ElektrophoreseTeil 2

Skript zur Vorlesung „Grundlagen der Analytik I“im MSc-Studiengang Analytik

Prof. C. Vogt, Leibniz Universität Hannover 11.1.2007

Literatur

„Analytical Isotachophoresis“P. Bocek, M. Deml, P. Gebauer, V. Dolnik, VCH, Weinheim, 1988

„Gelelektrophorese“R. Westermeier, In Analytiker Taschenbuch, Bd. 7, Springer-Verlag, Berlin

„Isoelektrische Fokussierung“R. Westermeier, In Analytiker Taschenbuch, Bd. 7, Springer-Verlag, Berlin

„Capillary Electrophoresis: Principle and Practice“R. Kuhn, S. Hoffstetter-Kuhn, Springer Laboratory, Berlin, 1993

„Handbook of Capillary Electrophoresis“Ed. J. P. Landers, CRC Press, Boca Raton, 1997

“Advances in Electrophoresis”, Serie, Band 1, 2 und 6Eds. A. Chrambach, M. J. Dunn, B. J. Radola, VCH, Weinheim, 1987-1993

Gliederung

Grundlagengeschichtlicher Überblickwichtige GrößenTrennprinzipien

Zonenelektrophorese (ZE)Isotachophorese (ITP)Isoelektrische Fokussierung (IEF)

technische Realisierungen

KapillarelektrophoreseAufbau, apparative KomponentenPuffersysteme und AdditiveMizellare Elektrokinetische Kapillarchromatographie (MEKC)

Gelelektrophorese

Theorie

Ionenwanderung im elektrischen Feld

F = zi. e . E

Reibungskonstante

KR = 6 . π . η . ri

stationäre Geschwindigkeit (Migration)

vi = F / KR

vi = zi. e . E / 6 . π . η . ri

Ionenbeweglichkeit

µi = zi. e / 6 . π . η . ri

vi = µi. E

Theorie

κ⋅== qI

lUEEuv ii ⋅=

FnzIt ⋅⋅=⋅ qlR ⋅ρ= ρ spezifischer Widerstand

q Querschnitt

±± ⋅⋅∑⋅=κ iii uzcFSpezifische Leitfähigkeit

ir6eiz

iu⋅η⋅π

⋅±=± 0eff cc ⋅α=

Joul´sche Wärme RIQ 2 ⋅∼ T1lgη ∼

pH, E (U und L), Ionenstärke I, T

Theorie

κ⋅== qI

lUEEuv ii ⋅=

...2temp

2inj

2ads

2diff

2ges +σ+σ+σ+σσ =

vv

4NR ∆

⋅=2

wt16N ⎟

⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⋅=

( ) ( )eo21 uuD

Uuu177.0R+⋅

⋅−⋅=

UR ≈ UN ≈

Theorie

Molekül Molekulargewicht D . 10-5 cm2/s

HCl 36.5 3.05NaCl 58.5 1.48Glycin 75.07 1.06Citronensäure 192.12 0.66Cytochrom C 12400 0.11Hemoglobin (human) 64500 0.969Tabak Mosaikvirus 3940000 0.0046

Diffusionskoeffizienten ausgewählter Moleküle(in H2O, bei 25°C)

Ursachen der Zonenverbreiterung

Longitudinale DiffusionN, D w

Joulsche WärmeT, laminare Flüsse

Länge des Injektionspfropfens

ProbenadsorptionPeaktailing

Elektrodispersionκ von Probe und Puffer → Fronting & Tailing

Ungleich hohe Pufferreservoirelaminare Flüsse

Detektorzellen-Größel Detektor < w

Theorie

lH

2σ= tD22

diff ⋅⋅=σ

ED2

vD2

ltD2H

⋅µ⋅

=⋅

=⋅⋅

=

LD2Ul

D2El

HlN

⋅⋅⋅µ⋅

=⋅⋅µ⋅

==

Elektroosmotischer Fluss - EOF

Eeo ⋅η

ξ⋅ε−=µ

ε0εrζ

η

Dielektrizitätskonstante des VakuumsDielektrizitätskonstante des MediumsPotential der elektrochemischen Doppelschicht am Übergang starre-diffuse SchichtViskosität der Lösung

