TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN II. Medizinische Klinik und ... · TECHNISCHE UNIVERSITÄT...

TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN

II. Medizinische Klinik und Poliklinik

des Klinikums rechts der Isar

Die Bedeutung von Socs3 im in-vivo-Modell der pankreatischen Karzinogenese

Thuy Trang Phan

TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN

II. Medizinische Klinik und Poliklinik

des Klinikums rechts der Isar

(Direktor: Univ.-Prof. Dr. Roland M. Schmid)

Die Bedeutung von Socs3 im in-vivo-Modell der pankreatischen Karzinogenese

Thuy Trang Phan

Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Medizin

der Technischen Universität München

zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Medizin

genehmigten Dissertation.

Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. Ernst J. Rummeny

Prüfer der Dissertation: 1. Priv.-Doz. Dr. Hana Algül

2. Univ.-Prof. Dr. Helmut Friess

Die Dissertation wurde am 10.07.2014 bei der Technischen Universität München

eingereicht und durch die Fakultät für Medizin am 15.04.2015 angenommen.

Meinen Eltern gewidmet

INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS

I. ABKÜRZUNGEN ......................................................................................................... 3

II. EINLEITUNG ............................................................................................................... 5

1. Das Pankreaskarzinom ................................................................................................ 5

1.1. Epidemiologie ................................................................................................................. 5

1.2. Molekularbiologische und –genetische Hintergründe .................................................... 6

2. Das murine Pankreaskarzinommodell ..................................................................... 11

2.1. Das Cre/loxP-Rekombinationssystem .......................................................................... 12

2.2. Das KrasG12D-Mausmodell ........................................................................................... 13

3. Suppressors of cytokine signaling (SOCS) ............................................................... 16

3.1. Die Struktur von Socs3 ................................................................................................. 16

3.2. Socs3 als Zytokin-Signaltransduktionsinhibitor ........................................................... 17

4. Zielsetzung der Arbeit ................................................................................................ 21

III. MATERIAL UND METHODEN .............................................................................. 22

1. Material ....................................................................................................................... 22

1.1. Chemikalien .................................................................................................................. 22

1.2. Geräte und Hilfsmittel .................................................................................................. 24

1.3. Puffer und Lösungen .................................................................................................... 25

1.4. Gele ............................................................................................................................... 27

1.5. Antikörper ..................................................................................................................... 28

1.5.1. Antikörper für Immunhistochemie (IHC).................................................................. 28

1.5.2. Antikörper für Western Blot (WB) ............................................................................ 28

1.6. Primer für Genotypisierung .......................................................................................... 29

1.7. Mäuse ........................................................................................................................... 29

2. Methoden ..................................................................................................................... 30

2.1. Versuchstiere ................................................................................................................ 30

2.1.1. Behandlung mit BrdU................................................................................................ 30

2.1.2. Gewebeentnahme in vivo-Präparation und Materialgewinnung ............................... 30

2.2. Molekularbiologische Methoden .................................................................................. 31

2.2.1. DNA-Extraktion aus der Mausschwanzspitze ........................................................... 31

2.2.2. Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR)................................... 31

2.2.3. Agarose-Gelelektrophorese ....................................................................................... 32

2.3. Detektion und Quantifizierung der Gen-Transkription ................................................ 33

2.3.1. Isolation von mRNA aus murinem Pankreasgewebe ................................................ 33

2.3.2. cDNA-Synthese ......................................................................................................... 33

2.3.3. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) .................................................................... 33

2.3.4. Reaktionsansatz und Reaktionsbedingungen ............................................................. 34

2.3.5. Quantifizierung der Genexpression ........................................................................... 35

2.4. Proteinchemische Methoden......................................................................................... 35

2.4.1. Proteinisolierung/Proteingewinnung aus Mauspankreasgewebe ............................... 35

2.4.2. Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford .................................................... 35

2.4.3. Western Blot Analyse ................................................................................................ 36 2.5. Histochemische Methoden ........................................................................................... 38

2.5.1. Immunhistochemie .................................................................................................... 38

2.5.2. Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.-Färbung) ............................................................ 39

IV. ERGEBNISSE ............................................................................................................. 41

II. EINLEITUNG

2

1. Pankreasspezifische Inaktivierung von Socs3 in der Maus .................................... 41 1.1. Generierung einer pankreasspezifisch Socs3-defizienten Mauslinie Socs3

Δpanc unter Anwendung des Cre/loxP-Rekombinationssystems ..................................................... 41

1.2. Morphologische Charakterisierung des exokrinen und endokrinen Pankreaskompartiments von Soc3

Δpanc-Mäusen ........................................................... 44

2. Nachweis der Aktivierung des Stat3/Socs3-Signalweges im KrasG12D-Mausmodell

...................................................................................................................................... 46

2.1. Nachweis der pankreatischen Aktivierung von p-Stat3 im KrasG12D-Mausmodell ...... 46

2.2. Expression des Stat3-abhängigen endogenen Inhibitors Socs3 im KrasG12D-

Mausmodell .................................................................................................................. 47

2.3. Aktivierung der an der Jak2/Stat3-Signaltransduktion beteiligten Proteine in KrasG12D-

Mäusen ......................................................................................................................... 49

3. Homozygote Socs3-Deletion führt zu einer konstitutiven Aktivierung des Stat3-Signalweges im Kras

G12D-Mausmodell ...................................................................... 51

3.1. Generierung der pankreasspezifisch Socs3-defizienten Tumormodellmaus Kras

G12D;Socs3Δpanc ....................................................................................................... 51

3.2. Proteinbiochemische und morphologische Charakterisierung von KrasG12D

;Socs3Δpanc-

Mäusen ......................................................................................................................... 51

3.2.1. Proteinbiochemischer Nachweis verstärkter Stat3-Phosphorylierung und Expression Stat3-abhängiger Proteine ............................................................................................ 51

3.2.2. Konstitutive Aktivierung des onkogenen K-Ras-Proteins in KrasG12D

;Socs3Δpanc-

Mäusen ......................................................................................................................... 53

3.2.3. Gewichts- und Pankreasanalyse bei KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäusen ............................... 54

4. Einfluss der Inaktivierung des endogenen Inhibitorproteins Socs3 auf die PanIN-Progression im Kras

G12D-Mausmodell ....................................................................... 56

4.1. Beschleunigung der PanIN-Progression in KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäusen .................... 56

4.1.1. Morphologische und quantitative Charakterisierung der PanIN-Läsionen ............... 56

V. DISKUSSION ............................................................................................................. 66

1. Rolle von Socs3 für die pankreatische Karzinogenese im KrasG12D-Mausmodell . 66

2. Einfluss von Socs3 auf die Apoptose und Proliferation im KrasG12D-Mausmodell

...................................................................................................................................... 68 3. Entzündliche Prozesse fördern die Initiierung und Progression der

pankreatischen Vorläuferläsionen zu duktalem Pankreaskarzinom .................... 71

4. Rolle von Socs3 bei der Pankreasfibrosierung/Desmoplasie in KrasG12D-

Tumormäusen ............................................................................................................. 75

5. Die Bedeutung von Socs3 in Transdifferenzierungsprozessen im Pankreas der Kras

G12D-Tumormäuse ................................................................................................ 78

6. Ausblick ....................................................................................................................... 81

VI. ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................ 82

VII. LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................. 85

VIII. ABBILDUNGSVERZEICHNIS ................................................................................ 99

IX. TABELLENVERZEICHNIS .................................................................................. 101

X. DANKSAGUNG ....................................................................................................... 102

XI. ERKLÄRUNG .......................................................................................................... 104

II. EINLEITUNG

3

I. ABKÜRZUNGEN

A Ampere

Abb. Abbildung

APS Ammoniumperoxiddisulfat

Beta-HCG Humanes Choriongonadotropin

Bcl-2 B-cell-lymphoma-2

Bcl-XL B-cell lymphoma-extra large

bp Basenpaare

BrdU 5-Brom-2-desoxyuridin

BSA Bovines Serumalbumin

c Konzentration

CA Carbohydrate Antigen

CaCl2 Kalziumchlorid

CEA Carcino-Embryonales Antigen

CK-19 Cytokeratin-19

Cox-2 Cyclooxygenase-2

Cre cyclization recombination

DAB Diaminobenzidin

dH2O einfach destilliertes Wasser

ddH2O zweifach destilliertes Wasser

DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)

DTT Dithiothreitol

EGF epidermal growth factor

EDTA Ethylendiamintetraacetat

F Flox

FAMMM familial atypical mole-malignant melanoma

GAP GTPase aktivierendes Protein

GDP Guanosindiphosphat

gp130 Glykoprotein 130

GTP Guanosintriphosphat

h Stunde(n)

HCL Hydrogenchlorid

H.E. Hämatoxylin-Eosin

HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-

ethansulfonsäure

H2O2 Wasserstoffperoxid

IHC Immunhistochemie

IL Interleukin

Jak Januskinase

KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat

KCl Kaliumchlorid

kD Kilodalton

II. EINLEITUNG

4

l Liter

loxP locus of x-over of P1

LSL lox-STOP-lox

M Molar

Mcl-1 myeloid leukemia cell differentiation protein 1

Min. Minute (n)

MAPK mitogen-activated protein kinase

Muc5 Mucin 5

NaCl Natriumchlorid

Na2HPO4 Natriumbicarbonat

NaOH Natriumhydroxid

p Phospho

PanIN pankreatische intraepitheliale Neoplasie

PBS phosphate-buffered saline

PCR polymerase chain reaction

(Polymerasekettenreaktion)

PDAC pancreatic ductal adenocacinoma

PFA Paraformaldehyd

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

PSC pancreatic stellate cell

RNA ribonucleid acid (Ribonukleinsäure)

RNAse Ribinuklease

rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)

RT Raumtemperatur

RTK Rezeptortyrosinkinase

SDS-PAGE Sodium Dodecylsulfat-

Polyacrylamidgelelektrophorese

SH2 Src-homology 2

SOCS suppressor of cytokine signaling

STAT signal transducer and activator of transcription

(human)

Stat signal transducer and activator of transcription

(murin)

TAE Tris-Acetat-EDTA

TBS Tris-buffered saline

TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin

TGFß transforming growth factor-beta

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

UV Ultraviolett

V Volt

WB Western Blot

II. EINLEITUNG

5

II. EINLEITUNG

1. Das Pankreaskarzinom

1.1. Epidemiologie

Das Pankreaskarzinom umfasst eine heterogene Gruppe von pankreatischen Malignomen. Im

Jahr 2011 liegt die Anzahl der Neuerkrankungen in den USA bei 44.030, 37.660 Patienten

verstarben am Pankreaskarzinom. Seit 1998 wird eine stetige Zunahme der Inzidenz dieser

aggressiven Tumorerkrankung verzeichnet. Somit stellt das duktale Adenokarzinom des

Pankreas eine fast immer fatal verlaufende Erkrankung dar, die sowohl bei Männern als auch

bei Frauen an neunter Stelle der geschätzten malignen Neuerkrankungen und an vierter Stelle

der tumorbedingten Todesfälle steht (American Cancer Society 2011). Mit einer medianen

Überlebenszeit von etwa drei bis fünf Monaten und einer 5-Jahresüberlebensrate von weniger

als 5% hat das Pankreaskarzinom eine düstere Prognose (Hezel et al., 2006).

Das hochaggressive Ausbreitungsmuster des Pankreaskarzinoms in Form frühzeitiger

Metastasierung in lymphatische und periphere Organe trägt zusätzlich zur infausten Prognose

dieser Tumorerkrankung bei. In der Tat weisen etwa 80% der Patienten bei der

Diagnosestellung Fernmetastasen auf (Yeo et al., 2002b). Darüber hinaus ist die frühzeitige

Infiltration und Ausbreitung der Karzinomzellen entlang der intra- und extrapankreatischen

Nerven charakteristisch für das PDA (Pour et al., 1991; Okusaka et al., 2001; Hirai et al.,

2002). Aufgrund der weitgehenden Resistenz des fortgeschrittenen Karzinoms gegenüber

einem breiten Spektrum an konventioneller Chemo- und Radiotherapie bzw.

Radiochemotherapie (Lionetto et al., 1995), stellt die chirurgische Resektion die einzige

kurative Therapieoption dar, wobei weniger als 20% der Tumore überhaupt resezierbar sind

(Yeo et al., 1995; Rosewitz et al., 1997). Nur etwa 20% der chirurgisch therapierten Patienten

überleben die ersten drei Jahre nach der Operation (Shaib et al., 2007).

Das mittlere Erkrankungsalter bei der Diagnosestellung liegt bei 70 Jahren. Nur etwa 10% der

Patienten entwickeln diesen Tumor vor dem 50. Lebensjahr. Somit stellt dieses

Karzinomleiden eine Erkrankung des hohen Lebensalters dar. Neben dem Alter konnte das

Rauchen als führender vermeidbarer Risikofaktor in der Pankreaskarzinogenese deklariert

werden. 25% der Karzinome lassen sich auf den Zigarettenkonsum zurückführen. Als weitere

denkbare Risikofaktoren werden eine fett- und fleischreiche, ballaststoffarme Ernährung,

Übergewicht, eine chronische Pankreatitis und ein lange bestehender Diabetes Mellitus

beschrieben (Lowenfels et al., 2006). 5-10% aller Pankreastumore sind mit einer familiären

Prädisposition assoziiert und zeigen somit eine familiäre Häufung. Patienten mit positiver

II. EINLEITUNG

6

Familienanamnese haben gegenüber der Normalbevölkerung ein zweifach erhöhtes Risiko an

Bauchspeicheldrüsenkrebs zu erkranken (Schenk et al., 2001).

In den meisten Fällen gehäuften Auftretens maligner Neoplasien des Pankreas ist die

genetische Ursache nicht klar definiert. Bei den familiären Tumorprädispositionssyndromen,

die einen kleinen Teil der hereditären Karzinome ausmachen, sind jedoch autosomal-

dominant vererbte Keimbahnmutationen bestimmter Gene für die hohe Tumorpenetranz

verantwortlich (Lynch et al., 1996). Folgende Tumorprädispositionssyndrome sind mit dem

Pankreaskarzinom assoziiert (Hong et al., 2011):

- Das familiäre Mamma- und Ovarialkarzinom mit der BRCA2 (breast cancer gene 2)-

Mutation;

- das Peutz-Jeghers-Syndrom mit dem mutierten Tumorsuppressorgen STK11

(Serin/Threonin Kinase 11);

- das FAMMM (familial atypical mole-malignant melanome)-Syndrom, das mit einer

Mutation des Genlokus CDKN24 (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A) einhergeht;

- die hereditäre Pankreatitis, bei der das kationische Trypsinogen-Gen PRSS1 (Protease,

Serin1) betroffen ist;

- darüber hinaus das hereditäre non-polypöse kolorektale Karzinom (HNPCC)-Syndrom

mit Keimzellmutationen der DNA Reparatur-Gene hMSH1, hMSH2, etc (Aarnio et al.,

1995)

- und die familiäre adenomatöse Polyposis (FAP) mit funktioneller Inaktivierung des

Genprodukts des APC-Gens (Su et al., 2000).

Untersuchungen haben allerdings gezeigt, dass die mit diesen Syndromen assoziierten

Genveränderungen besonders in fortgeschrittenen Tumorstadien zu finden sind, weniger in

prämalignen Läsionen. Infolge dessen geht man davon aus, dass diese Genmutationen eher

die Tumorprogression der Präkanzerose und weniger die Tumorinitiierung fördern (Sunil et

al., 2003; Hezel et al., 2006)

1.2. Molekularbiologische und –genetische Hintergründe

Der häufigste histologische Subtyp des Pankreaskarzinoms entwickelt sich in über 85% der

Fälle aus Pankreasgangzellen und wird als pankreatisches duktales Adenokarzinom (PDA)

bezeichnet. Etwa 15-20% der Neoplasien wie zystische Tumoren (seröses oligozystisches

Adenom, muzinöse nichtneoplastische Zyste), solid-pseudopapilläre Neoplasien,

Azinuszellzystadenome, Azinuszellkarzinome, Plattenepithelkarzinome und Lymphome

entwickeln sich aus anderen Zellen des exokrinen Pankreas. Endokrine Tumoren wie das

http://www.google.de/url?sa=t&rct=j&q=HNPCC&source=web&cd=1&ved=0CFoQFjAA&url=http%3A%2F%2Fde.wikipedia.org%2Fwiki%2FHeredit%25C3%25A4res_non-polyp%25C3%25B6ses_kolorektales_Karzinom&ei=Ut7yT6aQOOSM4gTu9py6CQ&usg=AFQjCNE19eh8D2Z9cXkdkORCpXoHSY8q4w&cad=rja

II. EINLEITUNG

7

Insulinom, Gastrinom und Glukagonom treten selten auf (Mulkeen et al., 2006).

In diesem Abschnitt der Arbeit soll besonders auf das PDA und dessen Vorläuferläsionen

eingegangen werden. Begriffe wie Pankreaskarzinom, Pankreastumor und duktales

Adenokarzinom werden in diesem Zusammenhang synonym verwendet.

In den letzten Jahren haben klinische, histopathologische und molekulargenetische

Untersuchungen drei wichtige Typen von Vorläuferläsionen identifiziert, die sich über einen

schrittweisen Transformationsprozess zum duktalen Adenokarzinom entwickeln können. Zu

diesen Vorstufen gehören zum einen die muzinös-zystischen Neoplasien (MCN), die

intraduktalen papillär-muzinösen Neoplasien (IPMN) und zum anderen die pankreatisch

intraepithelialen Neoplasien (PanINs) (Brugge et al., 2004; Maitra et al., 2005).

Das auf molekularer und histopathologischer Ebene am besten untersuchte und charakterisierte

Tumorprogressionsmodell für das Pankreaskarzinom beruht auf der Entwicklung und

Progression der PanINs zum pankreatischen duktalen Adenokarzinom. Demnach werden drei

PanIN-Stadien klassifiziert, die je nach Schwere der zellulären und architektonischen Atypien

im Bereich der duktalen Strukturen aufsteigend eingestuft werden (PanIN-1 bis PanIN-3, siehe

Abbildung 1).

Abbildung 1: Morphologische Tumorprogression über PanIN-Vorläuferläsionen. Die H.E.-Färbung zeigt die unterschiedlichen PanIN-Stufen mit aufsteigenden zellulären und architektonischen Atypien. Das PanIN-1A-Stadium weist ein verlängertes Zylinderepithel auf, das im Stadium-1B in ein papilläres Wachstum übergeht. Moderate Kernatypien mit Polaritätsverlust, Hyperchromatismus, verminderte Mitoserate sind charakteristisch für Stadium PanIN-2. PanIN-3 Läsionen zeigen neben zunehmender Schwere der Kernatypien Abknospung von Epithelzellen und intraluminale Nekrosen (400-fache Vergrößerung). Der Stern kennzeichnet Azini.

http://www.google.de/url?sa=t&rct=j&q=IPMN&source=web&cd=1&ved=0CFoQFjAA&url=http%3A%2F%2Feliph.klinikum.uni-heidelberg.de%2Ftexte_s%2F562%2Fintraduktal-papillaer-muzinoese-neoplasie-ipmn&ei=1YgFUNLgJpP54QT1itWQCQ&usg=AFQjCNGNiQXDUhT26VkQ9mnCVDa8x0kicw&cad=rja

II. EINLEITUNG

8

PanIN-1A und PanIN-1B sind durch eine Zellkörperverlängerung und eine vermehrte

Schleimproduktion gekennzeichnet. Die im PanIN-1A-Stadium noch vorhandene flache

epitheliale Architektur des Pankreasganges geht im Stadium-1B in ein papilläres

Wachstumsmuster über. Erstaunlicherweise lassen sich diese frühesten Vorläuferformen in

40% aller adulten Pancreata nachweisen, ohne dass ein malignes Geschehen vorliegt. Das

PanIN-2-Stadium weist moderate Kernatypien in Form von Polaritätsverlust,

Hyperchromatismus, nukleärer Vergrößerung und verminderter Mitoserate auf, die im

Stadium-3 an Schwere zunehmen. Zusätzlich beobachtet man bei diesem terminalen

Läsionsgrad weit in das Ganglumen ragende epitheliale Zellknospen sowie luminale Nekrosen

als Zeichen von Zelluntergang und –abstoßung. PanIN-Läsionen der Stufe 3 findet man in der

Regel in weniger als 5% der gesunden Organe, während 30-50% aller invasiven Karzinome

diese typischen schweren Veränderungen aufzeigen.

Pankreasadenokarzinome weisen darüber hinaus ein an das Tumorgewebe angrenzendes

reaktives desmoplastisches Stroma auf. Dieses „Tumor-Microenvironment“ setzt sich aus einer

Vielzahl unterschiedlicher Zellen, extrazellulären Matrixproteinen und neugebildeten Gefäßen

zusammen, die das Wachstum und die Progression des PDAC fördern. Infiltrierende

inflammatorische Zellen und Makrophagen setzen Chemokine und Zytokine frei, die wiederum

eine reaktive Aktivierung von Fibroblasten und pankreatische Sternzellen (pancreatic stellate

cells, PSC) bewirken. Fibroblasten und aktivierte PSCs produzieren daraufhin Fibronektin und

Kollagen, was die Fibrosierung des Pankreasparenchyms verstärkt und das Tumorwachstum

begünstigt (Algül et al., 2007b).

Molekulare Untersuchungen haben gezeigt, dass die morphologischen Auffälligkeiten

einzelner PanIN-Progressionsstufen bis zum invasiven Karzinom bestimmte genetische

Veränderungen aufweisen, die entsprechend ihrer Anzahl und Schwere mit dem Grad der

Läsion korrelieren (siehe Abbildung 2). Wie bei anderen Tumorentitäten kommt in diesem

Zusammenhang Onkogenen und Tumorsuppressorgenen eine besondere Bedeutung zu

(Sakorafas et al., 2001).

II. EINLEITUNG

9

Abbildung 2: Morphologisches und genetisches Progressionsmodell des duktalen Pankreasadenokarzinoms (Hruban et al., 2000).

Die Kras-Punktmutation am Kodon 12 ist die wohl bedeutendste mit der Tumorgenese

assoziierte Mutation eines Onkogens. Initiale PanIN-Läsionen und Pankreasadenokarzinome

weisen eine Mutationsrate von bis zu 44% bzw. 100% auf (Shibata et al., 1990; Magee et al.,

2001). Das K-Ras-Protein stellt das Genprodukt von Kras dar und gehört zu den kleinen GTP-

bindenden Proteinen der Ras-Familie. Diese auch als G-Proteine genannten Moleküle sind an

der Innenseite der Plasmamembran lokalisiert und werden nach Bindung von Zytokinen,

Hormonen, Wachstumsfaktoren an die extrazelluläre Domäne der G-Protein-gekoppelten

Transmembranrezeptoren aktiviert. Hierbei kommt es zur Umwandlung von inaktivem, GDP-

gebundenen K-Ras in die aktive, GTP-assoziierte Form. Über nachgeschaltete intrazelluläre

Signaltransduktionswege wie zum Beispiel die Raf-mitogen-activated protein kinase (Raf-

MAP-Kinase)- oder die Phosphoinositol-3-Kinase-Signalkaskade wird der extrazelluläre

Stimulus in den Nucleus übertragen, wo eine Aktivierung weiterer Transkriptionsfaktoren

initiiert wird. Somit übernehmen die R-Proteine eine bedeutende Funktion in der

Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose (Friday et al., 2008).

Bei Kras-Mutationen handelt es sich meist um eine Punktmutation eines einzelnen Nukleotids,

wodurch ein Aminosäureaustausch (Glycin wird durch Valin, Arginin oder Aspartat ersetzt)

stattfindet und infolge dessen ein Genprodukt mit Verlust der intrinsischen katalytischen

Eigenschaft entsteht. Aufgrund der Unfähigkeit zur Hydrolyse des gebundenen GTP bleibt das

„falsche“ G-Protein konstitutiv aktiv, sodass durch permanente Stimulierung der Downstream-

Kaskade kontinuierlich Signale an den Zellkern vermittelt werden, die zu dereguliertem

unkontrollierbaren Zellwachstum, Zellteilung und Differenzierung führen (Downward 2003).

II. EINLEITUNG

10

Molekulare Analysen haben eine signifikant verstärkte Amplifikation von Her2/neu mit

permanenter Aktivierung der entsprechenden Signaltransduktion und erhöhte EGF-

Konzentrationen beim PDA nachgewiesen. Bereits in frühen PanIN-Stadien ist die

Überexpression vorzufinden, sodass sie offenbar neben der Kras-Mutation zu den frühzeitig im

Ablauf der Tumorprogression auftretenden genetischen Veränderungen zählt (Lei et al., 1995;

Tsiambas et al., 2006; Hudis 2007).

Neben den Onkogenen werden die Tumorsuppressorgene als zweithäufigste mutierte

Genklasse im Pankreasadenokarzinom betrachtet. Mutationen an den jeweiligen Genloki

bewirken entweder eine Funktionsreduktion oder sogar einen vollständigen Funktionsverlust

der entsprechenden Genprodukte.

Zu den wichtigsten Vertretern der Tumorsuppressorgene gehören INK4A (inhibitor of cyclin

dependent kinase 4A) und ARF (Alternative Reading Frame), die sich beide auf der gleichen

Region 9p21 des Chromosoms 9 befinden. Das auch als CDKN2A (cyclin dependent kinase

inhibitor 2A) bezeichnete INK4A kodiert für das tumorsuppressive Protein p16, dessen

Inaktivierung in etwa 98% aller sporadischen Pankreaskarzinome auftritt (Schutte et al., 1997).

Über eine inhibitorische Bindung von p16 an die Cyklin-abhängigen Kinasen Cdk4 und Cdk6,

wodurch die funktionelle Phosphorylierung des Retinoblastom-Proteins verhindert wird,

kommt es zur Hemmung der Progression des Zellzyklus vor dem Eintritt in die S-Phase. Aus

der INK4A-Mutation resultiert konsequenterweise eine unkontrollierte Zellproliferation durch

Störungen in der Zellzyklusregulation. Der zweite vom gleichen Genlokus kodierte

Tumorsuppressor ist das Transkript der ARF-Gensequenz und wird als p19 bezeichnet. Die

Aufgabe dieses Proteins besteht in der Hemmung der MDM2-abhängigen Ubiquitinierung und

somit der Verhinderung des proteasomalen Abbaus von p53. Konsequenterweise führt die

Loss-of-function-Mutation des betroffenen Genabschnitts zur Reduktion des p19-Spiegels und

zum Abfall des p53-Levels (Wilentz et al., 1998; Lowe et al., 2003).

Das auf dem Chromosom 17 ansässige Tumorsuppressorgen TP53 kodiert einen weiteren für

die Kontrolle der Zellzyklus-Progression wichtigen „Wächter des Genoms“ p53. TP53 ist das

am häufigsten mutierte Gen in malignen Tumoren des Menschen. Beim Pankreaskarzinom

beträgt die Mutationsrate 50 bis 75%, wobei diese genetische Veränderung zumeist in

fortgeschrittenen PanIN-3-Läsionen vorzufinden ist (Talar-Wojnarowska et al., 2006). Das

Protein p53 stimuliert als Transkriptionsfaktor bei Replikationsstress mit Akkumulation von

gravierenden DNA-Schäden eine Reihe von Genen, die einen Zellzyklusarrest einleiten. Bei

Funktionsverlust des Proteins durch homozygote Mutation kommt es zum Ausfall der

tumorsuppressiven Eigenschaft des Genprodukts und das Wachstum von Zellen mit

II. EINLEITUNG

11

prokarzinogenen chromosomalen Aberrationen wird gefördert (Sherr 2004; Efeyan et al.,

2007).

Ein weiterer an der späteren Pankreastumorgenese beteiligter Tumorsuppressor ist SMAD4

bzw. DPC4 (deleted in pancreatic cancer locus 4), dessen Genprodukt SMAD4 bzw. DPC4

eine besondere Bedeutung in der Transforming Growth Faktor-ß (TGF-ß)-Signalkaskade

besitzt. Über dieses Messenger-Protein löst TGF-ß die Transkription spezieller Zielgene mit

antiproliferativer Wirkung aus. Infolgedessen kommt es bereits in der G1-Phase des Zellzyklus

zu einem Arrest, wodurch das Wachstum und die Differenzierung epithelialer Zellen zum

Stillstand kommen. Läsionen in diesem Genlokus führen zu unkontrollierter Proliferation

duktaler Zellen im Pankreas (Bardeesy et al. 2002; Miyaki et al., 2003). Ebenso sind

genetische Veränderungen des BRCA2-Gens in fortgeschrittenen Stadien der

Tumorprogression beschrieben worden. Eine Inaktivierung bedeutet Dysregulation der DNA-

Reparaturprozesse und daraus resultierende zelluläre Entartung (Hahn et al., 2003; Couch et

al., 2007).

