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INSTITUT FÜR BIOCHEMIE

Biochemisches Grundpraktikum

für Lehramtskandidaten

Kurs Wintersemester 2019/2020

Betreuer: Tobias Friedrich, Dr. Christina Weinberg, Dr. Karolin Wellner

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ZEITPLAN

1. TAG

SEMINAR MIT SICHERHEITSBELEHRUNG (Voraussetzung zur Praktikumsteilnahme)

2. TAG

LABOREINFÜHRUNG: sicheres Pipettieren mit Mikroliterpipetten

VERSUCH 1: Nukleinsäureanalytik

Transformation von E. coli-Zellen

VERSUCH 2: Reinigung von Lysozym aus Hühnereiweiß

Testmessungen zur Konzentrations- und

Aktivitätsbestimmung von Lysozym

3. TAG

VERSUCH 1: Nukleinsäureanalytik

Auswertung der Transformation

VERSUCH 2: Reinigung von Lysozym aus Hühnereiweiß

Extraktion

Konzentrationsbestimmung von Lysozym

Aktivitätsbestimmung von Lysozym

Chromatographie auf CM-Sepharose-Kationenaustauscher

4. TAG

VERSUCH 3: SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Vorbereitung Sammelgel, Verdünnungsschema

Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Seminar während Gelelektrophorese

Tabelle 1: Übersicht über alle Praktikumstermine im WS19/20

Gruppe 1 (Di) Gruppe 2 (Do) Gruppe 3 (Fr) Gruppe 4 (Do) Gruppe 5 (Fr)

Seminar 10.12. Seminar 12.12. Seminar 13.12. Seminar 12.12. Seminar 13.12.

Praktische Arbeit: Ab 13:15 Uhr bis 20:15 Uhr

17.12.19 19.12.19 (!) 20.12.19 (!) 23.01.20 24.01.20

07.01.20 09.01.20 10.01.20 30.01.20 31.01.20

14.01.20 16.01.20 17.01.20 06.02.20 07.02.20

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TERMINE PROTOKOLLABGABE

Tabelle 2: Übersicht über die Termine zur Protokollabgabe

VORBEREITUNG DER VERSUCHE

Für die erfolgreiche Durchführung der einzelnen Versuche ist es notwendig, sich im Vorfeld des betreffenden Versuches mit den jeweiligen Hintergrundinformationen zu befassen. Diese Hintergrundinformationen finden Sie u. a. in diesem Skript, werden im Einführungsseminar genauer erläutert oder sollen selbständig, beispielsweise durch Web-Recherche, erschlossen werden. Des Weiteren werden auf Moodle sog. „Quizzes“ angeboten. Diese Multiple Choice Tests können Sie selbständig bis spätestens zum Abend vor dem eigentlichen Praktikumstag durchführen, um Ihren Vorbereitungserfolg zu überprüfen.

GRUPPENARBEIT

Die Versuche werden von einer Gruppe aus jeweils vier bis sechs Kursteilnehmern durchgeführt. Bitte wechseln Sie sich bei der praktischen Versuchsdurchführung und beim Protokollieren ab, da sich viele Arbeitsgänge wiederholen.

ALLGEMEINE VERHALTENSREGELN

Alle Laborarbeiten bringen den Umgang mit Substanzen mit sich, die bei nicht sachgemäßer Handhabung zu Gesundheitsschäden führen können. Es ist deshalb darauf zu achten, dass bei allen Laborarbeiten die Sicherheit am Arbeitsplatz gewährleistet ist:

Bitte tragen Sie während des Aufenthaltes in den Praktikumsräumen einen Laborkittel, festes Schuhwerk sowie gegebenenfalls weitere Schutzausrüstung (Handschuhe / Schutzbrillen)!

Im Labor darf nicht gegessen, getrunken, sich geschminkt oder geraucht werden! Bitte achten Sie auf Sauberkeit und Ordnung am Arbeitsplatz: Ein unordentlicher

Arbeitsplatz führt leichter zu Unfällen, aber oftmals auch zum Misslingen des Experimentes!

Informieren Sie sich über die Toxizität der verwendeten Substanzen. Im Skript und in den Vorbesprechungen wird ebenfalls darauf aufmerksam gemacht.

Alle Gefäße, die Lösungen oder Chemikalien enthalten, sind sorgfältig zu beschriften!

Jede Mitnahme von Chemikalien aus den Praktikumsräumen ist untersagt!

Gruppe 1 (Di) Gruppe 2 (Do) Gruppe 3 (Fr) Gruppe 4 (Do) Gruppe 5 (Fr)

Protokoll 1 (Transformation von E. coli, Praktikumstag 1)

07.01.20 !! 09.01.20 10.01.20 30.01.20 31.01.20

Protokoll 2 (Reinigung von Lysozym aus Hühnereiweiß und SDS-PAGE)

21.01.20 23.01.20 24.01.20 13.02.20 14.02.20

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Alle Chemikalien dürfen nur in den zum Versuch notwendigen Mengen aus den Vorratsflaschen entnommen werden. Bitte füllen Sie nicht benötigte Lösungen NICHT in die Vorratsgefäße zurück, Kontaminationsgefahr!

Bitte bedienen Sie kein Gerät ohne vorherige Einweisung! Die Schäden von Fehlbedienungen belaufen sich meist auf mehrere tausend Euro!

Das Öffnen von unter Strom stehenden Elektrophoresekammern ist lebensgefährlich!

Bitte informieren Sie sich über die vorhandenen Sicherheitseinrichtungen (z. B. Feuerlöscher, Verbandskästen, Notbrause, Augendusche usw.)

Das Telefonieren mit Mobiltelefonen ist nur außerhalb des Praktikumsraumes gestattet.

Kenntnisnahme der Sicherheitsbelehrung, Betriebsanweisung S1. Eine Sicherheitsbelehrung erfolgt auf der Grundlage der Gefahrstoffverordnung (GefstoffV), der Laborordnung (ZH1/119) und der Regeln für Sicherheit und Gesundheitsschutz beim Umgang mit Gefahrstoffen im Hochschulbereich (GUV 19.17). Im Praktikum wird nur mit Mikroorganismen gearbeitet, die kein oder nur ein geringes Risiko für den Menschen bergen. Bei Schwangerschaft ist eine Teilnahme am Praktikum verboten!

HAFTUNGSREGELUNGEN

Am Institut für Biochemie gelten für studentische Praktika folgende Haftungsregeln:

Jeder Student muss für Glasbruch und sonstige selbst verschuldete Sachschäden in voller Höhe bzw. der Reparaturkosten selbst aufkommen.

Bei Gruppenpraktika haftet die Praktikumsgruppe, wobei alle Studenten einer Gruppe für die ausgehändigten Geräte quittieren.

Die Ausgabe der Praktikumsscheine erfolgt erst, wenn keine finanziellen Forderungen seitens des Institutes mehr bestehen.

BEENDIGUNG DER PRAKTISCHEN ARBEIT

Bitte bewahren Sie Ihre Proben zunächst für eventuelle Nachmessungen auf. Entsorgen Sie sie erst, wenn sie wirklich nicht mehr benötigt werden. Hinterlassen Sie den Laborplatz aufgeräumt und sauber, d.h. genutzte Gefäße sind zu spülen, der Tischmüll ist zu entsorgen, nicht-sterile Pipettenspitzen sollten nachgefüllt werden. Bitte schalten Sie alle elektrischen Messgeräte ordnungsgemäß aus. Bitte lassen Sie Ihr Laborheft vom Betreuer gegenzeichnen.

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HINWEISE ZUR PROTOKOLLFÜHRUNG

Die Protokolle sind Gruppenprotokolle, d.h. es wird pro Versuch ein gemeinsam erarbeitetes Protokoll abgegeben und daher auch gemeinsam verantwortet. Die Experimente werden in einem Laborheft vorbereitet, die Pipettierschemata tabellarisch aufgestellt. Wichtig ist, dass alle Arbeitsvorgänge und Beobachtungen sofort im Laborheft notiert werden. Dies betrifft ermittelte Werte (z.B. Volumina, Ergebnisse, verwendete Geräte) als auch Pannen und Besonderheiten. In Verbindung mit der Praktikumsanleitung muss es dem Leser möglich sein, den Verlauf und das Ergebnis der Experimente nachvollziehen zu können. Laborhefte müssen leserlich geschrieben werden und dürfen nach Beendigung der Arbeiten nicht noch einmal abgeschrieben werden. Das Protokoll wird mit Hilfe der Unterlagen (Laborheft, Tabellen, Messwerte usw.) zusammengestellt. Jede Gruppe liefert daher zwei Protokolle ab:

Nukleinsäureanalytik Reinigung von Lysozym aus Hühnereiweiß und SDS-PAGE

Mit dem letzten Protokoll reichen Sie bitte auch Ihr Laborheft mit ein. Das Protokoll soll jeweils spätestens eine Woche nach Beendigung des Versuchs abgegeben werden (siehe Tabelle 2 für die entsprechenden Stichtage). Jedes Protokoll muss zudem eine von den Studierenden unterschriebene Erklärung enthalten, dass die Arbeit selbstständig verfasst wurde. Erklärung Hiermit versichern wir, dass wir das vorliegende Protokoll selbständig verfasst und keine anderen als die im Literaturverzeichnis angegebenen Quellen benutzt haben. Die Zeichnungen oder Abbildungen in dieser Arbeit sind von uns selbst erstellt worden oder mit einem entsprechenden Quellennachweis versehen. Leipzig, den <Datum>

<Vollständige, handschriftliche Unterschriften>

Sofern Sie eine korrigierte Version Ihres Protokolls anzufertigen haben, legen Sie der korrigierten Version bitte Ihre alte Version bei! Die kompletten und vom Kursleiter akzeptierten Protokolle gehören zur Prüfungsvorleistung!

