Tierärztliche Hochschule Hannover Arbeitsgruppe Immunologie · von Substanz P an der...

Tierärztliche Hochschule Hannover

Arbeitsgruppe Immunologie _____________________________________________________________

Charakterisierung

der immunmodulatorischen Wirkung

des Neuromediators Substanz P

auf bovine Immunzellen

INAUGURAL - DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Anja Sipka

aus Karlsruhe

Hannover 2008

Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth

1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth

2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. M. Hoedemaker

Tag der mündlichen Prüfung: 18. November 2008

Gefördert durch die Firma Pfizer Animal Health durch Personal- und Sachmittel

Meinem Vater

Hanspeter Lamprecht gewidmet,

und in liebevoller Erinnerung

an meine Mutter

Gamze Lamprecht-Sipka.

Inhaltsverzeichnis Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen

1 Einleitung und Zielsetzung ............................................................................................. 13 2 Literaturübersicht............................................................................................................ 15

2.1 Die neuroendokrine Regulation der Immunantwort......................................... 15 2.1.1 Regulation durch das zentrale Nervensystem.............................................. 16 2.1.2 Modulation durch das periphere Nervensystem .......................................... 17

2.2 Das Neuropeptid Substanz P ............................................................................ 20 2.2.1 Gene und Peptidsynthese ............................................................................. 20 2.2.2 Abbau........................................................................................................... 22 2.2.3 Rezeptoren ................................................................................................... 22 2.2.4 Verbreitung und Funktion............................................................................ 24

2.3 Modulation von Zellfunktionen durch Substanz P........................................... 26 2.3.1 Interaktion mit neutrophilen Granulozyten.................................................. 26 2.3.2 Beeinflussung von Monozyten und Makrophagen ...................................... 29 2.3.3 Aktivierung von Thrombozyten................................................................... 30 2.3.4 Modulation von Lymphozyten..................................................................... 31

2.4 Die Rolle von Substanz P bei entzündlichen Erkrankungen............................ 33 2.4.1 Infektiöse und nicht-infektiöse Erkrankungen des

Gastrointestinaltrakts............................................................................... 33 2.4.2 Erkrankungen der Atemwege ...................................................................... 34 2.4.3 Arthritis ........................................................................................................ 35

2.5 Die Bedeutung von Substanz P beim Rind ...................................................... 36 3 Geräte, Material und Methoden ...................................................................................... 38

3.1 Geräte ............................................................................................................... 38 3.2 Material ............................................................................................................ 39

3.2.1 Klinikbedarf ................................................................................................. 39 3.2.2 Laborbedarf.................................................................................................. 40 3.2.3 Reagenzien................................................................................................... 41 3.2.4 Versuchstiere................................................................................................ 43 3.2.5 Mono- und polyklonale Antikörper ............................................................. 43 3.2.6 Kulturmedien, Puffer und Lösungen............................................................ 44 3.2.7 Plasmid für die Herstellung von Standardreihen ......................................... 49 3.2.8 Primer........................................................................................................... 50

3.3 Methoden.......................................................................................................... 51

3.3.1 Gewinnung einzelner Leukozytensubpopulationen des Blutes ................... 51 3.3.2 Generierung von Makrophagen aus Blutmonozyten in vitro....................... 54 3.3.3 In-vitro-Stimulation von Monozyten und in vitro generierter

Makrophagen........................................................................................... 55 3.3.4 Durchflusszytometrie................................................................................... 56 3.3.5 Quantifizierung vitaler Zellen mittels Referenzzellmethode....................... 57 3.3.6 In-vitro Proliferationsmessung..................................................................... 58 3.3.7 Bestimmung der Apoptose neutrophiler Granulozyten ............................... 59 3.3.8 In-vitro-Migration neutrophiler Granulozyten............................................. 61 3.3.9 Intrazelluläre Calciummessung.................................................................... 64 3.3.10 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF) .............................................. 66 3.3.11 Analyse der Thrombozyten-Granulozyten-Aggregation ............................. 67 3.3.12 Molekularbiologische Verfahren ................................................................. 68 3.3.13 Statistische Auswertung............................................................................... 82

4 Ergebnisse....................................................................................................................... 84 4.1 Expression und Regulation des Substanz P-Rezeptors in vivo und in vitro..... 84

4.1.1 Rezeptorexpression in vivo .......................................................................... 84 4.1.2 Rezeptorexpression in einzelnen Leukozyten-Subpopulationen in vitro..... 87

4.2 Modulatorische Wirkung auf die Proliferation mononukleärer Zellen............ 88 4.2.1 Einfluss von Substanz P auf die Vitalität und die Blastogenese

lymphoider Zellen nach In-vitro-Stimulation ......................................... 88 4.2.2 Einfluss von Substanz P auf die Proliferation von T-

Zellsubpopulationen nach In-vitro-Stimulation ...................................... 91 4.3 Die Substanz-P-vermittelte Modulation neutrophiler Granulozyten ............... 92

4.3.1 Modulation des Calcium-Einstroms in neutrophile Granulozyten .............. 92 4.3.2 Beeinflussung der Überlebensrate neutrophiler Granulozyten .................... 96 4.3.3 Beeinflussung der In-vitro-Migration neutrophiler Granulozyten durch

Substanz P ............................................................................................. 100 4.3.4 Aggregation von Thrombozyten und Granulozyten .................................. 103

4.4 Modulation von Monozyten und Makrophagen durch Substanz P ................ 106 4.4.1 Regulation von Chemokinen und Zytokinen ............................................. 106 4.4.2 Sezernierte Produkte von in-vitro-generierten Makrophagen.................... 113

5 Diskussion..................................................................................................................... 117 5.1 Expression und Regulation des Substanz-P-Rezeptors in vivo und in vitro .. 117 5.2 Modulatorischer Einfluss von Substanz P auf bovine Immunzellen.............. 121

5.2.1 Beeinflussung von Lymphozyten .............................................................. 121

5.3 Beeinflussung von Granulozyten ................................................................... 122 5.3.1 Beeinflussung von Monozyten und Makrophagen .................................... 128

5.4 Ausblick ......................................................................................................... 132 6 Zusammenfassung ........................................................................................................ 134 7 Summary....................................................................................................................... 137 8 Literaturverzeichnis ...................................................................................................... 139

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen A Adenin Abb. Abbildung ACE Angiotensin converting enzyme Ala Alanin AMP Adenosin-5´-monophosphat ANOVA analysis of variance Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser) Aqua tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) Arg Arginin Asp Asparagin ATP Adenosin-5′-triphosphat BAL Bronchio-Alveoläre-Lavage Bcl-2 B-cell lymphoma 2 (anti-apoptotisches Protein) bp base pairs (Basenpaare) bzw. beziehungsweise C Cytosin C5a opsonisierendes Fragment der Komplementkomponente C5 Ca2+ ionisiertes Calcium CCL β-Chemokin-Ligand, zwei Cysteinmoleküle in Folge („CC“) CD cluster of differentiation cDNA complemetary DNA CFU colony forming units CGRP Calcitonin-gene related peptide CNS central nervous system; zentrales Nervensystem CO2 Kohlenstoffdioxid ConA Concavalin A CpG Cytosin-Phosphat-Guanosin (unmethylierte DNA-Motive v.a. aus Bakterien) CRH Corticotropin-Releasing-Hormon Ct cycle threshold CXCL α-Chemokin-Ligand, zwei Cysteinmoleküle werden von beliebiger Aminosäure

(X) getrennt CXCL8 Interleukin-8 DAG Diacylglycerol DISC death inducing signalling complex DMF Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTPs Deoxynucleotide Triphosphates dsDNA doppelsträngige DNA E. coli Escherichia coli EDTA ethylendiamine-tetraacetic acid (Ethylendiamintetraacetat) et al. et alii (lateinisch: und andere) FACScan® fluorescence activated cell scanner (Fluoreszenzaktiviertes Zellmessgerät) FCCP Carbonylcyanid-4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazon FCM flow cytometer (Durchflusszytometer) FCS fetal calf serum (Fetales Kälberserum) FITC Fluoresceinisothiocyanat FL-1, -2, -3 Messkanäle des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz

FL-1 = Grünfluoreszenz, 530 ± 15 nm; FL-2 = Orangefluoreszenz, 585 ± 21 nm; FL-3 = Rotfluoreszenz, >650 nm

fMLP N-Formyl-Methionyl-L-Leucyl-L-Phenylalanin for forward FSC forward scatter (Vorwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan®

g Gramm G Guanin G-CSF granulocyte-colony stimulating factor (Granulozyten-Wachstumsfaktor) ggf. gegebenenfalls Gln Glutamin Gly Glycin GM-CSF granulocyte-macrophage-colony stimulating factor (Granulozyten-Makrophagen-

Wachstumsfaktor) h hora (lateinisch: Stunde) H2O Wasser HBSS Hanks Balanced Salt Solution His Histidin HPA hypothalamic-pituitary-adrenal-axis; Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-

Achse i.d.R. in der Regel I0+ Iscove®-Medium mit L-Glutamin, Antibiotikumzusatz ohne Serum I10F+ Iscove®-Medium mit L-Glutamin, Antibiotikumzusatz und 10% fetalem

Kälberserum IBD Inflammatory Bowel Disease ICAM intercellular adhesion molecule (interzelluläres Adhäsionsmolekül) IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin

IP3 Inositoltriphosphat IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid JC-1 5, 5´, 6, 6´-Tetrachloro-1, 1´, 3, 3´-Tetraethylbenzimidazol-Carbocyanin Jodid kB kilo Basen kDA kilo Dalton L Liter LB lysogeny broth Leu Leucin LFA Leukocyte function-associated antigen LMU Ludwig-Maximimilians-Universität LPS Lipopolysaccharid µ mikro (x10-6) µm Mikrometer m milli (x10-3) MACS magnetic associated cell sorting mAK monoklonaler Antikörper MdM monocyte derived macrophages Met Methionin MHC major histocompatibility complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) MIF Membranimmunfluoreszenz Min. Minute(n) mm Millimeter MMP Mitochondrienmembranpotential MNC mononuclear cells (mononukleäre Zellen, hier: des Blutes) mol Mol mRNA messenger RNA mV Millivolt MW molecular weight (Molekulargewicht) n nano (x10-9) n= bei Berechnung des Mittelwertes die Anzahl der Einzelbeobachtungen NaCl Natriumchlorid NADPH Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat-Wasserstoff NANC nicht-adrenerge, nicht-cholinerge Fasern des peripheren Nervensystems NEP neutrale Endopeptidase NFΚB nuclear factor-kappa B (Transkriptionsfaktor) NK Neurokinin NKR Neurokininrezeptor NP Neuropeptid p Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Datengruppen

PAF platelet activating factor PAMP pathogen associated molecular pattern (Molekulare Muster von Erregern) PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PCR polymerase chain reaction PE Phycoerythrin PGE2 Prostaglandin E2 PGF2α Prostaglandin F2α Phe Phenylalanin PJ Propidiumjodid PMA Phorbol-12 Myristate-13 Acetat PMN polymorphonuclear leukocytes (polymorphkernige neutrophile Granulozyten) PNS peripheres Nervensystem PPT Preprotachykinin Pro Prolin qrtPCR quantitative real time PCR r Korrelationskoeffizient RA rheumatoide Arthritis rev reverse ROS reactive oxygen species (Reaktive Sauerstoffspezies) rpm rounds per minute RT Raumtemperatur S. aureus Staphylococcus aureus s.u. siehe unten SEA Staphylococcus aureus Enterotoxin A SEM standard error of the mean (Standardfehler des Mittelwertes) SNS sympathisches Nervensystem SP Substanz P SPE Subtanz P Endopeptidase SSC side scatter (Seitwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan® spp. subspecies (lateinisch: Unterarten) T Thymin Tab. Tabelle TBE Tris Boric Acid EDTA-Puffer Thr Threonin TLR toll-like-receptor (Toll-ähnlicher-Rezeptor) TNF tumor necrosis factor (Tumornekrosefaktor) TRAIL TNF-related apoptosis-inducing ligand TXA2 Thromboxan A2

Tyr Tyrosin

u.a. unter anderem UV ultra violett V Volt v.a. vor allem v/v Volumen pro Volumen Val Valin VCAM vascular cell adhesion molecule; vaskuläres Zelladhäsionsmolekül VIP vasoaktives intestinales Peptid w/v Gewicht pro Volumen x g multipliziert mit der Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s²) Xaa variable Aminosäure z.B. zum Beispiel z.T. zum Teil

Einleitung und Zielsetzung

13

1 Einleitung und Zielsetzung

In der peripartalen Periode kommt es bei Milchkühen häufig zu schweren Masitiden, die zu

erheblichen wirtschaftlichen Einbußen in der Milchviehhaltung führen (SORDILLO u.

STREICHER 2002). Ursächlich für die erhöhte Infektionsanfälligkeit der Tiere ist eine

Dysregulation der Immunantwort in der Phase um die Geburt (MALLARD et al. 1998;

WALLER 2000; PAAPE et al. 2002). Bedingt durch den peripartalen Anstieg von

Stresshormonen wie Glukokortikoiden (SORDILLO u. STREICHER 2002) werden

Immunzellen in ihrer Anzahl und Funktion, wie zum Beispiel die Adhärenz und Migration

von neutrophilen Granulozyten, die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen und die

Ausdifferenzierung mononukleärer Zellen negativ beeinflusst (PREISLER et al. 2000). Seit

einigen Jahren liegt der Forschungsschwerpunkt bei Milchkühen auf der Stärkung natürlicher

Abwehrmechanismen während der peripartalen Phase der Immunschwäche. Dabei rücken

vermehrt Therapieansätze in den Focus, die in die immunologischen Reaktionsabläufe

eingreifen und diese modulieren, um so die Abwehr verschiedenster Krankheitserreger zu

optimieren.

Bei der Regulation der Immunantwort spielen neben präformierten und induzierten

Mediatoren von Immunzellen ebenfalls Neuromediatoren eine entscheidende Rolle. Von

besonderem Interesse ist hierbei das Neuropeptid Substanz P, das sowohl von Zellen des

Nervensystems als auch von Immunzellen produziert wird (O'CONNOR et al. 2004). Aus

humanmedizinischen Studien ist bekannt, dass Substanz P vor allem pro-inflammatorisch auf

Immunzellen wirkt, indem es unter anderem die Sekretion von pro-inflammatorischen

Zytokinen und Chemokinen in Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen sowie die

Rekrutierung und Aktivierung von neutrophilen Granulozyten verstärkt (STERNER-KOCK et

al. 1999; GUO et al. 2002; DIANZANI et al. 2003; BARDELLI et al. 2005). Eine Beteiligung

von Substanz P an der Pathophysiologie von Asthma, Inflammatory Bowel Disease und

rheumatoider Arthritis beim Menschen wird durch zahlreiche Studien belegt und der Einsatz

von Substanz-P-Antagonisten für therapeutische Zwecke diskutiert (JACOBY et al. 2000;

LAVAGNO et al. 2001; KOON u. POTHOULAKIS 2006).

Einleitung und Zielsetzung

14

Der Einfluss von Substanz P auf bovine Immunzellen und die Beteiligung an

Entzündungsreaktionen beim Rind ist noch weitgehend ungeklärt. Ziel dieser Arbeit war es

mithilfe von In-vitro-Studien die Wirkung von Substanz P auf die Immunzellen des Rindes zu

charakterisieren. Der Schwerpunkt lag dabei auf neutrophilen Granulozyten, die die

Haupteffektorzellen der bovinen Mastitis darstellen (PAAPE et al. 2003), sowie auf

Makrophagen, die als Sensorzellen die Anlockung und Regulation der Effektorzellen steuern.

Mittel- bis langfristig können die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse über die

immunmodulatorischen Eigenschaften von Substanz P für neue prophylaktische und

therapeutische Konzepte in der bovinen Mastitis genutzt werden.

Literaturübersicht

15

2 Literaturübersicht

2.1 Die neuroendokrine Regulation der Immunantwort

Das physiologische Gleichgewicht des Körpers wird von drei miteinander vernetzten

Systemen aufrechterhalten: dem Nervensystem, dem endokrinen System und dem

Immunsystem (GOETZL u. SREEDHARAN 1992). Der Austausch von Informationen

zwischen diesen drei Systemen wird durch die endokrine und parakrine Freisetzung von

Hormonen, Neurotransmittern, Neuropeptiden und Zytokinen, sowie durch die gemeinsame

Expression von Rezeptoren für diese Mediatoren ermöglicht (LAMBRECHT 2001). Das

angeborene Immunsystem bildet durch die Erkennung von Pathogen-assoziierten Mustern

(PAMPS) und die initiale, unspezifische, zelluläre und humorale Immunantwort die erste

Abwehrfunktion gegen eindringende Pathogene. Die Freisetzung von Mediatoren des

angeborenen Immunsystems führt zu einer raschen neuralen Aktivierung, die einerseits die

lokale Immunantwort verstärkt, um Pathogene zu eliminieren, und andererseits systemische

neuroendokrine Reaktionen auslöst, um die Immunantwort abzufangen und den Ruhezustand

wieder herzustellen (COOK et al. 2004; BEUTLER 2005). Dieser Rückkopplungs-

mechanismus führt zu einer Optimierung der Immunantwort. Eine Störung dieser Regelkreise

kann zu übersteigerten Entzündungsreaktionen oder unkontrollierten Infektionen führen und

somit schwerwiegende Krankheitsbilder auslösen (STERNBERG 2006). In Abb. 1 werden die

Signalwege zwischen Nerven-, Endokrinem-, und Immunsystem schematisch dargestellt.

Literaturübersicht

16

Abb. 1: Schematische Darstellung der neuroendokrinen Regulation des Immun-

systems; aus STERNBERG (2006). Dargestellt sind aktivierende (Pfeilspitze) und hemmende (Querstrich) Signale zwischen dem Immunsystem und dem zentralen Nervensystem (central nervous system, CNS) sowie dem peripheren Nervensystem (sympathisches Nervensystem (SNS), parasympathischen Nervensystem (Vagus nerve) und afferenten und efferenten Fasern des peripheren Nervensystems (PNS)).

2.1.1 Regulation durch das zentrale Nervensystem

Unter dem Begriff des zentralen Nervensystems werden die Neurone und Gliazellen von

Gehirn und Rückenmark zusammengefasst.

Die Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse (hypothalamic-pituitary-adrenal-axis,

HPA) stellt durch die Ausschüttung von Glukokortikoiden den wichtigsten negativen

Rückkopplungsmechanismus des zentralen Nervensystems in der Immunregulation dar.

Systemische pro-inflammatorische Stimuli, wie zum Beispiel bakterielles Lipopolysaccharid

Literaturübersicht

17

(LPS), aber auch psychologische Stressoren führen zu einer Ausschüttung von Corticotropin-

Releasing-Hormon (CRH) aus Zellen des paraventrikulären Nukleus des Hypothalamus.

Dadurch wird die Hypophyse zur Produktion von adrenokortikotropem Hormon angeregt,

was schließlich zur Synthese von endogenen Glukokortikoiden in der Nebennierenrinde führt

(WEBSTER et al. 2002). Glukokortikoide hemmen die Migration von Leukozyten, indem sie

die Expression von Adhäsionsmolekülen (ICAM-1, E-Selektin und VCAM-1) sowie die

Produktion von Chemokinen (CCL2, CXCL8) herunterregulieren (CRONSTEIN et al. 1992;

MIYAMASU et al. 1998; ATSUTA et al. 1999). Außerdem reduzieren Glukokortikoide die

Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen (IL-1, IL-6 und TNF-α) durch eine

Hemmung des nukleären Faktor κB (NFκB) (SCHEINMAN et al. 1995). Glukokortikoide

hemmen somit die Migration von Immunzellen in entzündetes Gewebe, sowie die

Aktivierung und Bildung von Zytokinen vor Ort, was zu einer Unterdrückung der

Immunantwort führt.

2.1.2 Modulation durch das periphere Nervensystem

Das periphere Nervensystem setzt sich aus Nervenfasern und eingelagerten Ganglien des

somatischen und des vegetativen Nervensystems zusammen. Funktionell lassen sich

somatische Nerven in sensorische und motorische Fasern unterteilen. Das vegetative

Nervensystem schließt neben sympathischen und parasympathischen Fasern auch nicht-

adrenerge, nicht-cholinerge Fasern (NANC) mit ein. Die Neurotransmitter und die

Neuropeptide des peripheren Nervensystems beeinflussen die Immunantwort in

unterschiedlicher Weise.

Systemisch beeinflussen sympathische Nervenfasern die Immunantwort über die

Ausschüttung von Adrenalin aus dem Nebennierenmark. Adrenalin führt über die Bindung an

β-adrenerge Rezeptoren auf Immunzellen zu einer Verringerung der Anzahl zirkulierender

Monozyten, B- und T-Zellen sowie natürlicher Killerzellen (JETSCHMANN et al. 1997). Auf

regionaler Ebene moduliert der Sympathikus das Immunsystem über die Innervation

lymphatischer Organe und Gewebe mit dem Transmitter Noradrenalin. Die Freisetzung von

pro-inflammatorischen Zytokinen während einer Immunantwort führt zu einer Stimulation

des sympathischen Nervensystems, wodurch Noradrenalin in den lymphatischen Organen

freigesetzt wird. Das Binden von Noradrenalin an β2-adrenerge Rezeptoren auf dendritischen

Literaturübersicht

18

Zellen und Makrophagen führt zur vermehrten Bildung von zyklischem AMP und zur

Aktivierung von Proteinkinase A. Dadurch wird in den Zellen über die Hemmung von NFκB

die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen, wie IL-1, IL-6 und TNF-α gehemmt

(VAN DER POLL et al. 1994; LE TULZO et al. 1997).

Das parasympathische Nervensystem moduliert die Immunantwort auf regionaler Ebene

durch die afferenten und efferenten Fasern des Nervus Vagus. Die afferenten Fasern

signalisieren durch Rezeptoren für IL-1 auf den Paraglia-Zellen der parasympatischen

Ganglien eine Entzündungsreaktion in der Peripherie an das Gehirn (WATKINS u. MAIER

1999). Von den efferenten Fasern wird daraufhin Acetylcholin freigesetzt, das vor allem über

nikotinerge Rezeptoren auf Makrophagen anti-inflammatorisch wirkt. Über die Hemmung

von NFκB wird die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen (IL-1, IL-6 und TNF),

nicht jedoch die von anti-inflammatorischen Zytokinen (IL-10) in Makrophagen gehemmt

(BOROVIKOVA et al. 2000; WANG et al. 2003).

Zusammengefasst werden sowohl Sympathikus als auch Parasympathikus von pro-

inflammatorischen Zytokinen aktiviert und vermitteln einen negativen Rückkopplungs-

mechanismus, der die Immunantwort hemmt und den Ruhezustand wieder herstellt.

Eine große Anzahl von Peptiden wird von Neuronen des vegetativen und somatischen

Nervensystems gebildet. Diese Neuropeptide dienen vor allem in NANC-Fasern aber auch in

cholinergen und sensorischen Fasern als Neurotransmitter, haben aber auch

immunmodulatorische Aufgaben (WIDDICOMBE 1998; HOKFELT et al. 2000). Sensorische

periphere Nerven, die an der Schmerz-, Druck- und Temperaturwahrnehmung beteiligt sind,

regulieren die Entzündungsreaktion an ihrem Entstehungsort durch die Ausschüttung von

Neuropeptiden, die im Allgemeinen pro-inflammatorische Wirkung haben. Die Stimulation

dieser Fasern durch Mediatoren des angeborenen Immunsystems führt zur Ausprägung

typischer Entzündungsmerkmale wie Vasodilatation, Ödembildung und Schmerz

(STERNBERG 2006). Primäre und sekundäre lymphatische Organe werden von NANC

Fasern innerviert, die durch die Ausschüttung von diversen Neuropeptiden mit T-Zellen,

Makrophagen und dendritischen Zellen interagieren (WEIHE et al. 1991; REUBI et al. 1998).

Zu den allgemein entzündungsfördernden Neuropeptiden gehören Substanz P (SP) und

Calcitonin-gene related Peptide (CGRP), die unter anderem zu einer vestärkten Bildung von

pro-inflammatorischen Zytokinen (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-α) und Chemokinen (CXCL8,

Literaturübersicht

19

CCL2) führen (CUESTA et al. 2002; BARDELLI et al. 2005). Das vasoktive intestinale

Peptid (VIP) gilt als anti-inflammatorisches Neuropeptid, da es die Produktion pro-

inflammatorischer Zytokine und Chemokine hemmt. In Abb. 2 sind die Mediatoren des

peripheren Nervensystems und ihre Wirkung auf Immunzellen schematisch dargestellt.

Abb. 2: Effekte des peripheren Nervensystems auf Immunzellen in lymphatischen

Organen; aus STERNBERG (2006).

Dargestellt sind die stimulierenden (Pfeilspitze) und hemmenden (Querstrich) Effekte von Neurotransmittern (Acetylcholin, Noradrenalin) und Neuropeptiden (Substanz P, vasoaktives intestinales Peptid (VIP), Calcitonin gene-related peptide (CGRP), Corticotropin-releasing Hormon (CRH) und Neuropeptid Y) auf die Produktion pro-inflammatorischer Zytokine. Die Immunzellen besitzen Rezeptoren für die Neuromediatoren und exprimieren die Neuromediatoren teilweise selbst. 5HTT (5-hydroxytryptamin Transporter).

Literaturübersicht

20

2.2 Das Neuropeptid Substanz P

Im Jahr 1931 beschrieben Von Euler und Gaddum erstmals einen aus dem Intestinaltrakt und

dem Gehirn von Pferden isolierten Atropin-resistenten Faktor, der hypotensiv sowie

stimulierend auf glatte Muskulatur wirkte. Es zeigte sich, dass die Wirkung des Extrakts auch

nach Verdampfung erhalten blieb, und das entstandene Pulver wurde als Substanz P

bezeichnet (HOKFELT et al. 2001). CHANG und LEEMAN (1970) gelang es erstmals,

Substanz P aus Rinderhypothalamus zu isolieren und als Undekapeptid (Peptid aus 11

Aminosäuren) zu charakterisieren.

