STRUKTURELLE UND FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNGDES MYELINPROTEINS 36K AUS DEM ZNS DER
REGENBOGENFORELLE (ONCORHYNCHUS MYKISS)
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades
„Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)“
des Fachbereiches Biologie/Chemie
der Universität Osnabrück
vorgelegt von
Wolfgang Moll
November 2004
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 2. MATERIAL UND METHODEN
2.1 Material 2.2.1 Bakterienstämme
2.2.2 Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss)
2.2 Methoden 2.2.1 Computergestützte Aminosäure-Sequenzanalysen
2.2.2 Animpfen einer Bakterien-Über-Nacht-Kultur (ÜK)
2.2.3 Heterologe Expression mit E. coli/pET-System (Fa. Novagen)
2.2.4 Affinitätschromatographische Aufreinigung mit Ni2+-chelatierender
Sepharose
2.2.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (nach Laemmli)
2.2.6 Proteinanfärbung mit Coomassie-Lösung
2.2.7 Proteinanfärbung durch Silberfärbung
2.2.8 Proteintransfer auf Nitrozellulose- oder Polyvinylidenfluorid- (PVDF-)
Membran (Western-Blot)
2.2.9 Immunologischer Nachweis von Proteinen auf Nitrozellulose- oder
Polyvinylidenfluorid- (PVDF-) Membran
2.2.10 Fern-UV-Circulardichroismus-Spektroskopie (CD-Spektroskopie) von
rekombinantem 36K in Lösung
2.2.11 Tryptophan-Fluoreszenz-Studien von rekombinantem 36K in Lösung
2.2.12 Elektronenspin-Resonanz-Spektroskopie (ESR-Spektroskopie) von
rekombinantem 36K in Lösung
2.2.13 Röntgenkleinwinkelstreuung von rekombinantem 36K in Lösung
2.2.14 Assoziation von rekombinantem 36K an phospholipidbeschichtete
Silica- Kügelchen („TRANSIL“; Fa. Nimbus, Leipzig)
2.2.15 Kontrollierter proteolytischer Verdau von rekombinantem 36K mit
Trypsin (Fa. Sigma-Aldrich, München)
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INHALTSVERZEICHNIS
2.2.16 Chemische Spaltung von rekombinantem 36K mit 2-Nitro-5-
Thiocyanobenzonsäure (NTCB)
2.2.17 Random-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-(Random-FRET-)
Untersuchungen von membranassoziiertem rekombinanten 36K
2.2.18 Isolieren von Myelin aus dem ZNS der Regenbogenforelle
(Oncorhynchus mykiss)
2.2.19 Herstellen einer 5%igen (w/v) Digitonin-Stammlösung und Myelinprotein-
Extraktion mit Digitonin
2.2.20 Protein-Konzentrationsbestimmung mit Amidoschwarz-Tüpfel-Test
2.2.21 Messung einer Dehydrogenase-Aktivität im isolierten ZNS-Myelin der
Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss)
2.2.22 Herstellung von Phosphatidylcholin (PC)/Phosphatidylethanolamin
(PE)-Liposomen
2.2.23 Aggregationsassay von Phosphatidylcholin (PC)/Phosphatidyl-
ethanolamin (PE)-Liposomen mit rekombinantem 36K
2.2.24 Blue-Native Gradienten-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (BN-PAGE)
(1. Dimension)
2.2.25 SDS-PAGE der durch BN-PAGE aufgetrennten Myelinprotein-Komplexe
(2. Dimension)
2.2.26 Separation der Myelinprotein-Komplexe mit ProFound-Co-Immuno-
präzipitation-Kit (Perbio Sciences, Bonn)
3. ERGEBNISSE
3.1 Computerunterstützte Analyse der 36K-Aminosäuresequenz 3.1.1 Homologie-Alignment der Aminosäure-Sequenzen von 36K und
Proteinen aus der Reduktase/Epimerase/Oxidoreduktase Superfamilie
(RED)
3.1.2 Sekundärstruktur-Vorhersage des 36K-Proteins mit dem JPred-Internet-
Server
3.1.3 3-dimensionales Modell des N-terminalen Teils von 36K
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INHALTSVERZEICHNIS
3.2 Untersuchung der Sekundärstrukturzusammensetzung des rekombinanten 36K-Proteins mittels Fern-UV-Circulardichroismus- Spektroskopie (CD-Spektroskopie)
3.3 Röntgenkleinwinkelstreuung von rekombinantem 36K in Lösung
3.4 Untersuchungen zur Funktion von 36K 3.4.1 Messung einer Dehydrogenase-Aktivität im isolierten Myelin
3.4.2 Aggregationsassay von Phosphatidylcholin (PC)/Phosphatidyl-
ethanolamin (PE)-Liposomen mit rekombinantem 36K
3.5 Einfluss von Nukleotiden auf die Konformation des rekombinanten 36K-Proteins 3.5.1 Tryptophan-Fluoreszenz-Spektren von rekombinantem 36K ± Nukleotide
3.5.2 Fern-UV-Circulardichroismus-Spektroskopie von rekombinantem
36K ± Nukleotide
3.5.3 Elektronenspin-Resonanz-Spektroskopie (ESR-Spektroskopie) von
rekombinantem 36K ± Nukleotide
3.6 Untersuchungen zur Penetration des 36K-Proteins in einen Phospholipid-Bilayer 3.6.1 Kontrollierter proteolytischer Verdau von membrangebundenem 36K
3.6.2 Einfluss von Nukleotiden auf Trypsinisierung von membrangebundenem
36K
3.6.3 Spaltung von rekombinantem 36K mit 2-Nitro-5-Thiocyanobenzonsäure
(NTCB) in Lösung
3.6.4 Spaltung von membrangebundenem rekombinanten 36K mit
2-Nitro-5-Thiocyanobenzonsäure (NTCB)
3.6.5 Random-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer- (Random-FRET-)
Untersuchung zwischen rekombinantem 36K-QSY und 7-Nitrobenz-2-
oxa-1,3-Diazol-4-yl-Phosphatidylcholin (NBD-PC)
3.6.6 Hypothetisches Modell der Lage von 36K in der „Major Dense Line“ des
ZNS-Myelins der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss)
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INHALTSVERZEICHNIS
3.7 Interaktionen zwischen 36K und anderen Myelinproteinen aus dem ZNS der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss)
3.7.1 Myelinprotein-Extraktionen aus dem Fisch-ZNS mit dem nicht-ionischen
Detergenz Digitonin (Fa. Merck, Schwalbach/Ts.)
3.7.2 Blue-Native Polyacrylamidgel-Elektrophorese (BN-PAGE) der
Myelinprotein-Extraktion aus dem ZNS der Forelle
3.7.3 Co-Immunopräzipitation von Myelinprotein-Komplexen aus dem ZNS-
Myelin der Forelle
3.8 Hypothetisches Modell der Lage und der Interaktionen von 36K mit Proteinen in der „Major Dense Line“ des ZNS-Myelins der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss)
4. DISKUSSION 5. LITERATUR 6. ANHANG 6.1 36K-Aminosäure-Sequnenz mit Sekundärstruktur-Vorhersage
(nach 3.1.2) und Trypsinisierungsstellen nach PeptidCutter
(Expasy-Internet-Server)
6.2 Klonierungsschema der 36KcDNA in die MCS („multiple cloning site“)
des pET23a(+)-Vektors (Fa. Novagen, Schwalbach/Ts.)
(nach Diplom-Arbeit W. Moll, 2001)
6.3 Abkürzungen
6.4 Publikationen
DANKSAGUNG ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGKEIT DER ERBRACHTEN WISSENSCHAFTLICHEN LEISTUNG
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INHALTSVERZEICHNIS
ERKLÄRUNG ÜBER ETWAIGE FRÜHERE PROMOTIONSVERSUCHE CURRICULUM VITAE
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1. EINLEITUNG
1. EINLEITUNG
Im Laufe der Evolution wurde es für das Überleben der Tiere immer wichtiger,
aufgenommene Sinnesreize schnell zu verarbeiten und entsprechend reagieren zu
können. Die Reize werden dabei von den Sinnesorganen registriert und als
elektrische Erregung (Aktionspotentiale) über weit verzweigte Nervenbahnen
weitergeleitet. Dabei entwickelten sich zwei Wege, um eine hohe Geschwindigkeit
der Impulsfortleitung zu erreichen. Der eine Weg ist die Vergrößerung des
Axondurchmessers, was in eine Verminderung des inneren Längswiderstandes
resultiert. Dieses ist z. B. beim Riesenaxon der Tintenfische verwirklicht. Bei den
Vertebraten wird diese Möglichkeit durch die zunehmende Anzahl von Nervenzellen
bzw. deren Ausläufern (Axone) und den daraus resultierenden Platzmangel limitiert.
Um transmembrane Leckströme zu minimieren und die Membrankapazität zu
verringern, werden deren Axone mit einer isolierenden Schicht, dem Myelin, das zu
ca. 70% aus Lipiden besteht
(Morell, 1977), umhüllt (Ritchie,
1995). Diese Myelinhülle wird von
spezialisierten Gliazellen, den
Schwannschen Zellen im
peripheren Nervensystem (PNS)
und den Oligodendrozyten im
zentralen Nervensystem (ZNS),
gebildet. Bei der Myelinisisierung
wickeln sich deren abgeflachte
Membranfortsätze mehrfach
konzentrisch um die Axone und
bilden nach Verdichtung die
typische kompakte, multi-
lammelare Struktur des Myelins.
Abb. 1: A. Schematische Darstellung einesmyelinisierten Axons (aus Roger Eckert:„Tierphysiologie“). B. ElektronenmikroskopischeAufnahme der multilamellaren Struktur des Myelinsaus einem peripheren Nerv der Maus(Vergrößerung 87200fach, aus J. B. Metzler „LinderBiologie“)
-1-
1. EINLEITUNG
In regelmäßigen Abständen (ca. alle 100 µm) ist die Myelinscheide durch die so
genannten „Ranviersche Schnürringe“ unterbrochen. Eine Erregung breitet sich
ausschließlich über diese freiliegenden Axonbereiche aus
(„Saltatorische Erregungsleitung“). Innerhalb des kompakten Myelins unterscheidet
man zwei unterschiedliche Bereiche: Die aus der extrazellulären Apposition gebildete
„Intraperiod Line“ und die aus der cytosolischen Apposition gebildete „Major Dense
Line“. Innerhalb dieser Bereiche befindet sich eine limitierte Anzahl von Proteinen,
die aufgrund ihrer adhäsiven Eigenschaften zur Stabilisierung der übereinander
liegenden Membranlamellen beitragen. Dabei gibt es deutliche Unterschiede in der
Proteinzusammensetzung des ZNS-Myelins phylogenetisch älterer Vertebraten wie
den Fischen und jener phylogenetisch jüngerer Vertebraten (Abbildung 2)
(Jeserich, 1983; Waehneldt & Jeserich,
1984). Das Proteolipid-Protein (PLP), für
das eine adhäsive Funktion auf der
extrazellulären Seite angenommen wird
(Lees & Brostoff, 1984), ist bei den
Fischen durch 2 Isoformen von
P0-ähnlichen Glykoproteinen ersetzt
(Intermediär Protein 1 & 2; Stratmann &
Jeserich, 1995; Lanwert & Jeserich,
2001). Ein weiteres Protein, das nach
seinem Molekulargewicht als 36K
bezeichnet wird (Jeserich, 1983), sucht
man bei höheren Vertebraten vergebens.
Dieses neue, myelinspezifische Protein ist
nicht glykolisiert (Jeserich & Waehneldt,
1987) und ausschließlich in der
cytosolischen Apposition („Major Dense
Line“) des ZNS der Fische zu finden
(Jeserich & Waehneldt, 1986b; Jeserich &
Rauen, 1990). Da rekombinantes 36K mit Phospholipid-Bilayern interagiert
(Diplom-Arbeit W. Moll, 2001) scheint dieses Protein mit der Myelinmembran
assoziiert zu sein.
Abb. 2: Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel von Myelinproteinen aus dem ZNS der Ratte und der Forelle. CNP: 2´, 3´ Cyclisches Nukleotid 3´-Phospho-diesterase, PLP: Proteolipid Protein, (L/S) BP: (large/small) Basisches Protein, IP: Intermediär Protein. Aus Neuron-Glia Interrelations during phylogony: I. Phylogeny and Ontogeny of Glial Cells, A. Vernadaktis & B. Roots, Eds. Humana Press Inc., Totowa, Nj
-2-
1. EINLEITUNG
-3-
Immunologische Untersuchungen zeigten, dass 36K mit keinem der polyklonalen
Antikörper gegen eines der bekannten Myelinproteine reagierte. Ebenso zeigten
erste Datenbank-Analysen überraschenderweise keine Homologien zu den
Myelinproteinen, sondern zu den NAD(P)(H)-abhängigen Oxidoreduktasen
(Dissertation Strelau, 1997). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde versucht
über einen Dehydrogenase-Assay sowohl eine entsprechende Aktivität als auch ein
mögliches Substrat zu identifizieren. Alternativ wurde für das membranassoziierte
36K, das neben IP1 & 2 und Basischen Myelinprotein (MBP) eines der
Hauptmyelinproteine im ZNS der Fische darstellt (vgl. Abbildung 2), eine Funktion als
Strukturprotein innerhalb der „Major Dense Line“ vermutet. In diesem
Zusammenhang ist die von Blaurock et al. (1986) festgestellte strukturelle Dynamik
der Myelinlamellen im Fisch-ZNS zu erwähnen. Blaurocks Experimente zeigten
erstmals, dass es unter bestimmten physiologischen Bedingungen zu einer
Veränderung der Abstände innerhalb der Myelinlamellen und damit zu einer
Auflockerung des scheinbar starren Myelins kam. In wie weit 36K dabei eine Rolle
spielen könnte, wurde sowohl mit Hilfe von Liposomen als auch mit isoliertem
ZNS-Myelin untersucht. Aufgrund der Sequenzähnlichkeiten von 36K zu den
NAD(P)(H)-abhängigen Oxidoreduktasen wurde dabei auch die Beeinflussbarkeit
durch Nukleotide geprüft. Dieser Einfluss könnte auf Konformationsänderungen
basieren, die wiederum mit biophysikalischen Methoden analysiert wurden. Die
beschriebene Myelindynamik könnte auch das Resultat eines koordinierten
Zusammenspiels einiger, eventuell komplexierter Myelinproteine sein. Im Rahmen
dieser Dissertation wurde deshalb erstmals versucht, Protein-Komplexe aus dem
ZNS-Myelin nativ aufzutrennen und deren Komponenten zu identifizieren.
2. MATERIAL UND METHODEN
2. Material und Methoden
2.1 Material Soweit nicht anders vermerkt, wurden alle Chemikalien von der Fa. Roth (Karlsruhe)
in p. A.-Qualität bezogen.
2.1.1 Bakterienstämme
STAMM GENOM
E. coli BL21(DE3)/pLysS E. coli B F- dcm ompT hsdS(rB-mB
- galλ(DE3[pLysS Camr]
2.1.2 Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) Vom Forellenzuchtbetrieb Lindhorst-Emme (Stukenbrock) wurden 3-4 cm lange
Jungfische bezogen und in den hauseigenen Aquarien bei ca. 8-10°C gehalten.
2.2 Methoden
2.2.1 Computerunterstützte Aminosäure-Sequenzanalysen Die aus der 36K-cDNA resultierende Aminosäure-Sequenz (Diplom-Arbeit W. Moll,
2001) wurde mit Hilfe des JPred-Internet-Servers (University of Dundee,
Dundee, UK) auf vorhandene Sekundärstruktur-Motive untersucht (Cuff et al., 1998).
Die Protein-Datenbank-Recherche wurde mit dem BLAST-Internet-Server
(Altschul et al., 1990; Madden et al., 1996) durchgeführt und Sequenzähnlichkeiten
zwischen 36K und homologen Proteinen mit MultAlin, Version 5.4.1, (Corpet, 1988)
analysiert. Das resultierende Alignment wurde mit dem Computerprogramm
GeneDoc, Version 2.6.002, bearbeitet.
Mit dem SWISS-MODEL-Server (Guex und Peitsch, 1997) und dem
SwissPdb-Viewer, Version 3.7, wurde eine mögliche Tertiärstruktur der N-terminalen
Hälfte von 36K (L39 – V186) modelliert.
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2. MATERIAL UND METHODEN
2.2.2 Animpfen einer Bakterien-Über-Nacht-Kultur (ÜK) Zu Beginn dieser Arbeit lag die für das 36K-Protein codierende cDNA im
prokaryotischen Expressionsvektor pET23a(+) (Fa. Novagen, Schwalbach/Ts.) in
E. coli als –80°C-Dauerkultur vor (Diplom-Arbeit W. Moll, 2001). Um das Protein
heterolog zu exprimieren, wurden pro 500 ml Expressionsansatz 5 ml ÜK angelegt.
In sterile Kulturröhrchen wurde mit entsprechenden Antibiotika versetztes
LB-Medium (1% (w/v) Bacto-Trypton, 0.5% (w/v) Hefe-Extrakt; Fa. Otto Nordwald,
Hamburg; 1% (w/v) NaCl) gegeben und Bakterien aus der Dauerkultur überimpft. Die
Inkubation erfolgte über Nacht bei 37°C im Rüttler (180 rpm).
2.2.3 Heterologe Expression mit E. coli/pET-System (Fa. Novagen) Die heterologe Expression in E. coli/pET-System erfolgte im Wesentlichen nach
Protokoll des Herstellers (Fa. Novagen, Schwalbach/Ts.).
Der pET23a(+)-Vektor trägt unter der Kontrolle des induzierbaren
Bakteriophagenpromotors T7 eine Nukleotidsequenz, die für 6 aufeinanderfolgende
Histidine codiert. Durch Klonierung des Zielproteins unter Beachtung des
Leserahmens in den distalen Polylinker entsteht bei Expression eine c-terminale
„His6-Tag“-Zielprotein-Fusion, mit der dieses Fusionsprotein durch Ni2+-chelatierende
Sepharose (Affinitätschromatographie) aufgereinigt werden kann.
Zur heterologen Expression wurden 500 ml LBamp/cam-Medium (Endkonz.: 100 µg/ml
Ampicillin; 34 µg/ml Chloramphenicol) mit einer ÜK aus 2.2.2 angeimpft und bei 37°C
im Schikanekolben inkubiert (180 rpm). Bei einer OD600 von 0.7 bis 0.8 wurde mit
IPTG (Endkonz. 100 mM) die Translation induziert und für weitere 2 h bei 16°C
inkubiert. Nach dieser Zeit wurden die Zellen pelletiert (15 Minuten, 5000xg, 4°C), in
Lyse-Puffer (20 mM Tris/HCl pH 8, 500 mM NaCl) resuspendiert und ggf. bis zur
weiteren Verarbeitung bei –80°C gelagert (Moll et al., 2003).
2.2.4 Affinitätschromatographie mit Ni2+-chelatierender Sepharose Die Affinitätschromatographie mit Ni2+-chelatierender Sepharose wurde unter nativen
Bedingungen durchgeführt. Sie erfolgte nach einem modifizierten Protokoll des
Herstellers (His-Bind Kit, Fa. Novagen, Schwalbach/Ts.).