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Für die Zusammenschrift der Protokolle wird folgende Gliederung vorgeschlagen, die sich nach den üblichen Vorschriften zur Anfertigung von wissenschaftlichen Arbeiten richtet. Folgendes Schema dient dabei als Orientierung: Allgemeine Angaben / Deckblatt Namen der Praktikanten, Gruppennummer, ggf. Uni-Leipzig Email-Adresse(n) Studienrichtung Name / Jahr des Praktikums Name des Versuches Einleitung Die Einleitung sollte nicht länger als eine halbe bis maximal eine Seite sein und zielgerichtet auf die Aufgabenstellung hinführen. Sie enthält eine kurze theoretische Einführung und Aussagen zum Inhalt und Sinn des Versuches. In einigen Fällen ist auch der theoretische Hintergrund von angewandten Methoden zu erläutern. Bitte Literaturangaben vermerken. Materialien und Methoden Materialien Hier müssen im Wesentlichen die verwendeten Chemikalien, Enzyme, Puffer usw. mit Konzentrationsangaben aufgeführt werden. Es muss über das Protokoll immer nachvollziehbar sein, unter welchen Konzentrationsverhältnissen ein Versuch durchgeführt wurde. Geräte müssen nur dann aufgeführt werden, wenn sie nicht unbedingt zur Grundausstattung eines Labors gehören (z.B. größere Zentrifugen mit Fabrikat, Rotortyp; Photometer). Dabei sollten Sie sich auf das Wesentliche beschränken, die Art der verwendeten Glasgeräte, Pipetten usw. muss nicht berücksichtigt werden. Methoden Hier reicht ein Verweis auf das Praktikumsskript, wenn die Versuche wie dort beschrieben durchgeführt wurden. Anzugeben sind jedoch die tatsächlichen Bedingungen bei der Durchführung sowie Abweichungen in den Methoden, so dass eine lückenlose Nachvollziehbarkeit gegeben ist. Ergebnisse Die Darstellung der Ergebnisse erfolgt – wie am Ende jeden Versuchsteils beschrieben – in der Regel in Form von Abbildungen und Tabellen. Dabei ist zu beachten: Abbildungen erhalten stets eine geeignete Unterschrift, die den Inhalt der

Abbildung sinnvoll wiedergibt und eine Legende. Durch die Legenden muss eine präzise Zuordnung des Dargestellten möglich sein. Die Achsen der Diagramme sind genau zu beschriften! Die Abbildungen erhalten eine fortlaufende Nummerierung, auf die im Text verwiesen werden muss. In der Legende erfolgt keine Ergebnisinterpretation.

Alle Messdaten sind übersichtlich anzuordnen, wenn möglich in Tabellenform! Tabellen erhalten eine Überschrift; sollte eine Legende erforderlich sein, steht diese

unter der Tabelle; ergeben sich die Daten in der Tabelle durch Rechnungen, so muss im Text ein Rechenbeispiel angegeben werden, das den kompletten Rechenweg

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enthält! Die Berechnung muss nachvollziehbar und mit der Angabe von Einheiten ausgeführt werden!

Eine ausführliche Diskussion der Ergebnisse erfolgt erst im sich anschließenden Ergebnisteil!

Diskussion In der Diskussion (maximal eine Seite) erfolgt in einem zusammenhängenden Text eine kritische Bewertung der Daten. Dabei gehen Sie bitte auf die Fragen am Ende der jeweiligen Versuchsbeschreibung ein. Literaturangaben Bitte nicht vergessen! Stil des Protokolls Alle Illustrationen (Abbildungen und Tabellen) müssen fortlaufend nummeriert, sowie mit Legenden (Abbildungen) bzw. Überschriften (Tabellen) versehen werden. Die Beschriftungen der Illustrationen müssen selbsterklärend sein. Sie müssen im fortlaufenden Text auf die Illustrationen hinweisen, damit der Leser weiß, wo die entsprechenden Daten gezeigt sind, und er so der Argumentation des Verfassers folgen kann. Bitte geben Sie für numerische Daten nur die Stellen an, die signifikant sind (nicht alle Stellen, die Ihnen der Rechner angibt)!

Abbildung 1: Beispiele für die wissenschaftlich korrekte Beschriftung einer Abbildung und einer Tabelle.

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Checkliste für ihr Protokoll Bevor Sie das Protokoll abgeben, gehen Sie bitte diese Liste durch und überprüfen Sie, ob wirklich alle genannten Punkte erfüllt sind. Allgemeine Form:

Blocksatz einheitliche Schriftart (z. B. Arial oder Times New Roman) 1,5-facher Zeilenabstand Seitennummerierung einheitliche Schriftgröße für Text (z. B. 11pt) bzw. Überschriften (z. B. 12pt)

Deckblatt:

Namen aller Gruppenmitglieder und Uni-Leipzig-Emailadressen Studienfach Praktikumsgruppe und Durchgang (bspw. Praktikumsdurchgang 1 (dienstags),

Gruppe 3 (siehe Tabelle 1) Name des beschriebenen Versuchs (siehe Seite 5)

Ergebnisse:

Alle Abbildungen haben eine Bildunterschrift Alle Abbildungen sind nummeriert Alle Tabellen haben eine Tabellenüberschrift Alle Tabellen sind nummeriert Alle Tabellen und Abbildungen sind im Text zitiert Sollten für dieses Protokoll Berechnungen erfolgt sein, ist jeweils eine

Beispielrechnung für jeden Rechenschritt vorhanden? Sind bei den Berechnungen auch alle Einheiten angegeben? Alle Rechnungen sind verständlich und nachvollziehbar beschrieben.

Insbesondere alle Verdünnungsschritte bei der Berechnung von Enzymaktivitäten sind angegeben (Lysozymversuch).

Die Ergebnisse sind auch in Textform erklärt (zusätzlich zu Abbildungen oder Tabellen)

Diskussion:

Haben Sie Ihre Ergebnisse und deren BEDEUTUNG interpretiert und erklärt? Haben Sie die Fragen, die als Hilfestellung zur Diskussion im Skript stehen, als

Teil Ihrer Diskussion beantwortet? Allgemeines:

Ist der Text exakt und für jemanden verständlich, der den Versuch nicht gemacht hat?

Ist der Ausdruck wissenschaftlich und nicht umgangssprachlich? Haben wirklich alle Gruppenmitglieder das Protokoll nochmal korrekturgelesen? Sind alle Rechtschreib- und Flüchtigkeitsfehler gefunden?

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Praktikumstag 1

LABOREINFÜHRUNG: PIPETTIEREN MIT MIKROLITERPIPETTEN

Während des Praktikums werden Sie häufig sehr kleine Volumina von einem Gefäß in

ein anderes transferieren. Hierzu verwendet man für Mengen zwischen 0,5 und 1000 µl

eine sogenannte Mikroliterpipette oder auch kurz Pipette. Da die Verwendung dieses

Hilfsmittels allgegenwärtig ist und sie die Qualität eines Experiments grundlegend

beeinflussen kann, ist es wichtig einige Regeln im richtigen Umgang mit Pipetten zu

erlernen – am besten durch pipettieren.

Einige Grundregeln und Tipps im Umgang mit Mikroliterpipetten

Es werden Ihnen drei Pipetten zur Verfügung stehen: eine mit blauem Knopf, welche für

Volumina von 100-1000 µl genutzt werden kann, eine mit gelbem Knopf für Volumina

zwischen 10-100 µl und schließlich eine mit grauem Knopf für das Pipettieren von 0,5-

10 µl. Durch Drehung des Knopfes kann das entsprechende Volumen eingestellt werden.