2. Das murine Pankreaskarzinommodell

Trotz des zunehmenden Verständnisses der Signale und Mechanismen der Kanzerogenese

gehört das duktale Pankreasadenokarzinom zu den sehr schwer therapierbaren

Tumorerkrankungen. Deshalb hat sich die Pankreaskarzinom-Forschung zum Ziel gesetzt, die

humane Erkrankung und ihre Charakteristika in möglichst identischen präklinischen

Modellorganismen widerzuspiegeln und somit eine effizientere Therapie zu entwickeln.

Erstaunlicherweise lassen sich die molekularbiologischen und –genetischen Veränderungen

des humanen Pankreaskarzinoms und dessen Vorstufen in der Maus exakt nachbilden. Auf der

Grundlage dieser Erkenntnis wurden in den letzten Jahren einige Mausmodelle entwickelt, bei

denen mittels moderner molekularer Technik die Aktivierung von relevanten Onkogenen bzw.

das Ausschalten von Tumorsuppressorgenen ermöglicht wird (Hruban et al., 2006; Olive et al.,

2006). Zur Generierung genetisch gezielt modifizierter Mäuse bietet sich idealerweise das

Cre/loxP-Rekombinationssystem an, welches zur Etablierung des in dieser Arbeit verwendeten

KrasG12D-Mausmodells essentiell war. Demzufolge werden im Folgenden sowohl die Cre/loxP-

Technologie als auch das KrasG12D-Mausmodell ausführlich beschrieben.

II. EINLEITUNG

12

2.1. Das Cre/loxP-Rekombinationssystem

Die Rekombination ist definiert als ein durch spezifische Enzyme (Rekombinasen)

katalysierter Prozess der Spaltung und Neuverknüpfung der DNA. Auf diesem Prinzip

basierend ermöglicht die Cre/loxP-Technik eine gezielte Entfernung von DNA-Sequenzen in

relevanten Gewebe- oder Zellarten, ohne dass andere davon betroffen sind. Ein in der

molekulargenetischen Forschung häufig verwendetes Rekombinationsverfahren beruht auf der

Aktivität der Cre (cyclization recombination)-Rekombinase des Bakteriophagen P1. Dieses 38

kD schwere, in allen Organismen vorkommende Protein katalysiert die ortsspezifische

Rekombination zwischen zwei angrenzenden locus of x-over of P1 (loxP)-

Erkennungssequenzen. Das loxP-Motiv besteht aus einer 8 bp Spacer-Region, die wiederum

von zwei, jeweils 13 bp langen, invertierten Wiederholungen (inverted repeats) flankiert wird.

Die invers repetitiven Komponenten dienen der Erkennung und DNA-Bindung von Cre. Die

zwei eingebauten loxP-Sequenzen ermöglichen eine effiziente Exzision des loxP-flankierten

(„gefloxten“) DNA-Abschnitts. Das herausgeschnittene DNA-Segment wird als zirkuläres

Rekombinationsprodukt intrazellulär abgebaut. Lediglich verbleibt eine einzelne loxP-Sequenz

im modifizierten Genmaterial. Mittlerweile ist das Cre/loxP-Rekombinationssystem als eine

gängige molekulargenetische Methode zur Herstellung gewebespezifischer Knockout-Mäuse

etabliert. Zur Generierung dieser transgenen Tiere werden zwei genetisch veränderte

Mauslinien benötigt (siehe Abbildung 3).

Abbildung 3: Gewebespezifische Deletion von Mausgenen mittels Cre/loxP-Technologie. Der grüne Pfeil kennzeichnet den Vorgang der Transkription. In Zelltypen mit aktiver Cre-Rekombinase in der Cre/loxP-Maus ist die Genfunktion durch Exzision zerstört.

II. EINLEITUNG

13

Die Mauslinie 1 der F0-Generation trägt den gefloxten Genabschnitt. Hierzu werden die

gleichgerichteten loxP-Sequenzen vor und nach dem betroffenen Allel in die flankierenden

Intronbereiche integriert, somit bleibt das Zielexon funktionsfähig. Die Mauslinie 2 der

Parentalgeneration exprimiert die Cre-Rekombinase selektiv in bestimmten Geweben bzw.

Zelltypen. Zur Generierung der Cre-Maus wird ein Cre-Transgen in das Genom eingebracht.

Die Auswahl des vorgeschalteten Promotors, unter dessen Kontrolle das Cre-Transgen gestellt

wird, bestimmt über Zeitpunkt und Gewebespezifität der Cre-Expression. Daher wird die Cre-

Rekombinase nur von denjenigen Zellen gebildet, die auch über den entsprechenden Promotor

verfügen (Claudine 2004).

Nach Verpaarung der parentalen Cre-exprimierenden und gefloxten Mauslinien geht eine

Maus (Mauslinie 3) in der F1-Generation hervor, die beide genetische Veränderungen in ihrem

Erbgut trägt. Cre-Rekombinase exprimierende Zelltypen weisen eine Exzision des loxP-

markierten Zielexons und daraus resultierend eine Deletion des definierten Gens auf. Im

Gegensatz dazu bleibt in allen anderen Geweben ohne Cre-Transkription die entsprechende

Genfunktion unbeeinflusst. Somit lässt sich mithilfe der Cre/loxP-basierenden Methode ein

gewebespezifischer Gen-Knockout in der Mausgenetik etablieren.

Eine weitere Bedeutung gewinnt das Cre/loxP-System in der Induktion gewebespezifischer

Mutationen über die Verwendung loxP-flankierter STOP-Kassetten. Diese Art der

Genommodifikation wurde im KrasG12D-Mausmodell zur Herstellung onkogener Kras-

Mutationen angewendet und wird im folgenden Abschnitt detailliert beschrieben.

2.2. Das Kras

G12D-Mausmodell

Mit der Entwicklung des LSL-KrasG12D Mausmodells für das PDA gelang dem Forscherteam

unter David Tuveson und Tyler Jacks die Etablierung eines der bedeutendsten murinen

pankreatischen Karzinommodelle, welches auch in dieser Arbeit eine wesentliche Stellung

einnimmt. Grundidee dieses Tiermodells ist die vom endogenen Kras-Locus ausgehende

heterozygote pankreasspezifische Aktivierung des mutierten Kras(G12D)-Onkogens. Über die

Transfektion eines Plasmids in einen Mausstamm wurde das Kras-Allel so verändert, sodass

dieses ein modifiziertes Exon 1 mit einer Guanin-zu-Adenin-Transition auf dem Kodon 12

(G12D) und folglich einen Glycin-Aspartat-Aminosäureaustausch im Genprodukt aufweist

(Jackson et al., 2001). Unter Anwendung des bereits beschriebenen Cre/loxP-

Rekombinationssystems wird die gezielte Expression des veränderten Kras-Allels spezifisch in

Pankreaszellen erreicht. Hierzu wird dem das Kodon 12 enthaltende Exon 1 eine Lox-STOP-

Lox (LSL)-Sequenz vorgeschaltet (siehe Abbildung 4). Dieser LSL-Konstrukt verhindert die

II. EINLEITUNG

14

Transkription des veränderten Strukturgens und somit die Überexpression des onkogenen K-

Ras-Proteins in der LSL-KrasG12D-Mauslinie. Um eine Kras

G12D-Aktivierung selektiv im

Pankreas vorzunehmen, wird die LSL-KrasG12D-Maus mit einer Mauslinie gekreuzt, in der die

Cre-Rekombinase unter pankreassspezifischem Promotor Pdx-1 oder als Knock-in heterozygot

durch Entfernung des Exons 1 in einen Ptf1a-Lokus eingebaut exprimiert wird. Die daraus

resultierende Mauslinie bezeichnet man als Ptf1a-Creex1 bzw. Pdx1-Cre (Hingorani et al.,

2003a; Nakkai et al., 2007).

Pdx1 kodiert für den Transkriptionsfaktor Pankreatischer und duodenaler Homebox Faktor 1

(Pdx1), der auch als Insulin-Promotor-Faktor 1 bezeichnet und ab dem Entwicklungstag 8,5

produziert wird. Eine homozygote Deletion von Pdx1 endet letal in der Embryonalperiode. Das

von Ptf1a-Genbereich kodierte Ptf1a-Protein, welches auch als p48 genannt wird, stellt die

Untereinheit des heterotrimerischen Pankreastranskriptionsfaktorkomplex 1 dar (Rose et al.,

2001). P48 wird ab Tag 9,5 der Embryonalentwicklung exprimiert und ist gemeinsam mit Pdx1

für die pankreasspezifische Differenzierung der Zellen verantwortlich. Das Vorhandensein

beider Faktoren ist essenziell für die morphologische und funktionelle Entwicklung der

Vorläuferzellen zu Pankreasgewebszellen, wobei erwachsene Mäuse Pdx1 zur Bildung der

Inselzellen und p48 zur Initiierung der Azinuszelldifferenzierung benötigen (Rose et al., 2001;

Beres et al., 2006). Demzufolge führt die vollständige Deletion der p48-Gene zu einer

Agenesie des exokrinen Pankreas und konsequenterweise zum Tod der Mäuse früh postnatal

(Krapp et al., 1998; Sellik et al., 2004).

Nach Kreuzung der transgenen Mauslinien LSL-KrasG12D und Ptf1-Cre

ex1 bzw. Pdx1-Cre geht

nun eine Mausmutante LSL-Kras+/G12D;Ptf1a-Cre

ex1 bzw. LSL-Kras+/G12D ;Pdx1-Cre hervor,

die eine Heterozygotie für das KrasG12D-Allel aufweist. Aufgrund der Ptf1a- bzw. Pdx1-Cre-

Rekombinase assoziierten Exzision der loxP-flankierten STOP-Sequenz in diesem auch als

KrasG12D bezeichneten Tumormausmodell entfällt die transkriptionsinhierende Funktion der

STOP-Kassette, was wiederum zur deregulierten hochfrequenten Transkription des mutierten

Exon 1 führt (siehe Abbildung 4).

II. EINLEITUNG

15

Abbildung 4: Systematik der Generierung des Kras

G12D-Tumormausmodells. Grüne Pfeile beschreiben die Transkription der Strukturgene. Roter Balken kennzeichnet die transkriptionsinhibierende Wirkung der STOP-Kassette (modifiziert nach Hingorani et al 2003).

Mithilfe der LSL-KrasG12D Mauslinie ist die selektive endogene Expression des onkogenen K-

Ras-Proteins in Ptf1a bzw. Pdx1 positiven und Cre-Rekombinase positiven

Pankreasgewebszellen möglich. Somit kann die Tumorentwicklung pankreasspezifisch initiiert

und die Entstehung des humanen Pankreaskarzinoms exakt in der Maus rekapituliert werden.

Die genetisch veränderten KrasG12D-Mäuse zeigen daraufhin alle Stadien der PanIN-Läsionen,

die analog zum humanen PDA in ihrer Anzahl und Schwere mit dem Alter der Mäuse

zunehmen. In 10% der Fälle und nach einer Latenz von etwa neun Monaten entwickeln sich

auch invasive und metastasierende Karzinome. Der Nachweis der Kras-Mutation bei allen

PanIN-Stufen in den Progenitorzellen bestärkt dessen Bedeutung in der Induktion und

Progression der Pankreaskarzinogenese. Bei LSL-KrasG12D;Pdx1-Cre-Mäusen treten zusätzlich

andere Tumoren mit variierender Penetranz auf, wie die intestinale Hyperplasie des

Magenepithels, monokutane Papillome und hyperplastische Polypen des Duodenums. Die

simultane Existenz dieser Malignome beweist die embryonale Expression von Pdx1 in

endothelialen Vorläuferzellen (Rose et al., 2001). Ausgehend von diesem etablierten KrasG12D-

Tumormausmodell sind verschiedene komplexe Tiermodellsysteme entwickelt worden, die

additiv zu dem mutierten Kras-Allel andere genetische Veränderungen aufzeigen. Damit lässt

sich der Einfluss einzelner Genmutationen auf die Karzinomentwicklung und –progression

genauer analysieren und mögliche Ansatzpunkte für ein gezieltes medizinisches Eingreifen

finden.

II. EINLEITUNG

16

3. Suppressors of cytokine signaling (SOCS)

Die Mitglieder der SOCS-Familie stellen wichtige Feedback-Inhibitoren des Zytokin-

Signaltransduktionswegs dar. Mittlerweile sind acht SOCS-Proteine (CIS, Socs1-Socs7)

beschrieben worden, die auf ein Zytokinsignal gewebeabhängig exprimiert werden. Von diesen

auch als STAT-induzierte STAT-Inhibitoren (SSI) bezeichneten negativen Regulatoren der

Zytokin-Signalkaskade sind die Proteine Socs1, Socs2 und Socs3 besonders gut charakterisiert

und nehmen eine wichtige Stellung in der Interleukin-6 (IL-6) Signalkaskade ein. Im

Gegensatz dazu sind Socs4 bis Socs7 bislang noch wenig erforscht (Krebs et al., 2000).

Aufgrund der tragenden Rolle von Socs3 in dieser Arbeit, soll im Folgenden besonders auf

diesen inhibitorischen Regulationsfaktor eingegangen werden.

3.1. Die Struktur von Socs3

Socs3 stellt ein aus 225 Aminosäuren (AS) bestehendes Molekül dar, das aus unterschiedlichen

Domänen zusammengesetzt ist (vergleiche Abbildung 5). Die einzelnen Abschnitte erfüllen im

Rahmen der Signaltransduktion bestimmte Funktionen, die in ihrer Gesamtheit für den

negativen Feedback-Mechanismus des Socs3-Proteins von großer Bedeutung sind. Die N-

terminale Kinase-Inhibitor-Region (KIR) bindet als Pseudosubstrat an das aktive Zentrum von

Janus-Kinasen (Jak), wodurch das Andocken nativer Substrate blockiert wird. Eine zentrale

Stellung nimmt die SH2 (Scr-homology-2)-Domäne im Socs3-Molekül ein. Diese bildet die

eigentliche Kinase-Bindungsstelle, die eine hohe Affinität zu phosphorylierten Tyrosinresten

im Aktivierungsloop der Jaks aufweist. Unterstützt wird die SH2-Sequenz von den beiden

flankierenden N-ESS (extended SH2 subdomain) und C-ESS-Domänen, die strukturell die

Assoziation und die Affinität von SH2 an die Tyrosinmotive erhöht. Am C-terminalen Ende

der SH2-Domäne liegt eine PEST-Insertion zwischen zwei konservierten Sekundär-

Strukturelementen. Untersuchungen haben gezeigt, dass dieses PEST-Motiv als wichtiger

Regulator der Proteinstabilität fungiert und seine Entfernung weder zu einer

Strukturveränderung führt noch die Funktion von Socs3 beeinträchtigt. Jedoch zeigen PEST-

Knockout Mäuse eine Zunahme der Socs3-Halbwertszeit durch Beeinflussung des Proteasom-

vermittelten Abbaumechanismus (Babon et al., 2006). Die für die hemmende Wirkung von

Socs3 ebenfalls wichtige SOCS-Box-Region ist C-terminal lokalisiert (siehe Abbildung 5).

II. EINLEITUNG

17

Abbildung 5: Schematische Darstellung der Socs3-Architektur. Die Socs3-Struktur besteht aus einem kleinen N-Terminus, einer Kinase-Inhibitor-Region (KIR), einer SH2-Domäne und einer C-terminalen SOCS-Box. Die zentrale SH2-Domäne setzt sich aus 141 Aminosäuren (AS) zusammen und wird durch ein aus 35 AS bestehendes PEST-Motiv unterbrochen. N-terminal bzw. C-terminal wird die SH2-Domäne durch eine N-ESS- bzw. C-ESS-Sequenz flankiert (modifiziert nach Babon et al. 2006).

Durch Rekrutierung von Elongin B, Elongin C, Cullin 2 und das Ringfinger-Protein Rbx1 an

der SOCS-Box bildet sich ein E3-Ubiquitin-Ligase-Komplex (siehe Abbildung 6), in dem

Socs3 als Adaptormolekül die Ubiquitination und Degradation von bestimmten an der

Signaltransduktion beteiligten Proteinen fördert (Kamura et al., 1998; Kamura et al. 2004).

Abbildung 6: Socs3 als Trägermolekül des E3-Ubiquitin-Ligase-Komplexes (modifiziert nach Krebs et al. 2000).

3.2. Socs3 als Zytokin-Signaltransduktionsinhibitor

Die intrazelluläre Socs3-Proteinkonzentration ist unter normalen Umständen relativ gering.

Für die Aktivierung des auf Chromosom 11 liegenden Socs3-Gens (entspricht dem humanen

Socs3-Gen auf Chromosom 17) ist die Interaktion von Zytokinen besonders der Interleukin

(IL)-6-Familie, Wachstumsfaktoren wie den Insulin-like growth factor oder Hormonen mit

den spezifischen Zelloberflächenrezeptoren essentiell. Innerhalb der Untergruppen zeigen die

Zytokine ähnliche Molekül- und Rezeptorstrukturen. Stellvertretend soll an dieser Stelle der

IL-6-Rezeptor und dessen anschließende Signaltransduktionswege näher erläutert werden.

Der IL-6-Rezeptor verfügt über zwei Untereinheiten. Durch Bindung an das extrazelluläre

Zytokin-bindende Modul, das auch als Glykoprotein (gp)180 bekannt ist, übt IL-6 seine

biologische Aktivität aus. Intrazellulär bilden die ubiquitär exprimierten gp130-

Rezeptoruntereinheiten die signalvermittelte Struktur durch Aktivierung der Signalkaskade

II. EINLEITUNG

18

und stellen gleichzeitig Ziel verschiedener Rückkopplungsmechanismen dar. Weitere

Charakteristika des IL-6-Rezeptors sind die fehlende intrinsische katalytische

Tyrosinkinaseaktivität und die Verankerung in der Plasmamembran über eine singuläre

Transmembrandomäne. Bei Interaktion des Liganden IL-6 mit der extrazellulären

Rezeptorkomponente kommt es zunächst zur Aktivierung rezeptorassoziierter, intrazellulärer

Janus-Kinasen (Jak) durch Autophosphorylierung. Daraufhin phosphorylieren die aktivierten

Jaks die zytosolischen Zytokinrezeptoranteile am Tyrosinrest 759, der als Bindungsstelle

sowohl für diverse Transkriptionsfaktoren wie Stat3 als auch Inhibitoren wie Socs3-Moleküle

fungiert. Die Rezeptor-Ligand-Interaktion setzt somit den Jak/Stat-Signalweg ebenso wie die

PI3K- und die Ras/Raf/MAPK-Signalkaskade in Gang.

Die als Monomere im Zytoplasma lokalisierten Stat3-Moleküle binden an die gp130-

Untereinheit und werden anschließend Jak-vermittelt am Tyrosin 705 phosphoryliert. Die

aktivierten phospho(p)-Stat3-Elemente lagern sich dann zu Homo-oder Heterodimeren

zusammen, die in den Zellkern translozieren und dort an Enhancer-Sequenzen in Promotoren

von IL-6-Zielgenen binden und folglich deren Transkriptionsfrequenz positiv modulieren

(siehe Abbildung 7). In vielen malignen Tumoren kommt es durch eine Hyperaktivität der

Rezeptor-Tyrosinkinasen zu einer konstitutiven Phosphorylierung und Aktivierung von Stat3

und folglich zu einer Überexpression der an verschiedenen physiologischen Prozessen wie

Proliferation, Apoptose, Angiogense, Inflammation beteiligten Zielgene. Dies führt zur

Dysregulation des Zellzyklus und der Zellfunktion, was wiederum das Wachstum und

Überleben transformierter Zellen begünstigt und die Karzinomentwicklung fördert.

Abbildung 7: Die Mechanismen der Aktivierung der IL-6/Jak/Stat3-Signalkaskade und dessen Feedback-Inhibition durch Socs3.

II. EINLEITUNG

19

Die Aktivierung der Ras/Raf/MAPK-Kaskade setzt die Bildung eines Molekülkomplexes

bestehend aus SHP2 (SH2-Domäne enthaltende Phosphatase 2), Grb2 (growth factor receptor

bound protein 2), SOS (son of sevenless) und Gab1 (GRB2-associated binding protein 1)

voraus. Diese Proteineinheit bindet über SHP2 an die phosphorylierte Y759-Domäne und

vermittelt die Umwandlung des GDP-Ras in die energiereiche GTP-gebundene Form. Im

weiteren Verlauf kommt es nacheinander zur Aktivierung von Raf (rat fibrosarcoma), MEK

(Mitogen-activated protein kinase kinase) und MAPK (Mitogen-activated protein kinase),

welche anschließend intranukleär Transkriptionsfaktoren phosphoryliert und auf diese Weise

die Transkription von verschiedenen Ras-Zielgenen initiiert. Die Genprodukte beeinflussen

Wachstum, Proliferation, Zelldifferenzierung und Apoptose (Lim et al., 2005 Friday et al.,

2008).

Abbildung 8: Die Aktivierung der Ras/Raf/MAPK- und PI3K/AKT–Signalkaskade durch IL-6 und dessen negative Regulation durch Socs3.

Ein weiterer mit der IL-6-Signaltransduktion assoziierter Signalweg verläuft über die

Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K). Obwohl diesem eine große Bedeutung in der

Regulation mannigfaltiger Zellprozesse zugesprochen wird, ist die Komplexität der

Signalkaskade noch nicht vollständig verstanden. Nach Aktivierung durch Bindung an die

pY759-Einheit oder durch das aktive G-Protein Ras ist PI3K in der Lage, bestimmte

Membranlipide wie PIP2 (Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphat) in PIP3

(Phosphatidylinositol-3,4,5-Trisphosphat) zu phosphorylieren. Als second-messenger

rekrutiert PIP3 die Proteinkinase B (PKB; AKT) an die Plasmamembran, wo die

Phosphorylierung und Aktivierung dieses Enzyms stattfindet. In ihrer aktiven Form

beeinflusst AKT eine Reihe von zellulären Prozessen wie die Hemmung der Apoptose durch

Inhibition pro-apoptotischer Proteine der Bcl-Familie, die Stimulation der Proteintranslation

http://en.wikipedia.org/wiki/Mitogen-activated_protein_kinase

http://flexikon.doccheck.com/de/index.php?title=PIP2&action=edit&redlink=1

II. EINLEITUNG

20

an den Ribosomen durch Aktivierung von mTOR (mammalian Target of Rapamycin) und die

Förderung der Proliferation durch Inaktivierung des proliferationshemmenden Forkhead-Box-

Protein O3 (FOXO), welches die Zellteilung und Zellwachstum supprimiert. Alle genannten

Abläufe fördern letztendlich bei konstitutiver Aktivierung der Signalkaskade die

Tumorinitiierung und –progression (Manning et al. 2007; Assinder et al., 2009). Als

Antagonist von PI3K wird die Phosphatase PTEN (Phosphatase and Tensin homolog)

beschrieben, die PIP3 zu PIP2 dephosphoryliert und somit folglich die Aktivierung von AKT

verhindert. Eine Loss-of-function Mutation von PTEN resultiert daher in einer anhaltenden

Funktion der Proteinkinase B und führt letztlich zu unkontrolliertem Wachstum und

Proliferation der Zelle (Dubrovska et al., 2008).

Um einer Dauerstimulation entgegen zu wirken wird die IL-6-Wirkung über verschiedene

Mechanismen reguliert. In diesem Zusammenhang kommt insbesondere der Feedback-

Inhibition durch Socs3-Proteine als negative Rückkopplung eine große Bedeutung zu. Nach

Zytokin- bzw. Stat-induzierter Expression von Socs3 (Lang et al., 2003), bindet dieses

Genprodukt mit der SH2-Domäne direkt an das Phosphotyrosin 759 der zytoplasmatischen

gp130-Domäne und verhindert dadurch die Rekrutierung und Aktivierung nativer an der

Signaltransduktion beteiligter Substrate wie Stat3 (vergleiche Abbildung 7). Die Affinität zu

Jaks ist jedoch im Gegensatz zu Socs1 relativ gering, sodass höhere Konzentrationen für die

gleiche Hemmwirkung benötigt werden (Babon et al., 2006). Darüber hinaus fördert Socs3

den proteasomalen Abbau der Signal-Proteine durch Bildung des E3-Ubiquitin-Ligase-

Komplexes. Es kommt schließlich zur Terminierung der IL-6-Signaltransduktion. Die starke

Induktion des endogenen Inhibitors legt eine regulierende Funktion des Socs3 in der

pankreatischen Onkogenese nahe. Das Fehlen von Socs3-Molekülen durch homozygote

Deletion des entsprechenden Gens resultiert in konstitutiver IL-6-Signalvermittlung und führt

infolgedessen zu ungehindertem Wachstum und Entwicklung maligner Prozesse.

II. EINLEITUNG

21

4. Zielsetzung der Arbeit

Das duktale Adenokarzinom des Pankreas ist eine hochmaligne Tumorerkrankung des

Menschen mit einer Mortalitätsrate von 100% und einer frustranen Prognose (Lowensfels et

al., 2006). Trotz der zunehmenden Kenntnisse aus intensiven Forschungsuntersuchungen über

die histopathologischen und molekulargenetischen Ursachen stellt die Prognose eines

Pankreaskarzinoms für den heutigen Stand der Therapie immer noch eine große

Herausforderung dar. Mithilfe neu entwickelter Tumormausmodelle versucht man die

Mechanismen der Tumorentwicklung und- progression nachzuvollziehen und somit

Rückschlüsse auf das humane Pankreaskarzinom zu ziehen.

Die KrasG12D-Mutation spielt in der Tumorinitiierung und Tumorprogression eine tragende

Rolle. Untersuchungen haben diese genetische Veränderung sowohl in den PanIN-

Vorläuferläsionen als auch in fortgeschrittenen metastasierten und invasiven Tumorstadien

nachgewiesen. Andere aktivierende und hemmende molekulare Mechanismen im Rahmen der

PanIN-Progression zu invasiven duktalen Adenokarzinomen sind bisher weitgehend

unbekannt und sind Gegenstand gegenwärtiger Forschungsarbeiten.

Der suppressor of cytokine signaling 3 (Socs3) ist als negativer Regulator zahlreicher

Signaltransduktionswege besonders der IL-6/Jak/Stat3-Signalkaskade beschrieben worden

(Lang et al. 2003). Obwohl für Socs3 eine zunehmende Bedeutung in der Karzinogenese

postuliert wird (Ogata et al., 2006), ist dessen Funktion und Wirkungsweise in der

pankreatischen Onkogenese bisher nur unzureichend untersucht.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Rolle bzw. dem Einfluss von Socs3 auf die

durch die KrasG12D-Mutation induzierte murine Pankreaskarzinogenese. Im Rahmen der

durchgeführten Untersuchungen werden dabei folgende wichtige Fragestellungen formuliert:

- Lässt sich in PanIN-Läsionen von LSL-KrasG12D;Ptf1a-Cre

ex1 (Kras

G12D)-Mäusen eine

verstärkte Expression und folglich eine erhöhte Konzentration von Socs3 nachweisen?

- Welche Konsequenz hat dann eine homozygote Deletion des Socs3-Gens mit

konsekutiver Socs3-Inaktivierung für die Entwicklung und Progression von PanINs in

KrasG12D-Mäusen?

- Was bedeutet dieser Genverlust für das Wachstum und Entwicklung der genetisch

veränderten Tiere?

