UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2015 – 2016

THERAPEUTISCHE NANOBODIES

Door

Marien HEKKELMAN

Promotoren: Prof. Dr. Niek Sanders Literatuurstudie in het kader

Sean Mc Cafferty, MSc. van de Masterproef

© 2016 Marien Hekkelman

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of

volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk

uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden.

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor

enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig

vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2015 – 2016

THERAPEUTISCHE NANOBODIES

Door

Marien HEKKELMAN

Promotoren: Prof. Dr. Niek Sanders Literatuurstudie in het kader

Sean Mc Cafferty, MSc. van de Masterproef

© 2016 Marien Hekkelman

VOORWOORD

Hierbij wil ik graag mijn promotor Sean Mc Cafferty hartelijk bedanken voor het grondig nakijken en

verbeteren van mijn Masterproef. Zonder zijn inzet was de weg naar het voltooien van deze

literatuurstudie een stuk moeilijker geweest. Tevens wil ik mijn moeder bedanken voor het doorlezen

en corrigeren van mijn werk.

INHOUDSOPGAVE

VOORWOORD

INHOUDSOPGAVE

SAMENVATTING .................................................................................................................................... 1

INLEIDING ............................................................................................................................................... 2

LITERATUURSTUDIE ............................................................................................................................. 3

1. Kenmerken en eigenschappen van heavy-chain antistoffen en Nanobodies ..................................... 3

1.1. Structuur van de HCAbs................................................................................................................ 3

1.2. Structuur van de VHH ................................................................................................................... 4

1.3 Biochemische en fysiologische eigenschappen van Nanobodies .................................................. 5

1.4 Selectie en productie van Nanobodies via de phage-display techniek ......................................... 7

2. Therapeutische en diagnostische toepassingen van Nanobodies tegen kanker en tumoren ........... 10

2.1. Antagonistische Nanobodies ...................................................................................................... 10

2.1.1 Epidermal growth factor receptor (EGFR) ............................................................................ 11

2.1.2. Hepatocyte growth factor (HGF) en de c-Met receptor ...................................................... 11

2.1.3. Vascular endothelial growth factor (VEGF) en de VEGF-receptor 2 (VEGFR2) ................... 12

2.2. Targeting agents of effector domain .......................................................................................... 14

2.2.1. β-lactamase als effectordomein .......................................................................................... 14

2.2.2. Een toxine als effectordomein ............................................................................................ 14

2.2.3. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand .................................................. 15

2.2.4. Radioimmunotherapie ........................................................................................................ 15

2.3. Drug delivery systems ................................................................................................................ 16

2.3.1. Nanobody-liposomen .......................................................................................................... 16

2.3.2. Nanobody-micellen ............................................................................................................. 17

2.3.3. Nanobody-albumine nanopartikels ..................................................................................... 18

2.4. Nanobodies als diagnostische instrumenten ............................................................................. 19

2.4.1 Nucleaire beeldvorming ....................................................................................................... 19

2.4.2. Optische beeldvorming ....................................................................................................... 21

Discussie ............................................................................................................................................... 23

Referentielijst ......................................................................................................................................... 25

1

SAMENVATTING

Het gebruik van monoklonale antistoffen heeft een revolutie teweeggebracht voor zowel

kankertherapie als beeldvorming. Desondanks is de werkzaamheid van antistof-gebaseerde therapie

nog beperkt en de distributie in tumoren wordt belemmerd door hun grootte, zodat verdere

verbeteringen ijverig worden afgewacht. Sera van kameelachtigen bevatten zowel conventionele

antistoffen als unieke functionele zware (H)-keten antistoffen (HCAbs) en werden per toeval ontdekt in

1993. De H-keten van deze homodimere antilichamen bestaat uit een antigenbindend domein, het

VHH of Nanobody, en twee constante domeinen. Deze Nanobodies hebben een aantal voordelen en

unieke eigenschappen ten opzichte van conventionele antistoffen zoals: kleiner formaat, stabiliteit,

lage immunogeniciteit, goede bindingscapaciteit, gemakkelijke selectie en productie, en het eenvoudig

kunnen construeren van multifunctionele antigenbindende constructies. De ontdekking van deze

eigenschappen heeft Nanobodies veranderd van een interessante evolutionaire vondst naar potentieel

een nieuwe generatie therapeutische en diagnostische middelen voor allerlei ziekten. Voor

kankertherapie kunnen Nanobodies werkzaam zijn als antagonistische medicatie, targeting agents

van effector-domeinen en drug delivery systems. Tegelijkertijd worden er Nanobodies ontwikkeld voor

moleculaire beeldvorming, waaronder nucleaire en optische beeldvorming. In deze literatuurstudie

wordt de stand van zaken bekeken van Nanobodies en hun toepassingen op het gebied van

diagnostiek en therapie bij kanker.

Sleutelwoorden: Kanker – Kameelachtigen – Nanobody – Therapie - VHH

2

INLEIDING

Kanker is één van de meest voorkomende doodsoorzaken in de wereld met 14 miljoen nieuwe

gevallen en meer dan 8 miljoen doden per jaar in 2012 (Stewart et al., 2015). Verwacht wordt dat het

aantal kanker gerelateerde ziekte gevallen zal stijgen naar 22 miljoen in de komende 20 jaar. Veel

soorten kanker kunnen voorkomen worden door bepaalde risicofactoren te vermijden zoals roken,

overgewicht en een ongezond dieet. De mortaliteit kan verlaagd worden door eerder en betere

diagnoses te stellen, het verbeteren van bestaande therapieën en het ontwikkelen van nieuwe

therapieën. Reeds lang bestaande therapieën zoals radio- en chemotherapie werken over het

algemeen goed maar hebben veel bijwerkingen aangezien ze weinig specifiek zijn. In de laatste

anderhalve decennia is er veel vooruitgang geboekt met op antistof gebaseerde therapie (Scott et al.,

2012). Antistoffen kunnen specifiek antigenen binden die enkel of in meerdere mate aan een bepaalde

kankercel gecorreleerd zijn, hetzij door op het celoppervlak ofwel in de buurt van de kankercel

aanwezig te zijn. Daardoor kan gericht een therapeutisch of diagnostisch resultaat bekomen worden

met minder bijwerkingen als gevolg.

De antistoffen die door het immuunsysteem van vertebraten worden geproduceerd hebben eenzelfde

structurele basis en samenstelling bestaande uit twee identieke zware ketens en twee identieke lichte

ketens. Bij toeval werd een speciaal type antistof gevonden bij kameelachtigen dat enkel bestaat uit

twee identieke zware ketens (Hamers-Casterman et al., 1993). Naast het ontbreken van de lichte

ketens ontbrak ook het eerste constante deel van de zware ketens. Opmerkelijk genoeg bleek de

bindingscapaciteit van deze heavy chain antibodies gelijkaardig te zijn aan normale antistoffen. Later

werden ook bij bepaalde primitieve vissoorten soortgelijke heavy chain antibodies gevonden

(Greenberg et al., 1995). Bij de mens en de muis werden eveneens heavy chain antibodies

geconstateerd maar deze zijn het gevolg van een genetisch defect en zijn niet functioneel (Franklin et

al., 1964). Het antigenbindend domein of variabel domein van een enkele zware keten van de heavy

chain antibodies is in staat om een antigen te binden met grote affiniteit en dit in tegenstelling tot

variabele domeinen van alleenstaande ketens van normale antistoffen. Het variabele deel van de

zware keten van heavy chain antibodies afkomstig van kameelachtigen is daarmee het kleinste

natuurlijk afgeleide antigenbindend fragment en worden ook wel Nanobodies genoemd. De term

Nanobody werd bedacht door het bedrijf Ablynx® vanwege de grootte van Nanobodies in de

nanometer schaal (4nm x 2,5nm, 15 kDa). Conventionele antistoffen zijn veel groter (14,2nm x 8,5nm,

150 kDa) wat een groot nadeel is omdat ze daardoor een beperkte penetratie en een trage distributie

hebben in tumorweefsel. Om dit probleem op te lossen werden kleinere constructies bedacht en

uitgeprobeerd maar daar kwamen vaak weer andere problemen uit voort, onder andere met stabiliteit,

aggregatie en een lagere affiniteit.

In deze literatuurstudie zal een overzicht worden gegeven van de structurele en biochemische

eigenschappen van Nanobodies, de voor- en nadelen van deze eigenschappen ten opzichte van

conventionele antistoffen en welke eigenschappen relevant zijn voor kankertherapie. Aanvullend

zullen verschillende therapeutische strategieën en diagnostische technieken voor kanker worden

aangehaald met de bijhorende studies die tot dusver zijn uitgevoerd.

3

LITERATUURSTUDIE

1. Kenmerken en eigenschappen van heavy-chain antistoffen en Nanobodies

De structuur van conventionele antistoffen bestaat uit twee lichte ketens en twee zware ketens. De

lichte ketens bestaan uit twee delen, namelijk een variabel domein (VL) en een constant domein (CL).

De zware ketens bestaan uit vier delen, een variabel domein (VH) en drie constante domeinen (CH1,

CH2 en CH3). Het verschil met de heavy-chain antistoffen (HCAb) bij kameelachtigen (Hamers-

Casterman et al., 1993) is het ontbreken van de lichte ketens. De variabele domeinen van HCAb

worden voor het gemak VHH genoemd. De term Nanobody refereert aan een ‘alleenstaande’ VHH dat

niet meer verbonden is met een zware keten maar nog wel functioneel antigenbindend is (figuur 1).

1.1. Structuur van de HCAbs

Men kan verschillende eiwitdomeinen onderscheiden

in de structuur van HCAbs van kameelachtigen: een

variabel domein (VHH) dat de binding met het

antigen voorziet, gevolgd door een flexibele

scharnierregio en twee constanten delen (CH2 en

CH3). Een derde constante regio (CH1) die men wel

bij conventionele antilichamen terugvindt, komt niet

voor bij HCAbs. Nguyen kon verschillende

puntmutaties vinden aan de 3’ zijde van het CH1

exon die dit zouden kunnen verklaren. Deze mutaties

introduceren namelijk een extra splicing site

waardoor de coderende sequentie van het CH1

segment tijdens mRNA splicing wordt verwijderd

(Nguyen et al., 1999). Door het ontbreken van CH1

is ook de bindingsplaats verloren gegaan waar

normaal de lichte en de zware ketens interageren.

Bijkomend wordt gesuggereerd dat het scharnier

tussen VHH en CH2 van isotype IgG2 extra lang is

door het verlies van CH1 (figuur 1) (Hamers-

Casterman et al., 1993). Men kan vijf verschillende

antilichaam isotypes onderscheiden op basis van de

scharnierregio in het bloed van lama’s (Vu et al.,

1997). Naast de drie HCAb isotypes, namelijk IgG2a,

IgG2b en IgG3, vond men ook conventionele

antilichamen van 2 IgG1 isotypes die wel een CH1

domein en een lichte keten bevatten (figuur 1).

Figuur 1: Schematische representatie van de antistoffen die voorkomen bij kameelachtigen. IgG1 is een conventionele antistof molecule met twee lichte ketens (bestaande uit de CL en de VL domeinen) en twee zware ketens (bestaande uit de VH, CH1, CH2 en CH3 domeinen). IgG2 en IgG3 zijn HCAbs met enkel nog twee zware ketens (bestaande uit de VHH, CH2 en CH3 domeinen). Nanobody (Nb), de alleenstaande VHH van een HCAb. (Serge Muyldermans, 2013)

4

1.2. Structuur van de VHH

Door de grote genetische gelijkenis hebben VHHs en VHs een homologe opbouw, zo zijn er drie

complementariteitsbepalende regio's (CDR), framework regio’s, en worden VHHs op de dezelfde

manier herschikt door middel van V, D en J segmenten. Hoewel de antigenbindende variabele

domeinen (VHH) van de HCAb op genetisch vlak voor een groot deel lijken op de variabele domeinen

van conventionele antistoffen (VH) zijn er toch een aantal belangrijke verschillen op te merken die het

bestaan en antigenbindende activiteit mogelijk maken.

Het eerste opmerkelijke verschil tussen VHs en VHHs zijn de segmenten die origineel contact hadden

met het VL- en hetCH1-domein. Hoewel deze aminozuursequenties evolutionair sterk zijn

geconserveerd, kunnen verschillende substituties worden waargenomen in vergelijking met een

conventioneel VH domein (S Muyldermans et al., 1994). Framework regio 2 (FR2) heeft in Abs een

domein dat contact maakt met het VL domein door middel van een aantal hydrofobe aminozuren. In

VHHs zijn deze aminozuren vervangen door meer hydrofiele residuen en zorgen bijgevolge voor een

minder ‘klevend’ domein. Conventionele VHs interageren met het CH1-domein wat zorgt voor de

correcte oriëntatie tussen de VH-VL dimeer en de constante delen. Door het ontbreken van CH1 en

de lichte keten zijn deze verbindingen niet meer nodig en heeft het hydrofobe aminozuur plaats

moeten maken voor een meer hydrofiel aminozuur. Op welke posities aminozuren vervangen zijn is

onder andere afhankelijk van de VHH subfamilie en de diersoort (Harmsen et al., 2000).

