Biophysikpraktikum

Strukturuntersuchung vonLipidmembranen

mit Rontgenstreuung

Institut fur Rontgenphysik

Georg-August-Universitat Gottingen

Betreuer: Ch. Li

Tel.: 5064

e-mail: cli@uni-goettingen.de

1

Inhaltsverzeichnis

1 Lipid-Modellsysteme 4

1.1 Die Biologische Membran . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.2 Chemische Struktur der Lipidmolekule . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.3 Form und Struktur der Lipidstapel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.4 Geometrische Eigenschaften der Lipide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.5 Wechselwirkungen zwischen Membranen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.6 Dimyristoyl-Glycero-Phosphotidylcholine (DMPC) als Modellsystem . . . . . 10

2 Rontgenstrukturanalyse von Lipidmembranen 12

2.1 Streuvektoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.2 Brechungsindex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.3 Totalreflexion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.4 Fresnelreflektivitat der Rontgenstrahlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

2.5 Bragg-Reflexion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

2.6 Meßverfahren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

2.7 Ausleuchtungskorrektur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

3 Theoretische Beschreibung der Lipiddoppelschicht 18

3.1 Formfaktor, Strukturfaktor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

3.2 Rekonstruktion des Elektronendichteprofils . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

4 Praparation und Messung 20

4.1 Praparation auf Festkorpersubstrat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

4.2 Aufbau des Diffraktometers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

4.3 Probenumgebung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

4.4 Durchfuhrung der Messung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

5 Steuerprogramm 22

5.1 Diffraktometerbedienung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

5.2 Computerbedienung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

5.3 Fehlerbehebung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

5.4 Ausrichtung des Primarstrahls und der Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

5.5 Eineichung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

5.6 Messung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

5.7 Ermittlung von der Periodizitat D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

5.8 Datentranslation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

2

6 Auswertung 31

6.1 Meßkurve . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

6.2 Ermitteln des Elektronendichteprofils . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

3

1 Lipid-Modellsysteme

1.1 Die Biologische Membran

Grundelement aller Organismen ist die Zelle. Durch die Zellmembran ist die Zelle von

der Außenwelt getrennt. Im Jahr 1972 entwarfen S. Jonathan Singer und Garth Nicolson

ein Modell fur die Organisation biologischer Membranen, das flussige Mosaik. Auf-

grund dieses Modells bestehen biologische Membranen hauptsachlich aus Proteinen und

Lipiden . Eine biologische Membran ist als Mosaik von Proteinen in einer zahflussigen

Lipiddoppelschicht, wie in Abb.1 gezeigt, aufgebaut1. Die Lipiddoppelschicht bildet eine

zweidimensionale Flussigkeit und kann als Grundstruktur biologischer Membranen an-

gesehen werden. Zwischen den Lipiden sind Proteinmolekule eingebettet. Innerhalb des

Lipidfilms sind die Proteine beweglich. Manche der Proteine reichen durch die Membran

hindurch und sind auf beiden Seiten der Membran dem waßrigen Medium ausgesetzt.

Wenngleich die Lipidmolekule in der Membran ordentlich ausgerichtet sind, sind sie in

lateraler Bewegung kaum eingeschrankt. Auch die Proteine konnen sich lateral ungehindert

in der Lipiddoppelschicht bewegen. Es ist dagegen fur die Proteine wie auch fur die Lipi-

de nahezu unmoglich, von einer Membranoberflache zur anderen zu wandern (engl. flip-flop).

Abbildung 1: Dreidimensionale schematische Darstellung einer biologischen Membran. Die Li-piddoppelschicht dient zum einen als Losungsmittel fur sog. integrale Proteine, zum anderen alsPermeabilitatsbarriere .

Die Außenseite der Membran dient der Wechselwirkung mit dem extrazellularen Raum und

den Nachbarzellen. Die Proteine der Innenseite dagegen dienen der Interaktion mit dem

1L. Stryer, Biochemie, Spektrum Akademischer Verlag GmbH Heidelberg, 1996

4

Zellinnern, der Verankerung an das Cytoskelett und dem umgekehrten Transport von Meta-

boliten aus der Zelle heraus.

1.2 Chemische Struktur der Lipidmolekule

Wie eingangs bereits erwahnt sind Lipide neben den Proteinen ein Hauptbestandteil in

biologischen Membranen. Lipide sind amphiphile Molekule, die sowohl hydrophobe (Wasser

abweisende) als auch hydrophile (Wasser bevorzugende) Eigenschaften in einem Molekul

vereinen. Der hydrophile Teil dieser Molekule wird durch ihre polare Kopfgruppe gebildet,

wahrend der hydrophobe Teil aus nichtpolaren Fettsauren aufgebaut ist.

In biologischen Membranen gibt es eine Reihe naturlich vorkommender Lipide. Davon stellen

Phospholipide die Hauptgruppe dar. Ein Phospholipid besteht aus einem Glycerolruckgrat

an das jeweils durch Veresterung einerseits eine Phosphatkopfgruppe mit angehangtem Rest

(Cholin, Serin, etc.) und andererseits zwei Fettsaurereste gebunden sind. Abb.2 zeigt die

detaillierte chemische Struktur eines Phospholipides (POPS). In Tab.1 wurden einige in der

Natur haufig vorkommenden Phospholipide aufgelistet.

O

O

O

OO P

O

O

OCOO

NH3

Alkohol(hier: Serinrest)

Fettsäurerest (hier: Oleoylrest)

Fettsäurerest (hier: Palmitylrest) Phos-phor-säure-rest

Glycerol-rest

Polarer Teil des Lipids (B)Unpolarer Teil des Lipids (A)

Abbildung 2: Chemische Struktur eines Phospholipides.

1.3 Form und Struktur der Lipidstapel

Aufgrund der Amphiphilitat konnen Phospholipide in waßrigen Losungen in verschiedenen

Formen suspendieren und unterschiedliche Strukturen bilden. Die Kopfgruppe ist hydrophil,

die Kettenregion hingegen ist hydrophob. Dadurch konnen sich in Abhangigkeit von Tempe-

ratur und Feuchtigkeit eine Reihe unterschiedlicher Strukturen wie etwa Mizellen, Liposome,

oder Lipiddoppelschichten (Abb. 4) ausbilden. Man nennt dies den Polymorphismus der Li-

pide.

5

Kurzbez. vollstandiger Name R1 R2 Ladung

DMPC Dimyristoyl-Glycero-Phospho-Choline 14:0 14:0 0

POPS Oleoyl-Palmitoyl-Glycero-[Phospho-L-Serine] 18:1 16:0 -1

DLPC Dilauroyl-Glycero-Phosphocholine 12:0 12:0 0

DOPC Dioleoyl-Glycero-Phosphocholine 18:1 18:1 0

DPPC Dipalmitoyl-Glycero-Phosphocholine 16:0 16:0 0

DMPG Dimyristoyl-Glycero-[Phospho-rac-(1-Glycerol)] 14:0 14:0 -1

DMPE Dimyristoyl-Glycero-Phosphoethanolamine 14:0 14:0 0

OPPC Oleoyl-Palmitoyl-Glycero-Phospho-Choline 18:1 16:0 0

Tabelle 1: Bezeichnungen, Kettenlangen und Nettoladungen der haufig in der Natur vorkommendenPhospholipide. R1 bzw. R2 bezeichnen die Lange der ersten bzw. zweiten Kette in der Anzahl vonC-Atomen. Die Nettoladungen verstehen sich in Einheiten der Elementarladung e−.

a) b)

c) d)

Abbildung 3: Schematische Darstellung einiger haufig vorkommenden Lipidaggregate: (a)(b) Zy-lindrische Mizellen, (c) Lipiddoppelschichten, (d) Liposom oder Vesikel.