III. MATERIAL UND METHODEN

22


1. Material

1.1. Chemikalien

Chemikalie Name und Firma

ABC-Lösung ABC Elite Kit Vector, Burlingame, USA

Acrylamid Rotiphorese Gel 30 (Roth,Karlsruhe)

Antigen Unmasking Solution H-330 Vector Labs, Burlingame, USA

APS Sigma, Steinheim

Avidin Avidin/Biotin Blocking, Vector Labs, Burlingame, USA

Biorad Protein Assay Biorad, München

Biotin Avidin/Biotin Blocking, Vector Labs, Burlingame, USA

Bradford (5x) Protein Assay Dye Reagent Concentrate # 500-0006, Bio-Rad

Bromphenolblau Bromphenol blue sodium salt (Sigma, Steinheim)

BrdU Sigma, Steinheim

BSA Cohn V fraction (Sigma, Steinheim)

ddH2O Aqua ad injectabilia (Diaco,Naila)

dH2O Aqua Delta Select Spüllösung (Delta Select, München)

DAB DAB Substrate kit for Peroxidase, Vector Laboratories

DirectPCR® Lysis Reagent Peqlab, Erlangen

DMEM Gibco

DNA-Größenstandard DNA-Leiter-Mix (Peqlab, Erlangen)

ECL Amersham ECL Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare, München)

EDTA Sigma, Steinheim

Eindeckmedium (Mounting Medium) Pertex, Medite

Eosin Croma, Münster

Ethanol Apotheke MRI

Ethidiumbromid Sigma, Steinheim

Goat Serum Sigma, Steinheim

Hämalaun Merck, Darmstadt

Hämatoxylin Merck, Darmstadt

HCl Merck, Darmstadt


23

HEPES Sigma, Steinheim

Histoclear Roti-Histol (Roth, Karlsruhe)

30%H2O2 Merck, Darmstadt

Isofluran Forene (Abbott, Wiesbaden)

LE Agarose Biozym Scientific, Oldendorf

β-Mercaptoethanol Sigma, Steinheim

Magermilchpulver Sigma, Steinheim

Methanol Roth, Karlsruhe

NP-40 Roche, Mannheim

PBS-Pulver Instamed PBS Dulbecco (Biochrom AG, Berlin),

Pertex-Eindeckmedium Medite, Burgdorf

PFA Apotheke MRI

Phosphatase Inhibitor Cocktail I Sigma, Steinheim

Phosphatase Inhibitor Cocktail II Sigma, Steinheim

Protease-Inhibitor Cocktail Sigma, Steinheim

Proteinase K Roche, Mannheim

Protein-Größenstandard Precision plus protein™ standard (Biorad, München)

Rabbit serum Sigma, Steinheim

Ras Activation Assay Kit Biomal, Hamburg

RedTaq ReadyMix Sigma, Steinheim

RNAseZap Sigma, Steinheim

SDS SDS Ultra pure (Roth, Karlsruhe)

Streptavidin/Biotin block Vector Laboratories, Orton Southgate

TEMED Sigma, Steinheim

Tris-HCL Roth, Karlsruhe

Tris-Base Roth, Karlsruhe

Tween-20 Roth, Karlsruhe

Tabelle 1: Chemikalien.


24

1.2. Geräte und Hilfsmittel

Geräte Name und Firma Agarosegel-Bildwandler Molecular Imager Gel Doc XR System (Bio-

rad, München) Agarosegelkammer Sub-Cell GT (Biorad, München)

Automatischer Filmprozessor Amersham Hyperprocessor (GE Healthcare)

Computer Hardware Apple

Deckgläser #1 H868, 24x60 mm

Elektrophoreseapparatur Mini-PROTEAN Tetracell (Biorad, München)

Entwicklermaschine Amersham Hyperprocessor (GE, Healthcare, München)

Eppis Eppendorfer

Falcons Falcon®, BD, Franklin Lakes, USA

Feinwaage Analytic Sartorius, Göttingen

Filmkassette BAS Cassette 2025 (Fujifilm, Kleve)

Heizplatte Thermomixer compact (Eppendorf, Hamburg)

Histologiekassetten Bio-Cassettes 07-7130, Bio-Optica, Mailand,lt.

Homogenisator Diax 900 (Heidolph, Schwabach)

Hyperfilm Amersham Hyperfilm ECL (GE Healthcare, München)

Kamera ApoTome, Zeiss, Oberkochen

Magnetrührer MR 3001 (Heidolph, Schwabach)

Microtome HM 355, Microm GmbH

Mikroskope Axio Imager A1 (Zeiss, München) Axiover 40 CFL (Zeiss, München) MZ75 (Leica, Wetzlar)

Mikrowelle Siemens, München

Neubauer®-Zählkammer Marienfeld

Objektträger Superfrost®Plus, Menzel-Gläser, Braunschweig Thermo Scientific, Schwerte

Parafilm Parafilm®PM-992, pechiney plastic packaging, Brampton, USA

pH-Meter Inolab pH 720 (WTW, Weilheim)

Pipetten Eppendorf Research, Hamburg

Pipettenspitzen SafeSeal-Tips® Professional, (Biozym Oldendorf)

Power supply PowerPac basic, Bio-Rad


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Scanner Canon

Schwenktisch L40 (Labinco, Breda, Niederlande)

Slides-Folien Thermo scientific

Spektrophotometer 2001 (Anthos, Krefeld)

Stromquelle Power Pac Basic (Biorad, München)

Thermoblock/Schüttler Thermomixer compact (Eppendorf, Hamburg)

Thermocycler Mastercycler (Eppendorf, Hamburg)

Transferapparat Mini Trans-Blot Cellfer (Biorad, München)

Transfermembran Immobilon-P Transfer Membrane (Millipore, Schwalbach)

Vortexer Reax top (Heidolph, Schwabach)

Waage BP 2100 S (Sartorius Göttingen)

Well-Platte Microtest TM 96 Zellkulturplatte (Becton Dickinson, Heidelberg)

Whatman-Papier Biometra, Göttingen

WinRead Anthos

Zentrifuge Centrifuge 5415R (Eppendorf, Hamburg)

Tabelle 2: Geräte und Hilfsmittel.

1.3. Puffer und Lösungen

Puffer/Lösung Zusammensetzung Menge ABC-Lösung Pufferlösung

Reagenz A

Reagenz B

2,5 ml 1 Tropfen

1 Tropfen

Antigendemaskierungslösung pH 8,0

1 mM EDTA oder Citratpuffer

Blocklösung (5 %) für IHC Serum Avidin Pufferlösung (PBS/PBS-T, TBS/TBS-T)

50 µl 4 Tropfen 945 µl

Blocking-Puffer (5 %) für WB Skim milk TBS/T oder PBS/T

10 g 200 ml 200 ml

BrdU Stock-Lösung 50 µg/µl BrdU dH2O

500 ml 10 ml mit NaOH alkalisieren bis BrdU vollständig aufgelöst ist, steril filtrieren und Stocklösung bei -20°C aufbewahren

DAB-Lösung dH2O Buffer Stock-Lösung DAB-Lösung H2O2-Lösung

2,5 ml 1 Tropfen 1 Tropfen 1 Tropfen


26

Deparaffinisierung Histoclear Ethanol

76 % 96 % 100 %

Hydratation Ethanol Histoclear

76 % 96 % 100 %

IP–Puffer/Lysispuffer Lagerung bei 4°C

EDTA pH 8,0 HEPES pH 7,9 NaCl Glycerin NP-40 und kurz vor der Lyse supplementieren mit: DTT PMSF Protease Inhibitor Cocktail Phosphatase Inhibitor Cocktail I Phosphatase Inhibitor Cocktail II

1 mM 50 mM 150 mM 10 % 0.5 % 1 mM 0,2 mM 1 % 1 % 1 %

5x Laemmli-Ladepuffer pH 6,8 SDS Glycerin Tris-HCL Bromophenolblau ß-Mercaptoethanol

10 % 50 % 300 mM 0,05 % 5 %

10x Laufpuffer pH 8,3 Tris-Base Glycin SDS

30 g 144 g 10 g Auf 1 l mit dH2O auffüllen

Lysispuffer für Isolation genomischer DNA aus Mausschwanzspitzen

DirectPCR®

Proteinase K Alternative: selbst angesetzter Puffer Tris EDTA NaCl SDS Proteinase K kurz vor der Lyse dazugeben

200-300 µl 0,2-0,4 mg/ml 50 mM 100 mM 100 mM 1 % 0,5 mg/ml

10x PBS, pH 7,4 NaCl KCl Na2HPO4

KH2PO4

Auf 1 l mit dH2O auffüllen

80 g 2 g 14,4 g 2,4 g

PBST PBS 10x dH2O Tween-20

100 ml 900 ml 0,1 %

Peroxidase Blocklösung 3 % H2O2 30 % 100 µl


27

dH2O 900 µl PFA 4 % PFA 8 %

PBS 20 ml 20 ml

Proteinase K-Buffer, pH 7,5 CaCl2

Tris-Base Glycerin Proteinase K

20 mM 10 mM 50 % 1 %

Sammelgelpuffer pH 6,8 Tris-Base Auf 100 ml mit dH2O auffüllen, pH mit HCL einstellen

0,5 M

Stripping Puffer pH 2,0 Glycin SDS

25 mM 1 %

50x TAE (Tris-Acetat-EDTA)-Puffer pH 8,5

EDTA Tris-Base Essigsäure

0,5 M 2 M 1 M

10x TBS, pH 7,6 Tris-Base NaCl Auf 1 l mit dH2O auffüllen

24,2 g 80 g

TBS-T 10x TBS dH2O Tween 20

100 ml 900 ml 1 ml

10x Transfer-Puffer pH 8,3 Tris Glycin Auf 1 l mit dH2O auffüllen

30 g 144 g

1x Transfer-Puffer 10x Transferpuffer Methanol dH2O

100 ml 200 ml 700 ml

Trenngelpuffer pH 8,8 Tris-HCL Auf 1 l mit dH2O auffüllen

1,5 M

Tabelle 3: Puffer und Lösungen.

1.4. Gele

Gel Zusammensetzung Menge Sammelgel destilliertes Wasser

Sammelgelpuffer Acrylamid 30 % SDS 10 % APS TEMED

3,0 ml 1,3 ml 750 µl 50 µl 25 µl 10 µl

Tabelle 4: Gele.

Trenngel 7,5 % 10 % 12 % 15 % dH2O 4,9 ml 4,1 ml 3,4 ml 2,5 ml Trenngelpuffer 2,6 ml 2,6 ml 2,6 ml 2,6 ml Acrylamid 30 % 2,5 ml 3,3 ml 4,0 ml 5,0 ml SDS 10 % 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl APS 10 % 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl TEMED 15 µl 15 µl 15 µl 15 µl


28

1.5. Antikörper

1.5.1. Antikörper für Immunhistochemie (IHC)

Tabelle 5: Antikörper für IHC.

1.5.2. Antikörper für Western Blot (WB)

Erster Antikörper

Quelle Verdünnung Inkubationszeit Firma

Amylase Ziege 1:500 Zwei Nächte 4°C

Sigma, Steinheim

BrdU Ratte 1:250 2 h RT Serotec, Düsseldorf CK-19 Ratte 1:300 18 h 4°C Hybridom Bank, Iowa

City USA Cleaved Caspase 3

Hase 1:300 18 h 4°C Cell Signaling, Frankfurt

Cyclin D1 Hase 1:300 18 h 4°C Labvision/NeoMarkers, USA

F4/80 Ratte 1:100 18 h 4°C Caltag Laboratories, UK

Glucagon Meer- schweinchen

1:500 1 h RT Linco

Insulin Meer- Schweinchen

1:100 1 h RT DakoCytomation, Hamburg

Muc1 Armenien Hamster

1:250 18 h 4°C Labvision/Neomarkers, USA

Muc5A Maus 1:100 2 h RT Labvision/Neomarkers, USA

phospho-ERK Hase 1:100 18 h 4°C Cell Signaling, Frankfurt

phospho- Stat3 Hase 1:50 18 h RT Cell Signaling, Frankfurt

Socs3 Sekundärer Antikörper Biotinylierter Anti-Hase

Ziege 1:500 1 h RT Vector, Burlingame, USA

Biotinylierter Anti-Ziege

Hase 1:500 1 h RT Vector, Burlingame, USA

Biotinylierter Anti-Meerschweinchen

Ziege 1:500 1 h RT Vector, Burlingame, USA

Biotinylierter Anti-Ratte

Hase 1:500 1 h RT Vector, Burlingame, USA

Erster Antikörper

Quelle Verdünnung Inkubationszeit Firma

ß-Actin Maus 1:2000 18 h 4°C Sigma, Steinheim Bax Hase 1: 500 18 h 4°C BD, Heidelberg Bcl-2 Maus 1:500 18 h 4°C Cell Signaling


29

Tabelle 6: Antikörper für Western Blot.

1.6. Primer für Genotypisierung

Gen Primername Oligonukleotidsequenz (5ʼ- 3ʼ) Socs3 Socs3 loxpA

Socs3 loxpB -GCGGGCAGGGGAAGAGACTGTCTGGGGTTG- -GGCGCACGGAGCCAGCGTGGATCTGCG-

Ptf1a-cre Cre487 p48as1642

-GTCCAATTTACTGACCGTACACCAA- -CCTCGAAGGCGTCGTTGATGGACTGCA-

Kras Kras 3 Kras 5

-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGCG- -CGCAGACTGTAGAGCAGCG-

Tabelle 7: Primer.

1.7. Mäuse

Maus Kurzbezeichnung Referenz LSL-Kras

G12D (Jackson et al., 2001) Ptf1a-Cre

ex1 (Nakhai et al., 2007) Socs3

Flox/Flox Socs3

F/F (Okada, Nakamura 2006)

LSL-KrasG12D;Ptf1a-Cre

ex1 KrasG12D Eigene Kreuzung

Socs3F/F;Ptf1a-Cre

ex1 Socs3Δpanc Eigene Kreuzung

LSL-KrasG12D;Socs3

F/F;Ptf1a-Creex1 Kras

G12D;Socs3Δpanc Eigene Kreuzung

Tabelle 8: Mäuse.

Frankfurt Bcl-XL Hase 1:500 18 h 4°C Cell Signaling,

Frankfurt Cox-2 Ziege 1:200 18 h 4°C Caymann, Ann Arbor,

USA Cyclin D1 Maus 1:500 18 h 4°C Santa Cruz, Heidelberg HSP70 Hase 1:500 18 h 4°C Cell Signaling,

Frankfurt Mcl-1 Hase 1:500 18 h 4°C Epitomics, Burlingame,

USA p21 Maus 1:500 18 h 4°C BD Pharmingen,

Heidelberg p53 Maus 1:500 18 h 4°C Santa Cruz, Heidelberg PCNA Maus 1:500 18 h 4°C Santa Cruz, Heidelberg phospho-ERK Hase 1:500 18 h 4°C Cell Signaling,

Frankfurt Phospho-Jak 2 Hase 1:500 18 h 4°C Cell Signaling,

Frankfurt Phospho-Stat3Y705

Hase 1:500 18 h RT Cell Signaling, Frankfurt

Stat3 Hase 1:500 18 h RT Santa Cruz, Heidelberg Survivin Maus 1:500 18 h RT Santa Cruz, Heidelberg Sekundärer Antikörper Anti-Hase IgG Ziege 1:2000 1 h RT Promega, Mannheim Anti-Maus IgG Schaf 1:2000 1 h RT GE Healthcare,

München


30

2. Methoden

2.1. Versuchstiere

2.1.1. Behandlung mit BrdU

5-Brom-2-desoxyuridin (BrdU) ist ein Thymidinanalogon, welches von proliferierenden

Zellen in vitalen Geweben aufgenommen werden kann. In phosphorylierter Form wird BrdU

anstelle des Nukleotids Desoxythymidintriphosphat (dTTP) in die neu synthetisierte DNA

(Desoxyribonukleinsäure) aufgenommen. Mithilfe spezifischer Antikörper gegen BrdU kann

eine stattgefundene DNA Synthese immunhistochemisch nachgewiesen werden. Damit dient

die Behandlung mit 5-Brom-2-desoxyuridin der labordiagnostischen Markierung bzw. dem

Nachweis proliferierender Zellen.

Für die Detektion und Quantifizierung der proliferierenden Zellen wird die BrdU Stock-

Lösung 1:10 mit 0,9 % NaCl auf eine Endkonzentration von 2 mg/ml verdünnt. Die Mäuse

wurden zwei Stunden vor Präparation intraperitoneal mit 10 µl/g Körpergewicht (50 µg

BrdU/g Körpergewicht Maus) injiziert.

2.1.2. Gewebeentnahme in vivo-Präparation und Materialgewinnung

Zur Gewebegewinnung wurden die zu untersuchenden Tiere zwei Stunden nach der BrdU-

Injektion mit einer Überdosis Isofluran euthanasiert und das Gewicht bestimmt.

Nach Desinfektion des Abdomens der Mäuse mit 70 % Alkohol, Freilegung der Bauch- und

Thoraxhöhle erfolgte zuerst die Inspektion auf ggf. vorhandenen Aszites, Blut, Metastasen,

vergrößerte Lymphknoten etc.. Anschließend wurden Pankreas, Milz, Leber, Lunge und

Duodenum entnommen. Nach Bestimmung des Pankreasgewichts wurden Gewebestückchen

aus verschiedenen Pankreasanteilen (Caput, Corpus und Cauda) zur Protein- und RNA-

Bestimmung reseziert und in kleinen Eppis in Flüssigstickstoff schockgefroren. Das restliche

Pankreasgewebe und die anderen entnommenen Präparate wurden in 4 % Paraformaldehyd

(PFA) über Nacht fixiert. Am nächsten Tag wurde die Paraformaldehydlösung durch

phosphatgepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline, PBS) ersetzt. Zur weiteren

Verarbeitung wurden die Proben ins Institut für Pathologie der Technischen Universität

München geschickt, wo sie schließlich in Paraffin eingebettet wurden und somit für die

Immunhistochemie zur Verfügung standen.

Zur Nachgenotypisierung (PCR) wurden die Schwanzspitzen der verwendeten Mäuse getrennt

und bei -20°C bis zur Anwendung gelagert. Alter, Geschlecht, Gewicht und Genotyp der

Tiere sowie die bei der Resektion beobachteten Auffälligkeiten wurden notiert.


31

Alle Experimente wurden nach den Richtlinien des lokalen Tierschutzkommitees

durchgeführt.

2.2. Molekularbiologische Methoden

2.2.1. DNA-Extraktion aus der Mausschwanzspitze

Die DNA-Extraktion ist Voraussetzung für die Analyse des entsprechenden DNA-Abschnitts

mittels Polymerasekettenreaktion (PCR), die wiederum für die Bestimmung des Genotyps der

Versuchstiere essentiell ist.

Genomische DNA aus Mausschwänzen wurde mithilfe des DirectPCR®Lysis Reagent

(peqlab) isoliert. Die Isolation erfolgte nach dem Protokoll DirectPCR®Lysis Reagent.

Die ca. 0,5-1 cm großen Mäuseschwänze wurden mit 200-250 µl DirectPCR®Lysis Reagent,

komplettiert mit 0,2-0,3 mg/ml Proteinkinase K, in Reaktionsgefäßen bei 55 °C über Nacht in

einem Thermoschüttler bis zur kompletten Lyse des Gewebes inkubiert. Am nächsten Tag

wurden die Proben zur Inaktivierung der Proteinase K bei 85 °C für 45 Min. erhitzt und

anschließend für zehn Sekunden zentrifugiert. Der Überstand wurde so für die nachfolgende

PCR gewonnen und das Pellet verworfen. Für die anschließende Genotypisierung wurde 1 µl

pro 25 µl PCR-Reaktion eingesetzt.

2.2.2. Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR)

Die PCR diente der in vitro erfolgten enzymatischen Amplifikation der zu untersuchenden

Genabschnitte (spezifische DNA-Sequenzen) der verwendeten Versuchstiere. Mithilfe einer

hitzestabilen DNA-Polymerase und zwei definierter Oligonukleotidprimer, die den zu

amplifizierenden DNA-Abschnitt am 5ʼ- und 3ʼ-Ende flankieren, lässt sich die spezifische

DNA-Sequenz polymerisieren und somit exponentiell vervielfältigen. Die PCR ermöglicht

somit den Nachweis kleinster DNA-Mengen.

Zur Gewinnung einer ausreichenden DNA-Menge ist die PCR in drei Schritte unterteilt, die

sich in 12-50 genau definierten Zyklen wiederholen:

1. Denaturierung des DNA-Doppelstranges

2. Anlagerung (Annealing) der spezifischen Primer

3. Verlängerung (Elongation) der einsträngigen DNA durch die DNA-Polymerase


32

Die PCR-Proben mit jeweils 25 µl wurden wie folgt angesetzt:

Reagenz Menge dH2O 10,5 µl Primer 1 0,5 µl Primer 2 0,5 µl (oder PrimerMix) 1 µl RedTag Ready Mix 12,5 µl DNA 1 µl

Folgende Primer-Sequenzen wurden für die Genotypisierung verwendet: siehe Tabelle 7

Alle Ansätze wurden noch einmal kurz herunter zentrifugiert, bevor die PCR in einem

automatischen Thermocycler unter folgenden Bedingungen durchgeführt wurde:

1. Initiale Denaturierung 5 Min. 95°C

2. Denaturierung 30 Sek. 95°C

Annealing der Primer 30 Sek. 60°C 40 Zyklen

Elongation 90 Sek. 72°C

3. Terminale Elongation 10 Min. 72°C

Die erhaltenen DNA-Amplifikate können dann direkt mithilfe der Agarose-Gelelektrophorese

analysiert und der Erfolg der DNA-Amplifikation überprüft werden.

2.2.3. Agarose-Gelelektrophorese

Mittels der Agarose-Gelelektrophorese ist eine Größentrennung der DNA-Stränge und durch

Vergleich mit Strängen bekannter Größe eine DNA-Größenbestimmung möglich. Zur

horizontalen Auftrennung der Moleküle wird ein aus Agarosepolymeren vernetztes Gel

hergestellt, dessen Konzentration je nach Fragmentgröße zwischen 1 % und 3 % liegt. Der

Molekularsiebeffekt des Gels dient dabei als Trennprinzip. Die Agarose wurde in 1x TAE-

Puffer in der Mikrowelle fünf Minuten bis zum Kochen erwärmt. Anschließend wurde pro 10

ml Gellösung 1 µl Ethidiumbromid substituiert. Das flüssige Gel wurde dann blasenfrei in die

entsprechende Gelkammer gegossen und ein Gelkamm eingesetzt. Nach Verfestigung des

Gels erfolgte die Beladung der Geltaschen mit jeweils 15 µl der in der PCR gewonnenen

DNA-Amplifikate und dem Größenstandard, der der Größenbestimmung der Fragmente

diente. Aufgrund der negativen Ladung wanderten die DNA-Moleküle nach Anlegen einer

elektrischen Spannung von 120V von der Kathode zur Anode, wobei die

Wanderungsgeschwindigkeit der DNA-Moleküle durch die Gelmatrix von ihrer Größe

abhängig war. Je kleiner das Molekül, desto schneller bewegte es sich. Die Trennschärfe wird

ebenfalls von der Gelkonzentration, der angelegten Spannung und der Laufzeit beeinflusst.


33

Zur Visualisierung der aufgetrennten DNA dient die Interkalation der Ethidiumbromid-

Moleküle zwischen den Basen der DNA. Durch die so verstärkte fluoreszierende Eigenschaft

von Ethidiumbromid im ultravioletten Licht kann die daran gebundene DNA sichtbar gemacht

werden. Das Ergebnis wurde mit einer LCD-Kamera festgehalten und die Größenanalyse

mithilfe des Gel Doc XR Systems durchgeführt.

2.3. Detektion und Quantifizierung der Gen-Transkription

2.3.1. Isolation von mRNA aus murinem Pankreasgewebe

Zur Gewinnung von RNA wurde zunächst das Pankreasgewebe entnommen und in RLT-

Puffer/1 % (v/v) β-Mercaptoethanol überführt. Anschließend erfolgte die Zerkleinerung

mithilfe eines Homogenisators DIAX 900. Die Extraktion der RNA aus den Homogenisaten

wurde mit dem RNeasy®Mini Kit nach den Protokollangaben des Herstellers durchgeführt.

Dieses Kit enthält mit Silicagel gefüllte Säulen, über welche die RNA aufgereinigt wird. Die

RNA-Konzentration wurde photometrisch unter Zuhilfenahme eines Eppendorf

BioPhotometers gemessen. Nicht angewendete Lysate wurden in flüssigem Stickstoff

schockgefroren und bei -80 °C gelagert.

2.3.2. cDNA-Synthese

Die Umschreibung von RNA in cDNA erfolgte durch reverse Transkription gemäß

Herstellerprotokollen. Hierzu wurden 5 µg RNA nach Substitution von 1 µl Oligo(dT)-Primer

und 1 µl SuperScriptTM II Reverse Transkriptase in cDNA enzymatisch umgewandelt. Bis zur

weiteren Anwendung wurden die cDNA-Produkte bei -20 °C gelagert.

2.3.3. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR)

Die Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) stellte die Kombination aus

zwei molekulargenetischen Methoden, der Reversen Transkriptase (RT) und der Polymerase-

Kettenreaktion (PCR), dar, die dem Nachweis von RNA aus Genexpression spezifischer Gene

in Zellen, Geweben etc. dienten. Via qRT-PCR konnte die Produktsynthese in Echtzeit

verfolgt werden. Hierzu wurde die DNA mit einem interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff

markiert, der am Ende eines jeden Zyklus optisch angeregt wurde, sodass die

Fluoreszenzemission anschließend gemessen werden konnte. Hierbei korrelierte die Zunahme

der Fluoreszenz mit der Zunahme der DNA-Konzentration. Der häufig, auch in dieser Arbeit

verwendete Fluoreszenzfarbstoff ist SYBRTMGreen I, welcher sich an doppelsträngige DNA

anlagerte. DNA-Einzelstränge und einzelsträngige Oligonukleotid-Primer wurden von

SYBRTMGreen I mit einer geringeren Affinität gebunden, sodass diese die Messung

http://de.wikipedia.org/wiki/Reverse_Transkriptase

http://de.wikipedia.org/wiki/Polymerase-Kettenreaktion

http://de.wikipedia.org/wiki/Polymerase-Kettenreaktion


34

behinderte. Um die Messung unspezifischer Fluoreszenz durch so genannte Primerdimere zu

minimieren, wurde die Detektionstemperatur angehoben. Da Primerdimere einen geringeren

Schmelzpunkt als spezifische PCR-Produkte besaßen, konnten sie bei höheren Temperaturen

nicht mehr detektiert werden. Deswegen erfolgte die Registrierung der Fluoreszenz erst nach

einer kurzen Inkubation bei 80 °C, anstatt schon nach der Elongation bei 72 °C. Der Nachteil

der geringen Spezifität konnte durch Optimierung des Primerdesigns und der gewählten

Reaktionsbedingungen ausgeglichen werden. Desweiteren ließ sich die Bildung spezifischer

PCR-Produkte anhand der Fragmentlänge nach abgelaufener PCR mithilfe einer

Schmelzkurvenanalyse überprüfen. Hierbei wurde die doppelsträngige DNA bei

kontinuierlicher Temperaturerhöhung von 70 °C auf 90 °C aufgeschmolzen. An dem für das

Fragment definierten Schmelzpunkt zerfiel der DNA-Doppelstrang in Einzelstränge, wodurch

eine Abnahme der Fluoreszenz der Probe registriert wurde. Aufgrund der höheren

Schmelztemperatur der spezifischen doppelsträngigen PCR-Produkte gegenüber

unspezifischen Primerdimeren, widerspiegelte die Höhe des Peaks der Schmelzkurve

annähernd die Fragment-Konzentration.

2.3.4. Reaktionsansatz und Reaktionsbedingungen

Das für die qRT-PCR verwendete Reaktionsgemisch setzte sich zusammen aus SYBR Green

PCR Master Mix 2x, 100 ng cDNA und je 900 nM sense- und antisense-Primer in einem

Reaktionsvolumen von 25 µl. Die anschließende PCR fand in einem ABI-PRISM 7700

Sequenz-Detektions-System unter folgenden Reaktionsbedingungen statt:

1. Initiale Denaturierung 3 Min. 94°C

2. Inkubation 30 Sek. 94°C

3. Inkubation 30 Sek. 60°C 40 Zyklen



Nach dem letzten Inkubationsschritt eines jeden PCR-Zyklus erfolgte die

Fluoreszenzmessung. Zur Bestimmung der Schmelzkurven wurde die Temperatur in 0,5°C-

Schritten von 70 bis 90°C angehoben und jeweils für drei Sekunden gehalten und

währenddessen die Fluoreszenz registriert.


