Strukturelle und biophysikalische Charakterisierung der ... · Reaktionszyklus und führen zu...

Strukturelle und biophysikalische

Charakterisierung der Oligomerisierung des

humanen Guanylat-bindenden Proteins 1

Dissertation

Zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Chemie und Biochemie

an der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Adrian Syguda

aus Kattowitz

Bochum 2008

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit vom September 2004 bis zum Juni 2008 an der

Fakultät für Chemie und Biochemie an der Ruhr-Universität Bochum unter der Leitung von

Herrn Prof. Dr. Christian Herrmann angefertigt.

Tag der mündlichen Prüfung:

Referent: Prof. Dr. Christian Herrmann

Koreferent: Prof. Dr. Hermann Weingärtner

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1

1.1 T-Zell-vermittelte Immunität 1

1.2 Regulatorische, GTP-bindende Proteine 3

1.3 Große, Dynamin verwandte, GTPasen 6

1.3.1 Dynamin 7

1.3.2 Dynamin-verwandte Proteine 1

1.3.3 Mx-Proteine 12

1.3.4 Guanylate-bindende Proteine 14

1.4 Das humane Guanylate-bindende Protein 1 19

1.5 Zielsetzung 25

2 Material und Methoden 26

2.1 Material 26

2.1.1 Chemikalien 26

2.1.2 Enzyme und Marker 26

2.1.3 Reagenzienkits 27

2.1.4 Säulenmaterialien 27

2.1.5 Mikroorganismen 27

2.1.6 Vektoren 28

2.1.7 Antibiotika 29

2.1.8 Oligonukleotide 29

2.1.9 Nährmedien 30

2.2 Molekularbiologische Methoden 32

2.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA 32

2.2.2 Polymerase-Kettenreaktion 33

Inhaltsverzeichnis

II

2.2.3 Sequenzierung 33

2.2.4 Herstellung kompetenter Zellen 34

2.2.5 Transformation 34

2.2.6 Agarosegelelektrophorese 34

2.2.7 Isolierung von DNA aus Agarosegelen 35

2.2.8 Restriktionsenzymatischer Verdau von DNA 35

2.2.9 Ligation 35

2.2.10 Isolation von Gesamt-RNA aus HUVEC 35

2.2.11 Darstellung einer cDNA-Bank aus INF-γ stimulierten HUVECs 36

2.2.12 Darstellung kompetenter Hefen 37

2.2.13 Transformation in Hefen 37

2.2.14 Hefe 2-Hybrid Screen 38

2.3 Proteinbiochemische Methoden 39

2.3.1 Präparative Proteinexpression und Ultraschallaufschluss 39

2.3.2 Glutathion-Affinitätschromatographie 39

2.3.3 Nickel-NTA-Affinitätschromatographie 40

2.3.4 Größenausschlußchromatographie 40

2.3.5 Aufkonzentrieren durch Ultrafiltration 40

2.3.6 Denaturierende SDS-Gelelektrophorese 40

2.3.7 Konzentrationsbestimmung nach Gill & von Hippel 41

2.3.8 Markierung von Proteinen mit Fluoreszenzfarbstoffen 41

2.4 Biophysikalische Methoden 42

2.4.1 Bestimmung von Nukleotidkonzentrationen 42

2.4.2 Analyse von Nukleotiden mittels reversed-phase HPLC 42

2.4.3 Messungen der Nukleotidhydrolyse 43

Inhaltsverzeichnis

III

2.4.4 Stopped-flow Kinetik 44

2.4.5 Fluoreszenztitration mit mant-Nukleotiden 45

2.4.6 Größenausschlusschromatographie 45

2.4.7 Dynamische Lichtstreuung 46

2.4.8 Temperatursprung 46

2.4.9 FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) 48

3 Ergebnisse 49

3.1 hGBP1 49

3.1.1 Identifizierung einer elektrostatischen Interaktionsstelle 49

3.1.2 Proteinaufreinigung 52

3.1.3 Dynamische Lichtstreuung 52

3.1.4 Analytische Größenausschlusschromatographie 58

3.1.5 Nukleotidaffinität 64

3.1.6 Dynamik der Nukleotidbindung 66

3.1.7 Nukleotidhydrolyse 68

3.1.8 Kinetik der Dimerisierung an der helikalen Domäne 73

3.2 Identifizierung eines hGBP1 Interaktionspartners 77

3.2.1 Darstellung einer INF-γ induzierten HUVEC cDNA-Bank 78

3.2.2 Hefe 2-Hybrid-Screen 79

3.3 Biochemische Charakterisierung von hGBP2

3.3.1 Nukleotidabhängige Oligomerisierung 81

3.3.2 Konzentrationsabhängige Nukleotidhydrolyse 82

3.3.3 Dynamik der Nukleotidbindung 84

3.3.4 Interaktion von hGBP1 und hGBP2 86

4 Diskussion 92

Inhaltsverzeichnis

IV

5 Zusammenfassung 110

6 Literaturverzeichnis 113

7 Anhang 122

7.1 Abkürzungsverzeichnis 122

7.2 Abbildungsverzeichnis 124

7.3 Tabellenverzeichnis 125

Einleitung

- 1 -

1 Einleitung

1.1 T-Zell-vermittelte Immunität

Das angeborene Immunsystem ist für eine schnelle Verteidigung gegen Pathogene

zuständig und bildet die erste Verteidigungslinie während einer Infektion. Interferone

(IFN), Chemokine, Hämatopoetine und die Mitglieder der Tumornekrosefaktor-Familie

gehören aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit zu der Familie der Cytokine. Sie werden

von T-Zellen nach Antigenerkennung de novo synthetisiert und beeinflussen das Verhalten

oder die Eigenschaft dieser und anderer Zellen. Eines der wichtigsten Cytokine, das von

CD8-T-Effektorzellen freigesetzt wird, ist

das Interferon-γ (IFN-γ). Seine Aufgabe ist

es, die virale Replikation zu hemmen und

sorgt darüber hinaus dafür, dass das Virus

aus infizierten Zellen völlig eliminiert wird

ohne diese Zelle zu töten. Diese wichtige

antivirale Bedeutung der Interferone konnte

an knock-out Mäusen demonstriert werden,

denen die Rezeptoren für INFα/β und INF-γ

fehlen (van den Broek et al., 1995). Viele

Cytokine wirken aber auch lokal und

unterstützen dabei membrangebundene

Effektoren. Diese membrangebundenen

Effektoren können nur Rezeptoren einer Zelle binden, die mit ihnen in Kontakt sind. So

hat das von TH1-Zellen gebildete IFN-γ und der Tumornekrosefaktor (TNF) auf einige

Zellen eine cytotoxische Wirkung, da sie Makrophagen aktivieren, welche gezielt

infizierte Zellen vernichten können.

Cytokine beeinflussen ihre Zielzellen, indem sie spezifisch an zwei unterschiedlichen

Rezeptoren binden. Einer dieser Rezeptoren wird, da alle Interferone des Typs I an ihnen

binden, Typ I Interferon Rezeptor genannt. Er ist aus zwei Untereinheiten aufgebaut, dem

IFNαR1 und IFNαR2, die cytosolisch mit janus activated kinase (JAK) und tyrosine

kinase 2 (TYK2) assoziiert sind. Der zweite Rezeptortyp ist ebenfalls aus zwei

Abbildung 1-1: Humanes Interferon-γ Darstellung des humanen Interferon-γ im Bändermodell (PDB: 1HIG). Das in Lösung als Dimer vorliegende Protein ist hauptsächlich α-Helikal aufgebaut und besitzt keine β-Faltblätter (Ealick, S.E et al., 1991).

Einleitung

- 2 -

Untereinheiten aufgebaut (INFGR1 und INFGR2) und wird Typ II Interferon Rezeptor

genannt. Aktiviert wird er von Interferonen des Typs II (Platanias, 2005). Diese

Rezeptoren dimerisieren nach Bindung und aktivieren so die cytoplasmatischen Domänen,

indem sie sich gegenseitig phosphorylieren (Shuai et al., 1994).

Abbildung 1-2: JAK-STAT-Signalweg. Die Dimerisierung der Rezeptoren nach Bindung von Typ I oder Typ II Interferonen führt zu einer Tyrosin Phosphorylierung von STAT1 bzw. STAT2 und folglich zu ihrer Aktivierung. Die Aktivierung von STAT1 und STAT2 führt zur Bildung von STAT1 Homodimeren oder zur Heterodimerisierung von STAT1 und STAT2 welche dann an IRF9 (INF-regulatory faktor 9) binden. Diese Komplexe sind in der Lage in den Zellkern einzudringen um dort an die Promotorelemente ISRE bzw. GAS für die Aktivierung nachgeschalteter Gene zu binden (Abbildung entnommen aus Platanias, 2005).

Einleitung

- 3 -

Diese cytoplasmatischen Kinasen gehören zu den Janus-Kinasen, die aus einer Gruppe

naher verwandter Enzyme bestehen, die man als Jak1, Jak2, Jak3 und Tyk2 bezeichnet.

Diese Kinasen aktivieren wiederum Proteine die man als Signal Transducers and

Activators of Transcription (STAT) bezeichnet (Darnell, J.E. et al., 1994).

In Säugetieren gehören ihrer Familie sieben Mitglieder an (STAT1, STAT2, STAT3,

STAT4, STAT5a, STAT5b und STAT6). Bei Aktivierung des Rezeptors kommt es,

abhängig von Rezeptor und Ligand, zur Homo- oder Heterodimerisierung bestimmter

STATs. Ebenso sind liganden- und rezeptorspezifische JAKs beteiligt. So führt Interferon-

γ unter Beteiligung von JAK1 und JAK2 zur Homodimerisierung von STAT1. Interferon α

und β führen, unter Beteiligung von JAK1 und TYK2, zu einer Heterodimerisierung von

STAT1 und STAT2. Nach Aktivierung sind diese Komplexe fähig in den Zellkern

einzudringen, um dort durch Bindung an interferon response element (ISRE) genannte

Abschnitte der DNA, die Transkription bestimmter Gene in Gang zu setzten (Darnell, J.E.

et al., 1994) Es wurden bereits weit über 1000 Gene identifiziert, deren Transkription so

Aktiviert wird. Darunter sind drei Klassen von GTP-bindenden Proteinen: Die Mx-

GTPasen, die p47 GTPasen und die p65 GTPasen, zu denen auch die humanen Guanylat-

bindenden Proteine gehören.

1.2 Regulatorische, GTP-bindende Proteine

An vielen fundamentalen, zellulären Prozessen nehmen GTP-bindende Proteine teil, so

wie zum Beispiel an der intrazellulären Signalweiterleitung, der Proteinbiosynthese, der

Organisation des Cytoskeletts oder dem vesikulären Transport (Bourne HR. et al., 1990).

Aufgrund von Sequenzhomologien lassen sich die GTP-bindenden Proteine in mindestens

fünf Superfamilien einteilen:

Einleitung

- 4 -

Allen regulatorischen GTPasen gemeinsam ist die Mg2+-abhängige Bindung von

Guaninnukleotiden und die Hydrolyse von GTP zu GDP und freiem Orthophosphat, die

durch konservierte Sequenzmotive vermittelt wird (Bourne et al., 1991). Die größte

Gruppe unter den Guaninnukleotid-bindenden Proteinen (GNBPs), stellt die Ras-

Superfamilie dar. Es sind kleine monomere GTPasen mit einem Molekulargewicht von 20-

30kDa.

Die biologische Aktivität der Ras-homologen GTP-bindenden Proteine wird durch den

Nukleotidzustand reguliert (Abbildung 1-3). Die GTP-bindenden Proteine sind im GDP-

gebundenen Zustand inaktiv. Die Dissoziation des GDP führt zu einem nukleotidfreien

Zustand, der wegen der hohen GTP-Konzentration in der Zelle nur als kurzlebiges

Intermediat auftritt. Die Bindung von GTP induziert eine Konformationsänderung des

Proteins, das daraufhin mit seinen Effektoren interagieren kann. Die Hydrolyse des GTP

zu GDP und Orthophosphat versetzt das Protein wieder in den inaktiven Zustand.

Die fünf Superfamilien der regulatorischen GTPasen

Große, Dynamin verwandte, GTPasen

Dynamin

Mx-Proteine Mitofusine

GBP Atlastin

Faktoren für die Proteinsynthese

EF-Tu EF-G IF-2 RF-3

Ras-homologe kleine GTPasen

Ras Rho Ran Rab Arf

Signalerkennungs partikel

SRP54

SR Ffh

Heterotrimere G-Proteine

Gαs Gαi Gαq Gα12

Einleitung

- 5 -

Durch verschiedene Regulatoren ist eine Modulation der GTPase Aktivität möglich. Der

Guaninnukleotid Austauschfaktor (GEF), beschleunigt den Austausch von GDP zu GTP

und bewirkt so eine beschleunigte Aktivierung des Proteins. Es besteht bei einigen

GTPasen (Rho, Rab) ebenfalls die Möglichkeit den Austausch zu verlangsamen, indem ein

Guaninnukleotid-Dissoziationsinhibitor (GDI) bindet. Die Inaktivierung der GTPase, die

durch die Hydrolyse von GTP zu GDP und Orthophosphat (Pi) erfolgt, kann durch

GTPase-aktivierende Proteine (GAP) beschleunigt werden.

Mutationen, welche die Interaktion mit GEFs oder GAPs inhibieren, unterbrechen den

Reaktionszyklus und führen zu permanent inaktiven bzw. aktiven GNBPs. Beispielsweise

ist ein aufgrund einer Mutation in der Switch II-Region oder P-Schleife, konstitutiv

aktiviertes Ras-Protein der auslösende Faktor in etwa 10 bis 20% aller menschlicher

Tumoren.

Die bis heute bekannten Kristallstrukturen von Guaninnukleotid-bindenden Proteinen

(GNBPs) zeigen ein sehr homologes Bild der Guaninnukleotid-bindenden Domäne und

geben einen Hinweis darauf, dass diese Domänen einen gemeinsamen evolutionären

Ursprung haben müssen (Bourne, et al., 1990; Bourne, et al., 1991) Vergleicht man die

Struktur GTP-bindener Proteine miteinander, kann die Guaninnukleotid-bindende Domäne

auf eine minimale GTPase-Domäne reduziert werden. Diese minimale GTPase-Domäne

Abbildung 1-3: GTPase-Zyklus von Ras. Schematische Darstellung des GTPase-Zyklus. Der aktive Zustand des Ras-Proteins wird durch die GTP-beladene Form dargestellt, der inaktive durch die Beladung mit GDP. Die GTP-Hydrolyse kann durch GAPs, der Nukleotidaustausch durch GEFs beschleunigt werden.

Ras*GDP

Ras*GTP

GTP

GDP

GEFGAP

Pi

H O2

Effektorbindung

Einleitung

- 6 -

besteht aus ca. 170 Aminosäuren die strukturell sechs β-Faltblätter und fünf α-Helices

bilden (Milburn et al., 1990).

Eine weitere Gemeinsamkeit neben der Struktur sind die stark konservierten

Bindungsmotive, die einen Teil der Nukleotid- Bindungstasche bilden (Bourne et al.,

1991). Das G1-Motiv, oder auch P-loop genannt, enthält die Konsensussequenz

GX4GK(S/T). Diese Region bildet strukturell eine Schleife, bei denen die Amidprotonen

des Proteinrückgrads und die ε-Aminogruppe des Lysins für die Koordination der α- und

β-Phosphate vom GTP bzw. GDP zuständig sind (Saraste et al., 1990, Walker et al., 1982).

Ein konserviertes Threonin im G2-Motiv, auch switch I genannt, ist in die Hydrolyse des

GTP involviert. Dabei geht die Seitenkette einen H-Brückenkontakt zum γ-Phosphat und

zum Mg2+-Ion ein und hilft so, den GTP-Mg2+-Komplex im aktiven Zentrum korrekt zu

positionieren. Durch die korrekte Positionierung des Mg2+-Ions werden die Ladungen vom

β- und γ-Phosphat vom GTP abgeschirmt und somit ein nukleophiler Angriff von Wasser

an diesen Phosphatresten ermöglicht. Das G3-Motiv (switch II) enthält die Sequenz

DXXG, bei der das Glycin eine Wasserstoffbrückenbindung zu dem γ-Phosphat vom GTP

ausbildet. Das Aspartat bindet durch ein Wassermolekül an das katalytisch aktive Mg2+.

Das vierte Motiv (G4) enthält die Sequenz N/TKXD und konnte zuerst bei dem Protein Ras

gezeigt werden. Das Aspartat bildet eine Wasserstoffbrückenbindung zur Guaninbase aus,

und ist somit für die spezifische Erkennung der Guaninbase zuständig.

1.3 Große, Dynamin verwandte, GTPasen

Die Familie der großen, Dynamin verwandten, GTPasen beinhaltet Proteine die zwar eine

hohe strukturelle Ähnlichkeit zu den kleinen Ras-homologen Proteinen aufweisen, aber

einen deutlichen Unterschied in ihrer Funktion zeigen (Smirnova et al., 1999; Danino et

al., 2001; Praefcke and McMahon, 2004; Song et al., 2002). Die Dynamin verwandten

GTPasen haben eine molekulare Masse zwischen 60 und 100kDa und eine recht ähnliche

strukturelle Zusammensetzung. Allen gemeinsam ist die GTPase Domäne, dessen Aufbau

der minimalen Ras-GTPase Domäne entspricht, wobei zusätzlich

Sekundärstrukturelemente insertiert sind. Carboxyterminal folgt eine Mitteldomäne und

eine GTPase-Effektor Domäne (GED). Diese Domänen sind weniger stark konserviert und

Einleitung

- 7 -

spielen eine wichtige Rolle in der intramolekularen Faltung (Schumacher und Staeheli,

1998) und der Selbstassemblierung von Mitgliedern der Dynamin-Superfamilie

(Ramachandran et al., 2007; Praefcke and McMahon, 2004). Die Selbstassemblierung ist

ein Weg die Geschwindigkeit der GTPase-Aktivität zu erhöhen, ohne damit zusätzlich auf

GAPs oder GEFs angewiesen zu sein, wie es z.B. bei Ras der Fall ist (Danino et al., 2001).

Über die Pleckstrin-Homologie Domäne (PH-Domäne), sind einiger Mitglieder der

Familie in der Lage mit Phospholipiden zu interagieren und sie ist somit wichtig für die

Endocytose (Zheng et al., 1996; Vallis et al., 1999; Lee et al.; 1999).

Mitglieder der Dynamin-Superfamilie konnten bereits in vielen unterschiedlichen

eukaryontischen Organismen identifiziert werden. Darunter H.sapiens, D. melanogaster,

C.elegans, S.Pombe, S.cerevisiae, A.thaliana und D. discoideum. Ein weiteres, einfacheres

Dynamin-ähnliches Protein, konnte in der Rotalge C. merolae gefunden werden, ist aber

noch nicht näher charakterisiert (Nishida et al., 2003).

1.3.1 Dynamin

Erstmalig wurde Dynamin aus Rinderhirn als

100kDa großes, Mikrotubulin assoziiertes Protein

extrahiert (Shpetner HS et al., 1989). Weitere

Analysen der Sequenz weisen eine hohe

Sequenzhomologie des N-Terminalen Bereichs zu

anderen GTPasen, wie Mx oder Vps1p, auf (van

der Bliek et al., 1999). Die wichtigen GTP-

Bindungsmotive konnten bei Dynamin

identifiziert werden. Dynamin spielt eine

essentielle Rolle in der Endocytose von Clathrin

umhüllten Vesikeln. Dabei übernimmt das

Protein die Aufgabe, die Vesikel von der

Membran abzuschnüren (Koenig und Ikeda,

1989; Damke et al., 1994). Diese wichtige

Funktion konnte erstmals bei der

temperatursensitiven Mutante shibire in Drosophila melanogaster beobachtet werden, die

bei einer bestimmten Temperatur reversibel gelähmt wird (Grigliatti et al., 1973). Die

Abbildung 1-4: Elektronen-mikroskopische Aufnahme der Ringbildung um Lipidnanoröhren. Aufgereinigtes Dynamin wurde mit Lipidnanoröhren unter physiologischen ionischen Bedingungen inkubiert. Daraufhin bilden sich Ringe um die Röhren (aus Stowell et al., 1999).

Einleitung

- 8 -

Ursache für die Lähmung ist ein Defekt in der Endocytose, bei der die Vesikel an den

Membranen der Synapsen persistieren. Die Folge ist eine Verarmung an Neurotransmitter-

gefüllten Vesikeln und damit eine Unterbrechung der synaptischen Signalweiterleitung.

Die Unterbrechung der Endocytose konnte durch einen Fehler im Mechanismus der

Abschnürung der Vesikel erklärt werden (Koenig und Ikeda, 1989). Einen ähnlichen

Effekt auf die Vesikelabschnürung beobachtet man, wenn Synapsen mit dem nicht

hydrolysierbaren GTP Analogon GTPγS inkubiert wird (Takai et al., 1995). Dabei bilden

sich lange röhrenförmige Membraneinstülpungen die mit Hilfe eines Elektronenmikroskop

sichtbar gemacht werden kann. Diese Röhren sind dabei mit Ringen umgeben, die aus

Dynamin bestehen. Diese Ringe können auch in vitro erhalten werden, wenn Dynamin mit

Lipidnanoröhren unter physiologischen ionischen Bedingungen inkubiert wird (Hinshaw et

al., 1997). Die elektronenmikroskopische Aufnahme der mit Dynaminringen

umschlossenen Lipidnanoröhren ist in Abbildung 1-4 zu sehen. Alle zurzeit bekannten

Dynamine sind aus fünf Domänen aufgebaut. Die N-terminal gelegene GTPase-Domäne

zeigt alle klassischen Sequenzmotive der G-Proteine. Die Kristallstruktur der GTPase-

Domäne von Dynamin A aus Dictyostelium discoideum konnte im nukleotidfreien Zustand

und in Komplex mit GDP gelöst werden (Abbildung 1-5) (Niemann et al., 2001).

Strukturell unterscheidet sich die GTPase-Domäne durch mehrere Insertionen von der

minimalen GTPase-Domäne von Ras.

Carboxyterminal von der GTPase-

Domäne schließt sich die Mitteldomäne

an, gefolgt von der PH-Domäne , der

GED und der PRD die als Domäne für

Interaktionspartner von Dynamin zur

Verfügung steht (Abbildung 1-6).

Der genaue Mechanismus der

Vesikelabschnürung wurde in der

Vergangenheit kontrovers diskutiert.

Durch die Kombination von Röntgen-

strukturanalyse und Kryo-Elektronen-

Mikroskopie wurde vor kurzem ein

Modell für die Dynamin-vermittelte Membran-Abschnürung veröffentlicht. (Mears et al.,

2007). In Lösung liegt Dynamin als Tetramer vor, bevor es in Gegenwart von GTP zu

großen helikalen Strukturen assembliert (Binns et al., 1999; Muhlberg et al., 1997; Carr

Abbildung 1-5: Kristallstruktur der GTPase-Domäne von Dynamin A. Abgebildet ist die Kristallstruktur der GTPase-Domäne von Dynamin A aus Dictyostelium discoideum im Bändermodell. Die Struktur unterscheidet sich durch mehrere Insertionen zur minimalen GTPase-Domäne von Ras.

Einleitung

- 9 -

und Hinshaw, 1997). Diese Dynaminhelix legt sich um den Hals entstehender Vesikeln.

Durch die Hydrolyse des GTPs kommt es zur Konformationsänderungen, welche die

gleichzeitige Stauchung und Verengung der Dynaminhelix zur Folge hat und die

Abschnürung des Vesikels bewirkt (Mears et al., 2007). Dynamin zeigt damit das

Verhalten einer molekularen Maschine bei dem die Energie der Nukleotidhydrolyse in

mechanische Arbeit umgewandelt wird.

Für die Selbstassemblierung von Dynamin konnte die Mitteldomäne als wichtigste

Interaktionsfläche identifiziert werden (Ramachandran et al. 2007). Durch Mutationen

zweier Arginine zu Alaninen in der Mitteldomäne konnte die tetramere Struktur von

Dynamin gestört und die Bildung höherer oligomere Strukturen verhindert werden. Aber

auch die GED-Domäne scheint eine zentrale Rolle bei der Selbstassemblierung zu spielen

(Muhlberg et al., 1997). Es wurde weiterhin vermutet, dass die GED von Dynamin bei

Selbstassemblierung einen positiven Effekt auf die GTPase-Aktivität besitzt (Muhlberg et

al., 1997; Warnock et al., 1996). Aber die Funktion der GED von Dynamin als ein GAP,

welches wie bei Ras ein katalytisches Arginin in die richtige Position bringt, konnte nicht

bestätigt werden (Marks et al., 2001). Vielmehr konnten durch die Mutationen R361S und

R399A in der Mitteldomäne gezeigt werden, dass diese Domäne neben dem

Oligomerisierungsverhalten auch die Stimulation der GTPase Aktivität beeinflusst

(Ramachandran et al. 2007). Eine genaue Beschreibung der Mechanismen der

Oligomerisierung und der Stimulation der GTP-Hydrolyse sind noch nicht bekannt.

Abbildung 1-6: Anordnung der Domänen von Dynamin Das 100kDa große Dynamin teilt wird in fünf verschiedene Domänen unterteilt. Carboxyterminal von der GTPase-Domäne schließt sich die Mitteldomäne an, gefolgt von der PH-Domäne (Pleckstrin homolog), der GED (GTPase Effektor Domäne) und der PRD (Prolinreiche-domain). (Entnommen aus Praefcke und McMahon, 2004.)

GTPase Middle PH GED PRD

Einleitung

- 10 -

1.3.2 Dynamin-verwandte Proteine

Neben den echten Dynaminen gibt es auch die Dynamin-verwandten Proteine, die zwar

eine strukturelle Homologie aufweisen, aber deren Funktion und Lokalisation sich von

Dynamin unterscheidet. Strukturell unterscheiden sich die Dynamin-verwandten Proteine

von den klassischen Dynaminen durch das Fehlen der PH-Domäne und/oder der PR-

Domäne. Allen gemein ist jedoch die GTPase Domäne mit den konservierten

Sequenzmotiven GTP-bindender Proteine. Aufgrund ihrer zellulären Funktion werden die

Mitglieder der Dynamin-verwandten Proteine in Unterfamilien geordnet.

Neben dem klassischen Dynamin ist auch das Vps1p (Vacuolar-Protein-Sorting-1-Protein)

aus S. cerevisiae in den vesikulären Transport involviert (Rothman et al., 1990).

Strukturell unterscheidet sich das Vps1p von Dynamin durch das fehlen der PH- und PR-

Domäne, besitzt aber zusätzliche Insertionen in der GTPase-Domäne und zwischen der

Mitteldomäne und der GED. Es kontrolliert den Transport zwischen dem trans-Golgi

Netzwerk (TGN) und Endosomen. Für diesen Transport scheint die GTPase-Domäne

alleine ausreichend zu sein, wobei der C-terminale Teil des Proteins mit der Golgi-

Membran interagiert (Ekena et al., 1993; Vater et al., 1992; Wilsbach et al., 1993). Das

79kDa große Vps1p ist Teil eines Multiproteinkomplexes, welcher für die Sortierung von

Proteinen in die Vesikel (Ekena et al., 1993)zuständig ist. Weiterhin scheint Vps1p einen

Einfluß auf die Anzahl von Peroxisomen zu haben (Hoepfner et al., 2001).

Andere Mitglieder der Dynamin-verwandten Proteine sind in die mitochiondriale

Morphologie involviert. Zu dieser Gruppe zählt das im Menschen und im C.elegans

gefundene Dynamin-related protein 1 (Drp1), das auch als Dynamin related (Dnm1p) aus

S. cerevisiae und Dynamin-like protein1 (Dlp1) bekannt ist. Das Dlp1 ist ein 80kDa großes

Protein, welchem im Vergleich zum Dynamin die PR-Domäne fehlt. Dlp1 konnte in

Lokalisationsstudien an Mitochondrien und anderen Organellen wie z.B. an Peroxisomen

gefunden werden (Yoon et al., 1998; Pitts et al., 1999). Wie auch das Dynamin, liegt Dlp1

unter physiologischen Bedingungen als Homotetramer vor. Das Dlp1 ist für die Spaltung

von Mitochondrien notwendig. Desweiteren konnte auch die Spaltung von Peroxisomen

und eine Assoziation am endoplasmatischen Retikulum gezeigt werden (Koch et al., 2003;

Pitts et al., 1999).

Das 100kDa Protein Mitochondrial genome maintenance 1-protein (Mgm1) aus S.

cerevisiae, welches im Menschen als Optic atrophy type I (Opa1) und in S. pombe als

Einleitung

- 11 -

Abbildung 1-7: Kristallstruktur des dimeren BDLP in GDP-gebundenem Zustand. Die Bindung von GDP induziert die Homodimerisierung des bacterial dynamin-like protein (BDLP), indem die GTPase-Domänen und die „Spitzen“ der eingeklappten helikalen Domäne miteinander Interagieren. Aminoterminal von der GTPase-Domäne (Rot) liegt noch ein 67 Aminosäuren großes Helixelement (Blau). Die C-terminal gelegene, helikale Domäne (Grün) interagiert nach einer Wende mit der GTPase-Domäne. (PDB: 2j68)

Msp1 bekannt ist, wird ebenfalls mit der Morphologie von Mitochondrien in Verbindung

gebracht. Diese Proteine haben die gleiche Domänenarchitektur wie Dlp1 mit dem

Unterschied einer zusätzlichen, aminoterminal gelegenen mitochondrialen Importsequenz

(Guan et al., 1993). Diese Sequenz lokalisiert die Proteine an der inneren und äußeren

Mitochondrienmembran. Im Gegensatz zu den Dlp´s sind diese Proteine an der

Mitochondrienfusion beteiligt und gelten daher als Dlp Antagonisten (Olichon et al., 2002;

Satoh et al., 2003). Mutationen in Mgm1 bzw. Msp1 führen zu einer Fragmentierung von

Mitochondrien (Wong et al., 2003), die auch bei Expression von dominant negativen Drp1

Mutanten beobachtet wird.

Die humanen Proteine Mitofusin 1 und 2 (Mfn1/2) sind an der äußeren Membran von

Mitochondrien lokalisiert und ebenfalls essentiell für eine GTP abhängige

Mitochondrienfusion (Eura et al., 2003; Chen et al., 2003). Zwei weitere Mfn-Homologe

Proteine sind in D. melanogeaster (FZO) und der Hefe (Fzo1) zu finden.

Die Proteine plant-dynamin like (PDL) aus der Sojabohne und arabidopsis dynamin-like 1

(ADL1) aus Arabidopsis thaliana sind ebenfalls homologe Dynamin-verwandte Proteine

die in Pflanzen gefunden werden konnte. Das 68kDa große PDL ist während der

Zellteilung an Vesikeln der Zellplatte lokalisiert (Gu et al., 1997). Das Arabidopsis-

Dynamin like protein 1 (ADL1) konnte an Thylakoidmembranen von Chloroplasten

gefunden werden (Park et al., 1998).

Einleitung

- 12 -

In den Genomen mehrerer Prokaryonten konnten ebenfalls offene Leserahmen entdeckt

werden, die für Dynamin-verwandte Proteine kodieren (van der Bliek et al., 1999).

Kürzlich konnte ein DLP aus dem Cyanobakterium N. punctiforme isoliert werden (Low,

Löwe, 2006). Das bacterial dynamin-like protein (BDLP) genannte Protein zeigt in

Anwesenheit von GppNHp und Lipidextrakt aus E.coli die Bildung von langen

röhrenförmigen Membraneinstülpungen, die mit Hilfe eines Elektronenmikroskops

sichtbar gemacht werden konnten. Diese Röhren sind dabei mit Ringen umgeben, die aus

BLDP´s bestehen, analog zu den Beobachtungen, die bei Dynamin gemacht wurden

(Sweitzer et al., 1998). Dieses Protein konnte mittlerweile in nukleotidfreier und GDP-

gebundener Form kristallisiert werden (Abbildung 1-7). Es konnten klassische Dynamin

Strukturelemente wie die GTPase Domäne, die Mitteldomäne und die GED gefunden

werden. Der Sequenzvergleich zeigt die höchste Homologie zu Mitofusinen, wie das Fzo

aus D. melanogoaster und dem FZL aus A. thaliana.

1.3.3 Mx-Proteine

Die Mx-Proteine nehmen eine Schlüsselrolle ein bei der Typ I Interfron induzierten

antiviralen Immunantwort (Haller et al., 1998). Im Laborversuch an Mäusen konnte die

zentrale Rolle bei der Immunabwehr von RNA-Viren gezeigt werden (Haller und Kochs,

2002). Die Mx-Proteine haben eine Masse von 70-80kDa und besitzen eine hohe

Homologie zum humanen Dynamin und den Vps1 aus der Hefe. Im Vergleich zum

klassischen Dynamin besitzen die Mx-Proteine keine PR und PH-Domäne. Im Menschen

konnten zwei Isoformen identifiziert werden, die beide auf Chromosom 21 lokalisiert sind

und mit MxA und MxB bezeichnet werden (Haller et al., 2002). Es konnte nur für MxA

eine antivirale Aktivität nachgewiesen werden. Das MxA hat eine Masse von 76kDa, liegt

cytoplasmatisch vor und besitzt eine antivirale Aktivität gegen Mitglieder der Bunyaviren,

Togaviren, Orthomyxoviren, Paramyxoviren, Rhabdoviren, Picornaviren und Hepatitis B

Viren (Zurcher et al., 1992; Hefti et al., 1999; Landis et al., 1998; Haller et al., 2002). Die

Lokalisation der Mx-Proteine variiert je nach Isoform und Virusbefall der Zelle zwischen

cytoplasmatisch und nukleär. Für MxA konnte eine Assoziation mit dem glatten

endoplasmatischen Retikulum nachgewiesen werden (Accola et al., 2002). Frühere

Vermutungen, in denen MxA mit Aktin und dem Zytoskelett assoziiert ist, konnten nicht

Einleitung

- 13 -

bestätigt werden. MxA zeigt analog zu Dynamin eine relativ niedrige Nukleotidaffinität im

mikromolaren Bereich und neben der hohen GTPase Aktivität auch die Fähigkeit zur

Selbstassemblierung (Richter et al., 1995; Nakayama et al., 1993). In Experimenten unter

physiologischen Salzbedingungen, zeigte MxA eine lange filamentöse Struktur, die unter

dem Elektronenmikroskop sichtbar gemacht werden kann. In Gegenwart von

Guaninnukleotiden zeigte sich analog zu Dynamin eine Assemblierung zu einer

ringförmigen Struktur (Kochs et al., 2002). Da das Protein nach der INF-Stimulation nur

für eine sehr kurze Zeit expremiert wird, wird angenommen das eine

Homooligomerisierung ein Weg ist, einen stabilen intrazellulären Pool von MxA zu

schaffen, um das Protein für einen längeren Zeitraum verfügbar zu machen. Das

monomere MxA könnte möglicherweise nach Dissoziation vom homooligomeren

Komplex aktiv in der antiviralen Abwehr werden (Janzen et al., 2000; Haller and Kochs,

2002).