2.2.1 Gene und Peptidsynthese

Substanz P gehört zur Familie der Tachykinine, die ihren Namen aufgrund der Eigenschaft

erhielt, schnelle Kontraktionen in glatter Muskulatur hervorzurufen (HOLZER u. HOLZER-

PETSCHE 2001). Alle Tachykinine haben die gemeinsame C-terminale Sequenz Phe-Xaa-

Gly-Leu-MetNH2 (Xaa = variable Aminosäure) (MAGGI 1997). Neben Substanz P sind

Neurokinin A (NKA) und B (NKB) die bekanntesten Mitglieder der Tachykinin-Familie. Die

N-terminal erweiterten Formen von NKA (Neuropeptid K und Neuropeptid γ) sind ebenfalls

biologisch aktive Peptide. In neueren Studien konnten das beim Menschen und der Maus

entdeckte Hemokinin-1 sowie die humanen Endokinine A-D ebenfalls der Tachykinin-

Familie zugeordnet werden, obwohl sie im C-Terminus in einer Aminosäure von der

klassischen Tachykinin-Sequenz abweichen (PENNEFATHER et al. 2004). In Tab. 1 sind die

Aminosäuresequenzen der bei Säugetieren identifizierten Tachykinine dargestellt. Die

Primärstruktur von SP, NKA und NKB scheint für alle Säugetier-Spezies identisch zu sein,

wohingegen die Aminosäurensequenz von Hemokinin-1 in Ratte und Maus sich von dem

humanen Peptid unterscheidet.

Literaturübersicht

21

Tab. 1: Aminosäurensequenz der bei Säugetieren identifizierten Tachykinine; nach

PENNEFATHER et al. (2004).

Spezies Name Sequenz

Säugetiere Substanz P Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-MetNH2

Säugetiere Neurokinin A His-Lys-Thr-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu-MetNH2

Säugetiere Neurokinin B Asp-Met-His-Asp-Phe-Phe-Val-Gly-Leu-MetNH2

Ratte/Maus Hemokinin-1 Arg-Ser-Arg-Thr-Arg-Gln-Phe-Tyr-Gly-Leu-MethNH2

Mensch Hemokinin-1 Thr-Gly-Lys-Ala-Ser-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-MetNH2

Mensch Endokinin C Lys-Lys-Ala-Tyr-Gln-Leu-Glu-His-Thr-Phe-Gln-Gly-Leu-LeuNH2

Mensch Endokinin D Val-Gly-Ala-Tyr-Gln-Leu-Glu-His-Thr-Phe-Gln-Gly-Leu-LeuNH2

Die für Tachykinine spezifische Sequenz ist fett gedruckt. Die N-terminalen Erweiterungen von Neurokinin A (Neuropeptid K und γ) und humanem Hemokinin-1 (Endokinin A und B) sind nicht dargestellt.

Tachykinine werden aus Vorläuferproteinen, den so genannten Preprotachykininen

synthetisiert, die von drei verschiedenen Genen kodiert werden. Das Preprotachykinin A

(PPT-A) Gen kodiert bei Säugetieren für Substanz P, Neurokinin A, Neuropeptid K und γ

(CARTER u. KRAUSE 1990). Eine Transkription von PPT-A führt zu einer vorläufigen

mRNA, aus der nach unterschiedlichem „splicing“ vier verschiedene mRNA-Isoformen

entstehen, die sich jeweils in der Kombination der Exons unterscheiden. Das Vorläuferpeptid

von Substanz P wird aus allen mRNA-Isoformen synthetisiert, während die entsprechenden

Exons für NKA nur in zwei, die für NPK und NPγ nur in einer Isoform enthalten sind

(KRAUSE et al. 1987; HARMAR et al. 1990). Das PPT-B Gen kodiert nur für Neurokinin B

(HOKFELT et al. 2001). Das humane Hemokinin-1 und die Endokinine A-D werden

ebenfalls über verschiedene mRNA-Isoformen durch das PPT-C Gen kodiert (PAGE et al.

2003).

Die aus der reifen mRNA entstandenen Preprotachykinine sind große Polypeptide, die aus

einem Signalpeptid, einer oder mehrerer Kopien des Neuropeptids und einem oder mehreren

Platzhalter-Peptiden bestehen. Das am N-Terminus befindliche Signalpeptid erlaubt während

der Synthese die Bindung und den Eintritt in das Endoplasmatische Retikulum und wird dann

rasch abgespalten. Das so entstandene Propeptid wird zum Golgi-Apparat transportiert, wo

Literaturübersicht

22

die Platzhalterpeptide entfernt werden und das aktive Neuropeptid in Vesikel verpackt wird

(PENNEFATHER et al. 2004).

2.2.2 Abbau

Nach Freisetzung wird die physiologische Aktivität von Substanz P im Allgemeinen durch

hydrolytische Spaltung terminiert. Es gibt mehrere unspezifische Enzyme, die zur Hydrolyse

von Substanz P in der Lage sind, von denen Angiotensin converting enzyme (ACE) und

neutrale Endopeptidase (NEP) jedoch die bedeutendsten sind (KATO et al. 1978; SKIDGEL

et al. 1984; JOOS et al. 2000). NEP und ACE spalten die Peptidbindungen zwischen den

Aminosäuren Gln-Phe, Phe-Phe und Gly-Leu, was bei Substanz P zu der Entstehung inaktiver

Fragmente führt, denen das C-terminale Ende für die Rezeptorbindung fehlt (SKIDGEL et al.

1984; DI MARIA et al. 1998). Die Enzyme sind im Organismus weit verbreitet. NEP kommt

in Niere, Lunge, bestimmten Gehrinregionen sowie Knochenmark und Lymphknoten vor

Besonders gut ist die Hydrolyse von Substanz P durch NEP in den Atemwegen beschrieben.

Die Hemmung von NEP verstärkt die Effekte von exogen zugeführten Tachykininen, wie

Bronchospasmus, Extravasation und Degranulation von Mastzellen in der Lunge (CHEUNG

et al. 1992; ROQUES et al. 1993).

Aus menschlichem Gehirn und Rückenmark konnte auch eine für Substanz P spezifische

Peptidase isoliert werden, die so genannte Substanz P Endopeptidase (SPE) (KARLSSON u.

NYBERG 1998). Die Autoren konnten zeigen, dass durch die Spaltung mit SPE Fragmente

mit biologischer Aktivität entstanden. Daraus wurde von KARLSSON und NYBERG (1998)

geschlossen, dass es sich nicht um ein inaktivierendes sondern ein konvertierendes Enzym

handelt. Das aus der Spaltung entstehende N-terminale Fragment beeinflusst verschiedene

Verhaltensmuster, wie zum Beispiel das Lernverhalten von Mäusen (HASENOHRL et al.

1990; LARSON u. SUN 1993).

2.2.3 Rezeptoren

Wie alle Tachykinine bindet Substanz P an eine bestimmte Rezeptorgruppe, die

Neurokininrezeptoren (NKR). Es handelt sich hierbei um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren

mit sieben Transmembran-Domänen, einem extrazellulären N-Terminus und einem

Literaturübersicht

23

intrazellulären C-terminalen Teil (MAGGI et al. 1993). Zurzeit sind für Säugetiere drei

verschiedene Neurokininrezeptoren beschrieben, NKR1, NKR2 und NKR3. Alle drei

Rezeptoren werden von den klassischen Tachykininen Substanz P, Neurokinin A und

Neurokinin B erkannt, es gibt jedoch unterschiedliche Affinitäten. Substanz P bindet mit

höchster Affinität an NKR1. Die relative Affinität von NKR1 für Neurokinin A und

Neurokinin B ist 100- und 500-fach geringer im Vergleich mit Substanz P, während NKR2

und NKR3 für Substanz P die geringste Affinität aufweisen (GERARD et al. 1991; REGOLI

et al. 1994).

Die Bindung von Substanz P an den NKR1 führt zur Aktivierung von Phospholipase C,

welche Phosphatidylinositolbiphosphat in Inositoltriphosphat (IP3) und Diacylglycerol

(DAG) spaltet. Diese Second messenger stehen dann für die Mobilisation von Calcium aus

intrazellulären Speichern (IP3) und für die Aktivierung der Proteinkinase C (DAG, Ca2+) zur

Verfügung (O'CONNOR et al. 2004). Für den Haupt-Rezeptor von Substanz P existieren zwei

Isoformen, die sich in der Länge des zytoplasmatischen C-Terminus um etwa 8 kDa

unterscheiden, Substanz P jedoch mit derselben Affinität binden (KAGE et al. 1993). Zellen,

die den verkürzten Rezeptor ausbilden, zeigen bereits bei geringeren Konzentrationen von

Substanz P einen intrazellulären Calcium-Einstrom als Zellen, die den Rezeptor in voller

Länge exprimieren. Auch in ihrer Deaktivierung unterscheiden sich die Isoformen. So wird

der NKR1 in voller Länge nach Aktivierung schnell internalisiert und von Rezeptor-Kinasen

gespalten, während der verkürzte Rezeptor nicht dieser Deaktivierung unterliegt (LI et al.

1997). Neuere Studien zeigen, dass die durch den voll ausgebildeten NKR1 ausgelöste

Internalisierung zur Aktivierung von Enzymkaskaden führt, die ihrerseits Zellproliferation

und anti-apoptotische Faktoren induzieren. Der verkürzte Rezeptor kann durch die fehlenden

Abschnitte in der C-terminalen Sequenz diese Effekte nicht auslösen (DEFEA et al. 2000;

BOCKMANN et al. 2001).

Der NKR1 konnte im zentralen Nervensystem in Groß- und Kleinhirn sowie im Rückenmark

nachgewiesen werden (CABERLOTTO et al. 2003). Auch im autonomen Nervensystem von

Atmungsapparat, Gastrointestinaltrakt und Urogenitaltrakt ist der NKR1 exprimiert und an

der Regulation der Organfunktionen beteiligt (QUARTARA u. MAGGI 1998). Die

Expression von NKR1 ist auch für Immunzellen beschrieben. Der Rezeptor wird von

humanen Blutmonozyten und aus Monozyten gewonnenen Makrophagen (Monocyte derived

Literaturübersicht

24

Macrophages; MdM) sowie von humanen Alveolarmakrophagen exprimiert (HO et al. 1997;

BARDELLI et al. 2005). Auch in humanen Lymphozyten konnte die NKR1-mRNA

nachgewiesen werden (LAI et al. 2005). Für das Rind konnte der NKR1 in Membranextrakten

von Alveolarmakrophagen und Lutealzellen nachgewiesen werden (BRYLLA et al. 2005;

ROGERS et al. 2006).

2.2.4 Verbreitung und Funktion

Substanz P ist im zentralen und peripheren Nervensystem weit verbreitet. Im zentralen

Nervensystem ist das Neuropeptid an der Steuerung von Verhaltensmustern und der

Regulation von Überleben und Degeneration von Nervenzellen beteiligt (O'CONNOR et al.

2004). Im peripheren Nervensystem wird Substanz P in primären sensorischen Neuronen und

intrinsischen Neuronen des Gastrointestinaltrakts, Respirationstrakts und Urogenitaltrakts

gebildet und ist dort an der Regulation der Organfunktionen beteiligt (MAGGI 2000).

Außerdem wird Substanz P eine wichtige Rolle bei der Schmerz-Weiterleitung vom

peripheren zum zentralen Nervensystem zugeschrieben (IVERSEN 1982). Substanz P wird

jedoch auch von Zellen des Immunsystems, wie Makrophagen, Granulozyten, Lymphozyten

und dendritischen Zellen produziert (BOST et al. 1992; KILLINGSWORTH et al. 1997). Im

Folgenden wird der regulatorische Einfluss von Substanz P auf die Organfunktionen von

Magen-Darm-Trakt und Respirationstrakt sowie die Rolle bei der Schmerz-Weiterleitung

näher erläutert. Die immunmodulatorischen Funktionen von Substanz P auf zellulärer Ebene

werden in Kapitel 2.3 beschrieben. Die Rolle von Substanz P bei pathologischen Prozessen

wird in Kapitel 2.4 beschrieben.

Substanz P wird im Gastrointestinaltrakt hauptsächlich von enterischen, cholinergen

Motoneuronen produziert und nimmt zusammen mit Neurokinin A die Funktion eines Ko-

Transmitters ein (COSTA et al. 2000; FURNESS 2000; SCHEMANN et al. 2001). Die beiden

Tachykinine sind dem Transmitter Acetylcholin untergeordnet und fördern als

unterstützendes System die Motilität des Magen-Darm-Trakts (MAGGI 2000). Im

Tierversuch konnte gezeigt werden, dass eine Hemmung der Tachykinin-Rezeptoren NKR1

und NKR2 zu einer deutlichen Verminderung der Peristaltik in Dünn- und Dickdarm sowie

im Ösophagus führt (BARTHO et al. 1999; TONINI et al. 2001). Auch der Elektrolyt- und

Flüssigkeitshaushalt und die Sekretion von Verdauungsenzymen werden durch Substanz P

Literaturübersicht

25

beeinflusst. Studien mit humanen und porcinen Systemen konnten zeigen, dass Substanz P an

der Sekretion von Chlorid-Ionen im Kolon sowie an der Säureproduktion und Pepsinogen-

Sekretion im Magen beteiligt ist (RIEGLER et al. 1999; SCHMIDT et al. 1999). Die

vaskulären Effekte von Substanz P im Gastrointestinaltrakt sind variabel. Substanz P und

NKA können sowohl Vasodilatation als auch Vasokonstriktion hervorrufen. Außerdem erhöht

Substanz P bei inflammatorischen Prozessen über den NKR1 die Permeabililtät von Venolen

in Magen-Darm-Trakt und Pankreas, die unter physiologischen Bedingungen durch die

Anwesenheit von neutraler Endopeptidase niedrig gehalten wird (STURIALE et al. 1999;

MAA et al. 2000). Substanz P konnte auch in nicht neuronalen Zellen im

Gastrointestinaltrakt, wie enteroendokrinen Zellen, eosinophilen Granulozyten und

Makrophagen nachgewiesen werden (METWALI et al. 1994; CASTAGLIUOLO et al. 1997).

Im Respirationstrakt sind SP-haltige Nervenfasern in Epithelien, Drüsen, Blutgefäßen und

glatter Muskulatur von Bronchien lokalisiert (BARNES et al. 1991). Substanz P reguliert in

den Atemwegen vor allem neurogene Entzündungsprozesse. Eine Freisetzung von Substanz P

und NKA aus Capsaicin-sensitiven sensorischen Nervenfasern führt zu Bronchokonstriktion,

Plasma-Extravasation und Vasodilatation (O'CONNOR et al. 2004). Auslösende Faktoren

können eine Reihe von Substanzen wie Allergene, Zigarettenrauch, Ozon aber auch

bronchoaktive Substanzen wie Histamin, Prostaglandine und Leukotriene sein (MARTINS et

al. 1991; BALUK et al. 1996; TAKEBAYASHI et al. 1998). Substanz P ist potenter in der

Stimulation von Extravasation und Vasodilatation, während NKA der stärkere

Bronchokonstriktor ist (SHELDRICK et al. 1995; VAN RENSEN et al. 2002). Tachykinine,

im Besonderen Substanz P, lösen über den NKR1 eine Reihe von Reaktionen bei Leukozyten

aus, die Entzündungsprozesse in der Lunge initiieren und verstärken (DEROSE et al. 1994;

NAKAGAWA et al. 1995).

Mitte der 70er Jahre wurde Substanz P in demyelinisierten Capsaicin-sensitiven Nervenfasern

sowie in Spinalganglien und Neuronen des dorsalen Horn des Rückenmarks nachgewiesen,

was die ersten strukturellen Hinweise auf eine Beteiligung an der Schmerz-Weiterleitung

lieferte (ZUBRZYCKA u. JANECKA 2000). Das Neuropeptid wird in den Spinalganglien

synthetisiert und von dort nach zentral in das dorsale Horn oder nach peripher in

unmyelinisierte, Capsaicin-sensitive Nervenfasern transportiert, die größtenteils Nozizeptoren

sind. Versuche mit Mäusen und Ratten haben gezeigt, dass eine Injektion von Substanz P zu

Literaturübersicht

26

Schmerzäußerungen führt, während eine Behandlung mit einem Antagonist eine Analgesie

hervorruft (YASHPAL u. HENRY 1983; ZUBRZYCKA et al. 1997). Die Gabe von

Capsaicin führte bei Ratten zu einer Abnahme der Substanz P-Gehalte im Rückenmark

einhergehend mit einer Erhöhung der Schmerzreiz-Schwelle (NAGY u. VAN DER KOOY

1983).

2.3 Modulation von Zellfunktionen durch Substanz P

2.3.1 Interaktion mit neutrophilen Granulozyten

Zu den vielfältigen Funktionen neutrophiler Granulozyten im Rahmen der Abwehr gehören

die Adhärenz an Gefäßwände, das gerichtete Auswandern in entzündetes Gewebe und die

dortige Aktivierung der Effektorfunktionen zur Eliminierung eingewanderter

Mikroorganismen. Entzündungsmediatoren (u.a. CXCL8, Leukotrien B4, C5a) wirken

chemotaktisch auf neutrophile Granulozyten. Sie induzieren außerdem die Bildung von

Selektinen (CD62P, CD62E) und Integrinen (LFA-1, Mac-1) sowie deren Liganden auf

Endothelzellen und neutrophilen Granulozyten.

Es konnte gezeigt werden, dass Substanz P in einem breiten Konzentrationsbereich (1x10-16

mol/L bis 1x10-7 mol/L) die Adhäsion von humanen neutrophilen Granulozyten sowohl an

Endothelzellen als auch an Epithelzellen steigert (DEROSE et al. 1994; TOMINAGA et al.

1999). Substanz P verstärkte dabei dosis- und zeitabhängig die Ausbildung von

Adhäsionsmolekülen auf allen beteiligten Zelltypen, wobei sich eine glockenförmige Dosis-

Wirkungs-Beziehung mit einem maximalen Effekt bei einer SP-Konzentration von 1x10-10

mol/L einstellte (DEROSE et al. 1994; DIANZANI et al. 2003). Auf humanen neutrophilen

Granulozyten wird durch Substanz P vermehrt das β2-Integrin LFA-1 (CD11a/CD18)

exprimiert, auf Endothelzellen werden ICAM-1 (CD54), der zugehörige Ligand für LFA-1

sowie die für das Anhaften von PMN zuständigen Selektine CD62P und CD62E verstärkt

gebildet (SMITH et al. 1993; NAKAGAWA et al. 1995; DIANZANI et al. 2003). Die von

Substanz P vermittelte Adhärenz an Lungenepithelzellen konnte durch Lipopolysaccharid

(LPS) noch verstärkt werden und führte außerdem zu einer vermehrten Ausschüttung der pro-

Literaturübersicht

27

inflammatorischen Zytokine TNF-α und IL-1β bei den neutrophilen Granulozyten (KUO et al.

2000).

Eine chemoattraktive Wirkung von Substanz P in mikromolaren Bereichen (1x10-6 bis 1x10-4

mol/L) wurde in mehreren Studien für neutrophile Granulozyten von Mensch und Ratte

gezeigt (PERIANIN et al. 1989; IWAMOTO et al. 1990; FRANCO-PENTEADO et al. 2005).

PERIANIN et al. (1989) waren jedoch der Meinung, dass diese hohen Konzentrationen nicht

die physiologischen Bedingungen widerspiegeln. Sie konnten in ihrer Studie zeigen, dass

Substanz P in geringeren Konzentrationen (1x10-10 bis 1x10-6 mol/L) eine durch fMLP

ausgelöste Migration von PMN verstärkt. In einer In-vivo-Studie konnten SMITH et al.

(1993) eine anhaltende Migration von humanen neutrophilen Granulozyten in der Haut nach

intradermaler Injektion von Substanz P feststellen. In Gewebekulturen von Zahnpulpa führte

eine Zugabe von Substanz P (1x10-10 bis 1x10-8 mol/L) zu einer signifikanten Erhöhung der

CXCL8-Produktion (PATEL et al. 2003; PARK et al. 2004). SUN et al. (2007) konnten

mittels Immunfluoreszenz zeigen, dass Substanz P (1x10-6 mol/L) die Expression des

Chemokin-Rezeptors CXCR2 auf der Oberfläche von murinen neutrophilen Granulozyten

verstärkt. Außerdem konnte in der Studie eine Verstärkung der CXCL2-induzierten Migration

neutrophiler Granulozyten nach Inkubation mit Substanz P (1x10-6 mol/L) beobachtet werden.

Das Chemokin CXCL8, das Komplementspaltprodukt C5a aber auch bakterielle Produkte wie

N-Formyl-Peptide führen über die Bindung an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren zu einer

Mobilisation von Calcium aus intrazellulären Speichern von PMN (BOULAY et al. 1990;

GERARD u. GERARD 1991; MURPHY u. TIFFANY 1991). Dieser Prozess stellt ein

Schlüsselsignal für die Aktivierung von neutrophilen Granulozyten dar (HALLETT u.

LLOYDS 1995). Die folgenden Phosphorylierungs-Kaskaden führen über die Aktivierung der

NADPH-Oxidase zur Bildung von bakteriotoxischen und gewebsschädigenden reaktiven

Sauerstoffspezies. Verschiedene Untersuchungen zeigten, dass Substanz P die Aktivierung

von neutrophilen Granulozyten und die nachfolgende Bildung von Sauerstoffradikalen

beeinflusst. Ein Anstieg der intrazellulären Calcium-Konzentration in humanen PMN wurde

durch Substanz P in vergleichsweise hohen Konzentrationen (1x10-6 bis 1x10-3 mol/L)

(SERRA et al. 1988; LLOYDS u. HALLETT 1993) aber auch in niedrigeren

Konzentrationsbereichen (1x10-7 mol/L) (NOWAK et al. 1996) hervorgerufen. Dabei konnte

sowohl das ganze Neuropeptid als auch das C-terminale Fragment von Substanz P (SP6-11)

Literaturübersicht

28

einen Calcium-Einstrom auslösen (SERRA et al. 1988; IWAMOTO et al. 1990). Häufig wird

ein so genannter „Priming-Effekt“ für die Aktivierung neutrophiler Granulozyten

beschrieben. Eine Vorinkubation mit Substanz P verstärkte die Aktivierung von PMN durch

experimentelle Stimuli (fMLP und PMA) (WOZNIAK et al. 1989; LLOYDS u. HALLETT

1993; STERNER-KOCK et al. 1999). DIANZANI et al. (2001) zeigten für humane PMN

einen Priming-Effekt von Substanz P für den CXCL8-induzierten Calcium-Einstrom. Durch

eine 3-minütige Vorinkubation mit Substanz P (3x10-6 mol/L) wurde der CXCL8-induzierte

Calcium-Einstrom im Vergleich zur Kontrolle verdoppelt. Substanz P allein löste in derselben

Konzentration in dieser Studie keinen Calcium-Einstrom aus.

Die Apoptose ist die häufigste Form des Zelltodes bei neutrophilen Granulozyten. Es handelt

sich dabei um eine aktive Form des Zelltodes, bei der zelluläre Bestandteile und Metaboliten

abgebaut werden ohne Entzündungsreaktionen hervorzurufen. Die Apoptose wird im

Allgemeinen über zwei unterschiedliche Signaltransduktionswege reguliert, den extrinsischen

und den intrinsischen Pfad. Beide Signalwege münden in der Aktivierung von Caspasen, einer

Familie von Cystein-Proteasen, die typischerweise ihr Substrat nach einer Asparaginsäure

spalten (HOLLÄNDER 2006; LUO u. LOISON 2008). Der extrinsische Signalweg wird über

die Stimulation von so genannten Todesrezeptoren vermittelt, von denen vor allem CD95

(Fas) und der TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) receptor 2 und 3 sowie deren

Liganden für die Apoptose von neutrophilen Granulozyten am Bedeutendsten sind (LUO u.

LOISON 2008). Die Bindung der Liganden an die Todesrezeptoren führt über die Entstehung

eines „Death Inducing Signalling Complex“ (DISC) zur Aktivierung der Caspasen, die

wiederum verschiedene Enzyme aktivieren, welche die Fragmentierung der DNA und somit

den Zelltod in Gang setzten (LILES et al. 1996; RENSHAW et al. 2000; KOGA et al. 2004).

Der intrinsische Pfad der Apoptose ist der wichtigste Mechanismus für das konstitutive

Absterben von neutrophilen Granulozyten. Auslösender Faktor dieses Prozesses ist der

Verlust des Mitochondrien-Membranpotentials. So genannte Bcl-2-Proteine lagern sich an die

depolarisierten Mitochondrien an und erhöhen die Durchlässigkeit der Mitochondrien-

membran, so dass pro-apoptotische Proteine (Cytochrom C, Smac, Omi) ins Zytosol

gelangen, die ihrerseits die Caspase-Kaskade aktivieren (MAIANSKI et al. 2004a).

BÖCKMANN et al. (2001) konnte einen anti-apoptotischen Effekt von Substanz P (1x10-5 bis

1x10-4 mol/L) auf humane PMN zeigen. Ein NKR1-Rezeptorantagonist konnte diesen Effekt

Literaturübersicht

29

hemmen, was die Autoren zu der Annahme führte, dass der NKR1-Rezeptor maßgeblich an

der Übermittlung dieses Effekts beteiligt ist. Substanz P konnte in den untersuchten

Konzentrationen außerdem die Aktivität von Caspase-3 hemmen. Dabei wurde sowohl die

Prozessierung der inaktiven Pro-Caspase-3 als auch die Funktion der aktiven Caspase-3 durch

Substanz P herabgesetzt. In einer anderen Studie konnte ein protektiver Effekt auf neutrophile

Granulozyten durch das C-terminale Fragment von Substanz P (SP6-11) beobachtet werden

(MACKINNON et al. 2002). Das SP-Fragment konnte den Anteil apoptotischer Zellen nach

20 Stunden Inkubation konzentrationsabhängig (1x10-6 bis 1x10-4mol/L) um bis zu 50%

reduzieren.