35

2.3.5. Quantifizierung der Genexpression

Die Analyse der Expressionsniveaus der Gene erfolgte entweder durch absolute

Quantifizierung anhand einer gegebenen Kalibrierkurve oder durch relative Quantifizierung

mit Einbezug eines oder mehrerer Referenzgene. Diese auch als „housekeeping“-Gene

bezeichneten Referenzgene wurden als Ladekontrolle eingesetzt, da deren Expressionsniveau

in allen Proben gleichbleibend hoch ist. Häufig wird das Haushaltsgen Cyclophilin eingesetzt.

Als Maß für die Quantifizierung der DNA-Startmenge wurde der sogenannte Ct-(Cycle

Threshold für Schwellenwert-Zyklus) bzw. CP-(Crossing Point)-Wert verwendet, welcher die

Anzahl der nötigen PCR-Zyklen zum Erreichen eines konstant definierten Fluoreszenzniveaus

beschrieb. Unter optimalen Bedingungen und bei 100 %iger Effizienz kommt es zur

Verdopplung der DNA-Menge und analog dazu auch der Fluoreszenzemission nach jedem

PCR-Zyklus. Zur Berechnung des Expressionsniveaus wurde zunächst für jede untersuchte

Probe die Differenz zwischen dem CP-Wert des Referenzgens und des zu untersuchenden

Gens ermittelt: ΔCP = CP-Zielgen – CP-Referenzgen und anschließend in die Gleichung 2-ΔCP

eingesetzt.

2.4. Proteinchemische Methoden

2.4.1. Proteinisolierung/Proteingewinnung aus Mauspankreasgewebe

Zur Proteingewinnung aus Mauspankreasgewebe wurde zunächst das nach der Resektion der

Mäuse schockgefronene Pankreasgewebe auf Eis aufgetaut und danach mit einem Skalpell

zerkleinert. Um die intrazellulären Proteine zu isolieren, wurde das Gewebe mit je 600 µl IP-

Puffer/Lysispuffer resuspendiert und homogenisiert. Nachdem die Proben für 30 Min. auf Eis

gelagert wurden, erfolgte abschließend eine zehnminütige Zentrifugation bei 4°C und 13.200

rpm. Der dabei gewonnene proteinhaltige Überstand wurde für die weitere Diagnostik

abgenommen, während das Pellet verworfen wird.

2.4.2. Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford

Die Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford (Bradford, 1976) erfolgte mit dem Bio-

Rad Protein-Assay. Hierbei handelt es sich um eine photometrische Methode, bei der der

Triphenylmethanfarbstoff Coomassie-Brillant-Blau G-250 zur Komplexbildung mit Proteinen

eingesetzt wird. Je nach Proteinkonzentration ist das Maß der Proteinbindung an den Farbstoff

unterschiedlich, was wiederum zu unterschiedlichen Farbveränderungen führt.

Coomassie-Brillant-Blau G-250 hat in ungebundener Form ein Absorptionsmaximum bei 465

nm, das in der gebundenen Form auf 595 nm erhöht wird. Die Absorptionsverschiebung ist

http://de.wikipedia.org/wiki/Triphenylmethanfarbstoff

http://de.wikipedia.org/wiki/Coomassie-Brillant-Blau

http://de.wikipedia.org/wiki/Coomassie-Brillant-Blau


36

photometrisch messbar und stellt somit ein Maß für die Proteinkonzentration der verwendeten

Probe dar.

Zunächst wird der Bio Rad Protein-Assay im Verhältnis 1:5 mit dH2O verdünnt.

Anschließend wurde auf einer 96-Well-Platte 10 µl der Probe oder 10 µl des Standards mit

250 µl 1x Bradford-Lösung gemischt. Als Standardprotein diente BSA (c=1 mg/ml), welches

in Form einer Standardreihe (0, 1, 2, 4, 6, 8 mg/ml) eingesetzt wurde. Die Proteinlösungen

(aus 2.3.1.) wurden im Verhältnis 1:5 mit dH2O verdünnt, bevor sie in die Wells pipettiert

wurden. Anschließend wurde die Extinktion der Proben mithilfe des Spektrophotometers bei

595 nm gemessen und die Proteinkonzentration anhand der Kalibrierkurve aus den

Konzentrationen der Standards berechnet.

2.4.3. Western Blot Analyse

Unter Western Blot versteht man die Übertragung von Proteinen von einem Elektrophorese-

Gel auf eine Membran, um diese immunologisch zu detektieren bzw. nachzuweisen. Bei

dieser Methode wird zunächst das Proteingemisch der zu untersuchenden Proben mittels

Gelelektrophorese nach Ladung und Größe aufgetrennt und anschließend auf eine Membran

transferiert. Durch das Aufbringen spezifischer Primär- und Sekundärantikörper auf die

Membran erfolgt der Proteinnachweis.

SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) dient der Auftrennung der Proteine

der eingesetzten Proben nach ihrer Größe und Ladung. Dazu wurde das Mini-PROTEAN 3-

Gelelektrophorese-System (BioRad) verwendet. Der Ausgangspunkt der Proteinauftrennung

ist die Überführung der Tertiär- und Sekundärstruktur der Proteine in die Primärstruktur durch

Erhitzung der Proben mit einem SDS-Überschuss auf 95 °C. Dadurch erfolgt die Aufspaltung

der Wasserstoffbrücken und Streckung der Moleküle. SDS als anionisches Detergenz

maskiert die Eigenladung der Proteine, wodurch Mizellen mit konstanter negativer Ladung

entstehen. Die Aufspaltung der Schwefelbrücken zwischen Cysteinen wurde durch die

Substitution von ß-Mercaptoethanol unterstützt. Basis für das Prinzip der SDS-PAGE ist das

Polyacrylamid-Gel, dessen Gelmatrix aus einem Trenngel und Sammelgel besteht und somit

eine diskontinuierliche Elektrophorese gewährleistet. Das weitporige Sammelgel als

Molekularsieb verhinderte die Aggregation der Proteine beim Eintritt in das Gel, während das

engporige Trenngel die Trennung der Proteine ermöglichte. Die variierenden Konzentrationen

des Trenngels (7,5; 10; 12; 15 %; siehe Tabelle 4) mit unterschiedlichem Anteil an Acrylamid

waren umgekehrt proportional zur untersuchten Proteingröße und bestimmten die


37

Trenneigenschaften des Gels. Durch die Wahl der richtigen Gelkonzentration sollte eine

optimale Bandenschärfe im untersuchten Molekulargewichtsbereich erreicht werden. Das

Trenngel-Gemisch wird mit Ammoniumpersulfat, einem Radikalstarter und TEMED, einem

Polymerisierungskatalysator, versetzt und zügig zwischen zwei abgedichtete, durch einen

Abstandhalter (Spacer) voneinander getrennte Glasplatten blasenfrei gegossen. Der Abstand

zwischen den Glasplatten, die sauber und fettfrei sein müssen, beträgt 1,5 mm. Das Trenngel

wurde nach oben hin mit dH2O überschichtet, welches zum einen eine Glättung der

Geloberfläche ermöglichte und zum anderen eine Störung der Gelpolymerisation durch den

Luftsauerstoff verhinderte. Nach Verfestigung des Gels wurde dH2O abgegossen und das

Sammelgel etwa einen Zentimeter hoch über das Trenngel pipettiert. Ein spezieller Kamm

wurde in das Sammelgel eingesteckt, um Taschen zu erhalten. Diese wurden anschließend mit

den Proben nach definierten Proteinmengen gefüllt. Eine Geltasche wurde mit dem

Längenstandard belegt. Nach Auffüllen der Elektrophorese-Apparatur mit Laufpuffer erfolgte

der Gellauf bei einer Anfangsspannung von 70 V im Sammelgel und 90-120 V (je nach

Gelkonzentration) im Trenngel.

Proteintransfer

Die aufgetrennten Proteine wurden mithilfe eines vertikalen Tank-Blot Systems (Mini Trans-

Blot) auf eine Nitrozellulose-Membran transferiert. Die Nitrozellulose-Membran wurde in

Methanol 100 % bei Raumtemperatur (RT) für eine Minute aktiviert. Anschließend wurden

das zu blottende Gel, die Membran und die Filterpapiere in Transferpuffer äquilibriert und

danach als Sandwich luftblasenfrei in eine Blotkassette gelegt. Die Kassette wurde in eine

Blotkammer (Mini Blot Transfer CellTM) mit eiskaltem Transferpuffer überführt und der

Transfer bei 350 mA für 1-2 Std. durchgeführt. Die Transferbedingungen mussten dabei auf

die Molekülgröße des gewünschten Proteins angepasst werden, da verschieden große Proteine

unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten aufzeigten.

Proteindetektion

Die geblottete Membran wurde nach dem Transfer kurz bei RT mit einer Pufferlösung

gewaschen und anschließend eine Stunde bei RT im Blocking-Puffer unspezifisch geblockt.

Der Nachweis der auf die Nitrocellulosemembran geblotteten Proteine erfolgte durch

Immunodetektion mit spezifischen Antikörpern. Die Inkubation mit dem entsprechenden

Primärantikörper (siehe Tabelle 6) und der Pufferlösung erfolgte in einer eingeschweißten

Folie bei 4 °C über Nacht. Am nächsten Tag wurde die Membran zunächst 5x10 Min. mit der

Pufferlösung gewaschen, um danach eine Stunde bei RT auf einem Schüttler mit


38

peroxidasegekoppeltem Sekundärantikörper (siehe Tabelle 6) inkubiert zu werden. Nach

erneutem Waschgang für 5x10 Min. mit der entsprechenden Pufferlösung erfolgte die

Proteindetektion mit dem Amersham ECLTM Western Blotting Detektion Reagents auf

Amersham HyperfilmTMECL, welcher mithilfe des Amersham Automatic Film-Prozessor

entwickelt wurde.

Wiederverwendung der Membran (Membran-Stripping)

Wenn verschiedene Proteine auf einer Membran sequenziell detektiert werden sollten, wurde

diese zunächst mit Pufferlösung gewaschen, danach in Stripping-Pufferlösung für 30 Min.

gestrippt. Nach erneutem Waschgang wurde die Membran für eine Stunde in Blockierlösung

5 % geschwenkt, bevor diese mit dem nächsten Primärantikörper inkubiert wurde.

2.5. Histochemische Methoden

2.5.1. Immunhistochemie

Das Prinzip der Immunhistochemie beruht auf der Affinität von Antikörpern zu einem

bestimmten Gewebeantigen als Antigen-Antikörper-Reaktion. Die immunhistochemischen

Techniken ermöglichen den hochspezifischen Nachweis von Proteinen und Strukturen, gegen

die Antikörper gebildet werden können. Mithilfe von markierten Antikörpern können diese

detektiert und somit sichtbar gemacht werden. Je nach Art und Lokalisation des zu

untersuchenden Proteins bzw. der Art und Beschaffenheit des zu untersuchenden Gewebes ist

die Wahl der richtigen Methode aus einer Vielzahl an Methoden der immunhistochemischen

Färbung zu treffen.

Das Ergebnis und die Qualität der Färbung sind von mehreren Variablen abhängig: Zum einen

beeinflussen die Fixierung des Materials, die Einbettungsmethode und die

Vorbehandlungsmethoden die Gewebequalität, zum anderen ist die Antigen-Antikörper-

Reaktion von der optimalen Temperatur, der Antikörperkonzentration und der Inkubationszeit

abhängig. Die Immunhistochemie wurde in dieser Arbeit an Paraffingewebeschnitten

durchgeführt.

Herstellung von Paraffinschnitten

Unmittelbar nach der Resektion der Mäuse werden die entnommenen Gewebeproben in 4 %

gepuffertem Paraformaldehyd über Nacht fixiert, um die Autolyse bzw. Heterolyse zu

verhindern. Am nächsten Tag wurde das Fixierungsmittel ausgewaschen und das

Gewebematerial in heißem Paraffinwachs getränkt, das bei Abkühlung erstarrt. Das Gewebe

erhielt dadurch Stabilität und eine gleichmäßige Konsistenz, was die Herstellung dünner und


39

gleichmäßiger Schnitte ermöglichte. Paraffinschnitte ließen sich mittels Schlittenmikrotomen

anfertigen. Die 3,5 µm dicken Gewebeschnitte wurden zunächst in ein Warmwasserbad

übertragen, in dem sie gestreckt und von Falten befreit wurden. Danach wurden sie auf

beschichtete Objektträger aufgezogen und über Nacht bei RT getrocknet. Zur Färbung wurden

die Schnitte zuerst in Xylol (dreimal fünf Minuten) entparaffiniert und dann durch eine

absteigende Alkoholreihe (jeweils drei Minuten in 100 %, 96 % und 76 % Alkohol) bis zum

dH2O hydratisiert. Die Vorbehandlung der Gewebeschnitte mit EDTA- oder mit Citrat-

Pufferlösung (Antigen Unmasking Solution) in der Mikrowelle für zehn Minuten diente der

Demaskierung der Antigene. Danach wurden die Schnitte 15 Min. bei RT abgekühlt, mit

dH2O und/ohne Waschpuffer gewaschen und anschließend zur Blockierung der endogenen

Peroxidaseaktivität 15 Min. in frisch angesetzter 3 % H2O2-Lösung inkubiert. Nach jedem

Schritt wurden die Gewebeschnitte mit dH2O und 3x5 Min. mit Waschpuffer (PBS bzw.

PBS/T oder TBS bzw. TBS/T) gewaschen. Die darauffolgende immunhistochemische

Färbung wurde nach der (Strept)Avidin-Biotin-Komplex-Methode (ABC-Methode)

durchgeführt.

Streptavidin-Biotin-Komplex-Methode

Die Streptavidin-Biotin-Methode als indirekte Nachweismethode nutzt die starke Affinität

von Avidin bzw. Streptavidin für Biotin zur Bildung von Komplexen aus enzymmarkierten

Avidin-Biotin-Komplexen mit biotinylierten Sekundärantikörpern. Dabei bindet das

Glykoprotein Avidin bzw. Streptavidin an den Sekundärantikörper. Bei der Färbung werden

nacheinander Primärantikörper (siehe Tabelle 5), biotinylierter Sekundärantikörper (siehe

Tabelle 5) und Avidin-Biotin-Enzymkomplex-Substrat-Chromogenlösung appliziert, wobei

die Meerrettichperoxidase am häufigsten als Enzym verwendet wird. Die Funktion der

Peroxidase liegt in der Elektronenübertragung von Chromogen DAB (3,3-Diaminobenzidin)

auf das zugegebene Substrat Wasserstoffperoxid, das dadurch zu Wasser reduziert wird. Im

Rahmen dieser Redoxreaktion fällt DAB zu einem unlöslichen, bräunlichen Endprodukt aus,

das eine signalverstärkende Wirkung hat.

2.5.2. Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.-Färbung)

Die H.E.-Färbung ist eine der Routinefärbemethoden in der Histologie und dient durch die

Anfärbung verschiedener Strukturen eines Gewebeschnittes der morphologischen

Untersuchung. Diese klassische Übersichtsfärbung wird typischerweise vor den

immunhistochemischen Färbungen durchgeführt und setzt sich aus zwei Einzelfärbungen

IV. ERGEBNISSE

40

zusammen, mithilfe derer physiologische aber pathologische Aspekte von Zellen,

Zellbestandteilen und Extrazellularmatrix untersucht werden können.

Hämatoxylin

Hämatoxylin ist ein Inhaltstoff aus dem Blauholzbaum und wird als natürlicher Farbstoff

verwendet. Die färbende Eigenschaft entwickelt das Hämatoxylin durch dessen Aufbereitung

zu Hämalaun. Hämalaun färbt saure bzw. basophile Strukturen wie Zellkerne mit der darin

enthaltenen DNA, Mitochondrien, das raue endoplasmatische Retikulum (rER),

Kollagenfasern und Elastin blau.

Eosin

Eosin ist ein synthetischer Farbstoff und färbt alle basischen (eosinophilen) bzw. azidophilen

Strukturen rot, insbesondere die Zytoplasmaproteine.

Die Färbung

Zur Färbung wurden zunächst die Paraffinschnitte (siehe 2.4.1.) 2x5 Min. in Histoclear

(Xylol) entparaffiniert und dann in einer absteigenden Alkoholreihe (2x100 %, 2x96 % und

2x76 %) bis zum dH2O hydratisiert. Die Gewebeschnitte wurden anschließend für 10 Min.

mit Hämalaun gefärbt. Nach der Hämalaun-Färbung erschienen die Zellkerne aufgrund des

niedrigen pH-Wertes der Färbelösung rötlich-braun. Der Farbton schlug sich nach Spülen der

Schnitte in laufendem Leitungswasser in blauviolett um. Danach erfolgte die Gegenfärbung

mit Eosin für 5 Min., das Waschen in 96 % Ethanol und Isopropanol für 25 Sek. Bevor die

Schnitte mit Pertex blasenfrei eingedeckt wurden, erfolgte die Behandlung mit Histoclear für

2x3 Min..

IV. ERGEBNISSE

41

IV. ERGEBNISSE

1. Pankreasspezifische Inaktivierung von Socs3 in der Maus

1.1. Generierung einer pankreasspezifisch Socs3-defizienten Mauslinie Socs3

Δpanc unter Anwendung des Cre/loxP-Rekombinationssystems

Socs3 scheint für die Karzinogenese vieler maligner Tumoren eine besondere Rolle zu spielen

(Ogata et al. 2006). Als negativer Regulator des Jak/Stat3-Signalweges ist dieses Molekül

bereits in verschiedenen Arbeiten beschrieben worden. Um die Bedeutung des Socs3-Proteins

in der pankreatischen Onkogenese zu evaluieren, generierten wir zunächst eine Mauslinie, die

eine pankreasspezifische Inaktivierung des Socs3-Gens und somit eine Socs3-Defizienz

aufweist. Davon ausgehend untersuchten wir in einem weiteren Schritt den Effekt der Socs3-

Deletion auf die PanIN-Entwicklung in KrasG12D-Tumormäusen.

Socs3 wird nach Zytokin-Rezeptor-Interaktion über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors

p-Stat3 durch Janus-Kinasen vermehrt exprimiert. Da wir eine Inaktivierung von Socs3 und

den daraus resultierenden Wegfall des negativen Feedback-Mechanismus auf den Jak/Stat3-

Signalkaskade nur in murinen Pankreasgewebszellen anstrebten, wurde das im Abschnitt

I.2.1. beschriebene Cre/loxP-Rekombinationssystem angewendet (siehe Abbildung 9).

Abbildung 9: Schematische Darstellung der Generierung der Socs3Δpanc-Mauslinie.

Nach Kreuzung der SocsF/F-Maus mit der Ptf1a-Cre

ex1-Maus entsteht die Socs3Δpanc-Mauslinie durch

Exzision des Exons 2 mithilfe der Cre-Rekombinase.

IV. ERGEBNISSE

42

Hierzu benötigten wir eine Socs3Flox/Flox(Socs3

F/F)-Mauslinie und eine Ptf1a-Cre-

Rekombinase exprimierende Maus Ptf1a-Creex1. Die gefloxte Socs3-Maus wurde uns von

Okada und Kollegen für die Untersuchungen zur Verfügung gestellt (Mori et al., 2004; Okada

et al., 2006). Diese genetisch modifizierte Maus besaß am Exon 2 beider Socs3-Allele

flankierende loxP-Sequenzen (Socs3F). Das Exon 2 kodiert für die Bindungsdomäne des

Soc3-Moleküls am gp130-Rezeptor. Nach anschließender Kreuzung der Socs3F/F-Maus mit

der unter I.2.2. bereits beschriebenen, von unserem Labor generierten Ptf1a-Creex1-Maus

gingen Nachkommen hervor, die eine Cre-Rekombinase-vermittelte Exzision des loxP-

markierten Exons 2 auf beiden Socs3-Allelen aufwiesen (siehe Abbildung 9). Das

benachbarte Exon 1 hingegen wurde nicht deletiert. Zum Nachweis des Knockouts haben wir

Exon 2 spezifische Primer eingesetzt und konnten eine deutlich reduzierte mRNA-

Konzentration in den Socs3Δpanc-Mäusen detektieren, während Exon 1 spezifische Primer

keinen Unterschied aufzeigten (vergleiche Abbildung 10).

Abbildung 10: Nachweis der Deletion von Exon 2 im Socs3-Gen mittels mRNA Konzentrationsbestimmung. *p < 0,005; n≥4.

Da die Cre-Rekombinase nur in Ptf1a-Promotor-positiven Zellen gebildet wird, erfolgt die

genetische Modifizierung der Socs3-kodierten Region spezifisch und ausschließlich nur in

pankreatischen Progenitorzellen, im exokrinen und in definierten Teilen des endokrinen

Pankreas. Durch die homozygote Gendeletion entsteht die neue konditionale Socs3-defiziente

Mauslinie Socs3F/F

;Ptf1a-Creex1 bzw. Socs3

Δpanc.

Durch die Inaktivierung des Socs3-Gens entfällt die Expression seiner Genprodukte. Dadurch

ist die endogene negative Feedback-Inhibition des Jak/Stat3-Signalweges durch Socs3

aufgehoben. Die gp130-Domäne, die im Rahmen der Hemmung von Socs3 gebunden wird,

steht für die Bindung und Aktivierung der an der Stat3-vermittelten Signaltransduktion

beteiligten Proteine zur Verfügung. Diese beeinflussen wiederum als intranukleäre Initiatoren

IV. ERGEBNISSE

43

die Transkription bestimmter Zielgene und steuern somit Prozesse der Proliferation,

Apoptosis und Inflammation.

Um den Effekt der Ptf1a-Cre-assoziierten DNA-Mutation im Bereich des Socs3-Lokus zu

evaluieren, wurde der Genotyp der aus der Kreuzung von Socs3F/F- und Ptf1a-Cre

ex1-Mäusen

hervorgehenden Nachkommen mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) bestimmt. Das hierfür

benötigte genetische Material gewannen wir aus der Schwanzspitze der Mäuse. Anschließend

führten wir die PCR wie unter II.2.2. beschrieben durch. Dabei verwendeten wir die Socs3-

Primer A und B, die eine Abgrenzung des Wildtyp-Allels von am Exon 2 gefloxtem Socs3-

Allel ermöglichten. Zusätzlich dienten zwei Primer Cre487 und p48as1642 dem Nachweis des

Ptf1a-Cre-Transgens auf der DNA (vergleiche Tabelle 8).

Die PCR-Ergebnisse in der Abbildung 9 zeigen bezüglich des Genotyps drei mögliche

Kombinationen, wobei alle Nachkommen homozygot für das Ptf1a-Cre-Transgen sind.

Socs3+/+

;Ptf1a-Creex1-Mäuse weisen eine deutliche Bande für das Socs3-Wildtyp-Allel auf,

d.h. sie zeigen keine mutative Veränderung im Bereich dieses Genlokus und sind deshalb

homozygot für das entsprechende Allel. Anders besitzen Socs3+/Δ

;Ptf1a-Creex1-Mäuse ein

Allel entsprechend dem Wildtyp-Genotyp und ein loxP-flankiertes Exon 2 auf dem zweiten

Allel. Die für uns relevante und interessante Kombination waren die auch als Socs3Δ/Δ

;Ptf1a-

Creex1

bzw. Socs3Δpanc bezeichneten Mäuse. Die pankreasspezifische Cre-Rekombinase-

vermittelte, homozygote Deletion des Exons 2 auf beiden Allelen des Socs3-Gens lässt sich

nur in diesen Mäusen initiieren, sodass diese die Grundlage unserer weiteren Untersuchungen

darstellen.

Abbildung 11: PCR-Analysen der möglichen Genotypen aus der Kreuzung von Socs3

F/F-und Ptf1a-Cre

ex1-Mäusen. loxP=gefloxtes Allel; wt=Wildtyp-Allel.

IV. ERGEBNISSE

44

1.2. Morphologische Charakterisierung des exokrinen und endokrinen Pankreaskompartiments von Soc3

Δpanc-Mäusen

Nach dem molekulargenetischen Nachweis der homozygoten Socs3-Deletion in Socs3Δpanc-

Mäusen mittels PCR interessierte uns die Auswirkung dieser Cre-Rekombinase vermittelten

DNA-Mutation auf die Morphologie und die physiologische Funktionalität des exokrinen und

endokrinen Pankreaskompartiments. Hierzu fertigten wir Paraffin-Schnitte aus isolierten

Pankreata von vier Wochen alten Socs3F/F-und Socs3

Δpanc-Mäusen an.

Die H.E.-Färbung der Schnitte diente zur anatomischen Abgrenzung und Differenzierung der

unterschiedlichen Gewebekomponente. Um relevante Proteine zu detektieren, setzten wir die

Technik der Immunhistochemie ein (siehe Abbildung 12).

Abbildung 12: Charakterisierung des exokrinen und endokrinen Pankreaskompartiments. Morphologische und immunhistochemische Analysen des Pankreas vier Wochen alter Socs3

F/F- und Socs3

Δpanc-Mäuse. IS=Langerhans-Inseln; Schwarze Pfeile stellen normale Pankreasgänge dar. (100-fache Vergrößerung)

IV. ERGEBNISSE

45

Die in Abbildung 12 veranschaulichte H.E.-Übersichtsfärbung verdeutlicht, dass es keinen

Unterschied in der Pankreasmorphologie zwischen der Socs3Δpanc-Maus und der Socs3

F/F-

Kontrollmaus besteht. In beiden Darstellungen erkennen wir die Pankreas-typische

Gewebestruktur zusammengesetzt aus Lobuli, welche von Bindegewebssepten voneinander

abgegrenzt sind. Da dieses Organ hauptsächlich aus serös-exokrinen Drüsen besteht, ist in

beiden Schnittpräparaten eine große Dichte an basophilen Azinuszellen und hellen

zentroazinären Zellen deutlich erkennbar. Zwischen den Läppchen verlaufen

Ausführungsgänge, die sich im Ductus pancreaticus vereinigen. Vereinzelt erkennt man

scharf abgrenzbare Langerhans-Inseln, welche die endokrine Funktion des Organs erfüllen.

Aus diesem unauffälligen Befund beider Präparate lässt sich schließen, dass die homozygote

Socs3-Deletion in der Socs3Δpanc-Linie die Morphologie des exokrinen und endokrinen

Pankreaskompartiments nicht beeinträchtigt.

Zur Evaluation der Funktion der endokrinen Zellgruppen detektierten wir mittels

immunhistochemischer Färbung Insulin und Glucagon unter Nutzung der Spezifität

markierter Primärantikörper. Auch hier konnten wir keinen Unterschied in der

Hormonproduktion feststellen. Es lassen sich im Vergleich bei beiden Mauslinien sowohl

Insulin, welches von den zentral liegenden dominierenden β-Zellen produziert wird, als auch

Glucagon, das von den randständig lokalisierten α-Zellen sezerniert wird, nachweisen. Somit

bleibt die endokrine Funktion der Langerhans-Inselzellen von der Socs3-Mutation

unbeeinflusst.

Zusätzlich hatten wir das Pankreasgewebe beider exemplarisch dargestellten Tiere

immunhistochemisch nach Cytokeratin-19 (CK-19) detektiert. CK-19 ist ein zytoskelettales

Protein, welches von einschichtigem Epithel und luminalen Drüsenzellen zur Stabilisierung

und Formgebung produziert wird. Hierbei zeigen sich sowohl bei der Socs3Δpanc-Maus als

auch der Kontrollmaus Socs3F/F eine annähernd gleiche CK-19 Expression.

Desweiteren interessierte uns die Gewichtsentwicklung der Tiere aus beiden Mauslinien.

Hierzu ermittelten wir ab der dritten bis ca. 20. Lebenswoche wöchentlich das Gewicht von

zehn Socs3-Knockoutmäusen und 15 SocsF/F-Mäusen. Die gemessenen Gewichte wurden

tabellarisch aufgelistet, der Mittelwert und die Standardabweichung daraus berechnet und in

Abbildung 13 graphisch dargestellt. Auch hier konnten wir keine gravierenden Unterschiede

zwischen den Knockout- und den Kontrollmäusen feststellen. Zwar zeigen die Socs3Δpanc-

Tiere in der Verlaufsbeobachtung gegenüber gleichaltrigen Vergleichstieren leicht höhere

Mittelwerte, diese gleichen sich aber ab der 18. Lebenswoche den Werten der SocsF/F-Mäuse

an und bleiben im Verlauf konstant.

