Die Kovalente Struktur von Proteinen undNukleinsäure

1. Bestimmung der PrimärstrukturA) Endgruppenanalyse: Zahl der

Untereinheiten ?B) Spaltung der DisulfidbrückenC) Trennung, Reinigung und

Charakterisierung der PolypeptideD) AminosäurezusammensetzungE) Spezifische

PeptidspaltungsreaktionenF) Trennung und Reinigung von Peptid-

fragmentenG) SequenzbestimmungH) Ordnen der PeptidfragmenteI) Zuordnung von DisulfidbrückenJ) Peptidsequenzierung durch

MassenspektroskopieK) Peptid Mapping

2. Nukleinsäuresequenzierung

3. Chemische EvolutionA) SichelzellanämieB) Spezies VariationC) Evolution durch Genduplikation

4. BioinformatikA) SequenzdatenbankenB) Sequenz AlignmentC) Phyleogenetische Stammbäume

5. PolypeptidsyntheseA) SyntheseschemaB) Probleme und Aussichten

6. OligonukleotidsyntheseA) Synthese SchemaB) DNA ChipsC) SELEX

Proteine bauen das Leben auf

o Auge, Wahrnehmung von Licht: Rhodopsino Knochen, Körperform: Collageno Immunsystem, Verteidigung gegen Fremd:

Immunoglobuline

o Zum Verstehen der Funktion von Proteinenmüssen wir deren Aufbau/Struktur kennenlernen: primär, sekundär, tertiär und quartärStruktur

Hierarchie der Proteinstrukturen

Primärstruktur von Insulin

Frederick Sanger 1953 erste Sequenz von Insulin

Intra- und Inter-Ketten Disulfidbrücken

Schritte zur Primärstruktur/Sequenz

1. Vorbereitungen zur Sequenzierung– Bestimmung der Anzahl unterschiedlicher Untereinheiten– Spaltung der Disulfidbrücken– Reinigung der Untereinheiten– Bestimmung der AS Zusammensetzung der Ue.

2. Sequenzierung der Ue.– Fragmentierung der Ue. in Peptide, welche durchsequenziert werden

können– Trennung und Reinigung der Fragmente– Bestimmung der Sequenz der Fragmente– Wiederholung mit unterschiedlicher Fragmentierung, um die Fragmente

aufgrund ihrer Überlappungen ordnen zu können3. Aufbau der kompletten Struktur

– Anordnung überlappender Fragmente– Bestimmung der Inter- und Intra-Ketten Disulfidbrücken

Endgruppenanalyse• Wie viele unterschiedliche Ue. befinden sich in meinem

Protein:– N-Terminus:

• Dansyl chlorid reagiert mit primären Aminen (auch ε Gruppen vonLys), Hydrolyse, Analyse der Dansyl-Derivatisierten AS

• Edman Abbau, PITC (Phenylisothiocyanate, Edman‘s Reagenz)reagiert mit N-ter. Amin zu PTC (Phenylithiocarbamyl),Säurespaltung, Analyse der PTH (Phenylthiohydantoin)-AS mittelsTLC, Elektrophorese, HPLC, GLC..

Kann wiederholt werden zur Sequenzbestimmung, N -> C– C-Terminus: weniger zuverlässig als N-terminale Methoden

• Exopeptidase, Bsp. Carboxypeptidase, zeigen AS-Spezifität• Hydrazinolyse, zeigt aber viele Seitenreaktionen

Analyse der N-terminalen AS mittels

Dansyl Chlorid

Edman Abbau

Bestimmung der C-terminalen AS mittelsExopeptidasen

Hydrazinolyse zurBestimmung der C-

term. AS

Spaltung von Disulfidbrücken1. Zur Trennung der Polypeptidketten2. Zur nachfolgenden Spaltung– Entweder oxidative Spaltung: Per-Ameisensäure -> Cys zu

Cystein Säure, Nachteil: oxidiert auch Met zu MethionineSulfon und interferiert daher mit der nachfolgendenCyanbromid Spaltung

– Oder reduktive Spaltung mit 2-Mercaptoethanol (BME), oderDitiothreitol (DTT), Ditioerythritol (Cleland‘s Reagenz)

Spaltung unter denaturierenden Bedigungen, um alleDisulfidbrücken zu exponieren. Die freien Sulfhydryl Gruppenwerden danach mit Iodessigsäure zu S-Carboxymethylcysteinalkyliert, um die weitere Neubildung von Disulfidbrücken zuvermeiden.