Dabei darf niemals der Knopf weitergedreht werden als das zulässige Minimal- oder

Maximalvolumen, da sonst die Mechanik in den Pipetten kaputtgeht. Nach der

Volumeneinstellung wird die Pipette mit der passenden Wegwerf-Pipettenspitze

versehen (blaue Spitzen für die blaue Pipette, gelbe spitzen für die gelbe, weiße Spitzen

für die graue Pipette).

Tipp: Zum sterilen (keimfreien) Arbeiten im Versuch 1 ist es bei manchen

Arbeitsschritten notwendig speziell vorbehandelte Pipettenspitzen zu verwenden. Diese

Pipettenspitzen wurden autoklaviert, d.h. in Wasserdampf bei erhöhtem Druck und

Temperaturen von 121 °C für mindestens 20 Minuten inkubiert. Diese Behandlung tötet

sämtliche Bakterien ab und unterstützt so im Folgenden steriles Arbeiten.

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Pipettieren: Um Flüssigkeit aufzunehmen,

Knopf bis zum ersten Widerstand (auch

Druckpunkt genannt) drücken, dann in die

Flüssigkeit eintauchen und anschließend

langsam den Knopf loslassen. Überprüfen,

dass keine Luftblasen eingesaugt wurden. Um

Flüssigkeit wieder abzugeben, Knopf langsam

bis zum zweiten Druckpunkt durchdrücken

(Abb. 2). Es ist stets darauf zu achten, dass

keine Flüssigkeit in das Innere der Pipette

gesaugt wird.

Beim Pipettieren sollte man die Pipettenspitze immer nur knapp in die

Flüssigkeit eintauchen. Dabei sollte die Spitze weit genug in der

Flüssigkeit sein, damit man beim vorsichtigen Aufziehen keine Luft

einsaugt, aber so minimal wie möglich damit man nicht an der

Außenwand der Pipettenspitze zusätzliches Volumen transferiert und

damit sein Experiment verfälscht.

Beim Pipettieren ist stets darauf zu achten, dass die Pipette

möglichst vertikal gehalten wird, nie waagerecht oder auf dem Kopf

ist, damit die Flüssigkeit in der Spitze nicht ins Pipetteninnere läuft.

Aufgabe:

Probieren Sie doch mal Ihre Pipettiergenauigkeit aus! Transferieren Sie eine bestimmte

Menge Wasser, z.B. 500 µl, 50 µl und 5 µl auf ein Wägeschälchen, welches sich auf der

Feinwaage befindet. Messen Sie nach jedem Pipettierschritt den Gewichtsanstieg.

Stimmt er mit dem zu erwartenden Gewichtsanstieg überein? Worin können

Abweichungen vom Erwarteten begründet sein?

Abbildung 2: Druckpunkte beim Pipettieren

(eppendorf.de)

Abbildung 3: Eintauchtiefe (eppendorf.de)

Abbildung 4: Pipettierwinkel

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VERSUCH 1: NUKLEINSÄUREANALYTIK

TRANSFORMATION VON E. COLI UND HETEROLOGE

PROTEINEXPRESSION IN BAKTERIEN

EINLEITUNG

Heterologe Proteinexpression. Bis vor einigen Jahren konnten nur solche Proteine

untersucht werden, die in relativ großen Mengen in einer Zelle produziert werden. Jedoch

sind die meisten der Tausenden von verschiedenen Proteinen in pro- und eukaryotischen

Zellen nur in sehr geringen Mengen vorhanden. Oftmals ist es unmöglich, mit Hilfe

klassischer Proteinreinigungsstrategien mehr als ein paar Mikrogramm reines Protein zu

erhalten. Oftmals ist es günstiger, das Protein nicht aus dem Ausgangsorganismus zu

isolieren, sondern durch heterologe Expression in Bakterien oder eukaryotischen Zellen

zu gewinnen. Dabei können große Mengen eines Proteins mit Hilfe einer

proteinkodierenden DNA-Sequenz hergestellt werden, die in einen Expressionsvektor

kloniert und in die Zellen eingeschleust wird. So kann z. B. ein im Bakterium

Escherichia coli überexprimiertes Protein bis zu 40 % des Gesamtproteins der Zelle

ausmachen.

Heterologe Expression von GFP in E. coli. Im vorliegenden Versuch werden Sie

Bakterien veranlassen, ein grün fluoreszierendes Protein, das ursprünglich in der

biolumineszenten Qualle Aequorea victoria vorkommt,

zu produzieren. Sie werden das Gen des GFPs nicht

isolieren müssen, sondern finden es bereits kloniert in

dem Vektor pGLO der Firma BioRad (Abb. 5).

Neben dem Gen, welches für das GFP-Protein kodiert,

enthält der Vektor ein Ampicillin-Resistenzgen (bla), um

transformierten Zellen einen Selektionsvorteil zu

verschaffen. Außerdem ist ein Genregulationssystem

kodiert, das es erlaubt, die Expression des Fremdgens in

transformierten Zellen zu steuern.

Abbildung 5: Vektorkarte des

Vektors pGLO.

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Dabei macht man sich die Fähigkeit von E. coli zunutze, Arabinose als Kohlenstoff-Quelle

nutzen zu können. In Bakterien sind die Gene, die für die Arabinose-abbauenden

Enzyme kodieren (AraB, AraA und AraD) häufig in Form eines Operons kodiert (Abb. 6).

Die Transkription dieser Gene wird von einem gemeinsamen Promotor Para kontrolliert.

Dieser Promotor (und damit auch die Expression der drei zum Abbau der Arabinose

erforderlichen Enzyme) wird nur dann aktiviert, wenn Arabinose im Nährmedium

vorhanden ist:

Bei Abwesenheit von Arabinose bindet das regulatorische Protein AraC an die

Bindungsstelle der RNA-Polymerase vor dem ara-Operon und verhindert damit die

Bindung der RNA-Polymerase und die Transkription der ara-mRNA. In Anwesenheit von

Arabinose jedoch kommt es zu einer Konformationsänderung von AraC, es versperrt nun

nicht mehr die Bindungsstelle der RNA-Polymerase, sondern erleichtert vielmehr deren

Bindung und die Synthese der ara-mRNA erfolgt (Abb. 6A).

Abbildung 6: Die Wirkungsweise des Arabinose-Promotors im natürlichen Kontext (A)

und zur Induktion der Expression heterologer Proteine auf einem künstlichen

Plasmid (B).

Auf dem verwendeten Vektor ist das araC-Gen vorhanden. Ferner wurden die drei Gene

des ara-Operons durch das GFP-Gen ersetzt (Abb. 6B). Das GFP-Gen steht nun unter

der Kontrolle des PBAD-Promotors im Vektor, so dass die Transkription und damit die

Expression von GFP-Protein durch Zusatz oder Weglassen von Arabinose im Medium

gesteuert werden kann.

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Transformation von E. coli. Im nächsten Schritt wird die rekombinante Plasmid-DNA

durch die Methode der Transformation in E. coli-Zellen eingeschleust. In der Gentechnik

versteht man unter einer Transformation die Übertragung von freier, löslicher DNA auf

ein Empfänger-Bakterium. E. coli besitzt keine natürliche Transformationskompetenz und

muss durch chemische oder physikalische Methoden künstlich kompetent gemacht

werden. Standardmäßig verwendet man chemische Methoden, bei denen Suspensionen

von E. coli K12-Stämmen bei 4 °C mit Calciumchlorid-Lösung behandelt werden. Nach

einem Hitzeschock bei 42 °C wird die Plasmid-DNA in die Zelle aufgenommen und

oftmals eine Transformationseffizienz von 107 – 108 Transformanten/µg DNA erreicht. Es

wird vermutet, dass die Salze die Zellwandstruktur lockern und zusätzlich die DNA als

schwerlösliches Salz auf der Zelloberfläche ausfällen, um die direkte Aufnahme der

Plasmide zu erleichtern.

Nachweis und Isolierung von GFP aus E. coli. Der Nachweis des GFP ist durch seine

Eigenschaft, bei Bestrahlung mit Licht der Wellenlänge 366 nm grün zu leuchten, leicht

möglich, weswegen das Protein vielfältige Anwendungen in der Molekularbiologie

gefunden hat.

Nach der Anreicherung folgt die Reinigung der rekombinanten Proteine. Aus einem Mix

aus Tausenden von Proteinen muss das rekombinante überexprimierte Protein

herausgefiltert werden. Eine Vielzahl an Chromatographie-Verfahren sind zu diesem

Zweck entwickelt worden. Man unterscheidet klassische Reinigungsverfahren, die das

rekombinante Protein in der Sequenz unverändert lassen oder Verfahren mit einem tag.