IV. ERGEBNISSE

46

Abbildung 13: Gewichtsanalyse der Socs3Δpanc- und Socs3

F/F-Nachkommen.

Beide Mauslinien zeigen ein etwa annähernd gleiches Gewicht; p < 0,05.

Aus den bisherigen Ergebnissen kann schlussfolgernd festgestellt werden, dass die Socs3-

Defizienz weder einen Einfluss auf die Entwicklung des exokrinen und endokrinen Pankreas

hat noch die Gewichtsentwicklung der Socs3-Knockoutmäuse beeinträchtigt. Somit stellt die

SocsΔpanc-Mauslinie die Grundlage für gentechnologisch basierte Analyse der Inaktivierung

des Inhibitorproteins Socs3 in der pankreatischen Onkogenese dar.

2. Nachweis der Aktivierung des Stat3/Socs3-Signalweges im KrasG12D-

Mausmodell

2.1. Nachweis der pankreatischen Aktivierung von p-Stat3 im KrasG12D-

Mausmodell

Über die Beteiligung von Stat3 an der Pankreaskarzinogenese des Menschen ist bereits in

einigen Arbeiten beschrieben worden. Sämtliche Untersuchungen an humanen

Karzinomresektaten und Pankreaskarzinomzelllinien zeigen hohe Konzentrationen am

Tyrosinrest 705 phosphorylierter und somit aktivierter Stat3-Moleküle. Jedoch sind die

genauen Mechanismen des Stat3-Signalweges in der pankreatischen Onkogenese bisher

unbekannt. Um die Bedeutung von Stat3 in der Initiierung und Progression KrasG12D-

induzierter PanIN-Läsionen zu evaluieren, generierten wir zunächst die KrasG12D-Mauslinie.

Hierfür kreuzten wir die von der Arbeitsgruppe um Tuveson uns zur Verfügung gestellten

LSL-KrasG12D-Mäuse (Jackson et al., 2001) mit der von uns gentechnisch veränderten Ptf1a-

Creex1-Mauslinie. Die daraus hervorgehenden Kras

G12D-Nachkommen zeigten alle drei PanIN-

Stufen, die sich nach einer Latenzzeit zu invasiven, metastatischen duktalen

Adenokarzinomen entwickelten. Im nächsten Schritt untersuchten wir die Aktivierung des

IV. ERGEBNISSE

47

Stat3-Signalweges in den Pankreata dieser Tumormodellmäuse. Mittels der unter II.2.3.

beschriebenen Western Blot-Methode wiesen wir die Expression von Stat3-Molekülen nach,

die dann durch Phosphorylierung am Tyrosin 705 zu p-Stat3 aktiviert werden. In der

Abbildung 14 sind die Ergebnisse dargestellt.

Der Nachweis von Stat3 bzw. p-Stat3 in den präneoplastischen Läsionen des Pankreas führt

zu der Hypothese, dass Stat3 an der pankreatischen Onkogenese im KrasG12D-Mausmodell

beteiligt sein könnte.

Abbildung 14: Proteinbiochemischer Nachweis der Expression von Stat3 und p-Stat3 in Pankreata neun Wochen alter Kras

G12D-Mäuse.

2.2. Expression des Stat3-abhängigen endogenen Inhibitors Socs3 im Kras

G12D-Mausmodell

Nachdem wir die Stat3-Expression und dessen Phosphorylierung zu p-Stat3 in der KrasG12D-

Maus mittels Western Blot analysiert haben, überprüften wir anschließend die Aktivierung

von Socs3. Das Socs3-Gen mit Stat3-responsiven Elementen in ihren Promotoren gehört zu

den Zielgenen dieser Moleküle. Das Genprodukt Socs3 reguliert in einer negativen

Rückkopplung (negatives feedback) die Stat3-Signalvermittlung und verhindert somit eine

konstitutive Aktivierung der Signalkaskade.

Durch Bindung der Stat3-Dimeren an die vorgeschaltete Promotorregion kommt es zur

Induktion der Socs3-Transkription und zur Bildung der mRNA, einer einsträngigen messenger

Ribonukleinsäure, die als Matrize der Proteinbiosynthese dient. Konsequenterweise führt die

vermehrte Stat3-Aktivierung in der KrasG12D-Tumormauslinie zu einer erhöhten

Transkriptionsfrequenz des Socs3-Genlokus mit gesteigerter Synthese der mRNA. Abbildung

15 veranschaulicht die von uns mittels quantitativer Real-Time-PCR (quantitative Echtzeit-

PCR) gemessene relative Socs3-mRNA in Pankreata von KrasG12D-Mäusen im Vergleich zu

den Kontroll-LSL-KrasG12D-Tieren, bei denen die vorgeschaltete gefloxte STOP-Kassette die

Transkription des onkogenen Kras verhindert.

IV. ERGEBNISSE

48

Abbildung 15: Quantitative Real-Time-PCR Analysen der vermehrten Expression von Socs3-mRNA in neun Wochen alten Kras

G12D-Mäusen. Mittelwert ± Standardabweichung (n ≥ 5), *p < 0.005

Die Ergebnisse zeigen für die Mauslinie KrasG12D eine deutlich erhöhte mRNA-Expression

des endogenen Inhibitors Socs3 gegenüber der der Kontrolltiere. Konsequenterweise führt die

gesteigerte mRNA-Bildung zu einer verstärkten Socs3-Proteinbiosynthese an den Ribosomen.

Im Folgenden überprüften wir die Expression von Socs3 in der KrasG12D-Mauslinie auf

histochemischer Ebene. Wie Abbildung 16 demonstriert, konnten wir immunhistochemisch

mithilfe eines gegen Socs3 gerichteten Primärantikörpers dessen vermehrte Bildung in Azini-

Zellen und PanIN-Läsionen neun Wochen alter KrasG12D-Mäuse nachweisen. Somit legt die

starke Induktion des endogenen Inhibitors eine regulierende Funktion des Socs3 in der

pankreatischen Onkogenese nahe.

Abbildung 16: Immunhistochemische Detektion von Socs3 in Zellen der Azini (schwarze Pfeile) und in den PanIN-Läsionen (weiße Pfeile) neun Wochen alter Kras

G12D-Mäuse.

IV. ERGEBNISSE

49

2.3. Aktivierung der an der Jak2/Stat3-Signaltransduktion beteiligten Proteine in Kras

G12D-Mäusen

Neben der Induktion des endogenen Inhibitors Socs3 regulieren phosphorylierte Stat3-Dimere

intranukleär die Transkription bestimmter Gene, die an der Steuerung von Proliferation,

Wachstum, Apoptose und Inflammation beteiligt sind. Der Nachweis der exprimierten

Genprodukte lässt auf die Aktivierung des Jak2/Stat3-Signaltransduktionsweges

rückschließen. Hierzu setzen wir erneut die Methode der Immunhistochemie ein und

detektieren die relevanten Proteine. Das zu färbende Pankreasgewebe stammte von 13

Wochen alten KrasG12D-Mäusen und offenbart histologisch PanIN-Vorläuferläsionen (siehe

Abbildung 17). Charakteristisch für die pankreatischen intraepithelialen Neoplasien in diesem

Wochenalter ist die Zunahme der Anzahl der Ausführungsgänge, eine Verlängerung des

epithelialen Zellkörpers der Ducti und eine erhöhte zytoplasmatische Muzinproduktion. Hinzu

geht das normalerweise flach dominierende Ausführungsgang-Epithel in ein papilläres

Wachstumsmuster über. Diese auf Abbildung 17 aufgeführten Eigenschaften weisen auf

PanIN-Stufen 1A bis 1B hin, die zusätzlich ein umgebendes desmoplasmatisches Stroma

aufweisen. Sowohl in den Azinuszellen als auch in den Pankreasgangzellen innerhalb der

PanIN-Läsionen lässt sich das phosphorylierte Jak2-Protein (p-Jak2) nachweisen. Das aktive

p-Jak2 phosphoryliert das Stat3-Monomer am Tyrosinrest Y705 zu p-Stat3 (Babon et al.,

2006). Dementsprechend konnten wir, wie Abbildung 17 veranschaulicht, sowohl in den

Azini als auch in den duktalen Zellen eine erhöhte p-Stat3-Konzentration detektieren.

Darüber hinaus ist es uns gelungen, die Expression Stat3-abhängiger Proteine in den

präneoplastischen Läsionen und in den Azinuszellen 13 Wochen alter KrasG12D-Mäuse zu

demonstrieren. Hierzu zählen Cyclin D1, Survivin, die antiapoptisch wirkenden und zur

Proteinfamilie der Bcl-2 (B-cell lymphoma-2) gehörigen Mitglieder Mcl-1 (Myloid cell

lymphoma-1) und Bcl-XL. Zusätzlich ließen sich andere Moleküle bei unseren

immunhistochemischen Untersuchungen detektieren, wie die Matrix Metalloproteinase-2

(MMP-2), welche im Abbau der extrazellulären Matrix involviert ist und somit für den

Prozess der Metastasierung eine entscheidende Rolle spielt und das proinflammatorische

Protein Cox-2 (Cyclooxygenase-2). Auch die Expression des von uns nachgewiesenen

Hitzeschockproteins-70 (heat shock protein 70, HSP-70) ist Stat3-abhängig und wird durch

dessen Aktivierung gesteigert. HSP-70 stabilisiert in Situationen des zellulären Stresses

andere Eiweißstrukturen, um diese vor Denaturierung und Abbau zu schützen. Andererseits

unterstützt HSP-70 die proteasomale Degradation funktionsunfähiger Proteinmoleküle.

IV. ERGEBNISSE

50

Somit können wir in unseren bisherigen Untersuchungen p-Stat3, des diesem Molekül

vorgeschalteten p-Jak2 und die gesteigerte Expression diverser Stat3-abhängiger, in den

Jak2/Stat3-Signalweg involvierter Proteine nachweisen. Diese Veränderungen sind sowohl in

den PanINs als auch in den Zellen der Azini vorzufinden. Desweiteren belegen unsere

Versuche erstmalig den Nachweis der starken Induktion des endogenen Inhibitors Socs3 in

Azinuszellen und duktalen Zellen der Vorläuferläsionen im Rahmen der Stat3-Signalkaskade.

Diese Ergebnisse legen eine regulierende inhibierende Funktion von Socs3 in der

pankreatischen Onkogenese nahe. Die folgenden Experimente fokussieren auf die

Auswirkung der homozygoten Socs3-Deletion auf die Stat3-Signaltransduktion. Ziel ist es

herauszufinden, inwiefern diese Socs3-Mutation die Aktivierung von Stat3 und die

Expression Stat3-assoziierter Proteine beeinflusst und welche Konsequenz diese

molekulargenetische Veränderung auf die KrasG12D-vermittelte Tumorinitiierung und -

progression hat.

Abbildung 17: Aktivierung der Stat3-Signalkaskade im Kras

G12D-Mausmodell. Immunhistochemische Untersuchung der Expression von p-Stat3, p-Jak2 und Stat3-abhängigen Proteinen in Azinuszellen und PanINs 13 Wochen alter Kras

G12D-Mäuse. Schwarze Sterne stellen Azini dar; schwarze Pfeile kennzeichnen PanIN-Läsionen (200-fache Vergrößerung).

IV. ERGEBNISSE

51

3. Homozygote Socs3-Deletion führt zu einer konstitutiven Aktivierung des Stat3-Signalweges im Kras

G12D-Mausmodell

3.1. Generierung der pankreasspezifisch Socs3-defizienten Tumormodellmaus Kras

G12D;Socs3Δpanc

Um der Bedeutung von Socs3 auf die KrasG12D-vermittelte Tumorinitiierung und -progression

genauer nachzugehen, generierten wir zunächst eine Socs3-defiziente KrasG12D-Mauslinie.

Hierzu benötigten wir erneut zwei Mauslinien: die bereits unter I.2.2. beschriebene LSL-

KrasG12D;Ptf1a-Cre

ex1 (KrasG12D)-Tumormaus und die unter III.1.1. charakterisierte

Socs3F/F

;Ptf1a-Creex1 (Socs3

Δpanc)-Mauslinie. Nachdem wir beide Mauslinien miteinander

gekreuzt haben, gingen Nachkommen hervor, die einen Genotyp LSL-KrasG12D

;Socs3F/F

;

Ptf1a-Creex1 aufwiesen. Diese neu entstandene auch als Kras

G12D;Socs3

Δpanc bezeichnete

Tumormauslinie besaß sowohl das aktive pankreasspezifische Onkogen KrasG12D, welches die

Entwicklung und Progression der PanINs förderte, als auch die Ptf1a-Cre-vermittelte

homozygote Deletion des Exons 2 des Socs3-Gens, die zu einer fehlenden Expression von

Socs3 führte. Somit haben wir mit der Etablierung des neuen KrasG12D

;Socs3Δpanc-

Tumormausmodells die Basis für die daran anschließenden Versuche geschaffen. Hierin galt

es die Charakteristika der von uns generierten KrasG12D

;Socs3Δpanc-Maus mit den der nicht

Socs3-defizienten KrasG12D-Kontrollmaus zu vergleichen und so die Bedeutung bzw. die

Relevanz des Inhibitorproteins Socs3 auf die KrasG12D-vermittelte Entwicklung

pankreatischer präneoplastischer Läsionen und die Stat3-Phosphorylierung zu untersuchen.

3.2. Proteinbiochemische und morphologische Charakterisierung von Kras

G12D;Socs3

Δpanc-Mäusen

3.2.1. Proteinbiochemischer Nachweis verstärkter Stat3-Phosphorylierung und Expression Stat3-abhängiger Proteine

Der Tyrosinrest 759 an der zytosolischen gp130-Untereinheit stellt im phosphorylierten

Zustand die Andockstelle für die Stat3-Monomere und Socs3-Moleküle dar. Gebunden an

diesem aktiven Phosphotyrosin werden die Stat3-Proteine anschließend Jak2-vermittelt am

Tyrosin 705 zu p-Stat3 umgewandelt. Das phosphorylierte Tyrosin 759 ist zugleich

Bindungsort von dem endogenen Inhibitor Socs3, an dem dieser den inhibierenden Feedback-

Mechanismus auf den Stat3-Signaltransduktionsweg ausübt (Lang et al., 2000).

Ausgehend von diesen Vorkenntnissen untersuchten wir im folgenden Schritt die Auswirkung

der pankreasspezifischen Socs3-Defizienz auf die Induktion von p-Stat3 und den Stat3-

abhängigen Proteinen in KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäusen. Hierzu verglichen wir die Western

IV. ERGEBNISSE

52

Blot-Analysen der Socs3-defizienten KrasG12D-Maus mit den der Kras

G12D-Kontrollmaus. Die

von uns im Rahmen der Experimente verwendeten Antikörper sind in Tabelle 7 aufgelistet.

Zunächst überprüften wir proteinbiochemisch die Expression von Stat3, p-Stat3 und p-Jak2 in

beiden Mauslinien. Wie Abbildung 18 demonstriert, exprimieren sowohl vier Wochen alte

KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäuse als auch gleich alte Kras

G12D-Kontrolltiere Stat3 und p-Stat3.

Jedoch weist das Pankreasgewebe der KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäuse eine frühzeitige und

prolongierte Stat3-Phosphorylierung auf, was an dem hohen Proteinlevel von p-Stat3 zu

erkennen ist. Auch die Phosphorylierung der dem Stat3-Molekül vorgeschalteten Jak2 ist

ebenso frühzeitig nachweisbar.

Desweiteren interessierte uns die Auswirkung der Socs3-Defizienz auf die Expression Stat3-

abhängiger Proteine. Wie die Western Blot-Analysen in der Abbildung 18 veranschaulichen,

führt die frühzeitige und prolongierte Aktivierung von p-Stat3 ebenfalls zu einer gesteigerten

Expression diverser Stat3-Zielproteine in den exemplarisch dargestellten vier Wochen alten

KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäusen im Vergleich zu den Kras

G12D-Kontrolltumormäusen. Für Bcl-

XL, Mcl-1, Cox-2, HSP-70 und Cyclin D1 weisen die Socs3-deletierten KrasG12D-Mäuse ein

höheres Proteinlevel auf. ß-actin wurde hier als Ladekontrolle eingesetzt.

A B

Abbildung 18: Proteinbiochemischer Nachweis der Socs3-Defizienz in Kras

G12D;Socs3

Δpanc-Mäusen. A: Nachweis der frühzeitigen und prolongierten Stat3-Phosphorylierung im Pankreasgewebe vier Wochen alter Socs3-defizienter Kras

G12D-Mäuse. B: Verstärkte Expression Stat3-abhängiger Proteine in Western Blot-Analysen vier Wochen alter Kras

G12D;Socs3

Δpanc-Mäuse.

IV. ERGEBNISSE

53

3.2.2. Konstitutive Aktivierung des onkogenen K-Ras-Proteins in Kras

G12D;Socs3

Δpanc-Mäusen

Das G-Protein K-Ras bindet im aktiven Zustand Guanosintriphosphat (GTP). Durch die

intrinsische Hydrolyseaktivität wird das GTP-gebundene K-Ras bei Terminierung des

Ligandensignals in die inaktive GDP-assoziierte Form umgewandelt. Bei der KrasG12D-

Mutation liegt eine ungenügende Überführung von GTP-korreliertem K-Ras in die inaktive

GDP-gebundene Konfiguration, wodurch eine konstitutive, wachstumsfördernde K-Ras-

Proteinaktivität entsteht (Shibata et al., 1990). Da in den Socs3-defizienten KrasG12D-Mäusen

sowohl eine KrasG12D-Mutation als auch eine Socs3-Deletion vorliegt, überprüften wir

mithilfe des Ras-Aktivierungsassays mit dem Ras Activation Assay Kit, ob die Inaktivierung

von Socs3 einen Einfluss auf die Ausprägung der G12D-Mutation ausübt. Das Prinzip dieser

eingesetzten Methode beruht auf der hochspezifischen Bindung der Ras-bindenden Domäne

(RBD) des im Kit enthaltenen Proteins Raf-1 (Ras effector kinase) an aktives GTP-

korreliertes Ras-Protein. Nach Herstellung der Proteinlysate aus Pankreasgewebe beider

Mauslinien wurden diese jeweils mit dem Raf-1 RBD Agarose enthaltenden Reaktionsreagenz

versetzt. Anschließend ließ sich der entstandene Raf-RBD/GTP-Ras Komplex im Western

Blot mit einem konjugierten Ras-spezifischen Sekundärantikörper detektieren. Die Western

Blot-Ergebnisse des durchgeführten Ras Pull-Down Assays in der Abbildung 19 zeigen für

beide vier Wochen alte KrasG12D- und Kras

G12D;Socs3

Δpanc-Mauslinien eine annähernd gleich

starke Expression von RBD- und damit von GTP-assoziiertem Ras-Protein im Pankreas. Aus

unseren gewonnenen Daten kann demnach geschlossen werden, dass die pankreasspezifische

Inaktivierung des Socs3-Gens keinen Einfluss auf die Ras-Aktivität bzw. auf die Expression

des konstitutiv aktiven K-Ras-Proteins ausübt. Beide genetische Veränderungen existieren

nebeneinander und scheinen synergistisch die Progression von pankreatischen

intraepithelialen Neoplasien zum duktalen Adenokarzinom zu verstärken.

Abbildung 19: Nachweis der Expression konstitutiv aktiver K-Ras-Proteine. In beiden Mauslinien liegt eine unveränderte Aktivierung des onkogenen K-Ras-Proteins vor.

IV. ERGEBNISSE

54

3.2.3. Gewichts- und Pankreasanalyse bei KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäusen

Um die Auswirkung der Socs3-Deletion auf die Entwicklung duktaler Adenokarzinome des

Pankreas in KrasG12D-Tumormäusen rechtzeitig feststellen zu können, überwachten wir sieben

KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäuse ungefähr sechs Monate. In diesem Beobachtungszeitraum

analysierten wir regelmäßig das Gewicht, das Wohlbefinden, Krankheitsentwicklung und –

verlauf der Tiere. Einige Mäuse wurden aufgrund fortgeschrittenen Krankheitszustandes mit

starkem Gewichtsverlust, ausgedehntem Aszites, Ikterus und palpabler abdominaler

Tumormasse der weiteren Untersuchung geopfert oder schieden durch Tod aus der

Beobachtung aus.

Wie Abbildung 20 und 21 veranschaulichen, wiesen sechs Wochen alte Socs3-defiziente

KrasG12D-Mäuse im Vergleich zum gleichaltrigen Wildtyp und zu den Kras

G12D-Mäusen ein

signifikant niedrigeres Gewicht auf. Das Endgewicht dieser Tiere lag mit etwa 18 g deutlich

unter dem des Wildtyps bzw. der KrasG12D-Kontrollmäuse, während das Körpergewicht der

beiden letzteren sich meist auf dem gleichen Level bewegten und minimale Unterschiede

aufwiesen.

Abbildung 20: Gewichtsanalyse sechs Wochen alter KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäuse (n=7) im

Vergleich zu gleichaltrigen KrasG12D-Kontrollmäusen (n=7) und zum Wildtyp (n=17). *p > 0,05;

**p < 0,0005; ***p < 0,0005.

Bei der Resektion wurden die Pankreata 13 Wochen alter KrasG12D-Tumormäuse und

KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäuse isoliert und auf Hinweise bezüglich der Entwicklung

pankreatischer Neoplasien makroskopisch analysiert. Dabei verglichen wir die entnommenen

Bauchspeicheldrüsen der geopferten KrasG12D-, Kras

G12D;Socs3

Δpanc-Tiere und des Wildtyps

miteinander bezüglich Größe, makroskopisch sichtbare Veränderungen und

IV. ERGEBNISSE

55

Gewebebeschaffenheit. Die Abbildung 21 demonstriert ein im Vergleich zum Wildtyp stark

vergrößertes Pankreas der KrasG12D-Tumormaus. Zusätzlich lassen sich Lobulierungen und

Indurationen im Organgewebe nachweisen.

Die zusätzliche Socs3-Defizienz in KrasG12D-Tumormäusen bewirkt jedoch eine starke

Abnahme des Organgewichts (siehe Abbildung 21).

Abbildung 21: Analyse des makroskopischen Pankreasaspekts. Größe, Form und Konsistenz der Pankreata 13 Wochen alter Kras

G12D; Socs3

Δpanc-Mäuse und KrasG12D-Kontrollmäuse im Vergleich

zum Wildtyp. Zum Größenvergleich ist aus jeder Mauslinie ein Tier exemplarisch dargestellt.

Abbildung 21 demonstriert ein im Vergleich zum Wildtyp bis auf ein Fünftel der Organmasse

geschrumpfte Bauchspeicheldrüse mit diffus nodulärer und lobulierter Parenchymstruktur.

Die ausgedehnte Fibrosierung des sonst weichen Gewebes lässt das Organ derb, knotig und

formlos erscheinen. Diese makroskopisch sichtbaren Veränderungen an den Pankreata der

von uns generierten KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mauslinie deuten auf vorhandene präneoplastische

und/oder neoplastische Prozesse hin, die sich scheinbar in weiter fortgeschrittenen Stadien

befinden als die der gleichaltrigen Mäuse mit singulärer KrasG12D-Mutation.

Im Beobachtungszeitraum von sechs Monaten entwickelten 28,57% (2/7) der

KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäuse ein Pankreasadenokarzinom, während in der Kras

G12D-Kohorte

keine Karzinomentwicklung zu beobachten war. Die Tumorlatenz von etwa 63 Tagen bei den

KrasG12D

;Socs3Δpanc-Versuchstieren war somit geringer im Vergleich zu den Kras

G12D-

Kontrolltieren.

Aus unseren bisher gewonnen Daten können wir damit annehmen, dass die

pankreasspezifische Deletion des Socs3-Gens und die dadurch aufgehobene negative

Rückkopplung auf den Stat3-Signalweg einen maßgeblichen Effekt auf die Tumorprogression

in der KrasG12D-induzierten pankreatischen Onkogenese haben könnte. Die im Folgenden

durchgeführten Experimente sollen unsere angenommene Hypothese belegen.

IV. ERGEBNISSE

56

4. Einfluss der Inaktivierung des endogenen Inhibitorproteins Socs3 auf die PanIN-Progression im Kras

G12D-Mausmodell

4.1. Beschleunigung der PanIN-Progression in KrasG12D


4.1.1. Morphologische und quantitative Charakterisierung der PanIN-Läsionen

In der vergleichenden Analyse der PanIN-Entwicklung in Pankreata von KrasG12D- und

KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäusen im folgenden Abschnitt möchten wir den Einfluss der aus der

Inaktivierung des Inbibitorproteins Socs3 fehlenden Hemmung des Stat3-Signalweges auf die

alterskorrelierte PanIN-Progression in Socs3-defizienten KrasG12D-Mäusen näher beleuchten.

Zunächst untersuchten wir anhand H.E.-gefärbter Gewebefeinschnitte vier, neun, 13 und 18

Wochen alter KrasG12D-Kontrollmäuse und Kras

G12D;Socs3

Δpanc-Mäuse die

Pankreasmorphologie im Vergleich. Die Ergebnisse dieser Übersichtsfärbung sind in zehn-

und 100-facher Vergrößerung in der Abbildung 22 dargestellt.

IV. ERGEBNISSE

57

Abbildung 22: Morphologische Charakterisierung der PanINs und des PDA. H.E.-Übersichtsfärbungen der Pankreasgewebefeinschnitte vier, neun, 13 und 18 Wochen alter Tiere bei zehn- und 100-facher Vergrößerung. Schwarze Pfeile kennzeichnen PanIN-Läsionen; der weiße Pfeil hebt einen reaktiven Ausführungsgang hervor; der weiße Stern markiert regelrechte Azini; der schwarze Stern kennzeichnet das PDA.

KrasG12D-Tumormodellmäuse weisen zum Zeitpunkt von vier Wochen ein nahezu

unauffälliges Pankreas auf. Zwischen den normal konfigurierten Azini sind die

Ausführungsgänge schmal und selten sichtbar. Vereinzelt können wir reaktive

Ausführungsgänge und PanIN-1-Läsionen darstellen. Die Lobuli werden von unauffälligen

Bindegewebssepten separiert, die keine Entzündungszellen enthalten. Das Pankreas der neun

Wochen alten Tiere offenbart bereits bei zehnfacher Vergrößerung suspekte Areale, die diffus

im ganzen Organ lokalisiert vorliegen. Diese weißen Salzkorn-artige Läsionen lassen die

betroffene Bauchspeicheldrüse durchlöchert erscheinen. Bei höherer Vergrößerung eines

betroffenen Bereiches erkennen wir eine zunehmende Anzahl reaktiver Gangstrukturen und

früher Stadien von PanIN-Läsionen. Die jetzt zwischen den basophilen Azinuzellen deutlich

sichtbaren Ausführungsgänge mit stark eosinophilen duktalen Zellen sind erweitert und

treiben die Lobuli auseinander. Die zunehmende Anzahl histologisch erkennbarer Ducti mit

IV. ERGEBNISSE

58

Formanomalie lässt auf einen neoplastischen duktalen Prozess hindeuten. Zudem weist das

vermehrte desmoplastische Stroma auf eine verstärkte Entzündungsreaktion mit fibrotischer

Begleitreaktion hin. Mit zunehmendem Alter nimmt sowohl die Dichte als auch die Schwere

der PanIN-Läsionen zu. Die zehnfache Vergrößerung des Pankreas der 13 Wochen alten

KrasG12D-Kontrollmaus veranschaulicht, dass in diesem Stadium ein dominierender Organteil

von den PanINs eingenommen ist und die zunehmende Ausdehnung dieser eine Verdrängung

der exokrinen Azini bedeutet. Bei 100-facher Vergrößerung erkennen wir im Vergleich zur

neun Wochen alten Maus Areale mit übermäßig dilatierten Gangstrukturen, die statt dem

normal flachen Epithel ein papilläres Wachstumsmuster offenbaren. Zusätzlich bewirkt die

raumfordernde Expansion des umgebenden desmoplastischen Stromas ein Auseinanderdriften

der Azini. Um die 18. Lebenswoche zeigt die 10-fach vergrößerte Pankreasaufnahme der

Mäuse mit KrasG12D-Mutation eine weitere Progression der PanIN-Dichte und des

Schweregrades der Neoplasien. Wie Abbildung 22 verdeutlicht, erstrecken sich

präneoplastische Läsionen und das Stroma über fast das ganze Organ mit daraus

resultierendem deutlichem Rückgang der Azinuszellen. In der höheren Vergrößerung

erkennen wir zusätzlich intraluminale Pankreasgangnekrosen als Charakteristikum der PanINs

im Stadium 3 und atrophierte Azinuszellen. Die exemplarisch dargestellten Pankreata der

KrasG12D-Mäuse unterschiedlichen Alters zeigen somit die für diese Tumormauslinie typische

zeit- bzw. altersabhängige PanIN-Progression.

