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STRUKTURELLE UND FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNGDES MYELINPROTEINS 36K AUS DEM ZNS DER

REGENBOGENFORELLE (ONCORHYNCHUS MYKISS)

DISSERTATION

zur Erlangung des akademischen Grades

„Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)“

des Fachbereiches Biologie/Chemie

der Universität Osnabrück

vorgelegt von

Wolfgang Moll

November 2004

INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS

1. EINLEITUNG 2. MATERIAL UND METHODEN

2.1 Material 2.2.1 Bakterienstämme

2.2.2 Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss)

2.2 Methoden 2.2.1 Computergestützte Aminosäure-Sequenzanalysen

2.2.2 Animpfen einer Bakterien-Über-Nacht-Kultur (ÜK)

2.2.3 Heterologe Expression mit E. coli/pET-System (Fa. Novagen)

2.2.4 Affinitätschromatographische Aufreinigung mit Ni2+-chelatierender

Sepharose

2.2.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (nach Laemmli)

2.2.6 Proteinanfärbung mit Coomassie-Lösung

2.2.7 Proteinanfärbung durch Silberfärbung

2.2.8 Proteintransfer auf Nitrozellulose- oder Polyvinylidenfluorid- (PVDF-)

Membran (Western-Blot)

2.2.9 Immunologischer Nachweis von Proteinen auf Nitrozellulose- oder

Polyvinylidenfluorid- (PVDF-) Membran

2.2.10 Fern-UV-Circulardichroismus-Spektroskopie (CD-Spektroskopie) von

rekombinantem 36K in Lösung

2.2.11 Tryptophan-Fluoreszenz-Studien von rekombinantem 36K in Lösung

2.2.12 Elektronenspin-Resonanz-Spektroskopie (ESR-Spektroskopie) von

rekombinantem 36K in Lösung

2.2.13 Röntgenkleinwinkelstreuung von rekombinantem 36K in Lösung

2.2.14 Assoziation von rekombinantem 36K an phospholipidbeschichtete

Silica- Kügelchen („TRANSIL“; Fa. Nimbus, Leipzig)

2.2.15 Kontrollierter proteolytischer Verdau von rekombinantem 36K mit

Trypsin (Fa. Sigma-Aldrich, München)

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INHALTSVERZEICHNIS

2.2.16 Chemische Spaltung von rekombinantem 36K mit 2-Nitro-5-

Thiocyanobenzonsäure (NTCB)

2.2.17 Random-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-(Random-FRET-)

Untersuchungen von membranassoziiertem rekombinanten 36K

2.2.18 Isolieren von Myelin aus dem ZNS der Regenbogenforelle

(Oncorhynchus mykiss)

2.2.19 Herstellen einer 5%igen (w/v) Digitonin-Stammlösung und Myelinprotein-

Extraktion mit Digitonin

2.2.20 Protein-Konzentrationsbestimmung mit Amidoschwarz-Tüpfel-Test

2.2.21 Messung einer Dehydrogenase-Aktivität im isolierten ZNS-Myelin der

Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss)

2.2.22 Herstellung von Phosphatidylcholin (PC)/Phosphatidylethanolamin

(PE)-Liposomen

2.2.23 Aggregationsassay von Phosphatidylcholin (PC)/Phosphatidyl-

ethanolamin (PE)-Liposomen mit rekombinantem 36K

2.2.24 Blue-Native Gradienten-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (BN-PAGE)

(1. Dimension)

2.2.25 SDS-PAGE der durch BN-PAGE aufgetrennten Myelinprotein-Komplexe

(2. Dimension)

2.2.26 Separation der Myelinprotein-Komplexe mit ProFound-Co-Immuno-

präzipitation-Kit (Perbio Sciences, Bonn)

3. ERGEBNISSE

3.1 Computerunterstützte Analyse der 36K-Aminosäuresequenz 3.1.1 Homologie-Alignment der Aminosäure-Sequenzen von 36K und

Proteinen aus der Reduktase/Epimerase/Oxidoreduktase Superfamilie

(RED)

3.1.2 Sekundärstruktur-Vorhersage des 36K-Proteins mit dem JPred-Internet-

Server

3.1.3 3-dimensionales Modell des N-terminalen Teils von 36K

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INHALTSVERZEICHNIS

3.2 Untersuchung der Sekundärstrukturzusammensetzung des rekombinanten 36K-Proteins mittels Fern-UV-Circulardichroismus- Spektroskopie (CD-Spektroskopie)

3.3 Röntgenkleinwinkelstreuung von rekombinantem 36K in Lösung

3.4 Untersuchungen zur Funktion von 36K 3.4.1 Messung einer Dehydrogenase-Aktivität im isolierten Myelin

3.4.2 Aggregationsassay von Phosphatidylcholin (PC)/Phosphatidyl-

ethanolamin (PE)-Liposomen mit rekombinantem 36K

3.5 Einfluss von Nukleotiden auf die Konformation des rekombinanten 36K-Proteins 3.5.1 Tryptophan-Fluoreszenz-Spektren von rekombinantem 36K ± Nukleotide

3.5.2 Fern-UV-Circulardichroismus-Spektroskopie von rekombinantem

36K ± Nukleotide

3.5.3 Elektronenspin-Resonanz-Spektroskopie (ESR-Spektroskopie) von

rekombinantem 36K ± Nukleotide

3.6 Untersuchungen zur Penetration des 36K-Proteins in einen Phospholipid-Bilayer 3.6.1 Kontrollierter proteolytischer Verdau von membrangebundenem 36K

3.6.2 Einfluss von Nukleotiden auf Trypsinisierung von membrangebundenem

36K

3.6.3 Spaltung von rekombinantem 36K mit 2-Nitro-5-Thiocyanobenzonsäure

(NTCB) in Lösung

3.6.4 Spaltung von membrangebundenem rekombinanten 36K mit

2-Nitro-5-Thiocyanobenzonsäure (NTCB)

3.6.5 Random-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer- (Random-FRET-)

Untersuchung zwischen rekombinantem 36K-QSY und 7-Nitrobenz-2-

oxa-1,3-Diazol-4-yl-Phosphatidylcholin (NBD-PC)

3.6.6 Hypothetisches Modell der Lage von 36K in der „Major Dense Line“ des

ZNS-Myelins der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss)

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INHALTSVERZEICHNIS

3.7 Interaktionen zwischen 36K und anderen Myelinproteinen aus dem ZNS der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss)

3.7.1 Myelinprotein-Extraktionen aus dem Fisch-ZNS mit dem nicht-ionischen

Detergenz Digitonin (Fa. Merck, Schwalbach/Ts.)

3.7.2 Blue-Native Polyacrylamidgel-Elektrophorese (BN-PAGE) der

Myelinprotein-Extraktion aus dem ZNS der Forelle

3.7.3 Co-Immunopräzipitation von Myelinprotein-Komplexen aus dem ZNS-

Myelin der Forelle

3.8 Hypothetisches Modell der Lage und der Interaktionen von 36K mit Proteinen in der „Major Dense Line“ des ZNS-Myelins der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss)

4. DISKUSSION 5. LITERATUR 6. ANHANG 6.1 36K-Aminosäure-Sequnenz mit Sekundärstruktur-Vorhersage

(nach 3.1.2) und Trypsinisierungsstellen nach PeptidCutter

(Expasy-Internet-Server)

6.2 Klonierungsschema der 36KcDNA in die MCS („multiple cloning site“)

des pET23a(+)-Vektors (Fa. Novagen, Schwalbach/Ts.)

(nach Diplom-Arbeit W. Moll, 2001)

6.3 Abkürzungen

6.4 Publikationen

DANKSAGUNG ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGKEIT DER ERBRACHTEN WISSENSCHAFTLICHEN LEISTUNG

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INHALTSVERZEICHNIS

ERKLÄRUNG ÜBER ETWAIGE FRÜHERE PROMOTIONSVERSUCHE CURRICULUM VITAE

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1. EINLEITUNG

1. EINLEITUNG

Im Laufe der Evolution wurde es für das Überleben der Tiere immer wichtiger,

aufgenommene Sinnesreize schnell zu verarbeiten und entsprechend reagieren zu

können. Die Reize werden dabei von den Sinnesorganen registriert und als

elektrische Erregung (Aktionspotentiale) über weit verzweigte Nervenbahnen

weitergeleitet. Dabei entwickelten sich zwei Wege, um eine hohe Geschwindigkeit

der Impulsfortleitung zu erreichen. Der eine Weg ist die Vergrößerung des

Axondurchmessers, was in eine Verminderung des inneren Längswiderstandes

resultiert. Dieses ist z. B. beim Riesenaxon der Tintenfische verwirklicht. Bei den

Vertebraten wird diese Möglichkeit durch die zunehmende Anzahl von Nervenzellen

bzw. deren Ausläufern (Axone) und den daraus resultierenden Platzmangel limitiert.

Um transmembrane Leckströme zu minimieren und die Membrankapazität zu

verringern, werden deren Axone mit einer isolierenden Schicht, dem Myelin, das zu

ca. 70% aus Lipiden besteht

(Morell, 1977), umhüllt (Ritchie,

1995). Diese Myelinhülle wird von

spezialisierten Gliazellen, den

Schwannschen Zellen im

peripheren Nervensystem (PNS)

und den Oligodendrozyten im

zentralen Nervensystem (ZNS),

gebildet. Bei der Myelinisisierung

wickeln sich deren abgeflachte

Membranfortsätze mehrfach

konzentrisch um die Axone und

bilden nach Verdichtung die

typische kompakte, multi-

lammelare Struktur des Myelins.

Abb. 1: A. Schematische Darstellung einesmyelinisierten Axons (aus Roger Eckert:„Tierphysiologie“). B. ElektronenmikroskopischeAufnahme der multilamellaren Struktur des Myelinsaus einem peripheren Nerv der Maus(Vergrößerung 87200fach, aus J. B. Metzler „LinderBiologie“)

-1-

1. EINLEITUNG

In regelmäßigen Abständen (ca. alle 100 µm) ist die Myelinscheide durch die so

genannten „Ranviersche Schnürringe“ unterbrochen. Eine Erregung breitet sich

ausschließlich über diese freiliegenden Axonbereiche aus

(„Saltatorische Erregungsleitung“). Innerhalb des kompakten Myelins unterscheidet

man zwei unterschiedliche Bereiche: Die aus der extrazellulären Apposition gebildete

„Intraperiod Line“ und die aus der cytosolischen Apposition gebildete „Major Dense

Line“. Innerhalb dieser Bereiche befindet sich eine limitierte Anzahl von Proteinen,

die aufgrund ihrer adhäsiven Eigenschaften zur Stabilisierung der übereinander

liegenden Membranlamellen beitragen. Dabei gibt es deutliche Unterschiede in der

Proteinzusammensetzung des ZNS-Myelins phylogenetisch älterer Vertebraten wie

den Fischen und jener phylogenetisch jüngerer Vertebraten (Abbildung 2)

(Jeserich, 1983; Waehneldt & Jeserich,

1984). Das Proteolipid-Protein (PLP), für

das eine adhäsive Funktion auf der

extrazellulären Seite angenommen wird

(Lees & Brostoff, 1984), ist bei den

Fischen durch 2 Isoformen von

P0-ähnlichen Glykoproteinen ersetzt

(Intermediär Protein 1 & 2; Stratmann &

Jeserich, 1995; Lanwert & Jeserich,

2001). Ein weiteres Protein, das nach

seinem Molekulargewicht als 36K

bezeichnet wird (Jeserich, 1983), sucht

man bei höheren Vertebraten vergebens.

Dieses neue, myelinspezifische Protein ist

nicht glykolisiert (Jeserich & Waehneldt,

1987) und ausschließlich in der

cytosolischen Apposition („Major Dense

Line“) des ZNS der Fische zu finden

(Jeserich & Waehneldt, 1986b; Jeserich &

Rauen, 1990). Da rekombinantes 36K mit Phospholipid-Bilayern interagiert

(Diplom-Arbeit W. Moll, 2001) scheint dieses Protein mit der Myelinmembran

assoziiert zu sein.

Abb. 2: Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel von Myelinproteinen aus dem ZNS der Ratte und der Forelle. CNP: 2´, 3´ Cyclisches Nukleotid 3´-Phospho-diesterase, PLP: Proteolipid Protein, (L/S) BP: (large/small) Basisches Protein, IP: Intermediär Protein. Aus Neuron-Glia Interrelations during phylogony: I. Phylogeny and Ontogeny of Glial Cells, A. Vernadaktis & B. Roots, Eds. Humana Press Inc., Totowa, Nj

-2-

1. EINLEITUNG

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Immunologische Untersuchungen zeigten, dass 36K mit keinem der polyklonalen

Antikörper gegen eines der bekannten Myelinproteine reagierte. Ebenso zeigten

erste Datenbank-Analysen überraschenderweise keine Homologien zu den

Myelinproteinen, sondern zu den NAD(P)(H)-abhängigen Oxidoreduktasen

(Dissertation Strelau, 1997). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde versucht

über einen Dehydrogenase-Assay sowohl eine entsprechende Aktivität als auch ein

mögliches Substrat zu identifizieren. Alternativ wurde für das membranassoziierte

36K, das neben IP1 & 2 und Basischen Myelinprotein (MBP) eines der

Hauptmyelinproteine im ZNS der Fische darstellt (vgl. Abbildung 2), eine Funktion als

Strukturprotein innerhalb der „Major Dense Line“ vermutet. In diesem

Zusammenhang ist die von Blaurock et al. (1986) festgestellte strukturelle Dynamik

der Myelinlamellen im Fisch-ZNS zu erwähnen. Blaurocks Experimente zeigten

erstmals, dass es unter bestimmten physiologischen Bedingungen zu einer

Veränderung der Abstände innerhalb der Myelinlamellen und damit zu einer

Auflockerung des scheinbar starren Myelins kam. In wie weit 36K dabei eine Rolle

spielen könnte, wurde sowohl mit Hilfe von Liposomen als auch mit isoliertem

ZNS-Myelin untersucht. Aufgrund der Sequenzähnlichkeiten von 36K zu den

NAD(P)(H)-abhängigen Oxidoreduktasen wurde dabei auch die Beeinflussbarkeit

durch Nukleotide geprüft. Dieser Einfluss könnte auf Konformationsänderungen

basieren, die wiederum mit biophysikalischen Methoden analysiert wurden. Die

beschriebene Myelindynamik könnte auch das Resultat eines koordinierten

Zusammenspiels einiger, eventuell komplexierter Myelinproteine sein. Im Rahmen

dieser Dissertation wurde deshalb erstmals versucht, Protein-Komplexe aus dem

ZNS-Myelin nativ aufzutrennen und deren Komponenten zu identifizieren.

2. MATERIAL UND METHODEN

2. Material und Methoden

2.1 Material Soweit nicht anders vermerkt, wurden alle Chemikalien von der Fa. Roth (Karlsruhe)

in p. A.-Qualität bezogen.

2.1.1 Bakterienstämme

STAMM GENOM

E. coli BL21(DE3)/pLysS E. coli B F- dcm ompT hsdS(rB-mB

- galλ(DE3[pLysS Camr]

2.1.2 Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) Vom Forellenzuchtbetrieb Lindhorst-Emme (Stukenbrock) wurden 3-4 cm lange

Jungfische bezogen und in den hauseigenen Aquarien bei ca. 8-10°C gehalten.

2.2 Methoden

2.2.1 Computerunterstützte Aminosäure-Sequenzanalysen Die aus der 36K-cDNA resultierende Aminosäure-Sequenz (Diplom-Arbeit W. Moll,

2001) wurde mit Hilfe des JPred-Internet-Servers (University of Dundee,

Dundee, UK) auf vorhandene Sekundärstruktur-Motive untersucht (Cuff et al., 1998).

Die Protein-Datenbank-Recherche wurde mit dem BLAST-Internet-Server

(Altschul et al., 1990; Madden et al., 1996) durchgeführt und Sequenzähnlichkeiten

zwischen 36K und homologen Proteinen mit MultAlin, Version 5.4.1, (Corpet, 1988)

analysiert. Das resultierende Alignment wurde mit dem Computerprogramm

GeneDoc, Version 2.6.002, bearbeitet.

Mit dem SWISS-MODEL-Server (Guex und Peitsch, 1997) und dem

SwissPdb-Viewer, Version 3.7, wurde eine mögliche Tertiärstruktur der N-terminalen

Hälfte von 36K (L39 – V186) modelliert.

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2.2.2 Animpfen einer Bakterien-Über-Nacht-Kultur (ÜK) Zu Beginn dieser Arbeit lag die für das 36K-Protein codierende cDNA im

prokaryotischen Expressionsvektor pET23a(+) (Fa. Novagen, Schwalbach/Ts.) in

E. coli als –80°C-Dauerkultur vor (Diplom-Arbeit W. Moll, 2001). Um das Protein

heterolog zu exprimieren, wurden pro 500 ml Expressionsansatz 5 ml ÜK angelegt.

In sterile Kulturröhrchen wurde mit entsprechenden Antibiotika versetztes

LB-Medium (1% (w/v) Bacto-Trypton, 0.5% (w/v) Hefe-Extrakt; Fa. Otto Nordwald,

Hamburg; 1% (w/v) NaCl) gegeben und Bakterien aus der Dauerkultur überimpft. Die

Inkubation erfolgte über Nacht bei 37°C im Rüttler (180 rpm).

2.2.3 Heterologe Expression mit E. coli/pET-System (Fa. Novagen) Die heterologe Expression in E. coli/pET-System erfolgte im Wesentlichen nach

Protokoll des Herstellers (Fa. Novagen, Schwalbach/Ts.).

Der pET23a(+)-Vektor trägt unter der Kontrolle des induzierbaren

Bakteriophagenpromotors T7 eine Nukleotidsequenz, die für 6 aufeinanderfolgende

Histidine codiert. Durch Klonierung des Zielproteins unter Beachtung des

Leserahmens in den distalen Polylinker entsteht bei Expression eine c-terminale

„His6-Tag“-Zielprotein-Fusion, mit der dieses Fusionsprotein durch Ni2+-chelatierende

Sepharose (Affinitätschromatographie) aufgereinigt werden kann.

Zur heterologen Expression wurden 500 ml LBamp/cam-Medium (Endkonz.: 100 µg/ml

Ampicillin; 34 µg/ml Chloramphenicol) mit einer ÜK aus 2.2.2 angeimpft und bei 37°C

im Schikanekolben inkubiert (180 rpm). Bei einer OD600 von 0.7 bis 0.8 wurde mit

IPTG (Endkonz. 100 mM) die Translation induziert und für weitere 2 h bei 16°C

inkubiert. Nach dieser Zeit wurden die Zellen pelletiert (15 Minuten, 5000xg, 4°C), in

Lyse-Puffer (20 mM Tris/HCl pH 8, 500 mM NaCl) resuspendiert und ggf. bis zur

weiteren Verarbeitung bei –80°C gelagert (Moll et al., 2003).

2.2.4 Affinitätschromatographie mit Ni2+-chelatierender Sepharose Die Affinitätschromatographie mit Ni2+-chelatierender Sepharose wurde unter nativen

Bedingungen durchgeführt. Sie erfolgte nach einem modifizierten Protokoll des

Herstellers (His-Bind Kit, Fa. Novagen, Schwalbach/Ts.).

