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Struktur und Funktion des GR1-Gens aus Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Gudrun Schmitz
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Struktur und Funktion des GR1-Gens aus Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.
Gudrun Schmitz
Struktur und Funktion des GR1-Gens aus Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.
Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften
der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen
zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin
der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation
vorgelegt von
Diplom-Agraringenieurin
Gudrun Schmitz
aus
Erkelenz
Berichter: Universitätsprofessor Alan J. Slusarenko, Ph. D.
Privatdozent Dr. Joachim Hamacher
Tag der mündlichen Prüfung: 15. April 2005
Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.
Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUNGEN ........................................................................................................................................... 1
1 EINLEITUNG .............................................................................................................................................. 1
1.1 ARABIDOPSIS THALIANA............................................................................................................................. 1
1.2 DIE WIRT-PATHOGEN-INTERAKTION ZWISCHEN ARABIDOPSIS THALIANA UND HYALOPERONOSPORA
PARASITICA, DEM ERREGER DES FALSCHEN MEHLTAUS .......................................................................... 3
1.3 RASSENSPEZIFISCHE RESISTENZ .............................................................................................................. 6
1.4 ARABIDOPSIS R-GENE UND R-GEN VERMITTELTE SIGNALTRANSDUKTION IN DER PFLANZLICHEN
PATHOGENABWEHR ................................................................................................................................ 7
1.5 ÜBERSICHT ÜBER VORANGEGANGENE ARBEITEN .................................................................................. 10
1.6 14-3-3 PROTEINE ................................................................................................................................... 12
1.7 AUFGABENSTELLUNG ............................................................................................................................ 15
2 MATERIAL................................................................................................................................................ 16
2.1 GERÄTE ................................................................................................................................................. 16
2.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN................................................................................................................... 17
2.3 ENZYME................................................................................................................................................. 18
2.4 ANTIKÖRPER.......................................................................................................................................... 18
2.5 KITS....................................................................................................................................................... 18
2.6 MARKER ................................................................................................................................................ 19
2.7 ANTIBIOTIKA ......................................................................................................................................... 19
2.8 PRIMER .................................................................................................................................................. 20
2.9 BIOLOGISCHES MATERIAL..................................................................................................................... 23
3 METHODEN .............................................................................................................................................. 25
3.1 PFLANZENMATERIAL ............................................................................................................................. 25
3.2 UNSTERILE PFLANZENANZUCHT............................................................................................................ 25
3.3 STERILE PFLANZENANZUCHT ................................................................................................................ 25
3.4 HYALOPERONOSPORA PARASITICA-ISOLAT WELA .................................................................................. 26
3.5 KULTIVIERUNG DES HYALOPERONOSPORA PARASITICA-ISOLATES WELA............................................... 26
3.6 LACTOPHENOL-TRYPANBLAU FÄRBUNG VON ARABIDOPSIS-BLÄTTERN ................................................ 27
3.7 BAKTERIENSTÄMME .............................................................................................................................. 27
3.7.1 Escherichia coli-Stämme .............................................................................................................. 27 3.7.1.1 Anzucht von E. coli ................................................................................................................................ 27
3.7.1.2 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen.................................................................................................. 28
3.7.2 Agrobacterium tumefaciens-Stämme ............................................................................................ 28 3.7.2.1 Anzucht von Agrobacterium tumefaciens............................................................................................... 29
3.7.2.2 Herstellung kompetenter Agrobakterien................................................................................................. 29
3.8 DNA-KLONIERUNG ............................................................................................................................... 29
3.8.1 Agarose-Gelelektrophorese........................................................................................................... 29
3.8.2 Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen ................................................................................... 30
3.8.3 Ligation......................................................................................................................................... 31
Inhaltsverzeichnis
3.8.4 Transformation von E. coli ............................................................................................................32
3.8.5 Animpfen von rekombinanten Bakterienkolonien.........................................................................32
3.8.6 Isolation von Plasmid-DNA aus transformierten E. coli (Mini-Präparation) ................................33
3.8.7 Restriktionsverdau von Plasmid-DNA ..........................................................................................33
3.8.8 Auffüllen überstehender 5`-Enden ................................................................................................34
3.8.9 Dephosphorylierung linearisierter Vektor-DNA ...........................................................................34
3.9 SEQUENZIERUNG ....................................................................................................................................35
3.10 STABILE TRANSFORMATION VON ARABIDOPSIS THALIANA MITTELS AGROBACTERIUM TUMEFACIENS .....37
3.10.1 Transformation von Agrobakterien .............................................................................................37
3.10.2 Überprüfung von Agrobakterienkolonien mittels Kolonie-PCR .................................................38
3.10.3 Transformation von Arabidopsis thaliana durch Vakuuminfiltration und Selektion bis zur
Homozygotie ................................................................................................................................38
3.11 ISOLATION VON NUKLEINSÄUREN AUS ARABIDOPSIS THALIANA ............................................................39
3.11.1 DNA-Extraktion aus Blättern ......................................................................................................39
3.11.2 RNA-Extraktion ..........................................................................................................................40 3.11.2.1 Phenol-Chloroform Extraktion ............................................................................................................. 41
3.11.2.2 RNA Extraktion mit dem NucleoSpin® RNA Plant Kit........................................................................ 41
3.11.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren ................................................42
3.12 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)................................................................................................42
3.13 RT-PCR...............................................................................................................................................45
3.14 QUANTITATIVE RT-PCR......................................................................................................................47
3.15 RAPID AMPLIFICATION OF CDNA ENDS (RACE)..................................................................................49
3.15.1 Amplifizierung des 5`-Endes (5`RACE) .....................................................................................49
3.15.2 Amplifizierung des 3`-Endes (3`RACE) .....................................................................................52
3.16 GENOME WALKING ..............................................................................................................................54
3.17 PROTEINEXPRESSION............................................................................................................................56
3.17.1 Bakterielle Proteinexpression ......................................................................................................57
3.17.2 Zellfreie Proteinexpression..........................................................................................................58
3.17.3 Proteinextraktion aus Arabidopsis-Blättern.................................................................................59
3.17.4 Antikörperproduktion ..................................................................................................................60
3.17.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page)...................................................................60
3.17.6 Western-Blotting und Immunodetektion .....................................................................................62
3.18 “YEAST-TWO-HYBRID”-SYSTEM ..........................................................................................................64
3.18.1 Anzucht des Hefestamms Y190...................................................................................................65
3.18.2 Hefetransformation......................................................................................................................66
3.18.3 ß-Galactosidase-Filtertest ............................................................................................................67
3.18.4 Proteinextraktion aus Hefe ..........................................................................................................68
4 ERGEBNISSE .............................................................................................................................................69
4.1 NACHWEIS DER EXPRESSION DES GR1-GENS MITTELS RT-PCR............................................................70
4.2 CHARAKTERISIERUNG DES GR1-GENS ...................................................................................................72
Inhaltsverzeichnis
4.2.1 Identifikation des 5`terminalen Transkriptionsstartes des GR1-Gens und Charakterisierung von
Promotorelementen...................................................................................................................... 72
4.2.2 Identifikation des 3`terminalen Transkriptionsendes des GR1-Gens ............................................ 74
4.3 CHARAKTERISIERUNG DER „LEFT“- UND „RIGHT-BORDER“ DER T-DNA INSERTIONSSTELLE ................ 75
4.3.1 Charakterisierung der „left-border“ der T-DNA........................................................................... 75
4.3.2 Lokalisierung der „right-border“ der T-DNA ............................................................................... 76
4.4 ZUSAMMENFASSENDER ÜBERBLICK ÜBER DIE ERGEBNISSE DER CHARAKTERISIERUNG DES GR1-GENS
UND DER GR1-MUTANTE....................................................................................................................... 78
4.5 SYNTHESE DER GR1-CDS ..................................................................................................................... 79
4.6 VERSUCH DER KOMPLEMENTIERUNG DES ANFÄLLIGEN PHÄNOTYPEN DER GR1-MUTANTE................... 82
4.6.1 Herstellung des nativen GR1 Promotor::GR1-CDS Konstruktes.................................................. 83
4.6.2 Nachweis der Expression des GR1-Gens in der transformierten gr1-Mutante ............................. 84
4.6.3 Mikroskopische Analyse der WELA-infizierten transformierten gr1-Mutante ............................ 86
4.7 SUCHE NACH UNABHÄNGIGEN GR1 T-DNA-MUTANTEN ....................................................................... 87
4.8 GENE-SILENCING MIT RNAI-KONSTRUKTEN ........................................................................................ 92
4.8.1 Herstellung der RNAi-Konstrukte ................................................................................................ 92
4.8.2 Nachweis der RNAi-Konstrukte in den transformierten Pflanzen mittels PCR............................ 95
4.8.3 Untersuchung des Silencing-Effektes bezüglich der GR1-Expression im transformierten Ws-
Wildtyp ........................................................................................................................................ 98
4.8.4 Mikroskopische Analyse der WELA-infizierten transgenen Linien des Ws-Wildtyps................. 99
4.9 “GAIN-OF-FUNCTION” HYPOTHESE...................................................................................................... 100
4.9.1 Nachweis der RNAi-Konstrukte in der transformierten gr1-Mutante mittels PCR .................... 100
4.9.2 Untersuchung des „gain-of-function“ Effektes in den Silencing-Linien der transformierten gr1-
Mutante...................................................................................................................................... 103
4.9.3 Herstellung des „gain-of-function“-Konstruktes für die Transformation des Ws-Wildtyps....... 104
4.9.4 Nachweis der Expression des aberranten GR1-Gens im transformierten Ws-Wildtyp ............... 106
4.9.5 Mikroskopische Analyse der WELA-infizierten gesilencten Linien der gr1-Mutante und der
transgenen Ws-Linien................................................................................................................ 107
4.10 UNTERSUCHUNG DER TRANSKRIPTE DER GR1-MUTANTE .................................................................. 108
4.11 EXPRESSION DES GR1-PROTEINS FÜR DIE ANTIKÖRPERPRODUKTION ............................................... 112
4.11.1 Proteinexpression der GR1-CDS in E. coli ............................................................................... 112
4.11.2 Proteinexpression der GR1-CDS im zellfreien System............................................................. 114
4.12 UNTERSUCHUNG VON PROTEIN-PROTEIN INTERAKTIONEN IM “YEAST-TWO-HYBRID”-ASSAY ......... 116
4.12.1 Interaktion des GR1-Proteins mit 14-3-3 Proteinen aus Gerste ................................................ 116
4.12.2 Herstellung der “Yeast-two-hybrid”-Konstrukte ...................................................................... 117
4.12.3 Überprüfung der Proteinexpression von GR1, Gerste 14-3-3a und den Arabidopsis 14-3-3s im
Western-blot und Überprüfung möglicher Autoaktivierung der Fusionsproteine im Vektor mit
DNA-Bindungsdomäne ............................................................................................................. 121
4.12.4 Untersuchung der Interaktion des GR1-Proteins mit Arabidopsis 14-3-3 Proteinen im ”Yeast-
two-hybrid”-Assay..................................................................................................................... 124
4.12.5 Untersuchung der Interaktion der Arabidopsis 14-3-3 Proteine untereinander......................... 128
Inhaltsverzeichnis
5 DISKUSSION............................................................................................................................................134
5.1 CHARAKTERISIERUNG DES GR1-GENS .................................................................................................134
5.2 CHARAKTERISIERUNG DER GR1-MUTANTE ..........................................................................................136
Charakterisierung der „left-“ und „right-border“ der T-DNA Insertionsstellen ...................................136
“Gain-of-function” Hypothese .............................................................................................................137
Untersuchung der Transkripte der gr1-Mutante ...................................................................................138
5.3 FUNKTIONSTESTS .................................................................................................................................140
Versuch der Komplementierung des anfälligen Phänotypen der gr1-Mutante.....................................140
Transformation des Ws-Wildtyps mit RNAi-Konstrukten ...................................................................141
Kreuzung der gr1-Mutante mit dem Ws-Wildtyp ................................................................................141
Suche nach unabhängigen gr1 T-DNA-Mutanten ................................................................................142
5.4 FUNKTION DES GR1-PROTEINS ............................................................................................................143
Expression des GR1-Proteins ...............................................................................................................143
Untersuchung der Interaktion des GR1-Proteins mit Arabidopsis 14-3-3 Proteinen im ”Yeast-two-
hybrid”-Assay.....................................................................................................................................144
5.5 UNTERSUCHUNG DER INTERAKTION DER ARABIDOPSIS 14-3-3 PROTEINE UNTEREINANDER IM ”YEAST-
TWO-HYBRID”-ASSAY .........................................................................................................................145
5.6 ZUSAMMENFASSENDER AUSBLICK.......................................................................................................148
6 ZUSAMMENFASSUNG ..........................................................................................................................150
SUMMARY ..................................................................................................................................................154
7 LITERATURVERZEICHNIS.................................................................................................................157
DANKSAGUNG...........................................................................................................................................173
LEBENSLAUF.............................................................................................................................................174
Abkürzungen Abb. Abbildung APS Ammoniumpersulfat avr avirulent A. bidest. Bidestilliertes Wasser bp Basenpaare BSA Rinderserumalbumin („bovine serum albumine“) CaMV „cauliflower mosaic virus“, Blumenkohl-Mosaik-Virus CC coiled-coil-Domäne cDNA doppelsträngige DNA: Kopie der mRNA CDS „coding sequence“ cv. cultivar °C Grad Celsius d Tag(e) Da Dalton DEPC Diethylpyrocarbonat DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat et al. und andere EtBr Ethidiumbromid EtOH Ethanol IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid g Erdbeschleunigung GF14 “G-box factor 14-3-3” GRF “General regulatory factor“ h Stunde HR hypersensitive Reaktion IAA Indol-3-Essigsäure INA 2,6-Dichlor-Isonikotinsäure IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid k kilo kDa Kilodalton kb Kilobasen l Liter LB Luria-Bertani-Medium LRR Leucin rich repeats
LZ Leucin-Zipper-Domäne m milli; Meter M Molarität MeOH Methanol MOPS N-Morpholino-propansulfonsäure MS Murashige und Skoog-Medium NBS Nukleotid-Bindungsstellen mRNA „messenger RNA“ min Minute MCS „multiple cloning site“ µ mikro n nano OD Optische Dichte PAA Polyacrylamid PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PCR „polymerase chain reaction“ (Polymerase-Kettenreaktion) R Resistenz RNA Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease RPP „Recognition of Peronospora parasitica“ RT Raumtemperatur s Sekunde SAP Shrimp alkalische Phosphatase SDS „sodium dodecyl sulfate“, Natriumdodecylsulfat Tab. Tabelle TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer TE Tris-EDTA-Puffer TEMED N,N,N´,N´,Tetramethylethylendiamin TIR N-terminale Toll/ Interleukin-Rezeptor-Domäne Tm Schmelztemperatur Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan rpm Umdrehungen pro Minute U Unit UV Ultraviolettes Licht v/v Volumen/Volumen V Volt Vol. Volumenteile WT Wildtyp w/v weight per volume (Gewicht pro Volumen) X-Gal 5-Bromo-4-chloro-3- indoxyl-β-D-galactosid
1 Einleitung
1
1 Einleitung
1.1 Arabidopsis thaliana
Die Pflanze Arabidopsis thaliana (s. Abb. 1) - zu deutsch Ackerschmalwand -
wurde im 16. Jahrhundert vom Arzt Johannes Thal zum ersten Mal beschrieben.
Er entdeckte sie im Harz und gab ihr den Namen Pilosella siliquosa. Seit dieser
Zeit wurde sie mehrmals umbenannt, bis es bei der jetzigen Namensgebung von
Carl von Linnè blieb (www.lexikon-definition.de). Arabidopsis ist ein ein- bis
zweijähriges Wildkraut ohne landwirtschaftliche Bedeutung und gehört zur Familie
der Kohlgewächse (Brassicaceae). Die Verbreitung von Arabidopsis erstreckt sich
über die gemäßigten Klimazonen der ganzen Welt.
Abb. 1: Arabidopsis thaliana
Das Potential von Arabidopsis thaliana als Modellpflanze für die genetische
Forschung legte der Botaniker Friedrich Laibach bereits 1943 dar (Laibach, 1943),
nachdem er schon 1907 die richtige Chromosomenanzahl (n=5) veröffentlicht
(Laibach, 1907) und weitere umfangreiche Forschungen durchgeführt hatte. Zu
den wichtigen Vorteilen, die Arabidopsis für die Grundlagenforschung in der
Genetik und der Molekularbiologie bietet, gehören ein nur ca. 6-8 wöchiger
Lebenszyklus von der Aussaat bis zur Samenreife, eine hohe Samenproduktion
1 Einleitung
2
(10-30.000 Samen pro Pflanze), ihre geringe Größe von 30-40cm, eine einfache
Anzucht auf begrenztem Raum sowie die Möglichkeit der Kultivierung unter
sterilen Bedingungen auf Agarmedien. Weiterhin können mit geringem Aufwand
Mutationen erzeugt werden (Mutagenese) und Kreuzungen sind relativ einfach
durchzuführen. Darüber hinaus sind effiziente Transformationstechniken mit
Agrobacterium tumefaciens anwendbar, so dass man unabhängige transgene
Pflanzen erhält, wenn entweder Samen (Feldmann und Marks, 1987) oder ganze
Pflanzen (Bechthold et al., 1993) mit einer Agrobakterien-beinhaltenden
Suspension inkubiert bzw. Vakuum-infiltriert werden. Da Arabidopsis zahlreichen
Nutzpflanzen sehr ähnlich ist, lassen sich Forschungsergebnisse übertragen, was
Arabidopsis nicht nur für die Grundlagenforschung, sondern auch für die Industrie
interessant macht.
Das Arabidopsis-Genom, mit einem der kleinsten bekannten Genome Höherer
Pflanzen (Arumuganthan und Earle, 1991), ist im Jahre 2000 vollständig
sequenziert worden (Arabidopsis Genome Initiative, 2000). Das Genom besteht
aus 125 Millionen Basenpaaren und umfasst insgesamt 25.498 Gene, die für
Proteine aus ungefähr 11.000 verschiedenen Proteinfamilien kodieren. Bei der
Analyse des Genoms wurde festgestellt, dass bei ca. 60% der Gene nochmals
eine Kopie im Genom existiert. So hat sich offensichtlich im Laufe der Evolution
der Pflanze das Erbgut teilweise verdoppelt. Dies könnte bedeuten, wenn ein Gen
mutiert bzw. nicht exprimiert wird, dass trotzdem das Protein entsteht und
funktionsfähig ist, weil die Kopie des Gens seine Aufgabe übernimmt.
Obwohl das Genom von Arabidopsis entschlüsselt wurde, sind noch längst nicht
alle Genfunktionen bekannt. Die Funktionen von bestimmten Genen können mit
Hilfe von Mutanten untersucht werden. Zur Erzeugung von Mutanten finden
Mutagenese-Verfahren wie die Bestrahlung mit ionisierenden Strahlen, die
Behandlung mit Chemikalien wie Ethylmethansulfonat (EMS), die Integration von
Transposons oder T-DNA Verwendung. So stehen beispielsweise mit den
Feldmann- (Feldmann und Marks, 1987) und Wisconsin- (Sussmann et al., 2000)
Linien umfangreiche T-DNA Insertionsmutanten-Kollektionen zur Verfügung, die
nach interessierenden Mutationen durchsucht werden können. Darüber hinaus ist
von Wissenschaftlern der Universität von North Carolina und dem Salk Institut im
kalifornischen San Diego im Jahre 2003 eine Knockout-Karte über das Genom
veröffentlicht worden (Science Daily, 2003). Mit dieser Karte über Mutanten von
1 Einleitung
3
Arabidopsis, bei denen einzelne Gene ausgeschaltet wurden, steht eine
umfangreiche Übersicht von detailliert beschriebenen Mutationen bei Höheren
Organismen zur Verfügung.
Für die Forschung von besonderem Interesse sind u.a. Pflanzengene, die an der
Abwehr von Schädlingen und Krankheiten beteiligt sind. Zu den bekannten
Pathogenen, denen Arabidopsis thaliana als Wirt dient, gehören neben
verschiedenen Bakterien (Davis et al., 1991) auch zahlreiche Pilze und
Oomyceten, die landwirtschaftlich von Bedeutung sind, weil sie Krankheiten wie
beispielsweise Wurzeltöter (Thanatephorus cucumeris) und Grauschimmel
(Botrytis cinerea) (Koch und Slusarenko, 1990b), Weißstängeligkeit (Sclerotinia
sclerotiorum) (Morgan, 1971; Dickman und Mitra, 1992) Kohlhernie
(Plasmodiophora brassicae) (Koch et al., 1991; Mithen und Magrath, 1992) sowie
Falschen Mehltau (Hyaloperonospora parasitica, ehemals Peronospora parasitica)
(Koch und Slusarenko, 1990a; Holub et al., 1991, 1994; Slusarenko und Schlaich,
2003) hervorrufen.
1.2 Die Wirt-Pathogen-Interaktion zwischen Arabidopsis thaliana und Hyaloperonospora parasitica, dem Erreger des Falschen Mehltaus
Hyaloperonospora parasitica gehört zur Familie der Peronosporaceae, den
Erregern des Falschen Mehltaus (Taxonomie: Abteilung Chromista, Klasse
Oomycetes, Ordnung Peronosporales). Die Oomyceten besitzen einen Thallus
aus unseptiertem, vielkernigem (coenocytischem) Mycel. Ihre Zellwände bestehen
im Gegensatz zu den Pilzen aus Cellulose und Hemicellulose und nicht aus Chitin.
Sie sind obligat biotrophe Parasiten, die für ihre Ernährung auf lebendes
Wirtsgewebe angewiesen sind und zur Nährstoffaufnahme mit Haustorien in die
Wirtszelle eindringen.
Der Entwicklungskreislauf von Hyaloperonospora parasitica bei der Infektion von
Arabidopsis thaliana (s. Abb. 2) beginnt im Frühjahr, indem die in abgefallenen
Blättern überwinternden Oosporen auskeimen und mit ihrem Keimschlauch in die
Wurzeln der Arabidopsis-Pflanze eindringen (s. Abb. 2, a). Hyaloperonospora
parasitica breitet sich mit Hilfe von interzellulär wachsendem Mycel in der
gesamten Pflanze aus. Dabei kommt es zur Differenzierung des Mycels in
1 Einleitung
4
Ernährungshyphen (Haustorien), die in die Wirtszellen eindringen, und in
Fortpflanzungshyphen (Konidiophoren), die auf der Blattunterseite aus den
Spaltöffnungen herausragen (s. Abb. 2, b) und als weißer Belag (Mehltau-
symptom) sichtbar sind. Die an den Konidiophoren bei hoher relativer Luftfeuchte
gebildeten Konidien werden während der Vegetationsperiode durch den Wind
verbreitet (s. Abb. 2, c). Dieser asexuelle Entwicklungskreislauf dient zur
Verbreitung des Pathogens und führt zu Sekundärinfektionen, indem die Konidien
bei ausreichender Luftfeuchtigkeit auf der Blattoberfläche auskeimen, ein
Appressorium bilden und mit Hilfe einer Penetrationshyphe zwischen zwei
Epidermiszellen in die Pflanze eindringen (s. Abb. 2, d). Der Übergang zum
sexuellen Entwicklungskreislauf erfolgt gegen Ende der Vegetationsperiode mit
der Bildung von Oogonien und Antheridien, aus denen nach Befruchtung (s. Abb.
2, e) Oosporen entstehen (s. Abb. 2, f). Diese gelangen im Herbst im Gewebe
abgefallener Blätter auf den Boden, überwintern dort (s. Abb. 2, g) und keimen
dann im Frühjahr aus.
Abb. 2: Entwicklungskreislauf von Hyaloperonospora parasitica bei der Infektion von Arabidopsis thaliana (nach Mauch-Mani und Slusarenko, 1993) a: keimende Oospore im Boden infiziert die Wurzeln von Arabidopsis thaliana b: interzellulär wachsendes Mycel mit Haustorienbildung und mit auf der
Blattunterseite aus den Spaltöffnungen herausragendem Konidiophor c: asexuell gebildete Konidien
1 Einleitung
5
d: Keimung der Konidie auf der Blattoberfläche, Appressoriumbildung und Penetration und Haustorienbildung
e: Befruchtung eines Oogoniums durch ein Antheridium f: reife Oospore g: Oosporen gelangen im Herbst im Gewebe abgefallener Blätter auf den Boden
Bei der Wirt-Pathogen-Interaktion zwischen Arabidopsis thaliana und
Hyaloperonospora parasitica muss zwischen kompatiblen und inkompatiblen
Interaktionen unterschieden werden. Bei einer kompatiblen Interaktion kommt es
zu einer verträglichen Wechselwirkung zwischen einer virulenten Rasse des
Pathogens und einer anfälligen (suszeptiblen) Akzession von Arabidopsis thaliana,
bei der das Pathogen in der Pflanze wachsen und Konidien bzw. Oosporen als
Vermehrungsstrukturen ausbilden kann. Bei einer inkompatiblen Interaktion
dagegen kommt es zu einer unverträglichen Wechselwirkung zwischen einer
avirulenten Rasse von Hyaloperonospora parasitica und einer resistenten
Akzession von Arabidopsis thaliana, bei der das Pathogen in seinem Wachstum
gehemmt oder abgetötet wird. Für diese inkompatible Interaktion ist das Auftreten
einer hypersensitiven Reaktion (HR) charakteristisch, die durch das Absterben der
Wirtszellen an der Infektionsstelle kurz nach dem Pathogenbefall gekennzeichnet
ist. Durch diese schnelle und lokal begrenzte Nekrotisierung wird der Pilz an der
weiteren Ausbreitung gehindert und stirbt schließlich ab.
Beispiele für kompatible Wirt-Pathogen-Interaktionen zwischen verschiedenen
Akzessionen von Arabidopsis thaliana und bestimmten Rassen (Isolaten) von
Hyaloperonospora parasitica (s. Tab. 1) sind die Anfälligkeit der Akzessionen
Weiningen und Landsberg gegenüber dem WELA-Isolat, der Akzession Columbia
gegenüber dem NOCO-Isolat und der Akzession Wassilewskija gegenüber dem
EMWA-Isolat. Inkompatible Wirt-Pathogen-Interaktionen stellen dagegen
beispielsweise die Resistenz der Akzessionen Wassilewskija und Columbia
gegenüber dem WELA-Isolat, sowie der Akzession Wassilewskija gegenüber dem
NOCO-Isolat dar.
1 Einleitung
6
Akzessionen Hyaloperonospora parasitica-Isolate
WELA NOCO EMWA
Weiningen (Wei) K K K
Columbia (Col) I K I
Wassilewskija (Ws) I I K
Landsberg (Ler) K I ?
Tab. 1: Kompatibilitätsmuster der verschiedenen Wirt-Pathogen-Interaktionen zwischen verschiedenen Akzessionen von Arabidopsis thaliana und bestimmten Isolaten von Hyaloperonospora parasitica. K: kompatible Interaktion; I: inkompatible Interaktion
1.3 Rassenspezifische Resistenz
Die Mehrzahl der Pflanzen sind gegenüber vielen Pathogenen resistent, denn sie
stellen für diese keine Wirte dar, da die Pathogene nicht fähig sind, vorhandene
Abwehrbarrieren der Pflanzenzellen zu überwinden. Dieses Phänomen wird als
Nichtwirtsresistenz oder Basisinkompatibilität bezeichnet. Bei kompatiblen Wirt-
Pathogen-Interaktionen wird diese Nichtwirtsresistenz von den Pathogenen
überwunden und die Pflanze erkrankt, weil die Abwehrmechanismen der Pflanze
unzureichend sind (Hammond-Kosack und Jones, 1996).
Die Koevolution zwischen Pathogenen und ihren Wirtspflanzen hat bei einzelnen
Sorten anfälliger Pflanzenarten zur Ausbildung einer Resistenz gegenüber
bestimmten Rassen eines Pathogens geführt, die als rassenspezifische Resistenz
bezeichnet wird. Diese rassenspezifische Resistenz kennzeichnet die oben auf-
geführten inkompatiblen Wirt-Pathogen-Interaktionen zwischen den Akzessionen
von Arabidopsis thaliana und den Rassen von Hyaloperonospora parasitica.
Die genetische Grundlage der inkompatiblen Wirt-Pathogen-Interaktionen basiert
auf der „Gen-für-Gen-Hypothese“ nach Flor (1942; 1955). Danach tritt nur dann
eine rassenspezifische Resistenz auf, wenn die Wirtspflanze zum jeweiligen
dominanten Avirulenzgen (Avr-Gen) des Pathogens ein komplementäres,
dominantes Resistenzgen (R-Gen) besitzt. Dabei werden durch direkte oder
indirekte Interaktion des Avr-Genproduktes mit dem entsprechenden R-
Genprodukt die Resistenzantworten ausgelöst (Baker et al., 1997). Bei der
1 Einleitung
7
rassenspezifischen Resistenz werden die gleichen Abwehrmechanismen aktiviert,
die auch für die Nichtwirtsresistenz beschrieben wurden (Hammond-Kosack und
Jones, 1996; Heath, 2000).
1.4 Arabidopsis R-Gene und R-Gen vermittelte Signaltransduktion in der pflanzlichen Pathogenabwehr
In Arabidopsis thaliana wurden seit Beginn der 90er Jahre mit Hilfe moderner
Klonierungstechniken, wie beispielsweise dem kartierungsgestützten Klonieren, R-
Gene isoliert (Parker et al., 1993). Die R-Gene von Arabidopsis, die für die
Resistenz gegenüber Hyaloperonospora parasitica-Rassen verantwortlich sind,
werden als RPP-Gene (Recognition of Peronospora parasitica) bezeichnet (Crute
et al., 1993).
Das Klonieren des ersten RPP-Gens wurde von Parker et al. (1997) veröffentlicht
und das Gen als RPP5 bezeichnet. Es ist für die rassenspezifische Resistenz der
Akzession Landsberg gegenüber dem NOCO-Isolat verantwortlich. Im
darauffolgenden Jahr wurde das Klonieren des RPP1-Gens von Botella et al.
(1998) beschrieben. RPP1 ist für die rassenspezifische Resistenz der Akzession
Wassilewskija u.a. gegenüber dem NOCO-Isolat zuständig. Weitere RPP-Gene
sind das von McDowell et al. (1998) klonierte RPP8-Gen, das von Bittner-Eddy et
al. (2000) klonierte RPP13-Gen und das von van der Biezen et al. (2002) klonierte
RPP4-Gen. Darüber hinaus wurden weitere RPP-Gene kartiert, sodass
mittlerweile mindestens 27 RPP-Gene vermutet werden. Zu diesen kartierten
RPP-Genen, welche bisher noch nicht kloniert wurden, gehört beispielsweise das
RPP12-Gen auf Chromosom 4, das für die rassenspezifische Resistenz der
Akzession Wassilewskija gegenüber dem WELA-Isolat verantwortlich ist.
Die Klonierung zahlreicher R-Gene verschiedener Pflanzen hat gezeigt, dass die
R-Genprodukte deutliche strukturelle Ähnlichkeiten aufweisen. So besitzen die
meisten der R-Genprodukte drei strukturelle Gemeinsamkeiten: 1) Leucin-reiche
Domänen (Leucin rich repeats, LRR), 2) Nukleotid-Bindungsstellen (NBS) und 3)
entweder eine N-terminale Toll/ Interleukin-Rezeptor-Domäne (TIR) oder eine N-
terminale coiled-coil-Domäne (CC), früher als Leucin-Zipper-Domäne (LZ)
bekannt. Während die LRR-Domänen vermutlich in der Spezifität der Gen-für-Gen
1 Einleitung
8
Interaktionen involviert sind (Staskawicz et al., 1995), sind die NBS wahrscheinlich
an der Signaltransduktion und die TIR- oder CC-Domänen an Protein-Protein-
Interaktionen beteiligt (Alber, 1992). Beispiele für R-Genprodukte, die eine TIR-
NBS-LRR-Domäne besitzen, sind die RPP-Gene 2, 4, 5, 10 und 14, während die
der RPP-Gene 7, 8 und 13 eine CC-NBS-LRR-Domäne tragen.
Zahlreiche Untersuchungen wurden vor allem genetisch in Arabidopsis zur R-Gen
vermittelten Signaltransduktion in der pflanzlichen Pathogenabwehr durchgeführt
(Falk et al., 1999; Innes, 1998; van der Biezen und Jones, 1998; Warren et al.,
1999). Dabei ließen Untersuchungsergebnisse mit Hilfe von Mutanten, bei denen
eine Reduzierung oder der Verlust der R-Gen vermittelten Resistenz vorliegt,
darauf schließen, dass sich die Signalwege schon bald nach der
Pathogenerkennung verzweigen (Innes, 1998; van der Biezen und Jones, 1998).
Nach Modellvorstellungen existieren mindestens drei R-Gen abhängige
Signalwege in Arabidopsis (Glazebrook, 2001; s. Abb. 3). Nach bisherigen
Erkenntnissen wird der erste Signalweg von R-Genen von Arabidopsis genutzt,
die für die Resistenz gegenüber Pseudomonaden verantwortlich sind (s. Abb. 3, a
RPM1, RPS2 und RPS5). Da die Resistenz von Arabidopsis gegenüber
Pseudomonaden im Rahmen dieser Arbeit keine Rolle spielt, und weil dieser
Signalweg offensichtlich nicht von RPP-Genen benutzt wird, bleibt er in den
folgenden Ausführungen unberücksichtigt. Der zweite Signalweg wird
anscheinend sowohl von R-Genen, die für die Resistenz gegenüber
Pseudomonaden verantwortlich sind (s. Abb. 3, b RPS4), als auch von
verschiedenen RPP-Genen genutzt (s. Abb. 3, b RPP-Gene 2, 4, 5, 10 und 14).
Der dritte Signalweg dagegen scheint bisher nur von RPP-Genen benutzt zu
werden (s. Abb. 3, c RPP-Gene 7, 8 und 13).
Mit EDS1 (Enhanced Disease Susceptibility 1; s. Abb. 3, b) wurde in Arabidopsis
ein Gen identifiziert, dessen Funktion für die RPP-Gene 2, 4, 5, 10 und 14 zur
Auslösung einer Resistenzreaktion erforderlich ist. So konnte mit Hilfe der eds1
Mutante gezeigt werden, dass die R-Gene, die als Strukturmotive die TIR-NBS-
LRR-Domäne besitzen, in ihrer rassenspezifischen Resistenz gegenüber
Hyaloperonospora parasitica beeinträchtigt sind (Parker et al., 1996, Aarts et al.,
1998). Dieser EDS1 abhängige Signalweg wird ebenfalls von den noch nicht
klonierten Genen RPP12 (Parker et al., 1996) und RPP21 (Aarts et al., 1998; Feys
et al., 2001) benutzt (s. Abb. 3, b). Mit der Klonierung von PAD4 (Phytoalexin
1 Einleitung
9
Deficient 4) scheint offenbar ein weiteres Gen als notwendige Komponente in
diesem Signalweg identifiziert worden zu sein. Die Auswirkungen der pad4
Mutation auf die Funktionsfähigkeit der RPP-Gene sind jedoch noch nicht in allen
Einzelheiten geklärt. Es scheint so, als würden einige RPP-Gene neben EDS1
auch PAD4 für ihre Funktionalität benötigen (Glazebrook et al., 1997).
Die beiden R-Gene RPP7 und RPP8, die als Strukturmotiv die CC-NBS-LRR-
Domäne besitzen und von eds1 nur sehr schwach beeinflusst werden, benutzen
offensichtlich einen anderen Signalweg (McDowell et al., 2000; s. Abb. 3, c). Das
RPP13-Gen, welches ebenfalls als Strukturmotiv die CC-NBS-LRR-Domäne
besitzt, wirkt vollkommen unabhängig von EDS1 und PAD4 (Bittner-Eddy und
Beynon, 2001) und nutzt nach den Modellvorstellungen den gleichen Signalweg
wie RPP7 und RPP8. Inwiefern sich die ausgelösten Resistenzreaktionen bei den
verschiedenen R-Gen vermittelten Signalwegen unterscheiden, und ob die
Signalwege miteinander verknüpft sind, ist bisher unbekannt.
Gen-für-Gen Resistenz
(a) (b) (c) R-Gene R-Gene R-Gene RPM1 RPS4 RPP7 RPS2 RPW8 RPP8 RPS5 RPP2 RPP13 RPP4 RPP5 RPP10 RPP14 RPP12 RPP21 NDR1 EDS1 PBS2 PAD4 Resistenz
Abb. 3: Modell von drei R-Gen abhängigen Signalwegen in Arabidopsis in Anlehnung an Glazebrook (2001).
a: Signalweg 1 wird von R-Genen genutzt, die Resistenz gegenüber Pseudomonaden vermitteln (bleibt für Ausführungen unberücksichtigt). b: Signalweg 2 wird von R-Genen genutzt, die für die Resistenz gegenüber Pseudomonaden, sowie von R-Genen, die für die Resistenz gegenüber Hyaloperonospora parasitica verantwortlich sind. In diesem Signalweg ist scheinbar die Funktion von EDS1 und PAD4 erforderlich.
1 Einleitung
10
c: Signalweg 3 wird von R-Genen genutzt, die für die Resistenz gegenüber Hyaloperonospora parasitica verantwortlich sind. Über Gene, deren Funktion für diesen Signalweg notwendig ist, wurde bisher noch nicht berichtet.
1.5 Übersicht über vorangegangene Arbeiten
Arabidopsis thaliana zeigt eine rassenspezifische Interaktion zum obligat
biotrophen Oomycet Hyaloperonospora parasitica (s. Tabelle 1). So ist die
Akzession Wassilewskija (Ws-0) resistent gegenüber dem WELA- und NOCO-
Isolat. In einer Population T-DNA markierter Pflanzen von Ws-0 (Feldmann und
Marks, 1987) wurde nach Mutanten gesucht, die anfällig gegenüber WELA sind.
Dabei wurde eine Mutante gefunden, die anfällig gegenüber dem WELA-Isolat,
jedoch resistent gegenüber dem NOCO-Isolat ist. Das T-DNA Grenzfragment der
Mutante wurde durch „plasmid rescue“ (Behringer und Medford, 1992) kloniert und
als Sonde in einer genomischen DNA-Bank von Ws-0 eingesetzt, um den Wildtyp-
Locus zu isolieren. Die Sequenzierung des klonierten Locus, welcher als GR1
bezeichnet wurde (Rempulska-Bujas, 1996) zeigt, dass sein Produkt keine
Strukturmotive klassischer RPP-Gene (s. 1.4) aufweist. Da die Mutante noch
resistent gegenüber dem NOCO-Isolat ist und die Behandlung mit
Dichloroisonicotinsäure (Cl2INA) die Resistenzreaktion der Mutante gegenüber
dem WELA-Isolat induziert (Rempulska-Bujas, 1996), ist die Mutante offensichtlich
nicht generell anfällig, sondern rassenspezifisch in ihrer Resistenzreaktion
gegenüber WELA beeinträchtigt. Da das GR1-Gen sich auf Chromosom 1 des
Arabidopsis-Genoms befindet, und damit die Mutation nicht das RPP12-Gen auf
Chromosom 4 betrifft, das für die rassenspezifische Resistenz bzw.
Pathogenerkennung der Akzession Wassilewskija gegenüber dem WELA-Isolat
verantwortlich ist, scheint das GR1-Gen am rassenspezifischen Signalweg
entweder an (s. Abb. 4, a) oder nach der Pathogenerkennung beteiligt zu sein (s.
Abb. 4, b).
1 Einleitung
11
(a) (b)
Abb. 4: Darstellung der möglichen Funktionen des GR1-Gens in der rassenspezifischen
Signaltransduktion mit möglicher Beteiligung von GR1 entweder an der Pathogenerkennung (a) oder nach der Pathogenerkennung (b).
Die Sequenzanalysen des GR1-Gens ergaben, dass das Genprodukt Homologie
(53-57%) zur Familie der IAA-Aminosäuren-Amidohydrolasen aufweist (Bartel und
Fink, 1995; Davies et al., 1999). Die Hypothese einer ähnlichen Enzymaktivität
des GR1-Proteins wurde allerdings widerlegt (Kruse, 2001; Rampey et al., 2004).
Weitere Übereinstimmung besteht zum JR3-Gen (Titarenko et al., 1997), das in
Arabidopsis durch Jasmonat und Verwundung induziert wird. Das GR1-Protein
umfasst 464 Aminosäuren mit einem kalkulierten Molekulargewicht von ca. 51kDa.
Neben einem putativen mitochondrialen Transitpeptid am N-Terminus wurden in
GR1 zwei nahezu perfekte Konsensussequenzen für die Bindung von 14-3-3
Proteinen (s. 1.6) aufgedeckt. Anhand der Ergebnisse eines „Yeast-two-hybrid“-
Assays wurde eine Interaktion zwischen dem GR1-Protein und zwei 14-3-3
Proteinen aus Gerste vermutet (Kruse, 2001).
RPP12
EDS1
GR1
Resistenz gegenüber H. peronospora WELA
?
?
Hyaloperonospora parasitica WELA-Isolat
Hyaloperonospora parasitica WELA-Isolat
RPP12
GR1
Resistenz gegenüber H. peronospora WELA
EDS1
1 Einleitung
12
1.6 14-3-3 Proteine
14-3-3 Proteine wurden ursprünglich als saure lösliche Hirnproteine charakterisiert
(Moore und Perez, 1967). Sie gelten inzwischen als ubiquitär in eukaryotischen
Zellen und als multifunktionelle Regulatoren zellulärer Signalprozesse. So ist ihre
Interaktion mit einer Vielzahl von Proteinen bekannt, die an der Signaltransduktion
und Transkriptionsregulation beteiligt sind (Roberts, 2003).
14-3-3 Proteine besitzen ein Molekulargewicht von ca. 30kDa. Zwei 14-3-3
Protein-Monomere interagieren miteinander an ihren N-Termini, um ein Dimer zu
bilden (Jones et al., 1995; Liu et al., 1995; Xiao et al., 1995). Jedes Monomer
besitzt einen konservierten Bereich, an dem die Zielproteine gebunden werden (s.
Abb. 5).
Abb. 5: Schematische Darstellung der Struktur von 14-3-3 Proteinen nach Palmgren et al. (1998).
Dabei erfolgt die Bindung an kurze, oft phosphorylierte Motive im Zielprotein (Yaffe
et al., 1997). Das spezifische Bindungsmotiv im Zielprotein besteht häufig aus
sechs bis sieben Aminosäuren, das in der vierten oder fünften Position einen
phosphorylierten Serinrest besitzt. Charakteristische Konsensussequenzen im
Zielprotein sind beispielsweise RSxpSxP (Muslin et al., 1996), RxF/YxpSxP (Yaffe
et al., 1997) und RxSxpSxP (Andrews et al., 1998) (R steht für die Aminosäure
Arginin, S für Serin, P für Prolin, F für Phenylalanin und Y für Tyrosin; p bedeutet,
dass das Serin phosphoryliert ist, x steht für eine beliebige Aminosäure und / im
zweiten Motiv bedeutet, dass entweder F oder Y an dieser Position auftreten
kann). Die Phosphorylierung dieser Stellen wird durch Proteinkinasen gesteuert.
Als Folge der Dimerisierung besteht die Möglichkeit, dass ein 14-3-3 Dimer sowohl
mit zwei gleichen als auch mit zwei verschiedenen Zielproteinen interagiert
(Palmgren et al., 1998), oder an ein Zielprotein bindet, das zwei Bindungsmotive
enthält (Yaffe et al., 1997).
1 Einleitung
13
Das erste pflanzliche 14-3-3 Protein wurde von Brandt et al. (1992) in Gerste als
Transkript identifiziert, das nach einem nicht-rassenspezifischen Angriff des
echten Mehltaupilzes Blumeria graminis f. sp. hordei in der Epidermis akkumuliert.
In Arabidopsis thaliana wurden bisher insgesamt fünfzehn 14-3-3 Gene
identifiziert. Die erste Arabidopsis 14-3-3 Isoform wurde als Teil eines Protein/G-
box Komplexes identifiziert und deshalb zunächst als “G-box factor 14-3-3” =
“GF14” bzw. als G-box regulating factor oder auch General regulatory factor =
“GRF” bezeichnet. Bei der Nomenklatur hat sich für die Gene die einfache
Nummerierung der Isoformen (GRF1-15) und für die Proteine die Benennung nach
dem griechischen Alphabet (GF14 chi-iota) durchgesetzt.
Die erste Arabidopsis 14-3-3 Isoform wurde von Lu et al. (1992) identifiziert und
später als GF14 omega (GRF2) bezeichnet. Über weitere Isoformen GF14 chi, psi,
phi, upsilon (GRF1, 3, 4, 5) berichteten Lu et al. im Jahre 1994. Im gleichen Jahr
identifizierten Jarillo et al. (1994) zwei „rare cold-inducible“ 14-3-3 Isoformen und
bezeichneten diese als RCI1 und RCI2. RCI1 war identisch mit GF14 psi (GRF3)
von Lu et al. (1994), während es sich bei RCI2 um eine neue Isoform handelte, die
später als GF14 lambda (GRF6) bezeichnet wurde (Wu et al., 1997a). Über vier
weitere 14-3-3s GF14 nu, kappa, mu, epsilon (GRF7, 8, 9, 10) wurde von Wu et
al. (1997a) berichtet. Rosenquist et al. identifizierten im Jahre 2000 die Isoformen
GF14 omicron (GRF11) und GRF15 und im Jahre 2001 die Isoformen GF14 iota
(GRF12), GRF13 und GRF14 (Rosenquist et al., 2001).
Anhand des Exonmusters der fünfzehn bisher bekannten Arabidopsis 14-3-3
Isoformen (s. Abb. 6) können die Proteine in zwei Gruppen eingeteilt werden.
Dabei umfasst die erste Gruppe die Isoformen GRF1-8 und die zweite Gruppe die
Isoformen GRF9-14. Eine Ausnahme stellt die Isoform GRF15 dar, die ein von
beiden Gruppen abweichendes Exonmuster aufweist.
Von diesen fünfzehn Isoformen konnte die Expression von zwölf Isoformen
(GRF1-12) nachgewiesen werden (Wu et al., 1997a; Rosenquist et al., 2001). Für
die Isoform GRF11 und 12 führten Rosenquist et al. (2001) organspezifische
Untersuchungen durch und konnten nachweisen, dass die Isoform GRF11 in
Blättern, Wurzeln und Blüten, aber die Isoform GRF12 ausschließlich in Blüten
exprimiert wird.
