Saccharide als Modulatoren von Leukozytenfunktionen im ...

Universitätsklinikum Ulm

Institut für Klinische Chemie

Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. Dr. Dr. h.c. A. Grünert

Saccharide als Modulatoren von Leukozytenfunktionen

im angeborenen Immunsystem

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin

der Medizinischen Fakultät

der Universität Ulm

von

Sandra Wohlhaupter

aus Nürtingen

2002

Amtierender Dekan: Prof. Dr. R. Marre

1.Berichterstatter: Prof. Dr. Dr. Dr. h.c. A. Grünert

2.Berichterstatter: PD Dr. S. Fulda

Tag der Promotion: 13.12.2002

1 EINLEITUNG 1 1.1 Functional Food....................................................................................................................................................... 1 1.2 Das gastrointestinale Immunsystem ..................................................................................................................... 1 1.3 Kohlenhydrate als Zellerkennungsmoleküle ........................................................................................................ 3 1.4 Lektine als Phagozytenrezeptoren......................................................................................................................... 4 1.5 Immunmodulation durch Kohlenhydrate .............................................................................................................. 8 1.6 Zentrale Mechanismen der Immunabwehr.......................................................................................................... 11

1.6.1 Phagozytose 11 1.6.2 Oxidativer Burst 12

1.7 Fragestellung ......................................................................................................................................................... 13

2 MATERIAL UND METHODIK 15 2.1 Geräte und Material ............................................................................................................................................... 15 2.2 Gewinnung und Behandlung von Probenmaterial ............................................................................................. 18

2.2.1 Granulozyten und Monozyten 18 2.2.2 Makrophagen 18

2.3 Versuchsdurchführung......................................................................................................................................... 20 2.3.1 Phagozytose-Test 20 2.3.2 Test für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst 23 2.3.3 Test zur quantitativen Bestimmung des oxidativen Burst 25

2.4 Auswertung der Testergebnisse.......................................................................................................................... 28 2.4.1 Parameter zur Beurteilung der Meßergebnisse 28 2.4.2 Arithmetisches Mittel und Spannweite 30 2.4.3 Beurteilung der Relevanz der Meßergebnisse 30 2.4.4 Präzision der verschiedenen Tests 31 2.4.5 Weitere Auswertungsaspekte 32

3 ERGEBNISSE 33 3.1 Adaptation der Testsysteme................................................................................................................................. 33

3.1.1 Phagozytose-Test 33 3.1.2 Test für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst 40 3.1.3 Test zur quantitativen Bestimmung des oxidativen Burst 43 3.1.4 Phagozytose-Test mit Makrophagen 47

3.2 Saccharidscreening im Phagozytose-Test.......................................................................................................... 51 3.3 Einfluß von Lipopolysaccharid auf die Phagozytose und den oxidativen Burst ............................................ 57

3.3.1 LPS-Konzentrationen verschiedener Zucker 57 3.3.2 Einfluß der Vorinkubation mit LPS auf die Phagozytose 57 3.3.3 Einfluß der LPS-Konzentration auf die Phagozytose und den oxidativen Burst 58

3.4 Stimulationstests................................................................................................................................................... 60 3.4.1 Vergleich von pyrogenfreien, LPS-versetzten und LPS-kontaminierten Sacchariden 60 3.4.2 Stimulation mit dem Echinacea-Extrakt Arabinogalaktan 63

3.5 Inhibitionstests ...................................................................................................................................................... 64 3.5.1 Inhibition von Leukozytenfunktionen mit pyrogenfreien Sacchariden 64 3.5.2 Inhibition mit dem Polysaccharid Fucoidan 66 3.5.3 Inhibition von Leukozytenfunktionen mit als immunmodulierend bekannten Sacchariden 68

4 DISKUSSION 72 4.1 Testbedingungen................................................................................................................................................... 75

4.1.1 Phagozytose-Test 75 4.1.2 Test für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst 76 4.1.3 Test zur quantitativen Bestimmung des oxidativen Burst 77 4.1.4 Phagozytose-Test mit Makrophagen 78

4.2 Auswirkung der LPS-Kontamination von Saccharidlösungen.......................................................................... 78 4.3 Stimulation von Leukozytenfunktionen mit Sacchariden.................................................................................. 79 4.4 Inhibition von Leukozytenfunktionen mit Sacchariden ..................................................................................... 82 4.5 Schlußfolgerung .................................................................................................................................................... 88

5 ZUSAMMENFASSUNG 89

6 LITERATURVERZEICHNIS 91

Abkürzungsverzeichnis

BSA bovine serum albumin, Rinderserumalbumin

C.albicans Candida albicans

CD cluster of differentiation, Nomenklatur der Leukozyten-Antigene

C3b Spaltprodukte des Komplementfaktors 3

CR Komplementrezeptor

ECD Handelsname der Fa. Coulter für ein Phycoerythrin-Texas Red -Conjugat

E.coli Escherichia coli

Mean mittlere Fluoreszenzintensität

FcγR Rezeptor für den konstanten Teil des Immunglobulin G

FITC Fluoresceinisothiocyanat

fMLP N-formyl-Met-Leu-Phe

FSC forward scatter; linear aufgetragene Vorwärtsstreuung

GPI Glycosylphosphatidylinositol

i.G. inaktive Granulozyten

i.M. inaktive Monozyten

IC Immunkomplex

IgG Immunglobulin G

KB Modulationskoeffizient des oxidativen Burst

KFcB Modulationskoeffizient des Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst

KPh Modulationskoeffizient der Gesamtphagozytose

LPS Lipopolysaccharid

p.G. phagozytierende Granulozyten

p.M. phagozytierende Monozyten

PE Phycoerythrin

PBS Phosphate buffered saline

PMA Phorbol-12-myristat-13-acetat

RB Burstrate

RFcB Rate des Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst

RPh Phagozytoserate

S.aureus Staphylococcus aureus

spp. Spezies

SSC sideward scatter; linear aufgetragene Seitwärtsstreuung

uPAR Urokinase-Typ Plasminogenaktivator Rezeptor

1 Einleitung In den letzten Jahren wurden vermehrt Lebensmittel mit gesundheitsfördernden Substan-

zen als sogenanntes „functional food“ auf den Markt gebracht. Damit kommen zu den

klassischen Vitaminen, Mineralstoffen und Spurenelementen beispielsweise Bakterienkul-

turen und spezielle Pflanzenhormone, die die Gesundheit fördern und das Risiko für be-

stimmte Krankheiten reduzieren sollen. Somit ändern sich die primären Zielsetzungen der

Ernährung zur ausreichenden Versorgung des Körpers mit wichtigen Nährstoffen. Durch

die Modulation bestimmter Zielfunktionen im Körper wie beispielsweise der Immunab-

wehr, soll die Ernährung auch zum physischen und psychischen Wohlbefinden beitragen

[12].

1.1 Functional Food Bis jetzt gibt es noch keine einheitliche Definition von „functional food“. Im Rahmen des

Functional Food Science in Europe (FUFOSE) Projektes wurde jedoch folgende von der

Europäischen Union anerkannte Arbeitsdefinition erstellt:

„Ein Nahrungsmittel darf als „funktionell“ betrachtet werden, wenn in zufriedenstellen-

dem Ausmaß gezeigt wurde, daß es über adäquate nutritive Effekte hinaus eine oder meh-

rere Zielfunktionen des Körpers in einer Art und Weise förderlich beeinflußt, die für einen

verbesserten Allgemein- und Gesundheitszustand und/oder zur Risikoreduktion von Krank-

heiten relevant sind. Functional foods müssen Nahrungsmittel bleiben. Sie müssen ihre Ef-

fekte in Mengen zeigen, die bei einer normalen Ernährung verzehrt werden können. Es

sind keine Tabletten oder Kapseln, sondern Bestandteile einer normalen Ernährung.“ [12]

1.2 Das gastrointestinale Immunsystem Die gastrointestinale Immunität unterscheidet sich in vieler Hinsicht vom systemischen

Immunsystem, um folgende spezifische Aufgaben zu gewährleisten:

• Schutz vor dem Eindringen potentieller Antigene aus dem Darmlumen

• Elimination intestinaler Pathogene

• Toleranz gegenüber oral aufgenommenen, physiologischen Nahrungsmittelbestandtei-

len und gegenüber der Darmflora

1 Einleitung 2

• Kontrolle der systemischen Immunantwort bei zahlreichen über den Gastrointestinal-

trakt aufgenommenen Antigenen, um schädigende Reaktionen des Immunsystems ge-

gen diese Stoffe zu verhindern

• Intestinale Resorptions- und Sekretionsvorgänge und vermutlich auch Mitwirkung an

der Aufrechterhaltung der Struktur der Dünndarmschleimhaut.

Wegen seiner Resorptions- und Sekretionsfunktion ist der Magen-Darm-Trakt im Gegen-

satz zur Haut nur mit einem einschichtigen Epithel ausgekleidet. Aus diesem Grund spie-

len bei der Aufrechterhaltung der Mukosabarriere weniger mechanische als biochemisch-

funktionelle Abwehrmechanismen eine entscheidende Rolle. Die antiseptische Beschich-

tung der Epitheloberfläche mit sekretorischem IgA verhindert die Aufnahme von Antige-

nen in den Organismus. Da IgA im Gegensatz zu anderen Immunglobulinen keine Aktivie-

rung des Komplementsystems hervorruft, bleibt eine phlogistische Immunreaktion aus.

Antigene, welche in der Lage sind die Mukosabarriere des Gastrointestinaltraktes zu über-

winden, stimulieren die „Immunelimination“. Sie arbeitet hauptsächlich mit IgG und mit

IgG-aktivierten Komplementfaktoren, die in Verbindung mit einer Stimulation poly-

morphkerniger Leukozyten und Makrophagen zu einer unspezifischen, funktionellen Im-

munantwort führen. Außerdem besteht sie aus einer IgG-abhängigen zellvermittelten Zyto-

toxizität durch Killerzellen, Makrophagen und T-Lymphozyten (spezifische, funktionelle

Immunabwehr) [2, 52].

Im Gastrointestinaltrakt stellen die polymorphkernigen Leukozyten und Makrophagen die

erste Abwehrfront gegen Pathogene dar, denen es gelang die antiseptisch beschichtete Mu-

kosa zu überwinden [2, 52]. Die Fähigkeit zur Diapedese ermöglicht es Neutrophilen und

Monozyten aufgrund eines Entzündungsreizes aus den Blutgefäßen ins Gewebe einzuwan-

dern (Extravasation), wo sich die Monozyten zu Makrophagen differenzieren. Unter dem

Einfluß von den als Chemoattraktoren wirkenden Zytokinen, wie beispielsweise TNF-α

und den Interleukinen IL-1, IL-6 und IL-8, wandern die phagozytierenden Zellen schnell

an den Infektionsort im Darmlumen und der gastrointestinalen Mukosa [21, 24]. Kürzlich

konnte gezeigt werden, daß polymorphkernige Granulozyten durch diese transepitheliale

Migration eine Steigerung ihrer Fähigkeit E.coli-Bakterien zu phagozytieren erlangen und

vermehrt CR3 exprimieren [19].

Neben diesen Schutzfunktionen besitzt die „Immunelimination“ jedoch auch ein hohes

Entzündungspotential. So kann die verstärkte Aktivierung von unspezifischen Abwehrme-

chanismen zu einer Gewebeschädigung führen, wie dies beispielsweise bei der Pathogene-

1 Einleitung 3

se der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen Morbus Crohn und Colitits ulcerosa

sowie bei der glutensensitiven Enteropathie der Fall ist [2, 52].

1.3 Kohlenhydrate als Zellerkennungsmoleküle Zu den wichtigsten Zellen des angeborenen Immunsystem gehören die neutrophilen poly-

morphkernige Leukozyten, Monozyten und Makrophagen. Diese körpereigenen Freßzellen

besitzen die Fähigkeit zur Phagozytose und zur intrazellulären Abtötung von Mikroorga-

nismen, welche für den Menschen lebenswichtige Funktionen darstellen [9].

Die Abtötung von in den Körper eindringenden Mikroben durch Phagozyten erfordert die

Erkennung und Anheftung der Erreger an die phagozytierenden Zellen über komplementä-

re Zelloberflächenstrukturen. Alle Zellen besitzen auf ihrer Oberfläche Kohlenhydrate in

Form von Glykoproteinen und Glykolipiden, deren Oligosaccharidseitenketten die soge-

nannte Glykokalix bilden. Trotz der seit über hundert Jahren existierenden Kenntnis vom

Vorkommen der Lektine als sogenannte Agglutinine in Pflanzenbestandteilen, stammt die

Erkenntnis, daß sie als Zellerkennungsmoleküle fungieren könnten, erst aus neuer Zeit

[55]. Nach der Definition von Kocourek und Horejsi sind Lektine eine von Antikörpern zu

unterscheidende Klasse von Proteinen, die mindestens eine Zuckerbindungsstelle besitzen

und fähig sind Kohlenhydratbestandteile spezifisch zu erkennen und reversibel zu binden,

ohne dabei die kovalente Struktur des erkannten Glykosylliganden zu verändern [29].

Hochspezifische Lektin-Kohlenhydrat-Interaktionen spielen besonders bei der Phagozytose

in Körperregionen mit niedrigen lokalen Opsoninkonzentrationen eine wichtige Rolle. Im

Vergleich zum Serum niedrige Opsoninkonzentrationen sind in den Lungen und im Nie-

renmark, sowie während Phasen mit niedrigem Komplementvorkommen, wie in der Neo-

natalperiode oder bei Patienten mit einem Komplementdefekt von C3 zu finden. Der von

Ofek und Sharon als Lektinophagozytose bezeichnete Vorgang erfordert spezifische Inter-

aktionen zwischen Lektinen und komplementären Kohlenhydraten auf der Oberfläche von

Zellen. Die Lektinophagozytose von Bakterien kann auf verschiedenen Wegen geschehen.

Entweder binden Bakterien, die auf ihrer Oberfläche Lektine tragen, an komplementäre

Kohlenhydrate auf der Zelloberfläche von Phagozyten, oder Lektine, die Bestandteile der

Zellwand von Phagozyten sind, binden an Kohlenhydrate auf der Bakterienoberfläche. Au-

ßerdem kann ein lösliches Lektin oder ein lösliches Glykoprotein eine Brücke zwischen

1 Einleitung 4

Bakterien und Phagozyten herstellen, indem es an Kohlenhydrate oder Lektine auf der

Zelloberfläche bindet [43, 55].

In den letzten Jahren wurden neue Kohlenhydratstrukturen auf Mikroorganismen entdeckt,

die bei der Zell- und Gewebsadhäsion eine Rolle spielen. Meist handelt es sich dabei um

Lektine, die an Glykokonjugatliganden auf Phagozyten binden. Tabelle 1 zeigt eine Reihe

von Sacchariden, die spezifische Liganden für die Zelloberflächenlektine verschiedener

Pathogene sind.

Tabelle 1: Zuckerspezifität von mikrobiellen Zelloberflächenlektinen [16, 42, 55]

Zuckerspezifität Mikroorganismus

Mannose Citrobacter freundii, Enterobacter spp., Escherichia coli Typ 1, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Salmonella spp., Serratia marcescens, Shigella flexnerii, Candida albicans

Galaktose Escherichia coli, Fusobacterium nucleatum

L-Fucose Vibrio cholerae, Streptomyces spp. Pseudomonas aeruginosa

N-Acetylgalactosamin Escherichia coli, Eikenella corrodens

N-Acetylglucosamin Escherichia coli Typ G

Galα1→4Gal Escherichia coli Typ P, Actinomyces naeslundii, Actinomyces vi-scosus, Bacteroides spp., Clostridia, Lactobacillus, Propionibac-terium

Galβ1→4GlcNAc Staphylococcus saprophyticus, Entamoeba histolytica

GalNAcβ1→4Gal Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Neisseria gonor-rhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas cepacia

GlcNAcβ1→3Gal Streptococcus pneumoniae

NeuAcα2→3Gal Escherichia coli K99, Escherichia coli Typ S, Bordetella bronchi-septica, Campylobacter pylori, Mycoplasma pneumoniae, Strepto-coccus sanguis, Influenzavirus

NeuAcα→6Gal Influenzavirus

Abkürzungen: Gal: Galaktose; Glc: Glucose; NAc: N-Acetyl; NeuAc: 5-N-Acetyl-Neuraminsäure

1.4 Lektine als Phagozytenrezeptoren Auf polymorphkernigen Leukozyten und Makrophagen wurden eine Reihe von Rezeptoren

charakterisiert, die Kohlenhydrate wie Lektine als Liganden binden. Diese lektinähnlichen

Rezeptoren ermöglichen es den Phagozyten Glykansequenzen als fremd zu erkennen, die

in vielen Pathogenen enthalten sind. Janeway stellte die Hypothese auf, daß das angebore-

1 Einleitung 5

ne Immunsystem zur Unterscheidung von „fremd“ und „eigen“ Lipopolysaccharide, Man-

nane, Glykane und doppelsträngige RNA durch Rezeptoren erkennt, die im Laufe der Evo-

lution selektioniert wurden. Auf diese Weise wird über eine Rezeptorbindung solcher in

pathogenen Mikroorganismen verbreiteten Bestandteile ein breitgefächertes Erkennungs-

spektrum für schädliches Fremdmaterial gewährleistet [23].

Bild 1 zeigt eine Übersicht von auf Phagozyten exprimierten Rezeptoren, die Bestandteile

von Mikroorganismen erkennen und die Phagozytose auslösen können.

CR3 (CD11b/CD18) CR4 (CD11c/CD18) Mannose-Rezeptor

LPS-Rezeptor (CD14)

Fcγ-Rezeptor

Glykan-Rezeptor Scavenger-Rezeptor

Bild 1: Phagozytenrezeptoren zur Erkennung verschiedener Bestandteile von Mi-

kroorganismen

Phagozyten exprimieren verschiedene Rezeptoren, die Bestandteile von Mikroorganismen (rot) erkennen und

die Phagozytose auslösen: Der Komplementrezeptor Typ 3 und Typ 4 (CR3 und CR4, blau) bindet das inak-

tive Komplementspaltprodukt C3bi, der LPS-Rezeptor (CD14, hellgrün) bindet bakterielle Lipopolysacchari-

de, der Glykan-Rezeptor (hellblau) bindet z.B. Lipophosphoglykan von Leishmania, der Mannose-Rezeptor

(dunkelgrün) auf Makrophagen bindet Mannose-haltige Oberflächenkohlenhydrate auf Bakterien, der Fcγ-

Rezeptor bindet Immunglobulin G und der Scavenger-Rezeptor (gelb) bindet viele Sialinsäureliganden [25].

Der zu den Lektinen gehörende Mannose-Rezeptor besitzt zwei Arten von Kohlenhydrat-

Erkennungsdomänen: acht C-Typ Lektindomänen und eine Cystein-reiche Domäne (Bild

2). Erstere bindet Oligosaccharide mit endständiger Mannose, Fucose oder N-

Acetylglucosamin, während letztere sulfatierte Glykane von Hormonen und sulfatierte

Glykosaminoglykane erkennt [32]. Die einzelnen C-Typ Lektindomänen besitzen eine

schwache Affinität für Monosaccharide. Erst durch die multivalenten Interaktionen von

1 Einleitung 6

Oligosacchariden mit mehreren Erkennungsdomänen erreicht der Rezeptor seine hohe

Bindungsaffinität [41, 60]. Er findet sich auf der Zelloberfläche von Gewebsmakrophagen,

jedoch nicht auf frisch isolierten Monozyten. Letztere exprimieren den Mannose-Rezeptor

erst nach einer in vitro Kultivierung von drei bis vier Tagen, indem sie sich zu Makropha-

gen differenzieren [14]. Die Hauptaufgabe des Rezeptors scheint, neben seiner Fähigkeit

die Endozytose von Glykoproteinen mit endständiger Mannose einzuleiten, in der Immun-

abwehr von Bakterien, Hefepilzen und Parasiten zu liegen. Er vermittelt die Bindung von

Mannose-Glykanen auf der Oberfläche von pathogenen Mikroorganismen, wie zum Bei-

spiel Candida albicans, und deren Phagozytose [8, 57].

Das mannanbindende Lektin (bzw. mannosebindende Lektin, MBL) spielt als lösliches

Serumprotein vermutlich eine wichtige Rolle bei der angeborenen Immunabwehr (Bild 2).

Zum einen wirkt es als Opsonin, indem seine Lektindomänen an Kohlenhydrate auf Mi-

kroorganismen, wie beispielsweise C.albicans und E.coli binden. Obwohl die Affinität der

einzelnen Kohlenhydraterkennungsdomänen schwach ist, kann auch hierbei durch die clu-

sterartige Bindung von repetitiven Zuckersequenzen auf der Oberfläche eines Mikroorga-

nismus eine hohe funktionelle Avidität erreicht werden. Andererseits sind seine kollagenen

Regionen Liganden des Kollektinrezeptors auf Phagozyten und aktivieren den klassischen

Komplementweg [63].

Ein weiterer lektinähnlicher Rezeptor ist der Komplementrezeptor Typ 3 (CR3, Mac-1,

CD11b/CD18) auf neutrophilen Granulozyten und Makrophagen (Bild 2). Dieses Integrin

besitzt neben der Bindungsstelle für iC3b-opsonisierte Partikel auch eine Lektin-Bindungs-

stelle für mikrobielle Polysaccharide wie lösliches Zymosan, ein Zellwandextrakt aus Sac-

charomyces cerevisiae, und β-Glucan. Letzteres ist ein Polysaccharid mit niedrigem Mole-

kulargewicht (10 kDa), das aus Zymosan isoliert wurde und hauptsächlich aus Mannose

und 5 % Glucose besteht. Der CR3 interagiert mit bestimmten Mannose-, N-Acetyl-D-

glucosamin- oder Glucose-haltigen Polysacchariden, wodurch er eine breitere Zuckerspezi-

fität besitzt als zunächst vermutet wurde. Ross und Mitarbeiter nahmen an, daß es sich bei

der Lektinbindungsstelle des CR3 um den früher von Czop und Mitarbeitern beschriebenen

β-Glucan-Rezeptor handelt [35, 62]. Der Komplementrezeptor erkennt verschiedene Sub-

stanzen von Mikroorganismen, darunter das bakterielle Lipopolysaccharid von Escherichia

coli [49], β-Glucan und Zymosan [46, 49], das Lipophosphoglycan von Leishmania und

einige Strukturen auf Hefen wie Candida albicans [15, 58].

1 Einleitung 7

A B

CY Mannose-Rezeptor

F2

Disulfidbrücke CL

Interaktion mit

Kollektin-

Komplement-Rezeptor Typ 3 (CD11b/CD18)

α cd11b

β cd18

Bild 2: Schematische Darstellung der Domänen des Mannose

zeptors (A), sowie des mannanbindenden Lektins (B) [

Abkürzungen: CY: cysteine-rich domain, F2: fibronectin-type-two-like repeats

α-integrin subunit, β: β-integrin subunit

Galektine gehören ebenfalls zur Familie der Lektine und besitzen

Erkennungsdomäne für β-Galactose-haltige Oligosaccharide. Durc

nen wird die Expression von Galektin-3 auf neutrophilen Granulo

krophagen, Eosinophilen und Mastzellen gesteigert. Galektin-3 er

der Zelloberfläche von Effektorzellen und spielt bei Interaktionen

zwischen Zellen und extrazellulärer Matrix eine Rolle [36].

Makrophagen, Monozyten und polymorphkernige Leukozyten bes

che einen LPS-Rezeptor (CD14) mit dem sie bakterielles Lipopo

standteil der Zellwand gramnegativer Bakterien (Endotoxin), erke

gibt es Hinweise darauf, daß CD14 auch für die Zellaktivierung du

rien und Mykobakterien verantwortlich ist. Dies untermauert die H

kollagene

Triplehelix

Rezeptor

Kohlenhydrat Erkennungsdomäne

- und Komplementre-

35, 63]

, CL: C-type lectin domain, α:

eine Kohlenhydrat-

h Entzündungsreaktio-

zyten, Monozyten, Ma-

kennt Glykoproteine auf

zwischen Zellen bzw.

itzen auf ihrer Oberflä-

lysaccharid, einen Be-

nnen können. Daneben

rch grampositive Bakte-

ypothese, daß dieser

1 Einleitung 8

Rezeptor eine große Anzahl verschiedener bakterieller Oberflächenmoleküle erkennen

kann und somit ein Mustererkennungsrezeptor von Zellen des angeborenen Immunsystems

ist [48]. CD14 ist ein 55 kDa GPI-verankertes Membranprotein (mCD14), das zur Signal-

transduktion mit dem Integrin CR3 in der Zellmembran interagiert (siehe Tabelle 2). Ob-

wohl von weiteren Proteinen eine LPS-Rezeptorfunktion vermutet wird, ist CD14 bisher

das einzige Protein mit vollständig definierter Struktur, das sowohl die Bindung und Auf-

nahme von LPS als auch eine Zellaktivierung bewirkt [64]. Es genügen nanomolare Kon-

zentrationen an LPS, um eine Zellaktivierung hervorzurufen [53, 70]. CD14 spielt bei der

Bakterienbindung an Phagozyten und der Internalisierung nonopsonierter Bakterien eine

Rolle [45]. Neben seiner Schlüsselrolle bei der Initiierung der angeborenen Immunabwehr

bewirkt die Erkennung von Endotoxin durch CD14 auch die Auslösung von proinflamma-

torischen Reaktionen, die bis zum septischen Schock führen können [48, 65].

Durch die Bindung von LPS an ein Serumprotein, das Lipopolysaccharid-bindende Protein

(LBP), entsteht ein LPS-LBP Komplex, der die Bindung an CD14 auf der Oberfläche von

polymorphkernigen Leukozyten [69], Monozyten und Makrophagen erleichtert. Somit

dient LBP als Opsonin für LPS-tragende Partikel (gramnegative Bakterien) und verstärkt

deren Phagozytose [65, 64].

Die Scavenger-Rezeptoren auf Makrophagen sind eine strukturell heterogene Rezeptoren-

familie und unterscheiden sich von vielen anderen Endozytose-Rezeptoren durch ihre un-

gewöhnlich breite Ligand-Bindungsspezifität. Die Klasse A Scavenger-Rezeptoren binden

beispielsweise acetylierte und oxidierte Low Density Lipoproteine (LDL), Lipopolysac-

charid, sowie grampositive und gramnegative Bakterien. Der Klasse B Scavenger-Rezeptor

CD36 ist an der Phagozytose apoptotischer Zellen beteiligt [1]. Die einzige Gemeinsamkeit

dieser Moleküle ist, daß sie, wie fast alle Proteine, polyanionisch sind. Sie sind an der Er-

kennung von konservierten Strukturen auf pathogenen Mikroorganismen und deren Endo-

zytose beteiligt [30] und spielen bei der Beseitigung und Degradation von Endotoxinen aus

dem Körper eine wichtige Rolle [47].