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2. MATERIAL UND METHODEN
Die resuspendierten Bakterien wurden bis zur Zelllyse sonifiziert und zur Pelletierung
der unlöslichen Bestandteile und Zelltrümmer für 30 min bei 16000xg und 4°C
zentrifugiert. Der filtrierte (0.42 µm-Filter) Überstand wurde auf eine mit Nickelsulfat
(NiSO4) geladene (Charge-Buffer mit 50 mM NiSO4) und mit Binding-Buffer
(20 mM Tris/HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 50 mM Imidazol) equilibrierte His-Bind
Sepharose-Säule (Fa. Novagen, Schwalbach/Ts.) gegeben. Das anschließende
Säulenwaschen erfolgte mit 10fachem Säulenbettvolumen Binding-Buffer und
13fachem Säulenbettvolumen Wash-Buffer (Lysepuffer mit 100 mM Imidazol). Das
Zielprotein wurde mit 3fachem Bettvolumen Elution-Buffer (Lyse-Puffer mit
150 mM Imidazol) von der Säule gelöst. In das Auffanggefäß vorgegebenes EDTA
(Endkonzentration 2 mM) komplexierte ausgewaschene Nickelionen. Vor der Dialyse
(Dialyseschläuche Fa. Serva, Heidelberg) gegen 100fach Volumen PBS-
(50 mM Na-/K-Phosphat, pH 7.4, 150 mM NaCl) oder Tris-Puffer (30 mM Tris/HCl,
pH 7.4, 150 mM NaCl) und vor jedem Experiment wurde die Proteinlösung zur
Entfernung von 36K-Aggregaten und sonstigen Partikeln ultrazentrifugiert
(30 Minuten, 200000xg, 4°C).
Die elektrophoretische Analyse durch SDS-PAGE (2.2.5) zeigte nach Anfärbung der
Proteine (2.2.6 oder 2.2.7) in der Elutionsfraktion eine einzige Bande mit dem
erwarteten Molekulargewicht. Im Western Blot (2.2.8 & 2.2.9) reagierte die Bande
eindeutig mit polyklonalen Antikörpern gegen das native Protein (Jeserich und
Waehneldt, 1986b; Moll et al., 2003). Die Protein-Konzentrationsbestimmung über
die Absorption von aromatischen Aminosäure-Resten bei 280 nm (Warburg-Formel;
Layne, 1957) zeigte, dass rekombinantes 36K-Protein im Milligramm-Maßstab
aufgereinigt werden konnte.
2.2.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (nach Laemmli) Zur analytischen Proteingelelektrophorese nach Laemmli (1970) wurde zunächst das
Trenngel mit entsprechender Acrylamid-Endkonzentration (12 bis 15% (v/v) aus
37.5:1 Acrylamid/Bisacrylamid-Fertiglösung), 1/1000 Volumen TEMED,
1/400 Volumen Ammoniumpersulfatlösung (10% (w/v)), 0.375 M Tris/HCl pH 8.8,
1% (w/v) SDS im Hoefer Mighty Small Gelcaster (Amersham Biosciences, Freiburg)
gegossen und mit Isopropanol überschichtet.
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2. MATERIAL UND METHODEN
Nach Polymerisation wurde das Isopropanol abgegossen, kurz mit Wasser gespült,
das 5%ige Sammelgel (wie Trenngel mit 0.375 M Tris/HCl, pH 6.8) eingefüllt und ein
Teflonkamm eingeführt. Die Proteinproben wurden vor dem Auftragen mit
Laemmlipuffer (0.125 mM Tris/HCl pH 6.8, 2% (w/v) SDS, 6% (w/v) Glycerin,
10% (v/v) ß-Mercaptoethanol), 0.4 mM Bromphenolblau) versetzt und für
5 min aufgekocht. Die Elektrophorese erfolgte bei 60 Volt im Sammelgel und
180 Volt im Trenngel. Nach Auslaufen der Bromphenolblaufront aus dem Trenngel
wurden die Proteinbanden nach 2.2.6, 2.2.7 oder 2.2.8 sichtbar gemacht.
2.2.6 Proteinanfärbung mit Coomassie-Lösung Zum Anfärben der Proteine wurde das SDS-PAGE-Gel aus 2.2.5 in Coomassie-
Lösung (0.1% (w/v) Brillant blue R250 in 500 ml Methanol, 75 ml Essigsäure, 425 ml
Aqua dest.) gegeben und mindestens 1 Stunde geschwenkt. Durch Aufkochen in
Aqua dest. (30 Min.) oder Schwenken in Entfärberlösung (7.5% (v/v) Essigsäure,
7.5% (v/v) Methanol, 5% (v/v) Glycerin) konnte überschüssiger Farbstoff entfernt
werden. Das Gel wurde nach Stabilisierung in Geltrocknungslösung
(22% (v/v) Ethanol, 1% (v/v) Methanol, 1% (v/v) Isopropanol, 2% (v/v) Glycerin) in
Zellophanfolie (Fa. Deti, Meckesheim) eingeschweißt und über Nacht getrocknet.
2.2.7 Proteinanfärbung durch Silberfärbung Für die Silberfärbung wurde das SDS-PAGE-Gel zunächst für mindestens
15 Minuten in Fixierer (45% (v/v) Methanol, 10% (v/v) Essigsäure, 45% (v/v) Aqua
dest.) geschwenkt. Nach zweiminütiger Inkubation in „Farmers Reducer“
(0.03 M K3[Fe(CN)6], 0.032 M Na2S2O3) wurde das Gel mit Aqua dest. gewaschen
bis der gelbe Hintergrund verschwunden war. Die Anfärbung der Proteine erfolgte im
0.1% (v/v)-Silbernitrat-Bad (30 min.). Nach je zweimaligem Waschen mit A. dest.
(30 sec.) und 2.5% (v/v) Na2CO3-Lösung (30 sec.) folgte die Entwicklung in
Formaldehyd-Lösung (0.4% (v/v) in 2.5% (v/v) Na2CO3-Lösung) bis die
Proteinbanden zu sehen waren. Die Reaktion wurde mit 10% (v/v) Essigsäure
gestoppt. Das Gel wurde nach Stabilisierung in Geltrocknungslösung (22% (v/v)
Ethanol, 1% (v/v) Methanol, 1% (v/v) Isopropanol, 2% (v/v) Glycerin) in
Zellophanfolie (Fa. Deti, Meckesheim) eingeschweißt und über Nacht getrocknet.
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2. MATERIAL UND METHODEN
Zur Reduzierung des Hintergrundes bzw. zum Entfärben von silbergefärbten
SDS-PAGE-Gelen wurde die Lösung A (15% (w/v) Na2S2O3, 1.2% (w/v)
Thioharnstoff in Aqua dest.) und Lösung B (5% (w/v) K3[Fe(CN)6]) in Verhältnis 1:1
gemischt. Je nach Grad der Abschwächung wurde die Misch-Lösung mit 2 (stark)
oder 4 (mäßig) Volumenteilen Aqua dest. versetzt und das Gel bis zur gewünschten
Entfärbung darin geschwenkt. Anschließend wurde das Gel unter häufigem
Wasserwechsel in Aqua dest. gewässert bis der gelbliche Hintergrund vollständig
verschwunden war.
2.2.8 Proteintransfer auf Nitrozellulose- oder Polyvinylidenfluorid- (PVDF-) Membran (Western-Blot)
Es wurden drei Lagen Blotpapier (Fa. Whatman, Bruchsal) in Größe des zu
blottenden Gels in Transferpuffer (25 mM Tris/HCl, pH 8.0, 20 mM Glycin,
20% (v/v) Methanol) getränkt und auf die Anode der Semi-Dry-Blotting Apparatur
(Fa. Phase, Lübeck) gelegt. Darüber wurde ein gleich großes mit Transferpuffer
getränktes Stück Nitrozellulose- (Fa. Schleicher & Schuell, Dassel) oder
Polyvinylidenfluorid- (PVDF-) Membran (Fa. Amersham Biosciences, Freiburg)
luftblasenfrei aufgelegt. Das darüber gelegte SDS-PAGE-Gel wurde vorher kurz in
Transferpuffer equilibriert und mit weiteren drei Lagen getränktem Blotpapier
blasenfrei bedeckt. Die Kathode der Blotkammer wurde auf das Sandwich gelegt und
mit ca. 1 kg beschwert. Der Protein-Transfer erfolgte bei 150 mA pro SDS-PAGE-Gel
(max. 25 V) für 1.5 h. Die auf die Membran transferierten Proteine wurden durch
Schwenken in Ponceau-S-Lösung (0.1% (w/v) Ponceau-S, 5% (v/v) Essigsäure)
reversibel angefärbt und überschüssige Ponceau-S-Lösung mit Aqua. dest. entfernt.
Der Größenstandard wurde vor der Protein-Entfärbung mit TBST (10 mM Tris/HCl
pH 8.0; 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) Tween-20) und anschließendem immuno-
logischen Protein-Nachweis (nach 2.2.9) mit dem Skalpell abgetrennt.
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2. MATERIAL UND METHODEN
2.2.9 Immunologischer Nachweis von Proteinen auf Nitrozellulose- oder Polyvinylidenfluorid- (PVDF-) Membran
Um unspezifische Antikörperbindung zu vermeiden, wurde die proteintragende
Nitrozellulose- bzw. Polyvinylidenfluorid- (PVDF-) Membran aus 2.2.8 für 30 min in
TBST/Gelatine (10 mM Tris/HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) Tween-20,
0.3% (w/v) Gelatine) geschwenkt. Nach 1 bis 2 Stunden Inkubation mit
entsprechenden Antikörpern (verdünnt in TSBT/Gelatine) und 6x5 minütigem
Waschen der Membran mit TBST/Gelatine wurde der sekundäre
Meerrettich-Peroxidase gekoppelte Antikörper (ebenfalls verdünnt in TBST/Gelatine)
für 1 Stunde dazugegeben. Überschüssige Antikörper wurden durch abschließendes
Waschen der Membran in TBS (10 mM Tris/HCl pH 8.0 150 mM NaCl) entfernt. Die
Peroxidase gekoppelten Antikörper wurden mit Hilfe von Chemoluminiszenz auf
ECL-Film (Fa. Amersham Pharmacia, Freiburg) sichtbar gemacht.
2.2.10 Fern-UV-Circulardichroismus-Spektroskopie (CD-Spektroskopie) von rekombinantem 36K in Lösung
Die Fern-UV-Circulardichroismus-Spektroskopie (CD-Spektroskopie) wurde mit
einem Jasco J-600 Spektropolarimeter bei 20°C durchgeführt. Dazu wurden bei einer
Integrationszeit von 50 nm/s drei Spektren von je 0.12 mg/ml (3 µM) rekombinantem
36K (2.2.2 - 2.2.4) in PBS (50 mM Na/K-Phosphat, 150 mM NaCl, pH 7.4) über einen
Wellenlängen-Bereich von 185 bis 260 nm gemittelt. Die path length der Küvette
(Hellma, Müllheim) betrug 1 mm. Der Anteil von α-Helices, β-Faltblättern, β-Turns
und ungeordneter Strukturen („random coil“) wurde mit dem Computer-Programm
CDNN, Version 2.1 kalkuliert. Dabei wurde das erhaltene CD-Spektrum mit denen
von Proteinen mit bekannter Sekundärstruktur verglichen (Böhm et al., 1992). Der
Einfluss von Nukleotiden auf die Sekundärstruktur-Verteilung wurde durch Zugabe
von 0.6 mM NAD, NADP oder deren reduzierter Formen untersucht.
-9-
2. MATERIAL UND METHODEN
2.2.11 Tryptophan-Fluoreszenz-Studien von rekombinantem 36K in Lösung In der Primärstruktur von 36K (3.1.2) befinden sich 6 Tryptophane. Deren
Fluoreszenz nach Erregung bei 280 nm wurde mit einem SLM-Aminco
8100-Spektrometer (Fa. Polytec, Waldbronn) bei 4°C und einer Spaltbreite von 8 mm
gemessen. Dazu wurde 2 µM rekombinantes 36K in PBS pH 7.4
(50 mM Na/K-Phosphat, 150 mM NaCl) (2.2.2 - 2.2.4) in eine Quarzküvette
(Fa. Hellma, Müllheim) gegeben und Fluoreszenz-Spektren (300 bis 370 nm)
aufgenommen. Hinweise auf Konformationsänderungen sollten aufgrund von
Fluoreszenzlöschung nach Zugabe von 0.2 bzw. 0.4 mM Nukleotide erhalten
werden.
Nach Kd=[Nukl.]*(∆Fmax-∆F)*(∆F)-1 (Lin et al., 1997) wurden die jeweiligen
apparenten Dissoziationskonstanten berechnet, wobei für Fmax die größte
gemessene Fluoreszenzreduktion bei 0.4 mM NADH angenommen wurde.
2.2.12 Elektronenspin-Resonanz-Spektroskopie (ESR-Spektroskopie) rekombinantem 36K in Lösung
Die ESR-Spektroskopie wurde in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. H.-J. Steinhoff
(AG Experimentelle Physik, Universität Osnabrück) durchgeführt. Zum Einfügen des
Nitroxid-Spinlabels (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolin-3-methyl)-Methanthiosulfonat
(MTS, Fa. Toronto Research Chemicals, Kanada) über die Sulfhydrylgruppen der
beiden einzigen im Protein vorhandenen Cystein-Reste wurde die sonifizierte
Bakteriensuspension aus 2.2.3 filtriert (0.45 µm) und auf eine nach 2.2.4 vorbereitete
His-Bind Sepharose-Säule (Fa. Novagen, Schwalbach/Ts.) gegeben. Nach Waschen
mit 10 bzw. 8fachem Säulenbettvolumen Binding-Buffer (20 mM Tris/HCl, pH 8.0,
500 mM NaCl, 50 mM Imidazol) und Wash-Buffer (20 mM Tris/HCl, pH 8.0,
500 mM NaCl, 100 mM Imidazol) wurde 0.15 mM (~10fach molare
Proteinkonzentration auf Säule) MTS aus einer 10 mM Stock-Lösung (in DMSO) in
6 ml Wash-Buffer zu dem gebundenen rekombinanten 36K gegeben und die
Sepharose über Nacht bei 4°C geschwenkt. Nach Waschen mit weiteren
7 Bettvolumen Wash-Buffer wurde MTS-gelabeltes 36K (36K-MTS) wie unter 2.2.4
beschrieben von der Säule eluiert und gegen 100fach PBS pH 7.4
(50 mM Na/K-Phosphat, 150 mM NaCl) dialysiert.
-10-
2. MATERIAL UND METHODEN
Für die ESR-Spektroskopie wurde das Protein mit Centriprep-Säulen (Fa. Millipore,
Schwalbach/Ts.) nach Vorschrift des Herstellers auf mindestens 10 µM (0.4 mg/ml)
konzentriert und vor jeder Messung ultrazentrifugiert (30 Minuten, 200000xg, 4°C).
Das ESR-Spektrum wurde von Prof. Dr. H.-J. Steinhoff aufgenommen.
2.2.13 Röntgenkleinwinkelstreuung von rekombinantem 36K in Lösung Die Röntgenkleinwinkeldaten von rekombinantem 36K in Lösung (2.2.2 - 2.2.4)
wurden von PD Dr. G. Grüber (Inst. f. Biophysik, Universität des Saarlandes,
Homburg/Saar) aufgenommen und mit Hilfe des Programms DAMMIN ausgewertet.
2.2.14 Assoziation von rekombinantem 36K an phospholipidbeschichtete Silica-Kügelchen („TRANSIL“; Fa. Nimbus, Leipzig)
Die mit einem Phosphatidylcholin- (PC-) Bilayer beschichteten Transil-Kügelchen
wurden von Firma Nimbus (Leipzig) synthetisiert. Vor der Bindung von
rekombinantem 36K an die PC-Membran, wurden 2 µl der 50%igen
Transil-Suspension (111 µM PC) zunächst zweimal in 200 µl PBS pH 7.4
(50 mM Na/K-Phosphat, 150 mM NaCl) aufgenommen und bei Raumtemperatur (RT)
5 Minuten mit 3000xg zentrifugiert.
Zu den gewaschenen Kügelchen wurde 16 µM rekombinantes 36K (2.2.2 - 2.2.4)
gegeben (200 µl) und 1 Stunde bei RT unter Schütteln (500 rpm) inkubiert.
Anschließend wurden die Kügelchen pelletiert (5 Minuten, 3000xg, RT) und zum
Entfernen von nicht membranassoziiertem Protein zweimal mit PBS gewaschen. Für
die SDS-PAGE wurden die Membranen mit 2% SDS aufgelöst (15 Minuten, 500 rpm,
RT) und die Elektrophorese mit anschließender Proteinfärbung wie unter 2.2.5 und
2.2.6 beschrieben durchgeführt.
-11-
2. MATERIAL UND METHODEN
2.2.15 Kontrollierter proteolytischer Verdau von rekombinantem 36K mit Trypsin (Fa. Sigma-Aldrich, München)
Der kontrollierte proteolytische Verdau von rekombinantem 36K (2.2.2 - 2.2.4) wurde
statt bei (für Typsin) optimalen 37°C bei 30°C durchgeführt. Unter definierten 36K- zu
Trypsin-Verhältnissen (50:1, 500:1) wurde das Protein zwischen 0 und 20 Minuten
unter leichtem Schütteln (450 rpm) in PBS pH 7.4 (50 mM Na/K-Phosphat,
150 mM NaCl) trypsinisiert und die Reaktion nach entsprechender Zeit mit
8 mM Pefabloc (Fa. Serva, Heidelberg) gestoppt. Zur Identifizierung von
Trypsinisierungsstellen, die durch eine Membranassoziation geschützt sind, wurde
rekombinantes 36K vor dem proteolytischen Verdau an einen PC-Bilayer
(„TRANSIL“) gebunden (2.2.14) und nach Entfernen von nicht-assoziiertem Protein
einer Trypsinisierung ausgesetzt. Die entstandenen Fragmente wurden über
SDS-PAGE (2.2.5) aufgetrennt und mit Coomassie-Färbung (2.2.6) sichtbar
gemacht.
2.2.16 Chemische Spaltung von rekombinantem 36K mit 2-Nitro-5-Thiocyanobenzonsäure (NTCB)
NTCB (Fa. Sigma-Aldrich, München) spaltet Proteine chemisch an freien
Thiol-Resten (Jacobson et al., 1973; Bähler et al., 1989). Um zu prüfen, ob die 2 in
der Primärstruktur von 36K vorhandenen Cystein-Reste als Thiole vorliegen, wurde
5 mM NTCB (aus 40 mM NTCB in 50 mM Na/K-Phosphat pH 7.6) zu
13 µM (0.5 mg/ml) rekombinantem 36K (2.2.2 - 2.2.4) in PBS pH 7.4
(50 mM Na/K-Phosphat, 150 mM NaCl) gegeben und im Dunkeln für bis zu
48 Stunden bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von Laemmlipuffer (0.125 mM Tris/HCl
pH 6.8, 2% (w/v) SDS, 6% (w/v) Glycerin, 10% (v/v) ß-Mercaptoethanol,
0.4 mM Bromphenolblau) wurde die Reaktion durch das vorhandene
ß-Mercaptoethanol gestoppt und die Reaktionslösung für die SDS-PAGE (2.2.5)
vorbereitet.
Für die Spaltung von membranassoziiertem 36K wurde das Protein zunächst an
einen PC-Bilayer („TRANSIL“) gebunden (2.2.14) und nach Entfernen von
nicht-assoziiertem Protein der NTCB-Spaltung ausgesetzt. Die Spaltprodukte wurden
nach der SDS-PAGE (2.2.5) mit Coomassie-Färbung sichtbar gemacht (2.2.6).