In die Selbstassemblierung von MxA ist die Mitteldomäne und die GED beteiligt und bei

Deletion der GED ist eine verminderte GTPase-Aktivität zu beobachten (Schwemmle et

al., 1995). Beide Domänen, sowohl die GED als auch die Mitteldomäne sind für die

antivirale Aktivität wichtig. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass diese Domänen an

Abbildung 1-8: Gegenwärtiges Modell der MxA Aktivität. Das MxA assembliert wahrscheinlich zu einem homooligomeren Komplex, wenn keine antivirale Aktivität erforderlich ist. Diese Form der „Lagerung“ ermöglicht das Protein für einen längeren Zeitraum verfügbar zu halten. Erst das monomere Protein ist aktiv und in der Lage sich ein virales Ziel zu suchen. Dieses Ziel kann ein virales Nukleokapsid oder Nukleokapsid ähnliches Objekt sein, an dem MxA bindet um so einen intrazellulären Transport zu inhibieren (entnommen aus Haller and Kochs, 2002)

Einleitung

- 14 -

der Bindung von viralen Nukleokapsid-Proteinen beteiligt sind. Anhand dieser Daten

konnte ein vorläufiges Modell der MxA Aktivität erstellt werden (Abbildung 1-8.)

Weiterhin scheint MxA in der Lage zu sein in Abwesenheit von einer Lipid

interagierenden Domäne an Membranen zu binden und diese zu tubulären Strukturen zu

formen (Accola et al., 2002).

Für das humane MxB konnte bis heute keine antivirale Funktion nachgewiesen werden. Es

zeigte sich das MxB ausschließlich extrazellulär vorliegt und hauptsächlich auf der

zytoplasmatischen Seite von Kernporen zu finden ist, was auf seine Funktion hindeutet.

Durch Expression einer dominant negativen MxB Mutante konnte tatsächlich eine

Blockierung des Zellkern-Imports beobachtet werden (King et al., 2004). Ein weiterer

Effekt der Mutation war die Blockierung des Zellzyklus zwischen der G1 und der S-Phase.

Mit Hilfe der RNAi-Technologie konnte in einem anderen Experiment das Gen für MxB

ausgeschaltet werden. Es konnte zwar ebenfalls eine Blockierung des Zellzyklus, aber

nicht der Effekt auf den Zellkernimport beobachtet werden (King et al., 2004).

1.3.4 Guanylat-bindende Proteine

Nach der Behandlung von humanen Fibroblasten mit Interferonen konnte gezeigt werden,

dass eine Replikation von vesicular stomatitis virus (VSV) in den Zellen inhibiert ist. Der

anschließende Vergleich des Zelllysats mit dem von unbehandelten Zellen zeigte die

Expression von vier unterschiedlichen Proteinen mit einer Masse von 44kDa bis 68kDa,

die wahrscheinlich für den Replikations-inhibierenden Effekt verantwortlich sind (Knight

and Korant, 1979). Für zwei dieser Proteine konnte die Bindung an Agarose-

immobilisiertes Guaninnukleotid nachgewiesen werden. Die Bindung an andere

Nukleotide konnte nicht gezeigt werden (Cheng et al., 1982). Bei diesen Versuchen zeigte

sich, dass sich die Affinitäten, mit denen GMP, GDP und GTP gebunden wurden, keine

Unterschiede aufwiesen. Nach ihrer Eigenschaft und ihrer Größe wurden die beiden

Proteine 67k GBP und 56k GBP (Guanylate-Binding-Proteins) genannt (Cheng et al.,

1985; Cheng et al., 1991). Bei der Klonierung der cDNA konnten zunächst zwei 67k GBP

Isoformen im Menschen und eins in der Maus gefunden werden (Cheng et al., 1991).

Im Menschen wurden mittlerweile sieben GBP-Isoformen identifiziert (Cheng et al., 1991;

Fellenberg et al., 2004; Olszewski et al., 2006; Tripal et al., 2007). Alle sieben humanen

Einleitung

- 15 -

GBP´s und ein Pseudogen (ψGBP1) sind innerhalb eines Clusters auf Chromosom 1

lokalisiert (Olszewski et al., 2006). Des Weiteren konnten sechs Maus-Isoformen

(mGBP1-mGBP6), und je eins in der Ratte (Asundi et al., 1994) und im Huhn

(Schwemmle et al., 1996) gefunden und kloniert werden. Des Weiteren wurden GBP-

homologe im Affen, Hund, Schaf, Kuh sowie in verschiedenen Fischen gefunden, aber

nicht in Invertebraten, was darauf schließen lässt, dass die GBP´s sich ausschließlich in

Vertebraten entwickelt haben könnten (Olszewski et al., 2006).

Durch die Analyse des humanen GBP Gencluster auf Chromosom 1 konnten mehrere

Promotorelemente identifiziert werden, die für die Transkription der GBP´s verantwortlich

sind. Darunter ein interferon-stimmulated response element (ISRE) welches für die

Initiierung der Transkription durch INF-α verantwortlich ist und ein gamma-interferon

activation side (GAS) welches durch INF-γ gesteuert wird (Lew et al., 1991; Decker et al.,

1991). Die Überlappung der beiden Elemente konnte bei hGBP1 festgestellt werden und

ist verantwortlich für eine maximale Expression durch INF-γ (Lew et al., 1991). Kürzlich

konnte auch ein NF-κB (nuclear factor κB) Promotor gefunden werden, der zusammen mit

ISRE für die Expression durch Interleukin-1β, Interleukin-β und TNF-α verantwortlich ist

(Lubeseder-Martellato et al., 2002; Guenzi et al., 2001; Naschberger et al., 2004).

Über die zelluläre Funktion der GBP´s ist bis heute noch nicht viel bekannt. Eine antivirale

Funktion der GBP aufgrund der inflammatorischen Cytokin-vermittelten Expression ist

jedoch zu vermuten. Experimente mit HeLa-Zellen, in denen hGBP1 stabil exprimiert

wurde, konnten die Replikation des VS-Virus und des EMC-Virus (encephalomyocarditis

virus) hemmen (Anderson et al., 1999). Dieser antivirale Effekt konnte auch für das

mGBP2 beobachtet werden (Carter et al., 2005). Jedoch ist der beobachtete antivirale

Effekt von hGBP1 im Vergleich zu dem von MxA deutlich geringer. Einen

Zusammenhang zwischen hGBP1 und einer antibakteriellen Immunantwort konnte

ebenfalls hergestellt werden. Bei der Untersuchung des cerebralen Spinalfluids von

Patienten mit bakterieller Meningitis, konnte eine erhöhte Konzentration von hGBP1 im

Vergleich zu Kontrollpatienten, beobachtet werden. Es zeigte sich dabei, dass etwa 27%

des gesamten hGBP1 über einen nicht-klassischen, möglicherweise ABC-Transporter-

abhängigen Weg sekretiert wird. Für die Sekretion ist weder die Bindung und Hydrolyse

von GTP, noch die Farnesylierung des Proteins notwendig. Die Funktion von hGBP1 bei

bakterieller Meningitis konnte jedoch noch nicht geklärt werden (Naschberger et al.,

2006).

Einleitung

- 16 -

Die inflammatorische Cytokin abhängige Expression von hGBP1 konnte in vivo bereits in

vaskulären Endothelzellen unterschiedlicher Organe, wie Herz, Lunge, Uterus und Milz,

beobachtet werden. Dagegen konnte in vitro die Expression von hGBP1 auch in anderen

Zellsorten gezeigt werden (Lubeseder-Martellato et al., 2002).

Bei der Lokalisation von hGBP1 in Endothelzellen, zeigte sich bei einer INF-γ induzierten

Überexpression eine diffuse granuläre Verteilung im Cytoplasma. Im Zellkern dagegen

konnte kein hGBP1 gefunden werden. Bei der gleichzeitigen Gabe von INF-γ und

Aluminiumfluorid zeigt sich eine Translokation von hGBP1 am Golgi-Apparat

(Lubeseder-Martellato et al., 2002; Modiano et al., 2005, Tripal et al., 2006). Diese

Umverteilung von hGBP1 in der Zelle ist abhängig von der Farnesylierung, da bei der

Verwendung einer CaaX-Box defizienten Mutante keine Golgi-Lokalisation beobachtet

werden konnte. Jedoch ist für die Rekrutierung an den Golgi-Apparat noch ein weiterer

INF-γ induzierter Faktor notwendig, da hGBP1 in Abwesenheit von INF-γ im Cytosol

verbleibt (Modiano et al., 2005).

Werden Endothelzellen mit inflammatorischen Cytokinen wie INF-γ, TNFα oder IL-1β

behandelt, wird ein anti-proliferativer und wachstumshemmender Effekt beobachtet. Es

konnte gezeigt werden, dass dieser Effekt mit der Expression von hGBP1 korreliert.

Interessanterweise ist der anti-proliferative Effekt unabhängig von der GTPase-Aktivität

und wird ausschließlich durch die Anwesenheit der helikalen Domäne vermittelt. Eine

Farnesylierung des Proteins scheint nicht notwenig zu sein (Guenzi et al., 2001). Für

mGBP2 wurde ebenfalls eine Korrelation zwischen Expression und Proliferation gefunden

(Gorbacheva et al., 2002). Wurde jedoch mGBP2 konstitutiv in Fibroblasten des Typs NIH

3T3 exprimiert, zeigte sich eine um 50% erhöhte Wachstumsrate, was ein gegensätzliches

Bild zu hGBP1 in Endothelzellen zeigt. Ein weiterer Unterschied ist, das für die

Stimulation der Proliferation in Fibroblasten eine funktionierende GTPase-Domäne

notwendig ist. Wird die Hydrolysegeschwindigkeit durch die Punktmutation S52N

herabgesetzt, führt dies zu einer verminderten Wachstumsgeschwindigkeit (Gorbacheva et

al., 2002).

Für die Angiogenese ist neben der Proliferation auch das Eindringen von Endothelzellen in

die extrazelluläre Matrix eine wichtige Funktion. Diese Invasion der Endothelzellen ist ein

mehrstufiger Prozess, bei dem die Zellbeweglichkeit und die Proteolyse miteinender

verknüpft sind. Die angiogenetische Proteolyse ist abhängig von Matrixmetalloproteasen

(MMP), einer Familie die strukturell mit Zink-abhängigen Peptidasen verwandt ist. Es

konnte gezeigt werden, dass bei der Expression von hGBP1 selektiv die Expression von

Einleitung

- 17 -

MMP-1 inhibiert wird. Für diesen Effekt ist die GTPase-Aktivität essentiell (Guenzi et al.,

2003).

Für das Maus Ortholog mGBP2 konnte ein ähnlicher Effekt beobachtet werden. Die

Expression von mGBP2 oder die Behandlung mit INF-γ inhibiert die Ausbreitung von

Fibroblasten auf Fibronektin. Die Inhibition der Ausbreitung ist dabei begleitet von einer

verminderten Synthese von MMP-9, kann jedoch durch die Überexpression von MMP-9

wieder rückgängig gemacht werden (Vestal 2005). Bei einem Vergleich der

Aminosäuresequenzen aller humanen GBP´s ist eine hohe Sequenzhomologie

untereinander zu beobachten (Abbildung 1-9). Dabei zeigt sich die größte Sequenzidentität

zwischen hGBP1 und hGBP3, die bei etwa 87% liegt. Die Gene der beiden GBP´s liegen

im Gencluster auf Chromosom 1 direkt beieinander (Olszewski et al., 2006).

Die größten Homologien zwischen den humanen GBP´s liegen bei den N-Terminal

lokalisierten LG-Domänen. In allen sieben hGBP´s sind die vier Sequenzmotive GTP-

bindender Proteine zu finden. Der P-Loop (GxxxxGKS), das Threonin in Switch II und

DxxG-Motix sind sogar in allen sieben hGBP´s identisch. Das vierte Motiv, das bei

hGBP1 abweichend als (T/A)xRD-Motiv bekannt ist, ist in den meisten GTP-bindenden

Proteine als NKxD-Motiv bekannt. Die größte Diversität unter den sieben humanen GBP´s

liegt im C-terminalen Teil der Proteine. Dabei fällt auf, dass nur hGBP1, hGBP2 und

hGBP5 das CaaX-Motiv für die posttranslationale Isoprenylierung besitzen. Bei dieser

posttranslationalen Modifikation wird eine C15-Farnesylgruppe oder eine C20-

Geranylgeranylgruppe durch eine Thioether-Bindung an das Cystein des CaaX-Motivs

gebunden (Nantais et al., 1996). Über das an das Protein gebundene Isoprenoid können

Proteine an die Zellmembran oder an Membranen von Zellkompartimenten gebunden

werden. Experimentell konnte eine Isoprenylierung für hGBP1 (Nantais et al., 1996),

mGBP1 (Stickney et al., 2000), mGBP2 (Vestal et al. 1998) und beim p67 GBP aus der

Ratte nachgewiesen werden (Asundi et al., 1994). Bei in vivo Studien zur Zelllokalisation

von hGBP1-5, konnte für hGBP5 eine konstitutive Assoziation an den Golgi-Apparat

gezeigt werden.

Einleitung

- 18 -

Die Assoziation von hGBP1 und hGBP2 an den Golgi-Apparat trat aber erst nach

Stimulation der Zellen mit INF-γ und gleichzeitiger Gabe von Aluminiumfluorid auf. In

unstimulierten Zellen liegt hGBP1 und hGBP3 cytosolisch vor, wogegen hGBP2 und

hGBP4 im Zellkern und im Cytoplasma lokalisiert werden konnten (Tripal et al., 2006;

Modiano et al., 2005; Stickney et al., 2000). Die Zelllokalisation von mGBP1 und mGBP2

Abbildung 1-9: Sequenzvergleich der sieben humanen GBP´s. Abgebildet sind die Aminosäuresequenzen aller sieben hGBP´s. Schwarz markiert sind die Aminosäuren, die zwischen den hGBP´s identisch sind, graue Markierungen implizieren Aminosäuren die homolog zueinander sind. Die Markierungen mit einem Stern oder einem Kreuz kennzeichnen Aminosäuren, die in den humanen und den GBP´s aus der Maus invariant bzw. fast invariant sind. Angegeben sind auch die konservierten Sequenzmotive GTP-bindender Proteine wie die des P-Loops, des DxxG-Motifs und das (T/A)xRD-Motif, welches zwischen den hGBP´s Unterschiede aufweist. Das C-Terminale CaaX-Motiv, welches für die posttranslationale Lipid-Modifikation wichtig ist, ist nur in drei humanen GBP´s zu finden. (Entnommen aus Olszewski et al. 2006)

Einleitung

- 19 -

konnte ebenfalls in in vivo Experimenten geklärt werden. Das mGBP1 zeigte dabei eine

homogene Verteilung im Cytoplasma, wogegen mGBP2 im Cytoplasma in Vesikeln

unterschiedlicher Größe vorgefunden wurde (Vestal et al., 2000).

1.4 Das humane Guanylat-bindende Protein 1

Das bisher am besten biochemisch und strukturell charakterisierte Mitglied aus der Familie

der großen Guanylat-bindenden Proteine ist das hGBP1. Die Kristallstruktur des full length

hGBP1 (Abbildung 1-10) konnte bereits in Nukleotid-freier Form und im Komplex mit

GppNHp gelöst werden (Prakash et al., 2000a; Prakash et al., 2000b). Das hGBP1 besteht

aus einer kompakten, globulären large GTP-binding (LG-Domäne) und einer lang

gezogenen helikalen Domäne. Die N-terminal gelegene LG-Domäne ist ca. 30-kDa groß

und besteht aus einem achtsträngigen β-Faltblatt, das von neun α-Helices umgeben ist.

Diese Domäne ist bei allen GTPasen der Dynamin-Familie sehr ähnlich (Haller et al.

2002), unterscheidet sich aber von den G-Domänen aus anderen Familien der GTP-

bindenden Proteine aufgrund von Sequenzinsertionen. Die Nomenklatur der

Sekundärstruktur von hGBP1 baut auf der von Ras auf, die aus einem sechsträngigen β-

Faltblatt besteht, das von fünf α-Helices umgeben ist. Hinzu kommen N-terminal die

Elemente β0, α0 und β1 und die Helices α3´ (I3) und α4´(I4). Neben der kleinen Insertion

(I1) in Bereich des switch I gibt es noch große loop Insertionen zwischen dem 97DxxG100

Motiv und α2 (I2) und zwischen β6 und α5 (I5) (Prakash et al., 2000). Die helikale

Domäne besteht aus sieben α-Helices (α7-α13)und kann in die Subdomänen α7-11 und

α12-13 unterteilt werden. Die Helices α7 bis α11 bilden zwei Helix-Bündel, wobei α9

Bestandteil beider Bündel ist. Diese zwei Dreierhelixbündel geben dem hGBP1 eine

charakteristische langgezogene Form.

Einleitung

- 20 -

C

α7-11

α12-13

LG-Domäne

N

Abbildung 1-10: Darstellung der Kristallstruktur von hGBP1 im Bändermodell. Dargestellt ist die Kristallstruktur vom nukleotidfreien hGBP1 im Bändermodel (PDB:1dg3). Rot eingefärbt ist die aminoterminal gelegene LG-Domäne, die topologisch Ähnlichkeiten zu Ras aufweist, aber um ca. 100 Aminosäuren vergrößert ist. Der Rest des Proteins ist α-helikal und kann in zwei Subdomänen eingeteilt werden. Die erste Subdomäne (blau) besteht insgesamt aus fünf Helices und bildet zwei Helix-Bündel, wobei α9 Bestandteil beider Bündel ist. Angeschlossen an diese Bündel ist die 120Å lange Helix α12, die das gesamte Protein flankiert und auch mit der LG-Domäne interagiert (grün). An die Helix α12 schließt sich nach einer Kehre die Helix α13 an, die das CaaX-Motiv für die posttranslationale Farnesylierung trägt.

Angeschlossen an diese Helixbündel ist die 120Å lange Helix α12, die das gesamte Protein

flankiert und auch mit der LG-Domäne interagiert. An die Helix α12 schließt sich nach

einer Kehre die Helix α13 an, die zusammen eine kurze Coiled-Coil bilden. Betrachtet

man das elektrostatische Oberflächenpotential der helikalen Domäne wenn die Helices

α12-13 ausgeblendet ist, erkennt man dass die exponierten Aminosäuren überwiegend

polar sind aber durch die Anwesenheit von α12 maskiert werden. (Abbildung 1-11). Die

Kontakte zwischen dem Helixbündeln und α12 sind relativ schwach und liegen

hauptsächlich am ersten Helixbündel und der LG-Domäne (Pakash et al., 2000a). Das

zweite Helixbündel hat keinen Kontakt zur α12, die aber durch mehrere elektrostatische

Kontakte mit der Helix α4´ an die LG-Domäne gebunden ist.

Einleitung

- 21 -

Die letzten zehn Aminosäuren des Proteins am C-teminus sind ungeordnet. Sie enthalten

unter anderem die CaaX-Box, die Erkennungssequenz für die Farnesylierung des Proteins

(Prakash et al., 2000a).

hGBP1 zeigt, wie auch andere Mitglieder der Familie großer, Dynamin ähnlicher

GTPasen, eine nukleotidabhängige Oligomerisierung, die eine Stimulation der GTPase

Aktivität zur Folge hat. Einzigartig bei hGBP1 ist seine Fähigkeit GTP nicht nur zu GDP,

sondern sukzessiv zu GMP hydrolysieren zu können, wobei das Produktverhältnis

temperaturabhängig ist (Schwemmle et al., 1994). Das Hauptprodukt der Hydrolyse von

GTP durch hGBP1 ist bei 37°C, mit über 80% das GMP (Kunzelmann et al., 2006),

verschiebt sich aber bei kleiner werdenden Temperaturen auf die Seite des GDP´s

(Praefcke et al., 1999). Die GTPase-Aktivität ist konzentrationsabhängig und erhöht sich

um das achtfache in Messungen bei 37°C. Dieser kooperative Mechanismus konnte

ebenfalls für Dynamin gezeigt werden (Warnock et al., 1996) und deutet auf eine

intermolekulare Interaktion von hGBP1 hin. Mit Hilfe der analytischen

Größenausschlußchromatographie und analytischer Ultrazentrifugation, konnte eine

nukleotidabhängige Oligomerisierung nachgewiesen werden. Es zeigte sich, dass hGBP1

im nukleotidfreien Zustand als Monomer vorliegt. In Gegenwart der nicht

hydrolysierbaren GTP-Analoga GppNHp bzw. GTPγS bildet es ein Dimer. Im Komplex

mit GDP und Aluminiumfluorid assembliert hGBP1 zu einem Tetramer (Prakash et al.,

2000; Praefcke et al., 2004).

Abbildung 1-11: Interaktion des C-teminalen Helixmotiv α12/13 mit der Helikalen- und LG-Domäne. Das elektrostatische Oberflächenpotential zeigt dass die Regionen mit vielen polaren Aminosäuren durch die Helices α12und α13 maskiert werden (Abbildung entnommen aus Prakash et al., 2000a).

Einleitung

- 22 -

Die Kristallisation des full length hGBP1 in einem assemblierten dimeren- oder tetrameren

Zustand ist bis heute nicht gelungen. Jedoch konnten die Kristallstrukturen der isolierten

LG-Domänen von hGBP1 in unterschiedlichen Nukleotid-gebundenen Zustanden gelöst

werden (Ghosh et al., 2006). Es zeigte sich, dass die LG-Domänen im Komplex mit

GppNHp, GMP*ALF3 und GDP*AlF4- als Dimer kristallisierten (Abbildung 1-12).

Für die Bildung von Tetrameren ist jedoch die Anwesenheit der helikalen Domäne

erforderlich. Experimente mit dem Hefe-2-Hybrid System und analytischer

Größenausschlusschromatographie zeigten eine Interaktion der helikalen Domäne die über

die Helices α12 und α13 vermittelt wird (Dissertation Benscheid, 2005). Für die

Stimulierung der GTPase Aktivität ist jedoch die Interaktion der LG-Domänen

ausreichend (Ghosh et al., 2006; Praefcke et al.; 2001). Anhand der Kristallstrukturen der

dimeren LG-Domäne konnte erstmals der Mechanismus der sukzessiven Spaltung von

GTP zu GMP und die Beschleunigung der GTP- und GDP-Hydrolyse erklärt werden. Eine

Dimerisierung hat zur Folge, dass das im P-loop gelegene Arginin 48 eine Bewegung in

Richtung Nukleotid-Bindungstasche macht. Im monomeren, nukleotidfreien Protein

dagegen, zeigt das Arg48 vom Nukleotid weg (Ghosh et al., 2006). Dieses Arginin ist

Abbildung 1-12: Kristallstruktur des LG-Domänen Dimers in GppNHp-gebundener Form. Abgebildet ist die Bänderdarstellung des GppNHp-gebundenen Dimers der LG-Domänen (PDB: 2bc9). Die Interaktionsfläche des Dimers ist etwa 4000Å² groß. In die Dimerisierung sind die Guaninkappe, switch I und switch II involviert.

Monomer I Monomer II

Einleitung

- 23 -

wichtig für die Beschleunigung der GTPase-Aktivität und ist vergleichbar mit dem

Arginin des RasGAP, welches in die Nukleotid-Bindungstasche von Ras orientiert wird,

um dessen Aktivität zu steigern (Scheffzek et al., 1997). Eine weitere

Konformationsänderung im Zuge der Dimerisierung ist beim switch I zu beobachten. Das

dort gelegene Serin 73 orientiert sich nach der Dimerisierung so um, dass ein

Wassermolekül in die Nähe des γ-Phosphat vom Nukleotid positioniert wird und dieses

somit für einen nukleophilen Angriff positioniert und/oder aktiviert wird (Ghosh et al.,

2006).

Dass diese beiden Aminosäuren essentiell für die Aktivität von hGBP1 ist, konnte durch

die Punktmutanten R48A und S73A gezeigt werden. Die R48A Mutante hatte eine im

Vergleich zum Wildtyp, 100fach niedrigere maximale Hydrolyseaktivität und zeigte kein

kooperatives Verhalten mehr (Praefcke et al., 2004). Die Punktmutation S73A dagegen

zeigte im Vergleich zum Wildtyp nur eine zehnfach kleinere maximale

Hydrolysegeschwindigkeit war, aber ebenfalls nicht mehr kooperativ (Ghosh et al., 2006).

Diese Beobachtungen konnten sowohl für das full length Protein als auch für die isolierte

LG-Domäne gemacht werden.

Eine weitere wichtige Aminosäure ist das Aspartat 184 aus dem vierten GTP-

Sequenzmotiv, das in allen GTP-bindenen Proteinen für die Spezifität der Base zuständig

ist. Die Punktmutante D184N im hGBP1, änderte die Substratspezifität von Guanin- zu

Xanthinnukleotiden. Das Motiv, welches für die Spezifität der Guaninnukleotide

verantwortlich ist, wurde erst nachträglich als 181TLRD184 Motiv gefunden, da es von den

üblichen N/TKxD-Motiven aus z.B. Ras, abweicht (Praefcke et al. 1999). Ein weiteres

wichtiges Merkmal bei hGBP1 ist die Position der Guaninbase in der Bindungstasche.

Abweichend zu Proteinen wie z.B. EF-Tu, den Gα Untereinheiten, aber auch den Ras-

ähnlichen Proteinen ist der N-glykosidische Bindungswinkel, verändert. Als Konsequenz

dieser Änderung zeigt sich eine abweichende Interaktion zwischen dem Nukleotid und

dem Protein. In hGBP1 wird die Nukleotidbindungstasche im Gegensatz zu Ras vom

Lösungsmittel abgeschirmt. Dafür zuständig sind die Guaninkappe und die Phosphatkappe

die aus Insertionen bezogen auf die Topologie von Ras gebildet werden.

Interessanterweise sind beide Regionen in die Dimerisierung der LG-Domänen involviert.

Eine Besonderheit der isolierten LG-Domäne ist, dass sie in der Lage ist aus der Lösung

heraus GDP zu binden und in relativ hoher Geschwindigkeit zu hydrolysieren. Dagegen ist

die maximale spezifische GTPase-Aktivität der LG-Domänen jedoch kaum höher als im

full length Protein. Weiterhin bildet die LG-Domäne im Komplex mit GDP*AlFx und im

Einleitung

- 24 -

2E + 2GTP

2E·GTP

(E·GTP)2

schnell

(E·GDP)2

2E·GDP

2E + 2GDP 2E + 2GMP

2E·GMP

(E·GMP)2

k = 2,5 µM son -1 -1GTP k = 26soff

-1GDP

k = 0,87s -1

3

k = 0,45s -1

1 k = 2,2s -1

2

k = 20soff -1GMP

k = 0,26s4 -1

Gegensatz zum full length Protein, sogar mit GMP*AlFx Dimere (Ghosh et al., 2006;

Praefcke et al., 2001). Durch Überlagerung der beiden LG-Domänen Strukturen im

GMP*AlFx und GDP*AlFx gebundenen Zustand, die den Übergangszustand der GTP- und

der GDP-Hydrolyse simulieren, zeigte sich, das dass Aluminiumfluorid in beiden Fällen

eine ähnliche Position einnimmt. Es wird angenommen, dass die Abspaltung des γ-

Phosphats eine Positionsänderung des Nukleotids im aktiven Zentrum zur Folge hat, damit

das β-Phosphat mit den gleichen Seitenketten wie das γ-Phosphat interagieren kann. Der

zweite Hydrolyseschritt kann somit durch die gleichen Aminosäuren katalysiert werden

(Ghosh et al., 2006). Durch den Einsatz verschiedener transienter kinetischer Methoden

konnte die Kinetik der Nukleotidhydrolyse von hGBP1 detailliert untersucht werden.

Dabei konnten einzelne Reaktionsschritte, der Substratbindung, Dimerbildung, GTP und

GDP Hydrolyse sowie die Produktdissoziation ermittelt werden (Abbildung 1-13)

Die Geschwindigkeit der Hydrolyse von GTP zu GDP im dimeren hGBP1 liegt bei 0,45s-1

(k1) und ist damit langsamer als die Umsetzung von GDP zu GMP, die bei 2,2s-1 (k2) liegt.

Die Spaltung von GDP ist etwa 5-fach schneller als die GTP-Spaltung. Dieses Ergebnis ist

ein Hinweis darauf, dass die Verschiebung des Nukleotids innerhalb des katalytischen

Zentrums sehr schnell sein muss.

Abbildung 1-13: Reaktionsmodell der Nukleotidhydrolyse durch hGBP1. Es konnte gezeigt werden, dass die Geschwindigkeit der GTP-Hydrolyse (k1) langsamer ist als die der GDP-Hydrolyse (k2). Dieses Ergebnis ist ein Hinweis darauf, dass die Verschiebung des Nukleotids innerhalb des katalytischen Zentrums sehr schnell sein muss. Die Bildung eines Dimers nach der GTP-Bindung ist ein sehr schneller Vorgang und nicht Geschwindigkeits-limitierend. Ausserdem ist, im Gegensatz zum GTP-Dimer, die Dissoziation des GDP- und GMP-gebundenen Dimers irreversibel. (Entnommen aus Kunzelmann et al., 2006)

Einleitung

- 25 -

In weiteren Experimenten zur Kinetik der Abspaltung des γ-Phosphats, konnte ein

phosphate burst beobachtet werden, was auf einen Geschwindigkeitsbestimmenden Schritt

nach der Abspaltung des ersten Phosphats hinweist. Der langsame Schritt wurde als

Übergang des GMP-gebundenen Dimers zum GMP-gebundenen Monomer vorgeschlagen.

Weiterhin wurde festgestellt, dass im Gegensatz zum GTP-gebundenen Dimer die

Dissoziation des GDP- und GMP-gebundenen Dimers irreversibel ist (Kunzelmann et al.,

2006).

1.5 Zielsetzung

Die Selbstassemblierung von Proteinen der Dynamin Familie ist ein wichtiger Bestandteil

ihrer Funktion. Vorrangegangene Arbeiten konnten bereits für das hGBP1 eine

Assemblierung zu einem dimeren Komplex beobachtet werden, die eine starke

Beschleunigung der Hydrolyse zur Folge hat. Des Weiteren konnte auch die

Oligomerisierung zu einem tetrameren Komplex gezeigt werden, in der die Helices α12/13

als Interaktionsdomäne dient.

Ziel dieser Arbeit war es, unter biophysikalischen und biochemischen Gesichtspunkten,

die Selbstassemblierung von hGBP1 zu untersuchen und die Rolle der helikalen

Subdomäne α12/13 innerhalb dieses Vorgangs zu klären. Des Weiteren sollte in dieser

Arbeit eine c-DNA-Bank aus INF-γ induzierten HUVECs hergestellt werden, um mit

dieser und der Hilfe des Hefe 2-Hybrid-Systems einen Interaktionspartner von hGBP1 zu

identifizieren. Diese Arbeit beschäftigte sich ebenfalls mit der biochemischen

Charakterisierung von hGBP2 und gibt die ersten Hinweise auf eine Interaktion zwischen

hGBP1 und hGBP2.

Material und Methoden

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2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Chemikalien

Alle Chemikalien wurden von den Firmen Sigma-Aldrich (Deisenhofen), Amersham-

Pharmacia (Freiburg), Applichem (Darmstadt), Baker (Deventer, Niederlande), Boehringer

Mannheim (Mannheim), Fermentas (St. Leon-Rot), Fluka (Neu-Ulm), GERBU (Gaiberg),

Merck (Darmstadt), Qiagen (Hilden), Riedel-de Haen (Seelze), Roth (Karlsruhe) und Serva

(Heidelberg) in jeweils höchster Reinheit bezogen.

2.1.2 Enzyme und Marker Pepsin Sigma (Deisenhofen)

Trypsin Serva Electrophoresis (Heidelberg)

DNA Polymerase I Novagen (Madison, USA)

T4-DNA Polymerase Novagen (Madison, USA)

T4 Polynukleotid Kinase Novagen (Madison, USA)

Alkaline Phosphatase Novagen (Madison, USA)

RNase H Novagen (Madison, USA)

BamHI Fermentas (St. Leon-Rot)

DpnI Fermentas (St. Leon-Rot)

EcoRI Fermentas (St. Leon-Rot)

Pfu-DNA-Polymerase Fermentas (St. Leon-Rot)

Taq-DNA-Polymerase Fermentas (St. Leon-Rot)

SalI Fermentas (St. Leon-Rot)

NcoI Fermentas (St. Leon-Rot)

T4 DNA-Ligase Fermentas (St. Leon-Rot)

Thrombin (Serva, Heidelberg)

Protein molekular weight marker:

14,4; 18,4; 25; 35; 45; 66; 116 kDa Fermentas (St.Leon-Rot)

MassRuler DNA-Leiter High-Range Fermentas (St.Leon-Rot)

MassRuler DNA-Leiter Low-Range Fermentas (St.Leon-Rot)


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Presicion Plus Protein Standard:

Mg: 10; 15; 20; 25; 37; 50; 75; 100; 150; 250 kD Biorad (München)

DNA-Marker 100Bp-Leiter Sigma (Deisenhofen)

2.1.3 Reagenzienkits

QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen (Hilden)

Plasmid Midi- und Maxiprep Kit Qiagen (Hilden)

QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen (Hilden)

RNeasy Midi Kit Qiagen (Hilden)

Oligotex mRNA Kit Qiagen (Hilden)

OrientExpress Oligo(dT) cDNA Synthese Kit Promega

2.1.4 Säulenmaterialien Nickel-NTA-Agarose Superflow, Qiagen (Hilden)

Superdex® 75, Amersham-Pharmacia (Freiburg)

Superdex® 200, Amersham-Pharmacia (Freiburg)

GSH-Sepharose Superflow, Amersham-Pharmacia (Freiburg)

HisPur Cobald Resin, Pierce (Rockford,USA)

2.1.5 Mikroorganismen E.coli TG1: supE, hsdD5, thi, D (lac-proAB), F‘[traD36, proAB+,

lacIq, lacZDM15], (Gibson, 1984)

E.coli XL1-Blue: recA1, end A1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1,

lac, [F‘, proAB,

lacIqZDM15, Tn10 (Tetr)], (Bullock et al., 1981)

E.coli BL21 (DE3): B, F-, hsdS (rB-, mB-), gal, dcm, ompT, l(DE3),

(Studier & Moffatt, 1986)


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2.1.6 Vektoren pGEX 4T3

Der pGEX 4T3 Vektor hat eine Größe von 4950 bp. Er beinhaltet eine Ampicillin

Resistenz (Ampr) und einen durch IPTG induzierbaren lac Promotor (Lac). N-Terminal

von der MCS (multiple cloning site) liegt das Gen, das für die Glutathion-S-Transferase

(GST) kodiert, welche für die Aufreinigung des Proteins über eine Gluthathion-Sepharose-

Säule benötigt wird. Für die spätere Abspaltung des GST liegt dahinter eine Schnittstelle

für die Protease Thrombin.

pProEx HTb (Invitrogen, Carlsbad, USA)

Der pProEx HTb Vektor hat eine Größe von 4779 bp. Er beinhaltet eine Ampicillin

Resistenz (Ampr) und einen IPTG induzierbaren lac Promotor (Lac).