Wegen der amphiphilen Eigenschaft des Phospholipidmolekuls sind die Fettsaureketten bei

Bildung der Mizellen in deren Inneren verborgen, die geladenen hydrophilen Kopfgruppen

sind dagegen zum waßrigen Medium hin, an der Oberflache liegend, angeordnet. Die Mi-

zellen sind kugelformig mit einem hydrophoben Zentrum, daß nur von Fettsaureketten ge-

bildet wird. Solche Mizellen konnen tausende von Lipidmolekulen enthalten. Liposome sind

ebenfalls kugelformig. Sie bestehen aus einer Phospholipiddoppelschicht, die einen waßrigen

Innenraum umgibt. Als Grenzfall großer Liposome kann die planare Lipiddoppelschicht an-

gesehen werden.

6

�������Mizell

Abbildung 4: Querschnitte der drei typischen Strukturen, die von Phospholipiden in waßrigerLosung gebildet werden konnen .

1.4 Geometrische Eigenschaften der Lipide

Zur einfachen Beschreibung der verschiedenen Strukturen konnen einfache geometrische

Uberlegungen herangezogen werden. Dazu definiert man den Packungsparameter durch das

Verhaltnis von P = Va0lc

, wobei a0 die Kopfgruppenflache, V das Volumen der Fettsaureketten

und lC die kritische Lange der Fettsaureketten ist. In Abb. 5 ist dies veranschaulicht.

Fur verschiedene Verhaltnisse von P gibt es dann die in Abb. 6 dargestellten Formen. Wenn

a0, V und lc bekannt sind, kann man die raumliche Struktur, in der sich bestimmte Lipidmo-

lekule anordnen konnen, verstehen. Hat das Lipidmolekul zylindrische Form, so konnen sich

bevorzugt Lipiddoppelschicht ausbilden. Wenn aber die Kopfgruppenflache großer als die

Kettengrundflache ist, das Lipidmolekul also eine konische Form hat, bilden sich bevorzugt

Mizellen.

1.5 Wechselwirkungen zwischen Membranen

Die Krafte im Inneren eines biologischen Systems fuhren zur Ausbildung stabiler Strukturen.

(1) Van der Waals Potential

Durch thermische Fluktuationen kommt es zu inhomogenen Ladungsverteilungen, die wie-

derum Ladungsverteilungen in den Membranen induzieren, so daß letztlich eine Anziehung

zwischen den Lipidmolekulen resultiert. Die van der Waals Wechselwirkung ist als frequenz-

abhangige Wechselwirkung im allgemeinen nicht additiv und zeigt Retardierungseffekte. Das

Van der Waals Potential setzt sich zusammen aus einem statischen und einem dispersiven

Anteil.

7

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��

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Abbildung 5: (a) Die Packungsparameter (a0, lc, V ) bestimmen die geometrischen Eigenschaftender Lipide. a0 charakterisiert die zur Ausbildung eines stabilen Aggregats notige optimale Kopf-gruppenflache an der Grenzflache zwischen Kopfgruppe und Fettsaure eines Lipidmolekuls, lc istdie kritische Lange, welche die Fettsauregruppen der Lipide in einem stabilen Aggregat noch anneh-men konnen und V ist das von ihnen eingenommene Volumen. (b) Ein Lipidmolekul mit nur einerFettsaurekette. Solche Lipide konnen in waßriger Losung Mizellen (Abb. 4) mit einem ”inneren“Radius R = lc ausbilden .

Der statische Anteil wird fur kleine Membranabstande oft durch die Naherung zweier

durch eine dunne Wasserschicht getrennter Halbraume aus Kohlenwasserstoff ausgedruckt.

Es gilt dann mit dh → 0 (s.u.):

V0(dh, T ) =Hstat(lDH)kBT

12π

1

d2h

, (1)

wobei Hstat(lDH) die statische Hamakerkonstante, lDH die Debeye-Huckel-Lange und dh den

Abstand der Schichten (Abb. 7) bezeichnet.

Der dispersive Anteil kann wie folgt beschrieben werden:

Vdis(dh) =HdiskBT

16πd2h

[1 − 2

1 + a/dh

+1

1 + 2a/dh

](2)

mit der dispersiven Hamakerkonstante2 Hdis = 2∑∞′

n=0 ∆2n .

Hierbei beschrieben ∆n die relative Differenz der frequenzabhangigen Dielektri-

zitatskonstenten beider Medien mit ∆n = (εH2O(ωn) − εCH2(ωn))/(εH2O(ωn) + εCH2(ωn)),

a die Doppelkettenlange in einer Membran und dh der Abstand der Schichten (Abb. 7).

2Willi Fenzl. Zeitschrift fur Physik B, 97:333-336,1995

8

���������� P ����� ���� ������

���������� �����

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��

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�

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��

��

Abbildung 6: Darstellung einiger verschiedener Lipidsorten, ihrer approximierten geometrischenForm, des Großenbereichs von P und den Strukturen der stabilen Lipidaggregate.

9

dW

H HHO OO22

2

dh

ddd d

k

kk

k

a a

Abbildung 7: Modelldarstellung fur die Berechnung des van der Waals Potentials zwischen zweiMembranen.

(2) Hydrationspotential

Der Amphiphile Charakter der Phospholipide fuhrt zu einer Absenkung der freien Energie

wenn die hydrophilen Kopfgruppen mit Wasser umgeben sind. Die Ausbildung einer endli-

chen Wasserschicht zwischen den Membranen wird begunstigt. Dies fuhrt zu dem Auftre-

ten der sogenannten Hydrationswechselwirkung. Das Hydrationspotential pro Flacheneinheit

wird durch den empirischen Ansatz

Vhyd(dw) = H0e−dw/λh (3)

mit den Konstanten H0 ≈ 4kBT/A2 und λh � 2A beschrieben.

Aufgabe 1.

Berechnen Sie aus Gl. (1)(2)(3) das van der Waals-Potential und das Hydrationspotential bei dh =15A. Tragen Sie die Potentiale gegen dh auf. Tragen Sie danach das gesamte Potential (beidePotentiale zusammen) gegen dh auf. (dk = 9A, a = 25A, T = 313K, Hdis = −0.75,Hstat =

−0.6)

1.6 Dimyristoyl-Glycero-Phosphotidylcholine (DMPC) als Mo-

dellsystem

Das im Praktikum zu untersuchende Lipid ist DMPC. DMPC ist eine Abkurzung fur

1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphatidylcholin. Es besitzt zwei gesattigte Dimyristoyl-

fettsaureketten, die jeweils aus 14 C-Atomen bestehen (Abb. 8), und ein Phosphatidylcholin

als Kopfgruppe. DMPC ist elektrisch neutral. In Abb. 9 wurde ein Phasendiagramm von

10

DMPC in Abhangigkeit der Temperatur und Wasserkonzentration dargestellt. Daneben wird

eine Darstellung der sich bildenden Strukturen gezeigt.

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Abbildung 8: Chemische Struktur von DMPC. Seine lineare Struktur lautet C36H72NPO8.

Abbildung 9: Phasendiagramm der DMPC-Membran bei verschiedenen Wasserkonzentrationenund Temperaturen. Daneben sind typische Phasen dargestellt, Lc: Subgel-Phase; Lc′: Subgelartig-verkippt; Lβ:Gelartig-phase; Lβ′:Gelartig-verkippt; Lα:Fluid-phase; Pβ′:Ripple-phase.

Aufgabe 2.

Berechnen Sie den Erwartungswert fur die Elektronendichte von DMPC im Stufenmodell.3 (Flacheder Kopfgruppe = 60A, dk = 9A, a = 25A, dw = 15A) Siehe Abb. 7.

3Im Stufenmodell wird die Lipiddoppelschicht drei Bereiche konstanter Elektronendichten unterteilt:(a)Kopfgruppe, (b)Fettsaureketten, (c)Wasserschicht. Jeder Bereich wird hier dessen mittlere Elektronen-dichte zugeordnet.