Dass die große Anzahl der Arabidopsis 14-3-3 Isoformen funktionelle Spezifität
aufweist, zeigen die Ergebnisse der „Surface plasmon resonance“ (SPR), bei der
1 Einleitung
14
große Unterschiede in der Bindungsaffinität zwischen neun Arabidopsis 14-3-3
Isoformen und einem bekannten Zielprotein, der Arabidopsis Plasma-Membran
H+ATPase Isoform AHA2, nachgewiesen wurden (Rosenquist et. al., 2000).
Darüber hinaus sind in Arabidopsis thaliana Interaktionen der Arabidopsis 14-3-3
Proteine mit Proteinen bekannt, die an der Transkription und der
Signaltransduktion beteiligt sind. So konnte die Interaktion von fünf Isoformen mit
dem Transkriptionsfaktor TFΙΙB und dem TATA Box-bindenden Protein TBP2 in
einem in vitro „GST-pull down“-Assay nachgewiesen werden (Pan et al.,1999). Die
Interaktion mit einem Protein, das in der pflanzlichen Pathogenabwehr eine Rolle
spielt, zeigt das Beispiel des Arabidopsis AKR2 Proteins (ankyrin repeat protein),
das im “Yeast-two-hybrid“-Assay mit der Isoform GRF6 (GF14 lambda) interagiert
(Yan et al., 2002).
Abb. 6: Exon-/ Intronstruktur der 14-3-3 Arabidopsis Gene nach Rosenquist et al. (2001). Die Exons sind schwarz, die Introns sind weiß dargestellt und jeweils mit der Anzahl der Basen versehen. Die Expression der Isoform GRF12 wurde ausschließlich in Blüten nachgewiesen. Für die Isoformen GRF13, 14 und 15 konnte keine Expression nachgewiesen werden.
1 Einleitung
15
1.7 Aufgabenstellung
Da es scheint, dass in der gr1-Mutante nur eine T-DNA Insertion in dem bisher
noch nicht charakterisierten GR1-Gen vorliegt, darf man vermuten, dass das GR1-
Gen an der rassenspezifischen Resistenz der Akzession Ws-0 gegenüber dem
WELA-Isolat von Hyaloperonospora parasitica beteiligt ist.
Um die Rolle von GR1 in der rassenspezifischen Pathogenabwehr eingehender zu
durchleuchten, sollte im Rahmen dieser Arbeit das GR1-Gen und die gr1-Mutante
näher charakterisiert sowie die Funktion des Gens und des Proteins untersucht
werden. Zur Charakterisierung des GR1-Gens und in Vorbereitung zur Herstellung
eines GR1-CDS-Klons sollte die Analyse auf Transkriptionsebene mit der
Identifizierung des Transkriptionsstartes, Transkriptionsendes und des
Translationsstartes durchgeführt werden. Zur Charakterisierung der gr1-Mutante
sollten die genauen Positionen der „left“- und „right-border“ der T-DNA lokalisiert
werden.
Nach Herstellung eines GR1-CDS-Klons sollte dieser zur Komplementierung des
gr1-Mutanten Phänotyps in Transformationsversuchen und für die Protein-
expression zum Zwecke der Antikörperproduktion eingesetzt werden. Parallel zur
Komplementierung sollte durch Transformation mit RNAi-Konstrukten die
Expression von GR1 im Wildtyp reduziert bzw. verhindert werden, um auf diese
Weise den anfälligen gr1-Mutanten Phänotyp zu reproduzieren.
Aufgrund der Entdeckung von zwei nahezu perfekten Konsensusstellen für die
Bindung von 14-3-3 Proteinen in GR1 und dem Nachweis einer Interaktion mit
Gerste 14-3-3 Proteinen im „Yeast-two-hybrid“-Assay sollte systematisch die
Interaktion des GR1-Proteins mit den zwölf nachweislich exprimierten Arabidopsis
14-3-3 Proteinen (s. 1.6) mittels „Yeast-two-hybrid“-Assay untersucht werden. Im
Falle eine Interaktion könnte dann analysiert werden, ob ein derartiger Komplex in
der pflanzlichen Pathogenabwehr eine Rolle spielt.
2 Material
16
2 Material
2.1 Geräte
Autoklav Technoclav Integra Bioscience, Fernwald
Elektrophoresekammern MWG-Biotech, Ebersberg
Elektroblotter Pharmacia Biotech,
Braunschweig
Power Supply PPS 200-1D MWG-Biotech, Ebersberg
UV-Transilluminator Modell LM-20E Upland, CA, U.S.A.
Inkubationsschüttler Gallenkamp
Kameras MP4 Land Camera Polaroid Corporation
Cambridge, Ma, U.S.A.
Digital-Kamera Olympus CAMEDIA C-2000 Zoom Olympus Optical, Hamburg
Spiegelreflexkamera 7000 AF Minolta, Japan
Mikroskope Leica DM RBE mit Photoautomat Leica MPS28 Leica, Wetzlar
Zeiss, Modell 466300-9901 Zeiss, Jena
Stereomikroskop KL 1500 LCD Leica, Wetzlar
Photometer Beckman DU 7500 Spectrophotometer Beckman, München
Beckmann DU Life Science UV/ Vis
Spectrophotometer Beckman, München
PCR-Thermocycler Peltier Thermal Cycler PTC-200 Biozym, Hess. Oldenburg
2 Material
17
ABI PRISM® 7000 SDS Applied Biosystems,
Weiterstadt
pH-Meter MP 220 pH Meter Mettler, Gießen
Proteinexpressionsmaschine Rapid Translation System RTS 500 Instrument Roche Diagnostics,
Mannheim
Phytokammern York, Mannheim
Sequenziermaschine ALFTM DNA Sequenzer Amersham-Pharmacia,
Freiburg
Wachstumsschränke Sanyo MLR-350 Sanyo, Japan
Waagen Mettler P160N, P1200 Mettler, Gießen
Mettler PC 440 Mettler, Gießen
Sartorius 2357 Sartorius, Göttingen
Sartorius Basic Sartorius, Göttingen
Zentrifugen Eppendorf 5415 C Eppendorf, Oldenburg
Eppendorf 5415 D Eppendorf, Oldenburg
Eppendorf 5417R Eppendorf, Oldenburg
Megafuge 1.OR Heraeus Sepatech, Osterode
Alle weiteren nicht näher bezeichneten Geräte entsprachen dem üblichen
Laborstandard.
2.2 Verbrauchsmaterialien
Einheitserde ED 73 Werkverband e. V.
Einheitserde VM Werkverband e. V.
2 Material
18
Gel-Blotting-Paper Schleicher & Schuell, Dassel
Protran® Nitrocellulose Transfer Membrane Schleicher & Schuell, Dassel
2.3 Enzyme
Deoxyribonuclease Ι (RNase frei) MBI Fermentas, St. Leon-Rot
Ribonuklease A Boehringer, Mannheim
MBI Fermentas, St. Leon-Rot
Restriktionsenzyme MBI Fermentas, St. Leon-Rot
Roche, Mannheim
Promega, Mannheim
Shrimp alkalische Phosphatase (SAP) Boehringer, Mannheim
T4-DNA-Polymerase Boehringer, Mannheim
T4-DNA-Ligase Promega, Mannheim
TaKaRa Ex TaqTM Polymerase Biowhittaker, Verviers
Belgien
Taq-DNA-Polymerase (recombinant) MBI Fermentas, St. Leon-Rot
2.4 Antikörper
HA-Tag Polyclonal Antibody Clontech, Heidelberg
c-Myc Monoclonal Antibody Clontech, Heidelberg
INDIATM HisProbeTM-HRP Novagen, Bad Soden
S-Protein HRP Conjugat Novagen, Bad Soden
Anti-Rabbit (Peroxidase) Sigma, Deisenhofen
Anti-Mouse (Peroxidase) Sigma, Deisenhofen
2.5 Kits
QIAEX ΙΙ Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden
Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification
System Kit Promega, Mannheim
Thermo SequenaseTM fluorescent labelled
primer cycle sequencing Kit Amersham, Braunschweig
NucleoSpin® RNA Plant Kit Macherey-Nagel, Düren
2 Material
19
Revert AidTM H Minus First Strand cDNA
Synthesis Kit MBI Fermentas, St. Leon-Rot
RedTaqTM ReadyMixTM PCR Reaction Mix Sigma, Taufkirchen
TitanTM One Tube RT-PCR System Roche Diagnostics,
Mannheim
qPCRTM Core Kit for SYBR® Green Ι Eurogentec, Seraing, Belgien
5`Race System for Rapid Amplification
of cDNA Ends Life Technologies, Karlsruhe
3`Race System for Rapid Amplification
of cDNA Ends Life Technologies, Karlsruhe
ExpandTM 20kbPlus PCR System Roche Diagnostics,
Mannheim
Genome WalkerTM Kit Clontech, Heidelberg
QIAexpress Type ATG Kit Qiagen, Hilden
Rapid Translation RTS 500 E. coli HY Kit Roche Diagnostics,
Mannheim
SuperSignal® West Pico HisProbeTM Kit Pierce, Bonn
2.6 Marker
1kb DNA Ladder Life Technologies, Karlsruhe
Gene RulerTM 1kb DNA Ladder MBI Fermentas, St. Leon-Rot
Gene RulerTM 100bp DNA Ladder Plus MBI Fermentas, St. Leon-Rot
Kaleidoscope Marker Bio-Rad, München
2.7 Antibiotika
Ampicillin Sigma, Deisenhofen
Carbenicillin Sigma, Deisenhofen
Chloramphenicol Serva, Heidelberg
Gentamycin Boehringer, Mannheim
Hygromycin B Boehringer, Mannheim
Kanamycin Sigma, Deisenhofen
Rifampicin Sigma, Deisenhofen
Spectinomycin Sigma, Deisenhofen
2 Material
20
2.8 Primer
Die Primer wurden bei TIB Molbiol, Berlin; MWG Biotech AG, Ebersberg und
Sigma-Ark, Darmstadt erworben.
Anwendung Name Sequenz (5´→ 3`) Besonder-
heit PCR und E11 GACAATCTCCGGAAACT RT-PCR E12 CTCTCTAACCATAATCTTTG E13 AGCCACCAACTTACCTTTCT E14 TTACTACGGCCGACACCGAT E21 CTTGAGAAGATGTTCACGAG E22 AGCATAGTCACATGTGCGTC E23 TGCATGCATGTGGTCATGAC E31 CGGCTGAAGAAGCTGGAAAT E32 ATAGCCTCCACGTCATCCAA E33 CTTCAGCCGGTTGGAATAAC E51 GAGAAGCAGAATGCGATATACCCG E52 TTTAAGTATCTCTCAGCCACGGCG Con-1A CGTCTAGGTGGTTCAGTACCTGTTGA
ATG
Con-1B TTTATCGAAGAAACATGTCGTTGAACCAG
JL-202 CATTTTATAATAACGCTGCGGACATCTAC
Left-Pr. GGACAATCTCCGGAAACTTAATCTTCTCT
Right-Pr. GATCCGAGTTCTTCATTTCTTATGCCAAT
GR1B CCCATATCCATCCAACGG GR1C TTTCTTGAGGTAGTAGAAGC GR1D GCTCTGAAAGTACCACCG M80-1 AACACCCGTACATAAACGTCAGTC cv1 CAAAGCCATGGACAATCTCCGGAAA
CTTA
ch3 TTAAGATCTTGAATGTTTATCATTTAAGTA
M80-2 BglΙΙ AGATCTCTATCAATATATAAACACCCGTAC
Quantitative RT-PCR interner Standard
Actin 2 for GGTAACATTGTGCTCAGTGGT
Actin 2 rev GGTGCAACGACCTTAATCTTC 5`Race 54 CATGGATCGTCCTCCTAACG 55 CCAGCTCCGACCTAACAAGC TS1 CCCACATGCCCAAATATCCT TS2 CTCAGCATCCTTTTATAACC 3`Race 31 CACATTTCATGATCGATGAA 32 GCCGTGGCTGAGAGATACTT Sequenzieren SeqcDNA AGTCTTCAAGGCATTGTATC 5`Cy5 SeqcDNA 1 CGACTCACTATAGGGCGA 5`Cy5
2 Material
21
SeqcDNA 2 GAGCTAGCGTTTGAGGAG 5`Cy5 SeqcDNA 3 CGGCTGAAGAAGCTGGAA 5`Cy5 SeqcDNA 4 GGCGGTCATAGTCTCGAT 5`Cy5 SeqcDNA 5 GCCGAAGATTTCGCCTTC 5`Cy5 tdna1 CTGAGAGTCAAGAGGACTAG 5`Cy5 tdna2 GATACAATGCCTTGAAGACT 5`Cy5 Pro-sense EcoRΙ CAAATTACAGGGTAGAGAC Trans-EcoRΙ CATTAGGCACCCCAGGCTTTACA Trans-SphΙ TGCACTGAACGTCAGAAGCCGAC pET15b-T7 TAATACGACTCACTATAGG pET15b-SP6 GCTAGTTATTGCTCAGCGG GR1 3675 GGTGTAATAGAGGAGTTATGGTC pJawohl3-35S
Forw TCCACTGACGTAAGGGATGAC
pJawohl3-Intron Forw
AATGAATCGTGATCGGAAGTG
pJawohl3-Intron Reverse
CACTTCCGATCACGATTCATT
pJawohl3-PolyA Reverse
CAACACATGAGCGAAACCCTA
PCR und RT-PCR 14-3-3 Isoformen
Grf1NdeF AAAAAAACATATGGCGACACCAGGAGCTTCCTCAG
Grf1BamR AGGATCCTTAGGATTGTTGCTCGTCAGCGG
Grf2NdeF AAAAAAACATATG Grf2BamR AGGATCC Grf3NdeF AAAAAAACATATGTCGACAAGGGAGA
GGAATGTTT
Grf3BamR AGGATCCTTACTCGGCACCATCGGGCTT
Grf4NdeF AAAAAAACATATGGCGGCACCACCAGCATCATCC
Grf4BamR AGGATCCTTAGATCTCCTTCTGTTCTTCAGC
Grf5NdeF AAAAAAACATATGTCTTCTGATTCGTCCCGGGAAG
Grf5BamR AGGATCCTCACTGCGAAGGTGGTGGTTGGGC
Grf6NdeF AAAAAAACATATGGCGGCGACATTAGGCAGAGACC
Grf6BamR AGGATCCTCAGGCCTCGTCCATCTGCTCC
Grf7NdeF AAAAAAACATATGTCGTCTTCTCGGGAAGAGAATG
Grf7BamR AGGATCCTCACTGCCCTGTCTCAGCTGG
Grf8NdeF AAAAAAACATATGGCGACGACCTTAAGCAGAGATC
Grf8BamR AGGATCCTCAGGCCTCATCCATCTGCTCC
Grf9AseF AAAAAAATTAATGGTTCTGGAAAAGAGCGTGAC
2 Material
22
Grf9BamR AGGATCCTCACTCTGCATCGTCTCCACC
Grf10NdeF AAAAAAACATATGGAGAATGAGAGGGAAAAGCAGG
Grf10BamR AGGATCCTTAGTTCTCATCTTGAGGCTC
Grf11NdeF AAAAAAACATATGGAGAACGAGAGAGCGAAGCAAG
Grf11BcIR AAAAAATGATCATTACTTACCTCCTTCCTCTAG
Grf12NdeF AAAAAAACATATGTCATCATCAGGATCCGACAAAG
Grf12BglΙΙR AAAAGATCTTCAGTTCTCAGTGGCATCGGC
Gerste-a NdeΙ AAAAAAACATATGTCTACCGCTGAGGCAACCCGTG
Gerste-a BamHΙ AGGATCCTCAGTGCCCCTCTCCCTCAGGCT
5´3´14-3-3 CCAACCATGGCGACACCGATCAAGAACC
PCR Silencing
GR1SilXho1780 AAACTCGAGGTCTCTCCAGCCGTTACGAT
GR1SilBam2100 AAGGATCCATCGGTGTCGGCCGTAGTAAC
GR1SilSpe1780 AAACTAGTGTCTCTCCAGCCGTTACGAT
GR1SilRΙ2100 AGAATTCATCGGTGTCGGCCGTAGTAAC
GR1SilXho1965 AAACTCGAGAATCTCCGGAAACTTAATCT
GR1SilBam2222 AAGGATCCGCCACGCAACGTTATCCGGCT
GR1SilSpe1965 AAACTAGTAATCTCCGGAAACTTAATCT
GR1SilRΙ2222 AGAATTCGCCACGCAACGTTATCCGGCT
Genome Walking
GR1 3465 CCACGTTAATCAACGGCTACG
Alle weiteren Chemikalien wurden von den Firmen Roche, Mannheim; GIBCO
BRL, Karlsruhe; Merck, Darmstadt; PeqLab, Erlangen; Promega, Mannheim;
Serva, Heidelberg und Sigma-Aldrich, Deisenhofen mit analytischem
Reinheitsgrad bezogen.
2 Material
23
2.9 Biologisches Material
Escherichia coli-Stämme
DH5α Φ80dlacZ∆M15, recA1,endA1, gyrA96, thi-1,
hsdR17 (rK-, mK+), supE44,relA1, deoR,
∆(lacZYA-argF)U169
Raleigh et al. (1989); Woodcock et al. (1989)
M15 [pREP4] (nalS, strS, rifS, thi-, lac-, ara+, gal+, mtl-, f-,
recA+, uvr+, lon+)
Qiagen
SG13009 [pREP4] (nalS, strS, rifS, thi-, lac-, ara+, gal+, mtl-, f-,
recA+, uvr+, lon+)
Qiagen
BL21 [F-, ompT, hsdS (rb-,mb-), gal, dcm]
Amersham Pharmacia Biotech
Agrobacterium tumefaciens-Stämme
GV3101 (pMP90RK) C58 Rifr Kmr RK2
Koncz und Schell (1986)
Ase Weigel, Salk Inst. USA
LBA4404 Hoekema et al. (1983)
Hefe-Stamm
Y190 MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801,
trp1-901, leu2-3,112, gal4∆, gal80∆, cyhr2
Clontech
Plasmide
Name Referenz
pGEM® T-Easy Promega, Mannheim
pPZP221 Hajdukiewicz et al. (1994)
2 Material
24
pCHF1 Fankhauser, Salk Inst. USA
pQE60 Qiagen, Hilden
pET-29a(+) Novagen, Bad Soden
pGBKT7 Clontech, Heidelberg
pGADT7 Clontech, Heidelberg
pACT2 Clontech, Heidelberg
pJawohl3-RNAi Ülker, Max-Planck-Institut,
Köln
Hyaloperonospora parasitica-Isolat
WELA
Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.
Akzession Wassilewskija N1602
Akzession Wassilewskija; Mutante D Rempulska-Bujas (1996)
Akzession Weiningen N3110
3 Methoden
25
3 Methoden
3.1 Pflanzenmaterial
Als Versuchspflanzen standen die Arabidopsis thaliana [L.] Heynh. Akzessionen,
Wassilewskija (Ws-0) und Weiningen (Wei-0), sowie die Arabidopsis thaliana [L.]
Heynh. Akzession Wassilewskija Mutante D (Rempulska-Bujas, 1996) zur
Verfügung.
3.2 Unsterile Pflanzenanzucht
Arabidopsis-Samen wurden auf feuchter Aussaaterde (2/3 VM-Erde, 1/3 Sand)
gesät und anschließend für 2d bei 4°C stratifiziert. Bei hoher Luftfeuchtigkeit (ca.
80%) wurde das Saatgut zur Keimung gebracht. Drei Wochen nach der Aussaat
wurden die Keimlinge in Pikiererde (1/3 VM-Erde, 1/3 ED-73-Einheitserde, 1/3
Sand) vereinzelt und bei mäßiger Bodenfeuchtigkeit angezogen.
Die Anzucht erfolgte bei ca. 65% Luftfeuchtigkeit unter Kurztagbedingungen (8,5h
Licht/ 15,5h Dunkelheit) bei 20-22°C tags, 18-20°C nachts und einer Lichtintensität
von ca. 100µE PAR in einer Phytokammer mit Festwertsteuerung.
Zur Blühinduktion wurden die Pflanzen nach dem Pikieren unter
Langtagbedingungen (18h Licht/ 6h Dunkelheit) bei 20-22°C tags, 18-20°C nachts
und einer Lichtintensität von ca. 100µE PAR gehalten.
3.3 Sterile Pflanzenanzucht
Das Saatgut von Arabidopsis thaliana wurde zur Oberflächensterilisation 15min
mit 70%igem Ethanol behandelt und anschließend zweimal kurz in 100%igem
Ethanol geschwenkt. Die Samen wurden unter der Sterilbank auf sterilem
Filterpapier getrocknet und gleichmäßig auf MS-Agarplatten gestreut. Für die
Selektion von Transformanten wurden dem Medium in entsprechender
Konzentration Antibiotika zugesetzt. Die Petrischalen wurden mit
sauerstoffdurchlässigem MicroporeTM-Band der Firma Health Care umwickelt und
für 2d bei 4°C stratifiziert. Anschließend wurden die Petrischalen in eine
Phytokammer gestellt und die Pflanzen unter Langtagbedingungen (wie oben
beschrieben) kultiviert.
3 Methoden
26
MS-Agarplatten: ½ MS-Medium (nach Murashige und Skoog, 1962)
0.6% (w/v) Phytagar
3.4 Hyaloperonospora parasitica-Isolat WELA
Als Pathogen stand das Hyaloperonospora parasitica (falscher Mehltau) Isolat
WELA zur Verfügung. Dieses WELA-Isolat weist unterschiedliche Kompatibilität zu
den Arabidopsis-Akzessionen bzw. zu der Mutante D auf. WELA ist gegenüber der
Akzession Wei-0 und der Mutante D virulent (kompatible Interaktion). Gegenüber
der Akzession Ws-0 ist WELA avirulent (inkompatible Interaktion).
3.5 Kultivierung des Hyaloperonospora parasitica-Isolates WELA
Das Hyaloperonospora parasitica-Isolat WELA als obligat biotropher Oomycet, der
auf lebende Wirtszellen angewiesen ist, wurde auf der suszeptiblen Arabidopsis-
Akzession Weiningen kultiviert.
Dazu wurden wöchentlich Konidiosporen infizierter Blätter geerntet, indem die
Sporen mit Leitungswasser von den Blättern abgewaschen wurden. Anschließend
wurden mit dieser Sporensuspension drei Wochen alte Weiningen-Pflanzen
besprüht. Zur Erhöhung der Luftfeuchtigkeit und zur Förderung der Infektion
wurden die inokulierten Weiningen-Pflanzen für 1d mit einer feuchten Haube
bedeckt und in einen Wachstumsschrank gestellt. Die Kultivierung der inokulierten
Arabidopsis-Pflanzen erfolgte jeweils für eine Woche in einem 9h Licht/ 15h
Dunkelrhythmus bei 18°C am Tag und 15°C in der Nacht und einer Lichtintensität
von ca. 100µE PAR. Sechs Tage nach Inokulation wurden die Pflanzen zur
Förderung der Sporulation wiederum für ca. 24h mit einer feuchten Haube
bedeckt.
3 Methoden
27
3.6 Lactophenol-Trypanblau Färbung von Arabidopsis-Blättern
Mit Hilfe der Lactophenol-Trypanblau Färbung wurde der Infektionsverlauf von
Hyaloperonospora parasitica in infizierten Arabidopsis-Pflanzen und die
Wirtsreaktionen auf den Pathogenbefall analysiert.
Dazu wurden Arabidopsis-Blätter 3min in einer Lactophenol-Trypanblau-Lösung
gekocht und über Nacht bei RT in dieser Lösung inkubiert. Die Entfärbung der
Blätter erfolgte mit einer Chloralhydratlösung. Die Blätter wurden bis zur
Mikroskopie in 50%igem Glycerin aufbewahrt.
Lactophenol-Trypanblau Lösung: Chloralhydratlösung: 10g Phenol 50g Chloralhydrat
20mg Trypanblau 20ml Aqua bidest.
10ml Milchsäure
10ml Glycerol
10ml Aqua bidest. 95% Ethanol : Lactophenol-Trypanblau-Lösung, 2:1
3.7 Bakterienstämme
3.7.1 Escherichia coli-Stämme
Für allgemeine Klonierungen fand der Bakterienstamm DH5α (Raleigh et al.,
1989; Woodcock et al., 1989) Verwendung. Für die Proteinexpression wurden die
Stämme M15 [pREP4] und SG13009 [pREP4] der Firma Qiagen sowie der BL21-
Stamm der Firma Amersham Pharmacia Biotech getestet.
3.7.1.1 Anzucht von E. coli
Die Anzucht von E. coli-Zellen erfolgte in/auf LB-Medium bei 37°C unter Zusatz
des entsprechenden Antibiotikums. Für die Anzucht in Flüssigkultur wurde mit
220rpm geschüttelt.
LB-Medium: 10g/L Bacto-Tryptone
5g/L Hefe-Extrakt
10g/L NaCl
15g/L Agar für Agarplatten
3 Methoden
28
3.7.1.2 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen
Eine Vorkultur von ca. 5ml LB-Medium wurde mit Bakterien angeimpft und über
Nacht bei 37°C angezogen. Am darauffolgenden Tag wurden mit dieser Vorkultur
200ml LB-Medium angeimpft und solange inkubiert, bis sich die Bakterienkultur in
der logarithmischen Wachstumsphase befand (OD600nm= 0,5). Die Bakterienkultur
wurde in vorgekühlte sterile 50ml Falcon-Gefäße überführt und 10min auf Eis
inkubiert.
Nach 10minütiger Zentrifugation mit 1.559xg bei 4°C wurden die pelletierten Zellen
in 7,5ml eiskalter TFBΙ-Lösung resuspendiert und weitere 10min auf Eis gestellt.
Nach einer weiteren Zentrifugation (10min, 1.559xg, 4°C) wurden die
Bakterienpellets in 1ml eiskalter TFBΙΙ-Lösung aufgenommen, resuspendiert und
in 200µl Aliquots bei -75°C gelagert.
TFBΙ-Lösung: TFBΙΙ-Lösung:
30mM K-Acetat 10mM MOPS
50mM MnCl2 75 mM CaCl2
100mM RbCl 0,5mM RbCl
10mM CaCl2 15% Glycerin
15% Glycerin pH 6,8 mit NaOH einstellen;
pH 5,8 mit HCl einstellen; Lösung sterilfiltrieren
Lösung sterilfiltrieren
3.7.2 Agrobacterium tumefaciens-Stämme
Für die Blütentransformation von Arabidopsis thaliana wurde anfänglich der
Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404 (Hoekema et al., 1983) eingesetzt.
Allerdings zeigte sich nach mehrmaligen erfolglosen Transformationsversuchen,
dass der Stamm offensichtlich nicht für die Blütentransformation von Arabidopsis
geeignet ist (Laudert, 1997). Somit wurde dann der Stamm ASE getestet. Wegen
des Verlustes der Plasmide während der Inkulturnahme dieses Stammes wurde
letztendlich der Stamm GV3101 (pMP90RK) (Koncz und Schell, 1986) für die
Transformationen eingesetzt.
3 Methoden
29
3.7.2.1 Anzucht von Agrobacterium tumefaciens
Die Anzucht der Agrobacterium tumefaciens-Stämme erfolgte in YEP-Medium
bzw. auf YEP-Agarplatten bei 28°C unter Zusatz der entsprechenden Antibiotika.
Für die Anzucht in Flüssigkultur wurde mit 220rpm geschüttelt. YEP-Medium: 10g/L Proteose Pepton
10g/L Hefe-Extrakt
5g/L NaCl
15g Agar/L für Agarplatten
3.7.2.2 Herstellung kompetenter Agrobakterien
Eine Vorkultur von ca. 2ml YEP-Medium mit den entsprechenden Antibiotika
wurden mit dem Agrobacterium tumefaciens-Stamm GV3101 (pMP90RK)
angeimpft und über Nacht bei 28°C geschüttelt. Am nächsten Tag wurden 100ml
YEP-Medium mit den entsprechenden Antibiotika mit 1ml dieser Über-Nacht-
Kultur angeimpft und solange bei 28°C inkubiert, bis eine OD600nm von 1-1,5
erreicht wurde. Die Agrobakterienkultur wurde in vorgekühlte sterile 50ml Falcon-
Gefäße überführt und 10min auf Eis inkubiert. Nach der Zentrifugation (5min,
2.122xg, 4°C) erfolgte die Resuspension des Zellpellets in 10ml gekühltem sterilen
Aqua bidest. Dieser Schritt wurde nochmals wiederholt, bevor das Zellpellet in
500µl sterilem 10%igen Glycerin resuspendiert und anschließend in 50µl Aliquots
bei -75°C gelagert wurde.
3.8 DNA-Klonierung
3.8.1 Agarose-Gelelektrophorese
Die Trennung und der Nachweis von DNA erfolgte durch Agarose-
Gelelektrophorese.
Bei der Gelelektrophorese wird die elektrische Ladung von Molekülen wie
Nukleinsäuren und Proteinen ausgenutzt, um sie nach ihrer Größe aufzutrennen.
Zur Herstellung der Gele wird Agarose, ein Polysaccharid aus Rotalgen,
verwendet. Das Wanderungsverhalten der Moleküle ist abhängig von der Form
3 Methoden
30
und Größe der Moleküle, der Ionenstärke, der Porengröße der verwendeten
Gelmatrix, der Stärke des angelegten Feldes und der Nettoladung. Nukleinsäuren
sind negativ geladen und wandern daher zum positiven Pol, und zwar umso
schneller, je kleiner sie sind.
In Abhängigkeit von den zu erwartenden DNA-Fragmentlängen wurden 0,7-
2,0%ige Agarosegele hergestellt. Die Agarose wurde in 1xTAE-Puffer suspendiert
und in der Mikrowelle bis zur klaren Lösung geschmolzen. Nach Abkühlung der
Lösung auf ca. 65°C wurde Ethidiumbromid (0,5µg/ml Gel) hinzugefügt und das
Gel in die vorbereitete Gelkammer gegossen. Die DNA-Proben wurden vor der
Elektrophorese mit 3µl 10x DNA-Ladepuffer versetzt und in die Geltaschen
pipettiert. Mit Hilfe entsprechender Marker (s. 2.6 DNA-Ladder), die parallel zu den
DNA-Proben aufgetragen wurden, ließ sich die Größe der einzelnen Banden
bestimmen. Die Elektrophorese erfolgte in 1xTAE als Laufpuffer bei ca. 10Volt/cm.
Durch die Anfärbung des Gels mit Ethidiumbromid, einem interkalierenden
Farbstoff, wurden die DNA-Fragmente unter UV-Licht der Wellenlänge 302nm
sichtbar gemacht und anschließend mit einer Polaroidkamera MP4 (s. 2.1) zu
Dokumentationszwecken fotografiert.
10x TAE-Puffer: 10x DNA-Ladepuffer: 0,4M Tris/HCL 0,5% Bromphenolblau
0,2M Natriumacetat 50% Glycerin
10mM EDTA, pH 8,2 0,1M EDTA
ad 1L mit Aqua bidest. Aqua bidest.
Ethidiumbromidstammlösung: 5mg Ethidiumbromid/ml Aqua bidest.
3.8.2 Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen
Die Extraktion und Aufreinigung der DNA nach der Gelelektrophorese dient zur
Trennung der gewünschten DNA von Verunreinigungen wie Agarose, Salze,
Proteine, Ethidiumbromid und unerwünschter DNA.
Zur Isolierung der DNA aus dem Gel wurde das „QIAEXΙΙ Gel Extraction Kit“ (s.
2.5) eingesetzt. Das Prinzip der Extraktion basiert auf der Lösung der Agarose und
selektiven Bindung der DNA an Glasmilch, einem Silica-Gel, bei hoher
Salzkonzentration. Die DNA wird in dieser gebundenen Form durch
3 Methoden
31
Abzentrifugieren und mehreren Waschschritten von Substanzen, die nicht an die
Glasmilch binden, gereinigt. Die Elution der DNA erfolgt bei niedriger
Salzkonzentration mit Wasser.
Dazu wurde zunächst das Gelstück, welches die gewünschte DNA-Bande enthielt,
mit einem Skalpell unter UV-Licht ausgeschnitten. Das Gelstück wurde in ein
Eppendorfgefäß überführt, ausgewogen und zu 1 Volumen des Gelstücks wurde
das 3fache Volumen des „QX1-Puffers“ zugesetzt. Nach Zugabe von 10µl
Glasmilch-Suspension folgte zur Lösung der Agarose eine 10minütige Inkubation
bei 50°C, welche mehrfach von einem Resuspensionsschritt unterbrochen wurde.
Anschließend wurde die Glasmilch mit der daran gebundenen DNA für 30s bei
15.800xg abzentrifugiert und der Überstand mit einer Pipette entfernt. Daran
schlossen sich zunächst ein Waschschritt mit 500µl „QX1-Puffer“ einschließlich
Resuspendieren und Abzentrifugieren an, gefolgt von zwei weiteren
Waschschritten mit jeweils 500µl „PE-Puffer“. Nach dem letzten Entfernen des
Überstandes mit einer Pipette wurde das Pellet an der Luft getrocknet,
anschließend in 20µl Aqua bidest. resuspendiert und für 5min in Abhängigkeit von
der Größe der zu eluierenden DNA entweder bei Raumtemperatur (< 4kb) oder bei
50°C (4-10kb) inkubiert. Anschließend wurde für 30s bei 15.800xg abzentrifugiert
und der Überstand, der die gereinigte DNA enthielt, in ein neues Eppendorfgefäß
überführt. Die Aufbewahrung erfolgte bei –20°C.
Die auf diese Weise aufgereinigte DNA wurde beispielsweise in eine Ligation (s.
3.8.3), Restriktionsverdau (s. 3.8.7), PCR (s. 3.12) oder Sequenzierung (s. 3.9)
eingesetzt.
3.8.3 Ligation
Die Ligation basiert auf der kovalenten Verknüpfung des Vektormoleküls mit dem
DNA-Fragment (Insert) mittels DNA-Ligase (isoliert aus Bakteriophagen T4),
welche eine Phosphodiesterbindung zwischen zwei Nukleotiden bildet.
In die Ligation wurden sowohl unverdaute oder verdaute geleluierte PCR-Produkte
als auch bei Durchführung von Subklonierungen einem Restriktionsverdau
unterzogene und anschließend geleluierte DNA-Fragmente eingesetzt, um diese
mittels der T4-DNA-Ligase (s. 2.3) in die entsprechenden Vektoren zu klonieren.
3 Methoden
32
Der Ligationsansatz von 10µl Gesamtvolumen setzte sich aus 1µl Ligasepuffer
(10x), 1-2µl Vektor (ca. 50ng), xµg zu klonierendes DNA-Fragment und 1µl T4-
DNA-Ligase (ca. 1Unit) zusammen. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 4°C.
Der Ligationsansatz wurde anschließend in die Transformation kompetenter E. coli
eingesetzt.
3.8.4 Transformation von E. coli
Die Transformation kompetenter E. coli, mit deren Hilfe Plasmid-DNA
millionenfach vermehrt wird, erfolgte mittels Hitzeschock (Sambrook et al., 1989).
Dazu wurde ein Aliquot kompetenter E. coli Zellen nach dem Auftauen auf Eis mit
10µl Ligationsansatz versetzt. Nach einer 20minütigen Inkubation auf Eis wurden
die Zellen für 50s einem Hitzeschock von 42°C ausgesetzt, welcher die Aufnahme
der DNA in die Bakterienzellen bewirkt. Nach 2minütiger Inkubation der Zellen auf
Eis und Zugabe von 800µl LB-Medium folgte eine Regeneration für 1h bei 37°C
und 220rpm. Die Selektion erfolgte durch Ausstreichen der Bakterien auf LB-
Agarplatten mit entsprechendem Antibiotikum und anschließender Inkubation über
Nacht bei 37°C.
3.8.5 Animpfen von rekombinanten Bakterienkolonien
Von den Selektionsplatten der transformierten E. coli Bakterien wurden
Einzelkolonien mit sterilen Zahnstochern gepickt, auf einer neuen LB-Agarplatte
mit entsprechenden Antibiotika gesichert und anschließend in ein Reagenzglas mit
4,5ml LB-Medium inkl. entsprechender Antibiotika überführt.
Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert und anschließend bei 4°C bis
zum Anlegen von Glycerolstocks aufbewahrt.
Die Reagenzgläser mit den Kulturen wurden über Nacht bei 37°C und 220rpm
geschüttelt. Aus diesen Bakterienkulturen wurde am darauffolgenden Tag die
Plasmid-DNA isoliert.
3 Methoden
33
3.8.6 Isolation von Plasmid-DNA aus transformierten E. coli (Mini-Präparation)
Die Isolation der Plasmid-DNA aus den transformierten E. coli wurde mit dem
„Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System Kit“ (s. 2.5) durchgeführt.
Bei dieser Methode werden die verschiedenen Konformationen von
chromosomaler Bakterien-DNA und Plasmid-DNA ausgenutzt, um sie voneinander
zu trennen. Die Bakterien werden durch alkalische Behandlung denaturiert. Bei
der Neutralisation wird dann der pH-Wert und die Salzkonzentration erniedrigt, so
dass die lineare bakterielle DNA nicht renaturieren kann und zusammen mit
Proteinen und anderen Zellbestandteilen ausfällt und abzentrifugiert wird. Die
zirkuläre Plasmid-DNA dagegen renaturiert und bleibt im Überstand gelöst, wird
anschließend an eine Silica-Membran gebunden und bei niedriger
Salzkonzentration wieder eluiert.
Dazu wurden die 4,5ml der Bakterien-Über-Nacht-Kultur in zwei 10minütigen
Zentrifugationen bei 15.800xg pelletiert und anschließend das Pellet in 250µl „Cell
Resuspension Solution“ resuspendiert. Die Lyse der Zellen erfolgte durch Zugabe
von 250µl „Cell Lysis Solution“. Durch Zusetzen von 10µl „Alkaline Protease
Solution“ und einer 5minütigen Inkubation wurden Proteine und Endonukleasen
inaktiviert. Anschließend wurden 350µl „Neutralisation Solution“ hinzugefügt und
10min bei 15.800xg zentrifugiert. Das Lysat wurde dann in ein „Spin Column“
überführt und für 1min abzentrifugiert, was die Bindung der Plasmid-DNA an die
Silica-Membran bewirkte. Daran schlossen sich zwei Waschschritte durch Zugabe
von 750µl bzw. 250µl Ethanol enthaltender „Column Wash Solution“ an. Nach
Überführung des „Spin Column“ auf ein Eppendorfgefäß wurde die Plasmid-DNA
mit 100µl Nuclease-freiem Wasser durch 1minütige Zentrifugation eluiert. Die
Aufbewahrung erfolgte bei -20°C. Analysiert wurde die Plasmid-DNA zunächst
durch Restriktionsverdau, bevor sie abschließend einer Sequenzierung
unterzogen wurde.
3.8.7 Restriktionsverdau von Plasmid-DNA
Mit Hilfe von geeigneten Restriktionsenzymen bzw. Restriktionsendonukleasen,
welche DNA an spezifischen Sequenzen erkennen und spalten, konnten Plasmide
3 Methoden
34
nach Verdau und anschließender Agarose-Gelelektrophorese (s. 3.8.1) überprüft
bzw. die Größe ihrer Inserte bestimmt werden. Weiterhin wurden durch
Restriktionsverdau Plasmide bzw. Inserte aus Plasmiden herausgeschnitten, in
der Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt, mit dem „QIAEXΙΙ Gel Extraction Kit“
aus der Agarose aufgereinigt (s. 3.8.2) und anschließend für Subklonierungen
eingesetzt.
Der Restriktionsansatz aus 10µl Gesamtvolumen setzte sich aus 1-2µg Plasmid-
DNA, 1x Reaktionspuffer, 2-5Units Restriktionsenzym(e) und xµl Aqua bidest.
zusammen. Die Inkubationstemperatur und -zeit richtete sich nach den
verwendeten Restriktionsenzymen.
3.8.8 Auffüllen überstehender 5`-Enden
Damit überstehende 5´-Enden mit glatten Enden ligiert werden konnten, wurden
diese zuvor in einer „fill-in“-Reaktion mit Hilfe von T4-DNA-Polymerase (s. 2.3) zu
glatten Enden aufgefüllt.
Dazu wurde nach dem Restriktionsverdau 1-2µg Plasmid-DNA mit 0,5µl dNTP-Mix
(10mM) und 1Unit T4-DNA-Polymerase 5min bei Raumtemperatur inkubiert.
Danach erfolgte die Hitzeinaktivierung des Enzyms für 10min bei 70°C.
Die aufgefüllten DNA-Fragmente wurden anschließend in eine Ligation eingesetzt
(s. 3.8.3).
3.8.9 Dephosphorylierung linearisierter Vektor-DNA
Im Falle der Linearisierung von Vektor-DNA mit Hilfe eines Restriktionsenzyms,
wurden zur Verhinderung der Religation des Vektors die 5´-Enden mit Hilfe von
Shrimp alkalischer Phosphatase (SAP) (s. 2.3) dephosphoryliert.
Dazu wurde 50ng linearisierte Vektor-DNA mit 0,9µl Dephosphorylierungspuffer
(10x) und 1µl SAP (1Unit) versetzt und 10min bei 37°C inkubiert. Die
Hitzeinaktivierung des Enzyms erfolgte für 15min bei 65°C.
Die dephosphorylierte Vektor-DNA wurde anschließend in eine Ligation eingesetzt
(s. 3.8.3).
3 Methoden
35
3.9 Sequenzierung
Die Sequenzierung der DNA wurde zu Beginn dieser Arbeit mit dem ”Automated
Laser Fluorescent DNA Sequencer” (ALF) der Firma Pharmacia durchgeführt. Aus
Zeit- und Kostengründen und in Anbetracht der Vielzahl von Sequenzierungen
wurde später die Firma SEQLAB in Göttingen mit den Sequenzierungen
beauftragt.
Die eigenständig durchgeführten Sequenzierungen erfolgten nach dem Prinzip der
Didesoxy-Kettenabbruchmethode nach Sanger et al. (1977).
Dazu wird ein am 5’-Ende fluoreszenzmarkierter, sequenzspezifischer
Oligonukleotid-Primer, der an einer Einzelstrang-DNA bindet, in einer PCR-
Reaktion (s. 3.12) verlängert. In vier getrennten Ansätzen erfolgt die Zugabe
jeweils eines der vier Didesoxynukleotide ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP und
somit der Abbruch der Reaktion. Als Ergebnis liegen vier Reaktionsansätze mit
zahlreichen unterschiedlich großen DNA-Fragmenten vor, die an
unterschiedlichen Positionen mit dem jeweils zugesetzten Didesoxynukleotid
enden. Die Auftrennung der neu synthetisierten, unterschiedlich langen DNA-
Fragmente erfolgt über ein Polyacrylamidgel, wobei sich diese durch einen
Laserstrahl anregen lassen und somit von entsprechenden Dioden als Lichtblitze
detektiert werden können. Die Daten der vier verschiedenen Abbruchreaktionen in
vier nebeneinander liegenden Gelbahnen werden über einen Computer
prozessiert und in eine entsprechende Sequenz umgesetzt (Computerprogramm
ALFwin).
Für die Durchführung der Sequenzierung wurde zunächst die Gelkassette sehr
gründlich gereinigt, da das gesamte System sehr anfällig gegen Verunreinigungen
ist und somit die Fluoreszenz-Detektion leicht fehlschlagen kann. Dazu wurden die
Glasplatten mit Aqua bidest. von Verunreinigungen befreit, anschließend mit
70%igem Ethanol entfettet und nochmals mit Aqua bidest. nachbehandelt.
Für die Herstellung der Gelmatrix wurden 30g Rotiphorese NF-Harnstoff in 22ml
nicht-autoklaviertem Aqua bidest., 6ml Rotiphorese NF-10xTBE-Puffer und 10,4ml
Rotiphorese-NF-Autoseq 29:1 (40%)-Acrylamidlösung gelöst. Die Lösung wurde
für 10min entgast, bevor die Polymerisation durch Zugabe von 25µl N,N,N`,N´-
Tetramethylethylendiamin (TEMED) und 200µl 10% Ammoniumpersulfat (APS)
3 Methoden
36
gestartet wurde. Das Gel wurde sofort in die vorbereitete Gelkassette gegossen
und der Kamm eingesetzt. Die Polymerisation erfolgte für ca. 1,5-2h.
Die Sequenzierreaktionen wurden mit dem „Thermo SequenaseTM fluorescent
labelled primer cycle sequencing Kit“ (s. 2.5) durchgeführt. Als Primer wurden
entweder fluoreszenzmarkierte genspezifische Primer oder fluoreszenzmarkierte
Primer verwendet, die an den jeweilig eingesetzten Vektor binden, in dem das zu
sequenzierende DNA-Fragment ligiert wurde.
In einem Eppendorfgefäß wurden zunächst 2-4µg Plasmid-DNA mit 2pmol/µl
Primer versetzt, auf ein Gesamtvolumen von 25µl mit Aqua bidest. aufgefüllt und
gründlich gemischt. Daraufhin wurden jeweils 2µl des `A`-Mix, `C`-Mix, `G`-Mix
und `T`-Mix einzeln in die Gefäße der PCR-Streifen vorgelegt, mit jeweils 6µl
DNA- Primer Mix versetzt und anschließend mit 15µl Mineralöl überschichtet.
Die Synthese der DNA-Fragmente erfolgte mit folgendem PCR-Programm:
Initiale Denaturierung 95°C für 3min
Denaturierung 95°C für 30s
Primerannealing 50°C für 30s
Polymerisation 72°C für 30s
35 Zyklen
Finale Polymerisation 72°C für 2min
Nach Beendigung der PCR-Reaktion wurde in jedes Gefäß 5µl Stopp-Lösung
pipettiert und dann die abgestoppten Reaktionen bis zum Beladen des Gels auf
Eis gestellt.