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Die resuspendierten Bakterien wurden bis zur Zelllyse sonifiziert und zur Pelletierung

der unlöslichen Bestandteile und Zelltrümmer für 30 min bei 16000xg und 4°C

zentrifugiert. Der filtrierte (0.42 µm-Filter) Überstand wurde auf eine mit Nickelsulfat

(NiSO4) geladene (Charge-Buffer mit 50 mM NiSO4) und mit Binding-Buffer

(20 mM Tris/HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 50 mM Imidazol) equilibrierte His-Bind

Sepharose-Säule (Fa. Novagen, Schwalbach/Ts.) gegeben. Das anschließende

Säulenwaschen erfolgte mit 10fachem Säulenbettvolumen Binding-Buffer und

13fachem Säulenbettvolumen Wash-Buffer (Lysepuffer mit 100 mM Imidazol). Das

Zielprotein wurde mit 3fachem Bettvolumen Elution-Buffer (Lyse-Puffer mit

150 mM Imidazol) von der Säule gelöst. In das Auffanggefäß vorgegebenes EDTA

(Endkonzentration 2 mM) komplexierte ausgewaschene Nickelionen. Vor der Dialyse

(Dialyseschläuche Fa. Serva, Heidelberg) gegen 100fach Volumen PBS-

(50 mM Na-/K-Phosphat, pH 7.4, 150 mM NaCl) oder Tris-Puffer (30 mM Tris/HCl,

pH 7.4, 150 mM NaCl) und vor jedem Experiment wurde die Proteinlösung zur

Entfernung von 36K-Aggregaten und sonstigen Partikeln ultrazentrifugiert

(30 Minuten, 200000xg, 4°C).

Die elektrophoretische Analyse durch SDS-PAGE (2.2.5) zeigte nach Anfärbung der

Proteine (2.2.6 oder 2.2.7) in der Elutionsfraktion eine einzige Bande mit dem

erwarteten Molekulargewicht. Im Western Blot (2.2.8 & 2.2.9) reagierte die Bande

eindeutig mit polyklonalen Antikörpern gegen das native Protein (Jeserich und

Waehneldt, 1986b; Moll et al., 2003). Die Protein-Konzentrationsbestimmung über

die Absorption von aromatischen Aminosäure-Resten bei 280 nm (Warburg-Formel;

Layne, 1957) zeigte, dass rekombinantes 36K-Protein im Milligramm-Maßstab

aufgereinigt werden konnte.

2.2.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (nach Laemmli) Zur analytischen Proteingelelektrophorese nach Laemmli (1970) wurde zunächst das

Trenngel mit entsprechender Acrylamid-Endkonzentration (12 bis 15% (v/v) aus

37.5:1 Acrylamid/Bisacrylamid-Fertiglösung), 1/1000 Volumen TEMED,

1/400 Volumen Ammoniumpersulfatlösung (10% (w/v)), 0.375 M Tris/HCl pH 8.8,

1% (w/v) SDS im Hoefer Mighty Small Gelcaster (Amersham Biosciences, Freiburg)

gegossen und mit Isopropanol überschichtet.

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Nach Polymerisation wurde das Isopropanol abgegossen, kurz mit Wasser gespült,

das 5%ige Sammelgel (wie Trenngel mit 0.375 M Tris/HCl, pH 6.8) eingefüllt und ein

Teflonkamm eingeführt. Die Proteinproben wurden vor dem Auftragen mit

Laemmlipuffer (0.125 mM Tris/HCl pH 6.8, 2% (w/v) SDS, 6% (w/v) Glycerin,

10% (v/v) ß-Mercaptoethanol), 0.4 mM Bromphenolblau) versetzt und für

5 min aufgekocht. Die Elektrophorese erfolgte bei 60 Volt im Sammelgel und

180 Volt im Trenngel. Nach Auslaufen der Bromphenolblaufront aus dem Trenngel

wurden die Proteinbanden nach 2.2.6, 2.2.7 oder 2.2.8 sichtbar gemacht.

2.2.6 Proteinanfärbung mit Coomassie-Lösung Zum Anfärben der Proteine wurde das SDS-PAGE-Gel aus 2.2.5 in Coomassie-

Lösung (0.1% (w/v) Brillant blue R250 in 500 ml Methanol, 75 ml Essigsäure, 425 ml

Aqua dest.) gegeben und mindestens 1 Stunde geschwenkt. Durch Aufkochen in

Aqua dest. (30 Min.) oder Schwenken in Entfärberlösung (7.5% (v/v) Essigsäure,

7.5% (v/v) Methanol, 5% (v/v) Glycerin) konnte überschüssiger Farbstoff entfernt

werden. Das Gel wurde nach Stabilisierung in Geltrocknungslösung

(22% (v/v) Ethanol, 1% (v/v) Methanol, 1% (v/v) Isopropanol, 2% (v/v) Glycerin) in

Zellophanfolie (Fa. Deti, Meckesheim) eingeschweißt und über Nacht getrocknet.

2.2.7 Proteinanfärbung durch Silberfärbung Für die Silberfärbung wurde das SDS-PAGE-Gel zunächst für mindestens

15 Minuten in Fixierer (45% (v/v) Methanol, 10% (v/v) Essigsäure, 45% (v/v) Aqua

dest.) geschwenkt. Nach zweiminütiger Inkubation in „Farmers Reducer“

(0.03 M K3[Fe(CN)6], 0.032 M Na2S2O3) wurde das Gel mit Aqua dest. gewaschen

bis der gelbe Hintergrund verschwunden war. Die Anfärbung der Proteine erfolgte im

0.1% (v/v)-Silbernitrat-Bad (30 min.). Nach je zweimaligem Waschen mit A. dest.

(30 sec.) und 2.5% (v/v) Na2CO3-Lösung (30 sec.) folgte die Entwicklung in

Formaldehyd-Lösung (0.4% (v/v) in 2.5% (v/v) Na2CO3-Lösung) bis die

Proteinbanden zu sehen waren. Die Reaktion wurde mit 10% (v/v) Essigsäure

gestoppt. Das Gel wurde nach Stabilisierung in Geltrocknungslösung (22% (v/v)

Ethanol, 1% (v/v) Methanol, 1% (v/v) Isopropanol, 2% (v/v) Glycerin) in

Zellophanfolie (Fa. Deti, Meckesheim) eingeschweißt und über Nacht getrocknet.

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Zur Reduzierung des Hintergrundes bzw. zum Entfärben von silbergefärbten

SDS-PAGE-Gelen wurde die Lösung A (15% (w/v) Na2S2O3, 1.2% (w/v)

Thioharnstoff in Aqua dest.) und Lösung B (5% (w/v) K3[Fe(CN)6]) in Verhältnis 1:1

gemischt. Je nach Grad der Abschwächung wurde die Misch-Lösung mit 2 (stark)

oder 4 (mäßig) Volumenteilen Aqua dest. versetzt und das Gel bis zur gewünschten

Entfärbung darin geschwenkt. Anschließend wurde das Gel unter häufigem

Wasserwechsel in Aqua dest. gewässert bis der gelbliche Hintergrund vollständig

verschwunden war.

2.2.8 Proteintransfer auf Nitrozellulose- oder Polyvinylidenfluorid- (PVDF-) Membran (Western-Blot)

Es wurden drei Lagen Blotpapier (Fa. Whatman, Bruchsal) in Größe des zu

blottenden Gels in Transferpuffer (25 mM Tris/HCl, pH 8.0, 20 mM Glycin,

20% (v/v) Methanol) getränkt und auf die Anode der Semi-Dry-Blotting Apparatur

(Fa. Phase, Lübeck) gelegt. Darüber wurde ein gleich großes mit Transferpuffer

getränktes Stück Nitrozellulose- (Fa. Schleicher & Schuell, Dassel) oder

Polyvinylidenfluorid- (PVDF-) Membran (Fa. Amersham Biosciences, Freiburg)

luftblasenfrei aufgelegt. Das darüber gelegte SDS-PAGE-Gel wurde vorher kurz in

Transferpuffer equilibriert und mit weiteren drei Lagen getränktem Blotpapier

blasenfrei bedeckt. Die Kathode der Blotkammer wurde auf das Sandwich gelegt und

mit ca. 1 kg beschwert. Der Protein-Transfer erfolgte bei 150 mA pro SDS-PAGE-Gel

(max. 25 V) für 1.5 h. Die auf die Membran transferierten Proteine wurden durch

Schwenken in Ponceau-S-Lösung (0.1% (w/v) Ponceau-S, 5% (v/v) Essigsäure)

reversibel angefärbt und überschüssige Ponceau-S-Lösung mit Aqua. dest. entfernt.

Der Größenstandard wurde vor der Protein-Entfärbung mit TBST (10 mM Tris/HCl

pH 8.0; 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) Tween-20) und anschließendem immuno-

logischen Protein-Nachweis (nach 2.2.9) mit dem Skalpell abgetrennt.

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2.2.9 Immunologischer Nachweis von Proteinen auf Nitrozellulose- oder Polyvinylidenfluorid- (PVDF-) Membran

Um unspezifische Antikörperbindung zu vermeiden, wurde die proteintragende

Nitrozellulose- bzw. Polyvinylidenfluorid- (PVDF-) Membran aus 2.2.8 für 30 min in

TBST/Gelatine (10 mM Tris/HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) Tween-20,

0.3% (w/v) Gelatine) geschwenkt. Nach 1 bis 2 Stunden Inkubation mit

entsprechenden Antikörpern (verdünnt in TSBT/Gelatine) und 6x5 minütigem

Waschen der Membran mit TBST/Gelatine wurde der sekundäre

Meerrettich-Peroxidase gekoppelte Antikörper (ebenfalls verdünnt in TBST/Gelatine)

für 1 Stunde dazugegeben. Überschüssige Antikörper wurden durch abschließendes

Waschen der Membran in TBS (10 mM Tris/HCl pH 8.0 150 mM NaCl) entfernt. Die

Peroxidase gekoppelten Antikörper wurden mit Hilfe von Chemoluminiszenz auf

ECL-Film (Fa. Amersham Pharmacia, Freiburg) sichtbar gemacht.

2.2.10 Fern-UV-Circulardichroismus-Spektroskopie (CD-Spektroskopie) von rekombinantem 36K in Lösung

Die Fern-UV-Circulardichroismus-Spektroskopie (CD-Spektroskopie) wurde mit

einem Jasco J-600 Spektropolarimeter bei 20°C durchgeführt. Dazu wurden bei einer

Integrationszeit von 50 nm/s drei Spektren von je 0.12 mg/ml (3 µM) rekombinantem

36K (2.2.2 - 2.2.4) in PBS (50 mM Na/K-Phosphat, 150 mM NaCl, pH 7.4) über einen

Wellenlängen-Bereich von 185 bis 260 nm gemittelt. Die path length der Küvette

(Hellma, Müllheim) betrug 1 mm. Der Anteil von α-Helices, β-Faltblättern, β-Turns

und ungeordneter Strukturen („random coil“) wurde mit dem Computer-Programm

CDNN, Version 2.1 kalkuliert. Dabei wurde das erhaltene CD-Spektrum mit denen

von Proteinen mit bekannter Sekundärstruktur verglichen (Böhm et al., 1992). Der

Einfluss von Nukleotiden auf die Sekundärstruktur-Verteilung wurde durch Zugabe

von 0.6 mM NAD, NADP oder deren reduzierter Formen untersucht.

-9-


2.2.11 Tryptophan-Fluoreszenz-Studien von rekombinantem 36K in Lösung In der Primärstruktur von 36K (3.1.2) befinden sich 6 Tryptophane. Deren

Fluoreszenz nach Erregung bei 280 nm wurde mit einem SLM-Aminco

8100-Spektrometer (Fa. Polytec, Waldbronn) bei 4°C und einer Spaltbreite von 8 mm

gemessen. Dazu wurde 2 µM rekombinantes 36K in PBS pH 7.4

(50 mM Na/K-Phosphat, 150 mM NaCl) (2.2.2 - 2.2.4) in eine Quarzküvette

(Fa. Hellma, Müllheim) gegeben und Fluoreszenz-Spektren (300 bis 370 nm)

aufgenommen. Hinweise auf Konformationsänderungen sollten aufgrund von

Fluoreszenzlöschung nach Zugabe von 0.2 bzw. 0.4 mM Nukleotide erhalten

werden.

Nach Kd=[Nukl.]*(∆Fmax-∆F)*(∆F)-1 (Lin et al., 1997) wurden die jeweiligen

apparenten Dissoziationskonstanten berechnet, wobei für Fmax die größte

gemessene Fluoreszenzreduktion bei 0.4 mM NADH angenommen wurde.

2.2.12 Elektronenspin-Resonanz-Spektroskopie (ESR-Spektroskopie) rekombinantem 36K in Lösung

Die ESR-Spektroskopie wurde in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. H.-J. Steinhoff

(AG Experimentelle Physik, Universität Osnabrück) durchgeführt. Zum Einfügen des

Nitroxid-Spinlabels (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolin-3-methyl)-Methanthiosulfonat

(MTS, Fa. Toronto Research Chemicals, Kanada) über die Sulfhydrylgruppen der

beiden einzigen im Protein vorhandenen Cystein-Reste wurde die sonifizierte

Bakteriensuspension aus 2.2.3 filtriert (0.45 µm) und auf eine nach 2.2.4 vorbereitete

His-Bind Sepharose-Säule (Fa. Novagen, Schwalbach/Ts.) gegeben. Nach Waschen

mit 10 bzw. 8fachem Säulenbettvolumen Binding-Buffer (20 mM Tris/HCl, pH 8.0,

500 mM NaCl, 50 mM Imidazol) und Wash-Buffer (20 mM Tris/HCl, pH 8.0,

500 mM NaCl, 100 mM Imidazol) wurde 0.15 mM (~10fach molare

Proteinkonzentration auf Säule) MTS aus einer 10 mM Stock-Lösung (in DMSO) in

6 ml Wash-Buffer zu dem gebundenen rekombinanten 36K gegeben und die

Sepharose über Nacht bei 4°C geschwenkt. Nach Waschen mit weiteren

7 Bettvolumen Wash-Buffer wurde MTS-gelabeltes 36K (36K-MTS) wie unter 2.2.4

beschrieben von der Säule eluiert und gegen 100fach PBS pH 7.4

(50 mM Na/K-Phosphat, 150 mM NaCl) dialysiert.

-10-


Für die ESR-Spektroskopie wurde das Protein mit Centriprep-Säulen (Fa. Millipore,

Schwalbach/Ts.) nach Vorschrift des Herstellers auf mindestens 10 µM (0.4 mg/ml)

konzentriert und vor jeder Messung ultrazentrifugiert (30 Minuten, 200000xg, 4°C).

Das ESR-Spektrum wurde von Prof. Dr. H.-J. Steinhoff aufgenommen.

2.2.13 Röntgenkleinwinkelstreuung von rekombinantem 36K in Lösung Die Röntgenkleinwinkeldaten von rekombinantem 36K in Lösung (2.2.2 - 2.2.4)

wurden von PD Dr. G. Grüber (Inst. f. Biophysik, Universität des Saarlandes,

Homburg/Saar) aufgenommen und mit Hilfe des Programms DAMMIN ausgewertet.

2.2.14 Assoziation von rekombinantem 36K an phospholipidbeschichtete Silica-Kügelchen („TRANSIL“; Fa. Nimbus, Leipzig)

Die mit einem Phosphatidylcholin- (PC-) Bilayer beschichteten Transil-Kügelchen

wurden von Firma Nimbus (Leipzig) synthetisiert. Vor der Bindung von

rekombinantem 36K an die PC-Membran, wurden 2 µl der 50%igen

Transil-Suspension (111 µM PC) zunächst zweimal in 200 µl PBS pH 7.4

(50 mM Na/K-Phosphat, 150 mM NaCl) aufgenommen und bei Raumtemperatur (RT)

5 Minuten mit 3000xg zentrifugiert.

Zu den gewaschenen Kügelchen wurde 16 µM rekombinantes 36K (2.2.2 - 2.2.4)

gegeben (200 µl) und 1 Stunde bei RT unter Schütteln (500 rpm) inkubiert.

Anschließend wurden die Kügelchen pelletiert (5 Minuten, 3000xg, RT) und zum

Entfernen von nicht membranassoziiertem Protein zweimal mit PBS gewaschen. Für

die SDS-PAGE wurden die Membranen mit 2% SDS aufgelöst (15 Minuten, 500 rpm,

RT) und die Elektrophorese mit anschließender Proteinfärbung wie unter 2.2.5 und

2.2.6 beschrieben durchgeführt.

-11-


2.2.15 Kontrollierter proteolytischer Verdau von rekombinantem 36K mit Trypsin (Fa. Sigma-Aldrich, München)

Der kontrollierte proteolytische Verdau von rekombinantem 36K (2.2.2 - 2.2.4) wurde

statt bei (für Typsin) optimalen 37°C bei 30°C durchgeführt. Unter definierten 36K- zu

Trypsin-Verhältnissen (50:1, 500:1) wurde das Protein zwischen 0 und 20 Minuten

unter leichtem Schütteln (450 rpm) in PBS pH 7.4 (50 mM Na/K-Phosphat,

150 mM NaCl) trypsinisiert und die Reaktion nach entsprechender Zeit mit

8 mM Pefabloc (Fa. Serva, Heidelberg) gestoppt. Zur Identifizierung von

Trypsinisierungsstellen, die durch eine Membranassoziation geschützt sind, wurde

rekombinantes 36K vor dem proteolytischen Verdau an einen PC-Bilayer

(„TRANSIL“) gebunden (2.2.14) und nach Entfernen von nicht-assoziiertem Protein

einer Trypsinisierung ausgesetzt. Die entstandenen Fragmente wurden über

SDS-PAGE (2.2.5) aufgetrennt und mit Coomassie-Färbung (2.2.6) sichtbar

gemacht.

2.2.16 Chemische Spaltung von rekombinantem 36K mit 2-Nitro-5-Thiocyanobenzonsäure (NTCB)

NTCB (Fa. Sigma-Aldrich, München) spaltet Proteine chemisch an freien

Thiol-Resten (Jacobson et al., 1973; Bähler et al., 1989). Um zu prüfen, ob die 2 in

der Primärstruktur von 36K vorhandenen Cystein-Reste als Thiole vorliegen, wurde

5 mM NTCB (aus 40 mM NTCB in 50 mM Na/K-Phosphat pH 7.6) zu

13 µM (0.5 mg/ml) rekombinantem 36K (2.2.2 - 2.2.4) in PBS pH 7.4

(50 mM Na/K-Phosphat, 150 mM NaCl) gegeben und im Dunkeln für bis zu

48 Stunden bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von Laemmlipuffer (0.125 mM Tris/HCl

pH 6.8, 2% (w/v) SDS, 6% (w/v) Glycerin, 10% (v/v) ß-Mercaptoethanol,

0.4 mM Bromphenolblau) wurde die Reaktion durch das vorhandene

ß-Mercaptoethanol gestoppt und die Reaktionslösung für die SDS-PAGE (2.2.5)

vorbereitet.

Für die Spaltung von membranassoziiertem 36K wurde das Protein zunächst an

einen PC-Bilayer („TRANSIL“) gebunden (2.2.14) und nach Entfernen von

nicht-assoziiertem Protein der NTCB-Spaltung ausgesetzt. Die Spaltprodukte wurden

nach der SDS-PAGE (2.2.5) mit Coomassie-Färbung sichtbar gemacht (2.2.6).