11

2 Rontgenstrukturanalyse von Lipidmembranen

2.1 Streuvektoren

Seien �ki, �kr und �kf die Wellenvektoren der einfallenden, reflektierten und der gebeugten Wellemit Wellenlange λ (Abb. 10), wobei |�ki| = |�kr| = | �kf | = 2π

λ . Der Wellenvektor �ki und die Ober-flachennormale der Probe bestimmen die Einfallsebene. Der Rontgenstrahl trifft unter dem Ein-fallswinkel αi auf die Probenoberflache und wird von der Probe unter einen Winkel αf zur Probeno-berflache und einem Winkel 2θ zur Einfallsebene gestreut. Der Streuvektor oder Impulsubertrag�q = �kf − �ki laßt sich schreiben durch:

qx =2π

λ(cos αf cos φ − cos αi) (4)

qy =2π

λcos αf sinφ (5)

qz =2π

λ(sinαi + sinαf ) (6)

aa

�

Abbildung 10: Streugeometrie an Lipiddoppelschichten. Mit der grauen Kopfgruppe und hellenKettenregion wird ein einzelnes Lipidmolekul bezeichnet. Die gestreiften Pfeile stellen jeweils deneinfallenden Strahl �ki, den reflektierten Strahl �kr und den gebeugten Strahl �kf dar.

Abb. 10 stellt die Streugeometrie an einer Lipiddoppelschicht schematisch dar.

12

2.2 Brechungsindex

Die Grundlage fur das Verstandnis der Wechselwirkung von Rontgenstrahlung mit Materie ist dermaterial- und wellenlangenabhangige Brechungsindex n. Er wird definiert durch:

n =c

v(7)

c: Phasengeschwindigkeit der Welle im Vakuumv: Phasengeschwindigkeit der Welle im Medium

Im sichtbaren Bereich der elektromagnetischen Welle gilt dabei v < c und damit n > 1.Fur Rontgenstrahlung ist die Phasengeschwindigkeit der Welle in Materie großer als c, deshalb isthier n < 1. Der Brechungsindex eines Materials, das aus m Elementen besteht, laßt sich schreibenals :

n = 1 − reNAλ2

2π

m∑i=1

ρifi

Ai(8)

wobei:re = 2.81794092 · 10−5 A: klassischer Elektronenradiusλ: Wellenlange der RontgenstrahlungNA: Avogadrozahlρi: Partielle Massendichte des i-ten ElementsAi: Partielle relative Atommasse des i-ten Elementsfi: Atomformfaktor des i-ten Elements

Der Atomformfaktor beschreibt das wellenlangenabhangige Streuvermogen der Atome. Erkann in der folgenden komplexen Form dargestellt werden :

f = f0 + f ′ + if ′′ (9)

f ′ und f ′′ werden als Dispersions- und Absorptionskorrektur zu f bezeichnet. Der Brechungsindexn wird entsprechend geschrieben als:

n = 1 − δ + iβ (10)

Dabei beschreibt δ die Dispersion und β die Absorption im Material. Man kann δ und β aus Gl.(8) und Gl. (9) ableiten als:

δ =reNAλ2

2π

m∑i=1

ρi

Ai(f0

i + f ′i) (11)

β =reNAλ2

2π

m∑i=1

ρi

Ai(f ′′

i ) (12)

2.3 Totalreflexion

Da der Brechungsindex n eines Materials fur Rontgenstrahlung kleiner als 1 ist, ist alle Materiefur Rontgenstrahlung optisch dunner als Vakuum (oder Luft). Der Rontgenstrahl wird daher beim

13

Grenzubergang von Luft nach Materie von der Grenzflachenormale weg gebrochen (Abb. 11). DieserEffekt ermoglicht eine Totalreflexion fur den Rontgenstrahl an der Grenz-oberflache. Man kann alsoeinen kritischen Winkel αc fur den einfallenden Strahl finden, unter dem Totalreflexion auftritt.

n

n

�

�

��

� �

�

�

k k

k

� �

�

Abbildung 11: Reflexion und Transmission der Rontgenstrahlung an einer Grenzflache.

Wenn ein Rontgenstrahl von einem Medium i mit Brechungsindex ni in ein zweites Medium t mitBrechungsindex nt ubergeht (Abb. 11), gilt nach dem Brechungsgesetz von Snellius:

ni cos αi = nt cos αt (13)

Beim Grenzfall der Totalreflexion wird αt = 0, αi = αc. Mit ni = 1 fur Luft laßt sich Gl. (13) beiTotalreflexion schreiben als:

cos αc =nt

nicos αt = nt (14)

Fur kleines αc kann cos αc nach αc entwickelt werden. Man setzt nt in Gl. (10) ein, und erhalt unterVernachlassigung der Absorption des Mediums:

1 − 12α2

c ≈ 1 − δ =⇒ αc ≈√

2δ (15)

2.4 Fresnelreflektivitat der Rontgenstrahlung

Von besonderem Interesse ist die reflektierte Intensitat der Rontgenstrahlung an einer ideal glattenOberflache. Diese reflektierte Intensitat wird als Fresnelreflektivitat bezeichnet. Fur einen gegebe-nen kritischen Winkel αc bei ni = 1 laßt sich die Fresnelreflektivitat bestimmen.4

RF =

∣∣∣∣∣sinαi −

√sinαi

2 − sinαc2

sinαi +√

sinαi2 − sinαc

2

∣∣∣∣∣2

(16)

Mit qz = 2πλ (sin αi + sinαf ) = 4π

λ sinαi und qc = 4πλ sinαc laßt sich Gl. (16) schreiben als:

4Elements of Modern X-ray Physics; Autor: Jens Als-Nielsen und Des McMorrow; John Wiley & Sons; 1edition (January 18, 2001);ISBN: 0471498580

14

RF (qz) =

∣∣∣∣∣qz −

√q2z − q2

c

qz +√

q2z − q2

c

∣∣∣∣∣2

(17)

Fur qz < qc ist der Wurzelausdruck eine reine imaginare Große, so daß sich RF (qz) = 1 ergibt,entsprechend liegt in diesem Fall Totalreflexion vor.Dagegen ist fur qz > qc der Wurzelterm reel und es ist RF (qz) < 1, wobei RF (qz) mit steigendem qz

immer mehr abnimmt. Diese Abnahme kann fur großes qz gut charakterisiert werden, indem manden Zahler und den Nenner in Gl. (17) durch qz dividiert und die Wurzelausdrucke fur qz � qc

entwickelt. Man kann dann ableiten:

RF (qz) ≈∣∣∣∣ q2

c

4q2z − q2

c

∣∣∣∣2

∝ q−4z (qz � qc) (18)

Die Fresnelreflektivitat fallt daher mit q−4z ab.

2.5 Bragg-Reflexion

Da das zu untersuchende Lipidsystem eine periodische Struktur (Doppelschicht) besitzt, muß mansich auf die Reflektivitat an periodischen Strukturen konzentrieren. Diese Reflektivitat kann mitder Bragg-Reflexion gut beschrieben werden. Man betrachtet einen Rontgenstrahl der Wellenlange

�

a

�

�2a

a�

�

� �

�

����

Abbildung 12: Geometrie zur Bragg-Bedingung.

λ, der an parallelen Netzebenen eines Kristalls reflektiert wird (Abb. 12). Dabei ist αi = αf ,und der gegenseitige Abstand der Netzebenen ist D. Der Gangunterschied an zwei aufeinanderfolgenden Netzebenen reflektierten Rontgenstrahlen ist dann 2D sinαi. Wenn der Gangunterschiedein ganzzahliges Vielfaches der Wellenlange λ ist, findet konstruktive Interferenz statt. Die Bragg-Bedingung fur ein Maximum der reflektierten Intensitat lautet dann:

2D sinαi = nλ (n ∈ N ) (19)

15

Mit qz = 4πλ sin αi laßt sich Gl. (19) schreiben:

qz = n2π

D(n ∈ N ) (20)

Gl. (20) verknupft also die Bragg-Bedingung mit der z-Koordinate im reziproken Raum.

