikationsbanden wurden aus dem Agarosegel geschnitten.

Die Extraktion erfolgte mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kit (QUIAGEN, Hilden,

Deutschland). Das BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied

Biosystems, Darmstadt, Deutschland) diente der Sequenzierung.

Die Oligonukleotide 16SIGF (5'-CCG CGT GGA TGA GGC AT-3') und 16SIGR (5'-TCA

GTC CCA GTG TTG GC-3') wurden für die Amplifikation und die Sequenzierung als

Primer benutzt. Mit dem ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)

wurden die Nucleotidsequenzen bestimmt.

51

4. Ergebnisse

4.1. Ergebnisse der Klinik

Als klinisch RAO-erkrankt wurden 25 Pferde eingestuft.

Als Kontrollgruppe wurden 20 scheinbar gesunde Pferde (d.h. ohne klinische und anam-

nestische Hinweise auf das Vorliegen einer RAO) ausgewählt.

Abb.4: Makroskopische Aufsicht auf die Pleura der Lunge eines RAO-kranken

Pferdes

52

Abb. 5: Schnittfläche einer formalinfixierten Probe aus der Lunge eines RAO

erkrankten Pferdes. Deutlich sichtbare trübglasige Knötchen

Abb. 6: Schnittfläche einer formalinfixierten Probe aus der Lunge eines RAO er-

krankten Pferdes. Deutlich sichtbare trübglasige Knötchen. Zusätzlich Verdickung

der Pleura

53

4.2 Ergebnisse der Histologie

9 Tiere, die auch schon klinisch als krank eingestuft wurden, hatten einen Score von > 10

und gelten im Weiteren als die RAO erkrankten Pferde (Gruppe IV).

Diese Tiere zeigten histologisch eine ausgeprägte Bronchiolitis.

15 Pferde (Gruppe I) wurden als klinisch gesund/ histologisch gesund eingestuft (Histo-

Score ≤ 2). Lichtmikroskopisch sind keine entzündlichen Veränderungen zu erkennen.

Die anderen Kategorien von Pferden ergaben sich wie folgt:

Zum einen ist das die Gruppe der klinisch gesunden / histologisch leicht kranken Pferde.

Diese Gruppe umfasst 5 Pferde mit einen Score zwischen 4 und 6 Punkten (Gruppe II).

Zum anderen gibt es die Kategorie der klinisch kranken Pferde, die jedoch histologisch

keine RAO typischen Veränderungen zeigen (Score zwischen 0-5). 16 Pferde fallen in die-

se Kategorie (Gruppe III).

Die Histologie der erkrankten Tiere zeigt entzündliche Veränderungen in den Endver-

zweigungen des Bronchialbaums. Das Lumen der Bronchialäste bzw. der Bronchioli ist

partiell mit Sekret, dessen Bestandteile Granulozyten, Makrophagen und abgeschilferte

Epithelzellen sind, verlegt.

Intra- und subepitheliale Infiltrate aus neutrophilen Granulozyten und Lymphozyten treten

hervor.

Die Zahl der Becherzellen ist erhöht und die Bronchialepithelien sind aufgelockert. Diese

histologischen Veränderungen entsprechen denen, die Schoon und Deegen 1983 be-

schrieben.

Anhand der folgenden 3 Abbildungen soll ein Überblick über die wesentlichen Verän-

derungen, die bei RAO-kranken Tieren typisch sind, gegeben werden.

54

Abb. 7: HE, Lichtmikroskopie, Bronchioli eines RAO-erkrankten Tieres. Luminal

Sekret. Intra- und subepitheliale Infiltrate.

Abb. 8: HE, Lichtmikroskopie, deutliche Entzündung.

55

Abb. 9: HE, Lichtmikroskopie, Abbildung eines Bronchiolus aus der Lunge eines

RAO- kranken Pferdes. Entzündliche Infiltrate. Bronchialepithelien aufgelockert.

4.3 Ergebnisse der Immunhistochemie

Die Auswertung der Immunhistochemischen Markierungen ergab ein sehr eindeutiges Bild.

Bei den Tieren mit RAO sowie histologisch schwerer Erkrankung (Gruppe IV) fanden sich

ein hoher Antigen-Gehalt (Dargestellt duch die roten Spots) und viele Einschlusskörper-

chen, typisch für eine akute chlamydiale Infektion.

Die roten Spots sind perinukleär angeordnet. Die folgende Aufnahme zeigt eine Übersicht

bei 100-facher Vergrößerung im Lichtmikroskop.

56

Abb. 10: IHC, MPf 7, Antikörper Chl. ps., 100x Verg., Abbildung zweier Bronchioli.

Vorwiegend im Bronchiolusepitel rote Anfärbung von chlamydialem Antigen.

In den Proben der erkrankten Pferde gibt es Unterschiede in der Quantität der Spots, als

auch in dem Befall der einzelnen Zelltypen. Entsprechende Zahlen zu diesen Unter-

schieden sind der (Tabelle A 4) Auswertung der Immunhistochemie zu entnehmen. Diese

Variabilitäten sind den weiteren Abbildungen zu entnehmen. Die folgenden Abbildungen

wurden bei einer stärkeren Vergrößerung aufgenommen.

57


Bronchiolusepithel.


Brochiolusepithel. Vereinzelt Spots im Interstitium.

58

Im einzelnen handelt es sich bei den betroffenen Zellen um Makrophagen, Pneumozyten

Typ II und Epithelzellen der Bronchioli.

Abb. 13: IHC, MPf 45, Antikörper Chl. ps., 400x Verg., Ansicht eines Bronchiolus.

Intraluminal Sekret mit neutrophilen Granulozyten und ein befallener Makrophage.

Abb. 14: IHC, MPf 45, Antikörper Chl. ps., 400x Verg., Ausschnitt eines Bronchiolus.

Perinukleär angeordnete chlamydiale Einschlusskörper.

59

Abb. 15: IHC, MPf 7, Antikörper Chl. ps., 200x Verg., Ausschnitt eines Bronchiolus.

Stärkere Ausprägung des chlamydialem Befalls (rot markiert).

Abb. 16: IHC, MPf 7, Antikörper Chl. ps., 400x Verg., Darstellung alveolärer

Strukturen. Pneumozyten Typ II und Makropage trägt chlamydiales Antigen.

Die Verteilung des CP Antigen in den Lungen klinisch gesunder Pferde (Gruppe I und II) ist

typisch für eine persistierende Infektion (geringer Antigen-Gehalt, wenige Einschluss-

körperchen). Beispielhaft sind einige Aufnahmen der Kontrollgruppe dargestellt.

60

Abb. 17: IHC, MPf 21, Antikörper Chl. ps., 100x Verg., Darstellung eines Bronchiolus

und umgebenden alveolärem Gewebe.

Abb. 18: IHC, MPf 27, Antikörper Chl. ps., 100x Verg., Darstellung eines Bronchiolus

und umgebenden alveolärem Gewebe. Auch in dieser Aufnahme sind keine

spezifischen Einschlusskörperchen zu erkennen.

61

Anhand dieser Abbildungen werden die Unterschiede in Bezug auf die Quantität des

chlamydialen Antigens deutlich. Die Proben der betroffenen Tiere zeigen massenhaft

charakteristische Spots im Gegensatz zu den Tieren der Kontrollgruppe. Hier sind deutlich

weniger Spots zu erkennen.

Dazu kommen die sehr seltenen uncharakteristischen Anfärbungen und diese sind gut von

den Charakteristischen abzugrenzen. Diese wurden vereinzelt gesehen, liegen dann aber

nicht mit dem Gewebe in einer Ebene und/oder die Anordnung dieser Unspezifitäten ent-

spricht nicht dem der „echten“ Spots. Dazu zählt die Anordnung perinukleär sowie die Zu-

sammensetzung eines Spots aus sehr vielen kleinen Punkten, die bei starker Ver-

größerung sichtbar werden.

4.4 Ergebnisse der Immunfluoreszenzmikroskopie

Auch diese Untersuchungsmethode zeigt das Vorhandensein chlamydialer Antigene bei

den RAO-erkrankten Tieren. Durch diese Art der Mikroskopie sind Informationen über die

Lokalisation des chlamydialen Antigens zu bekommen. Dort zeigten sich typisch an-

geordnete perinukleare Spots in den Epithelzellen, Makrophagen und Granulozyten bei 2

Pferden der Gruppe IV.

Die folgenden drei Abbildungen zeigen jeweils einen Bronchiolus zweier RAO erkrankten

Pferde und eines gesunden Pferdes.

Die kleinen roten Spots markieren chlamydiales LPS.

62

Abb. 19: MPf 8, Anti-Chl. LPS, Vergrößerung: 40 x+1,5 x 0,85+ 255, rot

fluoreszierende Spots im Bronchiolusepithel.

Abbildung 20: MPf 22, Anti-Chl. LPS, Vergrößerung: 40 x+1,5 x 0,85+ 255, deutlich

rot fluoreszierende Spots. Vor allem im Bronchiolusepithel, aber auch interstiell

Vorkommen von chlamydialem Antigen. Spots liegen nahe dem Zellkern.

63

Abbildung 21: MPf 27, Anti-Chl. LPS, Vergrößerung: 40 x+1,5 x 0,85+ 255,

RAO-gesundes Pferd. Keine Rotfluoreszenz zu erkennen.

Im Folgenden sind drei Bilder aufgeführt, die mit einem Chlamydia psittaci Antikörper

markiert sind.

Abbildung 22: MPf 8, Anti-Chl. psittaci, Vergrößerung: 40 x+ 1,5 x 0,85+ 255,

Anschnitt eines Bronchiolus. Deutliche Markierung im direktem Umfeld eines

Zellkerns im oberen Bilddrittel.

64


Anschnitt eines Bronchiolus. Massives Antigenvorkommen im Epithel, zu erkennen

an den roten Spots. Zusätzlich im Lumen des Bronchiolus mehrere Zellen Träger

des Chl. psittaci-Antigens.


Anschnitt eines Bronchiolus eines Tieres der Kontrollgruppe. Kein Hinweis auf das

Vorhandensein des Antigens von Chl. psittaci in diesem Ausschnitt.