-12-
2. MATERIAL UND METHODEN
2.2.17 Random-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (Random-FRET)-Untersuchungen von membranassoziiertem rekombinanten 36K
Für die Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Untersuchungen wurden
von der Fa. Nimbus (Leipzig) Silica-Kügelchen hergestellt, die mit einem Bilayer aus
Phosphatidylcholin (PC) und 1 mol% 7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-yl-Gruppe-PC
(NBD-PC) beschichtet waren. Dabei war das als Fluoreszenz-Donor fungierende
NBD an das Ende je einer Fettsäurekette fusioniert. Wie bei der Einfügung des
Nitroxid-Spinlabels für die ESR-Spektroskopie (2.2.12), wurde als
Fluoreszenz-Akzeptor QSY® 7 Maleimid (Fa. MoBiTec, Göttingen) im Laufe der
affinitätschromatographischen Aufreinigung über die 2 im Protein vorhandenen
Cystein-Reste in das rekombinante 36K (2.2.2 - 2.2.4) gebracht. Dazu wurden
0.25 mM QSY® 7 Maleimid (~ 10fach molare Proteinkonzentration auf Säule) aus
einer 10 mM Stocklösung (in DMSO) zu 6 ml Wash-Buffer (20 mM Tris/HCl pH 8.0,
500 mM NaCl, 100 mM Imidazol) gegeben und über Nacht bei 4°C mit dem an die
NiSO4-Sepharose gebundenen rekombinanten 36K geschwenkt. Nach Waschen mit
weiteren 7 Bettvolumen Wash-Buffer wurde QSY-markiertes 36K (36K-QSY) wie
unter 2.2.4 beschrieben von der Säule eluiert, gegen 100fach PBS pH 7.4
(50 mM Na/K-Phosphat, 150 mM NaCl) dialysiert und vor jeder Messung
ultrazentrifugiert (30 Minuten, 200000xg, 4°C).
Zur Bestimmung des spektralen Überlappungsintegrals (Jda=Σ(Fd*εa*λ4)/ΣFd;
Fd: Donor-Fluoreszenz, εa: molarer Extinktionskoeffizient vom Akzeptor [M-1*cm-1], λ:
Wellenlänge [nm]) und dem daraus resultierenden Förster-Abstand R0
(R0=[(8.79*10-5)*(κ2*n-4*Qd*Jda)] 1/6 Å; Wu, P. & Brand, L., 1994) wurde mit Hilfe eines
Shimadzu UV-2501 PC Zweistrahlphotomerters (Fa. Shimadzu Deutschland,
Duisburg) ein Absorptionsspektrum vom Akzeptor (36K-QSY) sowie mit einem
SLM-Aminco 8100-Spektrometer (Fa. Polytec, Waldbronn) ein Emissionsspektrum
vom Donor (NBD-PC) in PBS pH 7.4 (50 mM Na/K-Phosphat, 150 mM NaCl)
aufgenommen. Für die Berechnung von R0 wurde für den
Dipol-Dipol-Orientierungsfaktor (κ2) 2/3 (Wu, P. & Brand, L., 1994), für den
Brechungsindex des Mediums (n) 1.4 und für die Quantenausbeute von NBD in
Membranen in Abwesenheit des Akzeptors (Qd) 0.32 (Chattopadhyay, A., 1990)
angenommen.
-13-
2. MATERIAL UND METHODEN
Um die Energietransfer-Effizienz (Fluoreszenz-Reduktion des NDB durch
ausreichende Annäherung des proteingebundenen Akzeptors; Wu, P. & Brand, L.,
1994; Szöllősi et al., 2002) zwischen den Chromophoren zu bestimmen, wurde
rekombinantes 36K (2.2.2 - 2.2.4) bzw. 36K-QSY wie unter 2.2.14 beschrieben mit
dem PC/NBD-PC-Bilayer assoziiert, nicht gebundene Proteine ausgewaschen und
die NBD-Fluoreszenz-Spektren nach Erregung bei 467 nm aufgenommen. Mit Hilfe
des Computerprogramms Mathcad 2001 Professional (MathSoft, München) wurden
minimal mögliche Abstände zwischen Donor und Akzeptor bei verschiedenen
vertikalen Abständen mit der von Fung und Stryer ermittelten (1978)
Integral-Gleichung kalkuliert. Aufgrund des großen Durchmessers der
Silica-Kügelchen konnte dabei von einem planaren Bilayer ausgegangen werden.
2.2.18 Isolieren von Myelin aus ZNS der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss)
Zum Isolieren von Myelin aus dem ZNS der Regenbogenforelle wurden
800 mg Gesamthirn von 3 bis 8 cm langen Forellen in 10 ml 0.2 M eiskalter
Sucrose-Lösung homogenisiert und je 5 ml auf auf ein 0.6 M Sucrose-Bett (7 ml)
geschichtet. Nach der Zentrifugation in einem Ausschwingrotor (1 Stunde, 100000xg,
4°C) wurde das weiße Myelin in der Grenzschicht zwischen den Sucrose-Lösungen
entnommen, in 10 ml Eiswasser transferiert und in einem Festwinkelrotor erneut
zentrifugiert (10 Minuten, 8500xg, 4°C). Das pelletierte Myelin wurde noch 3 mal in
Eiswasser resuspendiert, zentrifugiert und schließlich bis zur Weiterverarbeitung bei
–80°C eingefroren.
2.2.19 Herstellen einer 5%igen (w/v) Digitonin-Stammlösung und Myelinprotein-Extraktion mit Digitonin
Eine 5% (maximale Löslichkeit) entsprechende Menge des Detergenzes Digitonin
(Merck, Schwalbach/Ts.) wurde in 98°C heißem Aqua dest. aufgenommen,
15 Minuten gekocht und anschließend bei 4°C mindestens 30 Minuten abkühlen
lassen. Aus dieser Stammlösung wurden die bei der im Folgenden beschriebenen
Myelinprotein-Extraktion verwendeten Digitonin-Puffer hergestellt.
-14-
2. MATERIAL UND METHODEN
Das nach 2.2.18 isolierte ZNS-Myelin wurde zunächst in je 100 µl 0.5% (w/v) und
1% (w/v) Digitonin (in 20 mM Tris/HCl pH 7.4, 0.1 mM EDTA, 50 mM NaCl,
10% (v/v) Glycerin, 1 mM PMSF) resuspendiert, für 10 Minuten bei Raumtemperatur
(RT) inkubiert und anschließend zentrifugiert (25000xg, 15 Minuten, 4°C). Zur
Extraktion der Myelinproteine wurde das resultierende (Myelin-)Pellet zweimal in je
100 µl 4% (w/v) Digitonin-Puffer aufgenommen, 10 Minuten bei RT inkubiert und die
nicht solubilisierten Membranen bei 25000xg, 15 Minuten, 4°C pelletiert. Der
Überstand mit den gelösten Proteinen wurde abgenommen und die
Protein-Konzentration mit einem Amidoschwarz-Tüpfel-Test (2.2.20) bestimmt.
2.2.20 Protein-Konzentrationsbestimmung mit Amidoschwarz-Tüpfel-Test Zur Bestimmung der Protein-Konzentration wurde 1 µl Proteinlösung auf eine
Nitroacetat-Membran gegeben und für 2 Minuten in Amidoschwarzlösung
(0.5% (w/v) Amidoschwarz in 90% (v/v) Methanol, 10% (v/v) Essigsäure) gebadet.
Überschüssiger Farbstoff wurde im Methanol/Essigsäure-Bad (9:1) entfernt und die
Proteinkonzentration mit Hilfe einer BSA-Eichreihe bestimmt.
2.2.21 Messung einer Dehydrogenase-Aktivität im isolierten ZNS-Myelin der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss)
Nach Cammer et al. (1982) wurde die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Aktivität
im isolierten Myelin bestimmt. Dabei wird das bei der Umwandlung von
Glucose-6-Phosphat zu 6-Phosphoglucono-δ-lacton aus der Reduktion von NADP
entstehende NADPH durch die Absorptionszunahme bei 320 nm nachgewiesen.
Es wurden 3 µl nach 2.2.18 isoliertes Fisch-ZNS-Myelin (resuspendiert in
200 µl 30 mM Tris/HCl, pH 7.4) in Reaktionspuffer (30 mM Tris/HCl pH 7.4,
6.25 mM MgCl2, 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM Glucose-6-Phosphat) gegeben und die
Reaktion nach 20 Minuten Vor-Inkubation (Absorptionsabnahme durch Triton X-100)
mit 0.1 mM NADP (zur Kontrolle NADPH) gestartet. Die Zunahme der Absorption bei
320 nm (Biophotometer Fa. Eppendorf, Hamburg) wurde über die Zeit beobachtet
und die Aktivität nach (A320/t)*(Vtotal/6.22)*(1/VMyelin) [µmol/min/mg] berechnet.
-15-
2. MATERIAL UND METHODEN
Zur Untersuchung einer Dehydrogenase-Aktivität von myelininternem 36K wurde der
beschriebene Ansatz ohne Glucose-6-Phosphat im Reaktionspuffer durchgeführt.
Dazu wurde eine mögliche Reaktion mit Myelinkomponenten als Substrat mit
0.1 mM Nukleotiden gestartet.
Zur Verstärkung der potentiellen Dehydrogenase-Aktivität wurden nach Vor-
Inkubation in 30 mM Tris/HCl pH 7.4, 6.25 mM MgCl2, 1% (v/v) Triton X-100 und
0.1 mM Nukleotide als Reaktionsstart 80 µg/ml rekombinantes 36K (2.2.2 - 2.2.4)
zugegeben und die Absorption bei 320 nm über die Zeit verfolgt.
2.2.22 Herstellung von Phosphatidylcholin/Phosphatidylethanolamin-Liposomen
Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidylethanolamin (PE) stellen die
Hauptphospholipide im ZNS-Myelin der Forellen dar. Zur Herstellung von großen,
mulitlamellaren Vesikeln (large multilamellar vesicles, LMV) wurden
75% (w/v) Phosphatidylcholin und 25% (w/v) Phosphatidylethanolamin (in
Chloroform; Fa. Larodan, Schweden) zusammengegeben und das Chloroform unter
einem Stickstoff-Strahl verblasen. Der entstandene Lipidfilm wurde mit mind.
74°C (Tm von PE) heißem Tris-Puffer (30 mM Tris/HCl pH 7.4, 150 mM NaCl) für
1 Stunde unter starkem Rühren rehydriert und die Liposomen-Suspension (~1.3 mM)
bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.
2.2.23 Aggregationsassay von Phosphatidylcholin (PC)/Phosphatidyl-ethanolamin/(PE)-Liposomen mit rekombinantem 36K
Nach de la Fuente und Parra (1995), Lee und Pollard (1997) und Stieglitz et al.
(2001) wurden 0.1 mM PC/PE-Liposomen aus 2.2.22 mit 0.4 mg/ml rekombinantem
36K in Tris-Puffer (30 mM Tris/HCl pH 7.4, 150 mM NaCl) (2.2.2 - 2.2.4) versetzt und
die Absorption bei 320 nm (Biophotometer Fa. Eppendorf, Hamburg) über die Zeit
beobachtet. Um den Einfluss von Nukleotiden zu untersuchen, wurde entweder
0.1 mM NAD, NADP oder deren reduzierte Formen zu dem Ansatz gegeben.
-16-
2. MATERIAL UND METHODEN
2.2.24 Blue-Native Gradienten-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (BN-PAGE) (1. Dimension)
Nach Schägger & von Jagow (1991), Schägger et al. (1994) und Brookes et al.
(2002) wurden die nach 2.2.18 aus der Myelin-Membran extrahierten Proteine bzw.
Protein-Komplexe über ein natives Gradienten-Polyacrylamidgel elektrophoretisch
aufgetrennt. Dazu wurde mit Hilfe einer Hoefer Mighty Small Gradientengelcaster
(Amersham Biosciences, Freiburg), in dem eine ~1 cm Isopropanol-Schicht
vorgegeben wurde, ein 6-16%iges Polyacrylamid-Trenngel (6 bzw.
16% Acrylamid/Bisacrylamid aus 24:1-Stocklösung, 500 mM Aminocapronsäure,
50 mM Bis-Tris pH 7.0, 10% (w/v) Glycerin, 1/400 Volumen
Ammoniumpersulfatlösung (10% (w/v)) und 1/4000 Volumen TEMED gegossen.
Nach der Polymerisation wurde der Alkohol entfernt, vorsichtig mit Wasser gespült
und nach Auffüllen mit 4%iger Sammelgel-Lösung (4% Acrylamid/Bisacrylamid aus
24:1-Stocklösung, 500 mM Aminocapronsäure, 50 mM Bis-Tris pH 7.0,
10% (w/v) Glycerin, 1/125 Volumen Ammoniumpersulfatlösung (10% (w/v)) und
1/1250 Volumen TEMED) gegossen ein Teflonkamm eingefügt. Die Proteinproben
wurden auf 0.8 mg/ml verdünnt, mit BN-Probenpuffer (0.25% (w/v) Brillant Blue G250
in 25 mM Aminocapronsäure) versetzt und kurz vor dem Auftragen zentrifugiert
(2 Minuten, 10000xg, 4°C). Die nötige negative Ladung wurde durch den Farbstoff
Brillant Blue G250 an die Proteine gebracht. Aufgrund der daraus resultierenden
elektrischen Abstoßung wurde außerdem die Aggregation der Proteine im Gel
verhindert. Um dieses während der gesamten Elektrophorese-Dauer zu
gewährleisten, wurde zum Kathoden-Puffer (15 mM Bis-Tris pH 7.0, 50 mM Tricine)
0.02% (w/v) Brilliant Blue G250 geben, das nach der Hälfte der Elektrophorese auf
0.01% (w/v) reduziert werden konnte. Zu der Anode wurde ein Puffer aus
50 mM Bis-Tris pH 7.0 gegeben.
Die Elektrophorese wurde bei 4°C mit 40 Volt gestartet und nach Eintritt der
Farbstoff-Front in das Sammelgel auf 110 Volt erhöht. Nachdem die Front den
Anoden-Puffer erreicht hatte, wurde das Gel zur Proteinanfärbung in einem
Coomassie-Bad (Brilliant Blue R250) (2.2.6) geschwenkt.
-17-
2. MATERIAL UND METHODEN
2.2.25 SDS-PAGE der durch BN-PAGE aufgetrennten Myelinprotein-Komplexe (2. Dimension)
Zur Analyse der Protein-Zusammensetzung der durch BN-PAGE (1. Dimension)
(2.2.24) aufgetrennten Komplexe wurde entweder die gesamte Spur oder die
Komplexe mit einem scharfen Skalpell aus dem Gel geschnitten. Diese wurden auf
die Aluminium-Platte der Elektrophorese-Einrichtung gelegt und zum Einbringen der
nötigen negativen Ladung an die Protein bzw. zum Hydrolysieren von
Disulfid-Brücken für 2 Stunden mit 1% (w/v) SDS/1% (v/v) β-Mercaptoethanol
überschichtet. Im Anschluss wurde wie unter 2.2.5 beschrieben ein Trenngel und ein
dünnes Sammelgel bis ~0.5 cm unter die Gel-Fragmente gegossen. Diese wurden in
0.8% Agarose eingebettet und die Elektrophorese unter den üblichen Bedingungen
durchgeführt. Durch Silberfärbung wurden die aufgetrennten Proteine schließlich
sichtbar gemacht (2.2.7).
2.2.26 Separation der Myelin-Proteinkomplexe mit ProFound-Co-Immunopräzipitation Kit (Perbio Science, Bonn)
Mit Hilfe der entsprechenden polyklonalen Antikörper wurden die mit 36K, IP2 und
MBP assoziierten Proteine mit dem ProFound-Co-Immunopräzipitation Kit
(Perbio Science, Bonn) separiert. Dabei wurde im Wesentlichen nach Vorschrift des
Herstellers verfahren. Die Seren wurden mit 400 µl „Coupling Buffer“ 1/80 verdünnt,
zu 100 µl Matrix (aus 200 µl Suspension) gegeben und nach Zugabe von
1 µl 5 M Natrium-Cyanoborohydrid für 5 Stunden inkubiert. Zur längeren
Aufbewahrung der Antikörper-tragenden Matrix bei 4°C in „Coupling Buffer“ wurde
Natriumazid (Endkonzentration 0.02% (w/v)) zu der Suspension (400 µl) gegeben.
Für die Co-Immunopräzipitation wurden die Antikörper-Matrix-Suspensionen zum
entfernen des Lagerungspuffers zentrifugiert (1 Minute, 4000xg, RT) und mit der auf
400 µl verdünnten Protein-Extraktion (2.2.18) resuspendiert. Nach 3-stündiger
Inkubation bei RT in einem Überkopftaumler wurde der Ansatz erneut zentrifugiert
und nicht gebundene Proteine durch viermaliges Waschen in 300 µl gefolgt von
einmaligem Waschen in 100 µl Extraktionspuffer (4% Digitonin (w/v) in
20 mM Tris/HCl pH 7.4, 0.1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 10% (v/v) Glycerin,
1 mM PMSF) entfernt.
-18-
2. MATERIAL UND METHODEN
-19-
Die mit den Antikörpern assoziierten Proteine bzw. Protein-Komplexe wurden durch
dreimalige Inkubation mit „Elution-Buffer“ (5 Minuten, 750 rpm, RT) abgelöst und
durch Zentrifugation (1 Minute, 4000xg, RT) separiert. Die Proteinlösung wurde mit
Laemmli-Puffer (0.125 mM Tris/HCl pH 6.8, 2% (w/v) SDS, 6% (w/v) Glycerin,
10% (v/v) ß-Mercaptoethanol, 0.4 mM Bromphenolblau) versetzt und einer
SDS-PAGE (2.2.5) unterzogen. Mit Hilfe einer Silberfärbung (2.2.7) wurden die
auftrennten Proteine sichtbar gemacht und die Gele anschließend zur Aufbewahrung
in Zellophanfolie eingeschweißt.
3. ERGEBNISSE
-20-
3. ERGEBNISSE
3.1 COMPUTERUNTERSTÜTZTE ANALYSE DER 36K-AMINOSÄURE-SEQUENZ
Zu Beginn dieser Arbeit lag die vollständige, exprimierbare cDNA des Myelinproteins
36K als Bakteriendauerkultur vor (Diplom-Arbeit W. Moll, 2001). Die daraus
resultierende Sequenz von 325 Aminosäuren wurde für die folgenden
computergestützten Sequenz-Analysen verwendet.
3.1.1 Homologie-Alignment der Aminosäure-Sequenzen von 36K und Proteinen aus der Reduktase/Epimerase/Oxidoreduktase Superfamilie (RED)
Datenbank-Analysen mit dem BLAST-Internet-Server (Altschul et al., 1990; Madden
et al., 1996) der 36K-Aminosäure-Sequenz (2.2.1) zeigten keine signifikanten
Homologien zu allen bisher bekannten Myelinproteinen. Stattdessen gab es deutliche
Sequenzähnlichkeiten zu Proteinen aus der Reduktase/Epimerase/Oxidoreduktase
Superfamilie (RED) (Labesse et al., 1994; Kallberg et al., 2002). Abbildung 1 zeigt
ein Homologie-Alignment (2.2.1) der Aminosäure-Sequenzen von 36K und einem
humanen Protein unbekannter Funktion (FLJ13639), Retinol Dehydrogenasen von
Mensch (RDH 11) und Maus (UBE-1b) sowie der bereits kristallisierten
Carbonyl Reduktase vom Aal (Tanaka et al., 1996) und der
20-β-Hydroxysteriod-Dehydrogenase vom Zebrafisch (Gosh et al., 1991). Besonders
im N-terminalen Bereich, in dem sich auch das für die REDs charakteristische
Nukleotid-Bindemotif (GXXXGXG) befindet, stimmen die Aminosäuren abgesehen
vom FLJ13639 signifikant überein (Moll et al., 2003). Trotz abnehmender
Übereinstimmungen im Kern- und C-terminalen Bereich scheinen typische
Sequenzmotive der REDs im Bereich der Substrat-Bindtasche (YXXXK, PGXXXT)
zwischen 36K, FLJ13639, UBE-1b und RDH11 konserviert zu sein. Diese Motive
sind bei der Carbonyl Reduktase und der 20-β-Hydroxysteriod-Dehydrogenase durch
das Alignment in Richtung C-Terminus verschoben, können aber vermutlich trotzdem
als konserviert betrachtet werden. Ein Hinweis auf eine potentielles Substrat von 36K
konnte daraus nicht erhalten werden.