2.6 Meßverfahren

Um die verschiedenen Meßziele (z.B. Reflektivitat) zu erreichen, gibt es unterschiedliche Meßver-fahren.Beim Reflektivitats-Scan mißt man unter der ”spiegelnden“ Bedingung αi = αf den spekular reflek-tierten Rontgenstrahl. Es wird folglich die Intensitat entlang der qz-Achse erfaßt. Die Reflektivitatan Lipiddoppelschichten ist in Richtung senkrecht zur Probenoberflache sensitiv, weshalb mandurch Reflektivitatsmessungen Informationen uber Lipiddoppelschichten in Richtung senkrecht zurOberflache der Lipiddoppelschicht gewinnen kann.Im offset-Scan ist die Geometrie ahnlich dem Reflektivitats-Scan. Die Eichung zwischen αi und αf

ist um einen offset-Winkel ∆αi dejustiert. Mit dem offset-Scan kann die diffuse Streuung neben derspekularen Reflektivitat gemessen und fur den diffusen Untergrundabzug der spekularen Reflekti-vitat extrapoliert werden.Ein Verfahren, mit dem die Orientierung (Mosaizitat) der Probe bestimmt werden kann, ist derRocking-Scan. Dabei wird die Summe αi + αf immer konstant gehalten. Abb. 13 zeigt schematischden reziproken Raum eines Membranstapels. Die eben erklarten Meßverfahren werden durch ihreeindimensionale Bahn charakterisiert.

qz

qx

ki ka

q

�i �f

Abbildung 13: Schematische Darstellung der Bahnen der verschiedenen Meßverfahren im rezipro-ken Raum. 1©: Reflektivitats-Scan, 2©: Offset-Scan, 3©: Rocking-Scan.

16

2.7 Ausleuchtungskorrektur

Die Probe wird bei den Messungen gegen den Primarstrahl gedreht. Bei kleinen Einfallswinkeln kannnicht der gesamte Primarstrahl von der Probe erfaßt werden (Abb. 14(a)), so daß der Primarstrahlteilweise vorbeigeht. Folglich kann nicht alles reflektiert werden, was prinzipiell zur Verfugungstande. Man muß deswegen Ausleuchtungskorrekturen in die Datenauswertung miteinbeziehen, so-lange bis die Projektion der Probe der Strahlbreite des Primarstrahls entspricht (Abb. 14(b)).Ab jetzt wird der gesamte Primarstrahl von der Probe erfaßt und es kann prinzipiell alles reflek-tiert werden, was ankommt. Fur alle Winkel, die großer sind (Abb. 14(c)), ist daher fur Reflekti-vitatsmessungen keine Ausleuchtungskorrektur mehr notig.Seien l die Probelange, h die Strahlbreite, αG der Grenzwinkel, bei dem die Projektion der Probegleich der Strahlbreite des Primarstrahls ist, mit sinαG = h

l (Abb. 15).

� ��� ��

��� ������

������

Probe

Abbildung 14: Schematische Darstellung der Probedrehung gegen Primarstrahl

������

��

a a aa

��

� � ��

��

Probe

><

������

Abbildung 15: Geometrie zur Ausleuchtungskorrektur.

Bei αi < αG kann der Primarstrahl nicht vollstandig reflektiert werden, weil nicht der gesamtePrimarstrahl die Probe erreicht. Deshalb muß die reflektierte Intensitat in diesem Bereich miteinem winkelabhangigen Faktor

h

h′ =h

l sinαi=

1sinαi

h

l(21)

als Ausleuchtungskorrektur multipliziert werden.

17

3 Theoretische Beschreibung der Lipiddoppelschicht

3.1 Formfaktor, Strukturfaktor

Wir gehen davon aus, daß die Lipidschicht aus N perfekten Doppelschichten der Periode D ange-ordnet ist,

x

y

�

�

����

�

Abbildung 16: Geometrie zur Berechnung des Elektronendichteprofils. Die Lipiddoppelschichtensind perfekt geordnet, und in x-und y-Richtung herrscht vollige Homogenitat und Isotropie.

Mit diesem Modell kann man die Elektronendichteverteilung in z-Richtung schreiben als:

ρ(z) =N−1∑m=0

ρ0(z − mD), (22)

wenn in x- und y-Richtung vollige Homogenitat und Isotropie herrscht (Abb. 16). Hierbei ist N dieAnzahl der Lipiddoppelschichten und ρ0(z) die Elektronendichteverteilung einer einzelner Periode.Die Funktion ρ0(z) sei symmetrisch und nur fur z ∈ [−D

2 , D2

]ungleich Null.

Fur die Reflektivitat an einer glatten Oberflache eines Materials mit kontinuierlicher Elektronen-dichteverteilung gilt:

R(qz) = RF (qz)∣∣∣∣ 1ρe(∞)

∫∂ρ(z)∂z

e−iqzz dz

∣∣∣∣2

(23)

wobei RF (qz) die Fresnelreflektivitat und ρe(∞) die mittlere Elektronendichte im Material bezeich-net. Wenn man nun ρ(z) aus Gl. (22) in Gl. (23) einsetzt, und die Variable (z − nD) durch z′

ersetzt, erhalt man

R(qz) = RF (qz)∣∣∣∣ 1ρe(∞)

∣∣∣∣2∣∣∣∣∣N−1∑m=0

∫∂ρ0(z′)

∂z′e−iqz(z′+mD) dz′

∣∣∣∣∣2

= RF (qz)∣∣∣∣ 1ρe(∞)

∣∣∣∣2∣∣∣∣∣N−1∑m=0

e−iqzmD

∣∣∣∣∣2 ∣∣∣∣

∫∂ρ0(z′)

∂z′e−iqzz′ dz′

∣∣∣∣2

(24)

18

Man definiert:

S(qz) =N−1∑m=0

e−iqzmD, f(qz) =∫

∂ρ0(z′)∂z′

e−iqzz′dz′. (25)

wobei S(qz) Strukturfaktor und f(qz) effektiver Formfaktor der Lipiddoppelschicht genannt wird.Der kontinuierliche Formfaktor der Lipiddoppelschicht ist gegeben durch:

F (qz) =∫ ∞

−∞ρ0(z) cos(qzz)dz =

∫ D2

−D2

ρ0(z) cos(qzz)dz. (26)

3.2 Rekonstruktion des Elektronendichteprofils

Wenn man den Formfaktor F (qz) (Gl. (26)) beim n-ten Bragg-Maximum (qz = 2nπD ) betrachtet,

laßt sich F (qz) schreiben als:

F

(2nπ

D

)=

∫ D2

−D2

ρ0(z) cos(

2nπ

Dz

)dz =

2D

∫ D2

−D2

[D

2ρ0(z)

]cos

(2nπ

Dz

)dz (27)

F(

2nπD

)ist hier genau der n-te Fourierkoeffizient der Fourierentwicklung von D

2 ρ0(z). Damit kannρ0(z) geschrieben werden als:

ρ0(z) =2D

∑n

F

(2nπ

D

)cos

(2nπ

Dz

)=

2D

∑n

Fn cos(

2nπ

Dz

)z ∈

[−D

2,D

2

](28)

wobei Fn = F(

2nπD

)der diskrete Formfaktor beim n-ten Bragg-Maximum ist. Eine integrierte

Intensitat In (Abb. 23) beim n-ten Bragg-Maximum fur Membranstapel ist gegeben durch:

In = |Fn|2/qzn

wobei qzn den Streuvektor qz beim n-ten Bragg-Maximum bezeichnet. Mit qzn = 2nπD erhalt man

dann:

|Fn|2 =(

2nπ

D

)In bzw. |Fn| =

√2nπ

DIn. (29)

Damit kann das Elektronendichteprofil in einer Lipiddoppelschicht abgeleitet werden als:

ρ0(z) =M∑

n=1

2D

√2nπ

D

√Invn cos

(2nπ

Dz

)z ∈

[−D

2,D

2

], (30)

wobei vn die Phase (nimmt nur die Werte +1 und -1 an) des Formfaktors, M die Anzahl derBragg-Maxima, In die integrierte Intensitat beim n-ten Bragg-Maximum und D die Periode derLipiddoppelschichten bezeichnet.