1.5 Immunmodulation durch Kohlenhydrate Die Adhärenz an das Wirtsgewebe ist ein Schlüsselereignis bei der mikrobiellen Kolonisa-

tion und Infektion. Dabei spielt die Bindung mikrobieller Lektine an komplementäre Gly-

kolipid- oder Glykoprotein-Rezeptoren auf der Wirtszelle eine wichtige Rolle. Die Patho-

1 Einleitung 9

genität der verschiedenen Mikroorganismen ist von der Expression spezifischer Kohlenhy-

dratstrukturen auf deren Oberfläche abhängig [27].

In jüngster Zeit wurden die immunmodulatorischen Effekte zahlreicher Kohlenhydrate und

kohlenhydrathaltiger Zellwandbestandteile neu entdeckt. Dazu gehört beispielsweise ein

lösliches, β-1,6-verzweigtes, β-1,3-verknüpftes Glucosehomopolymer aus der Zellwand

von Saccharomyces cerevisiae (PGG-Glucan), welches die Leukozytenaktivität gegen In-

fektionen erhöht. Das Polysaccharid interagiert mit humanen Neutrophilen über das Gly-

kosphingolipid Lactosylceramid. Diese Bindung aktiviert direkt nukleäre Transkriptions-

faktoren und verstärkt den durch einen sekundären Stimulus induzierten oxidativen Burst.

Somit kann das Glucan die Zellen in einen aktivierten Zustand versetzen ohne eine in-

flammatorische Zytokinproduktion hervorzurufen [67].

Auch der Einfluß von komplexen Kohlenhydraten in der Nahrung auf die bakterielle Kolo-

nisation des Gastrointestinaltraktes wurde in letzter Zeit verstärkt untersucht. So belegten

verschiedene Studien eine Modulation der Mikroflora des Darmes durch mit der Nahrung

zugeführte Saccharide. Oligofruktose und Inulin, ein natürlich vorkommendes Fruktoseoli-

gomer, hatten demnach einen stimulatorischen Effekt auf das Wachstum der für den Men-

schen gesundheitsfördernden Gattung Bifidobacterium infantis. Im Gegensatz dazu wurden

potentielle Pathogene wie Escherichia coli und Clostridium perfringens im Wachstum ge-

hemmt [68]. Die gesundheitsfördernde Wirkung von täglich mit der Nahrung zugeführter

Lactosucrose, die das Wachstums von Bifidobacterium induzierte, wurde auch bei der An-

wendung von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen nachgewiesen

[44, 61]. Diese Beobachtungen zeigen, daß spezifische Saccharide die Bindung von Mi-

kroorganismen an das Wirtsgewebe beeinflussen und eine Modulation der Aktiviät des an-

geborenen, unspezifischen Immunsystems bewirken können.

Kohlenhydrate spielen jedoch nicht nur bei den konventionellen Vorstellungen der Signal-

transduktion in Zellmembranen eine wichtige Rolle, bei denen einer Ligand-Rezeptor Bin-

dung ein transmembranäres Signal folgt, welches dann chemische Veränderungen an der

Innenseite der Membran triggert (Bild 3). Auch bei der im Rahmen der Signaltransduktion

stattfindenden lateralen Interaktion von GPI-verankerten, selektiven Rezeptoren mit trans-

membranären, unselektiven Transduktoren spielen Kohlenhydrate eine wichtige Rolle. Da-

bei erkennt ein selektiver Plasmamembran-Rezeptor mit einer ganz bestimmten Spezifität

einen Liganden, während ein zweiter unselektiver, transmembranärer Rezeptor oder ein

Protein als Transduktor für viele verschiedene Signale dient. Es wurde gezeigt, daß die

1 Einleitung 10

Leukozyten-Integrine CR3 und CR4 solche unselektiven Transduktoren für eine Reihe von

GPI-verbundenen Leukozytenrezeptoren sind (Tabelle 2).

��

Signal Signal

Konventionelle Signaltransduktion

Laterale Interaktion von GPI-Proteinen mit transmembranären Rezeptorproteinen

Ligand

Ligand

GPI-Protein

transmembranärerRezeptorRezeptor��

��

Signal Signal

Konventionelle Signaltransduktion

Laterale Interaktion von GPI-Proteinen mit transmembranären Rezeptorproteinen

Ligand

Ligand

GPI-Protein

transmembranärerRezeptorRezeptor

Bild 3: Mechanismen der transmembranären Signalleitung [45]

Tabelle 2: Laterale Interaktionen des unselektiven Transduktors CR3 auf dem

transmembranären Signalweg [45]

Selektiver Rezeptor Expression Interaktion hemmbar durch folgende Saccharide

FcγRIIIB GPI N-Acetyl-D-glucosamin, α-Methyl-D-mannosid, D-Mannose

FcγRIIIB Löslich N-Acetyl-D-glucosamin, α-/β-Methyl-D-mannosid, α-/β-Methyl-D-glucosid, Zymosan

uPAR GPI N-Acetyl-D-glucosamin, D-Mannose, α-Methyl-D-mannosid

CD14 (LPS/LBP) GPI nicht bekannt

FcγRII Trans-membranär

nicht bekannt

Abkürzungen: uPAR: urokinase-type plasminogen activator receptor; GPI: glycosyl-phosphatidylinositol

Diese neuen Erkenntnisse über Interaktionen von GPI-verankerten Proteinen mit Integri-

nen bei der Signaltransduktion in biologischen Membranen ermöglichen die gezielte Erfor-

schung und Entwicklung von Substanzen, welche an die Lektinbindungsstelle der β2-

Integrine binden und die anschließende GPI-vermittelte Protein-Integrin-Koppelung beein-

flussen. So stärken Agonisten möglicherweise die Immunabwehr gegen verschiedene Tu-

1 Einleitung 11

moren, wie es schon für β-Glucan gezeigt wurde. Antagonisten könnten dagegen die Kon-

trolle von inflammatorischen Prozessen bei Arthritis, beim septischen Schock und bei post-

ischämischen Reperfusionsschäden unterstützen [45].

1.6 Zentrale Mechanismen der Immunabwehr Wie vorangehend beschrieben spielen in der Anfangsphase einer Infektion hochspezifische

Lektin-Kohlenhydrat Interaktionen bei zwei zentralen Mechanismen der unspezifischen

Immunabwehr, nämlich bei der Phagozytose von Mikroorganismen und dem oxidativen

Burst von Leukozyten, eine wichtige Rolle.

1.6.1 Phagozytose

Unter dem Begriff Phagozytose versteht man die Aufnahme großer Partikel (>0,5 µm), wie

beispielsweise Mikroorganismen oder Zelldebris, in Zellen. Sie verläuft in mehreren Pha-

sen und beinhaltet zunächst die Erkennung und Bindung der Partikel durch spezifische Re-

zeptoren auf der Zelloberfläche der Phagozyten. Anschließend kommt es am Ort der Inge-

stion zu einer Polymerisation von Aktin und zur Internalisierung des Partikels über Aktin-

abhängige Mechanismen. Nach der Internalisierung wird das Aktin vom entstandenen

Phagosom abgespalten und das Phagosom fusioniert mit einem oder mehreren Lysosomen

zu einem Phagolysosom. Durch die Freisetzung lysosomaler Enzyme in das Phagosom

werden die Pathogene gespalten und zerstört.

Bei der Erkennung von Phagozytosepartikeln sind sowohl zelluläre als auch humorale Fak-

toren beteiligt. Zu den zellulären Rezeptoren gehören der Mannose-Rezeptor, Integrine wie

beispielsweise CD11b/CD18, der LPS-Rezeptor CD14 und Scavenger-Rezeptoren, die

Zellwandbestandteile von Bakterien erkennen. Humorale Faktoren im Serum führen über

die Opsonierung der Erreger zu einer erheblichen Steigerung der Adhärenz an spezifische

Phagozytenrezeptoren und der Ingestion von Pathogenen [1].

Zu diesen Serumopsoninen zählt das mannanbindende Lektin (MBL), das Mannosereste

auf der Oberfläche von Hefen (Candida albicans, Cryptococcus neoformans) oder Bakteri-

en (Escherichia coli, Streptokokken) bindet und vom C1q-Rezeptor erkannt wird [59, 63].

Die Opsonisierung der Erreger mit der Komplementkomponente C3b und ihrem inaktiven

Derivat C3bi erfolgt nach Aktivierung des Komplementsystems.

An den Stellen im Organismus, an denen schon einmal ein Antigenkontakt mit einem be-

stimmten Mikroorganismus stattgefunden hat, opsonieren die von Plasmazellen sezernier-

1 Einleitung 12

ten, spezifischen Antikörper den Erreger. Die Aufnahme des Partikels wird durch die Er-

kennung des konstanten Teiles der Antikörper von spezifischen Fc-Rezeptoren (FcγRII =

CD32, FcγRIII = CD16) auf der Oberfläche von phagozytierenden Zellen verstärkt [1].

1.6.2 Oxidativer Burst

Bakterien, Pilze und einige behüllte Viren können von Phagozyten auch durch die Bildung

von toxischen Produkten geschädigt werden. Dieser als oxidativer Burst bezeichnete Pro-

zeß beinhaltet die Aktivierung der NADPH-Oxidase und ist für die Abtötung von infektiö-

sen Mikroorganismen durch Neutrophile essentiell [3].

Eine Vielzahl von Stimuli wie fMLP, C5a und Immunkomplexe aktivieren die NADPH-

Oxidase durch rezeptorvermittelte Mechanismen, während PMA und langkettige, ungesät-

tigte Fettsäuren eine rezeptorunabhängige Stimulation bewirken. Durch diese Aktivierung

kommt es zur Zusammenlagerung der zytoplasmatischen und membrangebundenen Kom-

ponenten zu einem aktiven NADPH-Oxidase-Komplex auf der Zellmembran von Neu-

trophilen [9]. Das membranständige Enzym katalysiert gemäß folgender Reaktion die Um-

setzung von Sauerstoff (O2) zum Superoxidanion (●O2-):

NADPH + O2 NADPH-Oxidase NADP + H+ + ●O2-

Superoxidanion ist Ausgangssubstanz für die Bildung weiterer mikrobizider Sauerstoffme-

tabolite wie Wasserstoffperoxid (H2O2) und Hydroxylradikal (OH-). Um eine Schädigung

des körpereigenen Gewebes zu verhindern, werden während der Phagozytose zusätzlich

Enzyme gebildet, die einen kontrollierten Abbau der reaktiven Sauerstoffprodukte gewähr-

leisten [3].

Andererseits kann eine gesteigerte Sauerstoffradikalproduktion durch Neutrophile, wie

dies in entzündlichen Geweben oder bei inflammatorischen Erkrankungen vorkommt, ne-

ben der protektiven Funktion bei der Abtötung von Pathogenen auch eine Gewebszerstö-

rung verursachen [11].

1 Einleitung 13

1.7 Fragestellung Die zentrale Frage dieser Arbeit, die im Rahmen eines Drittmittelprojektes des Bundesmi-

nisteriums für Bildung und Forschung und in Kooperation mit der Südzucker AG stattfand,

war:

Eignen sich chemisch und enzymatisch synthetisierte Saccharide pflanzlichen Ursprungs

als Functional Food zur Modulation immunologischer Funktionen von humanen Leukozy-

ten?

Als experimenteller Zugang sollten Modelle zur Erforschung der Modulation wichtiger

Immunabwehrmechanismen mit Sacchariden aufgebaut werden, welche auf die besondere

immunologische Funktion des Magen-Darm-Trakts übertragbar sind. Als zelluläre Modelle

wurden polymorphkernige Granulozyten und Monozyten im periphervenösen Vollblut ge-

sunder Spender, sowie kultivierte Makrophagen als physiologisches Zellmodell für die

Mucosa-assoziierten Phagozyten eingesetzt. Diese Phagozyten sind zur Transmigration in

den Gastrointestinaltrakt befähigt und bilden eine erste Abwehrfront gegen das Eindringen

von pathogenen Erregern auf mukösen Oberflächen.

Die folgenden funktionellen Testverfahren für Phagozyten sollten etabliert werden:

• ein Phagozytosetest, mit welchem die Aufnahme von Escherichia coli, Staphylococcus

aureus und Candida albicans gemessen werden kann.

• ein Test für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst, mit welchem die durch

Immunkomplexe ausgelöste Sauerstoffradikalproduktion gemessen werden kann.

• ein Test zur quantitativen Bestimmung des oxidativen Burst, mit welchem die Escheri-

chia coli-, PMA- und fMLP-stimulierte Sauerstoffradikalproduktion und

• ein Phagozytosetest mit aus humanen Monozyten kultivierten Makrophagen, mit wel-

chem die Aufnahme von Escherichia coli und Staphylococcus aureus gemessen werden

kann.

Durch den Einsatz verschiedener Partikel im Phagozytosetest sollte die Rezeptorspezifität

der Saccharide überprüft werden.

Ziel war es, funktionelle Tests zu etablieren, die sich nicht auf die Erforschung einzelner

Rezeptoren beschränken, sondern die die komplexen Rezeptor-Ligand-Interaktionen der

Phagozyten bei der unspezifischen Immunabwehr berücksichtigen. Die Tests sollten insbe-

sondere auf die Untersuchung der Interaktionen zwischen Mikroorganismen und Phagozy-

1 Einleitung 14

ten, die über die Expression von Lektinen und komplementären Kohlenhydraten auf deren

Zelloberflächen stattfinden, ausgelegt werden.

Mit den optimierten Tests sollte ein primäres Screening der aus Zuckerrüben, stärkehalti-

gen Pflanzen und Zichorien synthetisierten Saccharide durchgeführt werden. Dieses hatte

die Erforschung der immunmodulierenden Saccharideigenschaften bzw. die Definition von

wirksamen Kohlenhydratbasisstrukturen zum Ziel. Die daraus gewonnenen Erkenntnisse

sollten langfristig als Grundlage für die gezielte Isolierung und Synthese von Functional

Food Glykanen dienen. Sie könnten zukünftig zur Stimulation bzw. Hemmung des unspe-

zifischen, angeborenen Immunsystems im Gastrointestinaltrakt eingesetzt werden.

Bei Messung einer Stimulations- oder Inhibitionswirkung einzelner Saccharide im Scree-

ning sollten artifizielle Effekte durch eine Kontamination der Zucker bei den Isolierungs-

prozessen oder der Aufbereitung der Substanzen ausgeschlossen und gegebenenfalls Stra-

tegien zur Vermeidung solcher Artefakte entwickelt werden.

Abschließend sollten die in der Literatur vorbeschriebenen immunstimulierenden bzw.

-inhibierenden Wirkungen definierter Saccharide in den funktionellen Testverfahren verifi-

ziert und mit den Effekten der auf pflanzlicher Basis synthetisierten Saccharide verglichen

werden.

2 Material und Methodik

2.1 Geräte und Material Geräte

Durchflußzyto-

metriesystem: COULTER EPICS XL,

System II Software Version 1.0

COULTER Electronics GmbH, D-47807 Krefeld

Cell-Dyn 3500 ABBOTT GmbH Diagnostika, D-65205 Wiesbaden-Delkenheim

Material

Probengefäße: S-Monovette LH, Lithium-Heparin, 7,5 ml, Art.Nr.: 01.1604,

Fa. SARSTEDT, D-51588 Nümbrecht

Testgefäße: Röhren-Tubes, 5 ml, 75 × 12 mm ∅, Art.Nr.: 55.476,

Fa.SARSTEDT, D-51588 Nümbrecht

Mikrotiterplatten 96 well, v-Form PS, Art.Nr.: 651101, Greiner GmbH

Folie für Makro-

phagenkultur:

bio Folie 25, in vitro systems & services, Osterode

Endotoxin-

Bestimmung

Freundlicherweise in Mithilfe von Dr. Steinbach, Klinische Chemie,

Universität Ulm, mit dem Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test

Test-Reagenzien: • PHAGOTEST

ORPEGEN Pharma GmbH, D-69115 Heidelberg

• BURSTTEST


• Lysing Solution, 20 ml, 10 × Stammlösung, Art.Nr.: 1679


• DNA-Färbelösung (Propidiumjodid), 20 ml, Art.Nr.: 1633


• Quenchlösung, 10 ml, Art.Nr.: 1620


• Instamed-Salze für die Waschlösung, Art.Nr.: 2014


• Fc OxyBURST Green assay reagent, 500 µl,

Art.Nr.: F-2902, Molecular Probes - MoBiTec, D-37077 Göttingen

2 Material und Methodik 16

• Nicht-opsonisierte FITC-markierte E.coli-Suspension, 1 × 10 9 Bak-

terien pro ml, ORPEGEN Pharma GmbH, D-69115 Heidelberg

• Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParti-

cles, 7 × 10 5 Bakterien pro ml, non-opsonized, fluorescein conju-

gate, 10 mg, Art.Nr.: S-2851,

Molecular Probes - MoBiTec, D-37077 Göttingen

• Human IgG - Reagent Grade, From Serum, Art.Nr.: I-2511,

SIGMA-ALDRICH CHEMIE GmbH, D-82041 Deisenhofen

• Candida albicans, FITC-markiert, non-opsonized, 2 × 10 5 Partikel

pro ml, freundlicherweise von der Fa.ORPEGEN Pharma GmbH zur

Verfügung gestellt

• seromed, INSTAMED 9,55 g/l, PBS DULBECCO;

Art.Nr.: L182-50, Biochrom KG, D-12247 Berlin

• X-VivoTM-10, Art.Nr.: 04-380 Y,

Bio Whittaker, 21793 Maryland, USA

• Cell-wash, Art.Nr.: 349524, Becton Dickinson

• Fetal Calf Serum, Art.Nr.: 210471, Boehringer Mannheim GmbH

• Ficoll-PaqueTM PLUS, Art.Nr.: 17-1440-02,

Amersham Pharmacia Biotech AB; SE-751 84, Uppsala Sweden

• CD14 Antikörper ECD, Maus IgG2, Art.Nr.: PN IM 2707, Coulter-

Immunotech

• PE labeled anti-human Macrophage Mannose-Recepto, Maus IgG1,

Art.Nr.: 35975X, Pharmingen

• Galectin-3 PE Set, Maus IgG1, Art.Nr.: 36985K, Pharmingen

Testsaccharide: • Methyl-α-D-mannosid, Art.Nr.: M6882,

• Methyl-β-D-galactosid, Art.Nr.: M0285,

• Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid, Art.Nr.: M0257,

• Lactose (β-D-Gal [1→4]-β-D-Glc), Art.Nr.: L-3750,

• (+)-Arabinogalactan, Art.Nr.: 85,136-1,

SIGMA-ALDRICH CHEMIE GmbH, D-82041 Deisenhofen

• D-Mannose-6-phosphate, Disodium Salt, Art.Nr.: 444100,

• α-1,3-α-1,6-Mannotriose, Art.Nr.: 444043,

• Chitotetraose, Art.Nr.: 220474,


• Chitopentaose, Art.Nr.: 220475,

• Chitohexaose, Art.Nr.: 220476,

• Disialyllacto-N-tetraose, Art.Nr.: 322030,

• Fucoidan Fraction 7, Fucus vesiculosus, Art.Nr.: 344800,

CALBIOCHEM-NOVABIOCHEM GmbH, D-65812 Bad Soden

• N-Acetyllactosamin (2-Acetamido-2-deoxy-4-O-β-galactose-D-

glucosid), Dextra Laboratories Ltd, UK

Die folgenden Testsaccharide wurden von der Firma Südzucker zur Verfügung gestellt

und mußten zur Wahrung der Geheimhaltung größtenteils codiert werden. Sie wurden

durch chemische bzw. enzymatische Synthese und zum Teil durch anschließende Deriva-

tisierung aus pflanzlichen Rohstoffen, wie der Zuckerrübe, stärkehaltigen Pflanzen und

Zichorien, hergestellt:

Beschreibung: Monomere Bausteine: Bezeichnung:

• Disaccharide: - Galactose, Glucose Lactose

• oxidierte Disaccharide: - Glucose, Gluconsäure BC-D-146

BC-D-185

• Trisaccharide: - Glucose, Fructose, Galactose Lactosucrose

- Glucose, Fructose, Galactose Raffinose

- Glucose, Fructose BC-O-71

- Galactose, Glucose BC-O-207

- Glucose, Sorbit, Mannit, Polyol BC-O-150

• Tetrasaccharide: - Glucose, Fructose Nystose

- Galactose, Glucose, Fructose Stachyose

- Glucose, Fructose BC-O-50

- Glucose, Sorbit, Mannit, Polyol BC-O-76

- Galactose, Glucose BC-O-191

• Pentasaccharide: - Galactose, Glucose BC-O-192

- Glucosamin-Derivat BC-O-290

• Heptasaccharide: - Glucose, Fructose BC-O-25

• Aminozucker: - Glucose, aminiertes Hexit BC-O-145

• Glucuronsäurederviat: - oxidiertes Glucose-Derivat BC-D-148

• Xylooligosaccharid-Gemisch: - Xylose BC-O-282


2.2 Gewinnung und Behandlung von Probenmaterial

2.2.1 Granulozyten und Monozyten

Heparin-antikoaguliertes Vollblut wurde durch die Punktion einer peripheren Vene des

Armes von gesunden Spendern gewonnen. Die Blutentnahme erfolgte maximal eine Stun-

den vor Testbeginn, um Veränderungen der Leukozytenfunktionen durch lange Lagerungs-

zeiten zu verhindern [13].

Es wurde ausschließlich Heparin-Vollblut verwendet, da aufgrund der Calciumkomplexie-

rung von EDTA- oder Citrat-Blut keine hohe Phagozytoseaktivität erreicht werden kann

[28, 33].

Im Anschluß an die Blutentnahme erfolgte eine Messung des Differentialblutbildes (Cell-

Dyn), um Spender mit Granulozytopenie oder Granulozytose auszuschließen. Bei allen

Blutproben befanden sich sowohl die Leukozytenzahl (4300-10800 / µl) als auch auch der

Anteil an Monozyten (0-15 %) und Neutrophilen (37-80 %) im physiologischen Wertebe-

reich.

2.2.2 Makrophagen

2.2.2.1 Makrophagenkultur

Humane Makrophagen konnten durch die Kultivierung von Monozyten aus dem periphe-

ren Blut gesunder Spender oder aus Buffy Coats gewonnen werden.

Dazu wurden die mononukleären Zellen (Monozyten und Lymphozyten) unter sterilen Be-

dingungen mit Ficoll-Paque isoliert. Anschließend konnte im Cell-Dyn 3500 die Zellzahl

bestimmt und 1x 106 Zellen pro ml Medium (X-Vivo mit 10 % FCS) suspendiert werden.

In sterilisierten Säckchen aus Spezialfolie wurden 16 ml dieser Zellsuspension ausgesät

und bei 37 °C und 5% CO2-Atmosphäre im Brutschrank für 10-14 Tage inkubiert. Nach 4-

5 Tagen mußte erneut 4-5 ml Medium zugegeben werden. Nach insgesamt 10-14 Tagen

konnten die Makrophagen durch das vorsichtige Ziehen der Folie über eine Kante abgelöst

werden.

Die abgelösten Zellen wurden in 50 ml Zellkulturröhrchen überführt und mit 1200 U/min

bei 12°C für 5 min zentrifugiert, der Überstand dekantiert und dieser Waschvorgang drei

Mal mit PBS wiederholt. Anschließend wurden die Makrophagen in gepooltem Humanse-


rum resuspendiert (ca. 1.500 Zellen/µl Serum) und eine Stunde bei Raumtemperatur rekon-

stituiert.

2.2.2.2 Viability der Phagozyten

Mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstoffes Propidiumjodid, welcher nur geschädigte Zellmem-

branen passieren kann, war eine Differenzierung von vitalen Zellen mit intakter Zellmem-

bran und geschädigten Phagozyten möglich. Dazu wurde dem Vollblut bzw. der Ma-

krophagenzellsuspension 4 µg Propidiumjodid pro ml Ansatz zugegeben und die

Suspension 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und

sofort im Anschluß erfolgte die durchflußzytometrische Analyse. Die rotfluoreszierenden

Phagozyten konnten dabei als geschädigt identifiziert werden.

2.2.2.3 Charakterisierung von Makrophagen

Auf Mikrotiterplatten wurden pro Loch ca. 200.000 Zellen der kultivierten Makrophagen-

präparation pipettiert. Die Zellen wurden drei Mal mit ca. 100 µl Cell-wash gewaschen,

mit 1200 U/min bei 12°C für 5 min zentrifugiert und der Überstand dekantiert.

Anschließend erfolgte eine Immunphänotypisierung der Makrophagen mit folgenden Anti-

körpern:

1. Kontrolle: 20 µl Isotypkontrolle PE-markiert + 7 ml CD14-Rezeptor-Antikörper ECD-

markiert

2. Probe: 20 µl Mannoserezeptor-Antikörper PE-markiert + 7 ml CD14-Rezeptor-

Antikörper ECD-markiert

mit je 60 µl Cell-wash.

Die Antikörper inkubierten für 20 min bei 12°C im Kühlschrank. Anschließend wurden sie

zwei Mal mit je 100 µl Cell-wash gewaschen und nach obengenanntem Schema zentrifu-

giert. Nach Resuspension der Zellen in 400 µl PBS erfolgte die durchflußzytometrische

Analyse. Anhand der Expression des LPS-Rezeptors CD14 auf Monzyten und Makropha-

gen konnten diese von den CD14 negativen Lymphozyten abgegrenzt werden. Die Expres-

sion des Mannoserezeptors erlaubte die Differenzierung zwischen Makrophagen und Mo-

nozyten (siehe Bild 18 und Bild 19 in Kapitel 3.1.4.2).


2.3 Versuchsdurchführung

2.3.1 Phagozytose-Test

Testprinzip:

Der auf dem etablierten Phagotest basierende Test diente der quantitativen Bestimmung

der Phagozytoseaktivität von Monozyten und Granulozyten in heparinisiertem Vollblut.

Der Test konnte mit nicht opsonierten E.coli-Bakterien durchgeführt werden. Außerdem

wurden Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-markierte Escherichia coli-Bakterien mit gepool-

tem Serum opsoniert, wodurch eine effektivere Bindung an die Komplementrezeptoren

(C3b-Rezeptoren) und die Rezeptoren für den konstanten Teil des Immunglobulin-

Moleküls (Fc-Rezeptoren) der Monozyten und Granulozyten erreicht wurde.

Eine Differenzierung des Beitrages der verschiedenen Rezeptoren an der Phagozytose soll-

te durch eine Erweiterung des Tests mit einem grampositiven Bakterium (opsonierter bzw.

nicht opsonierter Staphylococcus aureus) und einem Sproßpilz (nicht opsonierter Candida

albicans) erreicht werden.

Nach der Inkubation der Bakterien mit den Phagozyten wurde die Fluoreszenz der nicht in

die Zelle aufgenommenen, Membran-adhärenten Bakterien durch die Zugabe einer

Quenchlösung unterdrückt. So war gewährleistet, daß in der durchflußzytometrischen Ana-

lyse ausschließlich die Grünfluoreszenz der phagozytierten Bakterien gemessen wurde.