Unterdessen wurde das auspolymerisierte Gel in eine Vertikalelektrophorese-
kammer eingespannt, der 1xTBE Laufpuffer eingefüllt und der
Probentaschenkamm entfernt. Die Probentaschen wurden mit Laufpuffer
ausgespült und nicht-polymerisierte Acrylamidmoleküle wurden durch eine
30minütige Vorelektrophorese bei 1.500V und einer Temperatur von 45°C
entfernt. Unmittelbar vor Beladung des Gels wurden die Proben bei 94°C für 3min
denaturiert, auf Eis gestellt und dann in definierter Reihenfolge (ACGT) in erneut
mit Laufpuffer ausgespülte Probentaschen pipettiert.
Die Gelelektrophorese erfolgte für 800min bei einer Temperatur von 45°C und bei
1500V, 38mA, 34W und 2,5s Probenintervall.
3 Methoden
37
3.10 Stabile Transformation von Arabidopsis thaliana mittels Agrobacterium tumefaciens
Die stabile Transformation von Arabidopsis thaliana erfolgte mit Hilfe des
Agrobacterium tumefaciens-Stamms GV3101 (pMP90RK). Dieser Stamm enthält
ein Ti-Plasmid, welches keine tumorauslösenden Gene (onc Gene) mehr besitzt,
sondern nur die für den Vorgang der Infektion notwendigen Virulenzgene (vir
Gene). In diesen Agrobakterien-Stamm wurde ein zweites Plasmid mit zwischen
„right-border“ (RB) und „left-border“ (LB) lokalisiertem Selektionsmarker und der in
die Pflanzenzelle zu übertragenden DNA transformiert. Die aktive Vir-Region des
Ti-Plasmides bewirkt dann in trans die Übertragung der T-DNA in das pflanzliche
Gen.
3.10.1 Transformation von Agrobakterien
Die Transformation der Agrobakterien erfolgte mittels Elektroporation, indem zu
einem aufgetauten Aliquot des kompetenten Agrobacterium tumefaciens-Stamm
GV3101 (pMP90RK) ca. 1µg Plasmid-DNA pipettiert und für 3min auf Eis inkubiert
wurde. Daran schloss sich die Elektroporation (2,5kV, 600Ω, 10µF) in 0,2cm
Küvetten mit sofortiger Zugabe von 1ml SOC-Medium an. Der Inkubation der
transformierten Zellen für 1h mit Kopf-Über-Rotation folgte die Selektion durch
Ausplattieren von 50-100µl auf YEP-Platten mit entsprechenden Antibiotika und
anschließender Inkubation der Platten für 2-3d bei 28°C.
SOC-Medium (sterilfiltrieren): 2% Bacto Trypton
0,5% Hefe-Extrakt
10mM NaCl
2,5mM KCl
10mM MgCl2
10mM MgSO4
20mM Glucose
3 Methoden
38
3.10.2 Überprüfung von Agrobakterienkolonien mittels Kolonie-PCR
Von den Selektionsplatten der transformierten Agrobakterien wurden
Einzelkolonien mit sterilen Zahnstochern gepickt, auf einer neuen YEP-Agarplatte
mit entsprechenden Antibiotika gesichert und anschließend in Eppendorfgefäße
mit jeweils 30µl Aqua bidest. überführt.
Die Platten wurden für 2d bei 28°C inkubiert und anschließend bei 4°C bis zum
Anlegen von Glycerolstocks aufbewahrt.
Die in Aqua bidest. suspendierten Agrobakterienkolonien wurden für 5min bei
95°C gekocht und anschließend als „template“ in eine PCR (s. 3.12) eingesetzt,
um zu prüfen, ob sie die entsprechende Plasmid-DNA enthalten.
3.10.3 Transformation von Arabidopsis thaliana durch Vakuuminfiltration und Selektion bis zur Homozygotie
Die Blütentransformation von Arabidopsis thaliana wurde in Anlehnung an eine
Methode von Bechtold et al. (1993) durchgeführt.
Drei Tage vor Inokulation wurden ca. 100ml YEP-Medium mit entsprechenden
Antibiotika als Vorkultur mit den transformierten Agrobakterien angeimpft und über
Nacht bei 28°C angezogen. Diese Vorkultur wurde in einem 1L-Erlenmeyerkolben
mit ca. 300ml YEP-Medium überführt und für weitere 2d inkubiert. Die
Agrobakterien wurden in verschraubbare 50ml Falcon-Gefäße überführt und bei
4.332xg für 10min abzentrifugiert. Das Pellet wurde in Infiltrationsmedium
aufgenommen und die OD600nm auf ca. 0,8 eingestellt. Anschließend wurde die
Bakteriensuspension in ein Becherglas überführt und dieses in einen Exsikkator
gestellt. In die Lösung wurden kopfüber Pflanzen mit bereits ausgebildeten, aber
noch nicht vollständig aufgeblühten Infloreszenzen getaucht. Ein Vakuum von
etwa 45mbar (35-40mm Hg) wurde für 5min angelegt und dann durch Ziehen des
Stopfens schnell abgelassen.
Die transformierten Pflanzen wurden mit einer angefeuchteten Plastikhaube
bedeckt und über Nacht bei ca. 16°C dunkel gestellt. Danach wurden sie bis zur
Samenreifung unter Langtagbedingungen gehalten. Das reife Saatgut wurde in
Abhängigkeit vom Selektionsmarker entweder unter sterilen Bedingungen auf MS-
Agarplatten (s. 3.3) mit entsprechenden Antibiotika oder unter unsterilen
Bedingungen auf Erde (s. 3.2) mit Basta der Firma Aventis (Herbizid mit dem
3 Methoden
39
Wirkstoff 200g/L Glufosinate-ammonium; eingesetzt mit der Endkonzentration
1ml/L Wasser) selektiert.
Die transformierten Pflanzen, die sich durch deutliches Wurzelwachstum und
Bildung von Primärblättern von den “nicht transformierten Pflanzen” (keimten,
zeigten aber kein weiteres Wachstum und bildeten kein Chlorophyll)
unterschieden, wurden nach 2-3 Wochen auf Erde pikiert und unter
Langtagbedingungen gehalten.
Das reife Saatgut dieser T1-Generation wurde geerntet, unter sterilen bzw. nicht
sterilen Bedingungen (wie oben beschrieben) weiter selektiert. In dieser
Generation wurden nur mit den Linien weiter gearbeitet, in denen ¾ der
Nachkommen überlebten.
Die überlebenden Keimlinge dieser T2-Linien wurden wiederum auf Erde pikiert
und bis zur Samenreife kultiviert, geerntet und einer letzten Selektion unterzogen.
In dieser T3-Generation waren nur die Linien von Interesse, bei denen alle
Nachkommen überlebten, d.h. homozygot und somit Antibiotika- bzw. Basta-
resistent waren.
Infiltrationsmedium: 5% Saccharose (w/v)
400µl/L Silwet L-77 (Detergenz) der Firma Union Carbide Chemicals
3.11 Isolation von Nukleinsäuren aus Arabidopsis thaliana
3.11.1 DNA-Extraktion aus Blättern
Die Isolierung von DNA aus Blättern für die PCR-Analyse erfolgte mittels
Phenol/Chloroform Extraktion.
Das Blattmaterial (1g) wurde zunächst in Stickstoff homogenisiert und in vier
Eppendorfgefäße mit jeweils 700µl Extraktionspuffer überführt, bei
Raumtemperatur gevortext und anschließend auf Eis gestellt. Nach Zugabe von
700µl Phenol/Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) wurde 1min gevortext. Die
Phasentrennung erfolgte durch 3minütige Zentrifugation von 20.817xg bei 4°C.
Die oberen, wässrigen Phasen wurden in neue Eppendorfgefäße überführt, mit
700µl Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) versetzt und 1min gevortext. Die
Phasentrennung erfolgte wiederum durch Zentrifugation (3min, 20.817xg, 4°C).
3 Methoden
40
Die oberen wässrigen Phasen wurden in neue Eppendorfgefäße überführt und mit
1/10 Volumen 3M Natriumacetat und 2 Volumen 100%igem Ethanol versetzt. Die
Präzipitation erfolgte über Nacht bei –20°C.
Am darauffolgenden Tag wurde die DNA abzentrifugiert (10min, 20.817xg, 4°C),
die Pellets in 550µl 1x TE-Puffer gelöst und anschließend in einem
Eppendorfgefäß vereinigt. Nach Zugabe von 5µl RNaseA (10mg/ml) erfolgte eine
einstündige Inkubation bei 37°C. Daran schlossen sich wieder eine Extraktion mit
200µl Phenol/Chloroform und weitere Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktionen an,
bis keine Interphase mehr sichtbar war. Die DNA aus der oberen, wässrigen
Phase wurde mit 1/10 Volumen 3M Natriumacetat und 2 Volumen 100%igem
Ethanol gefällt und anschließend in ca. 30µl TE-Puffer aufgenommen. Die
Aufbewahrung der DNA erfolgte bei –20°C.
DNA-Extraktionspuffer: TE-Puffer: 100mM Tris-HCl pH 8,5 10mM Tris-HCl pH 8,0
100mM NaCl 1mM EDTA pH 8,0
10mM EDTA pH 8,0
2% (w/v) SDS
Natriumacetatlösung: 3M Natriumacetat pH 5,2
3.11.2 RNA-Extraktion
Bei Höheren Pflanzen setzt sich die RNA zu 80-85% aus rRNA, zu 10-15% aus
tRNA und zu 1-4% aus mRNA zusammen.
Die Isolierung der RNA aus Arabidopsis-Pflanzengewebe wurde mit zwei
verschiedenen Methoden durchgeführt. Zunächst mit der Phenol-Chloroform-
Extraktion (nach B. Dietrich, pers. Mitteilung), einer relativ zeitaufwendigen
Methode, die dann später durch die schnellere RNA-Extraktion mit dem
„NucleoSpin® RNA Plant Kit“ (s. 2.5) abgelöst wurde. Diese Methode hatte
allerdings den Nachteil einer geringen RNA-Ausbeute, was aber für die
Umschreibung in cDNA und somit für den Einsatz in eine RT-PCR (s. 3.13) in den
meisten Fällen ausreichte.
3 Methoden
41
3.11.2.1 Phenol-Chloroform Extraktion
Blattmaterial (ca. 500mg) wurde in Stickstoff homogenisiert, in ein Eppendorfgefäß
mit 400µl Extraktionspuffer (denaturiert Proteine mit Hilfe von SDS und inaktiviert
RNasen zusätzlich mit LiCl und EDTA) überführt und gevortext. Nach Zugabe von
400µl Phenol (Tris-gesättigt, pH 8.0) und Vortexen erfolgte die Extraktion mit
400µl Chloroform/Isoamylalkohol (24:1). Die Phasentrennung erfolgte jeweils
durch eine 5minütige Zentrifugation (RT, 15.800xg). Diese Extraktion wurde mit
der oberen wässrigen Phase so lange wiederholt, bis die Interphase frei von
Proteinen war (2-3mal). Nach Zugabe von ¼ Volumen 10M LiCl wurde die RNA
über Nacht bei 4°C präzipitiert.
Am darauffolgenden Tag wurde nach 15minütiger Zentrifugation (4°C, 20.817xg)
das Pellet in 250µl DEPC-Wasser gelöst, mit 25µl Volumen 3M Natriumacetat und
750µl 95%igem Ethanol versetzt und die RNA erneut für 1h bei 4°C gefällt.
Abschließend erfolgte eine Zentrifugation (15min, 4°C, 20.817xg) und die
Aufnahme des Pellets in 20µl DEPC-Wasser.
Die Konzentration der extrahierten RNA wurde photometrisch bestimmt. Die
Aufbewahrung erfolgte bei –20°C.
RNA-Extraktionspuffer: 100mM LiCl
100mM Tris
10mM EDTA
1.0% (w/v) SDS
pH 8.0 (HCl)
DEPC-Wasser: Zur Herstellung RNase-freien Wassers wurde 1L Aqua bidest. mit 100µl DEPC versetzt, über
Nacht gerührt und autoklaviert.
3.11.2.2 RNA Extraktion mit dem NucleoSpin® RNA Plant Kit
Pflanzenmaterial (ca. 100mg) wurde in Stickstoff homogenisiert, in ein
Eppendorfgefäß zu 350µl „RA1-Puffer“ und 3,5µl ß-Mercaptoethanol (inaktiviert
RNasen) gegeben und gevortext. Die Filtration des Lysates erfolgte durch
Überführung auf einen „NucleoSpin® Filter“ und anschließende Zentrifugation für
1min bei 11.200xg. Das Filtrat wurde in einem neuen Eppendorfgefäß mit 350µl
3 Methoden
42
70%igem Ethanol versetzt und gevortext. Die Bindung der RNA an eine Silica-
Membran erfolgte durch Überführung auf ein „NucleoSpin® RNA Plant Column“
und anschließender Zentrifugation für 30s bei 5.900xg. Im nächsten Schritt wurde
die Membran durch Zugabe von 350µl „MDB-Puffer“ entsalzt und dann durch
Zentrifugation für 1min bei 11.200xg getrocknet, um den anschließenden DNaseΙ-
Verdau effektiver zu machen. Entfernt wurde gebundene DNA von der Säule
durch Zugabe von 95µl „DNase Reaction Mix“ (DNaseΙ mit „DNase Reaction
Buffer“ im Verhältnis 1:10) mit anschließender Inkubation für 15min bei
Raumtemperatur. Zur Inaktivierung der DNase folgte ein Waschschritt mit 200µl
„RA2-Puffer“ für 30s bei 5.900xg. Daran schlossen sich zwei weitere
Waschschritte, zum einen mit 600µl „RA3-Puffer“ für 30s bei 5.900xg und zum
anderen zum Trocknen der Membran mit 250µl „RA3-Puffer“ für 2min bei
11.200xg an. Nach Überführung der Säule in ein neues Eppendorfgefäß wurde die
RNA mit 40µl RNase-freiem Wasser eluiert.
Die Konzentration der extrahierten RNA wurde photometrisch bestimmt. Die
Aufbewahrung erfolgte bei –20°C.
3.11.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Die photometrische Konzentrationsbestimmung erfolgte bei einer Wellenlänge von
260nm. Die Adsorption von 1 entsprach einer RNA-Konzentration von 40µg/ml
und einer DNA-Konzentration von 50µg/ml. Die Reinheit der Nukleinsäuren wurde
zusätzlich über den Quotienten aus OD260/OD280 bestimmt. Ein Quotient zwischen
1,7 und 2 ließ auf saubere Nukleinsäuren schließen, während Quotienten unter
1,6 auf Verunreinigungen mit Proteinen hindeuteten.
3.12 Polymerase Chain Reaction (PCR)
Bei der Polymerase Chain Reaction (Saiki et al., 1988) oder Polymerase-
kettenreaktion handelt es sich um ein in vitro-Verfahren zur selektiven
Anreicherung von Nukleinsäure-Bereichen definierter Länge und definierter
Sequenz aus einem Gemisch von Nukleinsäure-Molekülen.
Die Basis der PCR-Reaktion bildet die Synthese neuer DNA an einer vorhandenen
Nukleinsäure-Matrize durch eine thermostabile DNA-Polymerase aus dem
3 Methoden
43
Bakterium Thermus aquaticus (Taq-Polymerase). Als Startmoleküle für die
Synthese werden zwei synthetisch hergestellte Oligonukleotid-Primer eingesetzt.
Die ganze Reaktion setzt sich aus den drei Schritten der Denaturierung, der
Primer-Anlagerung (Annealing) und der Kettenverlängerung (Polymerisation)
zusammen (s. Abb. 7).
Der Denaturierung des DNA-Doppelstrangs durch Erhitzen auf 94°C in
Einzelstrang-DNA schließt sich bei einer Temperatur von ca. 50-60°C (hängt von
der Länge und vom GC-Gehalt der Primer ab) die Hybridisierung der
Oligonukleotid-Primer mit den beiden DNA-Matrizensträngen an. Die Primer
dienen bei einer Temperatur von 72°C der DNA-Polymerase als Startmolekül zur
Vervielfältigung der beiden Matrizenstränge, indem sie die Primer an deren 3`-OH-
Enden mit Hilfe der Reaktion zugesetzten Desoxynukleotidtriphosphaten (dNTP-
Mix) entsprechend dem Matrizenstrang verlängert.
Bei jeder Wiederholung dieser Reaktionsschritte (Zyklus) findet die Verdopplung
der DNA statt, die dann zum Ausgangsmaterial für den nächsten Zyklus wird.
Abb. 7: Prinzip der PCR-Reaktion nach Birkenmeyer & Mushahwar (1991)
3 Methoden
44
Die PCR wurde im Rahmen dieser Arbeit zur Amplifizierung bestimmter DNA-
Fragmente eingesetzt, um diese anschließend zu klonieren. Darüberhinaus
wurden mittels PCR transformierte Bakterienkolonien und transformierte
Arabidopsis-Pflanzen überprüft, ob sie das Transgen enthalten.
Die PCR-Reaktion wurde mit verschiedenen Taq-Polymerasen durchgeführt.
Zunächst wurde die rekombinante Taq-DNA-Polymerase (s. 2.3) verwendet.
Später wurde dann der „RedTaqTM ReadyMixTM PCR Reaction Mix“ (s. 2.5)
eingesetzt, ein verhältnismäßig kostengünstiger Mix mit dem wesentlichen Vorteil
des geringen Pipettieraufwandes, da in dem Ready-Mix bereits alle PCR-
Reaktionskomponenten bis auf das „template“ und die Primer enthalten sind.
Bei Verwendung der rekombinaten Taq-DNA-Polymerase setzte sich der PCR-
Reaktionsansatz wie folgt zusammen:
xµl „template“-DNA
5µl Primer A (10µM)
5µl Primer B (10µM)
1µl dNTP-Mix (10mM)
5µl PCR-Puffer (10x)
3µl MgCl2 (25mM)
0,3µl Taq-Polymerase (5U*µl-1)
ad 50µl mit Aqua bidest.
Bei Verwendung des „RedTaqTM ReadyMixTM PCR Reaction Mix“ sah der PCR-
Reaktionsansatz wie folgt aus:
xµl „template“-DNA
1µl Primer A (10µM)
1µl Primer B (10µM)
25µl Ready-Mix
ad 50µl mit Aqua bidest.
3 Methoden
45
Die Amplifikation der DNA erfolgte mit folgendem PCR-Programm:
Initiale Denaturierung 94°C für 3min
Denaturierung 94°C für 30s
Primerannealing 50-60°C für 30s
Polymerisation 72°C für 2min
35-40 Zyklen
Finale Polymerisation 72°C für 7min
Die PCR-Produkte wurden gelelektrophoretisch analysiert, bei Bedarf aus dem
Gel extrahiert, anschließend kloniert und sequenziert (s. 3.8 u. 3.9).
3.13 RT-PCR
Bei dieser Methode handelt es sich um die Kombination aus reverser Transkription
und PCR. Um die RNA mit Hilfe der PCR zu vervielfältigen, wird diese zunächst in
DNA umgeschrieben (transkribiert). Dazu hybridisiert man einen Primer an die
RNA-Matrize und erstellt mit dem Enzym Reverse Transkriptase (RT), welches
RNA als Substrat nutzt, um sie in DNA umzuschreiben, eine Kopie (cDNA) der
RNA. Diese cDNA wird dann nachfolgend als Matrize in eine PCR eingesetzt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die RT-PCR für Genexpressionsstudien auf der
Stufe der mRNA eingesetzt. Für die Durchführung der RT-PCR wurden zwei
verschiedene Techniken angewandt. In der sogenannten „Zwei-Schritt“ RT-PCR
wird im ersten Schritt die cDNA-Synthese mit Reverser Transkriptase durchgeführt
und anschließend im zweiten Schritt ein Teil dieses cDNA-Syntheseansatzes als
„template“ in eine PCR-Reaktion eingesetzt und mit einer entsprechenden
thermostabilen DNA-Polymerase amplifiziert. Der Vorteil dieser Technik beruht
darauf, dass man aus einem cDNA-Syntheseansatz mehrere PCR-Reaktionen
ansetzen kann, welche bezüglich ihrer DNA-Matrize untereinander konsistent sind.
In der sogenannten „Ein-Schritt“ RT-PCR werden die cDNA-Synthese und PCR
mit einem optimierten Puffer und einem entsprechenden Enzym-Mix zeitlich
nacheinander, aber ohne erneute Zugabe von Reagenzien durchgeführt. Daraus
ergibt sich der Vorteil, dass diese Technik relativ schnell und mit geringerem
Pipettieraufwand durchzuführen ist.
3 Methoden
46
Bei der Anwendung der „Zwei-Schritt“ RT-PCR wurde für die Umschreibung von
mRNA in Minus-Strang-cDNA das „Revert AidTM H Minus First Strand cDNA
Synthesis Kit“ (s. 2.5) eingesetzt. Bestandteil des Kits ist das Enzym „Revert AidTM
H Minus M-MuLV Reverse Transcriptase“, eine gentechnisch veränderte Variante
der Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (MMLV-RT). Dieses
veränderte Enzym besitzt keine RNase H-Aktivität mehr, so dass während der
cDNA-Synthese eine Degradation der RNA-Matrize verhindert wird. Dadurch
produziert diese Enzymvariante größere Mengen an cDNA und mehr cDNAs,
welche die ganze Länge der mRNA abdecken.
Dazu wurden auf Eis 5µg extrahierte RNA (s. 3.11.2) mit 1µl Oligo(dT)18-Primer
versetzt und mit Aqua bidest. auf 12µl aufgefüllt. Nach einer Inkubation von 5min
bei 70°C und anschließendem Abkühlen auf Eis erfolgte die Zugabe von 4µl
Reaktionspuffer, 1µl Ribonuklease-Inhibitor (20U*µl-1) und 2µl dNTP-Mix (10mM).
Danach wurde für 5min bei 37°C inkubiert, zum Ansatz 1µl „Revert AidTM H Minus
M-MuLV Reverse Transcriptase“ (200U*µl-1) pipettiert und für 1h bei 42°C
inkubiert. Die Reaktion wurde durch Erhitzen für 10min auf 70°C abgestoppt,
anschließend auf Eis abgekühlt und bei –20°C aufbewahrt.
Die cDNA wurde sowohl als „template“ in eine PCR (s. 3.12) als auch in eine
quantitative PCR (s. 3.14) eingesetzt.
Die Durchführung der „Ein-Schritt“-RT-PCR erfolgte mit dem „TitanTM One Tube
RT-PCR System“ (s. 2.5). Dieses System verwendet für die cDNA-Erststrang-
Synthese die AMV-RT (aus Avian Myeloblastosis Virus isoliert) und für die PCR-
Reaktion einen „Expand High Fidelity Enzym-Mix“, bestehend aus Taq-DNA-
Polymerase und korrekturlesefähiger Polymerase.
Für die RT-PCR wurden auf Eis zwei Mastermixe in zwei getrennten
Eppendorfgefäßen angesetzt. Der erste Mastermix setzte sich aus 1µl dNTP-Mix
(10mM), 5µl downstream Primer (10µM), 5µl upstream Primer (10µM), 1µl
Ribonuklease-Inhibitor (40U*µl-1), 2,5µl DTT (100mM) und 5µg „template“-RNA
zusammen. Der Mastermix wurde mit DEPC-Wasser auf ein Volumen von 25µl
aufgefüllt. Im zweiten Mastermix wurden 10µl PCR-Puffer (5x) (enthält 1,5mM
MgCl2) und 1µl Enzym-Mix zusammenpipettiert und mit DEPC-Wasser auf ein
Volumen von 25µl aufgefüllt. Die beiden Mastermixe wurden in einem 0,2ml PCR-
Tube vereinigt und die RT-PCR wurde mit folgendem Programm durchgeführt.
3 Methoden
47
Reverse Transkription 50°C für 30min
Initiale Denaturierung 94°C für 2min
Denaturierung 94°C für 30s
Primerannealing 58°C für 30s
Polymerisation 68°C für 1min
14 Zyklen
Denaturierung 94°C für 30s
Primerannealing 58°C für 30s
Polymerisation 68°C für 1min
+5s/Zyklus
25 Zyklen
Finale Polymerisation 68°C für 7min
Die RT-PCR-Produkte wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert, bei
Bedarf aus dem Gel isoliert, kloniert und anschließend sequenziert (s. 3.8 u. 3.9).
3.14 Quantitative RT-PCR
Bei der quantitativen RT-PCR, der sogenannten real-time RT-PCR, wird zunächst
RNA in cDNA umgeschrieben und diese cDNA wird anschließend mittels PCR
quantifiziert. Dazu werden fluoreszierende Farbstoffe, wie z.B. SYBR Green
eingesetzt, um den Verlauf der PCR-Amplifikation zu verfolgen. SYBR Green
bindet nur an Doppelstrang-DNA und fluoresziert bei Anregung mit Licht der
Wellenlänge 530nm im gebundenen Zustand. Nach jedem PCR-Zyklus wird mit
dem verwendeten „ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System“ (s. 2.1) die
Fluoreszenz gemessen, die dabei proportional zu der Menge der
Amplifikationsprodukte ansteigt. Das Prinzip der Quantifizierung beruht darauf,
dass während der exponentiellen Phase der PCR die Produktmenge bei gleichen
Reaktionsbedingungen allein von der eingesetzten „template“-Menge abhängt.
Um die Proben zu quantifizieren, setzt man einen Fluoreszenzschwellenwert fest.
Der Zyklus, bei dem die Fluoreszenz der Probe diesen Schwellenwert
überschreitet, wird bestimmt und als CT-Wert (threshold cycle) festgehalten. Die so
erhaltenen CT-Werte der einzelnen Proben werden dann untereinander verglichen,
wobei Proben mit einer höheren „template“-Ausgangskonzentration den
Schwellenwert früher überschreiten, d.h. einen niedrigeren CT-Wert erreichen als
3 Methoden
48
Proben mit kleineren Mengen an „template“-cDNA. Ein Unterschied des CT-Wertes
von einem Zyklus entspricht dabei einem 2-fachen Mengenunterschied an
eingesetzter „template“-cDNA Konzentration.
Damit verschiedene Proben bezüglich einer bestimmten Target-cDNA quantitativ
miteinander verglichen werden können, müssten exakt gleiche Mengen an
Gesamt-cDNA in die PCR eingesetzt werden. Da dies nicht zu realisieren ist,
verwendet man ein konstitutiv exprimiertes Gen als internen Standard (z.B. Actin).
Dazu lässt man von jeder Probe parallel einen zweiten Ansatz mit Actin-Primern
laufen. Anhand der dabei erhaltenen CT-Werte lassen sich Unterschiede in der
eingesetzten cDNA-Menge erkennen und für die einzelnen Proben rechnerisch
korrigieren.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die quantitative RT-PCR zur Bestimmung der
Expressionsrate von GR1 bzw. der Menge der mRNA von GR1 im Wildtyp und der
Mutante im Vergleich zu verschiedenen transformierten Linien eingesetzt.
Dazu wurde zunächst extrahierte RNA (s. 3.11.2) in Minus-Strang-cDNA mittels
„Revert AidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit“ umgeschrieben (s. 3.13),
welche dann als „template“ in die quantitative PCR eingesetzt wurde.
Die quantitative RT-PCR wurde mit dem „qPCRTM Core Kit for SYBR® Green Ι“ (s.
2.5) durchgeführt.
Der PCR-Reaktionsansatz setzte sich wie folgt zusammen:
2µl PCR-Puffer (10x)
2µl MgCl2 (5mM)
0,8µl dNTP-Mix (200µM)
0,1µl Hot Goldstar enzyme (0,025U*µl-1)
0,2µl Primer A (10µM)
0,2µl Primer B (10µM)
0,61µl SYBR Green in DMSO (1in 66 000)
xµl „template“-cDNA
ad 20µl mit Aqua bidest.
3 Methoden
49
Das Thermoprofil der quantitativen PCR sah wie folgt aus:
Initiale Denaturierung 95°C für 10min
Denaturierung 95°C für 15s
Primerannealing 60°C für 1min
Polymerisation 60°C für 1min
40 Zyklen
Nach den eigentlichen PCR-Zyklen wird vom Gerät noch eine
Schmelzpunktanalyse durchgeführt, wobei ausgehend von 60°C die Ansätze auf
95°C erhitzt werden und dabei kontinuierlich die Fluoreszenz gemessen wird.
Die PCR-Produkte wurden anschließend durch die Schmelzkurven und zusätzlich
mittels Agarose-Gelelektrophorese (s. 3.8.1) analysiert.
3.15 Rapid amplification of cDNA ends (RACE)
Die von Frohman et al. (1988) beschriebene RACE-Methode dient zur
Amplifizierung von 5`- bzw. 3`-Enden bekannter mRNAs, unter der
Voraussetzung, dass spezifische Sequenzinformation für die Konstruktion eines
Primers vorhanden ist. Als zweiter Primer für die PCR-Amplifikation wird ein
Primer mit willkürlicher Nukleotid-Sequenz eingesetzt.
3.15.1 Amplifizierung des 5`-Endes (5`RACE)
Die 5`RACE zur Identifizierung des 5`terminalen Transkriptionsstartes des GR1-
Gens erfolgte mit Hilfe des „5`Race System for Rapid Amplification of cDNA Ends“
(s. 2.5).
Ausgehend von der mRNA wird mit Hilfe eines für das GR1-Gen genspezifischen
Primers (GSP1) durch eine reverse Transkriptase ein cDNA-Erststrang
synthetisiert. Anschließend wird das mRNA-“template“ durch Zugabe eines
RNase-Mixes abgebaut. Überschüssige dNTPs und genspezifischer Primer
müssen vor dem „Tailing“ der cDNA durch Aufreinigung des Erststranges entfernt
werden, da sie ansonsten selbst getailt und somit die anschließende PCR
behindern würden. Die Aufreinigung der cDNA erfolgt durch Bindung an eine
Silica-Membran, wobei die dNTPs, Enzyme und GSP1 durch Zentrifugation und
3 Methoden
50
Salze durch mehrere Waschschritte von der Säule entfernt werden. Die gereinigte
cDNA wird schließlich mit Aqua bidest. eluiert und in die Tailing-Reaktion
eingesetzt. Mit Hilfe einer terminalen Deoxynucleotid Transferase (TdT) wird dann
ein poly-dC-Schwanz an das 3`-Ende der cDNA angehängt. Dieser poly-dC-
Schwanz dient bei der PCR-Amplifizierung der cDNA als komplementäre Sequenz
für einen „Abridged Anchor Primer“. Mit diesem „Abridged Anchor Primer“ und
einem weiteren genspezifischen Primer (GSP2), der stromaufwärts von GSP1
liegt, wird die gewünschte DNA-Sequenz amplifiziert. Um die Spezifität der
Amplifikation zu erhöhen, wird das PCR-Produkt unter Verwendung eines
„Abridged Universal Amplification Primer“ (AUAP) und eines weiteren
genspezifischen Primers GSP3, der stromaufwärts von GSP2 liegt, reamplifiziert,
d.h. als „template“ in eine nested PCR eingesetzt. Das erhaltene PCR-Produkt
wird anschließend kloniert und sequenziert.
Abb. 8: Prinzip der 5`RACE-Methode zur Amplifizierung des 5`-Endes des GR1-Gens
Für die cDNA-Erststrang-Synthese wurde 5µg extrahierte RNA (s. 3.11.2) in einem
Eppendorfgefäß mit 2.5pmol GSP1 (s. 2.8 Primer GR1C) versetzt und mit DEPC-
3 Methoden
51
Wasser auf ein Volumen von 15,5µl aufgefüllt. Zur Denaturierung der RNA wurde
der Ansatz für 10min bei 70°C inkubiert und anschließend für 1min auf Eis
abgekühlt. Einer kurzen Zentrifugation folgte die Zugabe von 2,5µl PCR-Puffer
(10x), 2,5µl MgCl2 (25mM), 1µl dNTP-Mix (10mM) und 2,5µl DTT (0,1M). Die
Komponenten wurden gemischt, kurz anzentrifugiert und für 1min bei 42°C
inkubiert. Die Umschreibung in cDNA erfolgte durch Zugabe von 1µl
„SuperScriptΙΙ Reverse Transcriptase“ (200U*µl-1) und einer Inkubation für 50min
bei 42°C. Die cDNA-Synthese wurde durch Erhitzen der Reaktion auf 70°C für
15min abgestoppt. Einer Zentrifugation von 10-20s folgte die Zugabe von 1µl
RNase-Mix und eine Inkubation von 30min bei 37°C, wobei das mRNA-“template“
abgebaut wurde. Der Ansatz kann bei –20°C gelagert werden.
Die Reinigung der cDNA wurde mit Hilfe eines „GlassMax DNA Isolation Spin
Cartridge“ durchgeführt. Dazu wurde die cDNA-Erststrang-Reaktion mit 120µl
„Binding Solution“ (6M Nal) versetzt, in ein „GlassMax Spin Cartridge“ überführt
und für 20s bei 15.800xg zentrifugiert. Danach wurde die Säule 4mal durch
Zugabe von jeweils 0,4ml kaltem 1x Waschpuffer und jeweils 20sekündiger
Zentrifugation bei 15.800xg gewaschen, gefolgt von zwei Waschschritten mit
jeweils 400µl gekühltem 70%igem Ethanol und einer abschließenden
Zentrifugation von 1min bei 15.800xg. Nach Überführung der Säule in ein neues
Eppendorfgefäß wurde die cDNA durch Zugabe von 50µl Aqua bidest.
(vorgewärmt auf 65°C) und einer Zentrifugation von 15.800xg für 20s eluiert.
Für das Anhängen eines poly-dC-Schwanzes wurde 10µl gereinigte cDNA mit 5µl
„Tailing-Puffer“ (5x) und 2,5µl dCTP (2mM) versetzt und mit DEPC-Wasser auf ein
Volumen von 24µl aufgefüllt. Nach der Inkubation von 2-3min bei 94°C und
Abkühlung des Ansatzes für 1min auf Eis wurde 1µl Terminale Transferase
zugesetzt und für 10min bei 37°C inkubiert. Die Terminale Transferase wurde
durch Erhitzen der Reaktion auf 65°C für 10min inaktiviert.
Für die PCR-Amplifizierung wurden zu 5µl dC-getailter cDNA 5µl PCR-Puffer
(10x), 3µl MgCl2 (25mM), 1µl dNTP-Mix (10mM), 2µl GSP2 (10µM) (s. 2.8 die
5`Race-Methode wurde mit verschiedenen GSP2 durchgeführt Primer 55 u. GR1
D), 2µl „Abridged Anchor Primer“ (10µM) und 0,5µl Taq-DNA-Polymerase (5U*µl-1)
pipettiert. Der Ansatz wurde mit Aqua bidest. auf 50µl aufgefüllt.
3 Methoden
52
Die Amplifikation der cDNA erfolgte mit folgendem PCR-Programm:
Initiale Denaturierung 94°C für 3min
Denaturierung 94°C für 30s
Primerannealing 67°C für 30s Primer 55; 56°C Primer GR1 D
Polymerisation 72°C für 2min
30 Zyklen
Finale Polymerisation 72°C für 5min
Die PCR-Produkte wurden gelelektrophoretisch (s. 3.8.1) analysiert, anschließend
aus dem Gel eluiert (s. 3.8.2) und als „templates“ in eine nested PCR eingesetzt.
Für die nested PCR wurden jeweils 5µl der verdünnten PCR-Produkte mit 5µl
PCR-Puffer (10x), 3µl MgCl2 (25mM), 1µl dNTP-Mix (10mM), 1µl GSP3 (10µM) (s.
2.8; die 5`RACE-Methode wurde mit verschiedenen GSP3 durchgeführt Primer 54,
E21 u. E22), 1µl „Abridged Universal Amplification Primer“ (10µM) und 0,5µl Taq-
DNA-Polymerase (5U*µl-1) versetzt und mit Aqua bidest. auf 50µl aufgefüllt.
Die nested PCR wurde mit dem oben beschriebenen PCR-Programm
durchgeführt. Die Annealingtemperaturen für die eingesetzten GSP3 waren wie
folgt: 64°C für Primer 54, 58°C für Primer E21 und 64°C für E22
Die PCR-Produkte wurden gelelektrophoretisch analysiert, anschließend isoliert
und in den Vektor pGEM® T-Easy (s. 2.9) kloniert. Nach Analyse mittels
Restriktionsverdau (s. 3.8.7) wurde die cDNA von 10 unabhängigen Klonen
sequenziert (s. 3.9).
3.15.2 Amplifizierung des 3`-Endes (3`RACE)
Die 3`RACE-Methode zur Identifizierung des 3`terminalen Transkriptionsendes
des GR1-Gens erfolgte mit Hilfe des „3`Race System for Rapid Amplification of
cDNA Ends“ (s. 2.5).
Ausgehend von der mRNA mit Poly(A) Schwanz wird zunächst mit Hilfe von
reverser Transkriptase und eines „Oligo(dT) Adapter-Primers“ (AP) der cDNA-
Erststrang synthetisiert. Nach der Erststrangsynthese wird das mRNA-“template“
durch Zugabe von RNase H zerstört. Die spezifische cDNA wird dann mittels PCR
amplifiziert, wobei neben einem genspezifischen Primer (GSP) ein „Abridged
Universal Amplifikation Primer“ (AUAP) eingesetzt wird.
3 Methoden
53
Das erhaltene PCR-Produkt wird anschließend kloniert und sequenziert. Auf diese
Weise können unbekannte 3`-mRNA Sequenzen identifiziert werden, die sich
zwischen Exon und Poly(A) Schwanz befinden.
Abb. 9: Prinzip der 3`RACE-Methode zur Amplifizierung des 3`-Endes des GR1-Gens
Bei der praktischen Durchführung der 3`RACE-Methode wurde für die cDNA-
Synthese zunächst 5µg extrahierte RNA (s. 3.11.2) in einem Eppendorfgefäß mit
DEPC-Wasser auf ein Volumen von 11µl aufgefüllt. Nach der Zugabe von 1µl
„Adapter-Primer“ (10µM) wurden die Komponenten gemischt, für 10min bei 70°C
inkubiert und anschließend für 1min auf Eis abgekühlt. Einer kurzen Zentrifugation
folgte die Zugabe von 2µl PCR-Puffer (10x), 2µl MgCl2 (25mM), 1µl dNTP-Mix
(10mM) und 2µl DTT (0,1M). Die Komponenten wurden gemischt, kurz
anzentrifugiert und für 2-5min bei 42°C inkubiert. Die Umschreibung in cDNA
erfolgte durch Zugabe von 1µl „SuperScriptΙΙ Reverse Transcriptase“ (200U*µl-1)
und einer Inkubation für 50min bei 42°C. Beendet wurde die cDNA-Synthese
durch Erhitzen der Reaktion auf 70°C für 15min und anschließendem Abkühlen
auf Eis. Durch Zugabe von 1µl RNase H und einer Inkubation von 20min bei 37°C
wurde das mRNA-“template“ abgebaut.
Für die PCR-Amplifizierung wurden in einem neuen Eppendorfgefäß 2µl cDNA mit
5µl PCR-Puffer (10x), 3µl MgCl2 (25mM), 1µl dNTP-Mix (10mM), 1µl
3 Methoden
54
genspezifischer Primer (10µM) (s. 2.8; die 3`RACE-Methode wurde mit 3
verschiedenen genspezifischen Primern durchgeführt, 31, 32 u. GR1 B), 1µl
„Abridged Universal Amplification Primer“ (10µM) und 0,5µl Taq-DNA-Polymerase
(5U*µl-1) versetzt. Der Ansatz wurde mit Aqua bidest. auf 50µl aufgefüllt und mit
75µl Mineralöl überschichtet.
Die Amplifikation der cDNA erfolgte mit folgendem PCR-Programm:
Initiale Denaturierung 94°C für 3min
Denaturierung 94°C für 15s
Primerannealing 54°C für 30s Primer 31; 62°C Pr. 32; 56°C Pr. GR1 B
Polymerisation 72°C für 1min
30 Zyklen
Finale Polymerisation 72°C für 2min
Die PCR-Produkte wurden gelelektrophoretisch analysiert, anschließend isoliert
und in den Vektor pGEM® T-Easy (s. 2.9) kloniert. Nach Analyse mittels
Restriktionsverdau (s. 3.8.7) wurde die cDNA von 10 unabhängigen Klonen
sequenziert (s. 3.9).
3.16 Genome Walking
Die Methode des Genome Walking zur Identifizierung unbekannter genomischer
DNA Sequenzen der „left-border“ der T-DNA der gr1-Mutante wurde im Rahmen
dieser Arbeit von Frau Kiefer mit dem „Genome WalkerTM Kit“ (s. 2.5)
durchgeführt.
Ausgehend von der extrahierten genomischen DNA der gr1-Mutante wird die DNA
in verschiedene Restriktionsverdaue eingesetzt. Anschließend wird ein Adapter an
die verdaute DNA ligiert und als „template“ in eine PCR-Reaktion eingesetzt. Die
Amplifikation erfolgt mit einem zum Adapter komplementären „Adapter-Primer“
(AP1) und einem genspezifischen Primer (GSP1). Die PCR-Produkte werden
anschließend als „template“ in eine nested PCR eingesetzt, wobei die
Amplifikation mit einem nested „Adapter-Primer“ (AP2) und einem nested
genspezifischen Primer (GSP2) durchgeführt wird. Die nested PCR-Produkte
werden gelelektrophoretisch analysiert und anschließend sequenziert.
3 Methoden
55
Dazu wurde zunächst genomische DNA der gr1-Mutante extrahiert (s. 3.11.1) und
in vier verschiedene Restriktionsverdaue mit den Enzymen EcoRV, HindΙΙΙ, DraΙ
und PvuΙΙ eingesetzt, indem jeweils zu 25µl genomische DNA (0,1µg/µl), 8µl des
entsprechenden Restriktionsenzymes, 10µl Reaktionspuffer und 57µl Aqua bidest.
pipettiert wurde. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 37°C. Anschließend wurde
gelelektrophoretisch überprüft, ob die Restriktionsverdaue vollständig waren.
Daran schloss sich die Aufreinigung der verdauten DNA an, indem zu jeder
Reaktion 95µl Phenol zugesetzt wurde. Nach Vortexen und Phasentrennung
mittels Zentrifugation wurden die oberen wässrigen Phasen in neue
Eppendorfgefäße überführt und jeweils mit 95µl Chloroform versetzt. Der erneuten
Phasentrennung folgte die Zugabe von jeweils 190µl eiskaltem 95%igen Ethanol
zu den oberen wässrigen Phasen, sowie die Zugabe von jeweils 9,5µl NaOAc
(3M, pH 4,5) und 20µg Glycogen. Nach Vortexen und Zentrifugation für 10min bei
15.800xg wurden die Überstande verworfen und die Pellets in 100µl eiskaltem
80%igen Ethanol gewaschen. Der Zentrifugation (5min, 15.800xg) und
anschließender Lufttrocknung der Pellets folgte das Lösen der Pellets in jeweils
20µl TE-Puffer (10/0,1; pH 7,5).
Die verdaute aufgereinigte DNA wurde in die Ligation mit den “GenomeWalker
Adaptoren” eingesetzt, indem zu jeweils 4µl DNA 1,9µl Adapter (25µM), 1,6µl
Ligasepuffer (10x) und 1µl T4-DNA-Ligase (ca. 1Unit) zugesetzt und über Nacht
bei 16°C inkubiert wurde. Nach Abstoppen der Reaktionen durch Erhitzen für 5min
bei 70°C wurde zu jeder Reaktion 72µl TE-Puffer (10/1; pH 7,4) zugegeben. Die
“DNA Libraries” wurden anschließend jeweils als „template“ in die erste PCR
eingesetzt.
Für die erste PCR-Amplifizierung wurden in Eppendorfgefäße jeweils 1µl der „DNA
Libraries“ mit 5µl Tth PCR-Puffer (10x), 2,2µl Mg(OAc)2 (25mM), 1µl dNTP-Mix
(10mM), 1µl GSP1 (10µM) (s. 2.8 Primer E14), 1µl AP1 (10µM) und 1µl
„Advantage Genomic Polymerase Mix“ (50x) versetzt. Der Ansatz wurde mit Aqua
bidest. auf 50µl aufgefüllt und die Amplifikation der DNA erfolgte für die erste PCR
mit folgendem Programm:
3 Methoden
56
7 Zyklen
94°C 25s
72°C 3min
32-37 Zyklen
94°C 25s
67°C 3min
67°C für 7min
Für die nested PCR wurden zu jeweils 1µl der PCR-Produkte 5µl Tth PCR-Puffer
(10x), 2,2µl Mg(OAc)2 (25mM), 1µl dNTP-Mix (10mM), 1µl GSP2 (10µM) (s. 2.8
Primer GR1 3465), 1µl AP2 (10µM) und 1µl „Advantage Genomic Polymerase
Mix“ (50x) versetzt. Der Ansatz wurde mit Aqua bidest. auf 50µl aufgefüllt und die
Amplifikation wurde mit folgendem Programm durchgeführt:
5 Zyklen
94°C 25s
72°C 3min
20-24 Zyklen
94°C 25s
67°C 3min
67°C für 7min
Die nested PCR-Produkte wurden nach der gelelektrophoretischen Analyse
sequenziert (s. 3.9).
3.17 Proteinexpression
Die Proteinexpression der GR1-CDS zum Zwecke der Antikörperherstellung
wurde zunächst im bakteriellen Expressionssystem getestet. Dabei wurde für die
Expression von GR1-CDS in den E. coli Stämmen M15 und SG13009 der
Expressionsvektor pQE60 und in dem E. coli Stamm BL21 der Expressionsvektor
pET-29a(+) eingesetzt (s. 2.9). Da der Nachweis der bakteriellen Expression des
Proteins durch SDS-Gelelektrophorese (s. 3.17.5) mit anschließender Western-
blot Analyse (s. 3.17.6) erfolglos blieb, wurde die Methode der zellfreien
Proteinexpression durchgeführt.
3 Methoden
57
3.17.1 Bakterielle Proteinexpression
Die bakterielle Proteinexpression wurde zunächst mit dem Expressionssystem
„QIAexpress Type ATG Kit“ (s. 2.5) durchgeführt. Der verwendete Expressions-
vektor pQE60 ermöglicht die Expression von Proteinen in E. coli, basierend auf
dem T5-Promotor Transkriptions-Translationssystem. Neben dem Promotor des
Phagen T5 besitzt der Vektor zwei lac-Operatorsequenzen, eine synthetische
Ribosomenbindestelle (RBSΙΙ) und eine multiple cloning site (MCS). Der Vektor
pQE60 erlaubt C-terminale Fusion mit einer für sechs Histidinreste codierende
Sequenz (Hexahistidin-tag).