19

4 Praparation und Messung

4.1 Praparation auf Festkorpersubstrat

Stammlosung herstellen:

Das Lipid (DMPC) wird gewogen und in einer Mischung (1:1) von TFE (2-2-2-Trifluoroethanol)und Chloroform in einer definierten Konzentration (im allg. 10mg/ml) gelost. Diese Stammlosungwird mehrere Minuten mit einem Ruttler stark geschuttelt.

Si-Substrate reinigen:

Die Lipidmembran wird auf einem Si-Substrat hergestellt. Zuerst sollten die Silizium-Substratesehr gut gereinigt werden. Dazu werden die Substrate uber 5 Minuten in einen Behalter mit Me-thanol gelegt. Danach werden die Substrate einige Minuten in ein Ultraschallbad mit Methanol undReinstwasser (MQ, Millipore, ρ ≥ 18MQ/cm) getaucht. Anschließend folgt ein erneutes Reinigen inMethanol und mehrmaliges Waschen mit Reinstwasser. Zum Schluß des Reinigungsablaufs werdendie Substrate durch Ablasen mit Stickstoff getrocknet.

Stammlosung auf Si-Substrate spreiten:

Die gereinigten Silizium-Substrate werden auf eine absolut waagerechte Aluplatte gelegt, um dieStammlosung moglichst homogen auf den Substraten zu verteilen. Die Stammlosung wird gespreitetmit einer Pipette, die mit einer Glasspitze versehen wird, gleichmaßig auf das Si-Substrat gespreitet;jeweils 200 µl pro Substrat. Nach dem Spreiten verdunstet das Losungsmittel langsam. Nach demTrocknen werden die Losungsmittelruckstande aus den Proben extrahiert, indem die Proben ineinem Exsikkator uber mindestens eine Stunde, besser uber Nacht, im Vakuum aufbewahrt werden.

4.2 Aufbau des Diffraktometers

Die Probe wird am Diffraktometer (D500) im Institut fur Rontgenphysik gemessen. Der schemati-sche Aufbau der Anlage ist in Abb. 18 dargestellt. Der Rontgenstrahl (Cu-Rontgenrohre) wird durchzwei Blenden (Blende1, Blende2) kollimiert. Hinter der Probe werden noch zwei Blenden eingesetzt,um die Strahlkollimation weiter zu verbessern, danach wird ein Analysator (Graphit-Kristall) zurMonochromatisierung des Rontgenstrahls eingebaut. Damit der Detektor nicht ubersattigt, wird alsnachstes Element ein Absorber oder eine Blende verwendet, um den Rontgenstrahl abzuschwachen.Der lineare Meßbereich des Detektors ist typischerweise bis 50000 cps (counts per second) . Mitdem Θ -Motor kann die Probe in der Reflexionsebene rotiert werden. Am Ende des Strahlengangswird die an der Probe gestreute Intensitat mit einem Szintillations-Detektor aufgenommen.Die Messungen werden typischerweise bei einer Kathodenleistung von 30kV × 40mA und beiT=45C◦ durchgefuhrt. Bei den Messungen werden zwei Meßverfahren (Reflektivitats-Scan undoffset-Scan) verwendet. Die Primarstrahlintensitat unter dieser Kathodenleistung liegt typischer-weise bei ca. 2 · 105cps.

20

(Im Normalfall mußte das Diffraktometer vor der ersten Messung genau zum Primarstrahl ausge-richtet werden, der hier um wenige Hundertstel-Grad aus der Bahn geraten ist. Dabei kann es sein,dass bei der Messung eine Verschiebung um ebendiese Hundertstel entsteht. Im Laufe des Versucheswird das Gerat jedoch eingeeicht, wodurch die Fehlerrate des Primarstrahls minimiert wird.)

1 2 34 5 6 7 8 9

10

111: Röntgenquelle2: Blende_13: Blende_24: Probe5: Blende_36: Blende_47: Analysator(Graphit)8: Detektorblende oder

Absorber9: Detektor

10: Fahrrichtung des otors

11:

���

Fahrrichtung des 2 otors���

Abbildung 17: Schematische Darstellung des Diffraktometers.

1

2 3 4 5 6 87

9

10

11

1: Halter für Röntgenanode2: Blende_13: Blende_24: Probenhalter5: Blende_36: Blende_47: Analysator(Graphit)8: Detektorblende oder

Absorber9: Detektor10: Thetamotor11: 2Thetamotor

Abbildung 18: Aufbau des Diffraktometers und entsprechende Motor- und Blendenamen.

4.3 Probenumgebung

Da die Phase der Lipidmembranstapel von der Temperatur und Feuchtigkeit der Umgebungabhangig ist, benotigt man eine stabile Probenumgebung mit einstellbarer Temperatur und Feuch-

21

tigkeit. Um diese Anforderungen zu erfullen, wird bei der Messung die in Abb. 19 dargestellteProbenmeßkammer verwendet.

� i

q z

� f

q"

1

2

3

4

1: Heizplatte2: Kaptonfenster3: Wasserbehälter4: Probe5: Probenhalter

5

Abbildung 19: Schematische Darstellung der Probenmeßkammer.

Die Probenmeßkammer besteht aus zwei Heizplatten, zwei Wasserbehaltern, zwei Kaptonfensternund einem Probenhalter (Abb. 19). Die zwei Heizplatten dienen zum Heizen oder Abkuhlen derProbenkammer. Sie werden von einem Temperiergerat der Firma JULABO gesteuert. Fur dasStrahleintritts- und Strahlaustrittsfenster wurde Kapton als Fenstermaterial eingesetzt. Die Pro-benmeßkammer bietet nicht nur die Moglichkeit der Messung bei stabiler Temperatur, sondern auchbei verschiedenen Feuchtigkeitsbedingungen. Dazu wurden zwei Wasserbehalter in die Kammer ein-gesetzt. Die relative Feuchtigkeit in der Kammer kann eingestellt werden, indem man verschiedenegesattigte Salzlosungen in den Wasserbehalter einbringt (eine gesattigte KCl-Losung erzeugt bei-spielsweise eine Umgebung mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 88% in der Probenmeßkammer).

4.4 Durchfuhrung der Messung

Die Probe wird vorsichtig auf den Probentisch im Diffraktometer gelegt. Dabei sollte sie, wie obenauch, nur mit einer sterilen Pinzette oder mit Latexhandschuhen, und nur seitlich angefasst werden.Die Kammer wird darubergestellt und mit den Schrauben auf dem Sockel festgezogen. Die beidenWasserbehalter werden mit Millipore-Wasser (keimfrei) befullt und so in die Kammer geschoben,dass das Wasser nicht uber der Probe auslaufen kann (Abb. 19). Im Anschluss daran aktiviert mandie Heizungen, was naher unter 5.1 beschrieben wird.

5 Steuerprogramm

Um ein moglichst schnelles, aber auch exaktes Ergebnis im Umgang mit dem Diffraktometer zuerzielen, wird im folgenden Teil eine step-by-step-Anleitung gegeben. Durch Kombination von neu-em und etwas alterem Material kann es dazu kommen, dass evtl. Fehlermeldungen auftauchen.