Opsonisierung von Staphylococcus aureus:

Ein Teil der rekonstituierten S.aureus-Lösung wurde mit einem Teil der Lösung des huma-

nen IgG eine Stunde bei 37,0 °C im Wasserbad inkubiert und anschließend drei Mal mit

PBS gewaschen.

Testablauf:

Stimulationstest:

Bei diesem Test wird vor dem gewöhnlichen Testablauf eine Vorinkubation der Phagozy-

ten mit den Sacchariden vorangestellt.

Dazu werden die Blutproben 10 min im Eiswasserbad inkubiert, um sie auf 0°C abzuküh-

len. Anschließend werden die Saccharide hinzugegeben und die Proben 60 min bei 37,0°C

im vorgewärmten Wasserbad inkubiert.


Inhibitionstest:

Eine Vorinkubation ist bei der Durchführung des Inhibitionstests nicht notwendig. Die Zu-

gabe der Saccharide erfolgt während der zehnminütigen Vorkühlung der Blutproben im

Eiswasserbad.

Vorkühlung: Pro Ansatz werden 100 µl heparinisiertes Vollblut in ein 5 ml-

Teströhrchen pipettiert.

Alle Blutproben sollten ca. 10 min im Eiswasserbad auf 0°C ab-

kühlen; ebenso die Bakterien und die Quenchlösung.

Aktivierung: Nach guter Mischung der vorgekühlten Bakterien bzw. der Hefe

werden die E.coli-, S.aureus-Bakterien bzw. C.albicans zur Blut-

probe gegeben.

Inkubation: Die Röhrchen mit den Testansätzen werden 5-10 min bei 37,0 °C

im Wasserbad inkubiert, während die Röhrchen mit den Kontroll-

ansätzen auf Eis stehen bleiben.

Abstoppen der Phago-

zytose:

Exakt zum Inkubationszeitende werden alle Blutproben gleichzei-

tig auf Eis gestellt.

Quenchen: Je Ansatz pipetiert man 100 µl (bei Makrophagen 200 µl) eiskalte

Quenchlösung dazu.

Zweimalige Wäsche: Nach dem Mischen jeder Blutprobe mit 3 ml Waschlösung werden

alle Röhrchen 5 min bei 250 × g und 4°C zentrifugiert. Der Über-

stand wird dekantiert und der Waschvorgang in gleicher Weise

wiederholt.

Lyse und Fixierung: Durch die Zugabe von je 2 ml Lysing Solution werden die Voll-

blutproben 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden

sie 5 min mit 250 × g bei 4°C zentrifugiert; der Überstand wird

dekantiert.

Erneute Wäsche: Alle Proben werden mit 3 ml Waschlösung gewaschen, wiederum

zentrifugiert (5 min, 250 × g, 4°C) und der Überstand dekantiert.

DNA-Färbung: Abschließend wird je Ansatz 200 µl DNA-Färbelösung zugegeben

und die Proben werden 10 min im lichtgeschützten Eiswasserbad

inkubiert. Die durchflußzytometrische Analyse sollte innerhalb

von 60 min stattfinden.


Durchflußzytometrische Analyse:

Die Zellen werden im Durchflußzytometer (COULTER EPICS XL) analylsiert.

Messung:

Der Ausschluß von Bakterienaggregaten geschieht mit Hilfe der DNA-Färbelösung. Diese

enthält Propidiumjodid zur Anfärbung von DNA. Nach Anregung mit dem Argonlaser

zeigt sie eine Emission bei 617 nm. Auf diese Weise kann während der Datenaufnahme im

Histogramm der Rotfluoreszenz ein „Auswertungs-Gate“ auf die Ereignisse gesetzt wer-

den, die mindestens den DNA-Gehalt einer humanen diploiden Zelle besitzen (Bild 4). Da-

durch werden Bakterienaggregate, welche ähnliche Streulichteigenschaften wie Leukozy-

ten besitzen und demzufolge das Ergebnis verfälschen könnten, von der Auswertung

ausgeschlossen.

Leukozyten

Bakterien

Gate

Bild 4: Histog fluoreszenz zur Differenzierung zwischen Bakterienag-

gregat

Je Testansatz w

Der Photomulti

wärtsstreulicht (

logarithmischem

Auswertung:

Im Streulichtdia

das heißt die M

(siehe Bild 7 Ka

ramm der Rot

en und Leukozyten

erden 15.000-20.000 Leukozyten aufgenommen.

plyer (PMT) wird im Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter, FSC) und Seit-

Sideward Scatter, SSC) in linearem Modus und in Fluoreszenz 1 bis 3 in

Modus eingestellt.

gramm (FSC gegen SSC) wird die entsprechende Leukozytenpopulation,

onozyten und die Granulozyten, durch das Setzen eines „Gate“ eingegrenzt

pitel 3.1.1.1).


Anschließend können im Histogramm der Grünfluoreszenz anhand der FITC-markierten

Bakterien (Emission von FITC bei 520nm) folgende Parameter bestimmt werden:

1. Der prozentualen Anteil der Zellen, die FITC-markierte Bakterien phagozytiert haben

an der Gesamtzahl der Zellen (Phagozytoserate).

2. Die mittlere Fluoreszenzintesität pro Einzelzelle (= Mean), die zur Anzahl an aufge-

nommenen Bakterien pro einzelnem Phagozyt proportional ist (Bild 5).

67,6 % p.G.1,6 % p.M.

67,6 %

Phagozytierende

Granulozyten

1,6 %

Phagozytierende

Monozyten

0,9 %

Inaktive

Monozyten

29,9 %

Inaktive

Granulozyten 0,9 % i.M. 29,9 % i.G.

Bild 5: Histogramm der Grünfluoreszenz zur Messung der Phagozytoserate und der

mittleren Fluoreszenzintensität von Monozyten und Granulozyten

2.3.2 Test für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst

Testprinzip:

Das Reagenz besteht aus kovalent an BSA gebundenem Dichlorodihydrofluorescein

(H2DCF), das mit gereinigten, polyklonalen anti-BSA IgG Hasen-Antikörpern einen Im-

munkomplex bildet. Dies ermöglicht die Messung der Fc-Rezeptor-vermittelten Internali-

sierung und des anschließenden oxidativen Bursts bei neutrophilen Granulozyten.

Die Immunkomplexe binden an die Fc-Rezeptoren der Neutrophilen und werden direkt in

die Phagovakuolen internalisiert. Sie stimulieren die Produktion von reaktiven Sauerstoff-

metaboliten durch die membrangebundenen NADPH-Oxidase Enzyme und deren Freiset-

zung in die Vakuolen und den extrazellulären Raum. Durch diese Metaboliten wird das

nichtfluoreszierende H2DCF-Molekül zu dem grünfluoreszierenden Dichlorofluorescein


(DCF) oxidiert. Die Fluoreszenz ist nach den ersten 30 Sekunden linear vom Ausmaß der

Oxidation abhängig [50].

In geringem Umfang findet auch bei 0°C eine Rezeptorbindung des Immunkomplexes

statt, doch die Phagozytose und der anschließende oxidative Burst ist bei dieser Tempera-

tur blockiert.

Testablauf:

Anstelle der aus Citrat-Blut separierten Leukozyten wurde der Einsatz von heparinisiertem

Vollblut etabliert und der Testablauf analog dem Phagozytose-Test auf die Untersuchung

der potentiell aktivierenden bzw. inhibierenden Wirkung von Sacchariden adaptiert.

Eine maximale Aktivierung des oxidativen Burst wird bei einer IC-Konzentration von 360

µg/ml erreicht. Im Test wählten wir eine IC-Konzentration von 150 µg IC/ml zu 5,0 × 106

Zellen/ml. Diese Konzentration entsteht, wenn man bei der Blutprobe eines gesunden Pro-

banden von durchschnittlich 5000 Leukozyten pro µl Vollblut ausgeht und 10 µl einer 1:2

mit PBS verdünnten IC-Stammlösung (3mg/ml) je 100 µl Heparin-Blut ansetzt. Die IC-

Konzentration entspricht genau der Hälfte der Konzentration, die beim oxidativen Burst

von polymorphkernigen Leukozyten ein halbmaximales Fluoreszenzsignal (120 µg IC/ml

pro 2,0 × 106 Zellen/ml) auslöst.

Versuchsvorbereitung: Für jeden Test werden folgende Kontroll- und Testansätze benötigt

Kontrollansatz ohne IC-Aktivierung - Inkubation bei 37°C •

•

•

Testansätze mit IC-Aktivierung - Inkubation bei 37°C und

dazugehörige Kontrollansätze mit IC-Aktivierung - Inkubation bei 0°C

Aliquotieren Je Ansatz werden 100 µl heparinisiertes Vollblut, das zuvor gut

gemischt wurde, in ein 5 ml Teströhrchen gegeben.

Vorkühlung Die Blutproben und die IC-Suspension werden 10 min auf Eis ge-

stellt, um sie auf 0°C abzukühlen.

Inkubation Zu jedem Ansatz werden 10 µl der 1:2 verdünnten IC-Suspension

zugegeben. Die Testansätze und ein zusätzlicher Kontrollansatz

ohne IC werden 5 min im Wasserbad bei 37,0°C inkubiert, wäh-

rend die weiteren Kontrollansätze auf Eis stehen bleiben.


Abstoppen der Phago-

zytose:

Exakt zum Ende der Inkubationszeit werden gleichzeitig alle Blut-

proben aus dem Wasserbad genommen und ebenfalls auf Eis ge-

stellt.

Lyse und Fixierung: Den im Eiswasserbad stehenden Vollblutproben werden je 2 ml

Lysing Solution zugegeben und für 20 min bei Raumtemperatur

inkubiert. Anschließend werden sie 5 min mit 250 × g bei 4°C zen-

trifugiert; der Überstand wird dekantiert.

Einmalige Wäsche: Alle Proben werden mit 3 ml Waschlösung gewaschen, wiederum

zentrifugiert (5 min, 250 × g, 4°C) und der Überstand dekantiert.

DNA-Färbung: Die Proben werden mit 200 µl DNA-Färbelösung pro Ansatz 10

min im lichtgeschützten Eiswasserbad inkubiert und innerhalb von

60 min durchflußzytometrisch gemessen.


Die Messung erfolgt wie im Phagozytosetest beschrieben (siehe Kapitel 2.3.1.).

Auswertung:

Die Leukozytenpopulation wird im Streulichtdiagramm durch das Setzen eines „Gate“ e

gegrenzt (siehe Bild 7 Kapitel 3.1.1.1).

in-

Anschließend können im Histogramm der Grünfluoreszenz (siehe Bild 13 Kapitel 3.1.2.1)

anhand des fluoreszierenden Reagenz (Emission von Dichlorofluorescein bei ca. 520 nm)

folgende Werte ermittelt werden:

1. Die FcBurstrate, die dem prozentualen Anteil der Zellen die Immunkomplexe phagozy-

tiert haben, an der Gesamtzahl aller Zellen entspricht.

2. Die mittlere Fluoreszenzintensität pro Einzelzelle (= Mean), die zur Menge an durch

reaktive Sauerstoffmetabolite zu grünfluoreszierendem Dichlorofluorescein oxidierten

Immunkomplexen pro einzelnem Leukozyt proportional ist.

2.3.3 Test zur quantitativen Bestimmung des oxidativen Burst

Testprinzip:

Dieser Test wurde auf der Basis des Bursttests an die Untersuchung des immunmodulie-

renden Effektes der Saccharide beim oxidativen Burst von polymorphkernigen Leukozyten

adaptiert.

Der Test ermöglicht die quantitative Bestimmung der durch verschiedene Stimuli ausgelö-


sten Freisetzung reaktiver Sauerstoffmetabolite, des sogenannten oxidativen Burst, von

polymorphkernigen Granulozyten in heparinisiertem Vollblut.

Mit Hilfe einer Waschlösungs-Kontrolle wird der spontane oxidative Burst der Leukozyten

gemessen. Nichtmarkierte opsonisierte E.coli-Bakterien dienen als partikulärer Stimulus,

während Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA; ein Proteinkinase C Aktivator) als “high

stimulus” und N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP; ein chemotaktisches Pep-

tid) als physiologischer “low stimulus” dient.

Nach Stimulation der Leukozyten kommt es zur Aktivierung des membranständigen

NADPH-Oxidase-Komplexes und folglich zur Produktion von reaktiven S

boliten (Wasserstoffperoxid, Superoxid-Anion und Hydroxyl-Radikal). Letztere oxidier

das nicht fluoreszierende Substrat Dihydrorhodamin (DHR) 123 zu dem grünfluoreszie-

renden Produkt Rhodamin 123.

auerstoffmeta-

en

Testablauf:

Vor Versuchsbeginn wird die Substratlösung durch eine 30-45minütige Auflösung der

Substratscheibe in 1 ml Waschlösung hergestellt. Die fMLP- und PMA-Gebrauchslö-

sungen werden durch 1:200 Verdünnung der Stammlösungen mit Waschlösung in einem

zuvor errechneten Verbrauchsvolumen angesetzt.

Analog zu den beiden vorangehenden Testsystemen kann auch dieser Test als Stimulati-

ons- oder Inhibitionstest durchgeführt werden.

Vorkühlung: Die aliquotierten Blutproben, die E.coli-Bakterien, die fMLP- und

PMA-Gebrauchslösungen werden 10 min im Eiswasserbad auf 0°C

abgekühlt.

Aktivierung: Die Testansätze werden durch die Zugabe von 10 µl gut gemischter

E.coli-Bakterien pro Blutprobe hergestellt.

Außerdem werden folgende Kontrollansätze benötigt:

Negativkontrolle: ein Röhrchen mit 10 µl Waschlösung

„Low Control”: ein Röhrchen mit 10 µl fMLP-Gebrauchslösung

“High Control”: ein Röhrchen mit 10 µl PMA-Gebrauchslösung

Erste Inkubation: Alle Test- und Kontrollansätze werden 10 min bei 37,0°C im Was-

serbad temperiert.

Exakt zum Ende der Temperierzeit werden alle Blutproben gleich-

zeitig aus dem Wasserbad genommen und auf Eis gestellt.


Oxidation: Es folgt die Zugabe von 20 µl Substratlösung je Probe mit anschlie-

ßender guter Mischung der Ansätze.

Zweite Inkubation: Die Test- und Kontrollansätze werden ein weiteres Mal über 10 min

bei 37°C im Wasserbad temperiert.

Wiederum genau zum Ende der Temperierzeit werden alle Ansätze

gleichzeitig aus dem Wasserbad genommen und auf Eis gestellt.

Lyse und Fixierung: Zu allen Proben werden 2 ml Lysing-Solution gegeben. Sie werden

nach Mischen 20 min bei Raumtemperatur inkubiert.

Anschließend erfolgt eine Zentrifugation von 5 min mit 250 × g bei

4°C. Der Überstand wird dekantiert.

Waschen: Die Proben werden durch die Zugabe von 3 ml Waschlösung und

anschließender Zentrifugation (5 min, 250 × g, 4°C) gewaschen. Der

Überstand wird dekantiert.

DNA-Färbung: Alle Ansätze werden mit 200 µl DNA-Färbelösung 10 min im licht-

geschützten Eiswasserbad inkubiert und innerhalb von 30 min durch-

flußzytometrisch analysiert.


Die Messung erfolgt analog zum Phagozytose-Test (siehe Kapitel 2.3.1.).

Auswertung:

Die Leukozytenpopulation wird im Streulichtdiagramm durch das Setzen eines „Gate“ e

gegrenzt (siehe Bild 7 Kapitel 3.1.1.1).

in-

Im Histogramm der Grünfluoreszenz können aus der Oxidation von Dihydrorhodamin 123

zu fluoreszierendem Rhodamin 123 (Emission von Rhodamin 123 bei ca. 530 nm) durch

reaktive Sauerstoffmetaboliten, folgende Kenngrößen ermittelt werden:

1. Die Burstrate, die dem prozentualen Anteil der Zellen, die Sauerstoffmetabolite produ-

ziert haben entspricht.

2. Die mittlere Fluoreszenzintensität pro Einzelzelle (= Mean), die zur Menge an zu Rho-

damin 123 umgesetztem Substrat, also zur Menge an Oxidationsprodukten pro einzel-

nem Leukozyt, proportional ist (siehe Bild 16 in Kapitel 3.1.3.1).


2.4 Auswertung der Testergebnisse

2.4.1 Parameter zur Beurteilung der Meßergebnisse

Die Beurteilung der Versuchsergebnisse erfolgte mit folgenden Parametern:

1. Phagozytoserate (RPh)

2. FcBurstrate (RFcB)

3. Burstrate (RB)

4. Mittlere Fluoreszenzintenstiät (Mean)

5. Modulationskoeffizienten (KPh, KFcB, KB)

Zu 1.: Die Phagozytoserate (RPh) entspricht dem prozentualen Anteil aktiv phagozytie-

render Leukozyten ( ) an der Gesamtzahl aktiver und inaktiver Leukozyten ( iZ ) der

Testansätze:

taZ t

%100×+

=tt

tPh

iZaZaZ

R [%]

Zu 2.: Die FcBurstrate (RFcB) entspricht dem prozentualen Anteil der, nach Fc-Rezeptor

vermittelter Aufnahme von Immunkomplexen, aktiv Sauerstoffradikale produzierenden

Leukozyten ( ) an der Gesamtzahl von aktiven und inaktiven Leukozyten ( ) der

Testansätze:

taZ tiZ

%100×+

=tt

tFcB

iZaZaZ

R [%]

Zu 3.: Die Burstrate (RB) entspricht dem prozentualen Anteil aktiv Sauerstoffradikale

produzierender Leukozyten ( ) an der Gesamtzahl von aktiven und inaktiven Leukozy-

ten ( ) der Testansätze:

taZ

tiZ

%100×+

=tt

tB

iZaZaZ

R [%]

Zu 4.: Die mittlere Fluoreszenzintensität (Mean) pro Einzelzelle wird in der System IITM

Software des EPICS XL ermittelt und entspricht


• im Phagozytose-Test der Anzahl an aufgenommenen Partikeln pro einzelnem Leukozy-

ten,

• im Test für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst der Menge an reaktiven

Sauerstoffmetaboliten, welche die Immunkomplexe zu grünfluorezierendem Dichloro-

fluorescein oxidieren, pro einzelnem Leukozyten, und

• im Test für den E.coli-stimulierten oxidativen Burst der Menge an fluoreszierendem

Rhodamin 123, also der Sauerstoffradikalproduktion, pro einzelnem Leukozyten.

Zu 5.: Der Modulationskoeffizient der Gesamtphagozytose (KPh) entspricht dem relati-

ven Anteil des Produkts der Phagozytoserate ( ) und der mittleren Fluoreszenzintensität

( ) des Testansatzes (mit Sacchariden bzw. LPS) an dem Produkt der Phagozytoserate

( ) und der mittleren Fluoreszenzintensität ( ) der Kontrollansätze (ohne Saccharide

bzw. LPS):

PhtR

0F

tF

R0Ph

00 FF

RR

K tPh

PhtPh ×=

Der Modulationskoeffizient des Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst (KFcB) ent-

spricht dem relativen Anteil des Produkts der FcBurstrate ( ) und der mittleren Fluo-

reszenzintensität des Testansatzes (mit Sacchariden bzw. LPS) an dem Produkt der FcBur-

strate ( ) und der mittleren Fluoreszenzintensität der Kontrollansätze (ohne Saccharide

bzw. LPS):

FcBtR

FcBR0

FcB

FcBtFcB

RR

K0

=0F

Ft×

Der Modulationskoeffizient des oxidativen Burst (KB) entspricht dem relativen Anteil

der mittleren Fluoreszenzintensität ( ) von mit Sacchariden bzw. Lipopolysacchariden

vorinkubierten Leukozyten des Testansatzes an der mittleren Fluoreszenzintensität ( )

ohne Saccharide bzw. LPS vorinkubierter Leukozyten der Kontrollansätze:

tF

0F

0FF

K tB =

Wenn keine Modulation der Phagozytose oder des oxidativen Burst von Leukozyten durch

die Saccharide oder LPS stattfindet beträgt der Modulationskoeffizient K = 1. Bei Stimula-


tion der Phagozytose oder des oxidativen Burst von Leukozyten durch die Saccharide oder

LPS wird der Modulationskoeffizient K > 1, während bei Inhibition dieser Leukozyten-

funktionen K < 1 wird.

2.4.2 Arithmetisches Mittel und Spannweite

Alle Versuche wurden mit zwei Ansätzen pro Meßpunkt durchgeführt. Aus diesen zwei

Meßwerten wurde das Arithmetische Mittel errechnet.

Als Streumaß dieser Doppelwerte um das Arithmetische Mittel wurde die Spannweite als

die Differenz zwischen dem größeren und kleineren Meßwert angegeben (Bild 6):

Phag

ozyt

oser

eate

Spannweite ωArithmetisches Mittel

Maximum

Minimum

Phag

ozyt

oser

eate

Spannweite ωArithmetisches Mittel

Maximum

Minimum

Bild 6: Arithmetisches Mittel und Spannweite ω

Aus den jeweils doppelt bestimmten Meßwerten mit und ohne Saccharide lassen sich vier

Werte für den Modulationskoeffizient wie oben erklärt errechnen. Die Spannweite des

Modulationskoeffizienten ergibt sich aus der Differenz zwischen dem größten und dem

kleinsten ermittelten Modulationskoeffizienten:

SaccharidohneMaximumSaccharidmitMinimum

SaccharidohneMinimumSaccharidmitMaximumSpannweite −=ω

2.4.3 Beurteilung der Relevanz der Meßergebnisse

Anhand der Untersuchungsergebnisse zur Testpräzision kann innerhalb der Modulations-

koeffizienten von 0,8 < KPh, KFcB, KB < 1,2 von einer normalen Teststreuung und ab KPh,

KFcB, KB ≤ 0,8 oder KPh, KFcB, KB ≥ 1,2 von einem sicher erfaßbaren Inhibitions- bzw.

Stimulationseffekt auf die Phagozytose, den Fc-Rezeptor- und E.coli-vermittelten oxidati-

ven Burst von Leukozyten ausgegangen werden.

Die Beurteilung der biologischen Relevanz der Meßergebnisse ist aufgrund mangelnder

Erfahrungswerte eine Ermessensfrage. Wir setzten deshalb in Übereinkunft mit unseren


Projektpartnern fest, daß eine biologisch relevante Modulation der Phagozytenfunktionen

durch Functional Food Saccharide erst bei einer Inhibition des KPh, KFcB, KB ≤ 0,6 bzw.

einer Stimulation des KPh, KFcB, KB ≥ 1,4 stattfinden kann. Die Effekte solcher Substanzen

müssen in weiteren Tests, unter Umständen auch tierexperimentell, genauer untersucht

werden.

2.4.4 Präzision der verschiedenen Tests

Zur Beurteilung der Präzision der Testdurchführung und Messung der einzelnen Tests

wurden aus den doppelten Meßwerten von jeweils zehn unter gleichen Bedingungen

durchgeführten Tests folgende Parameter ermittelt:

1. der Mittelwert (MW) der absoluten Spannweiten ω errechnet sich aus der Summe

der Spannweiten der zehn Doppelwerte dividiert durch 10:

10)( 101

∑−=

ωω

SpannweiteSpannweiteabsoluteMW

2. der Mittelwert der relativen Spannweiten errechnet sich aus der Summe der Q

tienten aus der Spannweite und dem Arithmetischen Mittel der zehn Doppelwerte divi-

diert durch zehn. Die relative Spannweite berücksichtigt somit die Höhe der Phag

serate, FcBurstrate bzw. mittleren Fluoreszenzintensität:

uo-

ozyto-

10)( 101

∑−

=MittelschesArithmetri

Spannweite

SpannweiterelativeMW

ω

ω

In Tabelle 3 ist aus der absoluten und relativen Spannweite die Präzision aller Tests er-

sichtlich. Diese Berechnung sind unabhängig von den interindividuellen Schwankungen

der Phagozytoserate, FcBurstrate und mittleren Fluoreszenzintensität zwischen den ver-

schiedenen Spendern.

Die Präzision der Tests ist bei Messung der Granulozytenfunktionen sehr hoch und liegt

zwischen einer relativen Spannweite von 1,16 % bei dem mit opsonierten E.coli durchge-

führten Phagozytose-Test und einer relativen Spannweite der mittleren F

stität von 5,42 % bei dem Test für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst.

luoreszenzinten-

Aufgrund des gegenüber Granulozyten niedrigeren Monozytenanteils im peripheren Blut

wurden bei der durchflußzytometrischen Analyse geringere Zellzahlen dieser Population

analysiert, weshalb die Präzision der Tests bei den Monozyten geringer ausfiel.


Tabelle 3: Präzision der verschiedenen Tests bei Mono- und Granulozyten

Monozyten Granulozyten

Mittelwerte von

ω absolut ω relativ ω absolut ω relativ

Phagozytose-Test

ops E.coli RPh 2,56 % 4,87 % 0,74 % 1,16 %

Mean 3,85 13,83 % 1,53 4,29 %

non E.coli RPh 1,66 % 4,55 % 1,61 % 3,65 %

Mean 5,08 15,78 % 0,83 2,09 %

ops S.aureus RPh 3,39 % 8,63 % 0,76 % 1,34 %

Mean 12,38 9,19 % 5,37 3,42 %

non S.aureus RPh 3,31 % 10,85 % 1,35 % 3,30 %

Mean 13,80 9,25 % 3,53 2,93 %

non C.albicans RPh 2,64 % 10,09 % 1,33 % 3,40 %

Mean 0,75 6,13 % 0,31 2,36 %

Test für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst

RFcB 3,95 % 13,52 % 1,66 % 4,71 %

Mean 1,44 8,37 % 0,97 5,42 %

Test für die quantitative Bestimmung des oxidativen Burst

Mean 0,50 8,69 % 0,22 2,76 %

Abkürzungen: ω: Spannweite; RPh: Phagozytoserate; RFcB: FcBurstrate; Mean: mittlere Fluoreszenzinten-

sität; ops: opsoniert; non: nonopsoniert

2.4.5 Weitere Auswertungsaspekte

Ziel der Arbeit war es unter einer Vielzahl an untersuchten Sacchariden einen Hinweis auf

Struktur-Funktionsbeziehungen zwischen Kohlenhydraten und Lektinen bei Interaktionen

von Phagozyten mit Mikroorganismen zu bekommen. Um Trends bei den Modulationsef-

fekte zu sehen wurde zunächst ein Screening mit relativ wenig Messungen pro Saccharid

bei einer großen Anzahl verschiedener Saccharide durchgeführt. Nach Beratung durch

Herrn Muche (Abteilung Biometrie und Medizinische Dokumentation, Universität Ulm) ist

bei dieser Fragestellung eine weitere statistische Auswertungen, insbesondere statistische

Tests zum Vergleich der biochemischen Tests, nicht sinnvoll. Eine Zusammenfassung auf

der Grundlage der Relevanz der Ergebnisse (siehe Kapitel 2.4.3) reicht bei dieser Frage-

stellung hier aus. Die Saccharide, welche im Screening einen relevanten Stimulation- bzw.