N-Terminal von der MCS werden 6 Histidine codiert, die als Fusionspartner für das

inserierte Protein fungieren. Mit dem Histidin-Tag kann das Protein über eine Nickel-

NTA-Agarose-Säule aufgereinigt werden. Um den His-Tag abzuspalten, liegt davor eine

aus sechs Aminosäuren bestehende Erkennungssequenz für die Protease TEV.

pQE9 (Qiagen, Hilden)

Der pQe9 Vektor hat eine Größe von 3,4 kb. Er beinhaltet eine Ampicillin Resistenz

(Ampr) und einen IPTG-induzierbare T5-Promotor/Lac-Operator-Element.

N-Terminal von der MCS werden 6 Histidine codiert, die als Fusionspartner für das

insertierte Protein fungieren. Mit dem Histidin-Tag kann das Protein über eine

imobillisierte Nickel-Säule aufgereinigt werden.

pGBKT7 (Clonetech, Mountain view, USA)

Der Vektor pGBKT7 exprimiert Proteine welche an eine verkürzte GAL4 DNA

Bindedomäne fusioniert sind. In Hefen werden diese Proteine in einem hohen Level, durch

den konstitutiven ADH1 Promotor (PADH1) exprimiert. Die Transkription wird durch ein T7

und ein ADH1- transkriptions-terminations Signal beendet. Der Vektor besitzt außerdem

einen T7-Promotor und ein c-Myc Epitop Tag Der Vektor repliziert sich autonom sowohl

in E.coli als auch in S.cerevisiae durch pUC und 2µ Ori. Der Vektor trägt eine

Kanamycin-Resistenz für E.coli und einen TRP1 Selektionsmarker für Hefen.


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pGADT7 (Clonetech, Mountain view, USA)

Der Vektor pGADT7 exprimiert Proteine welche an eine verkürzte GAL4-DNA-

Aktivierungs- Domäne fusioniert sind. In Hefen werden diese Proteine in einem hohen

Level durch den konstitutiven ADH1-Promotor (PADH1) exprimiert. Die Transkription wird

durch ein ADH1-transkriptions-terminations Signal beendet. Das Fusionsprotein wird mit

Hilfe des SV40 Kern-Lokalisationssignal in den Kern transportiert. Der Vektor besitzt

außerdem einen T7 Promotor und ein HA-Epitop-Tag Der Vektor repliziert sich autonom

sowohl in E.coli als auch in S.cerevisiae durch pUC und 2µ Ori. Der Vektor trägt eine

Ampicillin Resistenz für E.coli und einen LEU2 Selektionsmarker für Hefen.

2.1.7 Antibiotika Ampicillin GERBU Biotechnik (Gaiberg)

Tetracyclin Sigma (Deisenhofen)

Kanamycin GERBU Biotechnik (Gaiberg)

Die Antibiotika wurden den Medien in Konzentrationen von 100mg/l (Ampicillin), 50mg/l

(Kanamycin) und 12,5mg/l (Tetracyclin) zugesetzt.

2.1.8 Oligonukleotide Alle Oligonukleotide wurden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg) bezogen. Die

Sequenzen sind in 5´-3´-Richtung angegeben und bezüglich ihrer Leserichtung mit s

(sense) oder as (antisense) gekennzeichnet. Die für die Sequenzierprimer angegebenen

Zahlen beziehen sich auf die Nukleotidsequenz von hGBP1, bzw. hGBP2.

Für Mutagenesen:

hGBP1-R227E-s CCTGCCCAGA CTCTGTATCG AGAAATTCTT CCCAAAG

hGBP1-R227E-as CTTTGGCAAG AATTTCTCGA TACAGAGTCT GGGCAGG

hGBP1-K228E-s CCCAGACTCT GTATCCGGGA ATTCTTCCCA AAG

hGBP1-K228E-as TCCTGGGAAG AATTCCCGGA TACAGAGTCT GGG

hGBP1-E563R-s GCAACTACTA AAACGCGGAT TTCAAAAAGA AAGC

hGBP1-E563R-as GCTTTCTTTT TGAAATCCGC GTTTTAGTA GTTG


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Für Sequenzierungen:

pQE-s GTATCACGAG GCCCTTTCGT CT

pQE-as CATTACTGGA TCTATCAACA GGAG

hGBP1 300-319-s ATCTGGATGT CGTGTGTGCC

hGBP1 300-319-as CGCACACACC ACATCCAGAT

hGBP1 570-589-s TCAGCTGACT TTGTGAGCTT

hGBP1 570-589-as AAGCTCACAA AGTCAGCTGA

hGBP1 1000-1018-s GCATGGAGAA CGCAGTTCCT

hGBP1 1000-1018-as AGGACTGCGT TCTCCATGC

hGBP2 500s CTGTAGACGA CTCAGCTGAC TTTGTGAGC

hGBP2 1000s CAGCAGATGG GCCAGAAGGT GCAGGTCC

pProEx-s AGCGGATAACAATTTCACACAGG

pProEx-as TTCTCTCATCCGCCAAAACAGCCAAG

pGBKT7-s GAGGAGCAGAAGCTGATCTCAGAG

pGBKT7-as GCGCGCAAAAAACCCCTCAAGACCC

pGex-s ATAGCATGGCCTTTGCAGG

pGex-as GAGCTGCATGTGTCAGAGG

2.1.9 Nährmedien LB-Medium:

10g/l Bacto-Trypton

5g/l Hefeextrakt

10g/l NaCl

pH 7,4 mit NaOH

LB-Agar-Medium:

LB-Medium

12g/l Agar

TB-Medium:

12g/l Bacto-Trypton

24g/l Hefeextrakt

4ml/l Glycerol


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0.17mM KH2PO4

0.072mM K2HPO4

YPD-Medium (Vollmedium):

20g/l BactoPepton

10g/l Hefeextrakt

2% Glucose

18g/l Agar (bei festem Nährmedium) pH 5,8

Yeast Nitrogen Base (YNB):

1g/l Kaliumphosphat

0,5g/l Magnesiumsulfat

0,1g/l Natriumchlorid

0,1g/l Calciumchlorid

0,002mg/l Biotin

0,4mg/l Calciumphatothenat

0,002mg/l Folsäure

2mg/l Inositol

0,4mg/l Nicotinsäure

0,2mg/l 4-Aminobenzoesäure

0,4mg/l Pyridoxin

0,2mg/l Riboflavin

0,4mg/l Thiamin

0,5mg/l Borsäure

0,04mg/l Kupfersulfat

0,1mg/l Kaliumiodid

0,2mg/l Eisenchlorid

0,4mg/l Mangansulfat

0,2mg/l Natriummolybdat

0,4mg/l Zinksulfat

5g/l Ammoniumsulfat

20g/l Dextrose


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SD-Medium:

20mg/l Arginin

30mg/l Isoleucin

30mg/l Lysin

20mg/l Methionin

50mg/l Phenylalanin

200mg/l Threonin

30mg/l Tyrosin

20mg/l Uracil

150mg/l Valin

20mg/l Adenin

20mg/l Histidin

100mg/l Leucin

20mg/l Tryptophan

Selektionsmedium:

THL- SD-Medium ohne Tryptophan, Histidin und Leucin

Die Nährmedien wurden vor Verwendung 15 Minuten lang bei 121°C autoklaviert.

2.2 Molekularbiologische Methoden

2.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA Für die Isolierung von Plasmiden aus E-coli Zellen wurde ein Präparationskit der Firma

Qiagen (Hilden) verwendet. Die Durchführung geschah nach Angaben des Herstellers.

Dabei werden 1,5 ml Zellen einer Übernachtkultur durch alkalische Lyse aufgeschlossen

und nach Fällung der Proteine mit Natrium-Dodecylsulfat über eine

Anionenaustauschersäule aufgereinigt. Die Plasmid-DNA wird somit hochrein in einem

Tris-Puffer (pH 7,5) erhalten.


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PCR-Ansatz (für 50 µl Gesamtvolumen):

30–500 ng Template DNA

1 µl 5’-Primer (sense) (100 µM)

1 µl 3’-Primer (anti-sense) (100 µM)

2,5 µl dNTP-Mix

5 µl 10x Taq-Polymerase Puffer

3 µl MgCl2

1 µl Taq-Polymerase (5U)

2.2.2 Polymerase-Kettenreaktion

Zur Amplifikation von Genfragmenten wurde die Polymerase-Kettenreaktion (PCR,

polymerase chain reaction) verwendet. Die selektive Vervielfältigung wurde unter

Verwendung hitzestabiler DNA-Polymerasen sowie zweier Oligonukleotide vollzogen. Die

Primer für die Amplifizierung wurden von der Firma MWG-Biotech (Ebersberg) bezogen.

Die PCR-Ansätze waren wie folgt zusammen gesetzt:

Die PCR-Zyklen wurden mit einem PCR-Gerät von Eppendorf wie folgt durchgeführt:

Initiale Denaturierung bei 95°C für eine Minute, 25-35 Zyklen mit einer Minute bei 95°C,

1 Minute bei 54°C (Primer Anlagerung), 1-16 Minuten bei 72°C (Synthese).

2.2.3 Sequenzierung Die Sequenzierung der DNA wurde am Lehrstuhl für Biochemie II an einem ABI 3130xl

(Applied Biosystems, Foster City, USA) durchgeführt. Dazu wurde das Plasmid isoliert

und eine Probe von 5µl in ein Reaktionsgefäß pipettiert. Die beiden Sequenzierprimer

wurden auf 10pmol/µl verdünnt und jeweils zu 5µl mitgeschickt.


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2.2.4 Herstellung kompetenter Zellen Für die Herstellung kompetenter Zellen (E-coli TG1, XL1-blue und BL21 (DE3)) wurden

5 ml Übernachtkulturen angesetzt. Je 1 ml wurden am nächsten Tag auf 100 ml LB-

Medium übergeimpft und bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,5 – 0,6 herangezogen (1-3

Stunden). Die Bakteriensuspension wurde dann für 20 Minuten auf Eis gestellt und

anschließend bei 4°C 5 Minuten bei 8000 U/min sedimentiert. Das Pellet wurde in 10 ml

eisgekühltem TSS-Puffer (10% PEG 8000, 5% DMSO, 50mM MgCl2 in LB ohne NaOH

pH6,5 ) resupendiert. Nach Zugabe von 1,5 ml 15%igen Glycerin wurden 300 µl Aliquots

hergestellt und diese direkt in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung erfolgte

bei -80°C.

2.2.5 Transformation Für die Transformation von E-coli Zellen wurden 250 µl kompetenter Zellen langsam auf

Eis aufgetaut. Danach wurden 5-20 µl eines Ligationsansatzes mit den 250µl kompetenter

Zellen versetzt und für eine Stunde auf Eis inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz

einem Hitzeschock unterzogen, indem eine Inkubation für 60 Sekunden bei 42°C erfolgte.

Nach 2 Minuten Abkühlung auf Eis wurden dem Ansatz 900 µl Antibiotika-freies LB-

Medium zugefügt, und der Ansatz eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden dann

bei 14000 UpM zentrifugiert und in 150 µl des Überstandes resuspendiert. Diese

Suspension wurde dann auf Antibiotika haltige Agar-Nährböden verteilt und über Nacht

bei 37°C im Brutschrank inkubiert.

2.2.6 Agarosegelelektrophorese Zur Analytischen und präparativen Trennung der DNA-Proben wurden diese mit

Probenpuffer (0,25% (w/v) Bromphenolblau, 30% (v/v) Glycerol, 0,25% (w/v) Xylen-

Cyanol pH 8,0) versetzt und auf ein einprozentiges Agarosegel aufgetragen. Die

Elektrophorese erfolgte bei einer Spannung von 100 V und einer Laufzeit von ca. 60 min.

Nach Färbung mit 0,001%igen Ethidiumbromid konnten die DNA-Banden auf einem UV-

Schirm (320nm) detektiert werden.


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2.2.7 DNA-Isolierung aus Agarosegelen Die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte mit dem Gelelutions

Kitsystem der Firma Qiagen (Hilden) nach Angaben des Herstellers. Sie beruht auf der

Auflösung der Agarose in Puffer bei 50 °C und anschließender Reinigung der DNA über

Anionenaustauschersäulen. Die Elution der DNA erfolgte mit 30µl eines 10 mM Tris-HCl

Puffers.

2.2.8 Restriktionsenzymatischer Verdau von DNA Die enzymatische Spaltung von Plasmiden und DNA-Fragmenten durch spezifische

Restriktionsenzyme wurde in einem Gesamtvolumen von je 40 µl durchgeführt. Da die

Enzyme bei unterschiedlichen Puffern auch unterschiedliche Aktivitäten besitzen, muss

gerade bei einem Doppelverdau auf die Menge und Art des Puffers und die Länge der

Inkubation geachtet werden. Die Inkubation erfolgte bei 37°C im Brutschrank gemäß den

Angaben der Hersteller der Enzyme. Vor der weiteren Verwendung der geschnittenen

Fragmente wurde zur Reinigung der gesamte Ansatz auf ein 1%iges Agarosegel

aufgetragen und nachher die benötigten Fragmente aus dem Gel extrahiert.

2.2.9 Ligation Zur Ligation wurden Vektor-DNA und die DNA des Fragments, das eingesetzt werde soll,

in einem Mengenverhältnis von 1:4 gemischt. Bei der Ligation mit überlappenden Enden

wurden die Fragmente in einem Endvolumen von 20 µl mit 1 U T4-DNA Ligase und 5µl

eines Ligase-Puffers (10x) des Herstellers Fermentas (St. Leon-Rot) über Nacht bei 16 °C

inkubiert.

2.2.10 Isolation von Gesamt-RNA aus HUVEC Für die Darstellung einer cDNA-Bank aus INF-γ stimulierten HUVEC (humane

Endothelzellen der Nabelschnurvene) musste im Vorfeld die gesamte RNA aus den Zellen

isoliert werden. Es wurden HUVEC in insgesamt 7 Zellkulturschalen (T75) bis zur

Konfluenz wachsen gelassen. Sechs dieser Schalen wurden dann mit 100U/µl INF-γ

induziert. Nach jeweils 5, 12 und 24 Stunden wurden Zellen von je zwei Platten mit


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geerntet. Die Zellen wurden in einem 2ml Reaktionsgefäß mit 1 ml Trizol versetzt. Mit

Hilfe einer Kanüle wurde die Lösung mehrfach eingezogen und abgelassen, um

genomische DNA zu scheren. Durch die Zugabe von Chloroform und nachfolgender

Zentrifugation (10 Minuten bei 10000g) wurden die Proteine abgetrennt und durch

Isopropanol die RNA präzipitiert. Die RNA wurde nachfolgend mit 75% Ethanol/DEPC-

H2O gewaschen. Der Überstand wurde vollständig abgenommen und das RNA-Pellet

getrocknet.

2.2.11 Darstellung einer cDNA-Bank aus INF-γ stimulierten HUVECs

Die zur Isolation der RNA verwendeten Zellen wurden vor der Ernte mit 100U/ml INF-γ

stimuliert. Inkubationszeiten von 0, 5, 12 und 24 Stunden wurden gewählt, um

unterschiedliche Expressionsstadien abzudecken, da nicht bekannt ist, zu welchem

Zeitpunkt ein möglicher Interaktionspartner von hGBP1 exprimiert wird.

Die erhaltene Gesamt-RNA wurde auf ihre Integrität hin kontrolliert und die Konzentration

bestimmt. Je 30µg der Gesamt-RNA wurde in einem großen Ansatz vereinigt und mit

Hilfe eines Oligotex mRNA-Kits (Qiagen, Hilden) die mRNA aufgereinigt. Für die

Aufreinigung von mRNA wurde eine Säulenmatrix benutzt, an der kovalent (dT)-

Oligonukleotide immobilisiert sind. Die so aufgereinigte mRNA wurde dann als Matrix für

die cDNA Synthese benutzt. Für die Synthese der cDNA wurde das Sythese-Kit

OrientExpress der Firma Promega verwendet.

Für die Erststrangsynthese wurden 30µl der aufgereinigten mRNA mit 3µg Oligo(dT)-

Primern in DEPC-H2O bei 70°C für 10 Minuten vorinkubiert. Nach kurzen Abkühlen auf

Eis wurden 12µl Erststrangpuffer (5x), 6mM DTT, 100µM dNTP-Mix (methyliert) und

800U MMLV reverse Transskriptase hinzugefügt. Die Inkubation erfolgte bei 37°C für

eine Stunde, gefolgt von 70°C für 10 Minuten. Für die Zweitstrangsynthese wurden 50µl

eines Zweitstrangpuffers (5x), 6µl DTT, 100µM dNTP (methyliert), 50U DNA-

Polymerase I und 1,6U RNaseH hinzugefügt. Nach 90 Minuten bei 15°C wurde der

gesamte Ansatz mit Hilfe des PCR-Purification-Kits (Qiagen, Hilden) aufgereinigt.

Um die cDNA erfolgreich in einen Vektor klonieren zu können, wurden die Enden der

cDNA modifiziert. Dazu wurde die cDNA mit 2,5U einer T4 DNA-Polymerase bei 11°C

für 20 Minuten inkubiert. Um den Puffer zu wechseln und die T4 DNA-Polymerase zu

entfernen, wurde abermals eine Aufreinigung durch ein PCR Purifikations Kit

vorgenommen.


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Um Schnittstellen einzufügen, wurden EcoRI-Linker verwendet. Diese Oligonukleotide

waren doppelsträngige palindromische Dodecamere, welche in ihrer Mitte eine EcoRI

Schnittstelle trugen. Durch Phosphorylierung durch eine T4-Polynukleotid-Kinase und

nachfolgender Verwendung einer T4 DNA Ligase wurden diese Linker an die

doppelsträngige cDNA ligiert. Nachdem Vektor und cDNA mit EcoRI restringiert worden

waren, wurde der Vektor (pGBKT7) durch alkalische Phosphatase dephosphoryliert und

die cDNA durch T4 Polynucleotid-Kinase phosphoryliert, um die Ligationseffizienz zu

erhören. Nach der Ligation wurde der Vektor in kompetente Zellen (E.coli, Nova Blue)

transformiert und auf 150 LB-Platten mit Kanamycin ausplattiert.

2.2.12 Darstellung kompetenter Hefen

Für die Methode der Co-Transformation wurde die LiAc-Methode nach Ito et al. (1983)

gewählt, in der die DNA mit einer Carrier-DNA in LiAc inkubiert wird. Die cDNA-Bank

und der Vektor mit dem Köder wurden simultan in den Hefestamm AH109 transferiert.

Dabei ist die Transfereffizienz zwar um eine Größenordnung kleiner gegenüber der

sequenziellen Transformation, aber es besteht sonst das Risiko, dass das erste Plasmid für

ein toxisches Protein kodiert. Um eine möglichst große Transformationseffizienz zu

erreichen, wurden die kompetenten Hefezellen direkt vor der Transformation hergestellt.

Dazu wurden aus dem Glycerol-Stock einige Hefezellen entnommen, diese in ca. 500µl

YPD Puffer gelöst und auf einer YPD-Agar Platte ausgestrichen. Von den gewachsenen

Kolonien wurde eine Kolonie in 3ml YPD-Medium resuspendiert und über Nacht bei

30°C, 180 UpM inkubiert. Diese wurde am nächsten Tag auf 50ml YPD-Medium verdünnt

und bei 30°C, 180 UpM inkubiert, bis zu einer Zelldichte von OD600 = 0,15-0,3.

Anschließend wurden die Hefen bei 700xg in 5min bei Raumtemperatur sedimentiert,

einmal mit 60ml TE/LiAc-Puffer gewaschen und erneut sedimentiert und abschließend in 8

ml TE/LiAc-Puffer resuspendiert. Danach erfolgte eine finale Inkubation bei RT für

mindestens 10 min.

2.2.13 Transformation in Hefen

Für die Transformation wurden dann zu 1ml Zellen 20 mg Lachs-Sperma DNA, 1mg

HUVEC-cDNA, 0,3mg hGBP1-pGADT7 DNA und 60 ml TE/LiAc-Puffer gegeben. Nach


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30 Minuten Inkubation bei 30°C und 200 UpM wurden 7ml DMSO hinzugefürt.

Anschließend erfolgte bei 42°C für 20 min der Hitzeschock. Die abschließend

sedimentierten Hefen (1000xg, 5min, RT) wurden in 10ml YPD-Medium aufgenommen

und 1 h bei 30°C, 180 UpM regeneriert.

2.2.14 Hefe 2-Hybrid Screen

Der Transformationsansatz wurde auf YPD-Agar-Platten ausplattiert, denen die

Aminosäuren Histidin, Tryptophan und Leucin fehlten, um die Transformanten auf eine

HIS3-Expression hin zu testen. Um das Histidin-Basallevel zu unterdrücken, wurde zu

dem Medium außerdem noch 20µM 3-Amino-1,2,4-Triazol (3-AT) gegeben. Die

erhaltenen Kolonien wurden dann auf Platten umgesetzt, denen zusätzlich noch die

Aminosäure Adenin fehlte, um die Stringenz weiter zu erhöhen.

Die hier erhaltenen Kolonien wurden darüber hinaus auf die Expression des lacZ-Gens

bzw. auf die Aktivität der ß-Galactosidase getestet. Dazu wurde ein Rundfilter auf die

Platten gelegt und angedrückt, um einen Teil der Zellen auf den Filter zu übertragen. Diese

Filter wurden für ein paar Sekunden in flüssigen Stickstoff gehalten und dann mit einer X-

GAL-Lösung getränkt. Sofern das (künstliche) Substrat X-Gal durch die ß-Galactosidase

umgesetzt wurde, zeigten die entsprechenden Kolonien eine Blaufärbung.

Um die Hefezellen auf ihre Kompetenz hin zu testen, wurden vor der Transformation der

Bibliothek einige Zellen entnommen und mit den Vektoren pGBKT7-T (Large T-Antigen)

und pGADT7-p53 kotransformiert. Diese wurden dann auf YPD-Nährböden ausplattiert,

denen die Aminosäuren Tryptophan und Leucin fehlten. Da die Proteine p53 und Large T-

Antigen interagieren, konnte durch das Umsetzten der erhaltenen Kolonien auf Nährböden

ohne Tryptophan, Leucin, Histidin und Adenin das 2-Hybrid System auf seine

Funktionsfähigkeit hin überprüft werden.

Für die Analyse der DNA aus den positiven Klonen wurde eine Plasmid-Extraktion

vorgenommen. Dazu wurden die Hefezellen in 4 ml Puffer resuspendiert, anschließend mit

5mg Lytikase versetzt und 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Durch den Verdau der

Zellwände durch die Lytikase konnte die DNA-Extraktion nachfolgend mit Hilfe eines

DNA Extraktions Kits der Firma Qiagen (Plasmid Mini Kit, Qiagen, Hilden) erfolgen.

Die Analyse des Inserts erfolgte durch eine PCR mit Hilfe von Standard-Vektor-Primern

für den Vektor pGADT7.


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2.3 Proteinbiochemische Methoden

2.3.1 Präparative Proteinexpression und Ultraschallaufschluss

Um größere Mengen eines Proteins herstellen zu können, wurden bis zu 10 Liter eines

entsprechenden antibiotikumhaltigen Nährmediums (TB-Medium) benötigt, welches mit

einer Übernacht-Kultur von 1/100 des Nährmedien-Volumen angeimpft wurde. Nach ca. 5-

6 Stunden Inkubation bei 37°C bzw. einer OD600 von 0,5 bis 0,6 wurde die Temperatur auf

25°C reduziert und nach Erreichen der Temperatur mit 100µM IPTG induziert und die

Inkubation über Nacht bei 25°C und 150upm weitergeführt. Die Zellen wurden durch

10minütige Zentrifugation bei 7000g und 4°C geerntet, der Überstand verworfen und das

Sediment bei -80°C gelagert. Zur Isolation des Proteins wurde das Pellet in Lysepuffer

(50mM Tris-HCl pH 7,9, 5mM MgCl2, 1mM PMSF, 4ml Triton X100) resuspendiert und

so langsam aufgetaut. Der Zellaufschluß erfolgte mit Hilfe eines Ultraschallgeräts unter

Eiskühlung. Dauer und Stärke der Beschallung richteten sich nach der Menge des

Zellpellets (ca. 10 Minuten bei 250ml Zellsuspension). Schließlich wurde die Suspension

30 Minuten lang bei 23000upm (SC-300 Rotor) und 4°C in einer Zentrifuge (Sorvall

Evolution RC) zentrifugiert.

2.3.2 Glutathion-Affinitätschromatographie Die affinitätschromatographische Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen wurde mit

einer GSH-Sepharose-Fastflow-Säule, 25 ml Säulenvolumen, (Amersham-Pharmacia,

Freiburg) durchgeführt. Auf die zuvor mit 10 mM Tris/HCl pH 7,4, 500 mM NaCl und 2

mM DTE äquilibrierte Säule wurde der Überstand bei einem Fluss von 2 ml/min

aufgetragen und anschließend mit 4 Säulenvolumen Tris-Puffer (10mM) gewaschen. Die

Spaltung des Fusionsproteins erfolgte durch Auftragen von 250U Thrombin in 10 ml Tris-

Puffer und nachfolgender Inkubation über Nacht. Das gespaltene Protein wurde mit ca. 125

ml Tris-Puffer mit 500 mM NaCl und 2mM DTE von der Säule eluiert und die Säule mit 4

Säulenvolumen Tris-Puffer mit 20mM Glutathion, und 4 Säulenvolumen 6 M Guanidin-

HCl gereinigt.


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2.3.3 Nickel-NTA-Affinitätschromatographie Zur affinitätschromatographischen Reinigung von N-terminal Histidin-markierten

Proteinen, wurde der Überstand des Aufschlusses auf eine in 50mM Tris/HCl pH 8,0,

500mM NaCl, 5mM MgCl2, 2mM Imidazol äquilibrierte HisPur-Cobalt Resin mit 25 ml

Säulenvolumen bei einem Fluß von 4 ml/min aufgetragen. Anschließend wurde die Säule

mit 5 Säulenvolumina 50 mM Tris/HCl (pH 8,0), 500mM NaCl, 5mM MgCl2 und 10mM

Imidazol, sowie 5 Säulenvolumina 20mM Tris/HCl pH 8,0, 100mM NaCl, 5mM MgCl2,

10mM Imidazol gewaschen. Die Elution des Proteins erfolgte durch einen

Imidazolgradienten von 10mM bis 150mM in 20mM Tris/HCl pH 8,0, 100mM NaCl,

5mM MgCl2.

2.3.4 Größenausschlußchromatographie Für die weitere Aufreinigung der Proteine wurde eine Größenausschlusschromatographie

durchgeführt. Für die zu trennenden Proteine wurde das Säulenmaterial Superdex® 75

(26/60) oder Superdex® 200 (26/60) verwendet (Amersham-Pharmacia, Freiburg). Die

Säule wurde mit 3 Säulenvolumen 50mM Tris/HCl, 2mM MgCl2, 2mM DTE äquilibriert,

bevor die Proteine über Nacht mit einem Fluss von 0,5 ml/min aufgetragen wurden. Der

Durchfluss wurde durch einen Probensammler in 4 ml Fraktionen aufgefangen.

2.3.5 Aufkonzentrieren durch Ultrafiltration Mit Hilfe von Zentrifugationsröhrchen (Vivascience, USA) wurden die Proteinlösungen

aus der Gelfiltration aufkonzentriert. Die Porengröße der Membran lag, je nach

Proteingröße, bei Mw = 10kDa bis Mw = 100kDa. Durch Zentrifugation bei 4000 upm und

4°C wurden alle Bestandteile, die kleiner als die Membranporen waren, durch diese

durchgedrückt, und es verblieb die aufkonzentrierte Proteinlösung.

2.3.6 Denaturierende SDS-Gelelektrophorese Proteine wurden entsprechend ihrem Molekulargewicht in einem denaturierenden

Polyacrylamidgel aufgetrennt (Schägger und von Jagow 1987). Dazu wurde ein vertikales

Gelelektrophoresesystem (BioRad, München) verwendet. Die Trenngele enthielten je nach

Molekulargewicht der aufzutrennenden Proteine 6-18% Acrylamid.


- 41 -

Die Proteinproben wurden mit Probenpuffer (125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 50 % Glycerin,

10 % SDS, 10 mM ß-Mercaptoethanol und 0.01 % Bromphenolblau) versetzt. Die

Elektrophorese erfolgte bei einer Spannung von 100-120 V. Das Gel wurde für 15 min in

der Färbelösung (0,1 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue G250, 0,1 % (w/v) Coomassie

Brilliant Blue R250, 40 % Ethanol (v/v), 10 % Essigsäure (v/v)) gefärbt. Nicht an Protein

gebundener Farbstoff wurde mit Wasser ausgewaschen.

2.3.7 Konzentrationsbestimmung nach Gill & von Hippel Die Proteinbestimmung nach Gill und Hippel (1989) beruht auf der Bestimmung des

molaren Extinktionskoeffizienten bei Wellenlängen um 280 nm. Der

Extinktionskoeffizient des Proteins kann aus der Anzahl der Tryptophan-, Tyrosin und

Phenylalaninreste pro Molekül bestimmt werden. Die Konzentration der Lösungen wurde

nach dem Lambert-Beerschen Gesetz ermittelt: A = a*c*d

Das Protein wurde in 20mM Kaliumphosphat, 6M Guanidiniumhydrochlorid (GuaHCl),

pH6,5 verdünnt, so dass die Extinktion zwischen 0,3 und 0,8 lag. Die Absorption wurde

gegen 20mM Kaliumphosphat, 6M GuaHCl, pH6,5 gemessen. Der Extinktionskoeffizient

konnte mit Hilfe des Internetprogramms „ProtParam„

(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html) berechnet werden. Die

Absorptionsmessungen wurden im UV-Bereich mit dem Zweistrahl-

Absorptionsspektrometer (Specord 200, Analytik Jena) durchgeführt.

2.3.8 Markierung von Proteinen mit Fluoreszenzfarbstoffen Die Markierung von Proteinen wurde mit Maleinimid- gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffen

durchgeführt, die unter Bildung eines Thioethers selektiv an Cysteine binden. Um einen

Fluoreszenz-Energie Transfer zu erhalten, wurden die beiden FRET-Paare Fluorescein und

Coumarin zum Markieren verwendet. Alle Fluoreszenzmarker wurden von der Firma

MoBiTec GmbH (Göttingen) bezogen. Die Markierungsreaktion erfolgte in einem

gegenüber dem Protein zweifachen Überschuss an Fluorophor in 50mM Tris-HCl pH 7,4,

5mM MgCl2 und wurde bei 4°C durchgeführt. Um die Kopplungsreaktion zu stoppen,

wurden zu der Probe 2mM Dithioerytrithol (DTE) hinzugefügt. Zum Abtrennen von

überschüssigem Fluorophor wurde der Reaktionsansatz über eine NAP-5


- 42 -

Gelfiltrationssäule (GE Healthcare, München) aufgereinigt und anschließend

aufkonzentriert.

Der Reaktionsansatz wurde dann mit Hilfe von Absorptionsmessungen hinsichtlich seiner

Markierungseffizienz (Menge an Fluorophor pro Protein) überprüft. Dazu wurde die

Kontentration an Fluorophor mit Hilfe des jeweiligen Extinktionskoeffizienten bestimmt

(Fluorescein λmax= 492nm, ε=83000M-1cm-1; Cumarin λmax=384nm, ε=18464M-1 cm-1) und

in Relation zur Proteinkonzentration gesetzt.

2.4 Biophysikalische Methoden

2.4.1 Bestimmung von Nukleotidkonzentrationen

Die Konzentration von Guaninnukleotiden wurde durch Absorptionsmessungen bei 253nm

in 20mM Tris-HCl bei pH 7,9 durchgeführt. Für unmodifizierte Guaninnukleotide wurde

der molare Extinktionskoeffizienz von ε253=13700 M-1cm-1verwendet. Für

Guaninnukleotide, die mit einer 3´-O-(N-Methyl-anthraniloyl)-Gruppe (mant-) gekoppelt

sind, wurde der molare Extinktionskoeffizient von ε253=22500 M-1cm-1verwendet

(Hiratsuka, 1983).

2.4.2 Analyse von Nukleotiden mittels reversed-phase HPLC

Die Bestimmung der Reinheit und die Analyse von Nukleotidgemischen erfolgte mittels

reversed-phase HPLC nach der Methode von Lenzen et al. (Lenzen et al., 1995). Die

Methode beruht auf der Interaktion der hydrophoben stationären Phase mit dem Ionenpaar

aus Nukleotid und dem Tetrabutylammoniumbromid-Ion (TBA-Br) in der mobilen Phase.

Die Menge an gebundenen TBA richtet sich nach der Menge an vorhandenen

Phosphatgruppen wodurch sich entsprechend die Retentionszeit verlängert.

Die zu untersuchende Probe wurde mit Hilfe einer BT4100 HPLC-Pumpe (Jasco, Gross-

Umstadt) auf die Säule aufgetragen. Die Trennung erfolgte durch eine 25cm Reprosil 100

C18 Säule (Dr. Maisch, Ammerbuch-Entringen). Denaturierte Proteine wurden an einer

Nucleosil 100-5 C18 Vorsäule absorbiert. Der verwendete Laufpuffer enthielt 100mM


- 43 -

Kaliumphosphat (pH6,5), 10mM TBA-Bromid, 0,3mM Natriumazid und 7,5% Acetonitril.

Die Detektion erfolgte über die Absorption bei Wellenlängen zwischen 200 und 370nm mit

Hilfe des Photodiodenarray-Detektors MD-2010 (Jasco, Gross-Umstadt).

2.4.3 Messungen der Nukleotidhydrolyse

Die steady-state Hydrolysegeschwindigkeiten von GTP und GDP durch GBP´s wurde

mittels reversed-phase HPLC gemessen. Dabei wurden die Proteine in Puffer (50mM Tris-

HCl, 5mM MgCl2, 2mM DTE) mit 350µM GTP bzw. GDP und 50µM BSA bei 25°C

inkubiert. Nach verschieden Zeitpunkten wurden 20µl der Probe auf die HPLC-Anlage

aufgetragen und die Nukleotide getrennt. Die Anteile an GTP, GDP und GMP konnten

dann dem Elugramm entnommen werden. Der Anteil am nicht umgesetzten Substrat wurde

dann gegen die Reaktionszeit aufgetragen und die Anfangsgeschwindigkeit in einem

Bereich bis 40% Substratumsatz durch lineare Regression angepasst. Der Quotient aus

Anfangsgeschwindigkeit und Proteinkonzentration liefert die spezifische Aktivität. Durch

Auftragung der Änderung der spezifischen Aktivität gegen die Proteinkonzentration wurde

die Kooperativität der Hydrolyse bestimmt. An diese Daten wurde entweder eine

quadratische Bindungskurve (Formel 2-1) oder ein modifizierte Hill-Funktion angepasst

(Formel 2-2)

Formel 2-1: [ ] [ ]( ) [ ]

[ ]EEKEKE

kkkk DD

2422

)(22

0max0

−+−+−+=

Formel 2-2: [ ]( )nKE

kkkk/1

1)( 0max0+

−+=

Dabei ist k die spezifische Aktivität bei der Enzymkonzentration E in mol/l, k0 die

spezifische Aktivität bei unendlich hoher Verdünnung von E, kmax ist die maximale

Erhöhung der spezifischen Aktivität, n der Hill-Parameter für das Maß der Kooperativität

und KD die Gleichgewichtskonstante der Dissoziation des Dimers in mol/l.