-12-


2.2.17 Random-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (Random-FRET)-Untersuchungen von membranassoziiertem rekombinanten 36K

Für die Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Untersuchungen wurden

von der Fa. Nimbus (Leipzig) Silica-Kügelchen hergestellt, die mit einem Bilayer aus

Phosphatidylcholin (PC) und 1 mol% 7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-yl-Gruppe-PC

(NBD-PC) beschichtet waren. Dabei war das als Fluoreszenz-Donor fungierende

NBD an das Ende je einer Fettsäurekette fusioniert. Wie bei der Einfügung des

Nitroxid-Spinlabels für die ESR-Spektroskopie (2.2.12), wurde als

Fluoreszenz-Akzeptor QSY® 7 Maleimid (Fa. MoBiTec, Göttingen) im Laufe der

affinitätschromatographischen Aufreinigung über die 2 im Protein vorhandenen

Cystein-Reste in das rekombinante 36K (2.2.2 - 2.2.4) gebracht. Dazu wurden

0.25 mM QSY® 7 Maleimid (~ 10fach molare Proteinkonzentration auf Säule) aus

einer 10 mM Stocklösung (in DMSO) zu 6 ml Wash-Buffer (20 mM Tris/HCl pH 8.0,

500 mM NaCl, 100 mM Imidazol) gegeben und über Nacht bei 4°C mit dem an die

NiSO4-Sepharose gebundenen rekombinanten 36K geschwenkt. Nach Waschen mit

weiteren 7 Bettvolumen Wash-Buffer wurde QSY-markiertes 36K (36K-QSY) wie

unter 2.2.4 beschrieben von der Säule eluiert, gegen 100fach PBS pH 7.4

(50 mM Na/K-Phosphat, 150 mM NaCl) dialysiert und vor jeder Messung

ultrazentrifugiert (30 Minuten, 200000xg, 4°C).

Zur Bestimmung des spektralen Überlappungsintegrals (Jda=Σ(Fd*εa*λ4)/ΣFd;

Fd: Donor-Fluoreszenz, εa: molarer Extinktionskoeffizient vom Akzeptor [M-1*cm-1], λ:

Wellenlänge [nm]) und dem daraus resultierenden Förster-Abstand R0

(R0=[(8.79*10-5)*(κ2*n-4*Qd*Jda)] 1/6 Å; Wu, P. & Brand, L., 1994) wurde mit Hilfe eines

Shimadzu UV-2501 PC Zweistrahlphotomerters (Fa. Shimadzu Deutschland,

Duisburg) ein Absorptionsspektrum vom Akzeptor (36K-QSY) sowie mit einem

SLM-Aminco 8100-Spektrometer (Fa. Polytec, Waldbronn) ein Emissionsspektrum

vom Donor (NBD-PC) in PBS pH 7.4 (50 mM Na/K-Phosphat, 150 mM NaCl)

aufgenommen. Für die Berechnung von R0 wurde für den

Dipol-Dipol-Orientierungsfaktor (κ2) 2/3 (Wu, P. & Brand, L., 1994), für den

Brechungsindex des Mediums (n) 1.4 und für die Quantenausbeute von NBD in

Membranen in Abwesenheit des Akzeptors (Qd) 0.32 (Chattopadhyay, A., 1990)

angenommen.

-13-


Um die Energietransfer-Effizienz (Fluoreszenz-Reduktion des NDB durch

ausreichende Annäherung des proteingebundenen Akzeptors; Wu, P. & Brand, L.,

1994; Szöllősi et al., 2002) zwischen den Chromophoren zu bestimmen, wurde

rekombinantes 36K (2.2.2 - 2.2.4) bzw. 36K-QSY wie unter 2.2.14 beschrieben mit

dem PC/NBD-PC-Bilayer assoziiert, nicht gebundene Proteine ausgewaschen und

die NBD-Fluoreszenz-Spektren nach Erregung bei 467 nm aufgenommen. Mit Hilfe

des Computerprogramms Mathcad 2001 Professional (MathSoft, München) wurden

minimal mögliche Abstände zwischen Donor und Akzeptor bei verschiedenen

vertikalen Abständen mit der von Fung und Stryer ermittelten (1978)

Integral-Gleichung kalkuliert. Aufgrund des großen Durchmessers der

Silica-Kügelchen konnte dabei von einem planaren Bilayer ausgegangen werden.

2.2.18 Isolieren von Myelin aus ZNS der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss)

Zum Isolieren von Myelin aus dem ZNS der Regenbogenforelle wurden

800 mg Gesamthirn von 3 bis 8 cm langen Forellen in 10 ml 0.2 M eiskalter

Sucrose-Lösung homogenisiert und je 5 ml auf auf ein 0.6 M Sucrose-Bett (7 ml)

geschichtet. Nach der Zentrifugation in einem Ausschwingrotor (1 Stunde, 100000xg,

4°C) wurde das weiße Myelin in der Grenzschicht zwischen den Sucrose-Lösungen

entnommen, in 10 ml Eiswasser transferiert und in einem Festwinkelrotor erneut

zentrifugiert (10 Minuten, 8500xg, 4°C). Das pelletierte Myelin wurde noch 3 mal in

Eiswasser resuspendiert, zentrifugiert und schließlich bis zur Weiterverarbeitung bei

–80°C eingefroren.

2.2.19 Herstellen einer 5%igen (w/v) Digitonin-Stammlösung und Myelinprotein-Extraktion mit Digitonin

Eine 5% (maximale Löslichkeit) entsprechende Menge des Detergenzes Digitonin

(Merck, Schwalbach/Ts.) wurde in 98°C heißem Aqua dest. aufgenommen,

15 Minuten gekocht und anschließend bei 4°C mindestens 30 Minuten abkühlen

lassen. Aus dieser Stammlösung wurden die bei der im Folgenden beschriebenen

Myelinprotein-Extraktion verwendeten Digitonin-Puffer hergestellt.

-14-


Das nach 2.2.18 isolierte ZNS-Myelin wurde zunächst in je 100 µl 0.5% (w/v) und

1% (w/v) Digitonin (in 20 mM Tris/HCl pH 7.4, 0.1 mM EDTA, 50 mM NaCl,

10% (v/v) Glycerin, 1 mM PMSF) resuspendiert, für 10 Minuten bei Raumtemperatur

(RT) inkubiert und anschließend zentrifugiert (25000xg, 15 Minuten, 4°C). Zur

Extraktion der Myelinproteine wurde das resultierende (Myelin-)Pellet zweimal in je

100 µl 4% (w/v) Digitonin-Puffer aufgenommen, 10 Minuten bei RT inkubiert und die

nicht solubilisierten Membranen bei 25000xg, 15 Minuten, 4°C pelletiert. Der

Überstand mit den gelösten Proteinen wurde abgenommen und die

Protein-Konzentration mit einem Amidoschwarz-Tüpfel-Test (2.2.20) bestimmt.

2.2.20 Protein-Konzentrationsbestimmung mit Amidoschwarz-Tüpfel-Test Zur Bestimmung der Protein-Konzentration wurde 1 µl Proteinlösung auf eine

Nitroacetat-Membran gegeben und für 2 Minuten in Amidoschwarzlösung

(0.5% (w/v) Amidoschwarz in 90% (v/v) Methanol, 10% (v/v) Essigsäure) gebadet.

Überschüssiger Farbstoff wurde im Methanol/Essigsäure-Bad (9:1) entfernt und die

Proteinkonzentration mit Hilfe einer BSA-Eichreihe bestimmt.

2.2.21 Messung einer Dehydrogenase-Aktivität im isolierten ZNS-Myelin der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss)

Nach Cammer et al. (1982) wurde die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Aktivität

im isolierten Myelin bestimmt. Dabei wird das bei der Umwandlung von

Glucose-6-Phosphat zu 6-Phosphoglucono-δ-lacton aus der Reduktion von NADP

entstehende NADPH durch die Absorptionszunahme bei 320 nm nachgewiesen.

Es wurden 3 µl nach 2.2.18 isoliertes Fisch-ZNS-Myelin (resuspendiert in

200 µl 30 mM Tris/HCl, pH 7.4) in Reaktionspuffer (30 mM Tris/HCl pH 7.4,

6.25 mM MgCl2, 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM Glucose-6-Phosphat) gegeben und die

Reaktion nach 20 Minuten Vor-Inkubation (Absorptionsabnahme durch Triton X-100)

mit 0.1 mM NADP (zur Kontrolle NADPH) gestartet. Die Zunahme der Absorption bei

320 nm (Biophotometer Fa. Eppendorf, Hamburg) wurde über die Zeit beobachtet

und die Aktivität nach (A320/t)*(Vtotal/6.22)*(1/VMyelin) [µmol/min/mg] berechnet.

-15-


Zur Untersuchung einer Dehydrogenase-Aktivität von myelininternem 36K wurde der

beschriebene Ansatz ohne Glucose-6-Phosphat im Reaktionspuffer durchgeführt.

Dazu wurde eine mögliche Reaktion mit Myelinkomponenten als Substrat mit

0.1 mM Nukleotiden gestartet.

Zur Verstärkung der potentiellen Dehydrogenase-Aktivität wurden nach Vor-

Inkubation in 30 mM Tris/HCl pH 7.4, 6.25 mM MgCl2, 1% (v/v) Triton X-100 und

0.1 mM Nukleotide als Reaktionsstart 80 µg/ml rekombinantes 36K (2.2.2 - 2.2.4)

zugegeben und die Absorption bei 320 nm über die Zeit verfolgt.

2.2.22 Herstellung von Phosphatidylcholin/Phosphatidylethanolamin-Liposomen

Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidylethanolamin (PE) stellen die

Hauptphospholipide im ZNS-Myelin der Forellen dar. Zur Herstellung von großen,

mulitlamellaren Vesikeln (large multilamellar vesicles, LMV) wurden

75% (w/v) Phosphatidylcholin und 25% (w/v) Phosphatidylethanolamin (in

Chloroform; Fa. Larodan, Schweden) zusammengegeben und das Chloroform unter

einem Stickstoff-Strahl verblasen. Der entstandene Lipidfilm wurde mit mind.

74°C (Tm von PE) heißem Tris-Puffer (30 mM Tris/HCl pH 7.4, 150 mM NaCl) für

1 Stunde unter starkem Rühren rehydriert und die Liposomen-Suspension (~1.3 mM)

bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.

2.2.23 Aggregationsassay von Phosphatidylcholin (PC)/Phosphatidyl-ethanolamin/(PE)-Liposomen mit rekombinantem 36K

Nach de la Fuente und Parra (1995), Lee und Pollard (1997) und Stieglitz et al.

(2001) wurden 0.1 mM PC/PE-Liposomen aus 2.2.22 mit 0.4 mg/ml rekombinantem

36K in Tris-Puffer (30 mM Tris/HCl pH 7.4, 150 mM NaCl) (2.2.2 - 2.2.4) versetzt und

die Absorption bei 320 nm (Biophotometer Fa. Eppendorf, Hamburg) über die Zeit

beobachtet. Um den Einfluss von Nukleotiden zu untersuchen, wurde entweder

0.1 mM NAD, NADP oder deren reduzierte Formen zu dem Ansatz gegeben.

-16-


2.2.24 Blue-Native Gradienten-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (BN-PAGE) (1. Dimension)

Nach Schägger & von Jagow (1991), Schägger et al. (1994) und Brookes et al.

(2002) wurden die nach 2.2.18 aus der Myelin-Membran extrahierten Proteine bzw.

Protein-Komplexe über ein natives Gradienten-Polyacrylamidgel elektrophoretisch

aufgetrennt. Dazu wurde mit Hilfe einer Hoefer Mighty Small Gradientengelcaster

(Amersham Biosciences, Freiburg), in dem eine ~1 cm Isopropanol-Schicht

vorgegeben wurde, ein 6-16%iges Polyacrylamid-Trenngel (6 bzw.

16% Acrylamid/Bisacrylamid aus 24:1-Stocklösung, 500 mM Aminocapronsäure,

50 mM Bis-Tris pH 7.0, 10% (w/v) Glycerin, 1/400 Volumen

Ammoniumpersulfatlösung (10% (w/v)) und 1/4000 Volumen TEMED gegossen.

Nach der Polymerisation wurde der Alkohol entfernt, vorsichtig mit Wasser gespült

und nach Auffüllen mit 4%iger Sammelgel-Lösung (4% Acrylamid/Bisacrylamid aus

24:1-Stocklösung, 500 mM Aminocapronsäure, 50 mM Bis-Tris pH 7.0,

10% (w/v) Glycerin, 1/125 Volumen Ammoniumpersulfatlösung (10% (w/v)) und

1/1250 Volumen TEMED) gegossen ein Teflonkamm eingefügt. Die Proteinproben

wurden auf 0.8 mg/ml verdünnt, mit BN-Probenpuffer (0.25% (w/v) Brillant Blue G250

in 25 mM Aminocapronsäure) versetzt und kurz vor dem Auftragen zentrifugiert

(2 Minuten, 10000xg, 4°C). Die nötige negative Ladung wurde durch den Farbstoff

Brillant Blue G250 an die Proteine gebracht. Aufgrund der daraus resultierenden

elektrischen Abstoßung wurde außerdem die Aggregation der Proteine im Gel

verhindert. Um dieses während der gesamten Elektrophorese-Dauer zu

gewährleisten, wurde zum Kathoden-Puffer (15 mM Bis-Tris pH 7.0, 50 mM Tricine)

0.02% (w/v) Brilliant Blue G250 geben, das nach der Hälfte der Elektrophorese auf

0.01% (w/v) reduziert werden konnte. Zu der Anode wurde ein Puffer aus

50 mM Bis-Tris pH 7.0 gegeben.

Die Elektrophorese wurde bei 4°C mit 40 Volt gestartet und nach Eintritt der

Farbstoff-Front in das Sammelgel auf 110 Volt erhöht. Nachdem die Front den

Anoden-Puffer erreicht hatte, wurde das Gel zur Proteinanfärbung in einem

Coomassie-Bad (Brilliant Blue R250) (2.2.6) geschwenkt.

-17-


2.2.25 SDS-PAGE der durch BN-PAGE aufgetrennten Myelinprotein-Komplexe (2. Dimension)

Zur Analyse der Protein-Zusammensetzung der durch BN-PAGE (1. Dimension)

(2.2.24) aufgetrennten Komplexe wurde entweder die gesamte Spur oder die

Komplexe mit einem scharfen Skalpell aus dem Gel geschnitten. Diese wurden auf

die Aluminium-Platte der Elektrophorese-Einrichtung gelegt und zum Einbringen der

nötigen negativen Ladung an die Protein bzw. zum Hydrolysieren von

Disulfid-Brücken für 2 Stunden mit 1% (w/v) SDS/1% (v/v) β-Mercaptoethanol

überschichtet. Im Anschluss wurde wie unter 2.2.5 beschrieben ein Trenngel und ein

dünnes Sammelgel bis ~0.5 cm unter die Gel-Fragmente gegossen. Diese wurden in

0.8% Agarose eingebettet und die Elektrophorese unter den üblichen Bedingungen

durchgeführt. Durch Silberfärbung wurden die aufgetrennten Proteine schließlich

sichtbar gemacht (2.2.7).

2.2.26 Separation der Myelin-Proteinkomplexe mit ProFound-Co-Immunopräzipitation Kit (Perbio Science, Bonn)

Mit Hilfe der entsprechenden polyklonalen Antikörper wurden die mit 36K, IP2 und

MBP assoziierten Proteine mit dem ProFound-Co-Immunopräzipitation Kit

(Perbio Science, Bonn) separiert. Dabei wurde im Wesentlichen nach Vorschrift des

Herstellers verfahren. Die Seren wurden mit 400 µl „Coupling Buffer“ 1/80 verdünnt,

zu 100 µl Matrix (aus 200 µl Suspension) gegeben und nach Zugabe von

1 µl 5 M Natrium-Cyanoborohydrid für 5 Stunden inkubiert. Zur längeren

Aufbewahrung der Antikörper-tragenden Matrix bei 4°C in „Coupling Buffer“ wurde

Natriumazid (Endkonzentration 0.02% (w/v)) zu der Suspension (400 µl) gegeben.

Für die Co-Immunopräzipitation wurden die Antikörper-Matrix-Suspensionen zum

entfernen des Lagerungspuffers zentrifugiert (1 Minute, 4000xg, RT) und mit der auf

400 µl verdünnten Protein-Extraktion (2.2.18) resuspendiert. Nach 3-stündiger

Inkubation bei RT in einem Überkopftaumler wurde der Ansatz erneut zentrifugiert

und nicht gebundene Proteine durch viermaliges Waschen in 300 µl gefolgt von

einmaligem Waschen in 100 µl Extraktionspuffer (4% Digitonin (w/v) in

20 mM Tris/HCl pH 7.4, 0.1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 10% (v/v) Glycerin,

1 mM PMSF) entfernt.

-18-


-19-

Die mit den Antikörpern assoziierten Proteine bzw. Protein-Komplexe wurden durch

dreimalige Inkubation mit „Elution-Buffer“ (5 Minuten, 750 rpm, RT) abgelöst und

durch Zentrifugation (1 Minute, 4000xg, RT) separiert. Die Proteinlösung wurde mit

Laemmli-Puffer (0.125 mM Tris/HCl pH 6.8, 2% (w/v) SDS, 6% (w/v) Glycerin,

10% (v/v) ß-Mercaptoethanol, 0.4 mM Bromphenolblau) versetzt und einer

SDS-PAGE (2.2.5) unterzogen. Mit Hilfe einer Silberfärbung (2.2.7) wurden die

auftrennten Proteine sichtbar gemacht und die Gele anschließend zur Aufbewahrung

in Zellophanfolie eingeschweißt.

3. ERGEBNISSE

-20-

3. ERGEBNISSE

3.1 COMPUTERUNTERSTÜTZTE ANALYSE DER 36K-AMINOSÄURE-SEQUENZ

Zu Beginn dieser Arbeit lag die vollständige, exprimierbare cDNA des Myelinproteins

36K als Bakteriendauerkultur vor (Diplom-Arbeit W. Moll, 2001). Die daraus

resultierende Sequenz von 325 Aminosäuren wurde für die folgenden

computergestützten Sequenz-Analysen verwendet.

3.1.1 Homologie-Alignment der Aminosäure-Sequenzen von 36K und Proteinen aus der Reduktase/Epimerase/Oxidoreduktase Superfamilie (RED)

Datenbank-Analysen mit dem BLAST-Internet-Server (Altschul et al., 1990; Madden

et al., 1996) der 36K-Aminosäure-Sequenz (2.2.1) zeigten keine signifikanten

Homologien zu allen bisher bekannten Myelinproteinen. Stattdessen gab es deutliche

Sequenzähnlichkeiten zu Proteinen aus der Reduktase/Epimerase/Oxidoreduktase

Superfamilie (RED) (Labesse et al., 1994; Kallberg et al., 2002). Abbildung 1 zeigt

ein Homologie-Alignment (2.2.1) der Aminosäure-Sequenzen von 36K und einem

humanen Protein unbekannter Funktion (FLJ13639), Retinol Dehydrogenasen von

Mensch (RDH 11) und Maus (UBE-1b) sowie der bereits kristallisierten

Carbonyl Reduktase vom Aal (Tanaka et al., 1996) und der

20-β-Hydroxysteriod-Dehydrogenase vom Zebrafisch (Gosh et al., 1991). Besonders

im N-terminalen Bereich, in dem sich auch das für die REDs charakteristische

Nukleotid-Bindemotif (GXXXGXG) befindet, stimmen die Aminosäuren abgesehen

vom FLJ13639 signifikant überein (Moll et al., 2003). Trotz abnehmender

Übereinstimmungen im Kern- und C-terminalen Bereich scheinen typische

Sequenzmotive der REDs im Bereich der Substrat-Bindtasche (YXXXK, PGXXXT)

zwischen 36K, FLJ13639, UBE-1b und RDH11 konserviert zu sein. Diese Motive

sind bei der Carbonyl Reduktase und der 20-β-Hydroxysteriod-Dehydrogenase durch

das Alignment in Richtung C-Terminus verschoben, können aber vermutlich trotzdem

als konserviert betrachtet werden. Ein Hinweis auf eine potentielles Substrat von 36K

konnte daraus nicht erhalten werden.

