Screening nach neuen Wirkstoffen – was kann man von ... · 3 Eine Lösung? • Computer-Aided...
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Screening Screening nachnach neuenneuenWirkstoffenWirkstoffen –– was was kannkann
man von computerman von computer--basiertenbasierten MethodenMethoden
erwartenerwarten??
Prof. Dr. Wolfgang SipplInstitut für Pharmazie
Martin-Luther-UniversitätHalle-Wittenberg
WirkstofforschungWirkstofforschung heuteheute
2
Hoher Aufwand Hoher Aufwand –– Steigende KostenSteigende Kosten
Jahre
Phase I
> 100.000 neue
Verbindungen
Klinische PhasenPhase II
Phase III
Zulassung
PräklinischeForschung 20
10
1
1000 Mio $ArzneimittelEntwicklungsphasen
0 2 4 6 8 10 12
22
55
Wie Wirkstoffe effizient finden?Wie Wirkstoffe effizient finden?
Wirkstoffforschung ist…
Die Suche nach der Nadel im Heuhaufen
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Eine LEine Löösung?sung?• Computer-Aided Drug Design
1970-1980 Erste Computer-Grafik Systeme(Tektronix, Silico Graphics, …)
• Computer-Aided Drug Design
1970-1980 Erste Computer-Grafik Systeme(Tektronix, Silico Graphics, …)
Eine LEine Löösung?sung?
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Eine LEine Löösung?sung?• Computer-Aided Drug Design
Time
Expe
ctat
ion
Neuer Neuer HypeHype in den 80ern: CADD in den 80ern: CADD
5
Time
Fortune 1981: Fortune 1981: „„NextNext industrialindustrial revolutionrevolution““
Einsatz CADD heuteEinsatz CADD heute
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GlivecGlivec®®
Blockiert die Blockiert die TyrosinTyrosin KinaseKinase BCRBCR--ABL ABL –– die in die in -- 90% aller chronischen 90% aller chronischen myeloidenmyeloiden LeukLeukäämie Fmie Fäälle lle üüberaktiv ist (beraktiv ist (GendefektGendefekt, Philadelphia Chromosom), Philadelphia Chromosom)
NH
N
N NH
N
NR N NH
N
NNH
R
O
N
NH
O
NN N
HN
N
N
Hit PKC Optimierter Hit - Leitstruktur AmideATP Mimic
Imatinib (Glivec®)BCR-ABL Tyrosin Kinase Inhibitor (u.a. PDGFR, c-KIT, ...)
ProteinProtein--Ligand KristallstrukturLigand Kristallstruktur
Die frühzeitige Aufklärung der 3D Struktur der cABLKinase lieferte Hinweise für die Optimierung des Wirkstoffes
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ImatinibImatinib
Imatinib
Wie lassen sich effizient neue Wirkstoffe mit Wie lassen sich effizient neue Wirkstoffe mit computercomputer--basiertenbasierten Methoden finden?Methoden finden?
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Virtuelles ScreeningVirtuelles Screening
Substanzdatenbanken Protein 3D Struktur
Sortierung
BiologischeTestung
• Verwaltung großer Datenbanken mit verfügbaren Verbindungen
• Filterung Arzneistoff-ähnlicher Verb.• Suche nach chemisch ähnlichen Verb. mit
hoher Chance auf biol. Aktivität• Suche nach Verb. mit Hilfe eines
Pharmakophormodells• Docking von Verb. in 3D Strukturen
von Targetproteinen• Auswahl von Verb. für biol. Testung
Virtuelles ScreeningVirtuelles Screening
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Suchmethoden fSuchmethoden füür Molekr Moleküülele
Form
MolekulareFelder
AD
DAr
3D Pharmakophore
3-PunktPharmakophore
Fragmente
2D- Fingerprints
2D- Fingerprints
N
NH
NH3+
Atom Pfade
Graphen
PharmakophorPharmakophor ModelleModelle
Chemische Features die für die Auslösung des biol. Effekts relevantsind
Ligand-basierte Pharmakophormodelle: Vergleich mehrerer MoleküleStruktur-basierte Pharmakophormodelle
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StrukurStrukur--basierterbasierter PharmakophorPharmakophor
Anordnung von chemischen Features, die für die biol. Wirkungrelevan sind
Chemische Features: - Electrostatische WW- H-Brücken- Hydrophobe WW
LigandScout, Inteligand
ProteinProtein--Ligand Docking/Ligand Docking/ScoringScoring
Bindungsstärke?