22

(Achtung: Es wird jeden treffen!)Und noch eins: Habt ein wenig GEDULD mit der Technik!

5.1 Diffraktometerbedienung

1. Wasserleitungen, die sich an der Wand befinden, offnen;

(a) den Ablauf (an der Wand);

(b) den Zulauf (an der Wand);

2. Julabo, sowohl Aggregat, als auch Steuereinheit, einschalten und so einstellen, dass im oberenBereich 80◦C und im unteren Bereich 15◦C herrschen;

• Fur den oberen Bereich einfach auf T1 drucken, mit Tastatur einstellen und mit Enter(rechts unten) bestatigen;

• Fur den unteren Bereich einfach auf T2 drucken, mit Tastatur einstellen und mit Enterbestatigen;

3. Netzschalter aktivieren (Links Mitte am Instrument);

4. DACO mittels weißem Schalter aktivieren (Mitte am Instrument);

5. Schlussel des Rontgengenerators auf I (Links unten am Instrument);

6. Diffraktometer durch grunen Schalter (0/1) aktivieren (Links unten am Instrument);

7. Starten mit gelber Taste (Links unten am Instrument);

• ACHTUNG: Leistung des Generators sollte sich beim Start bei ca. 20 kV und5 mA befinden. Regelbar ist dies an den Randelradchen;

8. Generatorstart mit gruner Taste;

• Jetzt kann die Leistung langsam (ca. 5 Minuten alle 10kV) hochgeregelt werden (z.B.auf 30 kV und 40 mA);

9. Durchfuhren der Diffraktometerinitialisierung

(a) Start/Stop-Hebel (Taste 5) in Stop-Richtung drucken (Reset des Diffraktometers)

(b) Eingabe folgender Tastenkombination (Start der Initialisierung, Uberprufung desGerates auf Funktionsfahigkeit)

2Θ/Θ (Taste 1) → Synchr. (Taste 9) → Set (Taste 10)

(c) WARTEN, bis auf den Anzeigen an der Drehachse 1.000 und 2.000 zu sehen ist;

23

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

9.

10.

11.

12.

1. Justierung θ und 2θ

2. Justierung von 2θ

3. Justierung von θ

4. Manuelle Justierung

5. Start/Stop-Taster

6. Manuelle Manipulatoren

(Grobtrieb)

7. Manuelle Manipulatoren

(Feintrieb)

8. Röntgenquelle an

(leuchtet orange)

9. Synchronisationstaster

10. Set-Taster

11. Shutter auf (Open)

12. Shutter zu (Shut)

8.

Abbildung 20: Steuereinheit des Diffraktometers mit Nummerierung und Bezeichnung der wich-tigsten Elemente.

24

(d) Reset des Diffraktometers und Freigabe fur Computersteuerung durch erneutes Druckenvon Taste 5 in Stop-Richtung;

10. Fertig!

Das Diffraktometer ist soweit betriebsbereit und man kann sich dem Computer zuwenden. Hierwird ebenfalls schrittweise vorgegangen.

5.2 Computerbedienung

1. Man startet den Rechner;

2. ... ebenso den Monitor;

3. Anmeldung wie folgt:

(a) login: prak

(b) password: prak

4. Start folgender Programme vom Desktop aus:

(a) Diffrac Plus Control und dort XRD Commander;

i. Auf Seite ADJUST (links unten) Markierung der Felder fur die Motoren Thetaund 2Theta mittels Hakchen;

ii. Klicken des Icons INIT Drives;

iii. WARTEN, bis sich die Motoren nicht mehr bewegen;

iv. Klicken auf Seite DETAILS (links unten);

v. Klicken des Icons SET DETECTOR;

(b) Diffrac Plus Evaluation und hier EVA;

5. Fertig!

5.3 Fehlerbehebung

Sollte es wieder zu Problemen kommen: Zum Beispiel tauchen Fehlermeldungen am Computer aufoder der DACO fangt an zu piepen, zu allererst: KEINE PANIK! Man fangt einfach damit an,den DACO neu zu starten, indem man den weißen Schalter aus- und wieder einschaltet. Danachmuss wieder ein Reset und die Initialisierung durchgefuhrt werden. Dann geht man wie unter Punkt5.1.8 vor. Ist dies geschehen, reicht es aus, sich im Computer ab- und neu anzumelden. Anschließendgeht man von Punkt 5.2.3 aus vor. In der Regel sollte alles wieder laufen.Sollte der Motor einmal mit Θ oder 2Θ in den negativen Bereich kommen, was ab -97.5◦ ungefahrder Fall ist, so ist es moglich, dass bei der Initialisierung ein Hard-Limit uberschritten werden kann.Einfach Taste 5 am Diffraktometer Richtung Stop drucken. Anschließend das Fenster offnen und derBeschreibung (Abb. 18) unten rechts folgen, um einen schwarzen Taster zu finden. Diesen drucken

25

und mit den Tasten 6 wieder in den positiven Bereich hochfahren. Zum Abschluss nochmal Taste 5drucken und nach 5.1.8 neu initialisieren. Unter Umstanden kann es vorkommen, dass dieser Schrittofters wiederholt werden muss. Im Anschluss daran kann probiert werden, das Gerat wieder uberden Computer zu bedienen; es kann sein, dass man sich am Computer ab- und neu anmelden muss.Die dritte Moglichkeit, etwas falsch zu machen ist, auf der Oberflache von XRD Kommastellen mit‘,‘ anzugeben. Einfache Losung: ‘.‘ nehmen.

5.4 Ausrichtung des Primarstrahls und der Proben

Die Ausrichtung des Primarstrahls kann vor der Installation der Probenkammer erfolgen, muss abernicht zwangslaufig so gemacht werden.Der Primarstrahl geht ungehindert mit einem Θ/2Θ-Verhaltnis von 0/0 in den Detektor. Somit istfur die folgenden Schritte eines von ganz grosser Bedeutung:Messingabsorber (Starke 0.2) in die außerst rechte Halterung am Detektor einschie-ben!Sonst wird der Detektor uberlastet. Um die Ausrichtung zu beginnen, befolgt man die nachstehen-den Schritte:

1. In der Maske von DIFFRAC PLUS COMMANDER muss unter SCANTYPE ’Set Detector’eingestellt sein, so dass sich nur der 2Θ-Arm bewegt;

2. Theta-Wert in XRD auf 0 setzen;

3. Fahren des 2theta-Armes in einem Bereich von -1 bis +1. Die Probe darf dabei nicht im Strahl sein;

4. Man erhalt einen Peak, der sich ungefahr bei 0 befinden durfte. Hat man eine positive Abwei-chung, so muss das Diffraktometer manuell um diesen Wert in den negativen Bereich gedrehtwerden. Bei negativen Abweichungen verfahrt man umgekehrt;

5. Zum Uberprufen kann diese Prozedur einmal wiederholt werden;

6. Mit dem unter der Probe angebrachten Mikromanipulator wird die Probe in den Strahl gefah-ren. Dieser Vorgang muss evtl. einige Male wiederholt werden, bis man die Probe so justierthat, dass im DACO-Display bei geoffnetem Shutter (Taste 11) die Halfte der maximalenCounts erscheint. Dieses wurde dann Abb. 21 b) entsprechen;

Da die Probe jedoch nicht umbedingt parallel zum Primarstrahl liegt, was allerdings fur gute Wertenotig ist, muss das Diffraktometer uberlistet werden:

1. Ein kurzer Rocking Scan mit der Einstellung ’Rocking Curve’ wird von 0 bis 3 bei einerSchrittgroße (Increment) von 0.01 vom XRD Commander gesteuert gefahren;

2. Durch die erhaltene Kurve, also der erhaltenen Counts, kann ersehen werden, ob man unterdem Strahl Abb. 21 (AA) ist oder im Strahl 21 (BB). bzw. ihn vollstandig blockiert 21 (CC);

26

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa a a a a a a a a a a a a a a a a a

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa a a a a a a a a a a a a a a a a a

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

A

B

C

h

r

r

r

I

I

I

�

�

�

(AA)

(BB)

(CC)

Abbildung 21: Stellungen der Probe fuhren zu A) Reflexion; B) Halbierung des Primarstrahls(Wichtig!); C) Abschattung des Detektors, so dass nur Teil des Maximums aufgenommen werden;h = Justierung der Hohe mittels Mikromanipulator; r = Rotation um Drehachse des Diffraktome-ters;

27

3. Entspricht der Graph:

• dem von Abb. 21 A), so hat man eine Reflexion oder befindet sich noch nicht im Strahlund Theta muss dahingehend verandert werden, dass der Winkel leicht vergroßert wird,bzw muss in den Strahl mittels Mikromanipulator hochfahren.