Fließprofile

Kapillarelektrophorese Chromatographie

Elektroosmotischer Fluss - EOF

EN, R, Q

Puffer-pHveo , zi,Puffer

IonenstärkeZeta-Potential, I [mA], Adsorption, Stacking

TemperaturViskosität

Organische ModifierZeta-Potential, Viskosität, Selektivität

TensideAdsorption, veo (Größe und Richtung), Selektivität

Neutrale hydrophobe PolymereAdsorption, veo , Viskosität

Kovalentes CoatingChemische Bindung, Modifizierungen, Stabilität

Beeinflussende Größen

Aufbau elektrophoretischer Trennsysteme

Einflussgrößen

Apparative ParameterSpannungTemperaturKapillarlänge

Chemische ParameterPufferzusammensetzungPufferkonzentrationpH

Puffer-Hauptkomponenten

Phosphate / Borate / organische SäurenChromat / Imidazol / Creatinin

Puffer-Zusätze zur Veränderung der Trenneigenschaften

Mizellbildnerorganische LösungsmittelKomplexbildnerGele, Modifier für den elektroosmotischen Fluß, Harnstoff, Derivatisierungsreagenzien

Kapillarsysteme

Temperaturgradient übereinen Kapillarquerschnitt

Radius der Kapillare [µm]

Wandtem-peratur [K]

Wandtem-peratur [°C]

∆T Wand -Kapillarzentrum [K]

25 299,0 25,85 0,5350 301,2 28,05 1,3975 304,2 31,05 3,14

100 307,7 34,55 5,58125 311,6 38,45 8,72

Kapillarsysteme

Innerer Durchmesser 10....200 mm (50...100 mm) Äußerer Durchmesser 50....400 mm (360 mm)

Kapillarlänge 1.......100 cm (30...80 mm)

ungefülltfused silica (Teflon, Borosilikatglas)

beschichtetverringerte / keine Adsorption an der KapillarwandBeschichtung mit Methylzellulose, Polyacrylamid, Aminopropyl, Polyethylenimin

mit Gel gefülltPolymerisierung in der Kapillare oder Anwendung gelartiger Puffer

mit Partikeln gefülltFüllmaterial aus HPLC, Partikeldurchmesser 1-5 µm

Kapillarlänge und Kapillardurchmesser

Kapillarsysteme

A direkte Detektion

Puffersystemepuffernder Bereich (pH)

H3PO4 / NaH2PO4 / Na2HPO4 / Na3PO4 3 - 9H3BO3 / Na2B4O7 7 - 10NaHCO3 / Na2CO3 7 - 10TRIS 5 - 8Glutaminsäure 5 - 8

B indirekte Detektion (UV- oder Fluoreszenzdetektion)

Zitronensäure 2,5 - 5,5Imidazol 4 - 7Creatinin 3,5 - 5,5Benzoesäure 3 - 64-Hydroxybenzoesäure 3 - 6Phthalsäure 3 - 6Pyromellitsäure 3 - 7Salicylsäure 3 - 5Natriumchromat 7 - 11

Kapillarsysteme

Einfluss des Puffersystems auf die Trennungaromatischer Carbonsäuren

10 mM Phosphat pH 9.07

10 mM Borat pH 9.15

10 mM Tricine pH 8.0

l=50/60 cm, 100 µm iD, U=25 kV, λ=200 nm, Druckinjektion 2 s bei 0.3 psi

Injektionstechniken

Druck, Gravitation (Syphon-Effekt), Spannung

L128tdpV

4

⋅η⋅⋅π⋅⋅∆

=

hgp

Druckinjektion

L128tdpV

4

⋅η⋅⋅π⋅⋅∆

= ∆⋅⋅ρ=∆Gravitationsinjektion

Spannungsinjektion( )

LtcrU

Q2

epeo ⋅⋅⋅π⋅⋅µ+µ=

Injektionstechniken

- 0 . 0 2 0

- 0 . 0 1 0

0

42

A

0

- 0 . 0 0 5

- 0 . 0 1 0

42

B

0

- 0 . 0 0 5

- 0 . 0 1 0

4 t [ m i n ]2

C

Puffer: 10 mM Creatinin, 25 mM α-HIBA, 10 mM Hac, 2 mM 18-Krone-6Probe: 0.01 mM NH4

+, K+, Rb+, Li+, Na+, Ca2+

und Mg2+

Vergleich von Druckinjektion und elektrokinetischer InjektionA 20 s bei 10 kVB 10 s bei 5 kVC 10 s bei 0.5 psi

Detektionstechniken

Methode NWG abs. NWG[Mol] [mol/l]

_______________________________________________________

UV-Vis-Absorption 10-13 - 10-16 10-5 - 10-8

Fluoreszenz 10-15 - 10-17 10-7 - 10-9

Laserinduzierte Fluoreszenz 10-18 - 10-20 10-14 - 10-16

Amperometrie 10-18 - 10-19 10-10 - 10-11

Leitfähigkeit 10-15 - 10-16 10-7 - 10-8

Massenspektrometrie 10-16 - 10-17 10-8 - 10-9

_______________________________________________________

bezogen auf 10 nl Injektionsvolumen

Nachweisgrenzen

Detektion

für 100 µm iD Kapillarenur max. 77 % TransmissionVerluste durch Reflexion und Streuung