3. ERGEBNISSE

-21-

Aufgrund dieser signifikanten Motif-Übereinstimmungen könnte 36K in die

Reduktase/Epimerase/Oxidoreduktase Superfamilie eingeordnet werden. Nach den

Kriterien von Kallberg et al. (2002) wäre dieses Myelinprotein eine „klassische

Kurzkettige Dehydrogenase/Reduktase (SDR)“.

Abb. 1: Computerunterstützter Aminosäuresequenz-Vergleich (1-Buchstaben-Code) von 36K mitFLJ13639 (Protein unbekannter Funktion vom Menschen; Q9H8H1), UBE-1b (Maus RetinolDehydrogenase; Q9R1R8), RDH11 (Retinol Dehydrogenase vom Menschen; Q8TC12), CarbRed(Carbonyl Reduktase vom Aal; Q90X71) und Steroid-DH (20 β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase vomZebrafisch; Q9DF44). Swissprot-TrEMBL-Dateinummern sind kursiv angegeben; Aminosäure-Nummerierung beginnend vom N-Terminus; identische/ähnliche Aminosäuren sind schwarz markiert.

3. ERGEBNISSE

3.1.2 Sekundärstruktur-Vorhersage des 36K-Proteins mit dem JPred-Internet-Server

Mit Hilfe des JPred-Internet-Servers (2.2.1), der die Vorhersagen von

6 verschiedenen Algorithmen verarbeitet (Cuff et al., 1998) wurde eine

Sekundärstruktur-Analyse des 36K-Proteins durchgeführt. Abbildung 2 zeigt die

36K-cDNA-Sequenz (Moll et al., 2003) und die daraus abgeleitete Primärstruktur aus

325 Aminosäuren mit der vorhergesagten Sekundärstruktur.

1 M G N S T M S L Y R N S A 1 ATG GGT AAT TCA ACG ATG TCT CTT TAC CGC AAC TCC GCG

14 W F L K G M T E F T R S A 40 TGG TTT CTG AAA GGA ATG ACT GAA TTC ACC AGG AGT GCG

27 F L S A A K H F V E K D L 79 TTC CTG TCT GCA GCC AAG CAC TTT GTG GAA AAG GAC CTG

40 E V S M A G R V F M I T G 118 GAA GTG TCC ATG GCA GGC AGG GTC TTC ATG ATC ACT GGA

53 A N S G I G R A T A M A I 157 GCC AAC AGT GGC ATA GGG AGA GCT ACA GCC ATG GCC ATC

66 A K R G G T V H M V C R N 196 GCC AAG AGA GGT GGT ACA GTC CAC ATG GTG TGC AGG AAC

79 K D K A E E A R A D I V K 235 AAG GAT AAA GCA GAG GAG GCC AGG GCT GAC ATT GTC AAG

92 E S G N K E I Y V H I L D 274 GAG TCA GGA AAT AAA GAA ATA TAT GTC CAC ATT CTG GAC

105 L S E T R K V W E F A E A 313 CTA TCA GAG ACA CGG AAG GTT TGG GAA TTT GCA GAG GCC

118 F K R K Y K V L N L L I N 352 TTC AAG AGG AAG TAC AAA GTC TTG AAT TTA CTG ATA AAT

131 N A G C I M S E R D V N A 391 AAT GCA GGC TGC ATC ATG AGT GAG AGG GAT GTG AAC GCT

144 E G L E K S F A S N V M G 430 GAG GGG CTG GAG AAG AGC TTT GCC AGT AAC GTC ATG GGT

157 V Y I L T R G L I P L L E 469 GTG TAT ATC CTG ACC AGG GGA CTG ATT CCC TTA CTG GAG 170 K S A E P R V I T V S S G 508 AAG AGT GCA GAG CCC AGA GTG ATC ACA GTT TCA TCT GGA

183 G M L V Q K L R T G N L Q 547 GGG ATG CTG GTC CAG AAG CTG AGG ACA GGG AAC CTG CAA

-22-

3. ERGEBNISSE

-23-

Demnach besteht das Protein aus alternierenden α-Helices (10) und β-Faltblättern

(7) (βαβ-Struktur). Diese sogenannte „Rossmann fold“ (Rossmann et al., 1974) ist

charakteristisch für Proteine aus der Reduktase/Epimerase/Oxidoreduktase

Superfamilie (RED). Wie bei den Proteinen aus dieser Familie ist das

Nukleotid-Bindemotif (GXXXGXG) zwischen dem ersten β-Faltblatt und der

darauffolgenden α-Helix lokalisiert (Moll et al., 2003).

Abb.2: cDNA-Nukleotidsequenz und daraus abgeleitete Aminosäuresequenz von 36Kmit Sekundärstruktur-Vorhersage nach JPret. ROT: α-Helices, GELB: β-Faltblätter.

196 T E I G R Y D G T M V Y A 586 ACA GAA ATA GGC CGC TAT GAC GGG ACC ATG GTC TAC GCA

209 Q H K R Q Q V V M T E Q W 625 CAG CAC AAG AGG CAA CAG GTG GTG ATG ACA GAG CAG TGG

222 A Q T H S N I H F S V M H 664 GCC CAA ACC CAT AGC AAC ATC CAC TTC TCA GTG ATG CAT

235 P G W V D T P A V A N A M 703 CCT GGC TGG GTG GAC ACA CCA GCG GTG GCC AAT GCC ATG

248 P D F H Q S M K D S L R T 742 CCT GAC TTC CAC CAG TCT ATG AAG GAC AGC CTG AGG ACC

261 P E Q G A D T V V W L A I 781 CCG GAG CAG GGG GCT GAC ACC GTG GTG TGG TTG GCC ATC

274 S E A A A T K P S G S F F 820 TCA GAA GCC GCC GCC ACC AAG CCC AGC GGA AGC TTC TTC

287 Q D R R M V S A H L P L A 859 CAG GAT CGG AGG ATG GTG TCG GCC CAC CTG CCC CTG GCC

300 W T H S S Q L E Q Q K F M 898 TGG ACC CAC AGT TCC CAG TTG GAG CAG CAG AAG TTC ATG

313 S V M E D L A K T F Q P H 937 AGT GTG ATG GAG GAT CTG GCC AAG ACC TTC CAG CCC CAC

326 * 976 TGA

3. ERGEBNISSE

-24-

3.1.3 3-dimensionales Modell des N-terminalen Teils von 36K Aus der in Abbildung 2 dargestellten 36K-Aminosäuresequenz konnte mit Hilfe des

SWISS-MODELL-Servers (Guex und Peitsch, 1997) und des SWISS-pdb-Viewer 3.7

ein 3-dimensionales Modell des N-terminalen Teils von 36K erzeugt werden.

Abbildung 3 zeigt den modellierten Teil des Proteins zwischen L39 und V186, der

nach 3.1.1 starke Homologien zu Proteinen aus der RED-Superfamilie aufweist. Das

dargestellte Molekül hat eine sehr geordnete Struktur mit β-Faltblättern im Zentrum

und α-Helices in der Peripherie. Das eingezeichnete Nukleotid-Bindemotif liegt in

einer „Tasche“ zwischen einem β-Faltblatt und der darauffolgenden α-Helix. Das

Modell bestätigt für den N-terminalen Teil von 36K die Sekundärstruktur-Vorhersage

aus 3.1.2 und zeigt die für REDs charakteristische βαβ-Struktur („Rossmann fold“)

(Rossmann et al., 1974).

Abb. 3: Struktur-Modell des N-terminalen Teils von 36K (L39 bis V186)modelliert mit SWISS-pdb-Viewer 3.7 zeigt βαβ-Struktur (Rossmann fold).ROT: α-Helices und GELB: β-Faltblätter. Putatives Nukleotid-BindmotifGXXXGXG ist angezeigt. α-Helix-Nummerierungen entsprechendSekundärstruktur-Vorhersage aus 3.1.2

3. ERGEBNISSE

-25-

3.2 UNTERSUCHUNG DER SEKUNDÄRSTRUKTURZUSAMMENSETZUNG DES REKOMBINANTEN 36K-PROTEINS MITTELS FERN-UV-CIRCULAR-DICHROISMUS-SPEKTROSKOPIE (CD-SPEKTROSKOPIE)

Zur Analyse der Sekundärstrukturzusammensetzung von 36K in Lösung wurde eine

Fern-UV-Circulardichroismus-Spektroskopie (CD-Spektroskopie) durchgeführt. Dabei

ergibt die Differenz der Absorptionen von links- und rechtscircular polarisiertem Licht

in Bezug zur Wellenlänge ein CD-Spektrum, dass Voraussagen zur

Sekundärstrukturzusammensetzung erlaubt. Dazu wurde mit 0.12 mg/ml (3 µM)

rekombinantem 36K in PBS pH 7.4 (2.2.2 - 2.2.4) wie unter 2.2.10 beschrieben das

in Abbildung 4A dargestellte gemittelte Spektrum aufgenommen. Dieses zeigt ein

Minimum bei 219 nm und ein Maximum bei 195 nm, was auf eine größtenteils

α-helicale Struktur des Proteins hindeutet (Yang et al., 1986).

Die Auswertung dieses UV-Spektrums mit Hilfe des Computerprogramms CDNN

(Böhm et al., 1992) ergab für das rekombinante 36K in Lösung die in Abbildung 4B

dargestellte Sekundärstrukturzusammensetzung von 35% ± 2% α-Helix,

12% ± 2% β-Faltblatt, 17% ± 2% β-Turn und 36% ± 2% ungeordnete Strukturen

(„random coil“). Dies steht in gutem Einklang mit den computergestützten

Vorhersagen aus 3.1.2 und 3.1.3, nach denen das Protein einen hohen Anteil

α-helicaler Strukturen aufweist.

Abb. 4: Sekundärstruktur-Zusammensetzung von rek. 36K nach CD-Spektroskopie.A: Fern-UV-CD-Spektrum in 50 mM PBS (150 mM NaCl) pH 7.4. B: Prozentuale Verteilung derSekundärstrukturen kalkuliert nach Böhm et al. (1992)

A B

3. ERGEBNISSE

3.3 RÖNTGENKLEINWINKELSTREUUNG VON REKOMBINANTEM 36K IN LÖSUNG

Die umhüllende Struktur des 36K-Proteins wurde in Kooperation mit

PD Dr. G. Grüber (Institut für Biophysik, Universität des Saarlandes, Homburg/Saar)

über Röntgenkleinwinkelstreuung von rekombinantem 36K in Lösung (2.2.2 - 2.2.4)

untersucht. Mit Hilfe des Programms DAMMIN konnte aus den gewonnenen

Streudaten die Quartärstruktur des Moleküls bestimmt werden. In Lösung hat das

36K-Protein demnach eine Länge von ~9 nm und setzt sich aus 2 Domänen mit den

Dimensionen von ~4 x 3 nm und ~5 x 4 nm zusammen (Abbildung 5). Mit BSA als

Referenzmolekül konnte eine apparente Molekularmasse von 35 ± 2 kD bestimmt

werden. In Zukunft soll rekombinantes 36K ebenfalls in Kooperation mit

PD Dr. G. Grüber kristallisiert werden, um über Röntgenstreuungsstudien eine

atomare Struktur des Moleküls zu erhalten.

Abb. 5: Die umhüllende Struktur des 36K-Proteins abgeleitet aus nach Röntgenkleinwinkeldaten; Studiewurde von PD Dr. G. Grüber (Inst. f. Biophysik,Universität des Saarlandes, Homburg/Saar)durchgeführt

-26-

3. ERGEBNISSE

-27-

3.4 UNTERSUCHUNGEN ZUR FUNKTION VON 36K

3.4.1 Messung der Dehydrogenase-Aktivität im isolierten Myelin Um die aus den Untersuchungen 3.1 und 3.2 erhaltenen Hinweise auf eine mögliche

Reduktase/Epimerase/Oxidoreduktase-Funktion von 36K zu prüfen, wurde zunächst

als Referenz die intrinsische Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Aktivität im

isolierten Forellen-Myelin (2.2.18) nach Cammer et al. (1982) bestimmt. Wie unter

2.2.21 beschrieben wurde dazu die durch das Auftreten von reduzierten Nukleotiden

bedingte Zunahme der Absorption bei 320 nm gemessen. Die Aktivität der

Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase wurde anhand der Reduktion von NADP bei

der Umwandlung von Glucose-6-Phosphat zu 6-Phosphoglucono-δ-lacton bestimmt

(Abbildung 6). Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0.1 mM NADP gestartet (zur

Kontrolle NADPH). Die daraus resultierende Aktivität von ~7 nmol/min/mg stimmte

mit den von Cammer et al. erhaltenen Werten gut überein. Es war also möglich unter

den beschriebenen Bedingungen myelininterne Dehydrogenase-Aktivitäten zu

messen.

Abb. 6: Untersuchung einer Dehydrogenase-Aktivität von 36K inisoliertem Forellen-Myelin in 30 mM Tris/HCl pH 7.4, 6.25 mM MgClB2B,±1 mM Glucose-6-Phosphat, 1% Triton X-100. Myelinkomponentenwurden als potentielle Substrate angenommen Die Reaktionen wurdennach 20 Minuten Vor-Inkubation mit 0.1 mM Nukleotiden gestartet. ZurKontrolle wurde die intrinsische Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase(Glc-6-P-DH)-Aktivität bestimmt.

3. ERGEBNISSE

-28-

36K stellt eines der Hauptmyelinproteine in ZNS der Regenbogenforelle dar

(Abbildung 23). Wenn es dort als Dehydrogenase fungiert, müsste die

entsprechende Aktivität ähnlich wie die der myelininternen Glucose-6-Phosphat-

Dehydrogenase zu messen sein. Aufgrund der Homologien von 36K zur

Carbonyl Reduktase und zur 20-β-Hydroxysteriod-Dehydrogenase (3.1.1) könnten

Myelinlipide als potentielle Substrate in Frage kommen. Deshalb wurde das

beschriebene Dehydrogenase-Assay ohne die Zugabe von Glucose-6-Phosphat

durchgeführt (2.2.21). Abbildung 6 zeigt deutlich, dass sich die Absorptionen im

Vergleich zu der von der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Reaktion kaum

ändern. Die Zugabe von rekombinantem 36K (2.2.2 - 2.2.4) zu der Myelinsuspension

führte zu dem in Abbildung 7 dargestellten Absorptionsverhalten, das nicht durch das

vermehrte Auftreten von reduzierten Nukleotiden zu erklären war. 36K bewirkte einen

Anstieg der Absorption, der durch NADP bzw. NADPH verlangsamt bzw. sogar

verhindert wurde. NAD und NADH beeinflussten die Zunahme nicht. Somit konnte

weder myelinintern noch durch Zugabe von rekombinantem Protein eine

Dehydrogenase-Aktivität von 36K im isolierten Myelin nachgewiesen werden.

Vielmehr schien es in der in der Myelin-Suspension zu einer durch

NADP(H)-beeinflussbaren 36K-bedingten Micellen- oder Liposomen-Aggregation zu

kommen, die unabhängig vom Oxidationsstatus der Nukleotide war.

Abb. 7: Untersuchung der Dehydrogenase-Aktivität nach Zugabe von80 µg/ml rek. 36K und 0.1 mM Nukleotiden zu isoliertem Forellen-Myelinin 30 mM Tris/HCl pH 7.4, 6.25 mM MgClB2B, 1% Triton X-100.Reaktionsstart durch Zugabe von rek. 36K nach 20 MinutenVor-Inkubation

3. ERGEBNISSE

3.4.2 Aggregationsassay von Phosphatidylcholin (PC)/Phosphatidyl-ethanolamin (PE)-Liposomen mit rekombinantem 36K

Nach den Ergebnissen aus 3.4.1 konnte für 36K keine Dehydrogenase-Aktivität

festgestellt werden. Da 36K mit einem PC-Bilayer interagiert (Diplom-Arbeit W. Moll,

2001), wäre stattdessen eine strukturelle Funktion innerhalb der cytosolischen

Apposition („Major Dense Line”) im ZNS-Myelin der Fische denkbar. Um dies zu

prüfen, wurden 0.1 mM Phosphatidylcholin (PC)/Phosphatidylethanolamin

(PE)-Liposomen (2.2.22) in Tris-Puffer pH 7.4 mit 0.4 mg/ml rekombinantem 36K

(2.2.2 - 2.2.4) versetzt und die Absorption der Liposomen-Suspension bei 320 nm

über die Zeit verfolgt (2.2.23) (de la Fuente und Parra., 1995; Lee und Pollard, 1997;

Stieglitz et al., 2001). Abbildung 8A zeigt, dass die Absorption nach ca. 90 Minuten

kontinuierlich ansteigt, was auf ein vermehrtes Auftreten von aggregierten

Liposomen schließen läßt. Die Selbstaggregation von 36K bzw. der Liposomen (nicht

gezeigt) bleibt dagegen konstant gering. Desweiteren geht aus Abbildung 8A hervor,

dass die Zugabe von Nukleotiden deutliche Absorptionsänderungen hervorrief. Wie

bei den Experimenten mit isoliertem Fisch-ZNS-Myelin (3.4.2) schienen NADP und

NADPH die Aggregation zu unterbinden, während NAD und NADH diese hier sogar

förderten. Ebenso könnte ein größerer bzw. kleinerer Abstand zwischen aggregierten

Liposomen die unterschiedliche Absorption hervorgerufen haben. Der

Oxidationsstatus der Nukleotide spielte dabei offensichtlich keine Rolle. In Abbildung

8B sind die Absorptionsänderungen nach 330 Minuten gegenüber der Aggregation

ohne Nukleotide prozentual dargestellt. NAD(H) bewirkt demnach eine Zunahme von

30-40%, während NADP(H) die Absorption um 20-35% senkt. Die durch Nukleotide

beeinflußbare Absorption der Liposomen-Suspension und die Experimente mit

isoliertem Fischmyelin (3.4.1) deuten auf eine NADP(H)-regulierte Funktion von 36K

an bzw. zwischen Lipidmembranen hin. Bereits 1986 haben Blaurock et al. in

Röntgenkleinwinkelstreuungsstudien am Fisch-ZNS-Myelin beobachtet, dass es

unter bestimmten physiologischen Bedingungen zu einer reversiblen Erweiterung der

cytosolischen Aposition („Major Dense Line”) kam. Die beschriebenen

Aggregationsassays legen die Vermutung nahe, dass 36K eine Rolle als

nukleotidregulierter molekularer Schalter bei dieser „strukturellen Dynamik“ des

kompakten ZNS-Myelins spielen könnte.

-29-

3. ERGEBNISSE

B

A

Abb.8: Aggregation-Assay von 0.1 mM PC/PE-Liposomen und 0.4 mg/ml rek. 36K in30mM Tris/HCl pH7.4, 150mM NaCl, 1mM CaCl2. A: Einfluß von Nukleotiden (je 0.1 mM).B: Prozentuale Veränderung nach 330 Minuten.

-30-

3. ERGEBNISSE

3.5 EINFLUSS VON NUKLEOTIDEN AUF DIE KONFORMATION DES REKOMBINANTEN 36K-PROTEINS

Trotz der Sequenzähnlichkeiten, insbesondere durch das Nukleotid-Bindmotif, zu

den REDs konnte mit den Experimenten in 3.4 für 36K keine

Dehydrogenase-Aktivität nachgewiesen werden. Inwieweit das Protein mit

Nukleotiden interagiert und ob diese Wechselwirkung möglicherweise die

Konformation beeinflußt, wurde mit den folgenden Experimenten untersucht.