Die Induktion der Transkription erfolgt durch Zugabe des Induktors IPTG. Damit
die Expression nicht beginnt, bevor die Wirtszellen die logarithmische
Wachstumsphase erreicht haben, besitzen die Wirtsstämme E. coli M15 [pREP4]
und SG13009 [pREP4] das Repressorplasmid pREP4. Dieses Plasmid trägt eine
mutierte Version des lacΙ-Gens aus E. coli und bewirkt, dass große Mengen an
lac-Repressor gebildet werden und die Transkription effizient unterdrückt wird.
Erst durch die Zugabe des Induktors IPTG, der an den lac-Repressor bindet und
diesen inaktiviert, kann die RNA-Polymerase der Wirtszelle mit der Transkription
beginnen. Das doppelte Operator-System des pQE-Vektors ermöglicht in
Verbindung mit den hohen Mengen an lac-Repressor-Protein die stringente
Kontrolle der Transkriptionsrate.
Der verwendete Expressionsvektor pET-29a(+) besitzt neben dem T7-Promotor,
der von der T7 RNA-Polymerase erkannt wird, eine lac-Operatorsequenz, eine
Ribosomenbindestelle, eine multiple cloning site, N-terminal eine S-
tagTM/Thrombin Konfiguration und C-terminal einen Hexahistidin-tag.
Zunächst wurden die jeweiligen kompetenten E. coli-Stämme mit Plasmid-DNA
(GR1-CDS subkloniert in die jeweiligen Vektoren) transformiert (s. 3.8.4).
Überprüft wurden die Bakterienkolonien mittels Plasmidpräparation und
anschließendem Restriktionsverdau (s. 3.8.5-3.8.7). Danach wurde 10ml LB-
Medium mit entsprechenden Antibiotika als Vorkultur mit dem jeweiligen
transformierten E. coli-Stamm angeimpft und über Nacht bei 37°C und 220rpm
geschüttelt. Am nächsten Tag wurden 100ml LB-Medium mit entsprechenden
Antibiotika mit 5ml der Über-Nacht-Kultur inokuliert und bei 37°C und 220rpm
inkubiert, bis eine OD600nm von 0,6 erreicht wurde. Die Induktion der
3 Methoden
58
Proteinexpression erfolgte durch Zugabe von 1mM IPTG. Die Kultur wurde unter
gleichbleibenden Bedingungen bis zu 24h inkubiert. Die Bakterienzellen wurden
anschließend durch Zentrifugation für 20min bei 2.772xg geerntet und bis zur
Analyse im Western-blot (s. 3.17.6) bei –20°C aufbewahrt.
3.17.2 Zellfreie Proteinexpression
Die zellfreie Proteinexpression wurde mit dem „Rapid Translation RTS 500 E. coli
HY Kit“ (s. 2.5) durchgeführt.
Die zellfreie Proteinexpression basiert auf einem gekoppelten in vitro
Transkription-Translationssystem, in dem die DNA sowohl transkribiert als auch
translatiert wird. In diesem System ist durch Zusatz der „template“-DNA und T7
RNA-Polymerase zu von endogener DNA (und RNA) befreitem „E. coli Lysat“,
welches die Ribosomen und vollständige Mischung von tRNAs liefert, die
Transkription und Translation eng gekoppelt in Raum und Zeit. Während die T7
RNA-Polymerase die „template“-DNA transkribiert, starten die Ribosomen mit der
Translation des 5`-Endes der entstehenden mRNA.
Bei der zellfreien Proteinexpression werden während der gekoppelten
Transkription-Translation Aminosäuren, ATP (Adenosintriphosphat) und GTP
(Guanosintriphosphat) verbraucht. Überflüssige Produkte wie anorganische
Pyrophosphate, Nukleotidmono- und diphosphate und andere degradierte
Produkte werden gebildet. Die Akkumulation von hemmenden Komponenten
würde zu einem raschen Ende der Reaktion führen. Dies wird verhindert, indem
Substrate, die für die Aufrechterhaltung der Reaktion erforderlich sind,
kontinuierlich durch die semipermeable Membran in den oberen 1ml
Reaktionsraum angeliefert werden. Zur gleichen Zeit werden potentielle Inhibitoren
verdünnt und diffundieren durch die gleiche Membran in den unteren 10ml
Reaktionsraum des Gefäßes. Die Proteinexpression erfolgt zwischen 4-24h mit
einer Ausbeute von 100-500µg Protein/ 1ml Reaktionvolumen.
3 Methoden
59
Abb. 10: Schematische Darstellung der zellfreien Proteinexpression der Firma Roche
Zunächst wurden die verschiedenen lyophilisierten Komponenten, wie „E. coli
Lysat“, „Reaction Mix“, „Feeding Mix“ und „Energy Mix“ entsprechend den
Angaben im Kit in unterschiedlichen Mengen „Reconstitution Buffer“ gelöst.
Anschließend wurden aus diesen Komponenten zwei „Working Solutions“
hergestellt, indem einerseits die „Feeding Solution“ durch Mischen von 0,5ml
„Energy Mix“ mit 10,5ml „Feeding Mix“ und andererseits die „Reaction Solution“
durch Zugabe von 0,75ml „Reaction Mix“, 50µl „Energy Mix“ und 5-15µg Plasmid-
DNA (GR1-CDS subkloniert in den pET-29a(+)) zu 0,25ml „E. coli Lysat“
hergestellt wurde.
Zuerst wurde 1ml der „Reaction Solution“ in den oberen 1ml Reaktionsraum und
anschließend ca. 10ml der „Feeding Solution“ in den unteren 10ml Reaktionsraum
pipettiert. Das Reaktionsgefäß wurde in das RTS 500 Instrument gestellt und die
Proteinexpression erfolgte innerhalb von 24h bei 180rpm. Am darauffolgenden
Tag wurde aus dem oberen 1ml Reaktionsraum die „Reaction Solution“, welche
das exprimierte Protein enthielt, mit einer Pipette entnommen und bei –20°C
aufbewahrt. Der Nachweis des Proteins erfolgte durch SDS-Gelelektrophorese (s.
3.17.5) mit anschließender Western-blot Analyse (s. 3.17.6).
3.17.3 Proteinextraktion aus Arabidopsis-Blättern
Für den Nachweis der Proteinexpression von GR1 in Arabidopsis bzw. zur
Überprüfung der Spezifität der Peptid-Antikörper (s. 3.17.4) durch SDS-
3 Methoden
60
Gelelektrophorese mit anschließender Western-blot Analyse wurden Proteine aus
Arabidopsis-Blättern extrahiert.
Für die Proteinextraktion wurden 200mg Blattmaterial gemörsert, in ein
Eppendorfgefäß mit 200µl Laemmli-Puffer überführt und gevortext. Nach
5minütigem Kochen in einem Heizblock bei 95°C folgte eine Zentrifugation und die
Überführung des Überstandes in ein neues Eppendorfgefäß. Die Aufbewahrung
der Proteinextrakte erfolgte bei –20°C.
2x Laemmli-Puffer: 2.5ml 0,5M Tris pH 6.8
2.0ml Glycerin
4.0ml 10% (w/v) SDS
0,4ml β-Mercaptoethanol
2mg Bromphenolblau
auf 10ml mit Aqua bidest. auffüllen
3.17.4 Antikörperproduktion
Für die Herstellung von GR1 Peptid-Antikörpern wurden mit Hilfe eines GCG-
Programms antigene Regionen im GR1-Gen ermittelt. Somit wurden zwei Peptid-
Antikörper bestellt, wobei der erste gegen das Peptid (VGSDECRVWTKACSD) im
Exon 1 und der zweite gegen das Peptid (FEKQNAIYPPTTNND) im Exon 5
gerichtet ist. Die dreimalige Immunisierung von vier Kaninchen (jeweils zwei
Kaninchen/Peptid-Antikörper) und die Gewinnung der Antiseren erfolgte durch die
Firma SEQLAB in Göttingen.
3.17.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page)
Die Denaturierung der Proteine für die Elektrophorese erfolgte, wie oben
beschrieben (s. 3.17.2), durch Zugabe von Laemmli-Puffer. Dieser Puffer enthält
das anionische Detergenz SDS (Natriumdodecylsulfat), welches alle nicht-
kovalenten Wechselwirkungen im nativen Protein zerstört. Da das SDS-Anion an
die gestreckte Polypeptidkette bindet, entsteht ein Komplex aus SDS und
denaturiertem Protein, dessen negative Ladung der Masse des Proteins ungefähr
proportional ist. Das im Puffer enthaltene β-Mercaptoethanol bewirkt die Reduktion
3 Methoden
61
möglicher Disulfidbrücken und der damit verbundenen Trennung einzelner
Untereinheiten des Proteins.
Die auf diese Weise denaturierten Proteine wurden durch Elektrophorese im
denaturierenden SDS-Polyacrylamid-Gel (Laemmli, 1970) aufgetrennt, um
anschließend die Expression der Proteine durch Bindung an einen spezifischen
Antikörper in der Western-Analyse nachzuweisen.
Die gelelektrophoretische Auftrennung erfolgte in zwei hintereinandergeschalteten
Gelsystemen, zunächst im großporigen Sammelgel und anschließend im
feinporigen Trenngel. Dadurch, dass beide Gele unterschiedliche pH-Werte und
v.a. Netzdichte aufweisen, wird eine schärfere Bandentrennung im Trenngel
bewirkt. Entscheidend für die Trennung der Proteine nach ihrer Größe ist die
Porengröße bzw. der Vernetzungsgrad des Trenngels. Die Porengröße des Gels
ist abhängig von der Konzentration an Acrylamid und quervernetzendem Agens.
Um Proteine in der Größenordnung um 52kDa (GR1-Protein) bzw. 30kDa (14-3-3
Proteine) im SDS-Gel aufzutrennen, wurden 10%ige bzw. 12%ige Gele gegossen.
Zusammensetzung der Polyacrylmidgele (4 Gele mit einer Dicke von je 1mm)
Trenngel: 10% 12% 30% Acrylamid (29:1) 10,6ml 12,8ml
1.5M Tris-HCl pH 8.8 8ml 8ml
Aqua bidest. 13,4ml 11,2ml
20% SDS 0,16ml 0,16ml
N,N,N`,N´-Tetramethylethylendiamin (TEMED) 40µl 40µl
25% Ammoniumpersulfat (APS) 120µl 120µl
Sammelgel: 5% 30% Acrylamid (29:1) 2,6ml
1.5M Tris-HCl pH 6.8 0,96ml
Aqua bidest. 11,4ml
20% SDS 80µl
TEMED 15µl
25% APS 120µl
3 Methoden
62
Zur Herstellung des Trenngels wurden die angegebenen Mengen an Wasser,
Puffer, Acrylamid und SDS gemischt und anschließend durch Zugabe von TEMED
und APS die Polymerisationsreaktion gestartet. Die Gellösung wurde in die
vorbereiteten Gelkammern gegossen und mit Wasser überschichtet. Nach der
Polymerisation des Trenngels (nach ca. 45min) wurde das Sammelgel hergestellt,
indem zunächst die angegebenen Mengen an Wasser, Puffer, Acrylamid und SDS
gemischt und dann das Wasser oberhalb des Trenngels entfernt wurde. TEMED
und APS wurden zum vorbereiteten Sammelgel gegeben, dann auf das Trenngel
gegossen und der Probenkamm in das noch flüssige Sammelgel eingesetzt. Nach
dem Aushärten des Gels (ca. 45min) wurden die mit Laemmli-Puffer versetzten
und für 5min bei 95°C denaturierten Proben und ein entsprechender
Größenmarker (s. 2.6 Kaleidoscope Marker) in die Geltaschen pipettiert. Die
Elektrophorese erfolgte in einer Vertikalelektrophoresekammer, die nach Einbau
des Gels mit Laufpuffer gefüllt wurde, bei 200V für 75min.
Laufpuffer: 25mM Tris
0,192% Glycin
0,1% SDS
3.17.6 Western-Blotting und Immunodetektion
Beim Western–Blotting werden die durch SDS-Gelelektrophorese aufgetrennten
Proteine über Elektrotransfer auf eine Trägermembran (z.B. Nitrozellulose)
übertragen und für die nachfolgende Immundetektion immobilisiert.
Nach der Immobilisierung des Proteingemisches auf der Membran werden
zunächst die unspezifischen Bindungsstellen der Membran für Proteine durch
Inkubation mit BSA abgesättigt. Danach folgt die Zugabe des ersten, unmarkierten
Antikörpers, der spezifisch gegen das zu detektierende Protein gerichtet ist.
Erkennt der Antikörper das Protein, so wird dieser durch einen zweiten Antikörper,
der spezifisch gegen den ersten Antikörper gerichtet ist, nachgewiesen. Der
zweite Antikörper seinerseits ist mit einem Enzym (z.B. Peroxidase) gekoppelt,
welches mittels enzymatischer Chemilumineszenz nachgewiesen wird.
Chemilumineszenz liegt vor, wenn eine chemische Reaktion zu einem angeregten
Molekül führt, das einen Teil seiner Energie als Photonen abgibt, wenn die
3 Methoden
63
angeregten Elektronen in den Grundzustand zurückkehren. Dazu benutzt man die
durch H2O2 und Peroxidase katalysierte Oxidation von Luminol in einem
alkalischen Medium, wobei das Luminol aus einem angeregten Zustand unter
Aussendung von Licht in den Grundzustand fällt und somit ein Signal auf einem
Film hinterlässt.
Bei der praktischen Durchführung folgte nach Trennung der Proteine durch SDS-
Gelelektrophorese der Transfer der Proteine auf die Nitrocellulose-Membran (s.
2.2) mittels Semi-Dry-Blotting. Zunächst wurde das Gel in Transfer-Puffer
überführt, die Nitrocellulose-Membran sowie 6 Lagen Whatman-Papier/Gel
zurechtgeschnitten und in Transfer-Puffer eingeweicht. Die Blotting-Apparatur
wurde zusammengebaut, indem drei Lagen des Whatman-Papiers auf die Anode
gelegt wurden, darauf die Membran, das Gel, 3 Lagen Whatman-Papier und
zuletzt die Kathode. Anschließend erfolgte das Elektroblotting für 1,5 h bei 0.8
mA/cm2 Gel.
Nach dem Blotting wurden zur Überprüfung des Transfers die Proteine auf der
Membran mit einer Ponceaùlösung gefärbt. Entfärbt wurde die Membran durch
Waschen in TBST-Puffer, um dann die Immunodetektion mit dem entsprechenden
Antikörper zur Detektion der Proteine durchzuführen.
Zunächst wurde die Membran zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen
über Nacht bei 4°C in Blockierungs-Puffer, bestehend aus 10mg BSA/ml TBST,
inkubiert. Es folgten zwei 10minütige Waschschritte in TBST-Puffer. Daran schloss
sich die Inkubation mit dem 1. Antikörper (verdünnt 1/500-1/5.000 in Blockierungs-
Puffer) für 1-2h bei RT an. Anschließend wurde die Membran 4mal für jeweils
10min mit TBST-Puffer gewaschen, um unspezifisch gebundenen und
überschüssigen Antikörper zu entfernen. Nach dem Waschen folgte die Inkubation
mit dem zweiten Antikörper (z.B. Anti-Mouse gekoppelt an Peroxidase, verdünnt
1/5.000-1/100.000 in TBST-Puffer) für 1h bei RT. Es schlossen sich wieder 4
Waschschritte für jeweils 10min in TBST-Puffer an. Durch Inkubation der
Membran für 5min in „Super Signal® West Pico Chemiluminescent Substrate“ (s.
2.5) und anschließendem Auflegen eines Films (für 30s-5min) mit Entwicklung in
der Dunkelkammer erfolgte die Detektion der Proteine.
3 Methoden
64
Transfer-Puffer: TBST-Puffer: 15,6mM Tris 10mM Tris/HCL
120mM Glycin 0,15M NaCL
20% Methanol 500µl Tween
Ponceaùlösung: 0,5g Ponceau S 1ml EtCOOH auf 100ml mit Aqua bidest. auffüllen
3.18 “Yeast-two-hybrid”-System
Das „Two-Hybrid“-System ist eine Hefe-basierende genetische Methode zur
Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen. Dieses in vivo System hat den
Vorteil, dass die Stabilität und die korrekte Faltung der zu untersuchenden
Proteine gewährleistet ist.
Das im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte „Yeast-two-hybrid“-System basiert
darauf, dass der Hefe Transkriptionsaktivator GAL4 aus zwei funktionell
trennbaren Domänen (DNA-Bindungsdomäne und Aktivierungsdomäne) besteht.
Zunächst werden zwei Plasmide benötigt, wobei das erste Plasmid den
Genabschnitt für die Bindungsdomäne (Bindungsplasmid: pGBKT7 s. 2.9) und das
zweite Plasmid den Genabschnitt für die Aktivierungsdomäne
(Aktivierungsplasmid pACT2 bzw. das weiterentwickelte Plasmid pGADT7 s. 2.9)
trägt. Während die DNA für Protein 1 mit der Bindungsdomäne fusioniert wird, wird
die DNA für Protein 2 mit der Aktivierungsdomäne fusioniert. Beide rekombinante
Plasmide werden in Hefezellen kotransformiert und die entsprechenden Proteine
in der Hefezelle gebildet. Wenn die beiden zu untersuchenden Proteine
interagieren, wird die Funktion des Transkriptionsfaktors GAL4 wiederhergestellt.
Der verwendete Hefestamm Y190 weist zwei Reportergene auf (lacZ und HIS3),
die unter Kontrolle eines Promotors stehen, welcher von GAL4 aktiviert wird. Die
Expression des HIS3-Gens ermöglicht das Wachstum der Hefezellen auf
selektivem Medium, welches kein Histidin enthält (s. 3.18.2 Hefetransformation).
Das lacZ-Gen kodiert die ß-Galactosidase, deren Aktivität durch die Bildung von
blauen Kolonien in X-GAL-haltigem Medium nachgewiesen wird (s. 3.18.3 ß-
Galactosidase-Filtertest).
3 Methoden
65
Abb. 11: Prinzip des Yeast-two-hybrid Systems (DNA-BD= DNA-binding domain; DNA-AD=
DNA-activating domain; AUS= upstream activating sequence)
3.18.1 Anzucht des Hefestamms Y190
Die Anzucht des Hefestamms Y190 der Firma Clontech erfolgte in YPD-Medium
bzw. auf YPD-Agarplatten bei 28°C. Für die Anzucht in Flüssigkultur wurde mit
220rpm geschüttelt.
YPD-Medium: 10g/L Hefe-Extrakt
20g/L Trypton
20g/L Glucose
für Platten 20g/L Agar
3 Methoden
66
3.18.2 Hefetransformation
Eine Vorkultur von ca. 5ml YPD-Medium wurde in einem 100ml Erlenmeyerkolben
mit dem Hefestamm Y190 angeimpft und über Nacht bei 28°C geschüttelt. Am
nächsten Morgen wurden 50ml (ausreichend für 10 Transformationen) YPD-
Medium mit der Vorkultur auf eine OD600 von ca. 0,2-0,3 einstellt. Diese Kultur
wurde ca. 3-4h bei 28°C geschüttelt, bis sie die OD600 von ca. 0,6 erreichte. Nach
Überführung der Zellkultur in ein steriles 50ml Falcon-Gefäß folgte eine 5minütige
Zentrifugation bei Raumtemperatur bei 695xg. Anschließend wurden die Zellen
einmal in ca. 30ml sterilem Aqua bidest. gewaschen und wiederum abzentrifugiert
(5min, 695xg, RT). Der Aufnahme der Zellen in 1ml 0,1M Lithiumacetat folgte die
Überführung in ein steriles 1,5ml Eppendorfgefäß und die Zentrifugation für 15s
bei 15.700xg. Zu den Zellen wurden 400µl 0,1M Lithiumacetat gegeben, mit der
Pipette resuspendiert und kurz gevortext. Pro Transformationsansatz wurden 50µl
Zellsuspension in ein Eppendorfgefäß pipettiert, kurz anzentrifugiert und der
Überstand mit einer Pipette entfernt. Zu den Zellen wurden in dieser Reihenfolge
geben:
240µl PEG (50%iges Polyethylene Glycol)
36µl 1M Lithiumacetat
10µl Heringssperm-DNA (10mg/ml)
xµl der zu transformierenden DNA (1µg/Partner)
xµl Aqua bidest.
360µl Gesamtvolumen
Nach 1min kräftigem Vortexen, einer 30minütigen Inkubation bei ca. 28°C mit
Kopf-Über-Rotation, folgte die Zugabe von 36µl DMSO und eine Inkubation von 15
min bei 42°C. Anschließend wurde 15s bei 3.300xg zentrifugiert, der Überstand
mit der Pipette entfernt, die Zellen in 200µl sterilen Aqua bidest. aufgenommen
und jeweils 100µl der kotransformierten Hefezellen auf beide Selektionsplatten
ausgestrichen.
Dabei diente das Ausstreichen der Transformationansätze auf den Platten, welche
kein Leucin (–Leu) und kein Tryptophan (–Trp) enthielten, als Kontrolle, ob die
3 Methoden
67
Kotransformation der Hefezellen erfolgreich war. Hatten die Hefezellen beide
Plasmide aufgenommen, waren sie in der Lage, auf den –Leu–Trp Platten zu
wachsen. Für das Wachstum auf diesen Platten ist eine Proteininteraktion
zwischen den zu untersuchenden Proteinen nicht erforderlich. Dagegen soll das
Ausstreichen der transformierten Hefezellen auf den Platten ohne Leucin, ohne
Tryptophan und ohne Histidin (–Leu–Trp–His) zeigen, ob die Proteine miteinander
interagieren.
Die Platten wurden für 5-7d bei 28°C inkubiert.
DOB-Leu-Trp Selektionsplatten: DOB-Leu-Trp-His Selektionsplatten: 26g/L DOB 26g/L DOB
650mg/L CSM–Leu–Trp 650mg/L CSM–Leu–Trp–His
20g/L Agar 20g/L Agar
auf ca. 55°C abkühlen lassen,
dann 25mM 3-AT (3-Amino 1,2,4 Triazole)
zugeben
Heringssperm-DNA vor Zugabe zum Transformationsansatz 5min im kochenden Wasserbad
denaturieren und sofort in Eiswasser abkühlen.
3.18.3 ß-Galactosidase-Filtertest
Der Filtertest (Blaufärbung) dient dem Nachweis der Expression der ß-
Galactosidase (lacZ Reportergen) und ist neben dem Wachstum von
Transformanten auf –Leu–Trp–His Selektionsplatten der zweite Hinweis auf
spezifische Protein-Protein Interaktion im „Yeast-two-hybrid“-System.
Dazu wurden die Hefetransformanten aus der Primärtransformation (s. 3.18.2) mit
sterilen Impfösen auf neue DOB –Leu–Trp Selektionsplatten ausgestrichen und
bei 28°C heranwachsen gelassen. Danach wurden runde Filter (∅ 90mm) in Z-
Puffer/X-Gal-Lösung eingeweicht. Ein trockener Filter (∅ 70mm) wurde auf die
Platte mit den Kolonien gelegt und auf die Platte gedrückt. Wenn der Filter
gleichmäßig angefeuchtet war, wurde er vorsichtig mit einer Pinzette von der
Platte abgezogen und für ca. 10s in flüssigen Stickstoff getaucht. Nach dem
Auftauen des Filters wurde dieser mit der Seite nach oben, auf der die Kolonien
waren, auf 2-3 Lagen der in Z-Puffer/X-Gal-Lösung getränkten Filter in ein
verschließbares Gefäß gelegt (luftblasenfrei).
3 Methoden
68
Die Filter wurden bei 28°C inkubiert und nach ca. 12h wurde geprüft, welche
Kolonien blau waren.
Z-Puffer pH 7,0: X-Gal-Stocklösung: 100mM Na2HPO4 x 2 H2O 20mg/ml X-Gal in DMF (N,N-dimethylformamide)
Na2HPO4x H2O
10mM KCl
1mM MgSO4 x 7H2O
Z-Puffer/X-Gal-Lösung: 50ml Z-Puffer
135µl ß-Mercaptoethanol
1000µl X-Gal-Stocklösung
3.18.4 Proteinextraktion aus Hefe
Um die Expression der im „Yeast-two-hybrid“-System zu untersuchenden Proteine
zu überprüfen, wurden die Proteine aus den Hefezellen extrahiert, anschließend in
einer SDS-Gelelektrophorese (s. 3.17.5) aufgetrennt, um dann die Expression der
Proteine durch Bindung an einen spezifischen Antikörper in der Western-Analyse
(s. 3.17.6) nachzuweisen.
Zunächst wurden in Über-Nacht-Kulturen jeweils 30ml DOB –Leu bzw. –Trp
Medium mit den transformierten Hefekolonien angeimpft und bei 28°C geschüttelt.
Am darauffolgenden Tag wurden 10 OD Hefezellen bei einer OD von ca. 0,5
geerntet, d.h. jeweils 20ml der Hefekulturen in sterile 50ml Falcon-Gefäße
überführt und abzentrifugiert. Die Pellets wurden in 200µl Laemmli-Puffer
aufgenommen, mit ca. 100µl glass beads versetzt und für 1-2min gevortext.
Anschließend wurden die Proben für 3-5min bei 95°C gekocht, nochmals für 1min
gevortext und bei 15.700xg abzentrifugiert. Die Überstände wurden in neue
Eppendorfgefäße überführt und bei –20°C aufbewahrt. Jeweils 10µl dieser
extrahierten Proteinproben wurden dann in der SDS-Gelelektrophorese
aufgetrennt.
4 Ergebnisse
69
4 Ergebnisse
Die Arabidopsis thaliana Akzession Wassilewskija (Ws-0) ist resistent gegenüber
dem WELA- und NOCO-Isolat von Hyaloperonospora parasitica. Diese
inkompatible Interaktion ist gekennzeichnet durch eine hypersensitive Reaktion (s.
Abb. 12, A) und gelegentlich durch Auftreten von sogenannter „trailing necrosis“
(Mauch-Mani und Slusarenko, 1994). Charakteristisch für die inkompatible
Interaktion ist, dass nach dem Eindringen des Oomyceten mit Ausbildung von
wenigen Haustorien die Zellen an der Infektionsstelle absterben und diesen damit
an der weiteren Ausbreitung hindern (s. Abb. 12, B). Ein Hof aus totem Gewebe
wird um das Pathogen gebildet (Nekrose), so dass mit den Wirtszellen auch der
obligat biotrophe Oomycet stirbt. Die Bildung von Konidiophoren auf der
Blattunterseite kann bei der inkompatiblen Interaktion nicht beobachtet werden (s.
Abb. 12, C).
Abb. 12: Inkompatible Interaktion zwischen der Arabidopsis thaliana Akzession Wassilewskija (Ws-0) und dem WELA-Isolat von Hyaloperonospora parasitica. Mikroskopische Aufnahme der Trypanblau-gefärbten Blätter (s. A und B) und makroskopische Aufnahme (s. C) des WELA-infizierten Ws-Wildtyps.
A und B: Hypersensitive Reaktion, Maßbalken entspricht 100µm
C: keine Konidiophorenbildung auf der Blattunterseite
Die aus einer Population T-DNA-markierter Ws-0 Pflanzen isolierte gr1-Mutante,
zeigt sich anfällig gegenüber dem WELA-Isolat, jedoch resistent gegenüber dem
NOCO-Isolat. Die kompatible Interaktion gegenüber dem WELA-Isolat von
Hyaloperonospora parasitica ist gekennzeichnet durch Ausbildung eines weit
verzweigten Mycels mit zahlreichen Haustorien (s. Abb. 13, A), sowie der Bildung
von Konidiophoren, die aus den Stomata an der Blattunterseite herauswachsen
4 Ergebnisse
70
(Abb. 13, B). Diese sind sieben Tage nach Infektion auch makroskopisch als
weißer Belag auf der Blattunterseite sichtbar (s. Abb. 13, C).
Abb. 13: Kompatible Interaktion zwischen der gr1-Mutante und dem WELA-Isolat von
Hyaloperonospora parasitica. Mikroskopische Aufnahme der Trypanblau-gefärbten Blätter (s. A und B) und makroskopische Aufnahme (s. C) der WELA-infizierten gr1-Mutante.
A: Mycelwachstum (m) mit Haustorienbildung (h), Maßbalken entspricht 100µm
B: einzelne Konidiophore, Maßbalken entspricht 100µm
C: Konidiophoren-Rasen auf der Blattunterseite
Nach Ergebnissen von Segregationsanalysen scheint es wahrscheinlich, dass in
der gr1-Mutante nur eine T-DNA Insertion in dem bisher noch nicht
charakterisierten GR1-Gen vorliegt. Daher darf man vermuten, dass das GR1-Gen
an der rassenspezifischen Resistenz der Akzession Ws-0 gegenüber dem WELA-
Isolat von Hyaloperonospora parasitica beteiligt ist. Im Rahmen dieser Arbeit sollte
das GR1-Gen und die gr1-Mutante näher charakterisiert, sowie die Funktion des
Gens und des Proteins untersucht werden.
4.1 Nachweis der Expression des GR1-Gens mittels RT-PCR
Bei GR1 handelt es sich offensichtlich um ein konstitutiv sehr schwach
exprimiertes Gen, denn der Expressionsnachweis mittels Northern-blot
Hybridisierung gelang erst infolge von Verwundungsinduktion (Kruse, 2001). Das
Vorhandensein von GR1-Transkripten in unbehandelten Ws-Wildtyp Pflanzen
sollte deshalb mittels RT-PCR nachgewiesen werden.
4 Ergebnisse
71
Dazu wurde RNA aus Blättern des Ws-Wildtyps extrahiert (s. 3.11.2) und mit der
Primerkombination GR1B und GR1D (s. 2.8; Abb. 14, oben und Abb. 20) ein
269bp langes Fragment mit Hilfe der „Ein-Schritt“ RT-PCR (s. 3.13) amplifiziert (s.
Abb. 14, unten, Spur 3; Position 3898-4243, Nummerierung bezieht sich auf den
genomischen Klon; Genbank Accession-Nummer AJ010735). Das so erhaltene
PCR-Produkt wurde in den pGEM® T-Easy Vektor (s. 2.9 und Abb. 22) kloniert
und anschließend sequenziert. Anhand der Sequenzanalyse von 5 unabhängigen
Klonen wurde die GR1-Nukleotidsequenz im Bereich von Exon 3 und 4 bestätigt
und somit die Expression des GR1-Gens nachgewiesen.
M NK Ws 1 2 3
Abb. 14: Expressionsnachweis des GR1-Gens mittels RT-PCR. Die obere Abbildung zeigt einen schematischen Überblick über das GR1-Gen mit den 5 Exons und den 4 Introns, wobei die Exons in verschiedenen Farben dargestellt sind: Exon 1 gelb, Exon 2 rot, Exon 3 grün, Exon 4 violett, Exon 5 grau. Die Positionen der verwendeten Primer sind eingezeichnet, beschriftet und die 5` →
3`-Richtung jeweils mit einem Pfeil gekennzeichnet. Dargestellt ist unten die gelelektrophoretische Auftrennung des RT-PCR amplifizierten GR1-Fragmentes mit extrahierter RNA des Ws-Wildtyps als Matrize und der Primerkombination GR1B und GR1D in Spur 3: Exon 3-4, 269bp; Spur 1: M-Marker (Gene RulerTM 1kb DNA Ladder, s. 2.6); Spur 2: NK-Negativkontrolle (ohne Matrize)
- 269bp500bp-
1000bp-
4 Ergebnisse
72
4.2 Charakterisierung des GR1-Gens
Zur näheren Charakterisierung des GR1-Gens sollte der Transkriptionsstart, das
Transkriptionsende sowie typische Promotorelemente und das für den
Translationsstart verantwortliche ATG identifiziert werden.
4.2.1 Identifikation des 5`terminalen Transkriptionsstartes des GR1-Gens und Charakterisierung von Promotorelementen
Zur Identifikation des 5`terminalen Transkriptionsstartes des GR1-Gens, zur
Lokalisierung von typischen Promotorelementen wie „CAAT“- und „TATA“- Boxen
und zur Klärung der Frage, welches der zwei in Frage kommenden ATG`s (s. Abb.
16; Position 1959 oder 2082) als Translationsstart dient, wurde die 5`RACE (s.
3.15.1) eingesetzt.
Analysiert wurden 10 unabhängige cDNA-Klone, welche z.T. am 5`-Ende
unterschiedlich lang waren. Das 5´-Ende der beiden längsten cDNA-Klone befand
sich in Position 1884, das weiterer cDNA-Klone in Position 1887, 1904, 1938,
1941 (s. Abb. 16). Daraus könnte man schlussfolgern, dass das GR1-Gen
verschiedene Transkriptionsstartpunkte besitzt. Die RACE-Methode hat aber den
Nachteil, dass eine Verschiebung des „Abriged Anchor“ Primers bei der
Amplifizierung auftreten kann, wenn cytidinreiche Sequenzen vorhanden sind.
Daraus resultieren dann verkürzte cDNAs, die zu falschen Rückschlüssen
hinsichtlich der Position des Transkriptionsstartes führen. Weiterhin können
Sekundärstrukturen in der mRNA einen Abbruch der Erststrang cDNA-Synthese
verursachen, was ebenso zu einer verkürzten cDNA-Sequenz führt.
Da von allen 10 cDNA-Klonen das 5`-Ende vor der Position 1959 lokalisiert wurde,
dient vermutlich das ATG in Position 1959 als Translationsstart (s. Abb. 16).
Um zu prüfen, ob es sich bei dem in Position 1884 lokalisierten 5`-Ende der
beiden längsten cDNA-Klone um den „tatsächlichen“ Transkriptionsstart handelt,
wurde zunächst RNA aus Blättern des Ws-Wildtyps extrahiert (s. 3.11.2). Diese
wurde dann als Matrize jeweils mit einem „forward upstream“ Primer (s. 2.8; Abb.
15, oben, Primer TS1 und Abb. 20) und einem „forward downstream“ Primer (s.
2.8; Abb. 15, oben, Primer TS2 und Abb. 20) zur Position 1884 jeweils in
Kombination mit dem „reverse“ Primer E21 (s. 2.8; Abb. 15, oben und Abb. 20) in
eine „Ein-Schritt“ RT-PCR (s. 3.13) eingesetzt. Würde es sich bei der Position
4 Ergebnisse
73
1884 um den Transkriptionsstart handeln, hätten bei der RT-PCR nach
gelelektrophoretischer Auftrennung nur bei der Primerkombination TS2 mit E21
(Position 1888-3221) eine Bande auftreten dürfen (s. Abb. 15, Spur 3,
Fragmentlänge 666bp). Dies war aber nicht der Fall, da auch eine schwache
Bande mit der Primerkombination TS1 mit E21 (Position 1859-3221) auftrat (s.
Abb. 15, unten, Spur 2, Fragmentlänge 695bp).
M Ws 1 2 3
Abb. 15: Identifikation des Transkriptionsstartes des GR1-Gens mittels RT-PCR. Die obere Abbildung zeigt einen schematischen Überblick über das GR1-Gen mit den 5 Exons und vier Introns, wobei die Exons in verschiedenen Farben dargestellt sind: Exon 1 gelb, Exon 2 rot, Exon 3 grün, Exon 4 violett, Exon 5 grau. Die
Positionen der verwendeten Primer sind eingezeichnet, beschriftet und die 5` →
3`-Richtung jeweils mit einem Pfeil gekennzeichnet. Dargestellt ist unten die gelelektrophoretische Auftrennung der amplifizierten Fragmente mit extrahierter RNA des Ws-Wildtyps als Matrize und der Primerkombination TS1 mit E21 (Spur 2, 695bp) und der Primerkombination TS2 mit E21 (Spur 3, 665bp); Spur 1: M-Marker (1kb DNA Ladder, s. 2.6)
Der Transkriptionsstart ist vermutlich im Bereich der Position 1841 lokalisiert, da
sich 35bp stromaufwärts eine AT-reiche Sequenz (TAATTAA) befindet, bei der es
sich möglicherweise um eine „TATA“-Box handelt. Eine potentielle „CAAT“-Box,
als zweites regulatorisches Promotorelement, befindet sich 90bp stromaufwärts
von dieser Position (s. Abb. 16).
- 695bp - 666bp
500bp-
1000bp-
4 Ergebnisse
74
1681 AGAGAGAAAGAAAAAAGAGTGGATGAAATAAAATCTAAAGAGGCGTGTCAAGAGTAAACA 1741 AGTCTGAACAATTCTCCGTAGAAAGTGGTGGGTCTCTCCAGCCGTTACGATTCGACATCT 1801 AATTAACCCACGTGCCTAAATTACTCTCTCATATCTCTCTATCTTTACCTCCTTTATACC 1861 CACATGCCCAAATATCCTCTCTCTTCACTCAGCATCCTTTTATAACCAAAACAAACTTTA TS1 → TS2 → 1921 TCTCCCTCTCTCTCTCTCACAGACAAGAACACAAAGTTATGGACAATCTCCGGAAACTTA 1981 ATCTTCTCTCTGTCTCTCTAACCATAATCTTTGTCTCTCTTACCATAGCCACCAACTTAC 2041 CTTTCTTTGAAGTGAAATATCCCAACAACAACCCTTTTGGGATGTTACTACGGCCGACAC 2101 CGATCAAGAACCAATCCTTGGGTCTACCGGCTCATGTCGGGTCAGATGAGTGTCGGGTTT Abb. 16: Ausschnitt aus der Nukleotidsequenz der Promotor-Region und der translatierten
Region des GR1-Gens. Die vermutlichen „CAAT“- und „TATA“-Boxen in der Promotor-Region, die 5`-Enden der sequenzierten cDNA-Klone (jeweils zwei cDNA-Klone/Position), sowie die beiden möglichen Translationsstartpunkte sind unterstrichen und fett gedruckt, der vermutliche Transkriptionsstart ist rot und unterstrichen, die Sequenz des 1. Exons ist gelb unterlegt.
Zur genauen Lokalisation des Transkriptionsstartes würde letztendlich nur die
Methode der Primer Verlängerung (Primer Extension) Aufschluss geben. Da die
Klärung des Problems für unsere weitere Arbeit von untergeordneter Bedeutung
war, wurde auf die Einführung dieser Methode verzichtet.
4.2.2 Identifikation des 3`terminalen Transkriptionsendes des GR1-Gens
Entsprechend zur 5`RACE wurde mit der Methode der 3`RACE (s. 3.15.2) das
3`terminale Transkriptionsende des GR1-Gens identifiziert.
Analysiert wurden 10 unabhängige cDNA-Klone, welche am 3`-Ende z.T.
unterschiedlich lang waren (s. Abb. 17). Die 3`-Enden der meisten cDNA-Klone
befanden sich in AT-reichen Regionen. Ein Polyadenylierungssignal mit der
klassischen Konsensus-Sequenz AATAAA konnte in der Terminationsregion nicht
nachgewiesen werden.
4 Ergebnisse
75
5281 GAAATGAAGAACTCGGATCAGTCCACATTGCTCATTCACCACATTTCATGATCGATGAAG 5341 ATAGTTTACCCGTTGGAGCCGCGGTTCATGCCGCCGTGGCTGAGAGATACTTAAATGATA 5401 AACATTCATAAGAGTAAAAACAATCTCCCCGGCTTTTTTTTGGGTGGTTATATTTCTAGG Stopcodon 5461 CGTTACGGAAATTATATTGTTCTTAATCTATCTTTGCTTGGAAATGTTTGTGAAGAGTAG 5521 TTTTTTTTTTTAAACGTGTAAACCGCATATTGCATATGGTGTATGGATTTTAGCTAAAGA (1) (2) (3) 5581 GGTTAGAGTAAAAGATAGCTAGCGGTACAAAATCTTAGACAACTATTTTCTTGATATCAT (1) (1) 5641 GAAATATTTGGACGTTTGAGTATTTGCTACGAAATTGTATTACCATGTGATTATTAAGGT (2) Abb. 17: Ausschnitt der Nukleotidsequenz der GR1-cDNA vom 3`-Ende.
Das Stopcodon TAA ist unterstrichen. Die 3`-Enden der sequenzierten cDNA-Klone sind unterstrichen und fett gedruckt und die Anzahl der cDNA-Klone/Position ist jeweils mit der entsprechenden Zahl gekennzeichnet, die Sequenz des 5. Exons ist grau unterlegt.
4.3 Charakterisierung der „left“- und „right-border“ der T-DNA Insertionsstelle
Zur näheren Charakterisierung der gr1-Mutante sollte die genaue Position der T-
DNA lokalisiert werden. Dabei sollte geklärt werden, an welcher Position bzw.
Positionen die „left“- und „right-border“ der T-DNA im GR1-Gen inseriert sind.
4.3.1 Charakterisierung der „left-border“ der T-DNA
Zur Lokalisierung und Identifizierung der „left-border“ Sequenzen der T-DNA in der
gr1-Mutante wurde die Methode des „Genome Walking“ (s. 3.16) angewandt.
Anhand der Sequenzanalyse der PCR-Produkte der gr1-Mutante wurde die „left-
border“ der T-DNA an der Position 3802 lokalisiert und zusätzlich wurden 50 GR1-
fremde „in frame“ Nukleotide identifiziert (s. Abb. 18). Da Datenbankabgleiche
nicht auf Arabidopsis Sequenzen schließen lassen, jedoch auch keine Homologien
zu T-DNA Sequenzen bestätigt wurden, könnte es sich um Füll-DNA handeln, die
bei der Reparatur nach T-DNA-Insertion eingebaut wurde. Alternativ könnte es
eventuell auch T-DNA Sequenz sein, die nicht in der Datenbank eingetragen ist,
denn die T-DNA der Feldmann-Linien wurde nicht sequenziert. Obwohl somit die
4 Ergebnisse
76
Herkunft bzw. Identifikation dieser Nukleotide nicht eindeutig geklärt ist, wurde im
Rahmen dieser Arbeit die Bezeichnung „left-border“ Sequenzen verwendet.
Stromabwärts vom ersten Stopcodon in der „left-border“ konnten nur noch drei
Nukleotide zuverlässig identifiziert werden. Darüber hinaus ergaben die
Ergebnisse mehrerer Sequenzierungen keine zuverlässigen Sequenzdaten bzw.
die Sequenzierreaktionen brachen immer relativ schnell ab.
3451 cttttttccccacgttaatcaacggctacgattacaagatctaagtctaaggctttggct 3511 cctatcactgtttttcataacattgttttataacttatttaaaagtggatgagatttcta 3571 aactttatttcttggtgggtcactgtttgttgtgctataatgacaactgatgtgaattaa 3631 tgatttgcttttgaagataagggaaatcatttaatttttattttatttttttggtgtaat 3691 agaggagttatggtctttaggcccatggtttcgttggaccggagatcaaagcaaataaat 3751 tagtcccttttgttgcatgtatgatttttttatagGGAACAGTGGTTCTGTGGACAAATA 2. Intron 3. Exon T-DNA TCCAGACTGACGTTTATGTACGGGTGTTTATATATTGATAGXXXXXXXXXXXXX Stopcodon Abb. 18: Ausschnitt der Nukleotidsequenz der gr1-Mutante vom 2. Intron, 3. Exon und
Übergang in die „left-border“ der T-DNA. Der Beginn vom 3. Exon ist fett gedruckt und grün unterlegt. Die Sequenz der „left-border“ der T-DNA ist fett gedruckt und kursiv. Das in den neuen 50 unbekannten Nukleotiden der T-DNA erste auftretende Stopcodon TGA ist unterstrichen. Da nur noch drei Nukleotide nach dem Stopcodon identifiziert werden konnten, ist die weitere unbekannte Sequenz mit X dargestellt.
4.3.2 Lokalisierung der „right-border“ der T-DNA
Zur Lokalisierung der „right-border“ der T-DNA wurde auf ein 9kb- und 4,3kb-
Fragment genomischer DNA zurückgegriffen. Das 9kb-Fragment wurde mittels
„Plasmid-recovery“ isoliert, enthielt die „right-border“ der T-DNA sowie
angrenzende Sequenzen der genomischen DNA von Ws-0 und wurde zum
Isolieren des Volllängen-GR1-Klons eingesetzt (Rempulska-Bujas, 1996). Dieses
9kb-Fragment wurde von Frau Rempulska-Bujas mittels Restriktionsverdau zu
einem 4,3kb Fragment verkürzt und in den pBluescriptΙΙ SK+ Vektor subkloniert.
Die Plasmid-DNA dieser beiden Fragmente wurde in den E. coli-Stamm DH5α
transformiert (s. 3.8.4) und anschließend durch Mini-Präparation aus den E. coli
isoliert (s. 3.8.6). Fünf unabhängige Klone (3 Klone vom 4,3kb-Fragment und 2
4 Ergebnisse
77
Klone vom 9kb-Fragment) wurden jeweils mit Hilfe der Primer tdna1 und tdna2 (s.
2.8; Abb. 18 und Abb. 20) ansequenziert. Anhand der Sequenzanalysen konnte
die „right-border“ der T-DNA an der Position 3880 lokalisiert werden (s. Abb. 19).
Da die „left-border“ der T-DNA in Position 3802 lokalisiert wurde (s. 4.3.1), liegt
zusätzlich zur T-DNA Insertion offenbar in der gr1-Mutante zwischen Position
3802 und 3880 eine Deletion vor, denn 78bp des GR1-Gens im 3. Exon fehlen. TCCAGAAACCCGCGGCTCAGTGGCTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTCAGTTCCAAACGTA AAACGGCTTGTCCCGCGTCATCGGCGGGGGTCATAACGTGACTCCCTTAATTCTCCGCTC ATGATCAGATTGTCGTTTCCCGCTTCGGTTTAAACTATCAGTGTTTGAACACTGATAACA ← right-border T-DNA 3881 CTTCGCGGTCCATGTGTCCCATATCCATCCAACGGGTGTGATTGGATCAAGAAGTGGTCC 3. Exon 3941 TTTGCTCGCGGGATGTGGAATTTTCCGGGCGGTTATCACTTCGGAAGATAGCCGTGGCGC 4001 CGCTAATCTCCTTCTTGCAGCTTCTTCCGCGGTCATTAGTCTTCAAGGCATTGTATCCCG ← tdna2 4061 TGAAGCTAGTCCTCTTGACTCTCAG ← tdna1 Abb. 19: Ausschnitt der Nukleotidsequenz der gr1-Mutante vom 3. Exon und Übergang in
die „right-border“ der T-DNA. Die Sequenz der „right-border“ der T-DNA ist fett gedruckt und kursiv. Die Sequenz des 3. Exons ist grün unterlegt. Die Positionen der Sequenzierprimer sind unterstrichen und die 5` → 3`-Richtung jeweils mit einem Pfeil gekennzeichnet.