3. ERGEBNISSE
-21-
Aufgrund dieser signifikanten Motif-Übereinstimmungen könnte 36K in die
Reduktase/Epimerase/Oxidoreduktase Superfamilie eingeordnet werden. Nach den
Kriterien von Kallberg et al. (2002) wäre dieses Myelinprotein eine „klassische
Kurzkettige Dehydrogenase/Reduktase (SDR)“.
Abb. 1: Computerunterstützter Aminosäuresequenz-Vergleich (1-Buchstaben-Code) von 36K mitFLJ13639 (Protein unbekannter Funktion vom Menschen; Q9H8H1), UBE-1b (Maus RetinolDehydrogenase; Q9R1R8), RDH11 (Retinol Dehydrogenase vom Menschen; Q8TC12), CarbRed(Carbonyl Reduktase vom Aal; Q90X71) und Steroid-DH (20 β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase vomZebrafisch; Q9DF44). Swissprot-TrEMBL-Dateinummern sind kursiv angegeben; Aminosäure-Nummerierung beginnend vom N-Terminus; identische/ähnliche Aminosäuren sind schwarz markiert.
3. ERGEBNISSE
3.1.2 Sekundärstruktur-Vorhersage des 36K-Proteins mit dem JPred-Internet-Server
Mit Hilfe des JPred-Internet-Servers (2.2.1), der die Vorhersagen von
6 verschiedenen Algorithmen verarbeitet (Cuff et al., 1998) wurde eine
Sekundärstruktur-Analyse des 36K-Proteins durchgeführt. Abbildung 2 zeigt die
36K-cDNA-Sequenz (Moll et al., 2003) und die daraus abgeleitete Primärstruktur aus
325 Aminosäuren mit der vorhergesagten Sekundärstruktur.
1 M G N S T M S L Y R N S A 1 ATG GGT AAT TCA ACG ATG TCT CTT TAC CGC AAC TCC GCG
14 W F L K G M T E F T R S A 40 TGG TTT CTG AAA GGA ATG ACT GAA TTC ACC AGG AGT GCG
27 F L S A A K H F V E K D L 79 TTC CTG TCT GCA GCC AAG CAC TTT GTG GAA AAG GAC CTG
40 E V S M A G R V F M I T G 118 GAA GTG TCC ATG GCA GGC AGG GTC TTC ATG ATC ACT GGA
53 A N S G I G R A T A M A I 157 GCC AAC AGT GGC ATA GGG AGA GCT ACA GCC ATG GCC ATC
66 A K R G G T V H M V C R N 196 GCC AAG AGA GGT GGT ACA GTC CAC ATG GTG TGC AGG AAC
79 K D K A E E A R A D I V K 235 AAG GAT AAA GCA GAG GAG GCC AGG GCT GAC ATT GTC AAG
92 E S G N K E I Y V H I L D 274 GAG TCA GGA AAT AAA GAA ATA TAT GTC CAC ATT CTG GAC
105 L S E T R K V W E F A E A 313 CTA TCA GAG ACA CGG AAG GTT TGG GAA TTT GCA GAG GCC
118 F K R K Y K V L N L L I N 352 TTC AAG AGG AAG TAC AAA GTC TTG AAT TTA CTG ATA AAT
131 N A G C I M S E R D V N A 391 AAT GCA GGC TGC ATC ATG AGT GAG AGG GAT GTG AAC GCT
144 E G L E K S F A S N V M G 430 GAG GGG CTG GAG AAG AGC TTT GCC AGT AAC GTC ATG GGT
157 V Y I L T R G L I P L L E 469 GTG TAT ATC CTG ACC AGG GGA CTG ATT CCC TTA CTG GAG 170 K S A E P R V I T V S S G 508 AAG AGT GCA GAG CCC AGA GTG ATC ACA GTT TCA TCT GGA
183 G M L V Q K L R T G N L Q 547 GGG ATG CTG GTC CAG AAG CTG AGG ACA GGG AAC CTG CAA
-22-
3. ERGEBNISSE
-23-
Demnach besteht das Protein aus alternierenden α-Helices (10) und β-Faltblättern
(7) (βαβ-Struktur). Diese sogenannte „Rossmann fold“ (Rossmann et al., 1974) ist
charakteristisch für Proteine aus der Reduktase/Epimerase/Oxidoreduktase
Superfamilie (RED). Wie bei den Proteinen aus dieser Familie ist das
Nukleotid-Bindemotif (GXXXGXG) zwischen dem ersten β-Faltblatt und der
darauffolgenden α-Helix lokalisiert (Moll et al., 2003).
Abb.2: cDNA-Nukleotidsequenz und daraus abgeleitete Aminosäuresequenz von 36Kmit Sekundärstruktur-Vorhersage nach JPret. ROT: α-Helices, GELB: β-Faltblätter.
196 T E I G R Y D G T M V Y A 586 ACA GAA ATA GGC CGC TAT GAC GGG ACC ATG GTC TAC GCA
209 Q H K R Q Q V V M T E Q W 625 CAG CAC AAG AGG CAA CAG GTG GTG ATG ACA GAG CAG TGG
222 A Q T H S N I H F S V M H 664 GCC CAA ACC CAT AGC AAC ATC CAC TTC TCA GTG ATG CAT
235 P G W V D T P A V A N A M 703 CCT GGC TGG GTG GAC ACA CCA GCG GTG GCC AAT GCC ATG
248 P D F H Q S M K D S L R T 742 CCT GAC TTC CAC CAG TCT ATG AAG GAC AGC CTG AGG ACC
261 P E Q G A D T V V W L A I 781 CCG GAG CAG GGG GCT GAC ACC GTG GTG TGG TTG GCC ATC
274 S E A A A T K P S G S F F 820 TCA GAA GCC GCC GCC ACC AAG CCC AGC GGA AGC TTC TTC
287 Q D R R M V S A H L P L A 859 CAG GAT CGG AGG ATG GTG TCG GCC CAC CTG CCC CTG GCC
300 W T H S S Q L E Q Q K F M 898 TGG ACC CAC AGT TCC CAG TTG GAG CAG CAG AAG TTC ATG
313 S V M E D L A K T F Q P H 937 AGT GTG ATG GAG GAT CTG GCC AAG ACC TTC CAG CCC CAC
326 * 976 TGA
3. ERGEBNISSE
-24-
3.1.3 3-dimensionales Modell des N-terminalen Teils von 36K Aus der in Abbildung 2 dargestellten 36K-Aminosäuresequenz konnte mit Hilfe des
SWISS-MODELL-Servers (Guex und Peitsch, 1997) und des SWISS-pdb-Viewer 3.7
ein 3-dimensionales Modell des N-terminalen Teils von 36K erzeugt werden.
Abbildung 3 zeigt den modellierten Teil des Proteins zwischen L39 und V186, der
nach 3.1.1 starke Homologien zu Proteinen aus der RED-Superfamilie aufweist. Das
dargestellte Molekül hat eine sehr geordnete Struktur mit β-Faltblättern im Zentrum
und α-Helices in der Peripherie. Das eingezeichnete Nukleotid-Bindemotif liegt in
einer „Tasche“ zwischen einem β-Faltblatt und der darauffolgenden α-Helix. Das
Modell bestätigt für den N-terminalen Teil von 36K die Sekundärstruktur-Vorhersage
aus 3.1.2 und zeigt die für REDs charakteristische βαβ-Struktur („Rossmann fold“)
(Rossmann et al., 1974).
Abb. 3: Struktur-Modell des N-terminalen Teils von 36K (L39 bis V186)modelliert mit SWISS-pdb-Viewer 3.7 zeigt βαβ-Struktur (Rossmann fold).ROT: α-Helices und GELB: β-Faltblätter. Putatives Nukleotid-BindmotifGXXXGXG ist angezeigt. α-Helix-Nummerierungen entsprechendSekundärstruktur-Vorhersage aus 3.1.2
3. ERGEBNISSE
-25-
3.2 UNTERSUCHUNG DER SEKUNDÄRSTRUKTURZUSAMMENSETZUNG DES REKOMBINANTEN 36K-PROTEINS MITTELS FERN-UV-CIRCULAR-DICHROISMUS-SPEKTROSKOPIE (CD-SPEKTROSKOPIE)
Zur Analyse der Sekundärstrukturzusammensetzung von 36K in Lösung wurde eine
Fern-UV-Circulardichroismus-Spektroskopie (CD-Spektroskopie) durchgeführt. Dabei
ergibt die Differenz der Absorptionen von links- und rechtscircular polarisiertem Licht
in Bezug zur Wellenlänge ein CD-Spektrum, dass Voraussagen zur
Sekundärstrukturzusammensetzung erlaubt. Dazu wurde mit 0.12 mg/ml (3 µM)
rekombinantem 36K in PBS pH 7.4 (2.2.2 - 2.2.4) wie unter 2.2.10 beschrieben das
in Abbildung 4A dargestellte gemittelte Spektrum aufgenommen. Dieses zeigt ein
Minimum bei 219 nm und ein Maximum bei 195 nm, was auf eine größtenteils
α-helicale Struktur des Proteins hindeutet (Yang et al., 1986).
Die Auswertung dieses UV-Spektrums mit Hilfe des Computerprogramms CDNN
(Böhm et al., 1992) ergab für das rekombinante 36K in Lösung die in Abbildung 4B
dargestellte Sekundärstrukturzusammensetzung von 35% ± 2% α-Helix,
12% ± 2% β-Faltblatt, 17% ± 2% β-Turn und 36% ± 2% ungeordnete Strukturen
(„random coil“). Dies steht in gutem Einklang mit den computergestützten
Vorhersagen aus 3.1.2 und 3.1.3, nach denen das Protein einen hohen Anteil
α-helicaler Strukturen aufweist.
Abb. 4: Sekundärstruktur-Zusammensetzung von rek. 36K nach CD-Spektroskopie.A: Fern-UV-CD-Spektrum in 50 mM PBS (150 mM NaCl) pH 7.4. B: Prozentuale Verteilung derSekundärstrukturen kalkuliert nach Böhm et al. (1992)
A B
3. ERGEBNISSE
3.3 RÖNTGENKLEINWINKELSTREUUNG VON REKOMBINANTEM 36K IN LÖSUNG
Die umhüllende Struktur des 36K-Proteins wurde in Kooperation mit
PD Dr. G. Grüber (Institut für Biophysik, Universität des Saarlandes, Homburg/Saar)
über Röntgenkleinwinkelstreuung von rekombinantem 36K in Lösung (2.2.2 - 2.2.4)
untersucht. Mit Hilfe des Programms DAMMIN konnte aus den gewonnenen
Streudaten die Quartärstruktur des Moleküls bestimmt werden. In Lösung hat das
36K-Protein demnach eine Länge von ~9 nm und setzt sich aus 2 Domänen mit den
Dimensionen von ~4 x 3 nm und ~5 x 4 nm zusammen (Abbildung 5). Mit BSA als
Referenzmolekül konnte eine apparente Molekularmasse von 35 ± 2 kD bestimmt
werden. In Zukunft soll rekombinantes 36K ebenfalls in Kooperation mit
PD Dr. G. Grüber kristallisiert werden, um über Röntgenstreuungsstudien eine
atomare Struktur des Moleküls zu erhalten.
Abb. 5: Die umhüllende Struktur des 36K-Proteins abgeleitet aus nach Röntgenkleinwinkeldaten; Studiewurde von PD Dr. G. Grüber (Inst. f. Biophysik,Universität des Saarlandes, Homburg/Saar)durchgeführt
-26-
3. ERGEBNISSE
-27-
3.4 UNTERSUCHUNGEN ZUR FUNKTION VON 36K
3.4.1 Messung der Dehydrogenase-Aktivität im isolierten Myelin Um die aus den Untersuchungen 3.1 und 3.2 erhaltenen Hinweise auf eine mögliche
Reduktase/Epimerase/Oxidoreduktase-Funktion von 36K zu prüfen, wurde zunächst
als Referenz die intrinsische Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Aktivität im
isolierten Forellen-Myelin (2.2.18) nach Cammer et al. (1982) bestimmt. Wie unter
2.2.21 beschrieben wurde dazu die durch das Auftreten von reduzierten Nukleotiden
bedingte Zunahme der Absorption bei 320 nm gemessen. Die Aktivität der
Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase wurde anhand der Reduktion von NADP bei
der Umwandlung von Glucose-6-Phosphat zu 6-Phosphoglucono-δ-lacton bestimmt
(Abbildung 6). Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0.1 mM NADP gestartet (zur
Kontrolle NADPH). Die daraus resultierende Aktivität von ~7 nmol/min/mg stimmte
mit den von Cammer et al. erhaltenen Werten gut überein. Es war also möglich unter
den beschriebenen Bedingungen myelininterne Dehydrogenase-Aktivitäten zu
messen.
Abb. 6: Untersuchung einer Dehydrogenase-Aktivität von 36K inisoliertem Forellen-Myelin in 30 mM Tris/HCl pH 7.4, 6.25 mM MgClB2B,±1 mM Glucose-6-Phosphat, 1% Triton X-100. Myelinkomponentenwurden als potentielle Substrate angenommen Die Reaktionen wurdennach 20 Minuten Vor-Inkubation mit 0.1 mM Nukleotiden gestartet. ZurKontrolle wurde die intrinsische Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase(Glc-6-P-DH)-Aktivität bestimmt.
3. ERGEBNISSE
-28-
36K stellt eines der Hauptmyelinproteine in ZNS der Regenbogenforelle dar
(Abbildung 23). Wenn es dort als Dehydrogenase fungiert, müsste die
entsprechende Aktivität ähnlich wie die der myelininternen Glucose-6-Phosphat-
Dehydrogenase zu messen sein. Aufgrund der Homologien von 36K zur
Carbonyl Reduktase und zur 20-β-Hydroxysteriod-Dehydrogenase (3.1.1) könnten
Myelinlipide als potentielle Substrate in Frage kommen. Deshalb wurde das
beschriebene Dehydrogenase-Assay ohne die Zugabe von Glucose-6-Phosphat
durchgeführt (2.2.21). Abbildung 6 zeigt deutlich, dass sich die Absorptionen im
Vergleich zu der von der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Reaktion kaum
ändern. Die Zugabe von rekombinantem 36K (2.2.2 - 2.2.4) zu der Myelinsuspension
führte zu dem in Abbildung 7 dargestellten Absorptionsverhalten, das nicht durch das
vermehrte Auftreten von reduzierten Nukleotiden zu erklären war. 36K bewirkte einen
Anstieg der Absorption, der durch NADP bzw. NADPH verlangsamt bzw. sogar
verhindert wurde. NAD und NADH beeinflussten die Zunahme nicht. Somit konnte
weder myelinintern noch durch Zugabe von rekombinantem Protein eine
Dehydrogenase-Aktivität von 36K im isolierten Myelin nachgewiesen werden.
Vielmehr schien es in der in der Myelin-Suspension zu einer durch
NADP(H)-beeinflussbaren 36K-bedingten Micellen- oder Liposomen-Aggregation zu
kommen, die unabhängig vom Oxidationsstatus der Nukleotide war.
Abb. 7: Untersuchung der Dehydrogenase-Aktivität nach Zugabe von80 µg/ml rek. 36K und 0.1 mM Nukleotiden zu isoliertem Forellen-Myelinin 30 mM Tris/HCl pH 7.4, 6.25 mM MgClB2B, 1% Triton X-100.Reaktionsstart durch Zugabe von rek. 36K nach 20 MinutenVor-Inkubation
3. ERGEBNISSE
3.4.2 Aggregationsassay von Phosphatidylcholin (PC)/Phosphatidyl-ethanolamin (PE)-Liposomen mit rekombinantem 36K
Nach den Ergebnissen aus 3.4.1 konnte für 36K keine Dehydrogenase-Aktivität
festgestellt werden. Da 36K mit einem PC-Bilayer interagiert (Diplom-Arbeit W. Moll,
2001), wäre stattdessen eine strukturelle Funktion innerhalb der cytosolischen
Apposition („Major Dense Line”) im ZNS-Myelin der Fische denkbar. Um dies zu
prüfen, wurden 0.1 mM Phosphatidylcholin (PC)/Phosphatidylethanolamin
(PE)-Liposomen (2.2.22) in Tris-Puffer pH 7.4 mit 0.4 mg/ml rekombinantem 36K
(2.2.2 - 2.2.4) versetzt und die Absorption der Liposomen-Suspension bei 320 nm
über die Zeit verfolgt (2.2.23) (de la Fuente und Parra., 1995; Lee und Pollard, 1997;
Stieglitz et al., 2001). Abbildung 8A zeigt, dass die Absorption nach ca. 90 Minuten
kontinuierlich ansteigt, was auf ein vermehrtes Auftreten von aggregierten
Liposomen schließen läßt. Die Selbstaggregation von 36K bzw. der Liposomen (nicht
gezeigt) bleibt dagegen konstant gering. Desweiteren geht aus Abbildung 8A hervor,
dass die Zugabe von Nukleotiden deutliche Absorptionsänderungen hervorrief. Wie
bei den Experimenten mit isoliertem Fisch-ZNS-Myelin (3.4.2) schienen NADP und
NADPH die Aggregation zu unterbinden, während NAD und NADH diese hier sogar
förderten. Ebenso könnte ein größerer bzw. kleinerer Abstand zwischen aggregierten
Liposomen die unterschiedliche Absorption hervorgerufen haben. Der
Oxidationsstatus der Nukleotide spielte dabei offensichtlich keine Rolle. In Abbildung
8B sind die Absorptionsänderungen nach 330 Minuten gegenüber der Aggregation
ohne Nukleotide prozentual dargestellt. NAD(H) bewirkt demnach eine Zunahme von
30-40%, während NADP(H) die Absorption um 20-35% senkt. Die durch Nukleotide
beeinflußbare Absorption der Liposomen-Suspension und die Experimente mit
isoliertem Fischmyelin (3.4.1) deuten auf eine NADP(H)-regulierte Funktion von 36K
an bzw. zwischen Lipidmembranen hin. Bereits 1986 haben Blaurock et al. in
Röntgenkleinwinkelstreuungsstudien am Fisch-ZNS-Myelin beobachtet, dass es
unter bestimmten physiologischen Bedingungen zu einer reversiblen Erweiterung der
cytosolischen Aposition („Major Dense Line”) kam. Die beschriebenen
Aggregationsassays legen die Vermutung nahe, dass 36K eine Rolle als
nukleotidregulierter molekularer Schalter bei dieser „strukturellen Dynamik“ des
kompakten ZNS-Myelins spielen könnte.
-29-
3. ERGEBNISSE
B
A
Abb.8: Aggregation-Assay von 0.1 mM PC/PE-Liposomen und 0.4 mg/ml rek. 36K in30mM Tris/HCl pH7.4, 150mM NaCl, 1mM CaCl2. A: Einfluß von Nukleotiden (je 0.1 mM).B: Prozentuale Veränderung nach 330 Minuten.
