SCHLUSSBERICHT - cleaner-production.de · borpraxis (GLP Good Laboratory Practice) durchgeführt....

BASF Aktiengesellschaft ProduktsicherheitChemikalienrecht, Toxikologie und Ökologie

SCHLUSSBERICHT

Computerunterstützte Neustoffentwicklung vonökologisch fortschrittlichen Produkten

Förderkennzeichen:01RC0090 (früher: 1461042/0)

Laufzeit:01.08.1998 – 31.12.2001

Durchführung in der Abteilung:ProduktsicherheitChemikalienrecht, Toxikologie und ÖkologieExperimentelle Toxikologie und ÖkologieGV/TB – Z 47067056 Ludwigshafen, FRG

Projektleiter:Herr Dr. D. B. Beimborn

BASF-Mitarbeiter:Herr E. RorijeFrau F. GermaFrau P. Geyer-ZachmannFrau A. Jochens

Unterauftragnehmer:Herr Prof. Dr. V. Mersch-SundermannHerr M. HoffInstitut für Toxikologie und ÖkotoxikologieUniversität Trier

Herr Prof. Dr. B. SchinkHerr Prof. Dr. A. CookHerr Dr. J. MampelHerr Dr. B. PhilippHerr Dr. TralauUniversität Konstanz, Fakultät Biologie


2

1. ZUSAMMENFASSUNG 3

2. VORHABENBESCHREIBUNG 4

2.1. GESAMTZIEL DES VORHABENS 4

2.2. WISSENSCHAFTLICHE UND/ODER TECHNISCHE ARBEITSZIELE DES VORHABENS 5

2.3. BEZUG DES VORHABENS ZU DEN FÖRDERPOLITISCHEN ZIELENDES FÖRDERPROGRAMMS 6

2.4. VORAUSSETZUNGEN UNTER DENEN DAS VORHABENDURCHGEFÜHRT WURDE 6

2.5. PLANUNG UND ABLAUF DES VORHABENS 6

2.6. STAND DER TECHNIK ZU PROJEKTBEGINN 7

3. ERGEBNISSE 8

3.1. EINLEITUNG 8

3.2. PROJEKTVERLAUF 83.2.1. Projektphase I 83.2.2. Projektphase II 93.2.3. Projektphase III 13

3.3. PROJEKTERFOLG UND ZUKUNFTSAUSSICHTEN 14

4. VORAUSSICHTLICHER NUTZEN UND VERWERTBARKEITDER ERGENISSE 14

5. ERFOLGTE UND GEPLANTE PUBLIKATIONEN 16

5.1. VORTRÄGE 16

5.2. POSTER 17

5.3. PUBLIKATIONEN 17


3

1. ZUSAMMENFASSUNG

Die bahnbrechenden Entwicklungen der Informationstechnologie in den letzten Jah-ren erlauben die Handhabung großer Datenbestände mit relativ geringem Rechner-aufwand, wie dies für Fragestellungen zu Struktur-Wirkungs-Korrelationen (SAR) er-forderlich ist. Zielsetzung des vorliegenden Projekts war es, Struktur-Abbau-Korrelationen (SBR) abzuleiten. Es wurden Abbau- und Strukturdaten zu ca. 6700Stoffen recherchiert und in eine neu entwickelte Datenbank eingespeist. Diese ‚ISISBASE‘-Datenbank ermöglichte die rasche Recherche und Visualisierung der Struktureines gewünschten organischen Stoffes und seiner Strukturanaloga mit den dazuge-hörigen experimentellen Daten, soweit diese vorhanden sind. In Projektphase I wur-den mit der Entwicklung und dem Aufbau dieser Datenbank BISS und der Etablie-rung geeigneter Softwaretools die Voraussetzungen für SBR-Studien geschaffen.

In Projektphase II wurden Struktur-Abbau-Relationen spezieller Chemikalienklassenerforscht und die Ergebnisse in speziellen Stoffmodulen zusammengefasst.

In Projektphase III wurde das Expertensystem BIOLINK für die Vorhersage der bio-log. Abbaubarkeit von Stoffen programmiert. Mit dieser Software hat der AnwenderZugriff auf die bisher erarbeiteten Zusammenhänge zwischen chemischer Strukturund Bioabbaubarkeit. Darüber hinaus bietet die Benutzeroberfläche die notwendigenVoraussetzungen für die Bearbeitung und Speicherung aktueller SBR-Fragestellungen. Die hier entwickelte Software BIOLINK ist für die Bearbeitung vonSAR-Fragestellungen anderer Fachgebiete gleichermaßen geeignet.

Das diesem Bericht zugrunde liegende Vorhaben wurde mit Mitteln des Bundes-ministeriums für Bildung und Forschung unter dem Förderkennzeichen 01RC0090gefördert.


4

2. VORHABENBESCHREIBUNG

2.1. GESAMTZIEL DES VORHABENS

Mikrobieller Abbau findet in unterschiedlichen Umweltkompartimenten statt und stelltden natürlichen Entsorgungspfad für organische Naturstoffe dar. Abbaubare Xenobio-tika werden in Kläranlagen und Gewässern von verschiedenen Bakterien und Pilzen inGegenwart (aerob) und Abwesenheit von Sauerstoff (anaerob) abgebaut. Die Kinetikdes Stoffabbaus hängt von ihren chemischen und physikalischen Eigenschaften ab, soz. B. von der Wasser- bzw. Fettlöslichkeit, der Polarität, Adsorbierbarkeit oder derFlüchtigkeit. Die Umweltschutzgesetze fordern eine ökologische Risikobewertung so-wohl für neu entwickelte als auch für bereits im Verkehr befindliche Stoffe. Mit demNachweis der biologischen Abbaubarkeit eines Stoffes erhält dieser eine bedeutendgünstigere ökologische Risikobewertung. Über Ableitungen von Struktur-Abbau-Korrelationen wurden mit diesem Projekt neue Möglichkeiten sowohl für die Stoff- undProduktbewertung als auch für ein innovatives Produktdesign eröffnet. Die Bewertungeines einzelnen Stoffes soll zukünftig vor dem Hintergrund der Bewertung ganzerStoffklassen (mit ähnlichen Strukturen) geschehen. Die Einsparung experimentellerPrüfungen kann auf diese Weise durch nachvollziehbare QSAR-Aussagen erreichtwerden, sowohl in Altstoffprüfprogrammen als auch bei der Entwicklung ökologischverbesserter Substanzen.

Ein wichtiges Forschungsziel der chemischen Industrie ist der Ersatz problematischerStoffe und Produkte durch technisch und ökologisch verbesserte. Sie verpflichtet sichdazu, auch unabhängig von gesetzlichen Forderungen, im Rahmen der ‘ResponsibleCare Initiative’. Die biologische Abbaubarkeit eines Stoffes verhindert dessen Anrei-cherung in Ökosystemen, reduziert die Gefahr ökotoxischer Wirkungen und gehörtdaher zu den wünschenswerten Eigenschaften. Ein ausreichender Abbau wird insbe-sondere von Stoffen gefordert, die bei ihrer Anwendung in das Abwasser gelangen.Das Labor für Mikrobiologie der BASF prüft seit fast 30 Jahren Stoffe und Abwässerauf biologische Abbaubarkeit und setzt dabei international genormte Testmethodenein.

Dem mikrobiellen Abbau von Chemikalien liegen komplexe biologische Prozessezugrunde. Sie sind schlecht vorhersagbar und müssen in der Regel experimentell er-arbeitet werden. Zielsetzung dieses Forschungsprojekts war es, aus bereits vorhande-nen experimentellen Daten an Hochschulen und Industrie, Rückschlüsse auf die Ab-baubarkeit von Chemikalien mit ähnlicher Struktur zu ziehen. Es sollte ein QSAR-System etabliert werden, das sich besonders durch seine Recherchier- und Prädikti-onsfunktionen auszeichnet. Die chemische Struktur einer Substanz sollte von derSoftware erkannt und die Recherche nach Strukturanaloga in einer entsprechendenDatenbank ablaufen. Hierfür wurde eine käufliche Software (ISIS for Excel vonMDL/Basel) eingesetzt, mit der die substanzcharakteristischen Stoffdaten dargestelltund auf ihre potentielle Abbaubarkeit hin bewertet wurden. Dies versetzt nun den An-wender in die Lage, gezielt nach neuen, abbaubaren Strukturen zu suchen. Zur Vor-hersage der Abbaubarkeit wurden zwei an der Case Western Reserve University ent-


5

wickelte Systeme lizensiert und modifiziert. MULTICASE ist ein ausgereiftes System,das auf der Basis statistischer Ableitungen Vorhersagen trifft. Im Rahmen dieses Pro-jekts diente es vornehmlich zur Analyse der chemischen Struktur bezüglich typischerAbbaudeskriptoren. METACASE beinhaltet mikrobielle Abbauwege und ist ein Exper-tensystem, das im Rahmen dieses Projekts für Abbauvorhersagen zusätzlich genutztwurde und Aussagen zu den wahrscheinlichen Abbauwegen von Stoffen lieferte.

Während die Datenbank BISS auch aufgrund firmeninterner, vertraulicher Daten über-wiegend BASFseitig aufgebaut wurde, wurden die für eine untersuchte Stoffgruppeerkannten Gesetzmäßigkeiten, nach denen biologische Abbauprozesse ablaufen, vonder Fakultät für Biologie der Universität Konstanz (Prof. Schink/Prof. Dr. Cook, ) erar-beitet. Herr Prof. Dr. Mersch-Sundermann von der Universität Gießen (ehemals Hei-delberg (Inst. f. Medizinische Mikrobiologie & Hygiene)) erarbeitete das Expertensys-tem BIOLINK.

Die durchgeführten Arbeiten werden als Bindeglied zwischen experimenteller Sub-stanzforschung (‘try and error’-Screening) und Molecular Modelling betrachtet. Derinnovative Aspekt ergibt sich aus der Nutzung EDV-technischer Recherche- und Da-tenmanagementmöglichkeiten auf Basis der chemischen Struktur eines Stoffes.

Das erarbeitete SAR-System wurde für das Fachgebiet ‚Bioabbaubarkeit von Stoffen‘erarbeitet; es kann grundsätzlich auf andere, beispielsweise (öko-) toxikologische Ge-biete ausgedehnt oder übertragen werden.

2.2. WISSENSCHAFTLICHE UND/ODER TECHNISCHE ARBEITSZIELE DES VORHABENS

Mit dem beantragten Projekt wurden die Möglichkeiten der modernen Informations-technologie genutzt, um aus vorhandenen experimentellen Daten zur biologischenAbbaubarkeit von Substanzen ein Expertensystem zu entwickeln, mit dem sich dieseStoffeigenschaft anhand strukturähnlicher Stoffe vorhersagen lässt. Das Struktur-Abbau -Relationssystem -System (SAR) wurde so flexibel konzipiert, dass die Daten-lage ständig erweitert und für folgende Dienstleistungen eingesetzt werden kann:

• Erstellung von Struktur-Abbau-Beziehungen im Rahmen der Entwicklung neuerStoffe, die beispielsweise der Substitution vorhandener Chemikalien mit wenigerguten Eigenschaften dienen (z. B. für Wasch- und Reinigungsmittel). Mit diesemSystem wird eine gezielte Stoffsuche deutlich erleichtert.

• Beurteilung von Altstoffen durch systematische Gruppierung und Klassifizierungvon Stoffen mit vergleichbaren Abbaueigenschaften z. B. bei der Risikobewertungvon Stoffen

• Aussagen zur biologischen Abbaubarkeit von Stoffen, die z.B. bei einer Betriebs-störung in die Umwelt gelangen und für die (noch) keine ausreichenden experi-mentellen Daten vorliegen.


6

2.3. BEZUG DES VORHABENS ZU DEN FÖRDERPOLITISCHEN ZIELEN DES FÖRDERPROGRAMMS

Das Labor ‚Ökologische Methoden‘ der BASF, ist ein Dienstleistungslabor, das für dieBASF, aber auch für jeden anderen Kunden, Prüfungen auf biologische Abbaubarkeitvon Stoffen, in der Regel nach international genormten Methoden anbietet. Die regel-mäßige Durchführung von Tests, die Mitarbeit bei der Entwicklung neuer Stoffe, aberauch die Mitwirkung bei der Erarbeitung von Abbaumethoden hat zu einem fundiertenWissen und Datenbestand geführt.

In diesem Projekt wurden die Möglichkeiten der modernen Informationsverarbeitungzur Lösung von Problemstellungen des Umweltschutzes eingesetzt. Damit wurde einBeitrag zur Umsetzung dieses ökologisch relevanten Wissens in Produkte undDienstleistungen geleistet.

2.4. VORAUSSETZUNGEN UNTER DENEN DAS VORHABEN DURCHGEFÜHRT WURDE

Die Unterabteilung Experimentelle Toxikologie und Ökologie gehört zum For-schungsbereich Wirk- und Effektstoffe der BASF Aktiengesellschaft. Diese Einheitarbeitet sehr eng mit der Abteilung Produktsicherheit zusammen. Etwa 200 Mitar-beiter sind dort in den Gebieten biologische Abbaubarkeit, toxische, ökotoxische Wir-kungen, Analytik, Risk Assessment von Neu- und Altstoffen und Ökobilanz-/Öko-effizienzerstellung tätig. In den Labors werden Untersuchungen mit international an-erkannten, genormten Prüfmethoden unter Anwendung der Kriterien der guten La-borpraxis (GLP Good Laboratory Practice) durchgeführt.

Für die Durchführung des Forschungsvorhabens standen moderne, gut eingerichteteLaborräume zur Verfügung. Notwendige Einrichtungen und Ausrüstungsgegenständewaren größtenteils vorhanden und wurden zum Teil ergänzt, insbesondere wasComputer Hard- und Software anbetraf.

2.5. PLANUNG UND ABLAUF DES VORHABENS

Das Vorhaben wurde in Zusammenarbeit der BASF AG mit den Universitäten Kon-stanz und Heidelberg (später Uni Trier) geplant und ausgeführt. Dazu wurden bereitsim Planungsstadium Treffen durchgeführt, in denen Inhalte und Zeitplan des Vorha-bens projektiert wurden.

Es bedurfte für die Bearbeitung der SAR-Studien, der Pflege sowie des ständigenAusbaus des Expertensystems eines Teams mit Fachkenntnissen aus Chemie, Bio-logie und Informatik.


7

2.6. STAND DER TECHNIK ZU PROJEKTBEGINN

Der Wissensstand über die vor Projektbeginn bekannten Vorhaben zur Entwicklungvon Computersystemen zur Vorhersage der Bioabbaubarkeit von Stoffen ist im Ta-gungsband „Peijnenburg, W.J.G.M. and Damborský, J.1996: Biodegradability Predicti-on. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands“ zusammengefaßt. Au-ßerdem war ein im Auftrag des Bundesumweltministeriums am Fraunhofer-Institut fürUmweltchemie und Ökotoxikologie in Schmallenberg entwickeltes ‘SAR-Programm(Version 3.0,1992; Projektleitung: Prof. Dr. W. Klein) bekannt; dieses Programm wurdeim Rahmen dieses Projekts nicht verwendet.

Bewertung vorhandener (Q)SAR-Modelle zur Vorhersage des biologischen Ab-baus vor Projektbeginn

Eine Bewertung von 84 (Q)SAR- Modellen erfolgte im Rahmen des EU-Projektes:‘QSAR for predicting fate and effects of chemicals in the environment’. Die Autorenkamen zu dem Schluss, dass keines der Modelle den geforderten Kriterien zur Vorher-sage der biologischen Abbaubarkeit von Chemikalien genüge.

Zu den besten verfügbaren Systemen zählte das SAR-System BIODEG (Howard, P.and Meylan, W. 1992 Biodegradation Probability Program, Version 3. Syracuse Re-search Corporation , NY). BIODEG ist über TDS (Technical Database Services/ NewYork) online abrufbar. Im Rahmen des vorliegenden Projekts wurde BIODEG einer-seits ausgewählt, um einen Vergleich der Vorhersagegenauigkeit mit dem hier entwi-ckelten System BIOLINK für ca. 80 Stoffe zu erarbeiten; andererseits wurde BIODEGin das Vorhersagemenue von BIOLINK integriert und liefert daher für jede neue Stoff-anfrage die gewünschte BIODEG-Vorhersage per Knopfdruck.


8

3. ERGEBNISSE

3.1. EINLEITUNG

Einen Überblick über den Projektverlauf gibt der Balkenplan in Anlage 1. Das Projektwurde inhaltlich in drei Projektphasen unterteilt und von drei Projektpartnern reali-siert. Die Bearbeitung der drei Projektabschnitte erfolgte mit zeitlicher Überlappung.Projektphase I wurde von der BASF AG bearbeitet und diente der Entwicklung unddem Aufbau der Datenbank BISS und der Etablierung geeigneter Softwaretools. DieErgebnisse der Projektphase II wurden überwiegend in Kooperation mit den Wissen-schaftlern der Universität Konstanz erarbeitet; es wurden Struktur-Abbau-Relationenvon verschiedenen Chemikalienklassen erforscht und die Ergebnisse in speziellenStoffmodulen zusammengefasst.

In Projektphase III wurde ein Expertensystem von Herrn Hoff an der Universität Hei-delberg (später Universität Trier) für die Vorhersage der biolog. Abbaubarkeit vonStoffen programmiert. Mit dieser Software hat der Anwender Zugriff auf die in denDatenbanken vorliegenden Zusammenhänge zwischen chemischer Struktur und Bio-abbaubarkeit. Darüber hinaus bietet die Benutzeroberfläche die notwendigen Vor-aussetzungen für die Bearbeitung und Speicherung weiterer aktueller Fragestellun-gen zu Struktur-Abbau-Relationen.

3.2. PROJEKTVERLAUF

3.2.1. Projektphase I

In der ersten Projektphase wurden die EDV-technischen Voraussetzungen geschaf-fen, mit denen eine Datenanalyse bezüglich Struktur – Abbau – Relationen erfolgenkonnte. Die ursprünglich geplante direkte Anbindung des BIOLINK-Expertensystemsan bestehende bzw. in der Entwicklung befindliche BASF-Datenbanken (wie z. B.BASIS) erwies sich als nicht praktikabel, da

• die zeitliche Korrelation bei der Entwicklung dieser verschiedenen Systeme nichthergestellt werden konnte,

• projektspezifisch programmierte EDV-Programme, die direkt auf BASIS zugriffen,durch ein neues BASIS-Release ihre Funktionstüchtigkeit verloren und teuernachgerüstet hätten werden müssen, ohne die Garantie, für zukünftige BASIS-Releases funktionsfähig zu bleiben.

Aufgrund dieser Erfahrungen in der ersten Projektphase wurde die Projektkonzeptionüberwiegend auf PC’s realisiert und hierfür eine projekteigene ISIS-Datenbank entwi-ckelt. In diese Datenbank wurden Daten aus externen Datenbanken wie BASIS,WISS, MITI-Datenbank, IUCLID u.a. eingespeist.


9

Das Projektteam konnte von neu entwickelten Softwaretools der Firma MDL profitie-ren (zum Beispiel von einigen neuen ‚Features‘ der Software ISIS for EXCEL und derVisualisierungssoftware SPOTFIRE). Durch Lizenzierung dieser Software konntenTeile der in der Projektplanung vorgesehenen Softwareausstattung käuflich erworbenwerden, ohne den geplanten teuren, projektspezifischen Programmieraufwand zubeanspruchen.

Mit dieser Kombination aus den oben erwähnten verschiedenen Softwaretools sowieeiner umfangreichen Literaturdatenbank waren in der ersten Projektphase dieGrundlagen geschaffen worden, um in der zweiten Projektphase Struktur-Abbau-Korrelationen (SBR) ableiten zu können. Dies erfolgte, indem zunächst das Haupt-modul der Heterozyklen bearbeitet wurde.

3.2.2. Projektphase II

Mit dem in Projektphase I etablierten EDV-System, bestehend aus ISIS for Excel,ISIS Base-Datenbank BISS, ISIS-Draw und SpotfirePRO, wurden in Projektphase IIStruktur – Abbau –Vergleiche für unterschiedliche Stoffklassen erstellt und mit derSoftware Spotfire-Decision-Explorer und MULTICASE analysiert. Ferner wurde dieErfassung biochemischer Grundlagen zum Abbau definierter Stoffklassen vorange-trieben und systematisiert. Parallel zu den Informatikarbeiten wurden Abbauexperi-mente im Labor zu stoffspezifischen Fragestellungen durchgeführt. Für die Ausar-beitungen der Stoffklassen (Module) siehe Anlagen 4 - 13 zu diesem Bericht.

Im Folgenden wird für die Stoffklasse der Imidazole exemplarisch gezeigt, wie dieAbleitungen von Struktur – Abbau – Relationen im Einzelnen durchgeführt wurden.Zunächst erfolgte für die jeweilige Stoffklasse eine Literaturrecherche und –auswer-tung gemäß der Arbeitsanweisung in Anlage 8. Die relevanten Ergebnisse wurden indie projekteigene Datenbank BISS eingespeist.

Im Anschluss wurde eine Recherche in dieser Datenbank und der BASF-eigenenDatenbank BASIS durchgeführt. In BASIS werden, unabhängig von dem hier vorlie-genden Projekt, die für die Umwelt und Sicherheit relevanten Stoffdaten für alleBASF-Produkte eingespeist.

Abb. 1 zeigt in einem Ausschnitt aus der BISS-Datenbank die experimentellen Ab-baudaten für die Leitstruktur dieses Submoduls, das Imidazol-Strukturformel. In Abb.2 ist ein Teil der Ergebnisse der Substruktursuche für diese Leitstruktur tabellarischdargestellt, wie sie mit der verwendeten Software erhalten wurde. Die Ergebnissewurden gemäß experimentellem Abbaugrad geordnet und als Grafik in Abb. 2b dar-gestellt. Die abgeleiteten Gesetzmäßigkeiten wurden in Form eines Entscheidungs-baumes formuliert. Bevor dieser Entscheidungsbaum als Vorlage für die Program-mierung des Expertensystems BIOLINK verwendet werden konnte, wurden dieBASF-seitig erarbeiteten Ergebnisse durch die Arbeiten der Universität Konstanz er-gänzt und in entsprechenden Dossiers beschrieben (siehe Anlagen 4 – 7).


10

Abb.1Ausschnitt der BISS-Datenbank mit den experimentellen Abbaudaten für die Substanz Imidazol.


11

Abb. 2Substruktursuche für die Leitstruktur Imidazol mit der Software ISIS for Excel

Abb. 2a: Ausschnitt aus der Excel-Tabelle, die einen Teil der Ergebnisse einer Substruktursuche für Imidazol dargestellt.

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

IMIDAZ

OLE

4-METH

YL

2-METH

YL

2-ETH

YL°

2-ISO

PROPYL

2-ETH

YL-4-

METHYL

5-AMINO-4-

CARBOXA

MIDE

1-METH

YL°

1-VINYL

2-PHENYL

5-NITR

O

1,2-D

IMET

HYL

2-MET

HYL-4-

NITRO

N-(3-

AMINOPROPY

L)

1,2-D

IMET

HYL-5-

NITRO

2-ISO

PROPY

L-5-N

ITRO

1-cya

nethy

l-2-et

hyl-5

-meth

yl*

1-CYA

NETHYL

*

1-VINYL

-2-MET

HYL*

B I O D E G R A D A T IO N O F IM ID A Z O L E D E R IV A T IV E S

Maximum Degradation te st r esu ltM in imum Degradation test r esult

B iodegradation tes t OE C D 3 02B w ith in d ustr ial s lu d ge(° wi th m unic ipal sludge; * O E C D 3 0 1-test)

N

N

N

NN

N N

N

N

N N

N

N

N

N

O

N

N

N

N

N

N

N N

NN

O

O

N

N

N

NNO

O

N

N

N

N

NN

O

O

N

NN

O

O

N

N

N

N

N

N

N

N


12

Abb. 2b: Grafische Darstellung der gemessenen Abbaugrade für die verschiedenen Imidazolderivate.

Folie 8 wm0782 ZH/T Juni 2000

Experimental Toxicology and Ecology

IUPAC NM E MOLSTRUCTUREABBAU O P R

ABBAU M IN

ABBAU M AX M ETHOD NEW

HENRY GROUP

KOW EST

IM IDAZO L 81 91 OECD 303A , Simulation 0,06

1 ,2-D IMETHYLIM IDA ZO L < 10 OECD 302B , Zahn-W ellens 1,15

1 -CYANETHYLIM IDA ZO L 0 10 OECD 301A , DOC Die-Away 0,12

1 -CYANOETHYL-2-E THYL-4 (5)METHYL-IMIDAZOL 0 10 OECD 301A , DOC Die-Away 1 ,7

1 -ME THYLIMIDA ZOL < 30 OECD 302B , Zahn-W ellens 0,61

1 -ME THYLIMIDA ZOL 2 OECD 302B , Zahn-W ellens 0,61

1 -VINYLIMIDAZOL < 20 OECD 302B , Zahn-W ellens 0,96N N

CH2

NNCH3

N

N

CH3

CH3

NNN

C H3

C H 3

N

N

N

N

NH


13

3.2.3. Projektphase III

In Projektphase III wurde das Expertensystem BIOLINK für die Vorhersage der biologi-schen Abbaubarkeit von Stoffen an der Universität Heidelberg (später Universität Trier)programmiert. Zeitlich überlappte diese Projektphase mit Projektphase II. Das Experten-system wurde in Visual Basic so programmiert, das die Anwender die erforschten wis-senschaftlichen Ergebnisse selbst einarbeiten konnten. Mit dieser neu entwickelten Soft-ware hat der Anwender Zugriff auf die erarbeiteten Zusammenhänge zwischenchemischer Struktur und Bioabbaubarkeit. Darüber hinaus bietet die Benutzeroberflächedie notwendigen Voraussetzungen für die Bearbeitung und Speicherung aktueller SBR-Fragestellungen. Diese Software ist daher auch für die Bearbeitung von SAR-Fragestellungen in anderen Fachgebieten einsetzbar. Sie ist mit folgenden Funktionenausgestattet (für die Detailbeschreibung s. Anlage 2):

Datenzugriff auf:

• Datenbank(en)• Worddokument-Ablage (systemintern)• PDF-Dokumente• Internetaddressen

• Datenspeicherfunktionen:• Enthält ca. 6700 verschiedene Substanzstrukturen bzw. Stoffmischungen (BASF-

Produkte) plus dazugehörige Abbaudaten sowie physikalische und chemische Eck-daten

• Strukturbasierte Datenrecherchierfunktionen

• Prädiktionsfunktionen


14

3.3. PROJEKTERFOLG UND ZUKUNFTSAUSSICHTEN

Die geplanten Forschungsziele wurden vollständig erreicht, bezüglich Quantität der be-arbeiteten Einzelmodule sogar übertroffen. An dieser Stelle gilt den engagierten undkompetenten Projektmitarbeitern ein besonderer Dank. Als besonders vorteilhaft wird dieAusbaufähigkeit des Systems gesehen:

1. Das System kann bei Bedarf um Funktionen des ‚molecular modelings‘ erweitert wer-den.

2. Die etablierte Softwarekombination kann leicht auf andere Forschungsgebiete (zumBeispiel ökotoxikologische Fragestellungen) übertragen werden.

3. Das Expertensystem BIOLINK wurde so flexibel programmiert, dass es kontinuierlichweiter ausgebaut werden kann. Jede hinzukommende SAR-Ableitung wird systema-tisch entsprechend der chemischen Struktur abgespeichert und steht zusammen mitallen bisherigen SBR-Ergebnissen für neue Fragestellungen zur Verfügung.

4. Die in das Expertensystem BIOLINK integrierte Datenbank BISS kann mit weiterenDatenbeständen aus anderen Datenbanken (zum Beispiel aus dem Internet) ergänztwerden.

5. Es können weitere ISIS BASE Datenbanken in das System integriert werden, wie bei-spielsweise die Biochemicals Pathway Reaction Database Computer-Chemie-CentrumDatenbank (Arbeitsgruppe Prof. Gasteiger , Universität Erlangen).

6. Über Internet-Links können externe Faktendatenbanken abgerufen werden, wie diesfür die UMBB Datenbank bereits realisiert wurde.

4. VORAUSSICHTLICHER NUTZEN UND VERWERTBARKEIT DER ERGENISSE

In vielen OECD-Länder besteht seit etlichen Jahren ein erhebliches Interesse an geeig-neten QSAR-Studien zu ökologischen Stoffeigenschaften von auf dem Markt befindlichenChemikalien. Vor dem Hintergrund der aktuellen internationalen Aktivitäten (QSAR TFder ECETOC; SETUBAL ICCA Workshop on the Regulatory Acceptance of QSARsMarch 2002; OECD QSAR Special Session Nov. 2002: „Risk Assessment, Possible O-ECD activities related to the use and regulatory acceptance of (Q)SARs; OECD/ECBWorkshop on QSAR Acceptability Criteria 03) gewinnen die in diesem Projekt geleistetenArbeiten an besonderer Bedeutung. Die genannte ECETOC Task Force kommt zu demSchluss, dass SAR-Systeme in aller Regel nur dann geeignet sind, wenn sie die Mecha-nismen, die einer vorherzusagenden Stoffeigenschaft zu Grunde liegen, mit in Betrachtziehen. Diese Schlussfolgerung bestimmte auch den gewählten methodischen Ansatzdes vorliegenden Projektes. Damit sind die erbrachten Leistungen auch für die zukünftigeSAR-Forschung von dauerhaftem Wert.Der in diesem Projekt verfolgte Ansatz gelangte über eine Integration des Universitäts-und industrieseitig vorhandenen Wissens zu wissensbasierten zuverlässigen Vorhersa-gen bezüglich der Abbaubarkeit nicht-geprüfter Stoffe. Es gelang die Erarbeitung einer


15

großen Anzahl von Stoffmodulen. Eine Auswahl der teilweise sehr umfassend bearbeite-ten Module ist nachfolgend aufgelistet:

1. Aromatenabbau1.1. Modul Chloraromaten (Anlage 3)1.2. Modul Nitroaromaten (Anlage 4)1.3. Modul monozyklische Sulfonate (Anlage 51.4. Modul Naphthalinsulfonate (Anlage 6)

2. Modul Alkansulfonate (Anlage 7)

Zu den besonderen Erfolgen dieses Projekts zählt die Erarbeitung der Module zum Ab-bau N-heterozyklischer Verbindungen (s. Anlagen 9 - 14). Mit der Bearbeitung diesesHauptmoduls, das in entsprechende Einzelmodule untergliedert wurde, konnte auf ein-drucksvolle Weise die Brauchbarkeit des diesem Projekt zugrunde liegenden methodi-schen Ansatzes für SAR-Ableitungen gezeigt werden. Die Kombination von Expertenwis-sen und statistischen Computermodellen führte zur Ableitung von Abbauregeln, mitdenen sich die Abbaubarkeit von Neustoffen gut vorhersagen lässt.

Wiewohl der Anteil an N-heterozyklischen Verbindungen bei den in den letzten Jahrenangemeldeten Neustoffen besonders hoch war, lagen für einige Stoffklassen dieses Mo-duls nur wenige wissenschaftliche Untersuchungen zum Abbau und Metabolismus vor.Daher haben die erarbeiteten Erkenntnisse Bedeutung sowohl für die Grundlagenfor-schung, die Neustoffentwicklung als auch bezüglich sicherheits- und umweltrelevanterAspekte der im Handel befindlichen N-Heterozyklen.

Die Projektergebnisse wurden einem fachlich interessierten Publikum in einer Reihe vonVorträgen auf unterschiedlichen BASF-internen und externen Veranstaltungen, zweiPostern und in mehreren Publikationen vorgestellt.


16

5. ERFOLGTE UND GEPLANTE PUBLIKATIONEN

5.1. VORTRÄGE

1. D. B. Beimborn (1999). Struktur – Bioabbau – Beziehungen. Info-Veranstaltung(Q)SAR-BIOABBAU Zwischenbericht eines BMBF-Projekts und Vorstellung der Soft-ware SPOTFIRE und CHESHIRE, 30.6.99; organisiert vom Labor für Ökologie derBASF AG, Ludwigshafen.

2. E. Rorije (1999). Struktur – Abbau – Beziehungen von sulfonierten Aromaten. Info-Veranstaltung (Q)SAR-BIOABBAU Zwischenbericht eines BMBF-Projekts und Vor-stellung der Software SPOTFIRE und CHESHIRE, 30.6.99; organisiert vom Labor fürÖkologie der BASF AG, Ludwigshafen.

3. F. Germa (1999). Struktur – Abbau – Beziehungen von nichtionischen Tensiden. Info-Veranstaltung (Q)SAR-BIOABBAU Zwischenbericht eines BMBF-Projekts und Vor-stellung der Software SPOTFIRE und CHESHIRE, 30.6.99; organisiert vom Labor fürÖkologie der BASF AG, Ludwigshafen.

4. B. Schink (1999). Anaerober Abbau von phenolischen Verbindungen, Polyethylengly-col und nichtionischen Tensiden. Info-Veranstaltung (Q)SAR-BIOABBAU Zwischen-bericht eines BMBF-Projekts und Vorstellung der Software SPOTFIRE und CHESHI-RE, 30.6.99; organisiert vom Labor für Ökologie der BASF AG, Ludwigshafen.

5. A. M. Cook (1999). Characterized reactions in aerobic and anaerobic utilisation of li-near alkylbenzenesulfonate (LAS). Info-Veranstaltung (Q)SAR-BIOABBAU Zwischen-bericht eines BMBF-Projekts und Vorstellung der Software SPOTFIRE und CHESHI-RE, 30.6.99; organisiert vom Labor für Ökologie der BASF AG, Ludwigshafen.

6. J. Waterman-Smith (1999). Spotfire – Interactive Data Visualisation & Datamining.Info-Veranstaltung (Q)SAR-BIOABBAU Zwischenbericht eines BMBF-Projekts undVorstellung der Software SPOTFIRE und CHESHIRE, 30.6.99; organisiert vom Laborfür Ökologie der BASF AG, Ludwigshafen.

7. J. Waterman-Smith (1999). Spotfire – Example Applications in Chemical & BiologicalResearch. Info-Veranstaltung (Q)SAR-BIOABBAU Zwischenbericht eines BMBF-Projekts und Vorstellung der Software SPOTFIRE und CHESHIRE, 30.6.99; organi-siert vom Labor für Ökologie der BASF AG, Ludwigshafen.

8. Bandara (1999). Sophisticated Interpretation of Structure Property Relationship withCheshire and Spotfire. Info-Veranstaltung (Q)SAR-BIOABBAU Zwischenbericht einesBMBF-Projekts und Vorstellung der Software SPOTFIRE und CHESHIRE, 30.6.99;organisiert vom Labor für Ökologie der BASF AG, Ludwigshafen.


17

9. J. Waterman-Smith (1999). Chemical Business Rule Management by MDL. Info-Veranstaltung (Q)SAR-BIOABBAU Zwischenbericht eines BMBF-Projekts und Vor-stellung der Software SPOTFIRE und CHESHIRE, 30.6.99; organisiert vom Labor fürÖkologie der BASF AG, Ludwigshafen.

10. C. Helma, S. Kramer, De Raedt (2000). Datamining in chemischen, biologischen undUmweltdatenbanken. Info-Veranstaltung im Rahmen des BMBF-Projekts (Q)SAR-BIOABBAU, 6.12.2000; organisiert vom Labor für Ökologie der BASF AG, Ludwigs-hafen.

11. D. B. Beimborn (für 2003 geplant). Computer-aided Design of Biodegradable Chemi-cals. ACHEMA 2003 – 27. International Meeting on Chemical Engineering, Environ-mental Protection and Biotechnology Frankfurt/Main.

5.2. POSTER

1. D. B. Beimborn, F. Germa, E. Rorije, B. Philipp, B. Schink (2000). BiodegradabilityTesting & SAR; Imidazole Derivatives. QSAR 2000 Conference, Dunes, Bulgarien,Sep. 2000. (Anlage 13)

2. E. Rorije, D. B. Beimborn, F. Germa, M. Hoff, V. Mersch-Sundermann, B. Philipp,A. M. Cook, B. Schink (2000). QSAR-Biodegradation; Prediction of Microbial Degra-dation of Imidazole Compounds. Poster auf der BASF AG-internen VeranstaltungExploratorische Forschung, Ludwigshafen Oktober 2000. (Anlage 12)

5.3. PUBLIKATIONEN

1. D. B. Beimborn, B. Schink, A. M. Cook, V. Mersch-Sundermann, (1999). BiologischerAbbau - Expertensysteme helfen mit. Herausgeber: Bundesministerium für Bildungund Forschung und Deutsches Zentrum für Luft und Raumfahrt e. V. Bonn. Bezug:BMBF – Referat Öffentlichkeitsarbeit (www.bmbf.de) (Anlage 14)

2. B. Philipp, F. Germa, M. Hoff, B. Schink, A. M. Cook, V. Mersch-Sundermann, E. Ro-rije and D. B. Beimborn (in Vorbereitung). Structure-Activity Relationships (SAR) foraerobic biodegradation of N-heterocyclic compounds: Computer-assisted structuralanalysis and biochemical explanations. (Anlage 10)

3. E. Rorije, D. B. Beimborn, F. Germa, M. Hoff, V. Mersch-Sundermann, B. Philipp, A.M. Cook, B. Schink (2000). QSAR-Biodegradation; Prediction of Microbial Degradati-on of Imidazole Compounds. ZH Forschungsnotiz des Hauptlaboratoriums der BASFAG. (Anlage 11)


18

4. E. Rorije, F. Germa, B. Philipp, B. Schink and D. B. Beimborn (erscheint in SAR &QSAR in Environmental Sciences 2002 oder 2003). Prediction of Biodegradabilityfrom Structure: Imidazoles. (Anlage 9)

6. Peijnenburg, W.J.G.M. (Ed.), Damborsky, J. (Ed.) (1996). Biodegradability Prediction.NATO Asi Series. Series 2, Environment, Vol. 23. Kluwer Academic Publ., Dordrecht

ANLAGE 1: Arbeitsschritte und Zeitplan (Balkenplan)98 1999 2000 2001

Arbeitsschritte IV I II III IV I II III IV I II III IV

COMPUTERGESTÜTZTE NEUSTOFFENTWICKLUNG VONÖKOLOGISCH FORTSCHRITTLICHEN PRODUKTEN

Recherchier- & SAR-Einheit (BASF AG)

Projektphase IPC und Software-Install: ISIS-Draw &ISIS for Excel; Excel Einarbeitung; ISIS-Kurse etc.

Entwicklung der Abbaudatenbank BISS; Integration der Abbaudaten der Stoffe aus derÖkodatei, IUCLID,MITI, BIODEG und ihrer Strukturformeln in die Abbaudatenbank BISS.Programmierung einer ISIS-Schnittstelle zu BASIS

Projektphase II

Aufbau der Module mit ISIS/Excel-, Multicase-, und Worddateien (Module s. Antragstext),

Projektbegleitende Laboruntersuchungen z. Abbaubarkt. v. Stoffen und Einspeisung derErgebnisse in BISS; Einspeisung von Abbauergebnissen aus der Literatur in BISS.Aufbau der Reference Manager Datenbank mit der verwendeten wissenschaftl. Literatur.

Fakultät für Biologie der Universität Konstanz

A) Literaturdatensichtung

B) ab November 99: SAR-Ableitungen und Erstellung von Modulen

QSAR-/Expertensystem-Einheit (Uni Heidelberg)

Hard/Software-Installation (MULTI- u. METACASE,...)

Einarbeitung des neuen Mitarbeiters m. USA-ReiseProjektphase III

Expertensystemgenerierung u. Evaluierung;fachlicher Ausbau des Expertensystems BIOLINK, Auswertung von Datenbanken mitMULTICASE, die von der BASF erstellt wurden

Anmerkungen: Das Projekt wurde kostenneutral verlängert bis 31.12.2001.

Universität Trier

Institut f. Toxikologie und Ökotoxikologie FB VI - Geozentrum H919

Universität Trier 54286 Trier

BIOLINK (II)

Schlußbericht zum BMBF-Teilprojekt Entwicklung eines Expertensystems zur Beurteilung der

Bioabbaubartkeit von Chemikalien

Projektleitung: Prof. Dr. med. Volker Mersch-Sundermann

Institut f. Toxikologie und Ökotoxikologie Universität Trier

Dipl.-Ing. Malte Hoff Prof. Dr. med. Volker Mersch-Sundermann

Juli 2001

BMBF Förderkennzeichen 1461142 Computergestützte Neustoffentwicklung von ökologisch fortschrittlichen Produkten

Entwicklung eines Expertensystems zur Beurteilung der Bioabbaubarkeit von Chemikalien: BIOLINK

Inhalt

1) Vorbemerkung 1

2) User(Browse)-Interface 2

3) Isis-Browser 4

4) Verknüpfung der SAR-Module: Interne Links 6

4.1) Umsetzung der internen Links 7

4.2) Interne Links und Datenstruktur 7

5) Relative Pfade zu Kurzinfos und Documents 9

6) Startfenster: Wahl der Informationsabfrage 12

7) Strukturbasierte Biolink-Abfragen 13

8) Ausblick: Anwendung der neuen Clipboardschnittstelle 14

1

1) Vorbemerkung

Dieser Schlußbericht stellt die Weiterentwicklungen von Biolink dar. Er ist

gleichzeitig eine Kurzanleitung für das nun vorliegende Biolink (II) und gibt

Nutzungsempfehlungen für die neuen Funktionen. Auf die diesen Neuerungen

zugrundeliegenden Umstellungen auf Programm- und Datenebene wird in diesem

Bericht nicht weiter eingegangen. Es sei aber erwähnt, daß alle bisher

eingegebenen Daten vollständig in Biolink (II) übernommen wurden. Speziell dafür,

also zum einmaligen Gebrauch, wurden Datenkonverter entwickelt, nachdem

beispielsweise die Verarbeitung und Speicherung von Molekül-Strukturen in Biolink

vollständig auf das Isis-Datenbank Format umgestellt wurde.

Zur Einführung in Biolink und zur begrifflichen Definition, wird gebeten, den

Zwischenbericht vom Januar 2001 einzusehen.

Da sowohl der technische Hintergrund (Programmentwicklung, Betriebssystem),

wie auch die zugrundeliegenden Daten und das Biolink-Interface selbst auf der

englischen Sprache basiert, wurde zur Vereinfachung auf eine klare Trennung von

englischen und deutschen Bezeichnungen verzichtet. U. a. folgende Begriffe werden

je nach Zusammenhang synonym verwendet: [Daten -Tree, -Baum]; [Link,

Verknüpfung, Verweis]; [Branch, Zweig, Seite]; [...].

2

2) User(Browse)-Interface

Die bisherige "Journal"-Form des User(Browse)-Interface bleibt erhalten: Dem

"Leser" (User) wird jeweils eine "Seite" (Branch) angeboten, mit "Headline"

(Message/Anweisungs-Feld im Navigations-Rahmen), einem "Abstract" (Kurzinfo), der

Hintergrundinformation ("more"-Button) und orientierender "Illustration" (Structure-Box). Im

Unterschied zu einem Journal "blättert" der User nicht zur nächsten Seite, sondern springt (über

das Angebot in der Answer-List) zu der Seite, die ihn seiner Fragestellung näher bringt und er

hat die Möglichkeit, Kommentare und Molekülstrukturen der jeweils geöffneten Seite

hinzuzufügen, wobei für die Struktureingaben sofort erste Berechnungen durchgeführt werden

wie Smiles, Henry-Koeffizienten und Kennwerte zum biologischen Abbauverhalten [vergl.

Zwischenbericht].

Drei Neuerungen, die auf Anregung der BASF umgesetzt wurden, sind im User(Browse)-

Interface sichtbar:

1. Die Hintergrundinformation ("more"-Button), die bisher MS-Word Dokumenten vorbehalten

war, kann jetzt in jedem beliebigen registrierten Dateityp angeboten werden, also auch als

Excel-Sheet, Html-Seite, Pdf-Dokument usw.. Wie bisher zeigt der Status des "more"-Buttons

(enabled/anklickbar oder disabled/nicht anklickbar/grau unterlegt) an, ob ein Dokument im

vorliegenden Zusammenhang angeboten wird oder nicht. Neu ist, daß der Name des

Dokumentes als QuickInfo (gelbes Label, das beim Verweilen des Cursors eingeblendet wird)

angekündigt wird.

2. Als "Zugangs-Tool" zu Daten und Hilfsprogrammen, soll Biolink auch jederzeit die

Sprungadresse zu anderen Programmen und externen Informationsquellen zur Verfügung stellen.

Diese Funktion ist als jederzeit zugängliches Pull-down Menü (Mausklick auf "->i") umgesetzt

(Bild 1).

Neben den Editoren Word und Excel, den Isis-Programmen "Base" und "Draw", erscheint in

dem Pull-down Menü auch eine Liste relevanter Weblinks, die durch einfachen Mausklick

direkt auf die Html-Seite von z. B. UMBBD (Univ. Minnesota), Chemfinder (Cambridge Soft)

3

oder EPA (Query-Input) verzweigen. In den Settings können diese Weblinks in beliebiger

Anzahl einschließlich eines jeweils treffenden Namens, der dem User im Pull-down Menü

angeboten werden soll, eingegeben/verändert werden.

3. Neben dem "go-back"-Button befindet sich der neue Button "check isis-db". Diese

Funktionalität stellt den denkbar schnellsten und einfachsten Weg zur Isis-Datenbank Abfrage

der BASF "Biss"-Datenbank dar und wird im folgendem Kapitel vorgestellt.

Bild 1: User(Browse)-Interface mit Sprungfunktion zu externen Hilfsprogrammen und Datenquellen als Pull-Down Menü

4

3) Isis-Browser

Der Isis-Browser soll nicht das Programm Isis-Base ersetzen, sondern für eilige Biolink-User

oder User ohne Vorkenntnisse in Isis-Base einen schnellen Überblick über die "Biss"-

Datenbank der BASF ermöglichen, sowie die Suchfunktionalität so einfach und schnell wie

möglich zur Verfügung stellen.

Ein Zwischen-Release von Biolink enthielt bereits einen Vorläufer dieser Funktionalität, der in

den Datenbankfeldern IUPAC-Name und Molstructure nach Substrings bzw. nach Substrukturen

suchte.

In der vorliegenden Version können alle Felder nach allen Suchkriterien (exact, substructure,

größer/kleiner als, exists usw.) abgefragt werden, jeweils als Abfrage der kompletten

Datenbank oder als Suche im bisherigen Suchergebnis (kombinierte Suche). Dabei ist der Isis-

Browser unabhängig von Aufbau oder Version der Datenbank, da beim ersten Start automatisch

die jeweilige Datenbank auf alle Felder einschließlich aller Unterfelder durchsucht wird. Aus

der Liste gefundener Felder (in der "Biss"-Datenbank zur Zeit mehr als 150) werden einmalig

die wichtigsten per Mausklick markiert und stehen dann zur Datenanzeige und als Suchfeld zur

Verfügung (Bilder 2 A-C). Als Zusatzfunktion können über den Button "view in WebLab"

einzelne Moleküle zur 3-D Ansicht in das Fenster des WebLab-Viewers kopiert werden (und

dort während einer Session gesammelt werden, siehe Bild 2 D).

5

Bild 2: Isis-Browser mit automatisch generierter Liste aller Datenbankfelder (A); in der Standardansicht mit einer Auswahl dieser Felder (B), mit denen sich durch Doubleclick eine

D

C

A

B

6

Datenbankabfrage durchführen läßt (C); Strukturen können zur 3-D Ansicht in den WebLabViewer exportiert werden (D)

7

4) Verknüpfung der SAR-Module: Interne Links

Wie im Zwischenbericht 01-2001 dargestellt, liegen dem Biolink Datenkonzept die von den

Projektpartnern (Univ. Konstanz; BASF) entwickelten SAR-Module zugrunde, deren interner

Aufbau, wie auch deren Verknüpfung miteinander als Baumstruktur umgesetzt wurde. Hieraus

wurde das im genannten Zwischenbericht dargestellte, transparente und stabile Datensystem

entwickelt, dessen Konsistenz sich bereits aus den Dateinamen ergab.

Im Laufe der Arbeit mit Biolink (Dateneingabe) wurde deutlich, daß es sinnvoll wäre,

innerhalb dieses Datenbaumes Verknüpfungen, also Sprungverbindungen von einem Branch

(Zweig des Datenbaumes) zu einem anderen, der sich in einem anderen Modul oder auf einer

anderen Ebene des Datenbaumes befindet, zu ermöglichen.

Zwei Überlegungen verdeutlichen dies:

1.) Je mehr SAR-Module entwickelt bzw. je dichter das Feld möglicher Molekül-Strukturen

durch diese SAR-Module abgedeckt wird, desto häufiger und enger werden die

Verwandtschaften zwischen diesen Modulen und um so wahrscheinlicher werden auch

Überlappungen.

In solchen Fällen könnte nach dem bisherigen Konzept die der Überlappung entsprechenden

Fragmente anderer Module kopiert werden. Auf diese Weise würde zwar die strenge

Baumstruktur erhalten bleiben, es ergäbe sich jedoch eine Datenredundanz, die nicht nur aus

Speicherplatzgründen, sondern auch im Hinblick auf künftige Datenänderungen (und der damit

verbundenen Problematik der simultanen Anpassung der selben Daten an verschiedenen

Speicherorten) vermieden werden sollte.

2.) Es hat sich gezeigt, daß Biolink (über den ursprünglichen Verwendungszweck hinaus) sich

auch zur Aufnahme chemischer Systematiken eignet. So wurde von der BASF die Beilstein-

Nomenklatur (als Hilfsmittel zur Datenablage) in Biolink umgesetzt.

Die Verknüpfung dieses Konzepts auf Datenebende mit den kausalen SAR-Modulen, kann nur

sinnvoll durch interne Links verwirklicht werden.

8

4.1) Umsetzung der internen Links

Die Nutzung dieser Funktion ist wieder so einfach wie möglich: Soll ein Doubleclick auf die

Answer-List zu einem Sprung auf einen bestehenden Branch führen, wird bei der Dateneingabe

wie bisher (ebenfalls durch einfachen Doubleclick) ein neuer, leerer Branch erstellt und dieser

mit dem "convert to link"-Button zu einer Verknüpfung umgewandelt. Nach Betätigen dieses

Buttons erscheint der Button "set link" (leuchtend grün). Der User(edit) bewegt sich dann auf

die Seite(/den Branch), die zukünftig anstelle des neuen, leeren Branches angezeigt werden soll

und etabliert dort den Link durch Betätigen dieses "set-Link"-Buttons.

Der Link kann, wie die "normalen" Branches auch, gelöscht und/oder modifiziert neu erstellt

werden. Im Edit-Modus wird explizit angegeben ob es sich um einen Link handelt und wohin

dieser verzweigt. Im Run/Browse-Modus weist lediglich ein kurzes Aufblinken "linked branch"

auf einen internen Link hin.

Der Eindruck, im Browse-Modus sicher durch die Daten geführt zu werden, bleibt erhalten:

Der "go back"-Button enthält intern eine History-List, die den Weg des Users speichert, so daß

der User wie gewohnt seinen Weg zurückverfolgen kann, auch wenn dieser "kreuz und quer"

durch die Module führte. Während der Dateneingabe im Edit-Modus ist die ursprüngliche

"go up"-Funktionalität erhalten, es wird also die Baumstruktur immer Richtung Root

zurückverfolgt.