- 44 -

2.4.4 Stopped-flow Kinetik

Für die Betrachtung schneller, im Millisekunden-Bereich liegender Reaktionen wurden

zeitaufgelöste Fluoreszenzmessungen an einem SFM400 stopped-flow Gerät (Bio-Logic,

Grenoble, Frankreich) durchgeführt. Für diese Messungen wurden zwei Reaktanden bei

einer Flussrate von 14ml/s in einer Probenküvette (FC08) gemischt und die zeitliche

Änderung der Fluoreszenzintensität detektiert. Die Totzeit des Systems betrug bei diesen

Bedingungen 1,1ms. Für die Auswertung wurde über mindestens drei einzelne Messungen

gemittelt.

Mit dieser Methode wurden Assoziations- und Dissoziationskinetiken von mant-

Nukleotiden (mGMP, mGDP, mGppNHp) bestimmt. In diesen Experimenten wurden die

mant-Guaninnukleotid-Konzentrationen konstant bei 0,5µM gehalten und

Proteinkonzentrationen zwischen 5µM und 40µM variiert. Der hohe Proteinüberschuss

wurde verwendet, um eine Bindungskinetik pseudo-erster Ordnung zu erhalten. Die

Anregung der mant-Fluorophore erfolgte bei 366nm und die Emission wurde, um das

Streulicht herauszufiltern, mit Hilfe eines Kantenfilters oberhalb von 420nm detektiert.

Aus einer einfach exponentiellen Anpassung an die zeitliche Fluoreszenzänderung wurde

kobs, die beobachtete Geschwindigkeitskonstante, erhalten.

Bei Auftragung der erhaltenen Geschwindigkeitskonstante (kobs) gegen die Konzentration

(B0) zeigte sich die lineare Abhängigkeit (Formel 2-3).

Formel 2-3 [ ] dissassobs kBkk += 0

Die Geschwindigkeitskonstante der Assoziation (kass) und die Geschwindigkeitskonstante

der Dissoziation (kdiss) wurde aus der Steigung und dem Achsenabschnitt bestimmt. Für

eine genauere Bestimmung der Dissoziationsgeschwindigkeit wurden

Verdrängungsexperimente vorgenommen. Dabei wird ein Komplex aus Protein und mant-

Nukleotid vorgelegt. Durch einen großen Überschuss an nicht markierten Nukleotid wird

dann das mant-Nukleotid aus dem Komplex verdrängt.


- 45 -

2.4.5 Fluoreszenztitration mit mant-Nukleotiden

Fluoreszenztitrationen zur Bestimmung von Nukleotidaffinitäten wurden an einem

Kontron SFM25 Spektrofluorometer bei 25°C durchgeführt. Dafür wurden 0,5µM mant-

Guaninnukleotid in einer Fluoreszenzküvette vorgelegt und in kleinen Schritten bis zu

250µl einer Proteinlösung hinzutitriert, in der auch 0,5µM mant-Nukleotid vorlag, um den

Verdünnungseffekt zu umgehen. Nach jedem Titrationsschritt wurde bis zu Einstellung des

Gleichgewichts gewartet, um ein konstantes Fluoreszenzsignal zu erhalten. Die Titration

wurde beendet, sobald eine Sättigung zu beobachten war. Die Anregung der mant-

Fluoreszenz erfolgte bei 366nm und die Emission wurde bei 435 nm detektiert. An die

Auftragung der relativen Fluoreszenz gegen die Proteinkonzentration wurde eine

quadratische Bindungskurve (Formel 2-4) angepasst.

Formel 2-4 [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]

[ ]000

20000

max0 24)(**

ELEKLEKLE

FFF DD −++−Δ+=

Dabei ist F die Gesamtfluoreszenz, F0 die Grundfluoreszenz, ΔFmax die maximale

Fluoreszenzerhöhung, [E]0 die Konzentration des vorgelegten Fluorophors, [L]0 die

Gesamtkonzentration des hinzutitrierten Reaktionspartners und KD die

Dissoziationskonstante. Aus dieser Anpassung wurde die Gleichgewichtskonstante der

Dissoziation (KD) erhalten.

2.4.6 Größenausschlusschromatographie

Die analytische, größenspezifische Trennung von Proteinen erfolgte durch

Größenausschlusschromatographie. Dazu wurde die Säule (Superdex S200 10/30, GE

Healthcare) mit 2 Säulenvolumen Puffer (50mM Tris-HCl, pH7,9, 5mM MgCl2, 2mM

DTE) equilibriert. Diese Puffer enthielten, je nach Experiment, 200µM eines

Guaninnukleotids (GMP, GDP, GppNHp). Um das Oligomerisierungsverhalten der

Proteine im Übergangszustand der Nukleotidhydrolyse zu analysieren, wurde ein Puffer

verwendet, in dem 200 µM eines Guaninnukleotids (GMP oder GDP) und AlFx

hinzugegeben wurden (300µM AlCl3, 10mM NaF, 50mM Tris-HCl, pH7,9 ,5mM MgCl2,

2mM DTE).


- 46 -

Bei einer Flussrate von 0,5ml/min wurden 200µl der vorinkubierten Probe auf die Säule

aufgetragen. Die Detektion erfolgte mit einem Photodiodenarray-Detektor MD-2010

(Jasco, Gross-Umstadt) zwischen 200nm und 600nm.

Die Kalibrierung der analytischen Gelfiltrationssäule erfolgte mit Standardproteinen

(Cytochrom C (12,4kDa), Carboanhydrase (29kDa), Albumin (66kDa), ADH (150kDa)

und β-Amylase (200kDa)) und einem hochmolekularen Farbstoff (Dextran Blue), um das

Ausschlussvolumen zu bestimmen (MW-GF-200, Sigma-Aldrich, Deisenhofen).

2.4.7 Dynamische Lichtstreuung

Bei der Methode der dynamischen Lichtstreuung wird Laserlicht (He-Ne-Laser, 632,8nm)

auf eine Küvette fokussiert, in der ein im Puffer gelöstes Protein vorliegt. Das dabei

entstehende Streulicht wird in einem Winkel von 90° zum Strahlengang detektiert. Durch

die Brownsche Molekularbewegung der Proteine wird die Wellenlänge des Streulichts so

verändert, dass eine Schwankung in der Streuintensität resultiert. Aus den detektierten

Fluktuationen des Streulichts berechnet ein digitaler Korrelator in Echtzeit eine

Korrelationsfunktion. Diese Korrelationsfunktion beschreibt die Ähnlichkeit der

Intensitäten des detektierten Streulichts in Relation zur Korrelationszeit τ. Dadurch lässt

sich nun die Diffusionsgeschwindigkeit des Makromoleküls in Lösung ableiten. Mit Hilfe

des Diffusionskoeffizienten und der Viskosität des Lösungsmittels lässt sich so, auf

Grundlage der Stokes-Einstein-Gleichung, der hydrodynamische Radius des einzelnen

Proteins bestimmen.

Für die Analyse des Oligomerisierungsverhaltens von hGBP1 und hGBP2 wurden 20µM

des jeweiligen Proteins in Puffer (50mM Tris-HCl pH7,9, 5mM MgCl2, 2mM DTE) gelöst,

und durch einen 0,2µm Spritzenfilter in die Küvette gefüllt. Um den nukleotidabhängigen

Oligomerisierungsstatus zu überprüfen, wurden jeweils 200µM eines Guaninnukleotids

(GMP, GDP, GppNHp, GDP*AlFx) hinzugegeben.

2.4.8 Temperatursprung

Die Temperatursprung-Methode (T-Jump) ist eine Methode, in der ein System, in diesem

Fall ein Monomer-Dimer-Gleichgewicht, durch eine kontrollierte Temperaturänderung aus

dem Gleichgewicht gebracht wird. Das Einstellen des neuen Gleichgewichts kann dann


- 47 -

durch unterschiedliche Methoden (Anisotropie, Absorption oder Fluoreszenz) detektiert

werden. Die Temperaturänderung wird erreicht, indem zwei Lösungen unterschiedlicher

Anfangstemperaturen sehr schnell miteinander vermischt werden. Die Endtemperatur

ergibt sich aus den Anfangstemperaturen der beiden Lösungen und dem

Mischungsverhältnis. Als Grundlage für den experimentellen Aufbau dient eine stopped

flow Anlage (Bio-Logic, Grenoble, Frankreich), die um ein Element für die

Temperaturregelung der Proben erweitert wurde. Die Temperaturregelung erfolgt durch

drei Peltier-Elemente, welche eine schnelle und genaue Temperaturanpassung

gewährleisten.

Mit dieser Methode wurden die Affinitäten der Deletionsmutanten α12-13, α7-13 und der

Doppelmutante hGBP1-R227E/K228E analysiert. Dazu wurden diese Proteine mit

Fluoreszenzmarkern versehen, die bei einer Interaktion der Proteine ein FRET-Signal

liefern. Der Donor und der Akzeptor wurden in equimolaren Konzentrationen in eine

Spritze gegeben und gewartet, bis die Lösungen die jeweiligen Temperaturen angenommen

hatten. In die andere Spritze wurde der Puffer (50mM Tris-HCl pH7,9 ,5mM MgCl2, 2mM

DTE) ohne Protein vorgelegt. Dabei wurde, ausgehend von der Zieltemperatur von 25°C,

eine Temperatur von 10°C für die Proteinlösung und 40°C für den Puffer gewählt. Es

wurden Proteinkonzentrationen zwischen 1µM und 20µM verwendet. Nach dem Mischen

der beiden Lösungen, konnte die Einstellung des neuen Gleichgewichts durch die

Fluoreszenzänderung detektiert werden. Die Datenpunkte wurden mit Hilfe der

Gerätesoftware (Bio-Kine32, Bio-Logic, Grenoble, Frankreich) angepasst.

Formel 2-5 [ ] dissassobs kBkk += 02

Die resultierenden Geschwindigkeitskonstanten wurden gegen die Konzentration

aufgetragen und eine lineare Anpassung der Datenpunkte vorgenommen (Formel 2-5) Die

Geschwindigkeitskonstante der Assoziation (kass) und die Geschwindigkeitskonstante der

Dissoziation (kdiss) wurden aus der Steigung und dem Achsenabschnitt bestimmt.


- 48 -

2.4.9 FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer)

Die Methode des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (Förster 1946), kann eingesetzt

werden, um auf molekularer Ebene sowohl Interaktionen als auch Distanzen quantitativ in

zellfreien oder zellulären Systemen zu bestimmen. Sie eignet sich zur Bestimmung von

Interaktionen zwischen löslichen Proteinen, Membranproteinen sowie Lipidkomponenten

von Membranen oder Nukleinsäuren. Grundlage dieser Methode ist der strahlungslose

Energietransfer von einem angeregten Energiedonor auf einen Energieakzeptor

(Flurophorenpaar) mittels einer intermolekularen long range Dipol-Dipol-Kopplung

(Förster 1946). Voraussetzungen für diesen Energietransfer sind u.a. die Überlappung des

Fluoreszenzemissionsspektrums des Donors und des Absorptionsspektrum des Akzeptors,

sowie ein geringer Abstand zwischen dem Paar. Der Abstand sollte innerhalb des Förster-

Radius liegen, der für jedes Donor-Akzeptor-Paar unterschiedlich ist (Clegg et al. 1995).

Der angeregte Donor übermittelt dann seine Energie strahlungslos auf den Akzeptor, der

seinerseits angeregt wird. Im Zuge des Energietransfers findet ein Quenching der

Fluoreszenz des Donors statt, dagegen wird die Fluoreszenz des Akzeptors verstärkt

angeregt.

Die Analyse der Oligomerisierung von hGBP1 Deletionsmutanten, α12/13, α7-13 und der

Doppelmutante hGBP1-R227E/K228E, wurde mit dem eYFP/eCFP-System oder einem

System bestehend aus Fluorescein und Coumarin vorgenommen. Das eYFP hat sein

Absorptionsmaximum bei 514nm und das Emissionsmaximum bei 525nm und fungiert als

Akzeptor. Das eCFP, das in diesem System als Donor agiert, besitzt sein

Absorptionsmaximum bei 453nm und emittiert maximal bei einer Wellenlänge von

475nm.

Das Coumarin hat sein Absorptionsmaximum bei 384nm und sein Emissionsmaximum bei

472nm. Das Fluorescein hat sein Absorptionsmaximum bei 492nm und sein

Emissionsmaximum bei 521nm.

Aufgrund der guten Überlappung des Emissionsspektrums von Coumarin und dem

Absorptionsspektrum von eYFP war es möglich, diese beiden Fluorophore als FRET-

System zu verwenden.

Ergebnisse

- 49 -

3 Ergebnisse

3.1 hGBP1

3.1.1 Identifizierung einer elektrostatischen Interaktionsstelle

In vorangegangenen Arbeiten konnten unter anderem die Kristallstrukturen der LG-

Domäne von hGBP1 im GMP (PDB: 2d4h) gebundenen Zustand und im Komplex mit

GDP und AlFx (PDB: 2b92) gelöst werden (Ghosh et al., 2006). Die Überlagerung dieser

beiden Strukturen zeigte große Unterschiede in der Position der Helix α4´. Diese Helix

α4´ bewegt sich in der GDP*AlFx-gebundenen Struktur weg von der

Nukleotidbindungstasche (Abbildung 3-1)

Abbildung 3-1: Konformationsänderung der LG-Domäne von hGBP1. Die Abbildung zeigt die Überlagerung der Kristallstrukturen der LG-Domäne von hGBP1 im GMP (rot, PDB: 2d4h) und GDP*AlFx-(blau, PDB: 2b92) gebundenen Zustand. Die Überlagerung dieser beiden Strukturen zeigt große Unterschiede in der Position der Helix α4´.

α4´

hGBP1 LG • GMP hGBP1 LG • GDP*AlFx

Ergebnisse

- 50 -

In einer detaillierten Betrachtung der full length Struktur ist zu erkennen, dass die Helix

α4´ mit den Helices α12-13 interagiert. Diese Interaktion zwischen der LG-Domäne und

dem C-Terminus ist ein elektrostatischer Kontakt bestehend aus einem Lysin (K228) und

einem Arginin (R227) auf Seite der Helix α4´ und mehreren Glutaminsäuren (E563, E568,

E556 und E575) auf Seiten von α12-13 (Abbildung 3-2). Die Bewegung der Helix α4´ um

ca. 7Å hat auch Folgen für die beiden Aminosäuren Arginin 227 und Lysin 228, die bei

näherer Betrachtung der Kristallstruktur die einzigen Interaktionspunkte der LG-Domäne

zu den Helices α12-13 darstellen. Das Arginin 227 wird um 3Å in seiner Position

verändert. Die Bindungsabstände zu dem Interaktionspartner E563 erhöht sich auf über

4,5Å, was für eine polare Bindung eine Schwächung bedeutet. Beim E556, dem zweiten

Interaktionspartner von R227, wird der Abstand auf unter 2Å verkürzt. Das Lysin 228 ist

durch Positionsänderung von α4´ um 5Å zur vorherigen Position verschoben. Die

Entfernung zu den Bindungspartnern E568 und E575 liegen bei über 8Å bzw. 5Å.

Abbildung 3-2: Darstellung des elektrostatischen Kontakts zwischen LG-Domäne und α12-13. Die LG-Domäne interagiert mit den Helices α12-13 aufgrund einer elektrostatischen Bindung zwischen einem Lysin (K228) und einem Arginin (R227) auf Seite der Helix α4´ und mehreren Glutaminsäuren (E563, E568, E556 und E575) auf Seiten von α12-13.

α4´

α12-13

Ergebnisse

- 51 -

Weiterhin ist zu beachten, dass durch die Positionsänderung um 7Å ein sterischer Konflikt

zwischen der α4´ und den Helices α12-13 hervorgerufen würde. Dadurch werden die

Helices α12-13 von der LG-Domäne weggedrückt. Zusammengenommen werden

möglicherweise durch diese Positionsänderungen die Bindungsabstände zwischen den an

der Interaktion beteiligten Aminosäuren so weit erhöht, dass sie unterbrochen werden.

Das hätte zur Konsequenz, dass die Helices α12-13 nicht mehr an der LG-Domäne fixiert

sind (Abbildung 3-3). Der C-terminale Teil des Proteins wäre somit flexibel und könnte

für eine intermolekulare Interaktion zur Verfügung stehen.

Durch den Übergangszustand der Hydrolyse werden diese strukturellen Änderungen der

LG-Domäne induziert, welche nachfolgend auf die Helices α12-13 übertragen werden

Abbildung 3-3: Darstellung des elektrostatischen Kontakts zwischen LG-Domäne und α12-13 vor und nach Konformationsänderung von α4´. Die Abbildung zeigt den elektrostatischen Kontakt zwischen der LG-Domäne und α12-13 im nukleotidfreien Zustand des Proteins (grün, PDB: 1DG3). Durch eine Konformationsänderung der α4´, die durch die Bindung von GDP und AlFx induziert wird (transparent, PDB: 2b92), verändern sich auch die Positionen der Aminosäuren R227 und K228. Aufgrund dieser Positionsänderungen liegen die an der Bindung beteiligten Aminosäuren für die Aufrechterhaltung der Interaktion zu weit auseinander. Als Konsequenz wird die Bindung der α12-13 zur LG-Domäne unterbrochen und steht möglicherweise dadurch für eine intermolekulare Interaktion zur Verfügung.

α4´

α12-13

7Å

Ergebnisse

- 52 -

könnten. Es ist aber bis heute keine full length Struktur im GDP und AlFx gebundenen

Zustand verfügbar, so dass diese Annahme anhand der Struktur nicht bewiesen werden

kann. Um zu zeigen, dass für eine Interaktion am C-terminus die Fixierung an der LG-

Domäne unterbrochen sein muss, wurden die beteiligten Aminosäuren so mutiert, dass

eine Ladungsumkehr resultiert und die Helices voneinander abgestoßen werden. Die

eingefügten Mutationen waren R227E, K228E, E563R und die Doppelmutante

R227E/K228E.

3.1.2 Proteinaufreinigung

Die Aufreinigung der Proteine erfolgte affinitätschromatographisch mit nachfolgender

Größenausschlusschromatographie. Dafür wurden die Proteine, die N-terminal mit einem

(His)6-Tag versehen sind, im E.coli Expressionsstamm BL21 expremiert. Um eine

ausreichende Menge an Protein zu erhalten, erfolgte die Expression in einer 10L-Kultur.

Nach der Zellernte wurden die Zellen durch Ultraschall aufgeschlossen. Durch

Zentrifugation wurden die nicht löslichen Bestandteile abgetrennt und der lösliche

Überstand auf eine HisPur Cobalt-Säule aufgegeben. Die Säule wurde mit Puffer, welcher

10mM Imidazol enthielt, gespült, um unspezifisch gebundenes Protein von der Säule zu

entfernen. Anschließend wurde das Protein mit 150mM Imidazol eluiert und in Fraktionen

von je 4 ml gesammelt. Die proteinhaltigen Fraktionen wurden vereinigt, mit 3M

Ammoniumsulfat gefällt und das gefällte Protein sedimentiert. Das Sediment wurde mit

Puffer C (50mM Tris-HCl, pH7,9, 5mM MgCl2, 2mM DTE) gelöst und auf eine Superdex

S200 Gelfiltrationssäule aufgetragen. Der Durchfluss der Säule wurde wiederum in

Fraktionen von je 4ml gesammelt. Die proteinhaltigen Fraktionen wurden

gelelektrophoretisch analysiert und entsprechend höchster Reinheit vereinigt und

aufkonzentriert.

3.1.3 Dynamische Lichtstreuung

Durch die dynamische Lichtstreuung gelingt es, den Diffusionskoeffizienten und damit

den hydrodynamischen Radius eines Proteins zu ermitteln. Durch den hydrodynamischen

Ergebnisse

- 53 -

Radius kann der Grad der Selbstassemblierung der GBPs in unterschiedlichen Nukleotid-

gebundenen Zuständen analysiert werden.

Da die Kristallstruktur von hGBP1 bereits gelöst werden konnte, ist es möglich über das

Programm HydroPro (Carrasco et al. 1999) den theoretischen Diffusionskoeffizient von

hGBP1 inklusive seiner Hydrathülle zu bestimmen. Dazu wird die Röntgenstruktur des

nukleotidfreien Monomers von hGBP1 (1dg3) aus der Proteindatenbank (RCSB.org)

verwendet. Durch HydroPro wird mit diesen Daten ein theoretischer Diffusionskoeffizient

von hGBP1wt, inklusive Hydrathülle, von 4,74•10-7 cm2•s-1 erhalten. Dieser liegt nahe am

experimentellen über die DLS-Messungen erhaltenen Wert von 4,98•10-7 cm2•s-1.

Mit dem Diffusionskoeffizienten und der Stokes-Einstein-Beziehung (Formel 3-1) kann

der hydrodynamische Radius von hGBP1 berechnet werden. Dabei ist k die Boltzmann-

Kostante, T die Messtemperatur, D der Diffusionskoeffizient und η die Viskosität des

Lösungsmittels bei 298,15K.

Formel 3-1:

Mit den aus HydroPro erhaltenden Diffusionskoeffizienten und der Stokes-Einsteinn-

Beziehung erhält man somit einen Wert für den theoretischen hydrodynamischen Radius

von 4nm. Durch die Messungen mit der DLS-Apparatur wird ein hydrodynamischer

Radius von 4,3nm erhalten. Da die Stokes-Einstein-Beziehung die Diffusion eines

sphärischen Objekts beschreibt erhält man mit dem aus den DLS-Messungen erhaltenen

hydrodynamischen Radius ein mit einer Sphäre korrespondierendes Volumen von

322nm³. Bei der Annahme einer durchschnittlichen Hydrathüllenstärke von 0,3nm, erhält

man für das mit einer Sphäre korrespondierende Volumen ohne Hydrathülle einen Wert

von 248nm³.

Jedoch ist zu beachten, dass hGBP1 geometrisch eher als Ellipsoid zu betrachten ist

(Abbildung 3-4). Das reelle Volumen des Proteins mit und ohne Hydrathülle konnte durch

das Programm HydroPro, anhand der Röntgenstruktur errechnet werden und liegen bei

118nm³ (mit Hydrathülle) bzw. 78nm³ (ohne Hydrathülle).

rTkD∗∗

∗=

ηπ6

Ergebnisse

- 54 -

Betrachtet man hGBP1 nährungsweise als Ellipsoid (V = a•b•c), können die Halbachsen

für die Volumenberechnung durch das Programm PyMol aus der Röntgenstruktur mit

6,1nm•1,9nm•2nm abgeschätzt werden (Abbildung 3-4). Damit ergibt sich ein mit einem

Ellipsoid korrespondierendes Volumen (4/3π•a•b•c) für das Protein ohne Hydrathülle, von

97nm³. Dieser Wert weicht nur gering von dem über HydroPro interpolierten Volumen

von 78nm³ ab. Mit diesem Volumen (78nm³) und einer Proteindichte von 1,4g/cm³

(Quillin et al. 2000) kann die Masse des Proteins mit 65,8kDa berechnet werden. Dieses

Ergebnis stellt nur eine geringe Abweichung von der tatsächlichen Masse von hGBP1

(69kDa) dar. Bei Addition von jeweils 0,3nm auf die drei Halbachsen

(6,4nm•2,2nm•2,3nm), kann das Volumen des Proteins inklusive einer Hydrathülle mit

136nm³ berechnet werden, was ebenfalls relativ nah and dem von HydroPro errechneten

Wert von 118nm³ liegt.

Abbildung 3-4: Darstellung des Oberflächenmodells von hGBP1. Abgebildet ist die Röntgenstruktur von hGBP1 als Oberflächenmodell. Für die Volumenberechnung von hGBP1 kann das Molekül nährungsweise als Ellipsoid behandelt werden. Die drei Radien (a,b,c) wurden durch das Programm PyMOL bestimmt und liegen bei 6,1nm•1,9nm•2nm.

c

a

b

Ergebnisse

- 55 -

Volumen

(ohne Hydrathülle)

Volumen

(inkl. Hydrathülle)

Masse

(g/mol)

HydroPro/Interpoliert 78nm³ 118nm³ 65,8

PyMol/Ellipsoid 97nm³ 136nm³ 81,8

Sphäre 248nm³ 322nm³ 209

Diese Berechnungen zeigen deutlich, dass die Annahme einer ellipsoiden

Proteingeometrie viel exakter ist als die einer sphärischen. Das mit einer Sphäre

korrespondierende hydrodynamische Volumen liegt für das Monomer bei 322nm³ und ist

damit 2,7mal größer als das tatsächliche, durch HydroPro berechnete Volumen. Jedoch ist

für einen relativen Vergleich des Assemblierungsstatus die vereinfachte Berechnung der

sphärischen hydrodynamischen Volumina ausreichend.

In der Abbildung 3-5 sind die aus den gemessenen hydrodynamischen Radien errechneten

Volumina aufgetragen. Dabei wurde zunächst vereinfacht angenommen, dass hGBP1 eine

sphärische Form besitzt. Für des monomere und nukleotidfreie hGBP1 konnte

experimentell ein Radius von 4,25nm erhalten werden. Das mit einer Sphäre

korrespondierende Volumen liegt damit bei 320nm³. Bei der Zugabe von 200µM

GppNHp, einem nicht hydrolysierbaren GTP-Analogon, erhöht sich der hydrodynamische

Radius von hGBP1 auf 5,33nm und damit das Volumen auf 634nm³. Die Verdoppelung

des Volumens zeigt, dass der Wildtyp von hGBP1 im GppNHp gebundenem Zustand zu

einem Dimer assembliert. In einem Komplex aus GDP und AlFx (50mM Tris-HCl, 5mM

MgCl2, 2mM DTE, 300µM AlCl3, 10mM NaF, 200µM GDP) liegt der Wert für den

hydrodynamischen Radius bei 6,5nm, was einem Kugelvolumen von 1161nm³ entspricht.

Dies entspricht in etwa dem vierfachen Volumen einer monomeren Einheit und zeigt, dass

hGBP1 im Komplex mit GDP und AlFx als Tetramer vorliegt. Diese Ergebnisse der

nukleotidabhängigen Oligomerisierung bestätigen das Modell von Praefcke et al. (2004).

Ergebnisse

- 56 -

Für die Doppelmutante hGBP1-R227E/K228E (Abbildung 3-5; Magenta), konnte ein

verändertes Oligomerisierungsverhalten gegenüber dem Wildtyp in der DLS beobachtet

werden. Die hGBP1 Doppelmutante, R227E/K228E, zeigt im nukleotidfreien Zustand

einen hydrodynamischen Radius von 5,0nm, was ungefähr dem Radius des Wildtyps im

GppNHp- gebundenem Zustand entspricht. Diese Mutante liegt bereits im nukleotidfreien

Zustand als Dimer vor. Der GppNHp gebundene Zustand der R227E/K228E besitzt einen

hydrodynamischen Radius von 6,5nm. Dieser Wert entspricht dem des GDP*AlFx-

gebundenen Wildtyps.

Abbildung 3-5: Dynamische Lichtstreuung von hGBP1 und Mutanten. Für die Analyse des Oligomerisierungsverhaltens von hGBP1 und seinen Mutanten, wurden 20µM des jeweiligen Proteins in Puffer (50mM Tris-HCl pH7,9, 5mM MgCl2, 2mM DTE) gelöst, und durch einen 0,2µm Spritzenfilter in die Küvette der DLS-Apparatur gefüllt. Der erhaltene hydrodynamische Radius wurde in ein sphärisches Volumen umgerechnet und aufgetragen. Die gelbe Säule zeigt das theoretische Volumen des hGBP1-Wildtyps, welches durch HydroPro unter Verwendung der PDB-Datei „1dg3“ errechnet wurde. Aufgetragen sind die Volumina von hGBP1wt (Blau), E563E (Cyan), K228E (Rot), R227E/K228E (Magenta) und R227E (Grün). Die Säulen einer Farbe stellen (von links nach rechts) die Volumina der unterschiedlichen Proteine im nukleotidfreien, im GppNHp-gebundenen Zustand und im Komplex mit GDP und AlFx dar.

hGBP1 wt R227EK228EE563R R227E/K228E

2500

2000

1500

1000

500

0

Vol

umen

(nm

³)

Ergebnisse

- 57 -

Die hydrodynamischen Radii der Punktmutante hGBP1-R227E (Abbildung 3-5; Grün)

zeigten ebenfalls ein abweichendes Bild gegenüber dem Wildtyp. Im nukleotidfreien

Zustand zeigt hGBP1-R227E einen Radius welcher dem des Wildtyp Dimer entspricht. Im

GppNHp- und GDP*AlFx-gebundenem Zustand liegen die Werte des hydrodynamischen

Radius bei 7,5nm bzw. 7,6nm. Diese Radien liegen über denen des GDP*AlFx

gebundenem Wildtypproteins. Auffallend bei den Messungen der R227E-Mutante war

aber ein vergleichsweise hoher Polydispersitätsindex (P.D.I.). Wahrscheinlich liegt das

Protein in verschiedenen oligomeren Zuständen vor

Die hGBP1-Punktmutanten K228E (Abbildung 3-5; rot) und E563R (cyan) wiesen

gegenüber dem Wildtyp kein verändertes Oligomerisierungsverhalten auf. Im GppNHp-

gebundenem Zustand liegt bei beiden Mutanten der Radius bei etwa 5,4nm, was einem

sphärischen Volumen von 660nm³ entspricht. Die Radii der Mutanten im Komplex mit

rH (nm) Volumen (nm³) P.D.I

Nt-frei 4,2 ± 1,0 322 0,0562

GppNHp 5,3 ± 0,9 634 0,043 Wildtyp

GDP*AlFx 6,5 ± 1,5 1161 0,064

Nt frei 4,4 ± 1,1 357 0,0556

GppNHp 5,4 ± 1,2 660 0,052 E563R

GDP*AlFx 7,1 ± 1,9 1499 0,0723

Nt frei 4,3 ± 1,0 333 0,0499

GppNHp 5,4 ± 1,1 660 0,076 K228E

GDP*AlFx 6,6 ± 1,6 1204 0,0564

Nt frei 5,0 ± 1,2 524 0,055

GppNHp 6,5 ± 1,5 1150 0,068 R227E/K228E

GDP*AlFx 6,9 ± 1,6 1376 0,068

Nt frei 5,4 ± 2,2 660 0,179

GppNHp 7,5 ± 2,6 1767 0,134 R227E

GDP*AlFx 7,6 ± 2,1 1839 0,15

Tabelle 3-1: Zusammenfassung der DLS-Ergebnisse von hGBP1 und Mutanten. Der erhaltene hydrodynamische Radius (rH) wurde in ein sphärisches Volumen umgerechnet. Der Polydispersitätsindex (P.D.I.) gibt die Molekulargewichtsverteilung in der gemessenen Probe an. Ein Wert von unter 0,1 bedeutet, dass hauptsächlich Moleküle einer Molmasse in der Probe vorliegen.

Ergebnisse

- 58 -

GDP und AlFx liegen für E563R bei 7,1nm und für K228E bei 6,6nm und bewegen sich

somit im Bereich eines tetrameren Proteins.

3.1.4 Analytische Größenausschlusschromatographie

Das Oligomerisierungsverhalten von hGBP1 und seinen Mutanten wurde in Gegenwart

verschiedener Nukleotide mittels analytischer Größenausschlusschromatographie

analysiert. Die dafür verwendete Säule (Superdex S200 10/30 HR) wurde im Vorfeld

durch Standardproteine (MW-GF-200, Sigma-Aldrich, Deisenhofen) nach

Herstellerangaben kalibriert (Abbildung 3-6).

Für die Messungen von hGBP1 und seinen Mutanten wurde die Säule vorher mit dem

Messpuffer equilibriert (50mM Tris-HCl, 5mM MgCl2, 2mM DTE). Für die Messungen

Abbildung 3-6: Kalibrierung der analytischen Größenausschlusschromatographiesäule. Die Kalibrierung erfolgte durch fünf Standardproteine und einen hoch-molekularen Farbstoff zur Messung des Ausschlussvolumens V0. Die Säule wurde gemäß Herstellerangaben (50mM Tris-HCl, pH 7.5, 100mM KCl) equilibriert und die Proteine in Konzentrationen zwischen 2mg/ml und 10mg/ml aufgetragen. Die Detektion erfolgte über die Absorption bei 280nm.

1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4

1

10

100

mol

ekul

are

Mas

se (k

Da)

Ve/V0

Ergebnisse

- 59 -

mit Nukleotiden wurde dem Puffer 200µM des jeweiligen Nukleotids (GDP, GMP,

GppNHp) beigefügt.

Der Puffer für die AlFx Messungen beinhaltete zusätzlich 300µM AlCl3 und 10mM NaF.

Das Elutionsverhalten des hGBP1 Wildtyps (Praefcke et al. 2004) ist in Abbildung 3-7

gezeigt. In einem nukleotidfreien Puffer eluiert der hGBP1-Wildtyp als Monomer bei ca.

100kDa. Diese Masse liegt um 30kDa über der reellen Masse vom monomeren hGBP1.

Die Ursache liegt in der geringen Ionenstärke der verwendeten Laufpuffers (Masterarbeit,

M. Wehner, 2007). Fügt man dem Laufpuffer 500mM NaCl hinzu, eluiert das Protein mit

einer Masse von 70kDa.

1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,00,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

rel.

Abs

orpt

ion

Ve/V0

Abbildung 3-7: Analytische Größenausschlusschromatographie vom hGBP1 Wildtyp. Die normierten Elutionsprofile zeigen, dass hGBP1 im nukleotidfreien Zustand mit einer Molmasse von 100kDa als Monomer eluiert (Blau).Die Abweichung zur reellen Monomermasse von 70kDa wird durch die geringe Ionenstärke des Laufpuffers verursacht. In Gegenwart von GppNHp liegt der Wildtyp mit einer Molmasse von 148kDa als Dimer (rot), und in Gegenwart von GDP und AlFx, mit einer Molmasse von 320kDa als Tetramer (Schwarz) vor.

100kDa 148kDa320kDa

Ergebnisse

- 60 -

In Gegenwart des nicht hydrolysierbaren GTP-Analogon GppNHp eluiert das Protein

schneller und liegt mit ca. 148kDa als Dimer vor. Die Bindung des Komplexes bestehend

aus GDP und AlFx, lässt hGBP1 bei noch höheren Massen eluieren und liegt mit ca.

320kDa bei einer Masse, die in etwa einem Tetramer entspricht (Praefcke et al. 2004). Bei

Betrachtung des Elutionsprofils der Mutante hGBP1-R227E/K228E zeigt sich ein im

Vergleich zum Wildtyp verändertes Elutionsverhalten (Abbildung 3-8).