Oxidative Spaltung mitPer-Ameisensäure

Reduktive Spaltung mit BME, DTT, oderCleland‘s Reagenz

Alkylierung der Cysteine mitIodessigsäure

Trennung, Reinigung undCharakterisierung der Polypeptidketten

o Denaturierung und Dissoziation der Untereinheiten untersauren oder basischen Bedingungen, mittels Harnstoff oderGuanidium, oder Detergentien (SDS). Danach Reinigung mittelsGel-Filtration, Ionentauscher etc. Massenbestimmung (110D/AS) zB. durch:

o Massenspektroskopie:MALDI, matrix assisted laser desorptionESI, electrospray-ionizationMS/MS, tandem massenspektroskopy

Aminosäureanalyse

• Hydrolyse des Polypeptides in seine AS Einheitenund quantitative Bestimmung der ASZusammensetzung– Saure Hydrolyse: 6N HCl, 100-120°C, 10-100 h -> Trp

geht kaputt, Glx, Asx– Basische Hydrolyse: 2-4N NaOH, 100°C, 4-8 h ->

zerstört Cys, Ser, Thr und Arg, aber kann zurBestimmung von Trp verwendet werden

– Enzymatisch: Endopeptidasen, Bsp. Pronase (Mischung ausversch. Endopeptidasen), Selbstverdau...

AminosäureanalyseAutomatisierte „amino acid analyzer“ mit vor- oder nach-Säulen(Ionentauscher oder RP-HPLC) Derivatisierung der AS mit o-Phthalaldehyde (OPA) plus BME (<1h, pmol Sensitivität).Die AS Zusammensetzung sagt ev. gar etwas über die Struktur desProteins aus

Fluorescent adduct

Spezifische Spaltungsreaktionen

• Ziel: Spaltung des Proteins in Peptidfragmente von 60-80AS, welche dann sequenziert werden können.

• Enzymatisch: Trypsin spaltet nach (C-Seite) positivgeladenen AS.– Lys kann mittels Citraconic Anhydrid unspaltbar gemacht

werden– Cys kann durch 2-Bromomethylamine spaltbar gemacht werden– Limitierte Proteolyse

• Chemisch: Cyanogenbromid spaltet nach (C-Seite) von Metund produziert ein Peptidyl Homoserin

Spezifität von Endopeptidasen

Trypsin Spaltung

Schutz von Lys

Macht Met Spaltbar

Spaltung mitCyanogenbromid

Weitere Schritte

o Reinigung der Peptidfragmente: RP-HPLCo Sequenzbestimmung mittels zyklischem Edman

Abbau, automatisiert, Sequenator ca. 1h pro AS.Heute auch über Massenspektroskopie möglich

o Bestimmung der Gesamtsequenz durch Bestimmungder Reihenfolge der unterschiedlichen Peptide(sequence assembly)

o Bestimmung der Disulfidbrücken mittelsDiagonalelektrophorese

Reihenfolge derPeptidfragemente

• Überlappende Sequenzinformation der einzelnenPeptidfragmente muss zur Bestimmung derGesamtsequenz herangezogen werden

Bestimmung derPosition von

Disulfidbrücken

Peptide Characterization andSequencing by Mass Spectrometry

o Determines the mass to charge ratio of anion (m/z) in the gase phase

o Soft ionization methods since 1985– FAB– ESI– MALDI

• Positive charge through ionisation of Lys,Arg

The ESI-MS spectrum of the 16,951-Dhorse heart protein apomyoglobin.

Peptide sequencing by tandem MS

The tandem mass spectrum of the doubly chargedion of the 14-residue human [Glu1]fibrinopeptide B

(m/z = 786).

Protein Modifikationen

o Zur Identifikation von AS, welche für die Funktiondes Proteins wichtig sind, werden gruppenspezifischeReagentien eingesetzt. Damit können zB. AS der„active site“ markiert und dann mittels Peptidmapping identifiziert werden. Bsp. das „active siteser“ in Serin Proteasen ist ungewöhnlich reaktiv undreagiert mit diisopropylphosphofluoridat (DIPPF)andere Ser aber nicht.