4.2) Interne Links und Datenstruktur

Im Zuge der Einführung des internen Links, konnte auch die Datenstruktur des SAR-Trees so

modifiziert werden, daß sich mehr Übersicht und eine größere Flexibilität bei der Gestaltung

des Datenbaumes ergibt: Bisher startete der User im Browse-Modus immer an der Wurzel des

Baumes (Root, ID 1) und sollte dieser Baum umstrukturiert werden, mußte auch das

Dateisystem umgeschrieben werden. Jetzt ist programmintern festgelegt, daß der User im

Browse-Modus nicht mehr an der Wurzel, sondern am ersten Zweig (ID 1'1) startet. Alle

9

Module sind ebenfalls auf dieser Ebene abgelegt (ID 1'2, 1'3, usw.). Die Module werden also

von der User-Startpage nur noch durch interne Links angesprochen.

Die Vorteile sind offensichtlich:

• Auch wenn bei sehr großen Modulen/Trees eine Neustrukturierung stattfindet, kommt es zu

keiner Systembelastung durch umfangreiche Dateineubenennungen, das Filesystem ist

statisch1.

• Im Edit-Modus stehen dem User alle Module, ob im Entwicklungsstadium oder nicht,

geordnet nebeneinander als Bausteine zur Verfügung.

• Dem User im Browse-Modus wird nur der jeweils optimierte und aktuelle Datenbaum

angeboten.

1 Das Edit-Fenster weist keine "copy branch"-, "copy tree"- oder "paste branch"-Buttons mehr auf, denn das interne Linken ersetzt diese Funktionen. Weggefallen ist ebenfalls der "move up"-Button zum Sortieren der Answer-List. Per Drag+Drop (ziehen mit der Maus) ist diese Routine jetzt deutlich schneller und flexibler.

10

5) Relative Pfade zu Kurzinfos und Documents Auf Wunsch der BASF wurden alle über den "more"-Button aufrufbaren Dokumente (vergl.

Kap. 2) im Biolink-Datenverzeichnis abgelegt, so daß die Links dorthin nur noch einen

relativen Pfad enthalten. Damit ist sichergestellt, daß alle User, die Zugriff auf die Biolink-

Daten haben, auch auf die gelinkten Dokumente zugreifen können, es besteht also eine

einheitliche Zugangsberechtigung. Hierdurch gestaltet sich außerdem das Linken der Documents

für den User im Edit-Modus komfortabler, denn durch einfachen Mausklick stellt Biolink eine

Liste aller verfügbaren Dokumente zur Wahl (Bild 3).

Bild 3: Linken von Hintergrunddokumenten, Listenauswahl

Die Kurzinfos (Abbildungen 1-seitiger Word-Dokumente, die dem User sofort angezeigt

werden) werden jetzt ähnlich gehandhabt. Statt wie bisher direkt eingebunden, werden diese

jetzt indirekt als Link adressiert, das heißt, die Kurzinfos werden jetzt ebenfalls separat im

Datenpool abgespeichert, können also mit einem aussagekräftigem Namen versehen und

beliebig oft wiederverwendet werden. Da wieder nur Links gesetzt werden, wird jegliche

Datenredundanz vermieden.

11

Die Kurzinfo ist eine der wichtigsten Funktionen in Biolink. Im Konzept des hierarchischen

Daten- und Informationsangebotes stellt sie das Bindeglied zwischen der ein- bis zweizeiligen

Message-Box und der Hintergrundinformation im gelinkten Dokument: Da Ole-basiert, ist sie

sofort für den User sichtbar und muß nicht (wie die Documents) separat geladen werden.

Andererseits kann ihr Layout (im Gegensatz zur Message-Box) mit allen Mitteln, die MS-Word

zur Verfügung stellt (einschließlich der Einbindung von Graphiken), gestaltet werden, um dem

User

• eine Orientierungshilfe zu geben (wo befindet er sich im Datenpool?),

• einen Ausblick/Hinweis auf den Inhalt des gelinkten Hintergrunddokumentes zu geben,

• zusätzliche Informationen anzubieten, die die Message-Box oder die Structure-Box nicht

leisten können

Bild 4: Kurzinfo-Browser und -Editor

12

Es stehen dem User dazu zwei Ansichten zur Verfügung (die Standardansicht im Run-Fenster

und die separate "enlarge"-Ansicht). Durch geeignete Wahl der Schriftgrößen werden somit im

"enlarge"-Fenster weitere Informationen (in kleiner Schrift) zugänglich, auf die in der

Standardansicht in Form von Überschriften (große Schrift) hingewiesen wird. Die Kurzinfos

sollten einheitlich gestaltet werden (beispielsweise die drei oben genannten Punkte in der

selben Reihenfolge und Farbe) um dem User Datenerfassung "auf einen Blick" zu ermöglichen.

Da von dieser Möglichkeit bisher zu wenig Gebrauch gemacht wurde, steht jetzt in Biolink ein

Kurzinfo-Browser und -Editor zur Verfügung (Bild 4). Er enthält eine Liste mit allen bisherigen

Kurzinfos, die durch Anklicken sofort sichtbar werden und in beiden Run-Modus-Formaten

betrachtet werden können. Durch Doubleclick auf die angezeigte Kurzinfo, wird diese zum

Editieren direkt in Word geöffnet und kann mit dem "save as"-Button unter dem bisherigem oder

einem neuen Namen gesichert werden. Neue Kurzinfos können wie bisher durch den Button

"paste from clipboard" nach Erstellen in Word und Kopieren in die Zwischenablage erstellt

werden.

13

6) Startfenster: Wahl der Informationsabfrage

Mit steigendem Funktionsumfang wird es sinnvoll, den User bereits unmittelbar nach

Programmstart dabei zu unterstützen, die Art der Biolink-Informationsabfrage seinem

Informationsbedarf anzupassen. Die neue Startseite, die nach dem Programmstart erscheint,

(Bild 5 A) bietet dem User:

• die "klassische", textbasierte Abfrage des SAR-Trees über den gleichnamigen Button, der

direkt zum Browse-Modus führt, von wo weiter verzweigt werden kann (Beilstein-

Systematik; direkt zu den SAR-Modulen; ...).

• zunächst im Isis-Browser eine Schnell-

abfrage durchzuführen;

• oder – und dies stellt wieder eine neue

Funktionalität in Biolink dar – per

Struktureingabe sich eine Übersicht zu

verschaffen, ob wo und wie oft

"seine" Struktur in den von Biolink

zugänglichen Strukturdatenbanken

vorliegt:

Bild 5: BIOLINK-Startpage (A) mit Struktursuche im Daten-Tree (B)

A

B

14

7) Strukturbasierte Biolink-Abfragen

Da diese Funktion der Orientierung dient, ist sie vollständig in die Programmstartseite

integriert. Nach Betätigung des "mol-query"-Buttons öffnet sich Isis-Draw zur Struktureingabe.

Nach Schließen von Isis-Draw werden automatisch 6 Datenbankabfragen durchgeführt: Jeweils

eine exakte und eine Substruktur-Suche in den Usermolekülen, den Leadstructures der Structure-

Box und in der "Biss"-Datenbank. Die Ergebnisse dieser Abfragen werden auf Textbuttons

angezeigt und sind sofort abrufbar (Bild 5 A).

Abrufbar heißt, im Falle der "Biss"-Datenbank, daß die Moleküle/das Molekül einschließlich

verfügbarer Daten im Isis-Browser angezeigt werden/wird, bei Fundstellen in den Userinputs

werden die zugehörigen User-Input-Fenster geöffnet und im Falle der Leadstructure-Datenbank

wird direkt der entsprechende Branch im Browse-Fenster geladen. Im Fenster des Browse-

Modus wird dann ein zusätzliches Navigationsfeld eingeblendet, mit dem ggf. mehrere

Fundstellen "durchgeblättert" werden können ("previous"- und "next"-Buttons), bzw. über einen

"back"-Button zurück zur Übersicht der Suchergebnisse (Programmstartseite) gelangt werden

kann (Bild 5 B).

15

8) Ausblick: Anwendung der neuen Clipboardschnittstelle Biolink (II) unterstützt zwei neue Schnittstellen:

• Den Programmstart mit Sprung zu einer vorgegebenen Adresse im Datenbaum durch

Erstellen einer temporären Datei "AutoExec" im Anwendungsverzeichnis von Biolink, in

der diese Adresse abgelegt ist2

• und eine Clipboard-basierte Schnittstelle, mit der Biolink zur Laufzeit angesteuert werden

kann, um 1. den Windowstatus zu setzen (minimiert, Standard, Standard mit Fokus), 2. im

Datenbaum zu navigieren, bzw. einzelne Seiten aufzurufen und 3. das Userinput-Fenster zu

öffnen (Tabelle 1).

Diese beiden Features richten sich insbesondere an die PL-Script Entwickler (Isis-Datenbank

Programmiersprache) der BASF, da sich jetzt direkte Verknüpfungen von der Isis-Base

Datenbank zu einzelnen Biolink-Seiten sehr einfach realisieren lassen.

Tabelle 1: Steuersatz der Clipboardschnittstelle3

Clipboard - Inhalt Biolink - Reaktion

"BiolinkMessage_OpenBranch_1'5'1'2'2" öffnet den Branch 1'5'1'2'2 (Beispiel)

"BiolinkMessage_MinimizeBiolink" minimiert das Biolink-Fenster

"BiolinkMessage_NormalSizeBiolink" Standardansicht

"BiolinkMessage_ShowBiolink" Standardansicht, der Fokus wechselt von der aufrufenden Anwendung zu Biolink

"BiolinkMessage_UserInput" öffnet das Userinput-Fenster zum aktuellen

Branch

"BiolinkMessage_EndCommunication" schließt in Biolink die Clipboardschnittstelle

"BiolinkMessage_UnloadBiolink" beendet Biolink

2 ASCII-Datei mit Datenadresse als String (mit Anführungszeichen), z. B.: "1'7'3'2". Sie wird von Biolink bei Programmstart gelesen und gelöscht. Ist die Datei leer oder enthält eine ungültige BranchID, wird der User-Startbranch geladen. 3 Diese Strings werden von Biolink sofort ausgeführt, sobald sie sich (ohne Anführungszeichen) im Clipoard befinden (PL-Script: CopyCustomDataToClipboard). Wird ein nicht vorhandener Branch aufgerufen, sendet Biolink eine Fehlermeldung über das Clipboard zurück.

16

Diese Entwicklung zielt wieder in Richtung des hierarchischen Informationsangebotes. Ein

Beispiel: Entscheidet sich der Biolink-User eine Datenbankrecherche nicht im Biolink-internen

Isis-Browser durchzuführen, sondern startet über "->i" (vergl. Kap. 2) die "Biss"-Datenbank in

Isis-Base, um dort auf die PL-Funktionen zurückzugreifen, besteht von dort beispielsweise die

Möglichkeit, daß simultan in Biolink entsprechende Seiten des Datenpools aufgerufen werden4.

Auf diese Weise sind alle Daten wie Kurzinfos und Links auch in Isis-Base verfügbar. Ebenso

stehen durch den Aufruf des Userinput-Fensters die komfortablen Userinputs von Biolink zur

Verfügung.

4 Die Clipboardschnittstelle öffnet sich, sofern von Biolink bei Programmstart die Datei "AutoExec" detektiert, oder wenn über "->i" Isis-Base geladen wurde.

Biologische Abbaubarkeit von Chloraromaten - Stand 11/12, 2001 S. 1/41

Anlage 3

Dossier über die biologische Abbaubarkeit von Chloraromaten:

I; Struktur, relevante chemische Eigenschaften und Toxizität

Mit Hinblick auf die Abbaubarkeit und Biochemie von chlorierten Aromaten ist es sinnvoll

zwischen Chlorbenzolen und -benzoaten,

Chlorphenol, chlorierten Biphenylen sowie

Chlornaphthalinen zu unterscheiden (s. Abb. 1).

Viele dieser Substanzen sind aufgrund

ausgeprägter Aromatizität schlecht wasserlöslich

(z. B. Chlorbenzol mit max. 500 mg/l, s. 9). Eine

Ausnahme von dieser Regel sind die

hydroxylierten Chloraromaten, wie z. B. die

Chlorphenole (70). In aquatischen Ökosystemen

bewirkt die schlechte Wasserlöslichkeit häufig

eine bevorzugte Anreicherung von Chloraromaten

im Sediment (39). Mit zunehmender Chlorierung reagieren Chloraromaten als schwache

Säuren:

Tabelle 1. pKS-Werte verschiedener Chlorphenole, entnommen aus (82).

Chlorphenol 4-Cl1 2,4-Cl2 2,4,6-Cl3 2,3,4,6-Cl4 2,3,4,5,6-Cl5

pKS 9,4 7,9 6,0 5,2 4,7

Sowohl auf Eukaryoten, als auch auf Prokaryoten wirken Chloraromaten toxisch, wenngleich

auf unterschiedliche Weise. Die Lipophilität der nicht hydroxylierten Chloraromaten bewirkt

in beiden Systemen eine gute Membrangängigkeit (9, 70). Eukaryotische Entgiftungs-

mechanismen zielen vornehmlich auf die Einführung von Hydroxylgruppen und die

nachfolgende Ausscheidung der entsprechenden Chloraromaten (70; s. auch Abschnitt über

den pilzlichen Metabolismus von Chloraromaten, 112).

Abb. 2: Chloraromatische Grundstrukturen


a) Toxikologisches Verhalten im eukaryotischen Organismus:

Beispielhaft für die Toxizität von Chloraromaten in Eukaryoten seien hier Hexachlorbenzol;

Pentachlorphenol (PCP); 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) und polychlorierte Biphenyle

(PCB's) vorgestellt ( und 4; für Strukturen s. Abb. 2, entnommen aus 70):

Hexachlorbenzol

Die Metabolisierung erfolgt neben reduktiver

Dehalogenierung meist über Einführung einer

Hydroxylgruppe oder einer Schwefelgruppe.

Letztere ermöglichen anschließend eine

Konjugierung mit Glutathion-SH, was die rasche

Ausscheidung ermöglicht.

Pentachlorphenol hat einen pKS = 4,7 (s. Tab.

1), vergleichbar der Essigsäure, so daß es unter

physiologischen Bedingungen als gut

wasserlösliches Phenolat vorliegt. Daher besteht

auch nicht die Tendenz sich in fetthaltigen

Geweben anzureichern. PCP entkoppelt die

oxidative Phosphorylierung, senkt somit die ATP-Bildung der Zelle und führt in Folge

letztendlich zu erhöhter Stoffwechselaktivität. Dies führt beim Menschen zu Tachykardie,

Schwitzen, Durst und Muskelschwäche. Ab 16 mg/l Blut ist mit einer letalen Vergiftung zu

rechnen. Für den Goldfisch wurde eine LC50 von 1,31 µM bestimmt. Chronische

Vergiftungen äußern sich in unspezifischen Symptomen. Je nach Spezies passiert PCP den

Organismus unverändert oder es wird vor seiner Ausscheidung zu Tetrachlor-p-hydrochinon

bzw. Tetrachlor-p-hydrochinonglucuronid metabolisert.

2,4-Dichlorphenoxyessigsäure wirkt als Herbizid selektiv auf zweikeimblättrige Pflanzen und

ist durch seine hydrophile Seitenkette sehr gut wasserlöslich. Die Entgiftung erfolgt über

Ausscheidung der unveränderten Substanz und als nicht näher charakterisiertes Konjugat.

Polychlorierte Biphenyle sind theoretisch in 209 Formen denkbar und finden sich meist als

Substanzgemisch. Sie zeichnen sich durch eine hohe chemische und physikalische Stabilität

und eine ölige Konsistenz über einen Temperaturbereich von mehreren hundert Grad Celsius

aus. Als lipophile Substanzen reichern sie sich bevorzugt in fettreichen Geweben (Leber,

Nervensystem, Fettgewebe) an und finden sich in fetthaltigen Nahrungsmitteln. Die akute

Abb. 2: Grundstrukturen von Hexachlorphenol,PCP, 2,4-D und PCB


toxische Wirkung ist abhängig vom Grad der Chlorierung und äußert sich bei Nagern in

Dünndarm- und Magenblutungen sowie abnormaler Lebervergrößerung. Symptome

chronischer Vergiftungen konnten in größerem Umfang 1968 in Japan und 1979 in Taiwan

beobachtet werden, wo in beiden Fällen über mehrere Monate hinweg PCB-verseuchtes

Reisöl im Lebensmittelhandel war. Es wird geschätzt, daß die tägliche Aufnahme sich auf 157

µg PCB/kg Körpergewicht und Tag belief. Äußerliche Symptome waren vor allem starke

Akne, Hyperpigmentierung, Schwellung von Augenlidern und Schleimhäuten, Erschöpfung,

Ödeme an Armen und Beinen, sowie Atemwegsbeschwerden. Zudem erhöhte sich bei

Schwangeren der Anteil an Totgeburten, ebenso wie die Krebsrate (Magen, Leber, Lunge) bei

Männern. PCB's werden je nach Anzahl und Position der Chloratome unterschiedlich

metabolisiert. Folgende Tendenzen konnten im Hund beobachtet werden:

- Je mehr Chloratome im Molekül vorhanden sind, um so geringer ist das Ausmaß der

Biotransformation.

- Die Hydroxylierung überwiegt gegenüber der Bildung Schwefelhaltiger Metabolite oder

der reduktiven Dechlorierung. Hydroxylierung erfolgt bevorzugt in der meta- oder para-

Stellung, sofern diese kein Chlor trägt.

- Die Biotransformation erfolgt

hauptsächlich durch Cytochrom-P450

abhängige Monooxygenasen und

Glutathion S-Transferasen.

b) Toxikologisches Verhalten in

Prokaryoten:

Neben den membranlösenden

Eigenschaften der lipophiler

Chloraromaten beobachtet man weitere

toxische Effekte gegenüber Prokaryoten,

welche meist durch Inhibition der am

Abbau beteiligten Enzyme durch

Metabolite des Abbauweges entstehen:

Bei aerob wachsenden Zellen bewirkt vor

allen Dingen die Bildung von 3-

Chlorcatechol als einem der zentralem

Metaboliten (89) eine Hemmung der als

Abb. 3: Irreversible Hemmung der ringspaltenden 2,3--Dioxygenasedurch chloraromatische Verbindungen.


Ringspaltenzym für den weiteren Aromatenstoffwechsel wichtigen Catechol-2,3-Dioxygenase

(meta-Ringspaltoxygenase), da zum einen das als Zwischenprodukt entstehende und äußerst

reaktive Acylchlorid das Enzym irreversibel hemmt (14) (s. Abb. 3) und zum anderen 3-

Chlorcatechol chelierend auf das Eisenatom im aktiven Zentrum der Ringspaltdioxygenase

wirkt (64). Während des Abbaus von 3-Chlorbenzoat wurde eine hemmende Wirkung eines

der catecholischen Zwischenprodukte auf das ringaktivierende Enzym, eine Benzoat-1,2-

Dioxygenase, beobachtet (34). Reineke und Havel beobachteten beim aeroben Abbau der

PCB-Mixtur "Arcoclor 1221" eine Hemmung der beteiligten Mikrobengemeinschaft in Folge

der Bildung eines toxischen Metaboliten aus 4-Chlorbenzoat durch Pseudomonas sp. JHK

(49). Zum Teil kommt es zu einer Kombination mehrerer toxischer Effekte, so wird die

toxische Wirkung von Chlorbenzol und 1,4-Dichlorbenzol auf Pseudomonas sp. RHO1

sowohl mit dem lipophilen Charakter dieser beiden Substanzen, als auch durch die Bildung

von 3-Chlorcatechol als Zwischenprodukt erklärt (36).

Anaerobe Kulturen werden z. T. durch Chloraromaten und ihre Abbauprodukte ebenfalls

gehemmt. Die Ursachen sind hier jedoch häufig unklar. Mehrere Studien berichten über die

Hemmung Methanogener durch Haloaromaten (17, 45, 73). Bei Chlorphenolen nimmt die

toxische Wirkung mit der Stellung des Chloratoms in ortho-, meta- oder para-Position

tendenziell zu (68). Ferner stellt sich für anaerobe Organismen häufig das Problem der

energetischen Verwertbarkeit von Chloraromaten. Letztere ist eine wesentliche

Voraussetzung für einen vollständigen enzymatischen Umsatz (56).

II; Vorkommen

a) natürlich

In vielen Publikationen gelten Chloraromaten als typische Xenobiotika rein menschlichen

Ursprungs. Wie schon bei den Chloralkanen, welche durchaus als natürliche Substanzen

vorkommen (93, 112), gibt es allerdings in der Literatur auch Berichte über natürlich

vorkommende Chloraromaten (vgl. 89, 94), wie z. B. das pilzliche Drosophilin A (p-

Methoxytetrachlorphenol) (8) oder 2-acetyl-4-Chlor-1,8-dihydroxy-3-methylnaphthalene-8-

O-beta-D-glucopyranoside aus Rumex patientia (66). Über die natürliche Funktion dieser

Substanzen ist meist nichts bekannt.


b) als Folge industrieller Verwendung

Viele Chloraromaten sind aufgrund ihrer vielfältigen Verwendung in industriellen

Produktionsprozessen zu ubiquitären Substanzen geworden (s. z. B. 1). Das

Produktionsvolumen von Chlorbenzol in den USA lag 1984 bei 116000 t, Tendenz steigend.

Verwendung finden Chlorbenzol und Chlortoluol als Lösungsmittel, Pestizide, Insektizide,

Geruchsstoffe und als Intermediate von Farbstoff-, sowie anderer organischer Synthesen (26,

81, 84, 88, 113). Ebenfalls Intermediate bei der Herstellung von Herbiziden sind Chloraniline

(30). Gleiches gilt für die Chlorbenzolsäuren, welche zudem noch als Verunreinigung von

PCB-Mixturen auftreten (52). Chlorphenole und Chlorguaiacole sind mit 47 % Anteil in der

niedermolekularen Abfallfraktion der Chlorlignine aus Bleichwerken enthalten (41, 43). Die

Chlorierte Phenole umfassen 19 Substanzen. Ihr weltweites jährliches Produktionsvolumen

umfaßte in den 70er Jahren um die 200.000 t (4, 83). Verwendung fanden die Chlorphenole in

großem Umfang als Biozide und Holzschutzmittel (vor allem Trichlorphenole &

Pentachlorphenol) (4, 12, 15, 68, 82). Ähnlich weit verbreitet sind die PCB's, welche

aufgrund ihrer Feuerresistenz und chemischen Stabilität breite Anwendung als

Wärmetauscher, Schmiermittel, Lösungsmittel, Weichmacher, Feuerschutzmittel und

dielektrische Flüssigkeiten fanden (25, 58). Ende der 80er betrug ihr weltweites

Produktionsvolumen ca. 106 t pro Jahr (105). Durch ihre langanhaltende Verwendung sind sie

inzwischen auch in nicht direkt kontaminierten Ökosystemen wie z. B. der Arktis

nachweisbar (75). Ähnlich verhält es sich mit den polychlorierten Naphthalinen, welche,

ähnlich den PCB's, aufgrund ihrer vielfachen Verwendung weit verbreitet wurden (32).


III; Umweltchemie und Abbaubarkeit

Die meisten Chloraromaten (z. B. PCB's) stellen aufgrund ihrer hohen Persistenz ein

ökologisches Problem dar, sind jedoch nicht prinzipiell inert. Chlorbenzole können an der

Luft langsam durch Oxidation mit freien Radikalen abgebaut werden (9). Pentachlorphenol

zerfällt ebenfalls langsam unter starker UV-Einstrahlung zu mehreren chlorierten

Zwischenprodukten (s. Abb. 4) (4).

Für viele Substanzen ist der abiotische Abbau jedoch so langsam, daß nennenswerter

Schwund nur bei mikrobiellem Abbau zu beobachten ist. Dies gilt neben den Chlorbenzolen

und -phenolen z. B. auch für die chlorierten Phenoxyalkansäureherbizide wie 2,4-

Dichlorphenoxysäure (2,4-D) (5, 76).

1) Stoffwechsel von Chloraromaten in eukaryotischen Systemen:

Den wesentlichsten eukaryotischen Beitrag zum Abbau von Chloraromaten leisten die

ligninolytischen Pilze. In der Regel nutzen diese die Chloraromaten nicht als Energie- und

Kohlenstoffquelle, sondern der Abbau ist eine kometabolische Reaktion der ligninabbauenden

Abb. 4. Abiotische Abbauprodukte von Pentachlorphenol.


Enzymsysteme bestehend aus Phenoloxidasen, Ligninperoxidasen, Manganperoxidasen und

Laccase, welcher unter Sticktstoffmangel beobachtet wird (89). Bedingt durch die Enzymatik

findet pilzlicher Umsatz von Chloraromaten unter aeroben Bedingungen statt.

W. Reineke beschreibt in seiner exzellenten Zusammenfassung über den Chloraromatenabbau

(89) in diesem Zusammenhang den Erreger der "Weißfäule" bei Holz, den Pilz

Phanerochaete chrysosporium, als eines der bestuntersuchten Modellsysteme, welcher

Chloraniline (vgl. auch 30), Chlorbenzol (s. ebenso 113), Chlorphenole (s. dazu ferner 44, 71,

und 82), chlorierte Phenoxyacetate (vgl. 29), PCB's (s. auch Beschreibung in 95) und

Dibenzo-p-dioxine (auch beschrieben von 111) abzubauen vermag. Die Chlorsubstituenten

werden im Zuges des Abbaus meist vor der Ringspaltung eliminiert. Dies geschieht

unspezifisch an allen Ringpositionen (ortho-, meta-, para-), wobei für P. chrysosporium

folgende Präferenz bezüglich des Abbaus beobachtet werden konnte Monochlorbenzol > m-

Dichlorbenzol > o-Dichlorbenzol > p-Dichlorbenzol (113).

Für 2,4-Dichlorphenol und 2,4,5-Trichlorphenol konnte in P. chrysosporium der in Abbildung

5 dargestellte Abbauweg ermittelt werden (59, 110). Bei beiden Substraten erfolgt zuerst eine

Peroxidase-katalysierte Dechlorierung. Das daraus entstehende Quinonintermediat wird

anschließend methyliert, was wiederum ein Substrat für eine weitere Peroxidase-katalysierte

Dechlorierung erzeugt. Letztendlich führt dies zu 1,2,4,5-Tetrahydroxybenzol als zentralem

Metaboliten mit anschließender Ringspaltung und vollständigem Umsatz zu CO2 und Energie.

Vermutlich liegen dem Abbau von 2-Chlorphenol durch Trametes versicolor (44), als auch

dem Umsatz verschiedener Haloaromaten, wie 3-Chlor- und 4-Chlorphenol, durch

Penicillium simplicissimum SK9117 (71) ähnliche Abbauwege zu Grunde. Mit zunehmender

Chlorierung wird ein Abbau der Chlorphenole problematisch: obwohl Pentachlorphenol von

P. chrysosporium metabolisiert werden kann (74) ist der metabolische Umsatz häufig gering.

Zudem steigt hier die Gefahr, daß statt des Abbaus Polymere gebildet werden (91), die sich

dem weiteren Abbau durch Adsorption an die Bodenmatrix entziehen (7). Am Abbau von

Abb. 5. Abbau von 2,4-Dichlorphenol in P. chrysosporium. Der Abbau von 2,4,5-Trichlorphenol verläuftanalog. LiP: Ligninperoxidase, MnP: Mangangperoxidase


PCB's konnte gezeigt werden, daß diese Oligomerisierung ganz oder teilweise auf die

Aktivität von Laccase zurückgeht (95)

Donnelly et al. haben den vollständigen Abbau sowohl von Atrazin, als auch von 2,4-

Dichlorphenoxyessigsäure durch verschiedene Pilze beschrieben. P. chrysosporium erwies

sich in dieser Studie als der effizienteste Abbauer, Informationen über die einzelnen

metabolischen Schritte liegen jedoch leider nicht vor (29).

Der Abbau von PCB's durch Pilze ist mehrfach beschrieben worden. Meist ist der

metabolische Umsatz jedoch gering und zudem langsam (s. 89). Vor allem die Biphenyle mit

wenigen Chlorsubstituenten (mono- und disubstituiert) konnten gut umgesetzt werden (24,

107). Die Abbauwege sind hier noch Gegenstand der Forschung.

Der Abbauweg von 2,7-Dichlordibenzo-p-Dioxin in P. chrysosporium wurde von Valli et al.

aufgeklärt (111; s. Abb. 6). Ähnlich dem Abbau der Chlorphenole erfolgt die Dechlorierung

hier ebenfalls vor der Ringspaltung über zyklische oxidative Dechlorierung, Methylierung

und abermalige Dechlorierung unter Beteiligung von Lignin- und Manganperoxidase.

Da die hier beschriebenen Abbaureaktionen kometabolisch sind, ist die Abbaurate meist sehr

langsam (89), gleichzeitig aber weniger störanfällig durch die Präsenz anderer Substrate, wie

Toluol (113), die in bakteriellen Systemen häufig zu einer regulatorischen Hemmung des

betreffenden Abbauweges führen.


2) Stoffwechsel von Chloraromaten in bakteriellen Systemen:

Bakteriell katalysierter Chloraromatenabbau ist sowohl unter aeroben, als auch unter

anaeroben Bedingungen beschrieben worden. Im Gegensatz zum kometabolischen Abbau bei

Pilzen sind dienen die umgesetzten Chloraromaten bei Bakterien häufig als alleinige Energie-

und Kohlenstoffquelle.

a) Aerober Stoffwechsel, allgemeine Prinzipien (zusammengefaßt nach 89):

Kritisch für die vollständige Mineralisation von Chloraromaten ist die Entfernung der

Chlorsubstituenten. Bei den verschiedenen Abbauwegen kann die sog. "Eliminierung" dieser

Substituenten vor (= "früh"), während oder nach der Ringspaltung (= "spät") beobachtet

werden.

Eine frühe Dechlorierung ist vor allen Dingen bei weniger stark substituierten Chloraromaten

zu beobachten. Im Fall der Chlorbenzole führt dies zur Bildung von Catecholen, welche über

den normalen Aromatenstoffwechsel umgesetzt werden. Bei zwei oder mehr Chloratomen am

Ring bilden sich Chlorcatechole, Chlorprotocatechuat oder Chlorhydroquinone, welche z. T.

toxisch auf die Zelle wirken können (s. "I b)"). Eine Stoffwechselkarte dieser Prozesse ist in

Abb. 7 dargestellt.

Abb. 6. Abbau von 2,7-Dichlordibenzo-p-Dioxin durch P. chrysosporium


Dechlorierung vor der Ringspaltung.

Folgende Mechanismen können zu einer Dechlorierung vor der Ringspaltung führen:

Hydrolyse, Oxygenolyse oder Reduktion (Abb. 8 ).

Eine frühe hydrolytische Dechlorierung wurde u. a. beim Abbau von 4-Chlorbenzoat und

einiger Chlorphenole beobachtet. Der

Sauerstoff stammt dabei aus Wasser.

Voraussetzung für die erfolgreiche Abspaltung

des Chloratoms vom Ring ist hierbei eine

vorhergehende Aktivierung des Ringes durch

Koenzym A an der Carboxylgruppe. Die

eigentliche Dechlorierung wird dann von einer

Dehalogenase katalysiert, welche durch

Bildung eines intermediären

Meisenheimerkomplex am chlortragenden C-

Atom den Abgang des Chlors bewirkt. Durch

die spezielle Enzymatik ist die hydrolytische

Dechlorierung von Chlorbenzoat auf das para-

substituierte Isomer beschränkt. Bei

Chlorphenolen findet man frühe hydrolytische

Dechlorierungen im sog. "Hydroquinon-Weg"

Abb. 7. Stoffwechselschema des (Chlor-)Aromatenabbaus. 1: Aromatenabbau über Catechol und den3-Oxoadipatweg; 2: Monochloraromatenabbau über Chlorcatechol mit vorheriger Dechlorierung; 3:Chloraromatenabbau über den Hydroquinonweg; 4: Tri- & Tetrachloraromatenabbau überChlorcatechol; 5: Chloraromatenabbau über Chlorcatechol

Abb. 8. Aromatendechlorierung vor derRingspaltung. Von links nachrechts: Hydrolytisch, Oxy-genolytisch und reduktiv.


(Abb. 9). Die frühe hydrolytische Dechlorierung von Chloraromaten ist auf wenige Beispiele

beschränkt, da für den nukleophile Angriff am Chlortragenden C-Atom eine vorhergehende

Aktivierung des aromatischen π-Elektronensystems notwendig ist, entweder durch Koenzym

A oder durch Hydroxylgruppen.

Schlüsselenzyme der oxygenolytischen Dechlorierung sind Di- und Monooxygenasen, welche

durch Einführung einer Hydroxylgruppe am Chlortragenden C-Atom die Kohlenstoff-

Chlorbindung destabilisieren mit letztendlicher Abspaltung von Chlorid als besserer

Abgangsgruppe (Abb. 10). Je nach Anzahl der Chlorsubstituenten ist das Produkt ein

Catechol oder ein Chlorbenzol bzw. das entsprechende Catechuat. Eine Dioxygenase-

katalysierte Dechlorierung konnte für 2-Chlor-, 3-Chlor-, 2,4-Dichlor-, 2,5-Dichlor und 3,4-

Dichlorbenzoat, sowie 1,2,4,5-Tetrachlorbenzol, 2-Chlortoluol und 4-Chlorphenylazetat

gezeigt werden. Die beteiligten Dioxygenasen besitzen eine stark ausgeprägte Substrat- als

auch Positionspezifität bezüglich der umgesetzten Aromaten. Einfach substituierte Substrate

werden über den regulären Aromatenstoffwechsel metabolisiert, mehrfach substituierte

Abb. 9. Dechlorierungen über den sog. "Hydroquinonweg" während des Abbausvon höher substituierten Chloraromaten.

Abb. 10. Oxygenolytische Dechlorierung von 2-Chlorbenzoat durch 1: Benzoat-1,2-Dioxygenase, 2:spontane Reaktion, 3: Ringspaltung


entweder über einem modifizierten ortho- oder meta-Weg (s. unten). Monooxygenasen

vermögen z. B. den Umsatz von 2,4,6-Trichlorphenol zu 2,6-Dichlorhydroquinon oder von 4-

Chlorphenol zu Hydroquinon zu katalysieren.

Eine reduktive Dechlorierung mittels Dehalogenasen kann entweder Glutathiongekoppelt

oder aber unter Einführung einer Hydroxylgruppe vonstatten gehen. Je nach Organismus -

Flavobacterium sp. oder Mycobacterium fortuitum CG-2 - können beide Varianten dieser

Form der Dechlorierung am Beispiel von Pentachlorphenol beobachtet werden (Abb. 11).

Dechlorierung während und nach der Ringspaltung.

Wie eingangs bei der Toxikologie beschrieben (s. "I b)") führen Chlorcatechole zu reversiblen

und irreversiblen Hemmungen der für unsubstituierte Aromaten verwendeten

Ringspaltoxygenasen. Studien über den Abbau von chlorierten Anilinen, Benzolen,

Benzoaten, Toluolen, Phenolen, Phenoxyacetaten, Biphenlyen und Naphthalinen haben

gezeigt, daß es in den betreffenden Organismen sowohl für den ortho-, als auch für den meta-

Weg (für letzteren s. auch 61) alternative Ringspaltoxygenasen gibt, welche durch die

Chlorsubstituenten nicht inaktiviert werden (Abb. 12 & 13).

Abb. 11. Reduktive Dechlorierung von Pentachlorphenol durch Flavobacterium sp. & Mycobacterium fortuitumCG-2


Abb. 12. Modifizierter ortho-Weg am Beispiel von 3-Chlor, 4-Chlor und 3,5-Dichlorcatechol. 1:Chlorcatechol-1,2-Dioxygenase, 2: Chlormuconatcycloisomerase, 3: Dienlactonhydrolase, 4:Maleylacetatreduktase; gestrichelte Pfeile stehen für spontane Dechlorierungen, Klammern fürinstabile Zwischenprodukte.


Abb. 13. Skizze der beiden bekannten Alternativen des ungehemmten meta-Weges beimChloraromatenabbau.


Der modifizierte ortho-Weg kann mit bis zu drei Chlorsubstituenten am Ring betrieben

werden, im Falle des Abbaus von höher substituierten Chloraromaten wird die Anzahl

Chloratome durch andere Dechlorierungsmechanismen auf 3 reduziert (s. Abbau von 1,2,4,5-

Tetrachlorbenzol durch Pseudomonas sp. PS14, Abb. 14). Die Inaktivierung der

Ringspaltoxygenase des modifizierten meta-Weges kann u. a. durch die Cyclisierung des

Ringspaltproduktes vermieden werden, da diese dann einhergeht mit einer nukleophilen

Abspaltung des Chlorsubstituenten.

b) aerober Stoffwechsel, Beispiele:

Chlorbenzole, -toluole, -aniline & -benzoate. Chlorbenzol wird von vielen Studien als

abbaubar beschrieben (z. B. 47, 72, 80, 86, 100). Einfach substituiertes Chlorbenzol wird

demnach in 2,3-Stellung dioxygeniert und das daraus resultierende 3-Chlorcatechol entweder

in meta- (72) oder aber in ortho-Position (47, 80, 86, 100) gespalten. Die Substratspezifität

der Benzoldioxygenasesysteme ist recht unterschiedlich: Das Enzymsystem in Pseudomonas

Abb. 14. Abbau von 1,2,4,5-Tetrachlorbenzol durch Pseudomonas sp. PS14. 1:Benzoldioxygenase, 2: spontan, 3: Chlorcatechol-1,2-Dioxygenase, 4:Chlormuconatcycloisomerase, 5: Dienlactonhydrolase, 6: Maleylacetatreduktase,7: vermutlich 3-Oxoadipat:SuccinylCoA-Transferase & 3-OxoadipylCoA-Thiolase, 8: unbekannt


sp. JS6 vermag neben Chlorbenzol auch Toluol umzusetzen (86). In anderen Isolaten führt die

gleichzeitige Präsenz von Chloraromaten und nichthalogenierten Benzolderivaten aufgrund

der Induktion der regulären Ringspaltenzyme zu einer Hemmung des Systems (72, 86). Ein

weiteres Enzymsystem, welches eine breite Substratspezifität besitzt, ist in Pseudomonas sp.

JS150 beschrieben worden (47). Nach Induktion mit Chlorbenzol wurden neben dem

Ausgangssubstrat auch noch 1,2- und 1,4-Dichlorbenzol, sowie Benzol, Toluol, Naphthalin

und Trichlorethylen umgesetzt. In mit 1,4-Dichlorbenzol (94 % Umsatz = freigesetztes

Chlorid) gewachsenen Zellen von Xanthobacter flavus 14p1 wurden zusätzlich zum

Wachstumssubstrat noch 1,2-Dichlor- (8 %), 1,3-Dichlor- (69 %), Chlor- (69 %) und mit

Einschränkung auch noch 1,2,4-Trichlorbenzol (4 %) über einen modifizierten ortho-Weg

umgesetzt. Bei den Dichlorbenzolen war die Güte des enzymatischen Umsatzes

positionsabhängig: para > meta > ortho (100).

Ein Enzym, welches gegenüber mehrfach substituierten Chloraromaten eine recht breite

Substratspezifität zeigt ist die Tetrachlorbenzoldioxygenase (TecAB) aus Ralstonia sp..

Neben Tetrachlorbenzol setzt dieses Enzym auch 2,4-Dichlor, 2,5-Dichlor- 2,6-Dichlor- und

3,4-Dichlortoluol um, wobei die Dioxygenierung an unsubstituierten C-Atomen erfolgt (87).

Ein weitere Metabolisierung könnte dann über einen modifizierten ortho-Weg erfolgen. Der

vollständige Abbau von 3- und 4-Chlortoluol ist ebenfalls beschrieben worden (23, 48). Der

Abbau von Chloranilinen (beschrieben für alle 3 Isomere) verläuft ebenfalls meist über einen

modifizierten ortho-Weg des jeweiligen Chlorcatechols nach vorhergehender Oxygenierung

durch eine Anilinoxygenase (54).

Chlorbenzoate wurden häufig als schwer abbaubare Produkte des bakteriellen

Phenoxyessigsäureherbizid- und PCB-Abbaus gefunden und in diesem Zusammenhang als

Modellsubstanzen für den Chloraromatenabbau studiert (31, 52). Grund für die Anhäufung als

Zwischenprodukt beim PCB-Abbau ist die Induktion des mit Chlorbenzoaten inkompatiblen

meta-Weges durch PCB's (52). Die monosubstituierten Derivate erwiesen sich in mehreren

Studien als abbaubar, während 4-Chlorbenzoat vorwiegend zu 4-Hydroxybenzoat umgesetzt

wird (für alternative Routen s. Abb. 15 aus 98), findet sich bei 3-Chlorbenzoat häufig 3-

Chlorcatechol als Zwischenprodukt.


Abb. 15. Aerobe Abbauwege für 4-Chlorobenzoat. 1: 4-Chlorbenzoatdehalogenase, 2: 4-Hydroxybenzoathydroxylase, 3: Benzoatdioxygenase, 4: Catechol-1,2-Dioxygenase, 5: 3-Chlormuconatcyclosiomerase, 6: Catechol-2,3-Dioxygenase, 7: 5-Chlor-2-Hydroxymucatsemialdehyd Dehydrogenase, 8: 5-Chlor-2-Hydroxymuconat Decarboxylase,9: 5-Chlor-2-Hydroxymuconat Dehalogenase, 10: 2,5-Dihydroxymuconat Decarboxylase, 11:2-Hydroxypenta-2,4-Dienoat Hydratase


Ersteres wird über den normalen Aromatenstoffwechsel umgesetzt, letzteres über einen

modifizierten ortho-Weg (52). 2-Chlorbenzoat erwies sich als persistenter (31), was

vermutlich unter anderem auf die Inkompatibilitäten der gefundenen Abbauwege

zurückzuführen ist: zum einen kann der Umsatz über eine 1,2-Benzoat-Dioxygenase zu

Catechol erfolgen (31, 52), zum anderen gibt es Hinweise auf die Möglichkeit einer Bildung

von 3-Chlorcatechol als problematischem Zwischenprodukt (52, 65), außerdem wird noch die

oxygenolytische Dehalogenierung zu 2-Hydroxybenzoat beschrieben (114). Die

Substratspezifitäten der gefundenen Halobenzoatdioxygenasen sind auch hier variabel.

Pseudomonas aeruginosa JB2 vermag außer 2- und 3-Chlorbenzoat auch 2,3-Dichlor-, 2,5-

Dichlor-, sowie 2,3,5-Trichlorbenzoat umzusetzen (s. Abb. 16 nach 52), das aus P.

aeruginosa 142 2-Chlorbenzoate und 2,4-Dichlorbenzoate (90, 108). Abbau von 3- und 4-

Chlorbenzoat über die respektiven Chlorcatechole als Intermediate und anschließender

Metabolisierung über einen modifizierten ortho-Weg ist für Pseudomonas aeruginosa 3mT

beschrieben worden (6).

Abb. 16. Abbau von 2-Chlor-, 3-Chlor-, 2,3-Dichlor-, 2,5-Dichlor- und 2,3,5-Trichlorbenzoatdurch Pseudomonas aeruginosa JB2.


Chlorphenole & chlorierte Herbizide. Für den Abbau der Monochlorphenole ist, ähnlich der

Situation bei den Dichlorbenzolen, eine positionsbedingte Präferenz des Abbaus zu

beobachten, der ausgehend von der para-Stellung, über die meta- hin zur ortho-Position

schwieriger zu werden scheint. Deutlich wird dies unter anderem am Abbau von 2-, 3- und 4-

Chlorphenol, sowie 2,4-Dichlorphenol in Rhodococcus opacus 1G, R. rhodnii 135, R.

rhodochrous 89 und R. opacus 1cp, wo die Wachstumsrate in R. opacus 1cp von 4-

Chlorphenol über 3-Chlorphenol hin zu 2-Chlorphenol abnimmt (s. Abb. 17, entnommen aus

Quelle 35). Das para- und das meta-Monochlorphenol, als auch das 2,4-Dichlorphenol

werden dabei über einen modifizierten ortho-Weg abgebaut, während 2-Chlorphenol in R.

opacus cp1 zu 3-Chlorcatechol und anschließend zu 4-Chlorpyrogallol umgewandelt wird.

Ein Umsatz von Trichlorphenolen konnte in dieser Studie nicht beobachtet werden. Farrel und

Quilty beschreiben den langsamen und z. T. unvollständigen Abbau von 2-, 3- und 4-

Chlorphenol in einer Mikrobengemeinschaft über den regulären meta-Weg (33). Während 2-

und 3-Chlorphenol in dem meta-Ringspaltsystem stark hemmend wirken, ist der vollständige

Abbau von 4-Chlorphenol über dieses System möglich (55). Eine weitere Variante des 4-

Chlorphenolabbaus wurde in Arthorbacter ureafaciens CPR706 beobachtet, wo eine frühe

Hydroxylierung den Chlorsubstituenten eliminiert und das entstehende Hydroquinon

nachfolgend über einen Hydroquinonweg (vgl. Abb. 9) abgebaut wird (12). Andere

Enzymsysteme vermögen monosubstituierte Chlorphenole kometabolisch umzusetzen, z. B.

3- und 4-Chlorphenol in phenolgezogenen Zellen von Acinetobacter sp. (62). Substituierte

Chlorphenole scheinen abbaubar, sofern Stellung und Art der Substituenten in das

Substratspektrum der induzierten Enzyme paßt, so wurden z. B. der vollständige Abbau von

4-Chlor-2-methylphenol und 2,4-Dichlorphenol in einem Neuisolat durch ein und dasselbe

Enzymsystem beschrieben (67). Für manche Spezies konnte ein ungewöhnlich breites

Substratspektrum beobachtet werden, Streptomyces rochei 303 vermag neben 2- und 3-

Chlorphenol auch 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, und 3,5-Dichlorphenol, sowie 2,4,6-, 2,4,5-, 2,3,4-,

2,3,5- und 2,3,6-Trichlorphenol umzusetzen. Hinzu kommen noch 2,3,5,6-Tetrachlorphenol

und Pentachlorphenol (42). Der Abbau von höher substituierten Chlorphenolen (> Tri)

verläuft häufig über den Hydroquinonweg (Abb. 9) ( oder 42, s. z. B. 101). Zum Teil

ermöglicht aber auch erst die Kooperation der Mikrobengemeinschaft an einem Standort den

Abbau solch höher substituierter Chlorphenole (z. B. 2,4,6-Trichlorphenol, s. 13).


Abb. 17. Metabolismus von Monochlorphenolen und Dichlorphenolen durch R. opacus 1G (a), R.Rhodnii 135 (b), R. Rhodochrous 89 (c) und R. opacus 1cp (d).


Mit Hinblick auf ihre Abbaubarkeit sind Atrazin, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, Dichlorprop

(2-(2,4-Dichlorphenoxy)propionat) und Mecoprop ((2-(4-Chlor-2-methyl-)phenoxypropionat)

die am besten untersuchten Systeme (5, 37, 38, 76, 77, 92, 106, 109, 117). Diese Herbizide

sind, mit Ausnahme von Atrazin, welches unter Kohlenstoffmangelbedingungen

unvollständig abgebaut wird (112), vollständig abbaubar. Dabei führt die Abspaltung der

Seitenkette entweder zu chlorierten Benzolderivaten wie Chlorphenolen oder zu

Chlorbenzoaten, welche nachfolgend über einen der oben genannten Abbauwege mineralisiert

werden.

Chlorierte Biphenyle. Unsubstituierte oder hydroxylierte Biphenyle sind prinzipiell leicht

abbaubar, meist über einen meta-Weg (s. Abb. 18, s. 53, 97). Im Fall von chlorierten

Biphenylen führt dies zu einer Hemmung der 2,3-Ringspaltoxygenase mit nachfolgender

Anhäufung von 2-,3- und z. T. auch 4-Chlorbenzoat, da letzteres nur von manchen

2,3-Ringspaltoxygenasen metabolisiert werden kann (10, 103) und zudem toxisch auf die

Zellen wirkt (49), weil es - ebenso wie 3-Chlorbenzoat - die 2-Hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-

2,4-dienoathydrolase (BphD) hemmt (96). Ein weiteres problematisches Produkt des PCB-

Abbaus ist Acetophenon, welches ebenfalls nur schlecht metabolisiert werden kann (s. Abb.

19 aus 50, 96). Sowohl für 3-Chlorbiphenyl, als auch für 4-Chlorbiphenyl ist vollständiger

Abbau beschrieben worden (34, 63), wobei die para-Position bevorzugt wird (51). Der Abbau

von 2-Chlorbiphenyl dagegen ist problematischer, vermutlich aufgrund der sterischen

Behinderung der bevorzugten 2,3-Dioxygenierung durch den Chlorsubstituenten in der ortho-

Position (3). In Mutanten erwies sich der Abbau von 2-Chlorbiphenyl als instabil,

dementsprechend häufen sich beim Abbau von Biphenylgemischen die in ortho-Stellung

substituierten Isomere an (51). In vielen Ökosystemen werden polychlorierte Biphenyle im

anaeroben Sediment zu einfach bis zweifach chlorierten Biphenylen dechloriert, welche

wiederum - sofern zugänglich - von aeroben Organismen abgebaut werden können (3). Eine

Ausnahme unter den biphenlyabbauenden Stämmen ist Alcaligenes eutrophus H850, welcher

ein ungewöhnlich breites Substratspektrum auch für höher substituierte Biphenyle aufweist:

Abb. 18. Aerober meta-Abbau unsubstituierter Biphenyle.


Tabelle 2. Abbau von chlorierten Biphenylen durch Alcaligenes eutrophus H850.


Dieser Stamm ist auch in der Lage Biphenyle mit dem

Chloratom in ortho-Stellung zu metabolisieren (16). Als

nichtabbaubar in diesem Stamm erwiesen sich die meisten

Biphenyle mit mehr als 5 Chlorsubstituenten, sowie

2,4,5,4'-, 2,3,6,2',4'- und 2,3,4,2',4'-Chlorbiphenyl. Seeger

et. al. (97) konnten in Burkholderia sp. LB400 zeigen, daß

Art und Position des dioxygenolytischen Angriffs auf den

Ring wesentlich von den vorhandenen Substituenten

bestimmt wird (s. Abb. 20). In ihrer Studie wurden auch

die ortho-sbustituierten Biphenyle größtenteils abgebaut.

Als inert erwiesen sich das 2,3-Dihydrodiol von 4,4'-

Chlorbiphenyl und das 5',6'-Dihydrodiol von 2,5,3'- und 2,4,3'-Chlorbiphenyl.

Abb. 19. Bildung von Chloraceto-phenon aus chloriertenBiphenylen. DiesesSubstrat kann von BphDnicht umgesetzt werdenund wirkt daherhemmend auf denAbbau.


Abb. 20. Regioselektivität der BphA-abhängigen Dioxygenierung verschiedener chlorierter Biphenyle inBurkholderia sp. LB 400, Reaktionen in Klammern sind nicht gesichert, die substituiertenPositionen sind jeweils angegeben.

Cl

Cl

Cl

Cl Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl Cl

Cl

Cl

Cl

Cl Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl Cl

ClO O

Cl

Cl

Cl

O O

O O

?

O O

?

O O

O O

O O

O O

OO ?

O O

O O

OO ?

O O O O O O

O O

?

Cl

Cl

Cl

Cl Cl

Cl

OO

O O

?

O O O O O O

O O

OO ?

Cl

Cl

Cl Cl

Cl

Cl

Cl Cl

Cl

Cl Cl

Cl

O O

OO ?O O

O O

?

OO

O O

OO ?

O O

?

O O

O O

?