Inhibitionseffekt zeigen müssen in folgenden Tests genauer untersucht werden.

3 Ergebnisse

3.1 Adaptation der Testsysteme Zunächst wurden funktionelle Tests für eine Erforschung der Modulation von zentralen

Funktionen des angeborenen Immunsystems durch Functional Food Glykane entwickelt

bzw. spezifisch an diese Fragestellung adaptiert.

Zu diesem Zweck wurde die Abhängigkeit aller Tests von folgenden Testbedingungen un-

tersucht: Vorinkubationszeit, Inkubationszeit und Konzentration der fluoreszenten Mikro-

organismen.


Der Test ermöglicht die quantitative Bestimmung der Aufnahme von fluoreszenzmarkier-

ten Mikroorganismen durch Leukozyten. Im Durchflußzytometer wird die Emission der

phagozytierten Fluoresceinisothiocyanat-markierten Mikroorganismen gemessen. Sie er-

laubt die Ermittlung des prozentualen Anteils der phagozytierenden Leukozyten an der Ge-

samtzahl der phagozytierenden und inaktiven Leukozyten (Phagozytoserate, RPh). Weiter-

hin kann die mittlere Fluoreszenzintensität als Maß für die Anzahl der von einem einzelnen

Leukozyten aufgenommenen Mikroorganismen bestimmt werden.

3.1.1.1 Ergebnisse der Durchflußzytometrischen Analyse des Phagozytose-

Tests

Die Streulichtdiagramme (Vorwärts- gegen Seitwärtsstreulicht, FSC gegen SSC) der mit

E.coli oder S.aureus durchgeführten Phagozytose-Tests unterschieden sich von denen mit

C.albicans. Beim Einsatz von E.coli (Bild 7) oder S.aureus zeigte sich im Streulichdia-

gramm eine homogene Granulozytenpopulation, bei C.albicans (Bild 8) dagegen zwei

Granulozytenpopulationen unterschiedlicher Zellgröße.

3 Ergebnisse 34

Gate A

Granulozyten

Monozyten

Lymphozyten

Bild 7: Streulichtdiagramm eines Phagozytose-Tests mit E.coli zur Differenzierung

der verschiedenen Leukozytenpopulationen

Bild

Abk

Gran

In d

beid

A

8: Streulichtdiagramm eines Phagozytose

riges Histogramm (B)

ürzungen: p.M.: phagozytierende Monozyten, i.M.: i

ulozyten, i.G.: inaktive Granulozyten

em mit C.albicans durchgeführten Phagozytos

en Leukozytenpopulationen durch die separate

B

6,7 % p.M. 38,9 % p.G.

51,4 % i.G.3,0 % i.M.

-Tests mit C.albicans (A) und zugehö-

naktive Monozyten, p.G.: phagozytierende

e-Test gelang eine Differenzierung der

Eingrenzung der Populationen im

3 Ergebnisse 35

Streulichtdiagramm mit Hilfe des „Gate A“. Wurde lediglich die Leukozytenpopulation

geringerer Zellgröße eingegrenzt, so zeigten sich im zugehörigen Histogramm vor allem

die phagozytoseinaktiven Granulozyten (Bild 9A). Bei Eingrenzung der Leukozyten höhe-

rer Zellgröße konnte diese Population im Histogramm als die aktiv C.albicans phagozytie-

rende Granulozytenpopulation identifiziert werden (Bild 9B). Die Messung der Phagozyto-

se von C.albicans erforderte deshalb die Erfassung beider Leukozytenpopulationen im

Streulichtdiagramm.

AI AII

2,4 % p.G.1,3 % p.M.

12,9 % i.M. 83,5 % i.G.

BII BI85,8 % p.G.5,0 % p.M.

0,3 % i.M. 9,1 % i.G.

Bild 9: Streulichtdiagramm eines Phagozytose-Tests mit C.albicans unter Eingren-

zung der Granulozytenpopulation geringerer (AI) und höherer (BI) Zell-

größe, sowie zugehörige Histogramme (AII/BII)

3 Ergebnisse 36

Im Histogramm der Grünfluoreszenz konnte anhand des Fluoreszenzanstieges der Leu-

kozyten durch die Phagozytose von FITC-markierten E.coli-Bakterien die Phagozytoserate

(RPh) und die Anzahl der pro Leukozyt aufgenommenen Bakterien (mittlere Fluoreszenzin-

tensität) bestimmt werden.

Der Kontrollansatzes bei 0 °C, bei dem die Phagozytose blockiert ist, diente zur Einstel-

lung des „Quadrantengitters B“ (Bild 10). Im Testansatz bei 37 °C wanderte die aktiv

FITC-E.coli phagozytierende Leukozytenpopulation aufgrund der ansteigenden Grünfluo-

reszenz nach oben. Sie war deshalb leicht von den lediglich autofluoreszierenden, inakti-

ven Phagozyten abgrenzbar. Die Abgrenzung von phagozytoseaktiven und -inaktiven Pha-

gozyten war bei allen Partikeln möglich, wobei in absteigender Reihenfolge mit S.aureus,

E.coli und C.albicans die höchste Fluoreszenzintensität gemessen werden konnte.

Bild

3.1.

Zur

char

Was

durc

Sacc

A

0,6 % p.G.0,2 % p.M.

5,0 % i.M. 94,2 % i.G.

10: Vergleich des Kontrollansatzes bei 0 °C

eines Phagozytose-Tests mit FITC-mar

1.2 Einfluß der Vorinkubation auf die P

Untersuchung eines phagozytosestimulierende

ide vor Beginn des Test sechzig Minuten mit d

serbad inkubiert. Um eine artifizielle Stimulat

h diese Vorinkubation auszuschließen, wurden

haride über 0, 30, 60, 90 und 120 Minuten vo

B

67,6 % p.G.1,6 % p.M.

0,9 % i.M. 29,9 % i.G.

(A) mit dem Testansatz bei 37 °C (B)

kierte E.coli-Bakterien

hagozytose

n Saccharideffektes wurden die Testsac-

em heparinisiertenVollblut bei 37 °C im

ion oder Inhibition der Phagozytose

Kontrollproben des Vollblutes ohne

rinkubiert.

3 Ergebnisse 37

Anschließend konnten im Phagozytose-Test die Phagozytoseraten und die mittleren Fluo-

reszenzintensitäten gemessen werden. Diese ergaben innerhalb der zweistündigen Vorin-

kubationszeit keine relevanten Änderungen bei opsonierten E.coli (RPh zwischen 26,2 %

und 30,2 %; Mean zwischen 31,3 und 36,7) und nonopsonierten E.coli (RPh zwischen 14,0

% und 17,4 %; Mean zwischen 32,6 und 37,6).

Ebenso wurden bei einer Vorinkubation bis zu 60 Minuten nur geringe Veränderungen der

granulozytären Phagozytoserate und der mittleren Fluoreszenzintensität mit opsoniertem

S.aureus (RPh zwischen 48,2 % und 50,4 %; Mean zwischen 122,2 und 126,8) und no-

nopsoniertem S.aureus (RPh zwischen 28,6 % und 31,0 %; Mean zwischen 109,7 und

111,7) gemessen. Erst nach einem Vorinkubationszeitraum von 120 Minuten konnte, ohne

relevante Änderung der mittleren Fluoreszenzintensität, eine Abnahme der Phagozytosera-

te von 50,4 % auf 44,3 % bei opsoniertem und von 31,0 % auf 23,8 % bei nonopsoniertem

S.aureus ermittelt werden.

Insgesamt konnte gezeigt werden, daß es durch eine sechzigminütige Vorinkubation zu

keiner relevanten Stimulation oder Inhibition der Phagozytose von E.coli- oder S.aureus-

Bakterien durch Granulozyten kam.

3.1.1.3 Einfluß der Konzentration der Mikroorganismen auf die Phagozytose

Die Phagozytose von Escherichia coli, Staphylococcus aureus und Candida albicans durch

polymorphkernige Granulozyten nahm mit steigender Konzentration der Mikroorganismen

im Test zu (Bild 11). Ein Vergleich zwischen den drei Phagozytosepartikeln zeigte eine

analog verlaufende Sättigungskinetik der Phagozytoseraten. Allerdings waren in abstei-

gender Reihenfolge für E.coli, S.aureus und C.albicans höhere Verhältnisse von Mikroor-

ganismen zu Leukozyten notwendig um vergleichbare Phagozytoseraten zu erhalten. Au-

ßerdem war die Phagozytoserate der Granulozyten bei Einsatz opsonierter Partikel stets

größer als bei nonopsonierten.

Demgegenüber nahm die Anzahl der phagozytierten Partikel pro einzelnem Mono- bzw.

Granulozyt (mittlere Fluoreszenzintensität) bei allen drei Phagozytosepartikeln annährend

linear mit dem Verhältnis von Mikroorganismen zu Leukozyten zu.

Analog zu den Granulozyten zeigten auch die Monozyten eine konzentrationsabhängige

Sättigungskinetik der Phagozytoserate und einen annähernd linearen Anstieg der mittleren

Fluoreszenzintensität bei allen drei Mikroorganismen (Ergebnisse nicht dargestellt).

3 Ergebnisse 38

0 5 10 15 20 25E.coli : Leukozyten - Verhältnis

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%Ph

agoz

ytos

erat

e

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9S.aureus : Leukozyten - Verhältnis

Phag

ozyt

oser

ate

B A

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

0 1 2 3 4C.albicans : Leukozyten - Verhältnis

Phag

ozyt

oser

ate

C

Bild 11: Einfluß der Konzentration an E.coli (A), S.aureus (B) bzw. C.albicans (C) auf

die Phagozytose von Granulozyten

Heparinisiertes Vollblut wurde während der Durchführung des Phagozytose-Tests mit den angegebenen

Konzentrationen von E.coli, S.aureus bzw. C.albicans fünf Minuten bei 37 °C im Wasserbad inkubiert. Er-

gebnisse aus einem repräsentativen von drei durchgeführten Versuchen. Angegeben ist das Arithmetische

Mittel aus zwei Einzelwerten und die zugehörige ( ) Spannweite ω.

3.1.1.4 Einfluß der Inkubationszeit auf die Phagozytose

Die Phagozytose von Escherichia coli, Staphylococcus aureus und Candida albicans durch

Leukozyten war bei der Kontrolle (Inkubationszeit 0 min) auf Eis blockiert und nahm mit

ansteigender Inkubationszeit der Mikroorganismen im heparinisierten Vollblut bei 37 °C

im Wasserbad zu. Dabei unterlag die granulozytäre Phagozytose aller drei Partikel einer

ähnlichen Zeitkinetik, wobei opsonierte Partikel stets schneller und in größerem Ausmaß

phagozytiert wurden als nicht opsonierte. Außerdem wurde S.aureus, trotz des geringeren

Bakterien : Leukozyten-Verhältnisses gegenüber E.coli, schneller und in höherem Ausmaß

3 Ergebnisse 39

durch Granulozyten aufgenommen. Die Phagozytoserate von Granulozyten bei C.albicans

lag in einem Bereich dazwischen (Bild 12). Auch die Anzahl an phagozytierten Partikeln

pro Leukozyt (mittlere Fluroeszenzintenstiät) stieg vor allem bei S.aureus mit zunehmen-

der Inkubationszeit an. Monozyten zeigten eine ähnlichen Inkubationszeitkinetik bei der

Phagozytoserate und mittleren Fluoreszenzintensität wie Granulozyten.

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

0

Phag

ozyt

oser

ate

C.albicans

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0

Mittl

ere F

luor

esze

nzin

tens

ität

Bild 12: Einfluß

zenzint

Heparinisiertes Vol

(E.coli : Leukozyte

Candida albicans (

Wasserbad inkubie

ist das Arithmetisch

A

10 20 30 40 50 60Inkubationszeit [min]

S.aureusopsoniert

S.aureusnonopsoniert

E.coliopsoniert

E.colinonopsoniert

C.albicansB


S.aureusopsoniert

S.aureusnonopsoniert

E.coli opsoniert

E.colinonopsoniert

der Inkubationszeit auf die Phagozytose (A) und mittlere Fluores-

ensität (B) von Granulozyten

lblut wurde während der Durchführung des Phagozytose-Tests mit Escherichia coli

n-Verhältnis 6:1), Staphylococcus aureus (S.aureus : Leukozyten-Verhältnis 2:1) oder

C.albicans : Leukozyten-Verhältnis 2:1) über die angegebenen Zeiträume bei 37 °C im

rt. Ergebnisse aus einem repräsentativen von drei durchgeführten Versuchen. Angegeben

e Mittel aus zwei Einzelwerten und die zugehörige ( ) Spannweite ω.

3 Ergebnisse 40


Der Test ermöglicht die Bestimmung der Fc-Rezeptor vermittelten Aufnahme von farb-

stoffmarkierten Immunkomplexen in Phagozyten. Die internalisierten Immunkomplexe

stimulieren die Produktion von reaktiven Sauerstoffradikalen in den Phagozyten, wodurch

der zunächst nicht fluoreszierende Farbstoff-Immunkomplex durch Oxidation fluoreszent

wird. Die Messung im Durchflußzytometer erlaubt die Bestimmung des Anteils der aktiv

Immunkomplexe phagozytierenden Leukozyten an der Gesamtzahl aller Leukozyten (=

FcBurstrate). Außerdem kann die mittlere Fluoreszenzintensität als Maß für die produzier-

te Menge an reaktiven Sauerstoffradikalen je Einzelzelle ermittelt werden.

3.1.2.1 Ergebnisse der durchflußzytometrischen Analyse des Tests für den Fc-

Rezeptor vermittelten oxidativen Burst

Das Streulichtdiagramm des Tests für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst war

dem des Phagozytose-Tests mit E.coli oder S.aureus (Bild 7 Kapitel 3.1.1.1) analog.

Die Gegenüberstellung eines Kontrollansatzes bei 0 °C und eines Testansatzes bei 37 °C

im Histogramm der Grünfluoreszenz (Bild 13) zeigt, daß eine nahezu vollständige Blok-

kierung des Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst bei 0 °C möglich ist. Der Kontroll-

ansatz diente der Differenzierung von phagozytoseaktiven und -inaktiven Leukozyten

durch eine Separation der Leukozytenpopulationen mit Hilfe des „Quadrantengitters B“.

3 Ergebnisse 41

Bild

3.1.

Im S

der T

Fc-R

Voll

60, 9

Inne

tose

resz

artif

gesc

3.1.

Die

Saue

(FcB

A

0,7 % p.G.0,1 % p.M.

9,2 % i.M. 90,1 % i.G.

13: Vergleich des Kontrollansatzes bei 0 °C

im Test für den Fc-Rezeptor vermittelt

2.2 Einfluß der Vorinkubationzeit auf d

tiven Burst

timulationstest sollte ausgeschlossen werden,

estsaccharide mit dem heparinisierten Vollbl

ezeptor abhängigen Phagozytose von Immun

blut, analog zum Phagozytose-Test, ohne Test

0 bis zu 120 Minuten vorinkubiert.

rhalb der zweistündigen Vorinkubation wurde

rate von Immunkomplexen (RFcB zwischen 28,

enzintensität der Granulozyten (Mean zwische

izielle Stimulation oder Inhibtion des Fc-Reze

hlossen werden konnte.

2.3 Einfluß der Konzentration an Immu

vermittelten oxidativen Burst

Phagozytose von Fc-Rezeptor gebundenen Im

rstoffradikale produzierenden Mono- und Gra

urstrate) nahm linear zur Konzentration der Im

B

46,3 % p.G.3,3 % p.M.

3,9 % i.M. 46,5 % i.G.

(A) mit dem Testansatz bei 37 °C (B)

en oxidativen Burst

en Fc-Rezeptor vermittelten oxida-

daß eine sechzigminütige Vorinkubation

ut eine artifizielle Zu- oder Abnahme der

komplexen auslöste. Dazu wurde das

saccharide über die Zeitintervalle 0, 30,

keine relevante Änderung der Phagozy-

0 % und 29,7 %) und der mittleren Fluo-

n 11,1 und 12,0) ermittelt, so daß eine

ptor vermittelten oxidativen Burst aus-

nkomplexen auf den Fc-Rezeptor

munkomplexen und der Anteil der aktiv

nulozyten an der Gesamtzahl der Zellen

munkomplexe im Versuchsansatz zu

3 Ergebnisse 42

(Bild 14). Auch die Menge an produzierten Sauerstoffradikalen je Einzelzelle (mittlere

Fluoreszenzintensität) zeigte einen linearen Anstieg mit der Immunkomplexkonzentration.

Insgesamt war die Sauerstoffradikalproduktion von Granulozyten um den Faktor 1,3 bis

2,1 höher als bei Monozyten. Bei einer Steigerung der Immunkomplexkonzentration von

34 µg/ml auf 272 µg/ml zeigten die Granulozyten zudem einen stärkeren Anstieg des oxi-

dativen Burst (von 9,4 auf 17,9) als die Monozyten (von 5,5 auf 8,4).

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

0 50 100 150 200 250 300Konzentration [µg/ml]

FcBu

rstra

te

Monozyten

Granulozyten

Bild 14: Einfluß der Immunkomplexkonzentration auf den Fc-Rezeptor vermittelten

oxidativen Burst von Monozyten und Granulozyten

Heparinisiertes Vollblut wurde während der Durchführung des Tests für den Fc-Rezeptor vermittelten oxida-

tiven Burst mit den angegebenen Konzentrationen an Immunkomplexen fünf Minuten bei 37 °C im Wasser-

bad inkubiert. Ergebnisse aus einem repräsentativen von drei durchgeführten Versuchen mit Einzelwerten.

3.1.2.4 Einfluß der Inkubationszeit auf den Fc-Rezeptor vermittelten oxidati-

ven Burst

Die Phagozytose von Fc-Rezeptor gebundenen Immunkomplexen und der nachfolgende

oxidative Burst stiegen mit zunehmender Inkubationsdauer der Immunkomplexe mit dem

Vollblut im 37 °C-Wasserbad an.

Der Anteil der Mono- bzw. Granulozyten die Sauerstoffradikale produzierten, an der Ge-

samtzahl der jeweiligen Zellpopulation zeigte im Verlauf der dreißigminütigen Inkubation

eine Sättigungskinetik. Dagegen stieg die Produktion von reaktiven Sauerstoffradikalen je

einzelnem Mono- bzw. Granulozyt linear mit der Inkubationsdauer an (Bild 15).

3 Ergebnisse 43

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

0

FcBu

rstra

te70

t

Bild 15

Heparin

tiven Bu

Wasserb

ist das A

3.1.3

Der Te

sten Sa

E.coli

stoffpe

fluores

fen. Di

laubt d

pro ein

len.

A


0

10

20

30

40

50

60

0

Mittl

ere F

luor

esze

nzin

tens

itä: Einfluß der Inkubationszeit auf die FcB

zenzintensität (B) von Monozyten und G

isiertes Vollblut wurde während der Durchführung de

rst mit Immunkomplexen (150 µg IC / ml Vollblut) ü

ad inkubiert. Ergebnisse aus einem repräsentativen v

rithmetische Mittel aus zwei Einzelwerten und die z

Test zur quantitativen Bestimmu

st ermöglicht die quantitative Bestimmung d

uerstoffradikalproduktion von Leukozyten.

produzieren Granulozyten und Monozyten re

roxid, Superoxid-Anion, Hydroxylradikal),

zierenden, zellmembranpermeablen Farbsto

e Messung der Emission dieses Farbstoffes

ie Ermittlung der mittleren Fluoreszenzinten

zelnem Mono- bzw. Granulozyt produzierte

B


urstrate (A) und die mittlere Fluores-

ranulozyten

s Tests für den Fc-Rezeptor vermittelten oxida-

ber die angegebenen Zeiträume bei 37 °C im

on drei durchgeführten Versuchen. Angegeben

ugehörige ( ) Spannweite ω.

ng des oxidativen Burst

er mit verschiedenen Stimuli ausgelö-

Nach Stimulation mit fMLP, PMA oder

aktive Sauerstoffmetaboliten (Wasser-

welche die Umwandlung eines nicht

ffes in einen fluoreszierenden hervorru-

erfolgt im Durchflußzytometer und er-

sität als Maß für die durchschnittlich

Menge an reaktiven Sauerstoffradika-

3 Ergebnisse 44

3.1.3.1 Ergebnisse der durchflußzytometrischen Analyse des Tests zur quanti-

tative Bestimmung des oxidativen Burst

Das Streulichtdiagramm des Tests zur quantitativen Bestimmung des oxidativen Burst

war dem des Phagozytose-Tests mit E.coli oder S.aureus (Bild 7 Kapitel 3.1.1.1) analog.

Die Gegenüberstellung eines Kontroll- und Testansatzes im Histogramm der Grünfluo-

reszenz zeigt die geringe Autofluoreszenz der Leukozyten im Kontrollansatz durch eine

Blockierung des oxidativen Burst auf Eis (0 °C), sowie einen Anstieg der mittleren Fluo-

reszenzintensität (Mean) bei Inkubation des Testansatzes im 37 °C-Wasserbad (Bild 16).

B

A

Mean G. 13,4Mean M. 0,8 Mean G. 0,8 Mean M. 6,2

Bild 16: Vergleich der Fluoreszenzintensität des Kontrollansatzes bei 0 °C (A) mit

dem Testansatz bei 37 °C (B) bei der quantitativen Bestimmung des oxidati-

ven Burst von Monozyten (Mean M.) und Granulozyten (Mean G.)

3.1.3.2 Einfluß der Vorinkubationzeit auf die quantitative Bestimmung des

oxidativen Burst

Zum Ausschluß einer artifiziellen Modulation des oxidativen Burst von Leukozyten im

Stimulationstest durch eine einstündige Vorinkubation mit den Testsacchariden, wurde das

heparinisierte Vollblut über 0, 30, 60, 90 bis zu 120 Minuten ohne Testsaccharide bei

37 °C vorinkubiert.

Innerhalb dieser Zeitintervalle wurde keine relevante Änderung der Burstrate (RB zwischen

95,2 % und 96,5 %) und der mittleren Fluoreszenzintensität von Granulozyten (Mean zwi-

3 Ergebnisse 45

schen 12,5 und 16,3) gemessen, so daß eine artifizielle Zu- oder Abnahme des durch E.coli

stimulierten oxidativen Bursts ausgeschlossen werden konnte.

3.1.3.3 Einfluß der Stimuluskonzentration auf die quantitative Bestimmung

des oxidativen Burst

Der prozentuale Anteil der Monozyten und Granulozyten mit oxidativem Burst und die

Produktion von reaktiven Sauerstoffmetaboliten pro Leukozyt nahm mit ansteigender

Konzentration des partikulären Stimulus E.coli und des chemischen Stimulus PMA zu,

während er durch den physiologischen Stimulus fMLP und die Kontrolle ohne Stimulus

unbeeinflußt blieb. Bei Einsatz des Stimulus PMA verursachten bereits geringste Konzen-

trationen einen starken Anstieg der Burstrate, so daß mit 0,24 µM PMA bereits 93 % der

Granulozyten Sauerstoffradikale produzierten (Bild 17AI).

Die von einem Leukozyt durchschnittlich produzierte Menge an reaktiven Sauerstoffmeta-

boliten zeigte eine annährend lineare Zunahme mit dem E.coli:Leukozyten-Verhältnis bzw.

der PMA-Konzentration (Bild 17AII).

Vor allem bei höheren Stimuluskonzentration lag die Sauerstoffradikalproduktion von

Granulozyten deutlich über der von Monozyten. So wurde bei einem E.coli:Leukozyten-

Verhältnis von 40:1 bei Granulozyten ein um den Faktor 2,4 höherer bzw. mit 1,9 µM

PMA ein um den Faktor 4,8 höherer oxidativer Burst als bei Monozyten ermittelt.

3.1.3.4 Einfluß der Inkubationszeit auf die quantitative Bestimmung des oxida-

tiven Burst

Der prozentuale Anteil der Leukozyten mit oxidativem Burst und die Sauerstoffradikalpro-

duktion pro Leukozyt nahm mit steigender Inkubationdauer des Vollblutes in Anwesenheit

des partikulären Stimulus E.coli und des „High Stimulus“ PMA bei 37 °C zu. Dagegen

zeigte sich in Gegenwart des physiologischen „Low Stimulus“ fMLP und der Kontrolle

ohne Stimulus keine Zunahme der Burstrate oder der mittleren Fluoreszenzintensität von

Leukozyten in Abhängigkeit von der Inkubationszeit. Bei Einsatz von 1,6 µM PMA pro-

duzierten nach einer Inkubation von 3,5 Minuten bereits 94 % und nach 7 Minuten 99 %

der Granulozyten Sauerstoffradikale, während bei einem E.coli:Leukozyten-Verhältnis von

34:1 nach einer 10 minütigen Inkubation 91 % der Granulozyten einen oxidativen Burst

aufwiesen (Bild 17BI).

3 Ergebnisse 46

Die nach einer Stimulation mit E.coli von einem Granulozyten durchschnittlich produzierte

Menge an reaktiven Sauerstoffmetaboliten nahm bis zu einer Inkubationsdauer von 10 Mi-

nuten annähernd linear zu (Bild 17BII).

Analog konnte bei Granulozyten auch in Abhängigkeit von der Inkubationszeit eine mit

den Stimuli E.coli circa zweifach und mit PMA circa fünffach erhöhte Sauerstoffradikal-

produktion im Vergleich zu Monozyten nachgewiesen werden.

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

0 5 10 15 20 25Stimulusfaktor

Burs

trate

0

5

10

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20

25

30

0 5 10 15 20 25Stimulusfaktor

Mittl

ere F

luor

esze

nzin

tens

ität

AI AII

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

0 5 10 15 20 25 30Inkubationszeit [min]

Burs

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0102030405060708090

100

0 5 10 15 20 25 30Inkubationszeit [min]

Mittl

ere F

luor

esze

nzin

tens

ität

BI BII

Bild 17: Einfluß der Stimuluskonzentration (A) bzw. der Inkubationszeit (B) auf den

prozentualen Anteil von Granulozyten mit oxidativem Burst (I) und die Sau-

erstoffradikalproduktion (II)

Heparinisiertes Vollblut wurde beim Test zur quantitativen Bestimmung des oxidativen Burst (A) mit ver-

schiedenen Konzentrationen an Stimuli zehn Minuten, bzw. (B) mit 20 µl Waschlösung, 1,0 µM fMLP (N-

formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine), 1,62 µM PMA (Phorbol-12-myristat-13-acetat) bzw. mit einem

Escherichia coli:Leukozyten-Verhältnis von 34:1 über die angegebenen Zeiträume, bei 37 °C im Wasserbad

3 Ergebnisse 47

inkubiert. Bei Stimulusfaktor 1 betrug das Escherichia coli:Leukozyten-Verhältnis 1:1, die Konzentration an

fMLP 0,03 µM und an PMA 0,05 µM. Alle weiteren Konzentrationen ergeben sich durch Multiplikation mit

dem angegebenen Stimulusfaktor. Ergebnisse aus einem repräsentativen von drei durchgeführten Versuchen

mit Einzelwerten.