Ten tweede zijn er verschillen in de hypervariabele

loops (HV-loops)(Vu et al., 1997; S Muyldermans et

al., 1994). Hypervariabele loops zijn 3D-structuren

waarin de complementariteitsbepalende regio’s

(CDRs) gelegen zijn. De hypervariabiliteit komt van

de aminozuursequentie van de CDR’s. De

verschillen zijn een gevolg van het feit dat VHHs in

HCAbs zelfstandig werken, los van de VL, en

derhalve maar de helft van het antigenbindend

oppervlak hebben van normale Abs. Hoewel maar

de helft van het antigenbindende oppervlak

aanwezig is voor HCAbs, kon men aantonen dat er

geen daling is in affiniteit voor het antigen. Dit is

deels te verklaren door een aantal wijzigingen in

deze loop-regio’s. (Sheriff & Constantine, 1996).

Ter hoogte van de HV1 loop is de CDR1 in VHHs

enkele aminozuursequenties langer dan in VHs

doordat enkele aminozuren in de HV1-loop nu deel

uitmaken van CDR1 (Nguyen et al., 2000; Vu et al.,

1997) (figuur 2). In VHHs zijn deze aminozuren aan

de buitenzijde van de HV1-loop gepositioneerd en

Figuur 2: Vergelijking van de variabiliteit van de sequenties in de variabele domeinen van kameelachtigen en de mens. Hier is goed te zien dat bij de kameelachtigen er veel meer variabiliteit upstream van CDR1 (aminozuren 25 t/m 31). (Vu et al., 1997)

5

kunnen op deze manier in contact komen met antigenen. Daarenboven zijn de aminozuren ook veel

variabeler dan de aminozuren in conventionele VHs. Zodoende is de aminozuur variabiliteit van de

CDR1 vergroot vergeleken met normale VHs en is de variabiliteit in CDR1 zelfs groter dan in CDR2,

wat normaal niet het geval is. Een tweede aanpassing aan de HV-loops is te vinden in de H3-loop, of

specifieker in CDR3. Het gemiddeld aantal aminozuren in de CDR3 regio in kameelachtigen is 15 (S

Muyldermans et al., 1994; Vu et al., 1997) tegenover 13 en 10 aminozuren bij respectievelijk mensen

en muizen (Wu et al., 1993) (figuur 3). Dit vergroot ook de variabiliteit en zou voor een deel instaan

voor het verlies van variabiliteit en antigenbindende activiteit van de VL.

Als laatste verschil tussen VHH en VH is er een disulfide brug tussen de H1-loop en de H3-loop (S

Muyldermans et al., 1994). Door de verlenging van de H3-loop is deze loop flexibeler waardoor de

affiniteit van VHHs voor hun antigen zou kunnen verminderen. Deze disulfidebrug maakt van de H3-

loop een meer rigide structuur en verhoogt de conformationele stabiliteit van het Nanobody door de

destabilisatie ten gevolge van de meer hydrofiele aminozuren in framework region 2 tegen te gaan.

(Govaert et al., 2012).

1.3. Biochemische en fysiologische

eigenschappen van Nanobodies

De structurele verschillen zoals hierboven

beschreven hebben een uitgesproken effect

op de biochemische en fysiologische

eigenschappen van HCAbs en Nanobodies.

Verscheidene voordelen komen voort uit

deze veranderingen en zullen hieronder

worden uitgelicht (tabel 1).

De wateroplosbaarheid van VHHs kon

worden verhoogd door de aminozuren op de

plaatsen 37, 44, 45, 47 in de FR2 te

vervangen door meer hydrofiele residuen

(Conrath et al., 2005). Dit werd bevestigd

door in humane VHs dezelfde aminozuren te

vervangen, waar vervolgens ook de

oplosbaarheid verhoogde (Davies &

Riechmann, 1994). De hogere oplosbaarheid

zorgt er tevens voor dat VHHs minder snel

de neiging hebben om met elkaar te gaan

dimeriseren in oplossing (Muyldermans et al.,

2001). De verhoogde stabiliteit van VHHs in

vergelijking met VHs wordt voor een groot

deel gewaarborgd door een extra

disulfidebrug die aanwezig is tussen de

Figuur 3: Fractioneel voorkomen van CDR3 lengtes. In deze figuur is te zien dat de gemiddelde lengte van de CDR3 in de HCAb van kameelachtigen langer is dan de CDR3 in Abs van muizen en mensen. (Vu et al., 1997)

6

CDR3 en de FR2. Deze disulfidebrug compenseert voor het verlies in stabiliteit die normaal wordt

voorzien door de VH-VL interactie. Het verwijderen van deze disulfidebrug met behulp van

recombinante gentechnologie, levert een VHH met verminderde stabiliteit. (Davies & Riechmann,

1996). Zonder deze disulfidebrug zou de conformationele vrijheid van het VHH leiden tot een

verminderde affiniteit voor zijn antigen (Govaert et al., 2012).

De monomere structuur en verhoogde wateroplosbaarheid van VHHs brengen daarnaast nog een

hoop voordelen met zich mee. HCAbs vertonen een veel hogere conformationele stabiliteit dan

beschreven voor conventionele Abs (Dumoulin et al., 2002). Zodoende kunnen VHHs weerstand

bieden aan hogere temperaturen voordat er een significante afname is van de affiniteit. Daarenboven

kon men VHHs identificeren die nog in staat waren om hun antigen te binden bij 90°C, een

temperatuur waarbij de meeste eiwitten thermisch volledig zijn gedenatureerd (Van der Linden et al.,

1999). Eveneens kunnen VHHs, nadat ze zijn ontvouwen, door verhoogde temperaturen weer terug

vouwen naar de originele conformatie en zijn ze terug in staat om antigenen te binden. Een mogelijke

reden hiervoor kan zijn dat VHHs maar één enkel domein moeten terugvouwen terwijl voor

conventionele Abs ook de zware en lichte ketens met elkaar moeten associëren (Ewert et al., 2002;

Pérez et al., 2001).

De affiniteit en specificiteit van VHHs tegenover hun antigen is hoog en er is geen kruis-reactie met

Tabel 1: Correlatie tussen de eigenschappen van Nanobodies met hun toepassingsgebied. (Siontorou, 2013)

7

andere niet-gerelateerde antigenen (Arbabi Ghahroudi et al., 1997). Daarbij kunnen ze wel

onderscheid maken tussen sterk op elkaar lijkende moleculen, alsook verschillende epitopen

herkennen op hetzelfde molecuul (Van der Linden et al., 1999). Bij praktisch elk onderzoek naar VHHs

wordt de affiniteit gemeten en daaruit blijkt telkens weer dat de affiniteit van VHHs in dezelfde

nanomoleculaire range zitten als conventionele Abs (Muyldermans, 2001). De lange CDR3-loop van

VHHs laat toe dat ze unieke epitopen kunnen herkennen en binden in tegenstelling tot conventionele

Abs. Het antigenbindend oppervlak van conventionele Abs is meestal plat tot concaaf terwijl de CDR3-

loop als een soort probe in holtes of groeven kan binden. Dergelijke concave oppervlakken vindt men

vaak terug op plaatsen waar een ligand bindt op zijn receptor en op de actieve plaats van enzymen

(Lauwereys et al., 1998; De Genst et al., 2006). VHHs kunnen daarom competitieve inhibitoren zijn

voor specifieke receptoren of enzymen maar ook verborgen cryptische epitopen binden (Stijlemans et

al., 2004).

Het kleine formaat en een sequentie die weinig verschilt van humane VH zijn eigenschappen die er

voor zorgen dat VHHs weinig tot geen immuunrespons opwekken bij mensen. Bij injectie van VHHs bij

mensen en muizen werd geen merkbare immuunrespons opgewekt (Muyldermans, 2013). Toch zijn

voor bepaalde therapieën VHHs nodig die helemaal geen respons opwekken. Hiervoor werd een

strategie ontwikkeld om VHHs van kamelen meer te laten lijken op humane VHs (Vincke et al., 2009).

Hierbij worden zoveel mogelijk afwijkende aminozuren vervangen zonder dat de belangrijkste en

voordeligste eigenschappen van de VHHs verloren gaan. Hierdoor ontstaat een ‘human-scaffolding’

waar CDR-sequenties van andere VHHs ingebracht kunnen worden. Door hun kleine afmetingen (15

kDa) en het niet aanwezig zijn van een Fc-fragment hebben VHHs een zeer korte halfwaardetijd van

ongeveer 2 uur in de systemische circulatie (Cortez-Retamozo et al., 2002). Voor sommige

therapeutische doeleinden is dit geen probleem of zelfs gunstig. Voor andere doeleinden is een korte

halfwaardetijd echter minder geschikt. Verlenging van de halfwaardetijd kan bekomen worden door

verschillende methodes toe te passen zoals het vergroten van de molecule. Men kan onder andere de

molecule vergroten door binding aan bijvoorbeeld poly(ethyleenglycol) (Chapman et al., 1999), het

binden aan serum proteïnes zoals albumine via chemical cross-linking, genetische fusie of

noncovolente binding (B.J. Smith et al., 2001; Tijink et al., 2008).

1.4. Selectie en productie van Nanobodies via de phage-display techniek

Alle voordelen die Nanobodies en HCAbs hebben zouden niets waard zijn voor therapeutische

doeleinden als ze niet in grote hoeveelheden en op een makkelijke, efficiënte wijze geproduceerd

kunnen worden. De meest courante manier om Nanobodies en HCAbs te produceren is via phage

display. Deze techniek wordt onder andere ook toegepast voor de selectie van monoclonale Abs.

Door hun eenvoudige monomere structuur en geringe formaat zijn Nanobodies efficiënt en eenvoudig

te produceren door recombinante gentechnologie. Bij conventionele Abs moeten de L- en H-ketens op

een gecoördineerde manier met elkaar interageren nadat ze zijn vertaald, met een minder efficiënte

productie tot gevolg (Glockshuber et al., 1990).

Er zijn twee manieren om antigenbindende Nanobodies te selecteren. Namelijk via naïeve

bibliotheken of via geïmmuniseerde bibliotheken. Naïeve bibliotheken hebben het voordeel dat deze

makkelijk en snel te isoleren zijn maar zijn over het algemeen wel van lagere kwaliteit qua affiniteit en

8

er moeten veel meer klonen aanwezig zijn om de kans te vergroten dat de kloon aanwezig is die

complementair is aan het antigen (Tanha et al., 2002). Geïmmuniseerde bibliotheken worden

bekomen door eerst de host te immuniseren tegen het antigen. Tijdens de immuunreactie van de host

tegen het antigen zal de affiniteit verhogen door affiniteitsmaturatie en selectie. Er is in de host al een

soort van voorselectie gedaan waardoor de affiniteit hoger is dan bij naïeve bibliotheken. Starten van

een geïmmuniseerde bibliotheek is dus meer tijds- en arbeidsintensief maar levert doorgaans wel

betere resultaten op (Holliger & Hudson, 2005).

Voor phage display worden voornamelijk lineaire fagen zoals M13 gebruikt. De phage display vectoren

die worden gebruikt bij de techniek zijn specifiek voor de gebruikte competente cellen. Fagen zijn

virussen die bacteriën of gisten kunnen infecteren en de hostcel aanzetten om nieuwe fagen te

produceren. De eigenschap die elke vector moet hebben is dat het exogene DNA segmenten kan

opnemen in het eigen DNA en deze tot expressie kan brengen. De lineaire opbouw van de M13

capside zorgt ervoor dat exogeen DNA van nagenoeg elke lengte kan worden ingebouwd in het

genoom van het virus. Het bijzondere aan de display techniek is dat het vreemde DNA segment aan

een coat proteïne wordt gefuseerd en zodoende aan de buitenzijde van de faag wordt gepresenteerd

(G.P. Smith & Petrenko, 1997). De presentatie aan de buitenzijde is cruciaal voor de antistof-antigeen

herkenning.

De verschillende stappen die nodig zijn voor de selectie en productie via phage display techniek zullen

nu kort worden toegelicht (Verheesen & Laeremans, 2012; Arbabi Ghahroudi et al., 1997; Frenken et

al., 2000; Baral et al., 2011) (figuur 4). Ten eerste worden perifere lymfocyten uit het bloed van de

host gehaald. Vooraf kan eventueel de host geïmmuniseerd zijn tegen de gewenste antigenen voor

een hogere efficiëntie en affiniteit. Daarna wordt uit de lymfocyten mRNA geïsoleerd dat door reverse

transcription wordt omgezet naar copy DNA (cDNA). Vervolgens wordt dit cDNA vermenigvuldigd door

middel van een polymerase chain reaction (PCR) met primers die specifiek zijn voor VHH-genen. Na

de PCR-procedure worden de fragmenten, die ook wel amplicons worden genoemd, in phage-display

Figuur 4: Schematisch overzicht van het klonen en selecteren van Nanobodies uit geïmmuniseerde kameelachtigen. (Revets et al., 2005)

9

vectoren ingebouwd waar vervolgens competente E. coli mee worden geïnfecteerd. Deze bibliotheek

bestaat uit een heterogene mix klonen die elk de sequentie van een VHH bevatten. Het VHH wordt

gepresenteerd op het oppervlak van de vector en kan zo blootgesteld worden aan het antigen. Voor

de selectie van de juiste antistoffen tegen de gewenste antigenen wordt gebruik gemaakt van

biopanning. Bij biopanning worden de faagvectoren met het gepresenteerde VHH in contact gebracht

met het antigeen dat op een inert oppervlak is aangebracht. Enkel de vectoren die binden aan het

antigen omdat ze een VHH presenteren dat affiniteit heeft voor het antigeen blijven na een was

procedure achter. Na het losmaken van deze geselecteerde vectoren worden deze weer bij

competente cellen gevoegd en zullen ze weer vermenigvuldigen. Deze stap wordt doorgaans nog

enkele malen herhaald om vectoren aan te rijken die een VHH bevatten met een hoge affiniteit voor

het antigen van interesse. Deze selectie kan men ook uitvoeren onder meer stringente condities. Zo

kunnen zuurresistente VHHs worden geselecteerd door panning in zuur milieu. Na de selectieronde(s)

kunnen individuele klonen worden onderzocht voor productie van een antigenbindend VHH door

middel van standaard ELISA testen. De VHH-sequentie van sterke binders wordt bepaald en

ingebouwd in een plasmidevector. Deze plasmidevector wordt getransformeerd naar E. coli, waarna

hoge concentraties aan VHHs in het medium worden gesecreteerd. Ten slotte kunnen de VHHs

opgezuiverd worden uit dit medium door middel van chromatografie.