O O

Cl

Cl

Cl

Cl

O O

2,2' 2,3' 2,4' 3,3'

3,4' 4,4' 2,3,2'

2,4,2'

2,5,2' 3,4,2' 3,5,2' 2,3,3'

2,4,3' 2,5,3' 2,3,4'

2,4,4' 2,4,2',4' 2,3,4,5,2'


b) Anaerober Stoffwechsel, allgemeine Prinzipien (zusammengefaßt nach 89):

Im Gegensatz zum aeroben Chloraromatenabbau sind Berichte über den anaeroben Abbau

weniger zahlreich und häufig weniger detailliert. Anaerober Abbau ist für folgende

Substanzklassen beschrieben worden: Chlorbenzole, Chloraniline, Chlorbenzoate,

Chlorphenole, Chlorphenoxyacetate, PCB's und Chlordibenzo-p-dioxine. Dabei wird sowohl

vollständiger Abbau, als auch Dechlorierung mehrfach substituierter Chloraromaten bis zur

Stufe einer 1- bis 2-fachen Substitution beobachtet. Insbesondere bei PCB's häufen letztere

sich an bis die höher substituierten Formen vollständig dechloriert worden sind. Ein nahezu

vollständiger Umsatz von Chloraromaten zu CH4 und CO2 wird vor allem unter

methanogenen Bedingungen beobachtet, wobei die, dem Abbau vorangehende

Dehalogenierung, auch von nicht-methanogenen Organismen durchgeführt werden kann. Im

Falle reduktiver Dechlorierung ist die Präsenz andere Elektronenakzeptoren entscheidend, ob

ein Abbau stattfindet oder nicht: Nitrat und Sulfat können u. U. bessere Akzeptoren sein und

somit einen Umsatz der Chloraromaten verhindern.

b) anaerober Stoffwechsel, Beispiele:

Chlorbenzole, -toluole & -benzoate. Die Dehalogenierung von Chlorbenzolen und -toluolen

durch Mikrobengemeinschaften unter methanogenen Bedingungen weist ein breites

Substratspektrum auf (s. Tab. 3 aus 88):

Tabelle 3. Substratspektrum und bekannte Dechlorierungssequenzen eines methanogenen Schlamms.

Ausgangssubstrat Dechlorierungssequenza)

1,3,5-Trichlorbenzol ?

1,2,3-Trichlorbenzol 1,2-DCB + 1,3-DCB

1,2,4-Trichlorbenzol 1,4-DCB + 1,3-DCB

1,2,3,4-Tetrachlorbenzol 1,2,3-TCB + 1,2,4-TCB; 1,2-DCB + 1,4-DCB; CB

1,2,4,5-Tetrachlorbenzol 1,2,3-TCB; 1,4-DCB

1,2,3,5-Tetrachlorbenzol ?

2,4-Dichlortoluol 4-CT; Toluol



2,3,6-Trichlortoluol 2,5-DCT; 2-CT; Toluol

2,4,5-Trichlortoluol 2,5-DCT + 3,4-DCT; 3-CT + 4-CT; Toluol

a) Abkürzungen: Chlorbenzol (CB), Dichlorbenzol (DCB), Trichlorbenzol (TCB), Chlortoluol (CT),Dichlortoluol (DCT)


Diese Studie zeigt unter anderem die Dechlorierung von Chlorbenzol und -toluol zu Benzol

bzw. Toluol als Endprodukt. In anderen Studien wird Chlorbenzol als Endprodukt

beschrieben (z. B. 20, oder 81). In einer Studie zum Abbau von Chlorbenzolen durch eine

methanogene Lebensgemeinschaft konnte gezeigt werden, daß bei mehrfacher

Chlorsubstitution bevorzugt die Chloratome abgespalten werden, die entweder durch zwei

weitere Chlorsubstituenten flankiert werden, oder aber in ortho-Position zu einem anderen

Chloratom stehen (s. Abb. 21, aus 81). Ähnliche Beobachtungen wurden beim Abbau von

Chlorphenolen (79) und PCB's (2) gemacht.

Chlorbenzoate werden meist zu Benzoat dechloriert, welches dann über den anaeroben

Aromatenstoffwechsel vollständig metabolisert werden kann (28, 57, 99, 102). Die

Dechlorierung von 2-Chlorbenzoat, 2,6-Dichlorbenzoat, 2,4-Dichlorbenzoat und 2-Chlor-5-

Abb. 21. In methanogener Mischkultur beobachtete anaerobe Dechlorierung von Chlorbenzolen,ausgehend vom Hexachlorbenzol. Chloratome, die bevorzugt abgespalten werden sind rot.Gestrichelte Pfeile bezeichnen Reaktionen, die abweichend von der bevorzugten ortho-Dechlorierung beobachtet wurden.


hydroxybenzoat durch verschiedene bakterielle Konsortien erfolgte ausschließlich in der

ortho-Position und war Benzoat-spezifisch: 2-Chlorbenzaldehyd und 2-Chloranisol wurden in

2-Chlorphenol umgewandelt, nicht jedoch dechloriert (40), vgl. auch mit dem anaeroben

Metabolismus von Chlorguaiacolen (78). Am Beispiel von 3-Chlor-4-Hydroxybenzoat konnte

gezeigt werden, daß die vorhergehende Adaptation des Sediments die beobachtete Biochemie

vorgibt: vorheriger Umsatz von 4-Hydroxybenzoat (= Aryldecarboxylierung) führte zu

Bildung von 2-Chlorphenol, Anpassung an 3-Chlorbenzoat (= meta-Dehalogenierung) oder 2-

Chlorphenol (= ortho-Dehalogenierung) zu 4-Hydroxybenzoat (115). Es scheint, daß in

einzelnen Organismen die Dehalogenierung von Chlorbenzoat positionsspezifisch ist. In

Mischpopulationen, welche Chlorbenzoate an allen drei Positionen dechlorieren, konnte eine

Präferenz für meta- > para- > ortho-Position beobachtet werden (89).

Chlorphenole & chlorierte Herbizide. Obwohl die Nutzung von 2-,3- oder 4-Chlorphenol als

alleiniger Energie- und Kohlenstoffquelle unter anaeroben Bedingungen möglich ist (11, 22,

27, 46, 60), häufen sich in vielen Studien monosubstituierte Chlorphenole als Zwischen- und

Endprodukte beim Abbau höher substituierter Chloraromaten an (15, 19, 21, 68, 79). Ursache

für diese Anhäufung ist vermutlich der langsame enzymatische Umsatz der einfachen

Chlorphenole, kombiniert mit toxischen Effekten derselben auf die Zellen, wie am Abbau von

2,4-Dichlorphenol über 4-Chlorphenol zu CH4 und CO2 gezeigt werden konnte (116). Bei

monosubstituierten Chlorphenolen zeigt sich bezüglich der Dechlorierung eine

positionsspezifsche Präferenz der Reihenfolge ortho- > meta- > para-Position (22). Bestätigt

wurde dies beim Abbau von Pentachlorphenol über 2,3,5,6-Tetrachlorphenol, 2,3,5-

Trichlorphenol und 3,5-Dichlorphenol zu 3-Chlorphenol durch ein methanogenes Konsortium

(60). Ausgehend von Pentachlorphenol sind die bisher gefundenen Dechlorierungen in

Abbildung 22 dargestellt (79, 104).

Der anaerobe Abbau des Herbizids 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure ist beschrieben worden (s.

89). Ähnlich der Situation beim aeroben Abbau wird zuerst Acetat abgespalten und es entsteht

2,4-Dichlorphenol, welches weiter metabolisiert wird (18).

Chlorierte Biphenyle. Der anaerobe Abbau von PCB's wurde sowohl in Modellsystemen, als

auch in Klärschlämmen beobachtet (25, 89). Häufig werden dabei nur partielle

Dechlorierungen gemessen. Für den weiteren Abbau der Endprodukte bedarf es dann anderer

Mitglieder der mikrobiellen Gemeinschaften, wie z. B. aerober Biphenylabbauer (69, 85).


Abb. 22. Für den anaeroben Abbau von Chlorphenolen beschriebene Dechlorierungsmechanismen. RotePfeile geben besonders bevorzugte Dechlorierungen (> 85 % Wahrscheinlichkeit), gestrichelteWahrscheinlichkeiten unter 40 % an, für die restlichen Reaktionen liegen keine Angaben vor.


IV; Zusammenfassung zum Abbau von Chloraromaten

Folgendes Resümee läßt sich für den Abbau von Chloraromaten ziehen:

- Abiotischer Abbau von chlorierten Aromaten ist meist extrem langsam.

- Da viele Chloraromaten sowohl auf Eukaryoten, als auch auf Prokaryoten toxisch wirken,

bedarf es meist einer Adaptation des betreffenden Ökosystems, bevor nennenswerter

Abbau zu beobachten ist.

- Unter den Pilzen leisten die ligninolytischen Pilze den größten Beitrag zum Abbau von

Chloraromaten. Unter Stickstoffmangelbedingungen setzen Phenoloxidasen,

Ligninperoxidasen, Manganperoxidasen und Laccase ein bis mehrfach substituierte

Chloraromaten um. Allerdings sinkt der Umsatz mit zunehmender Substituentenzahl,

gleichzeitig steigt das Risiko einer Polymerisierung der Substrate zu größeren, noch

schlechter abbaubaren Molekülen. Da der Umsatz kometabolischer Natur ist, ist er

langsam und meist gering.

- Der aerobe Abbau wird mit zunehmender Substituentenzahl (> 3 Chloratome) schwierig.

Durch vorhergehende Dechlorierung im anaeroben Milieu können vorher schwer

zugängliche Substanzen wie z. B. einige PCB's einem aeroben Abbau zugeführt werden.

Eines der größten Probleme beim aeroben Abbau ist die irreversible Hemmung der

regulären 2,3-Dioxygenaseringspaltenzyme durch reaktive Zwischenprodukte meta-

gespaltener Chloraromaten. Obwohl alternative Ringspaltsysteme für den

Chloraromatenabbau existieren (ortho, als auch meta), kann es in natürlichen

Ökosystemen durch nicht-chlorierte Aromaten zur bevorzugten Induktion der normalen

Systeme und damit zu toxischen Effekten in den Zellen kommen. Dies ist besonders beim

PCB-Abbau ein Problem. Sowohl für die Chlorbenzole, als auch für die Chlorphenole

ergibt sich mit Hinblick auf den Chlorsubstituenten eine positionsspezifische Präferenz

der Abbaubarkeit: para > meta > ortho. Beim Abbau von PCB's wirken sich vor allem

Chlorsubstituenten in 2-Stellung störend aus, da sie den Angriff der 2,3-Dioxygenase

sterisch behindern. Chlorsubstituenten in para-Stellung wirken dagegen weniger störend.

- Der anaerobe Abbau geht - im Gegensatz zum aeroben Abbau - mit höher substituierten

Chloraromaten leichter vonstatten als mit den niedrigsubstituierten, welche sich häufig

anhäufen. Da Chloraromaten in anaeroben Systemen meist als Elektronenakzeptoren

dienen, hängt ihre (Nicht-)Abbaubarkeit wesentlich von den zur Verfügung stehenden

Elektronendonatoren bzw. alternativen -akzeptoren ab. Bei Chlorbenzolen ist eine

bevorzugte Dechlorierung des ortho-Substituenten beobachtet worden. Anders als beim

aeroben Abbau wird hier für die Chlorphenole eine Präferenz der Dechlorierung in der


Reihenfolge ortho > meta > para beobachtet. Für Monochlorbenzoat wurde in

Mischkulturen andere Präferenzen beobachtet: meta > para > ortho.


Literaturquellen:

1. Abrahamsson, K., and A. Ekdahl. 1996. Volatile halogenated compounds and

chlorophenols in the Skagerrak. J. Sea Res. 35:73-79.

2. Abramowitz, D. A. 1990. Aerobic and anaerobic biodegradation of PCB's: a review.

Crit. Rev. Biotechnol. 10:247-251.

3. Adriaens, P., and D. Grbic-Galic. 1994. Cometabolic transformation of mono- and

dichlorobiphenyls and chlorohydroxybiphenyls by methanotrophic groundwater

isolates. Environ. Sci. Technol. 28:1325-1330.

4. Ahlborg, U. G., and T. M. Thunberg. 1980. Chlorinated phenols: occurrence,

toxicity, metabolism, and environmental impact. Crit. Rev. Toxicol. 7:1-35.

5. Aislabie, J., and G. Lloyd-Jones. 1995. A review of bacterial degradation of

pesticides. Aust. J. Soil Res. 33:925-942.

6. Ajithkumar, P. V., and A. A. M. Kunhi. 2000. Pathways for 3-chloro- and 4-

chlorobenzoate degradation in Pseudomonas aeruginosa 3mT. Biodegradation

11:247-261.

7. Alexander, M. 1999. Biodegradation and bioremediation. 2nd ed. Academic Press,

San Diego, Calif.

8. Anchel, M. 1952. Identification of Drosophilin A as p-methoxytetrachlorophenol. J.

Am. Chem. Soc. 74:2943.

9. Anonymus. 1988. Chlorobenzene. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 106:37-49.

10. Arensdorf, J. J., and D. D. Focht. 1994. Formation of chlorocatechol meta cleavage

products by a pseudomonad during metabolism of monochlorobiphenyls. Appl.

Environ. Microbiol. 60:2884-2889.

11. Bae, H. S., J. M. Lee, Y. B. Kim, and S. T. Lee. 1997. Biodegradation of the

mixtures of 4-chlorophenol and phenol by Comamonas testosteroni CPW301.

Biodegradation 7:463-469.

12. Bae, H. S., J. M. Lee, and S. T. Lee. 1996. Biodegradation of 4-chlorophenol via a

hydroquinone pathway by Arthrobacter ureafaciens CPR706. FEMS Microbiol. Lett.

145:125-129.


13. Bae, H. S., J. M. Lee, and S.-T. Lee. 1997. Biodegradation of the mixture of 2,4,6-

trichlorophenol, 4-chlorophenol, and phenol by a defined mixed culture. J. Gen. Appl.

Microbiol. 43:97-103.

14. Bartels, I., H. J. Knackmuss, and W. Reineke. 1984. Suicide inactivation of

catechol 2,3-dioxygenase from Pseudomonas putida mt-2 by halocatechols. Appl.


15. Beaudet, R., M. J. Levesque, R. Villemur, M. Lanthier, M. Chenier, F. Lepine,

and J. G. Bisaillon. 1998. Anaerobic biodegradation of pentachlorophenol in a

contaminated soil inoculated with a methanogenic consortium or with

Desulfitobacterium frappieri strain PCP-1. Appl. Microbiol. Biotechnol. 50:135-141.

16. Bedard, D. L., R. E. Wagner, M. J. Brennan, M. L. Haberl, and J. F. Brown.

1987. Extensive degradation of Aroclors and environmentally transformed

polychlorinated biphenyls by Alcaligenes eutrophus H850. Appl. Environ. Microbiol.

53:1094-1102.

17. Belay, N., and L. Daniels. 1987. Production of ethane, ethylene, and acetylene from

halogenated hydrocarbons by methanogenic bacteria. Appl. Environ. Microbiol.

53:1604-1610.

18. Berestovskaya, Y. Y., V. V. Ignatov, L. N. Markina, A. A. Kamenev, and O. E.

Makarov. 2000. Degradation of ortho-chlorophenol, para-chlorophenol, and 2,4-

dichlorophenoxyacetic acid by the bacterial community of anaerobic sludge.

Microbiology (Russia) 69:397-401.

19. Boothe, D. D. H., J. E. Rogers, and J. Wiegel. 1997. Reductive dechlorination of

chlorophenols in slurries of low-organic-carbon marine sediments and subsurface

soils. Appl. Microbiol. Biotechnol. 47:742-748.

20. Bosma, T. N. P., J. R. van der Meer, G. Schraa, and M. E. Tros. 1988. Reductive

dechlorination of all trichloro- and dichlorobenzene isomers. FEMS Microbiol. Ecol.

53:223-229.

21. Bouchard, B., R. Beaudet, R. Villemur, G. McSween, F. Lepine, and J. G.

Bisaillon. 1996. Isolation and characterization of Desulfitobacterium frappieri sp.

nov., an anaerobic bacterium which reductively dechlorinates pentachlorophenol to 3-

chlorophenol. Int. J. Syst. Bacteriol. 46:1010-1015.


22. Boyd, S. A., and D. R. Shelton. 1984. Anaerobic biodegradation of chlorophenols in

fresh and acclimated sludge. Appl. Environ. Microbiol. 47:272-277.

23. Brinkmann, U., and W. Reineke. 1992. Degradation of chlorotoluenes by in vivo

constructed hybrid strains: problems of enzyme specificity, induction and prevention

of meta-pathway. FEMS Microbiol. Lett. 75:81-87.

24. Bumpus, J. A., M. Tien, D. Wright, and S. D. Aust. 1985. Oxidation of persistent

environmental pollutants by a white rot fungus. Science 228:1434-1436.

25. Chang, B. V., S. W. Chou, and S. Y. Yuan. 1999. Microbial dechlorination of

polychlorinated biphenyls in anaerobic sewage sludge. Chemosphere 39:45-54.

26. Chaudhry, G. R., and S. Chapalmadugu. 1991. Biodegradation of halogenated

aromatic compounds. Microbiol. Rev. 55:59-79.

27. Cole, J. R., A. L. Cascarelli, W. W. Mohn, and J. M. Tiedje. 1994. Isolation and

characterization of a novel bacterium growing via reductive dehalogenation of 2-

chlorophenol. Appl. Environ. Microbiol. 60:3536-3542.

28. de Weerd, K. A., and J. M. Suflita. 1990. Anaerobic aryl reductive dehalogenation

of halobenzoates by cell extracts of of Desulfomonile tiedjei. Appl. Environ.

Microbiol. 56:2999-3005.

29. Donnelly, P. K., J. A. Entry, and D. L. Crawford. 1993. Degradation of atrazine and

2,4-dichlorophenoxyacetic acid by mycorrhizal fungi at three nitrogen concentrations

in vitro. Appl. Environ. Microbiol. 59:2642-2647.

30. Emtiazi, G., M. Satarii, and F. Mazaherion. 2001. The utilization of aniline,

chlorinated aniline, and aniline blue as the only source of nitrogen by fungi in water.

Water Res. 35:1219-1224.

31. Engesser, K. H., and P. Schulte. 1989. Degradation of 2-bromo-, 2-chloro- and 2-

fluorobenzoate by Pseudomonas putida CLB 250. FEMS Microbiol. Lett. 51:143-147.

32. Falandysz, J. 1998. Polychlorinated naphthalenes: An environmental update. Environ.

Pollut. 101:77-90.

33. Farrell, A., and B. Quilty. 1999. Degradation of mono-chlorophenols by a mixed

microbial community via a meta-cleavage pathway. Biodegradation 10:353-362.


34. Fava, F., and L. Marchetti. 1991. Degradation and mineralization of 3-

chlorobiphenyl by a mixed aerobic bacterial culture. Appl. Microbiol. Biotechnol.

36:240-245.

35. Finkel’shtein, Z. I., B. P. Baskunov, E. L. Golovlev, O. V. Moiseeva, J. Vervoort,

I. Rietjens, and L. A. Golovleva. 2000. Dependence of the conversion of

chlorophenols by Rhodococci on the number and position of chlorine atoms in the

aromatic ring. Microbiology (Russia) 69:40-48.

36. Fritz, H., W. Reineke, and E. Schmidt. 1992. Toxicity of chlorobenzene on

Pseudomonas sp. strain RHO1, a chlorobenzene-degrading strain. Biodegradation

2:165-170.

37. Fulthorpe, R. R., C. McGowan, O. V. Maltseva, W. E. Holben, and J. M. Tiedje.

1995. 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid-degrading bacteria contain mosaics of catabolic

genes. Appl. Environ. Microbiol. 61:3274-3281.

38. Fulthorpe, R. R., and L. N. Schofield. 1999. A comparison of the ability of forest

and agricultural soils to mineralize chlorinated aromatic compounds. Biodegradation

10:235-244.

39. Gastaldi, D., G. Ostacoli, A. Torazzo, and V. Zelano. 1998. Degradation of 2-

chloroaniline, 3-chloronitrobenzene and 1,2,4-trichlorobenzene in River Sediments.

Ann. Chim. - Rome 88:657-666.

40. Genthner, B. R. 1999. Preliminary characterization of four 2-chlorobenzoate-

degrading anaerobic bacterial consortia. Biodegradation 10:27-33.

41. Gergov, M., M. Priha, E. Talka, O. Valttila, A. Kangas, and K. Kukkonen. 1988.

Chlorinated organic compounds in effluent treatment at kraft mills. TAPPI J. 71:175-

184.

42. Golovleva, L. A., O. Zaborina, R. Pertsova, B. Baskunov, Y. Schurukhin, and S.

Kuzmin. 1992. Degradation of polychlorinated phenols by Streptomyces rochei 303.


43. Gonzalez, B., C. Acevedo, R. Brezny, and T. Joyce. 1993. Metabolism of

chlorinated guaiacols by a guaiacol-degrading Acinetobacter junii strain. Appl.



44. Grey, R., C. Hofer, and D. Schlosser. 1998. Degradation of 2-chlorophenol and

formation of 2-chloro-1,4-benzoquinone by mycelia and cell-free crude culture liquids

of Trametes versicolor in relation to extracellular laccase activity. J. Basic. Microbiol.

38:371-382.

45. Guthrie, M. A., E. J. Kirsch, R. F. Wukasch, and C. P. L. J. Grady. 1984.

Pentachlorophenol biodegradation. II. Anaerobic. Water Res. 18:451-461.

46. Häggblom, M. M., and L. Y. Young. 1995. Anaerobic degradation of halogenated

phenols by sulfate-reducing consortia. Appl. Environ. Microbiol. 61:1546-1550.

47. Haigler, B. E., C. A. Pettigrew, and J. C. Spain. 1992. Biodegradation of mixtures

of substituted benzenes by Pseudomonas sp. strain JS150. Appl. Environ. Microbiol.

58:2237-2244.

48. Haigler, B. E., and J. C. Spain. 1989. Degradation of p-chlorotoluene by a mutant of

Pseudomonas sp. strain JS6. Appl. Environ. Microbiol. 55:372-379.

49. Havel, J., and W. Reineke. 1992. Degradation of Aroclor 1221 and survival of strains

in soil microcosms. Appl. Microbiol. Biotechnol. 38:129-134.

50. Havel, J., and W. Reineke. 1993. Microbial degradation of chlorinated

acetophenones. Appl. Environ. Microbiol. 59:2706-2712.

51. Havel, J., and W. Reineke. 1991. Total degradation of various chlorobiphenyls by

cocultures and in vivo constructed hybrid pseudomonads. FEMS Microbiol. Lett.

62:163-169.

52. Hickey, W. J., and D. D. Focht. 1990. Degradation of mono-, di-, and trihalogenated

benzoic acids by Pseudomonas aeruginosa JB2. Appl. Environ. Microbiol. 56:3842-

3850.

53. Higson, F. K., and D. D. Focht. 1989. Bacterial metabolism of hydroxylated

biphenyls. Appl. Environ. Microbiol. 55:946-952.

54. Hinteregger, C., M. Loidl, and F. Streichsbier. 1994. Pseudomonas acidovorans: a

bacterium capable of mineralizing 2-chloroaniline. J. Basic. Microbiol. 34:77-85.

55. Hollender, J., J. Hopp, and W. Dott. 1997. Degradation of 4-chlorophenol via the

meta cleavage pathway by Comamonas testosteroni JH5. Appl. Environ. Microbiol.

63:4567-4572.


56. Holliger, C., G. Wohlfarth, and G. Diekert. 1998. Reductive dechlorination in the

energy metabolism of anaerobic bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 22:383-398.

57. Horowitz, A., J. M. Suflita, and J. M. Tiedje. 1983. Reductive dehalogenation of

halobenzoates by anaerobic lake sediment microorganisms. Appl. Environ. Microbiol.

45:1459-1465.

58. Hutzinger, O., S. Safe, and V. Zitko. 1974. The Chemistry of PCBs. CRC Press,

Cleveland, Ohio.

59. Joshi, D. K., and M. H. Gold. 1993. Degradation of 2,4,5-trichlorophenol by the

lignin-degrading basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Appl. Environ.

Microbiol. 59:1779-1785.

60. Juteau, P., R. Beaudet, G. McSween, F. Lepine, and J. G. Bisaillon. 1995. Study of

the reductive dechlorination of pentachlorophenol by a methanogenic consortium.

Can. J. Microbiol. 41:862-868.

61. Kaschabek, S. R., T. Kasberg, D. Mueller, A. E. Mars, D. B. Janssen, and W.

Reineke. 1998. Degradation of chloroaromatics: Purification and characterization of a

novel type of chlorocatechol 2,3-dioxygenase of Pseudomonas putida GJ31. J.

Bacteriol. 180:296-302.

62. Kim, M. H., and O. J. Hao. 1999. Cometabolic degradation of chlorophenols by

Acinetobacter species. Water Res. 33:562-574.

63. Kim, S., and F. W. Picardal. 2000. A novel bacterium that utilizes

monochlorobiphenyls and 4-chlorobenzoate as growth substrates. FEMS Microbiol.

Lett. 185:225-229.

64. Klecka, G. M., and D. T. Gibson. 1981. Inhibition of catechol 2,3-dioxygenase from

Pseudomonas putida by 3-chlorocatechol. Appl. Environ. Microbiol. 41:1159-1165.

65. Kozlovsky, S. A., and F. Kunc. 1995. Metabolism of 2-chlorobenzoic acid in

Pseudomonas stutzeri. Folia Microbiol. 40:454-456.

66. Kuruuzum, A., L. O. Demirezer, I. Bergere, and A. Zeeck. 2001. Two new

chlorinated naphthalene glycosides from Rumex patientia. J. Nat. Prod. 64:688-690.

67. Lechner, U., R. Baumbach, D. Becker, V. Kitunen, G. Auling, and M. Salkinoja-

Salonen. 1995. Degradation of 4-chloro-2-methylphenol by an activated sludge isolate

and its taxonomic description. Biodegradation 6:83-92.


68. Madsen, T., and H. Aamand. 1992. Anaerobic transformation and toxicity of

trichlorophenols in a stable enrichment culture. Appl. Environ. Microbiol. 58:557-561.

69. Maltseva, O. V., T. V. Tsoi, J. F. Quensen, M. Fukuda, and J. M. Tiedje. 1999.

Degradation of anaerobic reductive dechlorination products of Aroclor 1242 by four

aerobic bacteria. Biodegradation 10:363-371.

70. Marquardt, H. 1994. Lehrbuch der Toxikologie. BI-Wissenschaftlicher Verlag,

Mannheim.

71. Marr, J., S. Kremer, O. Sterner, and H. Anke. 1996. Transformation and

mineralization of halophenols by Penicillium simplicissimum SK9117. Biodegradation

7:165-171.

72. Mars, A. E., T. Kasberg, S. R. Kaschabek, M. H. van Agteren, D. B. Janssen, and

W. Reineke. 1997. Microbial degradation of chloroaromatics: Use of the meta-

cleavage pathway for mineralization of chlorobenzene. J. Bacteriol. 179:4530-4537.

73. Mikesell, M. D., and S. A. Boyd. 1986. Complete reductive dechlorination and

mineralization of pentachlorophenol by anaerobic microorganisms. Appl. Environ.


74. Mileski, G. J., J. A. Bumpus, M. A. Jurek, and S. D. Aust. 1988. Biodegradation of

pentachlorophenol by the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium. Appl.


75. Mohn, W. W., K. Westerberg, W. R. Cullen, and K. J. Reimer. 1997. Aerobic

biodegradation of biphenyl and polychlorinated biphenyls by Arctic soil

microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 63:3378-3384.

76. Müller, M. D., and H.-R. Buser. 1997. Conversion reactions of various

phenoxyalkanoic acid herbicides in soil. 1. Enantiomerization and enantioselective

degradation of the chiral 2-phenoxypropionic acid herbicides. Environ. Sci. Technol.

31:1953-1959.

77. Müller, R. H., S. Jorks, S. Kleinsteuber, and W. Babel. 1999. Comamonas

acidovorans strain MC1: a new isolate capable of degrading the chiral herbicides

dichlorprop and mecoprop and the herbicides 2,4-D and MCPA. Microbiol. Res.

154:241-246.


78. Neilson, A. H., A. S. Allard, C. Lindgren, and M. Remberger. 1987.

Transformations of chloroguaiacols, chloroveratroles, and chlorocatechols by stable

consortia of anaerobic bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 53:2511-2519.

79. Nicholson, D. K., S. L. Woods, J. D. Istok, and D. C. Peek. 1992. Reductive

dechlorination of chlorophenols by a pentachlorophenol- acclimated methanogenic

consortium. Appl. Environ. Microbiol. 58:2280-2286.

80. Nishino, S. F., J. C. Spain, L. A. Belcher, and C. D. Litchfield. 1992.

Chlorobenzene degradation by bacteria isolated from contaminated groundwater.

Appl. Environ. Microbiol. 58:1719-1726.

81. Nowak, J., N. H. Kirsch, W. Hegemann, and H.-J. Stan. 1996. Total reductive

dechlorination of chlorobenzenes to benzene by a methanogenic mixed culture

enriched from Saale river sediment. Appl. Microbiol. Biotechnol. 45:700-709.

82. Öberg, L. G., and K. G. Paul. 1985. The transformation of chlorophenols by

lactoperoxidase. Biochim. Biophys. Acta 842:30-38.

83. Paasivirta, J. 1978. Chlorophenols - poisons, possible environmental poisons. Kem.

9:367.

84. Pearson, C. R. 1982. Halogenated aromatics. p. 98-116. In O. Hutzinger (ed.), The

handbook of environmental chemistry, anthropogenic compounds, vol. 3. Springer,

New York, Berlin, Heidelberg.

85. Pettigrew, C. A., A. Breen, C. Corcoran, and G. S. Sayler. 1990. Chlorinated

biphenyl mineralization by individual populations and consortia of freshwater bacteria.


86. Pettigrew, C. A., B. E. Haigler, and J. C. Spain. 1991. Simultaneous biodegradation

of chlorobenzene and toluene by a Pseudomonas strain. Appl. Environ. Microbiol.

57:157-162.

87. Pollmann, K., S. Beil, and D. H. Pieper. 2001. Transformation of chlorinated

benzenes and toluenes by Ralstonia sp. strain PS12 tecA (tetrachlorobenzene

dioxygenase) and tecB (chlorobenzene dihydrodiol dehydrogenase) gene products.



88. Ramanand, K., M. T. Balba, and J. Duffy. 1993. Reductive dehalogenation of

chlorinated benzenes and toluenes under methanogenic conditions. Appl. Environ.

Microbiol. 59:3266-3272.

89. Reineke, W. 2001. Aerobic and Anaerobic Biodegradation Potentials of

Microorganisms. p. 161. In B. Beek (ed.), The Handbook of Environmental

Chemistry, vol. 2, Part K, Biodegradation and Persistence. Springer Verlag, Berlin.

90. Romanov, V., and R. P. Hausinger. 1994. Pseudomonas aeruginosa 142 uses a

three-component ortho-halobenzoate 1,2-dioxygenase for metabolism of 2,4-dichloro-

and 2-chlorobenzoate. J. Bacteriol. 176:3368-3374.

91. Rüttimann-Johnson, C., and R. T. Lamar. 1996. Polymerization of

pentachlorophenol and ferulic acid by fungal extracellular lignin-degrading enzymes.


92. Saari, R. E., D. A. Hogan, and R. P. Hausinger. 1999. Stereospecific degradation of

the phenoxypropionate herbicide dichlorprop. J. Mol. Catal. B-Enzm. 6:421-428.

93. Sailler, B., and K. W. Glombitza. 1999. Halogenated phlorethols and

fucophlorethols from the brown alga Cystophora retroflexa. Nat. Toxins 7:57-62.

94. Santesson, J. 1969. Chemical studies on lichens. Ph.D. Uppsala University.

95. Schultz, A., U. Jonas, E. Hammer, and F. Schauer. 2001. Dehalogenation of

chlorinated hydroxybiphenyls by fungal laccase. Appl. Environ. Microbiol. 67:4377-

4381.

96. Seah, S. Y., G. Labbe, S. Nerdinger, M. R. Johnson, V. Snieckus, and L. D. Eltis.

2000. Identification of a serine hydrolase as a key determinant in the microbial

degradation of polychlorinated biphenyls. J. Biol. Chem. 275:15701-15708.

97. Seeger, M., M. Zielinski, K. N. Timmis, and B. Hofer. 1999. Regiospecificity of

dioxygenation of di- to pentachlorobiphenyls and their degradation to chlorobenzoates

by the bph-encoded catabolic pathway of Burkholderia sp. strain LB400. Appl.


98. Seo, D.-I., J.-C. Chae, K.-P. Kim, Y. Kim, K.-S. Lee, and C.-K. Kim. 1998. A

pathway for 4-chlorobenzoate degradation by Pseudomonas sp. S-47. J. Microbiol.

Biotechnol. 8:96-100.


99. Shelton, D. R., and J. M. Tiedje. 1984. Isolation and partial characterization of

bacteria in an anaerobic consortium that mineralizes 3-chlorobenzoic acid. Appl.


100. Sommer, C., and H. Gorisch. 1997. Enzymology of the degradation of

(di)chlorobenzenes by Xanthobacter flavus 14p1. Arch. Microbiol. 167:384-391.

101. Steiert, J. G., and R. L. Crawford. 1986. Catabolism of pentachlorophenol by a

Flavobacterium sp. Biochem. Biophys. Res. Commun. 141:825-830.

102. Suflita, J. M., D. R. Horowitz, D. R. Shelton, and J. M. Tiedje. 1982.

Dehalogenation: a novel pathway for the anaerobic biodegradation of haloaromatic

compounds. Science 218:1115-1117.

103. Sylvestre, M. 1995. Biphenyl/chlorobiphenyls catabolic pathway of Comamonas

testosteroni B-356: Prospect for use in bioremediation. Int. Biodeter. Biodegr. 35:189-

211.

104. Takeuchi, R., Y. Suwa, T. Yamagishi, and Y. Yonezawa. 2000. Anaerobic

transformation of chlorophenols in methanogenic sludge unexposed to chlorophenols.

Chemosphere 41:1457-1462.

105. Tanabe, S. 1988. PCB problems in the future: Foresight from current knowledge.

Environ. Pollut. 50:5-28.

106. Tett, V. A., A. J. Willetts, and H. M. Lappin-Scott. 1997. Biodegradation of the

chlorophenoxy herbicide (R)-(+)-mecroprop by Alcaligenes denitrificans.


107. Thomas, D. R., K. S. Carswell, and G. Georgiou. 1992. Mineralization of biphenyl

and PCBs by the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium. Biotechnol. Bioeng.

40:1395-1402.

108. Tsoi, T. V., E. G. Plotnikova, J. R. Cole, W. F. Guerin, M. Bagdasarian, and J. M.

Tiedje. 1999. Cloning, expression, and nucleotide sequence of the Pseudomonas

aeruginosa 142 ohb genes coding for oxygenolytic ortho dehalogenation of

halobenzoates. Appl. Environ. Microbiol. 65:2151-2162.

109. Vallaeys, T., L. Albino, G. Soulas, A. D. Wright, and A. J. Weightman. 1998.

Isolation and characterization of a stable 2,4-dichlorophenoxyacetic acid degrading


bacterium, Variovorax paradoxus, using chemostat culture. Biotechnol. Lett. 20:1073-

1076.

110. Valli, K., and M. H. Gold. 1991. Degradation of 2,4-dichlorophenol by the lignin-

degrading fungus Phanerochaete chrysosporium. J. Bacteriol. 173:345-352.

111. Valli, K., H. Wariishi, and M. H. Gold. 1992. Degradation of 2,7-dichlorodibenzo-p-

dioxin by the lignin-degrading basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. J.

Bacteriol. 174:2131-2137.

112. Wackett, L. P., and C. D. Hershberger. 2001. Biocatalysis and Biodegradation. 1rst

ed. ASM Press, Washington, D. C.

113. Yadav, J. S., R. E. Wallace, and C. A. Reddy. 1995. Mineralization of Mono- and

Dichlorobenzenes and Simultaneous Degradation of Chloro- and Methyl-Substituted

Benzenes by the White Rot Fungus Phanerochaete chrysosporium. Appl. Environ.


114. Zaitsev, G. M., and Y. N. Karasevich. 1984. Utilization of 2-chlorobenzoic acid.

Mikrobiologiia 53:75-80.

115. Zhang, X., and J. Wiegel. 1992. The anaerobic degradation of 3-chloro-4-

hydroxybenzoate in freshwater sediment proceeds via either chlorophenol or

hydroxybenzoate to phenol and subsequently to benzoate. Appl. Environ. Microbiol.

58:3580-3585.

116. Zhang, X., and J. Wiegel. 1990. Sequential anaerobic degradation of 2,4-

dichlorophenol in freshwater sediments. Appl. Environ. Microbiol. 56:1119-1127.

117. Zipper, C., C. Bolliger, T. Fleischmann, M. J.-F. Suter, W. Angst, M. D. Muller,

and H.-P. E. Kohler. 1999. Fate of the herbicides mecoprop, dichlorprop, and 2,4-D

in aerobic and anaerobic sewage sludge as determined by laboratory batch studies and

enantiomer-specific analysis. Biodegradation 10:271-278.

Germa, Philipp NitroaromatenZusammen.doc

05.2000 1/10

ANLAGE 4: Abbau der Nitroaromaten (Phe-NO2)Der überwiegende Teil der aromatischen Nitroverbindungen wird durch menschlicheAktivitäten verursacht (1,2): unvollständige Verbrennung von fossilen Brennstoffen, Synthesevon künstlichen Farbstoffen, Kunststoffen, Pestiziden und Sprengstoffen. Die meisten dieserStoffe sind toxisch (3). Es wurde nur über wenige natürliche Nitroaromaten berichtet, und dassind vor allem Antibiotika (2).

1. DATEN AUS DER LITERATURAromatische Nitroverbindungen können nach dem Aufbau ihres chemischen Grundgerüsts indrei Klassen eingeteilt werden:- einfach aromatische Verbindungen, die aus einem Phenylring bestehen, der verschiedensubstituiert sein kann- heteroaromatische Verbindungen- polycyclische aromatische Verbindungen (1).Im Folgenden wird überwiegend der Abbau der einfach aromatischen Verbindungenbetrachtet.

Chemie der Nitrogruppe• Die resonanzstabilisierte Nitrogruppe ist im Allgemeinen reaktionsträge; jedoch hat diese

funktionelle Gruppe aufgrund der positiven Partialladung am Stickstoff einenelektrophilen Charakter, weshalb die Nitrogruppe relativ leicht reduziert werden kann. Inder Natur kommen solche Reduktionen häufig vor. Dabei entstehen sehr reaktiveIntermediate, bevor die Nitrogruppe in die wiederum stabile Aminogruppe überführt wird(Abb. 1).

NOO

+ NO O

N

O

NOHH

NH2

e-

OH2

e- 2 e-

OH2

2 e-

Nitroradikal-Anion Nitroso-Intermediat Hydroxylamin

Abb.1: Reduktion der Nitrogruppe zur Aminogruppe am Beispiel der Umwandlung vonNitrobenzol zu Anilin (2)

Aromatische Nitroverbindungen haben sich im Boden und in industriellen Abwässern alspersistent erwiesen (1). Der mikrobielle Abbau ist durch die elektronenziehende Wirkung derNitrogruppe erschwert (1). Etliche Nitroaromaten sind jedoch nach Adaptation abbaubar (4).

Mehrere Faktoren können den Abbau von Nitroaromaten behindern:- die Toxizität der Nitroaromaten gegenüber Mikroorganismen- die schwache Bioverfügbarkeit (schlechte aquatische Solubilität, hohe Sorptionsneigung)- der Abbau einiger Nitroaromatengemische wird aufgrund bestimmter Nitroaromaten-kombinationen inhibiert- offenbar existieren nicht genügend Abbauwege für Nitroaromaten in Mikroorganismen (2)

Biologische Nutzung von NitroaromatenMikroorganismen können Nitroaromaten auf sehr unterschiedlicher Weise nutzen (2):


05.2000 2/10

- als Kohlenstoff- und Energiequelle- als Stickstoffquelle- als ElektronenakzeptorZum Teil verstoffwechseln Mikroorganismen Nitroaromaten sowohl als Kohlenstoff-,Energie- und Stickstoffquelle. Wenn Nitroaromaten ausschließlich als Stickstoffquelle oderals Elektronenakzeptor genutzt werden, werden die Substrate nicht abgebaut, sondernlediglich transformiert. Bei der Nutzung als Elektronenakzeptor kann unterschieden werdenzwischen Reduktionen, die zur Energiekonservierung beitragen und solchen, die keinenEinfluß auf die Energiebilanz der Organismen haben.

Strategien des aeroben Abbaus von NitroaromatenDie Enzyme, die den Abbau der Nitroaromaten ermöglichen, sind nicht dieselben, die imanorganischen Stickstoffzyklus vorkommen (2).

Viele Mikroorganismen verfügen über Enzyme (z.B. Redoxenzyme dienen alsNitroreductase), die Nitroaromaten primär abbauen können. Wenige sind aber in der Lage,Nitroaromaten zu mineralisieren (2).

Nitroaromatische Verbindungen können- entweder über die Entfernung der Nitrogruppe als Nitrit- oder über die Reduktion zur entsprechenden Aminoverbindungabgebaut werden. Dabei ist die Art des Abbaus von der Art der weiteren Substituentenweitgehend unabhängig (1).

Da die Sauerstoffatome elektronegativer sind als das Stickstoffatom, besitzt der Stickstoffelektrophile Eigenschaften. Er wird in biologischen Systemen daher vorwiegend reduziert.

Mikrorganismen bauen Nitroaromaten über die folgenden fünf Varianten ab (2):

a) Eliminierung der Nitrogruppe durch Monooxygenasen (2)b) Eliminierung der Nitrogruppe durch Dioxygenasen (2,5)c) Eliminierung der Nitrogruppe durch Ringreduktiond) Reduktion der Nitrogruppee) Partielle Reduktion der Nitrogruppe

Im Weiteren sind Beispiele für diese Reaktionen dargestellt. Der weitere Abbau derentstehenden Phenole ist den Modulen zum Aromatenabbau im Allgemeinen zu entnehmen.

NOO O

N

R

R

R

-NO2

Reduktion

CO2

-NH4+


05.2000 3/10

zu a) Eliminierung der Nitrogruppe durch Monooxygenase-Reaktionen

OH

OH

NO2

OH

OH

OH

o2 O

OH

O NAD+ NADH + H+

NO2-

Abb.2: Monooxygenase-katalysierte Umwandlung von 4-Nitrocatechol zuHydroxyhydrochinon (1,2,4-Trihydroxybenzol) durch Bacillus sphaericus JS905 (6). DieReaktion verläuft über 2-Hydroxy-1,4-benzochinon als Intermediat.

zu b) Eliminierung der Nitrogruppe durch Dioxygenase-Reaktionen

NO2 OHO2N OH

H

o2

NADH+H+ NAD+

OH

OH

NO2-

Abb. 3: Dioxygenase-katalysierte Umwandlung von Nitrobenzol zu Catechol (2). DieReaktion verläuft über ein cis,cis-Diol, wobei die Nitrogruppe über spontaneRearomatisierung des Ringes eliminiert wird.

zu c) Eliminierung über Reduktion des aromatischen RingesDiese Form der Nitrogruppen-Eliminierung wurde für den Abbau von Picrinsäurebeschrieben. Dabei wird ein Hydrid auf den aromatischen Ring übertragen, wodurch einsogenannter Meisenheimer-Komplex entsteht. Durch Abspaltung von Nitrit wird dasRingsystem wieder rearomatisiert (2,2,7)

zu d) Reduktion der NitrogruppeDie Reduktion der Nitrogruppe zum entsprechenden Hydroxylamin ist die erste Reaktion imMetabolismus von Nitrobenzol, 4-Nitrotoluene und 4-Nitrobenzoate. Diese Hydroxylaminewerden dann enzymatisch hydroxyliert bevor die Ringöffnung stattfindet (2,7-10).Die Reduktion der Nitrogruppe zum Hydroxylamin erfolgt über zwei NADPH-abhängigeReduktasen. Hydroxyamin wird über ein Mutase in ortho-Aminophenol umgewandelt. DieseReaktion kann auch chemisch spontan ablaufen und wird als „Bamberger-Umlagerung“bezeichnet. Ortho-Aminophenol wird dann durch eine ungewöhnliche meta-Spaltung in ein 2-Aminomuconsäuresemialdehyd überführt (2,11).


05.2000 4/10

NO2NO NHOH NH2

OH

NH2

COOHCOH

NADPH+H+ NADP+ NADPH+H+ NADP+O2

Abb. 4: Abbau von Nitrobenzol in Pseudomonas pseudoalcaligenes JS45 (11)

Zu e) Die Reduktion der Nitrogruppe kann auch durch eine partielle Reduktion zu NO-Substitution und Austauschreaktionen von NO- zu NH2- und OH-Substitutionen oder zu 2OH-Substitutionen erfolgen (12).

Aerober Abbau unterschiedlicher Nitroaromaten

- Chlornitroaromaten und Nitroaniline gehören zu den schwer abbaubarenVerbindungen. Der vollständige Abbau über Anilinderivate wurde selten beschrieben (1).

- Nitrotoluole werden von unterschiedlichen Mikroorganismen primär abgebaut, allerdingsnicht oder nur bis zu 20 % mineralisiert (1,2).

- Der Abbau von Nitrophenolen und Nitrobezoesäuren ist bereits für verschiedeneMikroorganismen beschrieben worden. Die Position der Nitrogruppe in 3-Stellung scheintschwieriger abbaubar zu sein als die Positionen 2 und 4 (1). Im Boden werden dieseVerbindungen möglicherweise eher abgebaut (3).Da Nitrogruppen elektronziehend bezüglich des aromatischen Ring wirken, hat deraromatische Ring von Polynitroaromaten eine starke Elektrondefizienz und ist entsprechendresistant gegen elektrophilen Angriff. Darüber hinaus führen mehrere Nitrogruppen amaromatischen Ring zu sterischer Behinderung des mikrobiellen Angriffs. Polynitroaromatensind daher in der Regel schwer biologisch abbaubar (3). In verschiedenen Mikro-organismenanreicherungen wurden Bakterien isoliert, die unterschiedliche Polynitroaromatenabbauen konnten (9,13,14). Möglicherweise werden eine Reihe dieser Verbindungenlängerfristig biologisch abgebaut.

Ergebnisse der SAR-Studien zum aeroben Abbau von Nitroaromaten- Die Nitrogruppe hat generell einen ungünstigen Einfluß auf die biologische Abbaubarkeit

(16-21).- Monosubstituierte Aromaten sind leichter abbaubar als polysubstituierte Aromaten.- Die Reduktionsrate nitroaromatischer Stoffe nimmt bei stärker elektronenziehenden

Substituenten in Paraposition zu : -NH2 < -OH < -H < -CH3 < -COOH < -NO2 (15).Die Position der Substituenten beeinflusst die biologische Abbaubarkeit.- Parasubstituierte Nitroaromaten sind besser abbaubar als ortho- oder metasubstituierte- Metasubstituierte Nitrophenole hingegen sind besser abbaubar als ortho- oder

parasubstituierte Nitrophenole.


05.2000 5/10

- Ortho- oder parasubstituierte Nitrobenzosäuren sind besser abbaubar als metasubstituierteNitrobenzosäuren (16)

- In Orthoposition substituierte Nitroaromaten sind leichter abbaubar als solche, die inMeta- oder Para-Stellung substituiert sind. (15).

- Der Abbaubarkeit nimmt mit steigender Elektronegativität des Substituenten inOrthoposition zu.


05.2000 6/10

Zusammenfassung zum aeroben AbbauNitroaromaten sind oft schwer abbaubar. Die Wirkung anderer Substituenten ist wie folgt:w Anzahl der NO2-Gruppen ì ⇒ Abbau îw Halogensubstitution ⇒ Abbau îw NH2-Gruppen ⇒ Abbau îw OH- (e- donnierend) und CO- (e- ziehend)Verbindungen vorhanden ⇒ Abbau ìw Methoxy-Substitutionen (e- donnierend) vorhanden ⇒ Abbau ì

Anaerober Metabolismus von NitroaromatenUnter anaeroben Bedingungen beschränkt sich der mikrobielle Umsatz von Nitroaromatenmeist auf eine Reduktion der Nitrogruppe (1,2). Allerdings können auch anaerobNitroaromaten als Kohlenstoff-, Energie- und Stickstoffquelle dienen, wie z.B. für den Abbauvon TNT gezeigt werden konnte (22).Mehrere Mikrooorganismen können Nitroaromaten unter anaeroben Bedingungen in diezugehörigen Amine reduzieren (23,24). Die Amingruppe wird dann wahrscheinlich nacheinem reduktiven Deaminationsmechanismus entfernt. Desulfuvibrio und Clostridium Artekönnen Nitroaromaten wie z.B. TNT mineralisieren (2) (24).Die Reduktion von Nitrogruppen dient vielen anaeroben Bakterien dazu, Elektronen aus denGärungsprozessen abzugeben. Wenn dadurch das Produktmuster der Gärungen zuoxidierteren Produkten verschoben werden kann, kann die Nitrogruppenreduktion indirektzum Energiegewinn beitragen. Kürzlich wurde gezeigt, daß die membrangebundeneReduktion von TNT auch direkt zur Energiekonservierung über einen chemiosmotischenMechanismus genutzt werden kann (25).

2. DATEN-ANALYSEUnsere WISS+ Datenbank enthält 148 Stoffe, die -NO2 substituiert sind.Davon sind- 2 Stoffe aliphatisch- 4 Stoffe mit einem Imidazolring- 117 auswertbare Nitroaromaten, davonsind 8 Stoffe polyzyklischhaben 26 eine Halogensubstitution am Nitroringhaben 34 überhaupt eine Halogensubstitution.

Der Abbau dieser 117 Nitroaromaten ist verteilt, wie folgt :

Abbau Stoffe Abbau für Multicase Stoffe1. schwer abbaubar 69 schwer 69schwer bis potentiell (nach Adaptation) 6mäßig abbaubar 11

mäßig 17

potentiell abbaubar 15potentiell abbaubar, gut nach Adaptation 5gut abbaubar nach Adaptation 4gut abbaubar 4leicht abbaubar 3

abbaubar 31


05.2000 7/10

a. Spotfire Visualisierung der DatenDie Visualisierung der Daten mit Hilfe von Spotfire hat zu folgenden Erkenntnissen gebracht:- die Anwesenheit von 2 (oder mehr) aromatischen Zyklen ist mit einem Abbau verbunden,der von „1.schwer“ bis „4.potentiell abbaubar“ ist- Polyzyklen sind mit einem Abbau verbunden, der von „1.schwer“ bis „4.potentiellabbaubar“ ist- die Anwesenheit von 2 (oder mehr) NO2-Gruppen am Nitroring ist mit einem Abbauverbunden, der von „1.schwer“ bis „5.potentiell abbaubar, gut nach Adaptation“ ist- Je mehr Halogenatome im Molekül vorhanden sind, desto schwerer ist der Abbau.

ZusammenfassungJe mehr aromatische Zyklen, NO2-Gruppen und Halogenatome im Molekül vorhanden sind,desto schwerer ist der Abbau.

b. Multicase-Analyse für BiophorenUnser Datenset enthält 116 Moleküle, davon sind31 aktiv aktiv = abbaubar (Abbauwert von 40 oder 55)68 inaktiv = schwer abbaubar (Abbauwert von 10)17 marginal = mäßig abbaubar (Abbauwert von 25)Die Analyse kann zwischen 3 möglichen Substrukturen für den ersten Biophor nichtentscheiden: 1. COH-c = siehe SNA1.DAT2. CH =cH –c =cH –cH =c >- siehe SNA2.DAT3. CH =cH –c =cH – siehe SNA3.DATDie drei möglichen Analysen wurden durchgeführt. Folgende Biophoren wurden für diewichtigsten gehalten:w COH-c =w CH3-O –c =cH –cH =w CH =c –cH =cH –c >=w OH- c =cH –cH =c >-cH =w cH =c –cH =cH –cH =c >-w CO –CH –w OH –SO2-c =cH –c =cH –cH =cHw NO2-c =cH –c =cH –c“ –NO2

InterpretationFolgendes fördert den Abbau von Nitroaromaten:w OH- (e- donnierend) und CO- (e- ziehend)Verbindungenw Methoxy-Substitutionen (e- donnierend)w eine kleine Anzahl an Substitutionen am aromatischen Ringw Substitutionen in Para- oder Meta-Position .

c. Multicase-Analyse für BiophobenUnser Datenset enthält 115 Moleküle, davon sind67 aktiv = schwer abbaubar (Abbauwert von 55)31 inaktiv = abbaubar (Abbauwert von 10)17 marginal = mäßig abbaubar (Abbauwert von 25)(Im Vergleich mit dem Datenset für Biophoren gibt es hier einen schwer abbaubaren Stoffweniger. Er wurde aus versehen gelöscht : 2-Chlor-3-(2-Chlor-5-Nitrophenyl)2-Propensäureethylester. Es sollte aber keine Folgen auf die Analyse haben.)