-30-
3. ERGEBNISSE
3.5 EINFLUSS VON NUKLEOTIDEN AUF DIE KONFORMATION DES REKOMBINANTEN 36K-PROTEINS
Trotz der Sequenzähnlichkeiten, insbesondere durch das Nukleotid-Bindmotif, zu
den REDs konnte mit den Experimenten in 3.4 für 36K keine
Dehydrogenase-Aktivität nachgewiesen werden. Inwieweit das Protein mit
Nukleotiden interagiert und ob diese Wechselwirkung möglicherweise die
Konformation beeinflußt, wurde mit den folgenden Experimenten untersucht.
3.5.1 Tryptophan-Fluoreszenz-Spektren von rekombinantem 36K ± Nukleotide in Lösung
Die 6 Tryptophane in der Aminosäuresequenz von 36K ermöglichen über
Änderungen im Fluoreszenzspektrum die Untersuchung von
Konformationsänderungen des Proteins. Daher wurde nach 2.2.11 von
2 µM rekombinantem 36K in PBS pH 7.4 (2.2.2 - 2.2.4) das in Abbildung 9
dargestellte gemittelte Fluoreszenzspektrum (Tryptophan-Erregung bei 280 nm)
aufgenommen.
Abb. 9: Tryptophanfluoreszenz-Spektrum von 2µM rek. 36K in50 mM PBS (150 mM NaCl) pH 7.4 ± 0.2 mM Nukleotide.Tryptophan-Erregung bei 280nm
-31-
3. ERGEBNISSE
-32-
Die Zugabe von 0.2 mM Nukleotide (100fach) reduzierte die Fluoreszenz deutlich,
was auf eine zunehmende Entfaltung des Proteins hindeutete. Im Gegensatz zu den
Ergebnissen aus den Aggregationsassays (3.4.2) gab es hier Unterschiede zwischen
den oxidierten und reduzierten Formen. NAD und NADP verringerten die
Fluoreszenz um ca. die Hälfte, während NADH und NADPH diese fast vollständig
reduzierten. Die daraus resultierenden apparenten Dissoziationskonstanten (K Bd B) von
~140 µM für NAD, ~100 µM für NADP und ~30 µM für NADH bzw. NADPH wurden
nach KBd B=[Nukl.]*(∆FBmaxB-∆F)*(∆F)P
-1P (Lin et al., 1997) berechnet, wobei für FBmaxB die
größte gemessene Fluoreszenzreduktion bei 0.4 mM NADH angenommen wurde.
Aus diesem Grund sollten die berechneten K Bd B´s lediglich als Richtwerte angesehen
werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass 36K mit Nukleotiden wechselwirkt und dass
diese Interaktion vermutlich zu Veränderungen in der
Sekundärstrukturzusammensetzung führt, die im Folgenden mittels
Fern-UV-CD-Spektroskopie näher analysiert wurden.
3.5.2 Fern-UV-Circulardichroismus-(CD-) Spetroskopie von rekombinantem 36K ± Nukleotide in Lösung
Die Hinweise aus der Tryptophanfluoreszenz (3.5.1) auf eine nukleotidbedingte
Konformationsänderung von 36K wurden wie in 3.2. über die Analyse der
Sekundärstruktur-Zusammensetzung mit Hilfe der Fern-UV-CD-Spektroskopie näher
untersucht. Dazu wurden von 3 µM rekombinantem 36K (0.12 mg/ml) in PBS pH 7.4
(2.2.2 - 2.2.4) unter Zugabe von 0.6 mM (200fach) der jeweiligen Nukleotide
CD-Spektren aufgenommen. Die Auswertung der gemittelten Spektren mit dem
Programm CDNN (Böhm et al., 1992) ergab die erwarteten deutlichen Änderungen
der Sekundärstruktur-Zusammensetzung und damit der 36K-Konformation. In
Anwesenheit von Nukleotiden nahm der prozentuale Anteil von α-Helices auf Kosten
von β-Faltblättern und ungeordneter Strukturen („random coils“) deutlich ab.
Während sich der α-helicale Anteil unabhängig von der Art des Nukleotids in
gleichem Maße reduzierte (35%± 2% auf 7%± 2%), wurde der random coil-Anteil und
damit der Grad der Entfaltung unterschiedlich stark beeinflusst.
3. ERGEBNISSE
-33-
Wie bei der Tryptophan-Fluoreszenz (3.5.1) spielte dabei der Oxidationsstatus der
Nukleotide eine Rolle. NAD und NADP liessen den Anteil der ungeordneten
Strukturen von 36%± 2% auf ca. 50% ansteigen, während die reduzierten Formen
das Protein weiter entfalteten (ca. 60% random coils). Demnach könnte eine
Funktion des Myelinproteins 36K über nukleotid-regulierte Änderungen der
Konformation stattfinden.
3.5.3 Elektronenspin-Resonanz-Spektroskopie (ESR-Spektroskopie) von rekombinantem 36K ± Nukleotide in Lösung
Inwieweit die durch Tryptophan-Fluoreszenz (3.5.1) und CD-Spektroskopie (3.5.2)
festgestellten starken Konformationsänderungen den Bereich um die
Nukleotid-Bindetasche betreffen, wurde in Kooperation mit Prof. Dr. H.-J. Steinhoff
(AG Experimentelle Physik, Osnabrück) mit Hilfe der Elektronenspin-Resonanz-
Spektroskopie (ESR-Spektroskopie) geprüft. Dabei können über die Absorption von
Mikrowellenstrahlung durch ungepaarte Elektronen im Magnetfeld Rückschlüsse
u. a. zur Mobilität eines proteingebundenen Spinlabels gewonnen werden.
Abb. 10: Einfluß von Nukleotiden (0.6 mM) auf die Sekundärstruktur-Zusammensetzung von rek. 36K (3µM) in 50 mM PBS, pH 7.4 kalkuliert nachBöhm et al. (1992)
3. ERGEBNISSE
-34-
Der Lösung zugewandt, ist ein Spinlabel beweglicher als im Inneren eines Moleküls,
wo dieser durch Wechselwirkungen mit den Aminosäureresten in der Flexibilität
eingeschränkt wird. Eine hohe Mobilität des hier benutzten Nitroxidspinlabels wird
aufgrund des Kernspins des Stickstoffs durch 3 deutliche Maxima im ESR-Spektrum
angezeigt (Hubbel et al., 2000; Steinhoff, H.-J., 2002). Wie unter 2.2.12 beschrieben,
sollten unter Verwendung von (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolin-3-methyl)-
Methanthiosulfonat-Spinlabel (MTSSL, Fa. Toronto Research Chemicals, Kanada)
über die Sulfhydrylgruppen der 2 im Protein vorhandenen Cystein-Reste
(C76 und C134) Nitroxid-Seitenketten in das rekombinante 36K-Molekül eingefügt
werden. Aus dem resultierenden Absorptionsspektrum von 26µM rekombinantem
MTS-markierten 36K in PBS pH 7.4 konnte bestimmt werden, dass durchschnittlich
ein Cystein-Rest pro Molekül 36K mit dem MTSSL markiert wurde. Um zu
untersuchen, ob C76 oder C134 mit dem Spinlabel reagiert hatte, wurde nach 2.2.16
eine chemische Spaltung mit NTCB, das Proteine ausschließlich an reduzierten
Cysteinen spaltet, durchgeführt (vgl. 3.6.3). Das in Abbildung 11B dargestellte
coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gel (2.2.5 & 2.2.6) zeigt neben dem ungespaltenen
Protein (Pfeil 1) ein Fragment von ca. 30 kD (Pfeil 2), dessen abgespaltener Teil
(ca. 8 kD) aus dem Gel gelaufen war. Aufgrund des Molekulargewichts konnten
diese Spaltprodukte nur aus der Spaltung am nicht-modifizierten C76, das demnach
als Thiol vorlag, resultieren. Eine Spaltung am zweiten Cystein-Rest (C134) war nach
dessen Reaktion mit dem Methanthiosulfonat-Spinlabel nicht mehr möglich. Nach der
Sekundärstruktur-Vorhersage (3.1.2) und dem 3D-Modell des N-Terminus (3.1.3) ist
dieser Cystein-Rest zwischen dem vierten β-Faltblatt und der sechsten α-Helix im
Bereich der putativen Nukleotid-Bindetasche lokalisiert. Die beiden deutlich
reduzierten Maxima links und rechts neben dem zentralen ESR-Maximun deuten an,
dass der eingefügte MTSSL in seiner Mobilität eingeschränkt war und daher
versteckt innerhalb des Proteins vorlag. In Abbildung 11C ist exemplarisch das
ESR-Spektrum von 26 µM MTS-markiertem 36K in PBS pH 7.4 nach Zugabe von
5 mM NADP (200fach) dargestellt. Der Vergleich zum Spektrum in Abbildung 11A
zeigt deutlich, dass sich die Form des Spektrums und damit die Mobilität des MTSSL
nicht geändert hat. Der Bereich um die Nukleotid-Bindetasche scheint demnach nicht
von den starken Konformationsänderungen des 36K-Proteine unter Nukleotid-
Einfluss betroffen zu sein.
3. ERGEBNISSE
Abb. 11: A. ESR-Spektrum von 26 µM (1mg/ml) rek. MTS-markiertem 36K in 50 mM PBS (150 mM NaCl) pH 7.4. B. Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel einer NTCB-Spaltung von MTS-markiertem rek. 36K. St: Low Molecular Weight Standard (Amersham Biosciences,Freiburg). C. ESR-Spektrum von 26 µM (1mg/ml) rek. MTS-markiertem 36K in PBS (150 mM NaCl), pH 7.4 nach Zugabe von 5 mM NADP (~200fach); * 1. Ableitung derMikrowellenstrahlung im magnetischen Feld
A
C
B
-35-
3. ERGEBNISSE
3.6 UNTERSUCHUNGEN ZUR PENETRATION DES 36K-PROTEINS IN EINEN PHOSPHOLIPID-BILAYER
Vor Beginn dieser Arbeit konnte mit phospholipidbeschichteten Silica-Kügelchen
(„TRANSIL“; Fa. Nimbus, Leipzig) gezeigt werden, dass 36K mit Lipidmembranen
wechselwirkt (Diplom-Arbeit W. Moll, 2001). Mit Hilfe der folgenden Experimente
sollten erste Hinweise zur Membrantopologie von 36K erhalten werden.
3.6.1 Kontrollierter proteolytischer Verdau von membrangebundenem 36K Da die Primärstruktur von 36K viele Arginin- (18) und Lysine-Reste (20) aufweist,
wurde für den kontrollierten Verdau die Protease Trypsin (Fa. Sigma-Aldrich,
München) verwendet. Dazu wurde rekombinantes 36K (0.6 mg/ml) in PBS pH 7.4
(2.2.2 - 2.2.4) mit 1/50 bzw. 1/500 (bezogen auf die eingesetzte 36K-Menge) Trypsin
versetzt und jeweils von 0 bis 20 Minuten bei suboptimaler Temperatur (30°C)
proteolytisch verdaut (2.2.15). Abbildung 12 zeigt das resultierende
Typsinisierungsmuster nach SDS-PAGE und Anfärbung mit Coomassie-Lösung
(2.2.5 & 2.2.6).
Abb. 12: Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel des zeitabhängigenproteolytischen Verdaus von 0.6 mg/ml rek. 36K in PBS (150 mM NaCl)pH 7.4 mit 1/50 und 1/500 Trypsin. WB: Western Blot des 1/50-Verdausnach 0 Minuten. Nachweis mit monoklonalem polyHis-Antikörper.K: rek. 36K ohne Trypsin-Zugabe. St.: Low Molecular Weight Standard(Amersham Biosciences, Freiburg)
-36-
3. ERGEBNISSE
-37-
Unter strengen Bedingungen (50:1, 0 Minuten) entstehen neben dem unverdauten
Protein 2 Hauptfragmente, die aufgrund ihres Molekulargewichtes vermutlich aus der
einfachen Spaltung von 36K resultierten. Mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers
gegen den fusionierten His B6 B-Tag (polyHis-Antikörper) konnte das kleinere Fragment
als C-terminal identifiziert werden (WB in Abbildung 13; 2.2.8 & 2.2.9). Aufgrund des
apparenten Molekulargewichts dieses Fragmentes konnten K211 und/oder R212
(in α-Helix 7) als wahrscheinlichste Spaltstellen angenommen werden. Unter diesen
Bedingungen war rekombinantes 36K bereits nach 5-minütiger Trypsinisierung fast
vollständig proteolytisch verdaut.
Um zu prüfen, welche Proteinteile bzw. welche Spaltstellen nach der
Membranassoziation zugänglich bleiben, wurde 0.15 mg/ml (4 µM) rekombinantes
36K (2.2.2 - 2.2.4) wie unter 2.2.14 beschrieben an phosphatidylcholin-
(PC-)beschichtete Silicakügelchen gebunden und anschließend mit Trypsin
proteolytisch verdaut (1/125, 10 Minuten; 2.2.15). Dabei wurden die 36K-Teile, die
aus dem Bilayer herausragten, von den membrangeschützten Teilen abgetrennt.
Nach Pelletierung der Kügelchen und Auflösen der Membran mit 2% (w/v) SDS
wurden die unverdauten Proteinteile in ¼ Volumen Laemmli-Puffer aufgenommen
und elektrophoretisch (2.2.5) getrennt. Das in Abbildung 13 dargestellte
coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gel
(2.2.6) zeigt neben dem unverdauten
Protein 2 Hauptfragmente um 30 kD,
die mit einem polyHis-Antikörper als
C-Termini identifiziert werden konnten
(2.2.8 & 2.2.9). Mit Hilfe des
Molekulargewichts und des
36K-Modells aus 3.1.3 konnte die
Lage der Schnittstellen im
Molekül bestimmt werden. Demnach
befinden sich die entsprechenden
Arginin- und Lysin-Reste (R59 und
R77/L79) im Bereich des Nukleotid-
Bindemotifs.
Abb. 13: Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel einer Trypsinisierung (500:1, 10 Minuten)von PC-gebundenem rek. 36K.PL: Phospholipid. St.: Low Molecular WeightStandard (Amersham Biosciences, Freiburg)
3. ERGEBNISSE
Dies würde bedeuten, dass die für eine Regulation wichtige putative
Nukleotid-Bindetasche am N-Terminus beim Eintauchen des Moleküls in den
Lipidbilayer vom Cytosol her zugänglich bleibt. Die in Abbildung 13 mit den Pfeilen
1a und 2a markierten Fragmente, die nach Trypsinisierung in Lösung als C-terminal
identifiziert wurden, waren nach Membranassoziation nicht mehr zu finden. Als
korrespondierende Fragmente kämen die mit 1b und 2b angezeigten Spaltprodukte
in Frage (gestrichelte Pfeile). Aufgrund der Lokalisation der entsprechenden
Spaltstellen (K188/R190 bzw. K211/R212) scheint der C-Terminus daher ca. bis zum
V176 in den Bilayer einzutauchen und ist so vor dem proteolytischen Verdau
geschützt.
3.6.2 Einfluß von Nukleotiden auf die Trypsinisierung von membrangebundenem 36K
Die Ergebnisse aus 3.6.1 zusammen mit den nukleotidbedingten Änderungen in der
Sekundärstruktur-Zusammensetzung (3.5) und der Interaktion mit isoliertem
Fisch-Myelin (3.4.1) bzw. Liposomen (3.4.2) legen die Vermutung nahe, dass sich in
die Membran penetrierte Teile des Moleküls aufgrund der beschriebenen
Konformationsänderung aus einem Lipid-Bilayer herausstrecken könnten und
dadurch Arginin- bzw.
Lysin-Reste nicht mehr
vor dem proteolytischen
Verdau geschützt sind.
Dazu wurde wie unter
3.6.1 zunächst der
Einfluss von
3 mM Nukleotiden
(200fach) auf die
Trypsinisierung von
0.6 mg/ml (15 µM)
rekombinantem 36K in
Lösung (PBS pH 7.4)
(2.2.2 - 2.2.4) untersucht.
Abb. 14: Trypsinisierung (500:1, 10 Minuten) von 0.6 mg/ml(15 µM) rek. 36K in 50 mM PBS (150 mM NaCl), pH 7.4± 3 mM Nukleotide. Erläuterungen siehe Text. St.: LowMolecular Weight Standard (Amersham Biosciences,Freiburg)
-38-
3. ERGEBNISSE
-39-
Das in Abbildung 14 dargestellte coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gel (2.2.5 & 2.2.6)
dieses proteolytischen Verdaus (2.2.15) zeigt, dass sich die Trypsinisierungsmuster
in Anwesenheit von NADP und NADPH von den übrigen geringfügig unterscheiden.
Mit Pfeil 1 ist ein bei diesen beiden verstärkt auftretendes Fragment markiert, das bei
einem Verdau ohne Nukleotide und unter NAD(H)-Einfluss weniger stark auftrat.
Gleichzeitig nahm der Anteil an hochmolekularen Fragmenten (Pfeil 2a) etwas ab,
während die Menge eines niedermolekularen Fragmentes (Pfeil 2b) in Anwesenheit
von NADPH zunahm. Im Western Blot mit anschließendem immunologischen
Nachweis (2.2.8 & 2.2.9) reagierte keines dieser Fragmente mit dem
polyHis-Antikörper und erlaubte somit keine exakte Aussage über die betreffenden
Arginin- bzw. Lysin-Reste. Durch den NADP(H)-Einfluß wurden demnach
Trypsin-Schnittstellen in der Aminosäuresequenz mehr oder weniger zugänglich für
den proteolytischen Verdau in Lösung. Im Gegensatz zu den durch
Tryptophan-Fluoreszenz (3.5.1) und CD-Spektroskopie (3.5.2) festgestellten
nukleotidbedingten Konformationsänderungen scheinen Nukleotide demnach kaum
Einfluss auf die Trypsinisierung von rekombinantem 36K zu haben (Abbildung 15).
Die Verteilung der Spaltstellen in der putativen Sekundär- (3.1.2) und Tertiärstruktur
(3.1.3) des Proteins könnte eine Erklärung dafür liefern. 23 der Arginin- und
Lysin-Reste befinden sich nach den Struktur-Vorhersagen in oder direkt an α-Helices
und somit leicht zugänglich in der Peripherie des Moleküls. Weitere 11 Spaltstellen
zwischen α-Helices und β-Faltblättern (incl. R77 in der Nukleotidbindetasche) sind
vermutlich ebenfalls gut für die Protease erreichbar. Lediglich
4 Trypsinisierungsstellen befinden sich in β-Faltblättern im eher schwer zugänglichen
Zentrum des Proteins. Die nukleotidbedingte starke Entfaltung von 36K im Vergleich
zur geringeren Zunahme des β-Faltblatt-Anteils (3.5.2) scheint demnach die bereits
gute Zugänglichkeit der Arginin- und Lysin-Reste des 36K-Moleküls in Lösung nicht
zu verändern.
Inwieweit sich die Zugänglichkeiten bei membrangebundem 36K, dass nach 3.6.1
teilweise in einen Lipidbilayer eingetaucht, durch Nukleotid-Einfluss ändern, wurde im
Folgenden untersucht. Rekombinantes 36K (2.2.2 - 2.2.4) wurde zunächst mit einem
Phosphatidylcholin-(PC-)Bilayer assoziiert (2.2.14) und anschließend in Anwesenheit
von Nukleotiden mit Trypsin (500:1, 10 Minuten) proteolytisch vedaut (2.2.15).
3. ERGEBNISSE
Das coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gel (2.2.5 & 2.2.6) in Abbildung 15 zeigt, dass
sich das Trypsinisierungsmuster von membranassoziiertem 36K in Anwesenheit der
verschiedenen Nukleotide nicht änderte und somit scheinbar keine weiteren
Spaltstellen zugänglich wurden.