Die Socs3-Defizienz in KrasG12D

-Mäusen lässt in den H.E.-gefärbten Gewebefeinschnitten

eine Beschleunigung der PanIN-Progression erkennen. Im Vergleich zu gleichaltrigen

KrasG12D-Mäusen ist das Pankreas dieser Mäuse interessanterweise schon nach vier Wochen

morphologisch sehr stark umgewandelt. Bereits bei 10-facher Vergrößerung demaskieren sich

duktale Vorläuferläsionen aufgrund starker Gangdilatation, die annähernd die Hälfte des

Organs eingenommen haben. Während Pankreata vier Wochen alter KrasG12D-Mäuse nahezu

unauffällig erscheinen, fallen bei näherer histologischer Betrachtung der Gewebestruktur

gleichaltriger KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäuse ausgedehnte fibrotisch umgebaute heterogene

Areale auf. Neben normalen Azinis und reaktiven Gängen sind ausgeprägte hochgradig

veränderte Ausführungsgänge in Form von PanIN-1- bis PanIN-3-Läsionen zu erkennen. Die

schon in der vierten Lebenswoche eingetretenen Veränderungen der Gangstruktur deuten auf

ein im Vergleich zu der KrasG12D-Tumormauslinie sehr früh einsetzendes neoplastisches

duktales Geschehen mit ausgedehnter fibrotischer Begleitreaktion hin.

Um das Ausmaß der PanIN-Progression bei pankreasspezifischer Inaktivierung von Socs3

noch genauer beurteilen zu können, führten wir anschließend einen quantitativ analytischen

IV. ERGEBNISSE

59

Vergleich der Gangstrukturen in Pankreata vier Wochen alter KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäuse und

KrasG12D-Kontrollmäuse durch. Hierfür bestimmten wir zunächst mittels 200-fach

vergrößerter pankreatischer Gewebeschnitte die Gesamtzahl der Ausführungsgänge bei

beiden Mauslinien.

Das in Abbildung 23 dargestellte Ergebnis zeigt eine mittlere Anzahl von etwa sieben Gängen

pro 10 Gesichtsfelder im Pankreasgewebe der KrasG12D-Kontrollmäuse. Die Socs3-

defizienten KrasG12D-Tiere weisen mit im Durchschnitt 14 Gängen pro 10 Gesichtsfelder eine

doppelte Anzahl an duktalen Strukturen auf.

Abbildung 23: Vergleichende Auswertung der Gesamtzahl an Ausführungsgängen pro zehn Gesichtsfelder an mindestens 17 sequentiellen Schnitten vier Wochen alter Versuchstiere (200-fache Vergrößerung). Mittelwert ± Standardabweichung (n ≥ 5); *p < 0,0001.

Die ermittelten sichtbaren Ausführungsgänge setzen sich aus reaktiven Gängen und PanIN-

Läsionen zusammen. Reaktive duktale Strukturen weisen entweder ein noch normales

kubisches Epithel mit zunehmendem Transformationscharakter in Form gesteigerter CK-19-

Expression oder metaplastische duktale Strukturen mit Umwandlung des kubischen

Pankreasgangepithels in Platten- oder Übergangsepithel ohne Atypie-Zeichen auf. Mit der

Bestimmung der relativen Häufigkeit pankreatischer intraepithelialer Neoplasien von der

Gesamtzahl lässt sich die PanIN-Dichte im jeweiligen Gewebe ermitteln.

Da im definierten Progressionsmodell des Pankreasadenokarzinoms neoplastische

Vorläuferläsionen in PanIN-Stadium 1 bis 3 klassifiziert sind, interessierte uns in der

anschließenden Analyse die Bestimmung der relativen Häufigkeit der einzelnen PanIN-Stufe

an der Gesamtzahl der neoplastisch veränderten Gangstrukturen. Dadurch würde eine

Beschleunigung der PanIN-Progression in der KrasG12D

;Socs3Δpanc-Linie im Vergleich zur

IV. ERGEBNISSE

60

KrasG12D-Linie bestätigen lassen. Hierzu wurden erneut 200-fach vergrößerte pankreatische

Gewebeschnitte eingesetzt (siehe Abbildung 24).

Abbildung 24: Quantifizierung der reaktiven Gänge und PanIN-Läsionen pro zehn Gesichtsfelder in mindestens 17 sequentiellen Feingewebsschnitten zum Zeitpunkt von vier Wochen und bei 200-facherVergrößerung. Mittelwert ± Standardabweichung ( n ≥ 5); *p < 0,0001, **p < 0,005

Aus der Quantifizierung konnten wir eine deutlich erhöhte Zahl sichtbarer Pankreasgänge in

KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäusen im Vergleich zu der Kras

G12D-Linie ermitteln. Reaktive

Gangstrukturen treten ausgedehnt bereits zum Zeitpunkt von vier Wochen in großen Arealen

auf. Die Anzahl der PanIN-Läsionen ist signifikant erhöht, wobei eine Dominanz des PanIN-

1-Stadiums zum Zeitpunkt von vier Wochen vorliegt. PanIN-Läsionen höheren Grades sind

nur in geringer Dichte detektierbar. Gleichaltrige KrasG12D-Kontroltiere zeigen im Vergleich

nur vereinzelte PanIN-1-Läsionen, während höhergradige Vorläuferläsionen in dem

entsprechenden Alter noch nicht im Pankreasgewebe vorzufinden sind.

Aus unseren gewonnenen Daten können wir schlussfolgern, dass die Inaktivierung des

endogenen Inhibitors Socs3 in der KrasG12D-Tumormauslinie im Vergleich zur Kras

G12D-

Tumormodellmaus zu einer Beschleunigung der PanIN-Entwicklung mit Bildung hoher

PanIN-Dichte bereits zum frühen Zeitpunkt von vier Wochen führt.

IV. ERGEBNISSE

61

Immunhistochemische Zusatzfärbungen mit gegen CK-19, p-Stat3 und Cyclin D1 gerichteten

Primärantikörpern bestätigen die bereits unter III.3.2.1. beschriebene verstärkte Aktivierung

von p-Stat3 und des Stat3-abhängigen Proteins Cyclin D1 in den Azinuszellen, reaktiven

Gängen und PanIN-Läsionen bei der Socs3-defizienten KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mauslinie (siehe

Abbildung 25).

Abbildung 25: Immunhistochemischer Nachweis der übermäßigen Expression von CK-19, p-Stat3 und Cyclin D1 in reaktiven Gängen und PanIN-Läsionen vier Wochen alter Kras

G12D;Socs

Δpanc-Mäuse. 100-fache Vergrößerung

Die intensive Expression des Intermediärfilaments CK-19 als Epithelzellmarker ist

charakteristisch für einen malignen duktalen Prozess im Rahmen der PanIN-Progression. In

der weiteren Entwicklung nimmt die Anzahl besonders der höhergradigen Läsionen zu. Hinzu

treten fokale Karzinome auf, die von ausgeprägter fibrotischer Umwandlung des sonst

weichen Pankreasgewebes begleitet werden.

Die 10-fach vergrößerte Übersichtsfärbung der exemplarisch gewählten neun Wochen alten

KrasG12D

;Socs3Δpanc-Maus zeigt ein an Größe abnehmendes Pankreas, welches stark

aufgelockert erscheint. Mehr als die Hälfte des betroffenen Organs ist von neoplastischen

Vorläuferläsionen höheren Grades mit luminaler Nekrose befallen. Morphologisch normale

Azinuszellen sind zugunsten der Karzinomexpansion verdrängt und nur noch vereinzelt

gruppiert detektierbar. In der 13. Lebenswoche weisen die Pankreata der erkrankten Tiere nur

noch ein Drittel der Organgröße gleichaltriger KrasG12D-Kontrollmäuse auf. Das Gewebe wird

IV. ERGEBNISSE

62

weiterhin neoplastisch verändert bis in der 18. Lebenswoche der größte Teil der

Bauchspeicheldrüse vom invasiv duktalen Adenokarzinom (PDA) eingenommen wird.

Makroskopisch imponiert dieser maligne Tumor als gelblich-graues, knotig umgebautes

Gewebe von derber Konsistenz. Das histologische Bild, wie in Abbildung 26 veranschaulicht,

wird geprägt durch atypisch unregelmäßige, drüsenartige Gangstrukturen, die von einer

ausgedehnten desmoplastischen Reaktion begleitet werden. Die mikroskopisch klare

Unterteilung des Organgewebes ist nicht mehr erkennbar. Zusätzliche immunhistochemische

Färbungen des Tumorareals bestätigen die exzessive CK-19-Expression durch die duktalen

Strukturen und eine übermäßige Phosphorylierung des Stat3-Proteins am Tyrosin Y705 (siehe

Abbildung 26).

Abbildung 26: H.E.-Färbung des duktalen Adenokarzinoms des Pankreas und immunhistochemische Detektion von CK-19 und p-Stat3 in atypischen, drüsenartigen Gangstrukturen. 100-fache Vergrößerung. Der gezoomte Ausschnitt verdeutlicht die reichliche nukleäre Ansammlung von p-Stat3 in duktalen Zellen.

Unsere Ergebnisse aus der vergleichenden Analyse der Pankreasmorphologie belegen somit

die frühzeitige und prolongierte Aktivierung des Stat3-Signalweges und die daraus

resultierende Beschleunigung der KrasG12D-induzierten PanIN-Progression und der

IV. ERGEBNISSE

63

Entstehung fokaler Karzinome in KrasG12D-Tumormodellmäusen mit Inaktivierung des

Inhibitorproteins Socs3. Diese Tiere zeigen pankreasmorphologisch bereits in der vierten

Lebenswoche neben harmlosen reaktiven Gängen alle Stadien der PanIN-Läsionen, die sich

rasch zu fokalen Karzinomen mit ausgedehnter fibrotischer Umwandlung entwickeln,

während Pankreata KrasG12D-Kontrollmäuse gleichen Alters nahezu regelrecht normal

erscheinen. Aus unseren bisherigen Daten kann somit geschlossen werden, dass Socs3 eine

wichtige Funktion als Tumorsuppressor im Rahmen der pankreatischen Onkogenese ausübt

und über die Regulation der Stat3-Phosphorylierung die PanIN-Progression in

pankreasspezifischen KrasG12D-exprimierenden Mäusen bestimmt.

Um die Veränderungen der duktalen Strukturen und dessen Entwicklung genauer

charakterisieren zu können, führen wir zusätzlich immunhistochemische Färbungen auf Muc1

(Mucin 1), Muc5 (Mucin 5) und CK-19 bei vier Wochen und neun Wochen alten

KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäusen und Kras

G12D-Kontrollmäusen durch (vergleiche Abbildung 27).

Abbildung 27: Detektion von Muc1, Muc5 und CK-19 in Pankreata vier und neun Wochen alten Mäusen mittels immunhistochemischer Färbung zur genauen Charakterisierung der neoplastisch transformierten Gänge (100-fache Vergrößerung).

Muc1 ist ein transmembranöses, hauptsächlich apikal lokalisiertes Protein der Epithelzellen,

welches aufgrund der Größe und der negativen Ladung die Adhäsion anderer Zellen und

IV. ERGEBNISSE

64

Mikroorganismen verhindert. Bei zahlreichen Adenokarzinomen oder anderen epithelialen

Tumoren kommt es zu einer Überexpression dieses Moleküls. Durch Polaritätsverlust der

Zelle bei fortgeschrittenen Tumoren wird Muc1 vermehrt auch basolateral gebildet, was eine

verminderte Zelladhäsion hervorruft. Die Abnahme des Zellzusammenhalts stellt somit die

Voraussetzung der Metastasenbildung bei invasiven Karzinomen dar. Muc5 gehört ebenfalls

zu den Glykoproteinen, die jedoch von Schleimhäuten als sekretorische Mucine abgesondert

werden. Eine verstärkte Expression dieses Makromoleküls liegt in PanIN-Läsionen und

Adenokarzinomen vor. Wie die in Abbildung 27 dargestellten Immunhistochemie-Bilder

veranschaulichen, lassen sich zahlreiche sowohl Muc1- als auch Muc5-exprimierende

Ausführungsgänge und PanINs in vier Wochen alten KrasG12D


nachweisen, die in der neunten Lebenswoche an Dichte und Schweregrad zunehmen. Im

Vergleich dazu sind im Pankreasgewebe der exemplarisch gewählten KrasG12D-Kontrollmaus

die Mucin-positiven Gänge und intraepithelialen Neoplasien erst zum Zeitpunkt von neun

Wochen detektierbar, während vier Wochen alte Tiere nur vereinzelt Muc1 in den reaktiven

Gängen produzieren. Auch die Anzahl der CK-19-exprimierenden Gangstrukturen und

PanINs in Pankreata der KrasG12D-Linie ist deutlich geringer als im Gewebe gleichaltriger

Socs3-defizienten KrasG12D-Mäuse.

Somit unterstützen die gewonnenen Daten einer frühzeitigen und intensiven Expression

PanIN-spezifischer Markerproteine Muc1, Muc5 und CK-19 in der Bauchspeicheldrüse von

KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäusen die Aussage: Die Deletion von Socs3 in der Kras

G12D;Socs3

Δpanc-

Mauslinie führt zu einer deutlichen Beschleunigung der Progression KrasG12D-induzierter

PanINs mit frühem Auftreten von invasiv duktalen Pankreasadenokarzinomen.

5. Zusammenfassung der Ergebnisse

In Bezug auf die unter I.4. formulierte Zielsetzung können die Ergebnisse der im Rahmen

dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen wie folgt zusammengefasst werden:

1) Im LSL-KrasG12D

;Ptf1a-Creex1(Kras

G12D)-Tumormausmodell konnten wir in den

PanIN-Läsionen eine Aktivierung des Stat3-Signaltransduktionsweges nachweisen.

Das Homodimer aus zwei aktivierten p-Stat3 fungiert als intranukleärer

Transkriptionsfaktor und reguliert die Expression diverser Stat3-Zielproteine. Socs3

als wichtiger Tumorsuppressor lässt sich in KrasG12D-Mäusen in hoher Konzentration

detektieren und reguliert den IL6/Stat3-Signalweg über negative Rückkopplung.

IV. ERGEBNISSE

65

2) Socs3-defiziente KrasG12D-Mäuse weisen im Verlauf der Beobachtung ein im

Vergleich zu KrasG12D-Kontrolltieren deutlich reduziertes Körper- und

Pankreasgewicht auf.

3) Mithilfe des Cre/loxP-Rekombinationssystems gelang es uns die Generierung der

LSL-KrasG12D

;Socs3F/F

;Ptf1a-Creex1(Kras

G12D;Socs3

Δpanc)-Mauslinie. Diese genetisch

veränderten Tiere weisen eine pankreasspezifische Deletion des Exons 2 des Socs3-

Gens auf. Die auf diesem Wege erreichte Inaktivierung des endogenen

Inhibitorproteins Socs3 im Pankreas führt zu einer frühzeitigen und prolongierten

Jak2-vermittelten Stat3-Phosphorylierung am Tyrosinrest Y705 (p-Stat3), die bereits

zum Zeitpunkt von vier Wochen detektierbar ist. Sowohl Morphologie und

Physiologie des endokrinen und exokrinen Pankreas als auch die PanIN-induzierte

konstitutive Aktivierung des onkogenen KrasG12D bleiben von der Socs3-Deletion

unbeeinflusst. Histomorphologische und proteinbiochemische Untersuchungen des

Pankreas der KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäuse im Vergleich zu Kras

G12D-Kontrollmäusen

belegen jedoch die beschleunigte Entwicklung und Progression der altersabhängigen

KrasG12D-induzierten PanIN-Läsionen schon nach der vierten Lebenswoche.

4) Im Beobachtungszeitraum von sechs Monaten entwickelten 28,57% (2/7) der

KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäuse ein Pankreasadenokarzinom, während in der Kras

G12D-

Kohorte keine Karzinomentwicklung zu beobachten war. Die Tumorlatenz von etwa

63 Tagen bei den KrasG12D

;Socs3Δpanc-Versuchstieren war somit kürzer im Vergleich

zu den KrasG12D-Kontrolltieren. Das Pankreasgewebe ist schon zum Zeitpunkt von

vier Wochen morphologisch stark umgewandelt. Es finden sich heterogene Areale mit

normalen Azinis, PanIN-Läsionen unterschiedlichen Grades mit ausgedehnter

desmoplasmatischer Stromareaktion vor.

5) Aus den gewonnenen Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass die Inaktivierung des

endogenen Tumorsuppressors Socs3 die Progression präneoplastischer Läsionen im

murinen KrasG12D-Tumormodell beschleunigt. Socs3 übt somit durch negative

Rückkopplung eine tragende Funktion im Akzelerationsprozess der PanINs aus und

bestimmt über die Stat3-Phosphorylierung die Regulation der PanIN-Entwicklung und

–Progression zu invasiv duktalem Adenokarzinom.

V. DISKUSSION

66

V. DISKUSSION

1. Rolle von Socs3 für die pankreatische Karzinogenese im Kras

G12D-Mausmodell

Obwohl Socs3 bereits in einigen humanen Tumorzelllinien und –geweben als ein wichtiger

Tumorsuppressor beschrieben wurde, blieb dessen genaue Rolle und Funktion in der

pankreatischen Karzinogenese bisher unbeleuchtet.

In einigen Studien wurde über eine endogene DNA-Hypermethylierung als epigenetischer

Inaktivierungsmechanismus bestimmter Socs-Gene im Rahmen der Karzinogenese spekuliert.

He und Kollegen konnten in humanen NSCLC (Nichtkleinzelliges Karzinom)-Zellinien,

Mesotheliom-Zelllinien und operativ gewonnenem Lungenkarzinomgewebe eine im

Vergleich zu den normalen Kontrollzelllinien supprimierte Expression des Socs3-Transkripts

feststellen. Die Socs3-Defizienz in den Tumorzellen resultierte in einer Hyperaktivität des

Jak/Stat-Signaltransduktionsweges mit proliferativer und onkogener Eigenschaft. Eine

genetische Wiederherstellung der Socs3-Funktion induzierte hingegen durch Inhibition der

Stat3-Aktivität Apoptose und Suppression des Zellwachstums.

Interessanterweise wurden hypermethylierte CpG-Inseln des Socs3-Gens in allen

Tumorzelllinien gefunden, während normale Gewebszellen mit regelrechter Socs3-Expression

keine Veränderung der entsprechenden Genareale zeigten (He et al., 2003).

CpG-Inseln haben ihre Bedeutung in der Regulation der Genexpression und stellen somit

einen Mechanismus der epigenetischen Genregulation dar (Antequera 2003). Die

Methylierung der CpG-Inseln eines Gens hat die Konsequenz, dass dieses Gen nicht mehr

transkribiert wird, was unter anderem in der Tumorentstehung durch das Abschalten

relevanter Tumorsuppressorgene eine große Rolle spielt. Untersuchungen mittels

molekulargenetischer Analysen an ösophagealem Plattenepithelkarzinom und Barrett-

Adenokarzinom (Tischoff et al., 2007), humanem Kopf- und Hals-Plattenepithelkarzinom und

deren dysplastischen Vorläuferläsionen (Weber et al., 2005), hepatozellulären Karzinomen

(HCC) und deren präneoplastischen Läsionen (Niwa et al., 2005) offenbarten ebenfalls eine

Hypermethylierung der CpG-Inseln enthaltenden Socs3-Promotorregion. Auch hier kam es

als Folge der Socs3-Defizienz zu einer konstitutiven Aktivierung des Stat3-Signalweges. Im

Kolon bietet die endogene Induktion der Socs3-Expression demzufolge einen protektiven

Mechanismus gegenüber Verletzung-induzierter Kryptenhyperplasie und Entzündungs-

assoziierter Karzinogenese durch Hemmung der IL-6/Stat3-Signalkaskade (Rigby et al.,

2007).

V. DISKUSSION

67

In den meisten Karzinomzellen der Ovarien und der Mamma kommt es zu einer Inaktivierung

des Socs1- und Socs2-Gens durch CpG-Hypermethylierung in der Promotorregion, wodurch

diese Gene nicht mehr transkribiert werden. Im Gegensatz zu den Ergebnissen von He und

Kollegen war die Promotorregion des Socs3-Gens in den beiden genannten Tumorentitäten

nicht hypermethyliert und das Genprodukt dementsprechend intrazellulär in hoher

Konzentration detektierbar. Darüber hinaus wurde eine erhöhte Stat3-Aktivität in den

betroffenen Tumorzellen registriert, die auf die fehlende Expression des Socs1-Moleküls mit

wachstums- und proliferationsinhibierender Wirkung zurück geführt wurde (Yoshikawa et

al., 2001; Lee et al., 2006). Die konstitutive Stat3-Aktivierung ist mit einer Überexpression

von Socs3 assoziiert und führte zur Zunahme der Proliferationsrate der mamillären

Epithelzellen. Die gewonnenen Ergebnisse ließen Sutherland und Kollegen annehmen, dass

das endogene Inhibitorprotein Socs3 in dieser Zellart keine Tumorsuppressor-Aktivität erfüllt,

was wiederum dessen vielseitige teilweise unerforschte Funktion in verschiedenen

Karzinomarten verdeutlicht (Sutherland et al., 2004).

Drei Jahre nach der Veröffentlichung der Arbeit von Sutherland und Kollegen, wurde die

Studie von der Arbeitsgruppe um Evans publik, in der sie entgegen Sutherlands Aussagen

eine Zunahme der Expression von Socs2 bis Socs7 postulierten. Im Vergleich zu den

normalen mamillären Epithelzellen reagierten die Tumorzelllinien trotz hypermethylierter

CpG-Inseln adäquat auf Zytokin- bzw. Wachstumsfaktor-Signale mit erhöhter Expression von

Socs1 und Socs3, wodurch der Mechanismus der Socs-vermittelten Feedback-Inhibition nicht

gestört wurde (Evans et al., 2007). In Übereinstimmung mit den Ergebnissen von der

Arbeitsgruppe um Sutherland, konnten sie belegen, dass trotz Zunahme des Socs3-Levels in

Mammakarzinomzellen keine effiziente Feedback-Inhibition auf konstitutive Stat3-

Aktivierung erfolgte. Socs3 fungierte stattdessen als Tumorpromotor, welcher die IFN-

α/Stat1-vermittelte Wachstumsinhibition hemmte.

Die intrazelluläre Stat3-Aktivierung im Rahmen der pankreatischen Onkogenese scheint

ebenfalls unter der Socs3-Kontrolle zu stehen. In unseren Versuchen konnten wir erstmalig

zeigen, dass in KrasG12D-Tumormäusen eine erhöhte Socs-3 Expression vorliegt. Um den

Einfluss von Socs3 auf die Pankreaskarzinogenese im KrasG12D-transgenen Mausmodell zu

untersuchen, generierten wir eine weitere Mauslinie mit pankreasspezifischer Socs3-Deletion.

Eine Inaktivierung des Socs3-Gens führte demnach zu einer prolongierten und verstärkten

Stat3-Phosphorylierung, was wiederum die Beschleunigung der PanIN-Progression und die

Entstehung von Pankreaskarzinomen förderte.

V. DISKUSSION

68

Im Einklang mit den aufgeführten Daten konnten wir in unserer Arbeit zeigen, dass innerhalb

des Beobachtungszeitraums von sechs Monaten 28,57% (2/7) der KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäuse

ein Pankreasadenokarzinom entwickelten, während in der KrasG12D-Kohorte keine

Karzinomentwicklung zu beobachten war. Die Tumorlatenz von etwa 63 Tagen bei den

KrasG12D

;Socs3Δpanc-Versuchstieren war somit kürzer im Vergleich zu den Kras

G12D-

Kontrolltieren.

2. Einfluss von Socs3 auf die Apoptose und Proliferation im Kras

G12D-Mausmodell

Proliferation und Apoptose sind zellautonome Effekte, die das Gleichgewicht zwischen

Zellwachstum und –eliminierung gewährleisten. Ein Ungleichgewicht dieser teilweise

komplexen Mechanismen kann eine unkontrollierte Proliferation begünstigen und die

Tumorentstehung fördern. Während in frühen und späten PanIN-Stadien die Apoptose als ein

seltenes Ereignis anzusehen ist, stellt die Proliferation einen dominierenden Mechanismus in

der Tumorprogression dar (Luttges et al., 2003).

Stat3 ist bereits in vielen Untersuchungen als einen wichtigen Regulator des programmierten

Zelltods und des Zellzyklus beschrieben worden (Konnikova et al., 2003; Lin et al., 2005;

Xihong et al., 2008). Aktivierte p-Stat3 Homo- oder Heterodimere aktivieren als

Transkriptionsfaktoren zahlreiche Zielgene. U.a. werden Proteine wie Bcl-XL, Mcl-1,

Survivin und Cyclin D1 vermehrt gebildet. Bcl-XL und Mcl-1 gelten als anti-apoptotische

Signalmoleküle, die durch verstärkte Expression zum Überleben transformierter Zellen in

einigen humanen Tumorerkrankungen beiträgt (Krajewska et al., 1996; Okaro et al., 2001; Ma

et al., 2004; Bhattacharya et al., 2005; Yu et al., 2009; Placzek et al., 2010).

Untersuchungen an humanen Pankreastumorzelllinien haben gezeigt, dass eine Inaktivierung

von Stat3 in einer Abnahme der Transkriptionsrate von Bcl-XL und Mcl-1 resultierte und

folglich die Apoptose induzierte (Huang et al., 2010). In unseren weiterführenden

Experimenten konnten wir zum ersten Mal nachweisen, dass die homozygote Deletion des

negativen Regulators Socs3 in vier Wochen alten KrasG12D-Tumormäusen eine frühe und

prolongierte Stat3-Aktivierung hervorruft und somit eine im Vergleich zu gleichaltrigen

KrasG12D-Tumormäusen stärkere Expression der anti-apoptotischen Proteine Bcl-XL und Mcl-

1 verursacht.

Zusätzlich zu den o.g. Ergebnissen konnten wir proteinbiochemisch eine stärkere Cyclin-D1

Expression in Socs3-defizienten KrasG12D-Tumormäusen im Vergleich zu den Kras

G12D-

Kontrollmäusen nachweisen. Cyclin D1 ist ein proliferationsförderndes, intranukleär

V. DISKUSSION

69

lokalisiertes Protein, welches die G1/S-Progression innerhalb des Zellzyklus fördert und somit

die proliferative Aktivität einer Zelle steuert (Baldin et al., 1993). Die Überexpression von

Cyclin D1 in KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäusen kennzeichnete somit eine Verkürzung des G1/S-

Phasenübergangs, die wiederum die Progression transformierter Zellen innerhalb des

Zellzyklus beschleunigt und die Entwicklung von Karzinomen wesentlich beeinflusst. In

anderen Studien konnte in Übereinstimmung mit unseren Resultaten ebenfalls eine

Überexpression von Cyclin D1 in humanen Pankreaskarzinomzellen nachgewiesen werden,

die mit einer schlechten Prognose assoziiert ist (Gansauge et al., 1997). Die Bedeutung von

Cyclin D1 in der Tumorgenese nicht nur im Pankreasadenokarzinom, sondern auch in

zahlreichen anderen Tumorarten wird auch in anderen Arbeiten betont (Musgrove et al.,

2011).

In unseren Versuchen konnten wir erstmalig zeigen, dass die übermäßige Stat3 Expression in

vier Wochen alten KrasG12D-Mäusen eine starke Aktivierung der genannten Proteine zur

Folge hat. Dieses Ergebnis verdeutlicht die Proliferation als dominierender Prozess in der

PanIN-Progression. Die zusätzliche, homozygote Deletion des Socs3-Gens in diesen

Tumormäusen führt zu einer im Vergleich zu gleichaltrigen KrasG12D-Kontrollmäusen

verstärkten und prolongierten Aktivierung von Stat3 und der Stat3-assoziierten Proteine durch

Wegfall des negativen Inhibitors. Die dadurch hervorgerufene, persistierende Stat3 Aktivität

und die vermehrte Bildung anti-apoptotischer und proliferationsfördernder Moleküle

verursachten eine Beschleunigung der PanIN-Progression zu pankreatischem duktalem

Adenokarzinom.