Als tag bezeichnet man ein Protein-Anhängsel oder Peptid, das mit dem zu

untersuchenden Protein schon auf Genebene fusioniert wird. Dieses tag besitzt hohe

Affinität zu einer bestimmten Substanz und das rekombinante Protein kann somit in

einem Schritt gereinigt werden.

Da das GFP-Protein zahlreiche hydrophobe Regionen besitzt, ist für die Abtrennung des

Proteins aus dem Bakterienrohextrakt die klassische hydrophobe Chromatographie

(HIC) geeignet. Bei Verwendung eines geeigneten Expressionsvektors für GFP bietet

sich allerdings auch die Reinigung über Affinitätstags an.

Aus Zeitgründen kann der Teil „Reinigung heterolog-exprimierter Proteine“ jedoch nur

theoretisch abgehandelt werden.

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MATERIALIEN

LB (engl. lysogeny broth) –Flüssigmedium: enthält Hefeextrakt, Trypton und NaCl)

1 LB- Agarplatte: enthält zusätzlich Agar

2 LB-Amp-Agarplatten: Zusatz von Ampicillin zu sterilem LB-Agar

(Endkonzentration:100 mg/l)

1 LB-Amp-Ara-Agarplatte: Zusatz von Arabinose zu LB-Amp-Agar

(Endkonzentration: 1 %)

Plasmid pGLO (5 ng/µl)

2 Aliquots

chemisch kompetente TOP10-Zellen

PRAKTISCHE DURCHFÜHRUNG

Geben Sie zu einem auf Eis aufgetauten Aliquot E. coli-Zellen 10 µl der pGLO-

Plasmidlösung (5 ng/µl), zu einem zweiten Aliquot pipettieren Sie 10 µl steriles

destilliertes Wasser (Negativkontrolle).

Mischen Sie durch vorsichtiges Schwenken oder Schnipsen der Röhrchen und

inkubieren Sie die Suspensionen für 10 Minuten auf Eis.

Anschließend werden die Ansätze für 45

Sekunden bei 42 °C und danach

sofort für 5 Minuten auf Eis inkubiert.

Nach Zugabe von 600 µl LB-Medium werden die Zellen für 1 Stunde bei 37 °C im

Thermoschüttler (500 rpm) zur Ausprägung der plasmidkodierten

Antibiotikaresistenz kultiviert.

Anschließend werden jeweils 50 µl der Ansätze auf die Agarplatten pipettiert, mit

Hilfe von sterilen Glasperlen verteilt (ca. 5 Stück pro Platte) und über Nacht bei

37 °C im Brutschrank inkubiert.

AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE

Machen Sie sich mit den Praktikumsbetreuern einen Termin zur Evaluation Ihrer

Agarplatten aus (wenn möglich am Folgetag)!

Was ist eigentlich ein „Aliquot“?

aliquot = engl.:

Was bedeutet „inkubieren“?

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Zählen Sie die Kolonien bei Tageslicht sowie unter UV-Licht und diskutieren Sie die

Ergebnisse. Unter welchen Bedingungen findet eine Expression des GFP-Proteins statt

und warum?

MOLEKULARBIOLOGISCHE VERSUCHE IM SCHULUNTERRICHT

Versuche, die Sie in diesem Praktikum durchführen, dienen dazu Inhalte aus der

Vorlesung zu verdeutlichen und Ihnen einen Eindruck davon zu vermitteln, wie

experimentelles Arbeiten in einem biochemischen bzw. molekularbiologischen Labor

abläuft.

Nichtsdestotrotz können Sie die Versuche aus diesem Praktikum aber auch für Ihre

Schüler anbieten, z.B. im Rahmen einer Projektwoche.

Es gibt einige Firmen die sog. Kits anbieten, die bereits alle wesentlichen Komponenten

für den Versuch enthalten. Diese Versuche sind zumeist darauf ausgelegt, dass sie mit

der Ausstattung eines Biologie-/Chemieunterrichtssaal einer Schule durchgeführt werden

können.

Beispiele für mögliche Kits zu verschiedensten (molekularbiologischen) Versuchen

finden Sie unter anderem hier (englische Webseite):

https://www.bio-rad.com/de-de/category/ap-biology?ID=PD866ATU86LJ

Außerdem finden Sie auf Moodle einen Katalog mit einer weiteren Auswahl zu

Schülerversuchskits.

Falls Ihnen doch größeres Equipment für die Durchführung eines Versuchs an Ihrer

Schule nicht zur Verfügung steht, denken Sie doch mal über einen Besuch in einem

nahen Schülerlabor nach. Im folgenden finden Sie Websites von Schülerlaboren in

Mitteldeutschland:

Übersicht Schülerlabore in Sachsen-Anhalt:

https://www.bildung-lsa.de/index.php?KAT_ID=1622

Übersicht Schülerlabore in Sachsen:

https://www3.sachsen.schule/sbs/einrichtungen/weitere/schuelerlabore/

Schülerlabore in und um Leipzig:

https://www.ufz.de/index.php?de=41611

https://tgzchemie.de/abi-lab-das-schuelerlabor/profil/

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VERSUCH 2:

REINIGUNG VON LYSOZYM AUS HÜHNEREIWEIß

EINLEITUNG

Lysozym katalysiert die Hydrolyse von Zellwänden grampositiver Bakterien. Das Enzym

wurde 1922 von Alexander Fleming erstmals im Nasensekret entdeckt, nachdem er

festgestellt hatte, dass Nasenschleim Bakterienkulturen auflöst. Lysozym ist weit

verbreitet in Tieren und Pflanzen, in Speichel, Tränen, Milch, in den Sekreten der

Atemwege und des Verdauungstraktes, in Leukozyten und den Nieren von Säugetieren

sowie insbesondere im Hühnereiweiß.

Lysozym spaltet bevorzugt die β-1,4-glykosidische Bindung zwischen

N-Acetylmuraminsäuren (NAM) und N-Acetylglucosaminen (NAG), welche in der

Zellwand vieler Mikroorganismen vorkommen. Dabei wird die Bindung zwischen dem

Kohlenstoffatom C-1 und dem Brückensauerstoff gespalten, so dass Disaccharide aus

NAG und NAM entstehen, an denen noch Peptidseitenketten hängen (Abb. 7):

Abbildung 7: Lysozym hydrolysiert die glykosidische Bindung zwischen N-Acetyl-

muraminsäure (NAM) und N-Acetylglucosamin (NAG).

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Die Kristallstrukturanalyse des Lysozyms hat gezeigt, dass das aktive Zentrum einen

langen Spalt enthält, der sein normales Substrat, das langkettige Peptidoglykan der

Bakterienzellwand, aufnehmen kann.

Lysozym aus Hühnereiweiß ist das am gründlichsten untersuchte Lysozym und eines der

mechanistisch am besten verstandenen Enzyme. Es ist ein kleines, stark basisches

Protein (MW = 14,4 kDa), dessen einzige Polypeptidkette aus 129 Aminosäuren besteht

und in sich durch vier Disulfidbrücken quervernetzt ist.

Von allen Mikroorganismen ist Micrococcus lysodeikticus besonders empfindlich gegen

eine Verdauung von Lysozym. Die bakteriolytische Eigenschaft des Lysozyms ist die

Grundlage für eine Nachweismethode des Lysozyms. Hierbei wird das Enzym mit einer

trüben Suspension gefriergetrockneter Bakterien gemischt. Bei fortschreitender

Hydrolyse der Zellwände nimmt die Trübung der Suspension ab. Diese

Trübungsabnahme kann bei 450 nm in einem Spektralphotometer verfolgt werden.

Eigenschaften von Lysozym

Aufbau und physikalische Eigenschaften: Lysozym ist ein monomeres Protein (MW =

14,4 kDa). Die Absorption einer 1 mg/ml Lösung bei 280 nm (A280) liegt bei 2,48. Der

isoelektrische Punkt liegt bei pH 11.

Definition der Enzymaktivität: Eine Einheit (U) Lysozym ist definiert als die Menge

Enzym, welche unter optimalen Bedingungen eine Trübungsabnahme einer

Bakteriensuspension von 0,001 pro Minute (min) bei 450 nm, pH 7,0 und 25 °C

hervorruft. Die relative spezifische Aktivität und die Gesamtaktivität des Enzyms sind

folgendermaßen definiert:

Relative spezifische Aktivität = TestansatzimProteinmg

10min /ΔA3

450

(1)

Gesamtaktivität = rel. spez. Aktivität mg Gesamtprotein (2)

PROBLEMSTELLUNG

Aus dem Eiklar von Hühnereiern soll das Enzym Lysozym gereinigt werden. Hierzu

werden pH-Präzipitation und eine Chromatographie an einer Kationenaustauschersäule

verwendet. Zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität des Lysozyms werden als

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Testverfahren die Trübungsmessung und als Testsubstrat Micrococcus lysodeikticus-

Bakterien verwendet.