05.2000 8/10

Folgende Biophoren wurden für die wichtigsten gehalten:c =cH –c =c –NH –c =NH2-c =cH –cH =CH= cH –c =c –c =c >=cH –c =cH –c >=

InterpretationFolgendes verschlechtert den Abbau von Nitroaromaten:w eine große Anzahl an Substitutionen am aromatischen Ringw NH- und NH2- Substitutionen (e- donnierend)w elektronziehende Substitutionen.

3. SCHLUßFOLGERUNGNitroaromaten sind oft schwer abbaubar. Die Substituenten haben folgende Wirkung auf denbiologischen Abbau:w Anzahl der Substitutionen am aromatischen Ring ì ⇒ Abbau îw NH- und NH2- Substitutionen vorhanden (e- donnierend) ⇒ Abbau îw elektronziehende Substitutionen vorhanden ⇒ Abbau îw Anzahl der aromatischen Zyklen ì ⇒ Abbau îw Anzahl der Halogenatomeì ⇒ Abbau îw Anzahl der NO2-Gruppen ì ⇒ Abbau îw OH- (e- donnierend) und CO- (e- ziehend)Verbindungen vorhanden ⇒ Abbau ìw Methoxy-Substitutionen (e- donnierend) vorhanden ⇒ Abbau ìw Substitutionen in Para-Position vorhanden ⇒ Abbau ì (außer bei Phenolen)siehe Entscheidungsbaum.


05.2000 9/10

Referenzen

1. A.V. Schackmann, BIOforum 12, 464 (1992).Reference ID: 430

2. J.C. Spain, Annual Review of Microbiology 49, 523 (1995).Reference ID: 459

3. F.K. Higson, Advances in Applied Microbiology 37, 1 (1992).Reference ID: 452

4. X.H. Xing, T. Inoue, Y. Tanji, H. Unno, J. 87, 372 (1999).Reference ID: 462

5. R.J. Spanggord, J.C. Spain, S.F. Nishino, K.E. Mortelmans, Appl. 57, 3200 (1991).Reference ID: 460

6. V. Kadiyala, J.C. Spain, Appl. 64, 2479 (1998).Reference ID: 816

7. C. Vorbeck, H. Lenke, P. Fischer, J.C. Spain, H.J. Knackmuss, Appl. 64, 246 (1998).Reference ID: 461

8. A. Oren, P. Gurevich, Y. Henis, Appl. 57, 3367 (1991).Reference ID: 229

9. E.P. Davis, R. Boopathy, J. Manning, Current Microbiology 34, 192 (1997).Reference ID: 490

10. C.M. Peres, H. Naveau, S.N. Agathos, Appl.Microbiol.Biotechnol. 49, 343 (1998).Reference ID: 456

11. Z.Q. He, J.C. Spain, Arch. 171, 309 (1999).Reference ID: 815

12. F.D. Marvin-Sikkema, J.A. de Bont, Appl.Microbiol.Biotechnol. 42, 499 (1994).Reference ID: 141

13. Z. Filip, Forum Städte-Hygiene 46, 309 (1995).Reference ID: 487

14. A. Haidour, J.L. Ramos, Environ.Sci.Technol. 30, 2365 (1996).Reference ID: 489

15. E. Razoflores, B. Donlon, G. Lettinga, J.A. Field, FEMS Microbiology Reviews 20, 525 (1997).Reference ID: 457

16. P. Degner, M. Müller, M. Nendza, W. Klein, Anonymous, Structure -Activity Relationships forBiodegradation. (, 1993) OECD/GD(93)126, 1 p. Environment Monograph NO.68. Ordner ProjektLitteratur.Reference ID: 62

17. P.H. Howard, et al, Environ. 11, 593 (1992).Reference ID: 4

18. G. Klopman, M.H. Tu, Environ. 16, 1829 (1997).Reference ID: 30


05.2000 10/10

19. P. Degner, M. Nendza, W. Klein, Science of the Total Environment 109-110, 253 (1991).Reference ID: 63

20. P.H. Howard, R.S. Boethling, W. Stiteler, W. Meylan, J. Beauman, Science of the Total Environment109-110, 635 (1991).Reference ID: 64

21. D. Gamberger, D. Horvatic, S. Sekusak, A. Sabljic, Environmental Science & Pollution Research 3, 224(1996).Reference ID: 86

22. A. Esteve-Nunez, J.L. Ramos, Environ.Sci.Technol. 32, 3802 (1998).Reference ID: 814

23. T. Kalafut, et al, Current Microbiology 36, 45 (1998).Reference ID: 454

24. B. Schink, A. Brune, S. Schnell, 1999), p. 220.Reference ID: 484

25. A. Esteve-Nunez, G. Lucchesi, B. Philipp, B. Schink, J.L. Ramos, Journal of Bacteriology 182, 1352(2000).Reference ID: 813

17.12.02 / Mampel monozyklische aromatische Sulfonate 1

ANLAGE 5: Monozyklische aromatische Sulfonate

1. Chemie der Sulfonate

Alle Sulfonate weisen definitionsgemäß die [-SO3-]-Gruppe auf. Dementsprechend wird

zwischen O-Sulfonaten (-O-SO3-, Sulfate), N- (-N-SO3

-,) und C-Sulfonaten (C-SO3-)

unterschieden. Aufgrund ihrer Labilität werden O- und N-Sulfonate meist hydrolytisch

gespalten (11) und sind unter dem Aspekt der Biodegradation unproblematisch.

Thermodynamisch stabiler hingegen sind die C-Sulfonate (32), bei denen das Schwefelatom

direkt mit dem C-Atom verbunden ist.

R S

O

O

OH

Abbildung 1 Struktur der Sulfonatgruppe

Die Sulfonatgruppe ist stark polar und Sulfonate sind starke Säuren. Die pKs-Werte dieser

Gruppe liegen bei Werten < 1 (Bsp.: 4-Toluolsulfonat, pKs = - 1.3) (17)), so daß sie bei

physiologischem pH immer deprotoniert vorliegt. Die starke Polarität erhöht die

Wasserlöslichkeit des entsprechend substituierten Moleküls.

Die Sulfonatgurppe wirkt elektronenziehend; sie oxidiert und inaktiviert somit den

aromatischen Kern.

1.A Vorkommen der Verbindungen

Sulfonierte aromatische Verbindungen kommen sowohl natürlich als auch als Xenobiotika in

der Umwelt vor, wobei die überwiegende Mehrzahl der verschiedenen Verbindungen über

anthropogene Aktivitäten in die Umwelt gelangen (6)

1.A.1: natürlich

Bislang wird in der Natur nur eine sulfonierte aromatische Verbindung mit definierter Struktur

beoabachtet, Aeruginosin B, ein Pigment in einigen Pseudomonaden (Abbildung 2) (4).


N+

N

NH3+SO3-

R

COOH

Abbildung 2: sulfonierte Teilstruktur vpn Aeruginosin B (Fragment)

Darüberhinaus stellen die Huminsäuren einen heterogenen pool an undefinierten

sulfonierten aromatischen Verbindungen dar (45), die globalen Stoffwechselzyklen

unterliegen (42) (37). So ist der größte Teil des Schwefels in Waldböden in Form von

Sulfonaten gebunden (1).

1.A.2: xenobiotisch

Bis auf die oben dargelegten Verbindungen sind alle anderen sulfonierten aromatischen

Verbindungen Xenobiotika. Die polare Sulfonatgruppe wird zur Verbesserung der

Wasserlöslichkeit entsprechender Verbindungen eingesetzt. Sulfonierte Aromaten werden in

großen Mengen in Form von Detergenzien und Textilfarbstoffen produziert, in geringeren

Mengen als Additive für Detergentien bzw. Öle sowie als Pflanzenschutzmittel und

Pharmaka. Die industrielle Produktion liegt bei mehreren Millionen Tonnen jährlich (18).

Einige Sulfonate entstehen als Produkte aus der Biotransformation von nicht sulfonierten

Xenobiotika (14,41). Die Obwohl die Vielfalt an natürlichen aromatischen Sulfonaten sehr

begrenzt ist, ist die Fähigkeit zur Biodegradation von sulfonierten Aromaten weit verbreitet.

Dennoch gelten zumindest einige Sulfonate als schwer abbaubar (30) (46). So können

einige xenobiotische Sulfonoaromaten beispielsweise in Flüssen und Sickerwässern von

Mülldeponien nachgewiesen werden (30) (26).

2. Biologische Nutzung von Sulfonaten

Sulfonierte aromatische Verbindungen können als C- und Energiequelle oder alternativ als

Schwefelquelle von Mirkroorganismen genutzt werden. Eine simultane Nutzung sowohl als

C- und Energiequelle als auch als S-Quelle wird nicht beobachtet. Werden sulfonierte

Verbindungen als S-Quelle genutzt, werden Enzyme, die unter der globalen regulatorischen

Kontrolledes ”Sulfate Starvation Induced Stimulon” (SSIS) stehen exprimiert. Die Biochemie

dieser Enzyme unterscheidet sich grundlegend von denen des dissimilatorischen

Stoffwechsels (24).

Unter anoxischen Bedingungen werden im Gegensatz zu aliphatischen Sulfonaten

sulfonierte Aromaten bislang nur als S-Quelle genutzt (6).


3. Abbau von Sulfonaten

Die Anwesenheit der Sulfonatgruppe erschwert die Biodegradation im Vergleich zu nicht

sulfonierten bzw. carboxylierten Analoga (46). Die Desulfonierung stellt somit einen

entscheidenden Schritt in der Biodegradation dar. Diese schien lange Zeit auf oxische

Standorte beschränkt zu sein (16). Zwischenzeitlich wächst jedoch die Anzahl von

Veröffentlichungen über einen anoxischen Metabolismus dieser Verbindungen (z.B. (10)).

Organismen, die aromatische Sulfonate als C- und Energiequelle vollständig mineralisieren

können, weisen im allgemeinen ein enges Substratspektrum auf. Selten können mehr als

zwei verschiedenen aromatische Sulfonate genutzt werden (43). Ausnahmen bilden

Alcaligenes sp. Stamm O-1 (drei aromatische Sulfonate) (44) und Pseudomonas maltophila

Stamm BSA56, der vier verschiedene monocyclische Arensulfonate, darunter auch eine

heterozyklische Verbindung, sowie Naphthalin-1- und 2-sulfonat mineralisieren kann.

3.A.1: allgemeine Prinzipien

Aufgrund der starken Polarität kann eine sulfonierte Verbindung nicht über die Zellmembran

diffundieren. Der einleitende Schritt im Abbau ist folglich der Transport über die

Zellmembran. Es gibt nur wenige Informationen zu Transportsystemen für sulfonierte

Aromaten Physiologische Messungen zum Transport von 4-Toluolsulfonat (TS) in C.

testosteroni T-2 weisen auf ein sekundäres Transportsystem hin, welches durch TS und 4-

Toluolcarboxylat (TC) induziert wird, jedoch neben TC nur 4-Chlorobenzolsulfonat

transportiert. Die Affinität für TS liegt bei ca. 90 µM. (34). Alcaligenes sp. Stamm O-1 verfügt

über ein spezifisches Transportsystem für 2-Aminiobenzolsulfonat, vermutlich vom Typ der

ABC-Transporter (pers. Mitteilung D. Schleheck). Biochemische Daten zu diesen

Transportsystemen liegen bislang nicht vor.

Aufnahmesysteme für aromatische Sulfonate, die unter SSIS-Bedingungen exprimiert

werden, besitzen vermutlich ein sehr breites Substratspektrum (vgl. P. putida S-313) und

sind vom ABC-Transporter Typ (E.coli und P. aeruginosa) (24).

Die biochemischen Umsetzungen in der Zelle sind im Gegensatz zu den

Transportvorgängen sehr viel besser verstanden. Drei Grundmechanismen werden in bezug

auf den enzymatischen Umsatz unterschieden (6):

1) Aktivierung in einem Thiamin-Pyrophosphat (TPP) abhängigen Schritt des C-Atoms,

welches sich in unmittelbarer Nachbarschaft der C-SO3- -Gruppe befindet (Abbildung 3).

Die Sulfonatgruppe wird als Sulfit freigesetzt (28). Dieser Mechanismus scheint auf

aliphatische Sulfonate beschränkt zu sein und ist sowohl unter oxischen als auch unter

anoxischen Bedingungen vorzufinden.


SO3-

O

HSO3-

H2O

O

OH

Abbildung 3 Hydrolyltische Desulfonierung von Sulfoacetaldehyd durch eine TPP-abhängige Lyase.

2) Destabilisierung der C-SO3 Bindung durch Addition eines weiteren Heteroatoms an das

C-Atom unter Freisetzung der besseren Abgangsgruppe (Sulfit) (Abbildung 4). Die

Freisezung des Sulfits erfolgt spontan, meist unter Rearomatisierung des

Benzolringsystems, oder hydrolytisch.

COOH

OH

OHSO3

-

NADH+H+

O2

SO3-

COO-COOH

OH

OH

HSO3-

Abbildung 4 Desulfonierung durch Oxygenierung von 4-Sulfobenzoat in C. testosteroni PSB-4 (33).Die C-S-Bindung wird durch Addition eines weiteren Heteroatoms an das C-Atom destabilisiert. Dasinstabile cis-Diol rearomatisiert spontan unter Freisetzung von Sulfit.

3) ein noch unverstandener, formell reduktiver Desulfonierungsmechanismus nach

vorausgegangener Dioxygenierung (Abbildung 5). Aufgrund fehlender Informationen ist

dieser Abbauweg bislang hypothetisch. Lediglich 3-Methylcatechol wurde als Intermediat

identifiziert.

NADH+H+

O2

SO3-

CH3

SO3-

CH3

OH

OH

CH3

OH

OH

Abbildung 5 Hypothetische reduktive Desulfonierung durch einen Pseudomonaden. 3-Methylcatecholund Sulfit wurden als erste Reaktionsprodukte identifiziert (15).

3.A.2: Mineralisation

Mineralisation von sulfonierten Aromaten wird bislang nur unter oxischen und nicht

Schwefel-Mangelbedingungen beobachtet. Unter anoxischen Bedingungen werden

sulfonierte Aromten lediglich desulfoniert (s.u.).

3.A.3: Transformation

Bei Schwefelmangel dient die Sulfonatgruppe als S-Quelle. Das desulfonierte

Reaktionsprodukt wird nicht weiter metabolisiert und akkumuliert. Die Substratspektren der

Organismen, die Sulfonate als Schwefelquelle nutzen, sind im allgemeinen sehr breit. So


kann z.B. Pseudomonas putida S-313 mehrere hundert verschiedene Sulfonate

desulfonieren (47) (25). Auch mehrfach substituierte Arensulfonate werden quantitativ von

Misch- und Reinkulturen desulfoniert (40) Als Reaktionsprodukte entstehen die

entsprechenden Phenole (oxische Bedingungen; Monooxygenasereaktion) bzw. Carboxylate

(anoxische Bedingungen; pers. Mitteilung Prof. Cook).

Biotransformationen zu desulfonierten Produkten werden auch von Pilzen katalysiert. Durch

den Einsatz extrazellulärer Enzyme (z.B. Lipoxygenase) fällt die Limitierung in bezug auf

spezifische Transportsysteme weg. Phanerochaete chrysosporium desulfoniert 3,5-dimethyl-

4-hydroxybenzolsulfonat (I) und 3,5-Dimethyl-4-aminobenzolsulfonat (II) zu den

entsprechenden Phenolen, wobei (II) sowohl desulfoniert als auch deaminiert wird. (36).

Desulfonierte Biotransformationsprodukte können unter entsprechenden Bedingungen

(Anwesenheit weiterer Organismen) meist vollständig mineralisiert werden.

3.A.4: Aerober Abbau

Der Abbau monozyklischer Sulfonoaromaten kann in die peripheren und die zentralen

Abbauwege untergliedert werden (7). Die peripheren Abbauwege münden intermediär in

zentralen Ringspaltintermediaten. Diese Intermediate sind Protocatechuat und Catechol

bzw. substituierte Derivate dieser Verbindungen. Gentisat als Intermediat ist relativ selten.

Die Desulfonierungsreaktion wird dabei

a) vor der Ringspaltung

b) während der Ringspaltung

c) nach der Ringspaltung

beobachtet. Die Ringspaltung erfolgt in ortho oder meta Position.

Zu a) Desulfonierung vor der Ringspaltung (Bsp.: Dioxygenierung von 4-Sulfobenzoat durch

Comamonas testosteroni Stamm PSB-4)

COOH

OHOH

OHCCOOH

OH

COOHNADH+H+

O2

HSO3-

SO3-

COO-O2

Abbildung 6: Desulfonierung vor der Ringspaltung. Dioxygenierung von 4-Sulfobenzoat (33)

Zu b) Desulfonierung während der Ringspaltung (Bsp.: Dioxygenierung von 3-Sulfocatechol

durch Alcaligenes sp. Stamm O-1)


SO3-

OH

OHCOO-O

OH

SO3-

H2OO2

H+ + HSO3-3-Sulfocatechol (Z,E)-2-Hydroxy-

muconate

OH-OOC

COO-

Abbildung 7: Desulfonierung während der Ringspaltung von 3-Sulfocatechol (22)

Zu c) Desulfonierung nach der Ringspaltung (Bsp: Dioxygenierung von 4-Sulfocatechol und

nachfolgender Hydrolyse des Sulfolactons durch Agrobacterium radiobacter S2)

OH

OH

SO3- SO3-

COO-COO-

SO3-

COO-

O

O

Ó

COO-

COO-H2O

HSO3-

4-Sulfocatechol

O2

Abbildung 8: Desulfonierung nach der Ringspaltung durch Hydrolyse des Lactons (12) (13)

Wichtige zentrale Ringspaltintermediate im Abbau sulfonierter aromatischer Verbindungen

sind Protocatechuat, Catechol, 3- bzw. 4-Methylchatechol und 3- bzw. 4 Sulfocatechol.

Für den Abbau von 4-Toluolsulfonat werden mindestens drei verschiedene desulfonierte

Ringspaltintermediate beoabchtet (Abbildung 9). Die Desulfonierungsreaktionen im

Abbauweg mit Protocatechuat bzw. 4 Methylcatechol als Intermediate sind identisch. Im

Unterschied zum Abbauweg in C. testosteroni T-2 wird die Methylgruppe im Abbauweg

durch Alcaligenes sp. Stamm O-1 jedoch nicht zur Carboxylgruppe oxidiert. Der dritte

Abbauweg von TS durch einen nicht näher definierten Pseudomanden erzeugt Sulfit und 3-

Methylcatechol als erste messbare Reaktionsprodukte. Lediglich für den TS-Abbauweg in

C. testosteroni T-2 liegen sowohl vollständige biochemische als auch molekularbiologische

Daten sowie erste Informationen über die weite Verbreitung dieses Abbauweges in der

Umwelt vor (23) (21).


Abbildung 9 Drei Abbauwege für den Katabolismus von 4-Toluolsulfonat durch aerobe Bakterien. Derobere Abbauweg wird in Alcaligenes sp. Stamm O-1 vorgefunden, der mittlere in C. testosteroni T-2und der untere in einem Pseudomonaden.

3-Sulfocatechol ist das Ringspaltintermediat im Abbauweg von 2-Aminobenzolsulfonat, eine

Verbindung, die modellhaft für in ortho Position zur Sulfonatgruppe substituierte

Sulfonoaromaten steht. 3-Sulfocatechol wird nachfolgend über den meta-Abbauweg

verstoffwechselt (Abbildung 10) (22).

Abbildung 10: Abbau von 2-Aminobenzolsulfonat durch Alcaligenes sp. Stamm O1

4-Sulfocatechol ist das zentrale Intermediat im Abbauweg von zusätzlcih in ortho- oder meta

Position substituierten Sulfonaten, beispielsweise im Abbau von 4-Aminobenzolsulfonat (19)

oder Benzol-1,3-disulfonat (5). Die Sulfonatgruppe verbleibt nach der Ringspaltung am

Molekül und wird nach Ausbildung einer Lactonstruktur hydrolytisch abgespalten (vgl.

Abbildung 8)


Definiert man die Sulfonatgruppe als zentralen Substituten, so lassen sich für disubstituierte

sulfonierte Aromaten folgende Prinzipien bezüglich des Abbaus ableiten:

a) Methyl-Substituent in para Position: Desulfonierung durch Oxygenierung vor der meta-

Ringspaltung. Die Methylgruppe kann vor der Ringspaltung zur Carboxylgruppe oxidiert

werden.

b) weiterer Substituent in para oder meta Postion: 4-Sulfocatechol als zentrales Intermediat,

Desulfonierung nach der Ringspaltung durch einen hydrolytischen Mechanismus.

c) weiterer Substituent in ortho Position: 3-Sulfocatechol als zentrales Intermediat.

Desulfonierung während der Ringspaltung.

3.A.5: Anaerober Abbau

Unter anoxischen Bedingungen dienen sulfonierte Aromaten bislang lediglich als S-Quelle

für verschiedene fakultative und strikt anaerobe Bakterien (9) (8). Die bislang nur wenig

verstandenen Desulfonierungsreaktionen erzeugen vermutlich mehrfach carboxylierte

Produkte (pers. Mitteilung Prof. Cook), die unter den gegebenen Bedingungen nicht weiter

verstoffwechselt werden. Das Substratspektrum der beteiligten Arensulfonatasen ist breit

(siehe (6)) und vermutlich existieren spezifische Sulfonatasen für aromatische Sulfonate

einerseits, sowie für Alkansulfonate und Taurin andererseits..

4. Enzymatik

4.A.1 Oxygenasen und Arensulfonate

Die einleitenden Schritte im Metabolismus von sulfonierten aromatischen Verbindungen

werden unter oxischen Bedingungen ausnahmslos von Oxygenasen katalysiert. Dabei

bewirken diese Enzyme entweder die Aktivierung der ansonsten relativ stabilen

aromatischen Ringsysteme oder aber direkt die Abspaltung der Sulfonatgruppe. Der

spezifischzen, enzymatischen Mono- oder Dioxygenierung folgt unter Rearomatisierung des

Ringsystems die spontane Freisetzung der Sulfitgruppe und die charakteristischen cis-Diole

entstehen (vgl. Abbildung 4), welche die Substrate für die nachfolgenden

Ringspaltoxygenasen sind.

Eine Desulfonierung im Zuge einer Oxygenasereaktion tritt immer dann auf, wenn die

Koordination des Moleküls im aktiven Zentrum der Oxygenase einen direkten Angriff des

aktivierten Sauerstoffs an ein mit einer Sulfonatgruppe substituiertem C-Atom ermöglicht.

4.A.2 Aktivierende Oxygenasen:

Diese Oxygenasen sind meist als kurze Elektronentransportkette organisiert, bestehend aus

einer Reduktasekomponente (flavinhaltig, FMN oder FAD), die darüber hinaus noch ein

Ferredoxin enthalten kann (Klasse I). Das Ferredoxin kann aber auch auf einem


eigenständigem Protein ausgelagert sein (Klasse II) oder zusätzlich zur Flavo-Ferrredoxin-

Reduktase existieren (Klasse III). Die katalytisch aktive Komponente bildet die terminale

Oxygenase, die neben einem [2Fe-2S]-Zentrum über ein mononukleares Eisenzentrum

(Fe2+) als aktivem Zentrum verfügt (siehe auch Modul Oxygenasen sowie (3) (38). Als

externes Reduktionsmittel wird NADH+H+ und seltener NADPH+H+ verwendet.

4.A.3 Ringspaltendende Oxygenasen

Die ringspaltenden Oxygenasen benötigen kein externes Reduktionsmittel, weisen bis auf

das mononukleare Eisenzentrum keine weitere Abhängigkeit von Co-Faktoren auf und

werden in drei Gruppen eingeteilt (vgl Modul Oxygenasen). Ringspaltende Oxygenasen, die

eine Sulfonatgruppe tolerieren, finden sich im Abbauweg von 2-Aminobenzolsulfonat (3-

Sulfocatechol als Ringspaltsubstrat, vgl. Abbildung 10) von Verbindungen, die über 4-

Sulfocatechol verstoffwechselt werden (z.B. 4-Amionbenzolsulfonat; vgl. Abbildung 8).

4.A.4 Oxygenasen und Desulfonierung

Die Abspaltung der Sulfonatgruppe folgt jeweils dem Prinzip, daß die Anwesenheit von zwei

Heteroatomen an einem C-Atom zur Freisetzung der besseren Abgangsgruppe führt (vgl

3.A.1: allgemeine Prinzipien). Sofern die Sulfonatgruppe nicht bereits im Verlauf der

Ringaktivierung abgespalten wurde, wird sie während der Ringspaltung entfernt, wenn sie

sich in ortho-Position zu einer der beiden Hydroxylgruppen befindet. Das Ringsystem wird

dann in meta-Position gespalten.

Befindet sich die Sulfonantgruppe in meta-Position zu einer der beiden Hydroxylgruppen,

erfolgt die Ringspaltung in ortho-Position und die Sulfonatgruppe verbleibt am Molekül. Die

Desulfonierung erfolgt nachfolgend durch einen hydrolytischen Mechanismus (vgl. Abbildung

8)

Dienen die Arensulfonate als Schwefelquelle, wird die Sulfonatgruppe durch ein neuartiges

Monooxygenasesystem abgespalten, welches vmtl. identisch ist zum Desufonierungssystem

für Alkansulfonate. Die Komponenten dieses Monooxygenasesystems sind auf mindestens

zwei Operonen verteilt. Das System besteht aus der der FMN-Reduktase SsuE, die freies

FMN reduzieriert, welches dann das FMNH2-abhängige Monooxygenasesystem mit

Reduktionsäquivaltenten versorgt. Das Multikomponenten Monooxygenassystem beseht aus

der Oxygenasekomponente SsuD, einer dazugehörigen putativen Reduktasekomponente

AsfA sowie einer Ferredoxinkomponente AsfB. Dieses Enzymsystem ist biochemisch noch

nicht untersucht, es sind aber Sequenzdaten verfügbar (24).

4.A.5 Hydrolasen

Die hydrolytische Abspaltung setzt ebenfalls die charakteristische Konstellation von zwei

Heteroatomen am C-Atom voraus. Darüberhinaus muß die Ringstruktur der Aromanten

bereits aufgehoben sein. Die einzige bislang bekannte hydrolytische Desulfonierung ist die

im Abbauweg von 4-Sulfocatechol (vgl. Abbildung 8)

4.A.6 Reduktive Desulfonierung


Bis auf eine Literaturstelle (NADH+H+-abhängige reduktive Desulfonierung von 4-X-2,6-

Dinitrobenzolsulfonaten) (29) finden sich in der Literatur keine Angaben zum

Reaktionsmechanismus. Diese reduktive Desulfonierung wird von der L-Glutamat-

Dehydrogenase katalysiert, läuft aber auch spontan in Anwesenheit von NADH ab.

Verschiedene Substituenten in para-Position werden toleriert und haben einen Einfluß auf

die Reaktionskinetiken. Als charakteristisches Intermediat wird ein sogenannter Sulfit-

Meisenheimer-komplex angegeben (Abbildung 11).

Die in Abbildung 5 postulierte reduktive Desulfonierung im Verlauf eines mikrobiellen

Sulfonatumsatzes wurde bislang nur einmal beobachtet und ist bis heute nicht

nachgewiesen worden (vgl. (15)).

SO3-

R

NO2O2NSO3

-

R

NO2O2N

R

NO2O2N

+ SO3-+ NADH + NAD+

-

Sulfit-Meisenheimer- Komplex

Abbildung 11: Reduktive Desulfonierung von von 4-X-2,6-Dinitrobenzolsulfonaten durch die L-

Glutamat-Dehydrogenase

4.A.7 In Sequenzdatenbanken verfügbare Informantionen zu Enzymen

Trotz einer Vielzahl von biochemischen Daten liegen nur für wenige Enzyme auch

Sequenzinformationen vor:

Tabelle 1 In Datenbanken verfügbare Informationen zu Proteinen mit suflonierten Aromaten alsSubstrat. Kategorien: 1, desulfonierende Monooxygenasen, SSIS-Kontrolle; 2, aktivierendeMonooxygenase; 3, aktivierende Dioxygenase; 3, desulfonierende Dioxygenase; 4, sonstige

Funktion Organismus Substrat Protein Acc. No. Kategorie

Arylsulfonatase-

system

Escherichia coli Arylsulfonate SsuD

SsuE

AJ237695 1

Monooxygenase C. testosteroni 4-Toluolsulfonat TsaM AAC44804 2

Dioxygenase C. testosteroni 4-Sulfobenzoat PsbA unpublished 3

Dioxygenase Alcaligenes sp.

Stamm O1

2-Aminobenzol-

sulfonat

AbsA AAF14227

AAF14228

2

Dioxygenase Alcaligenes sp.

Stamm O1

3-Sulfocatechol unpublished 3

Dehydrogenase C. testosteroni 4-Sulfobenzyl-

alkohol

TsaC U32622 4


Dehydrogenase C. testosteroni 4-Sulfobenzyl-

aldehyd

TsaD U32622 4

5. Organismen

In Datenbanken verfügbare Informationen zu Rein- und Mischkulturen von Mikroorganismen,

die die jeweiligen monozyklischen Arensulfonate über einen definierten Stoffwechsel

metabolisieren:

Tabelle 2:Mikroorganismen, die monozyklische Arensulfonate mineralisieren

Organismums Verbindung Literatur

Mischkulturen, 5 Organismen 1,3 Benzoldisulfonat (5)

Konsortium:

Hydrogenophaga palleronii (strain S1) und

Agrobacterium radiobacter (strain S2)

4-Aminobenzolsulfonat (13)

Alcaligenes sp. Stamm O-1 Benzolsulfonat /4-Toluolsulfonat/

2-Aminobenzolsulfonat

(44)

Comamonas testosteroni T-2 /

Comamonas testosteroni PSB-4

4-Toluolsulfonat, 4-Sulfobenzoat (43)

Comamonas (Pseudomonas)

testosteroni H-8

4-Toluolsulfonat, Benzolsulfonat (39)

Stamm S1 4-Aminobenzolsulfonat

3-Nitrobenzolsulfonat


(35)

Mischkultur aus industrieller Kläranlage 3-Nitrobenzolsulfonat


(27)

Pseudomonas sp. RW611 2 Carboxybenzolsulfonat (20)

Pseudomonas maltophila Stamm BSA56 Benzolsulfonat, Toluolsulfonat, 3-

Pyridinsulfonat, 2-Sulfobenzoat,

Sulfopropylpyridinium

(31)


6. Sonstiges

Enzyme, die an Desulfonierungsreaktionen an Arensulfonaten beteiligt sind, werden durch

ihre Substrate induziert und sind vielfach plasmidcodiert (2).

7. Stand der Informationen:

Dezember 2000

8. Literatur:

1. Autry, A. R., and J. W. Fitzgerald. 1990. Sulfonate S: A major form of forest soil

organic sulfur. Biology and Fertility of Soils 10:50-56.

2. Balashov, S. V., and A. M. Boronin. 1997. Benzenesulphonic and p-

Toluenesulphonic Acid Degradation Plasmids of Comamonas testosteroni. Russian Journal

of Genetics 33(5):498-503.

3. Batie, C. J., D. P. Ballou, and C. C. Correll. 1992. Phthalate dioxygenase reductase

and related flavin-iron-sulfur containing electron transferases, p. 543-556. In F. Müller (ed.),

Chemistry and biochemistry of flavoenzymes, vol. 3. CRC Press, Boca Raton.

4. Bentley, R. K., and F. G. Holliman. 1970. Pigments of Pseudomonas species. Part

III. The synthesis of dimethylaeruginosin B and aeruginosin B. J. Chem. Soc. (C) 1970:2447-

2457.

5. Contzen, M., R.-M. Wittich, H.-J. Knackmuss, and A. Stolz. 1996. Degradation of

benzene 1,3-disulfonate by a mixed bacterial culture. FEMS Microbiol. Lett. 136:45-50.

6. Cook, A. M., H. Laue, and F. Junker. 1999. Microbial desulfonation. FEMS

Microbiol. Rev. 22:399-419.

7. Dagley, S. 1978. Microbial catabolism, the carbon cycle and environmental pollution.

Naturwissenschaften 65:85-95.

8. Denger, K., and A. M. Cook. 1997. Assimilation of sulfur from alkyl- and

arylsulfonates by Clostridium spp. Arch. Microbiol. 167:177-181.

9. Denger, K., M. A. Kertesz, E. H. Vock, R. Schön, A. Mägli, and A. M. Cook. 1996.

Anaerobic desulfonation of 4-tolylsulfonate and 2-(4-sulfophenyl)butyrate by a Clostridium

sp. Appl. Environ. Microbiol. 62:1526-1530.

10. Denger, K., H. Laue, and A. M. Cook. 1997. Anaerobic taurine oxidation: a novel

reaction by a nitrate-reducing Alcaligenes sp. Microbiology (Reading UK) 143:1919-1924.

11. Dodgson, K. S., G. F. White, and J. W. Fitzgerald. 1982. Sulfatases of microbial

origin. CRC Press, Boca Raton.


12. Feigel, B. J., and H.-J. Knackmuss. 1988. Bacterial catabolism of sulfanilic acid via

catechol-4-sulfonic acid. FEMS Microbiol. Lett. 55:113-118.

13. Feigel, B. J., and H. J. Knackmuss. 1993. Syntrophic interactions during

degradation of 4-aminobenzenesulfonic acid by a two species bacterial culture. Arch.

Microbiol. 159(2):124-130.

14. Field, J. A., and E. M. Thurman. 1996. Glutathione conjugation and contaminant

transformation. Environ. Sci. Technol. 30:1413-1418.

15. Focht, D. D., and F. D. Williams. 1970. The degradation of p-toluenesulphonate by

a Pseudomonas. Can. J. Microbiol. 16:309-316.

16. Fuchs, G., M. E. S. Mohamed, U. Altenschmidt, J. Koch, A. Lack, R. Brackmann,

C. Lochmeyer, and B. Oswald. 1994. Biochemistry of anaerobic biodegradation of aromatic

compounds, p. 513-553. In C. Ratledge (ed.), Biochemistry of microbial degradation. Kluwer,

Dordrecht.

17. Furukowa, N., and H. Fujihara. 1991. Acidity, hydrogen bonding and metal

complexation of sulfonic acids and derivatives, p. 261-281. In S. Patai and Z. Rappoport

(ed.), The chemistry of sulfonic acids, esters and derivatives. John Wiley & Sons, Inc., New

York.

18. Gerhartz, W. (ed.). 1995. Ullmann's encyclopedia of industrial chemistry, 5th ed.

VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim.

19. Hammer, A., A. Stolz, and H.-J. Knackmuss. 1996. Purification and

characterization of a novel type of protocatechuate 3,4-dioxygenase with the ability to

oxidize 4-sulfocatechol. Arch. Microbiol. 166:92-100.

20. Hansen, C., P. Fortnagel, and R.-M. Wittich. 1992. Initial reactions in the

mineralization of 2-sulfobenzoate by Pseudomonas sp. RW611. FEMS Microbiol. Lett.

92:35-40.

21. Junker, F., R. Kiewitz, and A. M. Cook. 1997. Characterization of the p-

toluenesulfonate operon tsaMBCD and tsaR in Comamonas testosteroni T-2. J. Bacteriol.

179(3):919-927.

22. Junker, F., T. Leisinger, and A. M. Cook. 1994. 3-Sulphocatechol 2,3-dioxygenase

and other dioxygenases (EC 1.13.11.2 and EC 1.14.12.-) in the degradative pathways of 2-

aminobenzenesulphonic, benzenesulphonic and 4-toluenesulphonic acids in Alcaligenes sp.

strain O-1. Microbiology (Reading UK) 140:1713-1722.

23. Junker, F., E. Saller, H. R. Schläfli Oppenberg, P. M. H. Kroneck, T. Leisinger,

and A. M. Cook. 1996. Degradative pathways for p-toluenecarboxylate and p-

toluenesulfonate and their multicomponent oxygenases in Comamonas testosteroni strains

PSB-4 and T-2. Microbiology (Reading UK) 142:2419-2427.


24. Kertesz, M. A. 1999. Riding the sulfur cycle - metabolism of sulfonates and sulfate

esters in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 24:135-175.

25. Kertesz, M. A., P. Kölbener, H. Stockinger, S. Beil, and A. M. Cook. 1994.

Desulfonation of linear alkylbenzenesulfonate (LAS) surfactants and related compounds by

bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 60:2296-2303.

26. Kim, I. S., F. I. Sasinos, R. D. Stephens, and M. A. Brown. 1990. Anion-exchange

chromatography particle beam mass spectrometry for the characterization of aromatic

sulfonic acids as the major organic pollutants in leachates from Stringfellow, California.

Environ. Sci. Technol. 24:1832-1836.

27. Kölbener, P., U. Baumann, A. M. Cook, and T. Leisinger. 1994. 3-

Nitrobenzensulfonic acid and 3-aminobenzensulfonic acid in a laboratory trickling filter:

biodegradability with different activated sludges. Water Res. 28:1855-1860.

28. Kondo, H., and M. Ishimoto. 1975. Purification and properties of sulfoacetaldehyde

sulfo-lyase, a thiamine pyrophosphate-dependent enzyme forming sulfite and acetate.

Journal of Biochemistry. 78:311-325.

29. Kurz, L. C., and C. Frieden. 1977. Comparison of the structures of enzymatic and

nonenzymatic transition states. Reductive desulfonation of 4-X-2,6-dinitrobenzenesulfonates

by reduced nicotinamide adenine dinucleotide. Biochemistry 16(24):5207-5216.

30. Lange, F. T., M. Wenz, and H.-J. Brauch. 1995. Trace-level determination of

aromatic sulfonates in water by on-line ion-pair extraction/ion-pair chromatography and their

behaviour in the aquatic environment. J. High Resol. Chromatogr. 18:243-252.

31. Lee, N. A., and D. P. Clark. 1993. A natural isolate of Pseudomonas maltophila

which degrades aromatic sulfonic acids. FEMS Microbiol. Lett. 107:151-156.

32. Liebman, J. F. 1991. Thermochemistry of sulphonic acids and their derivatives, p.

283-321. In S. Patai and Z. Rappoport (ed.), The chemistry of sulphonic acids, esters and

their derivatives. Wiley, Chichester.

33. Locher, H. H., T. Leisinger, and A. M. Cook. 1991. 4-Sulphobenzoate 3,4-

dioxygenase: purification and properties of a desulphonative two-component enzyme

system from Comamonas testosteroni T-2. Biochem. J. 274:833-842.

34. Locher, H. H., B. Poolman, A. M. Cook, and W. N. Konings. 1993. Uptake of 4-

toluene sulfonate by Comamonas testosteroni T-2. J. Bacteriol. 175:1075-1080.

35. Locher, H. H., T. Thurnheer, T. Leisinger, and A. M. Cook. 1989. 3-

Nitrobenzenesulfonate, 3-aminobenzenesulfonate and 4-aminobenzenesulfonate as sole

carbon sources for bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 55:492-494.

36. Muralikrishna, C., and V. Renganathan. 1993. Peroxidase-catalyzed desulfonation

of 3,5-dimethyl-4-hydroxy and 3,5-dimethyl-4-aminobenzenesulfonic acids. Biochem.

Biophys. Res. Commun. 197:798-804.


37. Novak, M., S. H. Bottrell, D. Fottova, F. Buzek, H. Groscheova, and K. Zak. 1996.

Sulfur isotope signals in forest soils of central Europe along an air pollution gradient.

Environ. Sci. Technol. 30:3473-3476.

38. Powlowski, P., and V. Shingler. 1994. Genetics and biochemistry of phenol

degradation by Pseudomonas sp. CF600. Biodegradation 5:219-236.

39. Ripin, M. J., K. F. Nook, and T. M. Cook. 1971. Bacterial metabolism of aryl

sulphonates. 1. Benzene sulphonate as a growth substrate for Pseudomonas testosteroni H-

8. Appl. Environ. Microbiol. 21:495-499.

40. Ruff, J., T. Hitzler, U. Rein, A. Ritter, and A. M. Cook. 1999. Bioavailability of

water-polluting sulfonoaromatic compounds. Appl. Microbiol. Biotechnol. 52:446-450.

41. Scribner, E. A., E. M. Thurman, and L. R. Zimmerman. 2000. Analysis of selected

herbicide metabolites in surface and ground water of the United States. Sci Total Environ

248:157-167.

42. Strickland, T. C., J. W. Fitzgerald, and W. T. Swank. 1986. In situ measurements

of sulfate incorporation into forest floor and soil organic matter. Can J Forest Res 16:549-

553.

43. Thurnheer, T., T. Köhler, A. M. Cook, and T. Leisinger. 1986. Orthanilic acid and

analogues as carbon sources for bacteria: growth physiology and enzymatic desulfonation.

J. Gen. Microbiol. 132:1215-1220.

44. Thurnheer, T., D. Zürrer, O. Höglinger, T. Leisinger, and A. M. Cook. 1990. Initial

steps in the degradation of benzene sulfonic acid, 4-toluene sulfonic acid and orthanilic acid

in Alcaligenes sp. strain O-1. Biodegradation 1:54-63.

45. van Loon, W. M. G. M., J. J. Boon, and B. de Groot. 1993. Quantitative analysis of

sulfonic acid groups in macromolecular lignosulfonic acids and aquatic humic substances by

temperature-resolved pyrolysis-mass spectrometry. Environ. Sci. Technol. 27:2387-2396.

46. Wellens, H. 1990. Zur biologischen Abbaubarkeit mono- und disubstituerter

Benzolderivate. Zeitschrift für Wasser und Abwasser Forschung 23:85-98.

47. Zürrer, D., A. M. Cook, and T. Leisinger. 1987. Microbial desulfonation of

substituted naphthalenesulfonic acids and benzenesulfonic acids. Appl. Environ. Microbiol.

53:1459-1463.

17.12.02 / Mampel Naphthalinsulfonate 1

ANLAGE 6: Naphthalinsulfonate

1. Chemie der Naphthalinsulfonate

Im Gegensatz zu Naphthalin (Abbildung 1) sind Naphthlainsulfonate in Wasser sehr gut

löslich. Sie zeigen nur eine geringe Tendenz, sich an organisches Material zu binden (log

Kow< 2,2; (11)). Die Sulfonatgruppe erhöht die Bioverfügbarkeit im Vergleich zum nicht

substituierten Naphthalin.

R

2

34

6

7

8

5

Abbildung 1: Numerierung der C-Atome eines Naphthalinmoleküls

1.A Vorkommen der Naphthalinsulfonate

1.A.1: natürlich

Natürlich vorkommende Naphthalinsulfonate sind nicht bekannt.

1.A.2: xenobiotisch

Naphthalinsulfonate finden breite Anwendung in der Industrie u.a. in Form von Farbstoffen,

optischen Aufhellern und Detergenzien. Naphthalinsulfonate bzw. Verbindungen, in denen

Naphthlinsulfonat als Substruktur vorkommt, werden vor allem in der Papier-, Textil- und

Metallindustrie eingesetzt (3) . Amino- und Hydroxynaphthalinsulfonate sind wichtige

Ausgangsverbindungen für die Farbstoffsynthese (24). Mono- und disulfonierte

Naphthalinsulfonate mit einer Hydroxylgruppe in ortho Position zu einer Aminogruppe als

weitere Substituenten sind häufig Reaktionsprodukte im Zuge der anaeroben Reduktion von

Azofarbstoffen durch Mikroorganismen (37; 29).

Die Ökotoxizität von Naphthalinsulfonaten wird als gering eingeschätzt (11).

2. Biologische Nutzung von Naphthalinsulfonaten

Naphtahlinsulfonate können unter oxischen Bedingungen als C-und Energiequelle genutzt

werden. In Abhängigkeit des vorliegenden Substitutionsmusters und der Mikroorganismen

können einer (partielle Mineralisierung) oder beide Ringe des Naphthalinmoleküls

mineralisiert werden. Alternativ zur Verwendung als C- und Energiequelle dient die

Sulfonatgruppe als S-Quelle unter Schwefelmangelbdingungen (5) (30).


Unter anoxischen Bedingungen werden Naphthalinsulfonate bislang nur als Schwefelquelle

genutzt (vgl. (7) (6))

3. Abbau von Naphthalinsulfonaten


Wie bei allen sulfonierten Verbindungen ist der erste Schritt im Abbau von

Naphthalinsulfonaten ihr Transport über die Membran. Informationen zu Naphthlainsulfonat-

spezifischen Transportern liegen nicht vor. Das breite Substratspektrum von Sphingomonas

sp. Stamm BN6 (s.u.) deutet auf ein Transportsystem mit geringer Substratspezifität

zumindest in diesem Stamm hin.

Soweit untersucht, ist der Naphthalinsulfonatmetabolismus induzierbar. Die bei diesem

Umsatz intermediär entstehenden Salicylate spielen eine zentrale Rolle als Induktoren,

deren Induktionspotential vom Substitutionsmuster abhängt (24). Die Eigenschaft der

Salicylate als Induktoren zu wirken ist offenbar ausgeprägter als die der entsprechenden

Naphthalinsulfonate. In Pseudomonas sp. TA-2 ist beispielsweise der Salicylat- und

Gentisatmetabolismus induzierbar, die Aktivität des Umsatzes von Naphthalinsulfonat zu den

entsprechenden Salicylaten ist hingegen konstitutiv (25). Andererseits zeigen mit 5-

Sulfosalicylat gewachsene Zellen von Moraxella sp. keine Aktivität gegenüber Naphthalin-

2,6-disulfonat, welches über 5-Sulfosalicylat abgebaut wird (39). Salicylate induzieren also

nicht immer den gesamten Abbauweg.

Neben der Substratspezifität der Aufnahmesysteme und der Regulatoren ist für den

Metabolismus der Naphthalinsulfonate auch die Substratspezifität der den Abbau

einleitenden Oxygenasen wichtig. Obwohl bislang keine Naphthalinsulfonat-hydroxylierende

Oxygenase charakterisiert wurde und die bisher beschriebenen Naphthalindioxygenasen (als

analoge Enzyme) ein breites Substratspektrum besitzen (8) (10) (35), gibt es indirekte

Hinweise auf unterschiedliche Substratspektren der Naphthalinsulfonatdioxygenasen

(NSDO). So werden 2-Naphthylamin-1-sulfonat und 2-Naphthalinsulfonat von verschiedenen

Enzymen in Pseudomonas sp. TA-2 metabolisiert (25).

Zusammenfassend werden folgende Kriterien für die erfolgreiche Biodegradation von

substituierten Naphthalinsulfonaten postuliert (24):

1) ein breites Substratspektrum der beteilgten Transportsysteme und der

Naphthalin(sulfonat)-Dioxygenasen

2) Vermeidung der Autoxidation von in 4-Position substituierten 1,2-Dihydroxynaphthalinen

3) Induktion der Enzyme des Abbauweges durch die Substrate oder daraus entstehende

Intermediate

4) Toleranz gegenüber toxischen Intermediaten


3.A.2: Partielle Mineralisation und vollständige Mineralisation

Ein anaerober Metabolismus von Naphthalinsulfonaten wird lediglich unter

Schwefelmangelbedingungen beobachtet. Die Sulfonatgruppe wird abgespalten und dient

als Schwefelquelle. Das Naphthalinsulfonat wird im Zuge dieser Transformation vermutlich

zum entsprechenden Carboxylat umgesetzt (pers. Mitteilung Prof. Cook) und

ausgeschieden.

Partielle und vollständige Mineralisation findet nur unter oxischen Bedingungen statt und

werden in der Literatur nur für Naphthalin-1- und Naphthalin-2-sulfonate bzw. höher

substituierte Derivate dieser Leitstrukturen beschrieben. Der aerobe Metabolismus verläuft

analog zum etablierten Naphthalinabbau (siehe auch allgemeines Modul zum

Aromatenabbau) mit Salicylalt als charakteristischem Intermediat. Analog zum

Naphthalinmetabolismus kann der weitere Metabolismus von Salicylat über Catechol mit

nachfolgender meta- oder ortho-Spaltung erfolgen oder aber über den Gentisatweg

(Abbildung 2). Tatsächlich werden in den meisten untersuchten Stoffwechselwegen

Naphthalinsulfonate über Gentisat in zentrale Stoffwechselwege eingespeist.

Handelt es sich um nicht substituierte Naphthalin-1 oder Naphthalin-2-sulfonate, so wird die

Sulfonatgruppe infolge eines Angriffs durch eine Naphthalinsulfonat-1,2-dioxygensase

abgespalten. Das Produkt - 1,2-Dihydroxynaphthalin – ist identisch zum ersten Intermediat

des klassichen Naphthalinabbauweges. Der Abbau substituierter Naphthalinsulfonate

erfordert hingegen weitere spzefische Enzyme, die die zusätzlichen Substituenten entfernen

und Gentisat bzw. Gentisatiderivate als zentrale Ringspaltsubstrate erzeugen. Befinden sich

die weiteren Substituenten in Position 5-8 (vgl. Abbildung 1), werden die entsprechenden

Salicylate als Intermediate gebildet, die nachfolgend ggf. über Gentisat in zentrale

Stoffwechselwege eingeschleust werden können oder vom Organismus freigesezt werden.

Die freigesetzten Salicylate können ggf. von weitere Organismen vollständig abgebaut

werden.


SO3-

R

SO3-

OH

HOH

R

OH

OH

R

O

OH

COOH

R

OH

O

COOHR

OH

CHO

R

O

COOH

OH

COOH

R

OH

OH

OH

COOHOH

O2, 2[H]

HSO3-

O2, 2[H]

H2O

Tricarbon-säurecyclus

Gentisat-pathway

meta oderortho Ringspaltung

O2, 2[H]

O2, 2[H]R-H

H-COOH

R

H

OH

HOH

R

O2, 2[H]

2[H]

1

2

3

45

6

7

8

OH

O

O or NH

RR(4) = OH, NH

R(5) = NH2

N

OH

COOH

A B

C

D

E

F

G

H

1

2

3

4

5

6

7

8 9

11

12

13

14

10

+

Abbildung 2: Aerobe Abbauwege von Naphthalin bzw. Naphthalinsulfonat. 1, Nphthalinsulfonat;2, 1,2-Dihydroxy-1,2-dihydronaphthalin-2-sulfonat; 3, Naphthalin; 4, 1,2-Dihydroxy-1,2-dihydronaphthalin; 5, 1,2-Dihydroxynaphthalin; 6, 2-Hydroxychromene-2-carboxylat; 7, 2-Hydroxybenzalpyruvate; 8, Salicylaldehyd; 9, Pyruvat; 10, Salicylat; 11, Gentisat; 12, Catechol; 13, 2-Hydroxy-1,4-naphthochinon; 14, 5-Hydroxyquinolin-2-carboxylat. A, Naphthalinsulfonat-1,2-Dioxygenase; B, Naphthalindioxygenase; C, 1,2-Dihydroxynaphthalindioxygenase; D, 2-Hydroxychromene-2-carboxylat Isomerase; E, 2-Hydroxybenzalpyruvat Aldolase; F, SalicylaldeyhdDehydrogenase; G, z.B. 5-Sulfosalicylat Hydroxylase; H, Salicylat Hydroxylase


Analog zum Abbau von Naphthalin geht Pyruvat als weiteres zentrales Intermediat aus dem

Abbau von Naphthalinsulfonat(derivaten) hervor. Die Freisetzung von Pyruvat und dessen

nachfolgende energieliefernde Metabolisierung ermöglicht die partielle Mineralisation von

Naphthalinsulfonaten bzw. Naphthlinderivaten durch Organismen, denen weitere Enzyme

zum Abbau von Salicylat(derivaten) fehlen (vgl. Sphingomonas xenophaga BN6). Wird

aufgrund einer entsprechenden Substitution der produktive Metabolismus des Pyruvats

verhindert und kann das Salicylat nicht weiter umgesetzt werden, ist die Verbindung für den

Organismus als alleinige C- und Energiequelle sogar toxisch (vgl. Metabolismus von 5-

Aminionaphthalin-2-sulfonat; s.u.).

