�Analytik�

Screeningverfahren für Dioxin- und PCB-Kontrollen

Roland Herterich, Stephan Schröder

Der aktuelle Entwurf zur Änderung der Futtermittelverordnung sieht vor, dass Hersteller und

Überwachungsbehörden das Dioxin- und PCB-Monitoring ausweiten. Probenaufkommen

und die Nachfrage nach kostengünstigen Dioxin-und PCB-Analysen werden daher ansteigen.

Erfordern diese Grenzwertprüfungen immer den Einsatz der hochauflösenden Massenspektrometrie?

� Als Konsequenz aus dem jüngsten Fall von Dioxin in Futtermitteln hat das Bundeslandwirtschaftsministerium im Februar einen Gesetzentwurf zur Änderung der Futtermittelverordnung (FuttMV) vorgelegt: Ein Aktionsplan zur Dioxinsicherheit verpflichtet die Futtermittelbetriebe zu einer eng-maschigeren Eigenkontrolle. Die Be-hörden der Länder sind angehalten, schärfer zu überwachen, ob die Betrie-be die FuttMV umsetzen. Eckpunkte des Aktionsplans „Verbraucherschutz in der Futtermittelkette“ sind chargen-bezogene Dioxinprüfungen in Vorpro-dukten und Fertigfuttermitteln. Außer-dem müssen alle Prüfeinrichtungen ih-re Einzelergebnisse für alle 17 poly-chlorierten Dibenzo-p-Dioxine und Di-benzofurane (PCDD/F) an das Bundes-amt für Risikobewertung (BfR) über-mitteln. Die kostengünstigen Bioassay-Verfahren, die nur einen Gesamt-dioxinwert ausgeben, werden damit an Akzeptanz einbüßen.

Mit der neuen Überwachungspra-xis wird das Probenaufkommen stei-gen. Müssen alle diese Proben mit hochauflösender Massenspektrome-trie (HRMS) geprüft werden, oder erfüllt auch niedrig auflösende Mas-senspektrometrie, zum Beispiel Sin-gle-Quad-MS, den Zweck – das Er-kennen von Höchstwertüberschrei-tungen? Sie hat das Potenzial, die Prüfkosten zu reduzieren.

Gesetzliche Regelung

� Die Verfahren zur amtlichen Kon-trolle von Lebens- und Futtermitteln stehen in der Verordnung EG 1883/2006 Anhang II.1) Hier stehen die Anforderungen an das GC/MS-Screening-Verfahren – Single-Quad-

MS, Trap-MS oder Triple-Quad-MS – für einen hohen Probendurchsatz auf sowie an die GC/HRMS, welche die Ergebnisse absichert, wenn Grenzwerte überschritten sind.

Ein Abschnitt der Verordnung be-sagt, dass Screening-Verfahren für al-le Proben mit weniger als 25 Prozent

Nachrichten aus der Chemie | 59 | Mai 2011 | www.gdch.de/nachrichten

2,3,7,8- NWG Messwert WHO-TEF- WHO-TEQ PCDD/F pg•g–1 pg•g–1 2005 pg•g–1

TCDD 0,05 n.n. 1,0000 0,0500 PeCDD 0,05 n.n. 1,0000 0,0500 4-PeCDF 0,05 n.n. 0,3000 0,0150 HxCDD/F 0,05 n.n. 0,1000 0,0050 HpCDD/F 0,10 n.n. 0,0100 0,0010 TCDF 0,05 n.n. 0,1000 0,0050 OCDD/F 1,00 n.n. 0,0003 0,0003 andere n.n. 0,1–0,01 0,0360 PCDD/F-TEQ 0,16

no-WHO- PCB-126 1,0 n.n. 0,10000 0,1000 PCB-169 1,0 n.n. 0,03000 0,0300 PCB-77 5,0 n.n. 0,00010 0,0005 PCB-81 5,0 n.n. 0,00030 0,0015 mo-WHO- PCB-118 20 n.n. 0,00003 0,0006 PCB-156 20 n.n. 0,00003 0,0006 andere 20 n.n. 0,00003 0,0040 PCB-TEQ 0,14

Gesamt WHO-TEQ ohne NWG 0,00 Gesamt WHO-TEQ mit 1 x NWG 0,30 Höchstwert WHO-TEQ mit 1 x NWG 1,25

Ergebnisse für Dioxine und WHO-PCB (gekürzt) für einen unauffälligen Getrei-

derohstoff. Erforderliche Nachweisgrenze (NWG) nach dem 25-%-Kriterium aus

EG Nr 1883/2006 Anhang II.1) (TEF: Toxizitätsäquivalenzfaktor, TEQ: Toxizitäts-

äquivalente).