10

2. Therapeutische en diagnostische toepassingen van Nanobodies tegen

kanker en tumoren

De interesse naar Nanobodies en waarvoor ze gebruikt kunnen worden is verbazingwekkend groot en

dit komt vooral door de gunstige eigenschappen die Nanobodies hebben met als belangrijkste de

eenvoudige selectie en productie, hoge affiniteit, stabiliteit en klein formaat. Het overweldigend aantal

artikels dat wordt gepubliceerd beschrijven toepassingen voor Nanobodies in alle windrichtingen, van

immuuntherapie tegen virussen tot aan medische beeldvorming. Het grote aantal toepassingen

verplicht mij om toe te spitsen op een bepaald onderwerp, namelijk Nanobodies die hun toepassing

vinden in onderzoek, diagnose en bestrijding van kanker. Hieronder zal ik het achtereenvolgens

hebben over; antagonistische Nanobodies, Nanobodies gekoppeld aan effector domains, Nanobodies

die medicatie gericht afleveren en diagnostische Nanobodies (figuur 5).

2.1. Antagonistische Nanobodies

Overexpressie en/of activatie van bepaalde receptoren op het celoppervlak van kankercellen is een

bekend fenomeen. De receptoren en hun bijbehorende liganden helpen de kankercellen bijvoorbeeld

om ongecontroleerd te kunnen delen, induceren neovascularisatie (de vorming van een nieuw

bloedvatennetwerk uit bestaande vaten) en kunnen een aandeel hebben bij metastasering. Het

blokkeren van deze receptoren of hun liganden, en de daaropvolgende respons, kan helpen bij de

bestrijding van kanker door het inhiberen van pro-tumorale cellulaire pathways. Het blokkeren van een

Figuur 5: Schematische weergave van de toepassingen en de bijbehorende eigenschappen die voordelig zijn bij die toepassingen. (Sabrina Oliveira et al., 2013)

11

ligand heeft enkel zin als de receptor alleen door deze ligand wordt geactiveerd. Als een receptor door

meerdere liganden kan worden geactiveerd dan is het zinvoller om de receptor te blokkeren (Oliveira

et al., 2013). Er zijn al verschillende monoclonale antistoffen (mAbs) op de markt die specifiek binden

op receptoren en een antagonistische werking uitoefenen, maar door hun grootte is hun penetratie en

distributie in tumoren beperkt (Beck et al., 2010). De penetratie en distributie van Nanobodies in

tumoren is, door hun geringe grootte, veel beter. Het grootste nadeel bij het gebruik van Nanobodies

is hun korte halfwaardetijd in de systemische circulatie, maar er zijn verschillende manieren om dit te

verbeteren (zie eerder).

2.1.1. Epidermal growth factor receptor (EGFR)

In verschillende humane epitheliale kankers, waaronder colorectaal, long, hersenen en hoofd en nek

tumoren, is vastgesteld dat de epidermal growth factor receptor (EGFR) tot overexpressie komt op het

celoppervlak (Baselga & Arteaga, 2005). De abnormale activatie van EGFR leidt tot activatie van

verschillende intracellulaire signaaltransductie pathways die betrokken zijn bij cel-proliferatie, -

differentiatie en -migratie. Deze receptor is dus een aantrekkelijk doelwit voor antitumor therapie.

Bovendien wordt EGFR door meerdere liganden geactiveerd en het ligt dus voor de hand om de

receptor en niet de liganden te inhiberen. Al in de jaren ’80 van de vorige eeuw is vastgesteld dat

antistof binding op de EGFR de ligand-geïnduceerde activatie inhibeert en de tumorgroei tegengaat

(Gill et al., 1984). Cetuximab en panitumumab zijn voorbeelden van EGFR-specifieke mAbs die nu op

de markt zijn en die hun waarde al hebben bewezen bij de bestrijding van deze types epitheliale

tumoren.

Roovers produceerde in 2007 een anti-EGFR Nanobody die in vitro effectief de EGF-geïnduceerde

signalisatie en celproliferatie remt. Ze maakte hierbij gebruik van mono- en bivalente Nanobodies,

waarbij het bivalente Nanobody (twee Nanobodies die gefuseerd zijn), door de verhoogde aviditeit,

sterk in competitie ging met het EGFR-ligand (Roovers et al., 2007). In een vervolgstudie trachtte

dezelfde groep deze Nanobodies te verbeteren door ze te combineren in een biparatopische

molecule. Dit houdt in dat twee Nanobodies gefuseerd zijn die beide een ander antigen binden.

Cruciaal, in een in vivo model bleek dat dit biparatopische Nanobody beter presteerde dan de mono-

en bivalente Nanobodies uit de vorige studie en een vergelijkbare potentie had als cetuximab

(Roovers et al., 2011). De onderzoeksgroep van Omidfar behaalde gelijkaardige resultaten in twee

onafhankelijke studies (Omidfar et al. (2013)). Het EGFR-specifieke Nanobody was in staat om te

binden aan EGFR met soortgelijke affiniteit als mAbs en had tevens het vermogen om de

celproliferatie te inhiberen in vitro (K Omidfar et al., 2004; Kobra Omidfar et al., 2013).

2.1.2. Hepatocyte growth factor (HGF) en de c-Met receptor

Hepatocyte growth factor (HGF) is het enige bekende ligand van de c-Met receptor (Bottaro et al.,

1991). De c-Met receptor orkestreert de migratie en groei van cellen tijdens de embryogenese en

wordt normaal tot expressie gebracht op epitheliale cellen in verschillende organen zoals lever,

pancreas, nier en beenmerg. In tumorcellen zorgt de activatie van de c-Met receptor door HGF voor

diverse signaalcascades die leiden tot celproliferatie, metastasering en ontsnapping aan apoptose

(Birchmeier et al., 2003). Overexpressie van de c-Met receptor en HGF kan worden vastgesteld bij de

meerderheid van vaste tumoren en is geassocieerd met een toegenomen agressiviteit van tumoren en

12

een slechte prognose. Omdat de receptor maar één ligand heeft is het ook mogelijk om, naast het

selecteren van een antagonist/anti-receptor Nanobody, de receptor-ligand interactie tegen te gaan

door een anti-ligand (anti-HGF) Nanobody te selecteren.

Vosjan en collega’s beschreven in 2012 twee Nanobodies die specifiek bonden met HGF, dat

geproduceerd wordt in tumorcellen. Naast in vitro proeven werd de werkzaamheid ook nagegaan in

een glioblastoma xenotransplant muismodel. Toediening van deze Nanobodies aan tumordragende

muizen leidde tot een significante reductie van de tumorgrootte. De helft van de muizen vertoonde

bovendien een volledige regressie van de tumor. Evenzeer zijn er ook Nanobodies beschreven

tegenover de receptor c-Met (Denayer et al., 2013; Slørdahl et al., 2013). Slørdahl onderzocht

specifiek het effect van een anti-c-Met Nanobody op multipel myeloom (MM) kankercellen in vitro

(Slørdahl et al., 2013). Er kon worden aangetoond dat het Nanobody effectief de signaaloverdracht,

de MM cel-migratie en -adhesie inhibeert. Daarbij blokkeerde het ook de HGF-gemedieerde inhibitie

van osteoblastogenesis. Bij vergelijking van het Nanobody met een mAb tegenover de c-Met receptor

die zich op dit moment in een fase 3 klinische studie bevindt, werd er een gelijkwaardig effect

vastgesteld. De onderzoeksgroep van Denayer bestudeerde eveneens een Nanobody die een

doeltreffende antagonistische werking heeft op de c-Met receptor (Denayer et al., 2013). In vitro stelde

men vast dat het Nanobody in staat was om de HGF/c-Met interactie volledig te inhiberen in een A549

non-small cell longkanker cellijn. Vervolgens werd de werkzaamheid van het Nanobody op de

remming van de tumorgroei in vivo getest. Twee soorten tumorcellijnen werden bij muizen ingeplant,

namelijk glioblastoma cellen of pancreas carcinoma cellen. Intraperitoneale toediening resulteerde in

een duidelijke reductie in tumorgroei in beide modellen en zelfs tot volledige regressie van de tumor in

sommige muizen in het pancreas carcinoma model. Bovendien werd in deze studie vastgesteld dat de

serumgehaltes van oplosbaar c-Met, IL-8 en HGF significant waren gedaald bij de behandeling met

het Nanobody en hun serumconcentraties zouden mogelijk kunnen worden gebruikt als

farmacodynamische biomarkers in klinische studies waarbij c-Met wordt geïnhibeerd.

2.1.3. Vascular endothelial growth factor (VEGF) en de VEGF-receptor 2 (VEGFR2)

Angiogenese is een essentieel proces in de ontwikkeling van tumoren om de benodigde aanvoer van

zuurstof en nutriënten, en afvoer van afvalstoffen te kunnen garanderen. Zuurstoftekort is een

bekende remmende factor in de groei van tumoren en daarom is het interessant om te onderzoeken

hoe de formatie van nieuwe bloedvaten kan worden onderdrukt. Vascular endothelial growth factor

(VEGF) en zijn receptor (VEGFR2) spelen in de angiogenese een belangrijke rol en VEGF reguleert

ook in belangrijke mate de permeabiliteit van de vaatwand en heeft daardoor een effect op het

ontstaan van metastases (Hicklin & Ellis, 2005). VEGF bindt niet alleen op VEGFR2 maar eveneens

op VEGFR1 en 3, echter VEGFR2 is voornamelijk verantwoordelijk voor de aanleg van nieuwe

bloedvaten, waar VEGFR1 de migratie van monocyten en macrofagen beïnvloed en VEGFR3 een

belangrijke rol heeft in de ontwikkeling en functie van lymfevaten (Olsson et al., 2006). Vanwege de

grote invloed die VEGF/VEGFR2-signalisatie heeft op angiogenese zijn er al twee anti-VEGF mAbs en

een anti-VEGFR2 mAbs op de markt die angiogenese inhiberen. Pas vrij recent verschenen

publicaties die gebruik maken van Nanobodies die binden op VEGF of VEGR2.

13

Behdani beschreef meerdere Nanobodies die specifiek VEGFR2 binden. Eén Nanobody (3VGR19) in

het bijzonder heeft een sterke antagonistische werking op de receptor (Behdani et al., 2012). Of dit

Nanobody al dan niet in staat is om angiogenese te inhiberen werd nagegaan in een capillaire

buisvormingsexperiment in vitro. Deze test meet de mogelijkheid van endotheelcellen om capillair-

achtige structuren te vormen. In de aanwezigheid van het Nanobody was de vorming van capillaire

structuren zo goed als afwezig (Behdani et al., 2012). In een vervolgstudie construeerden zij een

bivalente Nanobody door twee 3VGR19 te fuseren als opzet naar een in vivo test (nog niet

gepubliceerd). Daaruit bleek dat de affiniteit van het fusieconstruct niet veranderd en de productie niet

in het gedrang kwam (Behdani et al., 2012). In tegenstelling tot de vorige twee onderzoeken waar de

Nanobodies de receptor als antigen hadden hebben de Nanobodies in de volgende drie onderzoeken

de ligand als antigen. Bovendien werd in deze studies telkens een andere strategie gebruikt om de

binding tussen VEGF-A en zijn receptor te blokkeren. VEGF-A heeft vijf verschillende isovormen met

verschillende lengtes, naargelang waar de mRNA splicing heeft plaatsgevonden. VEGF121 is de

kortste en heeft dus het laagste moleculair gewicht, is goed oplosbaar en vrij diffundeerbaar. Daarbij

heeft VEGF121 net zoals de andere isovormen dezelfde biologische activiteit tegenover de VEGF

receptoren (Liu et al., 2003). Vier Nanobodies zijn ontwikkeld tegen VEGF121 (Kazemi-Lomedasht et

al., 2015). Deze vier Nanobodies bonden sterk met VEGF121 en hadden een affiniteit voor VEGF121 die

gelijk was als de affiniteit van bevacizumab, een anti-VEGF-A121 mAb dat sinds 2004 is toegelaten

door de Amerikaanse FDA voor de behandeling van gemetastaseerde colonkanker en een vorm van

longkanker. De inhibitie van angiogenese werd eveneens in vitro nagegaan aan de hand van een

capillair buisvormingsexperiment. Alle Nanobodies hadden een inhiberend effect op de buisvorming,

wat suggereert dat de Nanobodies inderdaad de interactie tussen VEGF-A121 en VEGFR2

blokkeerden. In een andere studie werden de eerste 110 aminozuren, die de isovormen van VEGF-A

gemeenschappelijk hebben, gebruikt als antigen (Ebrahimizadeh et al., 2015). Vervolgens werd er

één anti-VEGF Nanobody geselecteerd die met de grootste affiniteit kon binden op het antigen.

Aansluitend werd een in vivo test uitgevoerd door middel van chorioallantoic membrane assay (CAM).