3.1.4 Phagozytose-Test mit Makrophagen

Um für die Mucosa-assoziierten Phagozyten des Gastrointestinaltraktes ein verbessertes

physiologisches Zellmodell zur Verfügung zu haben, wurden aus humanen Blutmonozyten

in Kultur Makrophagen erzeugt.

3.1.4.1 Makrophagenkultur

Die Kultivierung von Monozyten aus peripherem Spenderblut oder Buffy Coats und deren

Differenzierung zu humanen Makrophagen wurde als Standardmethode etabliert (Kapitel

2.2.2.1).

Nach einer Differenzierung von zehn bis vierzehn Tagen konnten die humanen Makropha-

gen geerntet werden. Wegen der gegenüber anderen Kulturgefäßen geringeren Makropha-

genadhärenz an eine spezielle Kulturfolie konnten die Zellen in guter Ausbeute von der

Folie abgelöst werden. Diese Ablösung erfolgte ohne Kollagenase und Proteasen, um eine

intakte Zelloberfläche und -funktion zu gewährleisten. Außerdem wurden die Zellen bei

der Ablösetechnik so gut vereinzelt, daß sie für die durchflußzytometrische Analyse geeig-

net waren.

3.1.4.2 Durchflußzytometrische Charakterisierung der Makrophagen

Im Streulichtdiagramm ließen sich die kultivierten Makrophagen anhand der Zellgröße

(Vorwärtsstreulicht, FSC) und der Zellgranularität (Seitwärtsstreulicht, SSC) von den Mo-

nozyten und Lymphozyten abgrenzen. Dabei zeigten die Makrophagen (Bild 18B) gegen-

über den Monozyten (Bild 18A) sowohl eine erhöhte Zellgröße als auch -granularität.

3 Ergebnisse 48

B A Makrophagen

Lymphozyten

Monozyten

Lymphozyten

Bild 18: Streulichtdiagramm eines Phagozytose-Test mit E.coli zur Differenzierung

von humanen Monozyten (A) und kultivierten Makrophagen (B)

Aus peripherem Spenderblut wurde mit Ficoll-Paque die mononukleäre Fraktion isoliert, und mit dem Durch-

flußzytometer wurden Lymphozyten und Monozyten anhand ihrer Zellgröße und -granularität analysiert

(Bild 18A). Nach 10 Tagen in vitro-Kultur (gemäß Kapitel 3.1.4.1) differenzierten sich die Monozyten zu

Makrophagen mit höherer Zellgröße und -granularität (Bild 18B).

Die Überprüfung der Vitälität mit Propidiumjodid ergab, daß die im Makrophagen-Gate

eingegrenzten Zellen zu über 95 % vital waren.

Der simultane Einsatz von fluoreszenzmarkierten Antikörpern sowohl gegen den CD14-

Rezeptor, der auf Monozyten und Makrophagen exprimiert ist, als auch gegen den Manno-

se-Rezeptor, der nur auf Makrophagen exprimiert wird, ermöglichte eine exakte Charakte-

risierung der Makrophagen und eine Abgrenzung gegenüber den Monozyten. Die Antikör-

per zur Isotyp-Kontrolle dienten zur Ermittlung der Autofluorezenz und zur Einstellung

des Quadrantengitters im Histogramm.

Aus dem Histogramm, in dem die Fluoreszenz der Mannoserezeptor-Antikörper gegen die

Fluoreszenz der CD14-Antikörper aufgetragen wurde, ist folgendes ersichtlich:

Auf der im Streulichtdiagramm als Monozyten identifizierte Population ließ sich CD14

(CD14 Expressionshöhe: Mean 20-30) nachweisen. Diese Monozytenpopulation war für

den Mannose-Rezeptor praktisch negativ (Bild 19A).

Dagegen exprimierte die Makrophagenpopulation (Bild 19B) CD14 um den Faktor 10 hö-

her (CD14 Expressionshöhe: Mean ca. 200) und war nahezu vollständig für den Mannose-

Rezeptor positiv (Mannoserezeptor Expressionshöhe: Mean ca. 30-60).

3 Ergebnisse 49

A B Monozyten

(CD14+/MR-)

Makrophagen

(CD14+/MR+)

Bild 19: Charakterisierung von humanen Monozyten (A) und kultivierten Makropha-

gen (B) anhand der Expressionshöhe des Mannoserezeptor (MR) und CD14

Aus peripherem Spenderblut wurde mit Ficoll-Paque die mononukleäre Fraktion isoliert und mit dem PE-

markierten Mannoserezeptor-Antikörper und dem ECD-markierten CD14-Rezeptor-Antikörper eine Im-

munphänotypisierung der Monozyten (A) und der 10 Tage kultivierten Makrophagen (B) gemäß Kapitel

2.2.2.2 durchgeführt.

3.1.4.3 Optimierung der Testbedingungen für Makrophagen

Vergleichende Untersuchungen der Phagozytose von E.coli mit Makrophagen, die über

verschiedene Zeiträume inkubiert wurden, zeigten eine 60-100 % Steigerung der Phagozy-

toserate von elf Tage kultivierten Zellen gegenüber der Kultur von acht Tagen. Auf diesen

Erfahrungswerten basierend wurden die Makrophagen in den Tests standardisiert zehn Ta-

ge in vitro kultiviert.

Weiterhin mußten die kultivierten Makrophagen in gepooltem Humanserum ca. eine Stun-

de bei Raumtemperatur rekonstituiert werden, da die Phagozytoseraten dieser Zellen an-

sonsten um ca. 20 % geringer waren.

Da Makrophagen größer als Granulo- und Monozyten sind konnte von einer höheren Ad-

härenz der Phagozytosepartikel an unspezifische Rezeptoren ausgegangen werden. Um die

Autofluoreszenz von nicht phagozytierten, sondern lediglich adhärenten Bakterien mög-

lichst vollständig zu unterdrücken, wurden Untersuchungen mit höheren Konzentrationen

an Quenchlösung (100-200 µl) durchgeführt. Dabei konnte gezeigt werden, daß die Ver-

doppelung der Konzentration an Quenchlösung von 100 µl auf 200 µl bei einem

3 Ergebnisse 50

E.coli:Makrophagen-Verhältnis von 10:1 zu einer Verminderung der Phagozytoserate von

36,5 % auf 26,2 % und der mittleren Fluoreszenzintensität von 168 auf 166 führte. Bei den

folgenden Untersuchugen wurde deshalb 200 µl Quenchlösung als Standard gewählt.

Die Phagozytose von Escherichia coli und Staphylococcus aureus durch die kultivierten

Makrophagen nahm mit steigender Konzentration der Mikroorganismen (Bild 20A) und

mit der Inkubationszeit (Bild 20B) nahezu linear zu. Im Vergleich zu Granulozyten im

Vollblut lag die Phagozytoserate der kultivierten Makrophagen insgesamt um ca. 10-20 %

niedriger. Außerdem fanden sich mit Makrophagen im Gegensatz zu Neutrophilen bei Ein-

satz von opsonierten und nonopsonierten E.coli nur geringe Differenzen der Phagozytose-

raten.

Die Inkubationszeit wurde standardisiert auf 5 Minuten beschränkt, um den Verlust der

Makrophagen durch eine Adhärenz am Inkubationsgefäß zu minimieren.

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

0

Phag

ozyt

oser

ate

90%100%

Bild 20

Die 10 T

den ange

me, bei 3

sche Mit

A

2 4 6 8 10E.coli : Makrophagen - Verhältnis

120%

10%20%30%40%50%60%70%80%

0

Phag

ozyt

oser

ate

: Einfluß der Konzentration von E.coli (A)

Phagozytose durch Makrophagen

age kultivierten Makrophagen wurden während der Du

gebenen E.coli-Konzentrationen 10 Minuten, bzw. (B)

7 °C im Wasserbad inkubiert. Ergebnisse aus jeweils e

tel aus zwei Einzelwerten und die zugehörige ( ) Spann

B

2 4 6 8 10 12 14 1Inkubationszeit [min]

6

und der Inkubationszeit (B) auf die

rchführung des Phagozytose-Tests (A) mit

mit S.aureus über die angegebenen Zeiträu-

inem Versuch. Angegeben ist das Arithmeti-

weite ω.

3 Ergebnisse 51

3.2 Saccharidscreening im Phagozytose-Test Die stimulierende bzw. inhibierende Wirkung verschiedener Saccharide auf die Phagozy-

tose von Escherichia coli ist anhand des „Modulationskoeffizienten der Gesamtphagozyto-

se“ (KPh) zu ersehen. Er bezeichnet den Quotient aus der Gesamtphagozytose (= Phagozy-

toserate × mittlerer Fluoreszenzintensität) des Testansatzes mit Saccharid und der

Gesamtphagozytose der Kontrolle ohne Saccharid.

Es wurden drei Testreihen mit doppelten Testansätzen je Saccharid und mit dreifachen

Kontrollansätzen ohne Saccharid als Stimulations- und als Inhibitionstest durchgeführt.

Anhand dieser Testreihen ist ersichtlich, daß starke interindividuelle Schwankungen der

Saccharideffekte trotz der hohen Testpräzision (geringe Spannweite der Doppelwerte)

auftreten können. Außerdem stellten wir im Rahmen der Auswertung fest, daß bestimm

Probanden, unabhängig von den eingesetzten Testsacchariden, ein generell erniedrigtes

bzw. erhöhtes Phagozytoseniveau aufwiesen. Da sich das Differentialblutbild dieser Perso-

nen im physiologischen Bereich befand, spielt hierfür möglicherweise eine latente Stimula-

tion der Leukozyten eine Rolle.

te

Wie in Tabelle 4 dargestellt zeigte im Stimulationstest ausschließlich BC-D-146 eine Stei-

gerung der granulozytären Phagozytose von nonopsonierten E.coli. Im Inhibitionstest

(Tabelle 5), das heißt ohne Saccharidvorinkubation, fanden sich ausschließlich hemmende

Effekte der Saccharide auf die granulozytäre Phagozytose von nonopsonierten E.coli, wo-

bei das Polysaccharid Fucoidan bereits in sehr niedrigen Konzentrationen (KPh ≤ 0,3 bei

0,5 mg/ml) den stärksten Hemmeffekt zeigte.

Eine Hemmung der Gesamtphagozytose mit einem KPh ≤ 0,5 wurde in mindestens zwei

Testreihen mit BC-O-148 und BC-O-145 und ein KPh ≤ 0,6 mit oxidierter Saccharose, BC-

O-71, BC-O-150 und BC-O-282 erreicht.

3 Ergebnisse 52

Tabelle 4: Einfluß verschiedener Saccharide auf die Phagozytose von nonopsonier-

ten Escherichia coli durch Granulozyten im Stimulationstest

Test 1 Test 2 Test 3

KPh (ω) KPh (ω) KPh (ω)

Monosaccharide

BC-O-148* (Glucuronsäurederivat) 0,65 (0,13) 0,68 (0,08) 0,74 (0,14)

D-Mannose-6-phosphat 1,01 (0,18) 0,44 (0,06) 0,98 (0,06)

Disaccharide

Lactose* (Galβ1,4Glc) 0,83 (0,12) 0,92 (0,14) 1,10 (0,28)

BC-D-146* (Glc, Gluconsäure) 1,37 (0,46) 1,17 (0,15) 1,35 (0,28)

BC-O-145* (Aminozucker, Glc) 0,89 (0,11) 0,54 (0,08) 0,63 (0,25)

BC-D-185* (oxidiert) 0,74 (0,14) 0,73 (0,10) 0,77 (0,15)

N-Acetyllactosamin (Galβ1,4GlcNAc) 1,03 (0,31) 0,43 (0,05) 0,97 (0,14)

Trisaccharide

Lactosucrose* (Galβ1,4Glcα1,2Fru) 0,92 (0,19) 0,96 (0,14) 1,21 (0,20)

Raffinose* 0,5 mg/ml (Galα1,6Glcα1,2Fru)

0,73 (0,02) 1,02 (0,17) 0,67 (0,13)

BC-O-71* (Glc, Fru) 0,66 (0,08) 0,68 (0,10) 0,78 (0,14)

BC-O-150* (Polyol, Glc, Sorbit, Man-nit)

0,76 (0,13) 0,93 (0,15) 1,16 (0,17)

BC-O-207* (Gal, Glc) 0,82 (0,14) 0,75 (0,09) 1,13 (0,33)

α-1,3-α-1,6-Mannotriose (Manα1,3Manα1,6ManαOMethyl)

1,08 (0,21) 0,46 (0,08) 0,95 (0,13)

Tetrasaccharide

Nystose* 0,5 mg/ml (Glcα1,2Fruα1,2Fruα1,2Fru)

0,71 (0,04) 1,10 (0,24) n.l. ( - )

Stachyose* (Galα1,6Galα1,6Glcα1,2Fru)

0,68 (0,15) 0,68 (0,10) 0,94 (0,16)

BC-O-50* (Glc, Fru) 0,81 (0,06) 0,80 (0,12) 1,24 (0,43)

BC-O-76* (Polyol; Glc, Sorbit, Man-nit)

0,70 (0,11) 0,68 (0,08) 0,89 (0,22)

BC-O-191* (Gal, Glc) 0,84 (0,13) 0,68 (0,10) 1,08 (0,24)

Chitotetraose (GlcNAc-[β1,4GlcNAc]3)

1,00 (0,28) 0,48 (0,01) 0,99 (0,24)

Pentasaccharide

BC-O-192* (Gal, Glc) 0,91 (0,15) 0,98 (0,15) 1,13 (0,23)

BC-O-290* 0,68 (0,14) 0,78 (0,17) 0,85 (0,21)

3 Ergebnisse 53

Chitopentaose 0,6 mg/ml (GlcNAc-[β1,4GlcNAc]4)

0,94 (0,17) 0,60 (0,03) 0,97 (0,10)

Hexasaccharide

Disialyllacto-N-tetraose, 0,5 mg/ml (Neu5Acα2,3Galβ1,3(Neu5Acα2,6)-GlcNAcβ1,3Galβ1,4Glc)

1,36 (0,21) 0,71 (0,04) 1,09 (0,13)

Chitohexaose (0,6 mg/ml) (GlcNAc-[β1,4GlcNAc]5)

0,97 (0,16) 0,51 (0,07) 1,09 (0,17)

Heptasaccharide

BC-O-25* (Glc, Fru) 0,70 (0,18) 0,55 (0,08) 0,90 (0,21)

Oligosaccharidmischung

BC-O-282* 0,69 (0,13) 0,74 (0,12) 1,06 (0,15)

Polysaccharid

Fucoidan (v.a. sulfatierte Fucose) 0,5 mg/ml

0,54 (0,22) 0,08 (0,03) 0,28 (0,01)

Tabelle 4: Heparinisiertes Vollblut wurde zunächst 60 Minuten mit den angegebenen Sacchariden bei 37 °C

im Wasserbad vorinkubiert. Die Saccharidkonzentration betrug 2 mg/ml. Die wegen mangelnder Saccharid-

löslichkeit vom Standard abweichenden Konzentrationen bzw. die nicht in höheren Konzentrationen verfüg-

baren Saccharide sind in der Tabelle extra aufgeführt. Anschließend wurde ein Phagozytose-Test mit 5 µl

nonopsonierten E.coli und einer Inkubationszeit von fünf Minuten durchgeführt. Angegeben ist der Modula-

tionskoeffizient der Gesamtphagozytose (KPh) und die Spannweite (ω) der je Saccharid doppelt bestimmten

Meßwerte. * Saccharide der Südzucker AG. n.l.: Saccharid von Südzucker AG nicht weiter lieferbar.

3 Ergebnisse 54


ten Escherichia coli durch Granulozyten im Inhibitionstest

Test 1 Test 2 Test 3

KPh (ω) KPh (ω) KPh (ω)

Monosaccharide

BC-O-148* (Glucuronsäurederivat)

0,49 (0,12) 0,53 (0,07) 0,36 (0,07)

D-Mannose-6-phosphat 0,65 (0,09) 0,52 (0,09) 0,72 (0,03)

Disaccharide

Lactose* (Galβ1,4Glc) 0,82 (0,17) 0,83 (0,21) 0,76 (0,23)

BC-D-146* (Glc, Gluconsäure) 0,94 (0,21) 0,90 (0,23) 0,77 (0,18)

BC-O-145* (Aminozucker, Glc) 0,48 (0,12) 0,66 (0,18) 0,34 (0,06)

BC-D-185* (oxidiert) 0,56 (0,11) 0,62 (0,10) 0,46 (0,07)

N-Acetyllactosamin (Galβ1,4GlcNAc) 0,69 (0,10) 0,56 (0,07) 0,76 (0,02)

Trisaccharide

Lactosucrose* (Galβ1,4Glcα1,2-Fru) 1,03 (0,33) 0,88 (0,29) 0,78 (0,16)

Raffinose* 0,5 mg/ml (Galα1,6Glcα1,2Fru)

1,02 (0,20) 0,89 (0,15) 0,98 (0,03)

BC-O-71* (Glc, Fru) 0,59 (0,14) 0,69 (0,14) 0,37 (0,23)

BC-O-150* (Polyol, Glc, Sorbit, Mnit)

an- 0,55 (0,14) 0,69 (0,135) 0,50 (0,16)

BC-O-207* (Gal, Glc) 0,73 (0,26) 0,87 (0,11) 0,48 (0,09)

α-1,3-α-1,6-Mannotriose (Manα1,3Manα1,6ManαOMethyl)

0,80 (0,17) 0,64 (0,10) 0,83 (0,02)

Tetrasaccharide

Nystose* 0,5 mg/ml (Glcα1,2Fruα1,2Fruα1,2Fru)

0,98 (0,18) 0,96 (0,14) 0,99 (0,05)

Stachyose* (Galα1,6Galα1,6Glcα1,2Fru)

0,61 (0,13) 0,78 (0,19) 0,52 (0,13)

BC-O-50* (Glc, Fru) 0,75 (0,18) 0,83 (0,12) 0,59 (0,10)

BC-O-76* (Polyol; Glc, Sorbit, Mnit)

an- 0,61 (0,13) 0,72 (0,19) 0,47 (0,08)

BC-O-191* (Gal, Glc) 0,71 (0,17) 0,88 (0,22) 0,62 (0,13)

Chitotetraose (GlcNAc-[β1,4GlcNAc]3)

0,73 (0,10) 0,61 (0,09) 0,81 (0,05)

Pentasaccharide

BC-O-192* (Gal, Glc) 0,83 (0,17) 0,85 (0,14) 0,66 (0,11)

3 Ergebnisse 55

BC-O-290* 0,74 (0,14) 0,84 (0,11) 0,69 (0,12)

Chitopentaose, 0,6 mg/ml (GlcNAc-[β1,4GlcNAc]4)

0,75 (0,06) 0,86 (0,18) 0,91 (0,08)

Hexasaccharide

Disialyllacto-N-tetraose, 0,5 mg/ml (Neu5Acα2,3Galβ1,3(Neu5Acα2,6)-GlcNAcβ1,3Galβ1,4Glc)

0,77 (0,04) 0,69 (0,09) 0,77 (0,02)

Chitohexaose, 0,6 mg/ml (GlcNAc-[β1,4GlcNAc]5)

0,69 (0,05) 0,77 (0,10) 0,86 (0,04)

Heptasaccharide

BC-O-25* (Glc, Fru) 0,71 (0,18) 0,81 (0,19) 0,55 (0,10)

Oligosaccharidmischung

BC-O-282* 0,56 (0,12) 0,84 (0,12) 0,48 (0,14)

Polysaccharid

Fucoidan (v.a. sulfatierte Fucose) 0,25 mg/ml

0,39 (0,02) 0,47 (0,14) 0,44 (0,03)

Fucoidan, 0,5 mg/ml 0,31 (0,02) 0,25 (0,16) 0,29 (0,02)

Tabelle 5: Die Saccharide wurden direkt vor Testbeginn (während der Eisinkubation) dem heparinisierten

Vollblut zugegeben. Die Saccharidkonzentration betrug 2 mg/ml. . Die wegen mangelnder Saccharidlöslich-

keit vom Standard abweichenden Konzentrationen bzw. die nicht in höheren Konzentrationen verfügbaren

Saccharide sind in der Tabelle extra aufgeführt. Anschließend wurde ein Phagozytose-Test mit 5 µl nonopso-

nierten E.coli und einer Inkubationszeit von fünf Minuten durchgeführt. Angegeben ist der Modulationskoef-

fizient der Gesamtphagozytose (KPh) und die Spannweite (ω) der je Saccharid doppelt bestimmten Meßwer-

te. * Saccharide der Südzucker AG.

Daneben wurde ein einmaliges Saccharidscreening mit nonopsoniertem S.aureus im

Stimulationstest der Phagozytose durchgeführt (Tabelle 6). Dabei konnte eine Aktivierun

der Gesamtphagozytose mit einem KPh ≥ 1,4 durch BC-D-146, Lactosucrose und BC-O-

192, Chitopentaose, Nystose und Lactose gezeigt werden.

g

Am Beispiel eines Phagozytose-Tests mit S.aureus (Tabelle 7) wurde gezeigt, daß sich die

Stimulationseffekte von BC-D-146 bei verschiedenen Versuchen trotz gleicher Testbedin-

gungen und hoher Präzision der Tests erheblich unterschieden. Die Modulationskoeffizien-

ten der Gesamtphagozytose schwankten zwischen 1,40 und 1,71.

3 Ergebnisse 56


tem Staphylococcus aureus durch Granulozyten im Stimulationstest

KPh (ω) KPh (ω)

Monosaccharide Tetrasaccharide

BC-O-148 1,03 (0,10) Nystose 1,43 (0,18)

BC-O-145 1,11 (0,15) Stachyose 1,26 (0,19)

Disaccharide BC-O-50 1,37 (0,16)

Lactose 1,43 (0,06) BC-O-76 1,34 (0,10)

BC-D-146 1,71 (0,10) BC-O-191 1,19 (0,10)

BC-D-185 0,87 (0,12) Pentasaccharide

Trisaccharide BC-O-192 1,50 (0,09)

Lactosucrose 1,58 (0,26) Chitopentaose 1,47 (0,27)

Raffinose 1,11 (0,15) Heptasaccharide

BC-O-71 1,21 (0,10) BC-O-25 1,11 (0,08)

BC-O-150 1,01 (0,13) Xylooligosaccharid-Gemisch

BC-O-207 1,18 (0,12) BC-O-282 1,26 (0,02)

Tabelle 6: Heparinisiertes Vollblut wurde zunächst 60 Minuten mit den angegebenen Sacchariden (2 mg/ml)

bei 37 °C im Wasserbad vorinkubiert. Anschließend wurde ein Phagozytose-Test mit 5 µl nonopsonierten

E.coli und einer Inkubationszeit von fünf Minuten durchgeführt. Angegeben ist der Modulationskoeffizient

der Gesamtphagozytose (KPh) und die Spannweite (ω) der je Saccharid doppelt bestimmten Meßwerte.

Tabelle 7: Variabilität der Stimulationswirkung von BC-D-146 bei der Phagozytose

von Staphylococcus aureus durch Granulozyten

BC-D-146 Test 1 Test 2 Test 3 Test 4

KPh 1,40 1,45 1,58 1,71

(ω) (0,05) (0,02) (0,21) (0,10)

Tabelle 7: Heparinisiertes Vollblut wurde zunächst 60 Minuten mit BC-D-146 (1,8 mg/ml) bei 37 °C im

Wasserbad vorinkubiert. Anschließend wurde ein Phagozytose-Test mit einer Inkubationszeit von fünf Minu-

ten durchgeführt. Angegeben ist der Modulationskoeffizient der Gesamtphagozytose (KPh) und die Spann-

weite (ω).

3 Ergebnisse 57

3.3 Einfluß von Lipopolysaccharid auf die Phagozytose und

den oxidativen Burst

3.3.1 LPS-Konzentrationen verschiedener Zucker

Um die bakterielle Kontamination der Saccharidlösungen zu untersuchen wurde der LPS-

Gehalt einiger ausgewählter Saccharide vor und nach einer Lagerung der Saccharidlösun-

gen bei 4 °C im Kühlschrank gemessen (Tabelle 8).

Nach einer längeren Lagerungsperiode zeigte sich eine drei- bis vierfach höhere LPS-Kon-

zentration in BC-D-146, Lactosucrose und Nystose als vor der Lagerung. Die geringe Zu-

nahme der LPS-Konzentration von gelagerter Raffinose im Vergleich zu den anderen Sac-

charidlösungen läßt sich durch die kürzere Lagerungszeit dieser Substanz erklären.

Tabelle 8: Veränderung der LPS-Konzentration verschiedener Saccharidlösungen

nach einer Lagerung von circa einem Monat

Saccharidlösung [100mg/ml] LPS-Konzentration der Saccharidlösung [ng/ml]

frisch gelöst nach Lagerung bei 4 °C

BC-D-146 2,8 12,5

Lactosucrose 32,2 119,3

Raffinose* 3,2 3,5

Nystose 3,1 14,9

Arabinogalactan 5,5 n.b.

Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid

n.n. n.b.

Lactose 0,11 n.b.

Methyl-α-D-mannosid 0,01 n.b.

Methyl-β-D-galactosid n.n. n.b.

Abkürzungen: n.n.: nicht nachweisbar; n.b.: nicht bestimmt; *Lagerung ca. 2 Wochen

3.3.2 Einfluß der Vorinkubation mit LPS auf die Phagozytose

Als Parameter für den stimulierenden bzw. inhibierenden Effekt von Lipopolysaccharid

auf die Phagozytose wurde der „Modulationskoeffizient der Gesamtphagozytose“ (KPh)

eingeführt. Er bezeichnet den Quotient aus der Gesamtphagozytose (= Phagozytoserate ×

3 Ergebnisse 58

mittlerer Fluoreszenzintensität) des Testansatzes mit LPS und der Gesamtphagozytose der

Kontrolle ohne LPS.

Bereits der Zusatz von Lipopolysaccharid (4,5 ng/ml Ansatz) zum heparinisierten Vollblut

ohne Vorinkubation erhöhte die Phagozytose von E.coli bei Granulozyten. Nach einer Vor-

inkubation von zehn Minuten konnte ein relevanter Anstieg der granulozytären Phagozyto-

se von opsonierten und nach zwanzig Minuten auch von nonopsonierten E.coli-Bakterien

nachgewiesen werden.