65

Als Negativkontrolle wurde bei jedem der drei untersuchten Pferde der Primärantikörper

durch PBS ersetzt, wobei die Zusammenstellung der Sekundärantikörper unverändert

blieb.

Beispielhaft im Folgenden die Immunfluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen des Pferdes

MPf 8 in der Negativkontrolle.

Abbildung 25: MPf 8, Negativkontrolle durch Ersatz des Primärantikörpers mit PBS,

Vergrößerung: 40 x+ 1,5 x 0,85+ 255, Position 2 des Markierungsprotokolls der IFT.

Lediglich Darstellung der Zellkerne durch DAPI. Kein Cytokeratin und kein

chlamydiales Antigen markiert.

66

Abbildung 26: MPf 8, Negativkontrolle durch Ersatz des Primärantikörpers mit PBS,

Vergrößerung: 40 x+ 1,5 x 0,85+ 255, Position 3 des Markierungsprotokolls der IFT.

Lediglich Darstellung der Zellkerne durch DAPI. Kein Cytokeratin und kein

chlamydiales Antigen markiert.

Diese Ergebnisse, verdeutlicht durch die entsprechenden Abbildungen, stützen die

Ergebnisse der Immunhistochemie. Ebenso wie in der Immunhistochemie sind auch hier

die RAO-erkrankten Pferde deutlich „Chlamydien positiv“. Das Tier der Kontrollgruppe zeigt

in diesem Ausschnitt kein Chlamydiales Antigen

67

4.5 Ergebnisse der PCR

Die PCR ist positiv in 60% der RAO erkrankten Tiere und 45% der Kontrollgruppe.

Die PCR zeigte CP DNA in 6 von 15 (=40%) Pferden der Gruppe I, 4 von 5 ( =80%) in

Gruppe II, 12 von 16 (=75%) in Gruppe III und 2 von 9 (=22,2%) in Gruppe IV.

Zur Unterscheidung der Identität der Chlamydien Spezies wurde von 22 der 24 positiven

Fälle die DNA sequenziert.

Die Sequenzierung des ompA Gens zeigt das Vorhandensein von Chlamydophila psittaci

(n = 9) und Chlamydophila abortus (n = 13).

68

4.6. Statistik

Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe eines PC und dem Betriebssystem Window

XP Professional (Microsoft, Redmond, USA). Als Softwareprogramm diente SPSS Version

12 (SPSS Inc., Chicago, USA).

Zur Berechnung und Auswertung wurden die Tests Mann-Whitney-U-Test, Pearson Chi

Quadrat Test und der Spearman-Rho Korrelation Koeffizient (zweiseitig) verwendet. Die

Testvariabilität ist 0.05 und damit sind die Werte statistisch signifikant.

Von insgesamt 948 Pferden wurden 45 Pferde durch Befragung anhand des standar-

disierten Fragebogens und der Histologie für die vorliegende Studie ausgewählt.

Das Alter der Pferde liegt im Median bei 16,11 Jahren (Spanne 9-25Jahre).

Unter den 45 Pferden sind 23 Stuten, 20 Wallache und 2 Hengste.

Betreffend das respiratorische System waren 20 Pferde gesund. 25 Pferde zeigten

Symptome einer RAO.

Lahmheit war der häufigste Grund zur Tötung der Pferde (40% beider Gruppen). Bei den

RAO erkrankten Tieren, war es zu 36% diese Erkrankung, die zur Tötung führte.

Eine Therapie, betreffend die RAO erhielten 56% der Tiere. Da die Behandlung erheblich

variierte, wurde auf eine weitere Statistische Auswertung des Therapieregiemes verzichtet.

Der Grossteil, sowohl der gesunden als auch der kranken Pferde, wurde in Ställen ge-

halten und als Einstreu diente Stroh (70% der gesunden Pferde, 68% der erkrankten

Pferde). 5% der Pferde der Kontrollgruppe und 32% der RAO-erkrankten Tiere erhielten

als Alternative zu Stroh Holz/ Hobelspänen oder Leinenstroh als Einstreu.

Eine Offenstallhaltung bzw. permanenter Weidegang mit Unterstand wurde in 20% der

Fälle angegeben. Diese Haltungsform kam jedoch nur bei den Pferden der Kontrollgruppe

vor. Die beiden Gruppen zeigten signifikante Unterschiede im histologischen Score (p =

0,010), in der Anzahl der CP Antigen positiven bronchialen Epithelzellen (p < 0,001), eben-

so wie der prozentuale Anteil der CP Antigen positiven Zellen insgesamt (p < 0,001)

(Tab. A 7).

69

Die klinischen Daten und die histologischen Ergebnisse lassen eine Aufteilung in folgende

Gruppen zu:

Zu Gruppe I gehören 15 Pferde, die als klinisch/histologisch gesund eingestuft wurden

(Histo-Score ≤ 2).

In Gruppe II sind 5 Pferde eingestuft worden, die klinisch gesund sind, aber histologisch

leicht entzündliche Veränderungen zeigen, (Histo-Score = 4-6).

Gruppe III entspricht klinisch kranker Pferde, die jedoch histologisch keine RAO typischen

Veränderungen zeigen (Histo-Score = 0-5). 16 Pferde fallen in diese Kategorie.

Gruppe IV umfasst 9 Tiere, die auch schon klinisch als krank eingestuft wurden und im

weiteren als die RAO erkrankten Pferde gelten (Histo-Score = 12-29).

Die Tiere, die speziell aufgrund ihrer RAO getötet wurden (9 Fälle) zeigen einen

signifikanten Unterschied in der Anzahl der CP Antigen positiven bronchialen

Epithelzellen (p = 0.037) im Vergleich zu den aufgrund anderer Erkrankungen

getöteten Tieren (Tab. A 8).

Zwischen dem Alter der Tiere und dem Histo-Score besteht keine Korellation (Spearman-

Rho, p=0.425).

Immunhistochemisch ist CP Antigen, mit Ausnahme von 3 Pferden in Gruppe I, bei allen

Tieren zu erkennen. Antigen ist in den bronchialen Epithelzellen und teilweise in Pneumo-

zyten Typ II und Makrophagen. Pneumozyten Typ II sind in 12 Fällen positiv (3 in Gruppe I,

1 in Gruppe III, 8 in Gruppe IV). Makrophagen sind in 6 Fällen betroffen (1 in Gruppe I, 5 in

Gruppe IV). Die entsprechenden Daten und signifikanten Unterschiede sind in Tabelle A 6

zu sehen. Je ausgeprägter die Krankheit ist, desto höher ist auch die Anzahl der antigen

positiven Zellen. Die Anordnung der Antigen positiven Zellen in den Lungen der gesunden

Tiere (Gruppe I und II) ist typisch für eine persistierenden Infektion und bei denen mit RAO

und histologisch gesicherter Erkrankung (Gruppe IV) ist die Anordnung typisch für eine

akute Infektion. Zwischen den Gruppen II und III gibt es in den immunhistochemischen

Untersuchungen keinen signifikanten Unterschied.

Das Alter der Tiere korreliert nicht mit den immunhistochemischen Ergebnissen

(Spearman Rho, >0,05).

70

Positive und signifikante Spearman Rho Korellationen finden sich bei folgenden Para-

metern: Lichtmikroskopischer Score, die Anzahl der CP antigen positiven Makrophagen,

Typ II Pneumozyten, bronchiale Epithelzellen und die Prozentzahl aller CP Antigen-

positiven Zellen.

Der höchste Korellationskoeffizient (r=0,993) wurde zwischen der Prozentzahl aller CP

antigen-positiven Zellen und der Anzahl der positiven bronchialen Epithelzellen gefunden.

Der niedrigste Korellationkoeffizient (r= 0,41) wurde zwischen positiven Makrophagen und

dem histologischen Score gefunden (Tab. A 10).

Die Betrachtung der Faktoren Stroh als Einstreu vs. alternative Einstreu oder RAO

erkrankung mit Therapie vs. ohne Therapie zeigt im histologischen Score, Ergebnis der

Immunhistochemie oder der PCR keine Korrellation (Mann-Whitney U-test, p>0,05).

Die PCR zeigte CP DNA in 6 von 15 (= 40%) Pferden der Gruppe I, 4 von 5 ( = 80%) in

Gruppe II, 12 von 16 (=75% ) in Gruppe III und 2 von 9 (=22,2% ) in Gruppe IV. Die Unter-

schiede sind signifikant in den 4 Gruppen (Pearson Chi Quadrat Test, p= 0,006). Gleich-

wohl gibt es keinen signifikanten Unterschied zwischen klinisch gesunden und kranken

Tieren (Tab. A 9).

Um die Identität der Chlamydien Spezies zu bestätigen, wurde von 22 der 24 Pferde DNA

extrahiert und in der 16S rRNA Region (ungefähr 300 bp) sequenziert. Bei 9 Proben wurde

CPP identifiziert und 13 Fälle mit CPA. Hier ist kein signifikanter Unterschied in den vier

Gruppen zu erkennen (Pearson Chi Quadrat Test, p=0,309).

Um weiter Informationen über die Lokalisation des chlamydialen Antigens zu bekommen,

wurde die Immunfluoreszenzmikroskopie durchgeführt. Dort zeigten sich typisch an-

geordnete perinukleare Spots in den Epithelzellen, Makrophagen und Granulozyten bei 2

Pferden der Gruppe IV (siehe Abbildungen zur Immunfluoreszenzmikroskopie).

71

4.7 Sonderfall MPf 9

Einen Sonderfall stellt das Pferd MPf9 dar. Hierbei handelt es sich um eine 30jährige

Warmblutstute, die aufgrund einer Kolik euthanasiert wurde. Klinisch erfüllte dieses Pferd

alle Kriterien einer RAO. Die Anamnese erfolgte durch den behandelnden Tierarzt und die

Besitzer, die über mehrere Jahre den Krankheitsverlauf beobachteten.