Ligand Docking und Ligand Docking und ScoringScoring
Sampling Problem Scoring Problem
Score
11
0
60
120
180
240
300
360
1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 und größer
bis RMSD
Num
bers
,00%
20,00%
40,00%
60,00%
80,00%
100,00%
120,00%
Cum
lativ
e %
< 2.5 Å RMSD: GOLD/ Goldscore 78%ParaDocks 79%GOLD/ Chemscore 69%
~800 Protein-Ligand Komplexe
Reproduktion der experimentell bestimmten Ligand-Struktur
Genauigkeit DockingGenauigkeit Docking
RMSD - Maß für Genauigkeit
Vorhersage der BindungsstVorhersage der Bindungsstäärkerke
Score
12
VirtuellesVirtuelles Screening Screening alsals effizienteeffizienteMethodeMethode zurzur AuffindungAuffindung erstererster
biologischbiologisch aktiveraktiver VerbindungenVerbindungen
BeispielBeispiel: Histon: Histon--ArgininArgininMethyltransferaseMethyltransferase PRMT1PRMT1
HistonHiston--MethyltransferasenMethyltransferasen
•• Arg/Arg/LysLys Methylierung reguliert die Interaktion Methylierung reguliert die Interaktion der Histone mit der DNA und steuert die der Histone mit der DNA und steuert die epigenetischeepigenetische RegulationRegulation
•• Histone Arginine Methyltransferases (PRMT)Histone Arginine Methyltransferases (PRMT)•• PRMTs sind SAM abhPRMTs sind SAM abhäängige Enzymengige Enzyme•• Methylieren Histone und Methylieren Histone und NichtNicht--HistonproteineHistonproteine
N
N N
N
NH2
O
OH OH
S+
NH3+
COO
CH3
N
N N
N
NH2
O
OH OH
S NH3+
COO
PRMTsPRMTs
SAM + Arg---Histone SAH + N-Methyl-Arg---HistoneSo, CW et al. Nat. Cell. Biol. 10, 1208, 2007
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hPRMT1 mit hPRMT1 mit KofaktorKofaktor SAM und ArgSAM und Arg
rat PRMT3 rat PRMT1
Histon SubstratBindungstasche
Virtuelles ScreeningVirtuelles Screening
Substanzdatenbanken Protein 3D Struktur
Sortierung
BiologischeTestung
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Virtuelles ScreeningVirtuelles Screening
• Verwendete Datenbanken• NCI Diversity Datenbank ~2 000 Verbindungen• Chembridge Datenbank ~400 000 Verbindungen
• Verwendung von 3D Strukturen• Stereoisomere, Tautomere, Protonierung, Konformationen
• Arzneistoff-Filter • Drug-likeness, ADME Filter
• Ligand Docking• 3D Struktur der Substratbindungstasche PRMT1• Visuelle Auswertung Bindungsmodus
• Auswahl von 36 Verbindungen • In vitro Testung humane PRMT1• 7 Inhibitoren mit IC50 1.7 – 76 µm
Spannhoff A, et al., J Med Chem 50, 2319, 2007
PRMT1 InhibitorenPRMT1 Inhibitoren
NH
N
O O
O
ONH
S
NH2
O
O
(1)
NH
NH2
NH
NH2
(2)(2) 1.7 µM IC50 hPRMT1 (3) 55 µM
NSC35605
Spannhoff A, et al., J Med Chem. 50, 2319, 2007
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ZellulZellulääre re AktivititAktivititäätt / Selektivit/ Selektivitäät t
25 50 1502
0
25
50
75
100
Met
hyla
tion
leve
l (%
)
25 50 150 µM
H4R3 H3K4 (SET7/9)
Hypomethylierung in HepG2 ZellenSelektivität für Histon H4R3
25 50 150 25 50 15
0 25 50 150
0
25
50
75
100
1 2 3
c(µM)
Met
hyla
tion
leve
l (%
) AMI-1
Substrat-kompetitiv
NH
NH2
NH
NH2
(2)
NSC 35605
µM
HighHigh--ThroughputThroughput ScreeningScreening• Biol. Testung von 9 000 strukturell diversen
Verbindungen (Chembridge Diversity) lieferte 9 aktive Inhibitoren – meist SAM Analoge (Hit Rate ~0.1 %)
• Nur eine Nicht-SAM Verbindung mit Selektivität gegenüber PRMT1 identifiziert
OH
NH
NH
O
OH
SO3O3SNa
+Na
+
- -AMI-1
HighHigh--ThroughputThroughput--ScreeningScreening
Bedford et al. J Biol Chem 279, 23892, 2004
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SucheSuche nachnach WirkstoffenWirkstoffen wennwenn keinekeine 3D 3D StrukturStruktur des Targetproteins des Targetproteins verfverfüügbargbar
istist
BeispielBeispiel: : SucheSuche nachnach neuartigenneuartigenHistaminHistamin HH33--AntagonistenAntagonisten
HH33 Rezeptor Rezeptor
• Keine 3D Struktur des H3 Rezeptors verfügbar
• GPCR
• Membranprotein
• Wichtiger Auto/Hetero
Rezeptor im ZNS
• Antagonisten zur
Steigerung kognitiver
Funktionen
Homologiemodell des H3 Rezeptors
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PharmakophorPharmakophor ModellierungModellierung
Datensatz mit aktiven H3 Antagonisten
H3 Pharmakophor Modell
PharmakophorPharmakophor ModellModell
CATALYST
Validierung anhand aktiver Antagonisten (~400)Diskriminierung aktiver und inaktiver Verbindungen
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Wie sensitiv ist der Wie sensitiv ist der PharmakophorPharmakophor??