3.5.1 Tryptophan-Fluoreszenz-Spektren von rekombinantem 36K ± Nukleotide in Lösung

Die 6 Tryptophane in der Aminosäuresequenz von 36K ermöglichen über

Änderungen im Fluoreszenzspektrum die Untersuchung von

Konformationsänderungen des Proteins. Daher wurde nach 2.2.11 von

2 µM rekombinantem 36K in PBS pH 7.4 (2.2.2 - 2.2.4) das in Abbildung 9

dargestellte gemittelte Fluoreszenzspektrum (Tryptophan-Erregung bei 280 nm)

aufgenommen.

Abb. 9: Tryptophanfluoreszenz-Spektrum von 2µM rek. 36K in50 mM PBS (150 mM NaCl) pH 7.4 ± 0.2 mM Nukleotide.Tryptophan-Erregung bei 280nm

-31-

3. ERGEBNISSE

-32-

Die Zugabe von 0.2 mM Nukleotide (100fach) reduzierte die Fluoreszenz deutlich,

was auf eine zunehmende Entfaltung des Proteins hindeutete. Im Gegensatz zu den

Ergebnissen aus den Aggregationsassays (3.4.2) gab es hier Unterschiede zwischen

den oxidierten und reduzierten Formen. NAD und NADP verringerten die

Fluoreszenz um ca. die Hälfte, während NADH und NADPH diese fast vollständig

reduzierten. Die daraus resultierenden apparenten Dissoziationskonstanten (K Bd B) von

~140 µM für NAD, ~100 µM für NADP und ~30 µM für NADH bzw. NADPH wurden

nach KBd B=[Nukl.]*(∆FBmaxB-∆F)*(∆F)P

-1P (Lin et al., 1997) berechnet, wobei für FBmaxB die

größte gemessene Fluoreszenzreduktion bei 0.4 mM NADH angenommen wurde.

Aus diesem Grund sollten die berechneten K Bd B´s lediglich als Richtwerte angesehen

werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass 36K mit Nukleotiden wechselwirkt und dass

diese Interaktion vermutlich zu Veränderungen in der

Sekundärstrukturzusammensetzung führt, die im Folgenden mittels

Fern-UV-CD-Spektroskopie näher analysiert wurden.

3.5.2 Fern-UV-Circulardichroismus-(CD-) Spetroskopie von rekombinantem 36K ± Nukleotide in Lösung

Die Hinweise aus der Tryptophanfluoreszenz (3.5.1) auf eine nukleotidbedingte

Konformationsänderung von 36K wurden wie in 3.2. über die Analyse der

Sekundärstruktur-Zusammensetzung mit Hilfe der Fern-UV-CD-Spektroskopie näher

untersucht. Dazu wurden von 3 µM rekombinantem 36K (0.12 mg/ml) in PBS pH 7.4

(2.2.2 - 2.2.4) unter Zugabe von 0.6 mM (200fach) der jeweiligen Nukleotide

CD-Spektren aufgenommen. Die Auswertung der gemittelten Spektren mit dem

Programm CDNN (Böhm et al., 1992) ergab die erwarteten deutlichen Änderungen

der Sekundärstruktur-Zusammensetzung und damit der 36K-Konformation. In

Anwesenheit von Nukleotiden nahm der prozentuale Anteil von α-Helices auf Kosten

von β-Faltblättern und ungeordneter Strukturen („random coils“) deutlich ab.

Während sich der α-helicale Anteil unabhängig von der Art des Nukleotids in

gleichem Maße reduzierte (35%± 2% auf 7%± 2%), wurde der random coil-Anteil und

damit der Grad der Entfaltung unterschiedlich stark beeinflusst.

3. ERGEBNISSE

-33-

Wie bei der Tryptophan-Fluoreszenz (3.5.1) spielte dabei der Oxidationsstatus der

Nukleotide eine Rolle. NAD und NADP liessen den Anteil der ungeordneten

Strukturen von 36%± 2% auf ca. 50% ansteigen, während die reduzierten Formen

das Protein weiter entfalteten (ca. 60% random coils). Demnach könnte eine

Funktion des Myelinproteins 36K über nukleotid-regulierte Änderungen der

Konformation stattfinden.

3.5.3 Elektronenspin-Resonanz-Spektroskopie (ESR-Spektroskopie) von rekombinantem 36K ± Nukleotide in Lösung

Inwieweit die durch Tryptophan-Fluoreszenz (3.5.1) und CD-Spektroskopie (3.5.2)

festgestellten starken Konformationsänderungen den Bereich um die

Nukleotid-Bindetasche betreffen, wurde in Kooperation mit Prof. Dr. H.-J. Steinhoff

(AG Experimentelle Physik, Osnabrück) mit Hilfe der Elektronenspin-Resonanz-

Spektroskopie (ESR-Spektroskopie) geprüft. Dabei können über die Absorption von

Mikrowellenstrahlung durch ungepaarte Elektronen im Magnetfeld Rückschlüsse

u. a. zur Mobilität eines proteingebundenen Spinlabels gewonnen werden.

Abb. 10: Einfluß von Nukleotiden (0.6 mM) auf die Sekundärstruktur-Zusammensetzung von rek. 36K (3µM) in 50 mM PBS, pH 7.4 kalkuliert nachBöhm et al. (1992)

3. ERGEBNISSE

-34-

Der Lösung zugewandt, ist ein Spinlabel beweglicher als im Inneren eines Moleküls,

wo dieser durch Wechselwirkungen mit den Aminosäureresten in der Flexibilität

eingeschränkt wird. Eine hohe Mobilität des hier benutzten Nitroxidspinlabels wird

aufgrund des Kernspins des Stickstoffs durch 3 deutliche Maxima im ESR-Spektrum

angezeigt (Hubbel et al., 2000; Steinhoff, H.-J., 2002). Wie unter 2.2.12 beschrieben,

sollten unter Verwendung von (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolin-3-methyl)-

Methanthiosulfonat-Spinlabel (MTSSL, Fa. Toronto Research Chemicals, Kanada)

über die Sulfhydrylgruppen der 2 im Protein vorhandenen Cystein-Reste

(C76 und C134) Nitroxid-Seitenketten in das rekombinante 36K-Molekül eingefügt

werden. Aus dem resultierenden Absorptionsspektrum von 26µM rekombinantem

MTS-markierten 36K in PBS pH 7.4 konnte bestimmt werden, dass durchschnittlich

ein Cystein-Rest pro Molekül 36K mit dem MTSSL markiert wurde. Um zu

untersuchen, ob C76 oder C134 mit dem Spinlabel reagiert hatte, wurde nach 2.2.16

eine chemische Spaltung mit NTCB, das Proteine ausschließlich an reduzierten

Cysteinen spaltet, durchgeführt (vgl. 3.6.3). Das in Abbildung 11B dargestellte

coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gel (2.2.5 & 2.2.6) zeigt neben dem ungespaltenen

Protein (Pfeil 1) ein Fragment von ca. 30 kD (Pfeil 2), dessen abgespaltener Teil

(ca. 8 kD) aus dem Gel gelaufen war. Aufgrund des Molekulargewichts konnten

diese Spaltprodukte nur aus der Spaltung am nicht-modifizierten C76, das demnach

als Thiol vorlag, resultieren. Eine Spaltung am zweiten Cystein-Rest (C134) war nach

dessen Reaktion mit dem Methanthiosulfonat-Spinlabel nicht mehr möglich. Nach der

Sekundärstruktur-Vorhersage (3.1.2) und dem 3D-Modell des N-Terminus (3.1.3) ist

dieser Cystein-Rest zwischen dem vierten β-Faltblatt und der sechsten α-Helix im

Bereich der putativen Nukleotid-Bindetasche lokalisiert. Die beiden deutlich

reduzierten Maxima links und rechts neben dem zentralen ESR-Maximun deuten an,

dass der eingefügte MTSSL in seiner Mobilität eingeschränkt war und daher

versteckt innerhalb des Proteins vorlag. In Abbildung 11C ist exemplarisch das

ESR-Spektrum von 26 µM MTS-markiertem 36K in PBS pH 7.4 nach Zugabe von

5 mM NADP (200fach) dargestellt. Der Vergleich zum Spektrum in Abbildung 11A

zeigt deutlich, dass sich die Form des Spektrums und damit die Mobilität des MTSSL

nicht geändert hat. Der Bereich um die Nukleotid-Bindetasche scheint demnach nicht

von den starken Konformationsänderungen des 36K-Proteine unter Nukleotid-

Einfluss betroffen zu sein.

3. ERGEBNISSE

Abb. 11: A. ESR-Spektrum von 26 µM (1mg/ml) rek. MTS-markiertem 36K in 50 mM PBS (150 mM NaCl) pH 7.4. B. Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel einer NTCB-Spaltung von MTS-markiertem rek. 36K. St: Low Molecular Weight Standard (Amersham Biosciences,Freiburg). C. ESR-Spektrum von 26 µM (1mg/ml) rek. MTS-markiertem 36K in PBS (150 mM NaCl), pH 7.4 nach Zugabe von 5 mM NADP (~200fach); * 1. Ableitung derMikrowellenstrahlung im magnetischen Feld

A

C

B

-35-

3. ERGEBNISSE

3.6 UNTERSUCHUNGEN ZUR PENETRATION DES 36K-PROTEINS IN EINEN PHOSPHOLIPID-BILAYER

Vor Beginn dieser Arbeit konnte mit phospholipidbeschichteten Silica-Kügelchen

(„TRANSIL“; Fa. Nimbus, Leipzig) gezeigt werden, dass 36K mit Lipidmembranen

wechselwirkt (Diplom-Arbeit W. Moll, 2001). Mit Hilfe der folgenden Experimente

sollten erste Hinweise zur Membrantopologie von 36K erhalten werden.

3.6.1 Kontrollierter proteolytischer Verdau von membrangebundenem 36K Da die Primärstruktur von 36K viele Arginin- (18) und Lysine-Reste (20) aufweist,

wurde für den kontrollierten Verdau die Protease Trypsin (Fa. Sigma-Aldrich,

München) verwendet. Dazu wurde rekombinantes 36K (0.6 mg/ml) in PBS pH 7.4

(2.2.2 - 2.2.4) mit 1/50 bzw. 1/500 (bezogen auf die eingesetzte 36K-Menge) Trypsin

versetzt und jeweils von 0 bis 20 Minuten bei suboptimaler Temperatur (30°C)

proteolytisch verdaut (2.2.15). Abbildung 12 zeigt das resultierende

Typsinisierungsmuster nach SDS-PAGE und Anfärbung mit Coomassie-Lösung

(2.2.5 & 2.2.6).

Abb. 12: Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel des zeitabhängigenproteolytischen Verdaus von 0.6 mg/ml rek. 36K in PBS (150 mM NaCl)pH 7.4 mit 1/50 und 1/500 Trypsin. WB: Western Blot des 1/50-Verdausnach 0 Minuten. Nachweis mit monoklonalem polyHis-Antikörper.K: rek. 36K ohne Trypsin-Zugabe. St.: Low Molecular Weight Standard(Amersham Biosciences, Freiburg)

-36-

3. ERGEBNISSE

-37-

Unter strengen Bedingungen (50:1, 0 Minuten) entstehen neben dem unverdauten

Protein 2 Hauptfragmente, die aufgrund ihres Molekulargewichtes vermutlich aus der

einfachen Spaltung von 36K resultierten. Mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers

gegen den fusionierten His B6 B-Tag (polyHis-Antikörper) konnte das kleinere Fragment

als C-terminal identifiziert werden (WB in Abbildung 13; 2.2.8 & 2.2.9). Aufgrund des

apparenten Molekulargewichts dieses Fragmentes konnten K211 und/oder R212

(in α-Helix 7) als wahrscheinlichste Spaltstellen angenommen werden. Unter diesen

Bedingungen war rekombinantes 36K bereits nach 5-minütiger Trypsinisierung fast

vollständig proteolytisch verdaut.

Um zu prüfen, welche Proteinteile bzw. welche Spaltstellen nach der

Membranassoziation zugänglich bleiben, wurde 0.15 mg/ml (4 µM) rekombinantes

36K (2.2.2 - 2.2.4) wie unter 2.2.14 beschrieben an phosphatidylcholin-

(PC-)beschichtete Silicakügelchen gebunden und anschließend mit Trypsin

proteolytisch verdaut (1/125, 10 Minuten; 2.2.15). Dabei wurden die 36K-Teile, die

aus dem Bilayer herausragten, von den membrangeschützten Teilen abgetrennt.

Nach Pelletierung der Kügelchen und Auflösen der Membran mit 2% (w/v) SDS

wurden die unverdauten Proteinteile in ¼ Volumen Laemmli-Puffer aufgenommen

und elektrophoretisch (2.2.5) getrennt. Das in Abbildung 13 dargestellte

coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gel

(2.2.6) zeigt neben dem unverdauten

Protein 2 Hauptfragmente um 30 kD,

die mit einem polyHis-Antikörper als

C-Termini identifiziert werden konnten

(2.2.8 & 2.2.9). Mit Hilfe des

Molekulargewichts und des

36K-Modells aus 3.1.3 konnte die

Lage der Schnittstellen im

Molekül bestimmt werden. Demnach

befinden sich die entsprechenden

Arginin- und Lysin-Reste (R59 und

R77/L79) im Bereich des Nukleotid-

Bindemotifs.

Abb. 13: Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel einer Trypsinisierung (500:1, 10 Minuten)von PC-gebundenem rek. 36K.PL: Phospholipid. St.: Low Molecular WeightStandard (Amersham Biosciences, Freiburg)

3. ERGEBNISSE

Dies würde bedeuten, dass die für eine Regulation wichtige putative

Nukleotid-Bindetasche am N-Terminus beim Eintauchen des Moleküls in den

Lipidbilayer vom Cytosol her zugänglich bleibt. Die in Abbildung 13 mit den Pfeilen

1a und 2a markierten Fragmente, die nach Trypsinisierung in Lösung als C-terminal

identifiziert wurden, waren nach Membranassoziation nicht mehr zu finden. Als

korrespondierende Fragmente kämen die mit 1b und 2b angezeigten Spaltprodukte

in Frage (gestrichelte Pfeile). Aufgrund der Lokalisation der entsprechenden

Spaltstellen (K188/R190 bzw. K211/R212) scheint der C-Terminus daher ca. bis zum

V176 in den Bilayer einzutauchen und ist so vor dem proteolytischen Verdau

geschützt.

3.6.2 Einfluß von Nukleotiden auf die Trypsinisierung von membrangebundenem 36K

Die Ergebnisse aus 3.6.1 zusammen mit den nukleotidbedingten Änderungen in der

Sekundärstruktur-Zusammensetzung (3.5) und der Interaktion mit isoliertem

Fisch-Myelin (3.4.1) bzw. Liposomen (3.4.2) legen die Vermutung nahe, dass sich in

die Membran penetrierte Teile des Moleküls aufgrund der beschriebenen

Konformationsänderung aus einem Lipid-Bilayer herausstrecken könnten und

dadurch Arginin- bzw.

Lysin-Reste nicht mehr

vor dem proteolytischen

Verdau geschützt sind.

Dazu wurde wie unter

3.6.1 zunächst der

Einfluss von

3 mM Nukleotiden

(200fach) auf die

Trypsinisierung von

0.6 mg/ml (15 µM)

rekombinantem 36K in

Lösung (PBS pH 7.4)

(2.2.2 - 2.2.4) untersucht.

Abb. 14: Trypsinisierung (500:1, 10 Minuten) von 0.6 mg/ml(15 µM) rek. 36K in 50 mM PBS (150 mM NaCl), pH 7.4± 3 mM Nukleotide. Erläuterungen siehe Text. St.: LowMolecular Weight Standard (Amersham Biosciences,Freiburg)

-38-

3. ERGEBNISSE

-39-

Das in Abbildung 14 dargestellte coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gel (2.2.5 & 2.2.6)

dieses proteolytischen Verdaus (2.2.15) zeigt, dass sich die Trypsinisierungsmuster

in Anwesenheit von NADP und NADPH von den übrigen geringfügig unterscheiden.

Mit Pfeil 1 ist ein bei diesen beiden verstärkt auftretendes Fragment markiert, das bei

einem Verdau ohne Nukleotide und unter NAD(H)-Einfluss weniger stark auftrat.

Gleichzeitig nahm der Anteil an hochmolekularen Fragmenten (Pfeil 2a) etwas ab,

während die Menge eines niedermolekularen Fragmentes (Pfeil 2b) in Anwesenheit

von NADPH zunahm. Im Western Blot mit anschließendem immunologischen

Nachweis (2.2.8 & 2.2.9) reagierte keines dieser Fragmente mit dem

polyHis-Antikörper und erlaubte somit keine exakte Aussage über die betreffenden

Arginin- bzw. Lysin-Reste. Durch den NADP(H)-Einfluß wurden demnach

Trypsin-Schnittstellen in der Aminosäuresequenz mehr oder weniger zugänglich für

den proteolytischen Verdau in Lösung. Im Gegensatz zu den durch

Tryptophan-Fluoreszenz (3.5.1) und CD-Spektroskopie (3.5.2) festgestellten

nukleotidbedingten Konformationsänderungen scheinen Nukleotide demnach kaum

Einfluss auf die Trypsinisierung von rekombinantem 36K zu haben (Abbildung 15).

Die Verteilung der Spaltstellen in der putativen Sekundär- (3.1.2) und Tertiärstruktur

(3.1.3) des Proteins könnte eine Erklärung dafür liefern. 23 der Arginin- und

Lysin-Reste befinden sich nach den Struktur-Vorhersagen in oder direkt an α-Helices

und somit leicht zugänglich in der Peripherie des Moleküls. Weitere 11 Spaltstellen

zwischen α-Helices und β-Faltblättern (incl. R77 in der Nukleotidbindetasche) sind

vermutlich ebenfalls gut für die Protease erreichbar. Lediglich

4 Trypsinisierungsstellen befinden sich in β-Faltblättern im eher schwer zugänglichen

Zentrum des Proteins. Die nukleotidbedingte starke Entfaltung von 36K im Vergleich

zur geringeren Zunahme des β-Faltblatt-Anteils (3.5.2) scheint demnach die bereits

gute Zugänglichkeit der Arginin- und Lysin-Reste des 36K-Moleküls in Lösung nicht

zu verändern.

Inwieweit sich die Zugänglichkeiten bei membrangebundem 36K, dass nach 3.6.1

teilweise in einen Lipidbilayer eingetaucht, durch Nukleotid-Einfluss ändern, wurde im

Folgenden untersucht. Rekombinantes 36K (2.2.2 - 2.2.4) wurde zunächst mit einem

Phosphatidylcholin-(PC-)Bilayer assoziiert (2.2.14) und anschließend in Anwesenheit

von Nukleotiden mit Trypsin (500:1, 10 Minuten) proteolytisch vedaut (2.2.15).

3. ERGEBNISSE

Das coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gel (2.2.5 & 2.2.6) in Abbildung 15 zeigt, dass

sich das Trypsinisierungsmuster von membranassoziiertem 36K in Anwesenheit der

verschiedenen Nukleotide nicht änderte und somit scheinbar keine weiteren

Spaltstellen zugänglich wurden.