MATERIALIEN

Puffer und Lösungen

Testpuffer: 0,1 M Kaliumphosphatpuffer; pH 7,0

Säulenpuffer A: 0,1 M Ammoniumacetatpuffer; pH 4,5

Säulenpuffer B: 0,1 M Ammoniumacetatpuffer; pH 7,0

Säulenpuffer C: 0,1 M Ammoniumacetatpuffer; 0,025 M Na2CO3; pH 9,0

Säulenpuffer D: 0,1 M Ammoniumacetatpuffer; 0,25 M Na2CO3; pH 10,0

Bakteriensuspension: 0,3 mg/ml gefriergetrocknete Micrococcus lysodeikticus-

Bakterien suspendiert in Testpuffer

Materialien CM-Sepharose-Säule, in dest. Wasser,

Photometer und Küvetten für UV- bzw. sichtbares Licht

Allgemeine Methoden

Nach jedem Reinigungsschritt werden Gesamtproteinkonzentration und Lysozymaktivität

bestimmt. Ein Aliquot von jedem Reinigungsschritt wird mittels SDS-Polyacrylamid-

Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert, um den Erfolg der Reinigung zu

dokumentieren (siehe Versuch 3).

a) Konzentrationsbestimmung des Enzyms

Die Proteinkonzentration in den bei der Reinigung erhaltenen Fraktionen wird durch

Absorptionsmessungen in UV-Küvetten bei 280 nm ermittelt. Da die

Zusammensetzungen der Proteinlösungen zu diesem Zeitpunkt noch nicht bekannt sind,

errechnen sich die Proteinkonzentrationen zunächst aus der Näherungsformel für

Proteingemische. Hierbei wird eine Absorption von A280 = 1 in guter Näherung gleich

einer Proteinkonzentration von 1 mg/ml gesetzt. Für reine Proteinlösungen ist diese

Näherung zu ungenau, hier müssen die jeweiligen spezifischen Extinktionskoeffizienten

berücksichtigt werden. Für Lysozym liegt die Absorption einer 1 mg/ml-Lösung bei

280 nm (A280) bei 2,48.

Verwenden Sie zur Proteinbestimmung in der Messküvette geeignete Verdünnungen

ihrer Aufarbeitungsstufen, nehmen Sie dazu Testpuffer als Verdünnungspuffer. Mit

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diesem Puffer wird auch der Nullabgleich

durchgeführt. Achten Sie darauf, nur

solche Verdünnungen zu verwenden, bei

denen Ihre bei 280 nm gemessenen

Absorptionen Werte von 0,1 weder unterschreiten noch Werte von 1,0 überschreiten.

Orientieren Sie sich dazu an den Empfehlungen zur Verdünnung für die

Proteinbestimmung am Ende der jeweiligen Aufarbeitungsstufe. Das Gesamtvolumen in

der Küvette beträgt immer 2 ml. Bei einer Verdünnung von 1:100 beispielsweise wird mit

1980 µl Puffer der Nullabgleich durchgeführt, anschließend werden 20 µl Probe zugefügt,

mit dem Rührspatel gut gemischt (durch Quirlen) und dann die Absorption gemessen.

Um das Ausmaß von Messfehlern durch Verdünnung und Messung abzuschätzen,

führen Sie drei unabhängige Verdünnungen und die dazugehörigen Messungen durch.

Tragen Sie alle Verdünnungsfaktoren, die tatsächlich pipettierten Volumina und die

dazugehörigen Messwerte in ihr Laborheft ein. Um die Proteinkonzentration in der

jeweiligen Fraktion zu bestimmen, berücksichtigen Sie alle Verdünnungsschritte und

tragen den Verdünnungsfaktor, die durchschnittlich gemessene Absorption bei 280 nm

(A280) und die daraus resultierende Proteinkonzentration in der Fraktion (mg/ml) in

Tabelle 3 ein.

Probemessung der Proteinkonzentration:

Tabelle 3: Proteinkonzentrationsmessung

Durchführung:

Gesamtvolumen der Küvette: _____ml =______µl

Benötigte Verdünnung der Probe: 100-fach

1. Nullabgleich: Was geben Sie in die Küvette?

2. Konzentrationsmessung:

Mischen von _____µl Probenpuffer und _____µl Eiweißextrakt

Ver-

dünnungs-faktor

A280

Protein-konzen-tration [mg/ml]

Eiweißextrakt

1. 2. 3.

Ø

Wozu dient der Nullabgleich?

20

Absorption messen bei _______nm

Küvetteninhalt verwerfen, Küvette mit destilliertem Wasser spülen und die

Messung noch zwei Mal wiederholen

Rechnen Sie nun mit Hilfe der Näherungsformel die Proteinkonzentration aus!

Welche Mengen Probenpuffer und Probe 1 müssten Sie mischen, um eine 10-fache oder

40-fache Verdünnung ihrer Probe zu erhalten?

b) Enzymtest für Lysozym

Die Suspension der Micrococcus lysodeikticus-Bakterien wird 20-30 Minuten bei 37 °C

vorinkubiert und vor Gebrauch gut durchmischt (dieser Schritt wird von den

Praktikumsbetreuern durchgeführt). 1,9 ml dieser Suspension werden in eine Küvette

(2 ml) gefüllt und am Photometer die Abnahme der Absorption bei 450 nm (A0)

gemessen. Dann wird die Reaktion durch Zugabe von 100 µl Lysozymlösung einer

geeigneten Vorverdünnung (verwenden Sie dazu immer Testpuffer als

Verdünnungspuffer) gestartet (vorher kurz umrühren!) und die Abnahme der Absorption

bei 450 nm und Raumtemperatur in Abhängigkeit von der Zeit (2 min) verfolgt.

Verwenden Sie solche Enzymverdünnungen, welche eine Trübungsabnahme von

minimal 0,02 A450/min und maximal 0,08 A450/min verursachen. Um das Ausmaß von

Messfehlern durch Verdünnung und Messung abzuschätzen, führen Sie drei

unabhängige Verdünnungen und die dazugehörigen Messungen durch. Tragen Sie alle

Verdünnungsfaktoren, die tatsächlich pipettierten Volumina und die dazugehörigen

Messwerte in Ihr Laborheft ein. Tragen Sie anschließend die durchschnittliche

Trübungsabnahme pro Minute (ΔA450/min) in Tabelle 4 ein und berechnen Sie die

spezifische Aktivität (U/mg) und die Gesamtaktivität (kU) wie oben unter „Eigenschaften

von Lysozym“ angegeben.

Probemessung der Lysozymaktivität:

Tabelle 4: Lysozymaktivitätsbestimmung

Verdünnungs-

faktor

ΔA450 [min-1]

rel. spez. Aktivität [U/mg]

Probe 1

1. 2. 3. Ø

21

Durchführung:

Gesamtvolumen der Küvette: _____ml =______µl

Benötigte Verdünnung der Probe: insgesamt 1000-fach (siehe Abb. 8)

1. Nullabgleich: Was geben Sie in die Küvette?

2. Aktivitätsmessung:

Herstellen der Vorverdünnung: für eine 50-fache Verdünnung _____µl

Probenpuffer und _____µl Eiweißextrakt mischen

Für die Aktivitätsmessung ______µl Micrococcus-Suspension in die Küvette

vorlegen und ______µl der Vorverdünnung hinzugeben, kurz mit Rührstäbchen

mischen und Trübungsabnahme im Photometer messen (Absorption bei ____nm),

Küvetteninhalt verwerfen, Küvette mit destilliertem Wasser spülen und die

Messung noch zwei Mal wiederholen

Rechnen Sie mit Hilfe der in der Versuchseinleitung gegeben Formel (Seite 17) die

relative spezifische Aktivität aus!

Welche Mengen Probenpuffer und Eiweißextrakt müssten Sie mischen, um eine finale

Verdünnung von 20-fach für die Aktivitätsbestimmung zu erreichen?

Abbildung 8: Pipettierschema für Bestimmung der Lysozymaktivität.

Allgemeine Hinweise:

Vergessen Sie bitte nicht, auch die Verdünnung in der Küvette in die Berechnung

der Verdünnungsschritte mit einzubeziehen (Siehe Abb. 4 dazu)!

Vermeiden Sie eine Kontamination der Stammlösung der Bakteriensuspension mit

Spuren von Lysozym!

Da Lysozym auch im menschlichen Speichel vorkommt, können Sie auch einen

entsprechenden Versuch zum Nachweis durchführen.