Datenbank mit 13 000Verb. versus
H3 Antagonisten
Virtuelles ScreeningVirtuelles Screening
• Datenbank• Maybridge Database ~55 000 Verbindungen
• 3D Strukturen (~13000)• Stereoisomere, Auswahl von basischen
Verbindungen• Pharmakophor Modell - CATALYST
• Validiert an 418 aktiven Liganden• Ligand Docking GOLD (~1700)
• Visuelle Analyse des Bindungsmodus • Auswahl von 7 Verbindungen für die
biologische TestungSchlegel, B. et al. JCAMD 2007
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NH
NH
ON S N
O
NCl
NN O
Cl
CF3
CF3NH
NH
S
NO
CF3
CF3
N
NO
N N
O N
N CF3
CF3
NH
ClNH
OCl
SO
N
HTS-07217 PD-00043 RJC-03033
BTB-12683 CD-04850 CD-06177
BTB-08079
Getestete VerbindungenGetestete Verbindungen
- Alle 7 aktive Antagonisten mit Ki zwischen 79 nM – 6 µM- 2 Potente Antagonisten (nM) mit neuem Chemotyp
BTBBTB--0807908079
KI 79 nM hH3
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ÄÄhnlichkeit zu bekannten Antagonistenhnlichkeit zu bekannten Antagonisten
0.4587.8979BTB-08079
0.5682.212958CD-06177
0.4760.136258CD-04850
0.5165.973655BTB-12683
0.5981.10383RJC-03033
0.5579.211024PD-00043
0.4572.892459HTS-07217
Tanimoto Coefficient
GoldScoreKi (nM)Compound
Chemische Ähnlichkeit
WieWie lassenlassen sichsich WirkstoffeWirkstoffe mitmit HilfeHilfe von von computercomputer--basiertenbasierten MethodenMethoden
optimierenoptimieren??
BeispielBeispiel: : BerechnungBerechnung der der freienfreienBindungsenergieBindungsenergie von Proteinvon Protein--Ligand Ligand
KomplexenKomplexen mitmit MolekMoleküüldynamikldynamikSimulationenSimulationen
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Freie BindungsenergieFreie Bindungsenergie
Ligand-protein Komplex
Wassermoleküle
∆Sint
∆H, ∆Shydr∆H, ∆Sinserted water
∆HDR
Wee1 Kinase Wee1 Kinase
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MolekMoleküüldynamik Simulationldynamik SimulationBetrachtung der Protein-Ligand Interaktion mittels Moleküldynamik Simulation
MMMM--PBSAPBSA
144 Wee1 Kinase Inhibitoren
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VorhersageVorhersage
30 neue Inhibitoren
Ziel: Ziel: SelektivititSelektivititäätsplotstsplots ffüür Kinasenr KinasenSelektivitätsplots für verschiedene Inhibitoren an verwandten Kinasen
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ZusammenfassungZusammenfassung
•• ComputerComputer--basiertebasierte Methoden als Methoden als essentieller Bestandteil der essentieller Bestandteil der präklinischenpräklinischenWirkstoffforschungWirkstoffforschung
•• Wichtig als Ideengenerator für die Wichtig als Ideengenerator für die Synthese und TestungSynthese und Testung
•• Virtuelles Screening liefert oft Virtuelles Screening liefert oft komplementäre Treffer zum HTSkomplementäre Treffer zum HTS
•• Ziel: Schnelle Vorhersage der Profile von Ziel: Schnelle Vorhersage der Profile von Wirkstoffen (Selektivitäten, Wirkstoffen (Selektivitäten, AntiAnti--TargetTargetEffekte, ADME)Effekte, ADME)
AcknowledgementsAcknowledgements• Dr. Sonja Schlimme - Suhaib Shekfeh• Dr. Rene Meier - Luca Carlino• Urszula Uciechowska - Ralf Heinke• German Erlenkamp• Martin Pippel• Kanin WichapongMartin-Luther-Universität
Halle-Wittenberg
Albert-Ludwigs-UniversitätFreiburg
• Prof. Manfred Jung• Dr. Astrid Spannhoff• Jörg Schemies• Martin Schmitt• Dr. Robert Neugebauer
Heinrich-Heine-UniversitätDüsseldorf
• Prof. H.-D. Höltje• Dr. Birgit Schlegel
Universität Regensburg • Prof. R. Seifert• David Schnell
Johann-Wolfgang-GoetheUniversität Frankfurt
• Prof. H. Stark
Leopold-Franzens UniversitätInnsbruck
• Prof. Thierry Langer• Dr. Gerhard Wolber• Dr. Christian Laggner
Funding: EU FP7, DFG, Krebshilfe, Sander Stiftung, Land Sachsen-Anhalt