Beispiel: L = 50 cm, 75 µm iD

LrV 2 ⋅⋅π=( ) cm50cm00375.0V 2

⋅⋅π=

L2.2Vges µ=

Injektionsvolumen 1 – 30 nL

Je injiziertem nL Lösung entsteht Zonenlänge von 0.23 cm

bei 200 µm Appertur ergibt sich maximales Detektionsvolumen von 0.88 nL !

Einfluss des Detektionsmodus

Detektion

Indirekte UV-Detektion

Detektion

Steigerung der Empfindlichkeit der Detektion

Einfluss der Trennspannung

UR ≈ UN ≈

Einfluss der Trennspannung

25 kV

15 kV

l=50/60 cm, 100 µm iD, Puffer: 10 mM Phosphat pH 9.07, 22°C

Trennung aromatischer Carbonsäuren

Einfluss der Temperatur

Zusatz von Mizellbildnern

Klassifizierung der Tenside nach hydrophilen GruppenKationische Tenside

primäre, sekundäre, tertiäre und quarternäre Ammonium-salze, Pyridiniumsalze

Anionische TensideCarboxylate, Sulfate, Sulfonate, Ethersulfate, Phosphate

Zwitterionische TensideAminoxide, Betaine, Sulfobetaine, Lecithine

Nichtionische TensidePolyglycolether, Polyalkohole, Zuckertenside

Tenside mit mehreren verschiedenen hydrophilen GruppenDicarboxylate, Sulfobernsteinsäureester

Mizellare Elektrokinetische Kapillarchromatographie

Prinzip der MEKC

c > cCMC

Mizellare Elektrokinetische Kapillarchromatographie

Prinzip der MEKC

ti Migrationszeit des Analytent0 Migrationszeit der Lösung (ohne

elektrophoretische Wanderung)tM Migrationszeit des Mizellbildners

tM < ti < t0

für anionische Mizellbildner und neutrale Analyten

Zusatz von Mizellbildnern

Natriumdodecylsulfat SDS 8,1 62Natriumtetradecylsulfat STS 2,1 (50°C) 138Natriumdecansulfonat 40 40Natriumdodecansulfat 7,2 54N-Lauryl-N-methyltaurat (Na-Salz) LMT 8,7 -Natriumpolyoxyethylendodecylethersulfat 2,6 66N-Dodecanyl-L-valinat (Na-Salz) SDVal 5,7 (40°C) -Natriumcholat 13 - 15 2 - 4Natriumdeoxycholat 4 - 6 4 - 10Natriumtaurocholat 10 - 15 5Natriumtaurodeoxycholat 2 - 6 -Kaliumperfluoroheptanoat 28 25,6Dodecyltrimethylammoniumchlorid DTAC 16 (30°C) -Dodecyltrimethylammoniumbromid DTAB 15 56Tetradecyltrimethylammoniumbromid TTAB 3,5 75Cetyltrimethylammoniumbromid CTAB 0,92 61

Name Kürzel CMC Aggr.-zahl(mM) n

Zusatz von Mizellbildnern

10 mM Phosphat,pH 9.07

10 mM Phosphat, 30mM SDS, pH 9.07

l=50/60 cm, 100 µm iD, U=25 kV, λ=200 nmTrennung aromatischer Carbonsäuren

Zusatz von SDS zum Trennpuffer → MEKC

Pufferadditive

NH2

Oberflächenmodifier

N+

Br

NH2NH2 N

H

NH2

Diaminopropan Spermidin

TetrabutylammoniumbromidTBA-Br

N+

CH3

CH3CH3

BrCH3

Hexadecyltrimethylammoniumbromid

AcetonitrilMethanolEthanol2-Propanol 0 ...... 50 %AcetonDMF

Formamid 0 .... 100 %N-Methylformamid

nicht geeignet: halogenierte KW, Alkane

Organische LM

Einfluss aufIonenstärkeViskositätε PufferEOFLöslichkeiten derAnalyten

Organische Lösungsmittel

Zusatz von Methanol zum Trennpufferl=50/60 cm, 100 µm iD, U=25 kV, λ=200 nm

Trennung aromatischer Carbonsäuren

10 mM Phosphat pH 9.07

10 mM Phosphat pH 9.07,20 % Methanol