Hierbij wordt de te onderzoeken stof op de chorioallantois membraan geïmplanteerd door een gaatje

in de schil. Na een incubatie periode van 1 tot 3 dagen wordt de angiogenese geanalyseerd via beeld

analyse of colorimetrie detectie methodes. Gefertiliseerde eieren werden na 9 dagen ingespoten met

een kleine hoeveelheid van het geselecteerde Nanobody en na 24u werden de resultaten uitgelezen.

Er was een duidelijk verschil te zien met de controle eieren, de eieren die met het anti-VEGF Nb

werden behandeld, vertoonden een verminderde angiogenese ten opzichte van de onbehandelde

eieren. In een derde studie werd het VEGF-receptor bindend domein (VEGF-RBD) gebruikt om

Nanobodies te selecteren die specifiek de binding van VEGF met zijn receptor verhinderen.

(Shahangian et al., 2015). Het VEGF-RBD bevindt zich in dezelfde 110 aminozuren die de vorige

studie gebruikte maar hier koos men ervoor om Nanobodies te selecteren met een nog specifiekere

bindingsplaats. De mogelijkheid van Nanobodies om unieke epitopen te binden door de lange CDR3-

loop is een essentiële eigenschap om te kunnen binden op het VEGF-RBD. De onderzoeksgroep

selecteerde drie Nanobodies die uiterst precies bonden op het VEGF-RBD, met hoge affiniteit en

selectiviteit. Twee van de Nanobodies hadden een CDR3-loop die sterk gelijkaardig waren aan elkaar.

14

Het derde Nanobody had een CDR3-loop die niet homoloog was aan de andere twee Nanobodies,

maar kon desondanks met gelijkwaardige affiniteit het VEGF-RBD binden. De in vitro capillaire

buisvormingstest toonde aan dat alle Nanobodies een inhiberend effect hebben op de angiogenese.

2.2. Targeting agents of effector domain

Een volgende manier om Nanobodies in te zetten als therapeutisch middel tegen kanker en tumoren

is het afleveren van een zogenaamd effector domain. Een effectordomein kan bijvoorbeeld een enzym

of een toxine zijn. Het Nanobody zorgt er voor dat het effectordomein in de tumor ter plaatse komt en

daar tevens lang genoeg aanwezig zal zijn om zijn functie uit te kunnen voeren en niet ergens anders

in het lichaam schade kan aanrichten. Een effectordomein kan verschillende werkingsmechanismen

hebben zoals het remmen van celproliferatie, of nog beter het induceren van celdood en aldus

tumorregressie. Het binden van het effectordomein aan het Nanobody kan bekomen worden op twee

manieren. Enerzijds door het chemisch conjugeren van het Nanobody en het effectordomein of

anderzijds (in het geval van een eiwit effectordomein) door de verbinding al genetisch vast te leggen

teneinde het conjugaat als een eenheid te produceren. De mogelijkheid bestaat echter dat door de

conjugatie van het Nanobody en effectordomein de bindingseigenschappen van het construct zijn

veranderd door interactie tussen de samenstellende delen en dit moet telkens worden gecontroleerd

(Sabrina Oliveira et al., 2013).

2.2.1. β-lactamase als effectordomein

β-lactamase van Enterobacter cloacae is in staat om met een grote efficiëntie verschillende precursors

voor cytotoxische medicijnen om te zetten naar hun actieve vorm (Senter & Springer, 2001). Doordat

het cytotoxisch medicijn slechts wordt geactiveerd op de doelwitplaats, i.e. de tumor, zal het medicijn

in zijn inactieve vorm geen andere cellen in het lichaam aantasten. De werking van een Nanobody,

met als antigen het carcino embryonic antigen (CEA), geconjugeerd aan het E. cloacae β-lactamase

werd beschreven door Cortez-Retamozo et al., in 2004. Het conjugaat bleek erg stabiel te zijn en de

affiniteit van het Nanobody was gelijkaardig aan die van het vrije Nanobody. Men kon eveneens

aantonen dat de tumorgroei werd geremd zonder toxische bijwerkingen, bij muizen met subcutane

LS174T adenocarcinoma tumoren. Het ontbreken van bijwerkingen kan verklaard worden door de

zeer specifieke opname in de tumor en de snelle klaring uit het andere delen van het lichaam

waardoor enkel in de tumor het cytotoxisch preparaat wordt omgezet naar de actieve vorm (Cortez-

Retamozo et al., 2004).

2.2.2. Een toxine als effectordomein

Als effectordomein kunnen ook toxines worden gebruikt die celdood induceren. Door de conjugatie

met een Nanobody die met kankercel-geassocieerde antigenen bindt zal het toxine enkel deze cellen

aantasten. Pseudomonas exotoxine A is een voorbeeld van een toxine die eukaryotische cellen doodt

door te binden aan een transmembranaire receptor waardoor het toxine wordt opgenomen in de cel.

Eenmaal binnen in de cel bindt het toxine aan ADP-ribosylating elongation factor II met als gevolg

inhibitie van de proteïnesynthese en daaropvolgende celdood (Beattie et al., 1996). Door

pseudomonas exotoxine A te conjugeren aan een anti-VEGFR2 Nanobody uit een eerdere studie

(Behdani et al., 2012), werd onderzocht of het toxine in staat was specifiek VEGFR2-expresserende

15

tumorcellen te laten sterven (Behdani et al., 2013). Uit de resultaten bleek dat het toxine gebonden

aan het Nanobody daadwerkelijk in staat was VEGFR2-expresserende cellen te elimineren. De

inhibitie van celgroei was zelfs bij lage concentraties van Nanobody-toxine nog ruim voldoende. Deze

resultaten bieden een goed vooruitzicht voor een in vivo experiment met dit construct en strategie.

Een ander toxine dat celdood induceert is het difterie toxine maar er zijn tot nu toe nog geen

conjugaten met Nanobodies beschreven.

2.2.3. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand

Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL/CD253) is een cytokine die apoptose

induceert door te binden aan de death receptors DR4 en DR5, en veroorzaakt voornamelijk apoptose

in tumorcellen (Song & Lee, 2008). Van de Water en collega’s hebben een Nanobody met als antigen

EGFR geproduceerd en die verbonden met TRAIL (van de Water et al., 2012). In de studie was de

groep geïnteresseerd in een therapie tegen de kwaadaardige glioblastoma multiforme tumor en

hadden hier een andere aanpak voor dan enkel het intraveneus toedienen van het Nanobody-TRAIL

conjugaat. Zij modificeerden hiervoor neurale stamcellen zodat ze het immunoconjugaat konden

produceren en vrijgeven. Eerder was al aangetoond dat zowel neurale stamcellen als mesenchymale

stamcellen zich verzamelen en concentreren in tumorweefsel (Aboody et al., 2000; Tang et al., 2003).

De stamcellen geven zodoende het immunoconjugaat lokaal en over langere tijd vrij. In deze studie

bleek dat een langere blootstelling van de tumorcellen aan het conjugaat effectiever is dan een enkele

dosis.

2.2.4. Radioimmunotherapie

Radioimmunotherapie maakt gebruik van een radioactief isotoop dat gebonden is aan een

antigenbindende molecule zoals een antistof of een Nanobody, die specifiek een tumor-geassocieerde

antigen kan binden. Op deze manier wordt de cytotoxische radiatie van het isotoop grotendeels in het

tumorweefsel afgegeven en is de dosis in de rest van het lichaam lager. Twee gepubliceerde studies

maken gebruik van lutetium-177 (177Lu)

gekoppeld aan een Nanobody (D’huyvetter et al.,

2014; Lemaire et al., 2014). D’huyvetter labelde

een anti-HER2 Nanobody met 177Lu en

onderzocht de accumulatie in de tumor, renale

retentie en de werkzaamheid tegen HER2-

positieve tumorcellen. Renale retentie kan een

probleem vormen als er met radioactieve

isotopen wordt gewerkt want er bestaat dan een

grote kans op het ontstaan van nefropathie door

de hoge lokale straling. De retentie van

Nanobodies in de nieren wordt voornamelijk

veroorzaakt door polaire aminozuren aan het C-

terminale einde. Door deze polaire aminozuren te

verwijderen konden ze een reductie van 88

procent behalen vergeleken met Nanobodies die

Figuur 6: Biodistributie van 177Lu-gelabelde Nanobodies met (zwart en wit) en zonder (grijs en gearceerd) polaire aminozuren aan het c-terminale einde. De gearceerde balk stelt tevens de combinatie met vloeistoftherapie voor. (D’huyvetter et al., 2014)

16

wel polaire aminozuren hadden en een reductie van 95 procent werd behaald als dit gecombineerd

werd met vloeistoftherapie. De biodistributie werd in een voorgaande studie uit 2012 onderzocht en

men kon aantonen dat de accumulatie in de tumor zeer hoog was vergeleken met de rest van het

lichaam (D’huyvetter et al., 2012). Met tumor geïmplanteerde muizen werden ingedeeld in twee

controlegroepen die een placebo of een niet-specifiek 177Lu gelabeld Nanobody kregen en een groep

die behandeld werd met een 177Lu-gelabeld Nanobody specifiek voor HER2. Geen enkele muis in de

behandelde groep had tumoren die groter waren dan 250mm3 en bij vijf van de acht behandelde

muizen werd vastgesteld dat er geen tumor meer aanwezig was. De groep van Lemaire ontwikkelde

een Nanobody met affiniteit voor het M-proteïne dat wordt geproduceerd bij multiple myeloma door

getransformeerde plasmacellen in het beenmerg. Naast beeldvormingsonderzoek met het Nanobody

hebben ook zij het Nanobody gelabeld met 177Lu voor therapeutische doeleinden. Muizen werden

geïnoculeerd met M-proteïne-expresserende cellen en werden 7 weken behandeld met het gelabelde

Nanobody. Muizen met multiple myeloma ontwikkelen een duidelijk waarneembare splenomegalie

(Asosingh et al., 2000). Men kon een duidelijk verschil opmerken tussen de controlegroepen en de

behandelde groep waarbij de controlegroepen een significant grotere milt vertoonden dan de

behandelingsgroep. Dit geeft aan dat de behandeling met het 177Lu-gelabelde Nanobody weldegelijk

een antitumorale werking vertoont in dit model.

2.3. Drug delivery systems

Nanopartikels, met een diameter kleiner dan 200 nm, worden reeds veelvuldig ingezet als drug

delivery systems. Door formulatie in nanopartikels kunnen onder meer hydrofobe moleculen worden

toegediend in een waterige omgeving, worden gezonde weefsels beschermd tegen eventuele toxische

effecten tot het medicijn zijn doelplaats bereikt en beschikken sommige over controlled release

eigenschappen waardoor medicijnen voor langere tijd vrijgegeven worden na een enkele dosis

(Zamboni et al., 2012). Accumulatie van nanopartikels wordt in eerste instantie veroorzaakt door het

enhanched permeability and retention effect (EPR effect) in tumoren (Maeda et al., 2000). Tumoren

vertonen afwijkende bloedvaten en een slechte lymfedrainage waardoor grotere partikels en

macromoleculen uit de bloedcirculatie in het kankerweefsel accumuleren. Het bekleden van

nanopartikels met Nanobodies moet er enerzijds voor zorgen dat de nanopartikels worden

weerhouden in het targetweefsel en dat zijn cargo meer specifiek in de tumorcel wordt afgeleverd door

middel van receptor-gemedieerde opname. (Mamot et al., 2005). Nanopartikels kunnen onder andere

voorkomen als liposomen, micellen en albumine nanopartikels, en zullen hieronder een voor een

worden behandeld.

2.3.1. Nanobody-liposomen

Anti-EGFR Nanobody-beklede liposomen zijn in 2010 voor het eerst beschreven in een studie naar

hun receptor-gemedieerde opname en de hierop volgende neerregulatie van EGFR, om op die manier

tumorregressie te verwezenlijken (Sabrina Oliveira et al., 2010). De neerregulatie van EGFR door

Nanobody-liposomen is uniek, immers met andere liposoomconstructies en het vrije anti-EGFR

Nanobody leidde de binding aan EFGR niet tot een neerregulatie van EGFR. De neerregulatie van

EGFR, waardoor overlevings- en groeisignalisatie via deze receptor afneemt, zorgt voor een inhibitie

17

van tumorcelproliferatie en verleent antitumorale eigenschappen aan anti-EGFR Nanobody-beklede

liposomen. In tegenstelling tot de voorgaande studie waar een leeg liposoom werd gebruikt, werd in

een vervolgstudie hetzelfde nanopartikel gevuld met een anti-IGF-1R kinase inhibitor (AG538) (van

der Meel et al., 2012, 2013). Insuline-like growth factor 1 receptor (IGF-1R) en EGFR kunnen elkaar

beïnvloeden via heterodimerisatie van de receptoren of indirect via gezamenlijke signaalmoleculen

stroomafwaarts, waardoor tumoren een resistentie kunnen ontwikkelen tegen EGFR-gerichte therapie

door IGF-1R-signalisatie te vermeerderen (S Oliveira et al., 2009; Wheeler et al., 2010). De

combinatie van EGFR- en IGF-1R-inhibitie in de studie van Oliveira toonde een verbeterde inhibitie

van tumorcelproliferatie aan, vergeleken met elk van de enkelvoudige therapieën. In vergelijking met

de lege liposomen uit de eerste studie, konden deze die met AG538 werden gevuld de in vitro

proliferatie van tumorcellen sterker inhiberen. Ten slotte kon men aantonen dat de tumorgroei in vier

verschillende tumormodellen (A549, MB-468, 14C, A431) sterk geïnhibeerd werd na intraveneuze

toediening van AG538-bevattende anti-EGFR Nb-liposomen (van der Meel et al., 2013).