Abb. 15: Trypsinisierung (500:1, 10 Minuten) von 0.15 mg/ml (4 µM) rek., membrangebundenem 36K in 50 mM PBS(150 mM NaCl), pH 7.4 ± 3 mM Nukleotide. St.: Low Molecular Weight Standard (Amersham Biosciences, Freiburg)

3.6.3 Spaltung von rekombinantem 36K mit 2-Nitro-5-Thiocyanobenzonsäure (NTCB) in Lösung

2-Nitro-5-Thiocyanobenzonsäure (NTCB) spaltet Proteine chemisch an reduzierten

Cystein-Resten (Jacobson et al., 1973; Bähler et al., 1989). Die 2 in der

Aminosäuresequenz von 36K vorkommenden Cystein-Reste (C76 & C134) liegen

nach dem 3D-Modell (3.1.3) im Bereich der Nukleotid-Bindetasche und räumlich so

nahe beieinander, dass sie eine Disulfidbrücke ausbilden könnten. Bei der

proteolytischen Spaltung von membrangebundenem rekombinanten 36K (3.6.1)

konnten nach Identifizierung von C-Termini und mit Hilfe des apparenten

Molekulargewichts die in Frage kommenden Arginin- und Lysin-Reste benannt

werden, die demnach ebenfalls im Bereich der Nukleotid-Bindetasche lokalisiert

waren.

-40-

3. ERGEBNISSE

Aus diesem Grund müsste eine chemische Spaltung von membrangebundenem 36K

mit NTCB möglich sein, sofern die beiden Cysteine als Thiole vorliegen. Daher wurde

zunächst eine NTCB-Spaltung von rekombinantem 36K in Lösung durchgeführt.

Dazu wurde wie unter 2.2.16 beschrieben 0.5 mg/ml (13 µM) rekombinantes 36K in

PBS pH 7.4 (2.2.2 - 2.2.4) mit 5 µM NTCB inkubiert. Abbildung 16 zeigt das

coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gel (2.2.5 & 2.2.6) dieser chemischen Spaltung mit

unterschiedlichen Inkubationszeiten, bei dem sich die entstandenen Fragmente in

dem erwarteten Molekulargewichtsbereich befinden.

Abb. 16: Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel einer NTCB-Spaltung(5 µM) von 0.5 mg/ml rekombinantem 36K in PBS (150 mM NaCl) pH 7.4nach angegebener Inkubationszeit in Stunden. K: rek. 36K ohne NTCB.WB: Western Blot der Spaltung nach 24h, Nachweis: polyHis-Antikörper.1: Spaltung an C76, 2. Spaltung an C134. St.: Low Molecular WeightStandard (Amersham Biosciences, Freiburg)

Das Spaltprodukt 1a resultiert aus der Spaltung an C76 (1b ist aus dem Gel

gelaufen), während 2a und 2b durch die Spaltung am C134 entstehen. Da zu den

Ansätzen kein Reduktionsmittel wie DTT zugegeben wurde, bilden C76 und C134

offensichtlich keine Disulfid-Brücke aus und liegen daher als Thiole vor. Ein

immunologischer Nachweis mit dem polyHis-Antikörper (2.2.8 & 2.2.9) identifizierte

die Fragmente 1a und 2a erwartungsgemäß als C-Termini (WB). Das Spaltprodukt

2a (C76) befindet sich im gleichen Molekulargewichtsbereich wie das kleinere

C-terminale Fragment aus der Trypsinisierung von membrangebundenem 36K

(3.6.1). Dies unterstützt die Vermutung, dass rekombinantes 36K wahrscheinlich am

R77 oder L79 proteolytisch gespalten wurde. Die Zugabe von 2.6 mM Nukleotide

(200fach) hatte keinen Einfluß auf die Proteinspaltung durch NTCB.

-41-

3. ERGEBNISSE

-42-

3.6.4 Spaltung von membrangebundenem rekombinanten 36K mit 2-Nitro-5-Thiocyanobenzonsäure (NTCB)

Da beide Cystein-Reste im Bereich der Nukleotidbinde-Tasche (Abbildung 3) nach

3.6.3 als Thiole vorliegen und dieser Bereich nach den Trypsinisierungsstudien

beim teilweisen Eintauchen von 36K in den PC-Bilayer zugänglich bleibt

(3.6.1 & 3.6.2), müsste eine NTCB-Spaltung von membrangebundenem 36K möglich

sein. Dazu wurde wie unter 2.2.14 beschrieben rekombinantes 36K (2.2.2 - 2.2.4)

zuerst durch Inkubation mit phosphatidylcholin-

beschichteten Transilkügelchen mit dem

PC-Bilayer assoziiert (vgl. 3.6.1) und

anschließend 5 mM NTCB zugegeben (2.2.16).

Verglichen mit der Spaltung von rekombinantem

36K in Lösung (3.6.3, Abbildung 16) zeigt das

coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gel (2.2.5 &

2.2.6) in Abbildung 17 die erwarteten

Fragmente. Wie beim proteolytischen Verdau

(3.6.1) war die Spaltung des in den PC-Bilayer

penetrierten Proteins durch NTCB ebenfalls

möglich. Da beide Cystein-Reste im Bereich der

putativen Nukleotid-Bindetasche lokalisiert sind,

scheint diese beim membranassoziierten 36K

von der Lösung her zugänglich zu bleiben.

3.6.5 Random-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer- (Random-FRET-) Untersuchung zwischen rekombinantem 36K-QSY und 7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-yl-Phosphatidylcholin (NBD-PC)

Mit Hilfe von Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-(FRET-) Untersuchungen

(Wu, P. & Brand, L., 1994; Szöllősi et al., 2002) wurden die aus den

Spaltungsexperimenten erhaltenen Hinweise zur Topologie von 36K bei der

Membranassoziation näher untersucht.

Abb. 17: Coomassie-gefärbtesSDS-PAGE-Gel der NTCB-Spaltung von membran-gebundenem rek. 36K in50 mM PBS (150 mM NaCl)pH 7.4. PL: Phospholipid.St.: Low Molecular WeightStandard (AmershamBiosciences, Freiburg)

3. ERGEBNISSE

-43-

Dazu sollten über die von Fung und Stryer (1978) ermittelten Beziehungen zwischen

der Energietransfer-Effizienz, der Oberflächen-Akzeptordichte σ, der

Donor-Lebenszeit in Abwesenheit des Akzeptors τ B0 B, dem Abstand zweier Donoren in

unterschiedlichen Membranhälften und dem Förster-Abstand RB0 B (Förster, 1949) die

horizontalen und vertikalen Abstände zwischen einem an das Ende einer

Fettsäurekette fusionierten Fluoreszenz-Donor (7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-yl-

Gruppe, NBD) und einem in 36K eingefügten -Akzeptor (QSY®7 Maleimid;

Fa. MoBiTec, Göttingen) kalkuliert werden. Fa. Nimbus (Leipzig) synthetisierte

Phosphatidylcholin- (PC)-beschichteten Silica-Kügelchen („TRANSIL“), bei denen

1 mol% der Phospholipide mit NBD markiert waren. Dabei ist zu berücksichtigen,

dass sich der NBD-Fluorophor aufgrund seiner Polarität und der hohen Flexibilität

der Fettsäureketten aus dem hydrophoben Kern des Lipid-Bilayers zurück an die

Membranoberfläche (unterhalb der Phosphat-Reste) bewegt (Chattopadhyay, A.,

1990). Der große Durchmesser der Silica-Kügelchen (10 µm) erlaubte für die

Abstandskalkulationen die Annahme eines planaren Bilayers.

Der Fluoreszenz-Akzeptor wurde wie unter 2.2.17 beschrieben über die

Sulfhydrylgruppen der beiden Cystein-Reste (C76 & C134), die nach 3.1.3

(Abbildung 3) im Bereich der putativen Nukleotid-Bindetasche lokalisiert sind, in das

rekombinante 36K-Protein (2.2.2 - 2.2.4) eingefügt (36K-QSY). Das resultierende

Absorptionsspektrum zeigte, dass wie bei der Markierung für die ESR-Spektroskopie

(3.5.3) durchschnittlich ein Cystein-Rest (C134) pro Molekül 36K mit dem Maleimid

reagiert hatte. Der für dieses Chromophorenpaar nach Messung der Emissions- und

Absorptionsspektren unter experimentellen Bedingungen errechnete Förster-Abstand

(2.2.17) lag sich mit 5 nm im Bereich des Durchmessers eines Myelinbilayers aus

dem ZNS der Fische (Kirschner et al., 1989). Als Förster-Abstand (RB0 B) wird der

Abstand (R) zwischen Donor und Akzeptor bezeichnet, bei dem die FRET-Effizienz

noch 50% beträgt.

Um die Energietransfer-Effizienz zwischen dem Fluoreszenz-Donor (NBD) an der

Bilayeroberfläche und dem proteingebundenen Akzeptor (QSY7) während der

Membranassoziation zu messen, wurde 1.4 µM rekombinantes 36K bzw. 36K-QSY

wie unter 2.2.14 beschrieben mit dem NBD-PC-Bilyayer, 111 µM Phospholipid)

assoziiert und nicht gebundenes Protein durch Pelletierung und Waschen der

Silica-Kügelchen entfernt.

3. ERGEBNISSE

Nach Resuspendieren in PBS pH 7.4 wurden die in Abbildung 18 dargestellten

gemittelten NBD-Fluoreszenz-Spektren nach Erregung bei 467 nm aufgenommen

(2.2.17). Die Assoziation von 36K-QSY mit der NBD-PC-Membran resultierte in einer

durchschnittlichen Fluoreszenz-Abnahme, d. h. Energietransfer-Effizienz, von ~20%,

wobei die Emission in Abwesenheit des Akzeptors QSY® 7 (unmarkiertes 36K) als

maximale Fluoreszenz (100%) angenommen wurde.

Abb. 18: Fluoreszenzspektrum von NBD-PC assoziiert mitrek. 36K (=100%) bzw. rek. 36K-QSY in 50 mM PBS(150 mM NaCl), pH 7.4. NBD-Erregung bei 467 nm

Da von der genauen Membrantopologie des 36K-Proteins bisher wenig bekannt war,

wurden für die Abstandsberechnungen nach Fung und Stryer (1978) verschiedene

horizontale und vertikale Abstände zwischen den Chromophoren kalkuliert und mit

der gemessenen Energietransfer-Effizienz von 20% abgeglichen. Diese Abstände

sind u. a. abhängig von der Oberflächenakzeptordichte, die sich mit der

Protein-Eindringtiefe ändert. Aufgrund der Ergebnisse aus der Spaltung von

membrangebundenem 36K (3.6.1-3.6.4) wurde für die folgenden Kalkulationen ein

ca. 40%iges Eindringen des Proteins in die Membran angenommen. Verglichen mit

den aus den Röntgenkleinwinkelstreuungsstudien (3.3) erhaltenen Dimensionen von

36K (~9 x 3 - 4 nm) konnte der in das Protein eingefügte Akzeptor demnach maximal

ca. 5.2 nm über der Membran bzw. ca. 5.9 nm über dem Donor liegen.

-44-

3. ERGEBNISSE

Der daraus resultierende minimal mögliche horizontale Abstand zwischen den

Chromophoren von ~1.6 nm liegt in der Nähe des maximal möglichen horizontalen

Abstandes (Abbildung 19). Wenn statt des vertikalen Abstandes ein maximal

möglicher horizontaler Abstand von 2 nm angenommen wurde, verringerte sich die

Höhe des Akzeptors über der Membran kaum (~5.0 nm). Dies ließ die Vermutung zu,

dass der Akzeptor und damit die putative Nukleotid-Bindetasche nahezu zentral und

wie durch die Sekundärstruktur-Analyse (3.1.2 & 3.1.3) vorhergesagt am N-Terminus

des Moleküls lokalisiert sein müsste. Wie die Ergebnisse aus der Spaltung von

membrangebundenem 36K (3.6.1-3.6.4) deutet dieser Abstand darauf hin, dass sich

ein Teil des Proteins außerhalb des Bilayers befindet. Aufgrund der Höhe des

Akzeptors über der Membran würde dies, unter Berücksichtigung der Dimensionen

im ZNS-Myelin der Fische (Kirschner et al., 1989), für 36K die Möglichkeit schaffen,

mit der gegenüberliegenden Membran zu interagieren. Da durch die Verwendung

von schnell absinkenden phospholipidbeschichteten Silica-Kügelchen vermutlich

jedes 36K-Molekül maximal mit einem Bilayer assoziiert war, konnte diese

Penetration in zwei Membranen mit diesem Experiment nicht näher untersucht

werden.

Abb. 19: Modell der nach Fung & Stryer(1978) kalkulierten Abstände derFRET-Chromophore NBD (gelber Stern)und QSY7 (roter Stern). Für 36K wurde zur Vereinfachung eine Quader-Form ange-nommen (nach 3.3). Bilayer-Durchmesser nach Fa. Nimbus (Leipzig)

-45-

3. ERGEBNISSE

3.6.6 Hypothetisches Modell der Lage von 36K in der “Major Dense Line” des ZNS-Myelins der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss)

Zusammenfassend erlaubten diese Ergebnisse die Erstellung des in Abbildung 20

dargestellten hypothetischen Modells von der Membrantopologie des Myelinproteins

36K in der “Major Dense Line” des kompakten ZNS-Myelins der Forelle. Zur

Vereinfachung wurde für das 36K-Molekül aufgrund der aus den

Röntgenkleinwinkelstreuungsstudien (3.3) erhaltenen Dimensionen eine

Quader-Form angenommen. Die Spaltungsexperimente von membrangebundenem

36K mit der Protease Trypsin (3.6.1) deuteten an, dass 36K teilweise in den Bilayer

eingebettet vorliegen müsste. Aufgrund des aus den FRET-Studien erhaltenen

Abstandes des Fluorezenz-Akzeptors über der Membran, könnte 36K ebenfalls mit

dem gegenüberliegenden Bilayer interagieren. Um eine Regulation durch Nukleotide

zu gewährleisten müsste dabei der Bereich um die putative Nukleotid-Bindetasche

vom Cytosol her zugänglich bleiben.

Abb. 20: A. Umhüllende Struktur von 36K nach Röntgenkleinwinkelstreuung (3.3).B. Vereinfachte umhüllende Struktur von 36K. C. Hypothetisches Modell der Lage vomMyelinprotein 36K im ZNS der Forelle; MDL: Major Dense line, Dimensionen nach Kirschner et al.(1989)

-46-

3. ERGEBNISSE

3.7 INTERAKTIONEN ZWISCHEN 36K UND ANDEREN MYELINPROTEINEN AUS DEM ZNS DER REGENBOGENFORELLE (ONCORHYNCHUS MYKISS)

Aufgrund räumlicher Limitierungen in der „Major Dense Line” (vgl. Abbildung 20) sind

Interaktionen zwischen den Myelinproteinen vorstellbar. Um mögliche

Protein-Komplexe, insbesondere mit 36K-Beteiligung, zu analysieren, wurden im

Folgenden Protein-Extraktionen aus dem ZNS-Myelin der Forelle untersucht.

3.7.1 Myelinprotein-Extraktionen aus dem Fisch-ZNS mit dem nicht-ionischen Detergenz Digitonin (Fa. Merck, Schwalbach/Ts.)

Nach 2.2.18 wurde Myelin aus dem Gesamthirn junger Forellen (3 bis 8 cm)

präpariert und über eine Digitonin-Extraktionsreihe die enthaltenen Proteine aus den

Lipidmembranen gelöst (2.2.19). Durch die Verwendung des nicht-ionischen

Detergenz Digitonin sollten vorhandene Protein-Komplexe erhalten bleiben. Zur

Festellung der optimalen Extraktionsbedingungen wurde das isolierte Myelin

zunächst in 1-4% (w/v) Digitonin-Puffer (in 20 mM Tris/HCl pH 7.4, 0.1 mM EDTA,

50 mM NaCl, 10% (w/v) Glycerin, 1 mM PMSF) resuspendiert und die gelösten

Proteine elektrophoretisch aufgetrennt (2.2.5).

Abb. 21: Myelinprotein-Extraktionsreihe von400 mg Forellen-Gesamthirn mit 1-4% (w/v)Digitonin in 20 mM Tris/HCl pH 7.4, 0.1 mM EDTA,50 mM NaCl, 10% (w/v) Glycerin, 1 mM PMSF.Hauptmyelinproteine sind angezeigt. St.: LowMolecular Weight Standard (AmershamBiosciences, Freiburg)

-47-

3. ERGEBNISSE

Das in Abbildung 21 dargestellte coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gel (2.2.6) zeigt,

dass bereits mit 2% (w/v) Digitonin neben den Hauptmyelinproteinen 36K, IP1, IP2

und MBP eine große Anzahl weiterer Proteine aus/von den Membranen gelöst

werden konnte. Um möglichst viele Proteine in ausreichender Menge zu extrahieren

und um die zunehmende Komplexität des Myelins bei älteren (5-8 cm) Fischen zu

kompensieren, wurden die folgenden Extraktionen mit 4% (w/v) Digitonin-Puffer

durchgeführt. Dazu wurde das isolierte Myelin zunächst mit 0.5% (w/v) und

1% (w/v) Digitonin-Puffer equilibriert. Auf diese Weise konnten 2 bis 3 µg/µl

Myelinproteine bzw. eventuelle Proteinkomplexe extrahiert und durch

Blue-Native-PAGE (2.2.24) und Co-Immunopräzipitation (2.2.26) analysiert werden .

3.7.2 Blue-Native-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (BN-PAGE) der Myelin-protein-Extraktion aus dem ZNS der Forelle

Mit Hilfe einer Blue-Native PAGE sollten vorhandene Proteinkomplexe im Myelin

nachgewiesen und untersucht werden. Diese Methode wurde ursprünglich von

Schägger zur Auftrennung von Proteinkomplexen aus Mitochondrien (Schägger und

von Jagow., 1991; Schägger et al., 1994; Brookes et al., 2002) entwickelt. Dabei wird

die für die Elektrophorese nötige negative Ladung durch einen Coomassie-Farbstoff

(Brillant Blue G250) an die Proteine gebracht. Außerdem übernimmt der Farbstoff bei

Eintritt in das Gradienten-Polyacrylamid-Gel die Aufgabe des

Extraktions-Detergenzes und verhindert durch elektrische Abstoßung eine

ungewollte Proteinaggreation. Die aus der 4% (w/v)-Digitonin-Extraktion (2.2.19)

erhaltene Myelinprotein-Lösung (3.7.1; Abbildung 22A) wurde mit

4% (w/v)-Digitonin-Puffer auf 0.8 mg/ml verdünnt, mit Blue-Native-Probenpuffer

(20% (w/v) Brillant Blue G250 in 500 mM Aminocapronsäure) versetzt und potentielle

Proteinkomplexe über ein 6-16% Polyacrylamid-Gradienten-Gel elektrophoretisch

aufgetrennt (2.2.24). Das coomassie-gefärbte (2.2.6) Gel in Abbildung 22B zeigt für

das ZNS-Myelin der Forelle 5 deutliche Proteinkomplexe von ~600 kD, ~230 kD,

~150 kD, ~100 kD und ~66 kD.