„active-site“ Modifikationen

• Bsp. Ser in serine proteasen

Gruppenspezifische Reagentien

DNA Sequenzierung• Primärstruktur von Proteinen ist durch die

Basenfolge der entsprechenden Gene bestimmt.Da DNA Sequenzierung technisch einfacher ist,wird heute die Proteinsequenz meist auf Ebeneder DNA bestimmt.

• Dabei bleibt allerdings offen:– Position der Disulfidbrücken– Post-translationelle Modifikationen– Sequenzfehler auf DNA Ebene– RNA Editing, Differenzen im Code

Strategy

1) break down into manageable sizedfragments

2) Sequencing of individual fragments3) Ordering of fragments

Chain termination

• Chain termination byincorporation ofdideoxynucleotides

Autoradiograph of a sequencing gel

Automated sequencing• Using fluorescent dideoxy nucleotides• 4 reactions/one gel or 1 reaction/one

gel

Genome sequencing strategies

The human genome

o 3200 Mbo 2001o 50% repetitive sequenceso 28% transcribed into RNAo Only 1% protein codingo Ca 30’000 proteins

Chemische Evolutiono Evolution von Proteinen, Struktur <->

Funktiono Bsp. Sichelzellanämie:

– Erkrankung der roten Blutkörperchen (Erythrozyten).Diese enthalten (33%) Hämoglobin, Tetramer α2β2,welches Sauerstoff bindet und an die Peripherietransportiert.

– Wild: HbA, Krank: HbS; Glu β6 -> Val β6 (Verlust 2-)– HbS aggregiert bei tiefem Sauerstoffdruck und

verändert damit die Form der Erythrozyten vondiscoidal (bikonkav) zu sichellförmig -> Aggregation derveränderten Blutkörperchen in der Peripherie ->Hämolytische Anämie, reduzierte Lebensdauer der Bltk.von 120 auf 60 Tage

– Mendelische Vererbung, nur Homozygote zeigenSymptome, meist tödlich.

– Heterozygot: ~40% HbS -> bessere Resistenz gegenMalaria (Infektion mit dem Protozoen Plasmodiumfalciparum), da die Infektion den pH der Erythrozytenerniedrigt -> sichelförmig -> Entfernung in der Leber

Sichelzellanämie ist eine molekulare Krankheit welche aberfür den heterozygoten Träger einen gewissen

Selektionsvorteil bringt. Die Mutation wurde daher inMalaria gefährdeten Zonen konserviert

Peptide MappingFingerprinting: Papier Chromatography + Papier Elektrophorese

Spezies-spezifische Variationen inhomologen Proteinen

• Sequenzvergleiche von homologen Proteinen, Bsp. Cytochrom C vonMensch, Schwein, Huhn,...– Protein mit einer Polypeptidkette ~103 AS. Teil der Elektronen-

Transportkette der Mitochondrien, transferiert Elektronen vonCytochrom C zu Cytochrom C Oxidase. Funktionell stark konserviert,Hefe-Protein kann das im Schwein ersetzen.

• Alle Proteine haben dieselbe Funktion, aber unterschiedliche ASSequenz: Neutraler Drift– Identifikation von konservierten/invarianten AS -> funktionell wichtig– Konservative Substitutionen, Asp -> Glu, d.h. Ladung ist hier wichtig– Hypervariable Regionen, zB. dienen nur als Linker zwischen 2

funktionellen Teilen (Domänen) des Proteins

Sequenzvergleich von Cytochrom C aus38 Spezies

Types of AS exchanges

o Invariant -> active site, funct. importanto Neutral drifto Conservativeo Hypervariable -> linker

Differenzmatrix,Anzahl der Ausgetauschten AS

zwischen den Spezies

Taxonomische Information durchProteinsequenzvergleiche

• Phylogenetischer Stammbaum vonCytochrom C– Anzahl Unterschiede per 100 AS =

PAM units, Prozent derakzeptierten Punktmutationen

– Gleiche Distanz am Ursprung, d.h.auch die Vorläufer haben sichweiter evolviert.