4 Ergebnisse
78
4.4 Zusammenfassender Überblick über die Ergebnisse der Charakterisierung des GR1-Gens und der gr1-Mutante
CAATAACAAA AATCACCGGC AGAGAGAAAG AAAAAAGAGT GGATGAAATA AAATCTAAAG AGGCGTGTCA AGAGTAAACA AGTCTGAACA ATTCTCCGTA
GR1Sil1780 → GAAAGTGGTG GGTCTCTCCA GCCGTTACGA TTCGACATCT AATTAACCCA CGTGCCTAAA TTACTCTCTC ATATCTCTCT ATCTTTACCT CCTTTATACC
TS1 → TS2 → CACATGCCCA AATATCCTCT CTCTTCACTC AGCATCCTTT TATAACCAAA ACAAACTTTA TCTCCCTCTC TCTCTCTCAC AGACAAGAAC ACAAAGTTAT
cv1 → GR1Sil1965 → E13 → GGACAATCTC CGGAAACTTA ATCTTCTCTC TGTCTCTCTA ACCATAATCT TTGTCTCTCT TACCATAGCC ACCAACTTAC CTTTCTTTGA AGTGAAATAT
← GR1Sil2100 / E14 → CCCAACAACA ACCCTTTTGG GATGTTACTA CGGCCGACAC CGATCAAGAA CCAATCCTTG GGTCTACCGG CTCATGTCGG GTCAGATGAG TGTCGGGTTT
← GR1Sil2222 ↓ MluΙ GGACCAAAGC ATGTTCTGAT GAGATTCTTA GGCTGACTTA TCAGCCGGAT AACGTTGCGT GGCTTAAACG CGTTAGGAGG ACGATCCATG AGAACCCGGA
↓ NheΙ GCTAGCGTTT GAGGAGTATG AGACTAGTAG GCTTGTTAGG TCGGAGCTGG ACCGTATGGG TATCATGTAT AGATATCCGT TAGCGAAAAC GGGTATTCGG GCTTGGATCG GATCCGGTGG ACCGCCTTTT GTTGCGGTTC GGGCTGATAT GGACGCACTA CCTATTCAGg taatcacaac aaagaaaagt ttattttttc taaattatat gttttgatgt atttactttt tccttttgca tacatagctt aaaaacctac gtttacaaaa tgtagctcgt agtctaattg ggccgactat attatacgtt acaaaatgtg ggactaggtc catgtgacat aaaaaatatt attcaaaaac acatggtttt cacgtgtgag cacactctga gaaccgcccc tgtttgtact gtatgaaaca gtaagacttt tgtttatgtt tttcttgtta agacttttta gttttgaagt atagttttat gaaagaaaag tcaaaatgat tcagaaataa tgcaaattgt ttatacgtta aatgtacaat attttgtgtt accaattata ttggcacata acaatgctta aactagtttc attatattct ttgttccatg tgaccatgtg aaatgttcta tttttggaaa gattttgtac ttatattggt agttactcac tgacagagag gctagctgtg tcacatgata taccagatat gatgataatg atagattgtg tggttgaggt gatatggttt atacagataa ggcatagaga tttgttagga ttatttttat ttactatatt gacataataa tattagttgt gttaatgcaa aatagGAAGC AGTTGAATGG GAACATATAA GCAAAGTTGC AGGCAAAATG CATGCATGTG GTCATGACGC
← E21 ACATGTGACT ATGCTTCTTG GTGCTGCCCA TATTCTTAAG GCTCGTGAAC ATCTTCTCAA Ggtacttcat caaactctat gctttttata cgagttaaga gttttggtgt tttggcttaa ttttggtttt atgggtttct tttaatattg gttttaggag ttttcttttt tacacaaagt attgtggcct atataaggta tcttcatctt aataaacaaa aaaactccca agaattaacc ttaacttcca agagagacta gggttaagag aaagtttgct tacatatttc cttttttccc
GR1 3465 → cacgttaatc aacggctacg attacaagat ctaagtctaa ggctttggct cctatcactg tttttcataa cattgtttta taacttattt aaaagtggat gagatttcta aactttattt cttggtgggt cactgtttgt tgtgctataa tgacaactga tgtgaattaa tgatttgctt ttgaagataa gggaaatcat ttaattttta ttttattttt ttggtgtaat agaggagtta tggtctttag gcccatggtt tcgttggacc ggagatcaaa gcaaataaat tagtcccttt
↓ left-border T-DNA tgttgcatgt atgatttttt tatagGGAAC AGTGGTTCTG TTATTCCAAC CGGCTGAAGA AGCTGGAAAT GGTGCAAAGA ATATGATCGA AGACGGAGCT
← E32 ↓ right-border T-DNA GR1B → TTGGATGACG TGGAGGCTAT CTTCGCGGTC CATGTGTCCC ATATCCATCC AACGGGTGTG ATTGGATCAA GAAGTGGTCC TTTGCTCGCG GGATGTGGAA
← tdna2 TTTTCCGGGC GGTTATCACT TCGGAAGATA GCCGTGGCGC CGCTAATCTC CTTCTTGCAG CTTCTTCCGC GGTCATTAGT CTTCAAGGCA TTGTATCCCG
← tdna1 TGAAGCTAGT CCTCTTGACT CTCAGgtact tcataaaatc cacaaccaga tatttgaaaa tttatagctt aattctgatt cccattttct cgagttgtag
← GR1D HindΙΙΙ ↓ GTTGTGTCGG TTACTTCATT TGATGGCGGT CATAGTCTCG ATGTGGCGCC GGACACGGTG GTCCTCGGTG GTACTTTCAG AGCTTTTTCT AACTCAAGCT
← GR1C TCTACTACCT CAAGAAACGT ATTCAAGAGg tgcgtaccat agaccataac cacttagatt aggaattttt gtttattgct atttattaaa aagcgggcca aaaccaatga ttaaaaggtt ccaactataa ttctcacatg accaaaccag tccaaaatta gggcccaaaa ttttttagac ccagttatac ttgagagttg tatgcaaacc aaatggacca acccgaacag aactgaaacc taaacagtaa ttactaaact agtacaacat tcatgcttag aagcctaaac aataattact aaacctaaac agtaattact aaactaatac aaaaaaaaat ttataaaata attacagatt ttagtgtgat tgaattaaac ttgaactgaa taaaccaaag cttacaaaaa ttgaatttga atttcatata tatagaaata gatgtagtta taaaatataa cataaatttg tttaattatt gatataatac gtttgaattt attattttgc taaaaccaaa ctaaggtgaa ttacaaataa tgtttataaa gctgatcaaa tgggaaaaag aaaaaaagaa aaacaaattg taaatcgcat ttttcacttc tatctttaac ttggtacgag acggtccgaa aatacattgg ttggacttgg tgcttggtct catcaggttc tatgtcacac acaacaatca caatggacat tacaaatatt ttgtctagct ccactgttat tgcaacacca tattaaaaga tatgcgtctt ttgtaccggc agGTACTCAT GGATCAGGTC
E51 → GGGGTTTTCG GTTGCCAAGC GACAGTGAAC TTCTTTGAGA AGCAGAATGC GATATACCCG CCAACTACGA ACAATGATGC AACATACAAT CACTTGAAGA AAGTCACCAT AGATTTGCTC GGAGATAGCC ATTTCACCTT GGCTCCACAG ATGATGGGAG CCGAAGATTT CGCCTTCTAC TCAGAAATCA TCCCAGCCGC TTTCTACTTC ATTGGCATAA GAAATGAAGA ACTCGGATCA GTCCACATTG CTCATTCACC ACATTTCATG ATCGATGAAG ATAGTTTACC CGTTGGAGCC
← E52 ← ch3 GCGGTTCATG CCGCCGTGGC TGAGAGATAC TTAAATGATA AACATTCATA AGAGTAAAAA CAATCTCCCC GGCTTTTTTT TGGGTGGTTA TATTTCTAGG CGTTACGGAA ATTATATTGT TCTTAATCTA TCTTTGCTTG GAAATGTTTG TGAAGAGTAG TTTTTTTTTT TAAACGTGTA AACCGCATAT TGCATATGGT GTATGGATTT TAGCTAAAGA GGTTAGAGTA AAAGATAGCT AGCGGTACAA AATCTTAGAC AACTATTTTC TTGATATCAT GAAATATTTG GACGTTTGAG TATTTGCTAC GAAATTGTAT TACCATGTGA TTATTAAGGT
4 Ergebnisse
79
Abb. 20: Nukleotidsequenz des GR1-Gens von Position 1661-5700 (Nummerierung bezieht sich auf den genomischen Klon; Genbank Accession-Nummer AJ010735). Die 5 Exons sind mit verschiedenen Farben unterlegt (Exon 1 gelb, 471bp; Exon 2 rot, 126bp; Exon 3 grün, 300bp; Exon 4 violett, 129bp; Exon 5 grau, 366bp; codierende Sequenz (CDS) umfasst insgesamt 1392bp); die 4 Introns sind in Kleinbuchstaben dargestellt; die potentielle „CAAT“- und „TATA“-Box sind in grünen Buchstaben hervorgehoben; der „vermutliche“ Transkriptionsstart ist rot hervorgehoben und unterstrichen; der Translationsstart ist unterstrichen; die verschiedenen Transkriptionsenden sind in violetten Buchstaben hervorgehoben und unterstrichen; die Positionen der „border“ Sequenzen der T-DNA der gr1-Mutante im 3. Exon sind mit Pfeilen gekennzeichnet; die Positionen verschiedener im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Primer sind eingezeichnet, beschriftet und die 5` → 3`-Richtung jeweils mit einem Pfeil gekennzeichnet; Schnittstellen von Restriktionsenzymen für Klonierungen sind beschriftet und mit einem Pfeil gekennzeichnet.
4.5 Synthese der GR1-CDS
Die Synthese der GR1-CDS sollte Transformationsversuchen zur
Komplementierung der gr1-Mutante und für die Proteinexpression zum Zwecke
der Antikörperproduktion dienen.
Die RT-PCR Amplifizierung der 1392bp kodierenden Sequenz (s. Abb. 20 und
Abb. 21) als ein Fragment war nicht durchführbar, deshalb erfolgte die Synthese
des GR1-CDS Klons nach Extraktion der RNA aus Arabidopsis-Blättern (s. 3.11.2)
durch Amplifizierung zweier getrennter Fragmente mittels „Zwei-Schritt“ RT-PCR
(s. 3.13). Das erste Fragment (Position 1959-4277) beinhaltete in Position 1959
eine NcoΙ-Schnittstelle und in Position 4256 eine HindΙΙΙ-Schnittstelle (s. 2.8; Abb.
20, Primerkombination cv1 mit GR1C). Das zweite Fragment (Position 3898-5408)
enthielt in Position 4256 ebenfalls die HindΙΙΙ-Schnittstelle und in Position 5408
eine BglΙΙ-Schnittstelle (s. 2.8 und Abb. 20, Primerkombination GR1B mit ch3; das
Stopcodon wurde bei der Synthese der GR1-CDS weggelassen, da für die
Proteinexpression ein Konstrukt mit einer C-terminalen His-tag Fusion hergestellt
werden sollte, s. 3.17.1 und 4.11.1). Die beiden Fragmente wurden unabhängig
voneinander in den pGEM® T-Easy Vektor kloniert (s. 2.9; Abb. 22 und 23). Das
erste Fragment wurde über die NcoΙ- und HindΙΙΙ-Schnittstelle aus dem pGEM® T-
Easy Vektor herausgeschnitten. Das zweite Fragment wurde über die NcoΙ-
4 Ergebnisse
80
Schnittstelle der „multiple cloning site“ des pGEM® T-Easy Vektors und der
HindΙΙΙ-Schnittstelle des Fragments geöffnet. In diese geöffneten Schnittstellen
wurde das erste Fragment hineinkloniert. Der so erhaltene GR1-CDS Klon (s. Abb.
23) wurde anschließend sequenziert.
Abb. 21: Schematische Darstellung der GR1-CDS mit den 5 Exons in verschiedenen Farben Exon 1 gelb, Exon 2 rot, Exon 3 grün, Exon 4 violett, Exon 5 grau. Die Positionen der verwendeten Primer sind eingezeichnet, beschriftet und die 5` → 3`-Richtung jeweils mit einem Pfeil gekennzeichnet.
Abb. 22: Der pGEM® T-Easy Vektor mit Restriktionskarte der „multiple cloning site“ der
Firma Promega.
4 Ergebnisse
81
Abb. 23: Klonierungsstrategie für die Synthese der CDS des GR1-Gens. Das Plasmid,
welches die CDS enthält, wurde als pGS2 bezeichnet.
4 Ergebnisse
82
4.6 Versuch der Komplementierung des anfälligen Phänotypen der gr1-Mutante
Eine der Möglichkeiten, zu überprüfen, ob das mutierte Gen für den
Hyaloperonospora parasitica-anfälligen Phänotyp der gr1-Mutante verantwortlich
ist, ist die Komplementation, indem Pflanzen der gr1-Mutante mit einem
transgenen Konstrukt, das die Ws-Wildtyp GR1-Sequenz umfasst, transformiert
werden.
Dazu wurden in einer vorangegangenen Arbeit (Kruse, 2001) Pflanzen der gr1-
Mutante mit drei unterschiedlich langen, genomischen Konstrukten (13,3kb, 8kb
und 5,4kb) transformiert, die das GR1-Gen unter der Kontrolle eines etwa 2kb
großen eigenen Promotors und einen unterschiedlich langen 3` Bereich enthielten.
Einige transgene Pflanzen zeigten im Gegensatz zu den Kontrollpflanzen zwar in
Bereichen einzelner Blätter lokal auftretende Resistenzreaktionen, die von
hypersensitiver Reaktion über reduziertes Hyphenwachstum bis zur Ausprägung
von „trailing necrosis“ reichte, aber eine vollständige Komplementation des
anfälligen gr1-Mutanten Phänotyps zum resistenten Wildtyp Phänotypen konnte
nicht beobachtet werden (Kruse, 2001). Deshalb wurden darüber hinaus im
Rahmen der Arbeit von Frau Kruse sense- und antisense-Konstrukte mit der ihr
von mir zur Verfügung gestellten GR1-CDS (s. 4.5), hergestellt. Dabei wurde die
GR1-CDS unter Kontrolle des 35S-Promotors in jeweils einer der beiden
möglichen Orientierungen hinter den Promotor kloniert und in den Agrobakterien-
Stamm GV3101 transformiert. Die Transformation der Pflanzen blieb jedoch ohne
Erfolg, denn die Selektion führte nicht zu transgenen Pflanzen mit
Antibiotikaresistenz.
Im Rahmen meiner Arbeit wurde die Transformation der gr1-Mutante mit den
sense- und antisense-Konstrukten im Agrobakterien-Stamm ASE nochmals
wiederholt. Wegen des Verlustes der Plasmide während der Inkulturnahme des
Stammes blieben auch diese Transformationsversuche erfolglos.
Eine mögliche Erklärung war, dass die GR1-CDS unter Kontrolle des starken 35S-
Promotors zu toxischen Effekten in den Agrobakterien führte. Deshalb wurde zur
Komplementierung des gr1-Mutanten Phänotyps der 35S-Promotor aus dem
sense-Konstrukt entfernt und durch den nativen GR1-Promotor ersetzt.
4 Ergebnisse
83
4.6.1 Herstellung des nativen GR1 Promotor::GR1-CDS Konstruktes
Zur Herstellung des nativen GR1 Promotor::GR1-CDS Konstruktes wurde auf das
bereits vorhandene sense-Konstrukt von Frau Kruse (2001) zurückgegriffen, bei
dem die GR1-CDS in die BamHΙ-Schnittstelle des pCHF1-Vektors (s. 2.9 und
Abb. 24) kloniert wurde. Dieser von Herrn Dr. Fankhauser (Salk Institute, USA)
modifizierte pPZP221 Vektor besitzt neben dem starken konstitutiven „cauliflower
mosaic virus“ Promotor (CaMV 35S) einen Terminator aus der kleinen
Untereinheit der RubisCO.
Aus diesem sense-Konstrukt wurde der 35S-Promotor und ein Teil des 1. Exons
der GR1-CDS durch einen Restriktionsverdau mit den Enzymen EcoRΙ und MluΙ
entfernt. In diese geöffneten Schnittstellen wurde der native GR1-Promotor
(Position 26-1958) und der Teil des 1. Exons der GR1-CDS (Position 1959-2228)
hineinkloniert, welcher zuvor aus dem von Frau Kruse freundlicherweise zur
Verfügung gestellten ClaΙ-Fragment über die EcoRΙ und MluΙ-Schnittstelle
herausgeschnitten wurde (s. Abb. 25). Die Schnittstellen wurden anschließend
durch Sequenzierung überprüft.
Dieses native GR1 Promotor::GR1-CDS Konstrukt wurde in den Agrobacterium
tumefaciens-Stamm GV3101 transformiert (s. 3.10.1), welcher anschließend für
die Blütentransfomation der gr1-Mutante eingesetzt wurde (s. 3.10.3).
Abb. 24: Der pCHF1 Vektor mit Restriktionskarte der „multiple cloning site“.
4 Ergebnisse
84
Abb. 25: Klonierungsstrategie zur Herstellung des nativen GR1 Promotor::GR1-CDS
Konstruktes.
4.6.2 Nachweis der Expression des GR1-Gens in der transformierten gr1-Mutante
Nach Blütentransformation der gr1-Mutante durch Vakuuminfiltration (s. 3.10.3)
mit dem nativen GR1 Promotor::GR1-CDS Konstrukt wurden nach erfolgter
Selektion unter sterilen Bedingungen auf MS-Agarplatten mit einer Gentamycin-
Konzentration von 30µg ml-1 (aktive Substanz) 25 unabhängige Transformanten
(T1) gewonnen. Diese wurden bis zur Samenreife gebracht und das reife Saatgut
dieser T1-Generation wurde, wie oben beschrieben, weiter selektiert. Nach dieser
Selektion wurde mit den drei unabhängigen Linien 6, 10 und 22 weitergearbeitet,
in denen ¾ der Nachkommen überlebt hatten (nach der 2. Mendelschen Regel
sind in der T2-Generation ¼ der Pflanzen für das Transgen homozygot, ½
heterozygot und das verbleibende ¼ ist genetisch nicht verändert und stirbt somit
infolge der Selektion). Jeweils 12 Keimlinge dieser unabhängigen T2-Linien
4 Ergebnisse
85
wurden ebenfalls bis zur Samenreife gebracht und einer letzten Selektion
unterzogen. In dieser T3-Generation fanden sich jedoch keine Linien, in denen alle
Nachkommen überlebten und somit homozygot waren. Dieses Phänomen wurde
einem Gen-Marker Silencing-Effekt zugeschrieben. Daraufhin wurde mit den
Linien 6-1, 10-5 und 22-2 weitergearbeitet, bei denen ca. 90-95% der
Nachkommen überlebt hatten.
Die Überprüfung, ob das künstlich eingeführte GR1-Gen (nativer GR1
Promotor::GR1-CDS) in den transgenen Pflanzen exprimiert wird, erfolgte mit Hilfe
von RT-PCR (s. 3.13). Dazu wurde RNA aus Blättern der drei transgenen Linien 6-
1, 10-5, und 22-2 und für die Kontrollen RNA aus Blättern des Ws-Wildtyps und
der gr1-Mutante extrahiert (s. 3.11.2) und anschließend in eine „Zwei-Schritt“ RT-
PCR (s. 3.13) eingesetzt. Mit der gewählten Primerkombination E13 mit GR1D (s.
2.8; Abb. 26 oben und Abb. 20) konnte in den drei transgenen Linien die
Expression des eingeführten GR1-Gens vom 1. bis zum 4. Exon (Position 2027-
4243) entsprechend der Kontrolle des Ws-Wildtyps nachgewiesen werden (s. Abb.
26, unten, Spuren 2-4 und Spur 6, Fragmentlänge 908bp). In der Kontrolle der
gr1-Mutante dagegen wurde mit dieser Primerkombination gezeigt, dass das 3.
und 4. Exon (Position 3802-4243) nicht exprimiert wurden (s. Abb. 26, unten, Spur
5). Mit der Primerkombination E13 mit Mut80-1 (s. 2.8 und Abb. 26, oben) konnte
nachgewiesen werden, dass in den drei transgenen Linien und in der Kontrolle der
gr1-Mutante das 1. bis 3. Exon bis zur T-DNA Insertion (Position 2027-3801) und
zusätzlich 37 der 50 GR1-fremden „in frame“ Nukleotide der „left-border“ der T-
DNA (s. 4.3.1) exprimiert wurden (s. Abb. 26, unten, Spur 9-12, Fragmentlänge
von 580bp; auf das Zustandekommen der übrigen Banden wird zu einem späteren
Zeitpunkt eingegangen, s. 4.10).
4 Ergebnisse
86
NK 6-1 10-5 22-2 gr1 Ws M NK 6-1 10-5 22-2 gr1 Ws 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Abb. 26: Expressionsnachweis des GR1-Gens in den transgenen Linien 6-1, 10-5 und 22-2 im Vergleich zu den Kontrollen des Ws-Wildtyps und der gr1-Mutante. Die obere Abbildung zeigt einen schematischen Überblick über das GR1-Wildtyp Gen (s. A) mit den 5 Exons und vier Introns und der gr1-Mutante mit der T-DNA Insertion im 3. Exon (s. B), wobei die Exons in verschiedenen Farben dargestellt sind: Exon 1 gelb, Exon 2 rot, Exon 3 grün, Exon 4 violett, Exon 5 grau. Die
Positionen der verwendeten Primer sind eingezeichnet, beschriftet und die 5` →
3`-Richtung jeweils mit einem Pfeil gekennzeichnet. Dargestellt ist in der unteren Abbildung die gelelektrophoretische Auftrennung der amplifizierten PCR-Fragmente, basierend auf cDNA des Ws-Wildtyps (Spur 6, 13), der gr1-Mutante (Spur 5, 12) und den transgenen Linien (Spur 2-4 und 9-11) als Matrize. Die verwendeten Primerkombinationen waren E13 mit GR1D (Spur 1-6) und E13 mit Mut80-1 (Spur 8-13); Spur 1 und 8: NK-Negativkontrollen (ohne Matrize); Spur 7: M-Marker (Gene RulerTM 1kb DNA Ladder, s. 2.6)
4.6.3 Mikroskopische Analyse der WELA-infizierten transformierten gr1-Mutante
Nachdem die Expression des eingeführten GR1-Gens (nativer GR1
Promotor::GR1-CDS) in den transgenen Linien der gr1-Mutante nachgewiesen
werden konnte, wurden von diesen Linien und von den Kontrollen des Ws-
Wildtyps und der gr1-Mutante jeweils ca. 100 Pflanzen mit dem Hyaloperonospora
parasitica WELA-Isolat infiziert (s. 3.5) und 7d nach Infektion makroskopisch bzw.
nach Trypanblau-Färbung auch mikroskopisch untersucht.
Dabei waren alle untersuchten transformierten Linien vollständig suszeptibel und
wiesen im Vergleich zu den Kontrollen dieselbe Anfälligkeit wie die infizierte gr1-
908bp-
- 580bp
4 Ergebnisse
87
Mutante (s. Abb 13, A-C.) auf. Unterm Mikroskop war deutlich Mycelwachstum
und Haustorienbildung zu beobachten (s. Abb. 27, A), sowie die Bildung von
Konidiophoren, die aus den Stomata an der Blattunterseite herauswuchsen (s.
Abb. 27, B). Diese waren auch makroskopisch als weißer Belag auf der
Blattunterseite sichtbar (s. Abb. 27, C). Eine Komplementation des anfälligen gr1-
Mutanten Phänotyps konnte bei den untersuchten Linien also nicht beobachtet
werden.
Abb. 27: Mikroskopische Aufnahmen der Trypanblau-gefärbten Blätter (s. A und B) und makroskopische Aufnahme (s. C) der WELA-infizierten transformierten Linie 22-2.
A: Mycelwachstum (m) mit Haustorienbildung (h), Maßbalken entspricht 100µm
B: einzelne Konidiophore, Maßbalken entspricht 100µm
C: Konidiophoren-Rasen auf der Blattunterseite
4.7 Suche nach unabhängigen gr1 T-DNA-Mutanten
Die Auffindung einer unabhängigen gr1-Mutante würde eine weitere Möglichkeit
bieten, zu untersuchen, ob GR1 an der Resistenz von Ws-0 gegenüber dem
WELA-Isolat beteiligt ist. Mit einer weiteren unabhängigen gr1-Mutante könnte
überprüft werden, ob sich der anfällige Phänotyp der in dieser Arbeit untersuchten
gr1-Mutante gegenüber WELA reproduzieren lässt.
Die Suche nach einer unabhängigen T-DNA-Mutante im GR1-Gen im Ws-0
Hintergrund wurde im Rahmen dieser Arbeit von Frau Kiefer in der Population der
„Arabidopsis Knockout Facility at the University of Wisconsin-Madison“ (Sussman
et al., 2000) durchgeführt.
Dazu wurden PCR Primer gemäß der Anleitung auf der Webseite
www.biotech.wisc.edu/Arabidopsis der Universität von Wisconsin-Madison in
4 Ergebnisse
88
unserem Labor getestet. Nach erfolgreicher Überprüfung wurde ein PCR-Screen
in 41 DNA-Superpools durchgeführt. Diese Pools umfassen insgesamt 72.960
unabhängige BASTA-resistente T-DNA Linien der Arabidopsis thaliana Akzession
Ws-0. Die PCR-Reaktionen wurden gelelektrophoretisch analysiert. Dabei wurden
in zwei Pools mit der Nr. 12 und mit der Nr. 22 zwei unabhängige T-DNA
Insertionen im GR1-Gen identifiziert (s. Abb. 28, Beschriftung der Spuren
entsprechen den Pool-Nummern).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
Abb. 28: Molekulare Identifizierung unabhängiger gr1 T-DNA-Insertionsmutanten. Dargestellt ist die gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Reaktionen der an der University of Wisconsin-Madison durchgeführten PCRs. Positive T-DNA Insertionen im GR1-Gen traten in den Pools mit den Nummern 12 und 22 auf, die fett gedruckt und unterstrichen dargestellt sind; M: Marker-Spur (Gene RulerTM 1kb DNA Ladder, s. 2.6)
Die zwei DNA-Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten, aufgereinigt (s. 3.8.2)
und anschließend sequenziert (s. 3.9). Anhand der Sequenzanalyse der PCR-
Produkte wurde die T-DNA im Pool mit der Nummer 12 im 2. Intron an der
Position 3624 und die T-DNA im Pool mit der Nummer 22 im 2. Intron an der
Position 3730 lokalisiert (s. Abb. 29).
3541 TAACTTATTTAAAAGTGGATGAGATTTCTAAACTTTATTTCTTGGTGGGTCACTGTTTGT 3601 TGTGCTATAATGACAACTGATGTGAATTAATGATTTGCTTTTGAAGATAAGGGAAATCAT ↑ Pool Nr. 12 3661 TTAATTTTTATTTTATTTTTTTGGTGTAATAGAGGAGTTATGGTCTTTAGGCCCATGGTT 3721 TCGTTGGACCGGAGATCAAAGCAAATAAATTAGTCCCTTTTGTTGCATGTATGATTTTTT ↑ Pool Nr. 22 2. Intron 3781 TATAGGGAACAGTGGTTCTGTTATTCCAACCGGCTGAAGAAGCTGGAAATGGTGCAAAGA 3. Exon
3000bp-
4 Ergebnisse
89
3841 ATATGATCGAAGACGGAGCTTTGGATGACGTGGAGGCTATCTTCGCGGTCCATGTGTCCC 3901 ATATCCATCCAACGGGTGTGATTGGATCAAGAAGTGGTCCTTTGCTCGCGGGATGTGGAA 3961 TTTTCCGGGCGGTTATCACTTCGGAAGATAGCCGTGGCGCCGCTAATCTCCTTCTTGCAG 4021 CTTCTTCCGCGGTCATTAGTCTTCAAGGCA Abb. 29: Ausschnitt der Nukleotidsequenz des GR1-Gens vom 2. Intron und 3. Exon.
Der Beginn vom 3. Exon ist fett gedruckt und unterlegt, die Positionen der T-DNAs der gefundenen unabhängigen Mutanten im 2. Intron sind jeweils mit einem Pfeil gekennzeichnet und unterstrichen.
Zur näheren Eingrenzung der Pools mit den positiven T-DNA Insertionen wurde
ein zweiter PCR-Screen mit 9 „DNA Sub-Pools“ durchgeführt. Die PCR-
Reaktionen wurden gelelektrophoretisch analysiert. Die entsprechende Pool-
Nummer mit der T-DNA Insertion an der Position 3730 im 2. Intron wurde der
Universität von Wisconsin-Madison mitgeteilt, worauf uns vierzig Samen in einem
Pool von zehn Pflanzen geschickt wurden.
Um die „gr1-knockout-Mutante“ aus diesem Pool zu isolieren, wurden die Samen
ausgesät, unter Kurztagbedingungen angezogen (s. 3.2), die DNA aus den
Blättern extrahiert (s. 3.11.1) und in eine PCR mit einem GR1-spezifischen Primer
und dem „left-border“ T-DNA Primer JL-202 (s. 2.8) eingesetzt. Nach der
Identifikation der Knockout-Pflanze wurde diese unter Langtagbedingungen zur
Samenreife gebracht und das reife Saatgut zur Erhaltung von homozygoten
Pflanzen einer Selektion auf Erde mit einer Basta-Konzentration von 1ml/L
unterzogen.
Von den homozygoten Pflanzen der unabhängigen gr1-Mutante und den
Kontrollen des Ws-Wildtyps und unserer gr1-Mutante wurden jeweils ca. 100
Pflanzen mit dem Hyaloperonospora parasitica WELA-Isolat infiziert (s. 3.5) und
7d nach Infektion makroskopisch bzw. nach Trypanblau-Färbung auch
mikroskopisch untersucht. Alle Pflanzen der unabhängigen gr1-Mutante waren
resistent und wiesen im Vergleich zu den Kontrollen den gleichen Phänotyp wie
der infizierte Ws-Wildtyp auf (s. Abb. 12, A-C).
Da die WELA-infizierten homozygoten Pflanzen der unabhängigen gr1-Mutante
keinen anfälligen Phänotypen zeigten, wurde von mir mit Hilfe von RT-PCR (s.
3.13) überprüft, ob das 2. Intron mit der inserierten T-DNA normal gespleißt und
somit das GR1-Gen in diesen Pflanzen entsprechend dem Ws-Wildtyp exprimiert
4 Ergebnisse
90
wird. Dazu wurde RNA aus Blättern der homozygoten Pflanzen der unabhängigen
gr1-Mutante und für die Kontrolle RNA aus Blättern des Ws-Wildtyps extrahiert (s.
3.11.2) und anschließend in eine „Ein-Schritt“ RT-PCR (s. 3.13) eingesetzt. Mit der
Primerkombination E14 mit E32 (s. 2.8 und Abb. 30, oben) konnte nachgewiesen
werden, dass in der unabhängigen gr1-Mutante entsprechend der Kontrolle des
Ws-Wildtyps das 1. bis 3. Exon (Position 2085-3880) exprimiert wurde (s. Abb. 30,
unten, Spur 1 und 3, Fragmentlänge von 563bp). Somit wurde offensichtlich in der
unabhängigen Mutante das 2. Intron mit der inserierten T-DNA normal gespleißt
und führte zur Bildung von Wildtyp mRNA. Dies bestätigte sich auch mit der
Primerkombination E51 mit E52 (s. 2.8 und Abb. 30, oben), so dass in der
unabhängigen gr1-Mutante entsprechend der Kontrolle des Ws-Wildtyps das 5.
Exon (Position 5097-5395) exprimiert wurde (s. Abb. 30, unten, Spur 2 und 4,
Fragmentlänge von 298bp).
Mutante Ws M 1 2 3 4
Abb. 30: Expressionsnachweis des GR1-Gens in der unabhängigen gr1-Mutante im Vergleich zur Kontrolle des Ws-Wildtyps.
- 298bp
- 563bp
1000bp-
500bp-
4 Ergebnisse
91
Die obere Abbildung zeigt einen schematischen Überblick über das GR1-Wildtyp Gen (s. A) mit den 5 Exons und vier Introns und der unabhängigen gr1-Mutante mit der T-DNA Insertion im 2. Intron (s. B), wobei die Exons in verschiedenen Farben dargestellt sind: Exon 1 gelb, Exon 2 rot, Exon 3 grün, Exon 4 violett, Exon 5 grau. Die Positionen der verwendeten Primer sind eingezeichnet,
beschriftet und die 5` → 3`-Richtung jeweils mit einem Pfeil gekennzeichnet.
Dargestellt ist unten die gelelektrophoretische Auftrennung der aus cDNA amplifizierten PCR-Fragmente der unabhängigen gr1-Mutante (Spur 1, 2) und des Ws-Wildtyps (Spur 3, 4). Die verwendeten Primerkombinationen waren E14 mit E32 (Spur 1, 3) und E51 mit E52 (Spur 2-4); M: Markerspur (1kb DNA Ladder, s. 2.6)
Aufgrund dieser Ergebnisse konnten mit Hilfe dieser „unabhängigen gr1-Mutante“
keine neuen Erkenntnisse über den Zusammenhang zwischen dem GR1-Gen und
der Resistenz von Ws gegenüber dem WELA-Isolat gewonnen werden.
Da auch bei der zweiten identifizierten unabhängigen gr1-Mutante die T-DNA im
Intron inseriert war (s.o., 2. Intron an der Position 3624), haben wir darauf
verzichtet, uns Samen von dieser Linie schicken zu lassen.
Dennoch wurde die Suche nach einer unabhängigen gr1-Mutante fortgesetzt und
Samen von zwei T-DNA markierten Linien mit Columbia als genetischem
Hintergrund bestellt, die vom Salk Institute zur Verfügung gestellt wurden. Die T-
DNA Insertionen im GR1-Gen dieser beiden Linien wurden im 3. Exon in der Nähe
zur T-DNA Insertion unserer gr1-Mutante lokalisiert.
Die Akzession Columbia ist ebenso wie Ws-0 resistent gegenüber dem WELA-
Isolat. Für die rassenspezifische Resistenz bzw. Pathogenerkennung gegenüber
dem WELA-Isolat ist in Ws das noch nicht klonierte RPP12-Gen auf Chromosom
4, dagegen in Columbia das noch nicht klonierte RPP6-Gen auf Chromosom 1
verantwortlich. Da vermutet wird, dass die Gegenwart von GR1 für RPP12 zur
Auslösung der Resistenzreaktion gegenüber WELA erforderlich sein könnte (s.
1.5), war nicht zu erwarten, dass eine Mutation im GR1-Gen von Columbia zu
einem anfälligen Phänotypen gegenüber dem WELA-Isolat führen würde.
Dies bestätigte sich auch in Infektionsversuchen, nachdem die Samen der beiden
Linien ausgesät, unter Kurztagbedingungen angezogen (s. 3.2), die ca. 3 Wochen
alten Pflanzen, sowie Pflanzen der Kontrollen des Ws-Wildtyps und unserer gr1-
Mutante mit dem Hyaloperonospora parasitica WELA-Isolat infiziert (s. 3.5) und 7d
nach Infektion makroskopisch untersucht wurden. Alle Pflanzen der beiden
4 Ergebnisse
92
unabhängigen gr1-Mutanten Linien waren resistent und wiesen im Vergleich zu
den Kontrollen den gleichen Phänotyp wie der infizierte Ws-Wildtyp auf (s. Abb.
12, C).
Um eingehender den Zusammenhang von GR1 und dem Phänotyp dieser beiden
unabhängigen gr1-Mutanten Linien und ihre Reaktion gegenüber dem WELA-
Isolat zu untersuchen, sollen in einem fortgeführten Projekt diese beiden Linien mit
Ws-0 rückgekreuzt werden, um den genetischen Columbia-Hintergrund zu
eliminieren.
4.8 Gene-Silencing mit RNAi-Konstrukten
Die Geninhibition bzw. -abschaltung (Gene-Silencing) durch Einschleusen von
doppelsträngiger RNA (dsRNA), die komplementär zu spezifischen
Gensequenzen ist und somit die Expression des zugehörigen Gens effektiv
verhindert, hat sich zu einem wichtigen Hilfsmittel in der Genfunktionsanalyse
entwickelt.
Mit Hilfe des Gene-Silencing sollte im Rahmen dieser Arbeit durch Transformation
des Wildtyps Ws-0 mit RNAi-Konstrukten die Expression von GR1 gehemmt bzw.
verhindert werden, um auf diese Weise den anfälligen gr1-Mutanten Phänotyp zu
reproduzieren. Darüber hinaus sollte durch Transformation der gr1-Mutante mit
den RNAi-Konstrukten die Hypothese überprüft werden, ob es sich bei der gr1-
Mutante um eine „gain-of-function“ Mutante handelt (s. 4.9).
4.8.1 Herstellung der RNAi-Konstrukte
Zur Herstellung der RNAi-Konstrukte wurde der pJawohl3-RNAi-Vektor (s. 2.9 und
Abb. 32) verwendet, welcher uns freundlicherweise von Herrn Ülker vom MPIZ in
Köln zur Verfügung gestellt wurde. Auf Anraten von Herrn Ülker erschien es
sinnvoll, verschiedene RNAi-Konstrukte im Rahmen des Silencing bzgl. ihrer
Effektivität zu testen, so dass zwei RNAi-Konstrukte hergestellt wurden.
Für das erste Konstrukt (K1) wurden zwei 332bp lange Fragmente in sense- und
antisense-Orientierung, welche 186bp Promotorsequenz und 146bp 1. Exon
Sequenz (Position 1772-2104) umfasst, mittels PCR amplifiziert. Als Matrize für
die PCR diente das in den Blueskript-Vektor pBS SK+ subklonierte ClaΙ-Fragment
4 Ergebnisse
93
(s. 4.6.1). Für die sense-Orientierung beinhaltete der „forward“ Primer eine XhoΙ-
Schnittstelle und der „reverse“ Primer eine BamHΙ-Schnittstelle (s. 2.8 und Abb.
20, Primerkombination GR1SilXho1780 mit GR1SilBam2100). Für die antisense-
Orientierung beinhaltete der „forward“ Primer eine EcoRΙ-Schnittstelle und der
„reverse“ Primer eine SpeΙ-Schnittstelle (s. 2.8 und Abb. 20, Primerkombination
GR1SilRΙ2100 mit GR1SilSpe1780). Die beiden Fragmente wurden einzeln in den
pGEM® T-Easy Vektor (s. 2.9 und Abb. 33) kloniert und sequenziert. Anschließend
wurde zunächst das sense-Fragment über die XhoΙ- und BamHΙ-Schnittstelle aus
dem pGEM® T-Easy Vektor herausgeschnitten und in die entsprechend geöffneten
Schnittstellen des pJawohl3-RNAi-Vektors (s. Abb. 33) hineinkloniert. In einem
weiteren Klonierungsschritt wurde das antisense-Fragment über die EcoRΙ- und
SpeΙ-Schnittstelle aus dem pGEM® T-Easy Vektor herausgeschnitten und in die
entsprechend geöffneten Schnittstellen des pJawohl3-RNAi-Vektors hineinkloniert
(s. Abb. 33). Die vier Schnittstellen wurden anschließend sequenziert.
Für das zweite Konstrukt (K2) wurde entsprechend der Anleitung der Firma
Qiagen ausschließlich im Bereich der codierenden Sequenz, mit einem GC-Gehalt
von annähernd 50%, dem Beginn der Targetsequenz mit zwei Adenosinen und
unter Vermeidung von Homologien zu anderen Genen der ILL Familie zwei 258bp
lange Fragmente in sense- und antisense-Orientierung (Position 1964-2222)
mittels PCR amplifiziert. Die Angaben zur Matrize, Primer-Schnittstellen (s. 2.8
und Abb. 20, Primerkombination für sense-Fragment GR1SilXho1965 mit
GR1SilBam2222 und für antisense-Fragment GR1SilRΙ2222 mit GR1SilSpe1965),
Klonierungen und Sequenzierungen entsprachen denen des ersten Konstruktes
(s.o. und Abb. 34).
Diese RNAi-Konstrukte wurden in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm
GV3101 transformiert (s. 3.10.1), welcher anschließend für die Blütentrans-
formation des Ws-Wildtyps und der gr1-Mutante eingesetzt wurde (s. 3.10.3).
4 Ergebnisse
94
Abb. 32: Der pJawohl3-RNAi Vektor mit den für die Klonierung wichtigen Restriktions-schnittstellen der „multiple cloning sites“.
Abb. 33: Klonierungsstrategie zur Herstellung des RNAi-Konstruktes 1 (K 1).
4 Ergebnisse
95
Abb. 34: Klonierungsstrategie zur Herstellung des RNAi-Konstruktes 2 (K 2).
4.8.2 Nachweis der RNAi-Konstrukte in den transformierten Pflanzen mittels PCR
Nach Blütentransformation des Ws-Wildtyps durch Vakuuminfiltration (s. 3.10.3)
mit beiden RNAi-Konstrukten wurden nach erfolgter Selektion mit einer Basta-
Konzentration von 1ml/L mit dem 1. Konstrukt 23 unabhängige Transformanten
(T1) und mit dem 2. Konstrukt 14 unabhängige Transformanten (T1) gewonnen.
Diese wurden bis zur Samenreife gebracht und das reife Saatgut dieser T1-
Generation wurde (wie oben beschrieben) weiter selektiert. Nach dieser Selektion
4 Ergebnisse
96
wurde beim 1. Konstrukt mit den drei unabhängigen Linien 2, 5, und 10 und beim
2. Konstrukt mit den drei unabhängigen Linien 21, 28, und 33 weitergearbeitet, in
denen ¾ der Nachkommen überlebt hatten. Jeweils 15 Keimlinge dieser
unabhängigen T2-Linien wurden ebenfalls bis zur Samenreife gebracht und einer
letzten Selektion unterzogen. In dieser T3-Generation wurden beim 1. Konstrukt
mit den Linien 2-4, 5-14 und 10-9 und beim 2. Konstrukt mit den Linien 21-3, 28-7
und 33-2 weitergearbeitet, bei denen alle Nachkommen überlebt hatten und somit
homozygot waren.
Um auszuschließen, dass die Basta-resistenten Pflanzen der selektierten Linien
nur mit der „leeren“ T-DNA des pJawohl3-Vektors transformiert wurden, wurde
genomische DNA aus Blättern der sechs transgenen homozygoten Linien 2-4, 5-
14, 10-9, 21-3, 28-7 und 33-2 und für die Negativkontrolle DNA aus Blättern des
Ws-Wildtyps extrahiert (s. 3.11.1) und anschließend in eine PCR (s. 3.12)
eingesetzt. Mit der gewählten Primerkombination pJawohl3-35SForw mit
pJawohl3-IntronReverse (s. 2.8 und Abb. 35, oben) konnte in den sechs
transgenen Linien das sense-Fragment (s. 4.8.1) nachgewiesen werden (s. Abb.
35, unten; für das 1. Konstrukt Spur 2, 4 und 6, Fragmentlänge 596bp; für das 2.
Konstrukt Spur 8, 10, 12, Fragmentlänge 522bp). Als Positivkontrollen wurde für
die beiden Konstrukte jeweils die Plasmid-DNA mit derselben Primerkombination
in die PCR eingesetzt (s. Abb. 35, unten, für das 1. Konstrukt Spur 16,
Fragmentlänge 596bp; für das 2. Konstrukt Spur 18, Fragmentlänge 522bp). Mit
der Primerkombination GR1SilRΙ2100 bzw. GR1SilRΙ2222 mit pJawohl3PolyA
Reverse (s. 2.8 und Abb. 35, oben) konnte in den sechs transgenen Linien das
antisense-Fragment (s. 4.8.1) nachgewiesen werden (s. Abb. 35, unten, für das 1.
Konstrukt Spur 3, 5 und 7, Fragmentlänge 460bp; für das 2. Konstrukt Spur 9, 11,
13, Fragmentlänge 386bp). Als Positivkontrollen wurde für die beiden Konstrukte
jeweils die Plasmid-DNA mit derselben Primerkombination in die PCR eingesetzt
(s. Abb. 35, unten, für das 1. Konstrukt Spur 17, Fragmentlänge 460bp; für das 2.
Konstrukt Spur 19, Fragmentlänge 386bp).
4 Ergebnisse
97
M 2-4 5-4 10-9 21-3 28-7 33-2 NK PK1 PK2 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Abb. 35: Nachweis der RNAi-Konstrukte in den Linien des 1. Konstruktes 2-4, 5-14, 10-9 und
des 2. Konstruktes 21-3, 28-7 und 33-2. Die obere Abbildung zeigt einen schematischen Überblick über die beiden RNAi-Konstrukte mit den sense- und antisense-Fragmenten. Die Positionen der
verwendeten Primer sind eingezeichnet, beschriftet und die 5` → 3`-Richtung
jeweils mit einem Pfeil gekennzeichnet. Dargestellt ist in der unteren Abbildung die gelelektrophoretische Auftrennung der amplifizierten PCR-Fragmente, basierend auf genomischer DNA der transgenen Linien (Spuren 2-13) als Matrize. Die verwendeten Primerkombinationen waren pJawohl3-35SForw mit pJawohl3-IntronReverse (Spur 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 und
18), GR1SilRΙ2100 mit pJawohl3PolyAReverse (Spur 3, 5, 7 und 17) und
GR1SilRΙ2222 mit pJawohl3PolyA Reverse (Spur 9, 11, 13, 15 und 19); Spur 16-19:
PK1 und PK2-Positivkontrollen (Plasmid-DNA der beiden Konstrukte als Matrize); Spur 14 und 15: NK-Negativkontrollen (genomische DNA des Ws-Wildtyps als Matrize); Spur 1 und 20: M-Marker (Gene RulerTM 1kb DNA Ladder, s. 2.6)
500bp-
750bp-
4 Ergebnisse
98
4.8.3 Untersuchung des Silencing-Effektes bezüglich der GR1-Expression im transformierten Ws-Wildtyp
Nach erfolgreichem Nachweis der RNAi-Konstrukte in den transgenen Ws-Linien
mittels PCR wurde mit Hilfe der quantitativen RT-PCR (qRT-PCR; s. 3.14)
überprüft, ob die Expression von GR1 in den transgenen Pflanzen gehemmt bzw.
verhindert wird.