-48-

3. ERGEBNISSE

A. B.

Abb. 22: A. Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel einerMyelinprotein-Extraktion (Extr.) aus 400 mg Forellen-Gesamthirn mit4% Digitonin in 20 mM.Tris/HCl pH 7.4, 0.1 mM EDTA, 50 mM NaCl,10% Glycerin, 1 mM PMSF. St.: Low Molecular Weight Standard(Amersham Biosciences, Freiburg); B. Coomassie-gefärbtes 6-16%(w/v) Gradienten-BN-PAGE-Gel der Myelinprotein-Extraktion (Extr.)aus dem ZNS der Forelle. St.: High Molecular Weight Standard fürnative PA-Gele (Amersham Biosciences, Freiburg)

Zur Analyse der Proteinzusammensetzung wurden zunächst die drei größten

Komplexe ausgeschnitten und in der 2. Dimension einer herkömmlichen SDS-PAGE

unterzogen (2.2.5). Die silbergefärbten Gele (2.2.7) in Abbildung 23 zeigen, dass

einige der aufgetrennten Proteine in allen Komplexen mehr oder weniger stark

vertreten sind, während sich andere auf ein oder zwei Komplexe beschränken. Die

Hauptmyelinproteine 36K und IP2 konnten bereits mit den entsprechenden

polyklonalen Antikörpern identifiziert werden (2.2.8 & 2.2.9) und sind demnach in

allen drei Komplexen zu finden. Die noch unbekannten Komplex-Komponenten

könnten mit Hilfe z. B. massenspektroskopischer Untersuchungen identifiziert

werden, um die Wechselwirkungen zwischen den Myelinproteinen näher

charakterisieren zu können.

-49-

3. ERGEBNISSE

Abb. 23: Silbergefärbte SDS-PAGE-Gelevon 600 kD-, 230 kD- und 150 kD-Komplexvon BN-PAGE der Myelinprotein-Extraktionaus ZNS der Forelle. Immunologischnachgewiesene 36K und IP2 sindangezeigt

Das Molekulargewicht von zwei Proteinspots im 600 kD-Komplex um ca. 55 kD legte

die Vermutung nahe, dass es sich dabei um Isoformen des Tubulins handeln könnte.

Dieses konnte mit Hilfe eines monoklonalen Tubulin-Antikörpers (Fa. Sigma-Aldrich,

München), der die polyglutamylierte Region am C-Terminus des Tubulins als Epitop

erkennt (Boucher et al., 1994; Gagnon et al., 1996; Mary et al., 1996), allerdings

nicht bestätigt werden. Im Western Blot (2.2.8 & 2.2.9) einer Myelinprotein-Extraktion

reagierte dieser Antikörper mit einem Protein im Molekulargewichtsbereich von 36K

statt in dem von Tubulin (Abbildung 24). Um auszuschließen, dass diese Reaktion

mit polyglutamylierten Proteinen, die durch die 36K-Bande verdeckt wurden,

stattfand, wurde ein Immunoblot mit aufgereinigtem rekombinanten 36K

(2.2.2 - 2.2.4) durchgeführt, das ebenfalls mit dem Tubulin-Antikörper reagierte.

Abbildung 24 zeigt deutlich, dass durch die in 2.2.19 beschriebene

Extraktionsmethode kein Tubulin aus dem ZNS-Myelin der Forelle gelöst wurde.

Stattdessen konnten durch die Reaktion von 36K mit dem Tubulin-Antikörper erste

Hinweise auf eine mögliche posttranslationale Modifikation dieses Myelinproteins

durch Polyglutamylierung erhalten werden.

-50-

3. ERGEBNISSE

-51-

Polyglutamylierung ist eine reversible posttranslationale Modifikation, die zum ersten

Mal von Eddé et al. (1990) am α-Tubulin beschrieben wurde. Dabei wird durch

Polyglutamylasen eine variable Anzahl von Glutamat-Resten an Glutamate in der

Primärstruktur fusioniert, wodurch u. a. die Affinität des Tubulins zum Tau-Protein

reguliert wird (Boucher et al., 1994). Inzwischen ist eine Polyglutamylierung auch bei

NAP´s (nucleosome assembly proteins) (Regnard et al. 2000) und Nucleoplasminen

(Regnard et al., 2003) festgestellt worden, bei denen eine mögliche Funktion dieser

Modifikation derzeit noch unbekannt ist. In Zukunft wäre eine Untersuchung dieser

möglichen posttranslationalen Modifikation von 36K bzw. deren Funktion sowie die

Identifizierung und Charakterisierung einer potentiellen 36K-Polyglutamylase im

ZNS-Myelin der Fische von Interesse.

Abb. 24: Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel einerMyelinprotein-Extraktion aus Forellen-ZNS (Extr., links)und immunologischer Nachweis mit angezeigtenAntikörpern. 36KBrek B: rek. 36K; P BExtr.B: Pellet nachExtraktion; St.: Low Molecular Weight Standard(Amersham Biosciences, Freiburg)

3. ERGEBNISSE

-52-

3.7.3 Co-Immunopräzipitation von Myelinprotein-Komplexen aus dem ZNS-Myelin der Forelle

Mit der Co-Immunopräzipitation können Proteine und assoziierte Moleküle mit den

entsprechenden Antikörpern aus einem Proteingemisch separiert werden. Nach den

Ergebnissen aus der BN-PAGE (3.7.2) liegen die Hauptmyelinproteine des

Forellen-ZNS 36K und IP2 in hochmolekularen Komplexen vor und müssten daher

durch Co-Immunopräzipitation ebenfalls separiert werden können. Dazu wurden

Myelinproteine wie für die BN-PAGE mit 4% (w/v)-Digitonin aus dem ZNS der Forelle

extrahiert (2.2.19) und mit Hilfe der entsprechenden polyklonalen Antikörper gegen

36K, IP2 und MBP mittels Immunopräzipitation aus dem Proteingemisch isoliert

(2.2.26). Die separierten (miteinander assoziierten) Proteine wurden anschließend

mit Hilfe einer SDS-PAGE (2.2.5) getrennt und durch Silberfärbung sichtbar gemacht

(2.2.7). Aus Abbildung 25 geht deutlich hervor, dass sich neben einigen schwachen

Proteinbanden die immunologisch nachgewiesenen (2.2.8 & 2.2.9)

Hauptmyelinproteine 36K, IP2 und MBP gegenseitig durch Co-Immunopräzipitation

separieren lassen und scheinen demnach im ZNS-Myelin der Fische miteinander

assoziiert zu sein.

Abb. 25: Silbergefärbtes SDS-PAGE-Gel und immunologischer Nachweisvon 36K, IP2 und MBP (WB) einer Co-Immunopräzipitation mit α36K, αIP2und αMBP aus Myelinprotein-Extraktion von ZNS der Forelle (Extr.).Immunologisch nachgewiesene Proteine sind angezeigt. St.: Low MolecularWeight Standard (Amersham Biosciences, Freiburg)

3. ERGEBNISSE

3.8 HYPOTHETISCHES MODELL DER LAGE UND DER INTERAKTIONEN VON 36K MIT PROTEINEN IN DER “MAJOR DENSE LINE” DES ZNS-MYELINS DER REGENBOGENFORELLE (ONCORHYNCHUS MYKISS)

Zusammenfassend konnte unter Berücksichtigung der Dimensionen im ZNS-Myelin

der Forelle (Kirschner et al., 1989) aus den erhaltenen Hinweisen zur

Membrantopologie und den Protein-Protein-Interaktionen das in Abbildung 26

dargestellte hypothetische Modell zur Lage von 36K, für das wie in Abbildung 20 eine

Quader-Form angenommen wurde, erstellt werden.

Abb. 26: Hypothetisches Modell der Lage von 36K in ZNS-Myelin der Forelle; mit Punkten sindmögliche Protein-Protein-Interaktionen angedeutet. IPL: Intraperiod Line, MDL: Major Dense Line,MBP: Basische Myelinprotein, IP: Intermediär Protein, ?: Unbekannte(s) Protein(e), Abständenach Kirschner et al. (1989).

-53-

3. ERGEBNISSE

Über Protein-Protein-Interaktionen zwischen den Hauptmyelinproteinen 36K, IP1 & 2

(Stratmann und Jeserich, 1995; Shapiro et al., 1996) und MBP (Beniac et al., 1996)

sowie einigen anderen, bisher noch nicht identifizierten Proteinen (vgl. BN-PAGE;

3.7.2), gäbe es im kompakten Myelin ein komplexes Netzwerk, das einer feinen

Regulierung bedarf. Die Untersuchung dieser Regulierung und welche Rolle ein

nukleotid-reguliertes 36K alleine oder im Zusammenspiel mit assoziierten Proteinen

spielen könnte, wäre für die Zukunft vor dem Hintergrund der von Blaurock et al.

(1986) festgestellten Dynamik des Myelins eine interessante Herausforderung.

-54-

4. DISKUSSION

4 DISKUSSION

Im Rahmen dieser Dissertation konnten für das nach seinem apparenten

Molekulargewicht benannten Myelinprotein 36K aus dem ZNS der Forelle erste

Hinweise auf dessen Struktur und mögliche Funktion in der cytosolischen Apposition

der Myelinmembranlamellen („Major Dense Line“; Jeserich & Waehneldt, 1986b)

erhalten werden. Ausgehend von computerunterstützten Homologie-Alignments der

Aminosäuresequenz wurden unerwartete Ähnlichkeiten zu Proteinen der

Reduktase/Epimerase/Oxidoreduktase-Superfamilie (RED) (Labesse et al., 1994)

statt zu den bekannten Myelinproteinen festgestellt. Nach Kallberg et al. (2002) wäre

36K eine „klassische Kurzkettige Dehydrogenase/Reduktase (SDR)“. Die

computerunterstützte Sekundärstruktur-Vorhersage zeigte, dass das Protein aus

alternierenden α-Helices (10) und β-Faltblättern (7) (βαβ-Struktur), dem sogenannten

„Rossmann fold“, besteht (Rossmann et al., 1974). Unterstützt wurde diese

Vorhersage vom einem computergenerierten, auf Sequenzhomologien basierenden

3D-Modell der N-terminalen Hälfte von 36K, das die für REDs charakteristische

geordnete Struktur mit β-Faltblättern im Molekül-Zentrum und α-Helices in der

Peripherie zeigte. Mit Hilfe einer Fern-UV-Circulardichroismus-Spektrokopie

(CD-Spektroskopie) konnte zum ersten Mal ein Einblick in die Sekundärstruktur-

Zusammensetzung des nativen 36K-Proteins erhalten werden. In Lösung ist das

Protein demnach aus etwa je einem Drittel α-Helices, β-Strukturen sowie

ungeordneter Strukturen („random coil“) aufgebaut. Die durch

Röntgenkleinwinkelstreuung bestimmte umhüllende Struktur von 36K in Lösung

zeigte ein längliches (9 nm), aus 2 Domänen von ~4 x 3 und 5 x 4 nm (Höhe x Breite)

bestehendes Molekül. Verglichen mit den von Kirschner et al. (1989) festgestellten

Dimensionen im ZNS-Myelin der Fische erscheint 36K als lang gestrecktes Molekül

in der mit ~2.5 nm Durchmesser eher schmalen cytosolischen Apposition („Major

Dense Line“). Dies legte die Vermutung nahe, dass das membranassoziierte Molekül

(Jeserich & Waehneldt, 1986b; Diplom-Arbeit W. Moll, 2001) zumindest teilweise in

den Bilayer eintauchten müsste.

-55-

4. DISKUSSION

Über den proteolytischen Verdau von membrangebundenen 36K konnte gezeigt

werden, dass der C-Terminus des Proteins in die Phospholipid-Membran eintauchte

und so vor der Trypsinisierung geschützt war. Durch immunologische Nachweise von

C-terminalen Fragmenten und anschließendem Abgleich mit dem jeweiligen

Molekulargewicht konnten die Arginin- bzw. Lysin-Reste identifiziert werden, an

denen 36K trotz Membranassoziation noch gespalteten wurde bzw. welche der

Spaltstellen nicht mehr zugänglich waren. Dabei stellte sich heraus, dass die für die

Protease erreichbaren Spaltstellen im Bereich der putativen Nukleotid-Bindetasche

lokalisiert waren, die demnach bei der Membranassoziation mit einem Bilayer

zugänglich blieb. Erwartungsgemäß war eine Spaltung der in diesem Bereich

befindlichen Cystein-Reste durch NTCB ebenfalls möglich. Mit Hilfe von

Random-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer- (FRET-)Studien konnte diese

Membrantopologie von 36K näher charakterisiert werden. Unter der Annahme des

maximal möglichen vertikalen Abstandes zwischen den Chromophoren, konnte mit

den nach Fung und Stryer (1978) erhaltenen Wertepaaren ein minimal möglicher

horizontaler Abstand von ~1.6 nm kalkuliert werden. Somit wäre der Akzeptor

ca. 5 nm über der Membran lokalisiert, was für 36K aufgrund der Dimensionen im

ZNS-Myelin der Forelle (Kirschner et al., 1989) die Möglichkeit schaffen würde, mit

dem gegenüberliegenden Bilayer zu interagieren. Dies konnte aufgrund des

schnellen Absinkens der Transil-Kügelchen bei diesem Experiment nicht näher

untersucht werden. Da 36K nach der Röntgenkleinwinkelstreuung eine Breite von

~4 nm aufweist (3.3), müsste der im Bereich der putativen Nukleotid-Bindetasche

eingefügte Akzeptor nahezu in der horizontalen Mitte des Moleküls und (im Myelin)

aufgrund des Abstandes zur Membran in der Nähe des gegenüberliegenden Bilayers

lokalisiert sein. Um eine nukleotid-bedingte Regulation zu gewährleisten, müsste die

Bindetasche bei der 36K-Interaktion mit zwei Myelinmembranen vom Cytosol

(„Major Dense Line“) her zugänglich bleiben. Die hier kalkulierten Abstände sollten

allerdings als Richtwerte angesehen werden, da sich die gemessene

Energietransfer-Effizienz lediglich auf eine Protein-Konzentration stützt. Um

genauere Aussagen zu den Abständen der Chromophore bei der

Membranassoziation von 36K zu machen, sind weitere Messungen mit

verschiedenen Konzentrationen notwendig.

Welche Funktion könnte dieses Protein in der Myelinmembran der cytosolischen

Apposition im ZNS-Myelin der Fische ausüben?

-56-

4. DISKUSSION

Wie bereits erwähnt, wäre 36K aufgrund der Aminosäuresequenz-Analysen eine

„klassische Kurzkettige Dehydrogenase/Reduktase (SDR)“ (Kallberg et al., 2002)

und würde somit zur Reduktase/Epimerase/Oxidoreduktase-Superfamilie (RED)

(Labesse et al., 1994) gehören. Das für die REDs charakteristische Nukleotid-

Bindemotiv (GXXXGXG) ist bei 36K erwartungsgemäß zwischen dem ersten

β-Faltblatt und der darauffolgenden α-Helix lokalisiert (Moll et al., 2003). Ein

Sequenz-Motiv im zweiten β-Faltblatt (VCR) sowie ein Arginin-Rest (R77) an dessen

C-Terminus deuten auf eine NADP(H)-Präferenz des 36K-Proteins hin. Durch

Aminosäureaustausche z. B. des R77 könnte diese NADP(H)-Präferenz weiter

verifiziert werden. Im Kern- und C-terminalen Bereich weist die Primärstruktur von

36K RED-typische Sequenzmotive einer Substrat-Bindetasche auf

(YXXXK, PGXXXT) (Persson et al., 1991; Labesse et al., 1994; Ghosh et al, 1994;

Jörnvall et al., 1995; Tanaka et al., 1996; Kallberg et al., 2002). Aus diesen

Sequenz-Motiven konnte direkt kein Hinweis auf ein potentielles Substrat erhalten

werden. Zum Nachweis einer Dehydrogenase-Aktivität von 36K im Myelin wurden

daher Myelinkomponenten als Bindepartner angenommen (Ledeen, 1984) und die

nukleotidbedingte Absorption der Suspension über die Zeit beobachtet. Statt der

erwarteten Dehydrogenase-Aktivität wurde vor allem nach Zugabe von

rekombinantem 36K eine Reaktion festgestellt, die auf Liposomen-/Micellen-

Aggregation zurückgeführt wurde. Dabei hatte NAD(H) anscheinend keinen Einfluss

auf die Aggregation, während die Anwesenheit von NADP(H) die Aggregation

offenbar negativ beeinflusste, was wiederum in gutem Einklang mit der aus der

Aminosäure-Sequenz-Analyse vermuteten NADP(H)-Präferenz steht.

Da bei den Experimenten mit isoliertem Myelin Triton X-100 zur Auflockerung

zugegeben werden musste, wurde die festgestellten Reaktion nach Zugabe von

rekombinantem 36K und Nukleotiden mit Hilfe von

Phosphatidycholin/Phosphatidylethanolamin-Liposomen unter detergenzfreien

Bedingungen erneut untersucht. Wiederum wurde die Absorption je nach Nukleotid

unterschiedlich beeinflusst: NADP(H) schien die Aggregation von PC-Liposomen zu

behindern, während es unter NAD(H)-Einfluss offenbar zu einer verstärkten

Aggregation kam.

-57-

4. DISKUSSION

Dass nukleotid-bindende Proteine nicht zwangsläufig (Dehydrogenase-)

Enzymproteine sein müssen, konnte z. B. bei den cytoplasmatischen

β-Untereinheiten von spannungssensitiven Kalium-Kanälen gezeigt werden. Wie bei

36K konnte auch für diese Proteine, die nach Kristallisation in die Aldo-Keto-

Reduktase-Superfamilie (AKR) eingeordnet werden konnten (McCormack und

McCormack, 1994), weder ein Hinweis auf potentielles Substrat noch auf eine

Oxidoreduktase-Funktion gefunden werden. Obwohl AKRs eigentlich in

NAD(P)(H)-abhängiger Weise die Oxidation bzw. Reduktion verschiedenster

Carbonyl-Substrate wie Steroide oder Prostaglandine (Jez et al., 1997) katalysieren,

beeinflussen diese β-Untereinheiten u. a. die Stabilität, das „gating“ oder die

intrazelluläre Verteilung der Kalium-Kanäle („intracellular trafficking“). Dabei

veränderte z. B. ein für die AKR-Funktion kritischer Aminosäure-Austausch im

aktiven Zentrum (Bohren et al., 1994) den Protein-Transport nicht. Allerdings konnte

dieser durch Mutationen in der Nukleotid-Bindedomäne unterbunden werden

(Campomanes et al., 2002). Wenn die β-Untereinheiten also eine Enzym-Aktivität

haben, scheint diese nach Campomanes et al. für die auszuführende Funktion an

den spannungssensitiven Kalium-Kanälen nicht notwendig zu sein. Aus diesem

Grund wäre für 36K eine nicht-enzymatische Funktion über nukleotidbedingte

Konformationsänderungen innerhalb des Fisch-Myelins durchaus vorstellbar. In

diesem Zusammenhang sind die von Blaurock et al. (1986) festgestellten

Abstandsänderungen innerhalb der Myelinlamellen erwähnenswert. Blaurock et al.

konnten zeigen, dass es unter bestimmten physiologischen Bedingungen zu einer

Auflockerung des Myelin am ZNS-Nerv der Goldfische kam. Über diese Dynamik

könnte mit Hilfe transgener Zebrafische eine potentielle Rolle von 36K mit

Null-Mutanten oder Mutanten, bei denen essentielle Aminosäuren für die

Nukleotid- und/oder die putative Substrat-Bindung ausgetauscht sind, untersucht

werden.

Die beschriebenen Abstandsänderungen könnten aus Konformationsänderungen

von Proteinen wie 36K resultieren. In wie weit 36K z. B. unter Nulkleotid-Einfluss

seine Konformation ändert, wurde im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe von

Tryptophan-Fluoreszenz- und CD-Spektroskopie untersucht. Dabei konnte gezeigt

werden, dass Nukleotide mit 36K in Lösung interagierten und dass diese

Wechselwirkung zu einer veränderten Sekundärstruktur-Zusammensetzung führte.