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des Grenzwertes ausreichen. Für ein Futtermittel mit dem Höchstwert von 0,75 pg·g–1 2) ist das Screening somit bis zu einem Messwert von

0,19 pg·g–1 juristisch gültig. Berück-sichtigt man im Screening die dioxin-ähnlichen PCB (WHO-PCB) beträgt der Gesamthöchstwert 1,25 pg·g–1

PCDD/ F-PCB-Toxizitätsäquivalente (TEQ). Das GC/MS-Screening-Verfah-ren muss nach der 25-%-Grenze also wenigstens eine Nachweisgrenze (NWG) von 0,19 pg·g–1 PCDD/F-TEQ und 0,14 pg·g–1 PCB-TEQ erreichen.

Die Nachweisgrenzen errechnen sich aus der Summe der Einzelergeb-nisse für 17 PCDD/F- und 12 PCB, wobei die Toxizitätsäquivalentfak-toren (TEF) der Einzelsubstanzen zu 2,3,7,8-Tetrachlordibenzodioxin (TCDD) in die Gewichtung einbezo-gen werden. Daher müssen solche Analyte, die einen hohen TEF auf-weisen, wenigstens mit einer Nach-weisgrenze von 0,05 pg·g–1 detektiert werden. Für OCDD oder andere we-niger toxische PCB reichen dagegen 1 pg·g–1 bis 20 pg·g–1 aus (Tabelle).

Stärken der HRMS

� Bei einer Probeneinwaage von 20 g und der Anreicherung des TCDD in 20 µL Toluol sind bei 5 µL Injektionsvolumen (Abbildung 1) 0,05 pg mit einem Signal-zu-Rausch-Verhältnis von 3:1 zu messen. Single-Quad-GC/MS-Geräte der neusten Ge-neration, beispielsweise das GCMS-QP2010 Plus, leisten das in matrix-freien Kalibrierlösungen mühelos. In-wieweit diese Nachweisgrenze auch in einer Futtermittelmatrix oder Fett-matrix erreichbar ist, hängt von der Reinheit der Extrakte und von der Se-lektivität des MS für den Analyten ab. Die Selektivität ist neben der bis zu zehnfach höheren Empfindlichkeit die Stärke der HRMS.

Die Fokussierung des Detektors auf die exakte Masse des TCDD von m = 321,894 u bei einer Peakhalb-wertsbreite w1/2 = 0,03 u blendet Ma-trixkomponenten mit weniger Chlor ato men oder chlorfreie Mole-küle aus, selbst wenn diese eine ähn-liche Masse aufweisen. Insbesondere diese hohe Spezifität, die mit einer Massenauflösung von R ≈ 10 000 (zu R siehe Abbildung 2) erzielt wird, macht die HRMS bei komplexen Ma-trizes unverzichtbar.

Es ist zeitraubend, aus Milch, Ei-ern oder magerem Fleisch ausrei-chende Fettmengen zu gewinnen. Werden wie bei der HRMS nur 2 g Fett anstatt 10 g benötigt, um die Nachweisgrenze zu erreichen, kön-nen Automaten die Matrixabtren-nung übernehmen. Daher ist für Fleischproben mit Fettgehalten un-ter 5 % oder homogenisierte Milch die einfache MS selbst als Vorab-Screeningverfahren keine Alternati-ve zur HRMS.