Dazu wurde RNA aus Blättern der sechs transgenen Linien 2-4, 5-14, 10-9, 21-3,
28-7 und 33-2 und für die Kontrolle RNA aus Blättern des Ws-Wildtyps extrahiert
(s. 3.11.2). Die RNAs (ca. 5µg) wurden anschließend jeweils als Matrize in eine
cDNA-Synthese (s. 3.13) eingesetzt, welche ihrerseits dann als Matrize für die
qRT-PCR dienten. Die mRNA-Menge des GR1-Gens wurde immer relativ zum
Actin2-Gen bestimmt und dargestellt. Anhand der relativen GR1-mRNA-Mengen
der transgenen Linien in Ws-0 im Vergleich zur Kontrolle des Ws-Wildtyps wird
deutlich, dass in den transgenen Linien mit Ausnahme der Linie 21-3 die
Transkriptmengen von GR1 z.T. deutlich verringert werden konnten. Insbesondere
in den Linien 28-7 und 33-2 war im Vergleich zur Kontrolle die Transkriptmenge
von GR1 um ca. 250-500fach reduziert (s. Abb. 36; ein Unterschied des CT-
Wertes von einem Zyklus entspricht einem 2fachen Unterschied der anfänglichen
DNA-Konzentration, so dass hier der Unterschied von 8-9 PCR Zyklen= 29 einer
Reduktion der Transkriptmenge um 250-500fach entspricht). Dieses Ergebnis
konnte bei einem unabhängigen Wiederholungsversuch auf die gleiche Weise
bestätigt werden. So wurde vor allem in diesen beiden transgenen Linien mit Hilfe
des „Gene-Silencing“ die Expression von GR1 deutlich gehemmt.
4 Ergebnisse
99
qRT-PCR von GR1 -Silencing Linien in Ws-0
0,0017
0,0019
0,0021
0,0023
0,0025
0,0027
0,0029
WT 2-4 5-14 10-9 21-3 28-7 33-2
1/(c
t GR
1/ c
t Act
in2
)
Abb. 36: Ergebnis der quantitativen RT-PCR (qRT-PCR) bezüglich des Silencing-Effektes in den transgenen Ws-Linien (2-4, 5-14, 10-9, 21-3, 28-7 und 33-2) im Vergleich zur Kontrolle des Ws-Wildtyps (WT). Die mRNA-Menge des GR1-Gens wurde immer relativ zum Actin2-Gen bestimmt und dargestellt. Die Daten zeigen die Zusammenfassung aus drei unabhängigen Versuchen und die entsprechenden Standardabweichungen.
4.8.4 Mikroskopische Analyse der WELA-infizierten transgenen Linien des Ws-Wildtyps
Nachdem gezeigt werden konnte, dass in zwei transgenen Ws-Linien die
Transkriptmenge von GR1 deutlich reduziert war, wurden von diesen Linien und
von den Kontrollen des Ws-Wildtyps und der gr1-Mutante jeweils ca. 100 Pflanzen
mit dem Hyaloperonospora parasitica WELA-Isolat infiziert (s. 3.5) und 7d nach
Infektion makroskopisch bzw. nach Trypanblau-Färbung auch mikroskopisch
untersucht.
Die untersuchten transgenen Linien waren resistent und wiesen im Vergleich zu
den Kontrollen den gleichen Phänotyp wie der infizierte Ws-Wildtyp auf (s. Abb.
12, A-C). Eine Reproduktion des anfälligen gr1-Mutanten Phänotyps mit Hilfe des
„Gene-Silencing“ konnte in den transgenen Linien nicht beobachtet werden.
4 Ergebnisse
100
4.9 “Gain-of-function” Hypothese
Mit Hilfe von RT-PCR (s. 3.13) konnte gezeigt werden, dass in der gr1-Mutante
das 1. bis 3. Exon bis zur T-DNA Insertion (Position 2027-3801) und zusätzlich die
50 GR1-fremden „in frame“ Nukleotide der „left-border“ der T-DNA (s. 4.3.1)
exprimiert werden (s. 4.6.2, Abb. 26, unten, Spur 12, Fragmentlänge 580bp).
Dies führte zur Überlegung, dass der gr1-Mutanten Phänotyp möglicherweise auf
„gain-of-function“ (Funktionsgewinn) infolge der Eigenschaften des aberranten
Peptids beruhen könnte, indem das aberrante Peptid mit der Funktion von GR1
interferiert.
Zur Überprüfung, ob es sich bei der gr1-Mutante um eine „gain-of-function“
Mutante handelt, wurden zwei unterschiedliche Vorgehensweisen verfolgt.
Einerseits sollte die gr1-Mutante mit den RNAi-Konstrukten (s. 4.8.1) transformiert
werden, um die Expression des verkürzten Gens zu hemmen bzw. zu verhindern.
Falls dieses verkürzte bzw. veränderte Peptid für den anfälligen Phänotypen
verantwortlich ist, könnte mit Hilfe des „Gene-Silencing“ eine Umkehrung zum
resistenten Wildtyp Phänotypen erzielt werden. Andererseits sollte der Wildtyp
Ws-0 mit einem Konstrukt transformiert werden, welches unter Kontrolle des
nativen GR1-Promotors die GR1-CDS Sequenz von Position 1959 bis zur T-DNA-
Insertion an Position 3802 und zusätzlich die GR1-fremden „in frame“ Nukleotide
der „left-border“ der T-DNA umfasst. Wenn das verkürzte bzw. veränderte Peptid
für den Phänotypen verantwortlich ist, sollte bei dieser Vorgehensweise durch
Transformation des Wildtyps Ws-0 eine Anfälligkeit gegenüber dem WELA-Isolat
in den transgenen Linien zu beobachten sein.
4.9.1 Nachweis der RNAi-Konstrukte in der transformierten gr1-Mutante mittels PCR
Nach Blütentransformation der gr1-Mutante durch Vakuuminfiltration (s. 3.10.3)
mit beiden RNAi-Konstrukten (s. 4.8.1) wurden nach erfolgter Selektion mit einer
Basta-Konzentration von 1ml/L mit dem 1. Konstrukt 21 unabhängige
Transformanten (T1) und mit dem 2. Konstrukt 22 unabhängige Transformanten
(T1) gewonnen. Diese wurden bis zur Samenreife gebracht und das reife Saatgut
dieser T1-Generation wurde (wie oben beschrieben) weiter selektiert. Nach dieser
Selektion wurde beim 1. Konstrukt mit den drei unabhängigen Linien 9, 12 und 15
4 Ergebnisse
101
und beim 2. Konstrukt mit den drei unabhängigen Linien 14, 31 und 40
weitergearbeitet, in denen ¾ der Nachkommen überlebt hatten. Jeweils 15
Keimlinge dieser unabhängigen T2-Linien wurden ebenfalls bis zur Samenreife
gebracht und einer letzten Selektion unterzogen. In dieser T3-Generation wurden
beim 1. Konstrukt mit den Linien 9-14, 12-1 und 15-2 und beim 2. Konstrukt mit
den Linien 14-5, 31-4 und 40-6 weitergearbeitet, bei denen alle Nachkommen
überlebt hatten und somit homozygot waren.
Um auszuschließen, dass die Basta-resistenten Pflanzen der selektierten Linien
der gr1-Mutante nur mit der „leeren“ T-DNA des pJawohl3-Vektors transformiert
wurden, wurde genomische DNA aus Blättern der sechs transgenen homozygoten
Linien 9-14, 12-1, 15-2, 14-5, 31-4 und 40-6 und für die Negativkontrolle DNA aus
Blättern der gr1-Mutante extrahiert (s. 3.11.1) und anschließend in eine PCR (s.
3.12) eingesetzt. Mit der gewählten Primerkombination pJawohl3-35SForw mit
pJawohl3-IntronReverse (s. 2.8 und Abb. 37, oben) konnte in den sechs
transgenen Linien das sense-Fragment (s. 4.8.1) nachgewiesen werden (s. Abb.
37, unten, für das 1. Konstrukt Spur 2, 4 und 6, Fragmentlänge 596bp; für das 2.
Konstrukt Spur 8, 10, 12, Fragmentlänge 522bp). Als Positivkontrollen wurde für
die beiden Konstrukte jeweils die Plasmid-DNA mit derselben Primerkombination
in die PCR eingesetzt (s. Abb. 37, unten, für das 1. Konstrukt Spur 16,
Fragmentlänge 596bp; für das 2. Konstrukt Spur 18, Fragmentlänge 522bp). Mit
der Primerkombination GR1SilRΙ2100 bzw. GR1SilRΙ2222 mit pJawohl3PolyA
Reverse (s. 2.8 und Abb. 37, oben) konnte in den sechs transgenen Linien das
antisense-Fragment (s. 4.8.1) nachgewiesen werden (s. Abb. 37, unten, für das 1.
Konstrukt Spur 3, 5 und 7, Fragmentlänge 460bp; für das 2. Konstrukt Spur 9, 11,
13, Fragmentlänge 386bp). Als Positivkontrollen wurde für die beiden Konstrukte
jeweils die Plasmid-DNA mit derselben Primerkombination in die PCR eingesetzt
(s. Abb. 37, unten, für das 1. Konstrukt Spur 17, Fragmentlänge 460bp; für das 2.
Konstrukt Spur 19, Fragmentlänge 386bp).
4 Ergebnisse
102
M 9-14 12-1 15-2 14-5 31-4 40-6 NK PK1 PK2 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Abb. 37: Nachweis der RNAi-Konstrukte in den Linien des 1. Konstruktes 9-14, 12-1, 15-2
und des 2. Konstruktes 14-5, 31-4 und 40-6. Die obere Abbildung zeigt einen schematischen Überblick über die beiden RNAi-Konstrukte mit den sense- und antisense- Fragmenten. Die Positionen der
verwendeten Primer sind eingezeichnet, beschriftet und die 5` → 3`-Richtung
jeweils mit einem Pfeil gekennzeichnet. Dargestellt ist in der unteren Abbildung die gelelektrophoretische Auftrennung der amplifizierten PCR-Fragmente, basierend auf genomischer DNA der transgenen Linien (Spuren 2-13) als Matrize. Die verwendeten Primerkombinationen waren pJawohl3-35SForw mit pJawohl3-IntronReverse (Spur 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 und
18), GR1SilRΙ2100 mit pJawohl3PolyAReverse (Spur 3, 5, 7 und 17) und
GR1SilRΙ2222 mit pJawohl3PolyA Reverse (Spur 9, 11, 13, 15 und 19); Spur 16-19:
PK1 und PK2-Positivkontrollen (Plasmid-DNA der beiden Konstrukte als Matrize); Spur 14 und 15: NK-Negativkontrollen (genomische DNA der gr1-Mutante als Matrize); Spur 1 und 20: M-Marker (Gene RulerTM 1kb DNA Ladder, s. 2.6)
500bp-
750bp-
4 Ergebnisse
103
4.9.2 Untersuchung des „gain-of-function“ Effektes in den Silencing-Linien der transformierten gr1-Mutante
Nach erfolgreichem Nachweis der RNAi-Konstrukte in den transgenen Linien der
gr1-Mutante mittels PCR wurde mit Hilfe der quantitativen RT-PCR (qRT-PCR; s.
3.14) überprüft, ob die Expression des 1. und 2. Exons von GR1 in den
transgenen Pflanzen gehemmt bzw. verhindert wird.
Dazu wurde RNA aus Blättern der sechs transgenen Linien 9-14, 12-1, 15-2, 14-5,
31-4 und 40-6 und für die Kontrolle RNA aus Blättern der gr1-Mutante extrahiert
(s. 3.11.2). Die RNAs (ca. 5µg) wurden anschließend jeweils als Matrize in eine
cDNA-Synthese (s. 3.13) eingesetzt, welche ihrerseits dann als Matrizen für die
qRT-PCR dienten. Die RNA-Menge des GR1-Gens wurde immer relativ zum
Actin2-Gen bestimmt und dargestellt.
Anhand der relativen GR1-mRNA-Mengen der transgenen Linien der gr1-Mutante
im Vergleich zur Kontrolle der gr1-Mutante wird deutlich, dass in den transgenen
Linien die Transkriptmengen des 1. und 2. Exons von GR1 deutlich verringert
werden konnten. Insbesondere in den Linien 9-14, 15-2 und 14-5 war im Vergleich
zur Kontrolle die Transkriptmenge um das 500-1000fache reduziert (s. Abb. 38;
ein Unterschied des CT-Wertes von einem Zyklus entspricht einem 2fachen
Unterschied der anfänglichen DNA-Konzentration, so dass hier der Unterschied
von 9-10 PCR Zyklen= 210 einer Reduktion der Transkriptmenge um 500-1000fach
entspricht). Dieses Ergebnis konnte bei einem unabhängigen Wiederholungs-
versuch auf die gleiche Weise bestätigt werden. So konnte in den transgenen
Linien mit Hilfe des „Gene-Silencing“ die Expression des 1. und 2. Exons von GR1
deutlich gehemmt werden.
4 Ergebnisse
104
qRT-PCR von GR1 -Silencing Linien in der gr1 -Mutante
0,0017
0,0019
0,0021
0,0023
0,0025
0,0027
0,0029
Mut 9-14 12-1 15-2 14-5 31-4 40-6
1/(c
t GR
1/ c
t Act
in2
)
Abb. 38: Ergebnis der quantitativen RT-PCR (qRT-PCR) bezüglich des Silencing-Effektes in den transgenen gr1-Mutanten-Linien (9-14, 12-1, 15-2, 14-5, 31-4 und 40-6) im Vergleich zur Kontrolle der gr1-Mutante (Mut). Die mRNA-Menge des 1. und 2. Exons des GR1-Gens wurde immer relativ zum Actin2-Gen bestimmt und dargestellt. Die Daten zeigen die Zusammenfassung aus drei unabhängigen Versuchen und die entsprechenden Standardabweichungen.
4.9.3 Herstellung des „gain-of-function“-Konstruktes für die Transformation des Ws-Wildtyps
Zur Herstellung des „gain-of-function“-Konstruktes wurde der pCHF1-Vektor (s.
2.9 und 4.6.1) verwendet. Dabei wurde auf das native GR1 Promotor::GR1-CDS-
Konstrukt (s. 4.6.1) zurückgegriffen, aus welchem durch Restriktionsverdau mit
den Enzymen MluΙ und SalΙ der Bereich der GR1-CDS von Position 2228-5408
entfernt wurde.
In einem zweiten Schritt wurde zunächst RNA aus Blättern der gr1-Mutante
extrahiert (s. 3.11.2) und anschließend in eine „Zwei-Schritt“ RT-PCR (s. 3.13)
eingesetzt. Mit der Primerkombination E14 mit Mut80-BglΙΙ (s. 2.8) wurde ein
534bp langes Fragment (Position 2085-3801 und zusätzlich die 50 GR1-fremden
„in frame“ identifizierten Nukleotide der „left-border“ der T-DNA; s. 4.3.1)
amplifiziert. Dieses Fragment, welches in Position 2228 eine MluΙ-Schnittstelle
4 Ergebnisse
105
beinhaltete, wurde in den pGEM® T-Easy Vektor (s. 2.9 und Abb. 39) kloniert und
sequenziert.
Anschließend wurde über die MluΙ- Schnittstelle des Fragmentes und über die
SalΙ-Schnittstelle der „multiple cloning site“ des pGEM® T-Easy Vektors das 391bp
lange Fragment herausgeschnitten (Anzahl der Nukleotide der „multiple cloning
site“ bis zur SalΙ-Schnittstelle sind nicht mitgerechnet). Dieses Fragment wurde in
die geöffnete MluΙ- und SalΙ-Schnittstelle des verkürzten nativen GR1
Promotor::GR1-CDS-Konstruktes hineinkloniert (s. Abb. 39). Die Schnittstellen
wurden anschließend durch Sequenzierung überprüft.
Dieses „gain-of-function“-Konstrukt wurde in den Agrobacterium tumefaciens-
Stamm GV3101 transformiert (s. 3.10.1), welcher anschließend für die Blüten-
transfomation des Ws-Wildtyps eingesetzt wurde (s. 3.10.3).
Abb. 39: Klonierungsstrategie zur Herstellung des „gain-of-function“-Konstruktes.
4 Ergebnisse
106
4.9.4 Nachweis der Expression des aberranten GR1-Gens im transformierten Ws-Wildtyp
Nach Blütentransformation des Ws-Wildtyps durch Vakuuminfiltration (s. 3.10.3)
mit dem „gain-of-function“-Konstrukt (s. 4.9.3) wurden nach erfolgter Selektion
unter sterilen Bedingungen auf MS-Agarplatten mit einer Gentamycin-
Konzentration von 30µg ml-1 20 unabhängige Transformanten (T1) gewonnen.
Diese wurden bis zur Samenreife gebracht und das reife Saatgut dieser T1-
Generation wurde unter sterilen Bedingungen (wie oben beschrieben) weiter
selektiert. Nach dieser Selektion wurde mit den drei unabhängigen Linien 11, 18
und 19 weitergearbeitet, in denen ¾ der Nachkommen überlebt hatten. Jeweils 15
Keimlinge dieser unabhängigen T2-Linien wurden ebenfalls bis zur Samenreife
gebracht und einer letzten Selektion unterzogen. In dieser T3-Generation wurde
mit den Linien 11-8, 18-8 und 19-3 weitergearbeitet, deren Nachkommen
homozygot waren.
Die Überprüfung, ob das künstlich eingeführte aberrante GR1-Gen bis zur T-DNA-
Insertion und zusätzlich die Nukleotide der „left-border“ der T-DNA in den
transgenen Pflanzen exprimiert wird, erfolgte mit Hilfe von RT-PCR (s. 3.13).
Dazu wurde RNA aus Blättern der drei transgenen Linien 11-8, 18-8, 19-3 und für
die Kontrollen RNA aus Blättern des Ws-Wildtyps und der gr1-Mutante extrahiert
(s. 3.11.2) und anschließend in eine „Zwei-Schritt“ RT-PCR (s. 3.13) eingesetzt.
Mit der gewählten Primerkombination E13 mit Mut80-1 (s. 2.8 und Abb. 40, oben)
konnte in den drei transgenen Linien die Expression des eingeführten verkürzten
GR1-Gens vom 1. bis 3. Exon bis zur T-DNA Insertion (Position 2027-3801) und
zusätzlich 37 der 50 GR1-fremden „in frame“ Nukleotide der „left-border“ der T-
DNA (s. 4.3.1) entsprechend der Kontrolle der gr1-Mutante nachgewiesen werden
(s. Abb. 40, unten, Spur 2-4 und Spur 6, Fragmentlänge von 580bp). Mit der
Primerkombination E13 mit GR1D (s. 2.8; Abb. 40, oben und Abb. 20) konnte
nachgewiesen werden, dass in den drei transgenen Linien und in der Kontrolle
des Ws-Wildtyps vom 1. bis zum 4. Exon (Position 2027-4243) exprimiert wurde
(s. Abb. 40, unten, Spur 9-12, Fragmentlänge 908bp). In der Kontrolle der gr1-
Mutante dagegen wurde mit dieser Primerkombination gezeigt, dass das 3. bis 4.
Exon (Position 3802-4243) nicht exprimiert wurde (s. Abb. 40, unten, Spur 13).
4 Ergebnisse
107
NK 11-8 18-8 19-3 Ws gr1 M NK 11-8 18-8 19-3 Ws gr1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Abb. 40: Expressionsnachweis des verkürzten GR1-Gens in den transformierten Linien im
Vergleich zu den Kontrollen des Ws-Wildtyps und der gr1-Mutante. Die obere Abbildung zeigt einen schematischen Überblick über das GR1-Wildtyp Gen (s. A) mit den 5 Exons und vier Introns und der gr1-Mutante mit der T-DNA Insertion im 3. Exon (s. B), wobei die Exons in verschiedenen Farben dargestellt sind: Exon 1 gelb, Exon 2 rot, Exon 3 grün, Exon 4 violett, Exon 5 grau. Die
Positionen der verwendeten Primer sind eingezeichnet, beschriftet und die 5` →
3`-Richtung jeweils mit einem Pfeil gekennzeichnet. Dargestellt ist in der unteren Abbildung die gelelektrophoretische Auftrennung der amplifizierten Fragmente mit extrahierter RNA des Ws-Wildtyps (Spur 5, 12), der gr1-Mutante (Spur 6, 13) und den transgenen Linien (Spur 2-4 und 9-11) als Matrize. Die verwendeten Primerkombinationen waren E13 mit Mut80-1 (Spur 1-6) und E13 mit GR1D (Spur 8-13); Spur 1 und 8: NK-Negativkontrollen (ohne Matrize); Spur 7: M-Marker (Gene RulerTM 1kb DNA Ladder, s. 2.6)
4.9.5 Mikroskopische Analyse der WELA-infizierten gesilencten Linien der gr1-Mutante und der transgenen Ws-Linien
Nachdem gezeigt wurde, dass in einigen transgenen Linien der gr1-Mutante die
Transkriptmengen des 1. und 2. Exons von GR1 deutlich reduziert waren und in
den transgenen Linien des Ws-Wildtyps das aberrante GR1-Gen exprimiert wurde,
580bp-
- 908bp
4 Ergebnisse
108
wurden von diesen transgenen Linien und von den Kontrollen des Ws-Wildtyps
und der gr1-Mutante jeweils ca. 100 Pflanzen mit dem Hyaloperonospora
parasitica WELA-Isolat infiziert (s. 3.5) und 7d nach Infektion makroskopisch bzw.
nach Trypanblau-Färbung auch mikroskopisch untersucht.
Die untersuchten transgenen Linien der gr1-Mutante waren alle vollständig
suszeptibel und wiesen im Vergleich zu den Kontrollen dieselbe Anfälligkeit wie
die infizierte gr1-Mutante (s. Abb. 13, A-C) auf. Ein „gain-of-function“ Effekt mit
Umkehrung zum resistenten Ws-Wildtyp Phänotyp mit Hilfe des „Gene-Silencing“
konnte bei den untersuchten transgenen Linien der gr1-Mutante nicht beobachtet
werden.
Alle untersuchten transgenen Linien des Ws-Wildtyps waren resistent und wiesen
im Vergleich zu den Kontrollen den gleichen Phänotyp wie der infizierte Ws-
Wildtyp auf (s. Abb. 12, A-C). Ein „gain-of-function“ Effekt und somit eine
Reproduktion des anfälligen gr1-Mutanten Phänotyps konnte in den transgenen
Linien des Ws-Wildtyps nicht beobachtet werden.
4.10 Untersuchung der Transkripte der gr1-Mutante
Bei genauer Betrachtung des Fotos der gelelektrophoretischen Auftrennung der
amplifizierten Fragmente beim Expressionsnachweis des künstlich in Ws-0
eingeführten aberranten GR1-Gens (s. 4.9.4, Abb. 40, unten) fiel mir auf, dass mit
der verwendeten Primerkombination E13 mit Mut80-1 (s. 2.8 und Abb. 40, oben)
bei den transgenen Ws-Linien nur eine spezifische Bande mit Hilfe der RT-PCR
auftrat. Bei der Kontrolle der gr1-Mutante dagegen traten mehrere Banden auf,
was ich bis dahin unspezifischen Bindungsreaktionen der Primer zugeschrieben
hatte. Mehrere Banden waren mit dieser Primerkombination auch schon bei der
gelelektrophoretischen Auftrennung der amplifizierten Fragmente beim
Expressionsnachweis des GR1-Gens in den Komplemenierungsversuchen der
transgenen gr1-Mutanten Linien und in der Kontrolle der gr1-Mutante aufgetreten
(s. 4.6.2, Abb. 26, unten). Da es sich offensichtlich nicht um unspezifische
Primerbindungen handelte, hatte ich mich entschlossen, dieses Phänomen
eingehender zu untersuchen.
Dazu wurde sowohl genomische DNA als auch RNA aus Blättern der gr1-Mutante
und einer transgenen Ws-Linie der „gain-of-function“ Versuche (s. 4.9) extrahiert.
4 Ergebnisse
109
Anschließend wurde die genomische DNA als Matrize in eine PCR (s. 3.12) und
die RNA als Matrize in eine „Zwei-Schritt“ RT-PCR (s. 3.13) eingesetzt. Die PCR-
bzw. RT-PCR-Produkte wurden anschließend, um eine besonders gute
Auftrennung zu erzielen, auf ein 2%iges Agarosegel geladen. Mit der
Primerkombination E13 mit Mut80-1 (s. 2.8 und Abb. 41, oben) konnte bei der
PCR mit genomischer DNA der gr1-Mutante das GR1-Gen vom 1. bis 3. Exon,
einschließlich der Introns, bis zur T-DNA Insertion (Position 2027-3801) und
zusätzlich 37 der 50 GR1-fremden „in frame“ Nukleotide der „left-border“ der T-
DNA (s. 4.3.1) nachgewiesen werden (s. Abb. 41, unten; M/D: Spur 2,
Fragmentlänge von 1811bp). Bei der RNA der gr1-Mutante traten sechs
Transkripte unterschiedlicher Größe auf (s. Abb. 41, unten, M/R: Spur 3). Als
Kontrolle diente mit derselben Primerkombination der Expressionsnachweis des
aberranten GR1-Gens in einer der transgenen Ws-Linien der „gain-of-function“
Versuche. Sowohl auf RNA- als auch auf DNA-Ebene konnte in dieser transgenen
Ws-Linie das GR1-Gen vom 1. bis 3. Exon bis zur T-DNA Insertion und zusätzlich
37 der 50 Nukleotide der „left-border“ der T-DNA nachgewiesen werden (s. Abb.
41 unten, gf/R: Spur 7 und gf/D: Spur 8, Fragmentlänge von 580bp).
Die sechs Banden der Transkripte der gr1-Mutante wurden aus dem Gel extrahiert
und in den pGEM® T-Easy Vektor (s. 2.9) kloniert. Da die Klonierungen der
Banden 1, 3 und 6 (s. Abb. 41, unten, B1: Spur 6; B3: Spur 5; B6: Spur 4)
erfolgreich waren, konnten die Insert-DNAs sequenziert werden. Als
Sequenzierprimer wurden die Primer E13 und Mut80-1 eingesetzt.
Die Sequenzanalyse der Plasmid-DNA der Bande 1 (s. Abb. 41, unten; B1: Spur 6
und Abb. 42, Fragmentlänge von 580bp) bestätigte die Nukleotidsequenz des
GR1-Gens vom 1., 2. und 3. Exon bis zur T-DNA-Insertion einschließlich der 37
Nukleotide der T-DNA. Die Sequenz der Plasmid-DNA der Bande 3 (s. Abb. 41,
unten, B3: Spur 5 und Abb. 42, Fragmentlänge von 672bp) umfasste die
Nukleotidsequenz des GR1-Gens vom 1. und 2. Exon, sowie teilweise die
Nukleotidsequenz vom 2. Intron (Position 3693-3785) und das 3. Exon wiederum
bis zur T-DNA-Insertion einschließlich der 37 Nukleotide der T-DNA. Die Sequenz
der Plasmid-DNA der Bande 6 (s. Abb. 41, unten, B6: Spur 4 und Abb. 42,
Fragmentlänge von 1146bp) umfasste die Nukleotidsequenz des GR1-Gens vom
1. und 2. Exon, sowie die gesamte Nukleotidsequenz des 2. Introns (Position
4 Ergebnisse
110
3222-3785) und das 3. Exon wiederum bis zur T-DNA-Insertion einschließlich der
37 Nukleotide der T-DNA.
Die Ergebnisse der Sequenzanalysen einiger Transkripte der gr1-Mutante zeigten,
dass in der gr1-Mutante, aufgrund der T-DNA-Insertion im 3. Exon, das 2. Intron
alternativ gespleißt wurde. So wurde das 2. Intron entweder nicht gespleißt
(Bande 6), teilweise gespleißt (Bande 3, eventuell auch die drei anderen Banden,
deren Klonierung erfolglos blieb) oder vollständig gespleißt (Bande 1).
M M/D M/R B6 B3 B1 gf/R gf/D M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Abb. 41: Untersuchung einiger Transkripte der gr1-Mutante. Die obere Abbildung zeigt einen schematischen Überblick über das gr1-Mutanten Gen mit den 5 Exons und vier Introns und mit der T-DNA Insertion im 3. Exon, wobei die Exons in verschiedenen Farben dargestellt sind: Exon 1 gelb, Exon 2 rot, Exon 3 grün, Exon 4 violett, Exon 5 grau. Die Positionen der verwendeten Primer
500bp-
750bp-
1000bp-
1500bp-
1
2
34
5
6
4 Ergebnisse
111
sind eingezeichnet, beschriftet und die 5` → 3`-Richtung jeweils mit einem Pfeil
gekennzeichnet. Dargestellt ist in der unteren Abbildung die gelelektrophoretische Auftrennung der amplifizierten Fragmente mit extrahierter genomischer DNA der gr1-Mutante (Spur 2), mit extrahierter RNA der gr1-Mutante (Spur 3), mit den Plasmid-DNAs der verschiedenen klonierten Banden der gr1-Mutante (Spur 4-6), mit extrahierter RNA einer transgenen Ws-Linie der „gain-of-function“ Versuche (Spur 7) und mit extrahierter genomischer DNA dieser transgenen Ws-Linie der „gain-of-function“ Versuche (Spur 8) als Matrize. Die verwendete Primerkombination war E13 mit Mut80-1 (Spur 2-8); Spur 1 und 9: M-Marker (Gene RulerTM 1kb DNA Ladder, s. 2.6)
ATGGACAATCTCCGGAAACTTAATCTTCTCTCTGTCTCTCTAACCATAATCTTTGTCTCTCTTACCATAGCCA 1. Exon CCAACTTACCTTTCTTTGAAGTGAAATATCCCAACAACAACCCTTTTGGGATGTTACTACGGCCGACACCGAT E13 → CAAGAACCAATCCTTGGGTCTACCGGCTCATGTCGGGTCAGATGAGTGTCGGGTTTGGACCAAAGCATGTTCT
GATGAGATTCTTAGGCTGACTTATCAGCCGGATAACGTTGCGTGGCTTAAACGCGTTAGGAGGACGATCCATG
AGAACCCGGAGCTAGCGTTTGAGGAGTATGAGACTAGTAGGCTTGTTAGGTCGGAGCTGGACCGTATGGGTAT
CATGTATAGATATCCGTTAGCGAAAACGGGTATTCGGGCTTGGATCGGATCCGGTGGACCGCCTTTTGTTGCG
GTTCGGGCTGATATGGACGCACTACCTATTCAGGAAGCAGTTGAATGGGAACATATAAGCAAAGTTGCAGGCA 2.Exon AAATGCATGCATGTGGTCATGACGCACATGTGACTATGCTTCTTGGTGCTGCCCATATTCTTAAGGCTCGTGA ACATCTTCTCAAGgtacttcatcaaactctatgctttttatacgagttaagagttttggtgttttggcttaat Anfang 2. Intron tttggttttatgggtttcttttaatattggttttaggagttttcttttttacacaaagtattgtggcctatat
aaggtatcttcatcttaataaacaaaaaaactcccaagaattaaccttaacttccaagagagactagggttaa
gagaaagtttgcttacatatttccttttttccccacgttaatcaacggctacgattacaagatctaagtctaa
ggctttggctcctatcactgtttttcataacattgttttataacttatttaaaagtggatgagatttctaact
ttatttcttggtgggtcactgtttgttgtgctataatgacaactgatgtgaattaatgatttgcttttgaaga ↓Spleißstelle Bande 3 taagggaaatcatttaatttttattttatttttttggtgtaatagaggagttatggtctttaggcccatggtt
tcgttggaccggagatcaaagcaaataaattagtcccttttgttgcatgtatgatttttttatagGGAACAGT Ende 2. Intron 3. Exon GGTTCTGTGGACAAATATCCAGACTGACGTTTATGTACGGGTGTTTATATATTGATAG T-DNA ← Mut80-1 Stopcodon Abb. 42: Ausschnitt der Nukleotidsequenz der klonierten Transkripte gr1-Mutante vom 1.
Exon (1959-2429), 2. Exon (3096-3221), 2. Intron (3222-3785), 3. Exon (3786-3801) und Übergang in die „left-border“ der T-DNA. Die Exons sind mit verschiedenen Farben unterlegt: Exon 1 gelb, Exon 2 rot und der Beginn von Exon 3 ist grün unterlegt. Das 2. Intron ist in Kleinbuchstaben dargestellt. Das in den 50 GR1-fremden „in frame“ Nukleotiden der T-DNA erste auftretende Stopcodon TGA ist rot unterlegt. Die Sequenz der „left-border“ der T-DNA ist fett gedruckt und kursiv. Die Positionen der verwendeten Primer sind
eingezeichnet, beschriftet und die 5` → 3`-Richtung jeweils mit einem Pfeil
gekennzeichnet.
4 Ergebnisse
112
4.11 Expression des GR1-Proteins für die Antikörperproduktion
Um zelluläre Lokalisationsstudien mit Hilfe GR1-spezifischer Antikörper
durchführen zu können, die eventuell Hinweise auf eine mögliche Funktion von
GR1 erlauben, musste zunächst das GR1-Protein exprimiert werden, um
Antikörper herstellen zu lassen.
Dazu wurde zunächst das bakterielle Expressionssystem getestet. Die
Proteinexpression im Wirtssystem E. coli hat im Erfolgsfalle die Vorteile einer
hohen Proteinausbeute, einer leichten Anzucht der Bakterien im großen Maßstab
und einer guten Expressionskontrolle. Zusätzlich ist das System kostengünstig
und es steht eine große Auswahl an Expressionsvektoren zur Verfügung.
4.11.1 Proteinexpression der GR1-CDS in E. coli
Für die Expression der GR1-CDS in E. coli wurde die CDS aus dem pGS2
Plasmid (s. 4.5) über die NcoΙ- und BglΙΙ-Schnittstelle herausgeschnitten und im
Expressionsvektor pQE60 (s. 2.9) in die entsprechend geöffneten Schnittstellen
kloniert. Die Schnittstellen wurden durch Sequenzierung überprüft. Das Plasmid
wurde sowohl in den E. coli M15-Stamm und als auch in den SG13009-Stamm
(SG13009 kann vorteilhaft für die Expression von Proteinen sein, die im M15-
Stamm nur unzureichend exprimiert werden) transformiert (s. 3.8.4) und die
Proteinexpression induziert (s. 3.17.1). Da der Nachweis der Proteinexpression
durch SDS-Gelelektrophorese (s. 3.17.5) mit anschließender Western-blot
Analyse (3.17.6) erfolglos blieb (Ergebnisse nicht gezeigt), wurde der
Expressionsvektor pET-29a (+) (s. 2.9) für die bakterielle Proteinexpression
eingesetzt.
Dazu wurde das Plasmid pGS2 (s. 4.5, Abb. 23) einem BglΙΙ-Restriktionsverdau
unterzogen, dann zum Auffüllen des überstehenden 5`-Endes zu einem glatten
Ende in eine „fill-in“ Reaktion (s. 3.8.8) mittels T4-DNA-Polymerase (s. 2.3)
eingesetzt und abschließend ein NcoΙ-Restriktionsverdau durchgeführt. Dieses
Fragment wurde in den über die NcoΙ- und EcoRV-Schnittstelle geöffneten pET-
29a (+) Vektor kloniert (s. Abb. 43 und 44) und die Schnittstellen anschließend
sequenziert. Das Plasmid wurde in den E. coli-Stamm BL21 transformiert und die
Proteinexpression induziert.
4 Ergebnisse
113
Auch in diesem Falle blieb der Nachweis der GR1-Proteinexpression durch SDS-
Gelelektrophorese mit anschließender Western-blot Analyse und Immunodetektion
mittels spezifisch gegen den N-terminalen S-tag des Fusionsproteins gerichteten
S-Protein HRP Konjugat (s. 2.4) (s. Abb. 45, Spur b) und mittels spezifisch gegen
den C-terminalen His-tag des Fusionsprotein gerichtete IndiaTM HisProbeTM-HRP
(s. 2.4) erfolglos (s. Abb. 45, Spur f).
Abb. 43: Der pET-29a (+) Vektor mit den für die Klonierung wichtigen Restriktions-schnittstellen.
Abb. 44: Klonierungsstrategie zur Herstellung des Konstruktes für die Proteinexpression.
4 Ergebnisse
114
Da die Expression des GR1-Proteins im bakteriellen System nicht durchführbar
war, wurde die Methode der zellfreien Proteinexpression getestet.
4.11.2 Proteinexpression der GR1-CDS im zellfreien System
Das System der zellfreien Proteinexpression (s. 3.17.2) hat den Vorteil, dass auch
toxische Proteine exprimiert werden können. Weitere Vorteile des Systems sind
die Unabhängigkeit der Expression von der „codon usage“ und, dass keine
Probleme mit unlöslichen Proteinen in „inclusion bodies“ auftreten. Darüber hinaus
ist dieses System zeitsparend und ermöglicht einfache Anpassungen an die
Expressionsbedingungen sowie gute Expressionskontrollen. Nachteilig sind
jedoch die relativ hohen Kosten.
Die Durchführung der zellfreien Proteinexpression erfolgte mit dem „Rapid
Translation RTS 500“ System der Firma Roche (s. 2.1 und 3.17.2), in welches die
in den pET-29a (+) Vektor klonierte GR1-CDS (s. Abb. 44) als Matrize eingesetzt
wurde.
Anschließend wurde die Proteinexpression von GR1 nach Auftrennung in einer
SDS-Gelelektrophorese (s. 3.17.5) und im nachfolgenden Western-blot (s. 3.17.6)
analysiert. Da die in den pET-29a (+) Vektor klonierte GR1-CDS N-terminal mit
einem S-tag und C-terminal mit einem His-tag fusioniert wurde, konnte sowohl mit
Hilfe des gegen den S-tag gerichteten S-Protein HRP Konjugates (s. Abb. 45,
Spur d), als auch mit Hilfe der gegen den His-tag gerichteten IndiaTM HisProbeTM-
HRP (s. Abb. 45, Spur h) die Proteinexpression von GR1 mit einem
Molekulargewicht von ca. 58kDa nachgewiesen werden (setzt sich aus dem
Molekulargewicht von GR1 von ca. 52kDa und dem Molekulargewicht des S-tag
und des His-tag von ca. 6kDa zusammen).
Mit Hilfe der beiden Nachweisreagenzien konnte somit gezeigt werden, dass das
GR1-Protein vollständig im zellfreien System exprimiert wurde.
4 Ergebnisse
115
a b c d e f g h
Abb. 45: Nachweis der Proteinexpression von GR1 im pET-29a (+) Vektor im bakteriellen und im zellfreien System mit Hilfe des S-Protein HRP Conjugates (Spur a - d) und der IndiaTM HisProbeTM-HRP (e - h) im Western-blot. Spur a und e: Negativkontrolle E. coli-Stamm BL21; Spur b und f: GR1 im pET-29a (+) Vektor im E. coli-Stamm BL21; Spur c und g: Negativkontrolle zellfreies System; Spur d und h: Proteinexpression von GR1 im pET-29a (+) Vektor im zellfreien System
Bei mehrmaligen Aufreinigungsversuchen des GR1-Proteins für die Herstellung
von Antikörpern zeigte sich jedoch, dass dieses zellfreie System noch nicht
vollständig ausgereift ist. Irgendeine der Proteinexpression zugesetzten
Reaktionskomponenten schien offensichtlich die Aufreinigung des Proteins zu
stören (Problem war der Firma Roche nach dortiger Rücksprache bekannt).
Da die Aufreinigung des Proteins somit erfolglos blieb, wurden bei der Firma
SEQLAB in Göttingen zwei Peptidantikörper gegen antigene Regionen des GR1-
Gens bestellt (s. 3.17.4).
Zur Überprüfung der Spezifität der Peptidantikörper wurden extrahierte Proteine
aus Arabidopsis-Blättern (s. 3.17.3) und als Kontrolle das aus dem zellfreien
Expressionssystem gewonnene GR1-Protein in einer SDS-Gelelektrophorese (s.
3.17.5) aufgetrennt und anschließend im Western-blot (s. 3.17.6) analysiert. Dabei
konnte weder eine spezifische Bindung der Peptidantikörper an das GR1-Protein
der Kontrolle noch an die Proteine aus Arabidopsis-Blattextrakten nachgewiesen
werden (Ergebnisse nicht gezeigt).
~ 58kDa ~ 58kDa
4 Ergebnisse
116
4.12 Untersuchung von Protein-Protein Interaktionen im “Yeast-two-hybrid”-Assay
Das von Fields und Song (1989) entwickelte „Two-hybrid“-System weist Protein-
Protein-Wechselwirkungen in lebenden Eukaryoten-Zellen (Hefezellen) nach. Bei
dieser recht sensitiven in vivo-Methode ist die Stabilität und korrekte Faltung der
zu untersuchenden Proteine wahrscheinlicher als bei einer Expression
beispielsweise in Bakterien. Eine besondere Reinigung der eingesetzten Proteine
ist nicht notwendig. Darüber hinaus bietet diese Methode die Möglichkeit,
unbekannte Protein-Protein-Wechselwirkungen mit geringem technischen
Aufwand zu identifizieren. Ein Nachteil des “Yeast-two-hybrid”-Assay kann jedoch
das Auftreten von falsch positiven Interaktionen sein, die auf Autoaktivierung
durch das Bindungsdomäne-Fusionsprotein zurückgeführt werden können.
4.12.1 Interaktion des GR1-Proteins mit 14-3-3 Proteinen aus Gerste
Auf der Suche nach einer möglichen Funktion des GR1-Proteins wurden in einer
vorangegangenen Arbeit (Kruse, 2001) neben einem putativen mitochondrialen
Transitpeptid am N-Terminus in GR1 zwei nahezu perfekte Konsensusstellen für
die Bindung von 14-3-3 Proteinen aufgedeckt (s. Abb. 46).
MDNLRKLNLLSVSLTIIFVSLTIATNLPFFEVKYPNNNPFGMLLRPTPIKNQSLGLPAHVG
SDECRVWTKACSDEILRLTYQPDNVAWLKRVRRTIHENPELAFEEYETSRLVRSELDRMGI
MYRYPLAKTGIRAWIGSGGPPFVAVRADMDALPIQEAVEWEHISKVAGKMHACGHDAHVTM
LLGAAHILKAREHLLKGTVVLLFQPAEEAGNGAKMIEDGALDDVEAIFAVHVSHIHPTGVI
GSRSGPLLAGCGIFRAVITSEDSRGAANLLLAASSAVISLQGIVSREASPLDSQVVSVTSF
DGGHSLDVAPDTVVLGGTFRAFSNSSFYYLKKRIQEVLMDQVGVFGCQATVNFFEKQNAIY
PPTTNNDATYNHLKKVTIDLLGDSHFTLAPQMMGAEDFAFYSEIIPAAFYFIGIRNEELGS
VHIAHSPHFMIDEDSLPVGAAVHAAVAERYLNDKHS
Konsensussequenzen für 14-3-3 Bindung: RSxpSxP (Muslin et al., 1996), RxF/YxpSxP (Yaffe et al., 1997), RxSxpSxP (Andrews et al., 1998)
Abb. 46: Aminosäurensequenz von GR1. Das putative mitochondriale Transitpeptid ist fett gedruckt und unterstrichen und die möglichen 14-3-3 Bindungsstellen sind unterlegt dargestellt.
4 Ergebnisse
117
Es wurde in Zusammenarbeit mit dem Labor von Herrn Dr. Collinge in Dänemark
die Interaktion des GR1-Proteins mit 14-3-3 Proteinen aus Gerste im “Yeast-two-
hybrid”-Assay getestet. In diesem Assay interagierte das GR1-Protein mit dem 14-
3-3a und 14-3-3b Proteinen aus Gerste, welche nach Infektion mit Blumeria
graminis (Brandt et al., 1992) induziert werden (s. Abb. 47, Daten aus dem Labor
von Herrn Dr. Collinge). Dabei wies GR1 eine stärkere Interaktion mit der Gerste
14-3-3a Isoform auf, insbesondere wenn die GR1-CDS verkürzt um das putative
mitochondriale Transitpeptid eingesetzt wurde (Kruse, 2001).
Abb. 47: Quantitativer β-Galactosidase-Test zur Überprüfung der Interaktion zwischen GR1 mit und ohne Transitpeptid (GR1 bzw. GR1-mTP) und 14-3-3 Proteinen (14-3-3a und 14-3-3b) aus Gerste im Vergleich zur Positivkontrolle (SNF1/SNF4) (Daten Dr. Collinge).
Aufgrund dieser Ergebnisse sollte systematisch die Interaktion von GR1 mit
Arabidopsis 14-3-3s mittels “Yeast-two-hybrid”-Assay untersucht werden. Im Falle
einer Interaktion sollte dann die Frage geklärt werden, ob diese in der pflanzlichen
Pathogenabwehr eine Rolle spielen.
4.12.2 Herstellung der “Yeast-two-hybrid”-Konstrukte
Für die Untersuchungen sollte der ”Yeast-two-hybrid”-Assay in beiden
Kombinationen, d.h. einerseits GR1 mit DNA-Bindungsdomäne und die
4 Ergebnisse
118
Arabidopsis 14-3-3s mit Aktivierungsdomäne und andererseits GR1 mit
Aktivierungsdomäne und die Arabidopsis 14-3-3s mit DNA-Bindungsdomäne
durchgeführt werden. Deshalb wurde GR1 mit und ohne Transitpeptid, die zwölf
Arabidopsis 14-3-3s und das Gerste 14-3-3a jeweils in beide ”Yeast-two-hybrid”-
Vektoren, d.h. in den pACT2 bzw. pGADT7 Vektor (mit Aktivierungsdomäne; für
die Klonierungen von GR1 eigneten sich die Restriktionsschnittstellen vom
pACT2-Vektor und für die 14-3-3s die des weiterentwickelten pGADT7-Vektors)
und in den pGBKT7 Vektor (mit Bindungsdomäne) kloniert (s. 2.9).