2.3.2 Beeinflussung von Monozyten und Makrophagen

Eine Verstärkung der Migration durch die direkte chemoattraktive Wirkung des C-terminalen

Endes des Neuromediators wurde in verschiedenen Studien mit humanen Blut-Monozyten

nachgewiesen (WIEDERMANN et al. 1989; SCHRATZBERGER et al. 1997). HOOD et al.

(2000) konnten zusätzlich zeigen, dass dieser Effekt durch den Substanz P-Rezeptor NKR1

vermittelt wird, da der Einsatz eines selektiven NKR1-Antagoisten die Chemotaxis aufheben

konnte.

Nach Stimulation durch Lipopolysaccharid (LPS) sezernieren Monozyten und Makrophagen

zahlreiche, vor allem pro-inflammatorische Zytokine, wie z.B. TNF-α, IL-1, IL-6 und IL-12,

sowie zahlreiche Chemokine (CXCL1, 2, 3, 6 und 8, CCL1-5). Diese Mediatoren führen zur

Eigenstimulation (IL-1α und IL-1β), zur Anlockung weiterer Makrophagen (CCL3 und

CCL4) und anderer Leukozyten (CXCL1, 2, 3, 6 und 8), zur Aktivierung bestimmter

Lymphozytensubpopulationen (IL-12) und auch zu systemischen Effekten wie z.B. Fieber

(IL-1α und IL-1β, IL-6, TNF-α) (AKIRA u. KISHIMOTO 1996; JANEWAY 2005). Ein

großer Teil der von Makrophagen initiierten Entzündungsreaktionen resultiert in der

Anlockung und Aktivierung von neutrophilen Granulozyten. So zeigen neutrophile

Granulozyten eine gerichtete Migration zu den meisten der von stimulierten Makrophagen

freigesetzten Chemokinen (CXCL1, 2, 3, 6 und 8, CCL1).

Eine Inkubation mit Substanz P (1x10-12 bis 1x10-6 mol/L) führte bei humanen Monozyten

und Makrophagen zu einer gesteigerten Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen wie

IL-1β, TNF-α und IL-6 (LAVAGNO et al. 2001; CUESTA et al. 2002; BARDELLI et al.

Literaturübersicht

30

2005). In diesen Studien konnte Substanz P auch die Entstehung von reaktiven

Sauerstoffspezies und den oxidativen Burst von Monozyten und Makrophagen verstärken.

BERMAN et al. (1996) konnten für Substanz P einen „Priming-Effekt“ auf murine

Makrophagen zeigen. In ihrer Studie führte eine Vorinkubation mit Substanz P vor der

Stimulation mit LPS zu einer stärkeren Sekretion von pro-inflammatorischen Zytokinen (IL-1

und IL-6), als eine alleinige LPS-Stimulation. Auch die LPS-induzierte Sekretion von IL-12,

einem Zytokin, das die Proliferation und Ausdifferenzierung von T-Zellen fördert, wird durch

Substanz P verstärkt (KINCY-CAIN u. BOST 1997).

Bei Peritonealmakrophagen von Meerschweinchen und Mäusen konnte Substanz P die

Produktion von Arachidonsäure-Metaboliten (Prostaglandin E2, Thromboxan B2) sowie die

Phagozytoseleistung steigern (BAR-SHAVIT et al. 1980; MURRIS-ESPIN et al. 1995).

Außerdem konnte Substanz P die Induktion von anti-apoptotischen Faktoren, wie Bcl-2 und

Stickstoffmonoxid, in murinen Peritonealmakrophagen fördern, und so die LPS-induzierte

Apoptose verringern (KANG et al. 2001).

HO et al. (1997) konnten nachweisen, dass humane periphere Monozyten und aus

menschlichem Speichel gewonnene Makrophagen neben dem NKR1 auch Substanz P selbst

produzieren können. Diese Tatsachen führten die Autoren zu der Annahme, dass

Makrophagen eine der hauptsächlichen Quellen für Substanz P bei entzündlichen

Erkrankungen der Atemwege sind. Andere Studien wiesen eine Hochregulation der SP und

NKR1 Expression in Monozyten und Makrophagen durch Endotoxin nach (BOST et al. 1992;

GERMONPRE et al. 1999).

2.3.3 Aktivierung von Thrombozyten

Unter physiologischen Bedingungen zirkulieren Thrombozyten als diskoide Partikel mit

glatter Oberfläche in der Blutbahn (COOMBER et al. 2001). Im Rahmen von

Entzündungsreaktionen werden lokal Thrombozyten-aktivierende Faktoren produziert, wie

zum Beispiel der Plättchen aktivierende Faktor (PAF), Thrombin und Thromboxan A2

(TXA2). Diese Stoffe binden an G-protein-gekoppelte Rezeptoren, die zu einem Anstieg von

intrazellulären Ca2+-Ionen und der Aktivierung von Proteinkinase C führen. Nach Aktivierung

verändern die Thrombozyten ihre Form und setzen die Inhalte der α-Granula und der dichten

Granula frei (HOLMSEN 1994). In Studien mit Kaninchen konnte festgestellt werden, dass

Literaturübersicht

31

Substanz P eine Formveränderung von Thrombozyten induziert (GUDAT et al. 1981; SAVI

et al. 1992). Dabei handelt es sich um einen kurzzeitigen, reversiblen Effekt, der durch den

Einsatz von NKR1-Antagonisten aufgehoben werden konnte.

DAMONNEVILLE et al. (1990) beschrieben eine Erhöhung der zytotoxischen Aktivität

humaner Thrombozyten gegenüber Larven von Schistosoma mansoni nach der Stimulation

mit Substanz P. Bei eingesetzten Konzentrationen von 1x10-12 bis 1x10-6 mol/L erreichte SP

einen maximalen Effekt bei 1x10-8 mol/L. In den Studien von GECSE et al. (1996; 1999)

zeigte Substanz P einen Einfluss auf die Arachidonsäure-Freisetzung aus humanen

Thrombozyten. Durch niedrige Dosen von Substanz P (1x10-12 mol/L) wird die Freisetzung

von Thromboxan A2 und Prostaglandin F2α (PGF2α) gehemmt, während höhere Dosen (1x10-8

- 1x10-10 mol/L) die Produktion der beiden Arachidonsäure-Metaboliten förderten. Die

Autoren betrachten ihre Ergebnisse in Zusammenhang mit denen von DAMONNEVILLE et

al. (1990) als Hinweis darauf, dass Substanz P durch eine vermehrte Freisetzung von TXA2

die Zytotoxizität von Thrombozyten fördert.

In einer neueren Studie wird bei humanen Thrombozyten eine gesteigerte Aggregat-Bildung

und eine Degranulation von α- und Dichten-Granula durch Substanz P in micromolaren

Konzentrationen beschrieben (GRAHAM et al. 2004). Diese Effekte waren mit einer

Mobilisation von Calcium aus intrazellulären Speichern verbunden. Außerdem konnte in der

Studie die Expression der NKR1 mRNA in Megakaryozyten und die Anwesenheit des NKR1

auf humanen Thrombozyten nachgewiesen werden.

2.3.4 Modulation von Lymphozyten

Studien über die Migration von humanen Lymphozyten zeigten eine direkte chemotaktische

Wirkung sowohl für T- als auch für B-Lymphozyten durch den C-terminalen Teil von

Substanz P (SCHRATZBERGER et al. 1997). In neueren Untersuchungen konnte die

chemotaktische Wirkung von Substanz P auf T-Lymphozyten weiter belegt, und über den

Einsatz von NKR1-Antagonisten dem hauptsächlichen Rezeptor für SP zugeordnet werden

(HOOD et al. 2000; GUO et al. 2002). GUO et al. (2002) konnten außerdem feststellen, dass

Substanz P die Bildung von CCL4 in T-Lymphozyten auf mRNA-Ebene und auch die

Sekretion des Chemokins signifikant steigerte. Das Chemokin wirkt vor allem auf

Monozyten, Makrophagen und T-Zellen chemotaktisch. Die Autoren ordnen diesen Effekt

Literaturübersicht

32

einer Aktivierung des NFκB zu, da Substanz P in den Versuchen zu einer erhöhten Tätigkeit

der NFκB-aktivierenden Luciferase führte.

Über den Einfluss von Substanz P auf die Proliferation von T-Lymphozyten gibt es

unterschiedliche Angaben. Indirekt moduliert Substanz P die Proliferation von T-Zellen durch

die verstärkte IL-12-Produktion von Makrophagen (siehe 2.3.2). Auf direktem Wege wird

Substanz P ein positiver Effekt auf die durch Mitogene, wie Concavalin A (ConA), induzierte

Proliferation von Lymphozyten zugeschrieben (PAYAN et al. 1983; COVAS et al. 1994).

COVAS et al. (1994) berichten aber auch von einer Hemmung der Proliferation durch

Substanz P bei immunsuppressiven Individuen. Andere Autoren konnten bei Versuchen mit

einer humanen Lymphozyten-Zelllinie keinen Einfluss von Substanz P auf die Mitogen-

induzierte Proliferation feststellen (ZHU et al. 1984; KRCO et al. 1986; ROBERTS et al.

1992). SCICCHITANO et al. (1987) untersuchten die Wirkung von Substanz P auf die

Proliferation von Lymphozyten in Abhängigkeit der Zeit. Dabei konnte die Arbeitsgruppe

feststellen, dass Substanz P innerhalb der ersten 24 Stunden hemmend auf die Proliferation

wirkte und nach 48 Stunden keinen Effekt zeigte, was sich mit den Ergebnissen von KRCO et

al. (1986) deckte. Nach 72 Stunden Inkubation konnte die Arbeitsgruppe eine

proliferationsfördernde Wirkung von Substanz P feststellen. CALVO et al. (1992) konnten

zeigen, dass Substanz P bei aktivierten humanen T-Zellen die Produktion von IL-2 verstärkt.

Dieses Zytokin fördert die Proliferation von T-Zellen. Der Effekt von Substanz P folgte einer

glockenförmigen Dosis-Wirkungs-Beziehung und hatte sein Maximum bei 1x10-12 mol/L.

RAMESHWAR et al. (1993) konnten eine Steigerung der IL-2-Produktion durch Substanz P

bei ruhenden murinen Lymphozyten und CD4-positiven T-Zellen beobachten. Dabei konnte

der maximale Effekt von Substanz P in dem auch von CALVO et al. (1992) beschriebenen

Konzentrationsbereich (1x10-12 mol/L) ermittelt werden.

Literaturübersicht

33

2.4 Die Rolle von Substanz P bei entzündlichen Erkrankungen

2.4.1 Infektiöse und nicht-infektiöse Erkrankungen des

Gastrointestinaltrakts

Eine Beteiligung von Substanz P wird vor allem bei Infektionen mit Clostridium difficile und

Salmonella spp., sowie bei der Pathogenese des Inflammatory-Bowel-Disease-Komplex

diskutiert.

Ein wichtiger Mechanismus der durch Clostridium difficile ausgelösten Colitis ist die

Freisetzung von Enterotoxin A und die damit verbundene Sekretion und Entzündung des

Darms. Enterotoxin A vermittelt seine Wirkung durch die Aktivierung von intestinalen

Neuronen und die Ausschüttung von Neuropeptiden, vor allem von Substanz P (KOON u.

POTHOULAKIS 2006). In Versuchen mit Ratten konnte die parenterale Gabe eines NKR1-

Antagonisten alle durch Enterotoxin A ausgelösten inflammatorischen und sekretorischen

Effekte hemmen (POTHOULAKIS et al. 1994; MANTYH et al. 1996). Eine Gabe von

Enterotoxin A führte bei Ratten innerhalb von 30 Minuten zu einem vermehrten Gehalt von

Substanz P in der Ileum-Mukosa und in Makrophagen der Lamina propria. Außerdem wurde

die TNF-α-Produktion der Makrophagen gesteigert (CASTAGLIUOLO et al. 1997).

Eine Beteiligung von Substanz P an der Pathophysiologie von Salmonella-Infektionen wird

ebenfalls diskutiert. Im Maus-Modell führte eine orale Infektion mit Salmonellen zu einer

beachtlichen Hochregulation des NKR1 in Peyerschen Platten und mesenterialen

Lymphknoten. Die Gabe eines Substanz P-Antagonisten vor der Infektion führte zu einer

erhöhten Mortalität und einer verringerten mRNA-Expression von IL-12 und IFN-γ in

intestinalen Makrophagen (KINCY-CAIN u. BOST 1996). Diese Ergebnisse ließen die

Autoren vermuten, dass Substanz P ein wichtiger Faktor für die Bildung einer ausreichenden

Immunantwort gegenüber Salmonella-Infektionen ist. Eine neuere Studie von WALTERS et

al. (2005) zeigte jedoch eine erhöhte Resistenz von NKR1-defizienten Mäusen gegenüber

Salmonella-Infektionen, die vermutlich auf eine erhöhte Produktion des anti-

inflammatorischen Zytokins IL-10 zurückzuführen ist.

Der Krankheitskomplex Inflammatory Bowel Disease (IBD) schließt die Erkrankungen

Morbus Crohn und ulzerative Colitis mit ein. Die Pathogenese von IBD beinhaltet

prädisponierende genetische Faktoren sowie exogene und endogene Auslöser, die in einer

Literaturübersicht

34

rezidivierenden und progressiven Entzündung des Darms münden (SHANAHAN 1993).

Obwohl die Ätiologie von IBD noch nicht hinreichend geklärt ist, wird angenommen, dass

Substanz P und der NKR1 eine Rolle bei der Pathophysiologie des Krankheitskomlpexes

spielen (KOON u. POTHOULAKIS 2006). Erhöhte Gehalte von Substanz P wurden in

Rektum und Kolon von Patienten mit ulzerativer Colitis ermittelt und korrelierten mit den

Krankheits-Schüben (MAZUMDAR u. DAS 1992; BERNSTEIN et al. 1993). Eine erhöhte

Dichte von SP-haltigen Nervenfasern konnte bei Morbus-Crohn-Patienten in Kolon und in

hypervaskulären Läsionen des Darms festgestellt werden (MAZUMDAR u. DAS 1992;

KIMURA et al. 1994). GOODE et al. (2000) untersuchten das Expressionsmuster des SP-

Rezeptors in Kolon-Biopsien von gesunden und an IBD erkrankten Individuen. Generell war

der Anteil NKR1-haltiger Zellen in den Bioptaten von IBD-Patienten erhöht. Bei Morbus-

Crohn-Patienten konnte die Arbeitsgruppe eine erhöhte Expression des NKR1 im

myenterischen Plexus ermitteln. Bei Patienten mit ulzerativer Colitis fiel eine verminderte

Expression des Rezeptors in Kolon-Epithelzellen im Vergleich zu gesunden Individuen auf.

Die Autoren vermuten eine Herabregulation des Rezeptors aufgrund erhöhter Substanz-P-

Sekretion bei ulzerativer Colitis.

2.4.2 Erkrankungen der Atemwege

Bei Asthma-Patienten konnten vermehrt Substanz-P-haltige Nervenfasern in der Submukosa

von Bronchien sowie eine erhöhte Menge von Substanz P aus Lungengewebe und Bronchio-

Alveolären-Lavagen (BAL) nachgewiesen werden (OLLERENSHAW et al. 1991; NIEBER

et al. 1992; LILLY et al. 1995). Substanz P und Neurokinin A werden als potente Mitogene

für glatte Muskelzellen, Endothelzellen, Epithelzellen und Fibroblasten beschrieben, und mit

der Dickenzunahme der Atemwege bei Asthma in Verbindung gebracht (KUWANO et al.

1993; HARRISON et al. 1995; KIM et al. 1995). In den Epithelzellen des Respirationstrakts

von Asthmatikern wurde eine erhöhte Expression von Substanz P und NKR1 gemessen

(ADCOCK et al. 1993; CHU et al. 2000). Das in Speichel und Bronchialsekret von

Asthmatikern erhöhte Zytokin IL-1β verursacht eine Hyperreagibilität der Atemwege

(BORISH et al. 1992; BROIDE et al. 1992). In Studien von WU et al. (2002) konnte gezeigt

werden, dass IL-1β zu einer vermehrten Freisetzung von Substanz P in Neuronen und glatter

Muskulatur der Atemwege führt und dadurch die Hyperreagibilität vermittelt.

Literaturübersicht

35

Eine Beteiligung von Substanz P an der Immunantwort bei Virus-Erkrankungen der

Atemwege wird ebenfalls diskutiert. TRIPP et al. (2002) konnten eine verstärkte Expression

des Substanz-P-Rezeptors auf CD4-positiven T-Zellen nach Infektion mit Para-

influenzavirus 3 und Respiratorischem Synzytialvirus feststellen. In Tierversuchen führten

Infektionen mit dem Respiratorischen Synzytialvirus zur verstärkten Expression von NKR1 in

Lungengewebe von Ratten (KING et al. 2001). Die Behandlung von Meerschweinchen mit

einem NKR1-Antagonisten bei Infektionen mit Parainfluenzaviren konnte die Einwanderung

von Makrophagen in das Lungengewebe sowie die Hyperreagibilität der Bronchien hemmen

(JACOBY et al. 2000).

Chronischer Raucherhusten wird mit einer vermehrten Synthese und Freisetzung von

Substanz P in Neuronen der Lunge und oberen Atemwege in Verbindung gebracht (KWONG

et al. 2001). Mehrere Studien belegen, dass eine Freisetzung von Substanz P durch

Zigarettenrauch die Adhäsion von Leukozyten an der Tracheal-Schleimhaut induziert und die

Aktivität der neutralen Endopeptidase herabsetzt (DUSSER et al. 1989; BALUK et al. 1996).

2.4.3 Arthritis

Eine Beteiligung von Substanz P an der Entstehung von rheumatoider Arthritis wird schon

seit längerer Zeit diskutiert. Die rheumatoide Arthritis (RA) ist durch eine chronische

Entzündung der Gelenke charakterisiert, die mit der Infiltration und Anhäufung von

aktivierten Immunzellen, hauptsächlich T-Zellen, Monozyten, Makrophagen und

Plasmazellen einhergeht. Durch die hauptsächlich von T-Zellen und Monozyten

ausgeschütteten Zytokine kommt es zu einer fortschreitenden Zerstörung von Knorpel und

Knochen (FELDMANN et al. 1996). LEVINE et al. (1984) ermittelten in Tierversuchen, dass

Sprunggelenke, die zu schweren Arthritiden neigen, dichter mit Substanz-P-haltigen

Nervenfasern innerviert waren als Kniegelenke, die in der Regel nur milde Arthritiden

entwickeln. Außerdem führte eine Injektion von Substanz P in Kniegelenke von Ratten zu

einer Verschlimmerung der Arthritis, während ein Antagonist diesen Effekt nicht auslösen

konnte. Bei humanen Synoviozyten führte Substanz P zu Zell-Proliferation und zur

Freisetzung von Prostaglandin E2 und Collagenase (LOTZ et al. 1987). Bei Patienten mit

rheumatoider Arthritis konnten außerdem erhöhte Gehalte des Neuropeptids in

Gelenkflüssigkeit und Serum gemessen werden (MARSHALL et al. 1990; MENKES et al.

Literaturübersicht

36

1993). Erhöhte Gehalte von Substanz P wurden auch in Kniegelenken von Kaninchen

gemessen, denen die pro-inflammatorischen Zytokine IL-1β oder TNF-α injiziert wurden

(O'BYRNE et al. 1990). KRAUSE et al. (1995) konnten feststellen, dass Synoviozyten von

Patienten mit rheumatoider Arthritis den Substanz-P-Rezeptor NKR1 exprimieren, während

er bei Synoviozyten von gesunden Individuen nicht ausgebildet wird. Bei Monozyten isoliert

aus Patienten mit RA führte eine Stimulation mit Substanz P zu einer vermehrten Produktion

von TNF-α im Vergleich zu Monozyten von gesunden Individuen (LAVAGNO et al. 2001).

Bei bakteriell ausgelösten Arthritiden konnte im Tiermodell gezeigt werden, dass eine

Blockade des NKR1 die Eliminierung der Bakterien verschlechterte und zu stärkeren

Läsionen im Gelenk führte (VERDRENGH u. TARKOWSKI 2008).

2.5 Die Bedeutung von Substanz P beim Rind

Bisher wurden nur wenige Studien durchgeführt, die sich mit der Bedeutung von Substanz P

im bovinen Organismus beschäftigen. NISHI et al. (2000) untersuchten die Verteilung von

Substanz-P-haltigen Nervenfasern im Respirationstrakt von Kälbern und adulten Rindern. Die

Arbeitsgruppe konnte vom nasalen Bereich der Atemwege bis in die Lunge SP-haltige

Nervenfasern detektieren, die bei Kälbern zahlreicher waren als bei adulten Tieren. SP-haltige

Nervenfasern wurden hauptsächlich in Epithelien und in darunter gelegenem Bindegewebe

sowie um Blutgefäße und in den Drüsen des gesamten Respirationstrakts gefunden. Sie waren

jedoch in der glatten Muskulatur nur spärlich ausgeprägt. Auch in den myenterischen

Ganglien des Pansens von Rindern, Schafen und Damwild konnte Substanz P nachgewiesen

werden (MUNNICH et al. 2008).

Hinweise auf eine Beteilgung von Substanz P an der Schmerzübertragung bei Rindern gibt

eine Studie von COETZEE et al. (2008). Die Arbeitsgruppe konnte bei frisch kastrierten

Kälbern erhöhte Substanz-P-Gehalte im Serum messen, deren Höhe positiv mit der Stärke der

Schmerz-Lautäußerung der Tiere korrelierte.

Auch in nicht neuronalen Zellen konnten Substanz P und sein Rezeptor beim Rind

nachgewiesen werden. Die mRNA von Substanz P und dem NKR1 konnte in bovinen

Lutealzellen und ovariellen Makrophagen gemessen werden (REIBIGER et al. 2001;

Literaturübersicht

37

BRYLLA et al. 2005). Die Autoren vermuten eine Beteiligung von Substanz P an der

Entwicklung des bovinen Gelbkörpers im frühen Stadium.

ROGERS et al. (2006) untersuchten den immunmodulatorischen Effekt von Substanz P auf

bovine Alveolarmakrophagen. Die Arbeitsgruppe konnte den hauptsächlichen Substanz P-

Rezeptor NKR1 auf diesen Zellen nachweisen. Eine Aktivierung boviner Alveolar-

makrophagen mit Substanz P (1x10-9 mol/L) führte zu einer leichten Erhöhung der

Phagozytose-Aktivität und zu einer vermehrten Produktion von TNF-α.

Zusammenfassend kann angenommen werden, dass Substanz P auch beim Rind von Zellen

des peripheren Nervensystems gebildet wird und an der Regulation von Organfunktionen des

Respirationstrakts und des Gastrointestinaletrakts sowie an der Schmerzweiterleitung beteiligt

ist. Es gibt außerdem Hinweise auf ein immunmodulatorisches Potential von Substanz P.