Sofern untersucht, werden alle Naphthalinsulfonate über den oben beschriebenen

Abbauweg für Naphthalinsulfonate mit Salicylat und Gentisat als Intermediate

verstoffwechselt. Für Pseudomonas maltophila werden jedoch nicht näher charakterisierte

Mutanten beschrieben, die weder Salicylat noch Gentisat umsetzen können, nach wie vor

aber mit Naphthalin-1- bzw. –2-sulfonat wachsen. Inwiefern ein alternativer Abbauweg zum

bekannten Weg für Naphthalinsulfonate exisitiert, kann aufgrund der unzureichenden

Charakterisierung der Mutanten nicht beurteilt werden (21).

Partielle Mineralisation zu Salicylaten durch Stamm BN6:

Sphingomonas xenophaga (fromals:Pseudomonas sp) BN6 setzt ein sehr breites Spektrum

mono- und disubstituierter Naphthalinsulfonate zu entsprechenden Salicylaten um (Tabelle

1, Abbildung 3). Mit diesem Stamm wurden sehr umfangreiche Untersuchungen zum

Metabolismus von Naphthalinsulfonaten durchgeführt (13, 16, 19, 24, 34). Stamm BN6

mineralisiert Naphthalin-1-sulfonat und Naphthalin-2-sulfonat. Substituierte Naphthalin-1-

sulfonate sowie substituierte Naphthalindisulfonate werden nicht als Substrate akzeptiert.

Naphthalin-2,6-disulfonat ist die einzige von Stamm BN6 akzeptierte disulfonierte

Verbindung und ein schlechtes Substrat für Stamm BN6. Eine Reihe von substituierten

Naphthalin-2-sulfonaten wird nicht vollständig von Stamm BN6 mineralisiert, aber zu den

entsprechenden Salicylaten umgesetzt, da die entsprechenden Salicylat-oxidierenden

Enzyme fehlen. Lediglich 4- bzw. 5-Aminonaphthalin-2-sulfonat und 4-Hydroxynaphthalin-2-

sulfonat werden nicht zu den entsprechenden Salicylaten metabolisiert. Bis auf 4- und 5-

Hydroxysalicylat sind alle getesteten Salicylate gute Induktoren des Abbaus; nicht

substituiertes Salicylat inhibiert hingegen den Abbau von Naphthalinsulfonaten. Einige der

Salicylate können in nachfolgenden Schritten durch andere Mikroorganismen innerhalb einer

Mischkultur vollständig mineralisiert werden. Entscheidend für die Reaktivität gegenüber den

verschiedenen Naphthalinsulfonaten ist ihre Umsetzung zu den entsprechenden Salicylaten,

die als Induktoren der Enzyme des Abbauweges dienen. Der Metabolismus von 5-

Aminonaphthalin-2-Sulfonat erzeugt beispielsweise ein in Stamm BN6 nicht weiter zum


Salicylat verstoffwechselbares Reaktionsprodukt (Dead End Produkt; das entsprechende

Naphthochinon) ohne Induktionspotential (23) (s.u.)

Tabelle 1 Transformation (Oxidation) verschiedener Naphtahlinsulfonate durch S. xenophga BN6 unddie entsprechenden Transformationsprodukte auf Stufe der Salicylate (24)

Naphthalinsulfonat-Derivat Transformationsprodukte

1- bzw. 2-Naphthalinsulfonat entsprechende Salicylate / Gentisat

1-Hydroxynaphthalin-2-sulfonat Salicylat

Naphthalin-2,6-disulfonat entsprechende Salicylate

(Sulfosalicylat)

Naphthalin-2-Sulfonat,

monosubstituiert in 4,5,6,7 oder 8-

Position

entsprechende Salicylate

Naphthalin-2-Sulfonat, disubstituiert in

4,5,6,7 oder 8-Position

entsprechende Salicylate

4-Amino bzw. 4-Hydroxy-naphthalin-2-

Sulfonat

entsprechende Naphthochinone

5-Aminonaphthalin-2-Sulfonat Dead end

5-Hydroxyquinolin-2-carboxylat

4-Aminonaphthalin-2-Sulfonat Dead End (Autoxidation)

4-Amino-1,2-Naphthochinon

4-Hydroxynaphthalin-2-Sulfonat Dead End (Autoxidation)

2-Hydroxy-1,4-Naphthochinon

substituierte Naphthalin-1-Sulfonate Kein Substrat, kein Umsatz

in 3-Position substituierte

Naphthalinsulfonate

Kein Substrat, kein Umsatz

substituierte Naphthalindisulfonate

(Sulfonatgruppen nicht in 2-Position)

Kein Substrat, kein Umsatz


OHCOOH

SO3-

NH2

SO3-

OH

NH2

SO3-

SO3-

NO2 NH2SO3

-

SO3-

OH

SO3-

OH

NH2

SO3-

SO3-

SO3-

COOH

SO3-

OHSO3

-

SO3-

NH2

SO3-

OHOH

SO3-

OHNH2

SO3-

O-CH3

SO3-N

H

CH3

SO3-

OH

SO3-

SO3-

SO3-

NH2

SO3-

NH2

NH2OH

SO3-SO3

-

OH

SO3-

SO3-

NH2

SO3-

SO3-

OH

SO3-

SO3-

OH

SO3-

SO3-

NH2

SO3-

SO3-

OH

SO3-

SO3-

SO3- OH

SO3-

OH

COOH

OHOH

COOH

N

NH2

SO3-

100 %

35

24

21

30

8

15

18

18

15

6

< 5 %

dead end

dead end

dead end

> 5 %

Abbildung 3:Transformation verschiedener Naphthalinsulfonate zu den entsprechendenSalicylaten durch Sphingomonas xenophaga BN6. Die mit 2-Naphthalinsulfonat gemesseneUmsatzrate wurde 100 % gesetzt. Zahlenangaben neben den Molekülstrukturen geben dengemessenen Umsatz realtiv zu Naphthalin-2-Sulfonat an. Die rot gezeicheten Verbindungen liefertenUmsatzraten von weniger als 5 Prozent und sind keine Substrate für Stamm BN6. Dead end: sogekennzeichnete Verbindungen wurden nicht in die entsprechenden Salicylate umgesetzt (24).

3.A.3: Transformation

Autoxidation:

Befindet sich eine Hydroxylgruppe in ortho-Stellung zu einer Aminogruppe – eine

Konstellation, die nach Reduktion von Azofarbstoffen häufig anzutreffen ist – unterliegt diese


kritische Struktur oft einer Autoxidation unter oxischen Bedingungen zur den

entsprechenden chinoiden Strukturen. (Abbildung 4) Die Kinetik der Autoxidation sowie die

Stabilität der primären Autoxidationsprodukte ist vom Substitutionsmuster abhängig. Dabei

setzt die Sulfonatgruppe in 3-Position die Reaktivität der Chinone herab, indem sie den

Zugang zur kritischen 4-Position sterisch blockiert. Weitere Amino- oder

Hydroxylsubstituenten können die Chinonstrukturen über Wasserstoffbrücken zusätzlich

stabilisieren und verhindern so die Neigung der nicht in 3-Position substituierten

Naphthochinone zur Ausbildung von Dimeren. Die monomeren Naphthochinone sind

mikrobiell zumeist weiter umsetzbar (18).

OH

NH2

SO3-

O

OH

OH

SO3-

N

SO3-

O

O

SO3-

1

2

3

+

OH

NH2

SO3- SO3

-

O

O

SO3- SO3

- SO3- SO3

-

COOHCOOH

A

B

Abbildung 4 Autoxidation von ortho-Hydroxyamino-Naphthalinsulfonaten. Befindet sich in 3-Position eine Sufonatgruppe (B), wird die reaktive 4-Position sterisch von dieser blockiert und diespontane Dimerisierung (A) mit der reduzierten Ausgangsverbindung unterbunden (18).

Ähnlilch wie die ortho-Hydroxyaminonaphthaline neigen Trihydroxynaphthaline, die als erste

Reaktionsprodukte nach der initialen Oxygenierung beim Abbau substituierter Naphthalin-1-

bzw. –2-suflonate entstehen, unter oxischen Bedingungen zur Autoxidation zu den

entsprechenden Naphtochinonen. Dabei erfolgt die Autoxidation umso schneller, je näher

sich die dritte Hydroxylgruppe zu den beiden vicinalen Hydroxylgruppen des 1,2,x-

Trihydroxynaphthalins (THN) befindet. Besonders schnell ist die Autoxidation bei 1,2,4-THN

im Vergleich zu 1,2,5- oder 1,2,6- oder 1,2,7-THN (24) (20). Die rasche Autoxidation von

1,2,4-THN verhindert beispielsweise den vollständigen Umsatz von 4-Hydroxynaphthalin-2-

sulfonat durch S. xenophaga BN6. Das Produkt der Autoxidation, 2-Hydroxy-1,4-


naphthochinon, ist ein natürlich vorkommendes Naphthalinderivat (Pigment der Henna-

Pflanze), dessen bakterieller Abbau bereits beschrieben wurde (38), so daß auch eine

Substituentenkonstellation mit einer Hydroxylgruppe in 4- oder 5-Position (vgl. 5-

Hydroxynaphthochinon (28) den vollständigen Abbau nicht ausschließt.

Desulfonierung:

Desulfonierung durch Bakterien:

Werden Naphthalinsulfonate als S-Quelle genutzt, verläuft ihr Metabolismus unter oxischen

Bedingungen über die entsprechenden Naphthole (41), so z.B. die Desulfonierung von 2,7-

Naphthalindisulfonat (30), unter anoxischen Bedingungen vermutlich über Carboxylate (Prof.

Cook, pers. Mitteilung)

Desulfonierung von Naphthlain-1-sulfonat durch die grüne Alge Scenedesmus obliquus.

Neben Bakterien können auch höhere Orgainsmen wie Pilze und Algen Naphthalinsulfonate

umsetzen. Unter Schwefelmangelbedingungen desulfoniert die grüne Alge Scenedesmus

obliquus Naphthlin-1-sulfonat zu einem Produktgemisch, bei dem nur ein Teil des

gebundenen Schwefels als Sulfat freigesetzt wird (17). Das desulfonierende Enzymsystem

wird konstitutiv exprimiert und wird auch nicht durch die Anwesenheit von Sulfat (bis zu 15

mg/l) inhibiert, wobei die Nutzung der organischen Schwefelquelle erst nach Verbrauch des

im Medium gelösten Sulfats einsetzt.

S. obliquus desulfoniert jedoch nur 10-20 % des Naphthalin-1-sulfonats. Das vorwiegende

Reaktionsprodukt aus der Transformation ist 1-Hydroxynaphthalin-2-sulfonat, welches aus

einem NIH-shift (12) nach vorausgegangener Monooxygenierung hervorgeht. Dieser NIH-

shift positioniert die Sulfonatgruppe in ortho-Position zur Hydroxylgruppe. 1-

Hydroxynaphthalin-2-sulfonat wird beispielsweise durch Sphingomonas xenophaga Stamm

BN6 oxidiert, so daß ein Abbau des Hauptproduktes dieser Transformation prinzipiell

möglich ist. Ein NIH-shift wird auch beim Abbau von Naphthalin durch Bakterien, Pilze und

Algen beobachtet (17). Desulfonierte Reaktionsprodukte sind 1-Naphthol, 4-Hydroxy-1-

tetralon und 1-Naphthylglucoside (Abbildung 5). Die Konjugation mit Glucose dient zur

Detoxifikation von 1-Naphthol.


SO3- SO3

-

OOH

OH

SO3-

OGlucose

NIH-shiftO

OH1-Hydroxynaphthalin- sulfonat

1-Naphthyl- glucosid

4-Hydroxy-1-tetralon

Abbildung 5 Transformation von Naphthalin-1-sulfonat durch Scenedesmus obliquus (17)

Dead-end Metabolite:

5-Aminonaphthalin-2-sulfonat (5AN2S) wird durch Stamm BN6 zu 5-Hydroxyquinolin-2-

carboxylat umgesetzt, welches nicht weiter verstoffwechselt werden kann. Da im

Gegengsatz zu 5AN2S die analoge Verbindung 5-Hydroxynaphthalin-2-sulfonat zu den

entsprechenden Salicylaten umgesetzt wird, ist die nicht beobachtete Abbaubarkeit von

5AN2S in der Aminogruppe in der 5-Position begründet. Tatsächlich verhindert die spontan

ablaufende Kondensationsreaktion des sehr reaktiven 6-Amino-2-hydroxybenzalpyruvats zu

5-Hydroxyquinolin-2-carboxylat (5H2QC) (Abbildung 6) seine Spaltung in Pyruvat und 6-

Aminosalicylaldehyd. Die Rekalzitranz von 5AN2S beruht dabei auf zwei Effekten: einerseits

zehrt der Umsatz von 5AN2S die NADH-Reserven des Organismus auf, da kein Pyruvat aus

dem Abbau von 5AN2S erzeugt und somit auch nicht der Vebrauch an

Reduktionsäquivaltenten durch die Aktivität der Naphthlinsulfonatdioxygenase kompensiert

werden kann. Andereseits wirken höhere Konzentrationen an 5H2QC toxisch auf den

Organismus. Die intramolekulare Kondensationsreaktion zu 5H2QC, die aufgrund der

Aminogruppe in 5-Position möglich wird, macht den Metabolismus sowohl unproduktiv (da

kein Pyruvat abgespalten wird und das Produkt in Wasser kaum löslich ist) als auch

kontraproduktiv (aufgrund der Toxizität in höheren Konzentrationen für Stamm BN6) (23).


OH

O

COOH

NH2 N

OH

COOH

H2O

Abbildung 6 Metabolismus von 5-Aminonaphthalin-2-sulfonat durch Sphingomonasxenophaga BN6 zum Dead End-Metaboliten 5-Hydroxyquinolin-2-carboxylat (vgl. Abbildung2)

Eine Transformation zu nicht weiter verstoffwechselbaren Dead-End-Metaboliten kann auch

innerhalb eines Konsortiums beobachtet werden, welches Naphthalin-2-sulfonat abbaut. Drei

der vier Stämme entwickeln während des Umsatzes einen braunen Einschlußkörper in ihren

Zellen, der schließlich das Wachstum hemmt. Dabei handelt es sich vermutlich um ein

Naphthochinon oder Polymerisationprodukt. Die Anwesenheit von Pseudomonas aeruginosa

verhindert die Bildung dieses Einschlußkörpers dadurch, daß 1,2-Dihydroxynaphthalin in

produktive Stoffwechselwege gespeist wird (Slaicylat/Gentisat-Abbauweg). P. aeruginiosa

ermöglicht dem Konsortium somit die vollständige Mineralisation von Naphthalin-2-sulfonat

(36).

3.A.4: Abbaubarkeit von Naphthalinsulfonaten: kritische Molekülstrukturen

Aus den in der Literatur verfügbaren Daten lassen sich folgende für den Abbau von

Naphthalinsulfonaten kritische Strukturen ableiten:

• Anzahl der Sulfonatgruppen

= 1 => abbaubar

= 2 => abbaubar, aber Biodegradationspotential schlechter als bei nur

einer –SO3--Gruppe

= 3 oder > 3 => nicht abbaubar

• Position der Sulfonatgruppe

- mono-sulfoniert => Naphthalin-2-sulfonate sind besser abbaubar als Naphthalin-1-

sulfonate

- di-sulfoniert => zweite Sufonatgruppe muß sich in Postion 6 befinden; in allen

anderen Postionen: kein Abbau beschrieben

• andere Substituenten zusätzlich zur Suflonatgruppe

- Naphthalin-1-sulfonat => lediglich in Pos. 2: -OH oder NH2-Gruppe; sonst kein Abbau

- Naphthalin-2-sulfonat => Abbau möglich

- Substituent in Postion 3=> kein Abbau, da Pyruvat-Bildung verhindert wird


- Substituenten am 1. Ring (Pos. 1-4) schränken Biodegradationspotential ein,

Substituenten am 2. Ring (Pos. 5-8) verhalten sind weniger kritisch

- Amino- und Hydroxylgruppe ortho-ständig zueinander => spontane Autoxidation

und Polymerisation möglich; schränkt Biodegradationspotential ein

• Hydroxylsubstituenten

Naphthalin-2-sulfonat:

Position 1 => Abbau möglich

Postiont 4-7 => Abbaubarkeit nimmt zu, je weiter die Hydroxylgruppe von den

vicinalen Diolen (Pos1 + 2) entfernt ist

• Aminosubstituenten

in Position 4 => schränken Biodegradationspotential ein

in Postion 5 => kein Abbau, ”Dead end Produkt”

Daten zu untersuchten Naphthalinsulfonaten beschränken sich in der Literatur überwiegend

auf Hydroxy-und Aminoderivate. Aussagen zu Verbindungen mit davon abweichenden

Substituionsmustern sind somit mit Literaturdaten nicht zu belegen. Da die den Abbau

einleitenden Naphthalinsulfonat-Dioxygenasen ein breites Substratspektrum besitzen, beruht

die Einschränkung des Biodegradationspotentials oft nicht auf dem Verhindern der

einleitenden metabolischen Schritte (Ringhydroxylierung) durch die Molekülstruktur, sondern

auf spontane Folgereaktionen, die nach der Aktivierung bzw. im Zuge der weiteren

Metabolisierung möglich werden.

4. Enzymatik

Naphthalinsulfonat-Dioxygenasen

Der Abbau von Naphthalinsulfonaten wurde auf biochemischer Ebene bislang nur mit

Naphthalin-1- bzw. Naphthalin-2-sulfonaten untersucht. Da die entsprechende

Naphthalinsulfonatdioxygenase bislang nicht gereinigt werden konnte, existieren auch keine

Untersuchungen zum desulfonierenden Enzym. Es wird aber in Analogie zum

Naphthalinabbau eine ringhydroxylierende Dioxygenase postuliert, die 1,2-Dihydroxy-1,2-

dihydronaphthalin-2-sulfonat als instabiles Intermediat erzeugt, welches spontan unter

Freisetzung der Sulfonatgruppe rearomatiesiert (siehe Abbildung 2). Die aus dieser Reaktion

entstehenden 1,2-Dihydroxynaphthalin(derivate) werden dann über eine Reihe von

Reaktionen zu den entsprechenden Salicylaten umgesetzt.

Die bilsang charakterisierten Naphthalindioxygenasen besitzen alle ein sehr breites

Substratspektrum gegenüber hydrophoben Substraten. Da der Reaktionsmechanismus zur

Hydroxylierung von Naphthalin derselbe ist wie für die Desulfonierung der entsprechenden

Sulfonate, können die Naphthalindioxygenasen potentiell auch Naphthlinsulfonat

desulfonieren. Die Röntgenstruktur der Naphthalindioxygenase aus Pseudomonas sp. NCIB


9816-4 (15) legt mit ihrer mit hydrophoben Aminosäuren ausgekleideten Tasche für das

Reaktionszentrum jedoch nahe, daß Naphthalinsulfonate aufgrund der Polarität ihrer

Sulfonatgruppe keine Substrate sind. In der Literatur zum Substratspetktrum der

Naphthalindioxygenasen erscheinen keine sulfonierten Verbindungen als Substrate (siehe

UMBDD-Datenbank). Hinweise auf spezifische Naphthalinsulfonatdioxygenasen liefert

darüberhinaus der Metabolismus von Naphthalin-2-sulfonat und 2-Naphthylamin-1-sulfonat

durch Pseudomonas sp. TA-2. Der Umsatz von 2-Naphthylamin-1-sulfonat wird durch

Naphthalin-2-sulfonat nicht inhibiert (25).

Sequenzdaten zu putativen Naphthalinsulfonatdioxygenasen liegen bis auf eine Ausnahme

nicht vor (Acc.No. U65001). Die Genprodukte zu diesen Sequenzen sind nicht

charakterisiert, so daß die Zuweisung einer Funktion als Naphthalinsulfonatdioxygenase

bislang hypothetisch ist.

Nach der initialen Hydroxylierung und spontanen Desulfonierung von Naphthalin-1- und –2-

sufonat verläuft ihr Metabolismus analog zum Naphthalinabbau. Dieser Metabolismus wird

folglich von denselben Enzymen katalysiert, die auch 1,2-Dihydroxynaphthalin und dessen

Folgeprodukte umsetzen. Informationen zu Enzymen, die weitere Substituenten von

Naphthalinsulfonatderivaten eliminieren, liegen bislang nicht vor. Die Enzyme des

Naphthalinsulfonatabbaus sind meist induzierbar. Eine wichtige Rolle als Induktoren spielen

Untersuchungen zufolge die intermediär erzeugten Salicylate. Naphthalinsulfonat-

dioxygenaseaktivitäten können induzierbar oder auch konstitutiv sein (siehe 3.A.1)

Die Aktivität von Monooxygenasen zur Desulfonierung von Naphthalinsulfonaten erzeugt die

entsprechenden Naphthole (41). Beim Abbau von Naphthalin-2,6-disulfonat entsteht 5-

Sulfosalicylat als Intermediat, welches durch eine nicht näher beschriebene Hydroxylase in

Gentisat umgesetzt wird. Der Angriff einer Sulfonatgruppe durch eine Monooxygenase

erzeugt in S. obliquus ein Epoxidintermediat, welches als spontane Folgereaktion bevorzugt

den NIH-shift durchläuft (siehe oben) und nicht die spontane Freisetzung der

Sulfonatgruppe.

4.A.7 In Sequenzdatenbanken verfügbare Informantionen zu Enzymen

Im Gegensatz zum aeroben Naphthalinmetabolismus sind für den Naphthalinsulfonat-

metabolismus keine verifizierten Sequenzdaten verfügbar. Lediglich für Sphingomonas sp.

wird ein Gencluster identifiziert, in dem ein 108 Aminiosäuren (AA) umfassendes offenes

Leseraster der Ferredoxinkomponente sowie ein 409 AA umfassendes offenes Leseraster

der zugehörigen Reduktasekomponente eines putativen Naphtahlinsulfonatdioxygenase-

Systems zugeordnet wird. Die Identifizierung der entsprechenden NSDO in diesem

Gencluster erfolgte nicht; es werden aber die Sequenz einer α- und β-Untereinheit einer

nicht näher charakterisierten ringhydroxylierenden Dioxygenase aufgelistet, bei denen es


sich vermutlich um die Untereinheiten der entsprechenden terminalen Oxygenase handelt.

Dieses Gencluster enthält darüber hinaus Sequenzen zu Proteinen, die für den vollständigen

Metabolismus von Naphthalinsulfonat bis zum Salicylat erforderlich sind.

Tabelle 1 In Datenbanken verfügbare Informationen zu Proteinen mit suflonierten Naphtahlinenals Substrat

Funktion Organismus Substrat Protein Acc. No. Kommentar

putaives Naphthalin-

sulfonatdioxygenase-

System bzw. Gene

des Abbauweges bis

zum Salicylat

Sphingomonas

sp.

(DSM6383T)

Naphthalin-

sulfonat (?)

- U65001 Zuordnung

bislang putativ

5. Organismen

Tabelle 2:Mikroorganismen, die Naphthalinsulfonate mineralisieren


Sphingomonas xenophaga BN6 Naphthalin-1-sulfonat

Naphthalin-2-sulfonat

(24)

Mischkultur mit S. xeonophaga. BN6 und

Pseudomonas sp BN9

6-Amino-Naphthalin-2-sulfonat

8-Amino-Naphthalin-2-sulfonat ?



(22)

Pseudomonas sp. BN9 5-Aminosalicylat (22)

Moraxella sp. Naphthalin-1,6-disulfonat

Naphthalin-2,6-disulfonat

(39)

Sphingomonas paucimobilis

(Pseudomonas sp.) TA-1 bzw. TA-2

2-Amino-Naphthalin-1-sulfonat

(tobias acid)

2-Hydroxy-Naphthalin-1-sulfonat


(26) (25)

Pseudomonas maltophila BSA56 Naphthalin-1-sulfonat (21)



Comamonas testosteroni Stamm N13 Naphthalin-2-sulfonat (1)

Konsortium (u.a. Pseudomonas

aeruginosa; Schwermetall-reistent)

Naphthalin-2-sulfonat (36)

Pseudoaminobacter salicylatoxidans 6-Aminonaphthalin-2-sulfonat (14)

6. Sonstiges

Regulation

Die Abbauwege für den Naphthalinabbau sind meist in mindestens zwei Regulons unterteilt,

wobei die Gene eines Regulons die Enzyme des Umsatzes von Naphthalin zu Slalicylat

umfassen, und das zweite Regulon den Abbau von Salicylat codiert. Häufig sind die Gene

der Regulons als Operon organisiert (40) (9). Ein solches Operon wird beispielsweise für

Pseudomonas putida NCIB 9816 mit einer koordinierten Expression der

Dihydroxynaphthalindioxygenase, 2´-Hydroxybenzalpyruvat Aldolase und der Salicylaldehyd

Dehydrogenase beschrieben (2).

Salicylat bzw. die Vorstufe Salicylaldehyd sind wichtige Induktoren des Naphthlin(sulfonat)-

Abbaus, z.B. als Induktor der nah- und sal-Operons des NAH7 Plasmids aus P. putida (31),

in P. putida. NCIB 9816 (32) (33) und in Pseudomonas sp. ATCC 17483 (Salicylaldehyd) (4).

In Stamm BN6 sind 3-Aminosalicylat (3-AS), 3-Hydroxysalicylat (3HS) und 4-HS Induktoren,

was auf ein breites Substratspektrum des entsprechenden Regulatorproteins hindeutet. Eine

unspezifische Induktion ist nicht ungwöhlich, wie z.B. die Regulatoren des TOL-Abbauweges

zeigen (27). Andererseits weist P. putida NCIB 9816 ein im Vergleich zu Stamm BN6

eingeschränktes Induktorspektrum auf (24).

Adaptation:

BN6 erlangte Fähigkeit mit 8-Aminonaphthalin-2-sulfonat als alleiniger C- und Energiequelle

zu wachsen, nachdem der Organismus längere Zeit mit 6-AN2S kultiviert wurde (24).


Januar 2001


8. Literatur:

Verwendete Literaturdatenbank: Fusion enl.

1. Balashov, S. V., and A. M. Boronin. 1996. Sewage-Sludge Bacterial Isolates

Decomposing Sulfoaromatic Compounds. Microbiology (Reading UK) 65(5):549-552.

2. Cane, P. A., and P. A. Williams. 1986. A restriction map of naphthalene catabolic

plasmid pWW60-1 and the location of some of its catabolic genes. J. Gen. Microbiol.

132:2919-2929.

3. Collin, G., and H. Höke. 1991. Naphthalene and hydronaphthalenes, p. 1-8,

Ullmann´s encyclopedia of industrial chemistry, 5 ed, vol. A17. VCH, Weinheim.

4. Connors, M. A., and E. A. Barnsley. 1980. Metabolism of naphthalene by

pseudomonads: salicylaldehyde as the first possible inducer in the metabolic pathway. J

Bacteriol 141(3):1052-1054.

5. Cook, A. M., T. Leisinger, and A. Schmuckle. 1986. Microbial desulfonation of

multisubstituted naphthalene sulfonic acids. Experientia 42:95-96.


arylsulfonates by Clostridium spp. Arch. Microbiol. 167:177-181.

7. Denger, K., M. A. Kertesz, E. H. Vock, R. Schön, A. Mägli, and A. M. Cook. 1996.

Anaerobic desulfonation of 4-tolylsulfonate and 2-(4-sulfophenyl)butyrate by a Clostridium

sp. Appl. Environ. Microbiol. 62:1526-1530.

8. Ensley, B. D., and D. T. Gibson. 1983. Naphthalene dioxygenase: purification and

properties of a terminal oxygenase component. J. Bacteriol. 155:505-511.

9. Fuenmayor, S. L., M. Wild, A. L. Boyes, and P. A. Williams. 1998. A gene cluster

encoding steps in conversion of naphthalene to gentisate in Pseudomonas sp. strain U2. J

Bacteriol 180(9):2522-2530.

10. Gibson, D. T., S. M. Resnick, K. Lee, J. M. Brand, D. S. Torok, L. P. Wackett, M.

J. Schocken, and B. E. Haigler. 1995. Desaturation, dioxygenation, and monooxygenation

reactions catalyzed by naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. strain 9816-4. J.

Bacteriol. 177(10):2615-2621.

11. Greim, H., J. Ahlers, R. Bias, B. Broecker, H. Hollander, H.-P. Gelbke, H.-J.

Klimisch, I. Mangelsdorf, A. Paetz, and e. al. 1994. Toxicity and ecotoxicity of sulfonic

acids: structure-activity relationship. Chemosphere 28(12):2203-2236.

12. Guroff, G., J. W. Daly, D. M. Jerina, J. Renson, B. Witkop, and S. Udenfriend.

1967. Hydroxylation-induced migration: the NIH shift. Recent experiments reveal an

unexpected and general result of enzymatic hydroxylation of aromatic compounds. Science

157(796):1524-1530.


13. Heiss, G., A. Stolz, A. E. Kuhm, C. Müller, J. Klein, J. Altenbuchner, and H. J.

Knackmuss. 1995. Charakterization of a 2,3-dihydroxybiphenyl dioxygenase from the

naphthalene sulfonate-degrading bacterium strain BN6. J. Bacteriol. 177:5865-5871.

14. Kämpfer, P., C. Müller, M. Mau, A. Neef, G. Auling, H. J. Busse, A. M. Osborn,

and A. Stolz. 1999. Description of Pseudaminobacter gen. nov. with two new species,

Pseudaminobacter salicylatoxidans sp. nov. and Pseudaminobacter defluvii sp. nov. Int. J.

Syst. Bacteriol. 49 Pt 2:887-897.

15. Kauppi, B., K. Lee, F. Carredano, R. E. Parales, D. T. Gibson, H. Eklund, and S.

Ramaswamy. 1998. Structure of aromatic-ring-hydroxylating dioxygenase-naphtahalene

1,2-dioxygenase. Structure 6:571-586.

16. Keck, A., J. Klein, M. Kudlich, A. Stolz, H. J. Knackmuss, and R. Mattes. 1997.

Reduction of azo dyes by redox mediators originating in the naphthalenesulfonic acid

degradation pathway of Sphingomonas sp. strain BN6. Appl Environ Microbiol 63(9):3684-

3690.

17. Kneifel, H., K. Elmendorff, E. Hegewald, and C. J. Soeder. 1997.

Biotransformation of 1-naphthalenesulfonic acid by the green algae Scenedesmus obliquus.

Arch. Microbiol. 167:32-37.

18. Kudlich, M., M. J. Hetheridge, H.-J. Knackmuss, and A. Stolz. 1999. Autoxidation

reactions of different aromatic o-aminohydroxynaphthalenes that are formed during the

anaerobic reduction of sulfonated azo dyes. Environ. Sci. Technol. 33:896-901.

19. Kudlich, M., A. Keck, J. Klein, and A. Stolz. 1997. Localization of the enzyme

system involved in anaerobic reduction of azo dyes by Sphingomonas sp. strain BN6 an

effect of artificial redox mediators on the rate of azo dye reduction. Appl. Environ. Microbiol.

63(9):3691-3694.

20. Kuhm, A. E., A. Stolz, K.-L. Ngai, and H.-J. Knackmuss. 1991. Purification and

characterization of a 1,2-dihydroxynaphthalene dioxygenase from a bacterium that degrades

naphthalenesulfonic acids. J. Bacteriol. 173(12):3795-3802.

21. Lee, N. A., and D. P. Clark. 1993. A natural isolate of Pseudomonas maltophila

which degrades aromatic sulfonic acids. FEMS Microbiol. Lett. 107:151-156.

22. Nörtemann, B., J. Baumgarten, H. G. Rast, and H.-J. Knackmuss. 1986. Bacterial

communities degrading amino- and hydroxynaphthalene-2-sulfonates. Appl. Environ.

Microbiol. 52:1195-1202.

23. Nörtemann, B., A. Glässer, R. Machinek, G. Reinberg, and H.-J. Knackmuss.

1993. 5-Hydroxyquinoline-2-carboxylic acid, a dead end metabolite from the bacterial

oxidation of 5-aminonaphthalene-2-sulfonic acid. Appl. Environ. Microbiol. 59:1898-1903.


24. Nörtemann, B., A. E. Kuhm, H.-J. Knackmuss, and A. Stolz. 1994. Conversion of

substituted naphthalenesulfonates by Pseudomonas sp. BN6. Arch. Microbiol. 161(4):320-

327.

25. Ohe, T., T. Ohmoto, Y. Kohayashi, A. Sato, and Y. Watanabe. 1990. Metabolism of

naphthalenesulfonic acids by Pseudomonas sp. TA-2. Agric. Biol. Chem. 54:669-675.

26. Ohe, T., and Y. Watnabe. 1986. Degradation of 2-naphthylamine-1-sulfonate by

Pseudomonas strain TA-1. Agric. Biol. Chem. 50:1419-1426.

27. Ramos, J. L., A. Stolz, W. Reineke, and K. N. Timmis. 1986. Altered effector

specificities in regulators of gene expression: TOL plasmid xylS mutants and their use to

engineer expansion of the range of aromatics degraded by bacteria. Proc Natl Acad Sci USA

83(22):8467-8471.

28. Rettenmeier, H., U. Kupas, and F. Lingens. 1983. Degradation of juglone by

Pseudomonas putida J1. FEMS Microbiol. Lett. 19:193-195.

29. Riediker, S., M. J.-F. Suter, and W. Giger. 2000. Benzene- and

naphthalenesulfonates in leachates and plumes of landfills. Water Res. 34(7):2069-2079.

30. Ruff, J., T. Hitzler, U. Rein, A. Ritter, and A. M. Cook. 1999. Bioavailability of

water-polluting sulfonoaromatic compounds. Appl. Microbiol. Biotechnol. 52:446-450.

31. Schell, M. A. 1985. Transcriptional control of the nah and sal hydrocarbon-

degradation operons by the nahR gene product. Gene 36(3):301-309.

32. Shamsuzzaman, K. M., and E. A. Barnsley. 1974. The regulation of naphthalene

metabolism in pseudomonads. Biochem Biophys Res Commun 60(2):582-589.

33. Shamsuzzaman, K. M., and E. A. Barnsley. 1974. The regulation of naphthalene

oxygenase in pseudomonads. J Gen Microbiol 83(0):165-170.

34. Stolz, A., C. Schmidtmaag, E. B. M. Denner, H. J. Busse, T. Egli, and P.

Kämpfer. 2000. Description of Sphingomonas Xenophaga sp. nov. for strains BN6(T) and

N,N which degrade xenobiotic aromatic compounds. Int. J. Syst. Bacteriol. 50:35-41.

35. Suen, W.-C., and D. T. Gibson. 1993. Isolation and preliminary characterization of

the subunits of the terminal component of naphthalene dioxygenase from Pseudomonas

putida NCIB 9816-4. J. Bacteriol. 175:5877-5881.

36. Vidal, C. M., A. A. Vitale, and A. A. Viale. 1993. [2-Naphthalene-sulphonic acid

degrading microorganisms]. Rev Argent Microbiol 25(4):221-226.

37. Walker, R. 1970. The metabolism of azo compounds: a review of the literature. Food

Cosmet Toxicol. 8(6):659-676.

38. Wessendorf, J., H. Rettenmaier, and F. Lingens. 1985. Degradation of lawsone by

Pseudomonas putida L2. Biol Chem Hoppe Seyler 366(10):945-951.


39. Wittich, R. M., H. G. Rast, and H.-J. Knackmuss. 1988. Degradation of

naphthalene-2,6- and naphthalene-1,6-disulfonic acid by a Moraxella sp. Appl. Environ.

Microbiol. 54:1842-1847.

40. Yen, K. M., and C. M. Serdar. 1988. Genetics of naphthalene catabolism in

pseudomonads. Crit Rev Microbiol 15(3):247-268.

41. Zürrer, D., A. M. Cook, and T. Leisinger. 1987. Microbial desulfonation of

substituted naphthalenesulfonic acids and benzenesulfonic acids. Appl. Environ. Microbiol.

53:1459-1463.

17.12.02 / Mampel aliphatische Sulfonate 1

ANLAGE 7 Alkansulfonate

1. Eigenschaften der Alkansulfonate

Die Stabilität der C-S-Bindung von aliphatischen Organosulfonaten ist eine Funktion der

Kettenlänge. Methansulfonat ist das stabilste Alkansulfonat. Mit steigender Kettenlänge

nimmt die Stabilität der C-S-Bindung jedoch ab. Bereits deutliche Unterschiede lassen sich

zwischen Methansulfonat und Ethansulfonat feststellen. Die Spaltung der C-SO3-Bindung

durch eine einfache Hydrolyse ist jedoch in jedem Fall auszuschließen (87) (31).

Sind aliphatische Sulfonate mit Amino-, Hydroxyl- und oder Carboxylgruppen derivatisiert,

spricht man von aktivierten Alkansulfonaten, die den nicht substiutierten Verbindungen (z.B.

Ethansulfonat) gegenüberstehen (Abbildung 1). Je nach Kettenlänge der Alkane handelt es

sich um niedermolekulare, hochpolare oder langkettige, amphiphile Verbindungen. Aufgrund

der Sulfonatgruppe sind die ansonsten hydrophoben Alkane wasserlöslich und nicht

membrangängig (11). Befindet sich die Sulfonatgruppe endständig an einem längeren

Alkylrest, ist die Verbindung in Abhängigkeit der Länge der aliphatischen Kette schwer

löslich. Eine zentrale Sulfonatderivatisierung der aliphatischen Kette erhöht die

Wasserlöslichkeit. Alkansulfonate sind bis zu einem Gehalt von ca. 30 Masse-%

wasserlöslich (C15-Kette), wobei sich die Löslichkeit mit abnehmender Kettenlänge erhöht

(54)

CysteatTaurin

H2NSO3

-

+H3NSO3

-

COO-

HOSO3

-

Isethionat

SO3-

Methansulfonat

HSSO3

-

Coenzym M

Cerilipin

R2

OH

O

O

NH

R1 O

NH

(CH2)3NH3+

O

SO3-

OHN

SO3-

OHOH

O

Taurocholat

Abbildung 1 Natürlich vorkommende Alkansulfonate


1.A Vorkommen der Alkansulfonate

1.A.1: natürlich

Bis auf Aeruginosin B und der Gruppe der sulfonierten Pyoverdine (vgl. Modul

”monozyklische Arensulfonate”) sind alle natürlich vorkommenden Sulfonate aliphatisch

(Abbildung 1). Sie spielen eine wichtige Rolle im globalen Schwefelkreislauf. Methansulfonat

entsteht im Megatonnenmaßstab durch die photochemische Oxidation von Dimethylsulfid

(5), eine der häufigsten organischen Schwefelverbindungen mit überwiegend biologischer

Herkunft (Dimethylsulfopropionat, ein Osmolyt mariner Algen (42). Weitere natürliche

Sulfonate sind Isethionat, das Haupt-Anion in Axonen mariner Arthropoden (z.B. in den

Riesenaxonen von Tintenfischen (50)), Coenzym M, ein wichtiges Coenzym methanogener

Bakterien (76), Cysteat, das man als Oxidationsprodukt des Cysteins in Wolle findet sowie

das in Algen und Tieren weit verbreitete Taurin, welches in Säugern eine der häufigsten

niedermolekularen Verbindungen darstellt, dort vielfältige Aufgaben erfüllt (Anitoxidanz,

Detergenz, Osmolyt), aber nicht verstoffwechselt wird (38). Taurin wird auch als Bestandteil

der bakteriellen Zellwand identifiziert (40) (72). In der Thylakoidmembran der Pflanzen sowie

in Membranen photosynthetisch aktiver Bakterien findet man mit dem pflanzlichen Sulfolipid

eines der zusammen mit Taurin mengenmäßig wichtigsten natülichen Alkansulfonate.

Sulfolipide (z.B. Cerlipin, Capinin) werden auch als Komponenten der bakteriellen Zellwand

identifiziert. Capinin ist ein Kondensationsprodukt aus Cysteat und einer aktivierten

Fettsäure und hat in der acylierten Form eine zentrale Funktion bei der Fortbewegung

gleitender Bakterien (Cytophaga johnsonae) (1) Unter den natürlichen Sulfonaten finden sich

auch zuckerähnliche Verbindungen (Sulfochinovose) sowie Stoffe aus der Klasse der

Tenside, z.B. Gallensäuren (u.a. Taurocholat). Einige xenobiotische Verbindungen weisen

Substrukturen natürlicher Alkansulfonate auf, beipielsweise sekundäre Alkansulfonate oder

Fettsäureestersulfonate (65). Eine Übersicht über die wichtigsten natürlich vorkommenden

Alkansulfonate gibt Tabelle 1

Tabelle 1 Die wichtigsten natürllich vorkommenden Alkansulfonate

Alkansulfonat Literatur

Methansulfonat (77) (41)

2-Aminoethansulfonat (Taurin) (38)

Sulfoacetat (48) (63)

Sulfolactat (29)

Sulfopyruvat (29)


Sulfosuccinat (65)

Isethionat (37)

Cysteat (58) (64) (88)

Sulfoacetaldehyd (47)

Sulfopropandiol (15)

2-Mercaptoethansulfonat (Coenzym M) (76)

Sulfolipide (3) (28) (32)

Sulfochinovose (30)

1.A.2: xenobiotisch

Langkettige, nicht substituierte Alkansulfonate sind in der Natur nicht bekannt. Es existieren

keine Untersuchungen über die natürliche Verbreitung von relativ kurzkettigen

Alkansulfonaten wie Propan- oder Butansulfonat. Da aber im Boden eine Vielzahl

sulfonierter organischer Verbindungen existiert und umgesetzt wird (4) (75), erscheinen

kurzkettige Alkansulfonate als plausible natürliche Verbindungen (Abbildung 2)

Aufgrund ihrer guten Wasserlöslichkeit werden Alkansulfonate in einer Vielzahl flüssiger

Verbindungen eingesetzt, vorzugsweise in Haushalts- und Allzweckreinigern und

Spülmitteln. Auch in der Textil- und Lederindustrie sowie als Emulgatoren bei der

Polymerisation (PVC) werden diese Verbindungen verwendet. Dialkylester von Sulfosuccinat

bilden eine Gruppe wichtiger synthetischer Tenside, die in Pestiziden, Kosmetika, Shampoos

und Spülmitteln Anwendung finden.

Vor allem disulfonierte Alkane werden als pharmakologisch inaktive Gegenionen (vgl. (2)) in

Pharmazeutika eingesetzt, beispielsweise Ethan-1,2-disulfonat (Edisylat) (pers. Mitteilungen

Prof. Cook; (13)). Ihr Eintrag in die Umwelt über Kläranlagen ist somit wahrscheinlich.


Abbildung 2 Einige xenobiotische Alkansulfonate

2. Nutzung von Alkansulfonaten durch Mikroorganismen

Sowohl unter oxischen als auch unter anoxischen Bedingungen werden Alkansulfonate als

C- und Energiequelle von Mikroorganismen genutzt und können so vollständig mineralisiert

werden. Eine vollständige Mineralisation wird unter anoxischen Bedingungen jedoch nur

selten beobachtet.

Die Nutzung des Sulfonatschwefels als Schwefelquelle unter Schwefelmangelbedingungen

ist unter Mikroorganismen sehr weit verbreitet und findet sowohl unter oxischen als auch

unter anoxischen Bedingungen statt.

3. Abbau von Alkansulfonaten


Der erste Schritt zur Degradation von Alkansulfonaten liegt im Transport dieser polaren

Verbindungen über die Membran. Für den intrazellulären Abbau von Alkansulfonaten werden

zur Zeit zwei grundlegende Mechanismen beschrieben, bei denen die Desulfonierung einen

zentralen Schritt im Abbauweg darstellt. Die Desulfonierung kann auf zwei Arten erfolgen:

A) Die Hydrolyse von Sulfoacetaldehyd durch eine Thiamin-Pyrophosphat (TPP) abhängige

Sulfolyase (Abbildung 3). Das zentrale Intermediat Sulfoacetaldehyd wird dabei zunächst

OCH3

SO3-

O

Fettsäureester-Sulfonat

SO3-

SO3-

primäres Alkansulfonat

sekundäres Alkansulfonat

SO3-

CH3

CH3

CH3

verzweigtkettiges Alkansulfonat

SO3-

SO3-

Ethandisulfonat (Edisylat)


durch verschiedene vorgeschaltete Reaktionen erzeugt. Die Hydrolyse von

Sulfoacetaldehyd wird sowohl unter oxischen als auch unter anoxischen Bedingungen

beobachtet. Das entstehende Acetat wird unter oxischen Bedingungen vollständig

mineralisiert, unter anoxischen Bedingungen wird es vom Organismus als Endprodukt

ausgeschieden. Die als Sulfit freigesetzte Sulfonatgruppe wird unter oxischen

Bedingungen als Sulfat freigesetzt (Sulfit-Dehydrogenase oder Sulfit-Oxidasen; siehe

(66)), unter anoxischen Bedingungen kann sie für katabolische Zwecke

weiterverstoffwechselt werden.

Abbildung 3 Transaminierung durch eine Taurin:Pyruvat-Transaminase und hydrolytischeDesulfonierung von Sulfoacetaldehyd während des Abbaus von Taurin. I, Taurin:Pyruvat-Transaminase; II, Alanin-Dehydrogenase; III, Sulfoacetaledhyd-Sulfolyase.

B) Oxygenierung zur Spaltung der C-S-Bindung (Abbildung 4) unter Freisetzung der

Sulfonatgruppe als Sulfit; ein Prozeß, der aufgrund des Bedarfs an molekularem

Sauerstoff nur unter oxischen Bedingungen abläuft. Die Abspaltung der Sulfonatgruppe

scheint bei allen näher untersuchten Systemen der erste Schritt in der Biodegradation zu

sein (65).

Pyruvate Alanine H2O HSO3-

H2O

NAD+NADH+H+

NH4+

I

II

III

Taurine Sulfoacetaldehyde Acetate

HS-

6 [H]IV

H3N+ SO3

-

OSO3

-

O

O-


Abbildung 4 Oxygenolytische Desulfonierung durch Monooxygenasen (A) oder α-Ketoglutaratabhängige Dioxygenasen (B)

Mechanismus A wird zur Zeit ausschließlich für aktivierte C2-Verbindungen beschrieben

(Taurin und Isethionat); Mechanismus B für Alkansulfonate mit einer Kettenlänge von C1 –

C12 (66). Mikroorganismen nutzen beide Mechanismen zur Degradation der verschiedenen

Alkansulfonate und es können beide Abbauaktivitäten in einem Organismus beobachtet

werden (67). Dabei spielen Umweltfaktoren (Verfügbarkeit molekularen Sauerstoffs), die

Organsimen (Bakterien, Pilze, Algen) und das jeweilige sulfonierte Alkan eine Rolle.

Beispielsweise wird Taurin von Bakterien und Pilzen durch einen initialen Angriff auf die

Aminogruppe abgebaut. Bakterien setzen dazu meist den Mechanismus der

Transaminierung zu Sulfoacetaldehyd ein, Pilze hingegen die Deaminierung zu Isethionat

(Taurin-Dehydrogenase). Algen hingegen greifen zunächst die Sulfonatgruppe an und

desulfonieren oxidativ Taurin zu Ethanolamin.

Die aktuell verfügbaren Informationen zur Abhängigkeit zwischen der jeweiligen Verbindung

und dem eingeschlagenen Abbauweg deuten an, daß aktivierte Alkansulfonate über die

hydrolytische Desulfonierung abgebaut werden, wohingegen nicht aktivierte Alkansulfonate

durch Oxygenierung aktiviert und desulfoniert werden.

3.A.2: Transport

Wie für alle Sulfonate gilt auch für die Alkansulfonate, daß eine passive Diffusion über die

Zellmembran aufgrund der starken Polarität der Sulfonatgruppe ausgeschlossen werden

kann, obwohl wie im Fall von Methan- oder Ethansulfonat die Molekulargewichte gering sind.

SO3- SO3

-

OH

O

H

SO32-

O2+

+

+ NADH2+ H2O

A

B

H2NSO3

-

-OOC COO-

O

H2NSO3

-

OH

-OOCCOO-

CO2

H2NO

HO2

NADH2

Taurin

α-Ketoglutarat

α-Hydroxytaurin Aminoacetaldehyd

Succinat+

+


In Chlorella fusca (9) (10) und verschiedenen Cyanobakterien (11) werden

Transportsysteme für Ethansulfonat und Taurin beschrieben. Das Sulfonattransportsystem

in Chlorella fusca wird durch Ethansulfonat sowie unter Schwefelmangelbedingungen

induziert und zeigt Affinitäten gegenüber einer Reihe von Alkansulfonaten (Methan-, Ethan-,

Pentansulfonate) bzw. substituierter Alkansulfonate (Amino-, Hydroxy-, Mercapto-

ethansulfonate) sowie gegenüber Benzolsulfonat, allerdings mit deutlich schwächerer

Affinität. Entsprechende nicht sulfonierte Alkane inhibieren die Aufnahme von Ethansulfonat

nicht. Die Sulfonatgruppe ist für dieses Transportsystem offenbar die entscheidende

Molekülsignatur, die auch erkannt wird, wenn sich in unmittelbarer Nachbarschaft zur

Sulfonatgruppe HO-, NH2-, HS- oder HOOC-Gruppen befinden. Die Affinität gegenüber

Alkansulfonaten liegt bei 50 µM (KD-Wert) (9). Dieselbe Alge verfügt über ein

Taurintransportsystem, welches analog zum Ethansulfonataufnahmesystem unter

Schwefelmangelbedingungen exprimiert wird. Auch dieses System erkennt spezifisch die

Sufonatgruppe. In beiden Aufnahmesystemem scheinen Thiolgruppen der Transportproteine

eine wichtige Rolle zu spielen. Vergleichbare Transportsysteme finden sich in einer Reihe

von Cyanobakterien (11). Im Gegensatz zu den sulfonatspezifischen Aufnahmesystemen

aus C. fusca für Taurin und Ethansulfonat existiert in Staphylococcus aureaus ein

Taurintransportsystem, welches jedoch keine spezifischen Affinitäten gegenüber

Sulfonatgruppen aufweist (7)

Unter Schwefelmangelbedingungen werden zusammen mit den cytosolischen Proteinen

vielfach spezielle Transportsysteme des ABC-Typs (hohe Affinitäten) über die Co-

lokalisation entsprechender Gene in Form eines Operons exprimiert (siehe unten, SSIS) (44)

(26). Soweit untersucht, spiegeln die Substratspektren der Transporter weitestgehend die

Substratspektren der den Abbau einleitenden Enzyme wieder (26).

Informationen zu Alkansulfonattransportern, die im dissimilatorischen Metabolismus

involviert sind, liegen bislang nicht vor.