Probenpräparation für das Single-Quad-MS

� Für eine reine Höchstwertkon-trolle bei Futtermitteln nach EG-Verordnung ist ein GC/MS-Scree-ningverfahren preisgünstiger. Da hier die Probeneinwaage fünf Mal so hoch sein muss wie bei der HRMS, um die Nachweisgrenze zu errei-chen, lässt sich die Probenvorberei-tung zwar kaum automatisieren. Aber das muss kein Nachteil sein, wenn die Probenbearbeitung (Abbil-dung 1) individuelle Probeneigen-schaften berücksichtigt und mit Er-fahrung und minimalen Mengen an Verbrauchsmaterialien ausgeführt wird. Wesentliche zusätzliche Ele-mente in der Matrixabtrennung ge-genüber einer Probenvorbereitung mit einer Autoprep3) sind die vor-geschaltete Fettzerstörung durch Ausschütteln gegen konzentrierte Schwefelsäure sowie die letzte Fett-abtrennung mit miniaturisierter GPC. Die so gewonnenen Extrakte weisen eine sehr hohe Reinheit auf und gewährleisten eine hohe Ro-bustheit des Single-Quad-MS-Sys-tems mit geringen Standzeiten.

Screening mit Single-Quad-GC/MS

� Die Anforderungen aus EG 1883/2006 Anhang II zur Qualität der HRMS-Messung erfüllt aus-nahmslos auch ein Single-Quad-Massenspektrometer. Auch die im Bestätigungsverfahren geforderten Bestimmungsgrenzen von kleiner als 20 % des Höchstwerts sind durch hö-here Probeneinwaagen in der Routi-

Abb. 1. Probenvorbereitung für eine Dioxin- und PCB-Grenzprüfung

mit Single-Quad-MS.

20 g gemahlene Vormischung+ 0,2/2,0 ng 13C PCB

+ 20/40 pg 13C PCDD/F

SPE Extraktion mit Toluol

Lösemittelwechsel in0,5 L Hexan

10 g Fett mit13C Std in0,5 L Hexan

Fettzerstörung mit H2SO4

H2SO4/Kieselgel/NaOH Säule0,75 L Hexanextrakt

Mini GPC: 10 mL Hexaneluat

PCB/PCDF Fraktionierung3 mal 5 mL Eluate

Finale Extrakte zur Injektionmo PCB 1 mLno PCB 0,1 mLPCDD/F 20 μL

� QUERGELESEN

• Nach EG-Verordnung können zur Höchstwertkon-

trolle von Dioxinen und PCB in Futtermitteln auch

Single-Quad-Massenspektrometer eingesetzt

werden, wenn die Befunde 25 Prozent der jeweili-

gen Grenzwerte nicht überschreiten.

• Single-Quad-MS neueren Typs erreichen die gefor-

derte Empfindlichkeit mit verbesserter Spezifität

und bieten damit eine Alternative zur hochauf-

lösenden MS (HRMS).

• Bei Proben mit aufwendiger Fettgewinnung, etwa

bei magerem Fleisch oder Milch, ist die empfindli-

chere HRMS auch unter wirtschaftlichen Aspek-

ten jedoch weiterhin das Verfahren der Wahl.

�Blickpunkt� Analytik 548

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Abb. 2. Beispiel Decachlorbiphenyl (PCB209), Peakhö-

hen für drei benachbarte Massen mit dm=0,3 u ≈ w1/2

und R=1660. R = u/w1/2 bzw. R = u/dm.

ne machbar, und das, obwohl man bewusst die Empfindlichkeit senkt, um eine höhere Spezifität zu errei-chen, denn diese muss beim Scree-ning im Vordergrund stehen.

Dazu ist das MS mit verminderter Ionisierungsenergie und einer etwa zweifachen Auflösung von R ≈ 2000 zu betreiben. Die Querempfindlich-keit zu einer koeluierenden Matrix-kompenente ist damit merklich ge-ringer als bei der üblichen Auflösung von R ≈ 1000,4) (Abbildung 2). Das Spektrum zeigt mit R = u/dm eine Auflösung von R>1660.4) Nach der 10-%-Definition der Auflösung darf im Abstand dm = 0,3 u von der Masse m = 497,7 u noch eine Intensität von 10 % des Peakmaximums vorliegen.