Für das GR1-Konstrukt mit Transitpeptid wurde die gesamte GR1-CDS aus dem
Plasmid pGS2 (s. 4.5 Abb. 23) über die NcoΙ- und EcoRΙ-Schnittstelle heraus-
geschnitten, in die “Yeast-two-hybrid”-Vektoren pACT2 und pGBKT7 kloniert (s.
Abb. 48), und anschließend die Schnittstellen durch Sequenzierung überprüft.
Abb. 48: Endprodukte des GR1-Konstruktes mit Transitpeptid.
Für das um das putative mitochondriale Transitpeptid verkürzte GR1-Konstrukt
wurde zunächst ein Fragment (Position 2097-2310), welches in Position 2097 eine
NcoΙ-Schnittstelle und in Position 2261 eine NheΙ-Schnittstelle (s. 2.8 Primer-
kombination 5`3`14-3-3 mit 55) beinhaltete, mittels PCR (s. 3.12) amplifiziert.
Dieses Fragment wurde in den pGEM® T-Easy Vektor (s. 2.9) kloniert,
anschließend sequenziert und dann über die NcoΙ und NheΙ-Schnittstelle aus dem
pGEM® T-Easy Vektor herausgeschnitten. Aus dem pGS2-Plasmid (s. Abb. 23
und Abb. 49), welches die gesamte GR1-CDS beinhaltete, wurde der Bereich der
CDS zwischen der NcoΙ-Schnittstelle (Position 1959) und der NheΙ-Schnittstelle
(Position 2261) durch Restriktionsverdau entfernt. In diese geöffneten Schnitt-
stellen wurde das amplifizierte Fragment hineinkloniert. Diese um das putative
mitochondriale Transitpeptid verkürzte GR1-CDS wurde dann über die NcoΙ- und
4 Ergebnisse
119
EcoRΙ-Schnittstelle in die “Yeast-two-hybrid”-Vektoren pACT2 und pGBKT7
kloniert (s. Abb. 49), und die Schnittstellen durch Sequenzierung überprüft.
Abb. 49: Klonierungsstrategie zur Herstellung des GR1-Konstruktes ohne Transitpeptid.
4 Ergebnisse
120
Für die Arabidopsis 14-3-3 betreffenden Konstrukte war von Bedeutung, dass von
den fünfzehn bekannten Arabidopsis 14-3-3 Isoformen die Expression von zwölf
Isoformen (GRF1-12) nachgewiesen werden konnte (Rosenquist et al., 2001).
Deshalb wurden von den zwölf nachweislich exprimierten Isoformen die Synthese
der CDSs der Isoformen GRF1 und GRF4-10 nach Extraktion der RNA aus
Arabidopsis-Blättern und Blütenständen (s. 3.11.2) durch Amplifizierung mit für die
einzelnen Isoformen entsprechend entworfenen Primern, die im “forward” Primer
eine NdeΙ-Schnittstelle (Ausnahme GRF9 AseΙ-Schnittstelle ist kompatibel zu
NdeΙ) und im „reverse“ Primer eine BamHΙ-Schnittstelle (s. 2.8) beinhalteten,
mittels „Ein-Schritt“ RT-PCR (s. 3.13) durchgeführt. Die CDSs wurden in den
pGEM® T-Easy Vektor kloniert (s. 2.9), anschließend sequenziert und über die
NdeΙ- und BamHΙ-Schnittstellen in die “Yeast-two-hybrid”-Vektoren pGADT7 und
pGBKT7 (s. Abb. 50) subkloniert und die Schnittstellen durch Sequenzierung
überprüft. Die CDSs der Isoformen GRF2 und GRF3 haben wir vom Arabidopsis
Biological Resource Center in den USA erworben und die CDSs der Isoformen
GRF11 und GRF12 wurden uns freundlicherweise von Herrn Dr. Rosenquist zur
Verfügung gestellt. Diese CDSs wurden als Matrizen in eine PCR (s. 3.12)
eingesetzt und mit entsprechend entworfenen Primern, die im “forward” Primer
jeweils eine NdeΙ-Schnittstelle und im „reverse“ Primer für GRF2 und GRF3 eine
BamHΙ-Schnittstelle, für GRF11 eine BclΙ-Schnittstelle und für GRF12 eine BglΙΙ-
Schnittstelle (beide Enzyme sind kompatibel zu BamHΙ) beinhalteten, amplifiziert.
Die CDSs wurden in den pGEM® T-Easy Vektor kloniert, sequenziert und
anschließend über die NdeΙ- und BamHΙ-Schnittstellen in die “Yeast-two-hybrid”-
Vektoren pGADT7 und pGBKT7 subkloniert (s. Abb. 50), und die Schnittstellen
durch Sequenzierung überprüft.
Abb. 50: Endprodukte der 14-3-3 Konstrukte.
4 Ergebnisse
121
Als Kontrolle wurde aufgrund der Ergebnisse aus Dänemark ein Konstrukt mit der
14-3-3a Isoform aus Gerste hergestellt. Die cDNA wurde uns von Herrn Dr.
Collinge freundlicherweise zur Verfügung gestellt, welche als Matrize in eine PCR
(s. 3.12) eingesetzt und mit entsprechend entworfenen Primern, die im “forward”
Primer jeweils eine NdeΙ-Schnittstelle und im „reverse“ Primer eine BamHΙ-
Schnittstelle beinhalteten, amplifiziert wurde. Die CDS wurde in den pGEM® T-
Easy Vektor kloniert, sequenziert und anschließend über die NdeΙ- und BamHΙ-
Schnittstellen in die “Yeast-two-hybrid”-Vektoren pGADT7 und pGBKT7
subkloniert (s. Abb. 50) und die Schnittstellen durch Sequenzierung überprüft.
Als Positivkontrolle wurden zwei Testplasmide pTD1 mit Aktivierungsdomäne und
pVA3 mit Bindungsdomäne der Firma Clontech eingesetzt, welche für die Proteine
SV40 large T-Antigen bzw. Maus p53 kodieren.
4.12.3 Überprüfung der Proteinexpression von GR1, Gerste 14-3-3a und den Arabidopsis 14-3-3s im Western-blot und Überprüfung möglicher Autoaktivierung der Fusionsproteine im Vektor mit DNA-Bindungsdomäne
Zur Überprüfung der Proteinexpression von GR1, Gerste 14-3-3a und den
Arabidopsis 14-3-3s im Western-blot wurde nach Herstellung aller benötigten
Konstrukte die Plasmide einzeln in den Hefestamm Y190 transformiert (s. 3.18.2)
und auf selektivem Medium ausplattiert. Dieses enthielt für die pGBKT7-Vektor
transformierten Hefen kein Tryptophan und für die pACT2- bzw. pGADT7-Vektor
transformierten Hefen kein Leucin. Anschließend wurden die Proteine aus den
Hefezellen extrahiert (s. 3.18.4) und in einer SDS-Gelelektrophorese (s. 3.17.5)
aufgetrennt.
Da die in den pGBKT7-Vektor klonierten CDSs am N-Term mit einem c-Myc
Epitop fusioniert wurden, konnte in der anschließenden Western-blot Analyse mit
Hilfe des α-myc monoklonalen Antikörpers (s. 2.4), der gegen das c-Myc Epitop
gerichtet war (als zweiter Antikörper, der spezifisch gegen den α-Myc Antikörper
gerichtet war, wurde ein an Peroxidase gekoppelter Anti-Maus Antikörper (s. 2.4)
eingesetzt), die Proteinexpression von GR1 mit und ohne Transitpeptid mit einem
Molekulargewicht von ca. 69 und 65kDa nachgewiesen werden (setzte sich aus
dem Molekulargewicht von GR1 mit Transitpeptid von ca. 52kDa und GR1 ohne
4 Ergebnisse
122
Transitpeptid von ca. 48kDa und dem Molekulargewicht des c-Myc Epitops von ca.
17kDa zusammen; s. Abb. 51, Spur b und c). Entsprechend konnte die
Proteinexpression von Gerste 14-3-3a mit einem Molekulargewicht von ca. 46kDa
(setzte sich aus dem Molekulargewicht der Gerste 14-3-3a von ca. 29kDa und
dem Molekulargewicht des c-Myc Epitops von ca. 17kDa zusammen; s. Abb. 51,
Spur d) und den Arabidopsis 14-3-3s (GRF1-12) mit einem Molekulargewicht von
ca. 44-47kDa (setzte sich aus dem Molekulargewicht der 14-3-3s von ca. 27-
30kDa und dem Molekulargewicht des c-Myc Epitops von ca. 17kDa zusammen;
s. Abb. 51, Spuren e - p) nachgewiesen werden.
a b c d e f g h i j k l m n o p
Abb. 51: Nachweis der Proteinexpression von GR1 mit und ohne Transitpeptid, Gerste 14-3-3a und den Arabidopsis 14-3-3s im pGBKT7-Vektor mit Hilfe des α-myc Antikörpers in den Proteinextrakten der transformierten Hefezellen im Western-blot. Spur a: Negativkontrolle Hefestamm Y190 mit leerem Plasmid; Spur b: GR1 mit Transitpeptid; Spur c: GR1 ohne Transitpeptid; Spur d: Gerste 14-3-3a; Spur e – p: GRF1-12
Da die in den pACT2- bzw. pGADT7-Vektor klonierten CDSs am N-Term das HA-
Epitop trugen, konnte entsprechend die Proteinexpression von GR1 mit und ohne
Transitpeptid im pACT2-Vektor und der Gerste 14-3-3a sowie der Arabidopsis 14-
3-3s (GRF1-12) im pGADT7-Vektor mit Hilfe des α-HA Antikörpers, in ähnlicher
Weise wie in Abb. 51 dargestellt, nachgewiesen werden (Ergebnisse nicht
gezeigt).
Darüber hinaus wurde überprüft, ob die Fusionsproteine im pGBKT7-Vektor mit
Bindungsdomäne autoaktivierend wirken, d.h. die Transkription selbständig
auslösen und somit falsch positive Interaktionen vorspiegeln.
Dazu wurden die in den pGBKT7-Vektor (mit DNA-Bindungsdomäne) klonierten
CDSs von GR1 mit und ohne Transitpeptid, Gerste 14-3-3a und der Arabidopsis
14-3-3s (GRF1-12) jeweils in die Hefezellen der Y190-Stammes transformiert und
auf selektiven Medien ausplattiert (s. 3.18.2). Die -Trp Platten (s. Abb. 52, linke
Spalte) zeigen, dass die Transformation der Hefezellen erfolgreich war. Da die
69kDa~ 65kDa~
~47kDa~44kDa
4 Ergebnisse
123
Hefezellen die Plasmide aufgenommen hatten, waren sie in der Lage, auf den -Trp
Platten zu wachsen. Auf den -Trp/-His Platten (s. Abb. 52, mittlere Spalte)
dagegen wuchsen nur die Hefezellen der Isoform GRF11. Da die Isoform GRF11
mit DNA-Bindungsdomäne autoaktivierend wirkte, löste sie die Transkription
selbständig aus, so dass das HIS3-Gen exprimiert wurde und somit den
Hefezellen das Wachstum auf den -Trp/-His Platten ermöglichte. Dies bestätigte
sich ebenfalls im β-Galactosidase-Filtertest (3.18.3), in welchem aufgrund der
Expression der β-Galactosidase nur bei GRF11 die Bildung blauer Kolonien im X-
GAL-haltigen Medium nachgewiesen werden konnte (s. Abb. 52, rechte Spalte).
Abb. 52: „Autoaktivitätstest“ mit GR1 mit und ohne Transitpeptid, Gerste 14-3-3a und der Arabidopsis 14-3-3s (GRF1-12) mit Bindungsdomäne. Dargestellt sind links die Ausstriche der transformierten Hefezellen auf -Trp Platten als Kontrolle für eine erfolgreiche Transformation der Hefezellen. In der
7
8
9
10
11
12
7
8
9
10
11
12
G G
oT oT
T T
1 1
2 2
3 3
4 4
5 5
6 6
G
T oT
1
6
5
4
3
2
7
8 12
11
10
9
4 Ergebnisse
124
Mitte der -Trp/-His Platten wuchsen nur die Hefezellen der Isoform GRF11, die
autoaktivierend wirkte (mit Pfeil gekennzeichnet). Rechts im β-Galactosidase-
Filtertest wurde die Autoaktivität der Isoform GRF11 durch Bildung blauer Kolonien bestätigt (mit Pfeil gekennzeichnet).
Legende zu den Abbildungen:
T=GR1 3=GRF3 8=GRF8
oT=GR1-mTP 4=GRF4 9=GRF9
G=Gerstea 5=GRF5 10=GRF10
1=GRF1 6=GRF6 11=GRF11
2=GRF2 7=GRF7 12=GRF12
4.12.4 Untersuchung der Interaktion des GR1-Proteins mit Arabidopsis 14-3-3 Proteinen im ”Yeast-two-hybrid”-Assay
Nach erfolgreicher Überprüfung der Proteinexpression wurde die Interaktion von
GR1 mit und ohne Transitpeptid mit den zwölf Arabidopsis Isoformen und der
Gerste 14-3-3a Isoform im ”Yeast-two-hybrid”-Assay (s. 3.18) getestet, mit der
Kombination GR1 mit DNA-Bindungsdomäne und den Arabidopsis 14-3-3s sowie
der Gerste 14-3-3a mit Aktivierungsdomäne.
Nach Kotransformation der Hefezellen des Y190-Stammes mit den jeweiligen
Plasmiden (s. 3.18.2), wurden diese auf selektiven Medien ausplattiert. Die -Leu/-
Trp Platten (s. Abb. 53, linke Spalte) zeigten, dass die Transformation der
Hefezellen erfolgreich war. Da die Hefezellen die Plasmide aufgenommen hatten,
waren sie in der Lage, auf den -Leu/-Trp Platten zu wachsen. Auf den -Leu/-Trp/-
His Platten (s. Abb. 53, mittlere Spalte) dagegen wuchsen nur die Hefezellen der
Positivkontrolle und waren somit die einzigen Proteine, die eine Protein-Protein-
Interaktion zeigten. Dies bestätigte sich ebenfalls im β-Galactosidase-Filtertest (s.
3.18.3), in welchem nur bei der Positivkontrolle aufgrund der Expression der β-
Galactosidase die Bildung blauer Kolonien im X-Gal-haltigen Medium
nachgewiesen werden konnte. Die anderen Proteine interagierten nicht
miteinander, so dass demzufolge die β-Galactosidase nicht exprimiert wurde und
somit die Kolonien rot blieben (s. Abb. 53, rechte Spalte).
In dieser Kombination konnte weder zwischen Gerste 14-3-3a und GR1 mit und
ohne Transitpeptid noch zwischen den zwölf Arabidopsis 14-3-3s und GR1 mit
und ohne Transitpeptid eine Interaktion nachgewiesen werden.
4 Ergebnisse
125
Abb. 53: ”Yeast-two-hybrid”-Assay mit der Kombination GR1 ohne Transitpeptid mit DNA-Bindungsdomäne und den Arabidopsis 14-3-3s sowie der Gerste 14-3-3a mit Aktivierungsdomäne. Dargestellt sind links die Ausstriche der transformierten Hefezellen auf -Leu/-Trp Platten als Kontrolle für eine erfolgreiche Transformation. In der Mitte auf -Trp/-His Platten wuchsen nur die Hefezellen der Positivkontrolle (mit Pfeilen gekennzeichnet) und waren somit die einzigen Proteine, die eine Protein-Protein
Interaktion zeigten. Rechts im β-Galactosidase-Filtertest zeigte nur die Positiv-
kontrolle die Bildung blauer Kolonien (mit Pfeilen gekennzeichnet), während die Kolonien der nicht interagierenden Proteine rot blieben.
Legende zu den Abbildungen: PK=Positivkontrolle 4=GRF4/ GR1-mTP 9=GRF9/ GR1-mTP
G=Gerstea/ GR1-mTP 5=GRF5/ GR1-mTP 10=GRF10/ GR1-mTP
1=GRF1/ GR1-mTP 6=GRF6/ GR1-mTP 11=GRF11/ GR1-mTP
2=GRF2/ GR1-mTP 7=GRF7/ GR1-mTP 12=GRF12/ GR1-mTP
3=GRF3/ GR1-mTP 8=GRF8/ GR1-mTP
PK PK PK
PK PK PK
PK PK PK
1 1 1
2 2 2
3 3 3
4 44
5 5 5
6 6 6
7 7 7
G G G
G G G
G G G
8 8 8
9 9 9
10
11 11 11
12 12 12
10 10
4 Ergebnisse
126
Anschließend wurde die umgekehrte Variante, d.h. GR1 mit Aktivierungsdomäne
und die Arabidopsis 14-3-3s sowie die Gerste 14-3-3a Isoform mit DNA-
Bindungsdomäne im ”Yeast-two-hybrid”-Assay getestet.
Nach Kotransformation der Hefezellen des Y190-Stammes mit den jeweiligen
Plasmiden wurden diese auf selektiven Medien ausplattiert. Die -Leu/-Trp Platten
(s. Abb. 54, linke Spalte) zeigten bei allen Kotransformationen die erfolgreiche
Aufnahme beider Plasmide in die Hefezellen. Auf den -Leu/-Trp/-His Platten (s.
Abb. 54, mittlere Spalte) wuchsen die Hefezellen der Positivkontrolle und die
Hefezellen mit GR1 und der Arabidopsis 14-3-3 Isoform GRF11. Dies bestätigte
sich ebenfalls im β-Galactosidase-Filtertest, in welchem bei der Positivkontrolle
und bei den Hefezellen mit GR1 und der Arabidopsis 14-3-3 Isoform GRF11 die
Bildung blauer Kolonien nachgewiesen werden konnte (s. Abb. 54, rechte Spalte).
Bei dem Wachstum der Hefezellen mit GR1 und der Arabidopsis 14-3-3 Isoform
GRF11 auf der -Leu/-Trp/-His Platte, sowie der Bildung blauer Kolonien im β-
Galactosidase-Aktivitätstest (s. Abb. 54, unten Mitte und rechts) handelte es sich
nicht um eine spezifische Protein-Protein-Interaktion zwischen GR1 und GRF11,
sondern um Autoaktivität von GRF11 (s. 4.12.3).
Auch mit der Variante GR1 mit Aktivierungsdomäne und die Arabidopsis 14-3-3s
sowie die Gerste 14-3-3 Isoformen mit DNA-Bindungsdomäne konnte weder
zwischen Gerste 14-3-3a noch zwischen den zwölf Arabidopsis 14-3-3s und GR1
mit und ohne Transitpeptid eine Interaktion nachgewiesen werden.
4 Ergebnisse
127
Abb. 54: ”Yeast-two-hybrid”-Assay mit der Kombination GR1 ohne Transitpeptid mit Aktivierungsdomäne und die Arabidopsis 14-3-3s sowie die Gerste 14-3-3a mit DNA-Bindungsdomäne. Dargestellt sind links die Ausstriche der transformierten Hefezellen auf -Leu/-Trp Platten als Kontrolle für eine erfolgreiche Transformation. In der Mitte auf -Trp/-His Platten wuchsen die Hefezellen der Positivkontrolle und die Hefezellen mit GR1 und der Arabidopsis 14-3-3 Isoform GRF11 (mit Pfeilen gekennzeichnet).
Rechts im β-Galactosidase-Filtertest zeigte die Positivkontrolle und GR1 mit der Isoform GRF11 die Bildung blauer Kolonien (mit Pfeilen gekennzeichnet), während die Kolonien der nicht interagierenden Proteine rot blieben.
Legende zu den Abbildungen: PK=Positivkontrolle 4=GRF4/ GR1-mTP 9=GRF9/ GR1-mTP
G=Gerstea/ GR1-mTP 5=GRF5/ GR1-mTP 10=GRF10/ GR1-mTP
1=GRF1/ GR1-mTP 6=GRF6/ GR1-mTP 11=GRF11/ GR1-mTP
2=GRF2/ GR1-mTP 7=GRF7/ GR1-mTP 12=GRF12/ GR1-mTP
3=GRF3/ GR1-mTP 8=GRF8/ GR1-mTP
PK PK PK
PK PK PK
PK PK PK
G G G
G G G
G G G
1 1 1
2 2 2
3 3 3
4 4 4
5 5 5
6 6 6
7 7 7
8 8 8
9 9 9
10 10 10
11 11 11
12 12 12
4 Ergebnisse
128
Zusammenfassend ist festzustellen, dass keine Interaktion zwischen Arabidopsis
14-3-3s und GR1 mit und ohne Transitpeptid im ”Yeast-two-hybrid”-Assay
nachgewiesen werden konnte, obwohl die Proteinexpression der 14-3-3 Proteine
und des GR1-Proteins im Western-blot gezeigt wurde. Darüber hinaus konnte die
Interaktion zwischen Gerste 14-3-3a und GR1 mit und ohne Transitpeptid
(Versuch aus Dänemark) nicht reproduziert werden. Deshalb hatten wir uns aus
Dänemark die -Leu/-Trp Selektionsplatten mit den kotransformierten Hefezellen
der Gerste 14-3-3a Isoform und GR1 mit und ohne Transitpeptid schicken lassen.
Mit diesen Platten wurde dann der β-Galactosidase-Filtertest (s. 3.18.3)
durchgeführt und gleichzeitig wurden die kotransformierten Hefezellen auf -Leu/-
Trp/-His Selektionsplatten ausplattiert. Weder konnte im β-Galactosidase-Filtertest
die Bildung blauer Kolonien noch auf den -Leu/-Trp/-His Platten ein Wachstum der
Hefezellen nachgewiesen werden.
4.12.5 Untersuchung der Interaktion der Arabidopsis 14-3-3 Proteine untereinander
Da keine Interaktion zwischen Gerste bzw. Arabidopsis 14-3-3s und GR1 mit und
ohne Transitpeptid im ”Yeast-two-hybrid”-Assay nachgewiesen werden konnte (s.
4.12.4), waren wir auf der Suche nach einer Positivkontrolle, bei der die
Arabidopsis 14-3-3 Proteine mit einem bekannten Targetprotein im ”Yeast-two-
hybrid”-Assay interagieren. Nach Rücksprache mit dem Labor von Frau Dr.
Oecking in Tübingen gab man uns den Rat, die Arabidopsis 14-3-3 Proteine
miteinander im ”Yeast-two-hybrid”-Assay interagieren zu lassen. Denn es wird die
Meinung vertreten, dass die 14-3-3 Proteine alle mit sich selbst und mit den
jeweils anderen Isoformen interagieren, und somit sowohl Homo- als auch
Heterodimere bilden (Wu et al., 1997b).
Daraufhin wurden die 14-3-3 Isoformen GRF6 und 9 ausgewählt und deren
Interaktion mit sich selbst und mit der anderen Isoform im ”Yeast-two-hybrid”-
Assay getestet (s. 3.18). Bei der Kombination GRF6 mit Bindungsdomäne und
GRF9 mit Aktivierungsdomäne konnte eine Interaktion zwischen den beteiligten
Proteinen gezeigt werden. Dagegen konnte bei der Kombination GRF9 mit
Bindungsdomäne und GRF6 mit Aktivierungsdomäne keine Interaktion zwischen
4 Ergebnisse
129
den Reaktionspartnern nachgewiesen werden. Ebenso interagierten die beiden
Isoformen nicht mit sich selbst.
Aufgrund dieses interessanten Ergebnisses, welches im Widerspruch zu den
Resultaten von Wu et al. (1997b) steht, haben wir uns entschlossen, systematisch
die Interaktion der zwölf Arabidopsis 14-3-3s mit sich selbst und mit den jeweils
anderen Isoformen im ”Yeast-two-hybrid”-Assay zu untersuchen.
Da bereits alle zwölf 14-3-3 Isoformen sowohl in den pGBKT7-Vektor (mit
Bindungsdomäne) als auch in den pGADT7-Vektor (mit Aktivierungsdomäne)
kloniert wurden (s. 4.12.2), waren alle benötigten Konstrukte vorhanden.
Somit wurden alle Kombinationen zwischen GRF1-12 mit DNA-Bindungsdomäne
und GRF1-12 mit Aktivierungsdomäne im ”Yeast-two-hybrid”-Assay getestet. Im
Folgenden sind repräsentativ zwei Ergebnisse dargestellt.
Bei der Kombination GRF5 mit Bindungsdomäne und den Arabidopsis 14-3-3s
GRF1-12 mit Aktivierungsdomäne wurden die mit den jeweiligen Plasmiden (s.
3.18.2) kotransformierten Hefezellen auf selektiven Medien ausplattiert. Die -Leu/-
Trp Platten (s. Abb. 55, linke Spalte) zeigten bei allen Kotransformationen die
erfolgreiche Aufnahme beider Plasmide in die Hefezellen. Auf den -Leu/-Trp/-His
Platten (s. Abb. 55, mittlere Spalte) wuchsen die Hefezellen der Positivkontrolle
und die kotransformierten Hefezellen der Isoform GRF5 mit den Isoformen GRF9,
10, 11 und 12. Dies bestätigte sich ebenfalls im β-Galactosidase-Filtertest (s.
3.18.3), in welchem bei der Positivkontrolle und bei den Hefezellen mit der Isoform
GRF5 und den Isoformen GRF9, 10, 11, 12 die Bildung blauer Kolonien
nachgewiesen werden konnte (s. Abb. 55, rechte Spalte).
4 Ergebnisse
130
Abb. 55: ”Yeast-two-hybrid”-Assay mit der Kombination GRF5 mit Bindungsdomäne und
den Arabidopsis 14-3-3s GRF1-12 mit Aktivierungsdomäne. Dargestellt sind links die Ausstriche der transformierten Hefezellen auf -Leu/-Trp Platten als Kontrolle für eine erfolgreiche Transformation der Hefezellen. In der Mitte auf -Trp/-His Platten wuchsen die Hefezellen der Positivkontrolle und die Hefezellen der interagierenden Proteine (mit Pfeilen gekennzeichnet). Rechts im
β-Galactosidase-Filtertest zeigten die Positivkontrolle und die interagierenden
Proteine (mit Pfeilen gekennzeichnet) die Bildung blauer Kolonien, während die Hefekolonien der nicht interagierenden Proteine rot blieben.
Legende zu den Abbildungen: PK=Positivkontrolle 5=GRF5/ GRF5 10=GRF5/ GRF10
1=GRF5/ GRF1 6=GRF5/ GRF6 11=GRF5/ GRF11
2=GRF5/ GRF2 7=GRF5/ GRF7 12=GRF5/ GRF12
3=GRF5/ GRF3 8=GRF5/ GRF8
4=GRF5/ GRF4 9=GRF5/ GRF9
PK PK PK
PK PK PK
1 1 1
2 2 2
3 3 3
4 4 4
5 5 5
6 6 6
7 7 7
8 8 8
9 99
10 10 10
PK PK
11 11 12 12
PK
11 12
4 Ergebnisse
131
Im zweiten Beispiel wurden bei der Kombination GRF10 mit Bindungsdomäne und
den Arabidopsis 14-3-3s GRF1-12 mit Aktivierungsdomäne die mit den jeweiligen
Plasmiden kotransformierten Hefezellen auf selektiven Medien ausplattiert. Die -
Leu/-Trp Platten (s. Abb. 56, linke Spalte) zeigten bei allen Kotransformationen die
erfolgreiche Aufnahme beider Plasmide in die Hefezellen. Auf den -Leu/-Trp/-His
Platten (s. Abb. 56, mittlere Spalte) wuchsen die Hefezellen der Positivkontrolle
und die kotransformierten Hefezellen der Isoform GRF10 mit den Isoformen
GRF1-5 und 7. Dies bestätigte sich ebenfalls im β-Galactosidase-Filtertest, in
welchem bei der Positivkontrolle und bei den Hefezellen, die mit der Isoform
GRF10 und den Isoformen GRF1-5 und 7 kotransformiert wurden, die Bildung
blauer Kolonien nachgewiesen werden konnte (s. Abb. 56, rechte Spalte).
PK PK PK
PK PK PK
1 1 1
2 2 2
3 3 3
4 4 4
5 5 5
6 6 6
7 7 7
8 8 8
9 9 9
10 10 10
PK PK
11 11
12 12
PK
11 12
4 Ergebnisse
132
Abb. 56 : ”Yeast-two-hybrid”-Assay mit der Kombination GRF10 mit Bindungsdomäne und den Arabidopsis 14-3-3s GRF1-12 mit Aktivierungsdomäne. Dargestellt sind links die Ausstriche der transformierten Hefezellen auf -Leu/-Trp Platten als Kontrolle für eine erfolgreiche Transformation der Hefezellen. In der Mitte auf -Trp/-His Platten wuchsen die Hefezellen der Positivkontrolle und die Hefezellen der interagierenden Proteine (mit Pfeilen gekennzeichnet). Rechts im
β-Galactosidase-Filtertest zeigten die Positivkontrolle und die interagierenden
Proteine (mit Pfeilen gekennzeichnet) die Bildung blauer Kolonien, während die Hefekolonien der nicht interagierenden Proteine rot blieben.
Legende zu den Abbildungen: PK=Positivkontrolle 5=GRF10/ GRF5 10=GRF10/ GRF10
1=GRF10/ GRF1 6=GRF10/ GRF6 11=GRF10/ GRF11
2=GRF10/ GRF2 7=GRF10/ GRF7 12=GRF10/ GRF12
3=GRF10/ GRF3 8=GRF10/ GRF8
4=GRF10/ GRF4 9=GRF10/ GRF9
Das zusammenfassende Ergebnis des ”Yeast-two-hybrid”-Assays der gesamten
Matrix ist in folgender Tabelle dargestellt.
GRF1
chi GRF2 omega
GRF3 psi
GRF4 phi
GRF5 upsilon
GRF6 lambda
GRF7 nu
GRF8 kappa
GRF9 mu
GRF10 epsilon
GRF11 omicron
GRF12iota
GRF1 chi − − − − − − − − + + + + GRF2 omega − − − − − − − − + + + + GRF3 psi − − − − − − − − + + + + GRF4 phi − − − − − − − − + + + + GRF5 upsilon − − − − − − − − + + + + GRF6 lambda − − − − − − − − + + + + GRF7 nu − − − − − − − − + + + + GRF8 kappa − − − − − − − − + + + + GRF9 mu + + + + + − + − − − − − GRF10 epsilon + + + + + − + − − − − − GRF11 omicron +A +A +A +A +A +A +A +A +A +A +A +A GRF12 iota + + + + + − + − − − − −
pGADT7
pGBKT7
4 Ergebnisse
133
Demnach interagierte keine Arabidopsis 14-3-3 Isoform mit sich selbst
(„Interaktion“ von GRF11 mit sich selbst beruhte auf Autoaktivität; s. 4.12.3). Die
Isoformen GRF1-8 im pGBKT7-Vektor (mit Bindungsdomäne) interagierten nur mit
den Isoformen GRF9, 10, 11, 12 im pGADT7 Vektor (mit Aktivierungsdomäne),
während die Isoformen GRF9, 10, 12 im pGBKT7 Vektor (mit Bindungsdomäne)
mit den Isoformen GRF1, 2, 3, 4, 5, und 7 im pGADT7-Vektor (mit Aktivierungs-
domäne) interagierten („Interaktionen“ von GRF11 mit Bindungsdomäne mit allen
Isoformen beruhte auf Autoaktivität; s. 4.12.3).
Die Arabidopsis thaliana 14-3-3 Isoformen wiesen somit im „Yeast-two-hybrid“-
Assay keine Homodimerbildung auf, sondern zeigten ausschließlich Hetero-
dimerbildung.
5 Diskussion
134
5 Diskussion
Pflanzen der Arabidopsis thaliana Akzession Wassilewskija (Ws-0) sind resistent
gegenüber dem WELA-Isolat des Oomyceten Hyaloperonospora parasitica.
Dagegen ist die in einer T-DNA markierten Population von Ws-0 (Feldmann und
Marks, 1987) gefundene und im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Mutante
anfällig gegenüber dem WELA-Isolat. Diese Anfälligkeit ist rassenspezifisch, da
sie sich gegenüber anderen Hyaloperonospora parasitica Isolaten wie der Wildtyp
verhält und auch keine morphologischen Unterschiede zum Wildtyp aufweist
(Rempulska-Bujas, 1996). Da es schien, dass in der gr1-Mutante nur eine T-DNA
Insertion in dem bisher noch nicht charakterisierten GR1-Gen vorliegt, wurde
vermutet, dass das GR1-Gen an der rassenspezifischen Resistenz von Ws-0
gegenüber dem WELA-Isolat beteiligt ist.
Um zu klären, ob GR1 in die rassenspezifische Pathogenabwehr involviert ist,
sollte im Rahmen dieser Arbeit das GR1-Gen und die gr1-Mutante näher
charakterisiert, sowie die Funktion des Gens und des Proteins untersucht werden.
5.1 Charakterisierung des GR1-Gens
Zur Identifizierung von Translationsstart, 5`terminalem Transkriptionsstart und zur
Lokalisierung von Promotorelementen, wie „CAAT“- und „TATA“-Box, wurde die
Methode der 5`RACE angewandt (s. 3.15.1). Nach den Ergebnissen der 5´RACE
wurde von den zwei ATG`s am 5`-Ende des GR1-Gens das erste ATG als
Translationsstart identifiziert (s. 4.2.1). Bei der Mehrzahl der Pflanzengene dient
das erste AUG Kodon auf der mRNA als Translationsinitiationstelle (Joshi, 1987a).
Die angrenzenden Sequenzen des putativen GR1-Translationskodons
(AGTTAUGGA) entsprechen nur in zwei Positionen der Konsensussequenz für die
Translationsinitiation pflanzlicher mRNAs (AACAAUGGC) (Joshi, 1987a; Lutcke et
al., 1987).
Beim vermutlichen Transkriptionsstart, der 118bp stromaufwärts des ersten ATG´s
lokalisiert werden konnte, handelt es sich um ein von Pyrimidinbasen umgebendes
Adenin. Dies stimmt mit den Untersuchungen von Joshi (1987a) überein, die
zeigten, dass bei einem Vergleich von 79 publizierten genomischen DNA-
5 Diskussion
135
Sequenzen Höherer Pflanzen, in 85% der pflanzlichen Promotoren ein von
Pyrimidinbasen flankiertes Adenin die Transkriptionsinitiationsstelle ist.
Der Promotorbereich des GR1-Gens enthält 35bp stromaufwärts vom
vermutlichen Transkriptionsstart eine AT-reiche Sequenz, bei der es sich
möglicherweise um eine TATA-Box handelt. Dabei bestätigt sich der für Pflanzen
übliche Abstand von 32±7bp stromaufwärts von der Transkriptionsinitiationsstelle
(Joshi, 1987a). Die Sequenz TAATTAA in GR1 dagegen entspricht nicht der für
Pflanzen gängigen TATA-Box Konsensussequenz TATATATA (Joshi, 1987a) bzw.
der für Eukaryoten beschriebenen Konsensussequenz TATAAA (Bucher und
Trifonov, 1986; Bucher, 1990).
Eine potentielle CAAT-Box, als zweites regulatorisches Promotorelement, befindet
sich 90bp stromaufwärts vom vermutlichen Transkriptionsstart und somit in der für
Eukaryoten üblichen Distanz von –129bp bis –50bp zum Transkriptionsstart
(Bucher und Trifonov, 1986).
Die Ergebnisse der Identifikation des 3`terminalen Transkriptionsendes mit Hilfe
der 3´RACE (s. 3.15.2) zeigen, dass in GR1 kein strikt definiertes Transkriptions-
ende existiert und die Transkripte in AT-reichen Regionen enden (s. 4.2.2). Dieses
Phänomen, das vermutlich auf alternativer Transkriptions-Termination beruht,
wurde auch für andere Pflanzengene beschrieben (Rabinowicz et al., 1996;
Krüger et al., 2002). So identifizierten beispielsweise Krüger et al. (2002) im Rcr3-
Gen der Tomate drei verschiedene 3´-Enden.
Dass kein Polyadenylierungssignal mit der klassischen Konsensussequenz
AATAAA (Proudfoot und Brownlee, 1976) in der Terminationsregion von GR1
nachgewiesen werden konnte, stimmt mit zahlreichen Beobachtungen bei anderen
Pflanzengenen überein (Dhaese et al., 1983; Dean et al., 1986; Hunt, 1988; Hunt
et al., 1987, 1989; Mogen et al., 1990). Weniger als 50% der Pflanzen mRNAs
weisen eine AATAAA Sequenz in der Nähe ihrer poly(A) Stelle auf (Wu et al.,
1995). Ein Vergleich von 46 publizierten genomischen DNA-Sequenzen Höherer
Pflanzen zeigte, dass eine Vielzahl verschiedener AATAAA-ähnlicher
Konsensussequenzen als putative Polyadenylierungssignale in Pflanzengenen
vorkommen (Joshi, 1987b).
Zusammenfassend ist festzustellen, dass GR1 am 5´-Ende z.T. deutlich vom
Konsensus anderer Pflanzengene abweicht, während am 3`-Ende fast kein
5 Diskussion
136
Konsensus bei Pflanzen existiert, aber der kleinste gemeinsame Nenner 5` wie 3´
bei GR1 durchaus erfüllt wird.
5.2 Charakterisierung der gr1-Mutante
Charakterisierung der „left-“ und „right-border“ der T-DNA Insertionsstellen
Die Lokalisierung der T-DNA in der gr1-Mutante (s. 4.3), erfolgte im Hinblick auf
die genaue Identifizierung der Positionen der „left“- und „right-border“, um somit
Information über eventuell auftretende Rearrangements an den Insertionsstellen
der T-DNA im GR1-Gen zu erlangen. Durch die T-DNA Integration in das Genom
können verschiedenartige Rearrangements in der Ziel-DNA Sequenz an den
Insertionsstellen der T-DNA-border hervorgerufen werden, so wurde
beispielsweise über interchromosomale Translokationen (Nacry et al.,1998; Tax
und Vernon, 2001), Duplikationen von DNA-Sequenzen, Deletionen, Austausch
einzelner Nukleotide oder Einbau von Füll-DNA (Gheysen et al., 1987; Ohba et al.,
1995) berichtet. Auch bei den Feldmann-Linien sind derartige Rearrangements als
Folge der T-DNA Integration im Arabidopsis Genom beobachtet worden
(Franzmann et al., 1992; Negruk et al., 1996; Feldmann et al., 1997; Maldonado et
al., 2002).
Da keine Sequenzinformationen zur „left“- und „right-border“ der T-DNA der
Feldmann-Linien zur Verfügung standen, konnte eine Lokalisierung der T-DNA
mittels PCR durch Einsatz von border-spezifischen in Kombination mit GR1-
genspezifischen Primern nicht durchgeführt werden. Dennoch wurde die „right-
border“ der T-DNA im 3. Exon 1921bp stromabwärts vom ATG problemlos
lokalisiert, da Plasmid-DNA basierend auf einem genomischen DNA-Fragment,
das ursprünglich zum Isolieren des Volllängen-GR1-Klons eingesetzt wurde
(Rempulska-Bujas, 1996), vorhanden war und somit sequenziert werden konnte
(s. 4.3.2). Die Identifizierung und Lokalisierung der „left-border“ der T-DNA
dagegen gestaltete sich relativ schwierig, denn die Anwendung einer PCR mit
Primern aus dem Kanamycin-Marker der T-DNA in Kombination mit GR1-
genspezifischen Primern war nicht durchführbar. Ebenso blieben mehrfache
Versuche zur Amplifizierung der gesamten T-DNA mit rechts und links der T-DNA
positionierten GR1-genspezifischen Primern unter Verwendung von speziellen
5 Diskussion
137
Polymerase-Gemischen erfolglos. Diese Probleme könnten eventuell auf
Sekundärstrukturen, Duplikationen und/ oder Rearrangements in der T-DNA
beruhen.
Mit der Methode des „Genome Walking“ (s. 3.16) konnte letztendlich die
Lokalisierung der „left-border“ der T-DNA im 3. Exon 1843bp stromabwärts vom
ATG durchgeführt werden. An dieser Position endete die GR1-Sequenz und ging
in eine bis dahin unbekannte Sequenz über, bei der es sich wahrscheinlich um
Füll-DNA oder aber um T-DNA Sequenz handelte (s. 4.3.1), die sich in den
Leserahmen von GR1 einfügte und in der nach 44 Nukleotiden ein Stopcodon
auftrat. Dass nur noch drei Nukleotide stromabwärts vom Stopcodon in der „left-
border“ zuverlässig identifiziert werden konnten, weil mehrere Sequenzier-
versuche keine zuverlässigen Sequenzdaten lieferten bzw. die
Sequenzierreaktionen immer relativ schnell abbrachen, deutet ebenfalls auf
mögliche Sekundärstrukturen oder Rearrangements in der T-DNA hin.
Analog zu den Beobachtungen von Negruk et al. (1996) und Feldmann et al.
(1997), die über Deletionen in Mutanten der Feldmann-Linien berichteten, wurde
auch in der gr1-Mutante infolge der T-DNA Integration eine 78bp große Deletion
im 3. Exon von GR1 festgestellt.
Somit zeigte die Charakterisierung der „left“- und „right-border“ der T-DNA
Insertionsstellen, dass auch in GR1 keine „glatte“ Integration der T-DNA vorlag,
sondern komplexe Veränderungen sowohl in der Pflanzen-DNA als auch in der T-
DNA, die mit der Integration ins Pflanzengenom einhergingen.
“Gain-of-function” Hypothese
Die Integration der T-DNA in ein Gen kann entweder zur „Knockout“-Mutation und
somit zum phänotypischen Funktionsverlust, oder durch Bildung eines neuen
Fusionsproteins zum phänotypischen Funktionsgewinn („gain-of-function“
Mutation) führen. Dabei kann der phänotypische Funktionsgewinn auf der
Interferenz des aberranten Peptids mit der Funktion des durch die T-DNA
inaktivierten Gens oder auf einer von der Funktion des inaktivierten Gens
unabhängigen neuen Funktion beruhen.
Da in der gr1-Mutante die Expression des 1. bis 3. Exon bis zur T-DNA Insertion
und der GR1 fremden „in frame“ Nukleotide der „left-border“ nachgewiesen wurde
5 Diskussion
138
(s. 4.6.2, Abb. 26, Spur 12, Fragmentlänge 580bp), eröffnete sich die Möglichkeit,
dass der Phänotyp der gr1-Mutante auf einem Funktionsgewinn beruhen könnte.
Mit zwei unterschiedlichen Vorgehensweisen sollte untersucht werden, ob es sich
bei der gr1-Mutante um eine „gain-of-function“ Mutante handelt. Wenn das
aberrante Peptid für den anfälligen Phänotypen verantwortlich wäre, dann sollte
einerseits durch Transformation der gr1-Mutante mit RNAi-Konstrukten eine
Umkehrung zum resistenten Wildtyp-Phänotypen erzielt werden. Andererseits
sollte durch Transformation des Ws-Wildtyps mit einem Konstrukt, welches dem
aberranten gr1-Transkript entspricht, eine Reproduktion des anfälligen Phänotyps
der gr1-Mutante möglich sein.
Die Resultate der Untersuchungen zeigen jedoch, dass weder die 500-1000fache
Reduktion der Transkriptmengen des aberranten Transgens in mehreren Linien
der mit den RNAi-Konstrukten transformierten gr1-Mutante zum resistenten Ws-
Wildtyp-Phänotypen, noch die Transformation des Ws-Wildtyps mit einem dem
aberranten gr1-Transkript entsprechenden Konstrukt zum anfälligen Mutanten
geführt hatten (s. 4.9). Diese Ergebnisse scheinen somit die „gain-of-function“
Hypothese zu widerlegen. Allerdings kann aufgrund meiner Daten nicht
ausgeschlossen werden, dass in der gr1-Mutante ein Funktionsgewinn vorliegt,
der auf alternatives Spleißen des 2. Introns zurückzuführen ist.
Untersuchung der Transkripte der gr1-Mutante
Erste Hinweise auf alternatives Spleißen lieferte die Überprüfung der Expression
des aberranten Transgens in den transformierten Ws-Linien mittels RT-PCR, bei
der mit der verwendeten Primerkombination nur ein Transkript nachgewiesen
wurde (s. 4.9.4, Abb. 40 Spuren 2-4 und 4.10, Spur 7). Bei der Kontrolle der gr1-
Mutante dagegen traten mit derselben Primerkombination mehrere Transkripte auf
(s. 4.9.4, Spur 6; traten schon im vorhergehenden Versuch auf, wurden aber bis
zu diesem Zeitpunkt wegen fehlender Vergleichsmöglichkeiten fälschlicherweise
für unspezifische Amplifikations-Produkte der Primer gehalten). Durch hochauf-
lösende Agarosegel-Analyse wurde festgestellt, dass es sich um insgesamt sechs
Transkripte handelt (s. 4.10, Spur 3). Die Ergebnisse der Sequenzanalysen von
drei erfolgreich klonierten Transkripten zeigten, dass in der gr1-Mutante,
hervorgerufen durch die T-DNA-Insertion im 3. Exon, das „normale“ Spleißen des
5 Diskussion
139
2. Introns beeinträchtigt war und alternativ gespleißt wurde. Somit könnte die
Möglichkeit bestehen, dass durch das alternative Spleißen in der gr1-Mutante aus
der aberranten GR1-DNA-Sequenz bzw. deren prä-mRNA mehrere verschiedene
reife mRNA-Moleküle und durch deren Translation mehrere funktionell
unterschiedliche Proteine gebildet werden, die dann eventuell zu einem
Funktionsgewinn führen. Dass der Funktionsgewinn Einfluss bzw. Auswirkungen
auf den anfälligen Phänotyp der gr1-Mutante hat, ist nach den Ergebnissen, die im
Rahmen der Untersuchungen zur „gain-of-function“ Hypothese erzielt wurden,
jedoch relativ unwahrscheinlich. Denn die Reduktion der mRNA Level der
aberranten GR1-Transkripte in den transgenen Linien der gr1-Mutante durch RNAi
hatte nicht zum Auslösen der Resistenz gegenüber WELA geführt. Dass bereits
eine ca. 50%ige Reduktion der mRNA Level mit Hilfe der RNA Interferenz
ausreichen, um wirksam die Genexpression zu hemmen, konnten Gupta et al.