3.A.3: Alkansulfonatabbau ohne Oxygenierung

Zentrales Intermediat im Abbau von Alkansulfonaten als C- und Energiequelle für

Mikroorganismen ohne Beteiligung von Oxygenasen ist Sulfoacetaldehyd. Dieses

Intermediat kann in Abhängigkeit der jeweiligen Ausgangsverbindung (Taurin, Isethionat,

Sulfoacetat) über eine individuelle Abfolge verschiedener Reaktionen erzeugt werden (70)

(52) (47) (53) (48). Da molekularer Sauerstoff an diesen Reaktionen nicht beteiligt ist, wird

dieser Umsatz sowohl unter oxischen als auch unter anoxischen Bedingungen beobachtet.

In der Literatur finden sich detaillierte Angaben zum Abbau von Taurin mit Sulfoacetaldehyd

als Zwischenprodukt (55-57, 60). Das über die Aminogruppe aktivierte Taurin kann über

zwei alternative Wege zu Sulfoacetaldehyd umgesetzt werden; ein dritter Weg ist bislang

hypothetisch:


1) Transaminasereaktionen erzeugen Sulfoacetaldehyd

Die Aminogruppe von Taurin wird auf einen Aminogruppenakzeptor übertragen (Abbildung

3). Dieser kann α-Ketoglutrarat (α-KG) oder Pyruvat sein (Abbildung 5). In Abhängigkeit

dieses Aminogruppenakzeptors werden α-KG (80) oder Pyruvat-abhängige Transaminasen

(70) unterschieden. Alle bislang charakterisierten Transaminasen verwenden Pyridoxal-5´-

Phosphat als Cofaktor. Die Übertragung der Aminogruppe auf den Akzeptor erzeugt

Glutamat bzw. Alanin als aminierte Produkte sowie Sulfoacetaldehyd. Oxidative

Deamnierung durch entsprechende Dehydrogenasen regenriert anschließend den

Aminogruppenakzeptor unter Freisetzung von Ammonium (57) (56).

2) Dehydrogenasereaktion erzeugt Sulfoacetaldehyd

Alternativ zum Transaminasemechanismus kann Taurin direkt oxidativ deamniert werden

(52) (Abbildung 5). Die beteiligten Taurin-Dehydrogenasen sind membrangebunden und

oxidieren Taurin zu Sulfoacetaldehyd unter Freisetzung von Ammonium. Dabei werden

Reduktionsäquivalente des Oxidationsschrittes auf nicht näher charakterisierte Akzeptoren

übertragen.

Abbildung 5 Wege zum aeroben nicht-oxygenolytischen Abbau von Taurin überSulfoacetaldehyd als zentralem Intermediat. Ia, Taurin-Dehydrogenase; Ib, Taurin-a-Ketoglutarat-Transaminase; Ic, Taurin-Pyruvat-Transaminase; II, Sulfoacetaldehyd-Sulfolyase; III, Sulfit-Oxidase

3) weitere Reaktionen zur Erzeugung von Sulfoacetaldehyd

Über Sulfoacetaldehyd als zentralem Intermediat werden vermutlich auch Isethionat und

Sufloacetat verstoffwechselt (48) (53). Ob der Abbau von Cysteat und Sulfolactat ebenfalls

Glu

α-KGPyr

Ala

IaIb Ic

II

III

Accox

Accred

Cyt coxCyt cred

H2O

O

O-

HSO3-

H3N+ SO3

-

H2O

+NH4

H2O

HSO4-

OSO3

-


über dieses Intermediat verläuft ist noch unklar. Ein möglicher Reaktionsweg verläuft über

Taurin als Zwischenstufe (74) (12). Es wird in Verbindung mit diesen Sulfonaten aber auch

ein noch unverstandener neuer Desulfonierungsmechanismus diskutiert (64). Arbeiten zum

Abbau von Cysteat durch anaerobe Bakterien zeigen, daß eine klassische Sulfoacetaldehyd-

Sulfolyase in dem entsprechenden Organismus nicht detektiert werden kann (68).

Hydrolytische Desulfonierung von Sulfoacetaldehyd durch eine Lyase

Sulfoacetaledhyd wird quantitativ zu den Produkten Acetat und Sulfit hydrolysiert (Abbildung

3). Katalysiert wird dieser Schritt von einer Thiamin-Pyrophosphat (TPP) abhängigen Lyase,

die in einer Vielzahl von aeroben und anaeroben Bakterien vorgefunden wird (51) (71).

Alternative Mechanismen zur Desulfonierung von Sulfoacetaldehyd

Alternativ zur Desulfonierung durch eine Sulfolyase kann Sulfoacetaldehyd reduktiv zu Sulfit

und Acetaldehyd gespalten werden, welcher nachfolgend -katalysiert von einer Acetaldehyd-

Dehydrogenase- zu Acetat oxidiert wird (Abbildung 6). Ein derartiger Mechanismus wird für

den Abbau von Isethionat durch Desulfovibrio desulfuricans IC1 (62) vorgeschlagen.

Ein weiterer alternativer Desulfonierungsmechanismus schlägt Sulfoacetaldehyd als direktes

Substrat für eine dissimilatorische Sulfitreduktase vor. Diese setzt Acetat und Sulfid als

Produkte dieser hypothetischen Desulfonierung frei (55).

Abbildung 6 Reduktive Spaltung von Sulfoacetaldehyd

3.A.4: aerober Abbau über Oxygenierungen

Unter oxischen Bedingungen werden aliphatische Sulfonate über drei Mechanismen

metabolisiert. Zwei dieser Mechanismen erfordern molekularen Sauerstoff als

Reaktionspartner (Abbildung 4), der dritte Mechanismus ist die Transaminierung zu

Sulfoacetaldehyd (s.o.; Abbildung 3). Die Monooxygenierung von Alkansulfonaten wird

beobachtet, wenn die Verbindung als C- und Energiequelle oder als Schwefelquelle genutzt

wird. Die Monooxygenasesysteme, die unter Schwefelmangelbedingungen exprimiert

werden, unterscheiden sich in ihrer Regulation und molekularen Architektur von denen

dissimilatorischer Prozesse (44). Wird Taurin als Schwefelquelle genutzt, kommt eine

ungwöhnliche α-Ketoglutarat abhängige Dioxygenase zum Einsatz (24) (siehe unten, 3.A.6).

2 [H] 2 [H]

HSO3-

H2O

O

H

OSO3

-H

O

O-


Die zur Zeit in der Literatur verfügbare Information deutet darauf hin, daß nicht aktivierte

Alkansulfonate über Monooxygenasen metabolisiert werden (vgl. (67)). Lineare

Alkansulfonate mit Kettenlängen zwischen C4–C7 bzw. C8-C12 (für zwei unterschiedliche

Pseudomonasstämme (79)), sekundäre Alkansulfonate wie Sulfosuccinat (65) oder 2-

Propansulfonat (67) sowie Methansulfonat (5) (77) werden durch diesen Oxygenasetyp

aktiviert, Sulfit und zentrale Stoffwechselintermediate freigesetzt und letztere über bekannte

Stoffwechselwege (β-Oxidation, seltener α-Oxidation) vollständig mineralisiert.

3.A.5: Anaerober Abbau

Der anaerobe Metabolismus von Alkansulfonaten führt i.d.R. nicht zur vollständigen

Mineralisierung dieser Verbindungen. Unter geänderten Umweltbedingungen und in

Anwesenheit weiterer Mikroorganismen sind die quantitativ erzeugten

Transformationsprodukte jedoch meist vollständig biologisch abbaubar.

Anaerobe Mikroorganismen nutzen Alkansulfonate im dissimilatorischen Stoffwechsel durch

Atmungs- oder Gärungsprozesse. Wird bei Atmungsprozessen immer ein zusätzlicher

Elektronenakzeptor oder –donator benötigt, erfordert der Gärprozeß aufgrund der

intramolekularen Redoxreaktionen, bei denen ein Teil des zu vergärenden Moleküls

reduziert, der andere Teil hingegen oxidiert wird, lediglich die Anwesenheit des

entsprechenden Organosulfonats.

Die anaerobe Dissimilation von Alkansulfonaten durch Bakterien ist sowohl phylogenetisch

als auch geographisch eine weit verbreiteter Metabolismustyp. Sie wird überwiegend in

sulfatreduzierenden Organismen, aber auch in einer Vielzalhl von nicht-sulfatreduzierenden

Organismen (u.a. Bilophila wadsworthia, Alcaligenes sp., Paracoccus denitrificans)

vorgefunden. Entsprechende Organismen können aus Kläranlagen, Sedimenten oder

Bodenproben angereichert werden. Andere Isolate werden im Gastro-Instestinaltrakt

vorgefunden (19).

Alkansulfonate können in drei Funktionen in dissimilatorische Prozesse eingebunden sein: in

Atmungsprozessen als Elektronendonor und –akzeptor sowie als Substrat für

Disproportionierungsreaktionen in Verbindung mit Gärungen (Abbildung 7)


Abbildung 7 Mögliche Funktionen von Alkansulfonaten im anaeroben Stoffwechsel.Exemplarisch sind die Möglichkeiten des Taurinabbaus durch anaerobe Bakterien aufgezeigt. EnzymeI, Taurin:Pyruvat-Aminotransferase; Enzym II, Alanindehydrogenase; Enzym III, Sulfoacetaldehyd-Sulfolyase. (1), Taurin als Elektronenakzeptor in einer anaeroben Atmung mit Formiat alsElektronendonator; (2), Taurin als Elektronendonor in einer anaeroben Atmung mit Nitrat oder Eisen(3) als Elektronenakzeptor; (4) (5), Vergärung von Taurin; (6), Assimilierung des Sulfonatschwefelsdes Taurinmoleküls unter Schwefelmangelbedingungen.

1. Organosulfonate als Elektronenakzeptoren:

Sowohl sulfatreduzierende (61, 62) (59) als auch nicht sulfatreduzierende anaerobe

Mikroorganismen (59) nutzen aliphatische Sulfonate als terminale Elektronenaktzeptoren.

Bei dieser Reduktion wird das Kohlenstoffgerüst des Organosulfonats oxidiert. Die

freiwerdenden Elektronen zusammen mit Elektronen des Elektronendonators werden

genutzt, um die Sulfonatgruppe zum Sulfid zu reduzieren. Desulfovibrio desulfuricans setzt

auf diese Weise 1 mol Isethionat mit 1 mol Lactat zu 1 mol Sulfid, 2 mol Acetat und 1 mol

CO2 um (62).

2. Organosulfonate als Elektronendonatoren:

Organosulfonate können in anaeroben Atmungsprozessen als Elektronendonatoren

eingesetzt werden. Neben ihrer gut verstandenen Funktion bei der Nitratatmung scheinen

aliphatische Organosulfonate auch die Atmung mit Eisen, nicht aber mit Sulfat als

Elektronenakzeptor zu ermöglichen. Alcaligenes sp. nutzt Taurin als C- und Energiequelle in

einer anaeroben Nitratatmung, bei der Taurin quantitativ in Zellmaterial und CO2

umgewandelt wird. Die Sulfonatgruppe wird zu Sulfat oxidiert und die Aminogruppe als

Ammonium freigesetzt. Nitrat wird zum molekularen Stickstoff reduziert (22). Dieser

anaerobe Prozeß führt somit zur vollständigen Mineralisierung des Organosulfonats.

NAD+I

Alanine

Pyruvate

FeIII

FeII

(2)(1)

CO2

(4)

[H]

R-SH

IIIIII

?

Acetate

Acetate

(3) (5)

II

Formate

Sulfite

Sulfate

+ CO2

Thiosulfate

Nitrate

IIIAcetate

Sulfide

N2

Sulfide

(6)

H2OH2O

+H3NSO3

-

OSO3

-

NH4+

H2O

H2O


3. Organosulfonate in Gärungen:

Die Vergärung von Organosulfonaten unterscheidet sich von der Veratmung dadruch, daß

kein geeigneter Elektronenakzeptor oder -donator erforderlich ist. Die Vergärung von Taurin

durch Desulfonispora thiosulfatigenes Stamm GKNTAU (23) disproportioniert dieses

Sulfonat in Acetat und Thiosulfat, wobei letzteres ein weitverbreiteter natürlicher

Elektronenakzeptor- und donator ist (39). Die Vergärung von Cysteat oder Isethionat durch

ein Desulfovibrio sp. erzeugt Ammonium, Acetat und CO2 als Gärprodukte. Im Unterschied

zur Sulfonatgärung durch Stamm GKNTAU wird hier die Sulfonatgruppe zu Sulfat und Sulfid

disproportioniert, vmtl. unter Energiegewinnung für den Organismus (58).

3.A.6 Alkansulfonate als Schwefelquellen

Die natürlichen Alkansulfonate Taurin, Isethionat und Cysteat werden von einer Reihe von

Bakterien und Hefen als Schwefelquelle genutzt (17) (69) (82) (83) (85) (84). Auch viele

photosynthetisch aktive Organismen wie Algen und Cyanobakterien können Alkansulfonate

als Schwefelquelle verwerten (11) (8). Werden Alkansulfonate als Schwefelquelle genutzt,

sind die Substratspektren der beteiligten Systeme sehr breit. Der Sulfonatschwefel sowohl

aktivierter als auch nicht aktivierter Alkansulfonate wird unter diesen Bedingungen

assimiliert. Werden sie jedoch als C- und Energiequelle für das Wachstum verwendet,

zeigen Mikroorganismen meist eine hohe Präferenz für ein oder wenige Substrate. In einer

Testreihe mit 100 nicht selektiv isolierten Mikroorganismen stellten King und Quinn fest, daß

mehr als 90 % der Bakterien Taurin, Isethionat, Sulfoacetaldehyd oder Sulfoacetat als

Schewelquelle nutzen konnten, wohingegen nur 10 % der Organismen Taurin oder

Isethionat, nicht aber Sulfoacetaldehyd als C- und Energiequelle akzeptierten (49).

SSIS: Sulfate Starvation Induced Stimulon

Unter Schwefelmangelbedingungen synthetisieren viele Bakterien eine besondere Gruppe

von Proteinen, die unter dem Begriff ”Sulfate Starvation Induced proteins” (SSI-proteins)

zusammengefaßt werden (6) (44). Diese Proteine werden nur in Abwesenheit der vom

jeweiligen Organismus bevorzugten Schwefelquelle (i.d.R. Sulfat, aber auch Cystein, Sulfid

und Thiocyanat) exprimiert. Neben Proteinen, denen eine spezifische Funktion in der

Kompensation des Schwefelmangels zukommt, z.B. periplasmatische Bindeproteine zur

hochaffinen Sulfataufnahme oder Enzyme zur Mobilisierung intrazellulärer Schwefelspeicher,

werden auch Kopien von nicht-SSI-Proteinen synthetisiert, deren nicht essentielle Cystein-

und Methioninaminosäuren in Anpassung an den Schwefelmangel ersetzt werden.

Die Expression der SSI-Proteine unterliegt einer Regulation auf Ebene eines Stimulons

(SSIS = Sulfate Starvation Induced Stimulon), das über CysB, einem übergeordneten

Regulator vom LysR-Typ, gesteuert wird.. Zusätzliche Regulatoren in Verbindung mit der

Nutzung des Sulfonatschwefels als S-Quelle werden mit dem Cbl-Protein in E. coli bzw.

dem AsfR-Protein aus Pseudomonas putida beobachtet. Die Abwesenheit von CysB und Cbl


führte zu einem vollständigen Verlust der Fähigkeit von E.coli, den Sulfonatschwefel unter

SSIS-Bedingungen zu nutzen und unterstreicht damit die zentrale regulatorische Funktion

dieser Proteine. Die Funktion von CysB in der Desulfonierung von n-Alkansulfonaten (C2-

C6), Isethionat, Sulfoacetat, MOPS (3-(N-morpholino)propansulfonat und Piperazin-1,4-bis-

2-ethansulfonat konnte belegt werden. Die Organisation der beteiligten Gene als Stimulon

unterscheidet sich wesentlich von der Organisation der an der Dissimilation von Sulfonaten

beteiligten Gene, die meist in Form eines Operons organisiert sind (44). Darüber hinaus

ändert sich unter SSIS-Bedingungen der Stoffluß des Schwefels innerhalb der Zelle (45).

Nutzung von Organosulfonaten als Schwefelquelle durch aerobe Mikroorganismen:

In Anwesenheit molekularen Sauerstoffs werden Oxygenasen zur Freisetzung des

Sulfonatschwefels eingesetzt. Bislang werden zwei Hauptmechanismen zur Assimilation des

Schwefels beschrieben: ein Abbauweg, der eine α-KG-abhängige Dioxygenase (TauD)

beinhaltet, sowie die Monooxygenierung (Abbildung 4). Die beteiligten Oxygenasen

unterscheiden sich von denen des katabolischen Stoffwechsels, wie es u.a. für den

Metabolismus von Methansulfonat gezeigt werden konnte (34) (46).

TauD hat ein Taurin-spezifisches Substratspektrum. Höhere homologe Alkansulfonate (C4-

C6) werden nur mit einer sehr viel geringeren Affinität desulfoniert (24). Homologe TauD-

Proteine werden in Yersinia pestis, Saccharomyces cerevisiae, Mycobacterium tuberculosis,

Bordetella pertussis, und Pseudomonas aeruginosa, z.T. mit mehreren homologen Proteinen

innerhalb eines Organismus vorgefunden. Das Substratspektrum der FeII-abhängigen α-KG

abhängigen Dioxygenase aus Saccharomyces cerevisiae ist weniger eng als das von TauD:

Isethionat und Taurocholat sind sogar bessere Substrate als Taurin (35).

Die am SSIS beteiligten Monooxygenasen weisen eine ungewöhnliche Struktur auf, da die

Flavinkomponente (FMN) nicht als prosthetische Gruppe an die Oxygenase gebunden ist,

sondern als frei lösliches Flavin in Funktion eines Co-Substrats an der Reaktion teilnimmt.

Entsprechend werden in diesen Fällen keine spezifischen Reduktasen gefunden. Reduzierte

Flavine genügen in Verbindung mit der Oxygenasekomponente zur Rekonstitution der in

vitro Aktivität. Werden α-KG abhängige Dioxygenasen bislang nur in Verbindung mit Taurin

beobachtet, wird eine Reihe von Alkansulfonaten durch Monooxygenasen desulfoniert. Eine

derartige Differenzierung des Abbaus innerhalb eines Organismus wird in E. coli beobachtet,

in dem zwei Operons (das tauABCD-Operon zur Verwertung von Taurin und das

ssuEADCB-Operon für alle anderen Alkansulfonate) existieren (26). Die beiden

Monooxygenasen zeigen ein vergleichsweise enges Substratspektrum. SSIS-

Monooxygenasesysteme konnten bislang in E. coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida,

P. aeruginosa, Rhodococcus erythropolis und Chelatobacter sp. identifiziert werden (44).

Nutzung von Organosulfonaten als Schwefelquelle durch anaerobe Mikroorganismen:


In Analogie zur Desulfonierung unter oxischen Bedingungen zeigen die desulfonierenden

Systeme der anaeroben Mikroorganismen ein im Vergleich zur Alkansulfonatdissimilation

breites Substratspektrum. Neben natürlich vorkommenden aktivierten Alkansulfonaten wie

Taurin und Cysteat (17) werden auch nicht aktivierte Sulfonate wie Ethansulfonat und 1-

Heptansulfonat desulfoniert (20). Methansulfonat kann unter anoxischen Bedingungen

offenbar nicht als S-Quelle genutzt werden, vermutlich aufgrund der hohen Stabilität der C-

S-Bindung in diesem Molekül (43). Es werden sowohl substratspezifische Sulfonatasen

(z.B. für Taurin) als auch unspezifische Alkansulfonatasen beschrieben (19). Clostridium

pasteurianum zeigt mit Taurin als Schwefelqulle gleiche Wachstumsraten wie mit Sulfat.

Verringerte Wachstumsraten werden mit Isethionat bzw. p-Toluolsulfonat beobachtet (16).

Der Desulfonierungsmechanismus unter anoxischen Bedingungen ist noch unverstanden.

Untersuchungen mit Clostridium pasteurianum C1 deuten auf eine unter

Schwefelmangelbedingungen induzierbare Taurin-Pyruvat Aminotransferase hin (18), so

daß unter diesen Bedingungen Taurin offenbar nach demgleichen Reaktionsmechanismus

desulfoniert wird wie unter dissimilatorischen Bedingungen, vermutlich aber katalysiert von

modifizierten Proteinen (s.o.).

3.A.7 Struktur-Abbaumechanismus Beziehungen für Alkansulfonate

# nicht aktivierte AlkansulfonateDie Aktivierung und Desulfonierung erfolgt durch Monooxygenierung; der nachfolgende

Abbau über β-Oxidation

# aktivierte AlkansulfonateÜber vorgeschaltete Reaktionen, beispielsweise Transaminierungen, wird Sufloacetaldehyd

als zentrales Intermediat erzeugt. Dieser wird nachfolgend durch Sulfolyasen hydrolytisch

desulfoniert.

# kurz- /kangkettige Alkansulfonate

Kurzkettige Alkansulfonate werden bevorzugt über Sulfoacetaldehyd abgebaut; langkettige

werden einleitend oxygenolytisch desulfoniert, dann über eine Folge von β-Oxidationen

abgebaut. Methansulfonat als stabilstes Alkansulfonat kann bislang nur unter oxischen

Bedinungen abgebaut werden.

# lineare- /verzweigtkettige AlkansulfonateLineare Alkansulfonate werden nach der einleitenden Desulfonierung über Sulfoacetaldehyd

(kurzkettige) oder eine Abfolge von β-Oxidationen (langkettige) abgebaut. Beim Abbau

längerkettiger Alkansulfonate scheint die Kettenlänge ein für den Abbau weniger wichtiges

Kriterium zu sein. Beispielsweise akzeptiert Stamm DS-1 eine ganze Reihe langkettiger

Alkansulfonate als C- und Energiequelle (pers. Mitteilung Prof. Cook).

Verzweigtkettige Alkane gelten allgemein als weniger leicht abbaubar als lineare n-Alkane

oder mit Methylseitenketten derivatisierte Alkane (14). Dennoch bauen einige


Pseudomonasstämme verzweigtkettige Alkane und Alkene ab, z.B. 3,7-Dimethyl-6-octen-1-

ol (27). In diesem Zusammenhang ist auch die Mineralisierung von verzweigtkettigen

Dodecylbenzolsulfonaten zu erwähnen (73). Methylseitenkettenverzweigungen werden

vermutlich über eine Decarboxymehtylase entfernt, wie sie für Pseudomonas citronellolis

beschrieben wird (27).

# mono-, disulfonierte, höhersulfonierte AlkansulfonateMonosulfonierte Alkanslfonate:

kurzkettig (C2, C3), aktiviert: Transaminierung zu Sulfoacetaldehyd; vorgeschaltete

Reaktionen erzeugen Sulfoacetaledhyd.

langkettig oder nicht aktiviert: Monooxygenierung zum Aldehyd, Oxidation zur

Carbonsäure, β-Oxidation

Disulfonierte Alkansulfonate:

kurzkettig: Desulfonierung der ersten Sulfonatgruppe zum Sulfoacetaldehyd durch

Monooxygenierung gefolgt von Desulfonierung des Sulfoacetaldehyds (21). Ethandisulfonat

wird von der n-Alkansulfonat-Sulfonatase aus C. acidovorans P53 (Monooxygenase) nicht

als Substrat akzeptiert.

langkettig: (hypothetischer Mechanismus) oxygenolytische Desulfonierung der ersten

Suflonatgruppe gefolgt von β-Oxidation bis zur Struktur Sulfolactat; Abbau Sulfolactat über

Sulfoacetaldehyd;

alternativ (hypothetisch):

oxygenolytische Desulfonierung beider Sulfonatgruppen, gefolgt von β-Oxidation

poly (>3) sulfonierte Alkansulfonate:

keine Informationen verfügbar

4. Enzymatik

4.A.1 Transaminierung und hydrolytische Desulfonierung aliphatischer Sulfonate

Dieser Reaktionstypus wurde detailliert am Abbau von Taurin untersucht. Biochemische und

molekularbiologische Analysen liegen zur Rolle des natürlichen Sulfonats Taurin als

terminaler Elektronenakzeptor einer anaeroben Atmung vor (56, 57, 60). In dieser Atmung

nutzt Bilophila wadsworthia Taurin als Elektronenakzeptor und Formiat als

Elektronendonator (59). 1 mol Taurin und 2 mol Formiat werden zu 1 mol Ammonium, 1 mol

Acetat, 1 mol Sulfid sowie 2 mol CO2 umgesetzt. An diesem mehrstufigen Prozess sind vier

Enzyme beteiligit:

- Taurin:Pyruvat Transaminase

- Alanin-Dehydrogenase

- Sulfoacetaldehyd Sulfolyase

- Sulfitreduktase


Die induzierbare Transaminase ist ein Pyridoxal-5´-phosphat abhängiges Enzym. Diese

prosthetische Gruppe ist essentiell für die Ausbildung einer Schiffschen Base während des

Reaktionszyklus. Neben Taurin werden Hypotaurin und β-Alanin als Substrate sowie 2-

Oxobutyrat und Oxaloacetat als alternative Aminogruppenakzeptoren erkannt. Der KM-Wert

für Taurin liegt bei 7 mM. Taurin wird zum Sulfoacetaldehyd deaminiert. Die Aminogruppe

wird dabei auf die α-Ketosäure Pyruvat übertragen, die dadurch zur Aminosäure Alanin

umgesetzt wird. Eine induzierbare Alanin-Dehydrogenase katalysiert die Regeneration des

Aminogruppenakzeptors Pyruvat durch die nachfolgende oxidative Deaminierung von Alanin

unter Reduktion von NAD+ und Freisetzung von Ammonium (Abbildung 3).

Die Hydrolyse von Sulfoacetaldehyd zu Acetat und Sulfit wird durch eine Thiamin-

pyrophosphat (TPP) abhängige Lyase katalysiert, die in verschiedenen Bakterien gemessen

wurde (51) (71). Gemäß eines hypothetischen Reaktionsmechanismus bildet sich ein Enol-

Adkut zwischen TPP und Sulfoacetaldehyd aus unter Freisetzung der guten Abgangsgruppe

Sulfit. Infolge der Anlagerung eines Wassermoleküls an die Doppelbindung wird Acetat

freigesetzt und TPP regeneriert (51) (Abbildung 8)

Im anaeroben Metabolismus wird Sulfit unter Energiegewinnung zu Sulfid reduziert,

katalysiert von einer dissimilatorischen Sulfitreduktase (60). Unter oxischen Bedingungen

wird es hingegen zu Sulfat oxidiert.

Die Enzyme dieses Abbauweges (Taurin) können sowohl induzierbar sein (56, 57)) als auch

konstitutiv exprimiert werden (61).

Abbildung 8 Postulierter Mechanismus zur hydrolytischen Desulfonierung vonSulfoacetaldehyd zu Acetat und Sulfit durch eine Sulfoacetaldehyd-Sulfolyase

4.A.2 Monooxygenierung und Desulfonierung aliphatischer Sulfonate

Die Monooxygenierung von Alkansulfonaten folgt dem grundlegenden Prinzip zur Spaltung

von stabilen C-SO3- Bindungen durch Oxygenasen. Die Addition eines weiteren Heteroatoms

SN+

SN

+

SN

HO CH2SO3-H

+

OHC-CH2-SO3-

+

SN

HO CH2

+

SN

O CH3

SO32-

OH-

CH3COO-

TPP-Rest

Sulfoacetaldehyd


an das mit der Sulfonatgruppe substituierte C-Atom führt zur Freisetzung der besseren

Abgangsgruppe Sulfit. Für Alkansulfonate wurde die Desulfonierung durch

Monooxygenierung erstmals für Methansulfonat nachgewiesen (5) (77). Die entsprechende

Monooxygenase gehört zur Klasse der Oxygenasen mit mononuklearem Eisenzentrum

(siehe Modul ”bakterielle Oxygenasen”). Reduktionsäquivalente zur Aktivierung des

molekularen Sauerstoffs werden von reduziertem NAD beretigestellt und über eine

Elektronentransportkette auf das mononukleare Eisenzentrum übertragen. Dort wird

molekularer Sauerstoff aktiviert, der die C-S-Bindung angreifen kann. Es ensteht ein

instabiles Hydroxymethansulfonat als Intermediat, welches unter spontaner Abspatlung der

Sulfitgruppe Formaldehyd ausbildet. (vgl. Abbildung 4). Ein verallgemeinerter

Reaktionsmechanismus umfaßt folgende Schritte:

- α-Hydroxylierung unter Ausbildung einer instabilen Hydroxysulfonatstruktur

(Aldehydbisulfit)

- Hydrolyse des Hydroxysulfonats unter Freisetzung der Sulfonatgruppe als Sulfit

- Oxidation des Aldehyds zur Carbonsäure

- β-Oxidation

Der Abbau sekundärer Alkansulfonate ist noch wenig untersucht, verläuft aber vermutlich

nach demselben Schema. Für n-Dodecan-2-sulfonat postulieren Thysse und Wanders

ebenfalls die Hydrolyse eines Bisulfits nach vorangegangener α-Oxygenierung (78).

4.A.3 Dioxygenierung und Desulfonierung aliphatischer Sulfonate

Der zugrunde liegende Reaktionsmechanismus unterscheidet sich nicht von dem der oben

skizzieten Monooxygenierung. Die bislang nur für aktivierte Alkansulfonate beschriebene α-

Ketoglutarat abhängige Dioxygenase führt ein Sauerstoffatom in das Alkansulfonat ein,

wobei wiederum ein instabiles Hydroxyalkansulfonat (Hydroxytaurin) entsteht, welches

spontan zu Aminoacetaldehyd und Sulfit zerfällt. Das andere Sauerstoffatom wird auf das

essentielle Co-Substrat α-KG übertragen, das oxidativ decarboxyliert wird unter Abspaltung

von Succinat (Abbildung 4B) (24) (35).

4.A.4 Desulfonierung aliphatischer Sulfonate über Mercaptane

In Zusammenhang mit der Degradation sulfonierter Aromaten durch Cyanobakterien

diskutieren Biedlingmaier und Schmidt eine Reduktion der Sulfonatgruppe als Vorbereitung

auf eine nicht näher charakterisierte Spaltung der C-S-Bindung der so erzeugten

Mercaptane (11). Ein derartiger Mechanismus ist bislang allerdings hypothetisch.

4.A.5 Induktion der Abbauaktivitäten

Die Enzyme des SSIS sind durchweg induzierbar bzw. werden effizient durch die

Anwesenheit bevorzugter Schwefelquellen reprimiert. Werden Alkansulfonate als C- und


Energiequelle genutzt, dann sind die beteiligten Enzyme meist auch induzierbar.

Rhodococcus- und Comamonasstämme zeigen ein solches Verhalten. Zellen, die mit

Propanol als C- und Energiequelle gewachsen sind bzw. mit den aktivierten Alkansulfonaten

Taurin oder Isethionat, die nicht über Monooxygenasen metabolisiert werden, können

Propansulfonat nicht umsetzen (67). Sowohl die Aktivitäten zum Abbau der Alkansulfonate

als auch die spezifischen Mechanismen zum Metabolismus des jeweiligen Alkansulfonattyps

unterliegen offenbar einer eigenen Regulation.

4.A.6 Substratspektren der am Abbau von Alkansulfonaten beteiligten Enzyme

Monooxygenasen:

Diese Enzyme scheinen über ein breiteres Substratspektrum zu verfügen (86). Die von

Thijesse und Wanders untersuchten Monooxygenasen setzen eine Reihe primärer und auch

sekundärer Alkansulfonate um. Die Enzyme aus Rhodococcus und Comamonas Stämmen

reagieren nicht nur mit Verbindungen, die das Zellwachstum unterstützen (Propan-,

Butansulfonat) (66), sondern auch mit 2-Propansulfonat und Ethansulfonat, deren

Stoffwechselprodukte (Aceton aus 2-Propansulfonat) akkumulieren (67). Offensichtlich

existiert hier ein Ausschlußprinzip zwischen der Verwertung von primären und sekundären

Alkansulfonaten als Wachstumssubstrate, wobei hierfür nicht die beiteiligten Oxygenasen

verantwortlich sind, sondern vielmehr die Architetktur bzw. Regulation nachgeschalteter

Abbauwege.

Die Substratspektren der einzelnen Monooxygenasen scheinen aber auch stark vom

jeweiligen Organismus abzuhängen. Die Methanmonooxygensase von Methylosulfomonas

methylovora Stamm M2 weist eine ausgeprägte Präferenz gegenüber Methansulfonat auf

Mit zunehmender Kettenlänge nehmen die Umsatzraten stark ab (33). Für C4-Alkansulfonate

werden keine Aktivitäten mehr gemessen. Demgegenüber steht das System aus C.

acidovorans P53 mit hohen Aktivitäten gegenüber C3 – C6 Alkansulfonaten.

Die sehr breiten Substratspektren der an der Desulfonierung unter SSIS-Bedingungen

beteiligten Monooxygenasesysteme sind bekannt (s.o.; (19) (25))

α-Ketoglutarat abhängige Dioxygenasen

Das Substratspektrum von TauD aus E. coli ist sehr eng (24). Das entsprechende Protein

aus Hefe (Saccharomyces cerevisiae) scheint demgegenüber weiter zu sein (35). Taurin ist

sogar ein schlechtes Substrat; Isethionat und Taurocholat sind die besten Substrate unter

den getesteten natürlich vorkommenden Alkansulfonaten. Darüberhinaus sind eine Reihe

synthetischer Alkansulfonate (MOPS, MOPSO, MES, TAPS) gute Substrate für das Enzym.

Bei letzt genannten Verbindungen handelt es sich um z.T. komplex substituierte Ethan- und

Propansulfonate. KM-Werte für den Substratumsatz liegen zwischen 0,2 und 5 mM, in

Abhängigkeit der jeweiligen Verbindung.

Transaminasen


Für die gereinigte Taurin:Pyruvat-Aminotransferase aus Bilophila wadsworthia wurde das

Substratspektrum bestimmt. Hypotaurin (218 % der Aktivität, die mit Taurin gemessen

wurde) stellte sich als ein besseres Substrat heraus als Taurin. Mit b-Alanin wurde 37 % der

Referenzaktivität beobachtet, mit Cystein nur noch 4 %. Dieses Niveau wird auch mit 3-

Aminopropansulfonat, dem einzigen weiteren Alkansulfonat, das dieses Enzym akzeptiert,

erreicht.

Sulfoacetaldehyd Sulfolyase

Die zur Verfügung stehenden Daten basieren auf Untersuchungen von Kondo und Ishimoto.

Die von ihnen gereinigte Sulfolyase setzte nur mit Sulfoacetaldehyd Sulfit frei. Eine Reihe

weiterer Sulfonate (Isethionat, Cysteat, Sulfoacetat, 2-Propen-1-sulfonat, p-

Hydroxybenzolsulfonat) wurden von diesem Enzym nicht als Substrat erkannt (51). Neuere

Untersuchungen zum Substratspektrum einer Sulfolyase deuten darauf hin, daß auch C3-

Verbindungen als Substrat erkannt werden (pers. Mitteilung Prof. Cook).

4.A.7 In Protein/Sequenzdatenbanken verfügbare Informantionen zu Enzymen

Tabelle 2 In Datenbanken verfügbare Informationen zu Proteinen mit Aklansulfonaten als Substrat.

Funktion Organismus Substrat Protein EC-Nr. Acc. Nr. Kategori

e

Transportsystem;

ABC-Typ; SSIS

E.coli MC4100 Taurin TauABC D85613

Sulfoacetaldehyd-

sulfolyase

Sulfoacetaldehyd 4.4.1.12 (51) (71)

Sulfosuccinat-MO Pseudomonas sp.

B1

Sulfosuccinat

Methansulfonat-

MO-System

Methylsulfomonas

methylovora M2

Methansulfonat AF091716 (36)

Taurin:α-

Ketoglutarat-

Transaminase

Achromobacter

superficialis

Taurin 2.6.1.55 (81) (89)

Taurin:Pyruvat -

Transaminase

Pseudomonas

aeruginosa

Taurin 2.6.1.- (70)

Taurin-

Dehydrogenase

keine Angaben Taurin 1.4.99.2 (52)

Flavinreduktase E. coli Flavine SsuE P80645 (25)

FMNH2-abhängige

Monooxygenase

E. coli Alkansulfonate SsuD P80644 (25)

α-KG-abhängige E. coli Taurin tauD


Taurin-

Dioxygenase

α-KG-abhängige

Isethionat/Taurocho

lat-Dioxygenase

S.cerevisiae Isethionat,

Taurocholat

Taurin

YLL057c Z73162 (35)

5. Organismen

Tabelle 3 Mikroorganismen, die Alkansulfonate mineralisieren


Alcaligenes sp Taurin (Aminoethansulfonat) (22)

Pseudomonas sp. B1 Sulfosuccinat (65)

Pseudomonas sp. n-Alkansulfonate (C4-C7) (C8-C9) (79)

Methylosulfomonas methylovora

Methylotrophe Organismen:

Methylosulfomonas

Marinosulfomonas

Hyphomicrobium

Methylobacterium

Methansulfonat (36)

Ralstonia Stamm EDS1

DSM 13640

Ethan-1,2-disulfonat, Propan-1,3-

disulfonat;

Taurin, Isethionat,

Sulfoacetaldehyd, Sulfoacetat,

Methansulfonat

(21)

Rhodococcus Stamm P40 Propan-, Butansulfonat; nicht

derivatisierte C3-C6-Alkansulfonate

(67)

Comamonas acidovorans Stamm P53

DSM 50251

Propan-, Butansulfonat; nicht

derivatisierte, lineare C3-C6-

Alkansulfonate

(67)

Pseudomonas aeruginosa Taurin (70)

Acinetobacter sp. Isethionat (47)


6. Sonstiges

keine Einträge


März 2001

8. Literatur:

Verwendete Bibliothek: Fusion.enl

1. Abbanat, D. R., E. R. Leadbetter, W. Godchaux III, and A. Escher. 1986.

Sulfonolipids are molecular determinants of gliding motility. Nature 324:367-369.

2. Adams, R. F. 1985. Ion-pair chromatography of pharmaceuticals. Chromatogr Sci

Ser 31:141-205.

3. Anderson, R., M. Kates, and B. E. Volcani. 1978. Identification of the sulfolipids in

the non-photosynthetic diatom Nitzschia alba. Biochimica et Biophysica Acta 528:89-106.

4. Autry, A. R., and J. W. Fitzgerald. 1990. Sulfonate S: A major form of forest soil

organic sulfur. Biology and Fertility of Soils 10:50-56.

5. Baker, S. C., D. P. Kelly, and J. C. Murrell. 1991. Microbial degradation of

methanesulphonic acid: a missing link in the biogeochemical sulphur cycle. Nature 350:627-

628.

6. Beil, S., M. Kertesz, T. Leisinger, and A. M. Cook. 1996. The assimilation of sulfur

from multiple sources and its correlation with expression of the sulfate-starvation induced

stimulon Pseudomonas putida S313. Microbiology 142:1989-1995.

7. Bieber, E. J., and B. J. Wilkinson. 1984. Sodium-dependent uptake of taurine in

encapsulated Staphylococcus aureus strain M. Biochimica et Biophysica Acta 770:127-135.

8. Biedlingmaier, S., and A. Schmidt. 1983. Alkylsulfonic acids and some S-

containing detergents as sulfur sources for growth of Chlorella fusca. Archives of

Microbiology 136:124-130.

9. Biedlingmaier, S., and A. Schmidt. 1986. Characterization of the non-constitutive

ethanesulfonate uptake in Chlorella fusca. Biochimica et Biophysica Acta 861:95-104.

10. Biedlingmaier, S., and A. Schmidt. 1987. Taurine transport in N-deprived Chlorella

fusca. Journal of Experimental Botany 38:1891-1900.


11. Biedlingmeier, S., and A. Schmidt. 1987. Uptake and utilization of sulfonic acids in

the cyanobacterial strains Anabaena variabilis and Plectonema 73110. Zeitschrift für

Naturforschung 42c:891-896.

12. Braun, R., and P. Fromageot. 1962. Désamination de la taurine par Aspergillus

niger. Biochimica et Biophysica Acta 62:548-555.

13. Budavari, S. 1989. The Merck Index, 11th ed. Merck & Co., Rahway, NJ.

14. Burlage, R. S., S. W. Hooper, and G. S. Sayler. 1989. The TOL (pWW0) catabolic

plasmid. Applied and Environmental Microbiology 55:1323-1328.

15. Busby, W. F. 1966. Sulfoporpanedial and cysteinolic acid in the diatom. Biochim

Biophys Acta 121:160-161.

16. Chien, C.-C., E. R. Leadbetter, and W. Godchaux III. 1995. Sulfonate-sulfur can be

assimilated for fermentative growth. FEMS Microbiology Letters 129:189-194.

17. Chien, C.-C., E. R. Leadbetter, and W. Godchaux , III. 1995. Sulfonate-sulfur can

be assimilated for fermentative growth. FEMS Microbiology Letters 129:189-194.

18. Chien, C.-C., E. R. Leadbetter, and W. Godchaux, III. 1997. Taurine-sulfur

assimilation and taurine-pyruvate aminotransferase activity in anaerobic bacteria. Applied

and Environmental Microbiology 63:3021-3024.

19. Cook, A. M., H. Laue, and F. Junker. 1999. Microbial desulfonation. FEMS

Microbiological Reviews 22:399-419.


arylsulfonates by Clostridium spp. Archives of Microbiology 167:177-181.

21. Denger, K., and A. M. Cook. 2001. Ethanedisulfonate degraded via

sulfoacetaldehyde in Ralstonia sp. strain EDS1. Archives of Microbiology submitted.

22. Denger, K., H. Laue, and A. M. Cook. 1997. Anaerobic taurine oxidation: a novel

reaction by a nitrate-reducing Alcaligenes sp. Microbiology 143:1919-1924.

23. Denger, K., E. Stackebrandt, and A. M. Cook. 1999. Desulfonispora

thiosulfatigenes gen. nov., sp. nov., a taurine fermenting, thiosulfate-producing anaerobic

bacterium. International Journal of Systematic Bacteriology 49:1599-1603.

24. Eichhorn, E., J. R. van der Ploeg, M. A. Kertesz, and T. Leisinger. 1997.

Characterization of α-ketoglutarate-dependent taurine dioxygenase from Escherichia coli.

The Journal of Biological Chemistry 272:23031-23036.

25. Eichhorn, E., J. R. van der Ploeg, and T. Leisinger. 1999. Characterization of a

two-component alkanesulfonate monooxygenase from Escherichia coli. J Biol Chem

274:26639-26646.

26. Eichhorn, E., J. R. van der Ploeg, and T. Leisinger. 2000. Deletion analysis of the

Escherichia coli taurine and alkanesulfonate transport systems. J Bacteriol 182:2687-2695.


27. Fall, R. R., J. L. Brown, and T. L. Schaeffer. 1979. Enzyme recruitment allows the

biodegradationof recalcitrant branched hydrocarbons by Pseudomonas citronellolis. Applied

and Environmental Microbiology 38:715-722.

28. Godchaux, W., III, and E. R. Leadbetter. 1980. Capnocytophaga spp. contain

sulfonolipids that are novel in procaryotes. Journal of Bacteriology 144:592-602.

29. Graupner, M., H. Xu, and R. H. White. 2000. Identification of an archaeal 2-hydroxy

acid dehydrogenase catalyzing reactions involved in coenzyme biosynthesis in

methanoarchaea. J Bacteriol 182:3688-3692.

30. Gupta, S. D., and P. S. Sastry. 1988. The biosynthesis of

sulfoquinovosyldiacylglycerol: studies with groundnut (Arachis hypogaea) leaves. Arch

Biochem Biophys 260:125-133.

31. Hales, S. G. 1993. Biodegradation of the anionic surfactant dialkyl sulphosuccinate.

Environmental Toxicology and Chemistry 12:1821-1828.

32. Harwood, J. L., and R. G. Nicholls. 1979. The plant sulpholipid-- a major

component of the sulphur cycle. Biochem Soc Trans 7:440-447.

33. Higgins, T. P., M. Davey, J. Trickett, D. P. Kelly, and J. C. Murrell. 1996.

Metabolism of methanesulfonic acid involves a multicomponent monooxygenase enzyme.


34. Higgins, T. P., P. De Marco, and J. C. Murrell. 1997. Purification and molecular

characterization of the electron transfer protein of methanesulfonic acid monooxygenase. J

Bacteriol 179:1974-1979.

35. Hogan, D. A., T. A. Auchtung, and R. P. Hausinger. 1999. Cloning and

characterization of a sulfonate/alpha-ketoglutarate dioxygenase from Saccharomyces

cerevisiae. J Bacteriol 181:5876-5879.

36. Holmes, A. S., D. P. Kelly, S. C. Baker, A. S. Thompson, P. De Marco, E. M.

Kenna, and J. C. Murrell. 1997. Methylsulfomonas methylovora gen. nov., sp. nov., and

Marinosulfomonas methylotropha gen. nov., sp. nov. Novel methylotrophs able to grow on

methanesulfonic acid. Archives of Microbiology 167:46-53.

37. Holst, P. B., S. E. Nielsen, U. Anthoni, K. S. Bisht, C. Christophersen, S. Gupta,

V. S. Parmar, P. H. Nielsen, D. B. Sahoo, and A. Singh. 1994. Isethionate in certain red

algae. J Appl Phycol 6:443-446.

38. Huxtable, R. J. 1992. Physiological actions of taurine. Physiological Reviews 72:101-

163.

39. Jrgensen, B. B. 1990. A thiosulfate shunt in the sulfur cycle of marine sediments.

Science 249:152-154.

40. Kelly, A. P., and L. L. Weed. 1965. Taurine as a constituent of a bacterial cell wall.

Journal of Biological Chemistry 240:2519-2523.


41. Kelly, D. P., S. C. Baker, J. Trickett, M. Davey, and J. C. Murell. 1994.

Methanesulphonate utilization by a novel methylotrophic bacterium involves an unusual

monooxygenase. Microbiology 140:1419-1426.

42. Kelly, D. P., and J. C. Murrell. 1996. Metabolism of methanesulfonic acid, p. 33-40.

In M. E. Lidstrom and F. R. Tabita (ed.), Microbial growth on C1 compounds. Kluwer,

Dordrecht.

43. Kelly, D. P., and J. C. Murrell. 1999. Microbial metabolism of methanesulfonic acid.

Archives of Microbiology 172:341-348.

44. Kertesz, M. A. 1999. Riding the sulfur cycle - metabolism of sulfonates and sulfate

esters in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiological Reviews 24:135-175.

45. Kertesz, M. A., A. M. Cook, and T. Leisinger. 1994. Microbial metabolism of sulfur-

and phosphorus-containing xenobiotics. FEMS Microbiological Reviews 15:195-215.

46. Kertesz, M. A., W. Rist, K. Schmidt-Larbig, and T. Wüest. 1998. A novel FMNH2-

dependent methanesulfonate monooxygenase encoded by the sulfur regulated msu-operon

of Pseudomonas aeruginosa. unpublished data.

47. King, J. E., R. Jaouhari, and J. P. Quinn. 1997. The role of sulfoacetaldehyde

sulfo-lyase in the mineralization of isethionate by an environmental Acinetobacter isolate.


48. King, J. E., and J. P. Quinn. 1997. Metabolism of sulfoacetate by environmental

Aureobacterium sp. and Comamonas acidovorans isolates. Microbiology 143:3907-3912.

49. King, J. E., and J. P. Quinn. 1997. The utilization of organosulphonates by soil and

freshwater bacteria. Letters in Applied Microbiology 24:474-478.

50. Koechlin, B. A. 1954. The isolation and identification of the major anion fraction of

the axoplasm of squid giant nerve fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences

of the United States of America 40:60-62.

51. Kondo, H., and M. Ishimoto. 1975. Purification and properties of sulfoacetaldehyde

sulfo-lyase, a thiamine pyrophosphate-dependent enzyme forming sulfite and acetate.

Journal of Biochemistry. 78:311-325.

52. Kondo, H., and M. Ishimoto. 1987. Taurine dehydrogenase. Methods in

Enzymology 143:496-499.

53. Kondo, H., H. Niki, S. Takahashi, and M. Ishimoto. 1977. Enzymatic oxidation of

isethionate to sulfoacetaldehyde in bacterial extract. J Biochem (Tokyo) 81:1911-1916.

54. Kosswig, K., and H. Stache (ed.). 1993. Die Tenside. Carl Hanser Verlag,

München.

55. Laue, H. 2000. Biochemical and molecular characterization of taurine metabolism in

the anaerobic bacterium Bilophila wadsworthia. Doctoral. University of Konstanz, Konstanz.


56. Laue, H., and A. M. Cook. 2000. Biochemical and molecular characterization of

taurine:pyruvate aminotransferase from the anaerobe Bilophila wadsworthia. Eur J Biochem

267:6841-6848.

57. Laue, H., and A. M. Cook. 2000. Purification, properties and primary structure of

alanine dehydrogenase involved in taurine metabolism in the anaerobe Bilophila

wadsworthia. Arch Microbiol 174:162-167.

58. Laue, H., K. Denger, and A. M. Cook. 1997. Fermentation of cysteate by a sulfate-

reducing bacterium. Archives of Microbiology 168:210-214.

59. Laue, H., K. Denger, and A. M. Cook. 1997. Taurine reduction in anaerobic

respiration of Bilophila wadsworthia RZATAU. Applied and Environmental Microbiology

63:2016-2021.

60. Laue, H., M. Friedrich, J. Ruff, and A. M. Cook. 2001. Dissimilatory Sulfite

Reductase (Desulfoviridin) of the Taurine- Degrading, Non-Sulfate-Reducing Bacterium

Bilophila wadsworthia RZATAU Contains a Fused DsrB-DsrD Subunit. J Bacteriol 183:1727-

1733.

61. Lie, T. J., J. R. Leadbetter, and E. R. Leadbetter. 1998. Metabolism of sulfonic

acids and other organosulfur compounds by sulfate-reducing bacteria. Geomicrobiology

Journal 15:135-149.

62. Lie, T. J., T. Pitta, E. R. Leadbetter, W. Godchaux, III, and J. R. Leadbetter. 1996.

Sulfonates: novel electron acceptors in anaerobic respiration. Archives of Microbiology

166:204-210.

63. Martelli, H. L., and A. A. Benson. 1964. Sulfocarbohydrate metabolism 1. Bacterial

production and utilization of sulfoacetate. Biochimica et Biophysica Acta 93:169-171.

64. Mikosch, C. A. R. M., K. Denger, E.-M. Schäfer, and A. M. Cook. 1999. Anaerobic

oxidation of cysteate: degradation via L-cysteate:2-oxoglutarate aminotransferase in

Paracoccus pantotrophus. Microbiology 145:1153-1160.

65. Quick, A., N. J. Russell, S. G. Hales, and G. F. White. 1994. Biodegradation of

sulphosuccinate: direct desulphonation of a secondary sulphonate. Microbiology 140:2991-

2998.

66. Reichenbecher, W., D. P. Kelly, and J. C. Murrell. 1999. Desulfonation of

propanesulfonic acid by Comamonas acidovorans strain P53: evidence for an

alkanesulfonate sulfonatase and an atypical sulfite dehydrogenase. Archives of Microbiology

172:387-392.

67. Reichenbecher, W., and J. C. Murrell. 1999. Linear alkylsulfonates as carbon and

energy sources for gram-positive and gram negative bacteria. Archives of Microbiology

171:430-438.


68. Rein, U. 1999. Abbauweg(e) für Cysteat bei anaeroben Bakterien. Diplomarbeit.

University of Konstanz.

69. Seitz, A. P., E. R. Leadbetter, and W. Godchaux III. 1993. Utilization of sulfonates

as sole sulfur source by soil bacteria including Comamonas acidovorans. Archives of


70. Shimamoto, G., and R. S. Berk. 1979. Catabolism of taurine in Pseudomonas

aeruginosa. Biochimica Biophysica Acta 569:287-292.