Die stärkste Stimulation der Gesamtphagozytose von opsonierten und nonopsonierten

E.coli-Bakterien bei Granulozyten wurde nach einer 45 minütigen Vorinkubation mit LPS

erreicht (Tabelle 9).

Tabelle 9: Einfluß der Vorinkubationszeit mit Lipopolysaccharid auf die Ge-

samtphagozytose (KPh) von E.coli durch Granulozyten

E.coli Vorinkubationszeit mit LPS [min]

o. LPS 0 5 10 20 30 45 60

opsoniert KPh 1,00 1,25 1,37 1,55 1,66 1,65 1,67 1,51

(ω) (0,06) (0,08) (0,11) (0,15) (0,11) (0,17) (0,16) (0,14)

KPh 1,00 1,15 1,19 1,22 1,43 1,55 1,61 1,50 non-opsoniert

(ω) (0,07) (0,11) (0,10) (0,15) (0,12) (0,19) (0,14) (0,13)

Tabelle 9: Heparinisiertes Vollblut wurde zunächst mit Lipopolysaccharid (4,5 ng/ml Ansatz) in den angege-

benen Zeitenräumen, bzw. die Kontrolle ohne LPS (o. LPS) 60 Minuten, bei 37 °C im Wasserbad vorinku-

biert und anschließend ein Phagozytose-Test mit Escherichia coli durchgeführt. Die Werte stammen aus ei-

nem repräsentativen von drei durchgeführten Versuchen. Angegeben ist der Modulationskoeffizient der

Gesamtphagozytose (KPh).

3.3.3 Einfluß der LPS-Konzentration auf die Phagozytose und den

oxidativen Burst

Die Phagozytose von Mikroorganismen, der Fc-Rezeptor abhängige und der E.coli stimu-

lierte oxidative Burst von Leukozyten stiegen in Abhängigkeit von der LPS-Konzentration

im vorinkubierten Vollblut (Tabelle 10).

Im Phagozytose-Test wurde eine sicher meßbare Stimulation (KPh ≥ 1,2) der granulozytä-

ren Aufnahme von nonopsonierten E.coli und C.albicans ab 10 ng LPS/ml Ansatz und bei

S.aureus ab 50 ng LPS/ml Ansatz bestimmt. Die Ergebnisse mit opsonierten E.coli-

3 Ergebnisse 59

(KPh = 1,34 bei 100 ng LPS/ml) und S.aureus-Bakterien (KPh = 1,38 bei 100 ng LPS/ml)

waren ähnlich.

Ebenso fand eine sicher meßbare Stimulation des Fc-Rezeptor abhängigen oxidativen

Burst (KFcB ≥ 1,2) erst ab LPS-Konzentrationen von 10 ng/ml statt.

Auch die E.coli-induzierte Produktion von Sauerstoffmetaboliten durch Granulozyten

wurde durch Lipopolysaccharid ab Konzentrationen von 10 ng LPS/ml stark stimuliert.

Allerdings nahmen gleichzeitig die Meßschwankungen im Test zu, wie aus den Spannwei-

ten in Tabelle 10 ersichtlich.

Tabelle 10: Einfluß der Konzentration von Lipopolysacchariden auf die Phagozytose,

den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst und den oxidativen Burst

von Granulozyten

LPS-Konzentration im Ansatz [ng/ml]

0 1 5 10 50 100

Phagozytose-Test

nonopsonierte E.coli KPh 1,00 1,07 1,20 1,26 1,27 1,36

(ω) (0,12) (0,09) (0,10) (0,13) (0,08) (0,19)

nonopsonierter S.aureus KPh 1,00 1,00 1,14 1,19 1,38 1,40

(ω) (0,06) (0,11) (0,05) (0,06) (0,06) (0,06)

nonopsonierte C.albicans KPh 1,00 1,05 1,05 1,21 1,20 1,25

(ω) (0,12) (0,07) (0,10) (0,20) (0,08) (0,21)

Test für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst

KFcB 1,00 1,06 1,19 1,40 1,51 1,57

(ω) (0,31) (0,17) (0,19) (0,31) (0,25) (0,43)

Test für die quantitative Bestimmung des oxidativen Burst

E.coli KB 1,00 1,03 1,47 2,48 3,68 3,01

(ω) (0,87) (0,52) (1,02) (1,16) (1,80) (2,28)

Tabelle 10: Heparinisiertes Vollblut wurde zunächst 60 Minuten mit den angegebenen Konzentrationen von

Lipopolysaccharid bei 37 °C im Wasserbad vorinkubiert und anschließend die verschiedenen Tests durchge-

führt. Ergebnisse aus einem repräsentativen von drei durchgeführten Versuchen. Angegeben ist der Modula-

tionskoeffizient der Gesamtphagozytose (KPh), des Fc-Rezeptor abhängigen oxidativen Burst (KFcB) und des

oxidativen Burst (KB) und die zugehörige Spannweite (ω).

3 Ergebnisse 60

3.4 Stimulationstests

3.4.1 Vergleich von pyrogenfreien, LPS-versetzten und LPS-

kontaminierten Sacchariden

Der im Saccharidscreening ermittelte Stimulationseffekt auf die Phagozytose von S.aureus

wurde mit den drei Sacchariden BC-D-146, Lactosucrose und Nystose und der kaum sti-

mulierenden Raffinose auch bei der Phagozytose von E.coli und C.albicans, dem Fc-

Rezeptor vermittelten und dem E.coli-stimulierten oxidativen Burst genauer untersucht.

Um den potentiellen Stimulationseffekt durch eine LPS-Kontamination der Saccharidlö-

sungen zu untersuchen, wurde ein Vergleich mit pyrogenfrei gereinigten, pyrogenfrei ge-

reinigten und anschließend gezielt mit Lipopolysaccharid (28,6 µg LPS/ml Saccharidlö-

sung bzw. 0,5 µg LPS/ml Testansatz) versetzten und LPS-kontaminierten Sacchariden (1,8

mg/ml Testansatz) durchgeführt.

Der Vergleich in Bild 21 zeigt, daß die granulozytäre Phagozytose der drei Mikroorganis-

men mit den pyrogenfrei gereinigten Sacchariden BC-D-146, Raffinose, Lactosucrose und

Nystose nicht relevant stimuliert oder inhibiert werden konnte (0,90 < KPh < 1,10). Die

Zugabe von LPS zu den pyrogenfrei gereinigten Saccharidlösungen führte mit Ausnahme

von Raffinose in ähnlichem Umfang wie die kontaminierten Saccharide zu einer Steige-

rung der granulozytären Phagozytoserate von E.coli- und S.aureus-Bakterien.

Dagegen wurde die Aufnahme von C.albicans durch Granulozyten in geringerem Ausmaß

durch LPS-versetzte oder kontaminierte Saccharide stimuliert.

Die Phagozytosestimulation durch LPS-versetzte bzw. kontaminierte Saccharidlösungen

fiel bei opsonierten E.coli bzw. S.aureus-Bakterien etwas höher aus als bei nonopsonierten.

3 Ergebnisse 61

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0Mo

dulat

ions

koef

fizien

t der

Ges

amtp

hago

zyto

se1,8

2,0

ytos

e

A

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

Modu

latio

nsko

effiz

ient d

er G

esam

tpha

gozy

tose

0

0

Bild

Hepar

ten (0,

serbad

opsoni

durchg

ge ( )

Auch

nuloz

(KFcB

Wie i

sucro

den E

BC-D-146 Raffinose Lactosucrose Nystose0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1,4

1,6

Modu

latio

nsko

effiz

ient d

er G

esam

tpha

goz

BC-D-146 Raffinose Lactosucrose Nystose

py

py

un

21: Vergleich einer Stimulation der granulo

S.aureus (B) bzw. C.albicans (C) mit pyr

kontaminierten Sacchariden

inisiertes Vollblut wurde zunächst 60 Minuten mit pyro

5 µg LPS/ml Ansatz) oder mit LPS-kontaminierten Sac

vorinkubiert. Anschließend wurde ein Phagozytose-Te

erten E.coli, S.aureus bzw. C.albicans durchgeführt. E

eführten Versuchen. Angegeben ist das Arithmetische

Spannweite ω.

der Fc-Rezeptor vermittelte und der mit E.co

yten wurde, mit Ausnahme eines geringen Sti

= 1,13; KF = 1,19), durch die pyrogenfreien S

n den Phagozytose-Tests zeigte sich bei Zuga

se und Nystose ein ähnlicher Stimulationseffe

.coli stimulierten oxidativen Burst wie bei de

B


C

1,01,
1,01,0
rogenfrei

rogenfrei + LPS
1,01,
gereinigt

zytären Phagozytose von E.coli (A),

ogenfreien, LPS-versetzten und LPS-

genfreien, pyrogenfreien und mit LPS versetz-

chariden (1,8 mg/ml Ansatz) bei 37 °C im Was-

st mit einer fünfminütigen Inkubation von

rgebnisse aus einem repräsentativen von zwei

Mittel aus zwei Einzelwerten und die zugehöri-

li stimulierte oxidative Burst von Gra-

mulationseffekts von Lactosucrose

accharide nicht signifikant moduliert.

be 0,5 µg/ml LPS zu BC-D-146, Lacto-

kt auf den Fc-Rezeptor vermittelten und

n mit LPS kontaminierten Sacchariden.

3 Ergebnisse 62

Die im Vergleich mit den anderen Sacchariden geringer mit LPS kontaminierte Raffinose-

lösung hatte auch beim oxidativen Burst der Granulozyten keine stimulierende Wirkung

(Bild 22).

0,00,20,40,60,81,01,21,41,61,82,02,2


Modu

latio

nsko

effiz

ient d

es F

cBur

st

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0


Modu

latio

nsko

effiz

ient d

es o

xidat

iven

Burs

t

A B

1,01,0 1,0

Bild 22: Vergleich einer Stimulation des Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst

(A) bzw. des E.coli stimulierten oxidativen Burst (B) mit pyrogenfreien, LPS-

versetzten und LPS-kontaminierten Sacchariden

Heparinisiertes Vollblut wurde zunächst 60 Minuten mit pyrogenfreien, mit LPS versetzten (0,5 µg LPS/ml

Ansatz) oder mit LPS-kontaminierten Sacchariden (1,8 mg Saccharid/ml Ansatz) bei 37 °C im Wasserbad

vorinkubiert. Anschließend wurde ein Test für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst bzw. zur quan-

titativen Bestimmung des oxidativen Burst mit dem Stimulus E.coli mit einer Inkubation von zehn Minuten

durchgeführt. Angegeben ist das Arithmetische Mittel aus zwei Einzelwerten und die zugehörige ( ) Spann-

weite ω aus einem durchgeführten Versuch.

3 Ergebnisse 63

3.4.2 Stimulation mit dem Echinacea-Extrakt Arabinogalaktan

Die Phagozytose insbesondere von nonopsonierten E.coli-Bakterien bei Granulozyten ließ

sich durch eine zehnminütige Vorinkubation des heparinisierten Vollblutes mit dem Poly-

saccharid Arabinogalaktan stimulieren (Bild 23).

Eine Steigerung der Aufnahme von nonopsonierten E.coli (KPh = 1,26) durch Granulozy-

ten konnte ab 2 mg/ml Arabinogalaktan gemessen werden. Mit 8 mg/ml Arabinogalaktan

wurde die maximale Aktivierung der granulozytären Gesamtphagozytose von opsonierten

(KPh = 1,21, ω = 0,08) und nonopsonierten E.coli (KPh = 1,55, ω = 0,18) erreicht. Höhere

Arabinogalaktankonzentrationen (50 mg/ml) führten dagegen wieder zu einer Inhibition

der Gesamtphagozytose von Bakterien bis auf den Kontrollwert.

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

0 10 20 30 40 50Konzentration [mg/ml]

Phag

ozyt

oser

ate

E.coliopsoniertE.colinonopsoniert

Bild 23: Einfluß der Arabinogalaktankonzentration auf die Phagozytose von E.coli

durch Granulozyten

Heparinisiertes Vollblut wurde zunächst zehn Minuten mit den angebenen Konzentrationen von Arabinoga-

laktan bei 37 °C im Wasserbad vorinkubiert und anschließend ein Phagozytose-Test mit einem Leukozyten :

Bakterien-Verhältnis von 1 : 6 und einer Inkubationszeit von zehn Minuten durchgeführt. Ergebnisse aus

einem repräsentativen von drei durchgeführten Versuchen. Angegeben ist das Arithmetische Mittel aus zwei

Einzelwerten und die zugehörige ( ) Spannweite ω.

3 Ergebnisse 64

3.5 Inhibitionstests

3.5.1 Inhibition von Leukozytenfunktionen mit pyrogenfreien Sac-

chariden

Untersucht wurde die Inhibition der Phagozytose von Mikroorganismen mit LPS-freien,

auf pflanzlicher Basis synthetisierten Sacchariden. Diese ließ sich bei nonopsonierten

E.coli-Bakterien ab circa 20 mM proportional zu den ansteigenden Konzentrationen an py-

rogenfreier Nystose, Lactosucrose, BC-D-146 und Raffinose im Vollblut hemmen. Im Ge-

gensatz zu der nur geringen Phagozytosehemmung durch Raffinose führten höhere Kon-

zentrationen (ab ca. 25 mM) an BC-D-146, Lactosucrose und Nystose zu einem annähernd

linearen Abfall der Phagozytoserate. Außerdem verminderte sich im gesamten Meßbereich

die durchschnittlich von einem einzelnen Granulozyten aufgenomme Anzahl an E.coli-

Bakterien (mittlere Fluoreszenzintensität) proportional zu den steigenden Saccharidkon-

zentrationen.

Ein Vergleich der Effekte von 40 mM Sacchariden unter allen Phagozytosepartikeln zeigte,

daß BC-D-146 insbesondere bei nonopsonierten E.coli (KPh = 0,48) die stärkste, und Raf-

finose sowie Nystose die geringste Inhibitionswirkung auf die Phagozytose der Mikroor-

ganismen hatte. Im Vergleich aller Phagozytosepartikel wurde vor allem die Aufnahme

von nonopsonierten E.coli-Bakterien gehemmt (Bild 24 A).

Außerdem wurde mit den oben genannten, pyrogenfreien Sacchariden die Inhibition des

E.coli-induzierten oxidativen Bursts gemessen. Analog ergaben diese Untersuchungen eine

Hemmung der Sauerstoffradikalproduktion von Granulozyten mit 40 mM BC-D-146 (KB =

0,56), Lactosucrose (KB = 0,63), Raffinose (KB = 0,79) und Nystose (KB = 0,81). Dagegen

wurde der PMA-stimulierte oxidative Burst von Granulozyten durch BC-D-146 (KB =

2,94), Nystose (KB = 2,31), Lactosucrose (KB = 1,89) und Raffinose (KB = 1,86) gesteigert

(Bild 24 B).

3 Ergebnisse 65

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

ops. E.coli nonops. E.coli

ops.S.aureus

nonops.S.aureus

C.albicans

Modu

latio

nsko

effiz

ient d

er G

esam

tpha

gozy

tose

Nystose

Lactosucrose

Raffinose

BC-D-146

0,0

0,5

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Modu

latio

nsko

effiz

ient d

es o

xidat

iven

Burs

t

Bild 24: Inhi

E.co

lozy

Die Saccharide

Vollblut zugege

mit PMA (Phorb

Burst durchgefü

ist das Arithmet

beim PMA-stim

B

b

l

t

(4

b

h

is

u

A
1,01,0
Nystose

Lactosucrose

Raffinose

1,01,0

E.coli PMA

BC-D-146

ition der Phagozytose von E.coli, S.aureus und C.albicans (A) sowie der

i- oder PMA-stimulierten Sauerstoffradikalproduktion (B) von Granu-

en mit pyrogenfreien, auf pflanzlicher Basis synthetisierten Sacchariden

0 mM) wurden direkt vor Testbeginn (während der Eisinkubation) dem heparinisierten

en. Anschließend wurde (A) ein Phagozytose-Test bzw. (B) ein mit Escherichia coli bzw.

ol-12-myristat-13-acetat) stimulierter Test zur quantitativen Bestimmung des oxidativen

rt. Ergebnisse aus einem repräsentativen von zwei durchgeführten Versuchen. Angegeben

che Mittel aus zwei Einzelwerten und die zugehörige ( ) Spannweite ω bzw. Einzelwerte

lierten oxidativen Burst. Abkürzungen: ops: opsoniert, nonops: nonopsoniert.

3 Ergebnisse 66

3.5.2 Inhibition mit dem Polysaccharid Fucoidan

Da das Polysaccharid Fucoidan im Saccharidscreening als stärkster Inhibitor der Phagozy-

tose von nonopsonierten E.coli-Bakterien auffiel, sollten die Saccharideffekte im folgen-

den verifiziert und näher untersucht werden. Dabei wurde bereits bei niedrigen Fucoidan-

konzentrationen ein Inhibitionseffekt nachgewiesen, der sich konzentrationsabhängig

steigern ließ (Bild 25A). In einem Vergleich zwischen den verschiedenen Mikroorganis-

men konnte gezeigt werden, daß 0,25 mg/ml Fucoidan die Phagozytose von opsonierten

(KPh = 0,26) und nonopsonierten E.coli (KPh = 0,20), sowie von nonopsoniertem S.aureus

(KPh = 0,22) in größerem Ausmaß inhibierte als die des Sprosspilzes C.albicans (KPh =

0,57) (Bild 25B).

3 Ergebnisse 67

0%

10%

20%

30%

40%

50%

0

Phag

ozyt

oser

ate

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

Modu

latio

nsko

effiz

ient d

er G

esam

tpha

gozy

tose

Bild 25: Inhibit

von de

Das Polysaccharid

Eisinkubation) dem

nopsonierten E.col

aus zwei Einzelwe

Spannweite ω aus

A

200 400 600 800Konzentration [µg/ml]

Granulozyten

Monozyten
B
ops. E.coli nonops. E.coli

nonops.S.aureus

C.albicans

0,25 mg/mlFucoidan

0,50 mg/mlFucoidan

ion der granulozytären Phagozytose mit Fucoidan (A) in Abhängigkeit

r Konzentration bei E.coli und (B) bei E.coli, S.aureus und C.albicans

Fucoidan wurde in den angegebenen Konzentrationen direkt vor Testbeginn (während der

heparinisierten Vollblut zugegeben und anschließend ein Phagozytose-Test mit (A) no-

i, (B) den angegebenen Keimen durchgeführt. Angegeben ist (A) das Arithmetische Mittel

rten, (B) der Modulationskoeffizient der Gesamtphagozytose (KPh), und die zugehörige ( )

einem Versuch. Abkürzungen: ops: opsoniert, nonops: nonopsoniert.

3 Ergebnisse 68

3.5.3 Inhibition von Leukozytenfunktionen mit als immunmodulie-

rend bekannten Sacchariden

In der Literatur wurde für 0,15 M Methyl-α-D-mannosid, D-Mannose, und N-acetyl-D-

glucosamin eine Hemmung der Interaktionen der Lektinbindungsstelle des CR3 mit dem

Fcγ-Rezeptor [45, 17] beschrieben. Außerdem sollen diese Saccharide die mit Immunkom-

plexen stimulierte Sauerstoffradikalproduktion bei Granulozyten, die aus dem Vollblut iso-

lierten wurden, inhibieren [54].

Daher sollte der Inhibitionseffekt des obengenannten Methyl-α-D-mannosids sowie von

Methyl-β-D-galactosid, Lactose, Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid und N-

Acetyllactosamin auf die granulozytäre Phagozytose von Mikroorganismen, den Fc-

Rezeptor vermittelten sowie den mit E.coli stimulierten oxidativen Burst mit unseren funk-

tionellen Tests überprüft werden. Hierzu wurden die Saccharide direkt vor Testbeginn

(während der Eisinkubation) dem heparinisierten Vollblut zugegeben.

Bei allen Sacchariden konnte eine konzentrationsabhängige Hemmung der Phagozytose

von opsonierten und nonopsonierten E.coli, S.aureus und von C.albicans bei Granulozyten

nachgewiesen werden. Bild 26A zeigt am Beispiel von Staphylococcus aureus die linear

zur N-Acetyllactosaminkonzentration sinkende Phagozytoserate.

Im Folgenden wurden die Inhibitionseffekte der obengenannten Saccharide bei einer Kon-

zentration von 100 mM unter den verschiedenen Mikroorganismen verglichen (Bild 26B).

Dabei konnte die Phagozytose von nonopsonierten E.coli durch alle Saccharide stärker ge-

hemmt werden als die von opsonierten E.coli-Bakterien. Die stärkste Hemmung wurde bei

der Phagozytose von nonopsonierten E.coli mit N-Acetyllactosamin (KPh = 0,44) und Me-

thyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid (KPh = 0,48), bei nonopsoniertem S.aureus mit

Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid (KPh = 0,54) und bei C.albicans mit Methyl-α-

D-mannosid (KPh = 0,43) erreicht. Alle anderen Saccharide zeigten im Vergleich innerhalb

eines Phagozytosepartikels kaum differierende Inhibitionseffekte.

3 Ergebnisse 69

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

0

Phag

ozyt

oser

ate

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

op

Modu

latio

nsko

effiz

ient d

er G

esam

tpha

gozy

tose

Bild 26: Inhibit

Acetyll

Saccha

(A) Das Saccharid N

nannten 100 mM Sa

Vollblut zugegeben

angegebenen Mikro

Versuchen. Angege

te ω. Abkürzungen:

Eine konzentrati

ven Burst von M

A

50 100 150 200Konzentration [mMol/l]

S.aureusopsoniertS.aureusnonopsoniert

Methyl-α-D -mannosid
B
s. E.coli nonops. E.coli

ops.S.aureus

nonops.S.aureus

C.albicans

Methyl-β-D -galactosid

β-Lactose

Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosidN-Acetyllactosamine

ion der granulozytären Phagozytose (A) in Abhängigkeit von der N-

actosamin-Konzentration bei S.aureus und (B) mit verschiedenen

riden bei E.coli, S.aureus und C.albicans

-Acetyllactosamin wurde in den angegebenen Konzentrationen bzw. (B) die obenge-

ccharide wurden direkt vor Testbeginn (während der Eisinkubation) dem heparinisierten

und anschließend ein Phagozytose-Test mit (A) Staphylococcus aureus bzw. (B) den

organismen durchgeführt. Ergebnisse aus einem repräsentativen von drei durchgeführten

ben ist das Arithmetische Mittel aus zwei Einzelwerten und die zugehörige ( ) Spannwei-

ops: opsoniert, nonops: nonopsoniert.

onsabhängige Hemmung des durch Immunkomplexe ausgelösten oxidati-

onozyten und Granulozyten konnte bei allen Sacchariden nachgewiesen

3 Ergebnisse 70

werden (Bild 27). Der Fc-Rezeptor vermittelte oxidative Burst von Granulozyten wurde in

absteigender Reihenfolge durch folgende für 100 mM interpolierten Saccharide gehemmt:

Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid (KFcB = 0,39), Methyl-β-D-galactosid (KFcB =

0,44), Methyl-α-D-mannosid (KFcB = 0,47), Lactose (KFcB = 0,52) und N-Acetyl-

lactosamin (KFcB = 0,69).

Wie am Beispiel von Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid (Bild 28A) demonstriert,

konnte auch der mit E.coli stimulierte oxidative Burst von Granulozyten durch ansteigende

Konzentrationen der obengenannten Saccharide gehemmt werden. In einem Vergleich der

Inhibitionseffekte von 100 mM Sacchariden zeigte N-Acetyllactosamin (KB = 0,24) die

stärkste Hemmung der Sauerstoffradikalproduktion von Granulozyten, wobei die anderen

Saccharide ähnliche Effekte (KB = 0,29-0,33) aufwiesen (Bild 28B).

Im Gegensatz dazu wurde der oxidative Burst mit dem Stimulus PMA vor allem bei Gra-

nulozyten durch die Saccharide von minimal KB = 2,84 mit Methyl-α-D-mannosid bis ma-

ximal KB = 4,34 mit Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid extrem gesteigert.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

0

FcBu

rstra

te

4550

t

Bild 2

Das Sa

inkubat

telten o

chen. A

Fluores

A

50 100 150 200 250Konzentration [mMol/l]

05

10152025303540

0

Mittl

ere F

luor

esze

nzin

tens

itä

7: Einfluß der Lactose-Konzentration auf

durch Immunkomplexe ausgelöste Saue

Leukozyten

ccharid Lactose wurde in den angegebenen Konzentra

ion) dem heparinisierten Vollblut zugegeben und ansc

xidativen Burst durchgeführt. Ergebnisse aus einem re

ngegeben ist das Arithmetische Mittel aus zwei Einze

zenzintensität und die zugehörige ( ) Spannweite ω.

B


die Phagozytoserate (A) und die

rstoffradikalproduktion (B) von

tionen direkt vor Testbeginn (während der Eis-

hließend ein Test für den Fc-Rezeptor vermit-

präsentativen von drei durchgeführten Versu-

lwerten der Phagozytoserate bzw. der mittleren

3 Ergebnisse 71

0,00,51,01,52,02,53,03,54,04,55,0


Mittl

ere F

luor

esze

nzin

tens

ität

Monozyten

Granulozyten

0,0

0,5

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

Modu

latio

nsko

effiz

ient d

es o

xidat

iven

Burs

t

01 0

Bild 28: Inhib

Abhä

gluco

(A) Das Sacchar

Testbeginn (wäh

Test zur quantita

12-myristat-13-a

chen. Angegeben

B

A

Methyl-α-D -mannosid

Methyl-β-D -galactosid

β-Lactose

Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-
1,,
E.coli PMA

glucosid

N-Acetyllactosamine

ition der Produktion von Sauerstoffmetaboliten bei Granulozyten (A) in

ngigkeit von der Konzentration an Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-

sid und (B) mit verschiedenen Sacchariden

id wurden in den angegebenen Konzentrationen bzw. (B) die 100 mM Saccharide direkt vor

rend der Eisinkubation) dem heparinisierten Vollblut zugegeben. Anschließend wurde ein

tiven Bestimmung des oxidativen Burst mit (A) E.coli bzw. (B) ) E.coli und PMA (Phorbol-

cetat) durchgeführt. Ergebnisse aus einem repräsentativen von drei durchgeführten Versu-

ist das Arithmetische Mittel aus zwei Einzelwerten und die zugehörige ( ) Spannweite ω.

4 Diskussion Bei der Immunabwehr gegen mikrobielle Infektionen spielt die schnelle Erkennung, Bin-

dung und Eliminierung von Pathogenen eine wichtige Rolle. Zu Beginn einer Infektion

stellen insbesondere die spezifischen Interaktionen zwischen Lektinen auf Phagozyten-

oberflächen und komplementären Kohlenhydraten auf Bakterien und umgekehrt einen kri-

tischen Schritt bei der Erkennung und Bindung der Bakterien dar. Die Aufnahme von Mi-

kroorganismen über Kohlenhydrat- und Lektin-abhängige Zellinteraktionen wurde von

Ofek und Sharon als Lektinophagozytose bezeichnet. Weiterhin beschrieben sie die Mög-

lichkeit der Mikrobenbindung über eine Brücke aus löslichen Lektinen oder Zuckern an die

Phagozyten [43, 55]. Demzufolge könnten Functional Food Saccharide zu einer verstärkten

Bakterienbindung an Phagozytenoberflächen beitragen (Bild 29 B). Andererseits würde die

kompetitive Hemmung der Bakterienadhäsion durch Functional Food Saccharide zu einer

verminderten Pathogenaufnahme führen (Bild 29 C).