Geräte, Material und Methoden

38

3 Geräte, Material und Methoden

3.1 Geräte

Aqua dest. Aufbereitungsanlage Umkehr-Osmose Anlage, „Typ RO 50/14SMB Typ I“

(Wasser und Regenerierstation, Barsbüttel)

Aqua tridest. Aufbereitungsanlage „SG Reinstwasser System Typ SG-RS90-4 UF“

(Wasser- und Regenerierstation, Barsbüttel)

Autoklav Typ GE406 (Getinge AB, Getinge/Schweden)

Biometra T-Gradient (biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen)

BioPhotometer (Eppendorf, Hamburg)

Brutschrank mit CO2-Begasung, Baureihe 5060 (Heraeus, Hanau)

Bunsenbrenner mit automatischer Zündung (Wartewig (6.001.000), Göttingen)

Centricon®– Filtrationssystem (Amicon, Beverly/MA, USA)

CO2-Flasche zur Sterilfiltration (Kohlensäurewerke Hannover, Hannover)

Druckbehälter zur Sterilfiltration „stainless steel pressure vessel“

(Alloy Products (XX670053) Wisconsin, USA)

Eismaschine Typ UBE 30-10 (Ziegra, Isernhagen)

Fluoreszenz-Durchflusszytometer, Modell FACScan®, mit angeschlossener Computereinheit

(Becton Dickinson, Heidelberg)

Fluoreszenzmikroskop Eclipse 80 i mit Phasenkontrasteinrichtung

(Nikon GmbH, Düsseldorf)

Heißluftsterilisator „Typ ST5050“ (Heraeus, Hanau)

Heizblock Techne Dir-Block DB.3 (Thermo Dux, Wertheim)

Invertmikroskop (Zeiss, Oberkochen)

Kühlschrank mit Gefrierfach (-20°C) (Einzelhandel)

Kühlzentrifuge Varifuge K mit Tragwinkelrotor, Hochgeschwindigkeitsaufsatz und Mikrotiterplattenrotor

(Heraeus Instruments, Osterode)

Laborfeinwaage „B6“ (Mettler, Zürich/Schweiz)

Labor-pH-Meter „766 Calimatic“ (Knick, Berlin)

Laborwaage „BL310“ (Sartorius GmbH, Göttingen)

MACS®MultiStand Metallständer (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach)

Magnetrührer mit Heizplatte (Janke und Kunkel, Staufen)

Microcomputer Gelelktrophoresis power supply consort (Keutz Laborgeräte, Reiskirchen)

MIDI MACSTM Separations-Einheit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach)

Mini-Sub® Cell GT Gelelektrophorese-Kammer (BioRad Laboratories GmbH, München)


39

Minizentrifuge (National Labnet CO., Woodbridge, NJ, USA)

Molecular Imager Gel Doc XR (BioRad Laboratories GmbH, München)

Pinzette, gebogen, anatomisch (Eickemeyer, Tuttlingen)

Pipette, einstellbar „Transferpette®“ (2-20 µL) (Brand, Wertheim)

Pipetten, einstellbar „pipetman“ (1-20 µL, 10-100 µL,20-200 µL, 100-1000 µL)

(Gilson, Villers Le Bel/Frankreich)

Pipettierhilfe „accu-jet®“ (Brand, Wertheim)

Plastikbox mit Gittereinsatz (Einzelhandel)

Plattenzentrifuge mit Plattenrotor (UJ II KS) (Heraeus-Christ. Osterode)

Reinwerkbank Laminair HL2448 (Heraeus-Christ, Hanau)

Rüttler für Mikrotiterplatten „AM69 Microshaker“ (Dynatec, Zug/Schweiz)

Schlauchpumpe zum Absaugen von Flüssigkeiten „Rumo100“

(Heidolph, Schwabach)

Schüttelinkubator RS 90-4 UF (SG Barsbüttel)

StepOnePlus® Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Darmstadt)

Tiefkühltruhe -80°C (Kendro, Hanau)

Tischzentrifuge „Hermle Z230M“ (Hermle, Gosheim)

Transmigrationskammer 10 wells; 400 µl/285 µl (Neuro Probe, Gaithersburg, MD/USA)

Zählkammer nach Bürker (Brand, Wertheim)

Zentrifuge „Megafuge 1.0R“ (Heraeus Instruments, Osterode)

Zentrifuge Multifuge 1 S-R (Thermo Scientific, Osterode)

3.2 Material

3.2.1 Klinikbedarf

Butterfly-Kanüle „Micro-FloTM“ 21G 0,8mm (Fa. Industria Biomedica (AS2102), Mailand/Italien)

Kanülen 1,80 x 40 mm, steril „TSK STERIJECT“ (TSK-Supra, Tochigi/Japan)

Staukette nach Witte (Eickemeyer, Tuttlingen)

Vacutainer Brand Luer Adapters (Becton Dickinson, Heidelberg)

Vacutainer® System, Halter (Fa. Becton Dickinson, Heidelberg)

Vacutainerröhrchen, 10 ml, Heparin (170 IU) (Becton Dickinson, Heidelberg)


40

3.2.2 Laborbedarf

Abdeckung für PCR-Platten optical adhesive covers (Applied Biosystems, Darmstadt)

Combitips, 1,25 mL (Eppendorf (0030069.420), Hamburg)

Combitips, 2,5 mL (Eppendorf (0030069.447), Hamburg)

Cryo-Freezing-Container (Nalgen Co., Rochester,. USA)

Einmal-Filter, Celluloseacetate Membrane, 0,2 µm, steril (Renner (26146040), Dannstadt)

Einmal-Küvetten UltraVette 8,5 mm (Brand (5406120), Wertheim)

Einmal-Pasteurpipetten aus Pe-Ld (Merck (612F1767), Darmstadt)

Eppendorf-Reaktionsgefäß, 1,5 mL (Greiner (616201), Frickenhausen)

Flachboden Zellkulturplatten mit Abdeckung, steril 24 Vertiefungen

(Biochrom (P92965), Berlin)

Flachboden–Mikrotiterplatten mit Abdeckung, steril 96 Vertiefungen

(Biochrom (P92960), Berlin)

Laborflaschen mit Gewinde, 500 mL (VWR international (215L1516), Hannover)

MACS Pre-Separation Filters (Miltenyi Biotec(130-041-407), Bergisch Gladbach)

MACS Säulen LS Columns (Miltenyi Biotec(130-042-401), Bergisch Gladbach)

Mikrobank-System Cryobank™ (Mast Diagnostika (291609), Reinfeld)

Pasteurpipetten, 22,5 mm aus Glas (Brand (747720), Wertheim)

PCR-Platten Micro Amp TM Fast 96-well plate (Applied Biosystems, Darmstadt)

PCR-Reaktionsgefäß 0,2 mL (Biozym Scientific GmbH, Hess. Oldendorf)

Pipettenspitzen 200 und 1000 µL (Sarstedt (70/762002) (70/760002), Frickenhausen)

Pipettenspitzen safe seal Tipps 10, 100, 1000 µL (Biozym Scientific GmbH, Hess. Oldendorf)

Polycarbonat-Membran 25 x 80 mm, 3 µm Porengröße, PVP Membranen

(Neuro Probe (PRB3-50), Gaithersburg, MD/USA)

Polystyrolröhrchen (Nerbe Plus (62 161 0000) Winsen/Luhe)

Röhrchen für die Durchflusszytometrie, 5 mL (Becton Dickinson (352008), Heidelberg)

Rundboden-Mikrotiterplatten mit Abdeckung; steril, 96 Vertiefungen

(Gechno Plastic Products TPP®, Trasadingen/Schweiz)

Saugpipetten, 10 mL (Sarstedt (86.1254.01), Nürnbrecht) Transwell Membraneinsätze (permeabel) 3 µm Porengröße (Coster GmbH (3402), Bodenheim) Zellkulturflaschen, 200 mL (Nunc (156499), Wiesbaden)

Zellkulturflaschen, 75 mL (Nunc (136196), Wiesbaden)

Zentrifugenröhrchen, 15 mL aus Polypropylen (steril) (Sarstedt (62.554.502), Nürmbrecht)

Zentrifugenröhrchen, 50 mL aus Polypropylen (Falcons, steril) (Corning (430829), Wiesbaden)


41

3.2.3 Reagenzien

1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen (10787-026), Karlsruhe)

Acridin-Orange (Sigma-Aldrich (A-6014), Steinheim)

Agarose (Life Technologies (15510-027), Paisely, Scotland)

Albumin Fraktion V, bovine, pulv. 98% (Roth (8076.2), Karlsruhe)

Ampicillin (Sigma-Aldrich (A-9518), Steinheim)

Bromphenolblau (3', 3', 5', 5'-Tetrabromhenol-sulfophtalin) (Severin (15375), Heidelberg)

Concavalin A (ConA) (Amersham Bioscience (17-0450-01), Freiburg)

CXCL 8, human, rekombinant (rhCXCL 8). (cell concepts GmbH (C-20008-ME), Umkirch)

Deoxynucleotide Triphosphates (dNTPs) (Promega (41221), Mannheim)

Dimethylformamid (DMF) (Sigma-Aldrich (D-4551), Steinheim)

Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich (D-5879), Steinheim)

Di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) (Sigma-Aldrich (S-0876), Steinheim)

EDTA (Ethylendiamine-Tetraacetic Acid) (Sigma-Aldrich (ED2SS), Steinheim)

Ethanol 641, absolut, vergällt (CG Chemikalien, Laatzen)

Ethidiumbromid (Sigma-Aldrich (E87A51), Steinheim)

FCCP (Carbonylcyanide-4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone) (Sigma-Aldrich (C-2920), Steinheim)

Fetales Kälberserum (FCS), Virus und Mykoplasmen getestet (Biochrom (S0 113/431B), Berlin)

FITC (Fluoreszein Isothiocyanate) (Sigma-Aldrich (F7250), Steinheim)

Fluo 4 Acetoxymethyl Ester Calcium Indikator (Invitrogen (F14201), Karlsruhe)

Formaldehyd 37%, p.a., ACS, Rotiuran® (Roth (49794.1), Karlsruhe)

Fura red Acetoxymethyl Ester Calcium Indikator (Invitrogen (F3021), Karlsruhe)

Gel Star® Nucleic Acid Stain (Lonza (50535), Rockland, Maine/USA)

Goat Anti-Mouse IgG MicroBeads (Miltenyi Biotec, (130-048-401), Bergisch Gladbach)

Goat-Anti-Mouse IgG/IgM, FITC-konjugiert (Dianova, (115-095-068), Hamburg)

Hind III Restriktionsenzym aus Haemophilus influenzae (Invitrogen (15207-012), Karlsruhe)

IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) (Invitrogen (15529-019), Karlsruhe)

Iscove® DMEM mit L-Glutamin (PAA Laboratories (E15-819), Linz/Österreich)

JC-1 (5'5'6'6' Tetrachloro-1'1'3'3' Tetraethylbenzimidazol-Carbocyanin Jodid)

(Invitrogen (T-3168), Karlsruhe)

Kaliumchlorid (KCl), kristallin (Biochrom (T046-10), Berlin)

Kaliumhydrogencarbonat reinst (KHCO3) (Merck (3852), Darmstadt)

Kupfer(II)-sulfat-5-hydrat (Roth (8174.1), Karlsruhe)


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L-Arginin (Sigma-Aldrich (A5131), Steinheim)

LB Agar (invitrogen (00705091), Karlsruhe

LB Base (Invitrogen (00705241), Karlsruhe)

L-Glutamin (Biochrom (K0283), Berlin)

L-Histidin (Sigma-Aldrich (8776), Steinheim)

Lipopolysaccharid von Escherichia coli Serotyp O55:B5 (Sigma-Aldrich (L-2637), Steinheim)

Lymphozytenseparationsmedium (PAA Laboratories (J15-004), Linz/Österreich)

Natriumazid (NaN3), 10%ig (Sigma-Aldrich (S-2002), Steinheim)

Natriumcarbonat (Na2CO3) (Sigma-Aldrich (S-2127), Steinheim)

Natriumchlorid (NaCl) (Roth (9265.2), Karlsruhe)

Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) (Sigma-Aldrich (S-63295), Steinheim)

Natriumhypochlorid (NaClO) (Sigma-Aldrich (425044)Steinheim)

Oligo (dt) 12-18 Primer (Invitrogen (18418-012), Karlsruhe)

Penicillin-Streptomycin-Glutamine-Lösung liquid100fach konzentriert

(Invitrogen (10378-016), Karlsruhe)

PercollTM (spezifisches Gewicht: 1,130 g/ml) (Amersham Bioscience (170-89101), Uppsala/Schweden)

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Dulbecco, ohne Ca++/Mg++

(Biochrom (L18210), Berlin)

Propidiumiodid (PI) (Calbiochem (537059), Bad Soden)

QIA Gel Extraction Kit (QIAGEN GmbH (28704), Hilden)

QIAquick® PCR Purification Kit (QIAGEN GmbH (28104), Hilden)

REact® 2, 10-fach konzentriert (Invitrogen (Y 92500), Karlsruhe)

RNaqueous® Kit (Ambion (AM 1912), Austin, Texas/USA)

RNaseOUTTM Ribonuclease Inhibitor (Invitrogen (10777-019), Karlsruhe)

RPMI liquid mit Hepes und L-Glutamin (Calbiochem (537059), Bad Soden)

ScaI Restriktionsenzym aus Streptomyces caespitosus (Invitrogen (15436-017), Karlsruhe) Staphylokokken-Enterotoxin A (SEA), lyophilisiert (Sigma-Aldrich (S-9399), Steinheim)

Substance P Acetate Salt Hydrate (Sigma-Aldrich (S6883), Steinheim)

SuperscriptTM II Reverse Transkriptase (Invitrogen (18064-014), Karlsruhe)

SYBR Green® PCR Master Mix (Appiled Biosystems (4309155), Darmstadt)

TOPO TA Cloning® Kit (Invitrogen (K 450641) Karlsruhe)

Tri-Natriumcitrat (2 x H2O) (Serotec (PBP 005), Oxford/UK)

Tris (Trizma Base) (Sigma-Aldrich (T8524), Steinheim)

Tris Boric Acid EDTA-Puffer (TBE) 10-fach konzentriert (Bio Rad Laboratories GmbH (161-0770), München)

X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galactopyranosid) (Invitrogen (15520-034), Karlsruhe)


43

3.2.4 Versuchstiere

Bei den Tieren, denen Blut zur Zellgewinnung entnommen wurde, handelte es sich um

ausschließlich weibliche Tiere der Rasse „Deutsche Schwarzbunte“, Typ Holstein-Friesian.

Das durchschnittliche Alter der Tiere betrug 4 Jahre. Alle verwendeten Tiere waren klinisch

gesund und stammten entweder aus der Klinik für Rinder oder aus dem Lehr- und

Forschungsgut Ruthe der Tierärztlichen Hochschule Hannover.

3.2.5 Mono- und polyklonale Antikörper

Monoklonale Antikörper wurden für die Charakterisierung von Oberflächenstrukturen auf

bovinen Leukozyten, für die Separation von bovinen Monozyten aus peripherem Blut und für

die Herstellung von Referenzzellen verwendet. Alle Antikörper, bis auf denjenigen ohne

erkennbare Spezifität, stammen von der Firma AbD Serotec, Düsseldorf. Eine Übersicht über

die verwendeten Antikörper und deren Spezifität ist in Tab. 2 dargestellt.

Tab. 2: Monoklonale Antikörper.

Name (Laborcode)

Spezifität Donor/Isotyp Kopplung Verdünnung1 Referenz

mAk IL-A11 (ILRI)

bovines CD4 Maus/IgG2a keine 1:20.000 HOWARD und NAESSENS (1993)

mAk CC63 (IAH-C)

bovines CD8α Maus/IgG2a keine 1:10 NAESSENS und HOPKINS (1996)

MCA 1568PE humanes CD142

Maus/IgG2a PE 1:50 JACOBSEN et al. (1993)

MCA 2419A488

humanes CD62P2

Maus/IgG1 Alexa Fluor® 488

1:20 MASSAGUER et al. (2003)

CDSW3#127 keine3 Maus/IgG2a keine 1:10 HAVERSON (2001)

Bo 1 MHC-I Maus/IgG1 keine 1:1 SCHUBERTH et al. (1991)

1) Die Verdünnung erfolgte in MIF-Puffer (3.2.6.4); 2) kreuzreaktiv mit dem homologen bovinen Molekül. Der Hersteller und die angegebene Referenz beschreiben eine Kreuzreaktivivtät für Rinder; 3) Der Antiköper ohne erkennbare Spezifität für Zelloberflächenstrukturen wurde im Rahmen des 3rd International Swine CD Workshops (HAVERSON 2001) an teilnehmende Einrichtungen versandt und im Rahmen dieser Arbeit als Isotypkontrolle eingesetzt.


44

Als Sekundärantikörper für die Membran-Immunfluoreszenz und für die Herstellung von

Referenzzellen diente ein affinitätschromatographisch gereinigter, polyklonaler Antikörper:

Ziege-anti-Maus-IgG und IgM (schwere und leichte Ketten). Der mit Fluoreszeiniso-

thiocyanat (FITC) gekoppelte Antikörper war gegen Human-, Rinder- und

Pferdeserumproteine absorbiert. Dieser Antikörper wurde in der Verdünnung 1:40 (in MIF-

Puffer 3.2.6.4) eingesetzt. Für die magnetische Separation von Monozyten wurde der

polyklonale Antikörper Goat-anti-Mouse-IgG (schwere und leichte Ketten) an magnetische

Microbeads (3.2.3) gekoppelt eingesetzt. Die Menge richtete sich hierbei nach der Anzahl der

zu separierenden Zellen, pro 1x107 Zellen wurden 20 µL Microbeads eingesetzt.

3.2.6 Kulturmedien, Puffer und Lösungen

Alle Medien wurden, wenn nicht anders angegeben, in Aqua tridest angesetzt.

3.2.6.1 Zellkulturmedien und Zusätze

Für die Kultivierung von Leukozyten wurden die Medien RPMI und Iscove® (3.2.3)

verwendet. Um Komplementaktivität auszuschließen und eventuell vorhandene Mykoplasmen

abzutöten, wurde das eingesetzte fetale Kälberserum (FCS, 3.2.3) bei 56°C für eine Stunde

inaktiviert. Ein mit Penicillin-Streptomycin-Lösung (3.2.3) versetztes Medium wurde mit

einem hochgestellten ‚+‘-Zeichen gekennzeichnet.

Iscove®-Medium mit 10% (v/v) fetalem Kälberserum (I10F+) (3.2.3):

Iscove® DMEM mit L-Glutamin 500 mL Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) 50 mL Penicillin-Streptomycin 10 mg

RPMI-Medium mit 10% (v/v) fetalem Kälberserum (R10F+) (3.2.3):

RPMI® liquid mit Hepes und L-Glutamin 500 mL Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) 50 mL Penicillin-Streptomycin 10 mg


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HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) mit Ca2+ (1 mmol/L) und Mg2+ (1 mmol/L)

HBSS 500 mL Ca2+ 1 mmol/L Mg2+ 1 mmol/L Für die Messung des Calcium-Einstroms wurde das Medium ohne den Zusatz von Phenolrot verwendet.

Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) mit EDTA (2 mmol/L)

EDTA 292 mg PBS ad 500 mL

Substanz P (SP) Stammlösung

Die Stammlösung von Substanz P (3.2.3) wurde, um es vor Oxidierung zu schützen, nach

Angaben des Herstellers in Essigsäure (0,5 mol/L) in einer Verdünnung von 7x10-5mol/L

angelegt. Die Stammlösung wurde in aliquoten Teilen von 50 µL bis 100 µL bei -95°C

aufbewahrt.

Lipopolysaccharid-Stammlösung

Die LPS-Stammlösung (1 mg/mL PBS) wurde bei -20°C aufbewahrt.

Superantigen-Stammlösung

Das Superantigen Staphylococcus aureus Enterotoxin A (SEA) wurde in einer Konzentration

von 10 µg/mL I10F bei -20°C aufbewahrt.


46

3.2.6.2 Material für die Separation von Zellen

Lymphozytenseparationsmedium®

Das Lymphozytenseparationsmedium® ist eine isotone, wässrige Lösung aus Natrium-

diatrizoat und einem hochmolekularen Zucker mit einem Zusatz des Röntgenkontrastmittels

Isopaque. Bei 10°C besitzt das Separationsmedium eine Dichte von 1,077 g/mL. In dieser

Arbeit wurde das Lymphozytenseparationsmedium® unverdünnt verwendet.

Percoll®

Bei Percoll® handelt es sich um ein synthetisches Sol aus Polyvinyl-Pyrolidon-beschichteten

Silikatpartikeln mit einem spezifischen Gewicht von 1,130 g/mL bei 20°C. Durch Zugabe von

0,9 g NaCl pro Liter Percoll® wurde die Isotonie erreicht (100%-iges, isotones Percoll®).

Natriumchloridlösung, 0,9%

NaCl 8,77 g Aqua tridest. ad 1000 mL

Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) ohne EDTA

Die PBS-Trockensubstanz wurde in Aqua tridest. gelöst. Es wurden folgende Bestandteile

eingewogen:

NaCl 8,0 g KCl 1,24 g Na2HPO4 0,2 g KH2PO4 0,2 g Aqua tridest. ad 1000 mL Der Puffer hatte einen pH-Wert von 7,4. Die Lagerung erfolgte bei 4°C.

Phosphatpuffer, doppelt konzentriert (2 x PBS)

Zur Herstellung wurde die doppelte Menge an PBS-Trockensubstanz eingesetzt (3.2.3) und

mit Aqua tridest. auf 1000 mL ergänzt.


47

3.2.6.3 Lösungen zum Fixieren und Quantifizieren von bovinen Zellen

Paraformaldehydlösung zum Fixieren von Referenzzellen

Paraformaldehyd 40 mg PBS ad 1000 mL Die Lagerung erfolgte bei 4°C.

Acridin-Orange-Ethidiumbromid-Lösung für die lichtmikroskopische Zellzählung

Acridin-Orange 250 mg Ethidiumbromid 250 mg PBS ad 100 mL Die Lagerung erfolgte bei 4°C.

3.2.6.4 Lösungen für die Durchflusszytometrie

Zur Reinigung des Gerätes wurde das Messkanalsystem nach den Messungen mit steril

filtriertem A. tridest. und 1%-iger Natriumhypochlorid-Lösung (3.2.3) gespült.

Trägerflüssigkeit

Als Trägerflüssigkeit für die durchflusszytometrische Messung wurde steril filtriertes

(0,2 µm) PBS mit 0,1 mg/mL NaN3 (Natriumazid) verwendet (3.2.3).

Propidiumjodid-Stammlösung

Die Stammlösung (100 µg Propidiumjodid/mL Trägerflüssigkeit) wurde in aliquoten Teilen

bei -20°C gelagert. Zum Anfärben toter Zellen wurden der Trägerflüssigkeit entsprechende

Teile der Stammlösung zugesetzt, um eine Endkonzentration von 2 µg/mL zu erreichen.

JC-1-Stammlösung

Der für die Apoptosebestimmung verwendete Farbstoff 5,5´,6,6´-Tetrachloro-1,1´,3,3´-

Tetraethylbenzimidazol-Carbocyanin Jodid (JC-1) wurde in einer Stockkonzentration von

2 mol/L in DMSO aufgenommen und in aliquoten Teilen von 20 µL bei -20°C eingefroren.

JC-1 wurde mit PBS verdünnt und in einer Konzentration von 7 µmol/L eingesetzt


48

Wasch- und Verdünnungspuffer für die Membranimmunfluoreszenz (MIF-Puffer)

bovines Serumalbumin 5,0 g Natriumazid (NaN3) 0,1 g PBS ad 1000 mL Die Lagerung erfolgte bei 4°C.

3.2.6.5 Puffer und Lösungen für die DNA-Analyse

1x TBE-Puffer, pH 8,4

Der 10-fach konzentrierte TBE-Puffer (3.2.3) wurde mit A. tridest verdünnt und bei RT

gelagert.

TE-Puffer, pH 7,5

Tris 10,0 mmol/L EDTA 1,0 mmol/L Gelöst in A. tridest wurde der Puffer 20 Min. bei 123°C und 2,8 bar autoklaviert, aliquotiert und bei RT gelagert.

Blaumarker

Glycerol 30%(v/v) Bromphenolblau 1%(w/v) Gelöst in 1x TBE-Puffer, Lagerung bei 4 °C.

3.2.6.6 Zusätze, Medien und Nährböden für Bakterienkulturen

Ampicillin: 100 mg/ml in A. tridest., Lagerung bei -20 °C.

IPTG: 100 mg/ml in A. tridest., Lagerung bei -20 °C.

X-Gal: 100 mg/ml in Dimethylformamid (DMF), Lagerung bei -20 °C.

LB-Medium

Jeweils 20 g LB-Trockenpulver wurden in 1 L A. tridest. gelöst und für 20 Min. bei 135°C

und 2,8 bar autoklaviert. Nach Abkühlung auf ~55°C erfolgte die Zugabe von Ampicillin in

einer Konzentration von 100 µg/mL. Das Medium wurde bei 4°C bis zu 1 Monat gelagert.


49

LB-Agar

Es wurden 32 g LB-Agar-Pulver in 1 L A. tridest gelöst und für 20 Min. bei 135°C und

2,8 bar autoklaviert. Nach Abkühlung auf ~55°C wurden 100 µg/mL Ampicillin,

80 µg/mL X-gal und 40 µg/mL IPTG zugegeben und das Gemisch unter sterilen Bedingungen

zu je 20 mL in Petrischalen gegossen. Anschließend wurden die Platten an einem sterilen

Arbeitsplatz für 15 Min. bei Raumtemperatur ausgehärtet. Die Agarplatten konnten für

1 Monat bei 4°C gelagert werden.

3.2.7 Plasmid für die Herstellung von Standardreihen

Für die Klonierung von Gensequenzen in chemisch kompetente Escherichia coli (E. coli)

wurde das im TOPO-Cloning-Kit enthaltene Plasmid pCR®2.1-TOPO® verwendet (Abb. 3).

Abb. 3 Plasmid für die Klonierung von Gensequenzen in E.coli zur Herstellung

von externen Standardreihen für die quantitative real time PCR. Schematisch dargestellt sind die Ligationsstelle für das PCR-Produkt, Antibiotika-Resistenzen und Schnittstellen für Restriktionsenzyme.


50

3.2.8 Primer

Die Oligonukleotid-Primer wurden aufgrund von bereits veröffentlichten Sequenzen

ausgewählt, oder im Fall von NKR1 selbst erstellt. Bezogen wurden alle Primer von der

Firma MGW aus Ebersberg. Die optimale Konzentration der Primer im StepOnePlus-PCR

System (3.1) wurde durch eine vom Hersteller beschriebene Primer-Optimierung (3.3.12.3)

ermittelt. Die Sequenzen der verwendeten Primer, die eingesetzte Konzentration sowie die

Länge des Amplikons und die Referenzen sind in Tab. 3 dargestellt.

Tab. 3: Primer-Sequenzen.

Gen Vorwärts- (for) und Rückwärts- (rev) Primer (5’ 3’) und Konzentrationen (nmol/L)

Länge des Amplikons Referenz

IL-1β for TTCTCTCCAGCCAACCTTCATT (300) rev ATCTGCAGCTGGATGTTTCCAT (300) 198 NEUVIANS et al.,

(2004)

TNF-α for CTTCTGCCTGCTGCACTTCG (300) rev GAGTTGATGTCGGCTACAACG (300) 156 YANG et al., (2008)

CXCL1 for CGCCTGTGGTCAACGAACT (300) rev CACCTTCACGCTCTGGATGTT (300) 83

TAUBERT und HERMOSILLA (2008)

CCL5 for CCTGCTGCTTTGCCTATATCT (300) rev AGCACTTGCTGCTGGTGTAG (300) 78 WIDDISON et al.

(2008)

CXCL8 for CCTCTTGTTCAATATGACTTCCA (300) rev GGCCCACTCTCAATAACTCTC (50) 170 YANG et al., (2008)

NKR1 for TGCCTTACATCAACCCTGATCTC (300) rev ACGGAACCTGTCGTTGAGAC (300) 131 selbst erstellt

Acc. no.a XM_607585

a Acc. No: Accession-Nummer der Nukleotid-Sequenz der NCBI Gen-Datenbank, welche für die Erzeugung der Primer benutzt wurde.