Die Elution der nukleotidfreien Mutante erfolgt bei einer Masse von ca. 120kDa. Dieser

Wert liegt genau zwischen den Massen des nukleotidfreien (100kDa) und GppNHp

Abbildung 3-8: Analytische Größenausschlusschromatographie der Mutante hGBP1 R227E/K228E. Aufgetragen sind die Elutionsprofile der hGBP1-Doppelmutante R227E/K228E, nukleotidfrei und im Komplex mit GppNHp bzw. GDP*AlFx. Die senkrechten Linien zeigen den Vergleich zum hGBP1 Wildtyp. Sie entsprechen den Positionen der Elutionsmaxima des Wildtyps im nukleotidfreien Zustand (blau) und im Komplex mit GppNHp (rot) bzw. GDP*AlFx (schwarz). Im Vergleich zeigen die Elutionsprofile von R227E/K228E, dass diese Mutante im nukleotidfreien Zustand wahrscheinlich als Monomer/Dimer Gemisch eluiert (blau). Neben dem Hauptpeak ist bei dem nukleotidfreien Protein auch eine kleine Schulter bei ca. 310kDa zu beobachten. In Gegenwart von GppNHp (rot) und dem Komplex aus GDP und AlFx (schwarz) eluiert diese Mutante mit derselben Masse wie der tetramere Wildtyp.

1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,00,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

rel.

Abs

orpt

ion

Ve/V0

100kDa 148kDa320kDa

Ergebnisse

- 61 -

gebundenen (140kDa) hGBP1-Wildtyps. Möglicherweise eluiert das Protein in einem

Monomer/Dimer Gemisch. Neben dem Hauptpeak ist bei dem nukleotidfreien Protein

auch ein kleiner Peak bei ca. 310kDa zu beobachten.

Die Mutante R227E/K228E eluiert im GppNHp gebundenen Zustand und im Komplex

mit GDP*AlFx bei sehr ähnlichen Massen von 333kDa (GDP*AlFx) bzw. 310kDa

(GppNHp). Diese Massen entsprechen ungefähr denen des tetrameren hGBP1-Wildtyps,

der bei ca. 320kDa eluiert. Die Durchführung der Größenausschlusschromatographie mit

der Mutante hGBP1 R227E ergab ein sehr ähnliches Elutionsverhalten im Vergleich zur

Doppelmutante R227R/K228E (Abbildung 3-9). Das nukleotidfreie Protein hGBP1

R227E eluiert bei einer Masse von 114kDa. Diese Masse liegt zwischen den Massen des

nukleotidfreien und des GppNHp-gebundenem Wildtyps..

1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,00,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

rel.

Abs

orpt

ion

Ve/V0

Abbildung 3-9: Analytische Größenausschlusschromatographie der Mutante R227E. Die Elutionsprofile zeigen, dass R227E im nukleotidfreien Zustand als Monomer eluiert (blau). Neben dem Hauptpeak ist bei dem nukleotidfreien Protein auch ein kleiner Peak bei ca. 310kDa zu beobachten. In Gegenwart von GppNHp (schwarz) und dem Komplex aus GDP und AlFx (rot) liegt diese Mutante als Tetramer vor. Die senkrechten Linien zeigen den Vergleich zum hGBP1 Wildtyp. Sie entsprechen den Positionen der Elutionsmaxima des Wildtyps im nukleotidfreien Zustand (blau) und im Komplex mit GppNHp (rot) bzw. GDP*AlFx (schwarz)

100kDa148kDa320kDa

Ergebnisse

- 62 -

Eine mögliche Erklärung dafür könnte sein, dass diese Mutante in einem Gemisch aus

Monomer und Dimer eluiert. Bei der R227E ist wie auch bei der Doppelmutante

R227E/K228E ein kleiner Peak bei höheren Massen (ca.280kDa) zu beobachtenBei der

Mutante R227E ist ein ähnliches Laufverhalten im GppNHp- und GDP*AlFx-gebundenem

Zustand zu beobachten wie bei der Doppelmutante R227E/K228E. Im Komplex mit

GppNHp eluiert das Protein bei einer Masse von ca. 295kDa. Im GDP*AlFx gebundenen

Zustand liegt die beobachtete Masse bei 330kDa. Dieses Oligomerisierungsverhalten ist

vergleichbar mit dem des GDP*AlFx gebundenen hGBP1 Wildtyp. Diese Beobachtungen

der Mutanten R227E und R227E/K228E bestätigen die Daten der hydrodynamischen

Radii, welche in der dynamischen Lichtstreuung beobachtet werden konnten.

Die Punktmutante K228E eluiert im nukleotidfreien Zustand bei einer Masse von 108kDa,

was ungefähr der Masse des nukleotidfreien Wildtyp Protein entspricht (Abbildung 3-10).

Abbildung 3-10: Analytische Größenausschlusschromatographie der Mutante R228E. Die Elutionsprofile zeigen, dass R228E im nukleotidfreien Zustand mit einer Masse von 108kDa als Monomer eluiert (blau). In Gegenwart von GppNHp (schwarz) eluiert das Protein bei 155kDa, wobei eine Schulter bei 271kDa zu beobachten ist. In dem Komplex aus GDP und AlFx (rot) eluiert diese Mutante als Tetramer bei einer Masse von 325kDa. Die senkrechten Linien zeigen den Vergleich zum hGBP1 Wildtyp. Sie entsprechen den Positionen der Elutionsmaxima des Wildtyps im nukleotidfreien Zustand (blau) und im Komplex mit GppNHp (rot) bzw. GDP*AlFx (schwarz).

1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,00,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

rel.

Abs

orpt

ion

Ve/V0

100kDa 148kDa320kDa

Ergebnisse

- 63 -

Der Komplex von GppNHp und der Mutante K228E eluiert bei etwa 155kDa, wobei eine

ausgeprägte Schulter bei 271kDa zu beobachten ist. Die Mutation K228E zeigt in

Gegenwart von GDP und AlFx eine Masse von 325kDa, was in etwa der Masse des

tetrameren Wildtyps entspricht.

Die Punktmutante hGBP1 E563R (Abbildung 3-11) eluiert im nukleotidfreien Zustand mit

einer Masse von 102kDa. Im GppNHp-gebundenem Zustand assembliert diese Mutante zu

einem Dimer und eluiert mit einer Masse von 178kDa. Dieser Wert zeigt damit im

Vergleich zum Wildtyp (148kDa) eine Verschiebung zu höheren Massen. Im Komplex

mit GDP und AlFx eluiert diese Mutante bei einer Masse von 276kDa. Dies stellt, im

Vergleich zum Wildtyp-Tetramer, eine Verschiebung zu kleineren Massen dar.

Abbildung 3-11: Analytische Größenausschlusschromatographie der Mutante E563R. Das Elutionsprofil der Mutante E563R zeigt im nukleotidfreien Zustand mit einer Masse von 102kDa einen Monomeren Zustand (Blau). In Gegenwart von GppNHp (Schwarz) eluiert das Protein bei 178kDa. In einem Komplex aus GDP und AlFx (Rot) eluiert diese Mutante bei einer Masse von 276kDa. Die senkrechten Linien beschreiben die Elutionsmaxima des Wildtyps nukleotidfrei (Blau) und in Gegenwart von GppNHp (Schwarz) bzw. GDP und AlFx (Rot).

1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,00,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

rel.

Abso

rptio

n

Ve/V0

100kDa 148kDa320kDa

Ergebnisse

- 64 -

3.1.5 Nukleotidaffinität

Zur Bestimmung der Affinitäten von mant-Nukleotiden wurden Fluoreszenztitrationen am

Fluoreszenzspektrometer (Kontron SFM25) durchgeführt. Dabei wurden in einer Küvette

0,5µM mant-Nukleotid vorgelegt und dazu eine Proteinlösung, die ebenfalls 0,5µM mant-

Nukleotid enthielt, hinzutitriert. Die Anregungswellenlänge lag bei 366nm und die

Emission wurde bei 435nm detektiert. An die Auftragung der Fluoreszenz gegen die

Proteinkonzentration wurde eine quadratische Bindungskurve (Formel 2-4) angepasst und

somit die Dissoziationskonstante erhalten. Mit dieser Methode wurden die Affinitäten der

Nukleotide mGMP, mGDP und mGppNHp von verschiedenen Mutanten bei 25°C

gemessen.

Die Ergebnisse der Fluoreszenztitrationen sind in der Abbildung 3-12 (A-E) zu sehen. Die

ermittelten Gleichgewichtskonstanten der Dissoziation aller untersuchten Mutanten zeigen

im Vergleich zum Wildtyp keine signifikanten Unterschiede. Die Kontaktregion von α12-

13 und α4´ hat keinen Einfluss auf die mant-Nukleotid-Bindung. Eine Zusammenfassung

der Ergebnisse der Fluoreszenztitrationen des Wildtyps von hGBP1 und den Mutanten

R227E, K228E, R227E/K228E und E563R sind in der Tabelle 3-2 gezeigt.

KD(µM) mGMP mGDP mGppNHp

Wildtyp 0,56 3,53 1,67

R227E 0,88 3,5 1,53

K228E 0,7 3,94 2,16

R227E/K228E 1,0 3,75 2,49

E563R 0,54 4,05 1,74

Tabelle 3-2: Gleichgewichtskonstanten von mant-Nukleotiden an hGBP1 und Mutanten. Die Gleichgewichtskonstanten der Bindung von mant-Nukleotiden an hGBP1 und verschiedene Mutanten des hGBP1 wurden durch Gleichgewichtstitrationen bei 25°C im Fluoreszenzspektrometer bestimmt. Dabei wurden in einer Küvette 0,5µM mant-Nukleotid in Puffer (50mM Tris-HCl pH 7,9, 5mM MgCl2, 2mM DTE) vorgelegt, und dazu eine Proteinlösung, ebenfalls mit 0,5µM mant-Nukleotid, hinzutitriert. Die Anregungswellenlänge lag bei 366nm und die Emission wurde bei 435nm detektiert. An die Auftragung der rel. Fluoreszenz gegen die Proteinkonzentration wurden quadratische Bindungskurven (Formel 2-4) angepasst und somit die Dissoziationskonstanten erhalten.

Ergebnisse

- 65 -

Abbildung 3-12: Bestimmung der mant-Nukleotidaffinitäten durch Fluoreszenz-titrationen. Aufgetragen sind die Fluoreszenztitrationen vom hGBP1 Wildtyp (A) und den Mutanten R227E/K228E (B), K228E (C), R227E (D) und E563R (E) mit mGMP (●), mGDP (○) und mGppNHp (□).Dabei wurden in einer Küvette 0,5µM mant-Nukleotid vorgelegt, und dazu eine Proteinlösung, ebenfalls mit 0,5µM mant-Nukleotid, hinzutitriert. Die Dissoziationskonstanten wurden durch Anpassung an eine quadratische Funktion erhalten.

1001010,10,01

4

3

2

1

[hGBP1 R227E/K228E] (µM)

rel.

Fluo

resz

enz

1001010,10,01

4

3

2

1

[hGBP1 wt] (µM)

rel.

Fluo

resz

enz

1001010,10,01

4

3

2

1

[hGBP1 K228E] (µM)

rel.

Fluo

resz

enz

1001010,10,01

4

3

2

1

[hGBP1 R227E] (µM)

rel.

Fluo

resz

enz

1001010,10,01

4

3

2

1

[hGBP1 E563R] (µM)

rel.

Fluo

resz

enz

A B

C D

E

Ergebnisse

- 66 -

3.1.6 Dynamik der Nukleotidbindung

Mit Experimenten an der stopped flow-Apparatur wurden Assoziations- und

Dissoziationskinetiken von mant-Nukleotiden (mGMP, mGDP, mGppNHp) bestimmt.

Die mant-Nukleotid Konzentrationen wurden konstant bei 0,5µM gehalten und

Proteinkonzentrationen zwischen 5µM und 40µM variiert. Der hohe Proteinüberschuss

wurde verwendet, um eine Bindungskinetik pseudo-erster Ordnung zu erhalten. Die

Anregung der mant-Fluorophore erfolgte bei 366nm und die Emission wurde, um das

Streulicht heraus zu filtern, mit Hilfe eines Kantenfilters oberhalb von 420nm detektiert.


kobs, die beobachtete Geschwindigkeitskonstante, erhalten. Bei Auftragung der erhaltenen

Geschwindigkeitskonstante (kobs) gegen die Konzentration (B0) zeigte sich eine lineare

Abhängigkeit (Formel 2-3). Die Geschwindigkeitskonstante der Assoziation (kass) und die

Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation (kdiss) wurde aus der Steigung und dem

Achsenabschnitt bestimmt. Für eine genauere Bestimmung der Dissoziationskonstante

wurden Verdrängungsexperimente vorgenommen (kdiss*).

Abbildung 3-13: Kinetik der Bindung von mant-Nukleotiden an hGBP1wt und hGBP1 R227E/K228E. Die Kinetik der Assoziation von mant-Nukleotiden an hGBP1 wt (A) und die Doppelmutante R227E/K228E (B) wurde mit 0,5µM mant-Nukleotid und unterschiedlichen Proteinkonzentration bei 25°C gemessen. Aus der Anpassung einer einfach exponentiellen Funktion wurde die Geschwindigkeitskonstante pseudo-erster Ordnung erhalten, die gegen die Proteinkonzentration aufgetragen wurde. Die Anpassung der linearen Funktion lieferte die Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation (kdiss) und Assoziation (kass). Gemessen wurden die Bindungskinetiken von mGMP(○), mGDP(●) und mGppNHp(□).

[hGBP1-R227E/K228E] (µM)

k obs

(s-1

)

50403020100

150

100

50

0

k obs

(s-1

)

[hGBP1wt] (µM)

50403020100

150

100

50

0

A B

Ergebnisse

- 67 -

Eine Zusammenfassung der Ergebnisse aus den stopped-flow Experimenten ist in Tabelle

3-3 zu finden. Aus dem Verhältnis kdiss*/ kass wurden die Dissoziationskonstanten

bestimmt. Dabei zeigt sich, dass zwischen dem hGBP1 Wildtyp und den verschiedenen

Mutanten keinen signifikanten Unterschied bei den Dissoziationskonstanten festzustellen

ist.

Die ermittelten Geschwindigkeitskonstanten der Dissoziation, aus den

Verdrängungsexperimenten (kdiss*) und dem Achsenabschnitt bei der Auftragung von kobs

gegen die Konzentration (kdiss ), sind bei mGDP und mGppNHp sehr ähnlich. Wogegen

bei mGMP bei allen Messungen ein Unterschied im Bereich einer Großenordnung

festzustellen war.

kass(µM-1s-1) kdiss(s-1) kdiss*(s-1) KD

*(µM) KD (µM)

mGMP 3,36 11,43 1,3 0,25 0,56 Wildtyp mGDP 1,9 9,9 8,2 3,57 3,53

mGppNHp 1,2 1,68 0,66 1,43 1,67 mGMP 3,6 16,3 1,67 0,46 1,0

R227E/ K228E mGDP 2,8 8,0 6,98 2,49 3,75

mGppNHp 0,5 2,1 0,77 1,57 2,49 mGMP 6,5 21,1 2,4 0,37 0,88

R227E mGDP 2,9 9,8 14,1 4,86 3,5 mGppNHp 0,8 1,5 1,46 1,85 1,53 mGMP 6,4 17,6 1,57 0,25 0,7

K228E mGDP 2,8 14,2 10,82 3,93 3,94 mGppNHp 0,7 3,4 1,1 1,64 2,16 mGMP 3,5 16,5 1,55 0,44 0,54

E563R mGDP 3,3 11,2 13,27 4,02 4,05 mGppNHp 1,2 0,5 1,52 1,32 1,74

Tabelle 3-3: Kinetik der Bindung von mant-Nukleotiden an hGBP1 und Mutanten. Die Geschwindigkeitskonstanten für die Assoziation und die Dissoziation wurden mit Hilfe der stopped-flow Apparatur bei 25°C bestimmt. Die Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation wurde aufgrund der höheren Genauigkeit separat durch Verdrängungsexperimente bestimmt (kdiss

*). Die KD*-Werte wurden aus dem Verhältnis kdiss

*/kass bestimmt. Die KD Werte sind die

Gleichgewichtskonstanten der Dissoziation, die aus den Fluoreszenztitrationen erhalten wurden.

Ergebnisse

- 68 -

Im Vergleich zwischen den Gleichgewichtskonstanten der Fluoreszenztitration und der

kinetischen Messung sind keine signifikanten Unterschiede zu erkennen. Auch die

Tendenz der Bindungsstärke stimmt in beiden Methoden gut überein, in der mGMP am

stärksten und mGDP am schwächsten gebunden wird. Diese Beobachtungen bestätigen

vorherige Messungen des Wildtyps (Praefcke et al., 2001; Praefcke et al., 2004).

3.1.7 Nukleotidhydrolyse

Die konzentrationsabhängige Nukleotidhydrolyse wurde für den Wildtyp von hGBP1 und

alle hGBP1-Mutanten mittels reversed-phase HPLC gemessen. Nach Inkubation des

Proteins mit 350µM GTP (bzw. GDP) bei 25°C wurde nach bestimmten Zeitpunkten eine

Probe auf ihre Nukleotid Zusammensetzung hin analysiert. Der Anteil an nicht

umgesetzten Substrat wurde dann gegen die Reaktionszeit aufgetragen und die

Anfangsgeschwindigkeit in einem Bereich bis 40% Substratumsatz durch lineare

Regression angepasst. Der Quotient aus Anfangsgeschwindigkeit und

Proteinkonzentration liefert die spezifische Aktivität.

43210

40

30

20

10

0

[hGBP1 R227E/K228E](µM)

spez

ifisc

he A

ktiv

ität (

min

-1)

Abbildung 3-14: Konzentrationsabhängigkeit der GTP-Hydrolyse von hGBP1 R227E/K228E. Auftragung der spezifischen Aktivität der Hydrolyse gegen die Proteinkonzentration. Die Inkubation erfolgte zusammen mit 350µM GTP in 50mM Tris-HCl pH7,9, 5mM MgCl2, 2mM DTE, 100µM Rinderserumalbumin bei 25°C. Aufgetragen ist die konzentrationsabhängige spezifische Aktivität von hGBP1-R227E/K228E. Die Datenanpassung erfolgte durch eine modifizierte Hill-Funktion.

Ergebnisse

- 69 -

Durch Auftragung der Änderung der spezifischen Aktivität gegen die

Proteinkonzentration wurde die Kooperativität der Hydrolyse bestimmt. An diese Daten

wurde entweder eine quadratische Bindungskurve (Formel 2-1) oder eine modifizierte

Hill-Funktion angepasst (Formel 2-2).

Die in Abbildung 3-14 gezeigte Auftragung der spezifischen Aktivität der GTP Hydrolyse

der hGBP1 Doppelmutante R227E/K228E zeigt einen sigmoidalen Verlauf. Die

Datenpunkte wurden durch eine modifizierte Hill-Funktion angepasst, welche einen Wert

für die kooperativen Einheiten von n=2,6 liefert. Die spezifische Aktivität zeigt eine

Basalaktivität von k0=11,1min-1 und steigt dann mit 36,2min-1 auf das 3-fache an. Dieser

Verlauf zeigt einen deutlichen Unterschied zum Wildtyp, bei dem eine 16-fache

Selbstaktivierung zu beobachten ist (Kunzelmann et al., 2006). Einen weiteren

Unterschied zum Wildtyp stellt das Produktverhältnis dar. Beim Wildtyp ist bei 25°C das

Hauptprodukt der GTP Hydrolyse mit 60% das GDP, bei der Doppelmutante

R227E/K228E liegt das Hauptprodukt mit 78% jedoch auf der Seite des GMPs. Das liegt

Abbildung 3-15: Konzentrationsabhängigkeit der GTP-Hydrolyse von verschiedenen hGBP1 Mutanten. Auftragung der spezifischen Aktivität der Hydrolyse gegen die Proteinkonzentration. Die Inkubation erfolgte zusammen mit 350µM GTP in 50mM Tris-HCl pH7,9, 5mM MgCl2, 2mM DTE, 100µM Rinderserumalbumin bei 25°C. Abgebildet sind konzentrationsabhängig die spezifischen Aktivitäten der hGBP1 Punktmutanten R227E(Δ), K228E (□) und E563R (●). Die maximalen Hydrolysegeschwindigkeiten zeigen zwischen den drei Mutanten keinen signifikanten Unterschied und liegen bei etwa 37min-1. Die dargestellten Kurven wurden durch Anpassung mit Formel 2-1 erhalten.

43210

40

30

20

10

0

[hGBP1](µM)

spez

ifisc

he A

ktiv

ität (

min

-1)

Ergebnisse

- 70 -

wahrscheinlich an der Besonderheit, dass die Doppelmutante in der Lage ist, GDP als

Substrat in hoher Geschwindigkeit zu hydrolysieren. Die Geschwindigkeit der GDP-

Hydrolyse bei 25°C ist in (Abbildung 3-16) gezeigt. Die Geschwindigkeit der GDP-

Hydrolyse hängt zwar ebenfalls von der Proteinkonzentration ab, jedoch muss für die

maximale Aktivität eine sehr viel höhere Konzentration verwendet werden. Ähnliche

Beobachtungen konnten bei der Deletionsmutante hGBP1 1-481 und der isolierten LG-

Domäne gemacht werden, die ebenfalls eine erhöhte GMP-Produktion besitzen und in der

Lage sind GDP aus der Lösung umzusetzen (S. Kunzelmann, Dissertation; Praefcke et al.,

2001).

Die in Abbildung 3-15 aufgetragenen spezifischen Hydrolyseaktivitäten der

Punktmutanten R227E, K228E und E563R zeigen in ihrem Verlauf keine signifikanten

Unterschiede. Die maximalen Geschwindigkeiten liegen bei 37min-1 und es war bei allen

drei Punktmutanten keine Basalaktivität feststellbar. Das Hauptprodukt der Hydrolyse ist

hier ebenfalls GMP und liegt bei etwa 66%. Die Mutanten K228E und E563R zeigen

beide keine messbare GDPase-Aktivität, die R227E (Abbildung 3-17) jedoch zeigt, wie

Abbildung 3-16: GDPase-Aktivität von hGBP1 R227E/K228E. Auftragung der spezifischen Aktivität der Hydrolyse von GDP gegen die Proteinkonzentration. Die Geschwindigkeit der GDP Hydrolyse wurde mit 350µM GDP bei 25°C gemessen. Die Anpassung an die Daten lieferte eine maximale Hydrolysegeschwindigkeit von 0,73min-1.

[hGBP1 R227E/K228E](µM)

spez

ifisc

he A

ktiv

ität (

min

-1)

20151050

0,6

0,4

0,2

0

Ergebnisse

- 71 -

auch schon die Doppelmutante R227E/K228E (Abbildung 3-16), eine erweiterte

Substratspezifität.

Für eine bessere Datenanpassung wurde die spezifische Aktivität für gegen Null gehende

Konzentrationen gleich Null gesetzt. Ob diese Annahme zutrifft, konnte experimentell

nicht bestimmt werden, da bei sehr kleinen Konzentrationen die Inkubationsdauer zu hoch

war. Der Vergleich der GDPase Aktivitäten der Mutanten R227E und R227E/K228E zeigt

keine signifikanten Unterschiede sowohl in der maximalen spezifischen Aktivität als auch

bei der apparenten Gleichgewichtskonstanten der Dissoziation.

Abbildung 3-17: GDPase-Aktivität von hGBP1 R227E. Auftragung der spezifischen Aktivität der Hydrolyse von GDP gegen die Proteinkonzentration. Die Geschwindigkeit der GDP Hydrolyse wurde mit 350µM GDP bei 25°C gemessen. Die Anpassung an die Daten lieferte eine maximale Hydrolysegeschwindigkeit von 0,94min-1.

[hGBP1 R227E](µM)

spez

ifisc

he A

ktiv

ität (

min

-1)

302520151050

0,8

0,6

0,4

0,2

0

Ergebnisse

- 72 -

Kdapp(µM) kmax(min-1) kmin(min-1) GMP(%)

Wildtyp GTP 0,032 22,8 n.b. 40

GTP 0,74(Hill) 36,2 11,1 78 R227E/K228E

GDP 1,93 0,73 n.b.

GTP 0,038 40,4 n.b. 67 R227E

GDP 2,6 0,94 n.b.

K228E GTP 0,06 37,6 n.b. 64

E563R GTP 0,05 37,9 n.b. 66

Eine Zusammenfassung aller Ergebnisse der steady state-Hydrolyse von hGBP1wt und

Mutanten ist in der Tabelle 3-4 zu sehen. Die Daten für die Messungen am Wildtyp

wurden der Dissertation von Simone Kunzelmann entnommen. Die apparenten

Dissoziationskonstanten der Selbstassemblierung Kdapp sowie die Werte der maximalen

(kmax) und minimalen (kmin) Aktivitäten wurden aus den Kurvenanpassungen abgeleitet.

Dabei ist zu beachten, dass der Wert für die apparente Dissoziationskonstante der

Doppelmutante aus einer Hill-Funktion abgeleitet ist und somit mit den anderen Werten

nicht vergleichbar ist.

Die maximalen Geschwindigkeiten der Hydrolyse der vier Mutanten sind um ca. 30%,

gegenüber der maximalen Geschwindigkeit des Wildtyps erhöht. Das Hauptprodukt der

Hydrolyse ist bei allen Mutanten GMP, wobei der Anteil zwischen 78% (R227E/K228E)

und 64% (K228E) liegt. Beim Wildtyp liegt der GMP-Anteil bei 40%. Interessanterweise

ist bei der Mutante R227E/K228E das GDP/GMP-Produktverhältnis im verwendeten

Messbereich konzentrationsunabhängig. Dagegen zeigt sich im Wildtyp eine Erhöhung

des GMP-Anteils mit zunehmender Proteinkonzentration.

Tabelle 3-4: Konzentrationsabhängige Hydrolyse von hGBP1 und Mutanten des hGBP1. Die Hydrolysegeschwindigkeiten wurden bei 25°C in Gegenwart von 350µM GTP bzw. GDP und verschiedenen Proteinkonzentrationen gemessen. Die Anpassung der durch Auftragung der Änderung der spezifischen Aktivität gegen die Proteinkonzentration erhaltenen Datenpunkte lieferten die apparenten Gleichgewichtskonstanten (Kd

app) sowie die Werte der maximalen (kmax) und minimalen (kmin) Aktivitäten. Das Produktverhältnis wurde im steady state der GTP Hydrolyse ermittelt. Die Kurvenanpassung der Daten für die GTP-Hydrolyse der Mutante R227E/K228E erfolgte durch eine modifizierte Hill-Funktion. Aus diesem Grund ist der Wert für die apparente Dissoziationskonstante nicht mit dem der anderen Mutanten vergleichbar. (n.b. = nicht bestimmt)

Ergebnisse

- 73 -

3.1.8 Kinetik der Dimerisierung an der helikalen Domäne

Für die Analyse der Kinetik der Dimerisierung an der helikalen Domäne von hGBP1

wurde die Methode des Temperatursprungs gewählt. Die verwendeten Proteine wurden

mit luoreszenzmarkern versehen, um die Gleichgewichtseinstellung durch einen

Fluoreszenz- Energie-Transfer (FRET) sichtbar zu machen. Es wurden zwei

unterschiedliche FRET-Systeme verwendet. eYFP-Fusionsproteine wurden als Akzeptor

(Excitation: 495nm, Emission: 525nm), in einem FRET-System verwendet, in dem

Coumarin (Excitation: 384nm, Emission: 472nm) als Donor fungiert. Als Alternative für

eYFP als Akzeptor wurde Fluorescein verwendet (Excitation: 497nm, Emission: 523nm).

Das Coumarin und das Fluorescein wurden jeweils in einer Kupplungsreaktion an die

Cysteine des Proteins gekoppelt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurde

überschüssiger Farbstoff über eine NAP5-Säule nach Herstellerangaben abgetrennt und

die Zahl der markierten Cysteine aus dem Verhältnis der Absorption von Protein zu

Fluorophor (280nm/495nm bzw. 280nm/384nm) bestimmt.

Die Effizienz der Kupplung von Fluoreszenzfarbstoffen an Cysteinen von hGBP1 konnte

von Tobias Vöpel im Rahmen seiner Diplomarbeit bestimmt werden. Dabei zeigte sich,

dass von den neun vorhandenen Cysteinen in hGBP1wt nur vier für die Kupplungsreaktion

zugänglich sind. Es handelt sich um die Cysteine an den Stellen C12, C82, C225 und

C589. Dabei ist zu beachten, dass die Cysteine an den Stellen C12, C82 und C225 in der

LG-Domäne liegen. Für die Deletionsmutante α12-13 bedeutet das, dass ausschließlich

das Cystein des CaaX-Motivs, C589, für eine Kupplungsreaktion zugänglich ist.

Fluoreszenzmarker Kupplungseffizienz Konzentration

hGBP1-α12-13 CPM 80% 824µM

hGBP1-α7-13 Fluorescein 40% 240µM

hGBP1-α7-13 CPM 84% 176µM

hGBP1-R227E/K228E CPM 400% 123µM

Tabelle 3-5: Effizienz der Kupplung von Fluoreszenzmarkern an hGBP1 Deletions- und Punktmutanten. Die Markierung von Proteinen wurde mit Maleinimid-gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffen durchgeführt, die unter Bildung eines Thioethers selektiv an Cysteine binden. Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurde die Effizienz der Kupplung spektroskopisch erfasst.

Ergebnisse

- 74 -

Im Falle der Deletionsmutante α7-13 ist ebenfalls, obwohl in diesem Bereich des Proteins

drei Cysteine vorhanden sind, nur das Cys589 für eine Fluoreszenzmarkierung

zugänglich.

Die Effizienz der Kopplung von CPM an die Doppelmutante R227E/K228E war sehr

hoch und mit einem Wert von 400% konnten alle vier zugänglichen Cysteine mit dem

Fluoreszenzfarbstoff markiert werden. Bei hGBP1-α12-13 und hGBP1-α7-13 wurden

lediglich 80% Kopplungseffizienz erreicht, was bedeutet, dass nicht jedes Protein mit

einem Fluorophor versehen ist. Die Kopplung von hGBP1-α7-13 mit Fluorescein erreichte

nur eine sehr geringe Effizienz von 40%.

Für die Messungen an der Temperatursprung Apparatur wurde jeweils Donor und

Akzeptor markiertes Protein in aufsteigenden Konzentrationen equimolar miteinander

vermischt und in der Apparatur auf 10°C temperiert. Durch die 1:1 Vermischung der 10°C

warmen Proteinlösung mit 40°C warmer Puffer wurde ein Temperatursprung auf 25°C

erzielt. Die dadurch hervorgerufene Einstellung des neuen Gleichgewichts wurde durch

einen Kantenfilter oberhalb von 515nm detektiert.

Abbildung 3-18: Position der Cysteine innerhalb der hGBP1 Struktur. Dargestellt ist das Bändermodell von hGBP1 und die Positionen der Cysteine. In seiner Struktur besitzt hGBP1 neun Cysteine. Fünf befinden sich in der LG-Domäne (C12, C82, C235, C270, C225; blau), zwei in der helikalen Subdomäne α7-11 (C396, C407; rot) und eins zwischen diesen beiden Domänen (C311). Das neunte Cystein liegt C-terminal an der Position 589. Dieser Bereich des Proteins konnte aber kristallographisch nicht aufgelöst werden und ist deshalb in der Struktur nicht markiert.

LG-Domäne

α7-11

α12/13

Ergebnisse

- 75 -


die Geschwindigkeitskonstante kobs erhalten. Die resultierenden

Geschwindigkeitskonstanten wurden gegen die Konzentration aufgetragen und eine

lineare Anpassung der Datenpunkte vorgenommen ( [ ] dissassobs kBkk += 02 ). Die

Geschwindigkeitskonstante der Assoziation (kass) und die Geschwindigkeitskonstante der

Dissoziation (kdiss) wurde aus der Steigung und dem Achsenabschnitt bestimmt.

Für die Analyse der Kinetik der Assemblierung von hGBP1 α7-13 und hGBP1

R227E/K228E wurden die Proteine mit den Fluorophoren Coumarin und Fluorescein

versehen, in einem equimolaren Verhältnis miteinander vermischt und bei 10°C inkubiert.

Durch die schnelle Zugabe von 40°C warmen Puffer wurde eine Änderung des

Komplexgleichgewichts induziert. Zur Detektion der Neueinstellung des Gleichgewichts

wird der Energietransfer vom Coumarin auf das Fluorescein genutzt und die Emission des

Fluorescein bei 515nm aufgenommen. Die Abbildung 3-19 (A) zeigt die zeitabhängige

Fluoreszenzänderung nach der schnellen Temperaturerhöhung von 10°C auf 25°C von

unterschiedlichen Konzentrationen des Proteinkomplexes aus hGBP1 α7-13 und hGBP1

R227E/K228E. Die Anpassung der Daten erfolgte über eine einfach exponentielle

86420

6

4

2

0

k obs

(s-1

)

[hGBP1 α7-13 + hGBP1 R227E/K228E] (µM)

210

1,2

1,1

1

rel.

Fluo

resz

enz

t (s)

Abbildung 3-19: Kinetik der Dimerisierung von hGBP1 α7-13 und hGBP1 R227E/K228E. Die Proteine hGBP1 α7-13 und hGBP1 R227E/K228E, die jeweils mit einem FRET-Partner markiert waren, wurden in einer äquimolaren Mischung bei 10°C in der Temperatursprung-Apparatur inkubiert. Durch das schnelle Mischen mit 40°C warmer Puffer wurde die Einstellung der neuen Gleichgewichtslage der Dimerisierung bei 25°C anhand des FRET-Signals oberhalb von 515nm beobachtet. (A) Die zeitliche Änderung der Fluoreszenz nach einer schnellen Temperaturerhöhung von 10°C auf 25°C. Die Anpassung einer einfach exponentiellen Funktion liefert die Geschwindigkeitskonstante kobs. (B) Auftragung der beobachteten Geschwindigkeitskonstanten kobs gegen die Konzentration des Komplexes aus der Deletionsmutante hGBP1 α7-13 und der Doppelmutante hGBP1 R227E/K228E. Aus der Steigung und dem Achsenabschnitt der linearen Anpassung wurden die Werte für die Geschwindigkeitskonstanten der Assoziation (kass) und der Dissoziation (kdiss) entnommen.

A B

Ergebnisse

- 76 -

Funktion, die einen Wert für die Geschwindigkeitskonstante kobs liefert. In der Abbildung

3-19 (B) sind die erhaltenen Geschwindigkeitskonstanten gegen die verwendeten

Proteinkonzentrationen aufgetragen, und mit Hilfe einer linearen Regression angepasst.

Aus der Steigung und dem Achsenabschnitt der linearen Anpassung wurden die Werte für

die Geschwindigkeitskonstanten der Assoziation (kass) und Dissoziation (kdiss)

entnommen.