Aufgrund der Symptome von Leistungsminderung, deutlicher Luftnot, Husten und Nasen-

ausfluss bei Stallhaltung wurde dieses Pferd in den letzten Jahren ausschließlich auf einer

Weide mit Unterstand gehalten. Auf der gleichen Weide wurde eine ebenfalls erkrankte

Stute (Tochter der Stute MPf 9) und ein Esel gehalten.

Therapeutisch wurden zusätzlich zu den verbesserten Haltungsbedingungen folgende

Maßnahmen zu unterschiedlichen Zeitpunkten durchgeführt:

Gabe von Anticholinergika

Gabe von Beta-2 Sympathomimetika

Gabe von Glykokortikoiden

Gabe von Antibiotika

Gabe von Expektorantien/ Acetylcystein

Gabe von Antihistaminika

Akupunktur

Homöopathika

Eine vollständige Wiederherstellung des Gesundheitszustands bzw. Symptomfreiheit

wurde nicht erreicht.

Postmortal wurde Proben der Lunge entnommen und entsprechend den anderen Fällen

aufgearbeitet und ausgewertet.

In der Histologie zeigte sich keine RAO-typische Veränderung. Der Histo-Score ist 0. Allerdings zeigten sich ein parasitärer Befall und eine Anhäufung eosinophiler Granulo-

zyten. Diese läßt am ehesten auf eine Infektion mit Dictyocaulus arnfieldi schließen.

72

Dieses Pferd wurde innerhalb des letzten Jahres vor der Tötung einmalig mit Ivermectin

intramuskulär, aufgrund eines Befalls mit Haarlingen, behandelt.

Britt beschrieb 1985 die hohe Effizienz von oral appliziertem Ivermectin zur Behandlung

von Dictyocaulus arnfieldi Infektionen.

In diesem Fall muß also von einer Reinfektion mit diesen Parasiten ausgegangen werden.

In der PCR wurde dieses Pferd Chlamydia psittaci positiv getestet.

Tab.2: Auswertung Immunhistochemie MPf9 MPf 9 Gesichtsfeld: 1 2 3 Makrophag pos. 0 0 0 0 Pneumozyt pos. 0 0 0 0 Epithelzelle pos. 18 0 2 20 Zellzahl ge-samt 637 441 387 1465 1,37

73

5. Diskussion

Die histologische Einteilung der Pferde in 4 Kategorien erklärt sich durch unterschiedliche

Gründe.

Sowohl Gruppe I als auch Gruppe IV schließt Pferde ein, bei denen die Klinik und Histo-

logie übereinstimmt.

Es gibt Pferde (Gruppe II) bei denen die geringen histologischen Veränderungen bisher

keine klinischen Beschwerden hervorgerufen haben.

Andersherum gibt es Fälle (Gruppe III) mit funktionellen, aber noch nicht morphologisch

fassbaren Veränderungen. Hier ist der Bronchospasmus zu nennen, der auch ohne

größere Sekretion und (noch) fehlender Muskelhypertrophie auftreten kann. Zudem gibt es

Pferde, die anscheinend klinisch erkrankt sind, jedoch auch bei mehrfach durchgeführter

endoskopischer Untersuchung keine oder nur geringe pathologische Befunde zeigen.

Diese Pferde sind dann sehr häufig Histamin-hyperreaktiv (K. Fey, Giessen).

Eine fehlerhafte Anamnese durch die subjektive Angaben der Besitzer/ Halter des Pferdes

sowie Fehler in der orientierenden klinischen Begutachtung und Untersuchung des Pferdes

sind ebenfalls nicht auszuschließen. Die klinische Begutachtung der Tiere gestaltete sich

schwierig. Da die Tiere in unterschiedlichem Maß nervös und unruhig waren, bedingt durch

unterschiedliche Faktoren, wie der Transport oder die fremde Umgebung, entsprachen die

zu überprüfenden Parameter wahrscheinlich nicht den tatsächlichen Ruhewerten.

Die Rolle der Chlamydien wird derzeit im Bezug auf viele Erkrankungen diskutiert. Von

unterschiedlichen Chlamydienarten ist eine unterschiedliche Virulenz bekannt.

Die Symptome sind sowohl beim Menschen als auch beim Tier meistens unspezifische

Grippesymptome. Aber auch schwerwiegende Erkrankungen in Form von Pneumonien,

Endokarditiden und Enzephalitiden können auftreten (Sachse and Großmann, 2002).

Mc Chesney et al. (1981) konnten Chlamydia psittaci als Auslöser für Pneumonien am

Pferd nachweisen.

74

Die latenten Infektionen verlaufen meistens asymptomatisch. Aber auch bei dieser

Infektionsform sind schwerwiegende Verläufe möglich.

Die chronisch, persistierende bakterielle Besiedlung ist vornehmlich für Streptococcus

zooepidemicus, aber auch eine Reihe weiterer Erreger bei RAO erkrankten Pferden

bekannt (Gerber, 1973, Gerber, 1994, Mc. Pherson et al., 1979).

Mit Hilfe einer Transmissionselektronenmikroskopie konnten auch beim Pferd Chlamydien-

typische Einschlusskörperchen nachgewiesen werden (Theegarten et al., 2004). Das

Vorhandensein von Elementar- und Retikularkörperchen spricht für ein Nebeneinander von

aktiver und persistierender Infektion.

Durch diese Untersuchungsmethode ist noch keine Differenzierung, um welchen Spezies

es sich handelt, möglich. Zu einer genauen Aussage verhilft die, in der vorliegenden

Studie, durchgeführte PCR. Hierbei wurde in 9 Fälle Chlamydia psittaci und in 13 Fälle

Chlamydia abortus entdeckt. Die PCR lässt keinen Zusammenhang zwischen klinischem

Bild, den histologischen Ergebnissen als auch den Ergebnissen der anderen Unter-

suchungen erkennen.

Erstmals konnten CPP und CPA in den Lungen klinisch gesunder und RAO kranker Pferde

nachgewiesen werden. Dies geschah mittels Immunhistochemie. Eine respiratorische

Chlamydieninfektion wird wahrscheinlich nur bei Tieren mit ergänzenden pathogenetischen

Faktoren (Stallhaltung, Endotoxinexposition, genetischer Hintergrund) klinisch relevant.

Grundsätzlich können als Ergebnis dieser Studie jedoch Pferde mit RAO von solchen ohne

RAO anhand des Histologie-Scores und des Zellgehaltes an Chlamydia psittaci Antigen

positiven Zellen unterschieden werden.

Die Verteilung des CP Antigen in den Lungen klinisch gesunder Pferde (Gruppe I und II)

war typisch für eine persistierende Infektion (geringer Antigen-Gehalt, wenige Einschluss-

körperchen). Die Subgruppe mit leichter Inflammation und erhöhtem CP Antigengehalt in

der Gruppe der gesunden Pferde ist als Gruppe mit präklinischer Erkrankung einzustufen.

75

Bei den Tieren mit RAO sowie histologisch schwerer Erkrankung (Gruppe IV) fanden sich

ein hoher Antigen-Gehalt und viele Einschlusskörperchen, typisch für eine akute

chlamydiale Infektion.

Obwohl keine signifikanten morphologischen Unterschiede zwischen klinisch gesunden

Pferden mit geringer Entzündung (II) und solchen mit RAO und geringem histologischen

Score (III) gefunden werden, gibt es hier aber grundlegende klinische Unterschiede. Diese

können nur funktionell, möglicherweise vor einem genetischen Hintergrund interpretiert

werden.

Ferner konnten korrespondierende pathophysiologische Aspekte (Zielzelltypen,

Freisetzung von Zytokinen, Chemokinen, MMPs) zwischen Chlamydieninfektionen auf der

einen Seite und der RAO / COPD auf der anderen aufgezeigt werden (von Fellenberg,

1987, Vernooy et al., 2004, Kol et al., 1998, Shapiro, 1999, Raulo et al., 2001a, Raulo et

al., 2001b, Nevalainen et al., 2002, Rasmussen et al., 1997, Keating 1996, Franchini et al.,

1998, Giguere et al., 2002).

Eine verminderte Aktivität der Alveolarmakrophagen zeigt sich bei der equinen RAO

(Franchini et al., 1998) ebenso, wie die typischerweise verminderte Aktivität bei Zigaret-

tenrauchern, die COPD erkrankt sind (Hodge et al. 2003).

Die präzise Rolle der Chlamydien in der Pathogenese der RAO / COPD muss weiter auf-

geklärt werden. Wegen der Ähnlichkeiten zwischen beiden Erkrankungen auch hinsichtlich

des Nachweises von CPP sollten diese verstärkt gemeinsam betrachtet werden. Die Er-

krankung beim Pferd kann als Tiermodell der humanen Form betrachtet werden.

Weiterhin ist bekannt, dass Landwirte mehr als die Gesamtbevölkerung an respiratorischen

Symptomen leiden (Radon et al., 2002). Die Staubexposition und ein erhöhter Endotoxin-

gehalt werden als Hauptfaktoren diskutiert. Als Ergebnis dieser Studie sind auch CPP und

CPA beim Pferd als mögliche Quelle zoonotischer Infektionen zu berücksichtigen.

76

6. Zusammenfassung

Untersuchungen aus der Vergangenheit wiesen auf die Verwicklung einer chlamydialen

Infektion in der humanen chronic obstructive pulmonary disease (COPD) hin. Die chronisch

obstruktive Bronchitis (RAO) des Pferdes wird als eine chronische Erkrankung der

Bronchiolen mit Ähnlichkeiten zur humanen COPD betrachtet. Es stellte sich die Frage, ob

Chlamydophila spp. in Lungenproben RAO erkrankter Pferde nachzuweisen sind.

Anhand Anamnese und klinische Untersuchung hinsichtlich einer RAO-Erkrankung wurden

45 Pferde ausgewählt. Von diesen Tieren wurden Proben der Lunge entnommen und

mittels Lichtmikroskopie, Immunhistochemie, Immunfluoreszenz, und PCR auf das Vor-

handensein typischer histologischer Veränderungen und auf Chlamydophila spp. unter-

sucht.

Entsprechend der histologischen Ergebnisse wurden die Pferde in Gruppen aufgeteilt.

