Evolutionäre Verfahren 3 : Yeast Two Hybrid System

Biochemiepraktikum IIWS 2007/2008

15. Januar 20085. Februar 2008

AG Bernd Groner Corina HeinzAstrid Weiß

Protein-Protein Interaktionen

Protein-Protein Interaktionen sind die Basisvon vielen wichtigen zelluläre Prozessenz.B. Signaltransduktion

Apoptose

Langlebige Interaktionen (Zytoskelett)Transiente Interaktionen (Kinasen, Proteasen)

Veränderungen von Protein-Protein-Interaktionen können zu Krankheiten führenz.B. HPV16 Proteine (p53 wird degradiert)

Neue therapeutische AnsätzeInhibitorische Peptide mittels YTH-Systemz.B. gegen Stat3 und Survivin (Überexpressionin vielen Tumoren)

Analyse von Protein-Protein Interaktionen

Identifizierung => Charakterisierung => Manipulation

In vitro Methoden:

(Co-)Immunpräzipitation zwei interagierenden Proteinen im LysatAffinitätschromatographie potentieller Interaktionspartner ist immobilisiertCross-linking chemische Verknüpfung von PartnernProtein-probing markiertes Protein beweist eine BindungPhage-display Suche nach Partner in einer Bibliothek

In vivo Methoden:

Fluorescence energy transfer (FRET)Hefe-Zwei-Hybrid

Reverse-Zwei-Hybrid-SystemHefe-Tribrid-System(Dual-Bait-System)

Yeast-Two-Hybrid : Das Prinzip I

Transkriptionsfaktoren haben eine DNA-Bindedomäne (DBD) und eineTransaktivierungsdomäne (AD), die von einander getrennt werden können.

GAL4- TranskriptionsfaktorGal4-Zielgen

Fields & Song (1989): Die DBD und AD müssen nicht in einem Protein vorliegen,sondern können auch nach indirekter Assoziierung die Transkription aktivieren.

Co-Aktivatoren, HAT, RNA-Pol II

Yeast-Two-Hybrid : Das Prinzip II

Transkriptionsrepressoren haben zwar eine DNA-Bindedomäne (DBD) aber keineTransaktivierungsdomäne (AD). Sie unterdrücken die Transkription.

GAL80 Repressor

Ma & Ptashne (1988): Die AD von GAL4 kann mit der DBD von GAL80 fusioniertwerden. In dem Fall ist GAL80 kein Repressor sondern ein Aktivator. D.h. die ADbestimmt, ob es sich um einen Aktivator oder einen Repressor handelt.

Gal4-Zielgen

GAL4/GAL80- FusionGal4-Zielgen

{–}

AD

BD

{+}

Ade2His3

Gal4 RE

WProtein 1

Gal4 DBD

Wichtig:• S. cerevisiae Stämme fehlern wesentliche Enzyme für die Synthese von den

Aminosäuren Leu, Trp, His und Ade• Grundlage bilden zwei Vektoren, die für das Protein1 und 2 (bilden zusammen

den Gal4-Transkriptionsfaktor)• Transformation ermöglicht Wachstum auf Leu- und Trp-Mangelmedium• Expression der Enzyme für die Synthese von His und Ade steht unter der

Kontrolle der Gal4 response elements (RE)

Yeast-Two-Hybrid : Das Prinzip III

LGal4 ADProtein 2

Selektionsmarker

Yeast-Two-Hybrid : Hefe

Genotyp:

MATa, his3−200, trp1-901, leu2-3,112, ura3-52, gal4, gal80, ade-2,LYS2::(GAL1UAS)-HIS3, LEU2::(GAL2UAS)-ADE2, URA3::(GAL1UAS)-LacZ

MATa oder α (mating type)

His-3: IGP-dehydratase, ist an der Biosynthese von Histidin beteiligt

Ade-2: Phosphoribosylamino-imidazole-carboxylase ist an der Biosynthese vonAdenin beteiligt

Ura-3: Orotidine-5’-phosphat decarboxylase, die an der Biosynthese der Pyrimidinbase Uracil beteiligt ist

LacZ: Kann verwendet werden, um die Interaktion im ß-Gal Test nachzuweisen

DeletionModifikation

Yeast-Two-Hybrid : Arbeitsablauf

Konstruktion vom DBD-Protein1-Vektor: Bait (Köder)