Auf der Grundlage dieses Modells wäre durch Functional Food Saccharide eine gezielte

Stimulation bzw. Hemmung der Kohlenhydrat- und Lektin-vermittelten Interaktionen zwi-

schen Phagozyten und Mikroorganismen und damit der Mikrobenaufnahme und -abtötung

möglich.

B

(

u

o

A

Lektin

Bakterium

Oberflächen- glykan

Phagozyt

ild 29: Mechanismen der Bin

A) Bindung von bakteriellen Lektine

ms über eine aus einem Functional F

n durch Functional Food Saccharide

B

Functional Food Saccharid

dung von Mikroorganismen

n an Oberflächenglykane auf Phagoz

ood Saccharid bestehende Brücke, (C

[56]

C

Functional Food Saccharide

an Wirtszellen

yten, (B) Bindung eines Bakteri-

) Inhibition der Bakterienadhäsi-

4 Diskussion 73

Eine Beeinflussung der Phagozytose und des oxidativen Burst durch Saccharide kann zum

einen über eine Verstärkung bzw. Hemmung der Mikrobenbindung an den Mannose-, Ga-

lactose-Rezeptor oder die Lektinbindungsstelle des Komplementrezeptors Typ 3 (CR3) auf

Phagozyten erreicht werden [35].

Des weiteren ist eine Hemmung von lektinvermittelten Rezeptorinteraktionen bei der Si-

gnaltransduktion durch Functional Food Saccharide denkbar, wie dies von Petty et al. po-

stuliert wurde. Sie stellten die Hypothese auf, daß die Lektinbindungsstelle des CR3 mit

vielen Komponenten, unter anderem GPI-verknüpften Rezeptoren (Bild 30), β-Glucan,

Zymosan und E.coli interagiert. Saccharide wie N-acetyl-D-glucosamin, α-Methyl-D-

mannosid und β-Glucan, die an die Lektinbindungsstelle des CR 3 binden, seien demnach

in der Lage, die Verbindung von GPI-verankerten Proteinen mit Integrinen zu blockieren

und in Folge die Leukozytenaktivierung zu beeinflussen [45].

C3bi-Bindungsstelle

Lektin-bindungsstelle

Fc-Bindungsstelle

C3bi-Bindungsstelle

Lektin-bindungsstelle

Fc-Bindungsstelle

Bild 30: Modell einer CR3

Abkürzungen: CR3: Komplemen

Durch die Interaktionen vo

der Komplementrezeptor in

geprimte CR3 kann anschli

zum Beispiel iC3b-behüllte

primten Zustand in der Lag

opsonierten Bakterien einz

CR 3

CHOCHO

-FcγR-Interaktion [5

trezeptor Typ 3; GPI: Gly

n Kohlenhydraten mit

einen rezeptiven Zus

eßend durch ein zweit

Partikel, aktiviert we

e, die Phagozytose un

uleiten, die ohne ein P

FcγR

ZytoskelettZytoskelett

4]

cosylphosphatidylinositol; CHO: Kohlenhydrat

der Lektinbindungsstelle des CR3 kann

tand versetzt werden („Priming“). Dieser

es, auslösendes Signal („Trigger“), wie

rden. Der Komplementrezeptor ist im ge-

d intrazelluläre Abtötung von iC3b-

riming nicht möglich gewesen wäre.

4 Diskussion 74

Vorteil dieses selektiven Primings des CR3 mit Kohlenhydraten ist, daß keine unspezifi-

sche Leukozytenaktivierung durch die Freisetzung von Zytokinen und somit keine inflam-

matorische Reaktion stattfindet [49]. Dagegen führt das Priming von polymorphkernigen

Leukozyten mit LPS, TNF-α oder PMA zur Erhöhung der Chemotaxis, der Exprimierung

bestimmter Leukozytenrezeptoren, der Substratadhäsion, der Phagozytose, des oxidativen

Burst und der Degranulation [66].

Im Gegensatz zu den meisten mit Zelllinien oder isolierten Granulozyten durchgeführten

Studien untersuchten wir den Effekt von Sacchariden auf Phagozytenfunktionen mit funk-

tionellen Testverfahren in humanem Vollblut, um eine artifizielle Aktivierung oder Hem-

mung der Leukozyten zu vermeiden. Die Testverfahren erfassen die komplexen,

multifunktionellen Rezeptor-Ligand-Interaktionen bei der Bindung von Mikroorganisme

an humane Phagozyten und reflektieren so am ehesten die in vivo-Situation der

angeborenen Imm

n

unabwehr.

Die Fähigkeit von neutrophilen Granulozyten zur Extravasation aus dem Blut und zur Mi-

gration ins Darmlumen und die subepitheliale Mukosa des Magen-Darm-Trakts [24, 21]

machen die Phagozyten im humanen Vollblut zu einem geeigneten Modell, um die Effekte

von Functional Food Sacchariden auf das gastrointestinale Immunsystem des Menschen zu

erforschen. Zudem wurde mit den aus humanen Monozyten kultivierten Makrophagen ein

weiteres physiologisches Zellmodell für die Mucosa-assoziierten Phagozyten geschaffen.

Untersucht werden sollte, ob sich chemisch bzw. enzymatisch synthetisierte Saccharide

pflanzlichen Ursprungs als Functional Food eignen und als Bestandteile einer normalen

Ernährung zu einer Modulation des angeborenen Immunsystems im Gastrointestinaltrakt

beitragen können. Diese Saccharide werden im Dünndarm nicht oder nur partiell durch

Verdauungsenzyme hydrolisiert, wie dies von der Südzucker AG mit in-vitro-Methoden

für die pH-Stabilität (Magen) und die Spaltbarkeit durch Pankreatin, Saccharase und Mal-

tase (dünndarmständige Enzymkomplexe) geprüft wurde. Die Substanzen erreichen des-

halb den Dickdarm, wo sie durch Dickdarmbakterien fermentiert werden.

Ergänzend wurden Saccharide eingesetzt, welche nach Literatur in der Lage sein sollten,

einzelne Lektin-Kohlenhydrat-Interaktionen zu stimulieren bzw. zu hemmen.

4 Diskussion 75

4.1 Testbedingungen


Polymorphkernige neutrophile Granulozyten und aus Monozyten herangereifte Makropha-

gen, die in großer Zahl im Gastrointestinaltrakt zu finden sind, spielen in allen Phasen der

Immunabwehr eine wichtige Rolle. Sie können nicht nur mit Antikörpern oder Komple-

ment opsonierte Mikroorganismen phagozytieren, sondern erkennen viele Mikrobenbe-

standteile direkt über Lektin-Kohlenhydrat Interaktionen [20]. Daher spielen Mannose-,

Fucose-, N-Acetyl-glucosamin-, Galactose- und β-Glucan-spezifische Lektine eine Schlüs-

selrolle bei der Aufnahme von Mikroorganismen [35]. Mit dem Phagozytose-Test sollte

der stimulierende bzw. hemmende Effekt von Functional Food Sacchariden auf die Lektin-

Kohlenhydrat-Interaktionen zwischen Phagozyten und Mikroorganismen bei der Ingestion

verschiedener Pathogene untersucht werden.

Zum Nachweis einer potentiellen Phagozytosestimulation durch Saccharide wurden diese

mit dem Vollblut vorinkubiert. Somit sollte eine „Phagozytoseaktivierung“ bzw. ein „Pri-

ming“ durch die Bindung der Saccharide an entsprechende Lektine auf den Phagozyten

ermöglicht werden. Eine artifizielle Veränderung der Phagozytoserate oder der mittleren

Fluoreszenzintensität von Leukozyten durch die Vorinkubation über sechzig Minuten

konnte in Kontrollversuchen ausgeschlossen werden. Erst nach einer zweistündigen Vorin-

kubation konnte ein Abfall der Phagozytoserate nachgewiesen werden, der vermutlich auf

eine Adhärenz der Phagozyten an die Probengefäße zurückzuführen ist.

Aufgrund der unterschiedlichen Zuckerspezifität der an der Mikrobenbindung beteiligten

Zelloberflächenlektine, wurde der Phagozytose-Test mit drei verschiedenen Mikroorgan-

gismen (E.coli, S.aureus und C.albicans) durchgeführt (siehe Tabelle 1, Kapitel 1.1). An

der Aufnahme von Escherichia coli ist beispielsweise die Lipid A-Region von LPS betei-

ligt, die bei gramnegativen Enterobakterien in großem Umfang konserviert ist und bei

grampositiven Bakterien wie Staphylococcus aureus fehlt. Sie besteht aus einem β-1‘,6-

verbundenen D-Glucosamin Disaccharid, das in den Positionen 1 und 4‘ phosphoryliert ist

(Bild 31) und an den Phagozytenrezeptor CD14 bindet [64].

4 Diskussion 76

O

O

O

O

NH P

O

O-

O-

HO

O

O

O

O

NH

P

O

-O

-O

OHO O

HO

OO

OOO

O

Bild 31: Chemische Struktur der Lipid A-Region von Lipopolysaccharid

Dagegen besteht die Zellwand des Sproßpilzes Candida albicans hauptsächlich aus Man-

nan (einem α-gebundenen Mannosepolymer), Glucan (einer β-verknüpften, verzweigten

Polysaccharidkette aus Glucose) und Chitin (einem vorwiegend aus N-Acetyl-D-

glucosamin bestehenden, zelluloseähnlichen Polymer). Die Bindung der Mannosereste in

der Zellwand von C.albicans an den Mannose-Rezeptor auf Makrophagen ermöglicht die

Phagozytose dieser Hefezellen [38]. Demzufolge erlaubt der Einsatz verschiedener Phago-

zytosepartikel Rückschlüsse auf die Spezifität der Saccharide bei der Stimulation bzw. In-

hibition der Phagozytose von Mikroorganismen.

Um die Rezeptorspezifität der Saccharide zu überprüfen wurde der Test mit opsonierten

und nonopsonierten Bakterien aufgebaut, da bekannt ist, daß Lektin-Kohlenhydrat Interak-

tionen vor allem bei niedrigen Serumopsoninkonzentrationen wichtig sind. Dabei mußte

berücksichtigt werden, daß es im Verlauf der Inkubationszeit zu einer sekundären Opsonie-

rung der initial nonopsonierten Mikroorganismen durch die Opsonine im Serum kommt.

Deshalb wurden für die Tests kurze Inkubationszeiten von fünf bis zehn Minuten ange-

setzt, bei denen die nonopsonierten Mikroorganismen eine, im Vergleich zu in-vitro prä-

opsonierten Partikeln, deutlich geringere Phagozytoserate aufwiesen.

Die Konzentration und Inkubationszeit der Mikroorganismen wurden so standardisiert, daß

die Phagozytose der Leukozyten bei einem Überschuß an freien Partikeln einen nahezu

linearen Anstieg zeigte. Auf diese Weise wurden auch kleinere Stimulations- bzw. Inhibi-

tionseffekte der Saccharide erkannt, die in der Sättigungsphase aufgrund des Verbrauchs

der freien Phagozytosepartikeln nicht mehr nachgewiesen werden konnten.


In der Literatur wurde eine Hemmung der durch Immunkomplexe ausgelösten Sauerstoff-

radikalproduktion von neutrophilen Granulozyten mit Sacchariden beschrieben [71].

4 Diskussion 77

Der Inhibitionseffekt der Saccharide setzt, nach der Bindung der Immunkomplexe an die

Fcγ-Rezeptoren der Phagozyten, auf der Ebene der Signaltransduktion ein. Durch die kom-

petitive Bindung bestimmter Kohlenhydrate an die Lektinbindungsstelle des Komplement-

rezeptors Typ 3 kommt es zu einer Hemmung der Rezeptorinteraktion des GPI-verankerten

Fcγ-Rezeptors mit der Lektinbindungsstelle des CR3 (Bild 30 Kapitel 4; Tabelle 2 Kapitel

1.3) und somit zur Unterbrechung der Signalleitung [45]. Auf diese Weise konnte eine

Hemmung der Sauerstoffradikalproduktion von neutrophilen Granulozyten mit Functional

Food Sacchariden auftreten. Eine Erhöhung des oxidativen Burst wäre über eine Kostimu-

lation der Interaktion des Fcγ-Rezeptors mit dem CR3 durch Saccharide vorstellbar.

Die Konzentration der Immunkomplexe und die Inkubationszeit wurden auch beim Fc-

Rezeptor abhängigen oxidativen Burst so gewählt, daß die FcBurstrate und die mittlere

Fluoreszenzintensität der Leukozyten im linearen Anstieg der Sättigungskurve lagen. Dies

ermöglichte auch die Erkennung kleinerer Stimulations- bzw. Inhibitonseffekte der Sac-

charide, die in der Phase der maximalen Sauerstoffradikalproduktion kaum detektierbar

waren.

4.1.3 Test zur quantitativen Bestimmung des oxidativen Burst

In diesem Test konnte die Produktion von reaktiven Sauerstoffmetaboliten gemessen wer-

den, die durch eine Bindung von nonopsonierten E.coli-Bakterien an die entsprechenden

Rezeptoren auf Granulozyten induziert wurde. Bei der Bindung von E.coli an die Granulo-

zyten spielen die gleichen lektinähnlichen Rezeptoren wie bei der Phagozytose des Bakte-

riums eine Rolle. Die kompetitive Inhibition bzw. Stimulation der Lektin-Kohlenhydrat-

Interaktionen zwischen dem Bakterium und den Phagozyten mit Functional Food Saccha-

riden hat somit eine Hemmung bzw. Steigerung der Sauerstoffradikalproduktion von Neu-

trophilen zur Folge.

Um die Rezeptorspezifität der Saccharide bei der Modulation der Lektin-Kohlenhydrat-

Interaktionen zu überprüfen, wurden neben dem partikulären Stimulus E.coli zwei weitere

Stimuli mit anderen Wirkungsmechanismen eingesetzt. Zum einen das chemotaktische

Tripeptid N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), das strukturell bakteriellen Peptiden ähnelt und

an spezifische fMLP-Rezeptoren auf der Phagozytenoberfläche bindet. Dieses Tripeptid

stimulierte den oxidativen Burst von Granulozyten allerdings so gering, daß es zur Kon-

trolle der Spezifität von Saccharideffekten ungeeignet war. Dagegen ist PMA eine chemi-

4 Diskussion 78

sche Substanz, die unter Umgehung einer Rezeptorbindung spezifische Enzyme der

Signaltransduktionskette (z.B. Proteinkinase C) aktiviert [7].

Wie in den vorangehenden Test wurde die Konzentration und Inkubationszeit des Stimulus

E.coli so standardisiert, daß eine submaximale Sauerstoffradikalproduktion der Granulozy-

ten erreicht wurde, und somit auch ein geringerer Modulationseffekt des oxidativen Burst

durch die Saccharide gemessen werden konnte.

4.1.4 Phagozytose-Test mit Makrophagen

Neben dem Komplementrezeptor Typ 3 und CD14, die auch auf Neutrophilen und Mono-

zyten vorkommen, exprimieren Makrophagen weitere wichtige Lektine, wie den Mannose-

Rezeptor und verschiedene Scavenger-Rezeptoren [1, 35], für die Erkennung und Bindung

von Mikrobenbestandteilen. Da diese Zellen zusammen mit den polymorphkernigen neu-

trophilen Leukozyten eine Schlüsselrolle bei der angeborenen Immunreaktion im sube-

pithelialen Bindegewebe des Gastrointestinaltraktes spielen, wurde der Phagozytose-Test

auch für den Einsatz von Makrophagen, die aus humanen Monozyten kulitiviert wurden,

adaptiert. Die Saccharideffekte bei der Phagozytose von E.coli, S.aureus und C.albicans

bei Makrophagen werden derzeit untersucht.

4.2 Auswirkung der LPS-Kontamination von Saccharidlö-

sungen Im Screening mit 27 Sacchariden sollten deren stimulierende bzw. inhibierende Effekte auf

die Phagozytose von E.coli und S.aureus erforscht werden. Wegen der trotz hoher Testprä-

zision (Tabelle 3 Kapitel 2.4.4) schlechten Reproduzierbarkeit der Ergebnisse bei S.aureus

mußte ein artifizieller Effekt angenommen werden. Bei der Ursachenabklärung kamen un-

ter anderem Differenzen im Ansprechen der Leukozyten von verschiedenen Blutspendern

in Frage. Diese könnten beispielsweise auf der individuellen Ausbildung des immunologi-

schen Gedächtnisses durch frühere Kontakte mit Pathogenen oder einer latent gesteigerten

Immunabwehr ohne klinisch manifeste Infektzeichen beruhen. Durch den Einsatz des

Vollblutes von ausschließlich gesunden Spendern sollten diese Störgrößen minimiert wer-

den. Außerdem wurden bei der Bestimmung der Testpräzision die Schwankungen zwi-

schen den verschiedenen Blutspendern mitberücksichtigt.

Nach der Abklärung der möglichen Störgrößen des Tests konnte als Ursache eine Verun-

reinigung der eingesetzten Saccharidlösungen mit bakteriellem Lipopolysaccharid nach-

gewiesen werden. Lipopolysaccharide sind für ihre Stimulation von Funktionen der ange-

4 Diskussion 79

borenen Immunabwehr bekannt. Sie binden an CD14, ein GPI-verankertes Membranprote-

in, das auf Makrophagen und Monozyten stark, und auf polymorphkernigen Granulozyten

schwach exprimiert ist, und bei der Signaltransduktion mit dem Integrin CR3 interagiert.

Auf diese Weise kommt es durch LPS zu einer gesteigerten Zelladhäsion und Phagozytose

von Bakterien, sowie zur Auslösung proinflammatorischer Reaktionen [22, 45].

Demgemäß konnte in unseren Tests durch eine Vorinkubation des Vollblutes mit LPS ein

Anstieg der granulozytären Phagozytose von E.coli, S.aureus und C.albicans, des Fc-

Rezeptor vermittelten und des E.coli stimulierten oxidativen Burst erzielt werden. Analog

wurde eine konzentrationsabhängige Stimulation der Phagozytose und des oxidativen

Burst von Neutrophilen mit 5 bis 100 ng/l LPS gezeigt. Somit konnten wir nachweisen,

daß die von Böhmer et al. beschriebene, konzentrationsabhängige Stimulation (0,1 – 100

mg /l LPS) der Phagozytose von S.aureus bei Neutrophilen [6] bereits ab LPS-

Konzentrationen von 10 ng/l ausgelöst werden kann und ebenso auf die Phagozytose von

E.coli-Bakterien und C.albicans übertragbar ist.

Auch eine Stimulation des mit fMLP ausgelösten oxidativen Bursts von isolierten Neutro-

philen mit 200 mg/l LPS war von Leet und Mitarbeiter beschrieben worden [31]. Unsere

Untersuchungen zeigten, daß bereits 5 ng/l LPS zu einer relevanten Erhöhung des mit Im-

munkomplexen und insbesondere des mit E.coli-Bakterien ausgelösten oxidativen Burst

von Granulozyten im Vollblut führen.

Demzufolge muß bei der Untersuchung der Saccharideffekte auf die Phagozytose und den

oxidativen Burst von Leukozyten eine artifizielle Stimulation durch Lipopolysaccharid

ausgeschlossen werden. Dies sollte bei der Herstellung und Aufarbeitung der Saccharide

sowie bei der Testdurchführung berücksichtigt werden.

4.3 Stimulation von Leukozytenfunktionen mit Sacchari-

den Im Saccharidscreening wurde mit BC-D-146, Lactosucrose, BC-O-192, Chitopentaose,

Nystose und Lactose eine relevante Stimulation der Phagozytose von S.aureus gemessen.

Aufgrund der inkonstanten Testergebnisse wurde anhand der drei stimulierenden Sacchari-

de BC-D-146, Lactosucrose und Nystose, sowie der kaum modulierenden Raffinose ver-

sucht, einen unspezifischen Stimulationseffekt nachzuweisen. Dabei konnte gezeigt wer-

den, daß die Saccharidlösungen der als stimulierend ermittelten Saccharide BC-D-146,

Lactosucrose und Nystose eine höhere Kontamination mit LPS aufwiesen als die von Raf-

finose. Um nun das Ausmaß des artifiziellen Stimulationseffektes durch die LPS-

4 Diskussion 80

Kontamination in den funktionellen Tests beurteilen zu können, wurde ein Vergleich zwi-

schen den pyrogenfreien, den pyrogenfrei gereinigten und anschließend gezielt mit bakte-

riellem LPS versetzten und den mit LPS kontaminierten Saccharidlösungen gemacht. Da-

bei konnte bestätigt werden, daß die LPS-freien Saccharidlösungen keine relevante

Stimulation der Phagozytose und des oxidativen Burst hervorrufen. Dagegen ließ sich der

Stimulationseffekt der kontaminierten Saccharidlösungen durch den Zusatz von bakteriel-

lem LPS zu den pyrogenfrei gereinigten Saccharidlösungen rekonstruieren, so daß die im

Screening gemessene Erhöhung der Phagozytose durch obengenannte Saccharide vor al-

lem auf einen unspezifischen Stimulationseffekt von Lipopolysaccharid zurückgeführt

werden konnte. Die schwächere Stimulationswirkung von kontaminierter gegenüber mit

LPS versetzter, pyrogenfreier Raffinose erklärt sich durch den geringeren LPS-Gehalt die-

ser Saccharidlösung (Tabelle 8). Bei den anderen Saccharidlösungen war die Kontaminati-

on durch eine längere Lagerung und die wiederholte unsterile Entnahme dagegen höher.

Trotz der relativ hohen Saccharidkonzentration von 1,8 mg/ml konnte in diesen Untersu-

chungen kein relevanter Stimulationseffekt von pyrogenfreien Sacchariden auf zentrale

Leukozytenfunktionen nachgewiesen werden. Dagegen verdeutlichen diese Ergebnisse die

artifizielle Stimulation der Phagozytose von Mikroorganismen und des oxidativen Burst

von Granulozyten durch geringe Verunreinigungen der synthetisch hergestellten Sacchari-

de mit LPS.

In der Phytotherapie werden die ethanolischen Echinacea purpurea-Extrakte wegen ihrer

Stimulation des unspezifischen Immunsystems zur Stärkung der körpereigenen Abwehr-

kräfte und Prophylaxe bei Infektanfälligkeit eingesetzt. In-vivo-Studien zeigten eine ma-

ximale Stimulierung der Phagozytose bei Granulozyten am vierten oder fünften Tag der

oral oder intravenös applizierten Echinacea-Extrakte. Bei in-vitro-Versuchen wurde ge-

zeigt, daß Echinacea-Lösung in Konzentrationen zwischen 10-4 und 10-7 ml/ml Versuchs-

ansatz zu einer Steigerung der Phagozytose und in Konzentrationen von 10-1 bis 10-3 ml/ml

zu einer dosisabhängigen Suppression führten [26]. Obwohl bisher kein genauer Wir-

kungsmechanismus nachgewiesen werden konnte wird angenommen, daß ein in Echinacea

purpurea-Extrakten enthaltenes, saures Arabinogalaktan für die immunstimulierende

Wirkung der Echinacea-Präparate verantwortlich ist [5]. Dieses Polysaccharid konnte in-

vitro und in-vivo die Phagozytose von Leishmania enriettii [37], sowie die Freisetzung von

TNF-α, Interleukin-1 und Interferon-α bei isolierten Mausmakrophagen erhöhen [4].

4 Diskussion 81

Diese von Beuscher et al. bei isolierten Mausmakrophagen beschriebene Stimulation der

Bakterienphagozytose durch Arabinogalaktan konnten wir in unseren funktionellen Test-

verfahren auch bei humanen Granulozyten im Vollblut nachweisen. Allerdings waren für

eine relevante Steigerung der Aufnahme von nonopsonierten E.coli-Bakterien (KPh = 1,55)

durch humane Granulozyten Arabinogalactankonzentrationen bis 8mg/ml im Ansatz not-

wendig. Dies kann bei oraler Zufuhr von Echinacea-Päparaten lediglich lokal im Darmlu-

men, jedoch nicht systemisch erreicht werden.

Die stärkere Steigerung der Phagozytose nonopsonierter Bakterien im Vergleich zu opso-

nierten mit dem lektinbindenden Arabinogalactan bestätigt die spezifische Wirkung dieses

Polysaccharids und zeigt, daß Lektin-Kohlenhydrat-Interaktionen bei der Bindung und

Aufnahme nonopsonierter Partikeln eine zentrale Rolle spielen. Da bis zu 80 % der Neu-

tralzucker-Bausteine von pflanzlichen Arabinogalaktanen oder Arabinogalaktanproteinen

aus Galaktose und Arabinose bestehen [5], wäre die Bindung der Arabinogalaktane über

ein Galactose-spezifisches Lektin (Galectin) denkbar. Beispielsweise wurde auf Ma-

krophagen ein 42-kDa großer Galactose-Rezeptor mit nahezu gleicher Affinität für end-

ständige Galactose- und N-Acetyl-Galactosamin-Reste von Oligosacchariden identifiziert.

Diesem Rezeptor wurde auch eine potentielle Beteiligung bei der Phagozytose von Mi-

kroorgansimen zugeschrieben [35]. Demnach wäre durch eine Vorinkubation der Phagozy-

ten mit Arabinogalactan eine Bindung des Polysaccharids an ein Galactose-spezifisches

Lektin möglich, die in Folge zu einer Arabinogalactan-vermittelten Bindung von Bakterien

bzw.einer Aktivierung von Leukozytenfunktionen führen könnte.

Dagegen könnte die geringere Steigerung der Phagozytose von opsonierten E.coli durch

Arabinogalactan auf der primären Bindung und Aufnahme der Bakterien über kohlenhy-

dratunabhängige Rezeptorinteraktionen beruhen. So wird über die Bindung von iC3b- und

IgG-opsonierten Bakterien an die iC3b-Bindungsstelle des CR3, den CR4 bzw. den trans-

membranären FcγRIIA (CD32A) auf polymorphkernigen Leukozyten direkt die Phagozy-

tose von Bakterien und der oxidative Burst ausgelöst [18]

Bei der Interpretation der Stimulationseffekte von Arabinogalaktan muß jedoch berück-

sichtigt werden, daß in der frisch gelösten Arabinogalaktanlösung Lipopolysaccharid in

einer Konzentration von 5,5 ng/ml nachgewiesen wurde. Da aber LPS bei diesen geringen

Konzentrationen in unseren Stimulationsversuchen keine relevante Steigerung der Phago-

zytose hervorrief, ist ein Stimulationseffekt von LPS wenig wahrscheinlich.