Gruppe I: klinisch und histologisch gesund, Gruppe II: klinisch gesund, aber histologisch

geringe Zeichen einer RAO. Gruppe III: klinisch RAO-erkrankt, in der Histologie leicht

entzündliche Reaktionen. Gruppe IV: klinisch und histologisch RAO-erkrankt.

Die Anzahl der Antigen-positiven Zellen bei mikroskopischer Betrachtung in 3 ausgewählte

Gesichtsfelder, nach immunhistochemischer Markierung, wurde registriert.

Die Ergebnisse der Histologie, Immunhistochemie und Immunfluoreszenz entsprechen

dem zu erwartendem Ergebnis nach vorheriger klinischer Einteilung in RAO-kranke und

gesunde Tiere. Die Verteilung des CP (Chlamydia psittaci) Antigen in den Lungen klinisch

gesunder Pferde (Gruppe I und II) war typisch für eine persistierende Infektion (geringer

Antigen-Gehalt, wenige Einschlusskörperchen). Die Subgruppe mit leichter Inflammation

und erhöhtem CP Antigengehalt in der Gruppe der gesunden Pferde ist als Gruppe mit

präklinischer Erkrankung einzustufen. Bei den Tieren mit RAO sowie histologisch schwerer

Erkrankung (Gruppe IV) fanden sich ein hoher Antigen-Gehalt und viele Einschluss-

körperchen, typisch für eine akute chlamydiale Infektion.

77

Bei der Immunfluoreszenzmikroskopie konnten nach der Markierung Einschlusskörperchen

in bronchialen Epithelzellen, in Makrophagen und in Pneumozyten Typ II nachgewiesen

werden.

Die PCR dagegen lässt keinen Zusammenhang zwischen klinischem Bild, den

histologischen Ergebnissen, als auch den Ergebnissen der anderen Untersuchungen

erkennen.

Damit konnten erstmals konnten CPP und CPA in den Lungen klinisch gesunder und RAO

kranker Pferde nachgewiesen werden. Eine respiratorische Chlamydieninfektion wird

wahrscheinlich nur bei Tieren mit ergänzenden pathogenetischen Faktoren (Stallhaltung,

Endotoxinexposition, genetischer Hintergrund) klinisch relevant.

Grundsätzlich können als Ergebnis dieser Studie jedoch Pferde mit RAO von solchen ohne

RAO anhand des Histologie-Scores und des Zellgehaltes an Chlamydia psittaci Antigen

positiven Zellen unterschieden werden.

Die präzise Rolle der Chlamydien in der Pathogenese der RAO / COPD muss weiter auf-

geklärt werden. Wegen der Ähnlichkeiten zwischen beiden Erkrankungen auch hinsichtlich

des Nachweises von CPP (Chlamydophila psittaci) sollten diese verstärkt gemeinsam

betrachtet werden. Die Erkrankung beim Pferd kann als Tiermodell der humanen Form be-

trachtet werden.

Weiterhin ist bekannt, dass Landwirte mehr als die Gesamtbevölkerung an respiratorischen

Symptomen leiden (Radon et al., 2002). Die Staubexposition und ein erhöhter Endotoxin-

gehalt werden als Hauptfaktoren diskutiert. Als Ergebnis dieser Studie sind auch CPP und

CPA (Chlamydophila abortus) beim Pferd als mögliche Quelle zoonotischer Infektionen zu

berücksichtigen.

78

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Comparison of respiratory Histologie in Horses, J. Vet. Med. A. 36, 32-38

88

Woods, G.L., Walker, D.H. (1996). Detection of Infection or Infectious Agents by Use of

Cytologic and Histologic Stains, Clin Microbiol Rev 9, 382-404

World organisation for animal health (2006). (Zugriff vom14.09.2006). Avian Chlamydiosis.

http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/A_00105.htm

Zehle, H.-H., Körber, R., Gaede, W., Peter, W. (2002). (Zugriff vom 19.08.2007). Einsatz

einer kommerziellen Vakzine in Rinderbeständen mit Chlamydienproblematik, Vortrag v. 2.

Arbeitstagung des NRL für Psittakose, Jena,

http://www.dvg.net/fileadmin/Bilder/PDF_AVID_Alt/chlamydien/zehle.pdf

89

8. Anhang

8.1 Verwendete Reagenzien

Antikörper

Primärantikörper:

Chlamydia psittaci, Klon 73/200, BIOTREND Chemikalien GmbH, Köln, Deutschland

Pan Cytokeratin Plus (mAb Maus), BIOCARE MEDICAL, Walnut creek, USA

Clamydia LPS (ACI) (mAb Maus) BIOTREND Chemikalien GmbH, Köln, Deutschland

Aktin (sm-alpha) ( mAb Maus), Bio Genex, San Ramon, USA

Vimentin (mAb Maus) BIOCARE MEDICAL, Walnut creek, USA

Tubulin (alpha) ( mAb Maus) BIOTREND Chemikalien GmbH, Köln, Deutschland

CK Pan (RbA Kaninchen), Bio Genex, San Ramon, USA

Sekundärantikörper:

Alexa 488

(Ziege anti Maus; IgG 1, IgG 2b, IgG 3), Moleculare Probes Europe (NL)

Alexa 594

(Ziege anti Maus; IgG 2b, IgG 3, F(ab`)2, ), Moleculare Probes Europe (NL)

Alexa 633 (Ziege anti Maus; IgG 2a, IgG 1,), Moleculare Probes Europe (NL)

90

Oligonukleotid-Primer:

191CHOMP (5’-GCI YTI TGG GAR TGY GGI TGY GCI AC-3’)

CHOMP371 (5’-TTA GAA ICK GAA TTG ICG RTT IAY GTG IGC IGC-3’)

218PSITT (5’-GTA ATT TCI AGC CCA GCA CAA TTY GTG-3’)

CHOMP336s (5'-CCR CAA GMT TTT CTR GAY TTC AWY TTG TTR AT-3')

201CHOMP (5'-GGI GCW GMI TTC CAA TAY GCI CAR TC-3')

PNEUM268 (5'-GTA CTC CAA TGT ATG GCA CTA AAG A-3')

16SIGF (5'-CCG CGT GGA TGA GGC AT-3')

16SIGR (5'-TCA GTC CCA GTG TTG GC-3')

Sonstiges

3% gepufferte Formalinlösung, Sigma, Taufkirchen, Deutschland

Ethanolessigsäure, Sigma, Taufkirchen, Deutschland

HISTOSTAIN-BULK-KITS, ZYMED Laboratories Inc., San Francisco, USA

AEC-Chromate, ZYMED Laboratories Inc., San Francisco, USA

BigDye™ Terminator Cycle Sequencing, Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland

Ready Reaction Kit, Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland

High Pure Templete Prepation Kit, Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland

Mouse Serum, DAKO GmbH, Hamburg, Deutschland

91

Epitope Retrieval Solution, DAKO GmbH, Hamburg, Deutschland

Phospat Buffered Saline, Sigma, Taufkirchen, Deutschland

DAPI (=4’, 6 Diamidino-2-Phenylindol), Sigma, Taufkirchen, Deutschland

QIAquick Gel Extraction Kit, QUIAGEN, Hilden

Microm GmbH, Walldorf, Deutschland

Zeiss Axiophot Mikroskop, Carl Zeiss, Oberkochem, Deutschland

Kappa, Gleichen, Deutschland

Mikroskop, Olympus IX-70 Mikroskop, Olympus Europe, Hamburg, Deutschland

Diskus Software, Koenigswinter, Deutschland

SPSS Inc., Chicago, USA Version 12

Windows XP Professional, Microsoft, Redmond, USA

ABI Prism 310 Genetic Analyzer, Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland

92

8.2 Arbeitsprotokolle

8.2.1 Arbeitsprotokoll Immunhistochemie ( ABC- Methode)

1. Aufziehen der Schnitte auf beschichtete Objektträger

(Menzel Super Frost Plus®)

2. über Nacht bei 37°Celsius im Brutschrank trocknen

3. Entparaffinisieren: 50 min. Xylol

10 min. Alkohol 100 %




15 min. PBS

4. Vorbehandlung: - Citratpuffer 1:10 mit Aqua dest. ver-

dünnen

- Schnitte in verdünntem Citratpuffer einstellen

- in der Mikrowelle aufkochen lassen (Perlenbildung,

hohe Stufe ca. 2-4 min.)

- 20 min. stehen lassen

- 5 min. PBS

5. 20 min. 1,8 % H2O2 (60ml 30 % H2O2 und 940 ml PBS)

6. 5 min. Spülen in PBS

7. Umkreisen des Gewebes mit Fettstift, Objektträger in feuchte

Kammer bringen

8. 10 min. Normalserum (1-2 Trpf.) Histostain-Bulk Kits®

9. 5 min. in PBS

10. Verdünnte Primär-Antikörper: 150µl pro Schnitt, 2 Std. bei

Raumtemperatur inkubieren

11. 5 min. PBS

12. 10 min. Sekundär-Antikörper (1-2 Trpf.; biotinylierter Goat-Anti-

Mouse, Rabbit, Guinea Pig, Rat; IgG), Histostain-Bulk Kits®

93

13. 5 min. PBS

14. 10 min. Steptavidin-Peroxidase-Konjugat (1-2 Trpf.), Histostain-

Bulk Kits®

15. 5 min. PBS

16. 10 min. AEC Chromogen (Ansatz für je 10 Schnitte: 1 ml Aqua

dest.+ je ein Trpf. A+B+C): 100 µl pro Schnitt, Rest verteilen

(Handschuhe tragen, da cancerogen)

17. 6 mal spülen in PBS/Aqua dest.