2.3.2. Nanobody-micellen

Amfifiele moleculen hebben een hydrofiele en een hydrofobe kant en zullen zich in een waterige

oplossing rangschikken met de hydrofiele kant naar buiten en met de hydrofobe kant naar binnen.

Hydrofobe stoffen kunnen oplossen in de hydrofobe binnenzijde van de micel en bijvoorbeeld

intraveneus worden geïnjecteerd. Micellen kunnen gebruikt worden voor zowel therapeutische als

diagnostische doeleinden. Bovendien is het ook mogelijk om meerdere hydrofobe stoffen in een micel

te laten oplossen. Een interessante stof voor de therapie van meerdere soorten kanker is Doxorubicin

maar heeft als groot nadeel dat het zeer toxisch is voor gezonde weefsels, vooral voor het hart, bij een

systemische toediening (Hershman et al., 2008). Talelli et al., heeft in 2011 voor het eerst een

Nanobody-micel beschreven op basis van een onderzoek van dezelfde studiegroep in 2010 (Talelli et

al., 2010, 2011). In de studie uit 2010 hebben zij een micel gevuld met Doxorubicin en de

cytostatische activiteit van deze micel vergeleken met de cytostatische activiteit van vrij Doxorubicin.

Daaruit bleek dat door opname van de micellen in de cellen en de daaropvolgende vrijlating van

Doxorubicin een verhoogde cytostatische activiteit was waar te nemen ten opzichte van het vrij

opgeloste Doxorubicin, zowel in vitro als in vivo. In 2011 heeft de studiegroep een Nanobody gericht

tegen de EFG receptor aan de hydrofiele zijde geconjugeerd om op deze manier een gerichtere en

hogere opname van Doxorubicin te verwezenlijken in tumorcellen met een overexpressie van EGFR.

De Nanobody-micellen werden inderdaad beter opgenomen in EGFR-expresserende tumorcellen dan

micellen zonder de Nanobodies. Evenwel bonden de Nanobody-micellen niet aan EFGR-negatieve

cellen wat aangeeft dat ze inderdaad binden met de EGF receptor. Een in vivo studie met anti-EGFR

Nanobody-micellen was de volgende stap (Talelli et al., 2013). De neerregulatie van EFGR die

hierboven werd beschreven bij Nanobody-liposomen is ook van toepassing bij de Nanobody-micellen,

ongeacht of Doxorubicin aanwezig was in de micellen. Bij het toevoegen van het medicijn aan

micellen met en zonder Nanobodies bleek dat de Nanobody-micellen effectiever waren in de inhibitie

van tumorgroei en daarbij ook significant de levensduur van de onderzochte dieren verlengde.

18

2.3.3. Nanobody-albumine nanopartikels

Nanopartikels gebaseerd op albumine hebben een aantal voordelen: het komt namelijk van nature

voor in het lichaam en is dus niet-immunogeen, niet toxisch en is gemakkelijk af te breken door het

lichaam. Bovendien heeft albumine verschillende bindingsplaatsen die een scala van moleculen en

stoffen, en in relatief grote hoeveelheden, kunnen binden. Daarnaast is het eenvoudig om albumine

nanopartikels te produceren door middel van verscheidende manieren (Elzoghby et al., 2012). Het

idee van nanopartikels bestaande uit albumine stamt uit 1996, maar de eerste albumine microspheres

zijn al begin jaren 70 beschreven en in de decennia daarna voor meerdere diagnostische

toepassingen ingezet (Müller et al., 1996). De laatste jaren kregen albumine nanopartikels bijzonder

veel aandacht. Dit is onder andere te wijten aan het succes van Abraxane®, een medicijn tegen

borstkanker met als actieve stof een taxaan (Petrelli et al., 2010). Albumine nanopartikels kunnen

gecoat worden met allerlei liganden die de eigenschappen van de nanopartikels kunnen veranderen.

Zo kan onder meer de stabiliteit en halfwaardetijd worden gemoduleerd, maar kunnen er ook targeting

agents zoals Nanobodies aan worden gekoppeld voor doelgerichte levering. Nanobody-albumine

nanopartikels (NANAPs), met anti-EGFR en anti-c-Met Nanobodies werden recent beschreven

(Altintas et al., 2013; Heukers et al., 2014). Het NANAP waar zich een anti-EGFR Nanobody op

bevindt werd daarenboven geladen met de multikinase inhibitor 17864 (Altintas et al., 2013). Deze

kinase-inhibitor verhindert onder andere signalisatie via verschillende receptor tyrosine kinasen

(RTKs). RTKs zijn receptoren voor groei- en overlevingsfactoren en staan onder andere in voor

tumorcel overleving en angiogenese (Berz & Wanebo, 2011). Aangezien multikinase inhibitoren zoals

17864 niet alleen toxisch zijn voor tumorcellen maar ook voor gezonde cellen is het aangewezen om

17864 selectief te laten accumuleren in tumorcellen. Door de binding van de nanopartikels aan EGFR

worden deze specifiek opgenomen in de tumorcellen en wordt 17864 intracellulair vrijgesteld. De

NANAPs gevuld met 17864 waren efficiënt genoeg om de proliferatie van tumorcellen te remmen in

vitro. De benodigde concentratie om proliferatie de inhiberen was wel drie maal zo hoog als het vrije

17864 maar dat is te verklaren door het makkelijker diffunderen van kleinere moleculen. Nanopartikels

zonder Nanobodies op het oppervlak werden slecht opgenomen in cellen en hadden geen

inhibitorisch effect op de proliferatie. Eveneens werd de downregulatie van EGFR vastgesteld zoals

dat ook werd gezien bij de eerder besproken micellen en liposomen. Een studie van een NANAP met

een c-Met bindend Nanobody werd in 2014 beschreven (Heukers et al., 2014). C-Met is een receptor

met als ligand HGF die in bepaalde kankertypes wordt overgeëxpresseerd en daar protumorale

activiteit vertoont, voor meer informatie zie 2.1.2.. In deze studie werd nog geen medicatie aan het

NANAP toegevoegd en werd uitsluitend de specifieke bindingsactiviteit en de effecten daarvan

bestudeerd. Uit de resultaten bleek dat de NANAPs weldegelijk specifiek bonden aan c-Met-positieve

cellen en niet bonden aan cellen die geen c-Met expresseren. De binding aan c-Met zorgde voor

receptor-gemedieerde opname van de NANAPs, waarna deze werden afgebroken in de lysosomen.

Men kon bovendien eenzelfde neerregulatie van c-Met waarnemen, zoals voor de EGFR na

behandeling met anti-EGFR Nanobody liposomen en micellen.

19

2.4. Nanobodies als diagnostische instrumenten

De meest interessante toepassing voor Nanobodies is misschien wel moleculaire beeldvorming. De

eigenschappen van Nanobodies komen in deze discipline het best tot hun recht. De snelle

verspreiding doorheen het lichaam en de tumor door het kleine formaat en de specifieke binding aan

het doelwit zijn essentieel voor moleculaire beeldvorming. Echter, waar de korte halfwaardetijd bij

Nanobody-therapie een behoorlijk nadeel is, is dat voor beeldvormingstechnieken juist het

belangrijkste voordeel. De snelle klaring van ongebonden Nanobodies uit de bloedstroom zorgt voor

beelden met een hoog tumor-to-background (T/B) contrast, en dit al snel na hun toediening (S Oliveira

et al., 2012). Nanobodies kunnen worden ingezet bij verschillende beeldvormingstechnieken zoals

single-photon emission computed tomography (SPECT), positron emmission tomography (PET),

optische beeldvorming en echografie. Deze technieken, en de toepassingen voor Nanobodies, worden

hieronder specifiek besproken voor beeldvorming van tumoren maar kunnen in allerlei vakgebieden

worden toegepast.

2.4.1. Nucleaire beeldvorming

Bij nucleaire beeldvorming worden radionucliden oraal ingenomen of intraveneus ingespoten bij de

patiënt. Daarna wordt de uitgezonden straling van de radionucliden opgevangen door externe

detectoren en tot een beeld verwerkt. De opgevangen straling komt dus uit de patiënt en niet zoals bij

röntgenopnamen van een externe bron waarna de straling door de patiënt gaat. Daarnaast is

nucleaire beeldvorming meer een functionele beeldvormingstechniek dan een anatomische techniek

zoals radiologie.

Het is noodzakelijk om bij nucleaire beeldvorming een Nanobody, die als antigen een tumor-

geassocieerd molecule heeft, te binden aan een radionuclide die γ-straling of positronen uitstraalt voor

respectievelijk SPECT en PET. Voor SPECT worden de radionucliden technetium-99m (99mTc) of

indium-111 (111In) gebruikt, terwijl voor PET de nucliden vaak Gallium-68 (68Ga) of Zirconium-89 (89Zr)

zijn. Hoewel SPECT goedkoper is, heeft PET een betere resolutie en sensitiviteit en is daarom ook

populairder geworden de laatste jaren (Chakravarty et al., 2014). Het 99mTc-isotoop is bovendien

gemakkelijk te koppelen aan Nanobodies via een hexahistidine tag (Huang et al., 2008).

Huang en Gainkam gebruikten een anti-EGFR Nanobody verbonden met 99mTc om SPECT

beeldvorming uit te voeren. In de studie van Huang en zijn collega’s werd opgemerkt dat de

hexahistidine tag aan de c-terminus van de Nanobodies een goede bindingsplaats is voor 99mTc.

Bijgevolg is dit de meest gebruikte methode om Nanobodies met 99mTc te labelen. Ongebonden

Nanobodies vertoonden een halfwaardetijd van 1,5 uur in het bloed en de klaring verliep door renale

excretie. Door de korte halfwaardetijd konden tumoren met hoge en gemiddelde EGFR-expressie van

elkaar worden onderscheiden. Omwille van de renale excretie was er een hoge retentie van het

Nanobody in de nier, wat zou kunnen leiden tot tubulaire toxiciteit zoals werd beschreven voor

radioimmunotherapie. Ook voor een anti-Carcinogenic embryonic antigen Nanobody waaraan 99mTc

was gekoppeld kon een gelijkaardige renale retentie worden waargenomen (Caveliers et al., 2008). Bij

een vergelijking van biodistributie en tumorcelbinding van twee verschillende 99mTc-gekoppelde anti-

EGFR Nanobodies werd opnieuw eenzelfde accumulatie in de nier vastgesteld (Gainkam et al., 2008).

Door simultane toediening van gelofusine en/of lysine en de 99mTc-Nanobodies kon men de renale

20

accumulatie duidelijk verminderen en tevens de opname in de tumor verhogen (Gainkam et al., 2011).

In een andere studie met 99mTc anti-EGFR Nanobodies werd de correlatie tussen tumoropname en de

grootte van de tumor bekeken (Gainkam et al., 2011). Muizen die geïmplanteerd waren met

tumorcellen werden behandeld met een tyrosine kinase inhibitor en de onderzoekers volgden de

tumorgroei via bioluminescente beeldvorming en vergeleken die resultaten met SPECT. De correlatie

tussen opname in de tumor en de grote van de tumor bleek groot genoeg te zijn om deze methode

eventueel te gebruiken bij de opvolging van therapieën. Dezelfde anti-EGFR Nanobodies uit de

voorgaande studie werden gebruikt door Vosjan, maar werden gelabeld met 68Ga (Vosjan et al.,

2011). Een hoge T/B ratio en opname in de tumor werd vastgesteld binnen 1 uur na injectie. De

beelden die via PET bekomen werden, waren vergelijkbaar met de SPECT beelden die Gainkam

bekwam met 99mTc Nanobodies. Zeer recent werd een studie gepubliceerd waarin kleine (< 100mm3)

EGFR-expresserende tumoren reeds 45 minuten na de injectie van de contraststof konden worden

gedetecteerd via SPECT. Anti-EGFR Nanobodies werden gelabeld met 99mTc en hadden slechts een

halfwaardetijd van 5 minuten, wat zowel in vivo als ex vivo resulteerde in een hoog contrast (Krüwel et

al., 2016).

De groep van Vaneycken isoleerde 38 verschillende anti-HER-2 Nanobodies en selecteerden hieruit

één Nanobody voor labeling met 99mTc om te gebruiken voor SPECT (Vaneycken et al., 2011).

Dezelfde resultaten werden behaald als voor de 99mTc anti-EGFR Nanobodies, namelijk een goede

opname in enkel het tumorweefsel, snelle klaring uit het bloed met een hoge T/B ratio en lage

weefselaccumulatie, uitgezonderd in de nieren. De goede resultaten van het Nanobody in deze studie

en de resultaten behaald door Vosjan et al. (2011)met het labelen van een PET radionuclide bracht de

groep van Xavier/Vaneycken en collega’s er toe om een preklinische studie te verrichten naar een

anti-HER2 Nanobody gelabeld met 68Ga (Xavier et al., 2013). De biodistributie van het Nanobody was

gelijkaardig aan de studie van Vaneycken et al. (2011) maar opmerkelijk was dat door het verwijderen

van de hexahistidine tag, die niet nodig is voor het binden van 68Ga, de opname in de nier werd

gereduceerd met 60 procent, terwijl de opname in de tumor werd verdubbeld. De gegevens omtrent

biodistributie werden vervolgens aangewend om de radiatiedosis te berekenen per orgaan en de

totale dosis afgegeven aan de tumor. Naderhand werd een toxiciteitsstudie uitgevoerd op muizen.