Konstruktion vom AD-Protein2-Vektor: Prey (Beute)

Transformation in Hefe

Selektion von Hefe-Transformanten auf Selektionsmedium

Zurück-Isolation des Protein2-Plasmids

Sequenzierung

Charakterisierung der Interaktion

Yeast-Two-Hybrid : Der DBD-Vektor

Nach der DBD-Protein1-Konstruktion:

1. Transformation in Hefen

2. Überprüfen, ob das Fragment alsFusionsprotein exprimiert wird

3. Sicherstellen, daß das Fragment nichtvon sich aus schon als “Aktivierungs-domäne” fungiert

Hier: Survivin als Protein 1

Yeast-Two-Hybrid : Der DBD-Vektor

Überprüfen, ob das Potein1 als Fusionsprotein mit Gal4-DBD exprimiert wird.

Survivin

α-Tubulin

OD

600

0,46

8

OD

600

0,6

69

OD

600

0,44

5

OD

600

0,6

11

OD

600

0,6

80

Surv Klon1 Surv Klon2

40 kDa

50 kDa

Erfolgreiche Expression desKöderproteins in den Hefen

Expression von Gal4-DBD-cMyc-Survivin im Hefestamm AH 109 S. cerevisiae

NK

Expressionsplasmid: DBD-Protein1mit c-Myc epitope tag (pGBKT7)

Yeast-Two-Hybrid : Der DBD-Vektor

A lag-PhaseB BeschleunigungsphaseC exponentielles Wachstum (log)D limitiertes WachstumE stationäre Phase

Yeast-Two-Hybrid : Der DBD-Vektor

Sicherstellen, daß das DBD-Fragment nicht von sich aus schon als AD fungiert.

1 DD BIR

6 10 89 102

coiled coil 143DD

Bir1

Bir2

Birc

SCC

Surv

Gal4-DBD +

-Trp -Trp/-His

0 10x 100x 1000xVerdünnungen

0 10x 100x 1000xVerdünnungen

pGBK_Gal4 DBD Survivin

Gal4-Zielgen

His?

DBD-Vektor: TrpAD-Vektor: LeuInteraktion: Trp, Leu, His

Yeast-Two-Hybrid : Die AD-Vektoren (Beute)

Prey: 1. Ein zweites bekanntes Protein, oder ein Fragment dieses Proteins

2. cDNA Bank

3. Peptid Bank integriert in einem Gerüstprotein

Gal4-AD cDNA

Gal4-AD Protein2

Gal4-AD Peptid Gerüst

Subdomäne

Alle Vektoren haben einen ADH1 Promoter: hohe Expression in der frühen Log-Phase.

*

Yeast-Two-Hybrid : Transformation

Doppeltes Mangelmedium

Interaktion: dreifaches Mangelmedium

Yeast-Two-Hybrid : Kommerzielle Vektoren

TAF

Yeast-Two-Hybrid : Reporter I

Interaktionsstärke:

His-3

Ade-2

GAL1-4xUAS GAL1-TATA

GAL2-2xUAS GAL2-TATA

schwach

stark

TFTF

TAF

TFTF

Hefegene: TATA-Box (transkriptionellen Startpunkt)Upstream Activating Sequences (cis-Elemente)

Deletionen: endogene Gene für GAL4, GAL80, LEU2, TRP1, HIS3, ADE2

Promotor

Yeast-Two-Hybrid : Reporter II

LacZ oder Mel1GAL2-UAS GAL2-TATA

TAF

TFTF

Gal-Assays

Aus Flüssigkulturen

Auf Platte

Methode

Zellen lysieren

Zellen lysieren

Medium abnehmen

Kolonien auf Filter-Papier transferrierenund lysieren

Hefe umstreichen

Substrat

Zugabe von ONPG

Zugabe von CPRG

Zugabe von PNP-αGal

Filter auf X-Gal

X-α-Gal in Platte

Produkt

o-Nitrophenol (gelb)

Chlorophenolrot

p-Nitrophenol

Blaues Präzipitat

Blaues Präzipitat

Detektion

Photometer (420 nm)

Photometer (578 nm)

Photometer (410 nm)

Blaue Kolonien

Blaue Kolonien

ß-Galactosidase

oder

α-Galactosidase

Substrat

Farbe

cDNA for protein (bait) to be testedfor ability to interact with otherproteins is fused to DBD