(2002) für das AtPTEN1 Gen zeigen, das für die Pollen-Entwicklung in Arabidopsis
essentiell ist. So berichteten die Autoren, dass die Reduktion der AtPTEN1
Genexpression zum Pollen-Zelltod nach der Mitose geführt hatte.
Das Phänomen des alternativen Spleißens wird für 7-10% der Gene des
Arabidopsis Genoms vorhergesagt, wobei ungefähr 30% dieser Gene „Intron-
Retention“ aufweisen (Ner-Gaon et al., 2004), d.h. ein Intron wird nicht gespleißt
oder die Transkripte beginnen oder enden in einem Intron. Dass nicht gespleißte
Introns Teil der CDS werden können, sich in den Leserahmen einfügen und „in-
frame“ Stopcodons enthalten, konnte an den Beispielen des CUTA-Gens
(Burkhead et al., 2003) und des RPS4-Gens (Zhang und Gassmann, 2003) aus
Arabidopsis bzw. deren aberranten Transkripten gezeigt werden. Auch bei den
aberranten GR1-Transkripten fügten sich jeweils die Sequenzen des alternativ
gespleißten 2. Introns in den Leserahmen ein. So trat beim Transkript mit Intron (s.
4.10, Abb. 41, Spur 3, Bande 6 und Abb. 42) nach 81 Nukleotiden und beim
Transkript mit teilweise gespleißtem Intron (s. 4.10, Abb. 41, Spur 3, Bande 3 und
Abb. 42) nach 15 Nukleotiden ein Stopcodon im 2. Intron auf.
Da bisher schon drei spezifische aberrante GR1-Transkripte identifiziert worden
sind, und sich die Anzahl eventuell auf sechs Transkripte erhöhen könnte, wird es
schwierig sein, die Bedeutung bzw. Funktion des alternativen Intron-Spleißens in
der gr1-Mutante zu analysieren.
5 Diskussion
140
Zusammenfassend ist festzustellen, dass eine „gain-of-function“ Mutation im
Hinblick auf den Anfälligkeitsphänotyp der gr1-Mutante sehr unwahrscheinlich zu
sein scheint.
5.3 Funktionstests
Versuch der Komplementierung des anfälligen Phänotypen der gr1-Mutante
Eine der Möglichkeiten zu überprüfen, ob ein mutiertes Gen für den Phänotyp
einer Mutante verantwortlich ist, ist die Komplementation. Dabei werden Pflanzen
einer Mutante mit einem transgenen Konstrukt, das der Wildtyp-Sequenz
entspricht, transformiert.
Durch Transformation der gr1-Mutante mit einem GR1-CDS Konstrukt unter
Kontrolle des nativen GR1-Promotors konnte der anfällige Phänotyp der gr1-
Mutante nicht komplementiert werden, obwohl mit Hilfe von RT-PCR gezeigt
wurde, dass das Transgen in den Pflanzen exprimiert wurde (s. 4.6). Dieses
Ergebnis stellt somit eine Beteiligung des GR1-Gens an der rassenspezifischen
Resistenz von Ws-0 gegenüber dem WELA-Isolat in Frage.
An dieser Stelle sei darauf hingewiesen, dass kurz vor Beendigung der Versuche
zur Arbeit entdeckt wurde, dass das für die Komplementierungsversuche
verwendete Konstrukt fehlerhaft war. So befand sich das Stopcodon nicht
unmittelbar am 3´-Ende der GR1-CDS, sondern zwölf Nukleotide weiter
stromabwärts. Somit wurden vier Aminosäuren zusätzlich exprimiert, die nicht zur
GR1-CDS gehören, was möglicherweise Auswirkungen auf die Eigenschaften des
eingeführten Gens haben könnte. Dadurch besteht die Möglichkeit, dass eventuell
die Komplementation des Mutanten Phänotypen verhindert wurde. Andererseits ist
aber zu bedenken, dass der anfällige Phänotyp der gr1-Mutante auch nicht mit
Hilfe von drei unterschiedlich langen, genomischen Konstrukten komplementiert
werden konnte (Kruse, 2001).
5 Diskussion
141
Transformation des Ws-Wildtyps mit RNAi-Konstrukten
Neben Komplementationstests stellt das „Gene-Silencing“ ein wichtiges Hilfsmittel
in der Genfunktionsanalyse dar, indem durch Einschleusen von doppelsträngiger
RNA (dsRNA), die komplementär zu spezifischen Gensequenzen ist, die
Expression des zugehörigen Gens reduziert oder sogar verhindert wird.
Die Ergebnisse der Transformation des Ws-Wildtyps mit RNAi-Konstrukten
befinden sich in sehr guter Übereinstimmung mit den Resultaten der
Komplementierungsversuche. So konnte mit Hilfe des „Gene-Silencing“ der
anfällige Phänotyp der gr1-Mutante nicht reproduziert werden, obwohl in den
transgenen Linien des Ws-Wildtyps die Transkriptmengen von GR1 reduziert
waren (s. 4.8). Da GR1 ein konstitutiv sehr schwach exprimiertes Gen ist und der
Expressionsnachweis nur mittels RT-PCR (s. 4.1) bzw. Northern-blot
Hybridisierung erst infolge von Verwundungsinduktion gelang (Kruse, 2001), kann
davon ausgegangen werden, dass die 250-500fache Reduktion der mRNA Level
von GR1 in den transgenen Wildtyp-Linien ausreichte, um die Genexpression
wirksam zu hemmen. Somit deuten auch die Ergebnisse des „Gene-Silencing“
darauf hin, dass GR1 wahrscheinlich keinen Einfluss auf die Resistenz von Ws-0
gegenüber WELA hat.
Kreuzung der gr1-Mutante mit dem Ws-Wildtyp
Unabhängig von den Resultaten der Komplementierungsversuche und des „Gene-
Silencing“ zeigten die neusten Ergebnisse einer Kreuzung zwischen der gr1-
Mutante und dem Ws-Wildtyp, die freundlicherweise von Frau Koch durchgeführt
wurde, dass in der F1-Generation die Nachkommen der Mutante nach Inokulation
mit WELA makroskopisch keine Konidiophorenbildung und mikroskopisch
überwiegend HR aufweisen (pers. Mitteilung Frau Noll; Ergebnisse nicht gezeigt).
Dass durch Einkreuzung des Wildtyp-Genoms der anfällige Mutanten Phänotyp
offenbar komplementiert werden konnte, weist ebenfalls darauf hin, dass eine
Beteiligung des GR1-Gens an der rassenspezifischen Pathogenabwehr von Ws-0
gegenüber WELA unwahrscheinlich ist. Deshalb liegt die Vermutung nahe, dass in
der gr1-Mutante wahrscheinlich in der Nähe zum GR1-Gen noch ein weiteres Gen
mutiert ist, das den anfälligen Mutanten Phänotypen verursacht.
5 Diskussion
142
Über Rearrangements, hervorgerufen durch die T-DNA Integration, die nicht die
Insertionsstellen der T-DNA betreffen, wurde von Dietrich et al. (1997) berichtet.
Die Autoren fanden in der lsd1-Mutante, die wie die gr1-Mutante auch den
Feldmann-Linien entstammte, eine ungefähr 900bp große Deletion, die nicht mit
der T-DNA Insertion assoziierte, sich aber in der Nähe zum inaktivierten Gen
befand.
Um Rearrangements in einem anderen Gen zu identifizieren, wäre es deshalb
sinnvoll, die Komplementierungsversuche mit verschiedenen BAC-Klonen, die
größere Bereiche des Chromosoms 1 in der Nähe des GR1-Gens abdecken, zu
wiederholen. Darüber hinaus könnte durch Untersuchung einer unabhängigen gr1-
Mutante im Ws-0 Hintergrund, die auf ihr Verhalten gegenüber WELA getestet
wird, abschließend geklärt werden, dass GR1 wahrscheinlich keine Rolle in der
rassenspezifischen Pathogenabwehr spielt.
Suche nach unabhängigen gr1 T-DNA-Mutanten
Bei der Suche nach einer unabhängigen gr1-Mutante in der T-DNA-markierten
Population im Ws-0 Hintergrund der University of Wisconsin-Madison (Sussmann
et al., 2000) konnte keine Mutante mit einer Exon T-DNA-Insertion im GR1-Gen
gefunden werden. Bei den zwei identifizierten unabhängigen Mutanten war
stattdessen die T-DNA jeweils im 2. Intron inseriert (s. 4.7). Da die
Untersuchungen zeigten, dass das Intron normal gespleißt wurde, konnten im
Hinblick auf die Funktion von GR1 keine neuen Erkenntnisse gewonnen werden.
Bei zwei weiteren unabhängigen gr1-Mutanten, die T-DNA markierten Linien im
Columbia-Hintergrund entstammen und vom Salk-Institut zur Verfügung gestellt
wurden, ist die T-DNA im GR1-Gen jeweils im 3. Exon in der Nähe zur T-DNA
Insertion unserer gr1-Mutante inseriert. Die Akzession Columbia ist ebenso wie
Ws-0 resistent gegenüber dem WELA-Isolat. Für die rassenspezifische Resistenz
bzw. Pathogenerkennung gegenüber dem WELA-Isolat ist in Ws-0 das noch nicht
klonierte RPP12-Gen auf Chromosom 4 verantwortlich. Dagegen erfüllt diese
Funktion in Columbia das noch nicht klonierte RPP6-Gen auf Chromosom 1. Da
vermutet wurde, dass die Gegenwart von GR1 für RPP12 zur Auslösung der
Resistenzreaktion gegenüber WELA erforderlich sein könnte (s. 1.5), müsste
5 Diskussion
143
zunächst der Columbia-Hintergrund durch Rückkreuzungen der beiden Linien mit
Ws-0 eliminiert werden. Auf diese Weise könnte dann mit Hilfe dieser beiden
unabhängigen Mutanten Erkenntnisse über die Funktion von GR1 im Hinblick auf
das Resistenzverhalten von Ws-0 gegenüber dem WELA-Isolat erlangt werden.
5.4 Funktion des GR1-Proteins
Expression des GR1-Proteins
Um zelluläre Lokalisationsstudien mit Hilfe GR1-spezifischer Antikörper
durchführen zu können, die evtl. Hinweise auf eine mögliche Funktion von GR1
erlauben, musste zunächst das GR1-Protein exprimiert werden, um Antikörper
herstellen zu lassen.
Im Hinblick auf die Vorteile des bakteriellen Expressionsystems mit einer Anzucht
der Bakterien im großen Maßstab und einer hohen Proteinausbeute, wurde
versucht, das GR1-Protein in E. coli zu exprimieren. Dass die Expression des
GR1-Proteins, obwohl zwei verschiedene Vektoren (pQE60 und pET29a) und
insgesamt drei verschiedene E. coli Stämme (M15, SG13009 und BL21) getestet
wurden (s. 4.11.1), im bakteriellen System nicht durchführbar war, scheint auf
toxischen Effekten des Proteins zu beruhen. Darauf deuten auch die erfolglosen
Transformationsversuche hin, die im Rahmen der Komplementierungsversuche
durchgeführt wurden (s. 4.6). Da der CaMV35S-Promotor in Agrobakterien aktiv ist
(Ferrando et al., 2000), könnte dies die Ursache dafür sein, dass bei der
Überexpression der GR1-CDS unter Kontrolle des 35S-Promotors im
Agrobakterien-Stamm GV3101 nach Transformation der gr1-Mutante keine
transgenen Pflanzen gewonnen werden konnten. Darüber hinaus führte die
Überexpression der GR1-CDS unter Kontrolle des 35S-Promotors im
Agrobakterien-Stamm ASE zum Verlust des Plasmides während der
Inkulturnahme des Stammes. Erst nach Austausch des 35S-Promotors gegen den
nativen GR1-Promotor konnte sowohl die Kultivierung der Agrobakterien als auch
die Transformation der gr1-Mutante erfolgreich durchgeführt werden (s. 4.6.1-
4.6.2).
Mit dem System der zellfreien Proteinexpression (Spirin et al., 1988), das auch die
Expression toxischer Proteine ermöglicht, wurde das GR1-Protein letztendlich
5 Diskussion
144
erfolgreich exprimiert. Das für die Proteinexpression eingesetzte System scheint
allerdings noch nicht vollständig ausgereift zu sein. Denn eine Aufreinigung des
GR1-Proteins für die Herstellung von Antikörpern war nicht durchführbar, weil
offensichtlich der Proteinexpression zugesetzte Reaktionskomponenten die
Aufreinigung des His-tags störte (pers. Mitteilung Firma Roche).
Untersuchung der Interaktion des GR1-Proteins mit Arabidopsis 14-3-3 Proteinen im ”Yeast-two-hybrid”-Assay
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Untersuchungen im Hinblick auf eine mögliche
Bindung des GR1-Proteins an Arabidopsis 14-3-3 Proteine im „Yeast-two-hybrid“-
Assay durchgeführt. Dies geschah vor dem Hintergrund, dass in der Arbeit von
Frau Kruse (2001) nach Entdeckung von zwei nahezu perfekten Konsensusstellen
für die Bindung von 14-3-3 Proteinen in GR1 eine Interaktion des GR1-Proteins
mit 14-3-3 Proteinen aus Gerste, die dort nach Infektion mit Blumeria graminis
induziert werden (Brandt et al., 1992), im „Yeast-two-hybrid“-Assay gezeigt wurde
(s. 4.12.1, Abb. 46 und Abb. 47, Ergebnisse aus Dänemark). Darüber hinaus
zeigte das Beispiel des Arabidopsis AKR2 Proteins (ankyrin repeat protein), dass
ein Protein, welches in der pflanzlichen Pathogenabwehr eine Rolle spielt, im
“Yeast-two-hybrid“-Assay mit der Arabidopsis 14-3-3 Isoform GRF6 interagierte
(Yan et al., 2002).
Da sich im Rahmen dieser Arbeit die Ergebnisse aus Dänemark nicht
reproduzieren ließen und keine Interaktion zwischen dem GR1-Protein und den
Arabidopsis 14-3-3 Proteinen nachgewiesen werden konnte (s. 4.12.4), weichen
die Konsensusmotive in GR1 vermutlich doch zu stark von den charakteristischen
Motiven a) RSxpSxP (Muslin et al., 1996), b) RxF/YxpSxP (Yaffe et al., 1997) und
c) RxSxpSxP (Andrews et al., 1998) für die Bindung von 14-3-3 Proteinen ab. Das
in GR1 an der Position 246 gefundene Konsensusmotiv IGSRSGP ist den
Konsensusmotiven a und c ähnlich, unterscheidet sich aber jeweils von diesen in
der ersten Aminosäure. Da es sich bei den charakteristischen Motiven bei der
ersten Aminosäure mit Arginin (R) um eine positiv geladene Aminosäure und im
Gegensatz dazu im GR1-Motiv mit Isoleucin (I) bzw. Glycin (G) um nichtpolare,
aliphatische Aminosäuren handelt, wird wahrscheinlich die Bindung von GR1 an
14-3-3 Proteine verhindert. Die Übereinstimmungen des in GR1 an der Position
5 Diskussion
145
326 gefundenen Konsensusmotivs RAFSNS mit dem Konsensusmotiv b betreffen
die ersten drei Aminosäuren. Dagegen weicht das GR1-Motiv von Motiv b ab
bzgl.:
• der Anzahl der Aminosäuren (bei GR1-Motiv 6, im Vergleich zu sieben
Aminosäuren bei Motiv b),
• der Position des phosphorylierten Serins (bei GR1-Motiv Position 4, im
Vergleich zu Position 5 bei Motiv b)
• und der letzten Aminosäure (bei GR1-Motiv mit Serin (S), einer polaren,
ungeladenen Aminosäure im Vergleich zu Prolin (P), einer nichtpolaren,
aliphatischen Aminosäure bei Motiv b).
Obwohl bekannt ist, dass einige Proteine mit suboptimalen Konsensusmotiven an
14-3-3 Proteine binden (Yaffe et al., 1997), sind im Falle von GR1 die
Motivabweichungen aber offenbar zu groß, so dass keine Bindungen mit 14-3-3
Proteinen nachgewiesen werden konnten.
5.5 Untersuchung der Interaktion der Arabidopsis 14-3-3 Proteine untereinander im ”Yeast-two-hybrid”-Assay
Die in der vorliegenden Arbeit ermittelten Ergebnisse des ”Yeast-two-hybrid”-
Assay zum Interaktionsverhalten der Arabidopsis 14-3-3 Proteine untereinander
(s. 4.12.5), stimmen nicht mit den Resultaten von Wu et al. (1997b) überein. Dass
die Arabidopsis 14-3-3 Proteine (GRF1-6, 8 und 10) alle mit sich selbst und mit
den jeweils anderen Isoformen im ”Yeast-two-hybrid”-Assay interagieren, und
somit sowohl Homo- als auch Heterodimere bilden (Wu et al., 1997b), konnte nicht
bestätigt werden. Nach den Ergebnissen der hier vorliegenden Arbeit weisen die
Arabidopsis 14-3-3 Isoformen (GRF1-12) im ”Yeast-two-hybrid”-Assay keine
Homodimerbildung, sondern ausschließlich Heterodimerbildung auf und
interagieren dabei nur mit bestimmten Isoformen.
Ursachen für die widersprüchlichen Ergebnisse scheinen auf methodische
Unterschiede vor allem bzgl. des Nachweises der Interaktionen zu beruhen. So
wurden in der Arbeit von Wu et al. (1997b) nach dem Ausplattieren der
kotransformierten Hefezellen auf -Leu/-Trp Platten und -Leu/-Trp/-His Platten, und
anschließendem Wachstum für 4 Tage bei 30°C die Anzahl der Hefekolonien auf
5 Diskussion
146
beiden Platten lediglich ausgezählt. Die Histidin-Reportergen Aktivität wurde dann
prozentual ermittelt, indem die Anzahl der Hefekolonien der -Leu/-Trp/-His Platten
durch die Anzahl der Hefekolonien der -Leu/-Trp Platten dividiert wurden. Den
Nachweis der Interaktion nur anhand der Anzahl der gewachsenen Kolonien auf
den selektiven Medien zu beurteilen, sind nach eigenen Erfahrungen relativ
problematisch, zumal Wu et al. (1997b) berichteten, dass die Fusionsproteine im
pGBT9-Vektor mit Bindungsdomäne alle schwache Autoaktivität aufwiesen.
Darüber hinaus tritt auf den -Leu/-Trp/-His Platten immer ein gewisses
„Hintergrund“-Wachstum der Hefezellen auf, was durch Zugabe von 3-AT (3-
Amino-1,2,4-Triazole) unterdrückt wird, aber nicht vollständig verhindert werden
kann. Weiterhin ist denkbar, dass die Hefezellen unterschiedliche Affinitäten zu
den verschiedenen Isoformen aufweisen bzw. die Transformationseffizienz für die
Isoformen nicht einheitlich ist, was somit ebenfalls die Anzahl der Kolonien
beeinflussen kann.
Um beim Nachweis der Interaktion zuverlässige Ergebnisse zu erzielen, wurde im
Rahmen der hier vorliegenden Arbeit nach dem Ausplattieren der
kotransformierten Hefezellen auf -Leu/-Trp Platten und -Leu/-Trp/-His Platten, und
anschließendem Wachstum für eine Woche bei 28°C, das Wachstum der Hefen
auf den -Leu/-Trp/-His Platten überprüft. Zusätzlich wurde als zweiter
unabhängiger Nachweis der ß-Galactosidase Filtertest durchgeführt, welcher das
Ergebnis des Wachstumstests bestätigte (s. 4.12.5, Abb. 55 und 56). Darüber
hinaus wurde vor der eigentlichen Untersuchung des Interaktionsverhaltens der
Isoformen untereinander überprüft, ob die Fusionsproteine im pGBKT7-Vektor mit
Bindungsdomäne autoaktivierend wirken, um auszuschließen, dass falsch positive
Interaktionen vorgespiegelt werden (s. 4.12.3).
Die auf diese Weise ermittelten Ergebnisse der systematischen Untersuchung des
Interaktionsverhaltens der zwölf nachweislich exprimierten Isoformen unter-
einander (s. 4.12.5; GRF1-12), befinden sich zudem in sehr guter Überein-
stimmung mit dem von Rosenquist et al. (2001) für die Arabidopsis 14-3-3
Isoformen erstellten phylogenetischen Baum (s. Abb. 57). Danach lassen sich die
Isoformen in zwei größere Gruppen einteilen, wobei die Isoformen GRF1-5 und 7
sowie 6 und 8 im unteren Bereich des Baumes eine Gruppe und die Isoformen
GRF9-14 im oberen Bereich des Baumes eine zweite Gruppe bilden.
5 Diskussion
147
Abb. 57: Phylogenetischer Baum der Arabidopsis 14-3-3 Protein-Familie in Anlehnung an
Rosenquist et al. (2001).
Dies spiegelt in gewisser Weise das im „Yeast-two-hybrid“-Assay ermittelte
Interaktionsverhalten der Isoformen untereinander wider. So interagierte keine
Arabidopsis 14-3-3 Isoform mit sich selbst („Interaktion“ von GRF11 mit sich selbst
beruht auf Autoaktivität; s. 4.12.3), und auch nicht mit den Isoformen, die nah
verwandt sind und somit derselben Gruppe angehören. Stattdessen interagierten
die Isoformen GRF1-8 der unteren Gruppe des Baumes (im pGBKT7 Vektor mit
Bindungsdomäne) mit den Isoformen GRF9, 10, 11, 12 der oberen Gruppe des
Baumes (im pGADT7 Vektor mit Aktivierungsdomäne). Auch in der umgekehrten
Kombination interagierten die Isoformen GRF1, 2, 3, 4, 5, und 7 (im pGADT7
Vektor mit Aktivierungsdomäne) mit den Isoformen GRF9, 10, 12 (im pGBKT7
Vektor mit Bindungsdomäne; „Interaktionen“ von GRF11 mit Bindungsdomäne mit
allen Isoformen beruhte auf Autoaktivität; s. 4.12.3). Eine Ausnahme in dieser
Kombination stellten die Isoformen GRF6 und 8 (im pGADT7 Vektor mit
Aktivierungsdomäne) dar, die innerhalb der unteren Gruppe des Baumes eine
kleine Untergruppe bilden und nicht mit den Isoformen GRF9, 10, 12 (im pGBKT7
5 Diskussion
148
Vektor mit Bindungsdomäne) interagierten. Die „Interaktionen“ mit der Isoform
GRF11 mit Bindungsdomäne dagegen beruhte auf Autoaktivität (s.o.).
Systematische Untersuchungen zum Interaktionsverhalten der Arabidopsis 14-3-3
Proteine untereinander mit Hilfe der in vivo Methode des „Yeast-two-hybrid“-
Assays wurden bisher nur in der hier vorliegenden Arbeit und in der Arbeit von Wu
et al. (1997b) durchgeführt. Ansonsten wurden zur Analyse des
Dimerisierungsverhaltens einiger Arabidopsis Isoformen vor allem in vitro
Methoden angewandt, mit dem Ergebnis, dass die Arabidopsis Proteine sowohl
Homo- als auch Heterodimere bilden (Wu et al., 1997b; Abarca et al., 1999).
Darüber hinaus konnten Abarca et al. (1999) zeigen, dass bei Untersuchungen der
Interaktion zwischen verschiedenen verkürzten CDS-Konstrukten der Isoform
GRF3 mit der jeweiligen Volllängen-CDS der Isoformen GRF3 und GRF6 von den
insgesamt neun Helices nur die vierte Helix für die Dimerisierung erforderlich war.
Bei 14-3-3 Proteinen der Säugetiere wurde dagegen berichtet, dass von den neun
antiparallelen Helices der Monomere, die ersten vier Helices der N-terminalen
Domäne für die Dimerisierung notwendig waren (Liu et al., 1995; Xiao et al.,
1995). Darüber hinaus wurde sowohl in vitro mit Crosslinker-Studien als auch in
vivo durch Koimmunopräzipitation und Western-blot Analyse gezeigt, dass 14-3-3
Proteine bei Säugetieren über ihre N-terminale Domäne Homo- und Heterodimere
bildeten (Jones et al., 1995).
Da die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit dem bisher beschriebenen
Interaktionsverhalten der 14-3-3 Proteine widersprechen, soll in weiterführenden
Studien mit Hilfe einer alternativen Methode versucht werden, die Resultate des
„Yeast-two-hybrid“-Assays zu bestätigen.
5.6 Zusammenfassender Ausblick
Da die im Rahmen der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnissen zeigten, dass
• die Komplementationsversuche des anfälligen gr1-Mutanten Phänotypen mit
einem nativen GR1 Promotor::GR1-CDS Konstrukt nicht zum resistenten
Wildtyp Phänotypen,
• das „Gene-Silencing“ im Ws-Wildtyp nicht zum anfälligen Mutanten
Phänotypen,
5 Diskussion
149
• das „Gene-Silencing“ in der gr1-Mutante nicht zum resistenten Wildtyp
Phänotypen
• und die Transformation des Ws-Wildtyps mit dem „gain-of-function“ Konstrukt,
das dem aberranten gr1-Transkript entspricht, nicht zum anfälligen Mutanten
Phänotypen
geführt hatten, ist das GR1-Gen wahrscheinlich nicht an der rassenspezifischen
Resistenz der Akzession Wassilewskija (Ws-0) gegenüber dem WELA-Isolat von
Hyaloperonospora parasitica beteiligt.
Da vermutlich ein weiteres Gen in der gr1-Mutante infolge der T-DNA Integration
mutiert ist, könnten Komplementierungsversuche mit verschiedenen BAC-Klonen,
die größere Bereiche des Chromosoms 1 in der Nähe des GR1-Gens abdecken,
zur Aufdeckung einer weiteren Mutation beitragen.
Ein weiterer Versuch, der abschließend bestätigen könnte, dass das GR1-Gen
wahrscheinlich keine Rolle in der rassenspezifischen Pathogenabwehr spielt,
könnte mit Hilfe der beiden unabhängigen gr1-Mutanten der Salk-Linien
durchgeführt werden, indem der Columbia-Hintergrund durch Rückkreuzungen der
beiden Linien mit Ws-0 eliminiert und anschließend ihr Verhalten gegenüber
WELA getestet wird.
Die Aufdeckung des alternativen Spleißens des 2. Introns in der gr1-Mutante,
hervorgerufen durch die T-DNA Insertion, eröffnet die Möglichkeit, dass in der gr1-
Mutante ein Funktionsgewinn vorliegen könnte. Da aber nach den
Untersuchungsergebnissen zur „gain-of-function“ Hypothese ein Einfluss auf den
anfälligen Phänotyp der gr1-Mutante relativ unwahrscheinlich ist und die gr1-
Mutante ansonsten keine phänotypischen Unterschiede zum Ws-Wildtyp aufweist,
wird es schwierig sein, die Auswirkungen des alternativen Intron-Spleißens im
Hinblick auf einen möglichen Funktionsgewinn zu analysieren. Sollten weitere
Untersuchungen durchgeführt werden, müsste zunächst geklärt werden, ob es
sich bei den bisher noch nicht analysierten Transkripten um spezifische aberrante
GR1-Transkripte handelt.
Weitergeführt werden sollen auch die Untersuchungen zum Interaktionsverhalten
der Arabidopsis 14-3-3 Proteine untereinander, um mit Hilfe einer alternativen
Methode zu versuchen, die Resultate des „Yeast-two-hybrid“-Assays zu
bestätigen.
6 Zusammenfassung
150
6 Zusammenfassung
Arabidopsis thaliana zeigt eine rassenspezifische Interaktion zum obligat
biotrophen Oomycet Hyaloperonospora parasitica. So ist die Akzession
Wassilewskija (Ws-0) resistent gegenüber dem WELA- und NOCO-Isolat. Die in
einer Population T-DNA markierter Pflanzen von Ws-0 gefundene gr1-Mutante ist
anfällig gegenüber dem WELA-Isolat, jedoch noch resistent gegenüber dem
NOCO-Isolat. Da das durch die T-DNA Insertion inaktivierte GR1-Gen als Ursache
für den Wegfall der rassenspezifischen Resistenz von Ws-0 gegenüber dem
WELA-Isolat verantwortlich sein könnte, sollte im Rahmen dieser Arbeit das GR1-
Gen und die gr1-Mutante näher charakterisiert, sowie die Funktion des Gens und
des Proteins untersucht werden.
Zur näheren Charakterisierung des GR1-Gens sollte der Transkriptionsstart, das
Transkriptionsende, typische Promotorelemente und der Translationsstart
identifiziert werden. Mittels 5´RACE konnte gezeigt werden, dass von den zwei
ATG`s am 5`-Ende offensichtlich das erste ATG als Translationsstart dient.
Darüber hinaus konnte der vermutliche Transkriptionsstart 118bp stromaufwärts
des ersten ATG´s lokalisiert werden. Denn 35bp stromaufwärts vom vermutlichen
Transkriptionsstart befindet sich eine AT-reiche Sequenz, bei der es sich
möglicherweise um eine TATA-Box handelt. Eine potentielle CAAT-Box, als
zweites regulatorisches Promotorelement, befindet sich 90bp stromaufwärts.
Mittels 3´RACE wurde gezeigt, dass es kein strikt definiertes Transkriptionsende
gibt und die Transkripte in AT-reichen Regionen enden.
Zur näheren Charakterisierung der gr1-Mutante sollte die genaue Position der T-
DNA Insertion lokalisiert werden. So wurde die „left-border“ der T-DNA 1843bp
stromabwärts vom ATG lokalisiert und zusätzlich wurden 50 GR1-fremde „in
frame“ Nukleotide identifiziert. Die „right-border“ konnte im 3. Exon 1921bp
stromabwärts vom ATG lokalisiert werden. Da die „left“- und „right-border“ der T-
DNA in der gr1-Mutante an unterschiedlichen Positionen inseriert sind, liegt
offenbar eine Deletion vor, da 78 Nukleotide des GR1-Gens im 3. Exon fehlen.
Nach Identifizierung des Translationsstartes wurde u.a. für Transformations-
versuche zur Komplementierung der gr1-Mutante und für die Proteinexpression
zum Zwecke der Antikörperproduktion die GR1-CDS mittels RT-PCR synthetisiert.
6 Zusammenfassung
151
Um zu überprüfen, ob das mutierte Gen für den Hyaloperonospora parasitica-
anfälligen Phänotyp der gr1-Mutante verantwortlich ist, sollte die gr1-Mutante mit
einem Konstrukt, das die Ws-Wildtyp GR1-Sequenz umfasst, komplementiert
werden. Dazu kam ein GR1-CDS-Konstrukt unter Kontrolle des nativen GR1-
Promotors zum Einsatz. Bei der mikroskopischen Analyse unabhängiger Linien
dieser Transformanten konnte nach Infektion mit WELA keine Komplementation
des anfälligen Phänotypen beobachtet werden, obwohl mit Hilfe von RT-PCR
nachgewiesen werden konnte, dass das künstlich eingeführte GR1-Gen in den
transgenen Pflanzen exprimiert wurde.
Da die Auffindung einer unabhängigen gr1-Mutante eine weitere Möglichkeit
bietet, zu untersuchen, ob GR1 an der Resistenz von Ws-0 gegenüber dem
WELA-Isolat beteiligt ist, wurde in der Population der „Arabidopsis Knockout
Facility at the University of Wisconsin-Madison“ nach einer unabhängigen T-DNA-
Mutante gesucht. Da bei der gefundenen unabhängigen Mutante die T-DNA im 2.
Intron inseriert war und normal gespleißt wurde, konnten mit Hilfe dieser Mutante
keine neuen Erkenntnisse gewonnen werden.
Mit Hilfe des „Gene-Silencing“ sollte durch Transformation des Ws-Wildtyps mit
RNAi-Konstrukten die Expression von GR1 reduziert bzw. verhindert werden, um
auf diese Weise den anfälligen Phänotyp der gr1-Mutante zu reproduzieren.
Obwohl mit Hilfe der quantitativen RT-PCR gezeigt wurde, dass vor allem in zwei
transgenen Linien die Transkriptmengen von GR1 um ca. 250-500fach reduziert
waren, konnte nach Inokulation mit WELA keine Auswirkung auf den resistenten
Phänotypen von Ws-0 bzw. keine Reproduktion des anfälligen Phänotypen der
gr1-Mutante beobachtet werden.
Mit Hilfe von RT-PCR wurde gezeigt, dass in der gr1-Mutante das 1. bis 3. Exon
bis zur T-DNA Insertion und die 50 GR1-fremden „in frame“ Nukleotide der „left-
border“ der T-DNA exprimiert werden. Zur Überprüfung, ob es sich bei der gr1-
Mutante um eine „gain-of-function“ Mutante handelt, weil möglicherweise das
aberrante Peptid mit der Funktion von GR1 interferiert, wurden zwei
unterschiedliche Vorgehensweisen verfolgt. Einerseits wurde die gr1-Mutante mit
den RNAi-Konstrukten transformiert und andererseits wurde der Ws-Wildtyp mit
einem Konstrukt transformiert, welches dem aberranten gr1-Transkript entspricht.
6 Zusammenfassung
152
Die untersuchten transgenen Linien der gr1-Mutante waren nach Infektion mit
WELA alle vollständig suszeptibel. Ein „gain-of-function“ Effekt und somit eine
Umkehrung zum resistenten Ws-Wildtyp Phänotyp mit Hilfe des „Gene-Silencing“
konnte bei den transgenen Linien der gr1-Mutante nicht beobachtet werden,
obwohl mit Hilfe der quantitativen RT-PCR gezeigt wurde, dass in einigen Linien
die Transkriptmengen des aberranten Transgens um ca. 500-1000fach reduziert
waren.
Die untersuchten transgenen Linien des Ws-Wildtyps zeigten nach Inokulation mit
WELA keinen veränderten Phänotyp und waren alle resistent. Ein „gain-of-
function“ Effekt und somit eine Reproduktion des anfälligen Phänotypen der gr1-
Mutante konnte in den transgenen Linien des Ws-Wildtyps nicht beobachtet
werden, obwohl mit Hilfe von RT-PCR nachgewiesen werden konnte, dass das
aberrante Transgen in den Pflanzen exprimiert wurde.
Bei der Überprüfung der Expression des aberranten Transgens in den
transformierten Ws-Linien mittels RT-PCR (s.o.) wurde mit der verwendeten
Primerkombination nur ein Transkript nachgewiesen. Bei der Kontrolle der gr1-
Mutante dagegen traten mit derselben Primerkombination mehrere Transkripte
auf. Daraufhin wurden einige Transkripte der gr1-Mutante kloniert und
sequenziert. Die Ergebnisse der Sequenzanalysen dieser Transkripte zeigten,
dass in der gr1-Mutante, aufgrund der T-DNA-Insertion im 3. Exon, das 2. Intron
alternativ gespleißt wurde.
Durch Expression des GR1-Proteins sollten gegen das entsprechende Gen-
produkt Antikörper hergestellt werden. Die Expression des GR1-Proteins war im
bakteriellen System nicht durchführbar, so dass das GR1-Protein im zellfreien
System exprimiert wurde. Da die Aufreinigung des Proteins erfolglos blieb, wurden
zwei Peptidantikörper gegen antigene Regionen des GR1-Gens bestellt. In der
Western-blot Analyse konnte weder eine spezifische Bindung an das im zellfreien
System exprimierte GR1-Protein, noch an die Proteine aus Arabidopsis-
Blattextrakten nachgewiesen werden.
Aufgrund der Entdeckung von zwei nahezu perfekten Konsensusstellen für die
Bindung von 14-3-3 Proteinen in GR1 sollte systematisch die Interaktion von GR1
mit Arabidopsis 14-3-3s mittels “Yeast-two-hybrid”-Assay untersucht werden. Im
6 Zusammenfassung
153
Falle einer Interaktion sollte dann geklärt werden, ob diese in der pflanzlichen
Pathogenabwehr eine Rolle spielt. Im ”Yeast-two-hybrid”-Assay konnte keine
Interaktion zwischen Arabidopsis 14-3-3s und GR1 nachgewiesen werden, obwohl
die Proteinexpression der 14-3-3 Proteine und des GR1-Proteins im Western-blot
gezeigt wurde.
Auf der Suche nach einer Positivkontrolle, bei der die Arabidopsis 14-3-3 Proteine
mit einem bekannten Targetprotein interagieren, wurde systematisch die
Interaktion der zwölf Arabidopsis 14-3-3s mit sich selbst und mit den jeweils
anderen Isoformen im ”Yeast-two-hybrid”-Assay untersucht. Danach wiesen die
Arabidopsis 14-3-3 Isoformen keine Homodimerbildung, sondern ausschließlich
Heterodimerbildung auf und interagierten dabei nur mit bestimmten Isoformen.
Aufgrund der Untersuchungsergebnisse ist das GR1-Gen wahrscheinlich nicht an
der rassenspezifischen Resistenz der Akzession Wassilewskija (Ws-0) gegenüber
dem WELA-Isolat von Hyaloperonospora parasitica beteiligt.
6 Zusammenfassung
154
Summary
Arabidopsis thaliana shows race-specific interactions with the obligate biotrophic
oomycete Hyaloperonospora parasitica. Thus, accession Wassilewskija (Ws-0) is
resistant to the isolates WELA and NOCO. The gr1 mutant was isolated from a T-
DNA population of Ws-0 plants showing susceptibility towards the WELA isolate,
however, retaining resistance towards the NOCO isolate. Since it seemed that the
T-DNA insertion into the GR1 gene was the cause for the loss of the race-specific
resistance against the WELA isolate, it was the aim of this thesis project to
characterize the GR1 gene and the gr1 mutant and to study the function of the
gene and protein.
Towards characterization of the GR1 gene, sites of transcription initiation and
termination, typical elements of the GR1 promoter, and the translation initiation
site should be identified. Using 5’RACE it was shown that the first of two ATGs at
the 5’-end serves as the translation initiation site. Moreover, the likely transcription
initiation site was localized 118bp upstream of the first ATG. Another 35bp
upstream of the transcription initiation site there is an AT-rich region which could
serve as the TATA-box. A potential CAAT-box, as a second regulatory element,
was found 90bp upstream. Using 3’RACE, it was shown that there is no strictly
defined end of transcription but that the transcripts end in AT-rich regions.
Towards characterization of the gr1 mutant the precise position of the T-DNA
insertion should be localized. Accordingly, the left-border of the T-DNA was found
to be integrated 1843bp downstream of the ATG and additional 50bp non-GR1
sequence was found and showed to be present in frame. The right-border was
localized in the third exon 1921bp downstream of the ATG. Since the left- and
right-border have integrated at different sites in the gr1 mutant a deletion of 78bp
in the third exon became apparent.
Upon identification of the translation initiation site, the coding sequence of GR1
was synthesized by RT-PCR technology to allow for both complementation of the
gr1 mutant and protein expression studies succeeded by antibody production.
6 Zusammenfassung
155
To test, whether the mutated gene is responsible for the susceptibility-phenotype
of the gr1 mutant to Hyaloperonospora parasitica, the gr1 mutant should be
complemented with a wild-type GR1 construct. Thus, the coding sequence of GR1
under the control of the native promoter was used. Microscopic analysis of
independent transgenic lines infected with the WELA isolate revealed no
complementation of the susceptible phenotype even though with RT-PCR
expression of the artificial GR1 gene in the transgenic plants could be shown.
Another way to test whether GR1 has a role in defence against the WELA isolate
would be the identification of an independent gr1 mutant. Screening a population
of the “Arabidopsis Knockout Facility at the University of Wisconsin-Madison” a T-
DNA insertion in the second intron could be found. However, this T-DNA was
spliced normally and thus this mutant didn’t yield new results.
With the help of gene silencing, it was attempted to repress or reduce expression
of GR1 in Ws-0 plants transformed with RNAi constructs, in order to recapitulate
the susceptible phenotype of the gr1 mutant. Even though RT-qPCR showed that
GR1 transcript levels in particularly two transgenic lines were reduced by 250-
500fold, no reproduction of the susceptible phenotype could be observed after
WELA infection.
RT-PCR showed that in the gr1 mutant the first to the third exon is transcribed until
the T-DNA insertion including the 50 non-GR1 nucleotides. To investigate whether
gr1 might a “gain-of-function” mutant, in which the aberrant peptide might interfere
with the function of GR1, two experimental strategies have been chosen. On the
one hand, the gr1 mutant was transformed with RNAi constructs. On the other
hand wild-type Ws-0 plants were transformed with a construct mimicking the
aberrant gr1 transcript.
The transgenic gr1 lines were still susceptible to WELA infection. Thus, a
reversion of the “gain-of-function” effect to a resistant phenotype could not be
observed, even though RT-qPCR showed a reduction of transcript levels up to
500-1000fold.
The transgenic Ws-0 lines didn’t show a change in phenotype and were all
resistant to WELA infection. Thus, a “gain-of-function” effect a phenocopy of the
6 Zusammenfassung
156
gr1 mutant could not be observed, even though expression of the aberrant
transgene could be shown with RT-PCR.
While checking the expression of the aberrant transgene in transformed Ws-0
lines, only a single transcript was detected with the primer combination used. In
the control reaction in the gr1 mutant, however, several transcripts were obtained.
Some of these transcripts were cloned and sequenced. Sequence analysis
demonstrated that the second intron has been alternatively spliced in gr1 mutant,
because of the presence of the T-DNA insertion in the third exon of the gene.
Expression of GR1 should facilitate the production of antibodies to the GR1
protein. Attempts to express GR1 in bacterial expression systems have been
unsuccessful. Therefore, GR1 has been expressed in a cell-free system. Because
purification of GR1 also was not successful, two peptide antibodies were raised
against antigenic regions in GR1. In western blotting and immunodetection
analyses specific binding of the antibody was not found, neither to GR1 that has
been expressed in the cell-free system nor to an extract of total polypeptides from
Arabidopsis leaves.
The discovery of two nearly perfect 14-3-3 binding sites in GR1, a systematic test
of yeast-two-hybrid interaction of the GR1 protein with the Arabidopsis 14-3-3
proteins was initiated. In case of an interaction its potential role in pathogen
defence should be clarified. However, in the yeast-two-hybrid assay, no interaction
between GR1 and the 14-3-3 proteins could be detected, even though protein
expression in the yeast cells could be shown.
In order to obtain positive yeast-two-hybrid interaction results, the twelve 14-3-3
proteins from Arabidopsis were systematically tested for interaction with each
other. According to our data, 14-3-3 proteins from Arabidopsis don’t show
homodimerization but heterodimerization with specific isoforms.
In summary it can be concluded from the present work that GR1 probably does not
play a role in the race-specific resistance of Arabidopsis thaliana accession
Wassilewskija (Ws-0) to the WELA isolate of Hyaloperonospora parasitica.
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transcripts with full-length and truncated open reading frames
Plant Cell 15, 2333-2342
Danksagung
Herrn Prof. Dr. A. Slusarenko danke ich für die Überlassung des Themas, die
Unterstützung und die Möglichkeit, diese Arbeit am Institut für Pflanzenphysiologie
der RWTH Aachen anzufertigen.
Herrn PD Dr. J. Hamacher danke ich sehr herzlich für die freundliche Bereitschaft,
das Koreferat für diese Arbeit zu übernehmen.
Bei Herrn PD Dr. N. Schlaich bedanke ich mich besonders herzlich für die
Mitbetreuung meiner Arbeit, die freundschaftlichen Diskussionen, vielfältigen
Anregungen und Hilfestellungen.
Herrn Prof. Dr. U. Conrath möchte ich ganz herzlich für die freundliche Unterstützung
in der Schlussphase meiner Arbeit danken.
Herrn Dr. M. Mierau danke ich herzlich für die Einführung in den Laboralltag und das
Thema dieser Arbeit.
Für die Durchführung bzw. Mithilfe bei einigen Versuchen möchte ich mich sehr
herzlich bei Ingrid Kiefer, Brigitte Thiede, Ulrike Noll, Monika Hermanns und Martina
Koch bedanken.
Silke Hahnen danke ich für ihre Hilfsbereitschaft und die Einführung in die Methode
der quantitativen PCR.
Ulrike Noll danke ich sehr für das Korrekturlesen dieser Arbeit.
Ich danke allen Mitarbeitern des Instituts für Biologie ΙΙΙ der RWTH Aachen für die
gute Zusammenarbeit. Mein ganz besonderer Dank gilt Ingrid Kiefer, Brigitte Thiede,
Angelika Seiler, Daniela Portz und Nora Paul für die freundschaftliche
Zusammenarbeit und ihre Hilfsbereitschaft. Die gemeinsame Zeit mit ihnen hat mir
sehr viel Freude gemacht.
Ein ganz besonderer Dank geht an meinen Freund Willi, der mich während der
gesamten Zeit ermutigt und unterstützt hat und an meinen Bruder Jürgen für seine
Hilfe bei der Bewältigung von Computerproblemen.
Lebenslauf
Name: Schmitz Vorname: Gudrun Geburtsdatum: 14.03.1969 Geburtsort: Erkelenz Wohnsitz: Am Bildchen 11 41812 Erkelenz Schulausbildung: 1975 - 1979 Kath. Grundschule, Heinsberg-Lieck 1979 - 1986 Kreis Gymnasium, Heinsberg 1986 - 1988 Cusanus Gymnasium, Erkelenz 11.06.1988 Abitur Berufsausbildung: 01.09.1988 - 26.07.1990 Lehre als Gärtnerin (Fachrichtung
Baumschule) Betrieb Müller-Platz, Erkelenz Praktikum: 01.04.1993 - 31.07.1993 Versuchsgut Dikopshof, Wesseling 01.06.1994 - 31.10.1997 Studentische Hilfskraft am Institut für
Pflanzenkrankheiten, Universität Bonn Hochschulausbildung: WS 1990 - WS 1992 und Studium der Agrarwissenschaften an der WS 1993 - WS 1997 Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität
Bonn 19.05.1998 Diplomprüfung, Abschluß Dipl.-Ing. Agr. (Fachrichtung Pflanzenproduktion) Berufstätigkeit: 02.11.1998 - 30.09.2004 Wissenschaftliche Angestellte am Institut für
Pflanzenphysiologie der RWTH Aachen seit 01.10.2004 Wissenschaftliche Angestellte am Institut für
Biochemie und Molekularbiologie der Pflanzen der RWTH Aachen