-58-

4. DISKUSSION

Der Anteil ungeordneter Strukturen nahm unter Einfluss der reduzierten Nukleotide

etwas stärker zu als in Anwesenheit von NAD bzw. NADP. Der Bereich um die

putative Nukleotid-Bindetasche blieb nach den Ergebnissen der ESR-Studien

offenbar von dieser zunehmenden Entfaltung verschont.

Ob diese nukleotidbedingten Konformationsänderungen von 36K dazu führen, dass

der nach 3.6.1 in die Membran eingetauchte C-Terminus den Bilayer teilweise

verlässt, konnte mit Trypsinisierungsstudien in Anwesenheit von Nukleotiden nicht

gezeigt werden. Dennoch kann ein Herausstrecken aus der Membran weiterhin nicht

ausgeschlossen werden, da entweder außer den bekannten Spaltstellen keine

weiteren zugänglich werden oder in dem die Membran verlassenen Proteinteil(en)

keine Trypsinisierungsstellen vorhanden sind. Dass Nukleotide die Zugänglichkeit

der Spaltstellen beeinflussen, konnte durch leichte Änderungen im

Trypsinisierungsmuster von rekombinantem 36K in Lösung gezeigt werden. Dabei ist

zu berücksichtigen, dass nach der Sekundärstruktur-Analyse ein Großteil der

Spaltstellen in oder direkt an den nach dem 3D-Modell peripheren α-Helices

lokalisiert ist und daher von vornherein leicht zugänglich war. Dennoch scheinen

NADP bzw. NADPH die Zugänglichkeit von Trypsinisierungsstellen zu verändern,

während NAD bzw. NADH scheinbar keinen Einfluss auf den proteolytischen Verdau

hatten. Dies steht wiederum in guten Einklang mit der vermuteten

NADP(H)-Präferenz von 36K.

Zusammen mit den Ergebnissen zur Membrantopologie konnte unter

Berücksichtigung der von PD Dr. G. Grüber (Institut für Biophysik, Universität des

Saarlandes, Homburg/Saar) ermittelten Dimensionen für das rekombinante 36K in

Lösung (2 Domänen von ~4 x 3 nm und ~5 x 4 nm, Gesamtmolekül ~9 x 4 nm) und

den Abständen im kompakten Myelin (Kirschner et al., 1989) ein hypothetisches

Modell der Lage des Moleküls in der cytosolischen Apposition („Major Dense Line“)

des ZNS-Myelins der Fische erstellt werden. Durch die Möglichkeit der Interaktion

von 36K mit zwei gegenüberliegenden Myelinmembranen, wobei die putative

Nukleotid-Bindetasche vom Cytosol her zugänglich bleiben würde, könnte 36K

alleine zur Veränderung des Abstandes zwischen den Myelinmembranen beitragen.

-59-

4. DISKUSSION

Dabei ist für dieses Myelinprotein bereits eine Rolle beim Start der Myelinisierung

eines Axons denkbar, bei der es z. B den wichtigen ersten Kontakt zwischen der

Gliazellmembran und der zu umwickelnden Axonmembran herstellen könnte.

Aufgrund der räumlichen Enge im Myelin sind Wechselwirkungen zwischen 36K und

anderen Myelinproteinen zu erwarten. Im Rahmen dieser Arbeit konnten zum ersten

Mal Protein-Protein-Interaktionen bzw. Protein-Komplexe im Myelin mit Hilfe von

Blue-Native-PAGE (BN-PAGE) und Co-Immunopräzipitationen gezeigt werden. Dazu

wurde zunächst eine Methode zur Extraktion von Myelinproteinen aus dem ZNS der

Forelle mit dem nicht-ionischen Detergenz Digitonin etabliert. Mit der BN-PAGE

(1. Dimension) konnten schließlich 5 hochmolekulare Proteinkomplexe aufgetrennt

werden. Die Auftrennung der Komplexe mit herkömmlicher SDS-PAGE in der

2. Dimension zeigte verschiedene Proteinkomponenten, von denen die

Hauptmyelinproteine 36K und das P0-ähnliche Glykoprotein IP2 (Intermediär Protein)

(Jeserich & Waehneldt, 1986a) in allen Komplexen immunologisch nachgewiesen

werden konnten. Eine weitere IP-Isoform, das vom Molekulargewicht etwas kleinere

IP1, konnte zwar nicht immunologisch nachgewiesen werden, war aber als

Proteinbande mit dem richtigen Molekulargewicht in allen Komplexen vorhanden.

Die mit der BN-PAGE festgestellten Protein-Protein-Interaktionen konnten schließlich

mittels Co-Immunopräzipitation bestätigt und auf das Basische Myelinprotein (MBP)

erweitert werden. Mit den polyklonalen Antikörpern gegen 36K, IP2 bzw. MBP ließen

sich diese Proteine neben wenigen anderen Proteinen gegenseitig separieren. Die

deutlich geringere Anzahl assoziierter Proteine in Vergleich zur BN-PAGE könnte

eine Folge der zahlreichen Wasch- und Zentrifugationsschritte sein, durch die

schwächere Protein-Wechselwirkungen getrennt worden sein könnten. Die

Hauptmyelinproteine 36K, IP2 und MBP scheinen demnach durch starke

Interaktionen miteinander verbunden zu sein. Es ist zu berücksichtigen, dass auch

Wechselwirkungen zwischen gleichartigen Proteinen möglich sind. Für MBP ist diese

„Eigen-Aggregation“, die in Anwesenheit von Lipiden noch verstärkt wird, schon seit

längerem bekannt (Smith, 1982 & 1992). Mit Hilfe von Größenausschluß-Gelfiltration

konnte für das aufgereinigte rekombinante 36K ebenfalls ein Hinweis auf

Oligomerisierung erhalten werden (Diplom-Arbeit W. Moll, 2001).

-60-

4. DISKUSSION

Inwieweit diese Aggregate eine funktionelle Bedeutung haben, ist derzeit noch nicht

näher untersucht worden. Durch Zugabe von Nukleotiden bei der

Myelinprotein-Extraktion und/oder bei der BN-PAGE bzw. Co-Immunopräzipitation

könnten mögliche Änderungen in der Komplexzusammensetzung analysiert werden.

Beim Versuch zwei Proteinspots (aus 2. Dimension nach BN-PAGE) immunologisch

als Isoformen des Tubulins zu identifizieren, wurde zum ersten Mal ein Hinweis auf

eine posttranslationale Modifikation von 36K erhalten. Demnach würde das Protein

durch die von Eddé et al. (1990) erstmals beschriebene (Poly)glutamylierung

modifiziert, bei der eine variable Anzahl von Glutamat-Resten reversibel an die

Primärstruktur des Proteins fusioniert wird. Während beim Tubulin durch den Grad

der Polyglutamylierung die Affinität zum Tau-Protein reguliert wird (Boucher et al.,

1994), ist eine Funktion dieser posttranslationlen Modifikation bei 36K noch

unbekannt. Ähnlich wie beim Tubulin wäre eine Beeinflussung der Affinität und damit

der Interaktion zu anderen Myelinproteinen über Anzahl der angefügten

Glutamat-Reste vorstellbar. Eine genaue Analyse dieser putativen

posttranslationalen Modifikation von 36K, u. a. wie viele Glutamat-Einheiten an

welche Glutamat-Reste fusioniert werden, könnte z. B. mit Hilfe

massenspektroskopischer Untersuchungen (Mary et al., 1996) durchgeführt werden.

Des Weiteren wäre die Identifizierung und Charakterisierung einer entsprechenden

Polyglutamylase von Interesse. Dabei muss diese nicht mit dem

Tubulin-glutamylierenden Enzym identisch sein, da z. B. Regnard et al. (2000)

festgestellt haben, dass die Tubulin-Polyglutamylase keine Glutamat-Reste an

Nukleosome Assembly Proteins (NAP) fusioniert.

Zusammenfassend konnte ein hypothetisches Modell zur Lage und zu den

Interaktionen mit den Hauptmyelinproteinen IP2 und MBP des vermutlich mit zwei

gegenüberliegende Myelinmembranen interagierenden 36K kreiert werden. Die

putative Nukleotid-Bindetasche würde dabei vom Cytosol her zugänglich bleiben und

so eine Regulation über Nukleotide ermöglichen. In diesem Modell sind die anderen

Proteinkomponenten, die nach der BN-PAGE ebenfalls mit diesem Komplex

assoziiert sind, aber im Rahmen dieser Arbeit nicht näher charakterisiert wurden,

nicht dargestellt.

MBP ist aufgrund seiner adhäsiven Eigenschaften wichtig für die Bildung und

Stabilisierung der cytosolischen Apposition im Myelin. Wie der molekulare

Mechanismus diese Funktion aussieht, ist jedoch noch unklar (Beniac et al., 1996).

-61-

4. DISKUSSION

-62-

Mit Hilfe von Absorptions- (ähnlich wie bei 36K) und FRET-Untersuchungen mit

markierten Liposomen konnte eine durch MBP hervorgerufene Vesikelaggregation

festgestellt werden (ter Beest und Hoekstra, 1992). Neben der Assoziation mit der

Myelinmembran und der im Rahmen dieser Arbeit gezeigten Wechselwirkung mit

36K interagiert MBP in Lösung außerdem mit Aktin (Boggs und Rangaraj, 2000),

wodurch 36K eine indirekte Verbindung zum Cytoskelett hätte.

Über die P0-ähnlichen Glykoproteine IP1 und IP2 (Jeserich und Waehneldt, 1987)

könnte das Myelinprotein 36K in Verbindung zur extrazellulären Apposition

(„Intraperiod Line“) stehen. IP1 besteht aus einer großen, als Immunglobulin-Einheit

aufgebauten, extrazellulären Domäne (124 Aminosäuren) und einem kleinen

cytosolischen Teil (30 Aminosäuren), die durch eine Transmembrandomäne

(26 Aminosäuren) getrennt sind. Die Isoform IP2 ist mit 29 zusätzlichen Aminosäuren

am cytosolischen Teil etwas größer als IP1 (Stratmann und Jeserich, 1995). Lanwert

und Jeserich (2001) konnten zeigen, dass in CHO-Zellen heterolog exprimiertes IP1

eine Zell-Aggregation bewirkte und daher eine Rolle beim Aufbau und/oder bei der

Stabilisierung der „Intraperiod Line“ spielen könnte. Da 36K nach den erhaltenen

Hinweisen teilweise in die Myelinmembran eintaucht, wären die bei der

BN-PAGE und Co-Immunopräzipitation festgestellte Assoziation des Proteins mit den

Intermediär Proteinen sowohl über den kleinen cytosolischen Teil der IP´s als auch

über die Transmembrandomäne denkbar. Dadurch könnte 36K seinen Einfluss über

die Myelinmembran hinweg in die extrazelluläre Apposition ausbreiten.

Die hier beschriebenen direkten Wechselwirkungen der Hauptmyelinproteine

IP1 & 2, MBP und 36K untereinander und die indirekten Interaktionen mit den

jeweiligen assoziierten Proteinen deuten auf ein komplexes Protein-Netzwerk im

ZNS-Myelin der Fische hin, dass einer feinen Regulierung bedarf. Ob und inwieweit

die nukleotidbedingte Konformationsänderung die Assoziation von 36K mit anderen

Myelin-Proteinen beeinflusst und/oder der Abstand innerhalb des Myelins durch 36K

alleine oder durch ein genau definiertes Zusammenspiel der einzelnen

Komplex-Komponenten beeinflusst wird, wäre vor dem Hintergrund der erwähnten

Dynamik des ZNS-Myelins der Fische für die Zukunft eine interessante

Fragestellung.

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6. ANHANG

6. ANHANG

6.1 36K-Aminosäure-Sequenz mit Sekundärstruktur-Vorhersage (nach 3.1.2) und Trypsinisierungsstellen nach PeptidCutter (Expasy-Internet-Server)

1 MGNSTMSLYR NSAWFLKGMT EFTRSAFLSA

31 AKHFVEKDLE VSMAGRVFMI TGANSGIGRA

61 TAMAIAKRGG TVHMVCRNKD KAEEARADIV

91 KESGNKEIYV HILDLSETRK VWEFAEAFKR

121 KYKVLNLLIN NAGCIMSERD VNAEGLEKSF

▼ ▼ ▼

▼ ▼ ▼ ▼

▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼

▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼

▼ ▼ ▼ ▼

151 ASNVMGVYIL TRGLIPLLEK SAEPRVITVS

181 SGGMLVQKLR TGNLQTEIGR YDGTMVYAQH

211 KRQQVVMTEQ WAQTHSNIHF SVMHPGWVDT

241 PAVANAMPDF HQSMKDSLRT PEQGADTVVW

271 LAISEAAATK PSGSFFQDRR MVSAHLPLAW

301 THSSQLEQQK FMSVMEDLAK TFQPH*

▼ ▼ ▼

▼ ▼ ▼

▼ ▼

▼ ▼

▼ ▼

▼ ▼

X: α-Helix, X: β-Faltblatt, : Trypsinisierungsstelle, : nach Membranassoziation in

den Bilayer eingetauchte Trypsinierungsstelle (nach 3.6.1) ▼ ▼

-69-

6. ANHANG

6.2 Klonierungsschema der 36KcDNA in die MCS („multiple cloning site“) des pET23a(+)-Vektors (Fa. Novagen, Schwalbach/Ts.) (nach Diplom-Arbeit W. Moll, 2001)

Bgl II (334)

Nde I Nhe I EcoR I Hinc II Hind III Not I Bpu1102

Xba I BamH I Sac I Sal I Eag I Xho I Sty I (57)

3´ 5´

Restriktion mNDE I & Sa

il I

t

Bgl II (334)

Xba I

Nde I Nhe I

Sal I

Hind III

Eag I

Not I

Xho I

Bpu1102

Sty I (57)

5´

Ligation mit cDN

3´

3´ 5´

Sal I 36K A

Nde I

Bgl II (334)

Xba I

Nde I Nhe I

Sal I

Hind III

Eag I

Not I

Xho I

Bpu1102

Sty I (57)

3´ 5´

-70-

6. ANHANG

6.3 Abkürzungen

% v/v Volumenprozente % w/v Gewichtsprozente µ mikro A320 Absorption bei einer Wellenlänge von 320 nm

icol esoxyribonukleinsäure

traessigsäure

ng g

alaktosid

ante

phosphat)

Wellenlänge von 600 nm Chemikalien.

Saline (“Phosphat-Puffer”)

(„Umdrehungen pro Minute”)

DS Natrium-(„Sodium“-)dodecylsulfat time (Zeit)

BS(T) Tris Buffered Saline (Tween-20) (“Tris-Puffer”) EMED N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin ris Tris-Hydroxymethylaminomethan Volumen

rvensystem

Amp Ampicillin BSA Rinderserumalbumin CAM ChloramphencDNA komplementäre DDMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure E. coli Escherichia coli EDTA EtylendiaminteFmax maximale Fluoreszenz Fa. Firma g Gramm 1xg 1x ErdanziehuHis-ta Histidin-„tag“ (engl. für Fortsatz, Anhang) IPTG Isopropylthiogl Liter Kd DissoziationskonstkDa Kilo-Dalton m milli M molar MCS „Multiple Cloning Site“ (multiple Klonierungsstelle)min Minute NAD(P) Nicotinamid-adenin-dinukleotid(-nm nanometer OD600 optische Dichte bei einerp. A. lat. „pro analysi“, ReinheitsbezeichnungPBS Phosphate Buffered pH Maßzahl für die Wasserstoffionen-KonzentrationPMSF Phenylmethansulfonylfluorid PNS Peripheres Nervensystem rpm rounds per minuteRT Raumtemperatur St TTTVZNS Zentrales Ne

-71-

6. ANHANG

-72-

6.4 Publikationen

oll W, Grüber G, Jeserich G. 2001. Structural dynamics in the myelin of fish – 36K

as a novel filamentous myelin protein. J Neurochem 78: 49

oll W, Lanwert C, Jeserich G. 2003. Molecular cloning, tissue expression and

partial characterization of the major fish CNS myelin protein 36K

M

M

DANKSAGUNG

Herrn apl. Prof. Dr. G. Jeserich möchte ich für die Möglichkeit und das Vertrauen

danken, meinen Teil zur Charakterisierung dieses interessanten Myelinproteins

beitragen zu können.

Ein besonderer Dank gebührt Bettina Flenker für ihre Unterstützung im Laboralltag

und das angenehme Arbeitsklima.

PD. Dr. G. Grüber (Inst. f. Biophysik, Universität des Saarlandes, Homburg/Saar)

danke ich für die Durchführung der Röntgenkleinwinkelstreuung, durch die wir einen

ersten Eindruck vom Aussehen des 36K-Proteins erhalten haben.

Des Weiteren möchte ich mich bei Prof. Dr. H.-J. Steinhoff und Klaus-Peter Vogel

(AG Experimentelle Physik) für die Aufnahme und Erläuterung der ESR-Spektren

bedanken.

Für die Einführung in die CD-Spektroskopie und Möglichkeit der Nutzung von

Geräten der Abt. Biophysik bedanke ich mich bei apl. Prof. Dr. R. Wagner.

Claudius Walter danke ich für seine unendliche Geduld bei der Einführung in die

FRET-Spektroskopie und für die Unterstützung und Diskussionsbereitschaft bei der

Kalkulation der Chromophoren-Abstände.

Danken möchte ich außerdem Dr. Wilfried Hamann für die auch über die

Wissenschaft hinausgehenden Gespräche.

Meinen Eltern danke ich, dass sie mir dieses Studium ermöglicht haben.

Bei meiner Frau Doris möchte ich mich für ihre Unterstützung und ihre Geduld, vor

allem während des Verfassens dieser Arbeit, bedanken. Und unserem Sohn Luis

danke ich für die Ablenkung, wenn der Gedankenfluss mal wieder blockiert war.

Abschließend möchte ich diese Dissertation meinem Schwiegervater Heinrich Pieper

widmen, der kurz vor der Fertigstellung verstorben ist.

-73-

CURRICULUM VITAE

Wolfgang Moll

geboren am 11.07.1974 in Aschendorf

verheiratet

Schule und Grundwehrdienst

1980 – 1984 Grundschule Heede

1984 – 1986 Orientierungsstufe Dörpen

1986 – 1994 Gymnasium Papenburg, Abschluss mit ABITUR

1994 – 1995 Grundwehrdienst in der Hümmling-Kaserne

Studium

1995 Immatrikulation an Universität Osnabrück,

Fach: Diplom-Biologie

2001 Diplom-Arbeit:

„Heterologe Expression und Charakterisierung des

Myelinproteins 36K aus dem ZNS der Regenbogenforelle

(Oncorhynchus mykiss)“

12.03.01 Verleihung des akademischen Grades DIPLOM-BIOLOGE

Promotion

03.01 – 08.04 Anfertigung der Dissertation unter der Leitung von

apl. Prof. Dr. G. Jeserich mit dem Thema „Strukturelle und

funktionelle Untersuchung des Myelinproteins 36K aus

dem ZNS der Regenbogenforelle (Oncoryhynchus

mykiss)“ in der Arbeitsgruppe Tierphysiologie

(Neurobiologie) und Neurobiologie

-76-

CURRICULUM VITAE

-77-

03.01 – 03.04 Stipendiat im Graduiertenkolleg 612 der DFG

„Molekulare Physiologie: Wechselwirkungen zwischen

zellulären Nanostrukturen“

03.04 – 08.04 wissenschaftlicher Angestellter an der Universität

Osnabrück im Sonderforschungsbereich 431

"Membranproteine - Funktionelle Dynamik und Kopplung

an Reaktionsketten"

Strukturelle und funktionelle Untersuchung des ...nbn:de:gbv:700... · E. coli als...

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