18. 15 sec. MAYERS Hämalaun

19. 10 min. Aqua dest. (mehrfach spülen)

20. mit erwärmter KAISERS Glyceringelantine eindeckeln (zunächst

3-4 Trpf. Aqua dest., dann 2-3 Trpf. Glyceringelantine)

(©Theegarten and Anhenn, 2000)

94

8.2.2 Arbeitsprotokoll Immunfluoreszenz

1. Aufziehen der Schnitte auf beschichtete Objektträger

(Menzel Super Frost Plus)

2. Über Nacht bei 37° Celsius im Brutschrank trocknen

3. Entparaffinieren: 50 min. Xylol

10 min. 100 % Alkohol




4. Vorbehandlung: - Citratpuffer 1:10 mit Aqua dest. verdünnen

- Schnitte in verdünntem Citratpuffer einstellen

- in der Mikrowelle aufkochen lassen

(Perlenbildung, hohe Stufe ca. 2-4 min.)

- 20 min. stehen lassen

- 5 min. PBS

5. 15 min. spülen in PBS

6. Umkreisen des Gewebes mit Fettstift, Objektträger in feuchte

Kammer bringen

7. 1. Primärantikörper

8. 2. Primärantikörper

evtl. 3. Primärantikörper

9. 3x5 min. PBS

10. 1. Sekundärantikörper

2 . Sekundärantikörper

evtl. 3. Sekundärantikörper

11. 3x5 min. PBS

12. 30 min. DAPI bei 37° Celsius

13. Einbettung mit Vectashield oder Glyceringelantine

(©Theegarten and Anhenn, 2000)

95

8.3 Markierungsprotokolle

8.3.1 Markierungsprotokoll Immunhistochemie

MsA-Chlamydia psittaci Antikörper (Biotrend, Klon 73/0200)

Vorgehen laut Arbeitsprotokoll Immunhistochemie

Tab. A1: Markierungsprotokoll Immunhistochemie

Lfd.

Nr.

P-Ak S-Ak

1 PBS PBS

2 PBS Substrat / Chromo-

gen

3 PBS Avidin-AP + Sub-

strat

4 PBS Alles

5 NMsS 1:250 Alles

6 MsA-Chl. ps. (73/0200)

1:60

Alles

7 MsA-Ck Pan Plus 1:50 Alles

96

8.3.2 Markierungsprotokoll Immunfluoreszenz

Markiert wurden MPf 8, MPf 22 und MPf 27

Vorbehandlung mit Citratpuffer in der Mikrowelle 3 x 5’

Blocken mit NGtS 1:200 1h 37°C

Tab. A2: Markierungsprotokoll Immunfluoreszenz

Lfd. Nr. P-Ak S-Ak

1. PBS PBS

2. PBS GtAMs-IgG1-AF 488 1:400 +

GtAMs-IgG3-AF 594 1:400


GtAMs-IgG2b-AF 594 1:400

4. PBS GtAMs-IgG2a-AF 633 1:400 +

GtAMs-IgG2b-AF 488 1:400 +



GtAMs-IgG3-AF 488 1:400 +

GtARb-F(ab’)2-AF 594 1:400



GtARb-F(ab’)2-AF 594 1:400

7. Ms-IgG1-Anti-Ck Pan Plus 1:50 +

Ms-IgG3-Anti-Chl. LPS (ACI) 1:50



8. Ms-IgG1-Anti-Ck Pan Plus 1:50 +

Ms-IgG2b-Anti-Chl. psittaci (73/0200) 1:100


GtAMs-IgG2b-AF 594 1:400

9. Ms-IgG2a-Anti-sm-alpha-Actin 1:50 +

Ms-IgG2b-Anti-Chl. psittaci (73/0200) 1:100 +

Ms-IgG3-Anti-Chl. LPS (ACI) 1:50

GtAMs-IgG2a-AF 633 1:400 +



10. Ms-IgG1-Anti-Vimentin 1:50 + GtAMs-IgG1-AF 633 1:400 +

97

Ms-IgG2b-Anti-Chl. psittaci (73/0200) 1:100 +

RbA-Ck Pan 1:50


GtARb-F(ab’)2-AF 594 1:400

11. Ms-IgG1-Anti-alpha-Tubulin 1:500 +

Ms-IgG3-Anti-Chl. LPS (ACI) 1:50 +

RbA-Ck Pan 1:50



GtARb-F(ab’)2-AF 594 1:400

Alle DAPI 1:10.000vv 30’ 37°C

98

8.4 RAO-Fragebogen

MPf ..

Alter:

Geschlecht:

Rasse:

Farbe:

Klinik ja nein

Atemfrequenz >20/min

Hypertrophie des M.rectus abdominis

(Dampfrinne)

Deutlich biphasisches Expirium und

expiratorische Dyspnoe

Geblähte Nüstern

Nasenausfluss

Auskultation (Giemen, Brummen, Pfeifen)

Anhaltender od. rezidivierender

Husten > 3 Mon.

Leistungsverminderung

Verschlechterung bei Kontakt antigen-

wirksamer Substanzen

99

Bisherige Therapie

Welche?:

Haltungsbedingungen:

Tötungsgrund und Art:

Besonderheiten:

100

8.5 Tabellenanhang

Tab. A3 : Auswertung des Fragebogens

Pferd Rasse Gesch. Farbe Alt. Klinik Haltung COB-Th. Tötungsart Tötungsgrund Besonderheiten

MPf 11 Warmblut Wallach Schimmel 25 gesund Stall/Stroh keine Schlachtung Lahmheit keineMPf 2 Pony Wallach Schimmel 14 gesund Weide keine Schlachtung Lahmheit keineMPf 21 Warmblut Wallach Braun 17 gesund Stall/Stroh keine Schlachtung Tumor (Euter) keineMPf 26 Warmblut Stute Fuchs 16 gesund Stall/Stroh keine Schlachtung red. Allgemeinzustand keine

MPf 27 Warmblut Wallach Braun 14 gesund Stall/Stroh keine Schlachtung Lahmheit keineMPf 28 Warmblut Wallach dunkelbr. 9 gesund Stall/Stroh keine Schlachtung Sportuntauglich keineMPf 3 Warmblut Wallach Braun 17 gesund Stall/Stroh keine Schlachtung Verletzung keine

MPf 30 Warmblut Wallach Braun 13 gesund Stall/Stroh keine Schlachtung Lahmheit keineMPf 31 Warmblut Wallach Braun 14 gesund Stall/Stroh keine Schlachtung red. Allgemeinzustand keineMPf 32 Haflinger Wallach 11 gesund Stall/Stroh+Weide keine Schlachtung Lahmheit keine

MPf 4 Warmblut Wallach Fuchs 10 gesund Stall/Stroh+Weide keine Schlachtung Hufrehe keineMPf 12 Vollblut Wallach Braun 13 gesund Stall/Stroh keine Schlachtung Ataxie? nach Sturz keineMPf 13 Haflinger Wallach 14 gesund Stall/Stroh keine Schlachtung Lahmheit/Sportuntauglich keine

MPf 33 Warmblut Stute Braun 17 gesund Stall/Holzspäne keine Schlachtung Kolik keineMPf 10 Vollblut Wallach dunkelbr. 10 gesund Stall/Stroh keine Schlachtung red. Allgemeinzustand keine

MPf 15 Warmblut Stute Fuchs 16 gesund Stall/Stroh keine Schlachtung Rückenveränderung keineMPf 25 Warmblut Hengst dunkelbr. 14 gesund Stall/Stroh keine Schlachtung Sportuntauglich keineMPf 23 Warmblut Stute dunkelbr. 18 gesund Weide keine Schlachtung Lahmheit keineMPf 24 Warmblut Wallach dunkelbr. 19 gesund Stall/Stroh keine Schlachtung Lahmheit keine

MPf 14 Haflinger Stute 14 gesund Stall/Stroh keine Schlachtung red. Allgemeinzustand keine

MPf 17 Warmblut Stute Fuchs 15 krank Stall/Holzspäne a,c,e,f, Euthanasie red. Allgemeinzustand keine

MPf 20 Warmblut Wallach Braun 16 krank Stall/Stroh keine Schlachtung Augenverletzung keineMPf 1 Pony Stute Fuchs 13 krank Stall/Stroh keine Schlachtung Lahmheit keineMPf 16 Warmblut Wallach dunkelbr. 12 krank Stall/Stroh Ja/ Welche? Schlachtung Dyspnoe/COB keine

MPf 18 Warmblut Stute Fuchs 17 krank Stall/Stroh keine Schlachtung nicht tragend/Lahmheit keineMPf 5 Kaltblut Hengst Braun 13 krank Stall/Holzspäne a Schlachtung Lahmheit keineMPf35 Pony Stute Fuchs 20 krank Stall/Stroh e+ Welche? Schlachtung red. Allgemeinzustand keine

MPf36 Warmblut Stute Schimmel 21 krank Stall/Stroh keine Schlachtung Dyspnoe/Leistungsm. keineMPf37 Warmblut Wallach Fuchs 18 krank Stall/Stroh keine Schlachtung Infizierte Wunde keineMPf38 Warmblut Stute Braun 22 krank Stall/Holzspäne a+ Welche? Schlachtung Lahmheit keineMPf39 Warmblut Stute Fuchs 19 krank Stall/Leinstroh a,e,i, Schlachtung Dyspnoe/COB keine

MPf40 Warmblut Wallach Braun 17 krank Stall/Stroh keine Schlachtung Lahmheit keineMPf41 Warmblut Stute dkl. Braun 25 krank Stall/Stroh Ja/ Welche? Schlachtung Lahmheit keineMPf43 Warmblut Wallach Braun 14 krank Stall/Holzspäne a,i, Schlachtung red. Allg./Dyspnoe keine

MPf44 Warmblut Stute Rappe 16 krank Stall/Stroh keine Schlachtung Schulterverletzung keineMPf46 Warmblut Stute Fuchs 21 krank Stall/Stroh a,f, Schlachtung Lahmheit/Dyspnoe keineKategorie klinisch krank / histologisch krankMPf 34 Warmblut Stute Rappe 16 krank Stall/Stroh keine Schlachtung Leistungsm./Dyspnoe keineMPf 19 Warmblut Stute Braun 20 krank Stall/Holzspäne e,f,g,i, Euthanasie Leistungsm./Dyspnoe keineMPf 6 Warmblut Stute Braun 12 krank Stall/Stroh keine Schlachtung Lahmheit keine

MPf 7 Warmblut Wallach Fuchs 16 krank Stall/Stroh Ja/ Welche? Schlachtung Lahmheit keineMPf 22 Pony Stute Falbe 12 krank Stall/Holzspäne a,e,f, Schlachtung red. Allgemeinzustand keineMPf 29 Pony Stute Schimmel 21 krank Stall/Stroh keine Schlachtung Verletzung keine

MPf 8 Warmblut Stute Braun 14 krank Stall/Stroh Ja/ Welche? Schlachtung red. Allg./Dyspnoe keineMPf42 Warmblut Stute Braun 24 krank Stall/Holzspäne a+ Welche? Schlachtung Dyspnoe/COB keineMPf45 Warmblut Stute dkl. Braun 16 krank Stall/Stroh keine Schlachtung Lahmheit/ Leistungsm. keine

Therapie:a) Verbesserte Haltungsbedingungegen, b) Anticholinergika, c) Beta-2 selektive Sympathomimetika, d) indirekte Sympathomimetika,e) Glukokortikoide, f) Expektorantien/Acetylcystein, g) Antibiotika, h) Antihistaminika, i) Alternative/ Akupuntur/Homöopathie/Thymian Die Anamnese der Therapie bezieht s ich ausschliesslich auf die COB Behandlung. Andere Therapien blieben ohne Berücksichtigung.Es wurden keine Daten zur Dauer, Dosierung und letzte Medikation erhoben.