Im murinen Modell der Hepatitis-assoziierten Hepatokarzinogenese stieg nach Injektion des

Karzinogens DEN bzw. con A die IL-6 Serumkonzentration sowohl im Wildtyp als auch in

den Soc3-Knockouts ohne signifikanten Unterschied dramatisch an. Jedoch war in den Socs3-

defizienten Tieren nach 24 Stunden eine anhaltende und stärkere Stat3-Phosphorylierung im

Vergleich zu den Wildtypen detektierbar. In diesem Zusammenhang nahm die

Transkriptionsfrequenz der Stat3-Zielgene Bcl-XL, Mcl-1, Cyclin D1 zu. Die homozygote

Deletion des Socs3-Gens in den Leberparenchymzellen resultierte in einer verstärkten,

prolongierten Stat3-Aktivierung und beschleunigte infolgedessen die Entwicklung des HCC

(Ogata et al., 2006).

Ein weiteres Ergebnis unserer experimentellen Untersuchungen stellte die

immunhistochemiche Detektion des Enzyms Cyclooxygenase 2 (Cox-2) in präneoplastischen

pankreatischen Läsionen dar. Cox-2 gehört zu den Zielgenen von Stat3 und wird bei dessen

Aktivierung verstärkt transkribiert (Yu et al., 2008). Cox-2-Synthese wird erst bei

V. DISKUSSION

70

Entzündungen bzw. Verletzung des Gewebes induziert und fördert anschließend die

Produktion von pro-inflammatorischen Prostaglandinen, die chronische Entzündungen

unterhalten. Inflammatorische Prozesse sind bedeutende epigenetische Faktoren, die

maßgeblich zur Entstehung und Progression zahlreicher Tumoren führen (Shacter et al.,

2002). Die PanIN-Progression und die Tumorentwicklung in der Pankreaskarzinogenese

scheinen auch entzündungsassoziiert zu sein (Raimondi et al., 2010). Da Cox2 ein Zielgen

von Stat3 darstellt und dessen Genprodukt pro-inflammatorische Wirkung besitzt, kann davon

ausgegangen werden, dass Stat3 maßgeblich als Regulator tumor-assoziierter Entzündung

fungiert. Mittels immunhistochemischer Färbungen konnten wir in PanINs der KrasG12D-

Tumormäuse Cox-2 nachweisen. Unsere Western-Blot Analysen demonstrierten eine bereits

in der vierten Lebenswoche verstärkte und prolongierte Expression von Cox-2 in Socs3-

defizienten KrasG12D-Mäusen im Vergleich zu den gleichaltrigen Kras

G12D-Kontrolltieren.

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die homozygote Deletion von Socs3 die Stat3-

vermittelte Cox-2-Synthese verstärkt, die wiederum inflammatorische Mechanismen bereits in

der vierten Lebenswoche aktivieren und so eine tumor-assoziierte Entzündung unterhalten,

die die PanIN-Progression und Karzinomentwicklung beschleunigen. Weiterhin begünstigt

das durch Cox-2 gebildete Prostaglandin E2 in vielen Tumorarten die Bildung des

Angiogenese-Faktors VEGF, das wiederum das Tumorwachstum fördert. Demzufolge wird

vermutet, dass Cox-2 eine wesentliche Rolle in der Tumorgenese spielen könnte (Simmons et

al., 2004).

In KrasG12D-induzierten PanINs war uns ebenfalls der proteinbiochemische Nachweis von

HSP-70 möglich. HSP-70 stellt ein wichtiger Bestandteil des Chaperonsystems dar, das

ubiquitär in eukaryontischen Zellen vorkommt. Die wichtigsten Funktionen von HSP-70

liegen in der richtigen Faltung und Aktivierung vieler Proteine. Zusätzlich ermöglicht dieses

Molekül über anti-apoptotische Mechanismen das Überleben und Wachstum von Tumorzellen

(Hatfield et al., 2012). HSP-70 wird reichlich in malignen Tumoren unterschiedlichen

Ursprungs gebildet und seine Expression korreliert mit erhöhter Zellproliferation, schlechter

Differenzierung, Lymphknotenmetastasen und schlechtem Therapie-Outcome (Ciocca et al.,

1993; Vargas-Roig et al., 1997; Jäättelä, 1999). Das Gen HSP-70 gehört ebenfalls zu den

Zielgenen von Stat3. Analog zur verstärkten und prolongierten Aktivierung von Stat3 in vier

Wochen alten, Socs3-defizienten KrasG12D-Tumormäusen konnten wir mittels Western Blot-

Methode ebenfalls eine im Vergleich zu den Kontrolltieren verstärkte HSP-70 Bildung

nachweisen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass HSP-70 als zytoprotektives Molekül

http://jnci.oxfordjournals.org/search?author1=Daniel+R.+Ciocca&sortspec=date&submit=Submit

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=J%C3%A4%C3%A4ttel%C3%A4%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10480757

V. DISKUSSION

71

für das Überleben und Wachstum transformierter Azinuszellen im Rahmen der

Tumorprogression von großer Bedeutung ist.

Die Rolle von Socs3 im Rahmen der pankreatischen Karzinogenese ist bisher kaum

beleuchtet worden. In einigen humanen Tumorzelllinien wurde die Bedeutung von Socs3 als

negativer Regulator in der Inhibition der IL-6/Jak2/Stat3-Signalkaskade und der daraus

resultierenden Reduktion zellulärer Proliferation, Induktion von Apoptose und Zellzyklus-

Arrest hervorgehoben. Demzufolge wird diesem Molekül ein Anti-Tumoreffekt

zugeschrieben (Iwahori et al., 2011).

In unseren experimentellen Untersuchungen konnten wir erstmals die Expression von Socs3

im murinen in-vivo KrasG12D-Modell belegen. Demzufolge scheint dieses Molekül in der

Regelung zellulärer Prozesse wie Apoptose, Proliferation, Zelldifferenzierung nicht nur unter

physiologischen Bedingungen sondern auch im Rahmen der pankreatischen Karzinogenese

eine wichtige Stellung einzunehmen. Neben Socs3 konnten wir mittels

immunhistochemischer Methode auch andere Stat3-Zielproteine nachweisen, die in ihrer

Gesamtheit zu kontinuierlicher Proliferation, apoptotischer Resistenz,

Angiogenesestimulation, zellulärer Invasivität und Metastasierung sowie tumor-assoziierter

Inflammation führen. Durch die zusätzliche homozygote Deletion von Socs3 in KrasG12D-

Tumormäusen entfällt dessen Inhibition auf den Stat3-Signalweg, wodurch diese Zielgene

bereits in frühen Lebenswochen vermehrt transkribiert werden und tumor-fördernde

Mechanismen aktivieren.

3. Entzündliche Prozesse fördern die Initiierung und Progression der pankreatischen Vorläuferläsionen zu duktalem Pankreaskarzinom

Inflammation ist definiert als eine lokale oder systemische Reaktion eines Organismus auf

einen internen oder externen Fremdstoff oder ein Antigen mit dem Ziel der Entfernung dieser

potentiell schädigenden Reize, um Voraussetzungen für anschließende

Gewebereparaturprozesse zu schaffen. Damit ist sie Ausdruck der Immunreaktion.

Nach Gewebsverletzung wandern Entzündungszellen wie Mastzellen, Makrophagen,

Granulozyten, Lymphozyten aber auch Fibroblasten in die geschädigte Geweberegion und

aktivieren Reparaturprozesse mit Angiogenese, Koordination der Zellmigration und

Wiederherstellung der extrazellulären Matrix. In der Regel ist die Inflammation ein

selbstlimitierender Prozess aufgrund der balancierten Verhältnisse zwischen initial

freigesetzten, pro-inflammatorischen Botenstoffen und anti-inflammatorischen

V. DISKUSSION

72

Signalmolekülen. Eine Dysregulation dieser Mechanismen kann zu einer chronischen

Entzündung des betroffenen Gewebes führen mit der Gefahr der Tumorentwicklung (Barton,

2008; Medzhitov, 2008; Raimondi et al., 2010).

Das Pankreas als Digestionsorgan enthält in den Zellen der exokrinen Drüsen viele

Enzymvorstufen, die bei Schädigung des Gewebes freigesetzt und aktiviert werden. Es

entsteht eine akute Pankreatitis. Rezidivierende Pankeatitiden führen letztendlich zur

Entstehung einer chronischen Entzündung mit irreversiblen Veränderungen des

Organgewebes, was wiederum der Ausgangspunkt für die Entstehung eines

Pankreaskarzinoms sein kann (Raimondi et al., 2010).

In den letzten Jahren wurde im Rahmen zahlreicher Pankreatitis-Forschungen ein

Zusammenhang zwischen chronischer Pankreatitis und pankreatischer Karzinogenese

postuliert (Lowenfels et al., 1993; Malka et al., 2002).

Kras-Mäuse mit einer chronischen Pankreatitis wie z.B. durch Caerulein (ein

Cholezystokinin-Analogon) induziert entwickelten bereits im fünften Lebensmonat

ausgeprägte Atrophie der Azini und zunehmende Fibrosierung im Vergleich zu den

Kontrolltieren. Desweiteren zeigte sich in den Pankreata der Kras-Tiere eine deutliche azinär-

duktale Metaplasie sowie multifokale metaplastische Gänge mit atypischen Kernstrukturen

und luminalen Veränderungen, die auf prä-maligne Vorgänge hindeuten. Die Hälfte der Kras-

Mäuse entwickelten bereits in frühem Lebensalter von fünf Monaten frühe PanIN-Läsionen

im Vergleich zu gleichaltrigen Kontrolltieren. Die Schwere der Läsionen nahm mit

zunehmendem Alter der Tiere zu, bis schließlich ein Drittel der Kras-Tumormäuse invasive

duktale Adenokarzinome im achten Lebensmonat entwickelten. Im Vergleich dazu waren in

den Organen der ebenfalls mit Caerulein behandelten Kontrolltieren weder PanINs noch

invasive Karzinome nachweisbar. Somit stellt die chronische Pankreatitis ein wesentlicher

Faktor dar, der zur Beschleunigung der Kras-induzierten PanIN-Progression führt (Guerra et

al., 2007).

In Entzündungsprozessen wurden dem inflammatorisch-potenten Zytokin IL-6 und dessen

Signalkaskade über Stat3/Socs3 eine besondere Bedeutung zugesprochen (Hodge et al.,

2005). Die Aktivierung von Stat3 sowohl in humanen Pankreasadenokarzinomen (Scholz et

al., 2003; Hutzen et al., 2009; Glienke et al., 2010; Lin et al., 2010b) als auch in den PanIN-

Läsionen der Tumormäuse (Lesina et al., 2011; Fukuda et al., 2011) lässt vermuten, dass

entweder zell-autonome Mechanismen oder autokrine bzw. parakrine Stimulation der Zellen

für diesen Effekt verantwortlich sind. Unsere immunhistochemischen Ergebnisse offenbarten

ausgedehnte Jak2- und Stat3-Aktivierung sowohl in den duktalen als auch infiltrierenden und

http://www.bpgastro.com/article/S1521-6918(10)00021-1/abstract

V. DISKUSSION

73

Azini-Zellen. Die Jak2-Phosphorylierung wies möglicherweise auf eine parakrine oder

autokrine, weniger auf eine zell-autonome Aktivierung der Signalkaskade hin (Heinrich et al.,

1998; Bravo et al., 2000). Bei den Liganden handelt es sich dabei um Zytokine wie IL-6, IL-

11, IL-27, aber auch LIF (leukemia inhibitor factor) und OSM (Oncostatin M). Die intensive,

ubiquitäre Jak2/Stat3-Aktivierung im KrasG12D-Tumormausmodell lässt vermuten, dass

gp130-Rezeptorliganden in der pankreatischen Onkogenese eine besondere Stellung

einnehmen könnten. In einigen klinischen Studien konnte gezeigt werden, dass eine

Korrelation zwischen der Höhe der IL-6-Serumkonzentration und dem Outcome bzw. der

Prognose der an Pankreaskarzinom erkrankten Patienten besteht (Ebrahimi et al., 2004; Talar-

Wojnarowska et al., 2009).

In zahlreichen Untersuchungen konnten Azinuszellen als epitheliale Quellen von Zytokinen

wie IL-6 und IL-11 in einer mit Caerulein induzierten Pankreatitis nachgewiesen werden

(Grady et al., 1997; Blinman et al., 2000; Bhatia et al., 2002). Die Expression von IL-6 und

IL-11 in den Azini von Stat3-defizienten KrasG12D-Mäusen war eindeutig niedriger als in den

Azini der KrasG12D-Kontrolltiere (Fukada et al., 2011). Diese Ergebnisse und die Kenntnis,

dass sowohl IL-6, IL-11, als auch IL-6Rα und gp130 Zielgene von Stat3 sind (Ernst et al.,

2008; Toth et al., 2011), lassen schlussfolgern, dass Stat3 möglicherweise selbst durch

Steigerung der IL-6 bzw. IL-11 Expression und über einen autokrinen Mechanismus die

Jak2/Stat3-Signalkaskade im murinen KrasG12D-Modell des Pankreaskarzinoms aktiviert

(Fukada et al., 2011).

Im Einklang mit den Ergebnissen der Arbeitsgruppe um Fukuda konnten wir in unseren

Versuchen ebenfalls eine höhere IL-6 mRNA-Konzentration in KrasG12D-Tumormäusen als in

den LSL-KrasG12D-Kontrollmäusen messen. Zusätzlich ist unserer Arbeitsgruppe gelungen, in

isolierten Tumorzelllinien, die im Gegensatz zum Primärtumor oder Metastasen keine bzw.

geringfügige Stat3-Aktivierung aufzeigen, nach IL-6 Stimulation eine starke Stat3-

Phosphorylierung zu induzieren (Lesina et al., 2011). Somit konnten wir zeigen, dass neben

der autokrinen Zellstimulation ein parakriner Mechanismus der Stat3-Aktivierung existiert.

Ein typisches, morphologisches Merkmal des duktalen Pankreaskarzinoms ist die reaktive,

stromale Desmoplasie angrenzend an die PanINs und das Tumorgewebe. Dieses

desmoplastische Stroma stellt ein für die Karzinomentwicklung komplexes „Tumor-

Microenvironment“ dar, das sich aus extrazellulärer Matrix, myofibroblastischen,

pankreatischen Sternzellen und v.a. inflammatorischen Zellen und Makrophagen

zusammensetzt. Untersuchungen haben gezeigt, dass Entzündungszellen insbesondere

Makrophagen für die Synthese von Chemokinen und inflammatorischen Zytokinen wie IL-6

V. DISKUSSION

74

verantwortlich sind (Algül et al., 2007b; Erkan et al., 2008). Weiterführende Experimente

unserer Arbeitsgruppe konnten tatsächlich infiltrierende Makrophagen als wichtigste

Produzenten von IL-6 identifizieren, das zur Aktivierung der Stat3/Socs3-Signalkaskade in

den Tumorvorläufer- bzw. Tumorzellen führt (Lesina et al., 2011). In Zusammenschau der

Forschungsergebnisse sowohl unserer Arbeitsgruppe als auch von Fukada und Kollegen kann

geschlussfolgert werden, dass eine parakrine Stimulation der transformierten Zellen durch IL-

6-Freisetzung aus den Makrophagen die intrazelluläre Jak2/Stat3/Socs3-Signalkaskade

aktiviert. Der Traskriptionsfaktor Stat3 fördert in seiner aktiven Form wiederum die Bildung

von IL-6 und IL-11, was zusätzlich als autokriner Mechanismus die Aktivität des Stat3-

Signalweges aufrechterhält.

Einige Analysen haben gezeigt, dass Stat3 sowohl in Tumorzellen als auch in

Entzündungszellen wie Makrophagen, natürlichen Killerzellen und neutrophilen

Granulozyten im „Tumor-Microenvironment“ konstitutiv aktiviert ist. Durch diese

Dauerstimulation verhindert Stat3 zum einen die Expression vieler für die Immunantwort

gegen die transformierten Zellen wichtiger Botenstoffe und zum anderen fungiert dieser

Transkriptionsfaktor als Aktivator diverser für die Immunsuppression bedeutender Gene u.a.

auch IL-6. Somit unterdrückt die konstitutive Aktivierung der Stat3-Signalkaskade bei Stat3-

Defizienz die antitumoröse Immunantwort, was die Bedeutung dieses Signalweges sowohl in

der Immunmodulation als auch der Tumorentwicklung unterstreicht (Yu et al., 2007).

Die IL-6/Jak2/Stat3-Signalkaskade ist ein ubiquitär vorkommender Signalweg, der bereits im

Rahmen entzündungsassoziierter Onkogenese in anderen Organen wie der Lunge (Li et al.,

2007) und dem Kolon (Bollrath et al., 2009; Grivennikov et al., 2009) beschrieben wurde.

Die komplexe Bedeutung von Socs3 im Rahmen akuter und chronischer Inflammation wurde

in einigen Studien untersucht. Demnach kam es nach Stimulation von isolierten,

pankreatischen Azinus-Zellen mit Lipopolysaccharide (LPS), Tumornekrosefaktor (TNF)-α,

IL-6 oder IL-1ß zu einer erhöhten mRNA-Synthese sowohl von Stat3 als auch Socs3.

Die Induktion des endogenen, negativen Regulators im Pankreas könnte für die Hemmung der

Synthese pro-inflammatorischer Gene eine wichtige Rolle spielen. Die Socs3 Hoch-

Regulation in Azinuszellen inhibiert möglicherweise die weitere Zytokin-Induktion und

hemmt somit die Prolongation und Chronifizierung entzündlicher Prozesse (Vona-Davis et

al., 2005).

In thermisch behandelten Hepatozyten konnte ebenfalls eine deutlich erhöhte Stat3-

Expression und –Aktivierung sowie eine gesteigerte Socs3-Synthese beobachtet werden.

Nicht-Leberparenchymzellen wie Kupffer-Zellen wurden als Quelle inflammatorischer

V. DISKUSSION

75

Zytokine wie IL-6, IL-1 und TNF-α identifiziert. Somit stellten diese wichtigen Zellen der

Socs3-Aktivierung in Rahmen immunologischer Prozesse dar. Das erhöhte Socs3-Proteinlevel

ging mit einer abnehmenden Stat3-Phosphorylierung einher. Die Stimulation primär isolierter

Hepatozyten mit IL-6 führte ebenfalls zu einer Zunahme der Socs3-Konzentration und

Abnahme von Stat3-Aktivität im Vergleich zu nicht mit IL-6 stimulierten Zellen. Daraus kann

geschlussfolgert werden, dass Socs3 die Stat3-Aktivierung hemmte und somit die IL6-

Signaltransduktion terminierte (Kong et al., 2002).

Im Rahmen chronisch entzündlicher Darmerkrankungen limitiert die Socs3-Überexpression

die Aktivierung der IL-6/Stat3-Signalkaskade in den betroffenen Darmzellen und verhindert

eine Hyperproliferation der Darmkrypten und die entzündungs-assoziierte Karzinogenese

(Suzuki et al., 2001; Rigby et al., 2007). In Übereinstimmung zu unseren Ergebnissen führt

eine Socs3-Deletion zur Hyperaktivierung der Stat3-Signalkaskade, was wiederum die

chronische Entzündung und die damit assoziierte Tumorinitiierung und –progression fördert.

Einige Studien haben gezeigt, dass eine intrazelluläre Proteintherapie mit Socs3 das Ausmaß

entzündlicher Prozesse und Apoptose vermindert. Die auf diesem Wege erfolgte Auffüllung

der endogenen Socs3-Reserve bei Defizienz terminierte die Zytokin-Signaltransduktion wie

z.B. durch IL-6 und verhindert somit Apoptose und hämorrhagische Nekrosen im Rahmen

einer akuten Entzündung der Leber (Jo et al., 2005).

Socs3 scheint wichtige Mechanismen im Rahmen von Entzündungsprozessen zu regulieren.

Um die Bedeutung dieses Moleküls für die entzündungsassoziierte Tumorgenese genauer

beschreiben zu können sind weiterführende Untersuchungen notwendig.

4. Rolle von Socs3 bei der Pankreasfibrosierung/Desmoplasie in Kras

G12D-Tumormäusen

Ein bedeutendes, histomorphologisches Kerncharakteristikum des duktalen

Pankreasadenokarzinoms ist die Bildung einer ausgeprägten Desmoplasie. Diese Veränderung

ist gekennzeichnet durch eine massive Fibrosierung des Pankreasgewebes, was als Folge einer

gestörten Homöostase der extrazellulären Matrix (ECM) darstellt. Unter normalen

physiologischen Umständen wird die Organarchitektur durch ein Gleichgewicht zwischen

Synthese und Degradation der ECM aufrechterhalten. Demzufolge führt eine Imbalance

zugunsten der vermehrten Bildung zu einer unphysiologischen Fibrosierung des Gewebes

(Algül et al., 2007; Pandol et al., 2009). Untersuchungen haben gezeigt, dass die Aktivität der

V. DISKUSSION

76

Desmoplasie einen prognostischen Wert bei Patienten mit Pankreaskarzinom besitzt, wobei

eine hohe Aktivität mit einer schlechteren Prognose assoziiert ist (Erkan et al., 2008).

Zu den wichtigsten zellulären Bestandteilen des desmoplasmatischen Stromas zählen neben

inflammatorischen Zellen und Makrophagen v.a. die pankreatischen Sternzellen (pancreatic

stellate cells, PSC). Die PSCs sind Äquivalente zu den hepatischen Sternzellen (auch als Ito

Zellen oder HSCs genannt) und sind in ihrem aktivierten Zustand für die Produktion von

Proteinen der ECM wie Kollagene Typ I und III sowie Fibronektin verantwortlich. Im

normalen, gesunden Pankreasgewebe sind ruhende, gering proliferierende PSCs in den

periazinären und interlobulären Organbereichen lokalisiert und synthetisieren kaum ECM.

Eine parakrine Aktivierung erfolgt bei Entzündungsprozessen oder im Rahmen tumoröser

Erkrankungen durch infiltrierende Zellen wie mononukleare Zellen, die v.a. TGF-ß1, PDGF,

TGF-α sowie Zytokine IL-1, IL-6 und Sauerstoffradikale freisetzen (Algül et al., 2007;

Shimizu, 2008). Die aktivierten PSCs veränderten ihre Morphologie zu proliferierenden

myofibroblastenähnlichen Zellen, die neben den o.g. Proteinen α-smooth muscle actin (α-

SMA), Matrix-Metalloproteasen (MMPs) und deren Inhibitoren exprimieren. Das

Vorkommen von α-SMA beschränkt sich normalerweise auf vaskuläre, glatte Muskelzellen

und ist im pankeatischen Gewebe sehr gering. Vielmehr ist dieses Protein als intrazelluläres,

in Mikrofilamentenbündel lokalisiertes Molekül in Myofibroblasten, glatten Muskelzellen und

Myoepithelzellen zu finden (Gugliotta et al., 1988; Desmouliere et al,. 1993).

MMPs und ihre spezifische Gewebeinhibitoren (TIMPs) werden sowohl von PSCs als auch

von Tumorzellen gebildet. MMPs dienen der Degradation der ECM durch Abbau der

Matrixproteine sowie der Basalmembran und tragen somit zur Metastasierung von

Tumorzellen bei. TIMP-1 und TIMP-2 inhibieren dagegen die MMPs und verhindern damit

den Abbau der ECM (Algül et al., 2007).

PSCs werden nicht nur parakrin stimuliert. Der Nachweis der Expression des TGF-ß1

Rezeptors an der Zelloberfläche und des Signalmoleküls TGF-ß1 zeigt, dass die Aktivität der

PSCs, einst durch exogene Faktoren getriggert, durch autokrine Stimulationsmechanismen

auch bei Abwesenheit exogener Noxen aufrechterhalten wird.

Trotz zahlreicher Studien zur Entstehung einer Desmoplasie im Rahmen diverser

Pankreaserkrankungen sind die zugrundeliegenden Mechanismen zur dessen Entstehung und

Rolle in der pankreatischen Karzinogenese sehr komplex und bisher noch nicht ausreichend

geklärt. Jedoch ist die Akkumulation von gering durchblutetem Stroma ein typisches

Merkmal für PanIN-Läsionen, wobei die Ausprägung mit dem Grad der PanIN-Stufen

zunimmt (Erkan et al., 2012).

V. DISKUSSION

77

In unseren Untersuchungen wiesen die Pankreata Socs3-defizienter KrasG12D-Tumormäuse

morphologisch ebenfalls ausgedehnte Fibrosierungsareale auf. Die Ergebnisse demonstrierten

ein im Vergleich zum Wildtyp bis auf ein Fünftel der Organmasse geschrumpfte

Bauchspeicheldrüse mit diffus nodulärer und lobulierter Parenchymstruktur. Die ausgedehnte

Fibrosierung des sonst weichen Gewebes lässt das Organ derb, knotig und formlos

erscheinen. Diese makroskopisch sichtbaren Veränderungen an den Pankreata der von uns

generierten KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mauslinie deuten auf vorhandene fibrotische Prozesse hin,

die sich scheinbar in weiter fortgeschrittenen Stadien befinden als die der gleichaltrigen

Mäuse mit singulärer KrasG12D-Mutation. Während Pankreata vier Wochen alter Kras

G12D-

Mäuse nahezu unauffällig erscheinen, fallen bei näherer histologischer Betrachtung der

Gewebestruktur gleichaltriger KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäuse ausgedehnte fibrotisch umgebaute

heterogene Areale auf. Dieses desmoplasmatische Stroma ist besonders um PanIN-Läsionen

detektierbar. Die Fibrosierungsprozesse scheinen durch die Socs3-Deletion beschleunigt zu

sein. In Anlehnung an die Arbeit von Ogata und Kollegen könnte die Erklärung für unsere

Ergebnisse darin liegen, dass bei chronischen Entzündungsprozessen, Einwirkung von

chemischen Noxen oder Apoptoseprozessen eine dynamische Kaskade von Reaktionen

hervorgerufen wird, bei der Entzündungszellen wie Makrophagen aktiviert werden, die

anschließend eine Reihe von Zytokinen wie IL-6 und Wachstumsfaktoren produzieren und

freisetzen, wodurch ruhende PSCs zu proliferierenden Myofibroblasten aktiviert werden. Die

zunehmende Transkription des Stat3-Zielgens TGF-ß1 in den Makrophagen aber

wahrscheinlich auch in den transformierten Zellen verursacht eine parakrine Stimulation der

PSCs zu proliferierenden Myofibroblasten, die dann vermehrt ECM-Proteinen wie Kollagene

und Fibronektin freisetzen. Somit stellt TGF-ß1 ein wichtiges Signalmolekül für

Fibrosierungsprozesse dar (Saxena et al., 2002; Ogata et al., 2006). Diese Matrixproteine

fördern in ihrer Gesamtheit die Pankreasfibrosierung. Durch autokrine

Stimulationsmechanismen kann die Aktivierung der PSCs trotz Wegfall der Stimuli

aufrechterhalten werden.

In KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäusen kommt es durch die Socs3-Deletion zu einem Ausfall der

negativen Rückkopplung der Stat3-Signalkaskade, wodurch es möglicherweise zu einer

verstärkten TGF-ß1 Expression und zu einer Beschleunigung der Fibrosierungsprozesse

kommt. Um die Komplexität und die genauen, grundlegenden Mechanismen der

Pankreasfibrosierung genauer verstehen zu können, sind weiterführende Untersuchungen

erforderlich.

V. DISKUSSION

78

5. Die Bedeutung von Socs3 in Transdifferenzierungsprozessen im Pankreas der Kras

G12D-Tumormäuse

Die häufigste bisher bekannte und auch histologisch am besten untersuchte Vorläuferläsion

des Pankreaskarzioms ist die PanIN, die einen duktalen Phänotyp besitzt sowie einen duktalen

Ursprung aufweist. Untersuchungen an genetisch veränderten Mausmodellen haben jedoch

gezeigt, dass durch azinär-duktale Metaplasie tubuläre Komplexe entstehen, die als flache,

intermediäre Strukturen eine weitere, alternative Vorläuferläsion des PDAC bilden können.