10 µl Probe 490 µl Testpuffer

1900 µl Micrococcus

100 µl

1:20 1:50

1:1000

22

Versuchstag 2

PRAKTISCHE DURCHFÜHRUNG

Isolierung von Lysozym aus Hühnereiweiß

a) Extraktion

Eiweiß von einem Hühnerei sorgfältig, ohne den Eidotter zu verletzen, von diesem

trennen

10 ml des gesammelten Eiweiß in einem Messzylinder abmessen und

anschließend in ein schmales Becherglas überführen

mit dem doppelten Volumen 0,1 M Ammoniumacetatpuffer pH 7,0 (= 20 ml

Säulenpuffer B) verdünnen

für etwa 15 Sekunden auf Eis mit einem Stabmixer homogenisieren

b) pH-Präzipitation

Die pH-Präzipitation dient der Fällung von Proteinen. Dabei macht man sich zu Nutze,

dass Proteine bei einem pH-Wert nahe ihres isoelektrischen Punktes (pI) ihre geringste

Löslichkeit aufweisen und somit aus der Lösung ausfallen (präzipitieren). Im Falle von

Hühnereiweiß werden mit Hilfe dieses Reinigungsverfahrens besonders Proteine mit

einem niedrigen pI zu einem gewissen Anteil aus der Lösung entfernt.

unter pH-Kontrolle (pH-Glaselektrode in die Lösung eintauchen) Eisessig (50 % =

9 M) zu tropfen bis der pH-Wert der Lösung einen Wert von 4,5 erreicht hat

Zentrifugation für 30 Minuten bei 4 °C und 20.000 U/min (Sorvall-Zentrifuge,

Keller). Vor der Zentrifugation bitte Probe mit einem zweiten Zentrifugationsgefäß

exakt austarieren!!

Dekantieren Sie den

klaren Überstand

Messen Sie das Volumen

und entnehmen Sie eine 1 ml

Probe dieses Rohextraktes

zur Protein- und Aktivitäts-

bestimmung

Was heißt „austarieren“? Wozu dient

dieser Vorgang bei der Zentrifugation?

23

c) Chromatographie mittels CM-Sepharose-Kationenaustauscher

Um Lysozym von den anderen Proteinen zu trennen, wird hier eine Ionen-Austausch-

Chromatographie angewendet. Dabei wird eine Chromatographie-Säule genutzt, welche

Carboxymethyl-(CM)-Sepharose als Säulenmaterial enthält (sog. feste Phase). Dieses

Säulenmaterial weist eine negative Ladung auf. Im ersten Schritt wird die Säule mit der

Probe beladen: Lysozym und andere Proteine des Hühnereiweiß binden je nach Ladung

an das negativ geladene Säulenmaterial. Bei niedrigem pH-Wert liegen die meisten

Proteine protoniert vor, so dass sie eine positive Ladung besitzen und somit über

elektrostatische Anziehung am negativ geladenen Säulenmaterial haften. Nun wird die

Säule nacheinander mit Puffern gewaschen (sog. mobile Phase), welche einen

steigenden pH-Wert besitzen. Dadurch verlieren die Proteine, abhängig von ihrem pI

nach und nach an positiven Ladungen und werden so durch den Ladungsverlust von der

Säulenmatrix gelöst und eluiert. Auf diese Weise können Proteine in unterschiedlichen

Fraktionen (Fraktion A-D) gesammelt und von Lysozym getrennt werden. Lysozym

besitzt einen relativ hohen pI und wird somit zuletzt, bei einem höheren pH-Wert eluiert.

Um das Ausfallen (Präzipitieren) des Proteins an seinem isoelektrischen Punkt zu

vermeiden, wird der pH-Wert nicht genau bis zum pI von Lysozym gewählt. Stattdessen

wird in den letzten Elutionsschritten, zusätzlich Na2CO3 dem Elutionspuffer zugegeben.

Die positiv geladenen Natrium-Ionen kompetitieren dann mit nur noch schwach

gebundenem Lysozym um die Bindestellen der negativ geladenen Matrix, sodass es

bereits vor dem Erreichen des isolektrischen Punkts von Lysozym zur Elution des

Enzyms kommt.

Rohextrakt aus pH-Präzipitation

mit einer Pasteurpipette auf eine

in Säulenpuffer A äquilibrierte

CM-Sepharose-Säule

auftragen und den sog.

Durchfluss in einem

Messzylinder (auf Eis) sammeln

nachdem der gesamte

Rohextrakt über die Säule gelaufen ist, wird das Volumen bestimmt

Durchfluss in das entsprechende Gefäß, welches für den restlichen Versuchstag

auf Eis gelagert wird, überführen

Was bedeutet es die Chromatographie-

Säule zu „äquilibrieren“? Warum führt

man diesen Schritt durch?

24

Achtung: Während der Chromatographie sollte der Flüssigkeitsmeniskus gerade

am Säulenmaterial angelangt sein, jedoch sollte die Säule nie trocken laufen!

Säulenpuffer A über die Säule laufen lassen, bis man genau 25 ml Säuleneluat

(Eluat A) gesammelt hat (dafür wieder Messzylinder auf Eis verwenden)

Achtung: Zuerst überschüssigen Puffer vorsichtig mit der Pasteurpipette

entfernen, dann das Säulenbett fingerbreit mit neuem Puffer überschichten, um

Aufwirbelungen des Säulenmaterials zu vermeiden.

Säule nacheinander mit Säulenpuffer B, C und D waschen und wieder jeweils

25 ml Eluat sammeln (Eluate B und C). Ebenfalls in entsprechende Gefäße

überführen.

Eluat D sofort mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 7,5 einstellen, um die Probe

zu neutralisieren und dann in entsprechendem Gefäß auf Eis lagern.

Welche Verdünnungen von Durchfluss, Eluat A, B und C schlagen Sie für die

Proteinbestimmung vor? Warum? Wie würden Sie Eluat D verdünnen? Besprechen Sie

Ihre Vorschläge erst innerhalb Ihrer Gruppe und dann mit den Praktikumsbetreuern bevor

Sie mit den Messungen beginnen.

Tipp: Es ist sinnvoll, bereits während der Elutionen mit der Bestimmung von

Proteinkonzentration und Lysozymaktivität zu beginnen. Tragen Sie die Messwerte in

Tabelle 5 ein und füllen Sie die Tabelle aus.

WICHTIG: Bitte bewahren Sie 1 ml-Probenaliquots aller Reinigungsschritte für den

Versuch 3 (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) auf.

AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE / DISKUSSION

Allgemeine Angaben zur Anfertigung des Protokolls finden Sie am Anfang des Skripts

(S. 5-7), detailliertere Hilfestellungen zur Interpretation und Diskussion Ihrer Daten sowie

zusätzliche Informationen finden Sie am Ende der Versuchsvorschrift 3 „SDS-

Gelelektrophorese“ (S. 31).

25

Tabelle 5: Reinigungstabelle für Lysozym aus Hühnereiweiß (wird auch im Kurs ausgegeben)

Reinigungs-

stufe

Gesamt-volumen

[ml]

Ver-

dünnungs-faktor

A280

Protein-konzen-tration [mg/ml]

Gesamt-protein

[mg]

Protein-

ausbeute

[%]

Ver-

dünnungs-faktor

ΔA450 [min-1]

rel. spez. Aktivität [U/mg]

Gesamt-aktivität

[kU]

Gesamt-aktivitäts-ausbeute

[%]

nach Extraktion

Durchfluss

CM-Sepharose Eluat A

CM-Sepharose Eluat B

CM-Sepharose Eluat C

CM-Sepharose Eluat D

26

Versuchstag 2

VERSUCH 3:

BIOCHEMISCHE TRENNVERFAHREN UND ANALYSEMETHODEN

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) zur Analyse der Reinheit und

zur Bestimmung des Molekulargewichtes von Proteinen

EINLEITUNG

Die Elektrophoresetechnik ist ein sehr wichtiges analytisches Hilfsmittel in der Biochemie,

um Molekulargewicht und Reinheit von Makromolekülen (Peptide, Proteine,

Oligonukleotide, Nukleinsäuren) zu bestimmen. Die Methode beruht auf der Tatsache,

dass Moleküle wie DNA, RNA oder Proteine Ladungen tragen und daher in einem

elektrischen Feld wandern können. Als Trägermaterialien, an denen Elektrophorese

durchgeführt wird, fanden früher Cellulose (Papier) oder Stärke Verwendung, heute

werden hierfür Polyacrylamid oder Agarose benutzt.