Die Einteilung in die Kategorie "Krank" erfordert die Beantwortung des Fragebogens in allen Punkten mit "ja".Dementsprechend die Einteilung in die Kategorie "Gesund", wenn alle Fragen mit "nein" beantwortet s ind.

Kategorie klinisch gesund / histologisch le icht krank

Kategorie klinisch gesund / histologisch gesund

Kategorie klinisch krank / histologisch keine COB

101

Tab. A4 : Auswertung Immunhistochemie

MPf 11 Summe % der pos. Zellen ge-samt

Gesichtsfeld: 1 2 3 Makrophag pos. 0 0 0 0 Pneumozyt pos. 0 0 0 0 Epithelzelle pos. 2 0 0 2 Zellzahl ge-samt 375 399 441 1215 0,16

MPf 2 Gesichtsfeld: 1 2 3 Makrophag pos. 0 0 0 0 Pneumozyt pos. 0 0 0 0 Epithelzelle pos. 5 6 12 23 Zellzahl ge-samt 341 557 627 1525 1,51

MPf 21 Gesichtsfeld: 1 2 3 Makrophag pos. 0 0 0 0 Pneumozyt pos. 0 0 0 0 Epithelzelle pos. 0 0 0 0 Zellzahl ge-samt 406 387 561 1354 0

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MPf 19 Gesichtsfeld 1 2 3 Makrophag pos. 0 1 0 1 Pneumozyt pos. 2 11 4 17 Epithelzelle pos. 92 70 84 246 Zellzahl ge-samt 701 487 581 1769 14,41


114



MPf 29

Gesichtsfeld: 1 2 3 Makrophag pos. 1 3 0 4 Pneumozyt pos. 12 23 28 63 Epithelzelle pos. 126 154 204 484 Zellzahl ge-samt 638 362 442 1442 38,21

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Tab. A5: RAO-Pferde Einteilung MPf Rasse Gesch. Farbe Alt. Klinik Histo-Score Sum. Kat. For. ompA Sequenzierung

1 Pony Stute Fuchs 13 krank 0 0 0 0 0 1 0 0 1 3 ja positiv Cp. abortus2 Pony Wallach Schimmel 14 gesund 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 × negativ 3 Warmblut Wallach Braun 17 gesund 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 × negativ 4 Warmblut Wallach Fuchs 10 gesund 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 × positiv Cp. abortus5 Kaltblut Hengst Braun 13 krank 0 0 0 0 0 1 0 0 1 3 × negativ 6 Warmblut Stute Braun 12 krank 2 2 3 3 3 3 3 3 22 4 × negativ7 Warmblut Wallach Fuchs 16 krank 4 3 2 2 2 4 3 2 22 4 × negativ8 Warmblut Stute Braun 14 krank 3 3 4 3 3 2 2 2 26 4 × positiv ?10 Vollblut Wallach dunkelbr. 10 gesund 0 0 0 0 1 0 0 1 2 1 ja positiv Cp. psittaci11 Warmblut Wallach Schimmel 25 gesund 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 ja negativ 12 Vollblut Wallach Braun 13 gesund 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 ja negativ 13 Haflinger Wallach 14 gesund 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 ja positiv Cp. psittaci14 Haflinger Stute 14 gesund 1 0 1 1 1 1 1 0 6 2 ja positiv Cp. abortus15 Warmblut Stute Fuchs 16 gesund 1 0 0 0 1 1 0 1 4 2 × negativ 16 Warmblut Wallach dunkelbr. 12 krank 0 0 0 0 1 0 0 0 1 3 × positiv Cp. abortus17 Warmblut Stute Fuchs 15 krank 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 × positiv Cp. abortus18 Warmblut Stute Fuchs 17 krank 1 0 0 0 0 0 0 0 1 3 × negativ 19 Warmblut Stute Braun 20 krank 1 1 3 3 2 2 3 2 17 4 × negativ20 Warmblut Wallach Braun 16 krank 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 ja positiv Cp. abortus21 Warmblut Wallach Braun 17 gesund 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 × negativ 22 Pony Stute Falbe 12 krank 4 3 2 4 2 4 2 3 24 4 ja negativ23 Warmblut Stute dunkelbr. 18 gesund 1 0 0 1 1 1 0 1 5 2 × positiv Cp. abortus24 Warmblut Wallach dunkelbr. 19 gesund 0 0 0 1 1 1 1 1 5 2 × positiv Cp. abortus25 Warmblut Hengst dunkelbr. 14 gesund 0 0 0 1 1 0 1 1 4 2 × positiv Cp. psittaci26 Warmblut Stute Fuchs 16 gesund 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 × negativ 27 Warmblut Wallach Braun 14 gesund 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 × negativ 28 Warmblut Wallach dunkelbr. 9 gesund 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 ja negativ 29 Pony Stute Schimmel 21 krank 3 1 3 4 3 3 4 4 25 4 × positiv ?30 Warmblut Wallach Braun 13 gesund 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 ja positiv Cp. psittaci31 Warmblut Wallach Braun 14 gesund 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 ja positiv Cp. psittaci32 Haflinger Wallach 11 gesund 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 × positiv Cp. abortus33 Warmblut Stute Braun 17 gesund 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 × negativ 34 Warmblut Stute Rappe 16 krank 2 1 2 2 1 1 1 2 12 4 × negativ35 Pony Stute Fuchs 20 krank 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 ja negativ 36 Warmblut Stute Schimmel 21 krank 1 1 0 2 1 0 0 0 5 3 ja positiv Cp. abortus37 Warmblut Wallach Fuchs 18 krank 0 0 0 0 3 0 0 0 3 3 ja negativ 38 Warmblut Stute Braun 22 krank 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 ja positiv Cp. abortus39 Warmblut Stute Fuchs 19 krank 1 0 0 0 0 0 0 0 1 3 ja positiv Cp. psittaci40 Warmblut Wallach Braun 17 krank 1 0 0 0 0 0 0 0 1 3 ja positiv Cp. psittaci41 Warmblut Stute dkl. Braun 25 krank 0 1 1 0 0 1 1 0 4 3 ja positiv Cp. psittaci42 Warmblut Stute Braun 24 krank 2 2 3 2 2 3 3 2 19 4 ja negativ43 Warmblut Wallach Braun 14 krank 0 0 2 0 0 0 0 0 2 3 ja positiv Cp. abortus44 Warmblut Stute Rappe 16 krank 2 0 0 1 1 0 0 0 4 3 ja positiv Cp. psittaci45 Warmblut Stute dkl. Braun 16 krank 4 4 4 3 3 4 3 4 29 4 ja negativ46 Warmblut Stute Fuchs 21 krank 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 ja positiv Cp. abortus

For.: weiteres Formalin-Material noch vorhanden

Sum.: Summe der Scores aller 8 Blöcke (rot: ergänzt, da 8. Block inadäquat)Kategorie: 1: Kategorie klinisch gesund / histologisch gesund, 2: Kategorie klinisch gesund / histologisch leicht krank3: Kategorie klinisch krank / histologisch gesund oder leicht krank (COB), 4: Kategorie klinisch krank / histologisch krank (COB)5: Kategorie klinisch krank / histologisch krank (parasitär)

MPf: Nummernvergabe nach MaterialeingangKlinik: Erhebung vom Besitzer bzw. Tierarzt nach COB-Fragebogen Dr. K. Fey (Gi)Histo-Score: je Tier 8 Blöcke der linken LungeBewertung (COB): 0: ohne, 1: minimal, 2: leicht, 3: mäßig, 4: stark ausgeprägte Entzündung

117

Tab. A6: RAO Pferde Gesamttabelle MPf. R. G. Farbe Al. K. Gr. PCR IFM Fo. H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 HS M1 M2 M3 MT P1 P2 P3 PT E1 E2 E3 ET G1 G2 G3 GT %Ges.