• Quantifizierung der evolutionärenDistanz

Unterschiedliche Proteine verändern sichmit unterschiedlicher Geschwindigkeit

„unit evolutionary period“:Zeit, um die Sequenzzweier homologer Proteineum 1% zu ändern, nachdemsich zwei Spezies getrennthaben. Widerspiegelt denevolutionären Druck aufdie Sequenz.

Die Evolutionsrate istkonstant

• Und nicht von der Generationszeit desOrganismus abhängig, d.h. ein Protein inInsekten evoluiert genau so schnell wiedasjenige in Elefanten.

Protein Evolution ist nicht dieBasis für Speziesunterschiede

• Der Mensch ist auf Sequenzeben ca. 99%identisch mit dem Affen. Trotzdem,...

Evolution durch Genduplikation

o Duplikation eines essentiellen Gensnimmt den Selektions-Druck von derKopie weg, sie kann sich dann sehrschnell verändern ohne dabei denWirten zu gefährden. Bsp.Hämoglobin, Myoglobin

o Vermutlich wurden deshalb währender Speziesbildung auch ganzeGenome dupliziert

o Proteine bestehen ausFunktionseinheiten (Domänen),welche immer wieder verwendet undangepasst werden

Bioinformaticso Data miningo Sequences are published in databases not in printed

form

Sequence alignments• PAM units, as measure of evolutionary

distance, (.99)50 = 61% identical• GAPS - Penalty

Alignments using dot matrices

The optical alignments of human myoglobin (Mb, 153residues) and the human hemoglobin a chain (Hba, 141residues)

PAM substitution matrices• Based on observed rates of protein

evolution

The PAM-250 Log Odds Substitution Matrix

Needleman-Wunsch alignment

Gap penalties

• introducing a gap is more expensivethan extending it

Pairwise alignments usingBLAST and FASTA

• Heuristic algorithm use educatedguesses

• BLOSUM matrices• BLAST, basic local alignmentsearch

tool• Sensitivity <-> selectivity

Multiple sequence alignments

• E.g. by CLUSTAL• Used to generate profiles for more

sensitive searches for distantlyrelated proteins

• Scoring matrices based on hiddenMarkov models (HMMs)

• PSI-BLAST

Phylogenetic tree

• Unrooted / rootedtree

Polypeptidsynthese

o Chemische Synthese von Peptiden aus AS:– zu Struktur - Funktionsbeziehungen– Einbau von nicht-standard AS– Pharmakologie

o Erst: homopolypeptide, Bsp. Polyglycin, Polyserino 1953: Oxytocin (Nonapeptid), biologisch aktives

Neuropeptid, Kontraktion des Uterus

Chemische Synthese von (Poly-)Peptiden

o Prinzip: Addition einer Boc-geschützten AS an denN-Terminus der wachsenden Kette, C->NWachstum

o Kopplung der wachsenden Kette(C->N) an eine feste Matrix(Polystren)

o Automatisierte PeptideSynthesizer

o Problem, Ausbeute:98% Ausbeute pro Schritt,100AS -> 200 Schritte ->0.98200 100 = 2% Endausbeute !

Merrifield:Festkörperphasensynthese

Kopplungschemie der ersten AS an die Matrix

1. Kopplung 2. Entschützen

DCCD dient derAktivierung und

Kondensation der AS

Beispiele vongeschütztenSeitenketten

Freisetzung

Native chemical ligation• Length limit ~60 Aa• Native chemical ligation to produce longer

peptides

Chemical synthesis ofoligonucleotides

o for probes in Southerno In situ hybridizationo PCR primerso Side-directed mutagenesis

Synthetic procedure

o Since 1980 solid-phasemethod analogous topeptide synthesis,phosphoramidite method

o Nonaqueouso 3’ -> 5’o Automated, up to 140mer,

40 min/cycle

DNA chips

o One-gene-at-a-time -> whole genomeanalysis

o Oligonucleotide arrayso Photolithography / in situ synthesiso SNIPs -> individualized medicine

A DNA chip

The photolithographicsynthesis of a DNA chip

Variations in gene expression, mRNAlevels, expression profiling

SELEX

o Systematic evolution of ligands byexponential enrichment

o High affinity oligonucleotide probes,aptamers