Abb. 15: Trypsinisierung (500:1, 10 Minuten) von 0.15 mg/ml (4 µM) rek., membrangebundenem 36K in 50 mM PBS(150 mM NaCl), pH 7.4 ± 3 mM Nukleotide. St.: Low Molecular Weight Standard (Amersham Biosciences, Freiburg)
3.6.3 Spaltung von rekombinantem 36K mit 2-Nitro-5-Thiocyanobenzonsäure (NTCB) in Lösung
2-Nitro-5-Thiocyanobenzonsäure (NTCB) spaltet Proteine chemisch an reduzierten
Cystein-Resten (Jacobson et al., 1973; Bähler et al., 1989). Die 2 in der
Aminosäuresequenz von 36K vorkommenden Cystein-Reste (C76 & C134) liegen
nach dem 3D-Modell (3.1.3) im Bereich der Nukleotid-Bindetasche und räumlich so
nahe beieinander, dass sie eine Disulfidbrücke ausbilden könnten. Bei der
proteolytischen Spaltung von membrangebundenem rekombinanten 36K (3.6.1)
konnten nach Identifizierung von C-Termini und mit Hilfe des apparenten
Molekulargewichts die in Frage kommenden Arginin- und Lysin-Reste benannt
werden, die demnach ebenfalls im Bereich der Nukleotid-Bindetasche lokalisiert
waren.
-40-
3. ERGEBNISSE
Aus diesem Grund müsste eine chemische Spaltung von membrangebundenem 36K
mit NTCB möglich sein, sofern die beiden Cysteine als Thiole vorliegen. Daher wurde
zunächst eine NTCB-Spaltung von rekombinantem 36K in Lösung durchgeführt.
Dazu wurde wie unter 2.2.16 beschrieben 0.5 mg/ml (13 µM) rekombinantes 36K in
PBS pH 7.4 (2.2.2 - 2.2.4) mit 5 µM NTCB inkubiert. Abbildung 16 zeigt das
coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gel (2.2.5 & 2.2.6) dieser chemischen Spaltung mit
unterschiedlichen Inkubationszeiten, bei dem sich die entstandenen Fragmente in
dem erwarteten Molekulargewichtsbereich befinden.
Abb. 16: Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel einer NTCB-Spaltung(5 µM) von 0.5 mg/ml rekombinantem 36K in PBS (150 mM NaCl) pH 7.4nach angegebener Inkubationszeit in Stunden. K: rek. 36K ohne NTCB.WB: Western Blot der Spaltung nach 24h, Nachweis: polyHis-Antikörper.1: Spaltung an C76, 2. Spaltung an C134. St.: Low Molecular WeightStandard (Amersham Biosciences, Freiburg)
Das Spaltprodukt 1a resultiert aus der Spaltung an C76 (1b ist aus dem Gel
gelaufen), während 2a und 2b durch die Spaltung am C134 entstehen. Da zu den
Ansätzen kein Reduktionsmittel wie DTT zugegeben wurde, bilden C76 und C134
offensichtlich keine Disulfid-Brücke aus und liegen daher als Thiole vor. Ein
immunologischer Nachweis mit dem polyHis-Antikörper (2.2.8 & 2.2.9) identifizierte
die Fragmente 1a und 2a erwartungsgemäß als C-Termini (WB). Das Spaltprodukt
2a (C76) befindet sich im gleichen Molekulargewichtsbereich wie das kleinere
C-terminale Fragment aus der Trypsinisierung von membrangebundenem 36K
(3.6.1). Dies unterstützt die Vermutung, dass rekombinantes 36K wahrscheinlich am
R77 oder L79 proteolytisch gespalten wurde. Die Zugabe von 2.6 mM Nukleotide
(200fach) hatte keinen Einfluß auf die Proteinspaltung durch NTCB.
-41-
3. ERGEBNISSE
-42-
3.6.4 Spaltung von membrangebundenem rekombinanten 36K mit 2-Nitro-5-Thiocyanobenzonsäure (NTCB)
Da beide Cystein-Reste im Bereich der Nukleotidbinde-Tasche (Abbildung 3) nach
3.6.3 als Thiole vorliegen und dieser Bereich nach den Trypsinisierungsstudien
beim teilweisen Eintauchen von 36K in den PC-Bilayer zugänglich bleibt
(3.6.1 & 3.6.2), müsste eine NTCB-Spaltung von membrangebundenem 36K möglich
sein. Dazu wurde wie unter 2.2.14 beschrieben rekombinantes 36K (2.2.2 - 2.2.4)
zuerst durch Inkubation mit phosphatidylcholin-
beschichteten Transilkügelchen mit dem
PC-Bilayer assoziiert (vgl. 3.6.1) und
anschließend 5 mM NTCB zugegeben (2.2.16).
Verglichen mit der Spaltung von rekombinantem
36K in Lösung (3.6.3, Abbildung 16) zeigt das
coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gel (2.2.5 &
2.2.6) in Abbildung 17 die erwarteten
Fragmente. Wie beim proteolytischen Verdau
(3.6.1) war die Spaltung des in den PC-Bilayer
penetrierten Proteins durch NTCB ebenfalls
möglich. Da beide Cystein-Reste im Bereich der
putativen Nukleotid-Bindetasche lokalisiert sind,
scheint diese beim membranassoziierten 36K
von der Lösung her zugänglich zu bleiben.
3.6.5 Random-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer- (Random-FRET-) Untersuchung zwischen rekombinantem 36K-QSY und 7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-yl-Phosphatidylcholin (NBD-PC)
Mit Hilfe von Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-(FRET-) Untersuchungen
(Wu, P. & Brand, L., 1994; Szöllősi et al., 2002) wurden die aus den
Spaltungsexperimenten erhaltenen Hinweise zur Topologie von 36K bei der
Membranassoziation näher untersucht.
Abb. 17: Coomassie-gefärbtesSDS-PAGE-Gel der NTCB-Spaltung von membran-gebundenem rek. 36K in50 mM PBS (150 mM NaCl)pH 7.4. PL: Phospholipid.St.: Low Molecular WeightStandard (AmershamBiosciences, Freiburg)
3. ERGEBNISSE
-43-
Dazu sollten über die von Fung und Stryer (1978) ermittelten Beziehungen zwischen
der Energietransfer-Effizienz, der Oberflächen-Akzeptordichte σ, der
Donor-Lebenszeit in Abwesenheit des Akzeptors τ B0 B, dem Abstand zweier Donoren in
unterschiedlichen Membranhälften und dem Förster-Abstand RB0 B (Förster, 1949) die
horizontalen und vertikalen Abstände zwischen einem an das Ende einer
Fettsäurekette fusionierten Fluoreszenz-Donor (7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-yl-
Gruppe, NBD) und einem in 36K eingefügten -Akzeptor (QSY®7 Maleimid;
Fa. MoBiTec, Göttingen) kalkuliert werden. Fa. Nimbus (Leipzig) synthetisierte
Phosphatidylcholin- (PC)-beschichteten Silica-Kügelchen („TRANSIL“), bei denen
1 mol% der Phospholipide mit NBD markiert waren. Dabei ist zu berücksichtigen,
dass sich der NBD-Fluorophor aufgrund seiner Polarität und der hohen Flexibilität
der Fettsäureketten aus dem hydrophoben Kern des Lipid-Bilayers zurück an die
Membranoberfläche (unterhalb der Phosphat-Reste) bewegt (Chattopadhyay, A.,
1990). Der große Durchmesser der Silica-Kügelchen (10 µm) erlaubte für die
Abstandskalkulationen die Annahme eines planaren Bilayers.
Der Fluoreszenz-Akzeptor wurde wie unter 2.2.17 beschrieben über die
Sulfhydrylgruppen der beiden Cystein-Reste (C76 & C134), die nach 3.1.3
(Abbildung 3) im Bereich der putativen Nukleotid-Bindetasche lokalisiert sind, in das
rekombinante 36K-Protein (2.2.2 - 2.2.4) eingefügt (36K-QSY). Das resultierende
Absorptionsspektrum zeigte, dass wie bei der Markierung für die ESR-Spektroskopie
(3.5.3) durchschnittlich ein Cystein-Rest (C134) pro Molekül 36K mit dem Maleimid
reagiert hatte. Der für dieses Chromophorenpaar nach Messung der Emissions- und
Absorptionsspektren unter experimentellen Bedingungen errechnete Förster-Abstand
(2.2.17) lag sich mit 5 nm im Bereich des Durchmessers eines Myelinbilayers aus
dem ZNS der Fische (Kirschner et al., 1989). Als Förster-Abstand (RB0 B) wird der
Abstand (R) zwischen Donor und Akzeptor bezeichnet, bei dem die FRET-Effizienz
noch 50% beträgt.
Um die Energietransfer-Effizienz zwischen dem Fluoreszenz-Donor (NBD) an der
Bilayeroberfläche und dem proteingebundenen Akzeptor (QSY7) während der
Membranassoziation zu messen, wurde 1.4 µM rekombinantes 36K bzw. 36K-QSY
wie unter 2.2.14 beschrieben mit dem NBD-PC-Bilyayer, 111 µM Phospholipid)
assoziiert und nicht gebundenes Protein durch Pelletierung und Waschen der
Silica-Kügelchen entfernt.
3. ERGEBNISSE
Nach Resuspendieren in PBS pH 7.4 wurden die in Abbildung 18 dargestellten
gemittelten NBD-Fluoreszenz-Spektren nach Erregung bei 467 nm aufgenommen
(2.2.17). Die Assoziation von 36K-QSY mit der NBD-PC-Membran resultierte in einer
durchschnittlichen Fluoreszenz-Abnahme, d. h. Energietransfer-Effizienz, von ~20%,
wobei die Emission in Abwesenheit des Akzeptors QSY® 7 (unmarkiertes 36K) als
maximale Fluoreszenz (100%) angenommen wurde.
Abb. 18: Fluoreszenzspektrum von NBD-PC assoziiert mitrek. 36K (=100%) bzw. rek. 36K-QSY in 50 mM PBS(150 mM NaCl), pH 7.4. NBD-Erregung bei 467 nm
Da von der genauen Membrantopologie des 36K-Proteins bisher wenig bekannt war,
wurden für die Abstandsberechnungen nach Fung und Stryer (1978) verschiedene
horizontale und vertikale Abstände zwischen den Chromophoren kalkuliert und mit
der gemessenen Energietransfer-Effizienz von 20% abgeglichen. Diese Abstände
sind u. a. abhängig von der Oberflächenakzeptordichte, die sich mit der
Protein-Eindringtiefe ändert. Aufgrund der Ergebnisse aus der Spaltung von
membrangebundenem 36K (3.6.1-3.6.4) wurde für die folgenden Kalkulationen ein
ca. 40%iges Eindringen des Proteins in die Membran angenommen. Verglichen mit
den aus den Röntgenkleinwinkelstreuungsstudien (3.3) erhaltenen Dimensionen von
36K (~9 x 3 - 4 nm) konnte der in das Protein eingefügte Akzeptor demnach maximal
ca. 5.2 nm über der Membran bzw. ca. 5.9 nm über dem Donor liegen.
-44-
3. ERGEBNISSE
Der daraus resultierende minimal mögliche horizontale Abstand zwischen den
Chromophoren von ~1.6 nm liegt in der Nähe des maximal möglichen horizontalen
Abstandes (Abbildung 19). Wenn statt des vertikalen Abstandes ein maximal
möglicher horizontaler Abstand von 2 nm angenommen wurde, verringerte sich die
Höhe des Akzeptors über der Membran kaum (~5.0 nm). Dies ließ die Vermutung zu,
dass der Akzeptor und damit die putative Nukleotid-Bindetasche nahezu zentral und
wie durch die Sekundärstruktur-Analyse (3.1.2 & 3.1.3) vorhergesagt am N-Terminus
des Moleküls lokalisiert sein müsste. Wie die Ergebnisse aus der Spaltung von
membrangebundenem 36K (3.6.1-3.6.4) deutet dieser Abstand darauf hin, dass sich
ein Teil des Proteins außerhalb des Bilayers befindet. Aufgrund der Höhe des
Akzeptors über der Membran würde dies, unter Berücksichtigung der Dimensionen
im ZNS-Myelin der Fische (Kirschner et al., 1989), für 36K die Möglichkeit schaffen,
mit der gegenüberliegenden Membran zu interagieren. Da durch die Verwendung
von schnell absinkenden phospholipidbeschichteten Silica-Kügelchen vermutlich
jedes 36K-Molekül maximal mit einem Bilayer assoziiert war, konnte diese
Penetration in zwei Membranen mit diesem Experiment nicht näher untersucht
werden.
Abb. 19: Modell der nach Fung & Stryer(1978) kalkulierten Abstände derFRET-Chromophore NBD (gelber Stern)und QSY7 (roter Stern). Für 36K wurde zur Vereinfachung eine Quader-Form ange-nommen (nach 3.3). Bilayer-Durchmesser nach Fa. Nimbus (Leipzig)
-45-
3. ERGEBNISSE
3.6.6 Hypothetisches Modell der Lage von 36K in der “Major Dense Line” des ZNS-Myelins der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss)
Zusammenfassend erlaubten diese Ergebnisse die Erstellung des in Abbildung 20
dargestellten hypothetischen Modells von der Membrantopologie des Myelinproteins
36K in der “Major Dense Line” des kompakten ZNS-Myelins der Forelle. Zur
Vereinfachung wurde für das 36K-Molekül aufgrund der aus den
Röntgenkleinwinkelstreuungsstudien (3.3) erhaltenen Dimensionen eine
Quader-Form angenommen. Die Spaltungsexperimente von membrangebundenem
36K mit der Protease Trypsin (3.6.1) deuteten an, dass 36K teilweise in den Bilayer
eingebettet vorliegen müsste. Aufgrund des aus den FRET-Studien erhaltenen
Abstandes des Fluorezenz-Akzeptors über der Membran, könnte 36K ebenfalls mit
dem gegenüberliegenden Bilayer interagieren. Um eine Regulation durch Nukleotide
zu gewährleisten müsste dabei der Bereich um die putative Nukleotid-Bindetasche
vom Cytosol her zugänglich bleiben.
Abb. 20: A. Umhüllende Struktur von 36K nach Röntgenkleinwinkelstreuung (3.3).B. Vereinfachte umhüllende Struktur von 36K. C. Hypothetisches Modell der Lage vomMyelinprotein 36K im ZNS der Forelle; MDL: Major Dense line, Dimensionen nach Kirschner et al.(1989)
-46-
3. ERGEBNISSE
3.7 INTERAKTIONEN ZWISCHEN 36K UND ANDEREN MYELINPROTEINEN AUS DEM ZNS DER REGENBOGENFORELLE (ONCORHYNCHUS MYKISS)
Aufgrund räumlicher Limitierungen in der „Major Dense Line” (vgl. Abbildung 20) sind
Interaktionen zwischen den Myelinproteinen vorstellbar. Um mögliche
Protein-Komplexe, insbesondere mit 36K-Beteiligung, zu analysieren, wurden im
Folgenden Protein-Extraktionen aus dem ZNS-Myelin der Forelle untersucht.
3.7.1 Myelinprotein-Extraktionen aus dem Fisch-ZNS mit dem nicht-ionischen Detergenz Digitonin (Fa. Merck, Schwalbach/Ts.)
Nach 2.2.18 wurde Myelin aus dem Gesamthirn junger Forellen (3 bis 8 cm)
präpariert und über eine Digitonin-Extraktionsreihe die enthaltenen Proteine aus den
Lipidmembranen gelöst (2.2.19). Durch die Verwendung des nicht-ionischen
Detergenz Digitonin sollten vorhandene Protein-Komplexe erhalten bleiben. Zur
Festellung der optimalen Extraktionsbedingungen wurde das isolierte Myelin
zunächst in 1-4% (w/v) Digitonin-Puffer (in 20 mM Tris/HCl pH 7.4, 0.1 mM EDTA,
50 mM NaCl, 10% (w/v) Glycerin, 1 mM PMSF) resuspendiert und die gelösten
Proteine elektrophoretisch aufgetrennt (2.2.5).
Abb. 21: Myelinprotein-Extraktionsreihe von400 mg Forellen-Gesamthirn mit 1-4% (w/v)Digitonin in 20 mM Tris/HCl pH 7.4, 0.1 mM EDTA,50 mM NaCl, 10% (w/v) Glycerin, 1 mM PMSF.Hauptmyelinproteine sind angezeigt. St.: LowMolecular Weight Standard (AmershamBiosciences, Freiburg)
-47-
3. ERGEBNISSE
Das in Abbildung 21 dargestellte coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gel (2.2.6) zeigt,
dass bereits mit 2% (w/v) Digitonin neben den Hauptmyelinproteinen 36K, IP1, IP2
und MBP eine große Anzahl weiterer Proteine aus/von den Membranen gelöst
werden konnte. Um möglichst viele Proteine in ausreichender Menge zu extrahieren
und um die zunehmende Komplexität des Myelins bei älteren (5-8 cm) Fischen zu
kompensieren, wurden die folgenden Extraktionen mit 4% (w/v) Digitonin-Puffer
durchgeführt. Dazu wurde das isolierte Myelin zunächst mit 0.5% (w/v) und
1% (w/v) Digitonin-Puffer equilibriert. Auf diese Weise konnten 2 bis 3 µg/µl
Myelinproteine bzw. eventuelle Proteinkomplexe extrahiert und durch
Blue-Native-PAGE (2.2.24) und Co-Immunopräzipitation (2.2.26) analysiert werden .
3.7.2 Blue-Native-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (BN-PAGE) der Myelin-protein-Extraktion aus dem ZNS der Forelle
Mit Hilfe einer Blue-Native PAGE sollten vorhandene Proteinkomplexe im Myelin
nachgewiesen und untersucht werden. Diese Methode wurde ursprünglich von
Schägger zur Auftrennung von Proteinkomplexen aus Mitochondrien (Schägger und
von Jagow., 1991; Schägger et al., 1994; Brookes et al., 2002) entwickelt. Dabei wird
die für die Elektrophorese nötige negative Ladung durch einen Coomassie-Farbstoff
(Brillant Blue G250) an die Proteine gebracht. Außerdem übernimmt der Farbstoff bei
Eintritt in das Gradienten-Polyacrylamid-Gel die Aufgabe des
Extraktions-Detergenzes und verhindert durch elektrische Abstoßung eine
ungewollte Proteinaggreation. Die aus der 4% (w/v)-Digitonin-Extraktion (2.2.19)
erhaltene Myelinprotein-Lösung (3.7.1; Abbildung 22A) wurde mit
4% (w/v)-Digitonin-Puffer auf 0.8 mg/ml verdünnt, mit Blue-Native-Probenpuffer
(20% (w/v) Brillant Blue G250 in 500 mM Aminocapronsäure) versetzt und potentielle
Proteinkomplexe über ein 6-16% Polyacrylamid-Gradienten-Gel elektrophoretisch
aufgetrennt (2.2.24). Das coomassie-gefärbte (2.2.6) Gel in Abbildung 22B zeigt für
das ZNS-Myelin der Forelle 5 deutliche Proteinkomplexe von ~600 kD, ~230 kD,
~150 kD, ~100 kD und ~66 kD.