Für die Analyse der Homodimerisierung der Deletionsmutanten hGBP1 α12-13 und

hGBP1 α7-13 wurde eYFP und Coumarin markierte Proteine verwendet. Die verwendeten

Konzentrationen der Komplexe lagen zwischen 2µM und 20µM.

Die Abbildung 3-20 zeigt die Auftragungen der beobachteten

Geschwindigkeitskonstanten gegen die Konzentration. Durch lineare Anpassung der

Datenpunkte wurde aus den Steigungen die Geschwindigkeitskonstanten der Assoziation

und aus dem Achsenabschnitt die Geschwindigkeitskonstanten der Dissoziation erhalten.

Die Gleichgewichtskonstanten der Dissoziation liegen für hGBP1 α12-13 bei 24,4µM und

für α7-13 bei 9,7µM.

[Protein] (µM)

k obs

(s-1

)

Abbildung 3-20:Analyse der Homodimerisierung von hGBP1 α12-13 und hGBP1 α7-13 durch die Temperatursprung-Methode. Auftragungen der beobachteten Geschwindigkeitskonstanten gegen die Konzentrationen der homodimeren Komplexe der Deletionsmutanten hGBP1 α12-13 (○) und hGBP1 α7-13 (▲). Aus der Steigung und dem Achsenabschnitt der linearen Anpassung wurden die Werte für die

20100

6

4

2

0

Ergebnisse

- 77 -

Die Dissoziationskonstanten der Komplexe liegen bei den drei Messungen deutlich

auseinander (Tabelle 3-6). Die geringste Affinität zeigt die Deletionsmutante α12-13, was

an der Geschwindigkeitskonstante für die Assoziation liegt, die um eine Größenordnung

verringert ist. Im Vergleich dazu weisen die Geschwindigkeitskonstanten der Dissoziation

nur geringe Unterschiede auf. Die Dissoziationskonstante für die Bindung der

Deletionsmutante α7-13 an die Doppelmutante R227E/K228E zeigt eine relativ hohe

Affinität von 1,78µM.

3.2 Identifizierung eines hGBP1 Interaktionspartners

Über die zelluläre Funktion von hGBP1 ist bis heute noch nicht viel bekannt. Bisher

konnte zwar eine antivirale und eine anti-proliferative Wirkung von hGBP1 in

Zellkulturexperimenten nachgewiesen werden, aber über die Signaltransduktion ist nichts

Genaues bekannt. Dementsprechend sind auch keine Proteine bekannt, die mit hGBP1

interagieren. Die Verwendung des Hefe 2-Hybrid Systems und einer embryonalen full

mouse cDNA-Bank führte in der Vergangenheit nicht zur Identifizierung eines

Interaktionspartner (Dissertation, Benscheid, 2005). Für die Suche nach einem

Interaktionspartner von hGBP1 mit Hilfe des Hefe 2-Hybrid Systems, wurde im Rahmen

kass (µM-1s-1) kdiss (s-1) KD (µM)

hGBP1 α7-13 /

hGBP1 R227E/K228E 0,82 1,46 1,78

hGBP1 α7-13

(Homodimerisierung) 0,36 3,5 9,7

hGBP1 α12-13

(Homodimerisierung) 0,046 1,12 24,4

Tabelle 3-6: Gleichgewichts- und Geschwindigkeitskonstanten der Assemblierung an der helikalen Domäne. Untersucht wurde die Homodimerisierung der Deletionsmutanten α12-13 und α7-13 und die Heterodimerisierung zwischen α7-13 und der Punktmutante R227E/K228E von hGBP1 mittels Temperatursprung. Die Werte für die Geschwindigkeitskonstanten der Assoziation (kass) und Dissoziation (kdiss) wurden der Steigung und dem Achsenabschnitt der linearen Anpassung der Auftragungen der beobachteten Geschwindigkeitskonstanten gegen die Konzentrationen entnommen.

Ergebnisse

- 78 -

dieser Arbeit erstmals eine INF-γ-induzierte cDNA Bank aus humanen Zellen hergestellt.

Verwendet wurden humane Endothelzellen aus der Nabelschnurvene (HUVEC), welche

freundlicherweise von Prof. Dr. M. Stürzl (Universität Nürnberg-Erlangen) zur Verfügung

gestellt wurden. Aufgrund einer starken Expression von hGBP1 in HUVECs nach

Stimulation mit INF-γ (Lubeseder-Martellato et al., 2002), wurde die mRNA aus Zellen

isoliert, welche im Vorfeld mit 100U/ml INF-γ versetzt wurden. Da nicht bekannt ist, in

welchem Expressionsstadium von hGBP1 der potentielle Interaktionspartner erscheint,

wurde die mRNA zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Induktionsstart entnommen, um

unterschiedliche Expressionsstadien der Zelle zu erfassen.

3.2.1 Darstellung einer INF-γ induzierten HUVECs cDNA-Bank

Für die Darstellung einer cDNA-Bank aus mit INF-γ stimulierten HUVECs (humane

Endothelzellen der Nabelschnurvene) musste im Vorfeld die Gesamt-RNA aus den Zellen

isoliert werden. Es wurden HUVEC in insgesamt 8 Zellkulturschalen (T75) bis zur

Konfluenz wachsen gelassen. Sechs dieser Kulturschalen wurden dann mit 100U/µl INF-γ

versetzt. Nach jeweils 5, 12 und 24 Stunden wurden Zellen von je zwei Platten geerntet.

Die beiden anderen Schalen wurden nicht mit INF-γ induziert und direkt geerntet. Durch

die Entnahme der mRNA zu unterschiedlichen Zeitpunkten können unterschiedliche

Expressionsstadien der Zellen untersucht werden. Nach der Zellernte und der Extraktion

der Gesamt-RNA wurde die Konzentration mittels UV-Absorption bei 254nm bestimmt

und die Integrität der RNA überprüft (Abbildung 3-6). Dazu wurde die RNA der

unterschiedlichen Erntezeitpunkte separat auf ein Agarosegel aufgetragen. Die Integrität

wird durch zwei Banden bestätigt, bei denen es sich um die 28S und 18S rRNA handelt.

Wenn diese Banden klar zu sehen sind, kann man davon ausgehen, dass die isolierte RNA

frei von RNasen ist. Es wurden von den zwei Schalen jedes Zeitpunktes jeweils 0,7-

0,9µg/µl Gesamt-RNA in jeweils 100µl Puffer erhalten.

Die Konzentrationsbestimmung ergab: 0h = 0,9µg/µl

5h = 0,9µg/µl

12h = 0,95µg/µl

24h = 0,7 µg/µl

Ergebnisse

- 79 -

Nach der Bestimmung der Konzentrationen wurden von den vier Proben jeweils 30µg

entnommen und in einem Ansatz vereint, um daraus die polyA-mRNA zu isolieren. Die

Aufreinigung erfolgte über ein mRNA Extraktions-Kit (Oligotex mRNA-Kit) der Firma

Qiagen. Nachdem die mRNA zur cDNA umgeschrieben und mit Hilfe der EcoRI-Linker

in den Vektor pGBKT7 kloniert worden war, wurde zur Überprüfung der Effizienz der

gesamten Prozedur 1µl, 3µl und 5µl der cDNA Bank in kompetente E. coli Nova Blue-

Zellen transformiert. Nach dem Ausplattieren auf mit Kanamycin versetzten LB-Platten

wurden nach 24 Stunden Inkubation die Anzahl der Kolonien gezählt. Pro Mikroliter

eingesetzter cDNA wurde auf den Platten ca. 2800 unabhängige Bakterienkolonien

gezählt. Daraus resultieren, nach der Transformation der gesamten cDNA-Bank (150µl),

ca. 420000 unabhängige Kolonien. Diese Kolonien wurden vereinigt und in 25% Glycerin

bei -80°C gelagert.

3.2.2 Hefe 2-Hybrid-Screen

Das Screenen der INF-γ induzierten HUVEC cDNA-Bank wurde in einem großen Ansatz

(large scale) durchgeführt. Dabei wurden 0,3 mg der HUVEC-cDNA-Bank und 0,3mg

hGBP1-pGADT7 DNA eingesetzt und gleichzeitig in den Hefestamm S. cerevisiae

AH109 transformiert.

Innerhalb von 5 Tagen wuchsen auf selektivem Medium THL- (ohne Tryptophan, Histidin

und Leucin) ca. 1400 Klone. Alle Klone wurden manuell auf selektiveres Medium

Abbildung 3-21: Integrität der isolierten Gesamt-RNA aus INF-γ induzierten HUVECs. Abgebildet ist ein 1%iges Agarosegel auf dem die Banden der 28s rRNA und 18s rRNA zu sehen sind. Die Integrität dieser Banden erlaubt eine Aussage über den Zustand der erhaltenen RNA. Die unterschiedlichen Auftragungen zeigen die RNA der vier verschiedenen Zeitpunkte (0, 5, 12, und 24 Stunden) nach denen die INF-γ induzierten Zellen geerntet wurden.

28s rRNA

18s rRNA

0 5h 12h 24h

Ergebnisse

- 80 -

(zusätzlich ohne Adenin und mit 20mM 3-AT zur Inhibition basaler Histidinproduktion)

übertragen. Daraufhin sind 174 Klone interaktionsabhängig gewachsen.

Die Klone wurden jeweils separat von der Platte gepickt und in ca. 5ml YPD –His-Ade-

Trp-Leu resuspendiert. Nach Inkubation über Nacht bei 30°C und 200upm wurden von

diesen Kulturen 25%ige Glycerin-Stocks hergestellt. Die verbliebenen Klone wurden

daraufhin analysiert, indem die Vektoren extrahiert und nachfolgend eine PCR mit

Vektorprimern durchgeführt wurde. Leider lieferte die PCR keine auswertbaren

Ergebnisse.

Ergebnisse

- 81 -

3.3 Biochemische Charakterisierung von hGBP2

Die biochemische Charakterisierung des humanen Guanylat-bindenden Proteins 2

(hGBP2) wurde bereits von Agnidipta Ghosh im Rahmen seiner Dissertation begonnen.

Ziel dieser Arbeit die biochemische Charakterisierung fortzusetzen und Daten bezüglich

des Oligomerisierungsverhaltens, der mant-Nukleotidaffinität und der

nukleotidabhängigen GTP-Hydrolyse von hGBP2 zu erhalten.

3.3.1 Nukleotidabhängige Oligomerisierung

Die Messungen der nukleotidabhängigen Oligomerisierung von hGBP2 erfolgten mittels

dynamischer Lichtstreuung analog zu den Messungen von hGBP1. Durch die dynamische

Lichtstreuung wurden der Diffusionskoeffizient und damit der hydrodynamische Radius

von hGBP2 ermittelt. Im Gegensatz zum hGBP1 ist jedoch die Struktur von hGBP2 nicht

bekannt und es kann deshalb noch keine theoretische Berechnung des

Diffusionskoeffizienten mittels HydroPro erfolgen. Die ermittelten Radii und die daraus

errechneten sphärischen Volumina wurden in Bezug zu den bereits ermittelten Werten für

hGBP1 gesetzt. Für die Analyse des Oligomerisierungsverhaltens von hGBP2 wurden

20µM des Proteins in Puffer (50mM Tris-HCl pH7,9, 5mM MgCl2, 2mM DTE) gelöst

und durch einen 0,2µm Spritzenfilter in die Küvette der DLS-Apparatur gefüllt.

Die Zugabe von GppNHp bewirkt bei hGBP1 eine Zunahme des hydrodynamischen

Radius die eine Verdopplung des Volumens zur Folge hat. Bei hGBP2 zeigt die Zugabe

von GppNHp keine signifikante Veränderung des hydrodynamischen Radius bzw. des

Volumens. Bei der Messung von hGBP1 im Komplex mit GDP und AlFx erhöht sich der

Radius auf 6,5nm. Im Vergleich zum nukleotidfreien Zustand vervierfacht sich das

Volumen.

Ergebnisse

- 82 -

Der Radius des Komplexes aus hGBP2, GDP und AlFx liegt bei 6,13nm und ergibt damit

ein Kugelvolumen von 965nm³. Dieses Volumen ist im Vergleich zum nukleotidfreien

Zustand von hGBP2 dreimal größer und liegt zwischen dem hGBP1 Dimer im GppNHp

gebundenem Zustand und dem Tetramer im GDP und AlFx Komplex. Es kann nicht

eindeutig festgestellt werden, ob es sich im GDP und AlFx gebundenem Zustand von

hGBP2 um ein Dimer, Trimer oder ein Tetramer handelt.

3.3.2 Konzentrationsabhängige Nukleotidhydrolyse

Die konzentrationsabhängige Nukleotidhydrolyse wurde für hGBP2wt mittels reversed-

phase HPLC gemessen. Es wurden 20µM des Proteins mit 350µM GTP (bzw. GDP) bei

25°C inkubiert und nach bestimmten Zeitpunkten eine Probe auf ihre Nukleotid-

Zusammensetzung hin analysiert. Der Anteil am nicht umgesetzten GTP wurde gegen die

Reaktionszeit aufgetragen und die Anfangsgeschwindigkeit in einem Bereich bis 40%

Abbildung 3-22: Nukleotidabhängige Oligomerisierung von hGBP1 und hGBP2. Für die Analyse des Oligomerisierungsverhaltens von hGBP1 und hGBP2 wurden 20µM des jeweiligen Proteins in Puffer (50mM Tris-HCl pH7,9, 5mM MgCl2, 2mM DTE) gelöst, und durch ein 0,2µm Spritzenfilter in die Küvette der DLS-Apparatur gefüllt. Der erhaltene hydrodynamische Radius wurde in ein sphärisches Volumen umgerechnet und aufgetragen. Aufgetragen sind die Volumina von hGBP1wt (rot), und hGBP2 (grün). Die Säulen einer Farbe (von links nach rechts) stellen die Volumina der unterschiedlichen Proteine im nukleotidfreien, im GppNHp gebundenen Zustand und im Komplex mit GDP und AlFx dar. Die Nukleotide GppNHp und GDP wurden jeweils in Konzentrationen von 200µM verwendet.

1500

1000

500

0

Vol

umen

(nm

³)

hGBP1 hGBP2

Vol

umen

(nm

³)

Ergebnisse

- 83 -

Substratumsatz durch lineare Regression angepasst, Abbildung 3-23 (A). Der Quotient aus

Anfangsgeschwindigkeit und Proteinkonzentration liefert die spezifische Aktivität. Durch

Auftragung der Änderung der spezifischen Aktivität gegen die Proteinkonzentration

wurde die Kooperativität der Hydrolyse bestimmt. An diese Daten wurde eine

quadratische Bindungskurve (Formel 2-1) angepasst Abbildung 3-23 (B).

Im Vergleich zum hGBP1 (22,8min-1) zeigt hGBP2 (15min-1) bei 25°C eine etwas

geringere GTPase-Aktivität. Dagegen unterscheidet sich hGBP2 am deutlichsten von

hGBP1 dadurch, dass die Produktion von GMP nicht nachgewiesen werden konnte. Als

Produkt der GTP Hydrolyse konnte demnach nur GDP detektiert werden.

Abbildung 3-23: Konzentrationsabhängige Nukleotidhydrolyse von hGBP2. Auftragung der spezifischen Aktivität der Hydrolyse gegen die Proteinkonzentration. Die Inkubation erfolgte zusammen mit 350µM GTP in 50mM Tris-HCl pH7,9, 5mM MgCl2,2mM DTE, 100µM Rinderserumalbumin bei 25°C. (A) Auftragung des Anteils an nicht umgesetztem Substrat gegen die Reaktionszeit unterschiedlicher hGBP2 Konzentrationen. Die Anfangsgeschwindigkeit wurde in einem Bereich bis 40% Substratumsatz durch lineare Regression angepasst. Der Quotient aus Anfangsgeschwindigkeit und Proteinkonzentration liefert die spezifische Aktivität. (B) Auftragung der Änderung der spezifischen Aktivität gegen die Proteinkonzentration. An diese Daten wurde eine quadratische Bindungskurve (Formel 2-1) angepasst und die Kooperativität der Hydrolyse bestimmt.

[hGBP2] (µM)

A

spez

ifisc

he A

ktiv

ität (

min

-1)

6420

12

8

4

0

t (min)

[GTP

]/[G

TP] 0

B

40200 20015010050

1

0,8

0,6

0,4

Ergebnisse

- 84 -

3020100

60

40

20

0

3.3.3 Dynamik der Nukleotidbindung

Die Dynamik der Nukleotidbindung vom hGBP2wt wurde unter Verwendung von mant-

Nukleotiden an der stopped-flow-Apparatur gemessen. Das Protein wurde in einem

Überschuss verwendet, um eine Kinetik pseudo-erster Ordnung zu erhalten.

An die erhaltenen Datenpunkte wurde eine einfach exponentielle Funktion angepasst um

die Geschwindigkeitskonstante kobs zu erhalten. Durch Auftragung von kobs gegen die

Konzentration und linearer Anpassung wurden die Geschwindigkeitskonstanten der

Assoziation (kass) erhalten (Abbildung 3-24). Die Geschwindigkeitskonstante der

Dissoziation (kdiss) wurde separat durch Verdrängungsexperimente ermittelt. Die

Ergebnisse sind in der Tabelle 3-7 zusammengefasst.

Die Geschwindigkeitskonstanten der Assoziation und Dissoziation vom mGMP zeigen

gegenüber den anderen mant-Nukleotiden einen deutlichen Unterschied. Sie liegen etwa

um eine Größenordnung über den Werten vom mGDP und mGppNHp. An den Werten für

[hGBP2] (µM)

k obs

(s-1

)

Abbildung 3-24: Kinetik der Assoziation von mant-Nukleotiden. Die Kinetik der Assoziation von mant-Nukleotiden an hGBP2 wurde mit 0,5µM mant-Nukleotid und ansteigender Proteinkonzentration bei 25°C gemessen. Aus der Anpassung einer einfach exponentiellen Funktion wurde die Geschwindigkeitskonstante pseudo-erster Ordnung erhalten, die gegen die Proteinkonzentration aufgetragen wurde. Die Anpassung der linearen Funktion lieferte die Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation (kdiss) und Assoziation (kass). Gemessen wurden die Bindungskinetiken von mGMP(○), mGDP(●) und mGppNHp(□).

Ergebnisse

- 85 -

die Gleichgewichtskonstanten der Dissoziation ist aber zu erkennen, dass alle Nukleotide

mit der gleichen Affinität gebunden werden.

kass(µM-1s-1) kdiss(s-1) kdiss

*(s-1) KD*(µM) KD(µM)

mGMP 2,41 15,2 1,7 0,7 1,8 hGBP2 wt mGDP 0,82 1,79 0,19 0,23 0,3

mGppNHp 0,35 1,68 0,06 0,17 0,9

Um diese Ergebnisse zu bestätigen, wurden die Nukleotidaffinitäten zusätzlich durch

Fluoreszenztitrationen bestimmt. Dabei wurden in einer Küvette 0,5µM mant-Nukleotid

in Puffer (50mM Tris-HCl pH 7,9, 5mM MgCl2, 2mM DTE) vorgelegt, und dazu eine

Proteinlösung, ebenfalls mit 0,5µM mant-Nukleotid, hinzutitriert.

Tabelle 3-7: Kinetik der Bindung von mant-Nukleotiden an hGBP1 und Mutanten. Die Geschwindigkeitskonstanten für die Assoziation und der Dissoziation wurden mit Hilfe der stopped-flow Apparatur bei 25°C bestimmt. Die Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation wurde aufgrund der höheren Genauigkeit separat durch Verdrängungsexperimente bestimmt (kdiss

*). Die KD

*-Werte werden aus dem Verhältnis kdiss*/ kass bestimmt. Die KD-Werte sind die

Gleichgewichtskonstanten der Dissoziation, die aus den Fluoreszenztitrationen erhalten wurden.

[hGBP2wt] (µM)

rel.

Fluo

resz

enz

Abbildung 3-25: Fluoreszenztitration von mant-Nukleotiden mit hGBP2. In einer Küvette wurden 0,5µM mGMP(○), mGDP(●) bzw. mGppNHp(□) vorgelegt, und eine Proteinlösung, ebenfalls mit 0,5µM des jeweiligen mant-Nukleotids, hinzutitriert. Die Anregung erfolgte bei einer Wellenlänge von 366nm und die Emission wurde bei 435nm detektiert. An die Auftragung der rel. Fluoreszenz gegen die Proteinkonzentration wurde eine quadratische Bindungskurve angepasst, um die Dissoziationskonstante zu erhalten.

1010,1

4

3

2

1

Ergebnisse

- 86 -

Die Anregung erfolgte bei einer Wellenlänge von 366nm und die Emission wurde bei

435nm detektiert. An die Auftragung der rel. Fluoreszenz gegen die Proteinkonzentration

wurde eine quadratische Bindungskurve (Formel 2-4) angepasst und somit die

Dissoziationskonstante erhalten.

In der Abbildung 3-25 sind die Fluoreszenztitrationen bei 25°C, von mGMP (□), mGDP

(●) und mGppNHp (○) aufgetragen. Die Fluoreszenztitrationen bestätigen, dass die

Gleichgewichtskonstante der Dissoziation im Fall von mGMP (○), mit 1,8µM im

Vergleich zu den anderen mant-Nukleotiden größer ist. Die anderen beiden mant-

Nukleotide, mGDP (●) und mGppNHp (□), weisen mit ca. 0,3µM und 0,9µM eine

stärkere Bindung zum hGBP2 Wildtyp auf.

3.3.4 Interaktion von hGBP1 und hGBP2

Für die Analyse einer möglichen Interaktion von hGBP1 und hGBP2 wurde die Methode

des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers verwendet. Grundlage dieser Methode ist

der strahlungslose Energietransfer von einem angeregten Donor auf einen Akzeptor

(Flurophorenpaar), welcher eintritt, sobald die Fluorophore in räumlicher Nähe zueinander

liegen. Der Abstand sollte in der Nähe des Förster-Radius liegen, welcher beim

eCFP/eYFP-Fluorophorenpaar bei 4,95nm liegt. Der angeregte Donor übermittelt dann

seine Energie strahlungslos auf den Akzeptor, der seinerseits angeregt wird. Im Zuge des

Energietransfers findet ein Quenching der Fluoreszenz des Donors statt, dagegen wird die

Fluoreszenz des Akzeptors verstärkt angeregt.

Für die Analyse der Assemblierung von hGBP1 und hGBP2 wurden die Fusionsproteine

hGBP1-eCFP, hGBP2-eYFP und hGBP1-α7-13-eCFP hergestellt. Dabei liegen die

Fluorophore bei allen Proteinen am N-terminus. Das eYFP hat sein Absorptionsmaximum

bei 514nm und das Emissionsmaximum bei 525nm und fungiert als Akzeptor. Das eCFP,

das in diesem System als Donor agiert, besitzt sein Absorptionsmaximum bei 453nm und

emittiert maximal bei einer Wellenlänge von 475nm.

Ergebnisse

- 87 -

Für die Untersuchung der Nukleotidabhängigkeit der Assemblierung der Wildtypproteine

von hGBP1 und hGBP2 wurden 200nM des Fusionsproteins hGBP1-eCFP und 2µM

hGBP2-eYFP in einem Spektrofluorometer (50mM Tris-HCl pH7,9, 5mM MgCl2, 2mM

DTE) vorgelegt. Der Donor wurde bei 407nm angeregt, um eine möglichst geringe

Direktanregung des Akzeptors zu erhalten. Die Emission wurde zwischen 430nm und

600nm detektiert (Abbildung 3-26). Die Zugabe von GMP (blau), GDP (gelb) oder

GppNHp (rot) zeigt im Vergleich zu dem Spektrum der nukleotidfreien Probe (cyan)

keine signifikante Änderung in der Fluoreszenz. Diese Nukleotide sind entweder nicht in

der Lage eine Assemblierung zu induzieren, oder die Fluorophore haben bei der

Interaktion einen zu großen Abstand zueinander. Dagegen ist eine deutliche Änderung in

der Fluoreszenz zu beobachten, sobald GDP und AlFx gebunden wird (schwarz). Im

Bereich der Akzeptoremission von 525nm steigt die Fluoreszenz um ca. 30% an, welcher

nur durch einen Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer verursacht werden kann. Die

Bindung von Nukleotiden ist demnach zwar notwendig, aber für die Assemblierung von

hGBP1 und hGBP2 wird die Hydrolyse des Nukleotids benötigt. Erst der

Abbildung 3-26: FRET zwischen hGBP2-eYFP und hGBP1-eCFP in Gegenwart unterschiedlicher Nukleotide. Vorgelegt wurden 200nM des Fusionsproteins hGBP1-eCFP und 2µM hGBP2-eYFP. Die Anregungswellenlänge lag bei 406nm und die Emission wurde im Bereich von 430nm bis 600nm detektiert. Die Messungen wurden nukleotidfrei (cyan) oder in Gegenwart von GMP (blau), GDP (gelb), GppNHp (rot) bzw. GDP im Komplex mit AlFx (schwarz) durchgeführt. Im Bereich von 475nm ist die Emission des Donors zu beobachten und bei 525nm Emittiert der Akzeptor.

600550500450

1

0,8

0,6

0,4

0,2

0

Wellenlänge (nm)

rel.

Fluo

resz

enz

Ergebnisse

- 88 -

200150100500

0,2

0,1

0

t (s)

rel.

Fluo

resz

enz

Übergangszustand der Hydrolyse, welcher durch den Komplex aus GDP und AlFx

dargestellt wird, induziert eine Interaktion.

Um die Assoziation von hGBP1 und hGBP2 in Gegenwart von GTP zu zeigen, wurde die

Emission des Akzeptors zeitabhängig bei 525nm erfasst. Dazu wurden 200nM des

Fusionsproteins hGBP1-eCFP und 2µM hGBP2-eYFP in einem Spektrofluorometer

(50mM Tris-HCl pH7,9, 5mM MgCl2, 2mM DTE) vorgelegt und nach ca. 10 Sekunden

70µM GTP dazugegeben. Die Anregungswellenlänge lag bei 407nm. Die in Abbildung

3-27 gezeigte Fluoreszenzänderung zeigt einen schnellen Anstieg gefolgt von einer

langsameren Phase, die kurz darauf ein Maximum erreicht. Aufgrund der durch die

Hydrolyse schwindenden GTP-Konzentration dissoziiert der Komplex und die

Akzeptorfluoreszenz erreicht nach ca. 220 Sekunden ihren Ausgangszustand. Der GTP-

Umsatz wird aufgrund der 10x höheren verwendeten Konzentration, hauptsächlich vom

hGBP2 getragen. Dazu tragen zusätzlich die geringeren Nukleotidaffinitäten vom hGBP1

im Vergleich zum hGBP2 bei.

Abbildung 3-27: FRET zwischen hGBP2-eYFP und hGBP1-eCFP in Gegenwart von GTP. Vorgelegt wurden 200nM des Fusionsproteins hGBP1-eCFP und 2µM hGBP2-eYFP. Die Anregungswellenlänge lag bei 406nm und die Emission wurde bei 525nm detektiert. Die Messungen wurden in Gegenwart von GTP zeitabhängig durchgeführt. Die Zugabe von 70µM GTP nach ca. 10s führt zu einer starken Erhöhung der Akzeptorfluoreszenz. Nach vollständigem Umsatz des GTPs erreicht die Akzeptorfluoreszenz wieder ihren Ausgangszustand.

Ergebnisse

- 89 -

Um zu zeigen, dass bei der hGBP1/hGBP2 Assemblierung die helikale Domäne von

hGBP1 involviert ist, wurde das hGBP1 Wildtypprotein durch die Deletionsmutante

hGBP1-α7-13 ersetzt und die Experimente wiederholt. Dabei wurde die Fusion von α7-13

mit eCFP als Donor verwendet (Abbildung 3-28).

Analog zu den Messungen mit den beiden Wildtypproteinen zeigen die Zugaben von

GMP (Blau), GDP (Gelb) und GppNHp (Rot) im Vergleich zur nukleotidfreien Messung

(Cyan) keine Änderung in der Fluoreszenz. Erst die Zugabe von GDP im Komplex mit

Max.

Hydrolysegeschwindigkeit

mGMP

Affinitäten

mGDP

mGppNHp

hGBP1 22,8 min-1 0,56µM 3,53µM 1,67µM

hGBP2 15min-1 1,8µM 0,3µM 0,9µM

Abbildung 3-28: FRET zwischen hGBP2-eYFP und hGBP1 Deletionsmutante α7-13-eCFP in Gegenwart unterschiedlicher Nukleotide. Vorgelegt wurden 200nM des Fusionsproteins hGBP1-α7-13-eCFP und 2µM hGBP2-eYFP. Die Anregungs-wellenlänge lag bei 406nm und die Emission wurde im Bereich von 430nm bis 600nm detektiert. Die Messungen wurden nukleotidfrei (Cyan), in Gegenwart von GMP (Blau), GDP (Gelb), GppNHp (Rot) oder mit GDP im Komplex mit AlFx (Schwarz) durchgeführt. Im Bereich von 475nm ist die Emission des Donors zu beobachten und bei 525nm emittiert der Akzeptor.

600550500450

1

0,8

0,6

0,4

0,2

0

Wellenlänge (nm)

rel.

Fluo

resz

enz

Ergebnisse

- 90 -

10008006004002000

0,2

0,1

0

t (s)

rel.

Fluo

resz

enz

AlFx (Schwarz) bewirkt eine Erhöhung in der Akzeptorfluoreszenz, was auf eine

räumliche Nähe von Donor und Akzeptor, und somit eine Interaktion der Proteine

schließen lässt. Ebenso scheint auch hier die Nukleotidbindung nicht ausreichend für eine

Assemblierung zu sein. Erst die Darstellung des Übergangszustands der Hydrolyse durch

GDP im Komplex mit AlFx, induziert eine Assemblierung der Proteine.

Da anscheinend die Hydrolyse des Nukleotids eine Assemblierung hervorruft, wurde

analog zu dem Experiment mit den Wildtypproteinen eine zeitabhängige Messung in

Gegenwart von GTP durchgeführt. Es wurden 200nM des Fusionsproteins hGBP1-α7-13-

eCFP und 2µM hGBP2-eYFP in einem Spektrofluorometer (50mM Tris-HCl pH7,9, 5mM

MgCl2, 2mM DTE) vorgelegt und die Messung gestartet. Nach ca. 20 Sekunden wurden

70µM GTP in die Küvette pipetiert.

Die in Abbildung 3-29 gezeigte Fluoreszenzänderung zeigt einen sehr schnellen Anstieg

gefolgt von einer langsameren Phase, die kurz darauf ein Maximum erreicht. Die

Akzeptorfluoreszenz erreicht nach Umsatz des GTPs wieder den Ausgangszustand. Um zu

Abbildung 3-29: FRET zwischen hGBP2-eYFP und hGBP1-α7-13-eCFP in Gegenwart von GTP. Vorgelegt wurden 200nM des Fusionsproteins hGBP1-α7-13-eCFP und 2µM hGBP2-eYFP. Die Anregungs-wellenlänge lag bei 406nm und die Emission wurde bei 525nm detektiert. Die Messungen wurden in Gegenwart von GTP zeitabhängig durchgeführt. Die Zugabe von 70µM GTP nach ca. 10s führt zu einer starken Erhöhung der Akzeptorfluoreszenz. Nach vollständigem Umsatz des GTPs erreicht die Akzeptorfluoreszenz wieder ihren Ausgangszustand. Die Zugabe von 70µM GTP wurde insgesamt viermal wiederholt.

Ergebnisse

- 91 -

untersuchen, ob es sich um eine reproduzierbare Assemblierung handelt, wurde nach

Erreichen des Grundzustands der Akzeptorfluoreszenz erneut 70µM GTP in die Küvette

pipetiert. Es erfolgte wiederum ein starker Anstieg der Akzeptorfluoreszenz bei 525nm,

der nach Umsatz vom GTP zurück auf seinen Grundzustand fiel. Die Zugabe von GTP

wurde insgesamt viermal wiederholt.

Dabei war zu beobachten, dass das Emissionsmaximum bei jeder Messung geringer

wurde. Der Grund dafür liegt in der Produktinhibierung, die deshalb auftritt, weil die

Affinitäten von GMP, GDP und GTP kaum Unterschiede aufweisen.

Diskussion

- 92 -

4 Diskussion Die Selbstassemblierung von Mitgliedern der Dynamin Familie ist ein essentieller

Bestandteil ihrer Funktion. Wie auch bei MxA und Dynamin zeigt die nukleotidabhängige

Oligomerisierung bei hGBP1 eine starke Beschleunigung der GTPase Aktivität (Prakash et

al., 2000, Praefcke et al., 2004). Vorangegangene Arbeiten an der isolierten LG-Domäne

zeigten detailliert den Mechanismus der Dimerisierung und den Effekt auf die GTPase-

Aktivität (Ghosh et al. 2006). Belege für die Bildung von tetrameren Strukturen, bei denen

der C-terminale Teil als Interaktionsfläche dient, konnten ebenfalls gefunden werden.

Durch Interaktionsstudien mit dem Hefe 2-Hybrid-System mit den Deletionsmutante α12-

13 und α7-13 konnte bereits gezeigt werden, dass diese Subdomänen in der Lage sind

miteinander zu interagieren (Benscheid, 2005). Studien an der Deletionsmutante 1-481, bei

der die Helices α12-13 deletiert sind, zeigen dass diese Mutante im GppNHp gebundenen

Zustand zwar dimerisiert, aber keine Tetramere mehr bilden kann. Des Weiteren hat die

Mutante 1-481 die Eigenschaft, ebenso wie die isolierte LG-Domäne, GDP aus der Lösung

zu binden und mit hoher Geschwindigkeit zu hydrolysieren (Kunzelmann, 2006). Diese

Ergebnisse zeigten, dass die Helices α12-13 nicht nur einen Einfluss auf die

Oligomerisierung haben, indem sie als Interaktionsdomäne funktionieren, sondern auch

eine Wirkung auf die Substratspezifität haben. Ein Ziel dieser Arbeit war es den C-

terminalen Teil von hGBP1 in seiner Funktion als Interaktionsdomäne und die

Auswirkungen der Selbstassemblierung auf die GTPase-Aktivität zu untersuchen.