71. Shimamoto, G., and R. S. Berk. 1980. Taurine catabolism II. Biochemical and

genetic evidence for sulfoacetaldehyde sulfo-lyase involvement. Biochimica et Biophysica

Acta 632:121-130.

72. Smiley, D. W., and B. J. Wilkinson. 1983. Survey of taurine uptake and metabolism

in Staphylococcus aureus. J Gen Microbiol 129:2421-2428.

73. Soberón-Chávez, G., J. Campos, A. Haidour, J. L. Ramos, and J. Ortigoza. 1996.

Selection and prelimnary characterization of a Pseudomonas aeruginosa strain mineralizing

selected isomers in a branched-chain dodecylbenzenesulphonate mixture. World Journal of

Microbiology & Biotechnology 12:367-372.

74. Stapley, E. O., and R. L. Starkey. 1970. Decomposition of cysteic acid and taurine

by soil microorganisms. Journal of General Microbiology 64:77-84.

75. Stevenson, F. J. 1996. Humus chemistry: genesis composition reactions. Wiley,

New York.

76. Taylor, C. D., and R. S. Wolfe. 1974. Structure and methylation of Coenzyme M

(HSCH2CH2SO3). J. Biol. Chem. 249:4879-4885.

77. Thompson, A. S., N. J. P. Owens, and J. C. Murell. 1995. Isolation and

Characterization of Methanesulfonic Acid-Degrading Bacteria from the Marine Environment.

Applied and Environmental Microbiology 61:2388-2393.

78. Thysse, G. J. E., and T. H. Wanders. 1972. Degradation of n -alkane-1-sulfonates

by Pseudomonas. Antonie van Leeuwenhoek 38:53-63.

79. Thysse, G. J. E., and T. H. Wanders. 1974. Initial steps in the degradation of n -

alkane-1-sulphonates by Pseudomonas. Antonie van Leeuwenhoek 40:25-37.

80. Toyama, S., H. Misono, and K. Soda. 1972. Crystalline taurine : α-ketoglutarate

aminotransferase from Achromobacter superficialis. Biochemical and Biophysical Research

Communications 46:1374-1379.

81. Toyama, S., and K. Soda. 1972. Occurence of taurine : α-ketoglutarate

aminotransferase in bacterial extracts. Journal of Bacteriology 109:533-538.

82. Uria-Nickelsen, M. R., E. R. Leadbetter, and W. Godchaux III. 1993. Sulfonate

utilization by enteric bacteria. Journal of General Microbiology 139:203-208.


83. Uria-Nickelsen, M. R., E. R. Leadbetter, and W. Godchaux. 1993. Sulfonate-sulfur

assimilation by yeasts resembles that of bacteria. FEMS Microbiology Letters 114:73-78.

84. Uria-Nickelsen, M. R., E. R. Leadbetter, and W. Godchaux. 1994. Sulfonate-sulfur

utilization involves a portion of the assimilatory sulfate reduction pathway in Escherichia coli.

FEMS Microbiology Letters 123:43-48.

85. Uria-Nickelson, M. R., W. Godchaux, and E. R. Leadbetter. 1994. Comparitive

aspects of utilization of sulfonate and other sulfur sources by Escherichia coli K12. Archives

of Microbiology 161:434-438.

86. van der Ploeg, J. R., N. J. Cummings, T. Leisinger, and I. F. Connerton. 1998.

Bacillus subtilis genes for the utilization of sulfur from aliphatic sulfonates. Microbiology

144:2555-2561.

87. Wagner, F. C., and E. E. Reid. 1931. The stability of the carbon-sulfur bond in some

aliphatic sulfonic acids. Journal of the American Chemical Society 53:3407-3413.

88. Weinstein, C. L., and O. W. Griffith. 1988. Cysteinesulfonate and beta-

sulfopyruvate metabolism. Partitioning between decarboxylation, transamination, and

reduction pathways. J Biol Chem 263:3735-3743.

89. Yonaha, K., S. Toyama, and K. Soda. 1985. Taurine-glutamate transaminase.

Methods in Enzymology 113:102-108.

ANLAGE 8

Methodischer Teil: Direkthilfen für das interaktive Arbeiten am Computer

Arbeitsanweisung:Einarbeitung von wissenschaftlichen Publikationen in ein neues Modul

1. Literaturrecherche zu Bioabbaudaten für die entsprechende Stoffklasse1.1. Suche der vorhandenen Artikel über die projektintern aufgebaute ‚ReferenceManager‘- Literaturdatenbank auf M:/Work/Literatur/Z570 Literatur.rmd1.2. Suche ergänzender Artikel in den per BASF-Intranet verfügbarenLiteraturdatenbanken : Medline 66-01 und Current contents 97-01(http://www.sirius.basf-ag.de/deutsch/ovidweb.htm.) Die verwertbaren Referenzenwurden als Papierkopie bestellt und abgelegt. Mit der OPAC Datenbank(http://www.sirius.basf-ag.de/opac/uopacsrc.htm) wurden hierfür die Standorte vielerZeitschriften innerhalb der BASF nachgeschlagen und die brauchbaren Artikel dorteingesehen oder bestellt.

2. Ablage der wissenschaftlichen PublikationDie verfügbaren Kopien der verwendeten Artikel wurden unter der Ablage „ProjektLiteratur“ abgelegt. Zuvor wurden diese Referenzen in die Datenbank Z 570Litertur.rmd des Reference Managers übernommen (Einzelheiten sieheREFERENCE MANAGER.doc). Die einzelnen wissenschaftlichen Publikationenwaren hierfür mit einer eindeutigen ID-Nummer zu versehen und entsprechenddieser Nummern geordnet.

3. Auswertung der PublikationDie Daten der Artikel wurden in der Literaturdatenbank möglichst vollständig undzitierfähig zusammengefasst. Im Reference Manager wurden der Name desbetroffenen Moduls (Chemikalienklasse) und die entsprechenden Schlagwortevermerkt.In der BISS-Datenbank wurden die zu einem Stoff bekannten Abbauwege undAbbaudaten stichwortartig mit entsprechenden Literaturzitaten eingetragen.Das zusammengetragene Wissen wurde in Form eines Berichts zu jedem Modul mitden entsprechenden Referenzen zusammengefasst.

Arbeitsanweisung:

BASIS-Recherche

Stoffsuche in der Biss-Datenbank mit der Software ISIS for Excel

Sie möchten eine Struktur und/oder ähnliche Strukturen suchen und mit derenAbbaudaten ein Excel-sheet (und eine Excelgrafik) erzeugen.

Suche nach einer Struktur

Öffnen Sie Excel.Clicken Sie auf das Tool Open database (links) oder auf das Menü ISIS und dannOpen database. Clicken Sie auf Browse und suchen Sie nach der Datenbank :M:\WORK\Biolink\Biss.db. Clicken Sie auf OK.Ein Search Biss Fenster ist jetzt geöffnet. Clicken Sie zuerst auf Clear Query(rechts). Dort wo REGNO angezeigt wird, mit dem Pfeil das Feld MOLSTRUCTUREwählen. Clicken Sie dann auf Edit Cell... (unten)Doppelclicken Sie auf das große weiße Feld, in welches die Struktur gezeichnetwerden soll, oder clicken Sie auf Edit Structure...Ein ISIS/Draw Fenster wird geöffnet und Sie können jetzt Ihre Struktur zeichnen.Anschließend auf das Tool in der linken oberen Ecke clicken.Ein Fenster Name The Structure ist jetzt offen, und Sie können der Struktur einenNamen geben (und Speichern) oder einfach bei query1 belassen. Die Persistencekann auf Temporary bleiben. Clicken Sie auf OK.Ihre Struktur steht jetzt im richtigen Feld. Weiterhin kann in dem geöffneten Fensterunter Condition: substructure (Substruktursuche) etc. gewählt werden, und unterStructure: wird der Name der Struktur (oder query1) angezeigt. Clicken Sie auf OK.Sie kehren zurück zum Search Biss Fenster. Clicken Sie auf Search.Nach ein paar Sekunden erscheint ein Search Results Fenster mit der Anzahl dergefundenen Strukturen. Clicken Sie auf OK.

Arbeitsanweisung:

Ein Excel-Sheet erzeugen, in dem Struktur und Abbaudaten angezeigt werden

Ein Retrieve Data Fenster ist zu öffnen. Sie sind in Define Table. Falls unter Columnsdie Felder IUPAC_NME, MOLSTRUCTURE und die gewünschtenMETHODE_ABBAUDATEN schon aufgelistet sind (eventl.von letzter Recherchenoch vorhanden), können Sie sofort auf OK clicken, und zum Punkt 12 gehen.Ansonsten clicken Sie in Table Definition auf Clear und dann auf Ja oder aufRemove all.Nun können Sie sich die gewünschten Felder in Available Fields markieren :IUPAC_NME, MOLSTRUCTURE und die gewünschten METHODE_ABBAUDATENund mit der Add Taste übernehmen. Clicken Sie auf OK. Ein Excel-sheet mit den gewünschten Daten wird erstellt. Es kann sein, daß dieStruktur des Query die Übersicht ein verhindert, dann sollten Sie auf die erste Zelleder ersten Spalte clicken und mit der Taste Entfernen die Suchstruktur löschen.Sie können die Daten (z.B.Abbaugrad) sortieren : clicken Sie auf das Menü Data,Sort, und wählen Sie diejenigen Daten, die geordnet werden sollen.Die Daten sind jetzt alle sortiert, nur die Strukturen nicht. Clicken Sie auf eineStruktur und dann auf das Menü Format, Structure, Relink structure to cell.

Eine Excel-Grafik erzeugen

15. Markieren Sie die Spalten IUPAC_NME und die gewünschten METHODE_ABBAUDATEN mit Hilfe der Strg Taste und der Maus.16. Clicken Sie auf das Tool Diagramm-Assistent.17. Nun kann man den gewünschen Diagrammtyp auswählen und Diagrammtitel,Achsenbeschriftungen etc. vornehmen .

Sie haben jetzt eine Excel-Grafik erzeugt, in dem Ihre Suchstruktur undSubstrukturen in Form von Substanznamen (IUPAC- /Trivial-) mit deren Abbaudatenangezeigt werden. Wenn Sie die Molekülstrukturen auf der Grafik sehen wollen,müssen Sie sie einzeln kopieren, einfügen und an die richtige Stelle in der Kurveablegen.

BISS-Datenbank: Zusätzliche Funktionen

Formblattwechsel durch Anklicken des Formblattnamens.

Neue Funktionen der rot unterlegten Buttons:

Im Formblatt StructureButton BISS info -> Info-Formblatt der BISS DatenbankButton Return to Database -> zurück zum Formblatt StructureButton 3 D -> aus der gespeicherten 2 D -Struktur wird eine optimierte 3 D-Strukturhergestellt (mit WebLabViewer und MOPAC), die automatisch in der Datenbankgespeichert wird.Im Formblatt BiodegradationButton rotes Kreuz in rechter Spalte im Browse Modus-> Sprung zum Formblattdegcurve, wo automatisch eine Abbaukurve erstellt wird, falls Rohdaten vorhandensind. Button Return to Biodegradation Test results -> zurück zum FormblattBiodegradationIm Formblatt Metabolism (aerobe)Button Tree -> ein Metabolismus-Baum wird anhand aller Umsetzungen dieserDatenbank hergestellt.(z.Z. noch nicht verfügbar)Button Parent(s) -> alle Strukturen dieser Datenbank, von welchen diese Verbindung(current compound) ein Metabolit ist, werden gesuchtButton Metabolite(s) -> alle Metaboliten dieser Verbindung (current compound)werden aus der Datenbank gesucht.Im Formblatt PredictionsButton Predictions for Current Compounds -> Berechnung von Biodeg-Ergebnissen,Modulerkennung mit Abbauvorhersage z.T. mit Links zu DokumentenButton Predictions for Current List -> siehe 1.Button Predictions for whole DataBase -> siehe 1.Button Biodeg linear -> Struktur und Substruktur, die zur Abbauvorhersage beitragenwerden gezeigt.Button Return to Prediction -> zurück zum Formblatt PredictionsAuf die Frage, ob dieses Formblatt gespeichert werden soll, soll mit nein geantwortetwerden.

Rorije et al. Biodegradability of Imidazoles 21-03-2001

1 of 16

ANLAGE: 9Prediction of Biodegradability from

Structure: Imidazoles

Emiel Rorije1*, Florence Germa1, Bodo Philipp2, Bernhard Schink2

and Dieter B. Beimborn1,

1. Regulations Toxicology and Ecology, BASF AG, Ludwigshafen, Germany.

2. Laboratory for Microbial Ecology, Department of Biology, University of

Konstanz, Konstanz, Germany.

* Author to whom correspondence should be sent:

Emiel Rorije

BASF AG, Regulations Toxicology and Ecology

Building Z570

D-67056 Ludwigshafen

Germany

e-mail: [email protected]

tel. 00-49-621-6058224

fax. 00-49-621-6058043


2 of 16

Running title: Biodegradability of Imidazoles


3 of 16

ABSTRACT

A project for the development of Structure-Activity Relationships for

Biodegradation is presented. The aim of the project is to assemble sets of

structural rules governing the potential microbial degradability of (classes of)

chemicals. These rules will provide tools to take into account the biodegradation

aspects of a product – and all precursors in the production process - early on in

the product development. The modeling concept is to take all experimental

biodegradation data available and combine structural trends in the data with

mechanistical information from degradation pathways. The rules that are

derived should give insight into the possibility of biodegradation for specific

classes of chemicals, thereby revealing why a compound is biodegradable or

not.

For the class of imidazole derivatives such rules are derived, and a model

degradation mechanism is proposed in analogy to the urocanate-hydratase

mechanism from histidine metabolism. The model is validated using 12

imidazole-compounds, which were all predicted correctly to be poorly

biodegradable, based on their substituent patterns. It is demonstrated that both

data analysis and information on enzymatic reaction mechanisms are

necessary to yield valid Structure Biodegradation Relationships.

Keywords: structure-activity relationships; biodegradation; imidazoles;

histidine; urocanate-hydratase.


4 of 16

INTRODUCTION

Biodegradability highly determines the persistence of chemicals in our

environment. The ability of ambient microorganisms to utilize chemicals as

nutrient sources secures the transformation of many man-made chemicals that

enter the environment. If and how a chemical is biodegraded in the environment

will often determine for a large part the overall environmental fate of a chemical.

The potential of a chemical to be biodegraded also determines wether

production process wastes can be treated in an industrial waste-water treatment

plant, or have to be treated with other (often more cost-intensive) chemical

waste processing methods. Testing the biodegradability of compounds is

however tedious and time-consuming, and negative results in a specific

(standardized) test do not necessarily mean that a compound is not

biodegradable. This makes it difficult (time- and cost-intensive) to take the

biodegradability of research candidates for new products into account at a very

early stage of product development. Therefore, reliable predictions of the

biodegradability in the environment of chemicals, based on their chemical

structure, would be very useful in risk assessment and environmental fate

analyses of existing chemicals. Even more convenient would these predictions

be in the development of new chemicals and production processes, where

models can give information about chemicals that have not even been

synthesized yet.


5 of 16

A BASF project has therefore been initiated, to gather all available information

on biodegradation behaviour of chemicals – test results as well as metabolism

information - and to look for trends in the data for specific classes of chemicals.

External partners are the Laboratory for Microbial Ecology from the University of

Konstanz, and the Laboratory for Toxicology and Ecotoxicology from the

University of Trier. It is not the aim of the project to develop general, statistical

models with a broad applicability, which give a certain probabilty that a chemical

will be biodegradable or not biodegradable in a specific test, since such models

have already been the subject of much research in the past [1-5]. Such models

do not fulfill the specific need for more fundamental understanding of

biodegradability [1-3], which is required in the selection and proposal of

research candidates in the development of new products.

The aim of the project is therefore to develop mechanistically based

(substructure) models for classes of chemicals which are thought to biodegrade

via a common degradation pathway or mechanism. As an example of our

approach, one of these newly developed models is presented here, for the class

of imidazole compounds.


6 of 16

BIODEGRADATION DATABASE

For this project a database has been assembled gathering all available data on

biodegradation test results, physico-chemical data and metabolic pathway

information. This database contains at the moment information on almost 5000

compounds, with chemical structures assigned to over 4000 compounds of

these, and the results of more than 15000 separate biodegradation tests.

Metabolic information comes from single literature references as well as from

combined available resources such as the Boehringer Metabolism Pathways [6]

and the Bioremediation and Biodegradation Database [7]. The database can be

searched on substructures and chemical similarity, making it easy to assemble

homologous series of chemicals, which can then be analyzed on biodegradation

trends.

For validation purposes the german environmental protection agency

(UmweltBundesAmt [8]) has provided the project with a database of 1363

compounds with their chemical structures and biodegradation test results, which

were provided for the registration of new chemicals on the german market in the

past years. These data are confidential, and are therefore only used to validate

our findings within the project. The data (structures and biodegradation test

results) can not be shown.


7 of 16

DATA ANALYSIS

A search for imidazole derivatives in our database yielded 23 compounds

containing an imidazole ring. Two of these were dyes and one was a polymer.

Since these compounds are expected to be non-biodegradable by purpose, and

as biological degradation is greatly hindered by the mere size of these

compounds, they are discarded from the Structure-Biodegradation Relationship

(SBR) analysis. This leaves a set of 20 different imidazole derivatives with their

biodegradation data. The most relevant quantitive data for these 20 structures

are shown in figure 1.

FIGURE 1 HERE

The following observations are made:

• Imidazole and its ring-C-substituted derivatives with methyl-, ethyl-, and

isopropyl-substituents are ultimately biodegradable.

• Phenyl-, cyano- and nitro-substituted imidazoles seem to be poorly

biodegradable.

• All N-substituted imidazole derivatives are poorly biodegradable.


8 of 16

MECHANISTIC INFORMATION

Literature research on biodegradation pathways of imidazole derivatives led us

to the histidine metabolism [6,9,10]. Catabolic pathways for substituted

imidazole compounds may be similar to the breakdown of urocanate, the first

metabolite in the histidine biodegradation pathway [9,10]. Below, in figure 2, the

proposed biodegradation pathway for the breakdown of substituted imidazole-

ring compounds is given, in close analogy to the histidine degradation pathway.

FIGURE 2 HERE

The details of the enzymatic mechanism of the urocanase attack is shown in

figure 3, as proposed by Klepp et al. The product of the hydratase of urocanate

is a 5-oxoimidazole derivative, which is subject to (abiotic) hydrolytic cleavage

and ring opening. The oxo-substituent of the product greatly reduces the

aromatic character of the imidazole ring, enabling cleavage of the ring structure,

which is necessary for further microbial degradation.

FIGURE 3 HERE

The hydratase mechanism as shown in figure 3 involves electronic

rearrangements of the imidazole ring system, induced by an electrophilic attack

of urocanase-bound NAD+. The imidazol-ring will be deactivated towards attack


9 of 16

of NAD+ by substituents, like nitro-, cyano- or halogen-groups, having an

negative electronic effect on the ring, either through inductive or resonance

effects. The attack on the imidazole ring will be activated by electron-donating

substituents, like alkyl-, amino- or hydroxyl-groups. The fact that not imidazole,

but 2-ethylimidazole is the most readily biodegraded substance in our series

(see figure 1) also indicates that the imidazole ring can possibly be activated

towards electrophilic attack, making the methyl-, ethyl-, and even

isopropylimidazoles better biodegradable than their mother compound

imidazole.

Combination of the data analyis and the mechanistic information leads to the

following rule for predicting the biodegradability of imidazoles in general:

Imidazole derivatives are biodegradable in the aquatic environment, if the

substituents are:

a) attached to the imidazole-ring carbon atoms, and

b) do not have an electron-withdrawing effect on the imidazole ring through

resonance- or inductive-effects.

VALIDATION

The above formulated rule was externally validated with all compounds in the

UBA-database [8] containing an imidazole ring. 12 compounds with an


10 of 16

imidazole ring were present. All of them were correctly predicted as poorly

biodegradable, because of their substitution patterns and/or their calculated

atomic HOMO electron density at the carbon 4 or 5 position of the imidazole

ring. Details of the validation data cannot be shown because of the

confidentiality of the data.

DISCUSSION

Only looking at the proposed degradation mechanism for imidazole-derivatives

(figure 2 and 3), it is not obvious that 1-N-substituted imidazoles will be

hindered in their degradation via a urocanase-like metabolism. Similarly it is not

obvious from the data-analysis that all C-substituents on the imidazole ring that

have an electron withdrawing effect through resonance or induction will

deactivate the imidazole ring towards NAD+ attack, thus making biodegradation

more difficult.

2-phenyl-imidazole is poorly biodegradable compound, whereas the imidazole-

ring substituent is not considered to be electron-withdrawing. This seems to be

contradicting the above formulated rules. Preliminary results of quantum-

chemical calculations performed on this set of imidazoles (results not shown)

indicate that the 2-phenyl-substituent to the imidazole ring is not overall

electron-withdrawing, but that this substituent has a very distinguished local

electron-withdrawing effect on the 4- and 5-imidazole ring positition, exactly


11 of 16

those positions which would be prone to a electrophilic attack by urocanase-

bound NAD+.

Apparently, N-substitution of the imidazole ring can block the urocanase

mechanism completely. From the preliminary results of the quantum-chemical

calculations it is concluded that the N-substitution does not decrease the

biodegradablity of the imidazole ring by making the ring less susceptible to

electrophilic attack. Possibly imidazole N-substitution hinders the degradation

mechanism by disabling the electronic rearrangements in the imidazole ring in

the reaction steps after the nucleophilic attack of the urocanase bound NAD+

(see figure 3, steps 3 and 4).

For the class of imidazoles it is shown that it is necessary to use both data-

analysis (statistical and/or manual methods) and interpret information from

catabolic mechanisms, to come up with meaningful structural rules for

biodegradation, which have general validity and thus predictive value.

OUTLOOK

The validation performed with 12 imidazole derivatives from the UBA-database

is very limited, since no biodegradable compounds were present in this

database. At present the model can therefore only be validated for predictions

of non-biodegradability. Some compounds which should be biodegradable

according to our rules will be tested in our laboratory in the future (given their


12 of 16

availability), to validate the ability of the model to also predict biodegradability of

imidazole derivatives.

Within the project several classes of chemicals have been analysed, a.o. N-

heterocyclic compounds (of which the imidazoles are a part) [11], sulfonated

aromatic and sulfonated aliphatic compounds [12], and nitro-aromatic

compounds to name a few. As the project continuous more classes of

chemicals will be analyzed and rules for their biodegradation will be established.

By identifying the possibility or impossibility of biological attack for specific

classes of compounds, it should in time even become feasable to make reliable

predictions for complex compounds, which might belong to several classes at

once.

Acknowledgements

This project was financially supported by the German Ministry of Education and

Science (BMBF). This help is greatfully acknowledged.

References

[1] Parsons, J.R., and Govers, H.A. (1990) Quantitative Structure-Activity

Relationships for Biodegradation. Ecotoxicology & Environmental Safety,

19, 212 – 227.


13 of 16

[2] Rorije, E., Langenberg, J.H., and Peijnenburg, W.J.G.M. (1995) Chapter 6:

QSARs for Biodegradation, in Overview of structure-activity relationships

for environmental endpoints. Report of the EU-DGXII Project QSAR for

Predicting Fate and Effects of Chemicals in the Environment, ed. JLM

Hermens, Brussels.

[3] Langenberg, J.H., Peijnenburg, W.J.G.M., and Rorije, E. (1996) On the

Usefulness and Reliability of Existing Qsbrs for Risk Assessment and

Priority Setting, SAR & QSAR in Environmental Research, 5, 1-16.

[4] Loonen, H., Lindgren, F., Hansen, B., Karcher, W., Niemela, J., Hiromatsu,

K., Takatsuki, M., Peijnenburg, W.J.G.M., Rorije, E., and Struijs J. (1999)

Prediction of biodegradability from chemical structure: Modeling of ready

biodegradation test data. Environmental Toxicology & Chemistry, 18,

1763-1768.

[5] Rorije, E., Loonen, H., Müller, M., Klopman, G., and Peijnenburg,

W.J.G.M. (1999) Evaluation and application of models for the prediction of

ready biodegradability in the MITI-I test. Chemosphere, 38, 1409-1417.

[6] Boehringer Mannheim Biochemical Pathways on the ExPASy server,

Geneva, Switzerland. [www http://www.expasy.ch/cgi-bin/search-biochem-

index]

[7] The University of Minnesota Biodegradation and Bioremediation Database

(UMBBD). [www http://dragon.labmed.umn.edu/umbbd/index.html]

[8] UmweltBundesAmt, UBA (2000) Daten für neue Stoffen under dem

Chemikalien Gesetz. Berlin, Germany.


14 of 16

[9] Lengeler J.W., Drews G., Schlegel, H.G. (1999) Biology of the

Prokaryotes. Thieme, Stuttgart, XXVII.

[10] Klepp, J., Fallert-Muller, A., Grimm, K., Hull, W.E., and Retey, J. (1990)

Mechanism of action of urocanase. Specific 13C-labelling of the prosthetic

NAD+ and revision of the structure of its adduct with imidazolylpropionate.

European Journal of Biochemistry, 192, 669 - 676.

[11] Philip B., Hoff M., Rorije E., Schink B., Mersch-Sundermann V., Beimborn

D.B. (2001) Structure-Activity Relationships (SAR) for aerobic

biodegradation of N-heterocyclic compounds: Computer-assisted

structural analysis and a biochemical viewpoint. submitted.

[12] Rorije E., Mampel J., Cook A., Beimborn D.B. (2001) Prediction of

Biodegradability from Structure: Sulfoaromatic and sulfoaliphatic

compounds. in preparation.


15 of 16

Figure 1. Biodegradability expressed in % Biological Oxygen Demand

(BOD) of theoretical oxygen demand (ThOD) after 28 days, for 20

imidazole-ring containing compounds.

0

20

40

60

80

100

BO

D o

f ThO

D (

in %

) a

fter

28 d

ays

2-ETH

YL

2-MET

HYL

4-MET

HYL

2-ETH

YL-4-

METHYL

2-ISO

PROPY

L

THEO

PHYL

LIN

imida

zole

5-amino

-4-ca

rboxa

mide1-V

INYL

2-PHEN

YL

1,2-D

IMET

HYL

N-(3-AM

INOPROPY

L)

1,2-D

IMET

HYL-5-

NITRO

1-cya

noeth

yl-2-e

thyl-4

-meth

yl

2-ISO

PROPY

L-4-N

ITRO

1-CYA

NETHYL

1-VINYL

-2-MET

HYL

1-MET

HYL

4-NITR

O

2-MET

HYL-4-

NITRO

Maximum DegradationMinimum Degradation

N NN N

N NN N

N N

N NN N

NN O

O

N N

NN O

N

N

N N

N

N

N

N

N

N

N

NO O

N N

N O

ON

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

NOO

N

N

NOO


16 of 16

Figure 2. Degadation of imidazole-derivatives in analogy to the histidine-

degradation pathway.

NN

R1

R2

NN

OR1

R2

NN

COOHR1

R2

N

COOHR1 NH2O

R2+

H2O H2OH2O


17 of 16

Figure 3. Proposed mechanism for the metabolism of urocanate by

urocanate-hydratase, EC 4.2.1.49 [6,10].

N

N

H

O

O

N+

CONH2

Urocanase

N+

N

O

O

N

Urocanase

CONH2

H

HN

N

O

O

N

Urocanase

CONH2

H

H+-

H+

+

H+

N+

N

O

O

N

Urocanase

CONH2

HH

H

OHH

+N

+

N

O

O

N

Urocanase

CONH2

HH

H

OH

H

N

N

C3H4O2

H

ON

+

Urocanase

CONH2

+

N

N

C3H4O2

H

O

Hydrolytic ring opening

-

-

17.12.02 1

ANLAGE 10

Structure-Activity Relationships (SAR) for aerobic

biodegradation of N-heterocyclic compounds: Computer-

assisted structural analysis and biochemical explanations.

BODO PHILIPP1*, FLORENCE GERMA3, MALTE HOFF2, , BERNHARD SCHINK1,

ALASDAIR M. COOK1, VOLKER MERSCH-SUNDERMANN2, DIETER B. BEIMBORN3 AND

EMIEL RORIJE3,

1University of Konstanz, Faculty of Biology, Konstanz, Germany;

2Institute for Toxicology and Ecotoxicology, University of Trier, Trier, Germany;

3BASF-AG, Regulations Toxicology and Ecology, Ludwigshafen, Germany;

* Corresponding author, present adress: Institute of Pharmaceutical Sciences, University

Park, University of Nottingham, Nottingham NG7 2RD; phone: +44-115-8486286; fax: +44-

115-8466296; e-mail: [email protected]

17.12.02 2

Abstract

In this study Structure-Activity Relationships (SAR) for the aerobic degradation of N-

heterocyclic compounds are derived using the complementary approaches of computer-

based structural analysis and biochemical expert knowledge. A dataset consisting of

validated biodegradation data for 194 N-heterocyclic compounds was established. Structural

analysis of this database was performed using the MultiCASE software. This analysis yielded

18 molecular fragments (biophores) and 21 fragments (biophobes) statistically significant for

differentiating between efficient or poor biodegradability, respectively. Classifications by the

model using the biophores and by the model using the biophobes are both over 99% correct.

When predictions for all compounds were generated using cross-validation (leave-10%-out),

only 70% of the overall predictions were correct. The nature of the biophores and biophobes

was evaluated on the basis of mechanistical knowledge obtained by literature analysis, with

emphasis on the initiating reactions in the biological degradation pathways. Plausible

mechanistic explanations based on four enzymatic reactions as initial attack on N-

heterocycles could be linked to the most significant biophores and biophobes showing that

the results obtained by either analysis were consistent. On the basis of this consistency

several rules for biodegradation were established. The presence of target sites for

amidohydrolases and for cytochrome P450 monooxygenase-catalysed N-dealkylations

enhance the degradation of non-aromatic N-heterocycles. In aromatic heterocycles, an

unsubstituted carbon-atom ortho to the hetero-atom, which is accessible for nucleophilic

attack by molybdenum hydroxylases, is essential for biodegradation. More rules are defined

for biodegradation of imidazoles and pyrazoles. Although these rules are more restricted in

their applicability than the original MultiCASE model, they promise a better predictability and

understanding of the potential biodegradability of N-heterocyclic compounds.

17.12.02 3

Introduction

Biodegradation of man-made compounds carried out by micro-organisms like bacteria and

fungi is an essential part of wastewater purification and remediation of contaminated soils.

Various micro-organisms are able to degrade the numerous man-made, often xenobiotic

pollutants after adaptation. In order to assess the fate and the biodegradability of chemical

products, industry and public institutions invest substantial money and effort. However, still

most of the compounds on the market and in production have not been subjected to

biodegradation tests [Wackett and Ellis, 1999, Karcher et al, 1995]. Therefore models to

reliably predict the biodegradability of organic compounds would be of great benefit, for both

ecological and economical reasons. Prediction of biodegradability would be valuable for risk

assessment of chemical compounds, specifically to evaluate the biodegradability of products

that are still untested but already on the market. Biodegradation models can help avoiding

unwanted biodegradability or persistence in the production of new chemical compounds and

furthermore, they could serve to develop synthesis strategies, where poorly degradable

intermediates or waste-streams can be avoided.

There are different approaches to develop SAR for biodegradation. One strategy is to

perform statistical analysis of biodegradation datasets [Loonen et al. 1999, Damborsky and

Schultz 1997, Niemi et al. 1987]. Advantages of this quantitative approach are the statistical

significance, the quantification of (in)security in a possible prediction and the possibility to

use combinations of physicochemical parameters like molecular weight (MW), the octanol-

water partition coefficient (Kow), ionization potential (IP) or electron affinity (EA), calculated

parameters like topological indices or quantum chemically derived electronic parameters,

and atom or molecular fragment counts like the number of chlorine atoms present etc.

Statistical analysis can give information about the prospective degradation rate of non-tested

substances. However, these models often only predict the endpoint of one specific

biodegradability test and do not consider biochemical aspects of biodegradation like the

respective enzymatic reactions, their diversity and the complexity of degradation pathways.

17.12.02 4

Often these statistical models come up with relationships which are sometimes illogical, or

counterintuitive, as shown for some multiple linear regression coefficients in the

Biodegradation Probability Programs by Howard et al. [Howard 1992]. For instance the

coefficients for the s-triazine and the ketone fragments are both positive, i.e. contributing to

better biodegradability in the linear version of the BIODEG models whereas they turn out to

be negative for the non-linear version of the model. Even more disturbing is the positive

contribution of fragments like aromatic chloride, aromatic bromide and fluoride substituents

in the newly derived multiple linear regression model for prediction of the MITI-I-test based

on the Biodegradation Probability Programs by Howard et al. [Tunkel 2000]. Although these

coefficients give the optimal fit to the data, they will clearly give false predictions (i.e. readily

biodegradable) for highly chlorinated and/or fluorinated compounds, compounds which were

clearly not present in the dataset used to derive this model.

Statistical analysis will therefore not automatically reveal much of the mechanistic insights of

biodegradability which are regarded in a different approach based on so-called metabolic

logic [Wackett and Ellis, 1999]. The concept of the latter approach is to organize and

systematize knowledge about the biochemistry of biodegradation and subsequently extract

rules for biodegradation. An outstanding example for the systematization of biochemical

knowledge is the highly linked and interactive Biocatalysis/Biodegradation [UMBBD, 2000]

developed at the University of Minnesota. The metabolism-simulating META-system

[Klopman et al. 1994], a project called Predict BT, which was raised with the aim to predict

biodegradation by the metabolic logic approach [Wackett and Ellis, 1999], and the current

undertakings at BASF [Rorije et al. 2001] are examples of how to transform biochemical

knowledge into expert systems containing rules for (possible) biodegradation.

The disadvantage of the mechanistic approach is that it lacks statistical evidence and that

the biochemical knowledge about biodegradation is incomplete since it is always restricted to

the current status of research in this area. In addition, the knowledge of biochemistry of

biodegradation is mainly derived from studies with selected bacterial strains or even purified

17.12.02 5

enzymes. Thus, the results from such laboratory studies may not be transferable to the

situation for example in waste water treatment plants, and may not reliably predict the

biodegradation rates of untested compounds. The existence of a certain biochemical

pathway proven in the laboratory does not at all imply that this transformation will actually

take place on a reasonable timescale in our environment.

Obviously, these two approaches for predicting biodegradation can be complementary and

their combination should lead to more significant models for biodegradation than either

method alone. Thus, in this study we made a synthesis of both approaches and tried a two-

tiered strategy to establish SAR to predict biodegradation in general. A similar study was

performed analysing anaerobic degradation of organic chemicals [Rorije et al. 1998A,

Klopman et al. 1998].

A dataset of 150 N-heterocyclic compounds containing validated biodegradation test data

was extracted from a 5000+ compounds database and submitted to statistical structural

analysis using the MultiCASE [Klopman 1992] method. Analysis by this software yielded a

statistical model based on molecular fragments,. In parallel with this statistical analysis,

extraction and systematization of mechanistical information from literature yielded rules for

biodegradation of compounds with similar structures. In the final step, these rules based on

expert knowledge and the results from the MultiCASE analysis were compared and

combined.

In this particular study, we chose N-heterocyclic compounds as model substances for two

reasons. First, N-heterocycles constitute a considerable portion of our database, and are a

comercially interesting group, as shown by the abundant presence of the N-heterocycles in

compounds introduced to the commercial market in the past 7 years. The

UmweltBundesAmt datenbank für neustoffanmeldungen shows that more than 23.4% of

these new compounds are N-heterocycles derivatives. Second, there is a high diversity of

known biochemical mechanisms involved in degradation of N-heterocycles (for reviews see

[Fetzner 2000, Fetzner 1998 and Kaiser et al. 1996] ) thus taking into account the metabolic

17.12.02 6

diversity of biodegradation in our modeling attempts. Literature analysis was focused mainly

on the primary enzymatic attack of a specific molecule including mechanistic considerations

of the respective enzyme. This is often also the rate-determining step in the biodegradation

pathway. Statistical analysis by MULTICASE is by design also focused on the parent

molecule and can not consider intermediates of biodegradation pathways when these

intermediates and their corresponding biodegradation data are not included in the dataset.

17.12.02 7

Materials and methods

Statistical analysis

MultiCASE and its principles have been described in detail elsewhere [Klopman 1984 and

Klopman 1992]. This program automatically performs a statistical analysis of datasets

containing structure and biological activity data of organic compounds, trying to identify

molecular fragments which are significantly linked to a biological endpoint, and derive

predictive QSAR-models therefrom.

In order to run statistical algorithms on the dataset the program calculates all the possible

structural fragments in the dataset, ranging from 2 to 10 non-hydrogen atoms along with

their associated hydrogens. Each of these fragments as well as automatically calculated 2-

dimensional distance descriptors (based upon the presence of lipophilic centers and

heteroatoms in the molecule) is associated with a confidence level and a probability of

activity that is derived from its distribution among biological active and inactive molecules.

Molecules containing the same biophores (activating fragments) but having slightly different

activity values are then searched for modulators of activity. These modulators may be

chemical properties (e.g. structural fragments), physico-chemical properties (e.g. log P) or

quantum chemical parameters (e.g. HOMO and LUMO energies) which are automatically

calculated by the program. Multiple QSAR-models are then established enabling the user to

run the program in predictive mode and evaluate untested molecules.

By inversion of the biodegration activity in the dataset (assigning a low activity to

biodegradable compounds and a high activity to the more persistent compounds), the

MultiCASE method can also be used to search for structural fragments that possibly inhibit

biodegradation processes. This approach seemed to be specifically useful in the analysis

ready biodegradability test data for aromatic comounds [Klopman and Tu 1997]. This can be

reasoned by the fact that ultimate biodegradation, or mineralization, is often a process

consisting of a series of single degradation steps. Although a compound may contain a

fragment that is associated with biodegradability (a biophore), and it may even be primary

17.12.02 8

degraded, there is no guarantee that this compound will completely mineralize. However, the

presence of a fragment that is related to poor biodegradability is a more solid indication that

a compound will not be mineralized, even if it may be primarily biodegraded.

Origin, evaluation and use of the data

Experimental biodegradation data were taken from the BASF Biodegradation Database,

containing corporate test data as well as biodegradation test data from various public

sources. Sufficiently reliable data on aerobic biodegradation test in water were found for 194

different compounds containing at least one N-heterocycle.

The experimental data from various biodegradation tests are not directly comparable. Each

compound is therefore classified as readily, inherently, moderately, or poorly biodegradable

using mostly OECD standards.

The BASF-biodegradation database contained 150 (5-, 6- or 7-ring) N-heterocycles

contained 86 biodegradable (readily or inherently), 9 moderately biodegrable and 55 poorly

biodegradable compounds.

In the MultiCASE analysis readily and inherently biodegradable compounds were thought to

have structural fragments that are vulnerable to biological attack, and were therefore coded

ACTIVE, with a (arbitrary) MultiCASE activity of 45 (readily) or 35 (inherently biodegradable).

Poorly biodegradable compounds were coded as inactive, using a MultiCASE activity of 10.

Moderately biodegradable compounds were given a MultiCASE activity of 25, which allows

the MultiCASE program to ignore these marginal compounds in its search for significant

biophores.

17.12.02 9

Results

14 fragments were identified in the analysis to be of statistical relevance for possible aerobic

biodegradation of N-heterocycles in water are listed in table 1 (see appendix, table needs to

be ‘prettyfied’. These 14 fragments explain the biodegradability of 83 out of the 86

biodegradable N-heterocyclics in our dataset. Also 6 fragments were identified that are

exclusively present in poorly biodegradable N-heterocycles. These fragments might be

inhibiting biodegradation.

The three compounds for which no fragment could be attributed to biodegradability are 2-

methylpyridine, captan and N,N‘-dimethylpiperazine

17.12.02 10

Discussion

Key-reactions initiating aerobic degradation of N-heterocyclic compounds

Analysis of the literature data led to the identification of four key reactions, which were found

to be very common for primary enzymatic attack on N-heterocycles occurring in our

database. Examples of each key reaction and the corresponding type of enzyme are

depicted in figure 1. All key-reactions involve the introduction of an oxygen atom either from

water or from dioxygen into the molecule leading either to hydrolysis or hydroxylation of N-

heterocycles. The site of hydroxylation later becomes the target site for ring-cleavage.

Non-aromatic N-heterocycles

Hydroxylation of the C2-atom adjacent to the N-heteroatom in non-aromatic heterocycles is

found to initiate degradation of piperidines, pyrrolidines [Poupin et al. 1999] and morpholines

[Poupin et al. 1998] and is catalysed by cytochrome P450 monooxygenases. This reaction is

analogous to N-dealkylations and proceeds most probably via a radical mechanism which

involves the intermediary formation of an aminium-radical [Guengerich and MacDonald

1990]. A further class of enzymes, which are often involved in degradation of non-aromatic

as well as aromatic N-heterocycles, are amidohydrolases (see below).

Aromatic N-heterocycles

The aromatic character of N-heterocycles is significantly decreased by the number of N-

atoms participating in the ring, leading to different reactivities. This is reflected by the diverse

biochemical strategies for primary attack on aromatic N-heterocycles. Sometimes, there are

also different strategies possible for the same compound. The most common initial attack is

a hydroxylation at C2, the C-atom adjacent to the N-heteroatom. In the case of quinolines

and substituted pyridines, a hydroxyl group derived from water is introduced by a nucleophilic

attack catalysed by molybdenum-containing enzymes [Fetzner 2000, Fetzner 1998].

Quinoline hydroxylases are also capable of hydroxylating pyrimidines as a cometabolic

reaction [Fetzner 1999] but they can also be hydroxylated by a specific enzyme, which is

most probably a molybdoenzyme, too [Vogels and Van der Drift 1976]. Another way of

17.12.02 11

introducing a hydroxyl-group is the addition of water to a double bound. Such a hydration

occurs in the degradation of the imidazole-moiety of urocanate, the first intermediate in

breakdown of histidine. This reaction is catalysed by urocanase, an enzyme containing a

tightly bound NAD+-cofactor [Lenz and Retey 1993, Klepp et al. 1990]. Unsubstituted

pyridine and pyrimidine bases like uracil or thymine are generally although not exclusively

reduced prior to hydroxylation [Xu and West 1992]. The resulting dihydropyrimidines are

cleaved by amidohydrolases, another important group of enzymes in the metabolism of N-

heterocycles [LaPointe et al. 1994, Runser and Meyer 1993]. In degradation of s-triazine

derivatives, cyanuric acid is the central intermediate [Cook 1987]. Its aromatic character is so

much diminished that it can be cleaved directly by an amidohydrolase [Karns 1999].

Evaluation of the statistical analysis from a mechanistical viewpoint

The statistical analysis performed with the MULTICASE-software yielded molecular

fragments of N-heterocycles, which are linked to efficient or poor biodegradability (table 1)

and by literature analysis we defined key-reactions for biodegradation of N-heterocycles

(figure 1).

Biophores 1 and 2 (this is biophore 1 with extensions) are both found mainly within non-

aromatic heterocycles with an oxo-group like pyrrolidones and piperidones. In 14 of 16

molecules carrying biophore 1, the oxo-group is adjacent to the N-atom of the heterocycle

like in biophore 2. Molecules with biophore 1 are therefore closely related to and partly

overlap with molecules carrying biophore 2. Biochemically, biophore 2 represents a site

characteristic for the attack of an amidohydrolase cleaving CN-bonds, like hydantoiase

[LaPointe et al 1994]. This kind of reaction was found to be one of the key-reactions in

degradation of N-heterocycles. Thus, the biodegradation-enhancing character of the closely

related biophores 1 and 2 can be interpreted from a mechanistic viewpoint as being target

sites for amidohydrolases.

Biophobe 8 would also represent such a target site but does not enhance biodegradation. A

closer look at the molecules carrying these fragments delivers possible explanations for this

17.12.02 12

contradiction since these compounds have very complex structures or contain other

biophobes like sulfonate-goups or chloride.

Biophores 7 and 8 are found in non-aromatic N-heterocycles including derivatives of

piperazine, piperidine, morpholine and imidazoline. According to literature analysis, one

would predict a hydroxylation of the C2-atom as the initiating reaction, catalysed by a

cytochrome P450 monooxygenase. For most of these classes of compounds, an attack by

cytochrome P450 has already been documented (see above). The same initiating reaction is

plausible for the molecules carrying biophore 3 which is also part of non-aromatic

heterocycles with at least the two N-atoms appearing in the fragment. Here, the

monohydroxylation could occur at the C-atom bridging the N-heteroatoms. Biophores 3, 7

and 8 have in common that the C-atom neighbouring the N-heteroatom is a secondary one.

Mechanistically, this could be the prerequisite for the radical-mechanism underlying this N-

dealkylation-like reaction.

Biophobe 5 is very similar to biophore 7 but leads to inactivation of biodegradation. The

difference between these two fragments is that in biophobe 5, the N-atom is always alkylated

while in biophores 7 the N-atom is unsubstituted. Probably, a second alkyl-group on the N-

atom might impede the formation of the aminium-radical as the first step of cytochrome

P450-catalysed N-dealkylation.

Biophores 4 and 5 as well as biophobe 3 are found in aromatic N-heterocycles, mainly

substituted pyridines and quinolines. Literature analysis suggests that the initiating step in

degradation of such compounds is a hydroxylation of the C2-atom catalysed by molybdenum

hydroxylases (see above). Nearly all compounds displaying biophores 4 and 5 have at least

one secondary C-atom neighbouring the N-heteroatom as a target site for this nucleophilic

attack. On the contrary, with the exception of one compound, in all molecules carrying

biophobe 3 the C-atoms adjacent the N-atom are tertiary, resulting in decreased

biodegradability. From a mechanistic point of view this indicates that substitution of the

hydrogen at C2 renders these molecules inaccessible to a nucleophilic attack by a

17.12.02 13

molybdenum containing hydroxylase. Biophobe 3 is found in many s-triazines with

substitutions on all three C-atoms, similar to the herbicide atrazine. It is well known that

herbicides based on s-triazine cores are recalcitrance to biodegradation due to their

substituents [Cook 1987].

Biophobe 6 is mainly found in aminopyridines. All isomers of aminopyridine were poorly

biodegradable. This fact suggests that the amino-group may inhibit a nucleophilic attack on

the aromatic N-heterocycle.

Biophore 6 is exclusively found in imidazole derivatives. Biophobe 7 comprises mostly

imidazole derivatives as well but these are all poorly biodegradable. The structural difference

between the imidazole moieties linked to these two fragments is that in biophobe 7 one N-

atom is alkylated while in biophore 6 they are both connected to H-atoms. The only

mechanistic knowledge about degradation of imidazoles stems from the metabolism of

histidine where a double bond of the heterocyclic residue is hydrated adjacent of one of the

N-atoms but not between the N-atoms. A possible explanation for the poor biodegradability

of N-alkylated imidazoles might be that a mesomeric structure necessary for this hydration is

unlikely to occur, probably due to the unfavourable formation of a quaternary N-atom. This

indicates that a hydration analogous to urocanase might be involved in initiating degradation

of imidazole residues in general [Rorije et al. 2001].

Biophobes 4 and 12 are nearly exclusively found in pyrazole residues and all of them were

poorly biodegradable. No information was found about degradation of pyrazole-derivatives in

literature. A possible degradation pathway might be initiated by a reductive cleavage of the

N-N-bond, which would be the reversal of the final step of pyrazole-biosynthesis found in

plants [Brown and Diffin 2000] and analogous to reductive cleavage of azo-dyes [Russ et al.

2000]. Considering the poor biodegradation of pyrazoles, the ability to cleave N-N-bonds in

ring systems is obviously not widespread in nature.

Biophobes 1 and 2 are very general biophobes since sulfonated and chlorinated compounds

are generally resistant to biodegradation and not specifically when attached to N-

17.12.02 14

heterocycles. Both the sulfonic acid group and the chloro-substituent turn out to be important

fragments negatively influencing biodegradability in various substructure models [Rorije et al.

1998B, Loonen et al. 1999].

17.12.02 15

Conclusions

The aim of our study was to derive SAR for biodegradation of N-heterocyclic compounds as

part of an expert-system for prediction of biodegradability. Our strategy was based on the

combination of two complementary approaches: statistical methods and analysis of

collected, systematized biochemical knowledge. Comparing the results of both approaches

we were able to find plausible mechanistic explanations for a number of biophores and

biophobes identified by the MultiCASE software, via the biochemistry of initial enzymatic

attack. Thus, the results of both approaches did not contradict each other but were

consistent and synergistic. Molecules prone to the initiating reaction are readily or inherently

biodegradable in most cases. This correlation underlines the key-role of the initial enzymatic

reaction of a metabolic pathway for the biodegradation process and endorses the statistical

method to conduct searches for activating fragments in the starter molecule. For our

purpose, the initiating reaction is therefore appropriate to develop rules for biodegradation,

especially regarding their diversity in degradation of N-heterocycles. Furthermore, it shows

that knowledge derived from laboratory studies performed with pure cultures can be

transferred to biodegradation tests to a significant degree and must therefore represent

ecologically relevant degradation pathways.

Summarizing the results we state the following SAR for aerobic biodegradation of N-

heterocycles:

i) Target sites for amidohydrolases enhance biodegradation of non-aromatic N-

heterocycles

ii) In non-aromatic N-heterocycles, a secondary C2-atom enhances biodegradation as a

target site for cytochrome P450 monooxygenases; these enzymes create target sites

for amidohydrolases or lead to ring cleavage directly.

iii) In aromatic N-heterocycles, a secondary C2-atom activates biodegradation as a

target site for nucleophilic attack by molybdenum hydroxylases.

17.12.02 16

iv) In pyridine derivatives, amino groups inhibit biodegradation, as well as chloro-

substitution, alpha to the ring-nitrogen atom.

v) In imidazole residues, alkylated N-atoms inactivate biodegradation.

vi) Pyrazole residues are poorly biodegradable probably due to the lack of enzymes for

cleavage of N-N bonds.

Outlook

These SARs will be continuously validated and updated by statistical analysis as the

database increases. Furthermore, the mechanistic explanations underlying our SAR should

also be experimentally tested to a certain degree, although this would have to be restricted

to a few selected cases due to the enormous and increasing number of chemicals. It should

be emphasised that SARs for biodegradation obtained by our complementary approach are

dynamical and subjected to critical re-evaluation regularly considering the growth of both

databases and biochemical knowledge. It is a fascinating future perspective to implicate

functional genomics and three-dimensional structures of relevant enzymes into the

establishment of SARs for biodegradation. The development of dynamic expert systems

steadily integrating new available information influencing biodegradation in order to make

predictions requires multiple steps. With our study, we were able to do a first step in

combining computer-based statistical analysis and biochemical knowledge. Present work in

our project makes use of this approach to develop SARs for other classes of compounds

and future work will include linking these SARs.

Acknowledgements

This project was financially supported by the German Ministry of Education and Science(BMBF; Code 01RC0090). This help is greatfully acknowledged.

17.12.02 17

REFERENCES

Brown EG and Diffin FM (2000) Biosynthesis and metabolism of pyrazole by Cucumis

sativus: Enzymatic cyclization and dehydrogenation of 1,3-diaminopropan.

Phytochemistry, 29(2):469-478.

Cook AM (1987) Biodegradation of s-triazine xenobiotics FEMS Microbiology Reviews, 4693-

116.

Damborsky J and Schultz TW (1997) Comparison of the QSAR models for toxicity and

biodegradability of anilines and phenols Chemosphere, 34(2) : 429-446.

Fetzner S (1998) Bacterial degradationof pyridine, indole, quinoline, and their derivatives

under different redox conditions. Applied Microbiology & Biotechnology, 49(3):237-250.

Fetzner S (1999) Bioconversion of pyrimidine by resting cells of quinoline-degrading bacteria

FEMS Microbiology Letters, 176(2):291-299.