-48-
3. ERGEBNISSE
A. B.
Abb. 22: A. Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel einerMyelinprotein-Extraktion (Extr.) aus 400 mg Forellen-Gesamthirn mit4% Digitonin in 20 mM.Tris/HCl pH 7.4, 0.1 mM EDTA, 50 mM NaCl,10% Glycerin, 1 mM PMSF. St.: Low Molecular Weight Standard(Amersham Biosciences, Freiburg); B. Coomassie-gefärbtes 6-16%(w/v) Gradienten-BN-PAGE-Gel der Myelinprotein-Extraktion (Extr.)aus dem ZNS der Forelle. St.: High Molecular Weight Standard fürnative PA-Gele (Amersham Biosciences, Freiburg)
Zur Analyse der Proteinzusammensetzung wurden zunächst die drei größten
Komplexe ausgeschnitten und in der 2. Dimension einer herkömmlichen SDS-PAGE
unterzogen (2.2.5). Die silbergefärbten Gele (2.2.7) in Abbildung 23 zeigen, dass
einige der aufgetrennten Proteine in allen Komplexen mehr oder weniger stark
vertreten sind, während sich andere auf ein oder zwei Komplexe beschränken. Die
Hauptmyelinproteine 36K und IP2 konnten bereits mit den entsprechenden
polyklonalen Antikörpern identifiziert werden (2.2.8 & 2.2.9) und sind demnach in
allen drei Komplexen zu finden. Die noch unbekannten Komplex-Komponenten
könnten mit Hilfe z. B. massenspektroskopischer Untersuchungen identifiziert
werden, um die Wechselwirkungen zwischen den Myelinproteinen näher
charakterisieren zu können.
-49-
3. ERGEBNISSE
Abb. 23: Silbergefärbte SDS-PAGE-Gelevon 600 kD-, 230 kD- und 150 kD-Komplexvon BN-PAGE der Myelinprotein-Extraktionaus ZNS der Forelle. Immunologischnachgewiesene 36K und IP2 sindangezeigt
Das Molekulargewicht von zwei Proteinspots im 600 kD-Komplex um ca. 55 kD legte
die Vermutung nahe, dass es sich dabei um Isoformen des Tubulins handeln könnte.
Dieses konnte mit Hilfe eines monoklonalen Tubulin-Antikörpers (Fa. Sigma-Aldrich,
München), der die polyglutamylierte Region am C-Terminus des Tubulins als Epitop
erkennt (Boucher et al., 1994; Gagnon et al., 1996; Mary et al., 1996), allerdings
nicht bestätigt werden. Im Western Blot (2.2.8 & 2.2.9) einer Myelinprotein-Extraktion
reagierte dieser Antikörper mit einem Protein im Molekulargewichtsbereich von 36K
statt in dem von Tubulin (Abbildung 24). Um auszuschließen, dass diese Reaktion
mit polyglutamylierten Proteinen, die durch die 36K-Bande verdeckt wurden,
stattfand, wurde ein Immunoblot mit aufgereinigtem rekombinanten 36K
(2.2.2 - 2.2.4) durchgeführt, das ebenfalls mit dem Tubulin-Antikörper reagierte.
Abbildung 24 zeigt deutlich, dass durch die in 2.2.19 beschriebene
Extraktionsmethode kein Tubulin aus dem ZNS-Myelin der Forelle gelöst wurde.
Stattdessen konnten durch die Reaktion von 36K mit dem Tubulin-Antikörper erste
Hinweise auf eine mögliche posttranslationale Modifikation dieses Myelinproteins
durch Polyglutamylierung erhalten werden.
-50-
3. ERGEBNISSE
-51-
Polyglutamylierung ist eine reversible posttranslationale Modifikation, die zum ersten
Mal von Eddé et al. (1990) am α-Tubulin beschrieben wurde. Dabei wird durch
Polyglutamylasen eine variable Anzahl von Glutamat-Resten an Glutamate in der
Primärstruktur fusioniert, wodurch u. a. die Affinität des Tubulins zum Tau-Protein
reguliert wird (Boucher et al., 1994). Inzwischen ist eine Polyglutamylierung auch bei
NAP´s (nucleosome assembly proteins) (Regnard et al. 2000) und Nucleoplasminen
(Regnard et al., 2003) festgestellt worden, bei denen eine mögliche Funktion dieser
Modifikation derzeit noch unbekannt ist. In Zukunft wäre eine Untersuchung dieser
möglichen posttranslationalen Modifikation von 36K bzw. deren Funktion sowie die
Identifizierung und Charakterisierung einer potentiellen 36K-Polyglutamylase im
ZNS-Myelin der Fische von Interesse.
Abb. 24: Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel einerMyelinprotein-Extraktion aus Forellen-ZNS (Extr., links)und immunologischer Nachweis mit angezeigtenAntikörpern. 36KBrek B: rek. 36K; P BExtr.B: Pellet nachExtraktion; St.: Low Molecular Weight Standard(Amersham Biosciences, Freiburg)
3. ERGEBNISSE
-52-
3.7.3 Co-Immunopräzipitation von Myelinprotein-Komplexen aus dem ZNS-Myelin der Forelle
Mit der Co-Immunopräzipitation können Proteine und assoziierte Moleküle mit den
entsprechenden Antikörpern aus einem Proteingemisch separiert werden. Nach den
Ergebnissen aus der BN-PAGE (3.7.2) liegen die Hauptmyelinproteine des
Forellen-ZNS 36K und IP2 in hochmolekularen Komplexen vor und müssten daher
durch Co-Immunopräzipitation ebenfalls separiert werden können. Dazu wurden
Myelinproteine wie für die BN-PAGE mit 4% (w/v)-Digitonin aus dem ZNS der Forelle
extrahiert (2.2.19) und mit Hilfe der entsprechenden polyklonalen Antikörper gegen
36K, IP2 und MBP mittels Immunopräzipitation aus dem Proteingemisch isoliert
(2.2.26). Die separierten (miteinander assoziierten) Proteine wurden anschließend
mit Hilfe einer SDS-PAGE (2.2.5) getrennt und durch Silberfärbung sichtbar gemacht
(2.2.7). Aus Abbildung 25 geht deutlich hervor, dass sich neben einigen schwachen
Proteinbanden die immunologisch nachgewiesenen (2.2.8 & 2.2.9)
Hauptmyelinproteine 36K, IP2 und MBP gegenseitig durch Co-Immunopräzipitation
separieren lassen und scheinen demnach im ZNS-Myelin der Fische miteinander
assoziiert zu sein.
Abb. 25: Silbergefärbtes SDS-PAGE-Gel und immunologischer Nachweisvon 36K, IP2 und MBP (WB) einer Co-Immunopräzipitation mit α36K, αIP2und αMBP aus Myelinprotein-Extraktion von ZNS der Forelle (Extr.).Immunologisch nachgewiesene Proteine sind angezeigt. St.: Low MolecularWeight Standard (Amersham Biosciences, Freiburg)
3. ERGEBNISSE
3.8 HYPOTHETISCHES MODELL DER LAGE UND DER INTERAKTIONEN VON 36K MIT PROTEINEN IN DER “MAJOR DENSE LINE” DES ZNS-MYELINS DER REGENBOGENFORELLE (ONCORHYNCHUS MYKISS)
Zusammenfassend konnte unter Berücksichtigung der Dimensionen im ZNS-Myelin
der Forelle (Kirschner et al., 1989) aus den erhaltenen Hinweisen zur
Membrantopologie und den Protein-Protein-Interaktionen das in Abbildung 26
dargestellte hypothetische Modell zur Lage von 36K, für das wie in Abbildung 20 eine
Quader-Form angenommen wurde, erstellt werden.
Abb. 26: Hypothetisches Modell der Lage von 36K in ZNS-Myelin der Forelle; mit Punkten sindmögliche Protein-Protein-Interaktionen angedeutet. IPL: Intraperiod Line, MDL: Major Dense Line,MBP: Basische Myelinprotein, IP: Intermediär Protein, ?: Unbekannte(s) Protein(e), Abständenach Kirschner et al. (1989).
-53-
3. ERGEBNISSE
Über Protein-Protein-Interaktionen zwischen den Hauptmyelinproteinen 36K, IP1 & 2
(Stratmann und Jeserich, 1995; Shapiro et al., 1996) und MBP (Beniac et al., 1996)
sowie einigen anderen, bisher noch nicht identifizierten Proteinen (vgl. BN-PAGE;
3.7.2), gäbe es im kompakten Myelin ein komplexes Netzwerk, das einer feinen
Regulierung bedarf. Die Untersuchung dieser Regulierung und welche Rolle ein
nukleotid-reguliertes 36K alleine oder im Zusammenspiel mit assoziierten Proteinen
spielen könnte, wäre für die Zukunft vor dem Hintergrund der von Blaurock et al.
(1986) festgestellten Dynamik des Myelins eine interessante Herausforderung.
-54-
4. DISKUSSION
4 DISKUSSION
Im Rahmen dieser Dissertation konnten für das nach seinem apparenten
Molekulargewicht benannten Myelinprotein 36K aus dem ZNS der Forelle erste
Hinweise auf dessen Struktur und mögliche Funktion in der cytosolischen Apposition
der Myelinmembranlamellen („Major Dense Line“; Jeserich & Waehneldt, 1986b)
erhalten werden. Ausgehend von computerunterstützten Homologie-Alignments der
Aminosäuresequenz wurden unerwartete Ähnlichkeiten zu Proteinen der
Reduktase/Epimerase/Oxidoreduktase-Superfamilie (RED) (Labesse et al., 1994)
statt zu den bekannten Myelinproteinen festgestellt. Nach Kallberg et al. (2002) wäre
36K eine „klassische Kurzkettige Dehydrogenase/Reduktase (SDR)“. Die
computerunterstützte Sekundärstruktur-Vorhersage zeigte, dass das Protein aus
alternierenden α-Helices (10) und β-Faltblättern (7) (βαβ-Struktur), dem sogenannten
„Rossmann fold“, besteht (Rossmann et al., 1974). Unterstützt wurde diese
Vorhersage vom einem computergenerierten, auf Sequenzhomologien basierenden
3D-Modell der N-terminalen Hälfte von 36K, das die für REDs charakteristische
geordnete Struktur mit β-Faltblättern im Molekül-Zentrum und α-Helices in der
Peripherie zeigte. Mit Hilfe einer Fern-UV-Circulardichroismus-Spektrokopie
(CD-Spektroskopie) konnte zum ersten Mal ein Einblick in die Sekundärstruktur-
Zusammensetzung des nativen 36K-Proteins erhalten werden. In Lösung ist das
Protein demnach aus etwa je einem Drittel α-Helices, β-Strukturen sowie
ungeordneter Strukturen („random coil“) aufgebaut. Die durch
Röntgenkleinwinkelstreuung bestimmte umhüllende Struktur von 36K in Lösung
zeigte ein längliches (9 nm), aus 2 Domänen von ~4 x 3 und 5 x 4 nm (Höhe x Breite)
bestehendes Molekül. Verglichen mit den von Kirschner et al. (1989) festgestellten
Dimensionen im ZNS-Myelin der Fische erscheint 36K als lang gestrecktes Molekül
in der mit ~2.5 nm Durchmesser eher schmalen cytosolischen Apposition („Major
Dense Line“). Dies legte die Vermutung nahe, dass das membranassoziierte Molekül
(Jeserich & Waehneldt, 1986b; Diplom-Arbeit W. Moll, 2001) zumindest teilweise in
den Bilayer eintauchten müsste.
-55-
4. DISKUSSION
Über den proteolytischen Verdau von membrangebundenen 36K konnte gezeigt
werden, dass der C-Terminus des Proteins in die Phospholipid-Membran eintauchte
und so vor der Trypsinisierung geschützt war. Durch immunologische Nachweise von
C-terminalen Fragmenten und anschließendem Abgleich mit dem jeweiligen
Molekulargewicht konnten die Arginin- bzw. Lysin-Reste identifiziert werden, an
denen 36K trotz Membranassoziation noch gespalteten wurde bzw. welche der
Spaltstellen nicht mehr zugänglich waren. Dabei stellte sich heraus, dass die für die
Protease erreichbaren Spaltstellen im Bereich der putativen Nukleotid-Bindetasche
lokalisiert waren, die demnach bei der Membranassoziation mit einem Bilayer
zugänglich blieb. Erwartungsgemäß war eine Spaltung der in diesem Bereich
befindlichen Cystein-Reste durch NTCB ebenfalls möglich. Mit Hilfe von
Random-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer- (FRET-)Studien konnte diese
Membrantopologie von 36K näher charakterisiert werden. Unter der Annahme des
maximal möglichen vertikalen Abstandes zwischen den Chromophoren, konnte mit
den nach Fung und Stryer (1978) erhaltenen Wertepaaren ein minimal möglicher
horizontaler Abstand von ~1.6 nm kalkuliert werden. Somit wäre der Akzeptor
ca. 5 nm über der Membran lokalisiert, was für 36K aufgrund der Dimensionen im
ZNS-Myelin der Forelle (Kirschner et al., 1989) die Möglichkeit schaffen würde, mit
dem gegenüberliegenden Bilayer zu interagieren. Dies konnte aufgrund des
schnellen Absinkens der Transil-Kügelchen bei diesem Experiment nicht näher
untersucht werden. Da 36K nach der Röntgenkleinwinkelstreuung eine Breite von
~4 nm aufweist (3.3), müsste der im Bereich der putativen Nukleotid-Bindetasche
eingefügte Akzeptor nahezu in der horizontalen Mitte des Moleküls und (im Myelin)
aufgrund des Abstandes zur Membran in der Nähe des gegenüberliegenden Bilayers
lokalisiert sein. Um eine nukleotid-bedingte Regulation zu gewährleisten, müsste die
Bindetasche bei der 36K-Interaktion mit zwei Myelinmembranen vom Cytosol
(„Major Dense Line“) her zugänglich bleiben. Die hier kalkulierten Abstände sollten
allerdings als Richtwerte angesehen werden, da sich die gemessene
Energietransfer-Effizienz lediglich auf eine Protein-Konzentration stützt. Um
genauere Aussagen zu den Abständen der Chromophore bei der
Membranassoziation von 36K zu machen, sind weitere Messungen mit
verschiedenen Konzentrationen notwendig.
Welche Funktion könnte dieses Protein in der Myelinmembran der cytosolischen
Apposition im ZNS-Myelin der Fische ausüben?
-56-
4. DISKUSSION
Wie bereits erwähnt, wäre 36K aufgrund der Aminosäuresequenz-Analysen eine
„klassische Kurzkettige Dehydrogenase/Reduktase (SDR)“ (Kallberg et al., 2002)
und würde somit zur Reduktase/Epimerase/Oxidoreduktase-Superfamilie (RED)
(Labesse et al., 1994) gehören. Das für die REDs charakteristische Nukleotid-
Bindemotiv (GXXXGXG) ist bei 36K erwartungsgemäß zwischen dem ersten
β-Faltblatt und der darauffolgenden α-Helix lokalisiert (Moll et al., 2003). Ein
Sequenz-Motiv im zweiten β-Faltblatt (VCR) sowie ein Arginin-Rest (R77) an dessen
C-Terminus deuten auf eine NADP(H)-Präferenz des 36K-Proteins hin. Durch
Aminosäureaustausche z. B. des R77 könnte diese NADP(H)-Präferenz weiter
verifiziert werden. Im Kern- und C-terminalen Bereich weist die Primärstruktur von
36K RED-typische Sequenzmotive einer Substrat-Bindetasche auf
(YXXXK, PGXXXT) (Persson et al., 1991; Labesse et al., 1994; Ghosh et al, 1994;
Jörnvall et al., 1995; Tanaka et al., 1996; Kallberg et al., 2002). Aus diesen
Sequenz-Motiven konnte direkt kein Hinweis auf ein potentielles Substrat erhalten
werden. Zum Nachweis einer Dehydrogenase-Aktivität von 36K im Myelin wurden
daher Myelinkomponenten als Bindepartner angenommen (Ledeen, 1984) und die
nukleotidbedingte Absorption der Suspension über die Zeit beobachtet. Statt der
erwarteten Dehydrogenase-Aktivität wurde vor allem nach Zugabe von
rekombinantem 36K eine Reaktion festgestellt, die auf Liposomen-/Micellen-
Aggregation zurückgeführt wurde. Dabei hatte NAD(H) anscheinend keinen Einfluss
auf die Aggregation, während die Anwesenheit von NADP(H) die Aggregation
offenbar negativ beeinflusste, was wiederum in gutem Einklang mit der aus der
Aminosäure-Sequenz-Analyse vermuteten NADP(H)-Präferenz steht.
Da bei den Experimenten mit isoliertem Myelin Triton X-100 zur Auflockerung
zugegeben werden musste, wurde die festgestellten Reaktion nach Zugabe von
rekombinantem 36K und Nukleotiden mit Hilfe von
Phosphatidycholin/Phosphatidylethanolamin-Liposomen unter detergenzfreien
Bedingungen erneut untersucht. Wiederum wurde die Absorption je nach Nukleotid
unterschiedlich beeinflusst: NADP(H) schien die Aggregation von PC-Liposomen zu
behindern, während es unter NAD(H)-Einfluss offenbar zu einer verstärkten
Aggregation kam.
-57-
4. DISKUSSION
Dass nukleotid-bindende Proteine nicht zwangsläufig (Dehydrogenase-)
Enzymproteine sein müssen, konnte z. B. bei den cytoplasmatischen
β-Untereinheiten von spannungssensitiven Kalium-Kanälen gezeigt werden. Wie bei
36K konnte auch für diese Proteine, die nach Kristallisation in die Aldo-Keto-
Reduktase-Superfamilie (AKR) eingeordnet werden konnten (McCormack und
McCormack, 1994), weder ein Hinweis auf potentielles Substrat noch auf eine
Oxidoreduktase-Funktion gefunden werden. Obwohl AKRs eigentlich in
NAD(P)(H)-abhängiger Weise die Oxidation bzw. Reduktion verschiedenster
Carbonyl-Substrate wie Steroide oder Prostaglandine (Jez et al., 1997) katalysieren,
beeinflussen diese β-Untereinheiten u. a. die Stabilität, das „gating“ oder die
intrazelluläre Verteilung der Kalium-Kanäle („intracellular trafficking“). Dabei
veränderte z. B. ein für die AKR-Funktion kritischer Aminosäure-Austausch im
aktiven Zentrum (Bohren et al., 1994) den Protein-Transport nicht. Allerdings konnte
dieser durch Mutationen in der Nukleotid-Bindedomäne unterbunden werden
(Campomanes et al., 2002). Wenn die β-Untereinheiten also eine Enzym-Aktivität
haben, scheint diese nach Campomanes et al. für die auszuführende Funktion an
den spannungssensitiven Kalium-Kanälen nicht notwendig zu sein. Aus diesem
Grund wäre für 36K eine nicht-enzymatische Funktion über nukleotidbedingte
Konformationsänderungen innerhalb des Fisch-Myelins durchaus vorstellbar. In
diesem Zusammenhang sind die von Blaurock et al. (1986) festgestellten
Abstandsänderungen innerhalb der Myelinlamellen erwähnenswert. Blaurock et al.
konnten zeigen, dass es unter bestimmten physiologischen Bedingungen zu einer
Auflockerung des Myelin am ZNS-Nerv der Goldfische kam. Über diese Dynamik
könnte mit Hilfe transgener Zebrafische eine potentielle Rolle von 36K mit
Null-Mutanten oder Mutanten, bei denen essentielle Aminosäuren für die
Nukleotid- und/oder die putative Substrat-Bindung ausgetauscht sind, untersucht
werden.
Die beschriebenen Abstandsänderungen könnten aus Konformationsänderungen
von Proteinen wie 36K resultieren. In wie weit 36K z. B. unter Nulkleotid-Einfluss
seine Konformation ändert, wurde im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe von
Tryptophan-Fluoreszenz- und CD-Spektroskopie untersucht. Dabei konnte gezeigt
werden, dass Nukleotide mit 36K in Lösung interagierten und dass diese
Wechselwirkung zu einer veränderten Sekundärstruktur-Zusammensetzung führte.