11 1 2 Schimmel 25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 negativ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 375 399 441 1215 0,16 ja2 5 2 Schimmel 14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 negativ 0 0 0 0 0 0 0 0 5 6 12 23 341 557 627 1525 1,51 ×21 1 2 Braun 17 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 negativ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 406 387 561 1354 0 ×26 1 1 Fuchs 16 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 negativ 1 0 0 1 0 2 0 2 8 25 16 49 554 705 339 1598 3,25 ×27 1 2 Braun 14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 negativ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 369 407 432 1208 0 neg ×28 1 2 dunkelbr. 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 negativ 0 0 0 0 0 4 0 4 9 22 0 31 629 471 599 1699 2,06 ja3 1 2 Braun 17 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 negativ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 2 321 689 541 1551 0,12 ×30 1 2 Braun 13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 C.psittaci 0 0 0 0 0 0 0 0 4 20 39 63 301 511 502 1314 4,79 ja31 1 2 Braun 14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 C.psittaci 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 387 677 509 1574 0 ja32 4 2 11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 C.abortus 0 0 0 0 0 0 0 0 32 3 0 35 386 466 681 1533 2,28 ×4 1 2 Fuchs 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 C.abortus 0 0 0 0 1 0 0 1 2 0 1 3 389 477 533 1369 0,29 ×12 2 2 Braun 13 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 negativ 0 0 0 0 0 0 0 0 11 9 4 24 672 399 722 1793 1,34 ja13 4 2 14 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 C.psittaci 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 13 13 388 607 624 1619 0,8 ja33 1 1 Braun 17 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 negativ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 3 707 620 638 1965 0,15 ×10 2 2 dunkelbr. 10 0 0 0 0 0 1 0 0 1 2 1 C.psittaci 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 4 6 687 429 555 1671 0,36 ja15 1 1 Fuchs 16 0 1 0 0 0 1 1 0 1 4 2 negativ 0 0 0 0 0 0 0 0 6 2 13 21 290 364 409 1063 1,98 ×25 1 3 dunkelbr. 14 0 0 0 0 0 1 0 1 1 4 2 C.psittaci 0 0 0 0 0 0 0 2 42 0 77 119 306 408 643 1357 8,77 ×23 1 1 dunkelbr. 18 0 1 0 0 1 1 1 0 1 5 2 C.abortus 0 0 0 0 0 0 0 0 6 2 3 11 313 407 533 1253 0,88 ×24 1 2 dunkelbr. 19 0 0 0 0 1 1 1 1 1 5 2 C.abortus 0 0 0 0 0 0 0 0 30 18 48 96 268 403 582 1253 7,66 ×14 4 1 14 0 1 0 1 1 1 1 1 0 6 2 C.abortus 0 0 0 0 0 0 0 0 0 49 27 76 487 613 466 1566 4,85 ja17 1 1 Fuchs 15 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 C.abortus 0 0 0 0 0 0 0 0 5 98 76 179 398 632 587 1617 11,07 ×20 1 2 Braun 16 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 C.abortus 0 0 0 0 0 0 0 0 83 12 18 113 701 471 437 1609 7,02 ja1 5 1 Fuchs 13 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 3 C.abortus 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 4 630 677 701 2008 0,2 ja16 1 2 dunkelbr. 12 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 3 C.abortus 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24 32 56 453 312 497 1262 4,44 ×18 1 1 Fuchs 17 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 3 negativ 0 0 0 0 0 0 0 0 48 11 25 84 457 380 313 1150 7,3 ×5 3 3 Braun 13 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 3 negativ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 4 283 618 504 1405 0,28 ×35 5 1 Fuchs 20 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 negativ 0 0 0 0 0 0 0 0 18 11 23 54 211 631 509 1351 4 ja36 1 1 Schimmel 21 1 1 1 0 2 1 0 0 0 5 3 C.abortus 0 0 0 0 0 0 0 0 37 63 48 148 327 613 556 1496 9,89 ja37 1 2 Fuchs 18 1 0 0 0 0 3 0 0 0 3 3 negativ 0 0 0 0 0 0 0 0 56 9 0 65 297 276 413 986 6,66 ja38 1 1 Braun 22 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 C.abortus 0 0 0 0 0 0 0 0 121 97 114 332 703 387 508 1598 20,78 ja39 1 1 Fuchs 19 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 3 C.psittaci 0 0 0 0 0 0 2 2 36 33 7 76 477 721 301 1499 5,2 ja40 1 2 Braun 17 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 3 C.psittaci 0 0 0 0 0 0 0 0 273 17 184 474 684 677 506 1867 25,83 ja41 1 1 dkl. Braun 25 1 0 1 1 0 0 1 1 0 4 3 C.psittaci 0 1 0 1 0 0 0 0 47 25 8 80 481 601 516 1598 5,07 ja43 1 2 Braun 14 1 0 0 2 0 0 0 0 0 2 3 C.abortus 0 0 0 0 0 0 0 0 1 51 4 56 378 802 543 1723 3,25 ja44 1 1 Rappe 16 1 2 0 0 1 1 0 0 0 4 3 C.psittaci 0 0 0 0 0 0 0 0 81 2 53 136 589 448 631 1677 8,11 ja46 1 1 Fuchs 21 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 C.abortus 0 0 0 0 0 0 0 0 8 1 74 83 709 306 484 1499 5,54 ja34 1 1 Rappe 16 1 2 1 2 2 1 1 1 2 12 4 negativ 0 0 0 0 0 3 1 4 140 201 0 341 631 662 348 1641 21,02 ×19 1 1 Braun 20 1 1 1 3 3 2 2 3 2 17 4 negativ 0 1 0 1 2 11 4 17 92 70 84 246 701 487 581 1769 14,41 ×6 1 1 Braun 12 1 2 2 3 3 3 3 3 3 22 4 negativ 1 0 0 1 14 6 5 25 186 143 206 462 547 481 553 1491 32,72 ×7 1 2 Fuchs 16 1 4 3 2 2 2 4 3 2 22 4 negativ 0 1 0 1 6 0 16 22 64 141 0 205 543 399 527 1469 15,52 ×22 5 1 Falbe 12 1 4 3 2 4 2 4 2 3 24 4 negativ 0 0 0 0 4 19 28 51 36 112 74 222 339 496 455 1280 21,33 pos ja29 5 1 Schimmel 21 1 3 1 3 4 3 3 4 4 25 4 positiv 1 3 0 4 12 23 28 63 126 154 204 484 683 362 442 1442 38,21 ×8 1 1 Braun 14 1 3 3 4 3 3 2 2 2 26 4 positiv 0 4 0 4 21 2 8 31 109 137 162 408 463 499 378 1340 33,06 pos ×42 1 1 Braun 24 1 2 2 3 2 2 3 3 2 19 4 negativ 0 0 0 0 1 0 1 2 28 29 14 71 550 387 602 1539 4,74 ja45 1 1 dkl. Braun 16 1 4 4 4 3 3 4 3 4 29 4 negativ 0 0 0 0 0 0 0 0 18 0 2 20 637 441 387 1465 2,83 ja9 1 1 Fuchs 30 1 5 5 5 5 5 5 5 5 5 C.psittaci 0 0 1 1 1 0 0 1 3 1 0 4 670 453 427 1550 1,37 ×

MPf: Nummernvergabe nach MaterialeingangRasse: 1: Warmblut, 2: Vollblut, 3: Kaltblut, 4: Haflinger, 5: PonyGeschlecht: 1: Stute, 2: Wallach, 3: HengstKlinik: Erhebung vom Besitzer bzw. Tierarzt nach COB-Fragebogen Dr. K. Fey (Gi); gesund: 0, krank: 1Histo-Score: je Tier 8 Blöcke der linken LungeBewertung: 0: ohne, 1: minimal, 2: leicht, 3: mäßig, 4: stark ausgeprägte Entzündung, 5: parasitärHS: Summe der Scores aller 8 Blöcke bei COB (rot: ergänzt, da 8. Block inadäquat)Gruppen: 1: kl. / histo. gesund, 2: kl. gesund / histo. leicht krank, 3: kl. krank / histol. gesund od. lt. krank, 4: kl. / histo. krank, 5: kl. krank / histo. parasitärPCR: PolymerasekettenreaktionImmunhistochemie: M: Makrophagen, P: Pneumozyten 2, E: Bron.Epithelzellen, G: Gesamtzellzahl, 1-3: Gesichtsfelder, T: total, %Ges.: % positive Zellen IFM: Immunfluoreszensmikroskopie (vorhanden: ja)/Makierung mit Chl. psittaci AntikörperFor.: weiteres Formalin-Material noch vorhanden

ImmunhistochemieHisto-Score

118

Tab. A7: Ergebnis klinisch gesunde Pferde vs. klinisch kranke Pferde Gruppe N Histologischer

Score: median (Spannweite)

IHC (MP): median (Spannweite)

IHC (PII): median (Spannweite)

IHC (BE): median (Spannweite)

IHC (Prozent): median (Spannweite)

PCR (Prozent): Positive Fälle

klinisch gesund ( Gruppe I + II)

20 0 (0-6)

0 (0-1)

0 (0-4)

17 (0-119)

1.08 (0-8.92)

9 (45)

klinisch krank (Gruppe III + IV)

25 3 (0-29)

0 (0-4)

0 (0-63)

113 (4-535)

7.304 (0.20-37.1)

15 (60)

Mann-Whitney-U-Test (exakte Signifikanz) *Pearson Chi Quadrat

p=0,010 p=0,079 p=0,127 p<0,001 p<0,001 *p=0,316

IHC: Immunhistochemischer Score (Anzahl der positiven Zellen in drei Gesichtsfeldern) MP: Makrophagen, PII: Pneumozyten Typ II, BE: bronchiale Epithelzellen IHC (Prozent): Anzahl aller Chlamydien-Antigen positiver Zellen bezogen auf die Gesamtzellzahl

119

Tab. A8: Ergebnis Tötungsgrund RAO im Vergleich zu anderen Tötungsgründen

N Histologischer Score: median (Spannweite)




IHC (percentage): median (Spannweite)

PCR: positive cases (Prozent)

Andere Tötungs- gründe

36 1 (0-29)

0 (0-4)

0 (0-63)

42 (0-535)

2.769 (0-37.1)

18 (50)

RAO 9 5 (0-26)

0 (0-4)

2 (0-31)

83 (56-408)

5.537 (3.23-32.8)

6 (66.7)

Mann-Whitney-U *Pearson Chi Quadrat

p=0,094 p=0,499 p=0,068 p=0,037 p=0,057 *p=0,370

IHC: Immunhistochemischer Score (Anzahl der positiven Zellen in drei Gesichtsfeldern) MP: Makrophagen, PII: Pneumozyten TypII, BE: bronchiale Epithelzellen IHC (Prozent): Anzahl aller Chlamydien-Antigen positver Zellen bezogen auf die Gesamtzellzahl