Um die Auflösung in Abbildung 2 darzustellen, wurde das stärkste Ion mit der exakten Masse von 497,68 u auf der Masse 497,7 u und im Ab-stand dm = 0,3 u auch auf 497,4 und 498,0 u aufgezeichnet. Diese Neben-massen existieren nicht real, son-dern verraten sich als von der richti-gen Flugbahn abgekommene Mas-sen 497,68 u. Je höher die Signale für diese neben der exakten Spur fliegenden Ionen, desto geringer die aktuelle Auflösung.

Tatsächlich beträgt die Peakhöhe in Abbildung 2 für 498,0 u (blaue Li-

nie) nur noch etwa 4 % des Maxi-mums, das korrekt auf der Zielmasse 497,7 u liegt. Ein benachbartes, reales Störion der Masse 498,0 u, das die gleiche Intensität wie die Zielmasse 497,7 u aufweist, würde das Messsig-nal für das Zielion 497,7 u nur um 4 % erhöhen.

Der Aufnahme ging ein Tuning mit einer Halbwertsbreite von w1/2 = 0,35 u voraus. Bei Tunes mit w1/2 = 0,30 u war es sogar möglich, die Intensität beider simulierter Ionen (497,4 u und 498,0 u) über zehn Injektionen auf <1,5 % der Höhe von 497,7 u zu hal-ten. Diese für ein Single-Quad-MS sta-bil hohe Auflösung geht zu Lasten der Empfindlichkeit. Die Berichtsgrenze von 0,05 pg·g–1 je Einzelsubstanz in der Matrix lässt sich dennoch realisie-ren, wie die Messwerte für HpCDD = 0,08 pg·g–1 und HpCDF = 0,05 pg·g–1

in einer Körnermaisprobe zeigen (Ab-bildung 3).

Ein einfaches, üblicherweise nur ganzzahlig auflösendes MS, läuft in der Routine robust und mit einer Auf-lösung von R ≈ 2000 auch sensitiv ge-nug. Einer weiteren Steigerung von R setzt die Quadrupoltechnik Grenzen. Bei einer Massengenauigkeit von ef-fektiv 0,1 u sind Separationsintervalle von weniger als 0,1 u nicht sinnvoll. Die Richtigkeit der Massenkalibrie-

rung, die sensibel auf Temperatur-schwankungen reagiert, ist zudem für jede Injektion zu gewährleisten.

Dafür bietet sich das PCB209 an. Es fungiert als Wiederfindungsstan-dard für die zudotierten 13C-Surroga-te und als lock mass. Konstante Flä-chenverhältnisse der Signale auf m/z = 497,7; 498,0 und 497,4 dokumen-tieren die korrekte Massenkalibrie-rung in Nachahmung der Autojustie-rungsfunktion bei HRMS-Geräten. Die Funktion einer zweiten „lock mass“ für den niedrigeren Massen-bereich kann das 13C-markierte 1,2,3,7,8-PeCDF mit den zusätzli-chen SIM-Ionen m/z = 351,7; 352,1 sowie 339,6 und 340,0 übernehmen.

Roland Herterich ist Geoökologe und hat in

Bayreuth über Nitrophenole und Pestizide in

der Atmosphäre promoviert. Seit 1993 ist er

bei der BLS-Analytik im Dioxinlabor tätig.

roland.herterich@bls-analytik.de

Stephan Schröder hat Biotechnologie an der

TU Berlin studiert und an der Uni Bonn über

die Analytik von proteingebundenen Oligo-

sacchariden promoviert. Seit 2007 ist er Pro-

duktspezialist für GC/GCMS bei Shimadzu

Deutschland in Duisburg. info@shimadzu.de

Literatur und Quellen

1) Verordnung (EG) Nr. 1883/2006.

2) Verordnung (EG) Nr. 1881/2006.

3) www.fmsenvironmental.com

4) www.wikipedia.de, Suchwort „Massen-

spektrometrie“ und dort zitierte Literatur.

Abb. 3. Maisprobe, nach Abbildung 1 aufgearbeitet; blau: 13C-Standard, rot und

schwarz: Zielionen für HpCDD mit 0,08 pg·g–1 (links) und HpCDF mit 0,05 pg·g–1.

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