• dem von Abb. 21 C), hat man eine Abschattung des Detektors und muss Theta ver-kleinern;

• dem von Abb. 21 B), so hat man alles richtig gemacht oder Gluck gehabt!

4. Um die Winkelveranderungen vorzunehmen, fahrt man diese kurzen Bereiche ab, in denensich der erste Peak befindet und kann daruber bestimmen, inwieweit man Theta wiederverandern muss, um ein Verhaltnis von Θ/2Θ von 1/2 zu erhalten, sprich wo bei einer Fahrtvon Theta=1 und 2Theta=2, eingestellt im XRD, ebendieses Verhaltnis herauskommt;

5.5 Eineichung

Kommen wir wieder zur richtigen Arbeit zuruck. Um die auf dem Sockel aufgebrachte Probe nun zuvermessen, muss das Diffraktometer bzw. der Computer evtl. etwas belogen werden. Aufgrund vonUnebenheiten der Membran und anderer Faktoren entspricht das Verhaltnis von Θ und 2Θ nichtimmer dem Ideal von 1:2. Die vorzunehmende Korrektur kann funktionieren, da Computer und Dif-fraktometer nicht 100prozentig miteinander kommunizieren. Deswegen geht man folgendermassenvor:

1. Komplettscan der Probe;

(a) In XRD-ADJUST gibt man fur Theta 1 und 2Theta 2 ein;

(b) INIT Drives klicken;

(c) Warten, bis die Motoren sich nicht mehr bewegen;

(d) Eingabe fur Start-Winkel unten links; Wert sollte ca. 0.3 betragen;

(e) Eingabe fur Stop-Winkel unten rechts; Wert sollte ca. 8.3 betragen;

(f) Eingabe fur Increment; sollte 0.005 oder 0.01 betragen;

(g) Eingabe fur Scantype; hier zum ersten Probefahren ‘Rocking Curve‘ und ‘Continuous‘;

(h) Eingabe fur Scanspeed; zum schnellen Grobscan 0.1 Sec/Step;

(i) WICHTIG: Shutter (Taste 11) am Diffraktometer offnen: Erkennbar am roten Lichtdirekt an der Rontgenquelle;

(j) Man kann vor dem endgultigen Messvorgang noch einmal INIT Drives aktivieren, mussman aber nicht;

(k) Durch Klicken der Start/Stop-Taste initiiert man den Scanvorgang;

(l) Nach Abschluss des Scanvorgangs den Shutter schließen (Taste 12);

28

2. Die erhaltene Kurve, insofern sie Abb. 22, ahnlich sieht, kann unter File und Save As imOrdner Biophysik-Praktikum abgelegt werden;⇒ Sollte dieses nicht der Fall sein, nochmal von vorn;

3. Ist die Kurve zulassig, notiert man sich die Werte fur x (=2Θ), indem man mit dem Cursorauf die erhaltenen Maxima zeigt (x steht bei XRD rechts unterhalb des Graphen);

4. Mit den Werten, die man dem Graphen entnommen hat, geht man wie folgt vor:

(a) Jeder Wert wird auf der ADJUST-Seite nacheinander in 2Theta eingetragen;

(b) Start- und Stop-Winkel fur Theta werden so verandert, dass sie ungefahr der Halftedes 2Theta-Wertes ensprechen; (also 2Theta = 1.8, dann fur Theta Start bei ca.0.7 undStop bei 1.1 usw.);

(c) Auch hier liest man die Werte wieder mit dem Cursor ab und notiert sie neben den2Θ-Werten;

(d) Um nun den Korrekturwert zu ermitteln, berechnet man ∆Θ nach folgender Formel

∆Θ = Θ − 2Θ2

(31)

(e) Hat man diese Werte bestimmt, wird es wohl in etwa so sein, dass die Werte fur diePeaks 3 und 4 ahnlich hoch sind. Dann nimmt man den Mittelwert.Sind alle Werte, zumindest die ersten vier ahnlich, so nimmt man von diesen den Mit-telwert;

5. Jetzt kommt der Punkt, an dem man den Computer betrugen muss, da das Verhaltnis zwi-schen Θ und 2Θ nicht 1:2 ist;

(a) Den erhaltenen Wert addiert man zu Θ=1 und stellt das dann folgendermaßen amDiffraktometer ein:

(b) Der Start/Stop-Button am Computer hat eine ahnliche Funktion wie die Taste 5 amDiffraktometer. Damit man nun die Einstellungen des Diffraktometers zurucksetzenkann, druckt man diesen Knopf;

(c) Am Diffraktometer betatigt man die Taste 5 ebenfalls zum Reset;

(d) Dann initialisiert man das Gerat neu (siehe 5.1.8);

(e) Jetzt druckt man Taste 3, um nur Θ zu verandern;

(f) Es folgt die Betatigung der Taste 9;

(g) Hieran schließt sich das Drucken der Taste 4, die manuelle Justierung erlaubt;

(h) Mittels des Stellrades (Taste 7 in Abb. 20) wird die errechnete Θ-Große eingestellt;

(i) Zum Abschluss nochmal mit Taste 5 in Stoprichtung das Gerat zuruckstellen;⇒ Auf keinen Fall darf jetzt nochmal am Computer initialisiert werden, da sonst dieEinstellungen am Diffraktometer hinfallig sind und alles erneut eingestellt werden muss!

29

5.6 Messung

Mit dem bis zu diesem Zeitpunkt erreichten kann jetzt gemessen werden. Zuerst beginnt man mitdem spekularen Reflektivitatsscan, anschließend kommt mit Abweichungen der offset-Scan hizu.

1. Man stellt fur Theta und 2Theta auf der ADJUST-Seite wieder das Verhaltnis 1:2 ein, wasdem Computer vorgaukelt, es lage tatsachlich dieses Verhaltnis vor;

2. Eingabe fur Start-Winkel unten links; Wert sollte ca. 0.3 betragen;

3. Eingabe fur Stop-Winkel unten rechts; Wert sollte ca. 8.3 betragen;

4. Eingabe fur Increment; sollte 0.005;

5. Eingabe fur Scantype; hier zum specular - und offset-Scan ‘locked coupled´ und ‘stepscan´;

6. Eingabe fur Scanspeed; zum feineren Scan 3 Sec/Step;

7. WICHTIG: Shutter (Taste 11) am Diffraktometer offnen: Erkennbar am roten Licht direktan der Rontgenquelle;

8. Durch Klicken der Start/Stop-Taste initiiert man den Scanvorgang;

9. Nach Abschluss des Scanvorgangs den Shutter schließen (Taste 12);

10. Im Falle des Gefallens der Kurve speichert man diese im o.g. Ordner;

Zum offset-Scan muss der Θ-Winkel vergroßert werden, um die diffuse Streuung aufnehmen zukonnen. Dazu geht man nach der Prozedur von Kapitel 5.5.5 vor, nachdem man das Diffraktometermit dem Computer uber INIT Drives neu initialisiert hat. Der einzige Unterschied zu 5.5.5 ist, dassman zusatzlich zu ∆Θ noch 0.15 hinzuaddiert. Ist dies geschehen, wird eine offset-Messung nachSchema 5.6 durchgefuhrt.