51

3.3 Methoden

3.3.1 Gewinnung einzelner Leukozytensubpopulationen des Blutes

Blutproben wurden durch Punktion der Vena jugularis unter sterilen Kautelen nach Stauung

des Gefäßes mit einer Staukette nach Witte (3.2.1) gewonnen. Eingesetzt wurde das

Vacutainersystem mit heparinisiertem (Natrium-Heparinat) Röhrchen.

Das Blut wurde im Verhältnis 1:2 mit PBS verdünnt und in 50 mL Röhrchen über

Lymphozytenseparationsmedium® (3.2.3) geschichtet. Die anschließende Zentrifugation

(30 Min., 4°C) wurde bei 1000 x g ohne Bremse durchgeführt.

Während dieser Zentrifugation trennten sich die einzelnen Zellpopulationen aufgrund ihrer

spezifischen Dichte auf. Zwischen dem Blutplasma und dem Lymphozyten-

separationsmedium befand sich die ‚Interphase‘ mit mononukleären Zellen (MNC; lymphoide

Zellen und Monozyten) sowie Anteilen der Thrombozytenfraktion. Unterhalb des

Lymphozytenseparationsmediums® lagen die gepackten Erythrozyten und die polymorph-

kernigen Granulozyten (PMN).

Gewinnung von mononukleären Zellen

Die Interphase wurde mit einer weitlumigen Pipette abgesaugt und in ein 50 mL

Zentrifugenröhrchen mit vorgelegtem PBS (10 mL) überführt. Nach Auffüllen mit PBS auf

30 mL schlossen sich drei Waschschritte an (je 10 Min., 4°C; 500 x g, 250 x g und 100 x g),

um die Thrombozyten weitestgehend zu entfernen. Nach dem ersten Waschschritt wurden

kontamierende Erythrozyten im Zellpellet durch hypotone Lyse entfernt: Nach Zugabe von

10 mL Aqua tridest. für 20 Sek. unter ständigem Schwenken wurden 10 mL 2-fach

konzentriertes PBS zugegeben. Zwischen den einzelnen Zentrifugationsschritten wurden die

Zellen durch Aufschütteln aus dem Pellet resuspendiert und in 40 mL PBS aufgenommen. Mit

dieser Methode konnten zwischen 1,5 und 3 x106 MNC/mL Vollblut gewonnen werden.

Gewinnung von Thrombozyten

Die Interphase wurde in 40 mL PBS aufgenommen und einmal zentrifugiert (10 Min., 4°C;

500 x g). Der thrombozytenreiche Überstand wurde in ein neues 50 mL Zentrifugenröhrchen


52

überführt und zweimal mit PBS gewaschen (10 Min., 4°C, 2500 x g). Anschließend wurde

das Zellpellet in Kulturmedium aufgenommen.

Gewinnung von Granulozyten

Das Plasma, die Interphase und das Lymphozytenseparationsmedium® wurden mit einer

weitlumigen Pipette abgesaugt und verworfen. Aus der verbleibenden Phase (Erythrozyten

und Granulozyten) wurden die Erythrozyten durch zweimalige hypotone Lyse entfernt: Nach

Zugabe von 20 mL Aqua tridest. für 20 Sek. unter ständigem Schwenken wurde 20 mL 2-fach

konzentriertes PBS zugegeben. Die Zellsuspension wurde für 10 Min. bei 500 x g bei 4°C

zentrifugiert, der Überstand dekantiert, die Zellpellets durch Rütteln der Röhrchen suspendiert

und nach Zugabe von 10 mL Aqua tridest. (nach 20 Sek. + 10 mL 2x konzentriertes PBS) ein

weiteres Mal hypoton lysiert. Die Zellen wurden zweimal mit 20 mL PBS bei 4°C für 10 Min.

gewaschen (250 x g, 100 x g). Das letzte Zellpellet wurde in Kulturmedium (I10F+)

aufgenommen, die Zellen gezählt und auf die gewünschte Konzentration eingestellt. Durch

dieses Verfahren konnten PMN-Populationen mit einer Reinheit von 90% bis 95% separiert

werden. Lag der Anteil kontaminierender MNC an den kernhaltigen Zellen bei >10%, wurde

die Zellsuspension nicht verwendet.

Gewinnung von Monozyten und Lymphozyten

Die Gewinnung von Monozyten und Lymphozyten aus mononukleären Zellen erfolgte über

die Positiv-Selektion von Monozyten anhand ihres CD14 Oberflächenmarkers in einem

magnetischen Separationssystem. Die nach der Dichtegradientenzentrifugation (s.o.)

gewonnenen mononukleären Zellen wurden in 5 mL PBS-EDTA (3.2.6) aufgenommen und

über einen 30 µm Nylonfilter (3.2.2) gegeben um Aggregate zu entfernen. Der Filter wurde

dreimal mit 5 mL PBS-EDTA gespült und die filtrierte Zellsuspension bei 100 x g und 4°C

für 10 Min. zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 400 µL PBS-EDTA resuspendiert und 8 µL

eines PE-konjugierten mouse-anti-human-CD14 Antikörpers (3.2.5) hinzugefügt. Nach einer

Inkubation für 30 Min. bei 4°C wurden die Zellen gewaschen (300 x g, 4°C, 10 Min.), um

ungebundenen Antikörper zu entfernen. Die Zellen wurden in 200 µL PBS-EDTA

aufgenommen. Ein Aliquot wurde 1:50 verdünnt und im Durchflusszytometer auf Reinheit,

Vitalität und das Vorhandensein einer CD14-positiven Population überprüft (Abb. 4, A und

B). Mittels Referenzzellverfahren (3.3.5) wurden die vitalen Zellen quantifiziert. Pro 1x107


53

Zellen wurden 80 µL PBS-EDTA und 20 µL goat-anti-mouse Micro Beads (3.2.3) zugegeben.

Nach der Inkubation (15 Min. bei 4°C) wurden die Zellen zentrifugiert (300 x g, 4°C,

10 Min.) und in 3 mL PBS-EDTA aufgenommen. Für die magnetische Separation der CD14-

positiven Zellen wurde eine MACS-Säule (3.2.2) in die Separationseinheit (3.1) eingespannt

und mit 3 mL PBS-EDTA gespült. Die Zellsuspension wurde nach und nach über die Säule

gegeben und der Durchfluss in einem 15 mL Röhrchen aufgefangen. Anschließend wurde die

Säule dreimal mit jeweils 3 mL PBS-EDTA gespült. Die Spülfraktion wurde in einem

gesonderten Gefäß aufgefangen. Zur Elution der in der Säule befindlichen CD14-positiven

Zellen wurde die Säule aus dem Magnetfeld entfernt und mit 5 mL PBS-EDTA eluiert. Die

erhaltenen Fraktionen Durchlauf und Eluat wurden am Durchflusszytometer auf Reinheit und

Vitalität überprüft (Abb. 4, C). Die im Durchlauf enthaltenen Lymphozyten erreichten eine

Reinheit von >90%. Sie wurden in nach einem Zentrifugationsschritt (300 x g und 4°C für

10 Min.) im Lyse-Puffer des RNaqueous Kits (3.2.3) für die mRNA-Extraktion aufgenommen

und für den Nachweis des NKR1 genutzt (3.3.12.1).

Die im Eluat enthaltenen Monozyten erreichten einen Reinheitsgrad von >96% (Abb. 4, D).

Die Monozyten wurden bei 300 x g und 4°C für 10 Min. zentrifugiert, in I10F+ (3.2.6)

aufgenommen und auf 2x105 Monozyten/mL eingestellt. Im weiteren Verlauf wurden die

Monozyten für die Generierung von Makrophagen (s.u.) genutzt oder nach einer 24-stündigen

Ruhephase für Stimulationsversuche mit LPS verwendet. Dabei wurde den Monozyten

Substanz P in den finalen Konzentrationen 1x10-6 mol/L, 1x10-8 mol/L, 1x10-10 mol/L und

1x10-12 mol/L zugesetzt. Diese Ansätze wurden entweder in Kombination mit LPS (1 µg/mL)

oder nur mit SP angelegt. Zusätzlich wurden eine Medium-Kontrolle und eine LPS-Kontrolle

angefertigt. Nach einer Inkubationszeit von drei Stunden bei 37°C und 5% CO2 wurden die

Zellen in Lyse-Puffer für die mRNA-Extraktion (3.3.12.1) aufgenommen.


54

0 256 512 768 10240

256

512

768

1024

010 110 210 310 4100

256

512

768

1024

14,88%14,88%

010 110 210 310 4100

256

512

768

1024

98,69%98,69%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024

Vorwärtsstreulicht (FSC)


Sei

twär

tsst

reul

icht

(SSC

)S

eitw

ärts

stre

ulic

ht (S

SC)

Sei

twär

tsst

reul

icht

(SSC

)S

eitw

ärts

stre

ulic

ht (S

SC)

Orangefluoreszenz (FL2)


A

DC

B

0 256 512 768 10240

256

512

768

1024

010 110 210 310 4100

256

512

768

1024

14,88%14,88%

010 110 210 310 4100

256

512

768

1024

98,69%98,69%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024



Sei

twär

tsst

reul

icht

(SSC

)S

eitw

ärts

stre

ulic

ht (S

SC)

Sei

twär

tsst

reul

icht

(SSC

)S

eitw

ärts

stre

ulic

ht (S

SC)



A

DC

B

Abb. 4: Magnet-aktivierte Zellseparation von bovinen Monozyten mit PE-konjugiertem Mouse-anti-human CD14. Durchflusszytometrische Darstellung von vitalen, bovinen MNC markiert mit Mouse-anti-Human-CD14 vor der magnetischen Separation (A, B) und von vitalen Monoyzten nach der Positiv-Anreicherung (C, D). Die Punktediagramme A und C zeigen die Morphologie der Zellen (FSC/SSC), die Punktediagramme B und D zeigen den Anteil CD14-positiver Zellen in der Orangefluoreszenz (FL2/SSC).

3.3.2 Generierung von Makrophagen aus Blutmonozyten in vitro

Makrophagen, die aus Blutmonozyten in vitro generiert wurden (bMdM, blood monocyte

derived macrophages), werden im Weiteren als „MdM“ bezeichnet. Die Blutmonozyten

wurden wie oben beschrieben separiert und in I10F+ (3.2.6) auf eine Zellzahl von 2x105

Monozyten/mL eingestellt. Die Monozyten wurden anschließend auf 24-well Platten (3.2.2)

zu je 2x105 Zellen pro Vertiefung ausgebracht. Die Reifung zu MdM fand über sieben Tage

bei 37°C und 5% CO2 statt. Nach drei Tagen wurden zu jedem Ansatz 500 µL frisches

Medium (I10F+) hinzugefügt, das zuvor auf 37°C vorgewärmt wurde. Die Zellen wurden im

Invertmikroskop auf Adhärenz und Kontamination überprüft. Kontaminierte Zellkulturen

wurden verworfen. Um einen Einfluss von Substanz P auf die Generierung von MdM zu

prüfen, wurde den Monozyten zu Beginn der Reifung und bei der Auffrischung des Mediums


55

SP in den finalen Konzentrationen 1x10-6 mol/L und 1x10-8 mol/L zugesetzt. Alle Ansätze

wurden in Duplikaten angelegt. Nach sieben Tagen wurden die MdM mit LPS (1 µg/mL)

stimuliert oder als Kontrolle belassen. Dabei wurde von jedem Duplikat ein Ansatz über drei

Stunden, der andere Ansatz über 24 Stunden bei 37°C und 5% CO2 stimuliert. Der 3-Stunden-

Ansatz diente zur Bestimmung der mRNA Expression ausgewählter Zytokine und

Chemokine, während von dem 24-Stunden-Ansatz die Zellkulturüberstände gewonnen

wurden, um deren Einfluss auf das Migrationsverhalten von PMN sowie auf Apoptose und

Nekrose zu untersuchen.

3.3.3 In-vitro-Stimulation von Monozyten und in vitro generierter

Makrophagen

Differenzierung von Makrophagen unter dem Einfluss von Substanz P

Um einen Einfluss von Substanz P auf die Generierung von MdM zu prüfen, wurde den

Monozyten zu Beginn der Reifung und bei der Auffrischung des Mediums SP in den finalen

Konzentrationen 1x10-6 mol/L und 1x10-8 mol/L zugesetzt. Alle Ansätze wurden in

Duplikaten angelegt.

Stimulation von Monozyten

MAC-separierte Monozyten wurden in Kulturmedium aufgenommen (2x105/mL) und in

Zellkulturplatten mit 24 Vertiefungen 24 h (37°C, 5% CO2) vorinkubiert (Ruhephase).

Danach wurden den Monozyten Substanz P in den finalen Konzentrationen 1x10-6 mol/L,

1x10-8 mol/L, 1x10-10 mol/L und 1x10-12 mol/L zugesetzt. Diese Ansätze wurden entweder in

Kombination mit LPS (1 µg/mL) oder nur mit SP angelegt. Parallelansätze enthielten keine

Zusätze (Medium-Kontrolle) oder nur LPS. Nach einer Inkubationszeit von drei Stunden bei

37°C und 5% CO2 wurden die Zellen in Lyse-Puffer für die mRNA-Extraktion (3.3.12.1)

aufgenommen.

In-vitro-Stimulation von Makrophagen

In-vitro-generierten Makrophagen wurde LPS (1 µg/mL) zugesetzt. Ein Ansatz wurde drei

Stunden inkubiert (er diente zur Bestimmung der mRNA-Expression ausgewählter Zytokine


56

und Chemokine, 3.3.12). Ein weiter Ansatz wurde 24 Stunden bei 37°C und 5% CO2

stimuliert. Danach wurde der Zellkulturüberstand gewonnen, um dessen Einfluss auf das

Migrationsverhalten von PMN (3.3.8) sowie auf die Apoptose (3.3.7) und Nekrose (3.3.5)

dieser Zellen zu untersuchen.

3.3.4 Durchflusszytometrie

Bei der Durchflusszytometrie werden Einzelzellen in einem Probenführungssystem an einem

Laserstrahl vorbei geleitet. Bei dem für diese Versuche verwendeten Durchflusszytometer

handelt es sich um ein FACScan®-Gerät (3.1) mit einem Argonlaser, der Licht einer

Wellenlänge von 488 nm erzeugt. Das Gerät erfasst mit entsprechenden Detektoren

Fluoreszenzlicht-Emissionen in drei verschiedenen Wellenlängenbereichen (FL-

1 = Grünfluoreszenz: 515-545 nm; FL-2 = Orangefluoreszenz: 564-606 nm; FL-

3 = Rotfluoreszenz: >650 nm). Gestreutes Licht wird zudem in Richtung des Strahls als so

genanntes Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter, FSC) oder im 90° Winkel dazu, als Seitwärts-

streulicht (Side Scatter, SSC), erfasst. Durch die Vorwärtsstreuung werden die Größe des

Partikels und dessen Refraktionsindex, durch die Seitwärtsstreuung die Komplexität

(Oberflächenbeschaffenheit und Granularität) charakterisiert (RADBRUCH 1992). Jedes

Messereignis wird damit durch fünf verschiedene Parameter (FSC, SSC, FL-1, FL-2, FL-3)

charakterisiert.

Mit Hilfe der Software „WinMDI Version 2.8“ erfolgte die computergestützte Auswertung

der Daten. Ergebnisse wurden mehrparametrisch als korrelierte Punkte- oder Dichte-

diagramme dargestellt. Da die Werte einzelner Parameter stark von den Einstellungen für

FSC, SSC und Fluoreszenzdetektoren abhängen, wurden nur solche Messungen miteinander

verglichen, die mit identischen Geräteeinstellungen erfasst wurden. Zur Definition einzelner

Untergruppen der Messereignisse („Events“) wurden nach der Messung softwaregestützt

elektronische „Fenster“ (sog. „Gates“) gesetzt und zum Teil mehrere Fenster logisch

miteinander verknüpft.


57

3.3.5 Quantifizierung vitaler Zellen mittels Referenzzellmethode

Ein Teil der in vitro eingesetzten Zellen stirbt im Laufe der Inkubation unter dem Einfluss der

Kulturbedingungen und der stimulierenden Signale ab. Daraus resultiert eine unbekannte Zahl

vitaler Zellen in der Suspension, die dadurch bestimmt werden kann, dass der Zellprobe eine

bekannte Anzahl von Zellen zugesetzt wird, die sich in mindestens einem Parameter von den

zu messenden Zellen unterscheidet, aber mit den gleichen Geräteeinstellungen am

Durchflusszytometer gemessen werden kann. Setzt man die Zahl der gemessenen, als

Referenzzellen identifizierten Events mit denen als vitale Zellen identifizierten gemessenen

Events ins Verhältnis, so kann auf den absoluten Gehalt vitaler Zellen geschlossen werden.

Herstellung von Referenzzellen

Zur Färbung wurden jeweils 2 x107 frisch separierte bovine mononukleäre Zellen des Blutes

in ein 15 mL Röhrchen gegeben und bei 80 x g für 5 Min. und 4°C zentrifugiert. Nach dem

Abgießen des Überstandes wurde das Zellpellet in 100 µL PBS resuspendiert und mit

demselben Volumen des unverdünnten monoklonalen Antikörpers Bo 1 (3.2.5) für 15 Min.

bei 4°C inkubiert. Anschließend erfolgte ein Waschschritt mit 5 mL MIF-Puffer (3.2.6.2) und

ein Zentrifugationsschritt (7 Min., 80 x g, 4°C). Der Überstand wurde verworfen und das

resuspendierte Zellpellet wurde mit 100 µL des 1:40 verdünnten FITC-konjugierten Ziege-

Anti-Maus Antikörpers (3.2.5) versetzt und 20 Min. unter Lichtabschluss bei 4°C inkubiert.

Nach einem weiteren Waschschritt wurden die Zellen in 50 mL PBS resuspendiert und erneut

zentrifugiert. Zur Fixierung wurden die Zellen in 30 mL einer 4%-igen Paraformaldehyd-

Lösung (3.2.6.3) resuspendiert. Nach einer Inkubation für 24 h bei 4°C unter Lichtabschluss

wurden sie für 15 Min. bei Raumtemperatur zentrifugiert, dekantiert und ein zweites Mal in

PBS gewaschen. Dieses nun gewonnene Zellpellet wurde in der PJ-haltigen Trägerflüssigkeit

aufgenommen (2 µg/mL PJ) und auf 4x105 Zellen/mL eingestellt. Die Konzentration wurde

vor Einsatz kontrolliert und gegebenenfalls korrigiert. Referenzzellen wurden durch ihre

Morphologie (mononukleäre Zellen) sowie ihre Rot- und Grünfluoreszenz charakterisiert

Quantifizierung vitaler Zellen am Durchflusszytometer

Die Inhalte einzelner Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit kultivierten Zellen wurden

vollständig entnommen und in ein Durchflusszytometerröhrchen überführt, in dem 100 µL


58

Trägerflüssigkeit mit PJ (4 µg/mL) vorgelegt war. Dazu wurden 50 µL einer Suspension mit

5x104 Referenzzellen pipettiert. Angestrebt wurde ein Verhältnis von Referenzzellen zu

Kulturzellen von ca. 1:1 bis 1:3. Waren höhere oder niedrigere Zahlen der Kulturzellen zu

erwarten, wurde die Zahl eingesetzter Referenzzellen entsprechend angepasst. Nach

durchflusszytometrischer Erfassung des Zellgemisches (10.000 Ereignisse) wurde die Zahl

der Ereignisse für Referenzzellen (FL1+/PJ+) und für vitale kultivierte Zellen (FL1-/PJ-)

erfasst. Beides erfolgte nach Setzen eines Fensters auf morphologisch identifizierbare Zellen

im FSC/SSC Punktediagramm. Die Absolutzahl vitaler Kulturzellen errechnete sich nach

folgender Formel:

Gemessene Ereignisse Kulturzellen x eingesetzte Zahl ReferenzzellenGemessene Ereignisse Referenzzellen

Anzahl Kulturzellen =Gemessene Ereignisse Kulturzellen x eingesetzte Zahl Referenzzellen

Gemessene Ereignisse Referenzzellen Anzahl Kulturzellen =

3.3.6 In-vitro Proliferationsmessung

Proliferierende mononukleäre Zellen nehmen vor der Teilung an Größe zu, und durch die

Veränderung im Plasma/Kern-Verhältnis steigert sich außerdem auch die Komplexität der

Zellen. Dadurch unterscheiden sich die Blasten bei durchflusszytometrischer Erfassung von

den kleineren, ruhenden Lymphozyten.

Testdurchführung

Die Proliferationsinduktion mononukleärer Zellen erfolgte durch die Stimulation mit dem

Superantigen SEA. Dazu wurden frisch separierte MNC in eine 96-well Rundbodenplatte zu

1x105 Zellen pro Vertiefung eingesetzt und mit SEA (1 ng/mL) stimuliert oder als

unstimulierte Kontrolle belassen. Parallele Ansätze enthielten Substanz P in den

Konzentrationen 1x10-8 mol/L, 1x10-10 mol/L und 1x10-12 mol/L. Die Zellen wurden bei 37°C

und 5% CO2 über 1, 2 oder 6 Tage inkubiert. Für die Messung am Durchflusszytometer

wurden die Zellen in ein FCS-Röhrchen überführt in das zuvor 100 µL Trägerflüssigkeit

(4 µg/mL PJ) und 50 µL Referenzzellen (3.3.5) pipettiert wurden.

Auswertung

Tote Zellen wurden durch das Setzen eines Fensters im FL-3/SSC Punktediagramm auf

Propidiumjodid-negative Ereignisse ausgeschlossen. Die morphologische Charakterisierung


59

der Zellen wurde im FSC/SSC Punktediagramm durchgeführt. Dazu wurde ein Fenster auf

kleinere, weniger komplexe Ereignisse gesetzt (ruhende Lymphozyten) und ein zweites

Fenster auf größere und komplexere Ereignisse (Blasten) gesetzt. Die Anzahl der beiden

Populationen wurde anhand der Referenzzellmethode (3.3.5) berechnet.

3.3.7 Bestimmung der Apoptose neutrophiler Granulozyten

Nachweis des intrinsischen Pfads der Apoptose mit JC-1

Die Bestimmung des Mitochondrienmembranpotentials (MMP) erfolgte mit dem Fluoro-

chrom 5,5',6,6'-Tetrachloro-1,1',3,3'-Tetraethylbenzimidazol-Carbocyanin Jodid (JC-1)

(FOSSATI et al. 2003). Bei JC-1 handelt es sich um ein metachromatisches Fluorochrom, das

durch seine Eigenschaft als lipophiles Kation durch die Membranen von vitalen Zellen

diffundieren kann. Das Kation aggregiert in funktionstüchtigen Mitochondrien vitaler Zellen,

da diese ein MMP von -180 mV bis -200 mV aufweisen. Nach Anregung mit Licht einer

Wellenlänge von 488 nm emittiert dieser Farbstoff Licht mit einer Wellenlänge von 590 nm

und kann somit im Durchflusszytometer in dem Detektor für oranges Licht (FL2-Detektor)

erfasst werden. Fällt das MMP einer Zelle in Folge von Apoptose über den intrinsischen Pfad

auf Werte unter -80 mV bis -100 mV ab, diffundieren die Aggregate von JC-1 in das

Zytoplasma und gehen dort in die monomere Form über. Es verändert sich folglich die

Wellenlänge des emittierten Lichtes auf 527 nm und wird somit von dem FL-1 Detektor für

grünes Licht erfasst. Zur Vereinfachung der Nomenklatur werden Zellen, deren MMP

depolarisiert ist, in den folgenden Ausführungen apoptotische Zellen genannt. Es sei darauf

hingewiesen, dass es sich hierbei um den intrinsischen Pfad der Apoptose handelt.

Testdurchführung

Mit der JC-1-Färbung sollte geprüft werden, ob Überstände aus MdM-Zellkulturen (3.3.1) die

Apoptose von neutrophilen Granulozyten beeinflussen. Dazu wurden bovine PMN wie unter

3.3.1 beschrieben separiert und in I0F+ resuspendiert (6x106 Zellen pro/mL). Die MdM-

Zellkulturüberstände in I10F+ wurden 1:2 mit I0F+ verdünnt, so dass in der Stocklösung der

Überstände fetales Kälberserum in einer Konzentration von 5% vorlag. Anschließend wurden

50 µL der verdünnten Überstände pro Vertiefung der 96-well-Zellkulturplatte vorgelegt. Von


60

der Zellsuspension wurden pro Vertiefung jeweils 50 µL eingesetzt. Durch die wiederholte

Verdünnung der Überstände mit der Zellsuspension entsprach die finale Konzentration von

fetalem Kälberserum 2,5%. Zur Kontrolle wurden Zellen in Iscove-Medium mit 2,5% FCS

angesetzt. Nach einer Inkubation von 24 h bei 37°C und 5% CO2 wurde die JC-1-Färbung

durchgeführt. Zunächst wurden die Zellkulturplatten zentrifugiert (250 x g, 20°C, 4 Min.) und

die Überstande abgeschlagen. Die Zellen wurden in 100 µL PBS resuspendiert und abermals

zentrifugiert (250 x g, 20°C, 4 Min.) und die Überstande abgeschlagen. Nach dem

Resuspendieren in der Restflüssigkeit wurden 100 µL JC-1-Lösung in einer Konzentration

von 7 µmol/L zu den Zellen gegeben und 15 Min. bei 37°C inkubiert. Nach zweimaligem

Waschen wurden die Zellen in 200 µL Trägerflüssigkeit (2 µg/mL PJ) aufgenommen, in

FCM-Röhrchen überführt und durchflusszytometrisch erfasst (10.000 Ereignisse). Alle

Ansätze erfolgten in Triplikaten.