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Als Trägermaterialien für die Gelelektrophorese eignen sich hydrophile Medien, welche

stabil und chemisch inert sind, und die Wanderung von kleinen Ionen in wässrigem Milieu

nicht behindern. All diese Eigenschaften vereinigt Polyacrylamid, welches man durch

Copolymerisation von Acrylamid und N,N'-Methylenbisacrylamid erhält (Abb. 9).

Abbildung 9: Polymerisation und Vernetzung von Acrylamid und N,N’-

Methylenbisacrylamid.

27

Der Vernetzungsgrad eines Polyacrylamid-Gels und damit seine Porengröße können

durch die Konzentrationen und das Verhältnis von Acrylamid zu N,N'-

Methylenbisacrylamid variiert werden. Die lineare Verknüpfung der Acrylamid-Monomere

und die Quervernetzung mit N,N'-Methylenbisacrylamid wird durch radikalische

Polymerisation mit Ammoniumperoxodisulfat (APS) gestartet. Tetramethylethylendiamin

(TEMED) wirkt dabei als Katalysator für die Bildung von Sulfatradikalen. Die SDS-Gel-

elektrophorese von Proteinen verbindet die Methoden der Gelfiltration und der

Elektrophorese. Die Trennung erfolgt jedoch nur nach der Größe der Proteine (relative

Molekülmasse), wenn die Form und die Ladung der Moleküle einheitlich sind. Diese

Bedingungen werden ziemlich gut erfüllt, wenn die Tertiärstruktur der Proteine durch

Einwirkung des Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS) zerstört wird. Die

Dodecylsulfatanionen binden mit ihren hydrophoben Kohlenwasserstoffketten an

hydrophobe Regionen eines Proteins, die ursprünglich im Inneren nativ gefalteter

Proteine lokalisiert waren. Dabei werden nicht-kovalent verknüpfte Untereinheiten

dissoziiert und die geordnete Tertiärstruktur aufgelöst. Es werden etwa 1,4 g SDS / g

Protein gebunden. Dadurch werden alle Proteine stark negativ geladen und die

Ladungsdichte (Ladung/Masse) wird für alle SDS-beladenen Proteine gleich. Die

Laufstrecke während der SDS-Gelelektrophorese hängt also nur noch von der Größe des

Proteins, d. h. von seiner relativen Molekülmasse ab. Die SDS-Polyacrylamid-

Gelelektrophorese ist eine der wichtigsten Routinemethoden der Biochemie.

PROBLEMSTELLUNG

Mit Hilfe der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese soll der Erfolg der Reinigung des in

Versuch 2 präparierten Lysozyms dokumentiert werden. Als Referenz dient ein Gemisch

von Standardproteinen mit bekannten Molekülmassen (Proteinmarker) sowie ein

kommerziell erhältliches Lysozympräparat. Die Experimente werden mit einer Flachbett-

Elektrophoresekammer durchgeführt.

28

MATERIALIEN

Puffer, Lösungen und Reagenzien

10x Elektrophoresepuffer: 250 mM Tris-Base; 1,9 M Glycin; 1 % (w/v) SDS

4x Probenpuffer: 6 % (w/v) SDS; 30 % (v/v) Glycerin; 1,9 M

β-Mercaptoethanol, 187,5 mM Tris-HCl-Puffer (pH 6,8);

0,2 mM Bromphenolblau

SDS-Sammelgel (3 %): 10 % (v/v) Acrylamid-Stock-Lösung (30 %); 0,125 M Tris-

HCl-Puffer (pH 6,8); 3,5 mM SDS; Bromphenolblau;

Zugabe von 0,1 % (v/v) TEMED und 4,4 mM

Ammoniumperoxodisulfat

SDS-Trenngel (15 %): 50 % (v/v) Acrylamid-Stock-Lösung (30 %); 0,39 M Tris-

HCl-Puffer (pH 8,8); 1,75 mM SDS;

Zugabe von 0,05 % (v/v) TEMED und 2,2 mM

Ammoniumperoxodisulfat

Färbelösung (1 l): 70 mg Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250, 3 ml konz.

HCl

Proteinlösungen: Lysozym aus Hühnereiweiß

Protein-Marker: Unstained Protein Molecular Weight Marker (Thermo

Scientific)

Abbildung 10: Proteinstandard zum Größenvergleich

29

PRAKTISCHE DURCHFÜHRUNG

a) Herstellung des Polyacrylamid-Gels

Der Zusammenbau der Glasplatten für die Gelelektrophorese sowie die Herstellung und

das Gießen des Trenngels wird von den Praktikumsbetreuern vorbereitet.

Nach erfolgter Polymerisation des Trenngels wird das Wasser entfernt, welches das

Trenngel überschichtet, um eine gleichmäßige Oberfläche zu garantieren.

Zur Herstellung des Sammelgels werden 5 ml Sammelgellösung in ein kleines

Becherglas pipettiert (Achtung: Handschuhe tragen!). Nach Zugabe von 50 µl 10 % APS-

Lösung und 5 µl TEMED wird durch Schwenken kurz gemischt und die Gellösung sofort

mit Hilfe einer Pasteurpipette auf das Trenngel geschichtet. Es ist darauf zu achten, dass

sich keine Luftblasen bilden. Ist die Form gefüllt, steckt man vorsichtig den Kamm in das

obere, offene Ende der Form. Nach 20-30 Minuten ist die Polymerisation abgeschlossen

(Vergleichen Sie mit der restlichen, nicht in die Gelform gefüllten Lösung).

b) Vorbereitung der Elektrophorese

Beim Einsetzen der Gelgießform und der Befestigung des Gels mit zwei Klammern ist

darauf zu achten, dass nach dem Eintauchen der Gelform in den Puffer der

Anodenkammer keine Luftblasen am unteren Gelende hängen bleiben. Jetzt wird der

Elektrophoresepuffer in den oberen Vorratsbehälter eingefüllt und schließlich der Kamm

so langsam und vorsichtig herausgezogen. Die vom Kamm erzeugten Geltaschen (in

welche später die Proben einpipettiert werden) sind vorsichtig und sorgfältig mit Hilfe

einer Pipette mit Elektrophoresepuffer zu spülen.

c) Denaturierung und Auftragen der Proben

Die jeweiligen Proteinlösungen werden so mit Wasser verdünnt, dass sie ca. 1,0 µg

Protein pro µl Lösung enthalten. (Bitte untenstehende Tabelle ausfüllen und vom

Praktikumsbetreuer gegenzeichnen lassen!) Anschließend werden in einem

Reaktionsgefäß jeweils zusammengemischt: 5 µl Probenpuffer und 15 µl der

Proteinverdünnung. Der Molekulargewichtsstandard muss nicht verdünnt werden und

enthält schon den Probenpuffer! Dann verschließt man die Gefäße, mischt am Vortex-

Mixer, zentrifugiert kurz an (Tischzentrifuge) und inkubiert alle Gefäße für 5 Minuten bei

95 °C in einem Heizblock und zentrifugiert wieder kurz an. Nun werden 15 µl der

denaturierten Proteinproben mit einer Pipette so langsam in die einzelnen Taschen des

Gels einpipettiert, dass sich die Proben als schmale blaue Banden direkt über dem Gel

30

absetzen. Die einzelnen Proteinproben werden wie in Tabelle 6 angegeben auf die

Taschen des Gels verteilt. Der Proteinmarker (Abb.10) muss nicht verdünnt werden.

Tabelle 6: Beladungsplan für die SDS-PAGE

Proteinprobe

Protein-

konzentration

[mg/ml]

Verdünnung

(Endkonz.:

1 mg\ml)

z. B. 1:20

Zu pipettieren:

z. B.

10 µl+190 µl

Spur 1 Protein-Marker -

Spur 2 kommerzielles

Lysozym

1 mg/ml

Spur 3 Rohextrakt

Spur 4 Durchfluss

Spur 5 Eluat A

Spur 6 Eluat B

Spur 7 Eluat C

Spur 8 freilassen - - -

Spur 9 Eluat D

d) Elektrophorese

Man setzt den Deckel auf die Kammer, legt eine Spannung von 60 V an, bis die Proben

das Sammelgel passiert haben, erhöht dann die Spannung auf 160 V und lässt die

Elektrophorese so lange laufen, bis die Farbstoffbande des Markers (Bromphenolblau)

den unteren Rand des Gels erreicht hat. Dies ist in der Regel nach etwa 60 Minuten Lauf

im Trenngel der Fall.

e) Anfärben und Entfärben des Gels

Die Gelform wird nach Abschalten des Stroms aus der Elektrophoresekammer

genommen. Man entfernt dabei die vordere und hintere Platte der Gelform und legt das

Gel in eine Plastikschale. Nach Zugabe von 75 ml dest. Wasser und anschließendem

Erhitzen in der Mirkowelle für 60 s wird 2 Minuten durch kontinuierliches Schwenken

gewaschen. Das Wasser wird verworfen und es werden erneut 75 ml Wasser zugegeben,

erhitzt und gewaschen. Insgesamt wird dieser Vorgang 3 mal durchgeführt.