5.7 Ermittlung von der Periodizitat D

Damit man die Periode der Lipiddoppelschichten bestimmen kann, benotigt man das ProgrammEVA aus dem Ordner Diffrac Plus Evaluation. Ist das Programm gestartet, offnet man die Datei,muss aber vorher noch den Dateityp auf *.raw umstellen. Dann wird die erhaltene Messkurveangezeigt, und uber dem Cursor kann man auf die Peaks gehen. Zum Offnen des Fensters, in demD abgelesen werden kann, auf das Icon CURSOR COORDINATES klicken oder F6 drucken. VonVorteil ist es, die Y-SCALE auf Log umzusetzen. Mit folgender Formel bekommt man den exaktenMittelwert:

D =∑

Dn ∗ n

n(32)

D ist die Periodizitat der Lipidmembran (bei EVA = d) und n ist die Anzahl der Peaks.

30

5.8 Datentranslation

Um mit den erhaltenen *.raw Daten arbeiten zu konnen, mussen sie vorher in *.dat Format kon-vertiert werden. Dazu benotigt man das Programm File Exchange aus dem Ordner Diffrac PlusEvaluation. Einige Einstellungen mussen noch uberpruft werden.

1. Unter FILE geht man zu UXD FORMAT. Hier muss folgendes angekreuzt und eingestelltsein:

• Angle + Intensity;

• d value + intensity;

• Column Width = 10;

• Items per line = 1;

• Field separator = Normal;

2. OK klicken und uber FILE/OPEN die gewunschte offset- oder specular-Kurve offnen;

3. Uber FILE/TRANSLATE/TO UXD Format ubersetzen;

4. Vor dem OK-Klick noch die Endung auf *.dat abandern (z.B. Scan1.dat);

6 Auswertung

6.1 Meßkurve

Die Auswertung wird mit dem Programm Origin (OriginLab) durchgefuhrt. Man erhalt nach denMessungen zwei Kurven, eine ist die spekular reflektierte Intensitat, die andere ist die diffuseIntensitat (Abb. 22). Um die reine reflektierte Intensitat zu gewinnen, muss die diffuse Intensitatvon der spekular reflektierten Intensitat abgezogen werden. Um diesen Vorgang durchzufuhren,geht man folgendermaßen vor:

1. Das Programm Origin 7 wird uber den Desktop geoffnet (durch Doppelklicken);

2. Zuerst loscht man hier das sich selbst offnende Datasheet;

3. Mit dem Icon NEW WORKSHEET offnet man zwei neue Seiten;

4. Unter FILE und SAVE PROJECT AS legt man die Datei im Praktikumsordner ab. DieBlatter benennt man in OFFSET und SPECULAR mit dem Befehl RENAME um;

5. Uber FILE und IMPORT/SINGLE ASCII holt man sich seine vorher gemessenen Datenund fugt sie in die erste Zeile tth(X) und Det(Y), was der Intensitat entspricht, ein (gehtautomatisch);

6. Unter time(Y) andert man durch einen Rechtsklick und SET COLUMN VALUES im großenFeld den Wert auf die verwendete Scanspeed;

31

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

10

-2

10

-1

10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

10

5

10

6

sp

eku

lar

offs

et

Intensity(cps)

qz [Å

-1]

Abbild

ung

22:Spekulare-

undD

iffuse-Intensitat

derD

MPC

-Mem

bran.D

ieIntensitat

istin

loga-rithm

ischerSkala

aufgetragen.

7.In

derZeile

qz(X

)setzt

man

unterSE

TC

OLU

MN

VA

LU

ES

folgendeForm

elein

4*pi*sin(col(tth)/2)/1.54,w

asungefahr

Formel

(6)entspricht;

8.In

derSpalte

korr1(Y)

tragtm

andie

Werte

ausSpalte

Det(Y

)ein,

wobei

zumindest

dieW

erteunverandert

ubernomm

enw

erden,die

großerals

derkritische

Winkel

sind.D

ieW

erte,die

kleinerdem

kritischenW

inkelsind,

mussen

einerK

orrekturunterzogen

werden.

Dazu

benotigtm

anForm

el(21),

dieuber

SET

CO

LU

MN

VA

LU

Ein

dieseB

ereichem

iteingebunden

wird.

hist

aufgrundder

vorgegebenenB

lenden0.1

mm

undl

ist25

mm

.D

erG

renzinkelist

ca.0.23;

9.In

korr2(Y)

werden

dieW

erteder

Intensitatnun

aus1

Sekunde,d.h.durchtim

e(Y)

geteilt;

10.D

ieletzte

Spaltebeinhaltet

danndie

Werte

furdie

reinereflektierte

Intensitat,nachdemm

andie

diffuse(korr2(Y

)von

offset-scan)

vonder

spekularen(korr2(Y

)specular)

substrahierthat;

11.D

argestelltw

irddie

Kurve

dannm

itdem

Befehl

PLO

Tund

LIN

E;

InA

bb.23

wird

dievon

derdiffusen

abgezogenereine

reflektierteIntensitat

gezeigt.

6.2

Erm

itteln

des

Ele

ktro

nendich

tepro

fils

Man

integriertdie

graueB

ereichein

Abb.

23,um

dasE

lektronendichteprofilrekonstruieren

zukonnen.

Durch

Gl.

(30)erhalt

man

dasE

lektronendichteprofilder

DM

PC

-Mem

bran.In

Abb.

24w

urdedie

Kurve

dasE

lektronendichteprofilsdargestellt.

Zum

Integrierengeht

man

wie

untenbe-

schriebenvor:

1.D

iekorrigierte

Kurve

wird

aufV

ollbildformat

gebracht;

32

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

10

-2

10

-1

10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

10

5

Intensity(cps)

qz [Å

-1]

Abbild

ung

23:A

bgezogenereflektierte

Intensitat,die

grauenZone

wird

zurBestim

mung

desElek-

tronendichteprofilsintegriert.

-40

-20

020

40

-1.0

x10

-2

0.0

1.0

x10

-2

Elektronendichteprofil (w. E.)

Z [Å

]

Abbild

ung

24:Elektronendichteprofil

derProbe

vonD

MPC

-Mem

bran.

2.M

itdem

IconD

ATA

SELE

CT

OR

markiert

man

dieG

renzenrechts

undlinks

derjew

eiligenPeaks

(sieheA

bb.23)

⇒Ist

einbisschen

tricky!

3.D

erunteren

Zeile

amB

ildrandentnim

mt

man

diex-

undy-W

erte;

33

4. Uber ANALYSIS/CALCULUS/INTEGRATE wird jetzt der Bereich zwischen den Grenzenintegriert und der Wert erscheint unten am linken Bildrand unter AREA;

5. Nun muss per Hand und Taschenrechner die trapezformige Flache unter der Kurve abgezogenwerden. Dazu hier die Formel fur das Trapez:

A =(a + b)(h)

2(33)

Die Datei zum exakten Bestimmen des Elektronendichteprofils steht unterC:/Praktikum/AuswertungMathcad, wenn man das Programm Mathcad 2000 Professionalvom Desktop aus geoffnet hat. Die Auswertung fallt relativ leicht, da das Programm alles fureinen ubernimmt. Man muss nur bei den Intensitaten die korregierten Werte eintragen und dasbestimmte D andern. Der Computer erledigt den Rest.

Aufgabe 3.

Ermitteln Sie den dw-Wert anhand des erzeugten Elektronendichteprofils und vergleichen Sie diesenmit den von Ihnen berechneten Wert.

Aufgabe 4.

Ermitteln Sie ebenfalls den dm-Wert (Membrandicke dm = D − dw) anhand des Elektronendichte-profils .

34