Aangezien geen schadelijke effecten konden worden waargenomen bij een dosis van 10mg/kg, werd

het 68Ga anti-HER2 Nanobody geselecteerd voor een fase 1 klinische studie waarvan de resultaten in

2015 zijn gepubliceerd (Keyaerts et al., 2015). Twintig vrouwelijke patiënten met één of meerdere

borsttumor(en) werden in de studie opgenomen en ondergingen elk 3 PET scans op 10, 60 en 90 min

post-toediening. Hieruit bleek dat er geen abnormale effecten voorkwamen en dat de stralingsdosis

binnen de grenzen bleef. De auteurs waren van mening dat het bestudeerde Nanobody een veilige en

goede optie zou zijn voor beeldvorming van HER2 positieve tumoren. Het gebruikte radionuclide

(68Ga) is echter niet het meest optimale en meest gebruikte nuclide voor PET. Vanwege zijn betere

eigenschappen wordt hier voornamelijk 18F voor gebruikt. In een vervolgstudie werd hetzelfde anti-

HER-2 Nanobody dan ook gekoppeld aan 18F, met de intentie om dit in de kliniek in te zetten als

diagnostisch instrument. (Xavier et al., 2016). De procedure om het Nanobody te labelen zou gebruikt

kunnen worden om andere Nanobodies te labelen met hetzelfde nuclide. Er werden geen afwijkende

21

resultaten gevonden en het 18F gelabeld Nanobody

vertoonde gelijkwaardige biodistributie en

beeldvormingseigenschappen als het 68Ga-

gelabeld Nanobody.

2.4.2. Optische beeldvorming

Nucleaire beeldvorimgstechnieken zoals de

hierboven beschreven SPECT en PET zijn relatief

trage technieken, aangezien een opname ongeveer

een uur in beslag neemt. Optische beeldvorming is

daarentegen een snelle techniek, waar binnen een

minuut een opname klaar is. Recente

ontwikkelingen hebben bovendien de techniek

goedkoper, sensitiever en sneller gemaakt.

Daarenboven is optische beeldvorming ook veiliger

want er komt geen ioniserende straling bij vrij zoals

dat wel het geval is bij nucleaire beeldvorming

(Oliveira et al., 2013). De werking van deze

techniek is gebaseerd op fluorescentie of op bio-

luminescentie. Bio-luminescentie maakt gebruik

van een luciferase-eiwit dat aanwezig is in de

targetcellen en dat licht produceert na verbruik van

zuurstof en ATP. Aangezien deze reactie

intracellulair gebeurt is deze techniek minder

geschikt voor gebruik met Nanobodies.

Fluorescentie maakt gebruik van fluorochromen die

geëxciteerd moeten worden met licht van een bepaalde golflengte waarna deze zelf licht gaat

uitzenden van een langere golflengte (Solomon et al., 2011). Fluorochromen kunnen alleenstaand

gebruikt worden als volgstof, als substraat van een enzym of gekoppeld worden aan een molecule als

marker zoals hieronder beschreven wordt. Meestal wordt gebruik gemaakt van nabij infrarood

fluorochromen omdat het een weefselpenetratie toelaat van enkele millimeters en er in dit

golflengtegebied een minimale autofluorescentie is van intracellulaire endogene moleculen.

Onderhuidse of blootgelegde tumoren kunnen zo in vivo in beeld worden gebracht.

Nanobodies gelinkt aan fluorchromen werden voor het eerst beschreven in 2011 (S Oliveira et al.,

2012). In deze studie werden anti-EGFR Nanobodies, niet-specifieke controle Nanobodies en een

anti-EGFR mAb (cetuximab) geconjugeerd aan de nabij infrarood fluorfoor IRDye800CW. De

conjugatie had geen significant effect op de specificiteit en de affiniteit van alle drie de antistoffen in

vitro. Toediening van Nanobody-IRDye800CW aan muizen met onderhuidse tumor transplantaten gaf

al na 30 min een goede aflijning van de tumor en het omringend weefsel weer, met een homogene

opname en verspreiding in het tumorweefsel. Het controle Nanobody accumuleerde daarentegen niet

in het tumorweefsel en het mAb had tot 72 uur nodig om een goede T/B ratio te bekomen. Tevens was

Figuur 7: Beeldgeleide chirurgie door middel van nabij-infrarood fluorescentie. De rode en de groene pijlen geven respectievelijk de tumor en de nieren weer. (Kijanka et al., 2013)

22

de distributie van het mAb in de tumor beperkter dan bij het Nanobody. Een latere studie van dezelfde

onderzoeksgroep maakte gebruik van een anti-HER2 Nanobody geconjugeerd aan IRDye800CW

(Kijanka et al., 2013). Idem als bij de vorige studie werd het Nanobody vergeleken met een

commercieel beschikbaar therapeutisch mAb tegen HER2 (trastuzumab). Vier uur na toediening was

de tumor al goed zichtbaar en afgelijnd van het omringende weefsel en met een T/B ratio gelijkaardig

aan trastuzumab zoals die pas bekomen wordt na 72 uur. In beide studies was er ook een hoge

accumulatie waar te nemen in de nieren zoals beschreven voor nucleaire beeldvorming, maar bij

optische beeldvorming is dit minder een probleem vanwege het ontbreken van de schadelijke straling.

Bovendien werd in de studie van Kijanka et al., een beeldgeleide chirurgische ingreep gedaan bij de

muizen met tumor transplantaten met behulp van een speciale near infrared camera (van Scheltinga

et al., 2011). Zowel de tumor als de nieren waren goed zichtbaar door de huid en door de snelheid

van de techniek is het mogelijk om real-time informatie te bekomen tijdens de operatie (figuur 7). De

tumoren werden succesvol verwijderd onder begeleiding van de beelden genomen tijdens de operatie.

Recentelijk heeft Bannas twee studies gepubliceerd voor het optisch in beeld brengen van lymfoma’s

door Nanobodies te ontwikkelen tegen het antigen ADP-ribosyltransferase 2 (ART2) en die te

conjugeren met een nabij infrarood fluorchroom (AF680) (Bannas et al., 2014, 2015). Tevens werd er

een vergelijking met een mAb tegen hetzelfde antigen en geconjugeerd aan hetzelfde fluorchroom

gemaakt in in vitro, in vivo en ex vivo experimenten. De affiniteit van de antistoffen werd in vitro

gecontroleerd en hieruit bleek dat er geen belangrijk verschil was tussen de non-conjugaten en

conjugaten. In vivo werd vastgesteld dat twee uur post-toediening de Nanobody-conjugaten de

hoogste fluorescentie vertoonden op de locaties van de tumoren met zeer weinig achtergrondruis. Het

mAb had pas na 24 uur de fluorescentiepiek bereikt. Ex vivo beeldvorming van de lymfeknopen

toonde aan dat de lymfeknopen van de muizen geïnjecteerd met de Nanobodies een 5 – 15 keer

hogere fluorescentie-intensiteit hadden dan de muizen die het mAb toegediend kregen.

23

Discussie

Na ruim 20 jaar onderzoek naar in eerste instantie HCAbs en vervolgens Nanobodies staan we nu

voor het begin van een nieuwe fase waarin Nanobodies hun intrede zullen doen in de kliniek voor

zowel diagnostische als therapeutische doeleinden. De eerste 10 à 15 jaar onderzoek was vooral

gericht op de Nanobodies zelf; de structurele eigenschappen, biochemische eigenschappen, selectie

en productie door middel van phage display. De resultaten van de tientallen onderzoeken die

gepubliceerd zijn over deze onderwerpen brachten vele belangrijke kenmerken naar voren zoals de

relatief makkelijke selectie en productie met een hoge opbrengst, het afwezig zijn van een

immuunreactie bij de host en de hoge oplosbaarheid in water. Eveneens werden een aantal unieke

eigenschappen ontdekt bij Nanobodies zoals de mogelijkheid om te kunnen binden aan, voor normale

antistoffen, cryptische epitopen, de hoge stabiliteit in extreme milieus en het bestand zijn tegen hoge

temperaturen. Het kleine formaat van de Nanobodies heeft zijn voordelen, namelijk enerzijds een

goede weefselpenetratie en distributie, zelfs door de bloed-hersenbarrière heen, en anderzijds ook

een potentieel nadeel te weten een snelle renale klaring uit het lichaam. Deze snelle klaring uit het

lichaam is niet bij iedere toepassing een gewenste eigenschap.

Er moest dus zorgvuldig afgewogen en onderzocht worden voor welke toepassingen in het onderzoek

naar kanker Nanobodies het meest geschikt zijn en in de laatste tien jaar zijn hier talrijke studies over

verschenen. Eerst en vooral was er de noodzaak om Nanobodies te produceren tegen specifieke

antigenen op tumorcellen. Verschillende bekende receptoren en liganden zoals EGFR,

VEGFR/VEGF-A en HGF/c-Met werden gebruikt als antigen en Nanobodies met grote affiniteit

kwamen hieruit voort. In de toekomst zullen nog meer tumorspecifieke merkers worden gevonden die

ook interessant kunnen zijn als doelwit voor Nanobodies en waarmee ook andere soorten kanker

kunnen worden aangepakt. Hoewel de bindingscapaciteit aan de antigenen uitstekend was en er

weldegelijk inhiberende reacties konden worden waargenomen, viel de therapeutische waarde van

alleenstaande, antagonistische Nanobodies tegen. Tumorgroei werd veelal geremd maar echte

regressie van een tumor was enkel te zien bij de Nanobodies tegen HGF. Nanobodies komen beter tot

hun recht als targeting agents waarbij ze bepaalde enzymen, toxines, medicatie of radioactieve

isotopen specifiek ter plaatse brengen in het tumorweefsel. Naast de antagonistische werking van de

Nanobodies zorgen de meegeleverde stoffen voor remming van de celdeling of induceren ze celdood.

De strategie die bepaalde effectordomeinen aan Nanobodies koppelt is op zichzelf veelbelovend.

Verder onderzoek zal de efficiëntie verhogen en wellicht kunnen zorgen voor volledige tumor

eradicatie door middel van effectordomeinen die enkel lokaal worden geactiveerd of die een precursor

omzetten in de actieve medicinale stof. Evenwel zorgt het kleine formaat van deze constructies voor

een snelle verwijdering uit het lichaam via de nieren en zal er moeten gekeken worden naar

oplossingen om de halfwaardetijd in de bloedbaan te verlengen zonder de distributie door het

tumorweefsel heen drastisch te verminderen. De halfwaardetijd van de drug delivery systems is door

het grotere formaat van de nanopartikels langer maar heeft echter wel een negatieve invloed op de

tumorpenetratie en zorgt voor een verhoogde accumulatie in lever en milt. Een balans zal gevonden

moeten worden tussen een acceptabele halfwaardetijd, biodistributie en voldoende opslagcapaciteit

voor medicatie. Juist de capaciteit van nanopartikels om veel medicatie specifiek ter plaatse te

24

brengen maakt dat deze strategie zeer veel potentie heeft. Daarenboven werd vastgesteld dat

bivalente Nanobodies op het oppervlak van nanopartikels zorgen voor internalisatie van het ganse

partikel met de intracellulaire vrijstelling van de medicatie tot gevolg. Het single-domein karakter van

Nanobodies maakt het mogelijk om relatief eenvoudig multivalente constructies te produceren wat een

voordeel is ten opzichte van mAbs. Tevens zijn er indrukwekkende resultaten behaald met

Nanobodies voor nucleaire en optische beeldvorming. Deze beeldvormingstechnieken worden steeds

vaker gebruikt bij therapie en de vroege detectie van kanker maar ook voor het opvolgen van

patiënten en bepaling van tumor-geassocieerde doelwitmoleculen. Het eenvoudig conjugeren van

Nanobodies met isotopen en kleurstoffen zal de intrede in de kliniek bespoedigen en zorgen voor

nauwkeurige en precieze informatie. De informatie die via optische beeldvorming bekomen wordt is

real-time waardoor het mogelijk wordt om tumoren vaker in hun geheel te verwijderen, zonder

omliggende weefsels aan te tasten en op die manier een hoger slagingspercentage te halen. Het

combineren van beeldvorming en therapie in een Nanobody zal de volgende stap zijn in de nucleaire

geneeskunde. Deze ‘radiofarmaceutica of theranostica’ kunnen worden toegediend aan een patiënt en

gelijktijdig zowel een therapeutische als een diagnostische werking hebben.

In de toekomst zullen er meer en nieuwe tumor-geassocieerde doelwitten moeten worden gevonden

om meerdere soorten kanker te kunnen behandelen of om meerdere doelwitmoleculen per tumorcel te

kunnen gebruiken. Het gebruiken van meerdere doelwitten zal de effectiviteit van een enkele

behandeling sterk doen toenemen en de behandeling dragelijker maken voor de patiënt. Verder zullen

er nu klinische studies nodig zijn om de tot nu toe behaalde resultaten te bevestigen en daarmee een

nieuw tijdperk in te leiden voor het diagnosticeren en behandelen van kanker.

25

Referentielijst

Aboody, K.S., Brown, A., Rainov, N.G., Bower, K.A., Liu, S., Yang, W., … others. (2000). Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: evidence from intracranial gliomas. Proceedings of the National Academy of Sciences 97(23): 12846–12851.

Altintas, I., Heukers, R., van der Meel, R., Lacombe, M., Amidi, M., van Bergen En Henegouwen, P.M.P., … Kok, R.J. (2013). Nanobody-albumin nanoparticles (NANAPs) for the delivery of a multikinase inhibitor 17864 to EGFR overexpressing tumor cells. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society 165(2): 110–8.

Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R. & Muyldermans, S. (1997). Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS letters 414(3): 521–6.

Asosingh, K., Radl, J., Van Riet, I., Van Camp, B. & Vanderkerken, K. (2000). The 5TMM series: a useful in vivo mouse model of human multiple myeloma. The Hematology Journal 1(5): 351–356.

Bannas, P., Lenz, A., Kunick, V., Fumey, W., Rissiek, B., Schmid, J., … others. (2015). Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE (98).

Bannas, P., Well, L., Lenz, A., Rissiek, B., Haag, F., Schmid, J., … others. (2014). In vivo near-infrared fluorescence targeting of T cells: comparison of nanobodies and conventional monoclonal antibodies. Contrast media \& molecular imaging 9(2): 135–142.

Baral, T.N., Murad, Y., Nguyen, T.-D., Iqbal, U. & Zhang, J. (2011). Isolation of functional single domain antibody by whole cell immunization: implications for cancer treatment. Journal of immunological methods 371(1-2): 70–80.

Baselga, J. & Arteaga, C.L. (2005). Critical update and emerging trends in epidermal growth factor receptor targeting in cancer. Journal of Clinical Oncology 23(11): 2445–2459.

Beattie, B.K., Prentice, G.A. & Merrill, A.R. (1996). Investigation into the catalytic role for the tryptophan residues within domain III of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Biochemistry 35(48): 15134–15142.

Beck, A., Wurch, T., Bailly, C. & Corvaia, N. (2010). Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies. Nature reviews. Immunology 10(5): 345–52.

Behdani, M., Zeinali, S., Karimipour, M., Khanahmad, H., Asadzadeh, N., Azadmanesh, K., … Anbouhi, M.H. (2012). Expression, purification, and characterization of a diabody against the most important angiogenesis cell receptor: Vascular endothelial growth factor receptor 2. Advanced biomedical research 1.

Behdani, M., Zeinali, S., Karimipour, M., Khanahmad, H., Schoonooghe, S., Aslemarz, A., … Muyldermans, S. (2013). Development of VEGFR2-specific Nanobody Pseudomonas exotoxin A conjugated to provide efficient inhibition of tumor cell growth. New biotechnology 30(2): 205–9.

Behdani, M., Zeinali, S., Khanahmad, H., Karimipour, M., Asadzadeh, N., Azadmanesh, K., … others. (2012). Generation and characterization of a functional Nanobody against the vascular endothelial growth factor receptor-2; angiogenesis cell receptor. Molecular immunology 50(1): 35–41.

Berz, D. & Wanebo, H. (2011). Targeting the growth factors and angiogenesis pathways: small molecules in solid tumors. Journal of surgical oncology 103(6): 574–586.

Birchmeier, C., Birchmeier, W., Gherardi, E. & Woude, G.F.V. (2003). Met, metastasis, motility and more. Nature reviews Molecular cell biology 4(12): 915–925.

Bottaro, D.P., Rubin, J.S., Faletto, D.L., Chan, A., Kmiecik, T.E., Woude, G.V. & Aaronson, S.A. (1991). Identification of the hepatocyte growth factor receptor as the c-met proto-oncogene product.

26

Science 251(4995): 802–804.

Caveliers, V., Cortez-Retamozo, V., Lahoutte, T., Tchouate Gainkam, L.O., Hernot, S., Packeu, A., … others. (2008). 99mTc-labeled nanobodies: a new type of targeted probes for imaging antigen expression. Current Radiopharmaceuticals 1(1): 37–41.

Chakravarty, R., Goel, S. & Cai, W. (2014). Nanobody: the “magic bullet” for molecular imaging. Theranostics 4(4): 386.

Chapman, A.P., Antoniw, P., Spitali, M., West, S., Stephens, S. & King, D.J. (1999). Therapeutic antibody fragments with prolonged in vivo half-lives. Nature biotechnology 17(8): 780–783.

Conrath, K., Vincke, C., Stijlemans, B., Schymkowitz, J., Decanniere, K., Wyns, L., … Loris, R. (2005). Antigen binding and solubility effects upon the veneering of a camel VHH in framework-2 to mimic a VH. Journal of molecular biology 350(1): 112–125.

Cortez-Retamozo, V., Backmann, N., Senter, P.D., Wernery, U., De Baetselier, P., Muyldermans, S. & Revets, H. (2004). Efficient cancer therapy with a nanobody-based conjugate. Cancer research 64(8): 2853–7.

Cortez-Retamozo, V., Lauwereys, M., Hassanzadeh Gh, G., Gobert, M., Conrath, K., Muyldermans, S., … Revets, H. (2002). Efficient tumor targeting by single-domain antibody fragments of camels. International journal of cancer. Journal international du cancer 98(3): 456–62.

D’huyvetter, M., Aerts, A., Xavier, C., Vaneycken, I., Devoogdt, N., Gijs, M., … others. (2012). Development of 177Lu-nanobodies for radioimmunotherapy of HER2-positive breast cancer: evaluation of different bifunctional chelators. Contrast media \& molecular imaging 7(2): 254–264.

D’huyvetter, M., Vincke, C., Xavier, C., Aerts, A., Impens, N., Baatout, S., … others. (2014). Targeted radionuclide therapy with a 177Lu-labeled anti-HER2 nanobody. Theranostics 4(7): 708–20.

Davies, J. & Riechmann, L. (1994). “Camelising”human antibody fragments: NMR studies on VH domains. FEBS letters 339(3): 285–290.

Davies, J. & Riechmann, L. (1996). Single antibody domains as small recognition units: design and in vitro antigen selection of camelized, human VH domains with improved protein stability. Protein engineering 9(6): 531–537.

De Genst, E., Silence, K., Decanniere, K., Conrath, K., Loris, R., Kinne, J., … Wyns, L. (2006). Molecular basis for the preferential cleft recognition by dromedary heavy-chain antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103(12): 4586–91.

Denayer, T., Stӧhr, T., Beste, G., Brige, A., Ververken, C. & Holz, J.-B. (2013). Abstract LB-316: The anti-c-Met Nanobody\textregistered, a novel and promising anti-cancer therapeutic. Cancer Research 73(8 Supplement): LB–316.

Dumoulin, M., Conrath, K., Van Meirhaeghe, A., Meersman, F., Heremans, K., Frenken, L.G.J., … Matagne, A. (2002). Single-domain antibody fragments with high conformational stability. Protein science : a publication of the Protein Society 11(3): 500–15.

Ebrahimizadeh, W., Gargari, S.L.M.M., Javidan, Z. & Rajabibazl, M. (2015). Production of Novel VHH Nanobody Inhibiting Angiogenesis by Targeting Binding Site of VEGF. Applied biochemistry and biotechnology 176(7): 1985–1995.

Elzoghby, A.O., Samy, W.M. & Elgindy, N.A. (2012). Albumin-based nanoparticles as potential controlled release drug delivery systems. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society 157(2): 168–82.

27

Ewert, S., Cambillau, C., Conrath, K. & Plückthun, A. (2002). Biophysical properties of camelid VHH domains compared to those of human VH3 domains. Biochemistry 41(11): 3628–3636.

Franklin, E., Lowenstein, J., Bigelow, B. & Meltzer, M. (1964). Heavy chain disease—a new disorder of serum $\gamma$-globulins: report of the first case. The American journal of medicine 37(3): 332–350.

Frenken, L.G., van der Linden, R.H., Hermans, P.W., Bos, J.W., Ruuls, R.C., de Geus, B. & Verrips, C.T. (2000). Isolation of antigen specific llama VHH antibody fragments and their high level secretion by Saccharomyces cerevisiae. Journal of biotechnology 78(1): 11–21.

Gainkam, L.O.T., Caveliersa, V., Devoogdt, N., Vanhove, C., Xavier, C., Boerman, O., … Lahoutte, T. (2011). Localization, mechanism and reduction of renal retention of technetium-99m labeled epidermal growth factor receptor-specific nanobody in mice. Contrast Media Mol. Imaging 6: 85–92.

Gainkam, L.O.T., Huang, L., Caveliers, V., Keyaerts, M., Hernot, S., Vaneycken, I., … Lahoutte, T. (2008). Comparison of the biodistribution and tumor targeting of two 99mTc-labeled anti-EGFR nanobodies in mice, using pinhole SPECT/micro-CT. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine 49(5): 788–95.

Gainkam, L.T., Keyaerts, M., Caveliers, V., Devoogdt, N., Vanhove, C., Grunsven, L., … Lahoutte, T. (2011). Correlation Between Epidermal Growth Factor Receptor-Specific Nanobody Uptake and Tumor Burden: A Tool for Noninvasive Monitoring of Tumor Response to Therapy. Molecular Imaging and Biology 5(13): 940–948.

Gill, G.N., Kawamoto, T., Cochet, C., Le, A., Sato, J., Masui, H., … Mendelsohn, J. (1984). Monoclonal anti-epidermal growth factor receptor antibodies which are inhibitors of epidermal growth factor binding and antagonists of epidermal growth factor binding and antagonists of epidermal growth factor-stimulated tyrosine protein kinase activity. Journal of Biological Chemistry 259(12): 7755–7760.

Glockshuber, R., Malia, M., Pfitzinger, I. & Plueckthun, A. (1990). A comparison of strategies to stabilize immunoglobulin Fv-fragments. Biochemistry 29(6): 1362–1367.

Govaert, J., Pellis, M., Deschacht, N., Vincke, C., Conrath, K., Muyldermans, S. & Saerens, D. (2012). Dual beneficial effect of interloop disulfide bond for single domain antibody fragments. Journal of Biological Chemistry 287(3): 1970–1979.

Greenberg, A.S., Avila, D., Hughes, M., Hughes, A., McKinney, E.C. & Flajnik, M.F. (1995). A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature 374(6518): 168–173.

Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hammers, C., Songa, E.B., … Hammers, R. (1993). Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature 363(6428): 446–448.

Harmsen, M.M., Ruuls, R.C., Nijman, I.J., Niewold, T.A., Frenken, L.G. & de Geus, B. (2000). Llama heavy-chain V regions consist of at least four distinct subfamilies revealing novel sequence features. Molecular immunology 37(10): 579–90.

Hershman, D.L., McBride, R.B., Eisenberger, A., Tsai, W.Y., Grann, V.R. & Jacobson, J.S. (2008). Doxorubicin, cardiac risk factors, and cardiac toxicity in elderly patients with diffuse B-cell non-Hodgkin’s lymphoma. Journal of Clinical Oncology 26(19): 3159–3165.

Heukers, R., Altintas, I., Raghoenath, S., De Zan, E., Pepermans, R., Roovers, R.C., … others. (2014). Targeting hepatocyte growth factor receptor (Met) positive tumor cells using internalizing nanobody-decorated albumin nanoparticles. Biomaterials 35(1): 601–610.

Hicklin, D.J. & Ellis, L.M. (2005). Role of the vascular endothelial growth factor pathway in tumor growth and angiogenesis. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of

28

Clinical Oncology 23(5): 1011–27.

Holliger, P. & Hudson, P.J. (2005). Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature biotechnology 23(9): 1126–36.

Huang, L., Gainkam, L.O.T., Caveliers, V., Vanhove, C., Keyaerts, M., De Baetselier, P., … Lahoutte, T. (2008). SPECT imaging with 99mTc-labeled EGFR-specific nanobody for in vivo monitoring of EGFR expression. Molecular Imaging and Biology 10(3): 167–175.

Kazemi-Lomedasht, F., Behdani, M., Bagheri, K.P., Habibi-Anbouhi, M., Abolhassani, M., Arezumand, R., … Mirzahoseini, H. (2015). Inhibition of angiogenesis in human endothelial cell using VEGF specific nanobody. Molecular immunology 65(1): 58–67.

Keyaerts, M., Xavier, C., Heemskerk, J., Devoogdt, N., Everaert, H., Gevaert, T., … others. (2015). Nanobody-based PET/CT imaging of HER2 expression in breast carcinoma: Phase I results and potential to assess tumor heterogeneity. In ASCO Annual Meeting Proceedings (Vol. 33).

Kijanka, M., Warnders, F.-J., El Khattabi, M., Lub-de Hooge, M., van Dam, G.M., Ntziachristos, V., … en Henegouwen, P.M. van B. (2013). Rapid optical imaging of human breast tumour xenografts using anti-HER2 VHHs site-directly conjugated to IRDye 800CW for image-guided surgery. European journal of nuclear medicine and molecular imaging 40(11): 1718–1729.

Krüwel, T., Nevoltris, D., Bode, J., Dullin, C., Baty, D., Chames, P. & Alves, F. (2016). In vivo detection of small tumour lesions by multi-pinhole SPECT applying a 99mTc-labelled nanobody targeting the Epidermal Growth Factor Receptor. Scientific reports 6.

Lauwereys, M., Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Kinne, J., Hölzer, W., De Genst, E., … Muyldermans, S. (1998). Potent enzyme inhibitors derived from dromedary heavy-chain antibodies. The EMBO journal 17(13): 3512–20.

Lemaire, M., D’huyvetter, M., Lahoutte, T., Van Valckenborgh, E., Menu, E., De Bruyne, E., … others. (2014). Imaging and radioimmunotherapy of multiple myeloma with anti-idiotypic Nanobodies. Leukemia 28(2): 444.

Liu, Y., Cheung, L.H., Thorpe, P. & Rosenblum, M.G. (2003). Mechanistic studies of a novel human fusion toxin composed of vascular endothelial growth factor (VEGF) 121 and the serine protease granzyme B: directed apoptotic events in vascular endothelial cells. Molecular cancer therapeutics 2(10): 949–959.

Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y. & Hori, K. (2000). Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of controlled release 65(1): 271–284.

Mamot, C., Drummond, D.C., Noble, C.O., Kallab, V., Guo, Z., Hong, K., … Park, J.W. (2005). Epidermal growth factor receptor-targeted immunoliposomes significantly enhance the efficacy of multiple anticancer drugs in vivo. Cancer research 65(24): 11631–11638.

Müller, B.G., Leuenberger, H. & Kissel, T. (1996). Albumin nanospheres as carriers for passive drug targeting: an optimized manufacturing technique. Pharmaceutical Research 13(1): 32–37.

Muyldermans, S. (2001). Single domain camel antibodies: current status. Reviews in Molecular Biotechnology 74(4): 277–302.

Muyldermans, S. (2013). Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual review of biochemistry 82: 775–797.

Muyldermans, S., Atarhouch, T., Saldanha, J., Barbosa, J. & Hamers, R. (1994). Sequence and structure of VH domain from naturally occurring camel heavy chain immunoglobulins lacking light chains. Protein engineering 7(9): 1129–1135.

29

Muyldermans, S., Cambillau, C. & Wyns, L. (2001). Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in biochemical sciences 26(4): 230–235.

Nguyen, V.K., Hamers, R., Wyns, L. & Muyldermans, S. (1999). Loss of splice consensus signal is responsible for the removal of the entire C H 1 domain of the functional camel IGG2A heavy-chain antibodies. Molecular immunology 36(8): 515–524.

Nguyen, V.K., Hamers, R., Wyns, L. & Muyldermans, S. (2000). Camel heavy-chain antibodies: diverse germline VHH and specific mechanisms enlarge the antigen-binding repertoire. The EMBO journal 19(5): 921–930.

Oliveira, S., Heukers, R., Sornkom, J., Kok, R.J. & van Bergen En Henegouwen, P.M.P. (2013). Targeting tumors with nanobodies for cancer imaging and therapy. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society 172(3): 607–17.

Oliveira, S., Schiffelers, R., Storm, G., Henegouwen, P., Roovers, R. & others. (2009). Crosstalk between epidermal growth factor receptor-and insulin-like growth factor-1 receptor signaling: implications for cancer therapy. Current cancer drug targets 9(6): 748–760.

Oliveira, S., Schiffelers, R.M., van der Veeken, J., van der Meel, R., Vongpromek, R., van Bergen En Henegouwen, P.M.P., … Roovers, R.C. (2010). Downregulation of EGFR by a novel multivalent nanobody-liposome platform. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society 145(2): 165–75.

Oliveira, S., van Dongen, G., Stigter-van Walsum, M., Roovers, R., Stam, J., Mali, W., … van Bergen en Henegouwen, P. (2012). Rapid visualization of human tumor xenografts through optical imaging with a near-infrared fluorescent anti-epidermal growth factor receptor nanobody. Molecular imaging 11(1): 33–46.

Olsson, A.-K., Dimberg, A., Kreuger, J. & Claesson-Welsh, L. (2006). VEGF receptor signalling? In control of vascular function. Nature reviews Molecular cell biology 7(5): 359–371.

Omidfar, K., Amjad Zanjani, F.S., Hagh, A.G., Azizi, M.D., Rasouli, S.J. & Kashanian, S. (2013). Efficient growth inhibition of EGFR over-expressing tumor cells by an anti-EGFR nanobody. Molecular biology reports 40(12): 6737–45.

Omidfar, K., Rasaee, M., Modjtahedi, H., Forouzandeh, M., Taghikhani, M. & Golmakani, N. (2004). Production of a Novel Camel Single-Domain Antibody Specificfor the Type III Mutant EGFR. Tumor Biology 25(5-6): 296–305.

Pérez, J.M., Renisio, J.G., Prompers, J.J., van Platerink, C.J., Cambillau, C., Darbon, H. & Frenken, L.G. (2001). Thermal unfolding of a llama antibody fragment: a two-state reversible process. Biochemistry 40(1): 74–83.

Petrelli, F., Borgonovo, K. & Barni, S. (2010). Targeted delivery for breast cancer therapy: the history of nanoparticle-albumin-bound paclitaxel. Expert opinion on pharmacotherapy 11(8): 1413–1432.

Revets, H., De Baetselier, P. & Muyldermans, S. (2005). Nanobodies as novel agents for cancer therapy. Expert opinion on biological therapy 5(1): 111–124.

Roovers, R.C., Laeremans, T., Huang, L., De Taeye, S., Verkleij, A.J., Revets, H., … van Bergen en Henegouwen, P.M.P. (2007). Efficient inhibition of EGFR signaling and of tumour growth by antagonistic anti-EFGR Nanobodies. Cancer immunology, immunotherapy : CII 56(3): 303–317.

Roovers, R.C., Vosjan, M.J.W.D., Laeremans, T., el Khoulati, R., de Bruin, R.C.G., Ferguson, K.M., … van Bergen en Henegouwen, P.M.P. (2011). A biparatopic anti-EGFR nanobody efficiently inhibits solid tumour growth. International journal of cancer. Journal international du cancer 129(8): 2013–24.

30

Scott, A.M., Wolchok, J.D. & Old, L.J. (2012). Antibody therapy of cancer. Nature Reviews Cancer 12(4): 278–287.

Senter, P.D. & Springer, C.J. (2001). Selective activation of anticancer prodrugs by monoclonal antibody-enzyme conjugates. Advanced drug delivery reviews 53(3): 247–264.

Shahangian, S.S., Sajedi, R.H., Hasannia, S., Jalili, S., Mohammadi, M., Taghdir, M., … Sariri, R. (2015). A conformation-based phage-display panning to screen neutralizing anti-VEGF VHHs with VEGFR2 mimicry behavior. International journal of biological macromolecules 77: 222–234.

Sheriff, S. & Constantine, K.L. (1996). Redefining the minimal antigen-binding fragment. Nature Structural \& Molecular Biology 3(9): 733–736.

Siontorou, C.G. (2013). Nanobodies as novel agents for disease diagnosis and therapy. International journal of nanomedicine 8: 4215.

Slørdahl, T.S., Denayer, T., Moen, S.H., Standal, T., Børset, M., Ververken, C. & Rø, T.B. (2013). Anti-c-MET Nanobody - a new potential drug in multiple myeloma treatment. European journal of haematology 91(5): 399–410.

Smith, B.J., Popplewell, A., Athwal, D., Chapman, A.P., Heywood, S., West, S.M., … others. (2001). Prolonged in vivo residence times of antibody fragments associated with albumin. Bioconjugate chemistry 12(5): 750–756.

Smith, G.P. & Petrenko, V.A. (1997). Phage display. Chemical reviews 97(2): 391–410.

Solomon, M., Liu, Y., Berezin, M.Y. & Achilefu, S. (2011). Optical imaging in cancer research: basic principles, tumor detection, and therapeutic monitoring. Medical principles and practice : international journal of the Kuwait University, Health Science Centre 20(5): 397–415.

Song, J.J. & Lee, Y.J. (2008). Differential cleavage of Mst1 by caspase-7/-3 is responsible for TRAIL-induced activation of the MAPK superfamily. Cellular signalling 20(5): 892–906.

Stewart, B., Wild, C.P. & others. (2015). World cancer report 2014. World.

Stijlemans, B., Conrath, K., Cortez-Retamozo, V., Van Xong, H., Wyns, L., Senter, P., … Magez, S. (2004). Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies African trypanosomes as paradigm. Journal of Biological Chemistry 279(2): 1256–1261.

Talelli, M., Iman, M., Varkouhi, A.K., Rijcken, C.J.F., Schiffelers, R.M., Etrych, T., … Hennink, W.E. (2010). Core-crosslinked polymeric micelles with controlled release of covalently entrapped doxorubicin. Biomaterials 31(30): 7797–804.

Talelli, M., Oliveira, S., Rijcken, C.J.F., Pieters, E.H.E., Etrych, T., Ulbrich, K., … Lammers, T. (2013). Intrinsically active nanobody-modified polymeric micelles for tumor-targeted combination therapy. Biomaterials 34(4): 1255–60.

Talelli, M., Rijcken, C.J.F., Oliveira, S., van der Meel, R., van Bergen en Henegouwen, P.M.P., Lammers, T., … Hennink, W.E. (2011). Reprint of “Nanobody-shell functionalized thermosensitive core-crosslinked polymeric micelles for active drug targeting”. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society 153(1): 93–102.

Tang, Y., Shah, K., Messerli, S.M., Snyder, E., Breakefield, X. & Weissleder, R. (2003). In vivo tracking of neural progenitor cell migration to glioblastomas. Human gene therapy 14(13): 1247–1254.

Tanha, J., Dubuc, G., Hirama, T., Narang, S.A. & MacKenzie, C.R. (2002). Selection by phage display of llama conventional V(H) fragments with heavy chain antibody V(H)H properties. Journal of immunological methods 263(1-2): 97–109.

31

Tijink, B.M., Laeremans, T., Budde, M., Stigter-van Walsum, M., Dreier, T., de Haard, H.J., … van Dongen, G.A. (2008). Improved tumor targeting of anti-epidermal growth factor receptor Nanobodies through albumin binding: taking advantage of modular Nanobody technology. Molecular cancer therapeutics 7(8): 2288–2297.

Van de Water, J.A.J.M., Bagci-Onder, T., Agarwal, A.S., Wakimoto, H., Roovers, R.C., Zhu, Y., … Shah, K. (2012). Therapeutic stem cells expressing variants of EGFR-specific nanobodies have antitumor effects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109(41): 16642–7.

Van der Linden, R., Frenken, L., De Geus, B., Harmsen, M., Ruuls, R., Stok, W., … Verrips, C. (1999). Comparison of physical chemical properties of llama V HH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology 1431(1): 37–46.

Van der Meel, R., Oliveira, S., Altintas, I., Haselberg, R., van der Veeken, J., Roovers, R.C., … Kok, R.J. (2012). Tumor-targeted Nanobullets: Anti-EGFR nanobody-liposomes loaded with anti-IGF-1R kinase inhibitor for cancer treatment. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society 159(2): 281–9.

Van der Meel, R., Oliveira, S., Altintas, I., Heukers, R., Pieters, E.H., van Bergen en Henegouwen, P.M., … Schiffelers, R.M. (2013). Inhibition of tumor growth by targeted anti-EGFR/IGF-1R nanobullets depends on efficient blocking of cell survival pathways. Molecular pharmaceutics 10(10): 3717–3727.

Van Scheltinga, A.G.T., van Dam, G.M., Nagengast, W.B., Ntziachristos, V., Hollema, H., Herek, J.L., … de Vries, E.G. (2011). Intraoperative near-infrared fluorescence tumor imaging with vascular endothelial growth factor and human epidermal growth factor receptor 2 targeting antibodies. Journal of Nuclear Medicine 52(11): 1778–1785.

Vaneycken, I., Devoogdt, N., Van Gassen, N., Vincke, C., Xavier, C., Wernery, U., … Caveliers, V. (2011). Preclinical screening of anti-HER2 nanobodies for molecular imaging of breast cancer. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 25(7): 2433–46.

Verheesen, P. & Laeremans, T. (2012). Selection by Phage Display of Single Domain Antibodies Specific to Antigens in Their Native Conformation. In Single Domain Antibodies. Springer.

Vincke, C., Loris, R., Saerens, D., Martinez-Rodriguez, S., Muyldermans, S. & Conrath, K. (2009). General strategy to humanize a camelid single-domain antibody and identification of a universal humanized nanobody scaffold. Journal of Biological Chemistry 284(5): 3273–3284.

Vosjan, M.J., Perk, L.R., Roovers, R.C., Visser, G.W., Stigter-van Walsum, M., en Henegouwen, P.M. van B. & van Dongen, G.A. (2011). Facile labelling of an anti-epidermal growth factor receptor Nanobody with 68Ga via a novel bifunctional desferal chelate for immuno-PET. European journal of nuclear medicine and molecular imaging 38(4): 753–763.

Vu, K.B., Ghahroudi, M.A., Wyns, L. & Muyldermans, S. (1997). Comparison of llama V H sequences from conventional and heavy chain antibodies. Molecular immunology 34(16): 1121–1131.

Wheeler, D.L., Dunn, E.F. & Harari, P.M. (2010). Understanding resistance to EGFR inhibitors—impact on future treatment strategies. Nature reviews Clinical oncology 7(9): 493–507.

Wu, T.T., Johnson, G. & Kabat, E.A. (1993). Length distribution of CDRH3 in antibodies. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 16(1): 1–7.

Xavier, C., Blykers, A., Vaneycken, I., D’Huyvetter, M., Heemskerk, J., Lahoutte, T., … Caveliers, V. (2016). 18 F-Nanobody for PET imaging of HER2 overexpressing tumors. Nuclear Medicine and Biology.

32

Xavier, C., Vaneycken, I., D’huyvetter, M., Heemskerk, J., Keyaerts, M., Vincke, C., … Caveliers, V. (2013). Synthesis, preclinical validation, dosimetry, and toxicity of 68Ga-NOTA-anti-HER2 Nanobodies for iPET imaging of HER2 receptor expression in cancer. Journal of Nuclear Medicine 54(5): 776–784.

Zamboni, W.C., Torchilin, V., Patri, A.K., Hrkach, J., Stern, S., Lee, R., … Grodzinski, P. (2012). Best practices in cancer nanotechnology: perspective from NCI nanotechnology alliance. Clinical cancer research 18(12): 3229–3241.