120

Tab. A9 : Vergleich der Ergebnisse nach Einteilung der Pferde in Gruppen, entsprechend der klinischen und histologischen Zeichen n Histologischer

Score median (Spannweite)




IHC (Prozent): median (Spannweite)

PCR: positive cases (Prozent)

Gruppe I 15 0 (0-2)

0 (0-1)

0 (0-4)

6 (0-63)

0.359 (0-4,79)

5 (33.3)

Gruppe II 5 5 (4-6)

0 (0-1)

0 (0-2)

76 (11-119)

4.853 (0.88-8.92)

4 (80)

Gruppe III 16 1 (0-5)

0 (0-1)

0 (0-2)

81.5 (4-474)

6.065 (0.20-25.4)

13 (81.2)

Gruppe IV 9 22 (12-29)

1 (0-4)

22 (0-63)

246 (20-535)

21.024 (1.37-37.1)

2 (22.2)

Mann-Whitney-U *Pearson Chi Quadrat

I vs.II: p<0,001 I vs.III: p=0,033 I vs.IV: p<0,001 II vs.III: p=0,003 II vs.IV: p=0,001 III vs.IV: p<0,001

I vs.II: p=0,866 I vs.III: p=0,984 I vs.IV: p=0,041 II vs.III: p=0,842 II vs.IV: p=0,112 III vs.IV: p=0,037

I vs.II: p=1,000 I vs.III: p=0,520 I vs.IV: p<0,001 II vs.III: p=0,372 II vs.IV: p=0,007 III vs.IV: p<0,001

I vs.II: p=0,033 I vs.III: p<0,001 I vs.IV: p<0,001 II vs.III: p=0,495 II vs.IV: p=0,042 III vs.IV: p=0,023

I vs.II: p=0,015 I vs.III: p<0,001 I vs.IV: p<0,001 II vs.III: p=0,548 II vs.IV: p=0,042 III vs.IV: p=0,020

*p=0,006

Gruppe I: Klinisch gesunde Pferde ohne klinische Zeichen einer RAO

Gruppe II: Klinisch gesunde Pferde mit leichten Entzündungszeichen / histologischer Score 4-6

Gruppe III: Pferde mit klinischen Zeichen einer RAO, aber ohne bedeutsame histologische Veränderungen/ histologischer Score 0-5

Gruppe IV: Pferde mit Symptomen und histologischen Veränderungen einer RAO/ histologischer Score > 10


121

Tab. A10: Korrelation zwischen histologischen Score und immunhistochemischen Ergebnis Korrellationskoeffizient (Spearman-Rho, 2-seitig)

Histologischer Score

IHC (MP) IHC (PII) IHC (BE)

IHC (MP) 0,410 p=0,005

IHC (PII) 0,459 p=0,002

0,612 p<0,001

IHC (BE) 0,493 p=0,001

0,448 p=0,002

0,495 p=0,001

IHC (percentage)

0,498 p<0,001

0,445 p=0,002

0,514 p<0,001

0,993 p<0,001


VIII. DANKSAGUNG

Herrn PD Dr. med. Dirk Theegarten möchte ich für die freundliche Überlassung des

anspruchsvollen und interessanten Themas danken, sowie für seine jederzeit offenen

Ohren, Geduld, interessanten Denkanstöße und seine große Hilfsbereitschaft.

Frau Dr. med. vet. Kerstin Fey (Medizinische und Gerichtliche Veterinärklinik der Justus-

Liebig -Universität Giessen) gilt mein Dank für die Einweisung in einfache klinische

Untersuchungsmethoden und der Unterstützung bei der Auswahl klinischer Ein- und

Auschlusskriterien.

Herrn Olaf Anhenn danke ich für die Hilfe bei der Durchführung der Immunhistochemie

und Immunfluoreszenz.

Außerdem gilt mein Dank der Medizinisch-technischen Assistentin Nellia Schatz. In

allen Fragen zur Technik der Gewebsaufbereitung stand sie mir zur Seite.

Den Mitarbeitern der Bundesforschungsanstalt für Viruserkrankungen der Tiere schulde

ich ebenfalls Dank für die Durchführung der PCR.

Weiterhin gilt mein Dank allen Tierärzten der besuchten Schlachthöfe sowie dem

Schlachthofpersonal und den Besitzern der Pferde, die mir die Möglichkeit gaben, an

Proben der erkrankten Pferde zu gelangen.

Zudem danke ich dem Tierarzt Dr. med. vet. Michael Olivier (Praxis für Pferde, Haltern),

der mir in vielen Fragen hilfreich zur Seite stand, sowie Herrn Dr. med. vet. Norbert

Schulze Schleithoff (Veterinäramt Gelsenkirchen) in die Einweisung der Sektions-

techniken am Pferd.

Bedanken möchte ich mich außerdem ganz besonders bei meinen Eltern, ebenso bei

meinen Geschwistern und Freunden, die mich immer wieder aufmunterten und in allen

Phasen unterstützt haben.

Lebenslauf Britta Mentrup Beethovenstr.18 Geburtsdatum: 11.02.1977 45777 Marl Geburtsort: Marl Tel.: 02365/940382 Familienstand: ledig Mobil.: 0172/2809624 Staatsangehörigkeit: deutsch E-Mail: Britta.Mentrup @t-online.de Schulbildung:

1983 -1987 Canisius-Schule, Marl, kath. Grundschule 1987 -1992 Gymnasium im Loekamp, Marl 1992 -1993 kath. Hauptschule an der Wiesenstraße, Marl 1993 -1996 Geschwister-Scholl- Gymnasium, Marl Die Schullaufbahn wurde mit dem Abitur abgeschlossen Berufsausbildung:

1996 -1999 Staatlich anerkannte Krankenpflegeschule der Kliniken Marl/

Westerholt GmbH. Am 16.09.1999 wurde die Ausbildung mit der staatlichen Prüfung erfolgreich abgeschlossen. Weitere Tätigkeit:

2000 - 2004 Katholische Kliniken Haltern/Marl/Westerholt GmbH.

Arbeitsverhältnis/ geringfügige Beschäftigung als Krankenschwester im Marien-Hospital Marl/ Innere Aufnahme/ Zentrale Notaufnahme.

Hochschulbildung:

10.1999 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität-Bochum.

09.2001 Ärztliche Vorprüfung 08.2002 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 08.2004 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 2004-2005 Praktisches Jahr: Urologie, Prof. Dr. med. Noldus, Marienhospital Herne Innere Medizin, Prof. Dr. med. Rump, Marienhospital Herne

: Chirurgie, PD Dr. med. Rupp, Marienhospital Herne 11.2005 Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Ärztliche Tätigkeit

Seit 01.2006 Assistenzärztin der Abteilung Anästhesie und Intensivmedizin des Marien-Hospitals Marl, Chefarzt Dr. med. Wilfried Schwarzhoff Dissertation/ Kongresse/ Publikationen

Seit 10.2002 Promotionsarbeit in der Abteilung für Pathologie der Ruhr- Universität-Bochum/ Nachweis von Chlamydophila spp. bei der equinen Recurrent Airway Obstruction (RAO) - Ähnlichkeiten zu der humanen COPD – Wissenschaftliche Betreuung durch PD Dr. Dirk Theegarten. Dienstort: Universitätsklinikum Essen Institut für Pathologie und Neuropathologie 09.2004 Proceedings fifths meeting of the Europeansociety for Chlamydia

Research/ Budapest/ Detection of chlamydophila psittaci in horses with recurrent airway obstruction. Theegarten, D., Mentrup, B.,Hotzel, H., Mogilevski, G., Sachse, K., Anhenn, O.

09.2004 Posterdiskussion bei Proceedings fifths meeting of the Europeansociety for Chlamydia Research/ Budapest/ Detection of chlamydophila psittaci in horses with recurrent airway obstruction. Anhenn, O., Mentrup, B., Hotzel, H., Mogilevski, G., Sachse, K., Theegarten, D.

09.2005 Posterdiskussion beim 3rd Workshop of COST Action 855 on Diagnosis and Pathogenesis of Animal Chlamydiosis/ Siena/ Detection of Chamydophila spp. in horses with and without recurrent

airway obstruction. Theegarten, D., Anhenn, O., Mentrup, B., Sachse, K., Hotzel, G.

10.2005 Posterdiskussion bei der 3. Arbeitstagung des nationalen veterinärmedizinischen Referenzlabors für Psittakose „Chlamydieninfektionen der Nutztiere - Diagnostik Pathogenese und zoonotische Aspekte“ / Jena / Nachweis von Chlamydophila spp. bei Pferden mit und ohne Recurrent Airway Obstruction

Theegarten, D., Anhenn, O., Mentrup, B., Fey, K., Hotzel, H., Sachse, K.

09.2006 Posterdiscussion beim European Respiratory Society Kongress. 315 Pathophysiology and treatment of infections in COPD/ München/Chlamydophila spp. infection in horses with recurrent airway obstruction shows similarities to human chronic obstructiv pulmonary disease. Theegarten, D., Mentrup, B., Fey, K., Hotzel,H.,

Sachse, K.,Anhenn, O. 10.2006 24th Symposium of the Veterinary Comparative respiratory society in cooperation with the Friedrich-Loeffler-Institut (Germany) and the Studie Group “Comparative Pathology and Pathophysiology of the Respiratory Systems” of the German Veterinary Medical Society/ Jena/ Detection of Chlamydophila psittaci an abortus in humans with chronic obstructive pulmonary disease and horses with

recurrent airway obstruktion. Anhenn, O., Hotzel, H., Mogilevski, G., Mertens, J-M., Mentrup, B., Sachse,K., Theegarten, D.

04.2007 submitted : Paper in Respiratory Research/ Chlamydophila spp.

Infection in Horses with Recurrent Airway Obstruction -Similarities to human chronic obstructive pulmonary disease - Theegarten, D., Sachse, K., Mentrup, B., Fey, K., Hotzel, H., Anhenn, O.

Unterschrift:________________________________________

Ruhr-Universität Bochum PD Dr. med. Dirk Theegarten ...€¦ · Koreferent: Prof. Dr. med. J....

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