Auswertung

Bei der Erhebung der Daten wurde in der Darstellung Seitwärtsstreulicht (SSC) gegen

Vorwärtsstreulicht (FSC) ein Fenster auf neutrophile Granulozyten (Abb. 5, A) und im

FL3/SSC Punktediagramm ein zweites Fenster auf PJ-negative Ereignisse gesetzt. Durch eine

Verknüpfung der beiden Fenster wurden für die Auswertung nekrotische Zellen

ausgeschlossen und nur PMN erfasst. Die nicht nekrotischen neutrophilen Granulozyten

wurden in einem Dichtediagramm Grünfluoreszenz (FL1) gegen Rotfluoreszenz (FL3)

dargestellt. Für die Auswertung wurden 3 Zustände unter den vitalen Zellen unterschieden:

vitale, nicht apoptotische Zellen im linken unteren Quadranten (Abb. 5, C, 1), apoptotische

Zellen, deren MMP depolarisiert ist und die somit nach JC-1-Färbung im linken oberen

Quadranten erscheinen (Abb. 5, C, 2) und intermediäre Zellen in den beiden rechten

Quadranten (Abb. 5, C, 3). Die Membran von intermediären Zellen ist in ihrer Integrität

gestört. Somit kann PJ in die Zelle eindringen und die JC-1-Molküle können aus dem Zytosol

in den extrazellulären Raum entweichen. Folglich ist die Grünfluoreszenz herabgesetzt.

Außerdem kann der Anteil der nekrotischen Zellen von der Gesamtheit der Kulturzellen

ermittelt werden (Abb. 5, B).


61

010 110 210 310 4100

256

512

768

1024

Rotfluoreszenz (FL3)

Sei

twär

tsst

reul

icht

(FS

C)

010 110 210 310 410

010

110

210

310

410

2

1

3


Grü

nflu

ores

zenz

(FL1

)

0 256 512 768 10240

256

512

768

1024


Sei

twär

tsst

reul

icht

(FS

C)

A

C

B

010 110 210 310 4100

256

512

768

1024


Sei

twär

tsst

reul

icht

(FS

C)

010 110 210 310 4100

256

512

768

1024


Sei

twär

tsst

reul

icht

(FS

C)

010 110 210 310 410

010

110

210

310

410

2

1

3


Grü

nflu

ores

zenz

(FL1

)

0 256 512 768 10240

256

512

768

1024


Sei

twär

tsst

reul

icht

(FS

C)

A

C

B

010 110 210 310 410

010

110

210

310

410

2

1

3


Grü

nflu

ores

zenz

(FL1

)

010 110 210 310 410

010

110

210

310

410

2

1

3

010 110 210 310 410

010

110

210

310

410

2

1

3


Grü

nflu

ores

zenz

(FL1

)

0 256 512 768 10240

256

512

768

1024


Sei

twär

tsst

reul

icht

(FS

C)

0 256 512 768 10240

256

512

768

1024


Sei

twär

tsst

reul

icht

(FS

C)

A

C

B

Abb. 5: Darstellung und Auswertung der JC-1-Färbung von bovinen PMN. Bovine PMN (24 h Kultur) wurden nach JC-1-Färbung durchflusszytometrisch erfasst (A und B Punktediagramm, C Dichtediagramm, jeweils 10.000 Ereignisse). A) Fenster auf morphologisch als PMN identifizierte Ereignisse; B) Fenster auf PJ-negative, vitale PMN; C) vitale PMN dargestellt in Rot- gegen Grünfluoreszenz (1 vitale Zellen, 2 apoptotische Zellen, 3 intermediäre Zellen).

3.3.8 In-vitro-Migration neutrophiler Granulozyten

Prinzip der Transmigrationskammer

Die 10-Well-Transmigrationskammer (3.1) besteht aus einer Acrylbodenplatte

(50 x 101 x 11mm), einer Acryldeckplatte (50 x 101 x 6 mm), einer Silikondichtungsmatte

und sechs Schraubenmuttern. In die Bodenplatte sind zehn Rundboden-Vertiefungen mit

einem Volumen von 415 µL eingelassenen. Sie korrespondieren mit den durchgehenden

Bohrungen der Deckplatte. Beim Zusammenbau werden die Kompartimente der Boden- und

der Deckplatte durch eine zwischengelegte Polycarbonatmembran (3.2.2) getrennt, die somit


62

den Boden für die Vertiefungen der Deckplatte bildet. Die entsprechend den Bohrungen der

Acrylplatten mit Löchern ausgestattete Silikonmatte wird zwischen den beiden Platten

platziert und dient der Abdichtung. In der Bodenplatte sind sechs Gewindestangen verankert,

die beim Zusammenlegen durch entsprechende Einsparungen der Silikonmatte und der

Deckplatte führen. Mit Hilfe der Schraubenmuttern werden die beiden Acrylplatten mäßig

fest aneinander gepresst. Die Polycarbonatmembran ist 25 x 80 mm groß und etwa 10 µm

dick. Bei einer Porengröße von 3 µm befinden sich 2 x 106 Poren auf einem

Quadratzentimeter der Membran. Die Membran weist eine glänzende, weniger adhärente und

eine matte, stärker adhärente Seite auf.

Testdurchführung

In die Vertiefungen des unteren Kammerteils wurden 315 µL Medium RPMI 1640 (3.2.3)

gegeben. Diese Flüssigkeit wurde mit 100 µL 100%-tigem isotonem Percoll® (3.2.3)

unterschichtet. Dadurch sollte die Adhärenz der gewanderten Zellen am Boden der

Vertiefungen vermindert werden. Die zehn Vertiefungen des unteren Kammerteils wurden

nun mit einer Polycarbonatmembran bedeckt. Durch ein exaktes Einhalten des

Flüssigkeitsvolumens von 415 µL in der unteren Vertiefung, wurde die Bildung von

Luftblasen unter der Membran vermieden. Auf die Membran wurde die Silikondichtung und

darüber der obere Kammerteil platziert und mittels Schraubenmuttern fixiert. In die

Vertiefungen des oberen Kammerteils wurden abschließend jeweils 200 µL Zellsuspension

(2x106 Gesamtleukozyten oder PMN) gegeben, je nach Versuchsaufbau mit entsprechenden

Zusätzen (s. u.). Die Inkubation der Kammern erfolgte bei 37°C und 5% CO2 über 1 oder 2

Stunden.

Nach der Inkubation wurden die Zellsuspensionen der oberen Vertiefungen (= nicht

gewanderte Zellen) komplett abpipettiert und zur durchflusszytometrischen Erfassung in

Durchflusszytometer-Röhrchen überführt, in denen 100 µL Trägerflüssigkeit und 50 µL

Referenzzellen (3.3.5) vorgelegt waren. Nach Entfernung der Schraubenmuttern wurde der

obere Teil der Kammer waagerecht abgehoben, wobei sich Silikonmatte und Membran

gleichzeitig ablösten. Nach guter Durchmischung der Zellsuspension des unteren

Kompartiments wurde auch diese in Durchflusszytometer-Röhrchen mit Trägerflüssigkeit und

Referenzzellen überführt.


63

Auswertung

Zellen aus den oberen und den unteren Kompartimenten wurden durchflusszytometrisch mit

der Referenzzellmethode (3.3.5) quantifiziert. Aus diesen Werten errechnete sich die

Migrationsrate nach folgender Formel:

Zellen aus der oberen Kammer + Zellen aus der unteren Kammer Migrationsrate % =

Zellen aus der unteren Kammerx 100

Zellen aus der oberen Kammer + Zellen aus der unteren Kammer Migrationsrate % =

Zellen aus der unteren Kammerx 100

Chemotaktische Wirkung von Substanz P

In die Vertiefungen des unteren Kammerteils wurde entweder Substanz P (1x10-8 mol/L und

1x10-7 mol/L) oder rhCXCL8 (rekombinantes humanes CXCL8, 0,1 µg/mL) (3.2.3) gegeben.

In die Vertiefungen des oberen Kammerteils wurden Leukozyten gegeben.

Beeinflussung der CXCL8-induzierten Migration durch Substanz P

In den unteren Kompartimenten befand sich rhCXCL8 (0,1 µg/mL) (3.2.3) oder Medium

(RPMI 1640) als Kontrolle der Spontanmigration. Den Leukozyten in den oberen

Kompartimenten wurde Substanz P (2x10-8 mol/L und 2x10-7 mol/L) zugesetzt

Transmigrationstest mit Makrophagen-Zellkulturüberständen

Für diese Ansätze wurden die Zellkulturüberstände von Makrophagen, die 10% fetales

Kälberserum enthielten, initial im Verhältnis 1:4 mit Medium ohne Serum (I0+) verdünnt, um

eine durch Serumproteine verursachte Spontanmigration zu reduzieren. Die verdünnten

Überstände, die in Ab- oder Anwesenheit von Substanz P und mit oder ohne LPS-Stimulation

generiert wurden (3.3.3), wurden in die unteren Vertiefungen der Kammer pipettiert. Medium

mit einer Konzentration von 2.5% Kälberserum (I2,5F+) diente als Negativ-Kontrolle. In die

oberen Kompartimente wurden PMN eingesetzt.


64

3.3.9 Intrazelluläre Calciummessung

Prinzip der Calciummessung mit Fura Red und Fluo 4

Um den transienten Anstieg von Calcium-Ionen im Zellinneren zu erfassen, wurden die

beiden Calcium-sensitiven Fluorochrome Fura Red und Fluo 4 (3.2.3) verwendet. Es handelt

sich bei den beiden Farbstoffen um Acetoxymethylester-Derivate, die zunächst an

Carboxylgruppen gekoppelt in ungeladener Form vorliegen und so die Zellmembran

durchdringen können. Im Zellinneren werden sie von unspezifischen Esterasen gespalten und

verbleiben so als geladenes Molekül in der Zelle. Nach der Hydrolyse sind die Fluorochrome

in der Lage Calcium-Ionen zu binden, wodurch ihre Fluoreszenzintensität beeinflusst wird.

Eine Bindung von Calcium-Ionen bewirkt bei Fura Red ein Absinken, bei Fluo 4 hingegen

einen Anstieg der Fluoreszenzintensität. Bei einer Anregung mit Licht der Wellenlänge

488 nm liegt das Emmissionsspektrum von Fura Red bei 665-685 nm, das von Fluo 4 bei 515-

535 nm. Am Durchflusszytometer kann Fura Red somit in der Rotfluoreszenz (Kanal FL3)

und Fluo 4 in der Grünfluoreszenz (Kanal FL1) erfasst und in einer Doppelfluoreszenz der

beiden Kanäle dargestellt werden. Da der Calcium-Influx ein transientes und außerdem

temperaturabhängiges Ereignis ist, muss die Messung unmittelbar nach Stimulus-Zugabe

erfolgen, und die Probe bei einer Temperatur von 37°C gehalten werden.

Testdurchführung

Jeweils 50 µg der beiden Fluorochrome wurden in je 5 µL reinem Dimethylsulfoxid (3.2.3)

gelöst und mit 95 µL fetalem Kälberserum versetzt. Die frisch separierten bovinen

Gesamtleukozyten (3.3.1) wurden in HBSS (3.2.6) mit einer Konzentration von 5x106

Zellen/mL aufgenommen. Um eine Beeinträchtigung der Fluorochrome zu vermeiden, wurde

HBSS ohne den Zusatz von Phenolrot verwendet. Zu 1 mL Zellsuspension wurden 22 µL

Fura Red-Lösung und 2 µL Fluo-4-Lösung gegeben und für 30 Min. bei 37°C inkubiert. Das

entspricht einer Konzentration von 10 µmol/L Fura Red und 1 µmol/L Fluo 4 pro Milliliter

Zellsuspension. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen bei 180 x g für 6 Min.

zentrifugiert und erneut in HBSS aufgenommen. Die Fluorochrom-beladenen Zellen wurden

bis zum Versuchsbeginn bei Raumtemperatur aufbewahrt. Die Messung des Calcium-Influx

wurde am Durchfluszytometer durchfgeführt. Dazu wurden in FCS-Röhrchen pro Messansatz


65

jeweils 100 µL Trägerflüssigkeit (3.2.3) vorgelegt und 175 µL mit Fluorochrom beladene

Zellsuspension hinzugefügt. Die Zellen in den FCS-Röhrchen wurden im Wasserbad bei einer

Temperatur von 37°C gehalten. Zu Beginn einer Messung wurde zu der Zellsuspension im

FCS-Röhrchen 20 µL des entsprechenden Zusatzes (s.u.) zugegeben, der Inhalt mittels

Vortexer gemischt und sofort die Fluoreszenz erfasst. Um den Grundzustand der

Zellaktivierung festzulegen, wurde zu jeweils einer Probe 20 µL Medium zugegeben. Der

maximale Calcium-Einstrom wurde durch die Zugabe des Ionophors Ionomycin in einer

finalen Konzentration von 1 mg/mL bestimmt. Rekombinantes humanes CXCL8 (3.2.3)

wurde als physiologischer Stimulus für PMN in der finalen Konzentration 1 nmol/L

eingesetzt. Substanz P wurde in einer finalen Konzentration von 3 µmol/L eingesetzt. Um

einen vorbereitenden Effekt des Neuromediators auf die Zelle zu überprüfen, wurde je ein

Messansatz drei Minuten mit Substanz P vorinkubiert und dann mit CXCL8 stimuliert. Zur

Beobachtung des transienten Verlaufs des Calcium-Influx wurden von jedem Ansatz drei

aufeinander folgende Messungen über jeweils 15 Sekunden durchgeführt, so dass der

Calcium-Einstrom pro Ansatz über 45 Sekunden erfasst wurde. Alle Ansätze wurden in

Duplikaten angelegt. Nach jeder Probe wurde das Durchflusszytometer eine Minute mit Aqua

tridest. und eine Minute mit Trägerflüssigkeit gespült, um eine Beeinflussung der

nachfolgenden Probe zu vermeiden.

Auswertung

Die Messungen einer Versuchsreihe wurden immer mit denselben Geräteeinstellungen

durchgeführt. Zur Beurteilung der Zellmorphologie wurde die Darstellung Vorwärts- gegen

Seitwärtssteulicht gewählt, dabei wurde ein Fenster auf die PMN gesetzt. Die PMN wurden

zur Auswertung des intrazellulären Calcium-Einstroms in einer Doppelfluoreszenz FL3/FL1

dargestellt. In der FL3 Fluoreszenz wurde Fura Red erfasst, im FL1-Kanal Fluo 4. Bei einem

geringen intrazellulären Calciumgehalt, d.h. einer starken Fura Red-Fluoreszenz und einer

vergleichsweise geringen Fluo 4-Fluoreszenz, lagen die Zellen in dieser Darstellung im linken

oberen Quadranten, während bei einem Anstieg der Calciumkonzentration (Absinken der

Fura Red- und Anstieg der Fluo 4-Fluoreszenz) eine Verschiebung in Richtung des unteren

rechten Quadranten stattfand (Abb. 6). Der Anteil der Zellen im unteren rechten Quadranten

wurde als aktivierte Zellen erfasst.


66

Fluo 4

0 256 512 768 10240

256

512

768

1024

68,57%68,57%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024

37,98%37,98%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024

53,45%53,45%

0 256 512 768 10240

256

512

768

1024

10,98%10,98%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024

11,78%11,78%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024

11,72%11,72%

0 256 512 768 10240

256

512

768

1024

95,49%95,49%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024

95,69%95,69%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024

95,64%95,64%

A)

B)

C)

Messung 1 Messung 2 Messung 3Fu

ra R

ed

Fluo 4Fluo 4

0 256 512 768 10240

256

512

768

1024

68,57%68,57%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024

37,98%37,98%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024

53,45%53,45%

0 256 512 768 10240

256

512

768

1024

10,98%10,98%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024

11,78%11,78%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024

11,72%11,72%

0 256 512 768 10240

256

512

768

1024

95,49%95,49%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024

95,69%95,69%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024

95,64%95,64%

A)

B)

C)

Messung 1 Messung 2 Messung 3

0 256 512 768 10240

256

512

768

1024

68,57%68,57%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024

37,98%37,98%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024

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0 256 512 768 10240

256

512

768

1024

10,98%10,98%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024

11,78%11,78%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024

11,72%11,72%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024

10,98%10,98%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024

11,78%11,78%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024

11,72%11,72%

0 256 512 768 10240

256

512

768

1024

95,49%95,49%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024

95,69%95,69%0 256 512 768 1024

0

256

512

768

1024

95,64%95,64%

A)

B)

C)

Messung 1 Messung 2 Messung 3Fu

ra R

ed

Abb. 6: Durchflusszytometrische Analyse des intrazellulären Calciumgehaltes boviner PMN. Bovine PMN wurden mit den beiden Fluorochromen Fura Red und Fluo 4 beladen. Korrelierte Darstellung der Fluo-4- und Fura-Red-Fluoreszenz nach Zugabe von Medium (A), Ionomycin (1 mg/mL) (B) oder CXCL8 (1 nmol/L) (C); 3 Messungen wurden im Abstand von 15 Sek. durchgeführt (10.000 Ereignisse). Im rechten unteren Quadranten ist der Anteil aktivierter Zellen angegeben.

3.3.10 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF)

Mit der indirekten Membranimmunfluoreszenz wurde der Nachweis exprimierter

Oberflächenstrukturen auf Zellen durchgeführt. Hierbei binden spezifische Antikörper an

Strukturen, die ihrerseits von einem zweiten, Fluorochrom-markierten Antikörper erkannt

werden. In der vorliegenden Arbeit wurden MNC anhand der Oberflächenmoleküle CD4 und

CD8 charakterisiert und ihr Anteil unter Einfluss von SP bestimmt. Dazu wurden pro


67

Vertiefung einer 96-Well-Rundbodenmikrotiterplatte 2x105 Zellen frisch separierter Zellen

pipettiert und Substanz P (1x10-12 mol/L, 1x10-10 mol/L und 1x10-8 mol/L) hinzugefügt. Die

Zellen wurden entweder mit dem Superantigen SEA (1 ng/mL) stimuliert oder unstimuliert

belassen, und über 5 Tage bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Alle Ansätze erfolgten in

Triplikaten. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen zentrifugiert (200 x g; 4 Min., 4°C)

und die Überstände dekantiert. Anschließend wurden die Zellen in 175 µL MIF-Puffer

(3.2.6.2) gewaschen: Resuspension, Zentrifugation, Abschlagen der Überstände,

Resuspension des Bodensatzes. Nach Zugabe von 25 µL des verdünnten spezifischen

primären Antikörpers (3.2.5) erfolgte eine 20-minütige Inkubation bei 4°C. Danach wurden

die Zellen zweimal mit 175 µL MIF-Puffer gewaschen, mit 25 µL des sekundären FITC-

konjugierten Ziege-anti-Maus-Antikörpers (3.2.5) versetzt und unter Lichtabschluss bei 4°C

für 20 Min. inkubiert. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen in 150 µL

Trägerflüssigkeit (2 µg/mL PJ) aufgenommen, in FCM-Röhrchen überführt und

durchflusszytometrisch erfasst. In der Auswertung wurde der Anteil FITC-positiver, vitaler

Zellen bestimmt. Um unspezifische Bindungen des primären und sekundären Antikörpers

ausschließen zu können, wurden sowohl Konjugat- als auch Isotypkontrollen durchgeführt,

bei denen den Zellen an Stelle des spezifischen Primärantikörpers 25 µL MIF-Puffer bzw. ein

irrelevanter monoklonaler Antikörper des selben Isotyps wie der spezifische Primärantikörper

zugesetzt wurde.

3.3.11 Analyse der Thrombozyten-Granulozyten-Aggregation

Die Aggregatbildung von PMN und Thrombozyten wurde mittels Phasenkontrast- und

Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Dazu wurde aus frisch separierten PMN und

Thrombozyten (3.3.1) eine Zellsuspension hergestellt, in der Thrombozyten und PMN im

Verhältnis 10:1 vorlagen. Jeweils 100 µL der Suspension wurde in Polysterolröhrchen mit

Medium, LPS (5 µg/mL) oder Substanz P (1x10-6 mol/L) über 1 h bei 37°C inkubiert. Um

aktivierte Thrombozyten nachzuweisen, wurde den Ansätzen ein Fluorochrom-markierter

Antikörper gegen P-Selektin (CD62P, 3.2.5) zugesetzt. In Kontrollansätzen wurden PMN in

Abwesenheit von Thrombozyten mit LPS oder Substanz P inkubiert. Nach der Inkubation

wurden 10 µL der Zellsuspension auf einen Objektträger gegeben und mit einem Deckglas

versehen. Mit der am Mikroskop angeschlossenen Digitalkamera wurden Aufnahmen der


68

Zellen jeweils in 100-facher Vergrößerung im Phasenkontrast und in 400-facher

Vergrößerung in Phasenkontrast und mit einem Filter für Grünfluoreszenz erstellt.

3.3.12 Molekularbiologische Verfahren

3.3.12.1 Aufbereitung von mRNA aus bovinen Leukozyten für die real time PCR

Separierte oder in-vitro-kultivierte Zellen wurden im Lyse-Puffer des RNAqueous®-Kit

(3.2.3) aufgenommen und bis zur weiteren Verarbeitung bei -95°C gelagert. Zusätzlich

wurden PMN und Lymphozyten auf das Vorkommen von Gentranskripten des NKR1

untersucht. Dabei wurde die RNA aus den Zell-Lysaten über ein System aus Wasch- und

Trennsäulen aufgereinigt. Alle Arbeitsschritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die

Überstände der Zellkulturen wurden zunächst mit einer Pipette vollständig abgenommen und

in jede Vertiefung 500 µL Lyse-Puffer pipettiert. Nach mehrmaligem Auf- und Abpipettieren

wurde der Inhalt der Vertiefung in ein steriles 1,5 mL Eppendorf-Gefäß (3.2.2) überführt. Zu

dem Zell-Lysat wurde nun das equivalente Volumen an 64%igem Ethanol in das 1,5 mL

Eppendorf-Gefäß gegeben und der Inhalt durch Schwenken gemischt. Anschließend wurde

das Gemisch auf das im Kit enthaltene Filter-System gegeben und für 1 Min. bei 16000 x g

zentrifugiert. Dabei wurden selektiv RNA-Moleküle mit einer Länge von über 200 Basen an

der Glasfiber-Membran der Filters adsorbiert, während Proteine und Salze den Filter

passierten und in das darunter befindliche Sammelröhrchen gelangten. Das beigemengte

Ethanol begünstigte diesen Vorgang. Um kontaminierendes Material aus dem Filter zu

entfernen, wurde dieser mit den im Kit enthaltenen Waschlösungen dreimal gewaschen.

Dabei wurden jeweils 700 µL der Waschlösung # 1 und zweimal 500 µL der Waschlösung

# 2/3 über das Filter-System gegeben und jeweils für 1 Min. bei 16000 x g zentrifugiert. Der

bei den einzelnen Schritten erzeugte Durchfluss wurde nach jeder Zentrifugation verworfen.

Nach dem letzten Wasch-Schritt wurde das Filter-System einmal leer zentrifugiert, um

Ethanol-haltige Rückstände der Waschlösungen vollständig zu entfernen. Zum Schluss wurde

das Filter-System in ein neues 2 mL Sammelröhrchen eingebracht und die im Filter

befindliche RNA mittels Elution in zwei Schritten gewonnen. Dazu wurden 50 µL Elutions-

Lösung, welche zuvor auf 80°C erhitzt wurde, direkt auf die Glasfiber-Membran pipettiert.

Daran schloss sich ein Zentrifugationsschritt für 30 Sek. bei 16000 x g an. Mit einer Menge


69

von 30 µL Elutions-Lösung wurde dieser Schritt wiederholt. Die so gewonnene Gesamt-RNA

wurde direkt nach der letzten Zentrifugation auf Eis gelagert. Die Reinheit und Konzentration

der gewonnenen RNA wurde im Eppendorf Biophotometer (3.1) über die Extinktion bei

260 nm und 280 nm ermittelt. Zur Messung im Photometer wurden die Proben 1:50 in TE-

Puffer (3.2.6.5) verdünnt und in UltraVetten (8,5 mm) (3.2.2) pipettiert. Die Reinheit der

cDNA-Proben wurde über den Quotienten der optischen Dichte bei 260 nm und 280 nm

beurteilt. Als akzeptabel galten Quotienten von 1,9 bis 2,1. Niedrigere Quotienten wiesen auf

eine Verunreinigung mit Proteinen hin. Die Konzentration (C) in µg/mL wurde anhand der

optischen Dichte bei 260 nm (OD260) nach folgender Formel berechnet:

C[µg/ml] = OD260 x 50 Nach der Beurteilung der Reinheit und der Bestimmung der Konzentration wurden die Proben

einheitlich auf 50 ng Gesamt-RNA pro µL eingestellt. Anschließend wurde die RNA

entweder sofort in cDNA umgeschrieben oder bei -95°C gelagert.

Synthese von cDNA durch Reverse Transkription

In der Reversen-Transkriptase-Reaktion wurde die aus den Zellen gewonnene RNA durch das

Enzym Superscript™ II Reverse Transcriptase (3.2.3) in komplementäre cDNA

umgeschrieben. Um ausschließlich die für die Genexpressionsanalyse relevante mRNA in

cDNA umzuschreiben, wurden Oligo–(dt)12-18–Primer (3.2.3) verwendet, die sich an das Poly-

A-Ende der mRNA Moleküle anlagerten und damit als Startregion für die Reverse

Transkriptase dienten. In einem 200 µL Reaktionsgefäß (3.2.2) wurden 10 µL der RNA,

1 µL Oligo-(dt)12-18-Primern und 1 µL Trinukleotiden gemischt. Die Komponenten wurden

für 5 Min. bei 65°C im Biometra T-Gradient (3.1) zum Auffalten von Sekundärstrukturen der

RNA inkubiert. Im Anschluss daran wurden die Proben sofort auf Eis gestellt und jeweils

7 µL des in der Zwischenzeit hergestellten Mastermix (Tab. 4) hinzugefügt. Es folgte eine

zweite Inkubation bei 42°C für 2 Min., um das Temperaturoptimum für die Reverse

Transkriptase zu erreichen. Durch Zugabe von 1 µL (200 U) SuperScriptTM II Reverse

Transkriptase in den Reaktionsansatz und nachfolgender Inkubation bei 42°C für 50 Min.

erfolgte die Reverse-Transkriptase-Reaktion. Zum Stoppen der Reaktion und um eine

Interaktion der bei der Umschreibung verwendeten Enzyme mit denen der nachfolgenden

PCR zu vermeiden, wurde abschließend eine Enzym-Denaturierung bei 70°C für 15 Min.