-58-
4. DISKUSSION
Der Anteil ungeordneter Strukturen nahm unter Einfluss der reduzierten Nukleotide
etwas stärker zu als in Anwesenheit von NAD bzw. NADP. Der Bereich um die
putative Nukleotid-Bindetasche blieb nach den Ergebnissen der ESR-Studien
offenbar von dieser zunehmenden Entfaltung verschont.
Ob diese nukleotidbedingten Konformationsänderungen von 36K dazu führen, dass
der nach 3.6.1 in die Membran eingetauchte C-Terminus den Bilayer teilweise
verlässt, konnte mit Trypsinisierungsstudien in Anwesenheit von Nukleotiden nicht
gezeigt werden. Dennoch kann ein Herausstrecken aus der Membran weiterhin nicht
ausgeschlossen werden, da entweder außer den bekannten Spaltstellen keine
weiteren zugänglich werden oder in dem die Membran verlassenen Proteinteil(en)
keine Trypsinisierungsstellen vorhanden sind. Dass Nukleotide die Zugänglichkeit
der Spaltstellen beeinflussen, konnte durch leichte Änderungen im
Trypsinisierungsmuster von rekombinantem 36K in Lösung gezeigt werden. Dabei ist
zu berücksichtigen, dass nach der Sekundärstruktur-Analyse ein Großteil der
Spaltstellen in oder direkt an den nach dem 3D-Modell peripheren α-Helices
lokalisiert ist und daher von vornherein leicht zugänglich war. Dennoch scheinen
NADP bzw. NADPH die Zugänglichkeit von Trypsinisierungsstellen zu verändern,
während NAD bzw. NADH scheinbar keinen Einfluss auf den proteolytischen Verdau
hatten. Dies steht wiederum in guten Einklang mit der vermuteten
NADP(H)-Präferenz von 36K.
Zusammen mit den Ergebnissen zur Membrantopologie konnte unter
Berücksichtigung der von PD Dr. G. Grüber (Institut für Biophysik, Universität des
Saarlandes, Homburg/Saar) ermittelten Dimensionen für das rekombinante 36K in
Lösung (2 Domänen von ~4 x 3 nm und ~5 x 4 nm, Gesamtmolekül ~9 x 4 nm) und
den Abständen im kompakten Myelin (Kirschner et al., 1989) ein hypothetisches
Modell der Lage des Moleküls in der cytosolischen Apposition („Major Dense Line“)
des ZNS-Myelins der Fische erstellt werden. Durch die Möglichkeit der Interaktion
von 36K mit zwei gegenüberliegenden Myelinmembranen, wobei die putative
Nukleotid-Bindetasche vom Cytosol her zugänglich bleiben würde, könnte 36K
alleine zur Veränderung des Abstandes zwischen den Myelinmembranen beitragen.
-59-
4. DISKUSSION
Dabei ist für dieses Myelinprotein bereits eine Rolle beim Start der Myelinisierung
eines Axons denkbar, bei der es z. B den wichtigen ersten Kontakt zwischen der
Gliazellmembran und der zu umwickelnden Axonmembran herstellen könnte.
Aufgrund der räumlichen Enge im Myelin sind Wechselwirkungen zwischen 36K und
anderen Myelinproteinen zu erwarten. Im Rahmen dieser Arbeit konnten zum ersten
Mal Protein-Protein-Interaktionen bzw. Protein-Komplexe im Myelin mit Hilfe von
Blue-Native-PAGE (BN-PAGE) und Co-Immunopräzipitationen gezeigt werden. Dazu
wurde zunächst eine Methode zur Extraktion von Myelinproteinen aus dem ZNS der
Forelle mit dem nicht-ionischen Detergenz Digitonin etabliert. Mit der BN-PAGE
(1. Dimension) konnten schließlich 5 hochmolekulare Proteinkomplexe aufgetrennt
werden. Die Auftrennung der Komplexe mit herkömmlicher SDS-PAGE in der
2. Dimension zeigte verschiedene Proteinkomponenten, von denen die
Hauptmyelinproteine 36K und das P0-ähnliche Glykoprotein IP2 (Intermediär Protein)
(Jeserich & Waehneldt, 1986a) in allen Komplexen immunologisch nachgewiesen
werden konnten. Eine weitere IP-Isoform, das vom Molekulargewicht etwas kleinere
IP1, konnte zwar nicht immunologisch nachgewiesen werden, war aber als
Proteinbande mit dem richtigen Molekulargewicht in allen Komplexen vorhanden.
Die mit der BN-PAGE festgestellten Protein-Protein-Interaktionen konnten schließlich
mittels Co-Immunopräzipitation bestätigt und auf das Basische Myelinprotein (MBP)
erweitert werden. Mit den polyklonalen Antikörpern gegen 36K, IP2 bzw. MBP ließen
sich diese Proteine neben wenigen anderen Proteinen gegenseitig separieren. Die
deutlich geringere Anzahl assoziierter Proteine in Vergleich zur BN-PAGE könnte
eine Folge der zahlreichen Wasch- und Zentrifugationsschritte sein, durch die
schwächere Protein-Wechselwirkungen getrennt worden sein könnten. Die
Hauptmyelinproteine 36K, IP2 und MBP scheinen demnach durch starke
Interaktionen miteinander verbunden zu sein. Es ist zu berücksichtigen, dass auch
Wechselwirkungen zwischen gleichartigen Proteinen möglich sind. Für MBP ist diese
„Eigen-Aggregation“, die in Anwesenheit von Lipiden noch verstärkt wird, schon seit
längerem bekannt (Smith, 1982 & 1992). Mit Hilfe von Größenausschluß-Gelfiltration
konnte für das aufgereinigte rekombinante 36K ebenfalls ein Hinweis auf
Oligomerisierung erhalten werden (Diplom-Arbeit W. Moll, 2001).
-60-
4. DISKUSSION
Inwieweit diese Aggregate eine funktionelle Bedeutung haben, ist derzeit noch nicht
näher untersucht worden. Durch Zugabe von Nukleotiden bei der
Myelinprotein-Extraktion und/oder bei der BN-PAGE bzw. Co-Immunopräzipitation
könnten mögliche Änderungen in der Komplexzusammensetzung analysiert werden.
Beim Versuch zwei Proteinspots (aus 2. Dimension nach BN-PAGE) immunologisch
als Isoformen des Tubulins zu identifizieren, wurde zum ersten Mal ein Hinweis auf
eine posttranslationale Modifikation von 36K erhalten. Demnach würde das Protein
durch die von Eddé et al. (1990) erstmals beschriebene (Poly)glutamylierung
modifiziert, bei der eine variable Anzahl von Glutamat-Resten reversibel an die
Primärstruktur des Proteins fusioniert wird. Während beim Tubulin durch den Grad
der Polyglutamylierung die Affinität zum Tau-Protein reguliert wird (Boucher et al.,
1994), ist eine Funktion dieser posttranslationlen Modifikation bei 36K noch
unbekannt. Ähnlich wie beim Tubulin wäre eine Beeinflussung der Affinität und damit
der Interaktion zu anderen Myelinproteinen über Anzahl der angefügten
Glutamat-Reste vorstellbar. Eine genaue Analyse dieser putativen
posttranslationalen Modifikation von 36K, u. a. wie viele Glutamat-Einheiten an
welche Glutamat-Reste fusioniert werden, könnte z. B. mit Hilfe
massenspektroskopischer Untersuchungen (Mary et al., 1996) durchgeführt werden.
Des Weiteren wäre die Identifizierung und Charakterisierung einer entsprechenden
Polyglutamylase von Interesse. Dabei muss diese nicht mit dem
Tubulin-glutamylierenden Enzym identisch sein, da z. B. Regnard et al. (2000)
festgestellt haben, dass die Tubulin-Polyglutamylase keine Glutamat-Reste an
Nukleosome Assembly Proteins (NAP) fusioniert.
Zusammenfassend konnte ein hypothetisches Modell zur Lage und zu den
Interaktionen mit den Hauptmyelinproteinen IP2 und MBP des vermutlich mit zwei
gegenüberliegende Myelinmembranen interagierenden 36K kreiert werden. Die
putative Nukleotid-Bindetasche würde dabei vom Cytosol her zugänglich bleiben und
so eine Regulation über Nukleotide ermöglichen. In diesem Modell sind die anderen
Proteinkomponenten, die nach der BN-PAGE ebenfalls mit diesem Komplex
assoziiert sind, aber im Rahmen dieser Arbeit nicht näher charakterisiert wurden,
nicht dargestellt.
MBP ist aufgrund seiner adhäsiven Eigenschaften wichtig für die Bildung und
Stabilisierung der cytosolischen Apposition im Myelin. Wie der molekulare
Mechanismus diese Funktion aussieht, ist jedoch noch unklar (Beniac et al., 1996).
-61-
4. DISKUSSION
-62-
Mit Hilfe von Absorptions- (ähnlich wie bei 36K) und FRET-Untersuchungen mit
markierten Liposomen konnte eine durch MBP hervorgerufene Vesikelaggregation
festgestellt werden (ter Beest und Hoekstra, 1992). Neben der Assoziation mit der
Myelinmembran und der im Rahmen dieser Arbeit gezeigten Wechselwirkung mit
36K interagiert MBP in Lösung außerdem mit Aktin (Boggs und Rangaraj, 2000),
wodurch 36K eine indirekte Verbindung zum Cytoskelett hätte.
Über die P0-ähnlichen Glykoproteine IP1 und IP2 (Jeserich und Waehneldt, 1987)
könnte das Myelinprotein 36K in Verbindung zur extrazellulären Apposition
(„Intraperiod Line“) stehen. IP1 besteht aus einer großen, als Immunglobulin-Einheit
aufgebauten, extrazellulären Domäne (124 Aminosäuren) und einem kleinen
cytosolischen Teil (30 Aminosäuren), die durch eine Transmembrandomäne
(26 Aminosäuren) getrennt sind. Die Isoform IP2 ist mit 29 zusätzlichen Aminosäuren
am cytosolischen Teil etwas größer als IP1 (Stratmann und Jeserich, 1995). Lanwert
und Jeserich (2001) konnten zeigen, dass in CHO-Zellen heterolog exprimiertes IP1
eine Zell-Aggregation bewirkte und daher eine Rolle beim Aufbau und/oder bei der
Stabilisierung der „Intraperiod Line“ spielen könnte. Da 36K nach den erhaltenen
Hinweisen teilweise in die Myelinmembran eintaucht, wären die bei der
BN-PAGE und Co-Immunopräzipitation festgestellte Assoziation des Proteins mit den
Intermediär Proteinen sowohl über den kleinen cytosolischen Teil der IP´s als auch
über die Transmembrandomäne denkbar. Dadurch könnte 36K seinen Einfluss über
die Myelinmembran hinweg in die extrazelluläre Apposition ausbreiten.
Die hier beschriebenen direkten Wechselwirkungen der Hauptmyelinproteine
IP1 & 2, MBP und 36K untereinander und die indirekten Interaktionen mit den
jeweiligen assoziierten Proteinen deuten auf ein komplexes Protein-Netzwerk im
ZNS-Myelin der Fische hin, dass einer feinen Regulierung bedarf. Ob und inwieweit
die nukleotidbedingte Konformationsänderung die Assoziation von 36K mit anderen
Myelin-Proteinen beeinflusst und/oder der Abstand innerhalb des Myelins durch 36K
alleine oder durch ein genau definiertes Zusammenspiel der einzelnen
Komplex-Komponenten beeinflusst wird, wäre vor dem Hintergrund der erwähnten
Dynamik des ZNS-Myelins der Fische für die Zukunft eine interessante
Fragestellung.
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6. ANHANG
6. ANHANG
6.1 36K-Aminosäure-Sequenz mit Sekundärstruktur-Vorhersage (nach 3.1.2) und Trypsinisierungsstellen nach PeptidCutter (Expasy-Internet-Server)
1 MGNSTMSLYR NSAWFLKGMT EFTRSAFLSA
31 AKHFVEKDLE VSMAGRVFMI TGANSGIGRA
61 TAMAIAKRGG TVHMVCRNKD KAEEARADIV
91 KESGNKEIYV HILDLSETRK VWEFAEAFKR
121 KYKVLNLLIN NAGCIMSERD VNAEGLEKSF
▼ ▼ ▼
▼ ▼ ▼ ▼
▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼
▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼
▼ ▼ ▼ ▼
151 ASNVMGVYIL TRGLIPLLEK SAEPRVITVS
181 SGGMLVQKLR TGNLQTEIGR YDGTMVYAQH
211 KRQQVVMTEQ WAQTHSNIHF SVMHPGWVDT
241 PAVANAMPDF HQSMKDSLRT PEQGADTVVW
271 LAISEAAATK PSGSFFQDRR MVSAHLPLAW
301 THSSQLEQQK FMSVMEDLAK TFQPH*
▼ ▼ ▼
▼ ▼ ▼
▼ ▼
▼ ▼
▼ ▼
▼ ▼
X: α-Helix, X: β-Faltblatt, : Trypsinisierungsstelle, : nach Membranassoziation in
den Bilayer eingetauchte Trypsinierungsstelle (nach 3.6.1) ▼ ▼
-69-
6. ANHANG
6.2 Klonierungsschema der 36KcDNA in die MCS („multiple cloning site“) des pET23a(+)-Vektors (Fa. Novagen, Schwalbach/Ts.) (nach Diplom-Arbeit W. Moll, 2001)
Bgl II (334)
Nde I Nhe I EcoR I Hinc II Hind III Not I Bpu1102
Xba I BamH I Sac I Sal I Eag I Xho I Sty I (57)
3´ 5´
Restriktion mNDE I & Sa
il I
t
Bgl II (334)
Xba I
Nde I Nhe I
Sal I
Hind III
Eag I
Not I
Xho I
Bpu1102
Sty I (57)
5´
Ligation mit cDN
3´
3´ 5´
Sal I 36K A
Nde I
Bgl II (334)
Xba I
Nde I Nhe I
Sal I
Hind III
Eag I
Not I
Xho I
Bpu1102
Sty I (57)
3´ 5´
-70-
6. ANHANG
6.3 Abkürzungen
% v/v Volumenprozente % w/v Gewichtsprozente µ mikro A320 Absorption bei einer Wellenlänge von 320 nm
icol esoxyribonukleinsäure
traessigsäure
ng g
alaktosid
ante
phosphat)
Wellenlänge von 600 nm Chemikalien.
Saline (“Phosphat-Puffer”)
(„Umdrehungen pro Minute”)
DS Natrium-(„Sodium“-)dodecylsulfat time (Zeit)
BS(T) Tris Buffered Saline (Tween-20) (“Tris-Puffer”) EMED N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin ris Tris-Hydroxymethylaminomethan Volumen
rvensystem
Amp Ampicillin BSA Rinderserumalbumin CAM ChloramphencDNA komplementäre DDMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure E. coli Escherichia coli EDTA EtylendiaminteFmax maximale Fluoreszenz Fa. Firma g Gramm 1xg 1x ErdanziehuHis-ta Histidin-„tag“ (engl. für Fortsatz, Anhang) IPTG Isopropylthiogl Liter Kd DissoziationskonstkDa Kilo-Dalton m milli M molar MCS „Multiple Cloning Site“ (multiple Klonierungsstelle)min Minute NAD(P) Nicotinamid-adenin-dinukleotid(-nm nanometer OD600 optische Dichte bei einerp. A. lat. „pro analysi“, ReinheitsbezeichnungPBS Phosphate Buffered pH Maßzahl für die Wasserstoffionen-KonzentrationPMSF Phenylmethansulfonylfluorid PNS Peripheres Nervensystem rpm rounds per minuteRT Raumtemperatur St TTTVZNS Zentrales Ne
-71-
6. ANHANG
-72-
6.4 Publikationen
oll W, Grüber G, Jeserich G. 2001. Structural dynamics in the myelin of fish – 36K
as a novel filamentous myelin protein. J Neurochem 78: 49
oll W, Lanwert C, Jeserich G. 2003. Molecular cloning, tissue expression and
partial characterization of the major fish CNS myelin protein 36K
M
M
DANKSAGUNG
Herrn apl. Prof. Dr. G. Jeserich möchte ich für die Möglichkeit und das Vertrauen
danken, meinen Teil zur Charakterisierung dieses interessanten Myelinproteins
beitragen zu können.
Ein besonderer Dank gebührt Bettina Flenker für ihre Unterstützung im Laboralltag
und das angenehme Arbeitsklima.
PD. Dr. G. Grüber (Inst. f. Biophysik, Universität des Saarlandes, Homburg/Saar)
danke ich für die Durchführung der Röntgenkleinwinkelstreuung, durch die wir einen
ersten Eindruck vom Aussehen des 36K-Proteins erhalten haben.
Des Weiteren möchte ich mich bei Prof. Dr. H.-J. Steinhoff und Klaus-Peter Vogel
(AG Experimentelle Physik) für die Aufnahme und Erläuterung der ESR-Spektren
bedanken.
Für die Einführung in die CD-Spektroskopie und Möglichkeit der Nutzung von
Geräten der Abt. Biophysik bedanke ich mich bei apl. Prof. Dr. R. Wagner.
Claudius Walter danke ich für seine unendliche Geduld bei der Einführung in die
FRET-Spektroskopie und für die Unterstützung und Diskussionsbereitschaft bei der
Kalkulation der Chromophoren-Abstände.
Danken möchte ich außerdem Dr. Wilfried Hamann für die auch über die
Wissenschaft hinausgehenden Gespräche.
Meinen Eltern danke ich, dass sie mir dieses Studium ermöglicht haben.
Bei meiner Frau Doris möchte ich mich für ihre Unterstützung und ihre Geduld, vor
allem während des Verfassens dieser Arbeit, bedanken. Und unserem Sohn Luis
danke ich für die Ablenkung, wenn der Gedankenfluss mal wieder blockiert war.
Abschließend möchte ich diese Dissertation meinem Schwiegervater Heinrich Pieper
widmen, der kurz vor der Fertigstellung verstorben ist.
-73-
CURRICULUM VITAE
Wolfgang Moll
geboren am 11.07.1974 in Aschendorf
verheiratet
Schule und Grundwehrdienst
1980 – 1984 Grundschule Heede
1984 – 1986 Orientierungsstufe Dörpen
1986 – 1994 Gymnasium Papenburg, Abschluss mit ABITUR
1994 – 1995 Grundwehrdienst in der Hümmling-Kaserne
Studium
1995 Immatrikulation an Universität Osnabrück,
Fach: Diplom-Biologie
2001 Diplom-Arbeit:
„Heterologe Expression und Charakterisierung des
Myelinproteins 36K aus dem ZNS der Regenbogenforelle
(Oncorhynchus mykiss)“
12.03.01 Verleihung des akademischen Grades DIPLOM-BIOLOGE
Promotion
03.01 – 08.04 Anfertigung der Dissertation unter der Leitung von
apl. Prof. Dr. G. Jeserich mit dem Thema „Strukturelle und
funktionelle Untersuchung des Myelinproteins 36K aus
dem ZNS der Regenbogenforelle (Oncoryhynchus
mykiss)“ in der Arbeitsgruppe Tierphysiologie
(Neurobiologie) und Neurobiologie
-76-
CURRICULUM VITAE
-77-
03.01 – 03.04 Stipendiat im Graduiertenkolleg 612 der DFG
„Molekulare Physiologie: Wechselwirkungen zwischen
zellulären Nanostrukturen“
03.04 – 08.04 wissenschaftlicher Angestellter an der Universität
Osnabrück im Sonderforschungsbereich 431
"Membranproteine - Funktionelle Dynamik und Kopplung
an Reaktionsketten"
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