Die Unterbrechung eines elektrostatischen Kontakts zwischen der LG-

Domäne und α12-13 verändert die nukleotidabhängige

Selbstassemblierung

Die Überlagerung der Kristallstrukturen der LG-Domänen von hGBP1 im GMP (PDB:

2d4h) gebundenen Zustand und im Komplex mit GDP und AlFx (PDB: 2b92) zeigt große

Unterschiede in der Position der Helix α4´. Diese Helix α4´ ist in der GDP*AlFx

gebundenen

Diskussion

- 93 -

Struktur weiter weg von der Nukleotidbindungstasche positioniert (Abbildung 4-1). In

einer detaillierten Betrachtung der full length Struktur ist zu erkennen, dass die Helix α4´

mit den Helices α12-13 interagiert. Diese Interaktion zwischen der LG-Domäne und dem

C-Terminus des Proteins stellt einen elektrostatischen Kontakt dar, bestehend aus einem

Lysin (K228) und einem Arginin (R227) in der Helix α4´ und mehreren Glutaminsäuren

(E563, E568, E556 und E575) in den Helices α12-13 (Abbildung 4-2). Die Bewegung der

Helix α4´ um ca. 7Å hat auch Folgen für die beiden Aminosäuren Arginin 227 und Lysin

228, die bei näherer Betrachtung der Kristallstruktur die einzigen Interaktionspunkte der

LG-Domäne zu den Helices α12-13 darstellen. Das Arginin 227 wird um 3Å und das

Lysin um 5Å in seinen Positionen verändert. Die Bindungsabstände zu dem

Interaktionspartnern erhöhen sich auf über 4,5Å, was für eine polare Bindung eine zu

große Distanz darstellt. Weiterhin ist wahrscheinlich die Positionsänderung der α4´ aus

sterischen Gründen auch für eine Änderung der Position von α12-13 verantwortlich. Das

würde ebenfalls seinen Teil zur Unterbrechung der polaren Bindungen beitragen, ist aber

anhand der Kristallstruktur schwer zu quantifizieren.

Abbildung 4-1: Konformations-änderung der LG-Domäne von hGBP1 Die Abbildung zeigt die Überlagerung der Kristallstrukturen der LG-Domäne von hGBP1 im GMP (rot, PDB: 2d4h) und GDP*AlFx (blau, PDB: 2b92) gebundenen Zustand. Die Überlagerung dieser beiden Strukturen zeigt große Unterschiede in der Position der Helix α4´.

Diskussion

- 94 -

Um zu analysieren welchen Einfluss diese Interaktion zwischen α4´ der LG-Domäne und

α12-13 auf das Protein hat, wurden einzelne Aminosäuren so mutiert, dass eine

Ladungsumkehr resultiert und die Helices voneinander abgestoßen werden. Es wurden die

Einzelmutationen R227E, K228E, E563R sowie die Doppelmutation R227E/K228E

hergestellt. Nach rekombinanter Herstellung und Aufreinigung der Mutanten, wurden

diese mit Hilfe von dynamischer Lichtstreuung und analytischer

Größenausschlusschromatographie auf ihre nukleotidabhängige Selbstassemblierung hin

untersucht. Das hGBP1wt liegt im nukleotidfreien Zustand als Monomer vor (Prakash et

al., 2000). Dies ist auch bei den Mutanten K228E und E563R der Fall, deren

nukleotidabhängige Selbstassemblierung, auch im Komplex mit GppNHp oder GDP*AlFx,

keine Unterschiede zum Wildtyp aufweisen.

Dagegen liegen die Mutante R227E und die Doppelmutante R227E/K228E in

nukleotidfreier Form bereits als Dimer vor. Die Zugabe des nicht hydrolysierbaren GTP

Analogon GppNHp bewirkt bei R227E und R227E/K228E die Assemblierung zu einem

Tetramer, was beim Wildtyp nur im Komplex mit GDP*AlFx geschieht.

Abbildung 4-2: Detailansicht des elektrostatischen Kontakts zwischen LG-Domäne und α12-13 Dargestellt ist die Überlagerung dem nukleotidfreien full length hGBP1 (grün, PDB: 1DG3) und der isolierten LG-Domäne im Komplex mit GDP*AlFx (transparent, PDB: 2b92). (A) Nach der Positionsänderung der Helix α4´ durch die GDP*AlFx-Bindung, wird das Lysin 228 um ca. 5Å verschoben. Die Bindungsabstände zu den beiden Glutaminsäuren E568 und E575 sind aufgrund dieser Positionsänderung nicht mehr in einem Bereich welcher eine polare Bindung zulässt (B) Durch die Positionsänderung der α4´ wird das Arginin 227 in seiner Position um 3Å verändert. Dadurch werden auch die Interaktion mit den zwei Glutaminsäuren E563 und E556 unterbrochen, da die Abstände nicht mehr innerhalb des Maximalabstands für polare Bindungen liegen.

A B

5Å K228

E568

E575

E556

3Å 3,2

2,7

3,3

2,8

3,5

3,5

E563

R227

Diskussion

- 95 -

Nukleotid frei GppNHp GDP*AlFx

Wildtyp Monomer Dimer Tetramer

K228E Monomer Dimer Tetramer

E563R Monomer Dimer Tetramer

R227E Dimer Tetramer Tetramer

R227E/K228E Dimer Tetramer Tetramer

1-481 (Δ12-13) Monomer Dimer Dimer

Durch die Mutante hGBP1 1-481, bei der der C-terminale Teil des Proteins (α12-13)

deletiert ist, konnte gezeigt werden, dass α12-13 für die Tetramerisierung von hGBP1

essentiell ist (Dissertation, S. Kunzelmann, 2006). Dieser Befund wird durch

Interaktionsstudien mit den isolierten Domänen α7-13 und α12-13 erhärtet (Dissertation,

U.Benscheid, 2005). Im Wildtyp kommt die Interaktion an den Helices α12-13 jedoch erst

durch die Bindung von GDP und Aluminiumfluorid zustande. Diese Ergebnisse legen

nahe, dass die Tetramerisierung durch die Helices α12-13 erfolgt, aber eines vorher

erfolgten Prozesses bedarf, welcher die Interaktionsfläche zur Verfügung stellt.

Bei den Mutanten R227E und R227E/K228E scheint dieser Prozess nicht mehr notwendig

für eine Interaktion an der helikalen Domäne zu sein. Die Helices α12-13 stehen dauerhaft

für eine Interaktion zur Verfügung, was bereits zur Dimerisierung im nukleotidfreien

Zustand führt. Die Aminosäuren Arginin 227 und Lysin 228 und somit der elektrostatische

Kontakt zwischen α4´ und α12-13, scheinen daher eine zentrale Rolle im Vorgang der

Tetramerisierung zu spielen. Aus diesem Grund ist möglicherweise im Wildtyp die

Unterbrechung des elektrostatischen Kontakts durch die Positionsänderung von α4´ Teil

des Mechanismus, welcher zur Tetramerisierung führt.

Zusammengefasst bewirkt die Bindung von GDP*AlFx durch den Wildtyp eine

Konformationsänderung, bei der sich die Helix α4´ verschiebt. Als Konsequenz dieser

veränderten Position wird die elektrostatische Interaktion zwischen LG-Domäne und α12-

Tabelle 4-1: Übersicht des nukleotidabhängigen Oligomerisierungsverhalten von hGBP1 und Mutanten. Im nukleotidfreien Zustand liegen der Wildtyp, sowie die Mutanten K228E und E563R als Monomer vor. Dagegen liegen die Mutanten R227E und R227E/K228E bereits als Dimer vor. Die Zugabe von GppNHp bewirkt beim Wildtyp dessen Dimerisierung. Die gleiche Beobachtung konnte auch bei den Mutanten K228E und E563R gemacht werden. Die Mutanten R227E und R227E/K228E dagegen liegen im Komplex mit GppNHp bereits als Tetramer vor, was im Wildtyp erst mit GDP und AlFx beobachtet werden kann. Bei der Mutante hGBP1-1-481(Dissertation, S. Kunzelmann), in der die Helices α12-13 deletiert sind, ist eine Tetramerisierung nicht zu beobachten. Es bilden sich sowohl im GppNHp als auch im GDP*AlFx gebundenem Zustand dimere aus.

Diskussion

- 96 -

13 gelöst. Dadurch werden die Helices α12-13 freigegeben und stehen als

Interaktionsfläche zur Verfügung. Bei den Mutanten R227E und R227E/K228E ist die

Konformationsänderung der α4´nicht notwendig. Diese elektrostatische Interaktion spielt

demnach eine wichtige Rolle für eine Weiterleitung der Information der GTP Hydrolyse

an die helikale Domäne.

Die Tetramerisierung hat keinen Effekt auf die Nukleotidaffinitäten

Die Analyse des nukleotidabhängigen Oligomerisierungsverhalten zeigt, dass die

Mutationen R227E und R227E/K228E einen Effekt auf die Selbstassemblierung haben.

Das deutet darauf hin, dass die elektrostatische Interaktion zwischen der LG-Domäne und

dem C-terminalen Teil des Proteins eine wichtige Rolle in der Selbstassemblierung spielt.

Die Interaktion an der helikalen Domäne kommt im Wildtyp Protein erst bei dem

Übergangszustand der GTP Hydrolyse zustande, die durch den Komplex mit GDP*AlFx

dargestellt werden kann. Es sollte nun weiterhin analysiert werden, ob die Mutationen

auch die Dynamik der Nukleotidbindung beeinflussen. Bereits die Fluoreszenztitrationen

mit mant-Nukleotiden zeigten, dass die ermittelten Dissoziationskonstanten im Vergleich

zum Wildtyp keine signifikanten Unterschiede aufweisen. Dieses Ergebnis wird durch die

Messungen der Dynamik der Nukleotidbindung mit der stopped flow Apparatur bestätigt.

Auch die Geschwindigkeitskonstanten der Assoziation und der Dissoziation zeigen

gegenüber dem Wildtyp keine signifikanten Unterschiede. Die Mutationen an der Stelle

zwischen der LG-Domäne und den Helices α12-13 haben somit keinen Einfluss auf die

Bindungskinetik der mant-Nukleotide. Dass die Helices α12 und α13 keinen Einfluss auf

die Nukleotidbindung haben, wurde bereits durch die Mutante 1-481 gezeigt (Kunzelmann

2006), bei der der C-Terminus deletiert ist. Sowohl die Geschwindigkeitskonstanten der

Assoziation als auch die der Dissoziation entsprechen den Wildtypwerten. Durch die

Unterbrechung der Interaktion zwischen C-Terminus und LG-Domäne konnte nun

zusätzlich gezeigt werden, dass die Tetramerisierung, also die intermolekulare

Wechselwirkung an den helikalen Domänen, ebenfalls keinen Einfluss auf die Kinetik der

Nukleotidbindung hat.

Diskussion

- 97 -

Die Tetramerisierung beeinflusst die Nukleotid-Hydrolyse

Einen wichtigen Hinweis auf die Kommunikation zwischen der LG-Domäne und den

Helices α12 und α13 liefert die Nukleotid-Hydrolyse. In vorangegangenen Arbeiten konnte

bereits gezeigt werden, dass die Anwesenheit der Helices α12-13 einen Einfluss auf die

Substratspezifität von hGBP1 hat. Bei der Deletionsmutanten 1-481, aber auch bei den

isolierten LG-Domänen konnte die Bindung und Umsetzung von GDP festgestellt werden

(Kunzelmann 2006, Ghosh et al., 2006). Diese veränderte Substratspezifität konnte auch

bei der Punktmutante R227E und bei der Doppelmutante R227E/K228E beobachtet

werden. Interessanterweise zeigte sich, dass die 1-481, mit 9 min-1eine bis zu 10mal

höhere maximale GDP Hydrolysegeschwindigkeit besitzt als die beiden Mutanten R227E

und R227E/K228E, die ca. 0,9 min-1 erreichen. Die maximale GDPase-Aktivität vom

Wildtyp-hGBP1 konnte mittlerweile ebenfalls bestimmt werden (Kunzelmann, 2006) und

liegt bei unter 0,02 pro Minute. Die Anwesenheit der Helices α12-13 zeigen demzufolge

einen inhibitorischen Einfluss auf die Hydrolyse von GDP aus der Lösung. Der

elektrostatische Kontakt scheint dabei auch eine wichtige Rolle zu spielen, da die

Unterbrechung des Kontaktes die Geschwindigkeit der GDP-Hydrolyse aus der Lösung

um mehr als eine Größenordnung, im Vergleich zum Wildtyp anhebt. Die GDPase-

Aktivitäten sind wie bei den Deletionsmutanten abhängig von den Proteinkonzentrationen.

Die apparenten Dissoziationskonstanten der Selbstassemblierung liegen sowohl bei der

Deletionsmutante 1-481, mit 10µM, als auch bei den Punktmutanten R227E und

R227E/K228E, mit 4µM bzw. 17,7µM, in der gleichen Größenordnung. Die

Unterbrechung des Kontakts zwischen der LG-Domäne und der Helices α12-13 reicht

somit für hGBP1 aus, um GDP als Substrat zu akzeptieren und nachfolgend zu

hydrolysieren.

Aber auch die GTP Hydrolyse wird durch die Unterbrechung des Kontakts beeinflusst. Die

erhaltenen Datenpunkte aus der Messung der konzentrationsabhängigen Hydrolyse von

GTP konnten im Falle der Doppelmutante R227E/K228E nur durch eine Hill-Funktion

angepasst werden. Es zeigte sich eine basale Aktivität bei 11 pro Minute und der Hill-

Parameter liegt bei 2,7. Dieses Ergebnis für die Doppelmutante zeigte aber auch einen

Unterschied zu der Punktmutante R227E, bei der keine Basalaktivität beobachtet wurde

und die Datenpunkte durch eine quadratische Bindungskurve angepasst werden kann.

Obwohl die einzelne Mutation R227E ausreichend ist, um das Oligomerisierungsverhalten

Diskussion

- 98 -

und die Substratspezifität zu verändern, scheint die K228E zusätzlich nötig zu sein um

eine Basalaktivität in der GTP-Hydrolysekurve zu verursachen. Der Grund dafür bleibt

jedoch ungeklärt.

Ein weiter Unterschied zwischen der Doppelmutante R227E/K228E und dem Wildtyp ist

das Verhältnis der Hydrolyseprodukte. Der Wildtyp zeigt bei kleinen

Proteinkonzentrationen einen GMP-Anteil von 13% welcher bei Erhöhung der

Proteinkonzentrationen bis auf 73% ansteigt. Im Wildtyp wird also mit zunehmender

Proteinkonzentration mehr GMP erhalten. Bei der Doppelmutante R227E/K228E konnte

jedoch in dem verwendeten Konzentrationsbereich keine Änderung der

Produktverhältnisse detektiert werden. Bei Proteinkonzentrationen zwischen 30nM und

4µM liegt das Hauptprodukt mit 78% konzentrationsunabhängig beim GMP. Das

entspricht ungefähr dem maximalen Wert der auch für den Wildtyp experimentell

bestimmt werden konnte.

Im Rahmen ihrer Dissertation konnte Simone Kunzelmann ein Reaktionsmodell für die

Nukleotidhydrolyse vom hGBP1 entwickeln (Abbildung 4-1). Demnach folgt der Bindung

von GTP eine Konformationsänderung von einer inaktiven in eine aktive Konformation.

Dadurch wird durch die richtige Positionierung des Arginin 48 erst die Möglichkeit zur

Hydrolyse geschaffen. Erst die aktive Konformation ist in der Lage GTP und GDP zu

spalten. Durch die Dimerisierung von hGBP1 wird diese aktive Konformation stabilisiert

und die maximale Geschwindigkeit der GTP-Hydrolyse wird erreicht.

Der Übergang der nach Dissoziation der GDP- und GMP- gebundener Dimere stattfindet,

ist quasi-irreversibel. Daher ist die Hydrolyse von GDP aus der Lösung sehr langsam und

die Bildung von GDP- oder GMP-Dimeren findet nicht statt. Die

Konzentrationsabhängigkeit der Produktverhältnisse kann ebenfalls durch das Schema 4-1

beschrieben werden. Demnach ist die produzierte Menge an GMP von den

Konzentrationen der Intermediate E*GDP und (E*GDP)2, und dementsprechend auch von

der Dissoziationskonstante der Dimerisierung abhängig.

Diskussion

- 99 -

2E + 2GTP

2E*·GTP

(E*·GTP)2 (E*·GDP)2

2E*·GDP

2E + 2GDP 2E + 2GMP

2E*·GMP

(E*·GMP)2

2,0 µM s-1 -1

0,45s-1 2,2s-1

1,9 µM s-1 -1 4,5 µM s-1 -1

K = 3nMd

0,45s-1 2,2s-1

2E·GTP 2E·GDP 2E·GMP

K = 161*

2,7s-1 26s-1 20s-1

15s-1 K > 60002*

Nukleotidbindung

Konformationsänderung

Dimerisierung

aktiv

inaktiv

Dieses Reaktionsschema kann nun um den Schritt der Tetramerisierung erweitert werden

(Schema 4-2). Im Zeitraum der Umsetzung von GTP zum GDP findet eine

Konformationsänderung statt, welche Vorraussetzung für die Interaktion an der helikalen

Domäne α12-13 ist. Abhängig von der Affinität der helikalen Interaktion, stellt sich ein

Gleichgewicht zwischen dem Dimer und dem Tetramer im GDP gebundenen Zustand ein.

Eine wichtige Frage die noch zu klären wäre, ist die Lebensdauer des Tetramers. Möglich

wäre, dass das Tetramer bereits im GDP gebundenen Zustand wieder zerfällt. Weiterhin

wäre aber auch die Dissoziation des tetrameren hGBP1 nach der Hydrolyse des GDP zum

GMP möglich. Daten bezüglich der Stabilität des tetrameren hGBP1 fehlen jedoch bisher,

sodass diese Vermutungen experimentell bestätigt werden müssen. Eine weitere Spezies

könnte ein helikal, GDP-gebundenes Dimer sein, welches neben dem LG-Domänen-Dimer

existiert. Dieses könnte nach der GTP-Hydrolyse durch das monomere hGBP1 auftreten.

Die Existenz dieser Spezies konnte aber bisher nicht nachgewiesen werden.

Schema 4-1: Reaktionschema der Nukleotidhydrolyse durch hGBP1. Nach der Bindung von GTP folgt eine Konformationsänderung von hGBP1 von einer inaktiven zu einer aktiven (*) Konformation. Im aktiven Zustand ist hGBP1 erst in der Lage GTP zu spalten. Im monomeren, GTP-gebundenem Zustand liegt nur ein geringer Teil in der aktiven Konformation vor und die Hydrolyse ist deshalb langsam. Die Hydrolyse wird beschleunigt indem die aktive Konformation durch die Dimerisierung stabilisiert wird. Im GDP- und GMP-gebundenem Zustand ist das Konformationsgleichgewicht, im Vergleich zum GTP-gebundenen Zustand, weiter zur inaktiven Konformation verschoben. Der nach der Dissoziation der GDP- und GMP-gebundenem Dimere Übergang in den inaktiven Zustand ist quasi-irreversibel. (Abbildung entnommen aus Dissertation, S. Kunzelmann)

Diskussion

- 100 -

4E + 4GTP

4E·GTP

4E*·GTP

2(E*·GTP)2

Nukleotidbindung


Dimerisierung

Tetramerisierung

4E*·GDP/P

2(E*·GDP/P)2

Intermediat

4E*·GDP

2(E*·GDP)2

4E·GDP

4E + 4GDP 4E + 4GMP

4E·GMP

4E*·GMP

2(E*·GMP)

(E*·GDP)4 (E*·GMP)2

4E + 4GTP

4E·GTP

4E*·GTP

2(E*·GTP)2

Nukleotidbindung


Dimerisierung

Tetramerisierung

4E*·GDP/P

2(E*·GDP/P)2

Intermediat

4E*·GDP

2(E*·GDP)2

4E·GDP

4E + 4GDP 4E + 4GMP

4E·GMP

4E*·GMP

2(E*·GMP)

(E*·GDP)4 (E*·GMP)2

Mit Hilfe dieses erweiterten Hydrolyseschemas kann für die hohe GMP-Produktion bei der

Doppelmutante R227E/K228E eine mögliche Erklärung gefunden werden. Da die

nukleotidfreie Doppelmutante bereits als dimeres, über die helikale Domäne assoziiertes,

Protein vorliegt führt schon die GTP-Bindung zu einer Tetramerisierung. Im Wildtyp

erfolgt jedoch der Schritt der LG-Domänen-Assoziation vor der helikalen Interaktion.

Diese Änderung im Ablauf der Homooligomerisierung bewirkt, dass sich die

Kontaktfläche für die Interaktion an den LG-Domänen verdoppelt, da nun zwei LG-

Domänen für eine Assoziation bereitstehen. Daraus resultiert eine höhere Affinität, die das

Verhältnis 4E*GTP/2(E*GTP)2 in die Richtung der GTP-gebundenen Dimere verschiebt.

Ein weiter Grund für die höhere GMP-Produktion ist, dass das Gleichgewicht zwischen

den GDP-gebundenen Dimeren und Monomeren stärker auf die Seite der Dimere liegt.

Somit folgt das der quasi-irreversible Übergang des GDP-gebundenen Monomers in die

inaktive Form schwieriger zu erreichen ist. Die Tetramerisierung ist eine Möglichkeit die

Affinität an der LG-Domäne zu erhöhen, um somit den aktiven Zustand weiter zu

stabilisieren. Dies wirkt sich auf das Produktverhältnis der Hydrolyse aus, das somit in die

Richtung des GMP´s verschoben wird.

Für die hohe basale Aktivität (11min-1), die bei der GTP-Hydrolyse der Doppelmutante

beobachtet wurde ist scheinbar die helikalen Domäne α12-13 verantwortlich. Da bei der

Deletionsmutante 1-481 in der die α12-13 fehlen, eine Basalaktivität nicht beobachtet

Schema 4-2: Erweitertes Reaktionsschema der Nukleotidhydrolyse durch hGBP1. Das Reaktionsschema der Nukleotidhydrolyse welches von S. Kunzelmann in ihrer Arbeit entwickelt wurde, ist hier um den Schritt der Tetramerisierung erweitert worden. Demnach erfolgt im Laufe der GTP-Hydrolyse eine Konformationsänderung, die die nötige Vorraussetzung für eine Interaktion an den helikalen Domänen liefert. Das Tetramer ist ein weiterer Schritt das aktive Dimer zu stabilisieren und trägt zur Erhöhung der GMP-Produktion bei.

Diskussion

- 101 -

werden konnte, scheinen die Helices α12-13 für diesen Effekt notwendig zu sein. Die im

Vergleich zum Wildtyp später einsetzende Aktivierung ist möglicherweise in einer

verminderten Affinität an der LG-Domäne begründet. Dadurch erfolgen die Assoziation an

den LG-Domänen und die damit verbundene Beschleunigung der Hydrolyse erst bei

höheren Proteinkonzentrationen.

Die Tetramerisierung verläuft nicht nur über α12-13

Mit Hilfe der Temperatursprung-Methode wurde die Kinetik der Assemblierung der

helikalen Domäne näher bestimmt. Die Messungen mit den isolierten Helices α12-13

weisen mit einer Dissoziationskonstante von 24,4µM eine relativ geringe Affinität

zueinander auf. Bei der Homodimerisierung der isolierten helikalen Domäne α7-13, erhöht

sich die Affinität auf 9,7µM. Diese höhere Affinität gegenüber α12-13 liegt hauptsächlich

an einer um eine Größenordnung höheren Assoziationsgeschwindigkeit. Dieses Ergebnis

zeigt, dass die Helices α7 bis α11 ebenfalls einen kleinen, wenn auch nur relativ kleinen,

Beitrag zur Interaktion der helikalen Domänen liefern. Möglicherweise resultiert diese

Erhöhung durch eine Stabilisierung der α12-13 durch die α7-11.

Die Affinität wird durch die Anwesenheit der LG-Domäne weiter erhöht. Die Bindung von

α7-13 an die Doppelmutante R227E/K228E ist mit 1,78µM um mehr als eine

Größenordnung stärker als bei der Homodimerisierung von α12-13. Die Interaktion von

hGBP1 an der helikalen Domäne ist also nicht nur auf die Helices α12-13 beschränkt. Es

findet auch eine Interaktion zwischen der α12-13 des einen Interaktionspartners mit der

LG-Domäne des anderen statt. Durch Messungen mit dem Hefe-2-Hybrid–System konnte

keine Interaktion zwischen der isolierten LG-Domäne und der Subdomäne α12-13 bzw.

α7-13 festgestellt werden (Dissertation U. Benscheid, 2006). Da aber die Detektion von

schwachen Interaktionen mit dem Hefe-2-Hybrid-System sehr schwierig ist, muss eine

sensitivere Methode zur Bestimmung der Interaktion zwischen den isolierten LG- und

helikalen Domänen verwendet werden.

Diskussion

- 102 -

α12-13 α7-13 R227E/K228E

α12-13 24.4µM

α7-13 9,7µM 1,78µM

R227E/K228E 1,78µM

Die Messung der Homodimerisierung der Doppelmutante konnte leider im Rahmen dieser

Arbeit nicht durchgeführt werden. Möglicherweise ist die Dissoziationskonstante in

Gegenwart beider LG-Domänen noch kleiner und die Bindung noch fester. Im Vergleich

dazu konnte die Gleichgewichtskonstante der Dimerisierung der LG-Domänen mit 40nM

bestimmt werden (Dissertation S. Kunzelmann, 2006).

Die Helix α4´ ist innerhalb der hGBP´s stark konserviert

Der Vergleich der Aminosäurensequenz aller sieben hGBPs zeigt eine hohe Konservierung

ihrer Primärsequenz (Tabelle 4-1). Allen gemein sind die konservierten GTP-Bindemotive.

Jedoch existieren weitere Bereiche, deren Sequenzen identische Aminosäuren beinhalten,

die charakteristisch für die GBPs zu sein scheinen.

hGBP-1 hGBP-2 hGBP-3 hGBP-4 hGBP-5 hGBP-6 hGBP-7

hGBP-1 100% 77% 88% 56% 68% 54% 56%

hGBP-2 100% 76% 55% 65% 54% 57%

hGBP-3 100% 55% 68% 53% 56%

hGBP-4 100% 52% 74% 81%

hGBP-5 100% 52% 53%

hGBP-6 100% 74%

hGBP-7 100%

Tabelle 4-2: Prozentualer Vergleich der Primärsequenzidentität. Die Aminosäuresequenzen der Proteine hGBP1-7 wurden miteinander verglichen und die Übereinstimmungen der Aminosäuren prozentual angegeben. Die höchste Übereinstimmung haben hGBP1 und hGBP3 (übernommen aus Olszewski et al., 2006).

Diskussion

- 103 -

GxxxxGK(S/T) hGBP1 ---------------MASEIHMTGPMCLIENTNGRLMANPEALKILSAITQPMVVVAIVGLYRTGKSYLMNKLAGKKKGFSL (67) hGBP2 ---------------MAPEINLPGPMSLIDNTKGQLVVNPEALKILSAITQPVVVVAIVGLYRTGKSYLMNKLAGKKNGFSL (67) hGBP3 ---------------MAPEIHMTGPMCLIENTNGELVANPEALKILSAITQPVVVVAIVGLYRTGKSYLMNKLAGKNKGFSL (67) hGBP4 MGERTLHAAVPTPGYPESESIMMAPICLVENQEEQLTVNSKALEILDKISQPVVVVAIVGLYRTGKSYLMNRLAGKRNGFPL (82) hGBP5 ---------------MALEIHMSDPMCLIENFNEQLKVNQEALEILSAITQPVVVVAIVGLYRTGKSYLMNKLAGKNKGFSV (67) hGBP6 ---------------MESGPKMLAPVCQVENNNEQLLVNQQAIQILEKISQPVVVVAIVGLYRTGKSYLMNHLAGQNHGFPL (67) hGBP7 ---------------MASEIHMPGPVCLIENTKGHLVVNSEALEILSAITQPVVVVAIVGLYRTGKSYLMNKLAGKNKGFPL (67) T DxxG hGBP1 GSTVQSHTKGIWMWCVPHPKKPGHILVLLDTEGLGDVEKGDNQNDSWIFALAVLLSSTFVYNSIGTINQQAMDQLYYVTELT (149) hGBP2 GSTVKSHTKGIWMWCVPHPKKPEHTLVLLDTEGLGDIEKGDNENDSWIFALAILLSSTFVYNSMGTINQQAMDQLHYVTELT (149) hGBP3 GSTVKSHTKGIWMWCVPHPKKPEHTLVLLDTEGLGDVKKGDNQNDSWIFTLAVLLSSTLVYNSMGTINQQAMDQLYYVTELT (149) hGBP4 GSTVQSETKGIWMWCVPHLSKPNHTLVLLDTEGLGDVEKSNPKNDSWIFALAVLLSSSFVYNSVSTINHQALEQLHYVTELA (164) hGBP5 ASTVQSHTKGIWIWCVPHPNWPNHTLVLLDTEGLGDVEKADNKNDIQIFALALLLSSTFVYNTVNKIDQGAIDLLHNVTELT (149) hGBP6 GSTVQSETKGIWMWCVPHPSKPNHTLVLLDTEGLGDVEKGDPKNDSWIFALAVLLCSTFVYNSMSTINHQALEQLHYVTELT (149) hGBP7 GCTVKSETKGIWMWCVPHPSKPNHTLILLDTEGLGDMEKSDPKSDSWIFALAVLLSSSFVYNSMGTINHQALEQLHYVTELT (149)

TLRD Helix α4´ hGBP1 HRIRSKSSPDENENEVEDSADFVSFFPDFVWTLRDFSLDLEADGQPLTPDEYLTYSLKLKKGTSQKDETFNLPRLCIRKFFP (231) hGBP2 DRIKANSSP--GNNSVDDSADFVSFFPAFVWTLRDFTLELEVDGEPITADDYLELSLKLRKGTDKKSKSFNDPRLCIRKFFP (229) hGBP3 HRIRSKSSPDENEN--EDSADFVSFFPDFVWTLRDFSLDLEADGQPLTPDEYLEYSLKLTQGTSQKDKNFNLPRLCIRKFFP (229) hGBP4 ELIRAKSCP--RPDEAEDSADFVSFFPDFVWTLRDFSLDLEADGQPLTPDEYLEYSLKLTQGTSQKDKNFNLPRLCIRHFFR (244) hGBP5 DLLKARNSP--DLDRVEDPADSASFFPDLVWTLRDFCLGLEIDGQLVTPDEYLENSLRPKQGSDQRVQNFNLPRLCIQKFFP (229) hGBP6 LIKAKSSP--RPDGVEEDSTEFVSFFPDFLWTVRDFTLELKLNGHPITEDEYLENALKLIQGNNPRVQTSNFPRECIRRFFP (229) hGBP7 ELIRAKSCP--RPDEVEDSSEFVSFFPDFIWTVRDFTLELKLDGHPITEDEYLENALKLISGKNPQIQNSNKPREWIRHFFP (229) hGBP1 KKKCFVFDRPVH-RRKLAQLEKLQDEELDPEFVQQVADFCSYIFSNSKTKTLSGGIQVNGPRLESLVLTYVNAISSGDLPCM (312) hGBP2 KRKCFVFDWPAP-KKYLAHLEQLKEEELNPDFIEQVAEFCSYILSHSNVKTLSGGIAVNGPRLESLVLTYVNAISSGDLPCM (310) hGBP3 KKKCFVFDLPIH-RRKLAQLEKLQDEELDPEFVQQVADFCSYIFSNSKTKTLSGGIKVNGPRLESLVLTYINAISRGDLPCM (310) hGBP4 KRKCFVFDRPTNDKQYLNHMDEVPEENLERHFLMQSDNFCSYIFTHAKTKTLREGIIVTGKRLGTLVVTYVDAINSGAVPCL (326) hGBP5 KKKCFIFDLPAH-QKKLAQLETLPDDELEPEFVQQVTEFCSYIFSHSMTKTLPGGIMVNGSRLKNLVLTYVNAISSGDLPCI (310) hGBP6 KRKCFVFDRPTNDKDLLANIEKVSEKQLDPKFQEQTNIFCSYIFTHARTKTLREGITVTGNRLGTLAVTYVEAINSGAVPCL (311) hGBP7 KQKCFVFDRPINDKKLLLHVEEVREDQLDSNFQMQSENFCSYIFTHAKTKTLREGILVTGNRLGMLVETYLDAINSGATPCL (311) hGBP1 ENAVLALAQIENSAAVQKAIAHYEQQMGQKVQLPTETLQELLDLHRDSEREAIEVFIRSSFKDVDHLFQKELAAQLEKKRDD (394) hGBP2 ENAVLALAQIENSAAVEKAIAHYEQQMGQKVQLPTETLQELLDLHRDSEREAIEVFMKNSFKDVDQMFQRKLGAQLEARRDD (392) hGBP3 ENAVLALAQIENSAAVQKAIAHYDQQMGQKVQLPAETLQELLDLHRVSEREATEVYMKNSFKDVDHLFQKKLAAQLDKKRDD (392) hGBP4 ENAVTALAQLENPAAVQRAADHYSQQMAQQLRLPTDTLQELLDVHAACEREAIAVFMEHSFKDENHEFQKKLVDTIEKKKGD (408) hGBP5 ENAVLALAQRENSAAVQKAIAHYDQQMGQKVQLPMETLQELLDLHRTSEREAIEVFMKNSFKDVDQSFQKELETLLDAKQND (392) hGBP6 EDAVITLAQRENSAAVQRASDYYSQQMAQRVKFPTDTLQELLDVHAACEREAIAIFMEHSFKDENQEFQKKFMETTMNKKGD (393) hGBP7 ENAMAVLAQCENSAAVQRAANHYSQQMAQQVRFPTDTLQELLDVHAVCEREAIAVFMEYSFKDKSQEFQKKLVDTMEKKKED (393) hGBP1 FCKQNQEASSDRCSALLQVIFSPLEEEVKAGIYSKPGGYRLFVQKLQDLKKKYYEEPRKGIQAEEILQTYLKSKESMTDAIL (476) hGBP2 FCKQNSKASSDCCMALLQDIFGPLEEDVKQGTFSKPGGYRLFTQKLQELKNKYYQVPRKGIQAKEVLKKYLESKEDVADALL (474) hGBP3 FCKQNQEASSDRCSALLQVIFSPLEEEVKAGIYSKPGGYCLFIQKLQDLEKKYYEEPRKGIQAEEILQTYLKSKESVTDAIL (474) hGBP4 FVLQNEEASAKYCQAELKRLSEHLTESILRGIFSVPGGHNLYLEEKKQVEWDYKLVPRKGVKANEVLQNFLQSQVVVEESIL (490) hGBP5 ICKRNLEASSDYCSALLKDIFGPLEEAVKQGIYSKPGGHNLFIQKTEELKAKYYREPRKGIQAEEVLQKYLKSKESVSHAIL (474) hGBP6 FLLQNEESSVQYCQAKLNELSKGLMESISAGSFSVPGGHKLYMETKERIEQDYWQVPRKGVKAKEVFQRFLESQMVIEESIL (475) hGBP7 FVLQNEEASAKYCQAELKRLSELLTESISRGTFFVPGGHNIYLEAKKKIEQDYTLVPRKGVKADEVLQSFLQSQVVIEESIL (475) hGBP1 QTDQTLTEKEKEIEVERVKAESAQASAKMLQEMQRKNEQMMEQKERSYQEHLKQLTEKMENDRVQLLKEQERTLALKLQEQE (558) hGBP2 QTDQSLSEKEKAIEVERIKAESAEAAKKMLEEIQKKNEEMMEQKEKSYQEHVKQLTEKMERDRAQLMAEQEKTLALKLQEQE (556) hGBP3 QTDQILTEKEKEIEVECVKAESAQASAKMVEEMQIKYQQMMEEKEKSYQEHVKQLTEKMERERAQLLEEQEKTLTSKLQEQA (556) hGBP4 QSDKALTAGEKAIAAERAMKEAAEKEQELLREKQKEQQQMMEAQERSFQENIAQLKKKMERERENLLREHERLLKHKLKVQE (572) hGBP5 QTDQALTETEKKKKEAQVKAEAEKAEAQRLAAIQRQNEQMMQERERLHQEQVRQ----MEIAKQNWLAEQQKMQEQQMQEQA (552) hGBP6 QSDKALTDREKAVAVDRAKKEAAEKEQELLKQKLQEQQQQMEAQVKSRKENIAQLKEKLQMEREHLLREQIMMLEHTQKVQN (557) hGBP7 QSDKALTAGEKAIAAKQAKKEAAEKEQELLRQKQKEQQQMMEAQERSFQENIAQLKKKMERERENYMRELRKMLSHKMKVLE (557) hGBP1 QLLKEGFQKESRIMKNEIQDLQTKMRRRKA-CTIS (593) hGBP2 RLLKEGFENESKRLQKDIWDIQMRSKSLEPICNIL (592) hGBP3 RVLKERCQGESTQLQNEIQKLQKTLKKKTKRYMSHKLKI (595) hGBP4 EMLKEEFQKKSEQLNKEINQLKEKIESTKNEQLRLL-KILDMASNIMIVTLPGASKLLGVGTKYLGSRI (641) hGBP5 AQLSTTFQAQNRSLLSELQHAQRTVNNDDP-CVLL (587) hGBP6 DWLHEGFKKKYEEMNAEISQFKRMIDTTKNDDTPWIARTLDNLADELTAILSAPAKLIGHGVKGVSSLFKKHKLPF (634) hGBP7 ELLTEGFKEIFESLNEEINRLKEQIEAAENEEPSVFSQILDVAGSIFIAALPGAAKLVDLGMKILSSLCNRLRNPGKKIIS (639)

Abbildung 4-3: Sequenzvergleich der humanen GBP´s 1-7. Die humanen GBP´s 1-7 weisen untereinander eine sehr hohe Aminosäurenidentität auf (Olszewski et al., 2006). Die vier konservierten Motive GTP-bindender Proteine sind schwarz hinterlegt. Die Helix α4´ ist bei hGBP1-5 ebenfalls stark konserviert (grauer Kasten). Das Arginin an der Stelle 227 (Pfeil), welches bei hGBP1 die wichtigste Kontaktstelle zwischen α4´und α12-13 darstellt, ist ebenfalls konserviert. Die einzige Ausnahme macht hGBP5, bei der das Arginin gegen ein Glutamat getauscht ist.