70

durchgeführt. Die so gewonnene einzelsträngige cDNA konnte für 14 Tage im Kühlschrank

oder für mehrere Monate bei -20°C gelagert werden.

Tab. 4: Mastermix für die Umschreibung von mRNA in cDNA.

Reagenz Volumen Endkonzentration

5 x First-Strand-Buffer (250 mmol/L Tris-HCl, 375 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl2)

4,0 µL

RNase Inhibitor (RNaseOUTTM ) 1,0 µL 40 IU

Reduktionsmittel (DTT, Dithiothriol) 2,0 µL 0,1 mol/L

3.3.12.2 Herstellung externer Standardreihen für die real time PCR

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Genexpression durch eine absolute Quantifizierung der in

der quantitativen real time PCR (3.3.12.3) gemessenen Produkte vorgenommen. Dazu wurde

von jeder Zielsequenz ein externer Standard, ein so genanntes Messplasmid hergestellt. Es

wurden Genabschnitte der jeweiligen Zielkomponenten mit spezifischen Primern amplifiziert

und in einen Vektor (3.2.7) kloniert. Mit dem rekombinanten Plasmid wurde ein chemisch

kompetenter E.coli-Stamm transformiert, in dem das Plasmid vervielfältigt wurde. Nach

Extraktion aus den Bakterien wurden Länge und Sequenz des klonierten Genabschnitts

verifiziert. Standardreihen der linearisierten Messplasmide wurden parallel zu den Proben in

der qrtPCR gemessen und zur Berechnung der Kopienzahl der jeweiligen Gene herangezogen.

Gewinnung der Zielsequenzen

Die für die Klonierung erforderlichen Sequenzen der zu untersuchenden Komponenten

wurden aus der cDNA boviner Zellen erhalten. Dazu wurden bovine mononukleäre Zellen

(MNC) und bovine MdM wie in (3.3.1) beschrieben isoliert und kultiviert. Die Produktion

von Zytokinen und Chemokinen wurde durch die Stimulation der Zellen mit

Lipopolysaccharid (LPS, 1 µg/mL) und Staphylokokken Enterotoxin A (SEA, 1 ng/mL)

(3.2.3) angeregt. Die RNA der Zellen wurde wie unter (3.3.12) beschrieben extrahiert und in

cDNA umgeschrieben.


71

Amplifikation der cDNA mittels konventioneller rtPCR

Die Amplifikation der Zielsequenzen für die nachfolgende Klonierung erfolgte mittels

konventioneller PCR in einem Biometra T-Gradient Gerät (3.1). Für jede Zielsequenz wurde

eine PCR-Reaktion mit 5 µL cDNA und dem in Tab. 5 dargestellten Mastermix in einem

sterilen 200 µL PCR-Röhrchen angesetzt. Zu Beginn der PCR wurde die cDNA für 3 Min. bei

94°C vollständig denaturiert. Danach erfolgten 30 Zyklen, die sich aus einem

Denaturierungsschritt für 45 Sek. bei 94°C, der Primer-Anlagerung für 30 Sek. bei 58°C und

der Verlängerung des Produkts für 1 Min. 30 Sek. bei 72°C zusammensetzten. Abschließend

erfolgte die finale Extension für 10 Min. bei 72°C, um sicherzustellen, dass der für die

nachfolgende Klonierung erforderliche Adeninüberhang am 3`Ende des Amplikons durch die

Taq-Polymerase synthetisiert wird. Die Proben wurden unmittelbar nach Ablauf der PCR für

die Klonierung verwendet.

Tab. 5: Mastermix für Biometra T-Gradient

Reagenz Volumen Endkonzentration

10x PCR Rxn Puffer minus MgCl2

5 µL 1x

10 mmol/L dNTP Mixtur 1 µL 0,2 mmol/L

50 mmol/L MgCl2 1,5 µL 1,5 mmol/L

Primer Mix (jeweils 10 µmol/L)

2,5 µL 0,5 µmol/L

Taq Polymerase (5 U/µL) 0,25 µL 1 U

RNAse/DNAse-freies Wasser 34,75 µL

Klonierung der Zielsequenz in den Vektor

Zur weiteren Vervielfältigung der Zielsequenz wurde diese in ein Plasmid kloniert, das

nachfolgend zur Transformation von Bakterien genutzt wurde. Plasmide sind ringförmige,

doppelsträngige DNA-Moleküle, die in der Bakterienzelle unabhängig von der

chromosomalen DNA vermehrt werden. In dieser Arbeit wurde das Plasmid pCR®2.1-

TOPO® (3.2.7) mit einer Länge von 3931 Nukleotiden verwendet. Es verfügt sowohl über ein

Gen für Ampicillinresistenz als auch über ein lacZ Gen an der Ligationsstelle. Bei der

TOPO® Cloning Reaktion wurden 3 µL des frischen PCR Produktes, 1 µL Salzlösung, 1 µL


72

Wasser (RNase-/DNase-frei) mit 1 µL TOPO® Vektor für 15 Min. bei Raumtemperatur

inkubiert. Die Reaktion wurde nach Ablauf der Inkubationszeit umgehend für die

Transformation chemisch kompetenter E. coli verwendet.

Transformation chemisch kompetenter E. coli

Nach der Ligation erfolgte die Transformation des Plasmids in chemisch kompetente E. coli

(non-K-12 Wildtyp, W-Stamm, ATCC # 9637, S.A. Waksman). Das Einbringen des Vektors

erfolgte mittels Hitzeschocktransformation. Dazu wurden 2 µL des frischen Ligationsansatzes

mit 50 µL der Bakterien gemischt und für 30 Min. auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgt die

Öffnung der Zellwand und Aufnahme der Plasmide durch Hitzeschock bei 42°C im Heizblock

für 30 Sekunden. Nach Zugabe von 250 µL S.O.C. Medium (3.2.3) wurde der Ansatz für

1 Stunde auf einem Schüttler bei 37°C und 200 rpm inkubiert. In dieser Zeit konnten die

transformierten Bakterien, die das Gen für die Ausbildung einer Ampicillinresistenz mit dem

Vektor erhalten hatten, die Antibiotika-Resistenz ausbilden, bevor sie auf einer vorgewärmten

LB-Agarplatte (3.2.6.6) ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert wurden. Nur

diejenigen Bakterien, die erfolgreich mit dem Plasmid transformiert wurden, konnten sich zu

Kolonien auf dem Ampicillin-haltigen Agar entwickeln. Um zusätzlich eine Aussage darüber

treffen zu können, ob das transformierte Plasmid rekombinant ist, also die Zielsequenz

enthält, besaß der Vektor ein lacZ-Gen, das für das Enzym β-Galaktosidase kodiert. Innerhalb

dieses Genes lag der Ligationsbereich des Vektors, so dass bei einer erfolgreichen Ligation

dieses Gen nicht mehr funktionsfähig war. Dem Festagar wurden x-Gal (3.2.3), ein

chromogenes Substrat für ß-Galaktosidase, das bei Umsetzung blau erscheint sowie IPTG

(3.2.3), ein Galaktose-Derivat das als künstlicher Induktor des Laktose Operons fungiert und

nicht in den Metabolismus der Bakterien eingeht beigesetzt. So konnten die

Bakterienkolonien mit erfolgreich ligierten Plasmid das x-Gal nicht umsetzen und erschienen

weiß, während die Kolonien mit intaktem lacZ-Gen durch IPTG Galaktosidaseaktivität

entwickelten und durch die Umsetzung von x-Gal eine blaue Färbung aufwiesen. Dies

ermöglicht die Vorselektion der gewünschten Bakterienkolonien, die dann direkt isoliert und

in LB-Flüssigmedium (3.2.6.6) vermehrt wurden.


73

Extraktion der Plasmide

Zur Untersuchung des Vorhandenseins rekombinanter Plasmide in den Bakterien wurden

einzelne Kolonien in 3 mL Ampicillin-haltiges Medium überführt und für 12-16 h bei 37°C

und 225 rpm auf dem Schüttler inkubiert. Jeweils 1 mL der Suspension wurde bei 4°C bis

zum Abschluss der Untersuchungen aufbewahrt, um ggf. für die Herstellung eines

Glyzerolstocks zur Verfügung zu stehen. Die verbleibenden 2 mL der Bakteriensuspension

wurden für die Plasmidextraktion mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (3.2.3) verwendet. Die

Methode basiert auf einer Lyse der Bakterien unter alkalischen Bedingungen (BIRNBOIM u.

DOLY 1979) und der anschließenden Adsorption der DNA auf einer Silica-Membran in

einem System aus einer Mini-Säule und einem Auffangbehälter. Die Bakterien wurden dafür

zunächst für 10 Min. bei 8500 x g pelletiert und der Überstand abgenommen. Das

Bakterienpellet wurde in 250 µL Puffer P1 resuspendiert und in ein 1,5 mL Eppendorf-Gefäß

überführt. Anschließend wurden 250 µL Puffer P2 hinzugefügt und durch mehrmaliges

Schwenken durchmischt. Zur Kontrolle war dem Puffer P1 Lyse-Blau-Reagenz zugesetzt, die

in P1 präzipitert und sich bei Mischung mit P2 löst und blau erscheint. Die Proben wurden

solange geschwenkt bis sie eine gleichmäßige blaue Färbung aufwiesen. Nach Zugabe von

350 µl Puffer N3 wurde die Probe unter mehrmaligem Schwenken farblos. Danach erfolgte

eine 10-minütige Zentrifugation bei 16000 x g. Der Überstand wurde dann in ein im Kit

enthaltenes Säulen-System pipettiert und nochmals 1 Min. bei 16000 x g zentrifugiert und der

Durchlauf verworfen. Das Säulen-System wurde anschließend einmal mit 500 µL Puffer PB

(1 Min., 16000 x g) und ein zweites Mal mit 750 µl Puffer PE (1 Min., 16000 x g) gewaschen,

der Durchlauf wurde jedes Mal verworfen. Zur Entfernung von Waschpufferresten wurde die

Probe einmal leer zentrifugiert. Die Säule wurde dann in ein frisches Eppendorf-Gefäß gesetzt

und mit 50 µL Puffer EB beschickt. Nach einer Inkubation von 1 Min. wurde das Plasmid bei

16000 x g über 1 Min. eluiert. Das Vorhandensein der klonierten Sequenz in den extrahierten

Plasmiden wurde umgehend in der konventionellen PCR und mittels anschließender

Agarosegelelektrophorese (s.u.) überprüft. Bakterienkolonien, die das gewünschte

rekombinante Plasmid enthielten, wurden für die Anlage eines Glyzerolstocks (850 µL

Bakteriensuspension + 50 µL Glyzerol) in 1 mL Kryoröhrchen verwendet. Die

Bakterienstocks wurden bei -95°C eingefroren. Zur Überprüfung der Vollständigkeit der


74

klonierten Sequenz wurden 600-700 ng der Plasmid-DNA mit 5 pmol M13 Vorwärtsprimer

aus dem TOPO Cloning Kit zur Sequenzierung (SEQLAB, Göttingen) eingeschickt.

Agarose-Gelelektrophorese

Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt

und mit dem Farbstoff DNA Star sichtbar gemacht. Anhand eines mitglaufenen

Größenstandards konnte geprüft werden, ob die Größen der Amplifikate mit denen der

klonierten Zielsequenzen übereinstimmen. Im elektrischen Feld wandern die DNA-Fragmente

abhängig von ihrer Größe, der Stromstärke und der Spannung, den Pufferbedingungen und

der Agarose-Konzentration im Gel unterschiedlich schnell und weit. Je kleiner die

aufzutrennenden Fragmente sind desto schneller bewegen sie sich im elektrischen Feld. Der

dem Gel zugesetzte Farbstoff interkaliert mit der doppelsträngigen DNA, wodurch diese im

UV-Licht sichtbar werden. Das Agarosegel wurde wie unter 3.2.6.5 beschrieben hergestellt

und in die Gelelektrophoresekammer, in die ein Kamm für die Probetaschen gesteckt war,

gegossen. Nach Erkalten des Gels wurde der Kamm herausgezogen. Auf einem Stück

Parafilm wurden 10 µL der DNA-Probe mit 4 µL Blaumarker (3.2.6.5) gemischt und dann in

die entsprechende Probentasche des Gels gegeben. Der Blaumarker ermöglichte zum einen

die Kontrolle der Lauffront während der Gelelektrophorese, zum anderen wurde durch das in

ihm enthaltene Glycerin die Probe beschwert und sank besser in die Probentasche ab. In eine

Tasche des Gels wurden 3 µL eines 1 Kb-DNA-Längenstandards (3.2.3) zur Bestimmung der

Größe der DNA-Fragmente pipettiert. Die Agarose-Gelelktrophorese wurde in 1x TBE-

Laufpuffer bei einer Spannung von 85 V über 45 Min. durchgeführt. Anschließend wurden im

UV-Licht die Banden kontrolliert und mit einem Gel-Imager (3.1) fotografiert (Abb. 7).


75

NKR1

IL-1ß

CCL5CXCL1

Läng

ensta

ndar

d

Länge (bp)

100

200300400

650500

850

Abb. 7: Kontrolle der Messplasmide im Agarosegel.

Fotografie der Messplasmide nach konventioneller PCR in 3%-igem Agarosegel unter UV-Licht. Kontrolle der Produktlänge in Basenpaaren (bp) durch mitgeführten Längenstandard.

Linearisierung der Messplasmide

Aufgrund der physikalisch schlechteren Bindung der Primer an das ringförmige Messplasmid

wird die dsDNA liniarisiert. Es wurden nur Restriktionsenzyme gewählt, deren Schnittstellen

sich nicht in den Zielsequenzen befanden, um eine Fragmentierung der gewünschten Gene zu

vermeiden. Verwendet wurde für die Linearisierung von Messplasmiden mit IL-1ß, CXCL1,

CCL5 und NKR1 das Restriktionsenzym Hind III, welches zwischen den Basen 5'-

A↓AGCTT-3' und 3'-TTCGA↑A-5'schneidet. Für TNF-α und CXCL 8-enthaltende

Messplasmide wurde das Restriktionsenzym Sca I verwendet (Schnittstellen: 5'-AGT↓ACT-3'

und 3'-TCA↑TGA-5'). Hind III wurde aus Haemophilus influenzae Rd und Sca I aus

Streptomyces caespitosus isoliert. Zusammen mit dem 10-fach konzentrierten Puffer

„REact® 2“ (3.2.3) schneiden die Restriktionsenzyme 1 µg der dsDNA in einer Stunde bei

37°C. Nach der Linearisierung wurde das Amplikon mit dem QIAquick® PCR Purification

Kit (3.2.3) aufgereinigt. Das Kit entfernt über ein System von Wasch- und Trennsäulen

enzymatische Rückstände und adsorbiert die DNA unter alkalischen Bedingungen (pH≥7,5)


76

an eine Silica-Membran. Alle Zentrifugationsschritte fanden über 1 Min. bei 16000 x g und

Raumtemperatur statt. Zunächst wurde die Probe in einem Eppendorf-Gefäß im Verhältnis

1:6 mit Puffer PBI gemischt. Das Einhalten des pH-Werts von ≥7,5 wurde durch die gelbe

Farbe der Lösung angezeigt. Die Probe wurde auf ein mitgeliefertes Säulen-System gegeben

und zentrifugiert. Nach Verwerfen des Durchlaufs wurde die Säule einmal mit 750 µL Puffer

PE gewaschen und einmal leer zentrifugiert. Der Durchlauf wurde jedes Mal verworfen. Für

die Elution der DNA wurde die Säule in ein frisches Eppendorf-Gefäß gesetzt, mit 50 µL

Puffer EB bestückt und zentrifugiert. Von den aufgereinigten Messplasmiden wurden nach

der Prüfung der Reinheit umgehend Verdünnungsreihen hergestellt.

Berechnung der Kopienzahl

Für die Herstellung einer Verdünnungsreihe der Messplasmide musste die Anzahl der Kopien

pro µL bestimmt werden. Durch die Messung der optischen Dichte bei 260 nm (OD260) am

Eppendorf Biophotometer wurde die Konzentration (C) der doppelsträngigen Plasmid DNA

entsprechend der oben beschriebenen Formel (3.3.12.1) berechnet. Mittels dieser Information

und der bekannten Länge der Zielsequenz war es möglich, die genaue Kopienzahl mit

folgender Formel zu errechnen

MW = P x 660g/mol

6x1023[Kopien/mol] x DNA[g/µL]MW[g/mol]S[Kopien/µL] =

MW = Molekulargewicht des PCR-Produkts P = PCR-Produktlänge in Basenpaaren S = Standardkonzentration DNA = im Photometer gemessene DNA Konzentration 660 g/mol = Durchschnittliches molekulares Gewicht der Basen

Aus der Stocklösung mit der berechneten Anzahl von Kopien pro µL wurde eine

Verdünnungsreihe hergestellt (109 –100 Kopien/µL), die anschließend in der real time PCR

getestet wurde. Die Standardreihe wurde bei -20°C gelagert. Nach 3-maligem Auftauen

wurden die Verdünnungen verworfen und neu angesetzt.


77

3.3.12.3 Quantitative Real time PCR (qrtPCR)

Prinzip der qrtPCR

Bei der qrtPCR findet eine Quantifizierung der PCR-Produkte in „Echtzeit“, das heißt

während der Amplifikationszyklen statt. In den Reaktionsansätzen befindet sich der Farbstoff

SYBR Green, der nach der Anlagerung an die kleine Windung doppelsträngiger DNA grün

fluoresziert. Die Fluoreszenz steht dabei in direktem Verhältnis zur Menge der amplifizierten

DNA und wird über die gesamte Laufzeit durch die StepOneTM Software Version 2.0

aufgezeichnet. Wie eine konventionelle PCR besteht auch die qrtPCR aus der Wiederholung

der drei Reaktionsschritte: 1) Aufschmelzen der doppelsträngigen DNA, 2) Anlagerung der

Primer und 3) Verlängerung des Produkts. Der Ablauf der drei Reaktionsschritte wird als

Zyklus bezeichnet. Eine vollständige PCR umfasst 40 bis 50 Zyklen. In den frühen Zyklen der

PCR kommt es lediglich zu einem basalen Fluoreszenzsignal, das auch als Hintergrundsignal

bezeichnet wird. In Abhängigkeit von der initialen Menge an DNA im Reaktionsansatz steigt

nach einer bestimmten Zyklenzahl die Fluoreszenz des PCR-Produkts exponentiell an. Der

Zyklus, an dem die Fluoreszenz aus dem Hintergrundsignal in eine exponentielle Phase

übergeht, wird als Cycle threshold (Ct) (Abb. 8, B) bezeichnet und korreliert direkt mit der

ursprünglichen Kopienzahl der Proben. Die exponentielle Phase geht im weiteren Verlauf der

PCR aufgrund von Inhibition durch Reaktionsprodukte und Enzymlimitierung zunächst in

eine lineare Phase und letztendlich in eine Plateauphase über (Abb. 8, B). Da SYBR Green

unspezifisch an jede doppelsträngige DNA bindet, muss nach den Amplifikationszyklen eine

Schmelzkurvenanalyse durchgeführt werden (Abb. 8, A). Dabei werden die Proben schritt-

weise denaturiert. Abhängig von der Größe der Amplifikationsprodukte zerfallen diese zu

einem bestimmten Zeitpunkt und es findet ein schlagartiger Abfall der Fluoreszenz statt.

Befinden sich verschiedene Produkte im Reaktionsansatz, wird dies durch eine mehrgipfelige

Schmelzkurve sichtbar.


78

Abb. 8: Schmelzkurve und Amplifikations-Plot einer qRT-PCR. A: Exemplarische Darstellung einer Schmelzkurve von CXCL1 in der ersten negativen Ableitung des Reporter-Farbstoffs SYBR Green (Derivative Reporter(-Rn)) aufgetragen gegen die Temperatur mit einem einheitlichen Peak bei 82,3°C. B: Amplifikation (Steigung der SYBR Green-Fluoreszenz(∆ Rn)) von Messplasmiden des Chemokins CXCL1 in den Verdünnungen 1x103 Kopien bis 1x107 Kopien über 40 Zyklen. Eintritt in die exponentielle Phase am Ct-Wert, und Übergang in die Plateau-Phase am Ende der Amplifikation.

Primeroptimierung

Die optimale Konzentration von Vorwärts- und Rückwärts-Primern ist je nach Primer und

Gerät unterschiedlich. Daher wurden vor der Messung der Proben die optimalen Primer-

Konzentrationen für die zu untersuchenden Gene ermittelt. Entsprechend der Matrix aus Abb.

9 wurde für jede Konzentration ein Duplikat aus der Standardreihe (1000 Kopien/µL,

Positivkontrolle) und ein Duplikat DNase/RNase freies Wasser (Negativkontrolle) eingesetzt.

Ausgewählt wurde diejenige Kombination von Vorwärts- und Rückwärts-Primer-

Konzentration, bei der eine höchstmögliche Sensitivität bei niedriger oder fehlender

Amplifikation in der Negativkontrolle vorlag.


79

Rückwärts-Primer (nmol/L)

Vor

wär

ts-P

rimer

(nm

ol/L

)900

300

90030050

900

300

90030050

Abb. 9: Matrix für die Primeroptimierung. Kombination der einzelnen Konzentrationen von Vorwärts- und Rückwärts-Primern (nmol/L).

Messung unbekannter Proben

In der qrtPCR wurde die Beeinflussung der Genexpression der Chemokine CXCL1, CXCL8

und CCL5, der Zytokine TNF-α und IL-1ß in bovinen Monozyten und MdM nach Zusatz von

Substanz P alleine und in Kombination mit LPS untersucht. Zusätzlich wurde die Expression

des SP-Rezeptors NKR1 in Monozyten, MdM, Lymphozyten und PMN gemessen, um eine

Aussage über das Vorkommen dieses Rezeptors auf den unterschiedlichen Zellpopulationen

beurteilen zu können. Für die Durchführung wurde der SYBR Green® PCR Master Mix

verwendet. Die Proben wurden wie in 3.3.12 beschrieben extrahiert, auf eine Konzentration

von 50 ng/µL Gesamt-RNA und eingestellt und in cDNA umgeschrieben. Für jede Messung

wurden mindestens fünf Punkte der Standardreihe (100 Kopien–106 Kopien) und eine

Negativkontrolle (Mastermix + Wasser) eingesetzt. In eine Micro Amp TM Fast 96-well PCR-

Platte wurde pro Vertiefung jeweils 1 µL cDNA und 24 µL des entsprechenden Mastermix

(Tab. 6 und Tab. 7) pipettiert. Alle Ansätze wurden in Duplikaten angelegt. Zu Beginn der

PCR wurden die Proben zur vollständigen Denaturierung der DNA einmalig für 10 Minuten

auf 95°C erhitzt. Danach erfolgten 40 Zyklen mit je einer Denaturierung der Proben bei 95°C

über 15 Sekunden und der Anlagerung der Primer und der Verlängerung des Produkts bei

60°C über 1 Minute. Nach Ablauf der Amplifikationszyklen wurde eine Schmelzkurven-

analyse durchgeführt. Dabei wurden die Proben von 60°C in Schritten von 0,3°C unter

ständiger Aufzeichnung der Fluoreszenz auf 95°C erhitzt.


80

Tab. 6: Mastermix für IL-1ß, TNF-α, CXCL1, CCL5 und NKR1, Volumen in µL

pro Reaktion.

Reagenz Volumen (µL)

SYBR Green® PCR Master Mix 12,5

Wasser (RNAse-DNAse-frei) 8,5

Vorwärts-Primer (5 µmol/L) 1,5

Rückwärts-Primer (5 µmol/L) 1,5

Tab. 7: Mastermix für CXCL8, Volumen in µL pro Reaktion.

Reagenz Volumen (µL)

SYBR Green® PCR Master Mix 12,5

Wasser (RNAse-DNAse-frei) 9,75

Vorwärts-Primer (5 µmol/L) 1,5

Rückwärts-Primer (5 µmol/L) 0,25

Auswertung

Die StepOneTM Software zeichnete die Fluoreszenz von SYBR Green auf und legte für die

einzelnen Proben die Ct-Werte fest. Für die eingesetzten Punkte des externen Standards mit

bekannter Kopienzahl wurden ebenso die Ct-Werte festgelegt. Durch die logarithmische

Darstellung der ermittelten Ct-Werte (Ct) gegen die Kopienzahl der Standardpunkte entstand

eine Standardkurve (Regressionsgerade) anhand derer die in den Proben enthaltene

Kopienzahl abgeleitet wurde.

Zur Validierung der PCR wurden die Parameter Steigung der Regressionsgraden, Effizienz,

Bestimmtheitsmaß (R2) und Güte der Schmelzkurve herangezogen. Aus der von der Software

berechneten Steigung der Gerade lässt sich die Effizienz der Amplifikation ermitteln. Bei

einer Steigung von -3,32 liegt eine 100%ige Effizienz der Amplifikation vor, das heißt das

Produkt verdoppelt sich in jedem Zyklus. Steigungen von -3,1 bis -3,6 (entspricht einer

Effizienz von 90-110%) gelten als auswertbar (Abb. 10). Ist die Amplifikation nicht

ausreichend effizient, so können die Ausgangsmengen nicht exakt berechnet werden.