31

Danach werden 50 ml Färbelösung zugegeben und für 45 Sekunden in der Mikrowelle

erhitzt. Es wird nun geschwenkt, bis die Proteinbanden auf dem Gel gut sichtbar sind. Ist

der gewünschte Färbegrad erreicht (ca. 10 Minuten bei Raumtemperatur), wird das Gel

mit Wasser gewaschen, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Nach vollständiger

Entfärbung werden die Gele mit Hilfe eines Geldokumentationssystems fotografiert.

Bringen Sie einen USB-Stick mit, damit Sie das Gelfoto gleich mitnehmen können.

Achtung: Beim Umgang mit Polyacrylamidgelen sind Handschuhe zu tragen. Das Gel

ist sehr weich und reißt leicht, es ist daher mit äußerster Vorsicht zu behandeln!

AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE / DISKUSSION FÜR DIE

VERSUCHE 2 UND 3

Im Ergebnisteil sollten folgende Tabellen, Grafiken, Rechnungen etc. enthalten sein. Die

Form des Protokolls soll dabei der allgemeinen Form wissenschaftlicher Arbeiten (siehe

S. 5-8) entsprechen.

1. Reinigungstabelle

Bitte füllen Sie die Reinigungstabelle für Lysozym aus. Die Berechnung der relativen

Aktivität und der Gesamtaktivität erfolgt wie in Gleichung 1 und 2 angegeben.

Berücksichtigen Sie bei diesen Berechnungen alle Verdünnungsschritte und geben Sie

für jede Rechnung (Proteinkonzentration, rel. spez. Aktivität usw.) je eine

Beispielrechnung an. Bitte beachten Sie, dass die Beispielrechnung alle Einheiten

enthalten muss!

2. SDS-PAGE

Im Diskussionsteil diskutieren Sie anhand der Proteinmengen und der Aktivitätswerte

in der Reinigungstabelle den Reinigungserfolg und das Verfahren der Ionenaustausch-

chromatographie. Beziehen Sie in Ihre Bewertung auch das Ergebnis der SDS-

Gelelektrophorese aus Versuch 3 mit ein.

Bei der Diskussion Ihrer Ergebnisse sollten Sie u. a. auch auf folgende Fragen eingehen:

1. Welche Reinigungsschritte waren am erfolgreichsten, d.h. wo konnten die meisten

störenden Proteine entfernt werden?

32

2. Wieviel Protein bzw. Lysozymaktivität haben Sie auf die Chromatographiesäule

aufgetragen und wieviel Protein bzw. Lysozymaktivität haben Sie in den fünf

Elutionsschritten wieder im Eluat gefunden? Diskutieren Sie!

3. Betrachten Sie Proteinmenge und relative spezifische Aktivität vom ersten Schritt

der Reinigung bis zum Endprodukt! Was fällt auf?

4. Stellen Sie jeweils den Gesamtproteingehalt (in %) und die spezifische Aktivität

(in U/mg) grafisch dar!

5. Warum lassen sich bei der Reinigung mittels Ionenaustauschchromatographie

keine Lysozymaktivitäten in Eluat A, B und C nachweisen?

6. Welche Proteine könnten Sie im Durchfluss sowie den Eluaten A, B und C

gefunden haben? Welche Eigenschaften haben diese? Diskutieren Sie anhand

der Tabelle 7 „Zusammensetzung Hühnereiweiß“ und der Tabelle 8 „Prozentuale

Zusammensetzung der Hühnereiweißproteine“!

7. Wie bewerten Sie den Anstieg der relativen spez. Aktivität von <500 U/mg bei den

ersten Reinigungsschritten auf ~5.000 U/mg nach der Chromatographie?

Bitte bewerten Sie an Hand des SDS-Polyacrylamid-Gels in einer kurzen Diskussion den

Erfolg der einzelnen Reinigungsschritte sowie die Qualität des von Ihnen in Versuch 2

gereinigten Lysozyms. Achten Sie bitte auch auf die richtige Beschriftung

von Abbildungen in wissenschaftlichen Arbeiten!

33

Tabelle 7: Analyse isolierter Proteine aus dem Hühnereiweiß (aus Rhodes et al., 1957).

Tabelle 8: Prozentuale Zusammensetzung der Hühnereiweißproteine.

34

VERSUCH FÜR DIE SCHULE ODER ZU HAUSE:

Isolierung von DNA aus Tomaten

Einleitung

Für die Isolierung von DNA existieren sehr viele unterschiedliche Protokolle, die für

verschiedene Zellen und Gewebe, für Plasmid- oder genomische DNA im kleinen oder

großen Maßstab entwickelt wurden. Die folgende Methode ist eine sehr „grobe“ Methode,

um DNA und RNA aus pflanzlichem Gewebe zu isolieren. Sie wird natürlich so nicht im

Labor angewendet, zeigt aber die Grundprinzipien der DNA-Extraktion aus Geweben auf.

Ferner eignet sich diese Methode hervorragend für das Experimentieren zu Hause oder

in der Schule.

Das Gewebe wird zunächst mechanisch, die Zell- und Kernmembranen durch die

Tensidwirkungen eines Haushaltsreinigers zerstört. Die Zellreste werden herausgefiltert

und die Nukleinsäuren gelangen durch die groben Poren eines Kaffeefilters ins Filtrat.

Außer einer halben Tomate (Banane oder Zwiebel) werden noch folgende Stoffe

benötigt: 5 ml Spülmittel, 1,5 g Kochsalz, 2 Tropfen flüssiges Waschmittel, kalter Alkohol

aus der Apotheke (z.B. über Nacht im Gefrierfach aufbewahrt). Statt des Alkohols aus

der Apotheke kann auch Brennspiritus verwendet werden.

Praktische Durchführung

1. Zu 50 ml Wasser werden Kochsalz und Spülmittel gegeben. Gut Umrühren,

damit sich das Salz löst!

2. Die Tomate wird in kleine Stücke geschnitten und die Stücke in die salzige

Spülmittellösung gegeben. Das Spülmittel bricht die Zellmembranen auf, so

dass die DNA aus den Zellen und Zellkernen entlassen wird.

3. Die Mischung muss nun mindestens 15 Minuten stehenbleiben. Man kann sie

auch erhitzen (auf ca. 60 °C), denn Wärme beschleunigt den Auflöseprozess und

zerstört zugleich die sogenannten DNasen (das sind Enzyme, die die DNA

abbauen).

35

4. Jetzt wird die Mischung im Mörser püriert (oder gemixt – aber nicht zu lange,

sonst wird die DNA zerstört).

5. Anschließend wird die Mischung filtriert – zu Hause kann man dazu einen

Kaffeefilter verwenden. Dabei bleiben die festen Zellwandbestandteile im Filter

zurück und werden so von der gelösten DNA und den Proteinen getrennt.

6. Etwa 10 ml des Filtrats werden in ein hohes, schmales Glas (z.B.

Reagenzglas) gegeben. Dazu kommen 2 bis 3 Tropfen Flüssigwaschmittel.

Wieder gut mischen! Im Waschmittel sind Proteasen enthalten, Enzyme, die die

Proteine in der Lösung abbauen. Dazu sind nur winzige Mengen Enzym nötig.

7. Zum Schluss wird die Lösung mit dem gleichen Volumen kalten Alkohols

überschichtet – dabei wird der Alkohol vorsichtig an der Wand des Gefäßes

entlang hineingegossen. Man erhält zwei Flüssigkeitsschichten: oben den

Alkohol und unten den Tomatenextrakt.

8. Innerhalb kurzer Zeit reichert sich die DNA an der Grenze zwischen beiden

Schichten an. DNA löst sich nicht in Alkohol und wird daher als weißer Schleim

sichtbar. Mit Hilfe eines Holzstäbchens kann man die DNA herausfischen.

LITERATUR

Pingoud, A., Urbanke, C. (1997). Arbeitsmethoden der Biochemie. Walter de Gruyter, Berlin, New York Rhodes, M., Azari, P. und Feeney, R. (1957). Analysis, Fractionation, and Purification of Egg White Proteins with Cellulose-Cation Exchanger. J. Biol. Chem. 230(1): 399-408. Lottspeich, F., Zorbas, H. (1998). Bioanalytik. Spektrum, Akad. Verl., Heidelberg, Berlin Die biochemischen Grundlagen der hier beschriebenen Versuche können in diversen Lehrbüchern (Stryer, Voet etc.) nachgelesen werden.