Die Metaplasie ist definiert als Umwandlung einer differenzierten Gewebe- bzw. Zellart in

Anpassung auf die vorherrschende Umgebung. Rezidivierende Reizzustände durch

chemische, entzündliche und mechanische Stimuli rufen demzufolge eine meist qualitative

Änderung des Gewebes bzw. der Zellen hervor. Zum Beispiel entsteht durch chronische

Reflux-Ösophagitis aus dem Plattenepithel des unteren Ösophagusbereichs ein

magenschleimhautähnliches Zylinderepithel des Barrett-Ösophagus. In der Regel stellt die

Metaplasie einen reversiblen Vorgang dar, der bei Beendigung des einwirkenden Reizes

eintritt. Bleibt der Stimulus jedoch persistent, kann sich die Metaplasie zu einer Dysplasie

entwickeln (Lowenfels et al., 2000; Hruban et al., 2001; Fléjou, 2005).

Azinär-duktale Metaplasie (ADM) wurde bereits bei der Caerulein-induzierten Pankreatitis im

Kras-Mausmodell beobachtet (Guerra et al., 2007). Es ist jedoch unklar, ob die ADM primär

aus expandierten, duktalen Zellen und durch anschließenden Austausch der azinären Zellen

oder durch direkte Reprogrammierung azinärer Zellen in Zellen mit duktalen Eigenschaften

entwickelt, wobei azinären Zellen bei der PanIN-Entwicklung eine bedeutende Rolle

zugesprochen werden. In KrasG12D-exprimierenden Mäusen treten azinär-duktale Metaplasien

entweder zusammen mit PanIN-Läsionen auf oder sie sind diesen vorangestellt. Es wird somit

postuliert, dass die onkogene Kras-Mutation die ADM, die PanIN-Entwicklung und

letztendlich die Entstehung des Pankreasadenokarzinoms induziert (Kopp et al., 2012).

Die metaplastischen Strukturen enthalten sowohl azinäre Zellen mit Zymogengranula als auch

Übergangszellen mit duktalen Merkmalen wie muzinöses Zytoplasma, CK-19 Expression und

Sox9-Bildung (Zhu et al., 2007; Morris et al., 2010). Wie im humanen Pankreaskarzinom

entwickelten sich in den Pankreata der KrasG12D

;Pdx1-Cre- und LSL-KrasG12D

;p48Cre-

Mäuse drei verschiedene Zonen von Zellen, die aus PanINs, ADM und normalen Azinus-

Zellen bestehen. Aufgrund des frühen Auftretens der ADM im Rahmen der humanen,

pankreatischen Karzinogenese ist ihre Bedeutung im Rahmen der Tumorprogression bisher

nur wenig erforscht. Im in-vivo-Mausmodell jedoch zeigte sich bereits bei vier Wochen alten

LSL-KrasG12D

;p48Cre-Tumormäusen ausgedehnte azinäre Metaplasie, die aufgetriebene,

http://gut.bmj.com/search?author1=J-F+Fl%C3%A9jou&sortspec=date&submit=Submit

V. DISKUSSION

79

offene Lumina besitzen und muzin-produzierende Gang-ähnliche Zellen enthalten (Zhu et al.,

2007). Der Nachweis sowohl von Amylase (spezifischer Marker von Azinus-Zellen) als auch

von K19 (CK-19, spezifischer Marker duktaler Zellen) bestätigte das Vorliegen einer

metaplastischen Veränderung. Weiterführende Immunoblot-Untersuchungen offenbarten eine

Abnahme der azinären Genprodukte, während die Bildung duktaler Genprodukte anstieg.

Diese Ergebnisse der Arbeitsgruppe um Zhu demonstrierten deutlich die Kras-induzierte

Veränderung der Azinus- zu duktalen Zellen in KrasG12D

;p48Cre-Mäusen. Die

Zellproliferation innerhalb der metaplastischen Strukturen ist sehr hoch, wobei sich die Zellen

erst nach Umwandlung in Gang-ähnliche Zellen aktiv teilen.

In der vorliegenden Arbeit konnten wir in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Zhu

und Kollegen bereits in der vierten Lebenswoche azinär-duktale Metaplasie und vereinzelte,

frühe PanIN-Läsionen detektieren. Mit steigendem Alter der Tiere nahm die Anzahl

histologisch erkennbarer Ducti mit Formanomalie zu, die auf einen metaplastischen duktalen

Prozess hindeutete. Die positive immunhistochemische Detektion von duktalen Markern wie

CK-19 und Mucinen sowie die morphologisch ausgeweiteten, offenen Lumina der tubulären

Strukturen deuteten ebenfalls auf eine azinär-duktale Metaplasie hin.

In vielen Untersuchungen versuchten Forscher herauszufinden, welche molekulargenetische

Mechanismen für die metaplastische Veränderungen verantwortlich sind und inwiefern sich

diese von den der PanIN-Vorläuferläsionen unterscheiden. Dabei konnten sie feststellen, dass

viele in den metaplastischen Komplexen aktivierten Signalkaskaden auch in frühen PanIN-

Vorläufern vorzufinden waren (Kopp et al., 2012). Unter anderem werden dem Notch- (Zhu

et al., 2007), EGF- und dem Hedgehog-Signaltransduktionsweg eine große Bedeutung

zugeschrieben (Means et al., 2005; Pasca di Magliano et al., 2006; De La O et al., 2008;

Fendrich et al., 2008).

Ein weiterer für die ADM- bzw. PanIN-Entwicklung relevanter Signalweg stellt die Stat3-

Signalkaskade dar. Die Akkumulation von ADM und PanIN-Vorläuferläsionen in Pdx1-

Cre;LSL-KrasG12D-Mäusen veranlasste zur Überprüfung der Rolle von Stat3 in der

Entwicklung dieser für die pankreatische Karzinogenese wichtigen Veränderungen. Die

Pankreata der Stat3-defizienten KrasG12D-Mäuse wiesen im Vergleich zu den Pdx1-Cre;LSL-

KrasG12D

;Stat3F/+-Kontrolltieren zum größten Teil ein normales Pankreasparenchym mit

vereinzelten, sporadisch auftretenden ADM und PanINs auf. Das Organgewebe der

Kontrollmäuse zeigte hingegen ausgedehnte azinär-duktale Metaplasien und PanIN-

Formationen als Antwort auf eine exzessive Stat3-Aktivierung zu p-Stat3. Somit konnte

geschlussfolgert werden, dass die Stat3-Deletion die Kras-induzierte ADM- und PanIN-

V. DISKUSSION

80

Bildung bzw. -Progression zwar nicht verhindert, diese aber deutlich vermindert. Somit stellt

der Stat3-Signalweg bzw. die IL-6-Signaltransduktion mögliche, therapeutische Ziele in der

Behandlung des pankreatischen Adenokarzinoms dar (Corcoran et al., 2011).

Eine Stat3-Überexpression im Rahmen der azinär-duktalen Differenzierung wurde ebenfalls

in der genetisch generierten Ptf1a-Cre;CAG-CAT-PDX1-Mauslinie der Arbeitsgruppe um

Miyatsuka beobachtet. Neben der persistierenden Pdx1-Synthese, was die Induktion von

ADM verursacht, wurde von einer verstärkten Stat3-Aktivierung in den metaplastisch

veränderten, duktalen Einheiten des Organparenchyms berichtet. Die Ergebnisse von

Miyatsuka und Kollegen verdeutlichten die essenzielle Bedeutung der Hoch-Regulation von

Pdx-1 und der konstitutiven Stat3-Aktivierung für die Formation tubulärer Komplexe. Als

Antwort auf die Stat3-Hyperaktivierung in Ptf1a-Cre;CAG-CAT-PDX1-Mäusen fanden sie

eine Überexpression von Socs3. Dieses Resultat legte dem negativen Regulator Socs3 eine

regulierende Funktion auf den Stat3-Signalweg im Rahmen der ADM nahe (Miyatsuka et al.,

2006).

Unsere immunhistochemische Schnittfärbungen von KrasG12D-Mäusen bestätigen die

Ergebnisse der oben beschriebenen Arbeiten, dass die metaplastischen Veränderungen

vermehrt Stat3 exprimieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die verstärkte

Aktivierung von Stat3 in diesem Mausmodell ein frühes Ereignis bei der Entwicklung von

metaplastischen Strukturen darstellt. Im Rahmen weiterführender Untersuchungen

überprüften wir die Abhängigkeit der Reprogrammierung von Azini in duktale Zellen in vivo

von Socs3. Auch hier fanden wir Socs3 als Antwort auf die verstärkte Stat3-Aktivierung in

den metaplastischen Pankreasstrukturen der KrasG12D-Mäuse überexprimiert vor. Somit legt

die starke Induktion des endogenen Inhibitors eine regulierende Funktion des Socs3 in der

azinär-duktalen Metaplasie nahe. Eine Socs3-Deletion in der von uns generierten

KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mauslinie mit früher und verstärkter Stat3-Expression resultiert in einer

Beschleunigung der ADM bzw. PanIN-Progression in den entsprechenden Organen. Im

Vergleich zu gleichaltrigen KrasG12D-Kontrollmäusen sind metaplastisch duktale

Veränderungen bereits in der vierten Lebenswoche ausgedehnt im Pankreasgewebe der

KrasG12D

;Socs3Δpanc-Tumormäuse vorzufinden, während die Geweben der Kontrollmäuse

nahezu normal erscheinen. Immunhistochemische Untersuchungen auf CK-19, Mucin 1 und

Mucin 5 dienten zur genauen Charakterisierung der ADM und der Bestätigung der

Beschleunigung der ADM in Socs3-deletierten Mäusen. Bereits im Alter von vier Wochen

entwickeln KrasG12D

;Socs3Δpanc-Tumormäuse metaplastische Gänge mit ausgedehnter CK-19,

Muc1 und Muc5-Expression, während gleichaltrige KrasG12D-Kontrollmäuse ein nahezu

V. DISKUSSION

81

unauffälliges Organ aufweisen. Diese azinär-duktale Metaplasie könnte die Entstehung von

pankreatischen Neoplasien hervorrufen, sodass weiterführende Untersuchungen benötigt

werden.

6. Ausblick

Über die Inaktivierung von Socs3 in humanen Karzinomen und Tumorzelllinien ist in einigen

Arbeiten berichtet worden (He et al., 2003; Sutherland et al., 2004; Weber et al., 2005; Niwa

et al., 2005). Die Bedeutung von Socs3 im murinen in-vivo-Modell des Pankreaskarzinoms

blieb jedoch bisher unbeleuchtet. In unseren Untersuchungen konnten wir zeigen, dass die

KrasG12D-Mauslinie zeit- und altersabhängig alle PanIN-Stufen entwickelten, die den

humanen pankreatischen Vorläuferläsionen entsprechen. Zudem ließ sich eine starke Stat3-

Phosphorylierung am Tyrosinrest Y705 in den KrasG12D-Tumormäusen nachweisen. Socs3

wird Stat3-abhängig exprimiert und fungiert in den PanIN-Läsionen als essentieller Regulator

der Aktivierung und Inhibition von Stat3 und bestimmt somit über die zeitabhängige

Progression der PanINs im KrasG12D-Tumormausmodell.

Aus unseren Ergebnissen können wir damit annehmen, dass auch in humanen

Pankreaskarzinomen die Ausschaltung der Socs3-Aktivität eine Beschleunigung der malignen

Transformation und Progression bedeutet.

In einigen durchgeführten experimentellen Untersuchungen der letzten Jahre versuchten

Forscher die Socs3-Effizienz auf molekulargenetischer Ebene wiederherzustellen. In humanen

Tumorzelllinien wurde die häufig vorzufindende Methylierung und folglich Inaktivierung des

Socs3-Gens durch die Behandlung mit der demethylierenden Verbindung 5-aza-2-

deoxycytidin (5-AZA-DC; Sutherland et al., 2004; Weber et al., 2005; Niwa et al., 2005) oder

Socs3-Gen tragender viraler (CMV, Adenoviren) Vektoren (Lin et al., 2010; Rossa et al.,

2012) aufgehoben. Die dadurch ermöglichte Reaktivierung der Socs3-Expression reduzierte

die Proliferationsrate und induzierte die Apoptose von humanen Tumorzellen. Ebenfalls kam

es zu einer Down-Regulierung der Stat3-Phosphorylierung sowie der Stat3-abhängigen

Zielproteine, die diverse Mechanismen des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung, der

Apoptose und Inflammation steuerten (He et al., 2003; Weber et al., 2005; Iwahori et al.,

2011). Diese Ergebnisse demonstrierten, dass das endogene Inhibitorprotein Socs3 einen

potenziell tumorsuppressiven Effekt besitzt und dessen Inaktivierung eine Beschleunigung der

Tumorprogression bedeutet. Bisher ist der Einfluss von Socs3 auf die Initiierung und

Progression von präneoplastischen Läsionen des Pankreas zu duktalen Adenokarzinomen

kaum beleuchtet worden. Mit den gewonnenen Daten gelang unserer Arbeitsgruppe erstmalig

VI. ZUSAMMENFASSUNG

82

der Nachweis, dass Socs3 die Rolle eines essentiellen Regulators der zeitabhängigen

Progression der PanINs in der KrasG12D-initiirenden Onkogenese des Pankreas einnimmt und

die Inaktivierung dieses endogenen Inhibitors letztlich in einer malignen Entartung duktaler

Zellen endet. Diese Erkenntnisse über die Funktion und Mechanismen des Stat3/Socs3-

Signalweges sollen den Ausgangspunkt für weitere sowohl experimentelle als auch klinische

Untersuchungen zur Validierung eines spezifischen und vielversprechenden Targets in der

Therapie des hochaggressiven Pankreasadenokarzinoms darstellen.

VI. ZUSAMMENFASSUNG

Das Pankreaskarzinom steht an vierter Stelle der tumorbedingten Todesfälle. Mit einer

medianen Überlebenszeit von etwa drei bis fünf Monaten und einer 5-Jahresüberlebensrate

von weniger als 5% hat das Pankreaskarzinom eine düstere Prognose (Hezel et al., 2006).

Wesentliche Ursachen für das schlechte Outcome dieser Tumorerkrankung sind die späte

Diagnosestellung, frühe Metastasierung und mangelnde Therapieoptionen (Lionetto et al.,

1995; Yeo et al., 2002b; Kleef et al., 2007a).

Für die Entstehung des duktalen Pankreasadenokarzinoms wurde auf histopathologischer und

molekulargenetischer Ebene ein spezifisches Tumorprogressionsmodell entwickelt.

Demzufolge entsteht der invasive Tumor aus definierten, präneoplastischen

Vorläuferläsionen, den sogenannten pankreatischen intraepithelialen Neoplasien (PanINs), die

wiederum in drei Stadien eingeteilt sind. Mit steigendem Schweregrad dieser Läsionen

nehmen die architektonischen und zellulären Veränderungen der duktalen Strukturen

ebenfalls zu. Molekulargenetische Untersuchungen haben gezeigt, dass die einzelnen PanIN-

Progressionsstufen bestimmte genetische Veränderungen in Form von Mutationen der

Onkogene und Tumorsuppressorgene aufweisen (Hruban et al., 2000).

Mithilfe des Cre/loxP-Rekombinationssystems gelang David Tuveson und Tyler Jacks die

Etablierung eines Mausmodells, in dem die pankreasspezifische KrasG12D-Mutation am Exon1

des entsprechenden Gens vorliegt. In diesem Tumormausmodell konnte das komplette PanIN-

Spektrum rekapituliert werden, da die genetisch veränderten Mäuse alters- und zeitabhängig

alle Stadien dieser Vorläuferläsionen aufzeigen (Jackson et al., 2001). Ausgehend von diesem

etablierten KrasG12D-Tumormausmodell sind verschiedene komplexe Tiermodellsysteme

entwickelt worden, die additiv zu dem mutierten Kras-Allel andere genetische Veränderungen

aufzeigen. Damit lässt sich der Einfluss einzelner Genmutationen auf die

VI. ZUSAMMENFASSUNG

83

Karzinomentwicklung und –progression genauer analysieren und mögliche Ansatzpunkte für

ein gezieltes medizinisches Eingreifen finden.

Das Socs3-Molekül hat intrazellulär eine auf den IL6/Jak2/Stat3-Signalweg inhibierende

Funktion. Stat3-vermittelt exprimiert, moduliert dieses Inhibitorprotein in einer Feedback-

Schleife die Stat3-Phosphorylierung und somit die Stat3-abhängige Expression von

bestimmten Zielgenen, die Prozesse der Proliferation, Apoptose, Angiogenese und

Inflammation steuerten. In zahlreichen humanen Tumorgeweben bzw. -zelllinien konnte

bereits eine Inaktivierung von Socs3 wie z.B. durch eine Hypermethylierung der

Promotorregion und folglich eine Hemmung der Socs3-Transkription als epigenetische

Veränderung nachgewiesen werden (Sutherland et al., 2004; Weber et al., 2005; Niwa et al.,

2005). Die Auswirkung einer Socs3-Defizienz auf die Progression der Vorläuferläsionen zu

duktalen Adenokarzinomen in der pankreatischen Onkogenese blieb bisher jedoch

unbeleuchtet.

In dieser Arbeit haben wir zunächst die Expression von Stat3 und Stat3-abhängigen Proteinen

v.a. Socs3 in KrasG12D-Tumormäusen auf proteinbio- und immunhistochemischer Ebene

bestätigt. Daraus konnte geschlussfolgert werden, dass Socs3 eine balancierende Funktion auf

die Stat3-Phosphorylierung ausübt.

Um die Auswirkung einer Socs3-Defizienz auf die PanIN-Progression genau beurteilen zu

können, generierten wir in einem weiteren Schritt mithilfe der Cre/loxP-Technologie eine

KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mauslinie, die eine Deletion des für die Bindungsdomäne am gp130-

Rezeptor kodierenden Exons 2 im Socs3-Gen aufweisen. Durch diese genetische Mutation ist

die Bindung an den intrazellulären Rezeptorbestandteil und folglich die Feedback-Hemmung

der Stat3-Phosphorylierung nicht mehr gewährleistet.

Socs3-defiziente KrasG12D-Mäuse weisen keine Beeinträchtigung in der morphologischen und

funktionellen Entwicklung des exokrinen und endokrinen Pankreas auf. Ebenso wird die

Ausprägung der KrasG12D-Mutation durch die Socs3-Deletion nicht beeinflusst. Diese

Mauslinie ermöglicht somit die Untersuchung des Inhibitorproteins Socs3 auf die

pankreatische Karzinogenese und die Stat3-Phosphorylierung.

Unsere morphologische und biochemische Forschungsergebnisse demonstrieren für

KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäuse im Vergleich zu den Kras

G12D-Kontrolltieren eine frühzeitige und

prolongierte Stat3-Phosphorylierung, die bereits nach vier Wochen postpartum detektierbar

ist, sowie eine Beschleunigung der KrasG12D-initiierenden PanIN-Progression.

Interessanterweise ist das Pankreas der Socs3-defizienten KrasG12D-Mäuse schon zum

Zeitpunkt von vier Wochen morphologisch sehr stark umgewandelt. In dem fibrotisch

84

umgebauten Organ sind heterogne Areale detektierbar, die neben normalen Azinis ausgeprägt

hochgradig veränderte Gänge in Form von PanINs aufweisen.

Das endogene Inhibitorprotein Socs3 übt somit die Rolle eines Tumorsuppressors in der

Onkogenese des Pankreas aus und bestimmt über die Regulation der Stat3-Phosphorylierung

die PanIN-Progression. Unsere Ergebnisse dienen dazu, einen neuen vielversprechenden

Ansatz in der Therapie und Prophylaxe des Pankreaskarzinoms zu definieren und zu

etablieren, weshalb weitere experimentelle und klinische Studien angeschlossen werden

sollten.

VII. LITERATURVERZEICHNIS

85


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VIII. ABBILDUNGSVERZEICHNIS

99

VIII. ABBILDUNGSVERZEICHNIS

Abbildung 1: Morphologische Tumorprogression über PanIN-Vorläuferläsionen ................... 8

Abbildung 2: Morphologisches und genetisches Progressionsmodell des duktalen Pankreaskarzinoms. .................................................................................................................. 10

Abbildung 3: Gewebespezifische Deletion von Mausgenen mittels Cre/loxP-Technologie. .. 13

Abbildung 4: Systematik der Generierung des KrasG12D-Tumormausmodells. ....................... 16

Abbildung 5: Schematische Darstellung der SOCS3-Architektur. .......................................... 18

Abbildung 6: SOCS3 als Trägermolekül des E3-Ubiquitin-Ligase-Komplexes ..................... 18

Abbildung 7: Die Mechanismen der Aktivierung der IL-6/Jak/Stat3-Signalkaskade und dessen Feedback-Inhibition durch SOCS3-Moleküle .......................................................................... 19

Abbildung 8: Die Aktivierung der Ras/Raf/MAPK- und PI3K/AKT-Signalkaskade durch IL-6 und dessen negative Regulation durch Socs3........................................................................... 20

Abbildung 9: Schematische Darstellung der Generierung der Socs3Δpanc-Mauslinie. ............. 42

Abbildung 10: Nachweis der Deletion von Exon 2 im Socs3-Gen mittels mRNA Konzentrationsbestimmung ...................................................................................................... 43

Abbildung 11: PCR-Analysen der möglichen Genotypen aus der Kreuzung von Socs3F/F-und

Ptf1a-Creex1-Mäusen. ............................................................................................................... 44

Abbildung 12: Charakterisierung des exokrinen und endokrinen Pankreaskompartiments. ... 45

Abbildung 13: Gewichtsanalyse der Socs3Δpanc- und Socs3

F/F-Nachkommen. ........................ 47

Abbildung 14: Proteinbiochemischer Nachweis der Expression von Stat3 und p-Stat3 in Pankreata neun Wochen alter Kras

G12D-Mäuse ........................................................................ 48

Abbildung 15: Quantitative Real-Time-PCR Analysen der vermehrten Expression von Socs3-mRNA in neunWochen alten Kras

G12D-Mäusen. ..................................................................... 49

Abbildung 16: Immunhistochemische Detektion von Socs3 in Zellen der Azini (schwarze Pfeile) und in den PanIN-Läsionen (weiße Pfeile) neun Wochen alter Kras

G12D-Mäuse. ....... 49

Abbildung 17: Aktivierung der Stat3-Signalkaskade im KrasG12D-Mausmodell. .................... 51

Abbildung 18: Proteinbiochemischer Nachweis der Socs3-Defizienz in KrasG12D

;Socs3Δpanc-

Mäusen. .................................................................................................................................... 53

Abbildung 19: Nachweis der Expression konstitutiv aktiver K-Ras-Proteine. ........................ 54

Abbildung 20: Gewichtsanalyse sechs Wochen alter KrasG12D

;Socs3Δpanc-Mäuse (n=7) im

Vergleich zu gleichaltrigen KrasG12D-Kontrollmäusen (n=7) und zum Wildtyp (n=17). ........ 55

Abbildung 21: Analyse des makroskopischen Pankreasaspekts. ............................................. 56

100

Abbildung 22: Morphologische Charakterisierung der PanINs und des PDA ......................... 58

Abbildung 23: Vergleichende Auswertung der Gesamtzahl an Ausführungsgängen pro zehn Gesichtsfelder an mindestens 17 sequentiellen Schnitten vier Wochen alter Versuchstiere (200-fache Vergrößerung) ........................................................................................................ 60

Abbildung 24: Quantifizierung der reaktiven Gänge und PanIN-Läsionen pro zehn Gesichtsfelder in mindestens 17 sequentiellen Feingewebsschnitten zum Zeitpunkt von vier Wochen und bei 200-facher Vergrößerung .............................................................................. 61

Abbildung 25: Immunhistochemischer Nachweis der übermäßigen Expression von CK-19, p-Stat3 und Cyclin D1 in reaktiven Gängen und PanIN-Läsionen vier Wochen alter Kras

G12D;Socs

Δpanc-Mäuse. 100-fache Vergrößerung .............................................................................................................. 62

Abbildung 26: H.E.-Färbung des duktalen Adenokarzinoms des Pankreas und immunhistochemische Detektion von CK-19 und p-Stat3 in atypischen, drüsenartigen Gangstrukturen. .............................. 63

Abbildung 27: Detektion von Muc1, Muc5 und CK-19 in Pankreata vier und neun Wochen alten Mäusen mittels immunhistochemischer Färbung zur genauen Charakterisierung der neoplastisch transformierten Gänge. 100-fache Vergrößerung. .......................................................................... 64

IX. TABELLENVERZEICHNIS

101

IX. TABELLENVERZEICHNIS Tabelle 1: Chemikalien ............................................................................................................ 24

Tabelle 2: Geräte und Hilfsmittel ............................................................................................. 26

Tabelle 3: Puffer und Lösungen ............................................................................................... 28

Tabelle 4: Gele ......................................................................................................................... 28

Tabelle 5: Antikörper für IHC .................................................................................................. 29

Tabelle 6: Antikörper für Western Blot ................................................................................... 30

Tabelle 7: Primer ...................................................................................................................... 30

Tabelle 8: Mäuse ...................................................................................................................... 30

X. DANKSAGUNG

102

X. DANKSAGUNG

Die Dissertation wurde an der II. Medizinischen Klinik und Poliklinik der Medizinischen

Fakultät der Technischen Universität durchgeführt.

An dieser Stelle bedanke ich mich bei all den Menschen, die am Zustandekommen dieser

Dissertation beteiligt waren:

Mein ganz besonderer Dank geht an meinen Doktorvater Herrn Priv.-Doz. Dr. Hana Algül,

der mich herzlich in sein Forschungsteam aufgenommen und mir das überaus interessante und

anspruchsvolle Thema dieser Arbeit zur Verfügung gestellt hat. Durch ihn ergab es für mich

die Möglichkeit in einer hochprofessionellen Arbeitsgruppe tätig sein zu dürfen und auf

fachlich höchstem Niveau Einblicke in die Grundlagenforschung zu erhalten. Desweiteren

möchte ich mich bei meinem Doktorvater für seine Betreuung, Geduld, Motivation und

konzeptionelle Unterstützung bei der Fertigstellung der Dissertation bedanken. Trotz seines

weitreichenden Engagements sowohl im klinischen als auch wissenschaftlichen Bereich stand

er mir zu jeder Zeit mit Rat und Tat zur Seite.

Vielen herzlichen Dank!

Dem Direktor der II. Medizinischen Klinik und Poliklinik Herrn Prof. Dr. med. R.M. Schmid

danke ich für die Möglichkeit, in seiner Klinik promovieren zu dürfen.

Bei Frau Marina Lesina und Frau Karen Dlubatz möchte ich mich besonders für die

hochkompetente Einführung in die wissenschaftlich-experimentelle Arbeit des

Gastroenterologischen Forschungslabors und ihre unerschöpfliche Geduld bedanken. Mit

ihrer Hilfe war es mir möglich enorme praktische Kenntnisse und Erfahrungen zu gewinnen.

Ebenso möchte ich mich bei all den wissenschaftlichen Mitarbeitern des

Gastroenterologischen Forschungslabors für ihre Hilfsbereitschaft bedanken. Auch meinen

Mitdoktoranden danke ich für ihre Unterstützung bei manchen Experimenten.

Meinen Eltern Herrn Phan Nhan Hoa und Frau Chu Thi Minh Hao und meiner Schwester

Phan Ngoc Trang danke ich für ihre Fürsorge, Liebe und Unterstützung. Ohne sie wären mein

Medizinstudium und diese Promotion nicht möglich und ihnen möchte ich diese Arbeit

widmen.

Vielen Dank, liebe Eltern und Schwester!

Bei meinem Freund Nico Brehm möchte ich mich für die tatkräftige Unterstützung nicht nur

bei der Fertigstellung der Dissertation sondern auch bei zahlreichen Prüfungen bedanken. In

103

vielen schlaflosen Nächten war er die Person, die immer an meiner Seite stand und mich

immer wieder psychisch und physisch aufbaut.

Vielen, vielen Dank Nico!

Mein letzter Dank geht an Herrn Andreas Kaiser, der diese Arbeit für mich Korrektur las.

Herzlichen Dank für die ausgezeichneten und wertvollen Hinweise!

XI. ERKLÄRUNG

104

XI. ERKLÄRUNG

Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und unter Verwendung der

angegebenen Hilfsmittel, persönlichen Mitteilungen und Quellen angefertigt habe.

München, den 23.03.2014

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