DBDGal4 gene Bait

Bait

Bait

DBD Express thelibrary of hybridcDNAs in cells

Activation domainfused to manycDNAs

Test for the ability to activateexpression of LacZ

DBDGal1 lacZ

Gal1 lacZ

Gal1 lacZ

Übersicht : cDNA-screen

Plasmid-Rescue

Gesamt DNA Isolation

Transformation in E. coli

Bait Vektor:AmpR

Prey-Vektor:KanR

LB-Kan

HefeGal1 His3

LB-Amp

Nachprüfung der Interaktion : Mating-Assay

Mat a Mat α

Umstreichen

Variationen : Reverse-Yeast-Two-Hybrid System

AD

AD

His-3

His-3TetR

TetR

LexA operator

LexA operator

Tet operator

Tet operator

Zur Identifizierung von Molekülen/Proteinen/Mutationen, die eine Interaktion stören

Variationen : Reverse-Yeast-Two-Hybrid System

AD

DB

AD

DB

Ura-3

Ura-3

LexA operator

LexA operator

+ FOA (Fluoroorotsäure)

Fluoro-Uracil = Death

+ FOA

= Life

Zur Identifizierung von Molekülen/Proteinen/Mutationen, die eine Interaktion stören

Fluoro-Uracil: Antimetabolit, wird statt Uracil in RNA eingebaut (Cytosin / Thymin in DNA)

Übersicht : Systeme und cDNA-Banken

Erfinder

S.FieldsS. ElledgeClontech

R. Brent

S. Hollenberg

GibcoBRL

E. Golemis

R. Brent

System

Two-HybridImproved Two HybridMatchmaker

Interaction Trap

Modified Two-Hybrid

ProQuest

Dual Bait

Two Bait

DBD - AD

Gal4

LexA - B42

LexA - VP16

Gal4

LexA - B42cI - B42

LexA - B42TetR - B42

Selektion

His3, LacZHis3, Ade2, LacZHis3, Ade2, LacZ

Leu2, LacZ

His3, LacZ

His3, Ura3, LacZ

Leu2, LacZLys2, GusA

Leu2Ura3

cDNA-Bank

>51

>105

18

>105

>105

Vorteile des Hefe-Zwei-Hybrid Systems

1. In vivo

2. Es ist relativ einfach hiermit anzufangen und benötigt nicht viel Aufwand. Fürbiochemische Methoden wird oft aufgereinigtes Protein in sehr gute Qualitätbenötigt. Hier wird höchstens cDNA benötigt.

3. Hiermit können auch die schwachen Interaktionen noch detektiert werden,da mehrfache Promoterelemente vor dem Reportergen geschaltet sind, waszur Amplifikation des Signals führt.

4. Es können ganz einfache semi-quantitative Tests durchgeführt werden, umdie Affinität interpretieren zu können.

5. Nach dem Screen kann sofort die DNA des Interaktionspartners isoliertwerden.

Zu beachten : Potentielle Nachteile

1. Das Target-Protein darf keine eigene Aktivierungsdomäne besitzen.2. Die Konformation des Target-Proteins kann im Fusionsprotein geändert sein.

Wird nur eine Domäne verwendet, soll unbedingt die Bindung am gesamtenProtein untersucht werden.

3. Wird nur eine bestimmte Domänen des Target-Proteins an die DBD fusioniert(weil das Target zu groß ist oder weil es sich um ein Membranprotein handelt)dann soll beachtet werden, dass so normal nicht zugängliche Bindungsstellenvielleicht jetzt an der Oberfläche liegen.

4. Ein Protein, wovon bekannt ist, dass es das Target-Protein bindet, sollte alsPositiv-Kontrolle verwendet werden (bei Interaktion ist die Faltung der Domänekorrekt).

5. Manche post-translationale Modifikationen finden nicht statt.6. Die Fusionsproteine müssen in den Kern gelangen. Sind stärkere

Translokationssignale im Fusionsprotein vorhanden (z.B. Sekretion)?7. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass ein drittes Protein für die

Interaktion benötigt wird.8. Hefe wird als Wirt benutzt.

Nachteil: Ist die Faltung korrekt und das Protein in Hefen stabil?Vorteil: Gleicht mehr der Situation in höheren Eukaryoten als bei in vitro

Experimenten oder Systemen mit Bakterien als Wirt

Vielen Dank für Eure Aufmerksamkeit !