Arg227

Diskussion

- 104 -

Besonders ausgeprägt ist die Aminosäurenidentität zwischen hGBP1 bis hGBP7 in der

LG-Domäne. Auch bei der in der LG-Domäne liegenden Helix α4´ ist zwischen den sieben

hGBP´s eine hohe Homologie zu finden (Abbildung 4-3). Jedoch zeigen die beiden

Proteine hGBP6 und hGBP7 von allen mit knapp über 50% die geringsten

Sequenzhomologien zu den anderen Familienmitgliedern.

Beim Vergleich aller Sequenzen ist auffällig, dass das Arginin 227, welches im hGBP1 für

die Bindung der α12-13 an die α4´ essentiell ist, auch in allen anderen hGBP´s an gleicher

Stelle zu finden ist. Als einzige Ausnahme trägt hGBP5 an dieser Stelle ein Glutamin.

Nimmt man die beiden Proteine hGBP6 und hGBP7 aufgrund der geringen

Sequenzhomologien (<60%) beiseite und vergleicht nur hGBP1-5, zeigt sich, dass die

Helix α4´in diesen fünf Proteinen nahezu identisch sind. Möglicherweise hat diese Helix in

hGBP2-4 eine ähnliche Aufgabe wie in hGBP1 und ist deswegen stark konserviert

Modell der Tetramerisierung von hGBP1

Die Oligomerisierung von GTP-bindenden Proteinen ist eine essentielle Eigenschaft, die

einen direkten Einfluss auf die Hydrolyseaktivität hat. Das gereinigte hGBP1 liegt

nukleotidfrei als Monomer vor (Dissertation, Praefcke, 2001). Die Bindung von GTP bzw.

dem Analogon GppNHp, lässt das Protein an den LG-Domänen dimerisieren. Durch die

Dimerisierung wird die im Monomer Solvens-exponierte Seitenkette von Arg48 des P-

Loop in das aktive Zentrum orientiert, was die Hydrolyse des GTPs stark beschleunigt

(Ghosh et al., 2006). Wie die full length Struktur des dimeren hGBP1 aussieht, ist noch

nicht vollständig geklärt. Es konnte aber erfolgreich eine Dimerstruktur der isolierten LG-

Domänen im Komplex mit GppNHp gelöst werden (PDB: 2bc9), die einen Anhaltspunkt

liefert wie das Dimer, bestehend aus zwei full length Molekülen, aussehen könnte. Dazu

wurde an die beiden LG-Domänen aus der Dimerstruktur jeweils eine hGBP1 full length

Struktur überlagert (Ghosh et al., 2006). Das resultierende Modell zeigt ein gewinkeltes

Dimer, bei dem die helikale Domänen voneinander weg zeigen. Betrachtet man die

putative Dimerstruktur von oben (Abbildung 4-4, B), so ist zu erkennen, dass die Helices

α12-13 an entgegengesetzten Seiten der LG-Domänen liegen.

Diskussion

- 105 -

Für eine Assemblierung von zwei Dimermolekülen an den helikalen Domänen muss die

Interaktion der α12-13 gelöst werden, um die Beweglichkeit der Helices zu erhöhen

(Abbildung 4-4).

Die Unterbrechung der intramolekularen Interaktion zwischen der LG-Domäne und α12-

13 wird durch die Helix α4´ vermittelt, die durch seine Konformationsänderung die

elektrostatische Bindung unterbricht. Diese Konformationsänderung wird durch die

Bindung von GDP und AlFx induziert, was den Übergangszustand der Hydrolyse darstellt.

Erst wenn der Übergangszustand der Hydrolyse erreicht ist, ist das Protein in der Lage die

nötigen Konformationsänderung für die Tetramerisierung von hGBP1 zu vollziehen. Die

Bindung des GTPs alleine reicht nicht aus. Das Zeitfenster, in dem beim hGBP1wt die

Tetramerisierung stattfinden kann ist demnach klein, konnte aber bereits durch single

turnover Experimente bestimmt werden. Die Geschwindigkeitskonstante des GTP-

Umsatzes liegt dabei bei 0,47s-1. Interessanterweise ist jedoch die nachfolgende GDP-

Hydrolyse schneller und die ermittelte Geschwindigkeitskonstante liegt hier bei 2,2s-1

(Kunzelmann et al., 2006). Eine mögliche Begründung für den, im Vergleich zur GDP-

Hydrolyse, langsameren GTP-Umsatz könnte in der Konformationsänderung im Zuge der

Tetramerisierung liegen.

Diskussion

- 106 -

Möglicherweise besteht die Konformationsänderung nicht nur aus der Neuausrichtung von

α4´, denn ein weiteres Problem stellt die gewinkelte Konformation des LG-Domänen-

Dimers dar (Abbildung 4-4 A). Nach Analyse der Daten aus den mT-Jump-Messungen

erfolgt die Tetramerisierung sowohl über α12-13 als auch über die LG-Domäne des

Interaktionspartners. Diese Art der Interaktion ist aber bei dieser gewinkelten

Dimerstellung nicht möglich und könnte bedeuten, dass die Konformationsänderung im

Übergangszustand der Hydrolyse nicht nur die Helix α4´ betrifft, sondern zusätzlich der

Winkel vergrößert wird. Jedoch konnte diese These anhand der Daten dieser Arbeit nicht

bewiesen werden.

Abbildung 4-4: Bänderdarstellung des dimeren hGBP1. Durch die Überlagerung der Dimerstruktur der isolierten LG-Domänen im Komplex mit GppNHp (PDB: 2bc9) und jeweils einer hGBP1 full length Struktur entsteht ein full length-dimer Modell. (A) Das resultierende Modell zeigt ein gestrecktes Dimer, bei dem die helikale Domänen voneinander weg zeigen und eine gewinkelte Konformation einnehmen. (B) Dreht man das Molekül um 90°, wird deutlich dass die Helices α12-13 an entgegen gesetzten Seiten zueinander liegen und für eine Tetramerisierung an den Helices α12-13 eine Erhöhung der Beweglichkeit notwendig ist.

A

B 90°

α12-13

α12-13

Diskussion

- 107 -

= GTP= Phosphat

LG-Domäne

α7-13

α12-

13α4

/

GTP-Hydrolyse

GTP-Bindung

Dimerisierung

TetramerisierungTetramerisierung

GTP-Hydrolyse

Im nukleotidfreien, GMP- und GDP-gebundenen Zustand liegt hGBP1 als Monomer vor.

Die Bindung von GTP, nicht aber GDP oder GMP induziert eine Dimerisierung, bei der die LG-Domänen das Interface stellen. Die Proteine nehmen dabei eine gewinkelte Konformation ein.

Die Hydrolyse von GTP zu GDP induziert Konformationsänderungen: Die Helix α4´wird in ihrer Position so verändert, dass die elektrostatische Interaktion zur LG-Domäne abbricht. Dadurch lösen sich die Helices α12-13 von der LG-Domäne und eine Interaktion mit einem anderen dimeren hGBP1 an den helikalen Domänen kann erfolgen. Für diese helikale Assoziation gibt es zwei denkbare Möglichkeiten. (A) Zum einen könnte es eine reine coiled-coil-Interaktion der Helices α12-13 geben. Dabei erhalten die Proteine ihre gewinkelte Ausrichtung. (B) Die zweite Möglichkeit ist, dass neben der helikalen coiled-coil-Interaktion, ein interrmolekularer Kontakt zwischen der α12-13 und der LG-Domäne der Interaktionspartner zustande kommt. Dafür müsste sich aber der Winkel des Dimers vergrößern und sich das Molekül „strecken“. Bei Messungen an der mT-Jump-Apparatur zeigte sich, dass die Tetramerisierung sowohl über die α12-13 als auch die LG-Domäne erfolgt. Dieses Ergebnis spricht für das Modell der Winkelvergrößerung, muss aber noch durch weitere Experimente bestätigt werden.

A B

Diskussion

- 108 -

Das Oligomerisierungsverhalten von hGBP2 unterscheidet sich zu

dem von hGBP1

Die Analyse des nukleotidabhängigen Oligomerisierungsverhalten von hGBP2 zeigte ein

verändertes Bild im Vergleich zu hGBP1. Der hydrodynamische Radius von hGBP2 im

Komplex mit GppNHp zeigt keine signifikante Änderung zum nukleotidfreien Protein. Im

Gegensatz zum hGBP1, welches im Komplex mit GppNHp an den LG-Domänen

dimerisiert, ist hGBP2 sowohl im nukleotidfreien als auch im Komplex mit GppNHp

Monomer. Obwohl die beiden Proteine gerade in der LG-Domäne eine sehr hohe

Aminosäurenidentität besitzen, gibt es Unterschiede in wichtigen Aminosäuren, welche in

hGBP1 die Dimer Interaktionsfläche bilden (Dissertation A. Ghosh, 2004). Vor allen das

R240 und das R244 aus der Guaninkappe, welche im hGBP1 den Hauptbeitrag zur

Affinität des Dimers liefern (Dissertation, S. Kunzelmann; 2006), sind im hGBP2

verändert. Das R240 aus hGBP1 ist im hGBP2 ein Tryptophan und das R244 und R245

liegen im hGBP2 als Lysine vor.

Im Komplex mit GDP*AlFx liegt hGBP2 in einem höheren oligomeren Zustand vor. Im

Vergleich mit hGBP1 liegt der hydrodynamische Radius bei hGBP2 in einem Bereich

zwischen einem Dimer und einem Tetramer. Da aber nichts über die Faltung des Proteins

bekannt ist, kann nicht eindeutig bestimmt werden, wie viele monomere Einheiten in die

Assemblierung involviert sind.

Dieser Unterschied in der nukleotidabhängigen Oligomerisierung von hGBP2 weist auf

Unterschiede in der Biochemie zwischen hGBP1 und hGBP2 hin. Bei hGBP1 folgt auf die

Bindung von GTP die Dimerisierung an den LG-Domänen und eine damit verbundene

Beschleunigung der GTP-Spaltung (Ghosh et al., 2006). Das hGBP2 dagegen ist nach

Nukleotidbindung weiterhin Monomer, was bedeutet, dass die Beschleunigung der

Hydrolyse durch einen anderen Mechanismus als bei hGBP1 hervorgerufen wird, da auch

die hGBP2-Hydrolyse einen kooperativen Verlauf hat. Beim Vergleich der apparenten

Dissoziationskonstanten der Dimerisierung liegt der Kdapp von hGBP2 mit 0,76µM

deutlich über den von hGBP1 mit 0,032µM.

Die Messung der nukleotidabhängigen Oligomerisierung von hGBP2 zeigte in einer

früheren Arbeit ein anderes Bild (Dissertation A. Ghosh, 2004). Dabei liegt hGBP2

nukleotidfrei zwar als Monomer vor, aber dimerisierte im Komplex mit GppNHp bzw.

GDP*AlFx. Der Grund für diese Unterschiede ist nicht bekannt.

Diskussion

- 109 -

Auch die konzentrationsabhängige Nukleotidhydrolyse macht die unterschiedliche

Biochemie zwischen hGBP1 und hGBP2 deutlich. Zwar weisen die maximalen GTPase-

Aktivitäten kaum Unterschiede auf, jedoch konnte GMP bei 25°C nicht als Produkt

nachgewiesen werden. Als Hauptprodukt konnte ausschließlich GDP detektiert werden. In

früheren Arbeiten konnte bei der konzentrationsabhängigen GTP-Hydrolyse bei 37°C eine

geringe GMP Produktion nachgewiesen werden (Neun et al., 1996). Das könnte bedeuten,

dass die GMP Produktion stark temperaturabhängig ist. Interessanterweise konnten bei

Messungen mit der isolierten LG-Domänen von hGBP2 bei 37°C keine Produktion von

GMP festgestellt werden (Dissertation, Ghosh, 2004).

Ein weiterer Unterschied zwischen hGBP1 und hGBP2 ist bei den Messungen der mant-

Nukleotid-Affinitäten zu beobachten. Dabei sind bei hGBP2, mGDP und mGppNHp um

eine Größenordung fester gebunden als bei hGBP1. Dagegen bindet mGMP bei beiden

Proteinen mit derselben Affinität. Die Ergebnisse der mant-Nukleotidaffinitäten stimmen

mit den Messungen überein, die A. Ghosh bereits im Rahmen seiner Dissertation

vorgenommen hat.

Die helikale Domäne von hGBP1 interagiert mit hGBP2

Die Sequenzanalyse zwischen hGBP1 und hGBP2 zeigt eine Sequenzidentität von ca. 77%

(Olszewski et al., 2006). Die größte Sequenzidentität liegt dabei in der LG-Domäne (82%).

Dagegen zeigen die C-terminalen Bereiche eine geringe Homologie. In dieser Arbeit

konnte nicht nur gezeigt werden, dass hGBP1 mit hGBP2 interagiert, sondern auch dass

diese Interaktion über die helikale Domäne von hGBP1 vermittelt wird. Interessanterweise

findet eine Interaktion zwischen hGBP1 und hGBP2 im Übergangszustand der GTP-

Hydrolyse statt, welcher durch den Komplex mit GDP*AlFx induziert wird. Die Bindung

von GppNHp zeigt dagegen in FRET-Messungen keine Veränderung der

Akzeptorfluoreszenz und damit auch keine Interaktion zwischen den Proteinen. Diese

Beobachtung stellt einen Unterschied zu der Homooligomerisierung von hGBP1 dar, das

bei Bindung von GppNHp über die LG-Domänen dimerisiert. Möglicherweise ist eine

Interaktion an der LG-Domäne zwischen hGBP1 und hGBP2 nicht möglich.

Zusammenfasung

- 110 -

Denn trotz der großen Homologie zwischen den LG-Domänen sind gerade die

Aminosäuren die in der hGBP1 Dimerisierung den größten Beitrag leisten, im hGBP2

verändert. Das R240 aus hGBP1 ist im hGBP2 ein Tryptophan und das R244 und R245

liegen im hGBP2 als Lysine vor.

Es ist zu berücksichtigen, dass bei Verwendung von GDP*AlFx dauerhaft ein Zustand

dargestellt wird, der bei der Hydrolyse von GTP sehr kurzlebig ist. Um zu zeigen, dass

dieser Zustand während der GTP-Hydrolyse lang genug anhält, damit die Interaktion

zustande kommt, wurde der Versuch zeitabhängig unter multi turnover Bedingungen mit

GTP durchgeführt. Nach der Zugabe des GTP ist eine Zunahme der Akzeptorfluoreszenz

zu beobachten, die nur durch die Interaktion von hGBP1 und hGBP2 erfolgen kann.

5 Zusammenfassung

Die Selbstassemblierung von Proteinen der Dynamin Familie ist ein wichtiger Bestandteil

ihrer Funktion. In vorangegangenen Arbeiten konnte bereits für das hGBP1 eine

Assemblierung zu einem dimeren Komplex beobachtet werden, die eine starke

Beschleunigung der Hydrolyse zur Folge hat. Des Weiteren konnte auch die

Oligomerisierung zu einem tetrameren Komplex gezeigt werden, in der die Helices α12/13

als Interaktionsdomäne dienten.

Ziel dieser Arbeit war es, unter biophysikalischen und biochemischen Gesichtspunkten die

Selbstassemblierung von hGBP1 zu untersuchen und die Rolle der helikalen Subdomäne

α12/13 innerhalb dieses Vorgangs zu klären. Diese Arbeit beschäftigt sich ebenfalls mit

der biochemischen Charakterisierung von hGBP2 und gibt die ersten Hinweise auf eine

Interaktion zwischen hGBP1 und hGBP2.

In einer detaillierten Betrachtung der full length Struktur von hGBP1 ist zu erkennen, dass

die Helix α4´ aus der LG-Domäne mit den Helices α12-13 interagiert. Diese Interaktion

zwischen der LG-Domäne und dem C-Terminus ist ein elektrostatischer Kontakt

bestehend aus einem Lysin (K228) und einem Arginin (R227) auf Seiten der Helix α4´ und

mehreren Glutaminsäuren (E563, E568, E556 und E575) auf Seiten von α12-13. Durch die

Bindung von GDP*AlFx durch den Wildtyp erfolgt die Tetramerisierung des Proteins.

Aufgrund einer Konformationsänderung, bei der sich die Helix α4´ verschiebt, wird beim

Wildtyp die elektrostatische Interaktionen zwischen der LG-Domäne und der Subdomäne

Zusammenfasung

- 111 -

α12-13 gelöst. Dadurch stehen die Helices α12-13 als Interaktionsdomäne zur Verfügung.

Um diese These zu stützen, wurde in dieser Arbeit erfolgreich eine Mutation in hGBP1

eingefügt (R227E/K228E), die diese elektrostatische Interaktion dauerhaft unterbricht. Das

hat zur Folge, dass diese Mutante in nukleotidfreier Form bereits als helikal assoziiertes

Dimer vorliegt. Die Bindung des nicht hydrolysierbaren GTP Analogon GppNHp bewirkt

die Assemblierung zu einem Tetramer, was beim Wildtyp nur im Komplex mit GDP*AlFx

geschieht. Durch die Unterbrechung des elektrostatischen Kontakts ist die

Konformationsänderung der α4´nicht mehr notwendig und die Helices α12-13 stehen

dauerhaft für eine Interaktion zur Verfügung. Somit kann bereits im nukleotidfreien

Zustand eine Assemblierung an der helikalen Domäne stattfinden. Dadurch konnte gezeigt

werden, dass diese elektrostatische Interaktion verantwortlich für eine Weiterleitung der

Information der GTP Hydrolyse an die helikale Domäne ist.

Diese Unterbrechung des elektrostatischen Kontakts zeigt auch einen Einfluss auf die

Nukleotid-Hydrolyse. Die Konzentrationsabhängigkeit der Hydrolysegeschwindigkeit

zeigt einen sigmoidalen Verlauf. Dabei ist zwar die maximale Hydrolysegeschwindigkeit

der Mutante dem Wildtyp sehr ähnlich, jedoch besitzt sie schon bei geringen

Proteinkonzentrationen eine relativ hohe Aktivität.

Bei der Deletionsmutanten 1-481, aber auch bei den isolierten LG-Domänen konnte die

Bindung und Umsetzung von GDP festgestellt werden (Kunzelmann 2006, Ghosh et al.,

2006). Diese veränderte Substratspezifität konnte auch bei der Punktmutante R227E und

bei der Doppelmutante R227E/K228E beobachtet werden. Jedoch ist die GDP

Hydrolysegeschwindigkeit dieser Mutanten 10mal kleiner als die der Deletionsmutante

1-481, zeigt aber den Einfluss der α12-13 im Bezug auf die Substratspezifität.

Um die Interaktion an der helikalen Domäne untersuchen zu können, wurden zusätzlich

zur Doppelmutante R227E/K228E unterschiedliche Deletionsmutanten hergestellt und

hinsichtlich ihrer Affinität an der mT-Jump-Apparatur analysiert. Dabei zeigte sich, dass

die Tetramerisierung nicht nur über die Subdomäne α12/13 vermittelt wird. Bei der

zusätzlichen Anwesenheit von weiteren Domänen (α7-11 bzw. LG-Domäne), sind die

Affinitäten um bis zu einer Größenordnung höher.

Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der biochemischen und

biophysikalischen Charakterisierung von hGBP2. Im Gegensatz zur GTP-Hydrolyse durch

hGBP1 ist bei der Hydrolyse durch hGBP2 GDP das Hauptprodukt. Die Produktion von

GMP konnte nicht festgestellt werden. Auch in der nukleotidabhängigen Oligomerisierung

konnten Unterschiede zum Wildtyp festgestellt werden. In Gegenwart von GppNHp liegt

Zusammenfasung

- 112 -

hGBP2 als Monomer vor, während für hGBP1 eine Dimerisierung in Gegenwart von

GppNHp beschrieben wird. Dagegen liegt hGBP2 im Komplex mit GDP*AlFx in einem

oligomeren Zustand vor, welcher im Vergleich zum hGBP1 einem Trimer entspricht.

Die GTP-Hydrolyse von hGBP2 ist wie die von hGBP1 kooperativ. Die maximale

spezifische Aktivität von 15 min-1 bei sättigenden Proteinkonzentrationen ist allerdings

niedriger als die von hGBP1 (22,8 min-1).

Unter Verwendung Fluoreszenz-markierter Proteine konnte eine Interaktion zwischen

hGBP1 und hGBP2 nachgewiesen werden. Diese Interaktion wird über die α12-13 von

hGBP1 vermittelt.

- 113 -

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7 Anhang 7.1 Abkürzungsverzeichnis µl Mikroliter µM mikromolar A Adenin Amp Ampicillin APS Ammoniumperoxodisulfat bp Basenpaar BSA bovine serum albumine bzw. beziehungsweise C Cystein C-Terminus Carboxyterminus DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonucleinsäure DNase Desoxyribonuklease DTE Dithioerythritol E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat ER Endoplasmatisches Retikulum FPLC Fast Performance Liquid Chromatography FRET Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer g Gramm, Erdbeschleunigung G Guanin GAP GTPase Aktivierendes Protein GBP Guanylat-bindendes Protein GDI Guanine Nucleotide Dissociation Inhibitor GDP Guanosindiphosphat GEF Guaninnukleotid Austauschfaktor Gl. Gleichung GMP Guanosinmonophosphat GppNHp Guanosin-[β/γ-imido]-triphosphat GSH reduziertes Glutathion GTP Guanosintriphosphat h Stunde HPLC High Performance Liquid Chromatography IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid ITC isothermes Titrationskalorimeter kb Kilobasenpaar KD Gleichgewichtskonstante der Dissoziation kDa Kilodalton kJ Kilojoule LB Luria Bertani min Minute mM millimolar nm Nanometer

Anhang

- 124 -

NMR Kernspinresonanz nt Nukleotide NTA Nitrilotriacetat N-Terminus Aminoterminus OD Optische Dichte PAGE Polyarcrylamidgelelektrophorese PCR Polymerase Chain Reaction PEG Polyethylenglycol Pi Orthophosphat PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid RNA Ribonucleinsäure rpm Umdrehungen pro Minute RT Raumtemperatur s Sekunde SDS Sodiumdodecylsulfate (Natriumdodecylsulfat) T Tymidin Tab. Tabelle TBA Tetrabutylammoniumbromid TBK Triethylammonium-Bikarbonat TEMED N, N, N’, N’-Tetramethylethylendiamin Tris Trishydroxymethylaminomethan Units / U enzymatische Aktivität UV Ultraviolett V Volt XTP Xanthosintriphosphat dNTP 2‘-Desoxinukleosid-5‘-triphosphat S Svedbergeinheit 1 S = 10-13 s Å Angström (1Å = 10101 −• nm) Für die Aminosäuren wurde der Ein- und Dreibuchstabencode verwendet: A Ala Alanin M Met Methionin N Asn Asparagin C Cys Cystein P Pro Prolin D Asp Asparaginsäure Q Gln Glutamin E Glu Glutaminsäure R Arg Arginin F Phe Phenylalanin S Ser Serin G Gly Glycin T Thr Threonin H His Histidin V Val Valin I Ile Isoleucin W Trp Tryptophan K Lys Lysin Y Tyr Tyrosin L Leu Leucin x beliebige AS

Anhang

- 125 -

7.2 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1-1: Humanes Interferon-γ 1 Abbildung 1-2: JAK-STAT-Signalweg. 2 Abbildung 1-3: GTPase-Zyklus von Ras. 5 Abbildung 1-4: Elektronenmikroskopische Aufnahme der Ringbildung um Lipidnanoröhren. 7 Abbildung 1-5: Kristallstruktur der GTPase-Domäne von Dynamin A. 8 Abbildung 1-6: Anordnung der Domänen von Dynamin 9 Abbildung 1-7: Kristallstruktur des dimeren BDLP in GDP-gebundenem Zustand. 11 Abbildung 1-8: Gegenwärtiges Modell der MxA Aktivität. 13 Abbildung 1-9: Sequenzvergleich der sieben humanen GBP´s. 18 Abbildung 1-10: Darstellung der Kristallstruktur von hGBP1 im Bändermodell. 20 Abbildung 1-11: Interaktion des Cteminalen Helixmotiv α12/13 mit der Helikalen- und LG-

Domäne. 21 Abbildung 1-12: Kristallstruktur des LG-Domänen Dimers in GppNHp-gebundener Form. 22 Abbildung 1-13: Reaktionsmodell der Nukleotidhydrolyse durch hGBP1. 24 Abbildung 3-1: Konformationsänderung der LG-Domäne von hGBP1. 49 Abbildung 3-2: Darstellung des elektrostatischen Kontakts zwischen LG-Domäne und α12-13. 50 Abbildung 3-3: Darstellung des elektrostatischen Kontakts zwischen LG-Domäne und α12-13 vor und nach Konformationsänderung von α4´. 51 Abbildung 3-4: Darstellung des Oberflächenmodells von hGBP1. 54 Abbildung 3-5: Dynamische Lichtstreuung von hGBP1 und Mutanten. 56 Abbildung 3-6: Kalibrierung der analytischen Größenausschlusschromatographiesäule. 58 Abbildung 3-7: Analytische Größenausschlusschromatographie vom hGBP1 Wildtyp. 59 Abbildung 3-8: Analytische Größenausschlusschromatographie der Mutante hGBP1 R227E/K228E. 60 Abbildung 3-9: Analytische Größenausschlusschromatographie der Mutante R227E. 61 Abbildung 3-10: Analytische Größenausschlusschromatographie der Mutante R228E. 62 Abbildung 3-11: Analytische Größenausschlusschromatographie der Mutante E563R. 63 Abbildung 3-12: Bestimmung der mant-Nukleotidaffinitäten durch Fluoreszenztitrationen. 64 Abbildung 3-13: Kinetik der Bindung von mant-Nukleotiden an hGBP1wt und hGBP1 R227E/K228E 66 Abbildung 3-14: Konzentrationsabhängigkeit der GTP-Hydrolyse von hGBP1 R227E/K228E. 68 Abbildung 3-15: Konzentrationsabhängigkeit der GTP-Hydrolyse von verschiedenen

hGBP1 Mutanten. 69 Abbildung 3-16: GDPase-Aktivität von hGBP1 R227E/K228E. 70 Abbildung 3-17: GDPase-Aktivität von hGBP1 R227E. 71 Abbildung 3-18: Position der Cysteine innerhalb der hGBP1 Struktur. 74 Abbildung 3-19: Kinetik der Dimerisierung von hGBP1 α7-13 und hGBP1 R227E/K228E. 75 Abbildung 3-20:Analyse der Homodimerisierung von hGBP1 α12-13 und hGBP1 α7-13

durch die Temperatursprung-Methode. 76 Abbildung 3-21: Integrität der isolierten Gesamt-RNA aus INF-γ induzierten HUVECs. 79 Abbildung 3-22: Nukleotidabhängige Oligomerisierung von hGBP1 und hGBP2. 82 Abbildung 3-23: Konzentrationsabhängige Nukleotidhydrolyse von hGBP2. 83 Abbildung 3-24: Kinetik der Assoziation von mant-Nukleotiden. 84 Abbildung 3-25: Fluoreszenztitration von mant-Nukleotiden mit hGBP2. 85 Abbildung 3-26: FRET zwischen hGBP2-eYFP und hGBP1-eCFP in Gegenwart

unterschiedlicher Nukleotide. 87

Abbildung 3-27: FRET zwischen hGBP2-eYFP und hGBP1-eCFP in Gegenwart von GTP. 88 Abbildung 3-28: FRET zwischen hGBP2-eYFP und hGBP1 Deletionsmutante α7-13-eCFP

in Gegenwart unterschiedlicher Nukleotide. 89 Abbildung 3-29: FRET zwischen hGBP2-eYFP und hGBP1-α7-13-eCFP in Gegenwart von

GTP. 90

Abbildung 4-1: Konformationsänderung der LG-Domäne von hGBP1 93 Abbildung 4-2: Detailansicht des elektrostatischen Kontakts zwischen LG-Domäne und α12-13 94 Abbildung 4-3: Sequenzvergleich der humanen GBP´s 1-7. 103 Abbildung 4-4: Bänderdarstellung des dimeren hGBP1. 106

Anhang

- 126 -

7.3 Tabellenverzeichnis Tabelle 3-1: Zusammenfassung der DLS-Ergebnisse von hGBP1 und Mutanten. 57 Tabelle 3-2: Gleichgewichtskonstanten von mant-Nukleotiden an hGBP1 und Mutanten. 64 Tabelle 3-3: Kinetik der Bindung von mant-Nukleotiden an hGBP1 und Mutanten. 67 Tabelle 3-4: Konzentrationsabhängige Hydrolyse von hGBP1 und Mutanten des hGBP1. 72 Tabelle 3-5: Effizienz der Kupplung von Fluoreszenzmarkern an hGBP1 Deletions- und

Punktmutanten. 73 Tabelle 3-6: Gleichgewichts- und Geschwindigkeitskonstanten der Assemblierung an der

helikalen Domäne. 77 Tabelle 3-7: Kinetik der Bindung von mant-Nukleotiden an hGBP1 und Mutanten. 85 Tabelle 4-1: Übersicht des nukleotidabhängigen Oligomerisierungsverhalten von hGBP1 und

Mutanten. 95 Tabelle 4-2: Prozentualer Vergleich der Primärsequenzidentität. 102

Anhang

- 127 -

Danksagung

Zum Abschluss möchte ich mich noch bei all jenen bedanken die zum Gelingen

dieser Arbeit beigetragen haben.

Bei Prof. Dr. Christian Herrmann für die Möglichkeit in seiner Abteilung an

diesem spannenden Forschungsthema arbeiten zu dürfen. Danke auch für die

hervorragende Betreuung, die stetig offene Tür und die vielen konstruktiven

Gespräche.

Weiterhin bedanke ich mich bei Herrn Prof. Weingärtner für die Bereitschaft das

Zweitgutachten zu übernehmen.

Ein großer Dank gilt der gesamten Arbeitsgruppe für die unzähligen gemeinsamen

Stunden im Labor und den vielen interessanten Diskussionen. Allen voran Agne,

Andy, Christine B., Christine D., Cihan, Daniel, Diana, Klaus, Maik, Mark,

Nadine, Semra, Tobias und Herrn Hostmeier. Euch allen wünsche ich viel Erfolg

in eurem weiteren wissenschaftlichen Werdegang.

Ein spezieller Dank gilt noch Semra Ince und Christine Dovengerds für die

vielfältige Unterstützung meiner Arbeit im Labor. Christine Bee, Mark Wehner

und Tobias Vöpel danke ich für das Korrekturlesen meiner Arbeit.

Ich möchte mich auch bei Prof. Michael Stürzl, Dr. Michael Bauer und Dr. Philipp

Tripal (Universität Erlangen-Nürnberg) für das zur Verfügung stellen der HUVEC-

mRNA bedanken. Danke auch für die mir entgegen gebrachte Gastfreundschaft

und die interessanten Einblicke in die Zellbiologie.

Mein ganz persönlicher Dank gilt meiner Familie. Ohne eure Unterstützung wäre

ich nie so Weit gekommen. Besonders dir Steffi danke ich für alles!

- 128 -

LEBENSLAUF Adrian Syguda

Richard-Strauss Allee 1

42289 Wuppertal

Geburtsdatum: 21. Juni 1977

Geburtsort: Kattowitz (Polen)

Familienstand: verheiratet

Staatsangehörigkeit: deutsch

1984 - 1988 Städt. Gemeinschaftsgrundschule Einern in Wuppertal 1988 - 1990 Städt. Realschule im Schulzentrum Ost in Wuppertal 1990 - 1994 Städt. Hauptschule Wichlinghausen-Süd in Wuppertal 1994 - 1997 Gesamtschule Wuppertal-Langerfeld 28. Mai 1997 Allgemeine Hochschulreife 1998 - 2004 Studium der Biochemie an der Ruhr-Universität Bochum Jan.2004 – Jul. 2004 Diplom an der Ruhr-Universität Bochum am Lehrstuhl für

Physikalische Chemie I, AG Proteininteraktionen

bei Prof. Dr. Chr. Herrmann

Titel: Strukturelle und biophysikalische Charakterisierung

des dimeren hGBP1

13.07.2004 Abschluss: Diplom Biochemiker

Sep. 2004 – Jul. 2008 Promotion an der Ruhr-Universität Bochum am Lehrstuhl

für Physikalische Chemie I, AG Proteininteraktionen bei

Prof. Dr. Chr. Herrmann

Titel: Strukturelle und biophysikalische Charakterisierung

der Oligomerisierung des humanen Guanylat-bindenden

Protein 1

Strukturelle und biophysikalische Charakterisierung der ... · Reaktionszyklus und führen zu...

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