4 Diskussion 82

4.4 Inhibition von Leukozytenfunktionen mit Sacchariden Die Untersuchungen des hemmenden Effektes von pyrogenfreien, auf pflanzlicher Basis

synthetisierten Sacchariden ergaben, mit Ausnahme des geringen Inhibitionseffektes von

pyrogenfreier Raffinose, eine konzentrationsabhängige Hemmung der Phagozytose von

nonopsonierten E.coli-Bakterien mit BC-D-146, Lactosucrose und Nystose ab circa 25

mM. Ein Vergleich unter allen Mikroorganismen zeigte, daß bei allen Partikeln, aber ins-

besondere bei nonopsonierten E.coli-Bakterien, mit 40 mM BC-D-146 die stärkste Hem-

mung der Phagozytose möglich war. Das Saccharid weist als ein Baustein Gluconsäure

auf, welches die Funktionalität erhöht. Diese Eigenschaft könnte der Grund für die höhere

Affinität des Moleküls an Phagozytenrezeptoren, wie zum Beispiel den CR3, der unter an-

derem Glucose-haltige Saccharide bindet, sein.

Abgesehen von dem Inhibitionseffekt mit BC-D-146 bei nonopsonierten E.coli und der

fehlenden Wirkung von Raffinose und Nystose bei opsonierten S.aureus-Bakterien, waren

die Hemmeffekte der vier Saccharide bei Betrachtung des jeweiligen Mikroorganismus

relativ ähnlich. Dieses Ergebnis ist bemerkenswert, da von strukturdifferenten Zuckern un-

terschiedliche Inhibitionseffekte bei der Phagozytose von Mikroorganismen erwartet wur-

den (Bild 32).

O

HO

OH

HOO

OH

O

HO O

HO OH

OH OHO

HOOH

O

HO

OH

HOO

OH

OOHO

OH

OHO

HO

HO OH

OH

O

HO

OH

HOO

OH

O

HO

OH

HOO

O

HO

OH

HOO

OHO

HO

OH

OH

A B C

Bild 32: Strukturformeln von Raffinose (A), Lactosucrose (B) und Nystose (C)

Andererseits kann vor allem bei höheren Saccharidkonzentrationen von 30-100 mM ein

unspezifischer Hemmeffekt nicht sicher ausgeschlossen werden. Dieser könnte durch die

Adsorption der Zucker an die Zelloberfläche und folglich eine Blockade von Phagozyten-

rezeptoren bedingt sein. Gegen diese unspezifische Zuckeradsorption, bei der eine ähnliche

Hemmwirkung der granulozytären Phagozytose von nonopsonierten E.coli-Bakterien

durch alle vier getesteten Saccharide zu erwarten wäre, spricht jedoch die geringere Hem-

4 Diskussion 83

mung durch Raffinose. Eine unspezifische Inhibition könnte auch auf einem osmotischen

Effekt der Zucker mit Veränderungen der Zellmorphologie von Phagozyten beruhen. Die

Streulichteigenschaften der Monozyten und Granulozyten, als Maß für die Zellgröße waren

allerdings bei Saccharidkonzentrationen bis 50 mM im Vergleich zur Kontrolle unverän-

dert. Außerdem kam es zu keiner Anfärbung der Leukozyten mit dem Fluoreszenzfarbstoff

Propidiumjodid, welcher nur für Membranen geschädigter Zellen permeabel ist, so daß bei

diesen Konzentrationen die Integrität der Zellmembran erhalten blieb. Demnach ist eine

unspezifische Hemmung der Phagozytose bei Granulozyten durch einen osmotischen Sac-

charideffekt unwahrscheinlich.

Auch die mit E.coli stimulierte Sauerstoffradikalproduktion von Granulozyten konnte

durch 40 mM pyrogenfreie BC-D-146 (KB = 0,56) und Lactosucrose (KB = 0,63) gehemmt

werden. Als Mechanismus der Inhibitonswirkung von Sacchariden beim oxidativen Burst

ist einerseits eine Hemmung der Bindung des Stimulus E.coli an entsprechende lektinähn-

liche Rezeptoren auf der Oberfläche von Granulozyten denkbar. Andererseits wäre eine

Blockierung der Interaktion von GPI-verankerten Phagozytenrezeptoren, wie dem Fcγ-

Rezeptor Typ III oder dem LPS-Rezeptor (CD14), mit dem Komplementrezeptor Typ 3 bei

der Signaltransduktion denkbar (Bild 3 und Tabelle 2, Kapitel 1.5), so daß die Auslösung

der Sauerstoffradikalproduktion verhindert werden würde.

Eine systemische Wirkung dieser als Functional Food zugeführten Saccharide ist nach un-

seren Untersuchungen kaum möglich, da für einen meßbaren Saccharideffekt die Serum-

konzentration mindestens 25 mM erreichen müßte. Obwohl es bisher kaum Daten dazu

gibt, ist eine gastrointestinale Resorption von intakten Oligosacchariden in größerem Um-

fang eher unwahrscheinlich. Allerdings könnten die in die Darmmukosa ausgewanderten

Granulozyten bei oraler Zufuhr der Functional Food Saccharide im Gastrointestinaltrakt

lokal mit hohen Saccharidkonzentrationen in Kontakt kommen.

Andererseits ist der Einsatz unphysiologisch hoher Saccharidkonzentrationen in den funk-

tionellen Tests sinnvoll, um einen Anhalt für die Struktur-Funktionsbeziehungen einzelner

Mono- bzw. Oligosaccharide bei der Modulation zentraler Leukozytenfunktionen zu be-

kommen. Denn trotz der relativ niedrigen Affinität der einzelnen Monosaccharidbausteine

von Polysacchariden und Glykokonjugaten können diese durch die simultane Adhäsion an

multiple Bindungsstellen (Multivalenz) eine hohe Avidität erreichen [51, 67, 71]. Die mul-

tivalente Bindungsfähigkeit der Polysaccharide würde den Einsatz geringerer Saccharid-

konzentrationen mit der gleichen Wirkung wie höhere Konzentrationen an Mono- und Oli-

4 Diskussion 84

gosacchariden ermöglichen, und könnte in Zukunft bei der Synthese von Functional Food

Sacchariden genutzt werden.

Neben den obengenannten Sacchariden wurde mit Methyl-α-D-mannosid, Methyl-β-D-

galactosid, Lactose, Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid und N-Acetyllactos-

amin eine Blockade von Leukozytenfunktionen im Vollblut untersucht. Methyl-α-D-

mannosid ist in der Literatur als Inhibitor von Lektin-vermittelten CR3-FcγRIII-Inter-

aktionen [45, 17], sowie der Immunkomplex-stimulierten Sauerstoffradikalproduktion bei

aus dem Vollblut isolierten Granulozyten [54] bekannt.

Bei der Hemmung der Phagozytose von Mikroorganismen, als auch bei der Fc-Rezeptor

vermittelten und der E.coli-stimulierten Sauerstoffradikalproduktion durch obengenannte

Saccharide spielen vermutlich ähnliche biochemische Mechanismen eine Rolle. Die Pha-

gozytose von Mikroorganismen wird ebenso wie der E.coli-stimulierte oxidative Burst

durch die Bindung der Bakterien an lektinähnliche Rezeptoren, Komplement- und Fcγ-

Rezeptoren auf Granulozyten induziert. Auch beim Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen

Burst werden die Immunkomplexe über die Bindung an Fcγ-Rezeptoren auf Granulozyten

phagozytiert und die intrazelluläre Sauerstoffradikalproduktion gemessen. Demzufolge

führt die Inhibition der Bindung von Mikroorganismen bzw. Immunkomplexen an lektin-

ähnliche Granulozytenrezeptoren und an die Lektinbindungsstelle des CR3, sowie die

Blockade der lektinvermittelten CR3-FcγRIIIB-Interaktion zu einer Hemmung der Phago-

zytose und des oxidativen Burst.

Ein Vergleich der Inhibitionswirkung obengenannter Saccharide unter allen Phagozytose-

partikeln zeigte die stärkste Phagozytosehemmung bei nonopsonierten, gramnegativen

E.coli mit N-Acetyllactosamin (2-Acetamido-2-deoxy-4-O-β-D-galactose-D-glucosid) und

Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid und bei nonopsonierten, grampositiven

S.aureus mit Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid. Im Gegensatz zu den anderen

drei getesteten Sacchariden enthalten N-Acetyllactosamin und Methyl-2-acetamido-2-

deoxy-α-D-glucosid ein Glucosemonomer mit einer in C2-Position gebundenen Acetami-

do-Gruppe (Bild 33). Diese könnte für die stärkere Affinität dieser Zucker an die Phagozy-

tenrezeptoren und somit für die kompetitive Inhibition der E.coli-Bindung verantwortlich

sein. Außerdem führt die Bindung von N-Acetyllactosamin an Galectin-3 auf Neutrophilen

vermutlich zu einer Hemmung der Bakterienbindung an die Phagozyten.

4 Diskussion 85

OOHO OH

OH

HN

O

O

HO

HO OH

OH

OHO

HO

OC

OH

HN

O

A B

H3

OOHO OH

OH

OH

O

HO

HO OH

OH

O

HO

HO OH

OHOCH3

3

OHO

HO

OCH

OH

OH

C D E

Bild 33: Strukturformeln von N-Acetyllactosamin (A), Methyl-2-acetamido-2-deoxy-

α-D-glucosid (B), Lactose (C), Methyl-β-D-galactosid (D) und Methyl-α-D

mannosid (E)

Analog zu den oben angeführten Untersuchungen mit Arabinogalactan zeigte sich mit allen

Sacchariden eine stärkere Blockade der Phagozytose von nonopsonierten, als von

opsonierten E.coli. Bei nonopsonierten Phagozytosepartikeln können die Saccharide zu

einer Hemmung der Mikrobenbindung führen, indem sie kompetitiv die Lektine bzw.

Kohlenhydrate binden, die an der Bindung der Mikroorganismen an die

Lektinbindungsstelle des CR3 auf Leukozyten beteiligt sind. Beispielsweise wurde von

Ross und Mitarbeitern eine konzentrationsabhängige Hemmung der Bindung von

löslichem Zymosanpolysaccharid bzw. β-Glucan an die Lektinbindungsstelle des CR3

durch 25 mM bis 100 mM N-acetyl-D-glucosamin, α- oder β-Methylmannosid und α

β-Methylglucosid bei Ficoll-Hypaque isolierten

- oder

Neutrophilen gezeigt [62].

Unsere Tests mit humanen Granulozyten im Vollblut ergaben bei der Phagozytose von no-

nopsonierter C.albicans die stärkste Blockade mit Methyl-α-D-mannosid. Dies weist auf

eine Beteiligung von Mannose bei der Rezeptorbindung des Sproßpilzes hin. In der Litera-

tur ist vorbeschrieben, daß bei der Bindung von nonopsonierter Candida Interaktionen zwi-

schen dem β-1,2-verknüpften Mannotetraose-Anteils der Zellwand von C.albicans und

entsprechenden Lektinen auf Makrophagen eine wichtige Rolle spielen [16, 34]. Im Ge-

gensatz zu Makrophagen exprimieren Monozyten und Granulozyten jedoch keinen Man-

nose-Rezeptor. Allerdings wirkt das im Serum vorkommende mannanbindende Lektin

(MBL), das an Mannosereste von zuckerreichen Pathogenen bindet, als ein Opsonin für

Monozyten und Granulozyten und aktiviert den Lektinweg des Komplementsystems [63].

Die kompetitive Hemmung der Bindung von C.albicans an das MBL durch Methyl-α-D-

4 Diskussion 86

mannosid führt demnach auch zu einer verminderten Phagozytose der Hefe durch Mono-

und Granulozyten.

In den Studien von Petty und Mitarbeitern wurde eine Blockade der mit Immunkomplexen

stimulierten, intrazellulären Ca2+-Freisetzung und der Sauerstoffradikalproduktion von

Granulozyten mit 150 mM N-acetyl-D-glucosamin, Mannose und α-Methylmannosid ge-

zeigt. Die Inhibiton des oxidativen Burst der mit Ficoll-Hypaque isolierten Granulozyten

wurde auf eine kompetitive Hemmung der Interaktion des FcγRIII mit der Lektinbindung-

stelle des CR3 durch diese Saccharide (Bild 30) zurückgeführt [54].

Bei unseren Untersuchungen konnten wir hingegen nachweisen, daß auch bei Granulozy-

ten im Vollblut eine relevante Inhibition der mit Immunkomplexen stimulierten Produktion

von reaktiven Sauerstoffmetaboliten in absteigender Reihenfolge mit folgenden 100 mM

Sacchariden möglich ist: Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid > Methyl-β-D-

galactosid > Methyl-α-D-mannosid > Lactose > N-Acetyllactosamin.

Den drei Sacchariden mit dem stärksten Inhibitionseffekt ist dabei lediglich gemeinsam,

daß es sich um Monosaccharide mit einer in C1 substituierten Methylgruppe handelt, die

zu einer erhöhten Lipophilie der Saccharide führt. Weitere Struktur-Funktionsbeziehungen

liesen sich dabei nicht ableiten.

Unter allen getesteten Leukozytenfunktionen konnte die mit E.coli-Bakterien stimulierte

Sauerstoffradikalproduktion bei Granulozyten im Vollblut am stärksten mit den obenge-

nannten Sacchariden gehemmt werden. Allerdings muß wegen des ähnlich starken Inhibi-

tionseffektes aller fünf Saccharide (KB zwischen 0,24 und 0,33) an eine unspezifische

Hemmung des E.coli-induzierten oxidativen Burst gedacht werden. Dagegen spricht je-

doch die Beobachtung, daß sowohl der mit nonopsonierten E.coli ausgelöste oxidative

Burst als auch die Phagozytose von nonopsonierten E.coli in gleicher absteigender Rang-

folge durch folgende Saccharide gehemmt wurde: N-Acetyllactosamin > Methyl-2-

acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid, Methyl-β-D-galactosid > Methyl-α-D-mannosid, Lacto-

se. Da bei der Auslösung der Phagozytose und des oxidativen Burst durch die nonopsonier-

ten E.coli-Bakterien die gleichen Phagozytenrezeptoren beteiligt sind, spricht die Hem-

mung dieser beiden Leukozytenfunktionen mit denselben Zuckern für eine spezifische

Saccharidwirkung auf Rezeptorebene. Dementsprechend wurde der durch Immunkomplexe

über Fcγ-Rezeptoren ausgelöste oxidative Burst nur schwach mit N-Acetyllactosamin ge-

hemmt.

4 Diskussion 87

Im Gegensatz zu der Stimulation mit E.coli wurde der mit PMA induzierte oxidative Burst

der Granulozyten durch die obengenannten Saccharide stark erhöht. Da PMA jedoch ein

rezeptorunabhängiger Stimulus ist, stellt diese Beobachtung kein Widerspruch zu unserer

Theorie dar, daß die Zucker zu einer spezifischen Hemmung des rezeptorvermittelten oxi-

dativen Burst von Leukozyten führen. Der Wirkungsmechanismus wie die Saccharide bei

PMA zu einer Stimulation des oxidativen Burst führen bleibt jedoch offen.

Im Saccharidscreening fiel das Polysaccharid Fucoidan durch den bereits bei niedrigen

Konzentrationen ausgeprägten Inhibitionseffekt bei der granulozytären Phagozytose von

nonopsonierten E.coli-Bakterien auf.

Das von uns eingesetzte Fucoidan ist eine hochgereinigte Fraktion eines aus der Alge Fu-

cus vesiculosus isolierten Polysaccharidgemisches von unterschiedlichem Molekularge-

wicht (ca. 100000 - 150000 Dalton). Es besteht aus sulfatierter Fucose und ist ein Ligand

des Scavenger-Rezeptors A, der bei der Immunabwehr von Mikroorganismen durch Ma-

krophagen eine wichtige Rolle spielt [47]. Fucoidan ist für seine antikoagulative und fibri-

nolytische Wirkung [39], sowie antivirale Aktivität auch gegen AIDS-Viren [40] und seine

Wirkung gegen Krebszellen [10] bekannt.

In unseren Untersuchungen konnte der starke Inhibitionseffekt von Fucoidan bei der Pha-

gozytose von neutrophilen Granulozyten bereits bei niedrigsten Konzentrationen des Poly-

saccharids (250 µg/ml) nachgewiesen werden. Außerdem wurde der Inhibitionseffekt von

Fucoidan in Abhängigkeit von der Saccharidkonzentration, vor allem bei den Bakterien

Escherichia coli und Staphylococccus aureus, sowie in geringerem Ausmaß bei dem

Sproßpilz Candida albicans gezeigt.

Da Fucoidan ein sehr heterogenes Polysaccharidgemisch von vorwiegend 1,2-α-glykosi-

disch, aber auch 1,3-α- und 1,4-α-glykosidisch verknüpfter, zum Teil sulfatierter, anioni-

scher L-Fucose ist (Bild 34), werden zur Erforschung des Wirkungsmechanismus derzeit

Untersuchungen mit verschiedenen Molekulargewichtsfraktionen von Fucoidan durchge-

führt.

CH3

O

O

OO

CH3

O

HO

OH RestRest

O-OSO2

O-OSO2

Bild 34: Strukturformel von Fucoidan

4 Diskussion 88

4.5 Schlußfolgerung Zur Beantwortung der Frage, ob sich chemisch bzw. enzymatisch synthetisierte Saccharide

pflanzlichen Ursprungs als Functional Food zur Steigerung bzw. Hemmung der Phagozy-

tose von Mikroorganismen und des oxidativen Burst von Leukozyten eignen, wurden spe-

zifisch auf diese Fragestellung adaptierte Tests für die durchflußzytometrische Analyse im

Vollblut etabliert.

Die Erforschung der Stimulations- bzw. Inhibitionseffekte von Functional Food Sacchari-

den auf die Phagozytose und Sauerstoffradikalproduktion von Granulozyten erfordert den

Ausschluß artifizieller Stimulationseffekte durch bakterielle Lipopolysaccharide.

Um bei der Untersuchung der Modulation von Lektin-Kohlenhydrat-Interaktionen zwi-

schen Mikroorganismen und Phagozyten durch Saccharide mit funktionellen Testverfahren

im Vollblut einen Anhalt für die Struktur-Funktionsbeziehungen zu bekommen, ist der

Einsatz relativ hoher Saccharidkonzentrationen notwendig. Trotz der fehlenden Datenlage

ist eine gastrointestinale Resorption von Oligosacchariden in größerem Umfang eher un-

wahrscheinlich. Allerdings könnten die in den Magen-Darm-Trakt ausgewanderten Granu-

lozyten lokal mit hohen Zuckerkonzentrationen in Kontakt kommen.

In unseren Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, daß die Phagozytose von non-

opsonierten E.coli-Bakterien und der mit nonopsonierten E.coli stimulierte oxidative Burst

von Granulozyten am stärksten durch das anionisch geladene Glucosederivat BC-D-146

bzw. durch die 2-Acetamido-Glucose-haltigen Saccharide N-Acetyllactosamin und Me-

thyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid inhibiert wurden. Die granulozytäre Phagozytose

von nonopsonierter C.albicans konnte dagegen relevant durch Methyl-α-D-mannosid ini-

biert werden.

Zukünftig könnte die Isolierung und Synthese von auf diesen Monomeren basierenden Po-

lysacchariden den Einsatz weitaus geringerer Saccharidkonzentrationen mit ähnlichen Mo-

dulationseffekten ermöglichen, da Polysaccharide trotz der geringen Bindungsaffinität ih-

rer Mono- bzw. Disaccharidbausteine durch ihre multivalente Bindungsfähigkeit eine hohe

Avidität erreichen. Diese Hypothese wurde durch das Beispiel des Polysaccharids Fucoi-

dan, welches bei sehr geringen Konzentrationen (500 µg/ml) eine nahezu hundertprozenti-

ge Blockierung der granulozytären Phagozytose von E.coli und S.aureus hervorrief, unter-

stützt.

5 Zusammenfassung Die Elimination von pathogenen Mikroorganismen im Rahmen der angeborenen Immun-

abwehr erfordert die schnelle Erkennung und Bindung der Erreger durch Phagozyten. Da-

bei spielen die spezifischen Lektin-Kohlenhydrat-Interaktionen zwischen Bakterien und

Phagozyten eine wichtige Rolle.

In dieser Arbeit war zu untersuchen, ob sich chemisch bzw. enzymatisch synthetisierte

Saccharide pflanzlichen Ursprungs als Functional Food zur Modulation der Phagozytose

von Mikroorganismen und des oxidativen Burst bei Leukozyten eignen.

Zunächst wurden funktionelle Testverfahren ausgearbeitet, die eine durchflußzytometri-

sche Analyse der Phagozytose von Escherichia coli, Staphylococcus aureus und Candida

albicans, sowie des Fc-Rezeptor vermittelten und des mit E.coli-Bakterien stimulierten

oxidativen Burst ermöglichten. Als Modell zur Erforschung der Effekte von Functional

Food Sacchariden auf die Lektin-Kohlenhydrat-Interaktionen zwischen Mikroorganismen

und Phagozyten im humanen Gastrointestinaltrakt dienten die zur Extravasation in den

Magen-Darm-Trakt befähigten Granulozyten im periphervenösen Vollblut, sowie kultivier-

te, humane Makrophagen.

Ein zur Erforschung von Kohlenhydratbasisstrukturen durchgeführtes Saccharidscreening,

zeigte eine Stimulation der Phagozytose von S.aureus. Die aufgrund der schlechten Repro-

duzierbarkeit dieser Testergebnisse betriebene Ursachenforschung ergab eine Stimulation

der Phagozytose als auch des oxidativen Burst durch eine Kontamination der Testsacchari-

de mit bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS). Dies konnte ein Vergleich der Stimulations-

effekte von pyrogenfreien, gezielt mit LPS versetzten sowie LPS kontaminierten Saccha-

ridlösungen bestätigen.

Weiterhin wurde am Beispiel von Arabinogalactan der Effekt bekannter Immunstimulanzi-

en mit unseren funktionellen Testsystemen überprüft. Dieses saure Polysacharid, welches

vermutlich der wirksame Bestandteil von Echinacea-Präparaten ist, führte in unseren Un-

tersuchungen ab 2 mg/ml zu einer meßbaren und mit 8 mg/ml zur maximalen Steigerung

der granulozytären Phagozytose von insbesondere nonopsonierten E.coli. Solche Serum-

spiegel können bei oraler Zufuhr sicherlich nicht erreicht werden.

Bei den Untersuchungen der inhibitorischen Saccharideffekte zeigte sich insbesondere mit

nonopsonierten E.coli-Bakterien eine relevante Hemmung der Phagozytose und der Sauer-

5 Zusammenfassung 90

stoffradikalproduktion von Granulozyten durch 40 mM pyrogenfreie BC-D-146, sowie 100

mM N-Acetyllactosamin und Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid. Der Inhibitions-

effekt von BC-D-146 könnte auf einer erhöhten Rezeptoraffinität durch die anionische La-

dung dieser Gluconsäure beruhen. Dementsprechend führt bei N-Acetyllactosamin und

Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid das in beiden Molekülen enthaltene 2-Acet-

amido-Glucosemonomer möglicherweise zu einer erhöhten Rezeptoraffinität.

Dagegen wurde die granulozytäre Phagozytose von nonopsonierter C.albicans vor allem

mit Methyl-α-D-mannosid gehemmt. Dieses Mannosederivat inhibiert vermutlich kompe-

titiv die Bindung des mannanbindenden Lektins an die mannosehaltigen Zellwandbestand-

teile von C.albicans. Die herabgesetzte Bindung dieses Serumopsonins führt zu einer ver-

minderten Aktivierung des Lektinweges des Komplementsystems und somit zu einer ge-

ringeren Phagozytose von C.albicans.

Der stärkste Inhibitionseffekt konnte mit dem Polysaccharid Fucoidan nachgewiesen wer-

den, welches bereits bei Konzentrationen von 250µg/ml die Phagozytose von opsonierten

und nonopsonierten E.coli, von nonopsoniertem S.aureus und in geringerem Ausmaß von

C.albicans bei Granulozyten inhibierte. Eine nahezu hundertprozentige Phagozytoseblok-

kade von E.coli und S.aureus wurde mit 500 µg/ml Fucoidan erreicht.

Eine Hemmung der Fc-Rezeptor vermittelten Sauerstoffradikalproduktion von Granulozy-

ten konnte mit 100 mM Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid, Methyl-β-D-galacto-

sid, Methyl-α-D-mannosid, Lactose und N-Acetyllactosamin nachgewiesen werden.

Die Ergebnisse zeigen, daß bei der Erforschung der immunmodulierenden Saccharideffek-

te eine unspezifische Leukozytenstimulation durch bakterielles LPS stets ausgeschlossen

werden muß.

In Zukunft könnte die Isolierung und Synthese von Polysacchariden, die auf hydrophiler

Glucose und 2-Acetamido-Glucose bzw. auf Mannose basieren, eine Hemmung der Pha-

gozytose und des oxidativen Burst bei nonopsonierten E.coli bzw. C.albicans mit deutlich

geringeren Saccharidkonzentrationen ermöglichen. Denn trotz der niedrigen Bindungsaffi-

nität der Monomere kann ein Polysaccharid durch die multivalente Bindungsfähigkeit eine

hohe Rezeptoraffinität erreichen. Der ausgeprägte Inhibitionseffekt des Polysaccharids Fu-

coidan, der bei vergleichsweise geringen Konzentrationen eintritt, unterstützt diese

Hypothese.

6 Literaturverzeichnis 91

6 Literaturverzeichnis [1] Aderem A, Underhill D M: Mechanisms of phagocytosis in macrophages.

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cific antagonists suggest a model for cooperative saccharide-associated inhibition

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J Cell Biochem 56: 225-235 (1994)

98

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei meinen Betreuern Prof. Dr. Groß für die Unterstüt-

zung bei theoretischen und praktischen Fragestellungen während der Promotionsarbeit und

bei Prof. Dr. Dr. Dr. h.c. Grünert für die Beratung bei der Fertigstellung der Arbeit bedan-

ken.

Weiterhin danke ich Dr. Vogel von der Firma Südzucker AG für die nützlichen Hinweise

in Zusammenhang mit Sacchariden und Functional Food und die gute Zusammenarbeit in

diesem Projekt.

Herrn Dr. Muche aus der Abteilung Medizinische Biometrie und Dokumentation danke ich

für die Beratung in statistischen Fragen.

Ralph Müller möchte ich für die Hilfestellung bei technischen Fragen zur Software und zur

Datenverarbeitung im Rahmen der Forschungarbeit danken.

Ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mir während des Studiums immer unterstüt-

zend zur Seite standen und mir damit erst diese Promotion ermöglichten

Saccharide als Modulatoren von Leukozytenfunktionen im ...

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