Fetzner S (2000) Enzymes involved in the aerobic bacterial degradation of N-heteroaromatic

compounds: Molybdenum hydroxylases and ring-opening 2,4-dioxygenases.

Naturwissenschaften, 87(2):59-69.

Guengerich FP and Macdonald TL (1990) Mechanisms of cytochrome P-450 catalysis.

FASEB Journal, 4(8):2453-2459.

Howard PH, Boethling RS, Stiteler W, Meylan W, Hueber AE, Beauman J and Larosche ME (1992).

Predictive Model for aerobic biodegradability developed from a file of evaluated biodegradation

data. Environmental Toxicology & Chemistry 11, 593-603.

Kaiser JP, Feng Y and Bollag J-M (1996) Microbial metabolism of pyridine, quinoline,

acridine, and their derivatives under aerobic and anaerobic conditions. Microbiological

Reviews, 60(3):483-498.

Karcher W, Hansen BG, van Leeuwen CJ, Wagner P and Auer C (1995) Predictions for Existing

Chemicals - A Multilateral QSAR Project. SAR & QSAR in Environmental Research 3(3): 217-

221.

Karns JS (1999) Gene sequence and properties of an s-triazine ring-cleavage enzyme from

Pseudomonas sp. strain NRRLB-12227. Applied & Environmental Microbiology,

65(8):3512-3517.

Klepp J, Retey J, Hull WE, Grimm K and Fallert-Müller A (1990) Mechanism of action of

urocanase. Specific 13C-labelling of the prosthetic NAD+ and revision of the structure

of its adduct with imidazolylpropionate Eur.J.Biochem., 192(3):669-676.

Klopman G (1984) Artificial Intelligence Approach to Structure-Activity Studies. Computer

Automated Structure Evaluation of Biological Activity of Organic Molecules. Journal of

the American Chemical Society 106: 7315-7321.

17.12.02 18

Klopman G (1992) MultiCASE: A Hierarchical Computer Automated Structure Evaluation

Program. Quantitative Structure-Activity Relationships 11:176-184.

Klopman G, Dimayuga M and Talafous J (1994) META: 1. A Program for Evaluation of

Metabolic Transformation of Chemicals," Journal of Chemical Information and

Computer Sciences 34:1320-1325.

Klopman G and Tu MH (1997) Structure-Biodegradabiity study and computer-automated

prediction of aerobic biodegradation of chemicals. Environmental Toxicology &

Chemistry 16(9):1829-1835.

Klopman G, Saiakhov R, Tu M, Pusca F and Rorije E (1998) Computer-assisted evaluation

of anaerobic biodegradation products. Pure & Applied Chemistry 70(7):1385-1394.

LaPointe G, Viau S, LeBlanc D, Robert N, and Morin A (1994) Cloning, sequencing, and

expression in Escherichia coli of the D-hydantoinase gene from Pseudomonas putida

and distribution of homologous genes in other microorganisms. Applied &

Environmental Microbiology 60(3):888-895.

Lenz M and Retey J (1993) Cloning, expression and mutational analysis of the urocanase

gene (hutU) from Pseudomonas putita. Eur.J.Biochem. 217429-434.

Loonen H, Lindgren F, Hansen B, Karcher W, Niemela J, Hiromatsu K, Takatsuki M,

Peijnenburg WJGM, Rorije E and Struijs J (1999) Prediction of biodegradability from

chemical structure: Modeling of ready biodegradation test data Environmental

Toxicology & Chemistry, 18(8):1763-1768.

Niemi GJ, Veith GD, Regal RR and Vaishnav DD (1987) Structural features associated with

degradable and persistent chemicals Environmental Toxicology and Chemistry, 6515-

527.

Poupin P, Ducrocq V, Hallier-Soulier S and Truffaut N (1999) Cloning and characterization of

the genes encoding a cytochrome P450 (PipA) involved in piperidine and pyrrolidine

utilization and its regulatory protein (PipR) in Mycobacterium smegmatis mc(2)155

Journal of Bacteriology, 181(11):3419-3426.

Poupin P, Truffaut N, Combourieu B, Besse P, Sancelme M, Veschambre H and Delort AM

(1998) Degradation of morpholine by an environmental Mycobacterium strain involves

a cytochrome P-450. Applied & Environmental Microbiology, 64(1):159-165.

Rorije E, Peijnenburg WJGM and Klopman G (1998A) Structural Requirements for

Anaerobic Biodegradation of Organic Chemicals. Environmental Toxicology &

Chemistry, 17(10) : 1943-1950.

Rorije E, Loonen H, Müller M, Klopman G and Peijnenburg WJGM (1998B) Evaluation and

Application of Models for the Prediction of Ready Biodegradability in the MITI-I Test.

Chemosphere 38(6):1409-1417.

17.12.02 19

Rorije E, Germa F, Philipp B, Schink B and Beimborn DB (2001) Predicting Biodegradability

from Structure: Imidazoles. SAR&QSAR in Environmental Research, accepted for

publication in 2001.

Runser SM and Meyer PC (1993) Purification and biochemical characterization of the

hydantoin hydrolyzing enzyme from Agrobacterium species. A hydantoinase with no

5,6-dihydropyrimidine amidohydrolase activity. European Journal of Biochemistry,

213(3):1315-1324.

Russ R, Rau J and Stolz A (2000) The Function of Cytoplasmic Flavin Reductases in the

Reduction of Azo Dyes by Bacteria. Applied & Environmental Microbiology 66(4):1429-

1434.

Tunkel J. Howard PH. Boethling RS. Stiteler W. Loonen H. (2000) Predicting ready

biodegradability in the Japanese Ministry of International Trade and Industry test.

Environmental Toxicology & Chemistry 19(10):2478-2485.

UMBBD (2000) University of Minnesota Biometabolism and Biodegradation Database

http://umbbd.ahc.umn.edu/index.html

Vogels GD and Van der Drift C (1976) Degradation of purines and pyrimidines by

microorganisms. Bacteriological Reviews, 40(2):403-468.

Wackett LP and Ellis LBM (1999) Predicting Biodegradation, Environmental Microbiology

1:119-124.

Xu G and West TP (1992) Reductive catabolism of pyrimidine bases by Pseudomonas

stutzeri Journal of General Microbiology 138:2459-2463.

17.12.02 20

N N O

OH2

2 [H]

N

N O

O

NH2

N O

HOOC

OH2

N N OH

O2 + NADH + H+ H2O + NAD+

NN

HOOCOH2

HOOC

NN

O

1

2

3

4

Figure 1: Examples for key-reactions initiating degradation of N-heterocyclic compounds: (1)

Hydroxylation of quinoline catalysed by a molybdenum hydroxlase [Fetzner 2000]. (2)

Monohydroxylation of pyrrolidine catalysed by cytochrome P450 monooxygenase [Poupin et

al., 1999]. (3) Hydrolysis of dihydrouracil [Vogels and van der Drift, 1976]. (4) Hydratation of

the imidazole moiety of urocanate catalysed by urocanase [Klepp et al.,1990].

17.12.02 21

TABLE I

Biophores identified by MCASE for aerobic.A capital C indicates an aliphatic carbon atom,lowercase c indicates an aromatic carbon atom.

Substructures derived by using our rules for biodegradation based on the complementary approachAnd the evaluation of their scores in the 151 N-heterocycles database.

1. Target sites for amidohydrolasesOxo-group adjacent to N-atom in non-aromatic ring

18 / 150 compounds à 1 Poorly biodegradable, tetrahydrophtalimide:

31 / 150 compounds à 5 Poorly biodegradable, again tetrahydrophtalimide, and 4 timesa -N-C(=O)-N- compound.

19 / 150 compounds à 1 Poorly biodegradable, tetrahydrophthalimide.

Tetrahydrophthalimide is tested in a non-defined test as poorly biodegradable with adapted sludge. This source isa little old. PITTER P. (1976) DETERMINATION OF BIOLOGICAL DEGRADABILITY OF ORGANICSUBSTANCES, WATER RESEARCH 10:231-235. Captan, a N-substituted phthalimide is evaluated asinherently biodegradable (in several grab-sample test, i.e. degradation in soil!).

2. Target sites for cytochrome P450 monooxygenasesSecondary C-atom adjacent to secondary N-atom in non-aromatic ring

46 / 150 compounds à 9 Poorly biodegradable (5 of these are piperazine)

25 / 150 compounds à 5 Poorly biodegradable (5 x subst. piperazine deriv.!)

If we can explain why piperazine (methyl subst.) is so hard to degrade this might be a good fragment.

3. Target site for molybdenum hydroxlasesecondary C-atom adjacent to N-atom in aromatic ring

44 / 150 compounds à 15 poorly biodegradable!

NHCH

CH

O

O

CHCH

CH2

CH2

NH2CH

ONH2 O

CH3

NH

O

C H 3

CH 3

NH2

CH2 (in ring)

C H 2 ( i n r i n g )

NH

C H 2 ( i n r i n g )

NH 2 CH 2

H

CH 2

CH 2

NH

HH

17.12.02 22

16 / 150 compounds à 4 poorly biodegradable!

This one does not seem to have very good perspectives, it is too general.

4. Target site for hydration in imidazole residuesboth N-atoms not linked to other substituents than H

11 / 150 compounds à 4 poorly biodegradable (3 x nitro, 1 benzyl)

A mechanistic model explaining the non-biodegradability of these 4 is proposed in [Rorije et al. 2001] A separatemodel is developed, which explains the non-biodegradability of the imidazoles with electron-withdrawingsubstituents, and assumes that N-substitution blocks the urocanase like degradation mechanism.

5. N-unsubstituted pyrazolecontrary to imdazole N-substitution (-methyl) seems to makes pyrazole rings biodegradable

8 / 150 compounds, 6 poorly biodegradable, 2 are inherently biodegradable,

inherently biodegradable are and

The 6 poorly biodegradable pyrazoles are NOT N-substituted!

NCH

CH

N

CH

H

NHNA

AA

N+

N

CH

C H 3CH 3

C H

CH

CH

CHCH

C H

CH

CHC HCH

N

N

CH

CH

CH3

CH3

Experimental Toxicology and Ecology

17.12.02ANLAGE 11 Dr. Dieter Beimborn

ZH/TC – Z570Tel.: 58224

ZH ForschungsnotizTitle of EFO-Poster: QSAR-Biodegradation; Prediction of Microbial Degradation

of Imidazole Compounds.

PRODAS Ref.-No.: 56347

Authors: Dipl.Chem.E.Rorije, ZH/TC; Dr.D.B.Beimborn, ZH/TC; Dipl.Ing.F.Germa,ZH/TC; Dr.M.Hoff (Universität Trier); Prof.Dr.V.Mersch-Sundermann(Universität Trier); Dr.B.Philipp (Universität Konstanz); Prof.Dr.A.Cook(Universität Konstanz); Prof.Dr.B.Schink (Universität Konstanz).

Summary

An EFO-project for the development of Structure-Activity-Relationships forBiodegradation (SBRs) is presented. The concept of the project is to use all availablebiodegradation test results and metabolic pathway information for modelingpurposes. The aim is to assemble sets of structural rules governing the potentialmicrobial degradability of classes of chemicals. These structural rules do not yield‚classical‘ statistical models that are generally applicable, while being restrained tomodel one specific type of test result, but give insight into the general probability ofbiodegradation for specific classes of chemicals.

For the class of imidazole derivatives such rules are derived, and a degradationmechanism is proposed in analogy to the uracanat-hydratase mechanism fromhistidine metabolism. Histidine is a (natural) amino-acid which has the imidazol ring asa rest group. It is demonstrated that both data analysis and the proposed enzymaticreaction mechanisms are necessary to yield a meaningful SBR for imidazoles.

The model is validated using 12 imidazol-compounds, which were all predictedcorrectly to be poorly biodegradable, based on their substituent patterns.

Keywords: biodegradation, database, structure-activity relationships, imidazole.

Annex:EFo-Poster

INTRODUCTION

Biodegradability highly determines the persistence of chemicals in our environment.The ability of ambient microorganisms to utilize chemicals as nutrient sourcessecures the transformation of many man-made chemicals that enter the environmenteither through accidents or by their use (i.e. surfactants). If and how a chemical isdegraded in the environment determines for a large part the overall environmentalfate of a chemical. Persistance to microbial degradation or partial degradation leadingto intermediates could mean that environmental concentrations of specificcompounds could locally reach unacceptable levels. Testing of the biodegradabilitypotential of a compound is however a tedious and time-consuming job, where anegative result in a specific standardized test does not necessarily mean that acompound is not biodegradable. This makes it difficult (time- and cost-intensive) totake the biodegradability potential of research candidates for new products intoaccount at a very early stage of product development. Reliable predictions of thepotential for biodegradability of chemicals, based on their chemical structure wouldtherefore be very useful in risk assessment and environmental fate analyses ofexisting chemicals, but even more convenient in the development of new chemicalsand production processes, where models can give information about chemicals thathave not even been synthesized yet.

An EFo project has therefore been initiated, to gather all available information onbiodegradation behaviour of chemicals, and to look for trends in the data for specificclasses of chemicals. External partners are the Laboratory for Microbial Ecology fromthe University of Konstanz, and the laboratory for Toxicology and Ecotoxicology fromthe University of Trier. The project is financed 55% by BASF ExploratorischeForschung (EFO) and 45% by the german ministry of science and education(BundesMinisterium für Bildung und Forschung, BMBF). The aim of the project is notto develop general, statistical models with a broad applicability, which give a certainprobability that a chemical will be biodegradable or not biodegradable in a specifictest, as such models have been the subject of much research in the past [1-3]. Suchmodels also do not fulfill the need for more fundamental understanding ofbiodegradability [1,2], which arises e.g. in the case of sudden load of previouslyuntreated chemicals for the BASF waste water treatment plant, or in the selectionand proposal of research candidates in the development of new products.The aim of the project is therefore to develop mechanistically based (substructure)models for classes of chemicals which are thought to biodegrade via a commondegradation pathway or mechanism. As an example of our approach, one of thesenewly developed models is presented here, for the class of imidazole compounds.

BIODEGRADATION DATABASE

For this project a database has been assembled gathering all data on biodegradationtest results, physico-chemical characteristics and metabolic pathway information thatcould be found both within the BASF as well as outside, via scientific literature. Thisdatabase contains at the moment information on 5000 compounds, with chemical

structures assigned to over 4000 compounds of these, and the results of more than14000 separate biodegradation test. Metabolic information comes from literature andavailable resources such as the Boehringer Metabolism Pathways [4] and theBioremediation and Biodegradation Database on the internet [5]. The database canbe searched on substructures and chemical similarity, making it easy to assemblehomologous series of chemicals, which can be analyzed on biodegradation trends.

For validation purposes the german environmental protection agency(UmweltBundesAmt [7]) has provided the project with a database of 1363compounds with their chemical structures and biodegradation test results which wereprovided for the registration of new chemicals on the german market in the pastyears. These data are confidential, and are therefore only used to validate ourfindings within the project. The raw data (structures and biodegradation test results)can not be shown.

DATA ANALYSIS

An SBR analysis of imidazole derivatives in our database yielded 23 compoundscontaining an imidazole ring, from which 2 were dye-stuffs and 1 was a polymer,having only adsorption test data in the database. These three compounds aretherefore discarded from the analysis. This leaves a set of 20 different structures withtheir (evaluated) biodegradation data, The most relevant quantitive data for these 20structures are shown in figure 1.

The following observations were made:• Imidazole and its ring-C-substituted derivatives with methyl-, ethyl-, and

isopropyl-substituents are ultimately biodegradable.

0

20

40

60

80

100

Min

eral

izat

ion

(in %

) afte

r 28

days

2-ETH

YL

2-MET

HYL

4-MET

HYL

2-ETH

YL-4-

METHYL

2-ISO

PROPY

L

THEO

PHYL

LIN

imida

zole

5-amino

-4-ca

rboxa

mide1-V

INYL

2-PHEN

YL

1,2-D

IMET

HYL

N-(3-AM

INOPROPY

L)

1,2-D

IMET

HYL-5-

NITRO

1-cya

noeth

yl-2-et

hyl-4

-meth

yl

2-ISO

PROPY

L-4-N

ITRO

1-CYA

NETHYL

1-VIN

YL-2-M

ETHYL

1-MET

HYL

4-NITR

O

2-MET

HYL-4-

NITRO

Maximum DegradationMinimum Degradation

N NN N

N N N N

N N

N NN N

NN O

O

N N

NN O

N

N

N N

N

N

N

N

N

N

N

NO O

N N

N O

ON

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

NOO

N

N

NOO

• Phenyl-, cyano- and nitro-substituted imidazoles seem to be poorlybiodegradable.

• All N-substituted imidazole derivatives were poorly biodegradable.

MECHANISTIC INFORMATION

Literature research on biodegradation pathways of imidazole derivatives led to theHistidine metabolism [4,6,7]. Catabolic pathways for imidazole compounds may besimilar to the breakdown of urocanate, the first metabolite of the histidinebiodegradation pathway [5,6,7]. Below, in figure 2, the proposed enzymaticmechanism of the urocanase attack is given. The product of this reaction is a 5-oxoimidazole derivative, which is subject to hydrolytic cleavage and ring opening.

Figure 2. Proposed mechanism for the metabolism of uracanat by urocanat-hydratase, EC 4.2.1.49 [6].

The above hydratase mechanism involves electronic rearrangements of theimidazole ring system, followed by an electrophilic attack of Urocanase-bound NAD+.The imidazol-ring will be deactivated towards an attack of NAD+ by substituentshaving an electronic minus M- or I-effect on the ring, like nitro-, cyano- or halogen-groups. The attack on the imidazole ring will be activated by electron-donatingsubstituents, like methyl-, ethyl-, amino- or hydroxyl-groups. The fact that notimidazole, but 2-ethylimidazole is the most readily biodegraded substance in ourseries (see figure 1), also indicates that the imidazole ring is possibly activatedtowards electrophilic attack, making the methyl-, ethyl-, and even isopropylimidazolesbetter biodegradable than their mother compound imidazole.

Combination of the data analyis and the mechanistic information leads to thefollowing rule for predicting the biodegradability of imidazoles in general:

N

N

H

O

O

N+

CONH2

Urocanase

N+

N

O

O

N

Urocanase

CONH2

H

HN

N

O

O

N

Urocanase

CONH2

H

H+-

H+

+

H+

N+

N

O

O

N

Urocanase

CONH2

HH

H

OHH

+N

+

N

O

O

N

Urocanase

CONH2

HH

H

OH

H

N

N

C3H4O2

H

ON

+

Urocanase

CONH2

+

N

N

C3H4O2

H

O


-

-

Imidazole derivatives are biodegradable in the aquatic environment, if thesubstituents are:

a) attached to the imidazole-ring carbon atoms, andb) do not have an electron-withdrawing effect on the imidazole ring through

resonance- or inductive-effectsVALIDATION

This above formulated rule was then externally validated with a data set of 12imidazole derivatives from the UBA-database [8]. All of them were correctly predictedas poorly biodegradable, because of their substitution patterns (data not shown).

One other compound which was not in our degradation database but for whichinformation on biodegradability could be found in the BASF Material Safety DataSheets (MSDS) [9] is caffeine. This compound is the 1-N-methyl substitutedderivative of theophyllin (which was in our database), shown in figure 3.

N

N

N

N

O

O

Theophyllin90% degradation after 10 daysOECD 301A - DOC die-away test

N

N

N

N

O

O

Caffein<20% degradationDIN52900 - BOD of COD

Figure 3. Structure and biodegradability of Theophyllin and Caffein.

Whereas theophyllin is very rapidly biodegraded according to our data (90%degradation within 10 days in the OECD301A test – DOC die-away), we expectcaffein not to be readily biodegradable, according to our rules, because of the 1-N-substitution. Indeed, caffein is not readily biodegradable in the DIN52900 test,showing <20% Biological Oxygen Demand (BOD) as fraction of the ChemicalOxygen Demand (COD) [9].

DISCUSSION

It is not obvious looking at the mechanism only, that 1-N-substituted imidazoles willbe hindered in their degradation via a urocanase similar mechanism. Similarly it is notobvious only looking at the data-analysis, that all C-substituents on the imidazole ringthat have an electron withdrawing effect through resonance or induction willdeactivate the imidazole rings reactivity towards NAD+, therefore makingbiodegradation more difficult. For the class of imidazoles it is shown that it isnecessary to use both data-analysis (statistical and/or manual methods), andinterpret information from catabolic mechanisms, to come up with meaningfulstructural rules for biodegradation, which have general validity and thus predictivevalue.

The analysis can be made more quantitative by applying Hammett sigma constantsto describe (quantitatively) the electronic effects of the imidazole ring-carbon

substituents. Another possibility is to perform (semi-empirical) quantum chemicalcalculations to quantitate and/or visualize the electronic effects from substituents onthe imidazole ring. Both ideas are being worked out further.

Apparently, N-substitution of the imidazole ring can block the urocanase mechanism,possibly by disabling the electronic rearrangements in the imidazole ring. Onepossibility which will be further investigated is that it is not the neutral species ofimidazole which is reactive towards NAD+ but the dissociated form. With asubstituent on the 1-nitrogen of the ring, the aromatic character of the imidazole ringis enhanced and dissociation is not longer possible. The pKa of imidazole is 7.0,providing 50% dissociated imidazole anions in an aqueous medium at neutral pH.Although an experimental setup to test this hypothesis may prove difficult, it isrelatively simple to perform (semi empirical) quantum chemical calculations to studythe dissociation kinetics of imidazole-compounds. Such calculation can give indirectevidence of the correctness of our hypothesis, and may necessitate testing of furthercompounds in the laboratory. This aproach will be pursued.

Acknowledgements

This project was financially supported by the German Ministry of Education andScience (BMBF Code 01RC0090). This help is greatfully acknowledged.

References

[1] Parsons, J.R., and Govers, H.A. (1990) Quantitative Structure-ActivityRelationships for Biodegradation. Ecotoxicology & Environmental Safety 19,212 – 227.

[2] Rorije, E., Langenberg, J.H., and Peijnenburg, W.J.G.M. (1995) Chapter 6:QSARs for Biodegradation, in Overview of structure-activity relationships forenvironmental endpoints. Report of the EU-DGXII Project QSAR for PredictingFate and Effects of Chemicals in the Environment, ed. JLM Hermens, Brussels.

[3] Loonen H., et al. (1999) Prediction of Biodegradability From Chemical Structure:Modeling of Ready Biodegradation Test Data. Environmental Toxicology &Chemistry 18, 1763 - 1768 .

[4] Boehringer Mannheim Biochemical Pathways on the ExPASy server, Geneva,Switzerland. http://www.expasy.ch/cgi-bin/search-biochem-index

[5] The University of Minnesota Biodegradation and Bioremediation Database(UMBBD). http://dragon.labmed.umn.edu/umbbd/index.html

[6] Lengeler J.W., Drews G., Schlegel, H.G. (1999) Biology of the Prokaryotes.Thieme, Stuttgart, XXVII.

[7] Klepp, J., Fallert-Muller, A., Grimm, K., Hull, W.E., and Retey, J. (1990)Mechanism of action of urocanase. Specific 13C-labelling of the prostheticNAD+ and revision of the structure of its adduct with imidazolylpropionate.European Journal of Biochemistry 192, 669 - 676.

[8] UmweltBundesAmt, UBA (2000), Germany. Daten für neue Stoffen under demChemikalien Gesetz.

[9] Material Safety Data Sheet for Caffein (2000), Knoll AG, Germany.

EINLEITUNG

In diesem Projekt wird der Versuch unternommen, das verfügbare Wissen über den biologischen Abbau zu Struktur-ähnlichen Chemikalien zusammenzustellen, um

• Struktur-Abbau-Korrelationen abzuleiten

• Regelmässigkeiten des mikrobiellen Abbaus zu erkennen

Die erforschten Zusammenhänge sollen einen Beitrag leisten zur

• effizienten Entwicklung neuer, ökologisch verbesserter Produkte

• Vorhersage der Bioabbaubarkeit von nicht-untersuchten Stoffen

• Einsparung von experimentellem Aufwand

Bei ZH/TC wurde eine ISIS-Datenbank mit Struktur- und Abbaudaten zu mehr als 5000 Stoffen aufgebaut (Abb.1). Diese Datenbank wird kontinuierlich ergänzt um

• physikalisch-chemische Stoffdaten

• aerobe und anaerobe Angaben zum Metabolismus

STRUKTUR-ABBAU-ANALYSE DER IMIDAZOLE

Mit Substruktursuchen können Struktur-Abbau-Korrelationen ( SBRs) erkannt werden. In Abb . 2 ist beispielhaft der Grad der biologischen Abbaubarkeit für 19 verschiedene Imidazole aus dieser Datenbank im Balkendiagramm gezeigt.

Imidazol und seine C-substituierten Derivate (z.B. Methyl-, Ethyl-, und Isopropylimidazol) sind vollständig biologisch abbaubar.

Alle N-substitutierten Verbindungen, sowie Phenyl-, und Nitro -substituierte Imidazole sind schwer abbaubar.

UROCANASE MECHANISMUS

Das Analysenergebnis wird in Analogie zur Urocanase-Reaktion des Histidinabbaus erklärt. Die Aminosäure Histidin ist eine natürliche Imidazolverbindung, die über Urocanat als ersten Metaboliten abgebaut wird.

Abb . 3 zeigt den Reaktionsmechanismus der Urocanase die Urocanat zum 4-Imidazolon-5-propionat oxidiert.

Möglicherweise sind am Abbau von anderen Imidazolverbindungen Urocanase-ähnliche hydratasen beteiligt, deren Reaktionsmechanismen in gleicher Weise durch Umlagerungen von Elektronenpaarbindungen gekennzeichnet sind.

Es wird postuliert, dass Imidazole mit elektronenziehenden Substituenten (minus M- oder I- effekt , z.B. Nitro -, Phenyl und Halogengruppen), und N-substituierte Imidazole, von diesen Enzymen nicht umgesetzt werden. Dies würde die gefundenen Testergebnisse mechanistisch erklären.

Abb.3 Mechanismus der Urocanase

VALIDIERUNG UND WEITERE VORGEHENSWEISE

Abbaudaten zu 19 Imidazolverbindungen aus unterschiedlichen OECD-Testmethoden wurden analysiert. Folgende Regel wurde abgeleitet:

Imidazolverbindungen sind im aeroben aquatischen Milieu vollständig biologisch abbaubar, wenn siea) am Ringkohlenstoff substituiert sind, und b) diese Substituenten keinen minus M- oder I-Effekt haben.

Das UmweltBundesAmt (UBA) stellte für dieses Projektes zu 1350 Neustoffen Abbaudaten zur Verfügung. Diese Datenbank enthielt 12 Imidazolverbindungen , deren biologische Abbaubarkeit entsprechend dieser Abbauregel als biologisch schwer abbaubar korrekt vorhergesagt werden konnte.

In gleicher Weise, wie hier am Beispiel der Imidazole gezeigt, wird die Datenbank ständig um weitere Stoffklassen erweitert (sulfonierte Aromaten, weitereN-Heterozyklen, Pflanzenschutzmittel). Auf Wunsch können Stoffklassen für einzelne Unternehmensbereiche erarbeitet werden.

N

N

H

O

O

N+

CONH2

Urocanase

N+

N

O

O

N

Urocanase

CONH2

H

H

N

N

O

O

N

Urocanase

CONH2

H

H+

-

H+

+

H+

N+

N

O

O

N

Urocanase

CONH2

HH

H

OHH

+N

+

N

O

O

N

Urocanase

CONH2

HH

H

OH

H

N

N

O

OH

O

N+

Urocanase

CONH2

Abb .1 Ausschnitt aus der Datenbank BISS

ANLAGE 12: QSAR - BIOABBAU

Bernhard Schink (Uni. Konstanz)Kooperation mit: Alasdair Cook (Uni. Konstanz) Volker Mersch-Sundermann (Uni. Trier)

Bodo Philipp (Uni. Konstanz) Malte Hoff (Uni. Trier)

EFO Projekt, teilfinanziert (45%) vomBundesMinisterium für Bildung und

Forschung (BMBF)

Dieter B. Beimborn, Florence Germa, Emiel Rorije (ZH/TC)

Computergestützte Vorhersage des biologischen Abbaus von BASF-Stoffen

0

20

40

60

80

100

Abb

augr

ad (i

n %

) nac

h 28

Tag

en

IMIDAZ

OLE

4-MET

HYL

2-MET

HYL

2-ETH

YL°

2-ISOPR

OPYL

2-ETH

YL-4-

METHYL

4-AMINO-5-

CARBO

XAMIDE*

5-NITR

O

2-MET

HYL-5-

NITRO

2-ISO

PROPY

L-5-N

ITRO

2-PHE

NYL

1-MET

HYL

1-VINYL

N-(3-AM

INOPROPY

L)

1,2-D

IMETHYL

-5-NITR

O

1,2-D

IMET

HYL

1-cya

nethy

l-2-et

hyl-4

-meth

yl*

1-CYA

NETH

YL*

1-VINYL

-2-MET

HYL*

Abb.2 BIOABBAU von IMIDAZOLEN

Maximaler Abbau / 1-N-substituiertMaximaler Abbau - C-substituiert / elektronenziehendMaximaler Abbau - C-substituiert / elektronendonierend

Abbautest OECD 302B mit industriellem Schlamm° mit kommunalem Schlamm

* OECD 301-Testmethode

N

N

N

N

N

N

N

N

N

NN N

NO

O

N N

NO

O

N N

NO

O

N N

N N N N

N N N N

N N

N O

N

N N

N

N

N

NN

N

N

N N

N

O

O

N N

BASF Aktiengesellschaft Product SafetyRegulations, Toxicology and Ecology

ANLAGE 13:BIODEGRADABILITY TESTING & SBR ANLAGE 13:BIODEGRADABILITY TESTING & SBR withwith IMIDAZOLE DERIVATIVES IMIDAZOLE DERIVATIVES

Dieter B. Beimborn (BASF AG)Florence Germa (BASF AG)

Emiel Rorije (BASF Española)Bernhard Schink (University of Konstanz)

Alasdair Cook (University of Konstanz)Bodo Philipp (University of Konstanz)

Volker Mersch-Sundermann ( University of Trier)Malte Hoff ( University of Trier)

project sponsored partially by the German Ferderal Ministryfor Education, Science, Research and Technology (BMBF)

ABSTRACTABSTRACTStructure- Activity Relationships for Biodegradation (SBRs), using collated biodegradation test results from different OECD methods, are assessed within this project . The aim was to assemble sets of structural rules governing the potential microbial degradability of ( classes of) chemicals.For the class of imidazole derivatives such rules are derived, and it is demonstrated that both data analysis and proposed enzymatic reaction mechanisms are necessary to yield meaningful SBRs.

INTRODUCTIONINTRODUCTION(Q)SAR approaches in biodegradation are mainly developed using one specific endpoint, and are usually based on data sets that are as homogeneous as possible [1-3]. This often means that limited data sets have to be used, and that models will only be valid for predicting the result of one specific test . Moreover, mechanistic information in the form of metabolic pathways is often only valid for one (microbial) species and one compound only. Hence, the derivation of meaningful, generally valid, mechanistical models for biodegradation is complicated , and existing models have limited applicability.

Within this project all available (different) biodegradation data are gathered and used . Test data are evaluated from aquatic tests for each compound, with classifications poorly, moderately, inherently or readily biodegradableThis approach is similar to work by Howard et al. [4]. Our database now contains information on almost 5000 different structures, their associated physico -chemical properties, (raw and evaluated) biodegradation test results, and available information on metabolic pathways. Using these integrated data, trends are analyzed for different chemical classes, like imidazole derivatives. Further examples of heterocyclic chemicals are analyzed within this project [8].

BIODEGRADATION TEST METHOD: Zahn-BIODEGRADATION TEST METHOD: Zahn-Wellens testWellens test

A generally applied standardized test is OECD 302B, Zahn-Wellens (ZW) test. The ZW test is a static test to determine ultimate aerobic biodegradability in the aquatic environment. The test substance, a defined inorganic medium and activated sludge are incubated and aerated at room temperature for up to 28 days. At regular intervals the Dissolved Organic Carbon (DOC) concentration is measured. The %DOC removal is plotted vs. time to give the elimination curve. Final DOC removal is evaluated as follows:

> 70 %DOC removal biodegradable20-70 %DOC removal partly or moderately biodegradable< 20 %DOC removal poorly biodegradable

A test substance which is biodegradable in this test is more generally classified as inherently biodegradable. This implies that biodegradation will take place in the environment, especially in adapted environments like waste water treatment plants.

SBR ANALYSISSBR ANALYSIS of of IMIDAZOLE-DERIVATIVES IMIDAZOLE-DERIVATIVESThe benefits of integrating biodegradation test data and mechanistic information into one system are evident when analyzing the group of imidazole-derivatives. An SBR analysis of imidazole derivatives in our database yielded 19 different structures with their biodegradation data, given on the left.

The following observations are made:

– Imidazole and its ring-C-substituted derivatives with methyl-, ethyl-, and isopropyl-substituents are ultimately biodegradable.– Phenyl- and nitro -substituted imidazoles seem to be poorly biodegradable. This is in agreement with the electrophilic ring-attack by urocanase-bound NAD+ proposed in the mechanism above.– All N-substituted imidazole derivatives are poorly biodegradable in this test. Apparently, N-substitution of the imidazole ring can block the urocanase mechanism completely, possibly by disabling the electronic rearrangements in the imidazole ring. This i

s not obvious when looking only at the mechanism.

MECHANISTIC BACKGROUNDMECHANISTIC BACKGROUND

Literature data on biodegradation pathways of imidazole derivatives are rare. Catabolic pathways may be similar to the breakdown of urocanate, the first metabolite of the histidine biodegradation pathway [5-6]. Below, the proposed enzymatic mechanism of the urocanase attack is given. The product of this reaction is a 5-oxoimidazole derivative, which is subject to hydrolytic cleavage and ring opening.

Proposed mechanism of the Urocanase reactionProposed mechanism of the Urocanase reaction [6] [6]

The above hydratase mechanism involves electronic rearrangements of the imidazole ringsystem, followed by an electrophilic attack of Urocanase-bound NAD+. This attack may behindered by substituents having an electronic minus M- or I-effect, like nitro-, phenyl- orhalogen-groups.

N

N

H

O

O

N+

CONH2

Urocanase

N+

N

O

O

N

Urocanase

CONH2

H

HN

N

O

O

N

Urocanase

CONH2

H

H+-

H+

+

H+

N+

N

O

O

N

Urocanase

CONH2

HH

H

OHH

+N

+

N

O

O

N

Urocanase

CONH2

HH

H

OH

H

N

N

C3H4O2

H

ON

+

Urocanase

CONH2

+

N

N

C3H4O2

H

O


-

-

CONCLUSIONSCONCLUSIONS and and VALIDATION VALIDATIONWithin this project , collated biodegradation data from various OECD tests for classes of chemicals are analyzed for general trends. The findings of these analyses are compared with biodegradation mechanisms proposed in literature . As an example of our approach a Structure-Biodegradation Relationship for derivatives of imidazole was complemented by a hydratase mechanism. With the results obtained the following rule is derived for predicting the biodegradability of imidazole derivatives in general:

Imidazole derivatives are biodegradable in the aquatic environment, if the substituents are a) attached to the imidazole -ring carbon atoms, and b ) do not have an electronic minus M- or I-effect.

This rule was externally validated with a data set of 12 imidazole derivatives [7]. All of them were correctly predicted as poorly biodegradable, because of their substitution patterns ( data not shown).Due to the complexity of microbial catabolic pathways, it seems necessary to use both data-analysis (statistical and/or manual methods), and interpret information from catabolic mechanisms to assess meaningful structural rules for biodegradation with general validity.

[1] JR Parsons and HA Govers (1990) Quantitative Structure-Activity Relationships for Biodegradation, Ecotoxicology & Environmental Safety 19(2):212-227[2] E Rorije, JH Langenberg and WJGM Peijnenburg (1995) Chapter 6: QSARs for Biodegradation, in Overview of structure-activity relationships for environmental endpoints. Report of the EU-DGXII Project QSAR for Predicting Fate and Effects of Chemicals in the Environment, ed. JLM Hermens, Brussels..[3] H Loonen et al. (1999) Prediction of Biodegradability From Chemical Structure: Modeling of Ready Biodegradation Test Data, Environmental Toxicology & Chemistry 18(8):1763-1768[4] PH Howard, AE Hueber and RS Boethling (1987) Biodegradation Data Evaluation for Structure/Biodegradability Relations, Environmental Toxicology & Chemistry 6(1):1-10.[5] JW Lengeler; G Drews; HG Schlegel (1999) Biology of the Prokaryotes, Stuttgart : Thieme, 1999. - XXVII[6] J Klepp, A Fallert-Muller , K Grimm, WE Hull and J Retey (1990) Mechanism of action of urocanase. Specific 13C- labelling of the prosthetic NAD+ and revision of the structure of its adduct with imidazolylpropionate. European Journal of Biochemistry 192(3):669-76.[7] UmweltBundesAmt (UBA), Germany. Daten für neue Stoffen under dem Chemikalien Gesetz.[8] B. Philipp et al ., in preparation

N

N

R1

R2

R3

BIODEGRADABILITYBIODEGRADABILITY of of IMIDAZOLE-DERIVATIVES IMIDAZOLE-DERIVATIVES

0

20

40

60

80

100

%D

egra

datio

n af

ter 2

8 da

ys

IMIDAZO

LE

4-MET

HYL

2-MET

HYL

2-ETH

YL°

2-ISOPR

OPYL

2-ETH

YL-4-

METHYL

4-AMINO-5-

CARBO

XAMIDE*

5-NITR

O

2-MET

HYL-5-

NITRO

2-ISOPR

OPYL-5

-NITRO

2-PHEN

YL

1-MET

HYL

1-VINYL

N-(3-AM

INOPROPY

L)

1,2-DIM

ETHYL

-5-NITR

O

1,2-DIM

ETHYL

1-cya

nethy

l-2-eth

yl-4-m

ethyl*

1-CYA

NETHYL

*

1-VINYL

-2-MET

HYL*

Maximum Degradation test resultMinimum Degradation test result

Biodegradation test OECD 302B with industrial sludge(° with municipal sludge; * OECD 301-test)

N

N

N

N

N

N

N

N

N

NN N

NO

O

N N

NO

O

N N

N

O

O

N N

N N N N

N NN N

N N

N O

N

N N

N

N

N

N

N

N

N

N N

N

O

O

N N

ANLAGE 14: IntegrierterUmweltschutz in der nachhaltigenChemie

biologischer

Expertensysteme helfen mit

Computergestützte Neustoffentwickung von ökologisch fortschrittlichenProdukten. Ein datenbankgestütztes Informationssystem zur biologischenAbbaubarkeit chemischer Verbindungen ermöglicht bereits sehr frühzeitig eineumweltintegrierte Produktplanung. Bei der Entwicklung neuer Produktesteigert dieses Computersystem die Effizienz und schont Ressourcen. Mit derÜbertragung von strukturspezifischen Erkenntnissen zur biologischenAbbaubarkeit bekannter Stoffe lassen sich fundierte Aussagen über neu syn-thetisierte Verbindungen treffen. Damit wird es möglich, schon zu Beginn derProduktentwicklung Umweltaspekte in die Planung zu integrieren.

Zum Schutz der Umwelt sollten Chemikalien, die während der Produktion oder

bei ihrer späteren Anwendung in die Umwelt gelangen können, bio-logisch

abbaubar sein. Auch die fortschrittlichste Anlagentechnik und

verantwortungsvollste Anwendung kann die diffuse Verbreitung geringer

Mengen in der Umwelt nicht gänzlich ausschließen. Deshalb wendet die Industrie

standardisierte Verfahren, wie beispielsweise den DOC-Abnahmetest, zur

Untersuchung der biologischen Abbaubarkeit neu entwickelter Substanzen und

Produkte an. Gängige Praxis bei der Entwicklung neuer Stoffe ist bisher ein auf

die gewünschten Eigenschaften konzentriertes Vorgehen. Die

Umweltverträglichkeit wird üblicherweise erst zu einem späteren Zeitpunkt

anhand der entwickelten Produkte überprüft. Die vorgeschriebenen Tests sind

langwierig und ihre Durchführung ist aufwendig. Stellt sich dann nach einer

mehrmonatigen Testphase heraus, daß die Abbaubarkeit der neuen Produkte

nicht den einschlägigen Richtlinien entspricht, ist eine Markteinführung

blockiert. Mißerfolge dieser Art verlangsamen die Entwicklung, sind teuer und

vergeuden unnötig Ressourcen. An diesem kritischen Punkt setzt das vom BMBF

geförderte Projekt an. In dem Forschungsvorhaben zur computer-gestützten

Neustoffentwicklung von ökologisch fortschrittlichen Produkten soll ein

wissensbasiertes System aufgebaut werden, das fundierte Prog-

nosen über die Abbaubarkeit von Stoffen ermöglicht. Dieses innovative System

kann breit eingesetzt werden: Hauptsächlich soll es Forschungslaboratorien bei

der Entwicklung abbaubarer Stoffe unterstützen und den Aufwand für Tests

reduzieren. So läßt sich der vorbeugende Umweltschutz schon in die

Produktplanung integrieren. Daneben soll es ältere Testergebnisse von bekannten

Stoffen überprüfen, da die früher durchgeführten Tests häufig nicht mehr den

heutigen Standards entsprechen. In ähnlicher Weise können widersprüchliche

Testergebnisse bewertet werden (Plausibilitätskontrolle). Nicht zuletzt soll das

Datenbanksystem mithelfen, die Abbaubarkeit von Stoffen generell zu beurteilen.

Obwohl umfangreiche Datenbestände existieren, liegen für einige Substanzen nur

unzureichende Untersuchungsergebnisse über deren Bioabbaubarkeit

Die frühzeitige Berücksichtigung und Vermeidung umwelt-relevanter Auswirkungen eines geplanten Produkts schon inder Entwicklungsphase ist eine der Hauptforderungen desintegrierten Umweltschutzes. Ein wichtiges Maß für dieUmweltverträglichkeit chemischer Substanzen ist ihre biolo-gische Abbaubarkeit, die neben Toxizität und Ökotoxizität desStoffs zu Recht für eine ökologische Bewertung herangezogenwird. Mit einem System, das die Beurteilung der biologischenAbbaubarkeit neuer Produkte schon in der Konzeptphaseermögiicht, lassen sich ökologische und ökonomischeFehlentwicklungen rechtzeitig verhindern.

vor. Zwar werden lange bekannte Stoffe in einer Vielzahl von Forschungs-

vorhaben untersucht, von einer umfassenden Kenntnis und systematischen

Aufarbeitung der biologischen Abbaubarkeit von Stoffen ist die Wissenschaft

jedoch noch weit entfernt. Auch in der Nachsorge soll mit Hilfe der Datenbank

bei Produktionsstörungen und Störfällen eine schnelle Bewertung der

Umweltauswirkungen ermöglicht werden. Insbesondere nach Unfällen mit diesen

Substanzen kann dieses Wissen frühzeitig die entscheidenden Hinweise zur

Minimierung negativer ökologischer und ökonomischer Auswirkungen geben.

In diesem Forschungsvorhaben arbeiten Industrie und Universitäten Hand in

Hand. Das Labor für Ökologie der BASF stellt möglichst viele der weltweit

verfügbaren Daten zur Abbaubarkeit strukturanaloger Chemikalien zusammen

und bewertet die vorliegenden Testergebnisse. Die Universität Konstanz

untersucht die Gesetzmäßigkeiten des mikrobiologischen Abbaus, die sich aus

diesen Daten ableiten lassen. Anhand dieser Erkenntnisse baut die Universität

Heidelberg ein datenbankgestütztes Expertensystem auf, das im Laufe des

Projekts auf die speziellen Anforderungen hin optimiert wird.

Testergebnisse zum toxikologischen und ökotoxikologischen Verhalten

sowie zur biologischen Abbaubarkeit bereits untersuchter Stoffe und die

zugehörigen Strukturdaten und physikochemischen Kenngrößen sind weltweit

bereits heute in mehreren Datenbanksystemen abrufbar (beispielsweise in

„IUCLID", „BEILSTEIN" und „ACD"). Ein umfassendes,

anwendungsorientiertes System, das die vorhandenen Erkenntnisse mit der

Zielrichtung einer integrierten Produktplanung bündelt, fehlt aber noch. Das

geplante wissensbasierte System geht über die bestehenden Datenbanken hinaus,

die Testergebnisse lediglich dokumentieren: Das Exper-

tensystem soll nicht nur prozentuale Wahrscheinlichkeiten der Abbaubarkeit

liefern, sondern vielmehr durch die Erforschung der Zusammenhänge zwischen

Molekülstruktur und Abbauverhalten zusätzlich zu den vorhandenen Daten eine

wissenschaftlich fundierte Bewertung der mikrobiellen Abbaubarkeit für

einzelne Stoffklassen ermöglichen. Diese Übertragung von Detailwissen über

bereits untersuchte Substanzen auf neu synthetisierte Stoffe ermöglicht die

Integration des Umweltschutzes bereits in die Produktplanung. Die

umfangreichen Untersuchungen, die BASF im Laufe der Jahre zur biologischen

Abbaubarkeit der von ihr entwickelten und eingesetzten Chemikalien

durchgeführt hat, bilden die Grundlage der Datenbank. Ergänzt werden diese

Daten durch die Recherche in den bestehenden weltweiten Datenbanken und die

Bewertung der auf diese Weise erhaltenen Informationen. Aus diesem Datenpool

wird auf der Basis bereits entwickelter Software (ISIS) eine Verknüpfung der

angebundenen Datenbanken durchgeführt. Die im Rahmen des Projektes

zusammengestellte Datenbank bündelt und strukturiert also die vorhandenen

Informationen aus einer Vielzahl unterschiedlicher Quellen. Das Ziel ist eine

möglichst umfassende Ermittlung aller umweltrelevanten Daten, um so

Gesetzmäßigkeiten für gleichartige Stoffe oder chemische Strukturen ableiten zu

können. Die biologische Abbaubarkeit hängt unter

Auch außerhalb der Produktentwicklung besteht ein großerBedarf nach schnell verfügbaren aussagekräftigenUmweltinformationen. Droht bei Unfällen die Verschmutzung vonGewässern oder Böden, oder sind Altlasten zu bewerten, könntedas Expertensystem in kurzer Zeit wichtige Hinweise zumbiologischen Abbau von Stoffen geben und damit zu einerschnellen Schadensbegrenzung beitragen.

anderem von der Art der funktionellen Gruppen, der räumlichen Struktur und der

Größe des Moleküls ab. Dabei bewirken oft schon geringe Abweichungen in der

Molekülstruktur große Unterschiede in der Abbaubarkeit. Um also für nicht

getestete Substanzen Vorhersagen treffen zu können, muß das Wissen über

möglichst viele ähnliche Stoffe verfügbar sein. Als Ergebnis der Untersuchungen

zu den Abbaumechanismen wird eine valide Übertragbarkeit von der biologischen

Abbaubarkeit eines bekannten Stoffs auf einen unbekannten Stoff angestrebt.

Auf der Basis dieser Erkenntnisse soll an der Universität Heidelberg ein

Expertensystem programmiert werden, das Aussagen zu bisher nicht untersuchten

Substanzen treffen kann. Dieses Expertensystem ist so konzipiert, dass neue

Erkenntnisse jederzeit eingearbeitet werden können. Es vergleicht von ihm

erkannte chemische Strukturen, insbesondere funktionelle Gruppen und

Bruchstücke von Molekülen, mit den Einträgen in der Strukturdatenbank. Finden

sich gleiche oder ähnliche Molekülgrup-

pen in der Datenbank, werden die zugehörigen Untersuchungsergebnisse in der

Rangfolge der Ähnlichkeit dieser Stoffe tabellarisch zusammengestellt.

Als Arbeitsoberfläche wird die Standardsoftware Excel von Microsoft so

gestaltet, daß nach der Eingabe der gesuchten chemischen Substanz die Recherche

in den Datenbanken automatisch durchgeführt wird. Benutzerfreundlichkeit steht

bei der Gestaltung der Ein- und Ausgabemasken im Vordergrund. Die zu

untersuchende chemische Struktur läßt sich frei in ein Zeichenprogramm

eingehen, der Computer sucht dann automatisch die zugehörige chemische

Verbindung. Ist die eingegebene Struktur nicht exakt in der Datenbank

verzeichnet, tritt das Informationssystem in Aktion. Es sucht ähnliche Stoffe und

gibt die zugehörigen Daten zunächst tabellarisch aus. Sämtliche Angaben zu den

biologischen Abbaudaten, den verwendeten Testmethoden aber auch die

chemischen und physikalischen Kenndaten sowie Literaturhinweise sind diesen

Tabellen zu entnehmen. Zur Veranschaulichung und Interpretation der gefundenen

Ergebnisse steht den Tabellen ein Grafikmodul zur Seite, mit dem sich

beispielsweise Beziehungen zwischen der Abbaubarkeit und möglichen sonstigen

Molekülbausteinen analysieren und übersichtlich darstellen lassen. Insbesondere

dann, wenn viele unterschiedliche Testergebnisse zu der untersuchten Struktur

gefunden werden, ist die mathematische Aufbereitung zur Strukturierung der

Informationen hilfreich. So lassen sich aus differierenden Angaben, die häufig aus

den unter-schiedlichen Testmethoden resultieren, wissenschaftlich nachvollzieh-

bare Prognosen ableiten. Gerade diese Innovation gegenüber bestehenden

Datenbanksystemen macht das Expertensystem zu einem wertvollen Hilfs- mittel

der umweltintegrierten Produktplanung.

Redaktion Prognos GmbHDovestraße 2-4 • 10587 Berlin

Gestaltung Hayn/Willemeit Media GmbHMommsenstraße 47 • 10629 Berlin

Druck Druckhaus Berlin-Mitte GmbHSchützenstraße 18 • 10108 Berlin

Stand 4/99gedruckt auf chlorfrei wiederaufbereitetem PapierFotos mit freundlicher Genehmigung der Unternehmen

BASF AGExperimentelle Toxikologie undÖkologieLabor für Ökologie67056 LudwigshafenDr. Beimborn (Projektleiter)Telefon +49 (o) 621 / 605 82 24Telefax +49 (o) 621 / 605 80 43E-Mail [email protected]

Ruprecht-Karls-Universität HeidelbergInstitut für Med. Mikrobiologieund HygieneFakultät für Klinische Medizin MannheimPostfach 10002368135 MannheimPriv.-Doz. Dr. Mersch-SundermannTelefon +49 (o) 621 / 383 32 51Telefax +49 (o) 621 / 383 3816E-Mail [email protected]

Fakultät für Biologie der Universität Konstanz78457 KonstanzProf. Dr. SchinkProf. Dr. CookTelefon +49 (o) 7531 / 88 21 40 bzw. 8842 47Telefax +49 (o) 7531 / 88 29 66E-Mail [email protected] [email protected]

Herausgeber

DLR

Bezug

Bundesministerium fürBildung und ForschungReferat 423 - integrierter Umweltschutzin der Wirtschaft; UmwelttechnikHeinemannstraße 2 • 53175 BonnTelefon +49 (o) 228 / 57 34 81www.bmbf.de

Deutsches Zentrum für Luft- undRaumfahrt e. V.Projektträger Umweltforschung und-technik des BMBFSüdstraße 125 • 53175 BonnTelefon +49 (o) 228 / 38212 01email: [email protected]/PT

BMBF - Referat ÖffentlichkeitsarbeitTelefax +49 (o) 228 / 57 3917email: [email protected]

SCHLUSSBERICHT - cleaner-production.de · borpraxis (GLP Good Laboratory Practice) durchgeführt....

Documents

Transcript of SCHLUSSBERICHT - cleaner-production.de · borpraxis (GLP Good Laboratory Practice) durchgeführt....