Zusätzlich wird von der Software das Bestimmtheitsmaß berechnet. So kann der lineare


81

Zusammenhang zwischen Ct-Werten und eingesetzter Kopienzahl überprüft werden, dabei

sollte R2 Werte >0.985 annehmen. Bei der Analyse der Schmelzkurve durfte lediglich ein

einzelner Peak auftreten, um sicherzustellen, dass nur ein Produkt amplifiziert wurde (Abb. 8,

A). Nur wenn die genannten Parameter den vorgegebenen Kriterien entsprachen, wurden die

von der Software nach der Regressionsgerade berechneten Kopienzahlen der unbekannten

Proben für die weitere Auswertung verwendet.

Quantity

Ct

100 103 104 105 106 107 108

12

14

16

18

20

22

24

28

Abb. 10: Regressionsgerade einer Standardreihe in der qrtPCR. Dargestellt sind Messplasmide des Chemokins CXCL1 in den Verdünnungen 1x103 Kopien bis 1x107Kopien. Die Ct-Werte (Cycle threshold) sind gegen die Kopienzahlen aufgetragen und ergeben die Regressionsgerade mit der Steigung s = -3,429; einer Eiffizienz von 93,3% und mit R2 = 0,994.


82

3.3.13 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung wurde mithilfe des Programms SAS 9.1 (SAS Institute Inc.,

Cary/North Carolina, USA, 1988) und Microcal Origin durchgeführt. In der deskriptiven

Statistik wurden die Daten mit dem Shapiro-Wilk-Test auf Normalverteilung geprüft.

Normalverteilte Daten wurden durch Mittelwert und Standardfehler beschrieben und

dargestellt. Nicht normalverteilte Daten wurden durch Minimal- und Maximalwerte, das

obere und untere Quartil sowie den Median charakterisiert und in Boxplots dargestellt (Abb.

11).

Median

75%

25%

arithmetisches Mittel

Minimum

Maximum

Parameter

Mes

swer

te

Abb. 11: Exemplarische Darstellung eines Boxplots. Exemplarische Darstellung von Messwerten eines Parameters in einem Boxplot. Die zentralen 50% der Daten befinden sich in der Box, in der der Median durch eine horizontale Linie und der arithmetische Mittlewert durch ein Rechteck gekennzeichnet sind.

Um zu überprüfen, ob sich in voneinander abhängigen Stichproben zwei qualitative

Merkmale bezüglich eines quantitativen Merkmals voneinander unterscheiden, wurde bei

normalverteilten Daten der gepaarte Student´s t-Test angewendet, bei nicht normalverteilten

Daten wurde der Wilcoxon Signed-Rank Test verwendet. Um mehr als zwei qualitative

Merkmale bezüglich eines quantitaitven Merkmals untereinander zu vergleichen, wurde bei

den abhängigen Stichproben die 1-faktorielle Varianzanalyse für wiederholte Messungen

durchgeführt (normalverteilte Daten) bzw. der Friedmann ANOVA für nicht normalverteilte

Daten. Wurden bei der Varianzanalyse Unterschiede zwischen den Klassen festgestellt, wurde


83

durch multiple Mittelwertsvergleiche nach Bonferroni untersucht, zwischen welchen Klassen

die Unterschiede bestanden. Unterschiede zwischen Parameterklassen mit einer Irrtums-

wahrscheinlichkeit (p) von ≤ 0,001 wurden als höchst signifikant, jene mit p≤0,01 als hoch

signifikant und p-Werte ≤0,05 als signifikant bezeichnet. Werte mit p>0,05 galten als nicht

signifikant. Um Zusammenhänge zwischen quantitativen Daten zu erfassen, wurden

Korrelationsanalysen (nach Pearson für normalverteilte Daten, nach Spearman für nicht

normalverteilte Daten) durchgeführt. Die Signifikanz des Korrelationskoeffizienten (r) bei

einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 0,05 war von der Stichprobengröße abhängig. Verwendet

wurde die Liste für kritische r-Werte nach PETRIE und WATSON (2006).

Ergebnisse

84

4 Ergebnisse

4.1 Expression und Regulation des Substanz P-Rezeptors in vivo und

in vitro

Von den drei bekannten Tachykinin-Rezeptoren bindet Substanz P mit höchster Affinität an

den Neurokinin-Rezeptor 1 (NKR1). Die Neurokinin-Rezeptoren sind G-Protein-gekoppelte

Rezeptoren, deren Genregulation im Allgemeinen mit einer geringen Menge mRNA-

Transkripten in der Zelle verbunden sind (O'CONNOR et al. 2004).

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression und Regulation des NKR1 als hauptsächlicher

Rezeptor für Substanz P mittels quantitativer real time PCR (qrtPCR) bestimmt. Die In-vivo-

Regulation wurde in Eutergewebe gesunder oder mit E. coli bzw. S. aureus infizierter Kühe

untersucht. Eine Expression und Regulation des SP-Rezeptors in Immunzellen wurde anhand

in-vitro-generierter Leukozyten-Subpopulationen überprüft.

4.1.1 Rezeptorexpression in vivo

Zur Überprüfung der In-vivo-Expression des NKR1 wurde Eutergewebe aus zwei

verschiedenen, zeitlich und räumlich getrennt durchgeführten Mastitismodellen retrospektiv

untersucht.

Das erste Tiermodell wurde an der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule Hannover

nach PETZL (2005) durchgeführt, die Gewebeproben wurden am Forschungsinstitut für die

Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere (FBN) Dummerstorf analysiert. Dabei wurden

klinisch gesunde, laktierende Kühen sequentiell mit E. coli (500 CFU) oder S. aureus

(10000 CFU) infiziert. Nach 24 Stunden wurden die Tiere geschlachtet und aus den vier

Vierteln Gewebeproben entnommen, die entweder über 24 h, 12 h oder 6 h infiziert waren

oder aus dem mit Kochsalzlösung behandelten Placeboviertel stammten. Bei den mit E. coli

infizierten Tieren lag die Anzahl der Kopien für den NKR1 bei allen drei Infektionszeiten und

im Placeboviertel im selben Bereich um etwa 50 Kopien in 75 ng Gesamt-RNA (Abb. 12).

Die mit S. aureus infizierten Tiere zeigten dagegen eine um mehr als das zehnfach höhere

Ergebnisse

85

Expression des NKR1, die sich ebenfalls nicht innerhalb der verschiedenen Infektionszeiten

und von der des Placeboviertels unterschied (Abb. 12).

50100

1500

3000

E. coli S. aureus

0 6 12 24

Placebo(0h infiziert) 24 h

infiziert

12 hinfiziert

6 hinfiziert

Stunden nach Infektion

Anz

ahl K

opie

nin

75n

g G

esam

t-RN

A

Abb. 12: Expression des Substanz-P-Rezeptors (NKR1) nach sequentieller

Infektion von Eutervierteln mit E. coli und S. aureus.

Dargestellt ist die mRNA-Expression von NKR1 (Anzahl Kopien in 75 ng Gesamt-RNA, Mittelwerte ± SEM) in Eutergewebe sequentiell mit E.coli (500 CFU intramammär) oder S. aureus (10000 CFU intramammär) infizierter Tiere. Die einzelnen Viertel waren jeweils über 24 h (vorne rechts), 12 h (hinten rechts) oder 6 h (hinten links) infiziert oder als Placeboviertel (0 h) mit NaCl behandelt. Die Anzahl der Tiere betrug für E. coli 0 h und 24 h n=4, 6 h und 12 h n=2, für S. aureus 0 h und 12 h n=7, 6 h und 24 h n=3.

Das zweite Mastitismodell wurde nach MEYER (2008) an der Klinik für Wiederkäuer der

LMU München durchgeführt, die Proben wurden am Forschungsinstitut für die Biologie

landwirtschaftlicher Nutztiere (FBN) Dummerstorf analysiert. Dabei wurde Eutergewebe von

gesunden laktierenden Kühen (Goldstandard) und von Kühen, die experimentell entweder für

6 oder für 24 Stunden mit E. coli (500 CFU) infizierten wurden, gewonnen. Durch das

angewandte Modell konnten systemische Effekte auf unbehandelte und mit einem Placebo

(physiologische Kochsalzlösung, NaCl) behandelte Euterviertel untersucht werden.

Im Eutergewebe gesunder Tiere konnte der NKR1 mit einer Basisexpression von 2797 ± 293

Kopien in 75 ng Gesamt-RNA nachgewiesen werden (Abb. 13). Bei den infizierten Tieren lag

die Expression von NKR1 nach 6 Stunden auf einem ähnlichen Niveau wie bei gesunden

Tieren. Auch in den Placebo- und Kontroll-Vierteln konnte keine Veränderung der

Expression im Vergleich zum infizierten Viertel oder zu gesunden Tieren festgestellt werden.

Ergebnisse

86

Nach 24-stündiger Infektion mit E. coli kam es zu einer hoch signifikanten Reduktion der

NKR1-Expression in den infizierten Vierteln um etwa den Faktor 10. Auch im Gewebe der

Placebo- und Kontroll-Viertel kam es nach 24 Stunden zu einer hoch signifikanten Reduktion

der Expression in derselben Größenordung wie in den infizierten Vierteln (Abb. 13).

E. coli

Kontrolle

Anz

ahl K

opie

nin

75n

g G

esam

t-RN

A

** ** **

Placebo

Goldstandard

Infiziert

es Vier

tel

Kontrollvi

ertel

Placeb

ovierte

l

500100015002000250030003500

nicht infiziert 6 h infiziert 24 h infiziert

Abb. 13: Expression des Substanz P-Rezeptors (NKR1) in Eutergewebe gesunder

und mit E. coli infizierter Kühe. Dargestellt ist die mRNA-Expression von NKR1 (Anzahl Kopien in 75 ng mRNA, Mittelwerte ± SEM) in Eutergewebe nicht-infizierter, gesunder Kühe (‚Goldstandard‘, n=6) und über 6 h oder 24 h infizierter (E. coli, 500 CFU intra-mammär) Kühe (n=5) mit je einem infizierten Viertel, einem Placebo-Viertel (NaCl intra-mammär) und zwei unbehandelten Kontroll-Vierteln. Angegebene Signifikanzen beziehen sich auf den Goldstandard-Wert (**: p≤0,01).

Ergebnisse

87

4.1.2 Rezeptorexpression in einzelnen Leukozyten-Subpopulationen in

vitro

Zur Prüfung der Rezeptor-Regulation in unterschiedlichen Leukozyten-Subpopulationen

wurden aus bovinen Blutleukozyten reine PMN, Lymphozyten (CD14-negative Zellen nach

MAC-Separation), Monozyten (CD14-positiveZellen nach MAC-Separation) und MdM

generiert. Die vier verschiedenen Subpopulationen wurden mittels qrtPCR auf ihre Basis-

Expression von NKR1 überprüft (3.3.12.3). Für Monozyten und MdM wurde außerdem noch

die Rezeptor-Regulation nach Stimulation mit LPS überprüft.

Alle vier untersuchten Leukozytensubpopulationen exprimierten die mRNA des Rezeptors in

unstimuliertem Zustand. In Monozyten und MdM war der Rezeptor ungefähr um den

Faktor 10 schwächer exprimiert als in Lymphozyten und Granulozyten (Tab. 8).

Nach dreistündiger Stimulation von Monozyten und MdM mit LPS (1 µg/mL) konnte keine

Expressionsmodulation des NKR1 festgestellt werden (Abb. 14).

Tab. 8: Expression des Substanz P Rezeptors (NKR1) in unstimulierten

Leukozytensubpopulationen.

Zelltyp mRNA-Kopien1

Lymphozyten2 3055 ± 913 Granulozyten 1994 ± 92

Monozyten3 281 ± 37

Makrophagen4 381 ± 49

1) in 50 ng Gesamt-RNA Mittelwert ± SEM: Lymphozyten und Granulozyten n=3 Tiere; Monozyten und Makrophagen n=6 Tiere; 2) CD14-negative Zellen nach MAC-Separation (s.3.3.1); 3) CD14-positive Zellen nach MAC-Separation; 4) aus Blutmonozyten generierte Makrophagen.

Ergebnisse

88

Anz

ahl K

opie

nin

50

ng G

esam

t-RN

A

Monozyten

Monozyten

+LPSMdM

MdM + LPS0

100200300400500600700800

Abb. 14: Expression des NKR1 in Monozyten und Makrophagen (MdM) in unsti-

mulierten Zellen und nach LPS-Stimulation. Dargestellt ist die mRNA-Expression (in 50 ng Gesamt-RNA) des NKR1 in Monozyten und MdM in unstimuliertem Zustand und nach 3 Stunden Stimulation mit LPS (1 µg/mL). Die Box Plots enthalten Daten von 6 Tieren.

4.2 Modulatorische Wirkung auf die Proliferation mononukleärer

Zellen

4.2.1 Einfluss von Substanz P auf die Vitalität und die Blastogenese

lymphoider Zellen nach In-vitro-Stimulation

In der In-vitro-Stimulation wurde geprüft, ob Substanz P proliferationsinduzierend wirkt und

wie sich Substanz P auf die superantigeninduzierte Proliferationsreaktion boviner mono-

nukleärer Zellen auswirkt. Die Stimulation mit dem Superantigen SEA führte zur Bildung von

Blasten (großen Zellen), die neben der Gesamtzahl vitaler lymphoider Zellen separat

quantifiziert wurden. Dazu wurden mononukleäre Zellen (MNC) über 6 Tage mit Substanz P

(1x10-8 mol/L, 1x10-10 mol/L und 1x10-12 mol/L) inkubiert. In Parallelansätzen wurden die

Ergebnisse

89

Zellen zusätzlich mit Superantigen (SEA, 1 ng/mL) stimuliert. Nach 1, 2 und 6 Tagen wurde

die Gesamtzahl vitaler Zellen und die Anzahl vitaler Blasten mittels Referenzzellverfahren

bestimmt.

In Abb. 15 ist die Anzahl vitaler lymphoider Zellen und vitaler Blasten an Tag 1, 2 und 6

dargestellt. Die Gesamtzahl vitaler lymphoider Zellen reduzierte sich während der 6-tägigen

Inkubationszeit um etwa 50%, wobei an Tag 6 im SEA-stimulierten Ansatz signifikant

weniger vitale Zellen verblieben (p≤0,001).

Substanz P allein führte in keiner geprüften Konzentration zur Blastogenese (Abb. 15).

Ebenso wurde die Zahl vitaler kleiner lymphoider Zellen durch Substanz P im gesamten

Zeitraum nicht beeinflusst. In den mit SEA stimulierten Ansätzen befand sich schon an Tag 2

mit durchschnittlich 9 ± 1 x103 Zellen eine signifikant höhere Zahl vitaler Blasten im

Vergleich zur Mediumkontrolle (4 ± 0,3 x103 Zellen) (p≤0,01). Nach 6 Tagen manifestierte

sich eine deutliche, superantigeninduzierte Proliferation der Blasten (p≤0,001). Der Zusatz

von Substanz P bewirkt eine signifikante Reduktion dieser SEA-induzierten Blastogenese

(p≤0,001). Alle drei eingesetzten Konzentrationen von Substanz P (1x10-8 mol/L, 1x10-10

mol/L und 1x10-12 mol/L) hatten in etwa dasselbe Ausmaß. Die Zahl vitaler Blasten wurde

von 38 ± 4x103 Zellen im SEA-Kontrollansatz auf 28 ± 2 x103 Zellen (SP 1x10-12 mol/L und

SP 1x10-8mol/L) bzw. 29 ± 2 x103 Zellen (SP 1x10-10 mol/L) reduziert.

Ergebnisse

90

020406080

100120 ***

0

10

20

30

40

50

***

0

10

20

30

40

50

******

Kleine lymphoide Zellen Blasten

Tag 1

Tag 2

Tag 6

MediumSEA

MediumSEA

Vita

le Z

elle

n (x

103 ) 0

10

20

30

40

50

120 Kontrolle SP 1x10-12 mol/L SP 1x10-10 mol/L SP 1x10-8 mol/L

020406080

100120

020406080

100120

Abb. 15: Einfluss von Substanz P auf die superantigeninduzierte Blastogenese

boviner MNC nach in vitro Stimulation. Frisch separierte MNC wurden zusammen mit SP in verschiedenen Konzentrationen (1x10-8 mol/L, 1x10-10 mol/L und 1x10-12 mol/L) mit und ohne Zusatz von Staphylokokken Enterotoxin A (SEA, 1 ng/mL) in vitro stimuliert. Die Parallelansätze wurden über 1, 2 und 6 Tage bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM der Gesamtzahl vitaler kleiner lymphoider Zellen und der Anzahl vitaler Blasten (n=9). Signifikante Unterschiede der Ansätze mit SP beziehen sich auf den SEA-stimulierten Ansatz ohne SP (weißer Balken) (*** p≤ 0,001).

Ergebnisse

91

4.2.2 Einfluss von Substanz P auf die Proliferation von T-

Zellsubpopulationen nach In-vitro-Stimulation

Nach Stimulation von T-Zellen mit Superantigen folgt eine Phase der Proliferation, bei der

vor allem die Anzahl CD8-positiver Zellen stark zunimmt (HOLLÄNDER 2006). Im

Folgenden sollte geprüft werden, ob Substanz P die stimulationsbedingte Proliferation CD8-

positiver Zellen beeinflusst und sich somit auf das Verhältnis CD4-positiver zu CD8-

positiven Zellen unter kleinen lymphoiden Zellen auswirkt. Dazu wurden mononukleäre

Zellen über 5 Tage mit Substanz P (1x10-8 mol/L, 1x10-10 mol/L und 1x10-12 mol/L) inkubiert

und mit dem Superantigen SEA (1 ng/mL) stimuliert oder als unstimulierte Kontrolle

belassen. Um die Subpopulationen zu klassifizieren, wurde eine indirekte Membranimmun-

fluoreszenz mit Antikörpern gegen die Oberflächenmoleküle CD4 und CD8 durchgeführt

(3.3.10). Der Anteil CD4- und CD8-positiver Zellen wurde durchflusszytometrisch erfasst

und zueinander ins Verhältnis gesetzt.

In unstimulierten Ansätzen lagen überwiegend CD4-positive Zellen (Tab. 9) vor. In den

Kontrollansätzen war ihr Anteil 4-mal höher im Vergleich zu CD8-positiven Zellen. In der

niedrigsten eingesetzten SP-Konzentration (1x10-12 mol/L) lag das Verhältnis von CD4- zu

CD8-positiven Zellen im Mittel bei 3:1, wies aber mit einem Standardfehler von 1,6 eine

relativ hohe Streuung auf. Die anderen beiden eingesetzten SP-Konzentrationen lagen im

Bereich des Kontrollansatzes. In den mit SEA stimulierten Ansätzen war der Anteil der CD8-

positiven Zellen höher als in den Mediumkontrollen, was an einem geringeren CD4/CD8-

Verhältnis abzulesen war. In den Ansätzen mit Substanz P in niedrigen Konzentrationen

(1x10-12 mol/L und 1x10-10 mol/L) war das CD4/CD8-Verhältnis noch geringer, jedoch

statistisch nicht signifikant. Zellen denen, Substanz P in höherer Konzentration (1x10-8

mol/L) zugesetzt wurde, wiesen ein mit der Kontrolle vergleichbares Verhältnis von CD8 zu

CD4-positiven Zellen auf.

Ergebnisse

92

Tab. 9: Verhältnis CD4-positiver zu CD8-positiver kleiner lymphoider Zellen

nach 5-tägiger Stimulation mit SEA im Vergleich zur Medium-Kontrolle.

Verhältnis CD4+/CD8+ Zellen

- SP-12 SP-10 SP-8

Medium 4 ± 0,8 3 ± 1,6 4 ± 1,1 4 ± 1,2

SEA 2 ± 0,5 1 ± 0,5 1 ± 0,4 2 ± 0,6

Mittelwerte von 3 Tieren ± SEM; Unterschiede zwischen Kontrolle und SP-Ansätzen sind nicht signifikant; SP-12 (1x10-12 mol/L), SP-10 (1x10-10 mol/L), SP-8 (1x10-8 mol/L).

4.3 Die Substanz-P-vermittelte Modulation neutrophiler

Granulozyten

4.3.1 Modulation des Calcium-Einstroms in neutrophile Granulozyten

Der Anstieg von freien Calcium-Ionen im intrazellulären Raum ist eines der ersten Zeichen

einer Zell-Aktivierung. Im Folgenden wurde in Anlehnung an publizierte Ergebnisse mit

humanen Granulozyten (DIANZANI et al. 2001) untersucht, inwieweit bovine neutrophile

Granulozyten nach SP-Stimulation mit einem Calcium-Einstrom reagieren und ob Substanz P

den CXCL8-induzierten Calcium-Einstrom moduliert. Die Zellen wurden mit den Calcium-

sensitiven Fluorochromen Fura Red und Fluo 4 beladen und der Calcium-Einstrom direkt

nach der Stimulation durchflusszytometrisch als prozentualer Anteil aktivierter Zellen erfasst

(3.3.9).

In den Medium-Kontrollen lag der Anteil aktivierter Zellen über alle drei Messungen bei allen

Tieren auf einem gleich bleibend niedrigen Niveau (Abb. 16, A und B). Die Zugabe von

Substanz P führte nicht bei allen untersuchten Tieren zu einem Anstieg des intrazellulären

Calciumgehaltes. Bei drei von sechs Tieren konnte eine signifikante Erhöhung des Anteils

aktivierter Zellen in der ersten und zweiten Messung erfasst werden (Abb. 16, A und Abb. 17

A). Bei den anderen drei Tieren konnte Substanz P keine Aktivierung der Zellen auslösen

(Abb. 16, B und Abb. 17, B). Bei den Tieren, die eine SP-bedingte Aktivierung zeigten,

konnte ein transienter Verlauf des Calcium-Einstroms beobachtet werden. Bei der ersten

Messung nach der Zugabe von SP wurden 29 ± 7% aktivierte Zellen erfasst, ein signifikant

Ergebnisse

93

höherer Wert im Vergleich zur Medium-Kontrolle (p≤0,05). Nach 30 Sekunden ging die SP-

bedingte Aktivierung auf 23 ± 7% zurück, lag aber immer noch signifikant über den Medium-

Ansätzen (p≤0,05). Nach der letzten Messung lag der Anteil aktivierter Zellen mit 13 ± 2% in

den SP-Ansätzen im Bereich der Medium-Kontrolle (11 ± 1%). Aufgrund ihrer

unterschiedlichen Reaktion bezüglich Substanz P wurden die Tiere in zwei Gruppen

eingeteilt: Gruppe 1 enthielt Tiere, die auf Zugabe von Substanz P eine Aktivierung von

neutrophilen Granulozyten zeigten, Gruppe 2 enthielt die Tiere, die nicht auf Substanz P

reagierten. Zur Verdeutlichung der beiden Phänotypen sind in Abb. 17 exemplarisch

Punktediagramme von durchflusszytometrischen Messungen jeweils eines Tieres aus Gruppe

1 und Gruppe 2 nach der Zugabe von Substanz P dargestellt. Eine Stimulation mit dem

Calcium-Ionophor Ionomycin führte bei beiden Gruppen zu einer signifikanen Steigerung des

Anteils aktivierter Zellen auf ≥90% über alle drei Messungen (Abb. 16, C und D) (p≤0,001).

Nach Stimulation mit CXCL8 wurde ein im Vergleich zur Medium-Kontrolle signifikanter,

transienter Calcium-Einstrom beobachtet (Abb. 16, C und D). Bei Gruppe 1 verlief die

Zellaktivierung von 62 ± 7% (p≤0,001) bei der ersten Messung über 50 ± 6% (p≤0,05) bei der

zweiten Messung und 38 ± 8% (p≤0,05) bei der letzten Messung. In Gruppe 2 waren nach der

ersten Messung 53 ± 3% (p≤0,001) der Zellen aktiviert, nach der zweiten Messung 43 ± 4%

(p≤0,05) und nach der letzten Messung 32 ± 4% (p≤0,05). Auch hier unterschieden die

Gruppen sich nicht signifikant voneinander.

Ergebnisse

94

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100D)

******

Zeit nach Anregung (Sek.)

0

10

20

30

40

Gruppe 1

15 30 45 15 30 45Zeit nach Anregung

(Sek.)

Akt

ivie

rte

Zelle

n (%

)

**

A) B)

Gruppe 2



15 30 45 15 30 45

Akt

ivie

rte

Zelle

n (%

)

Medium SP (3x10-6 mol/L)

C)

Ionomycin (1 µg/mL) CXCL8 (1 nmol/L) Medium*

* **

******

*** *** *** ***

0

10

20

30

40

Abb. 16: Calcium-Einstrom bei neutrophilen Granulozyten nach Zugabe von

Substanz P. Bei bovinen PMN wurde nach Beladung mit den Flurochromen Fura Red und Fluo4 der Caclium-Einstrom nach Zugabe von Medium, SP (3x10-6 mol/L), Ionomycin (1 µg/mL) oder CXCL8 (1 nmol/L) durchflusszytometrisch erfasst. Der Anteil aktivierter Zellen ergab sich aus dem prozentualen Anteil von Zellen mit einem Calcium-bedingten Anstieg der Fluo4 und einem Abfall der Fura Red- Fluoreszenz. Dargestellt sind Mittelwerte mit Standardfehlern an drei Messzeitpunkten nach Anregung der Zellen (15 Sek., 30 Sek. und 45 Sek.). Bei insgesamt 6 untersuchten Tieren konnte eine Gruppe (A+C) mit signifikant höherem Anteil aktivierter Zellen nach SP-Zugabe bei der ersten und zweiten Messung und eine Gruppe (B+D) ohne sichtbaren SP-Effekt ermittelt werden. Die angegebenen Signifikanzen beziehen sich auf die Medium-Kontrolle (* p≤ 0,05, *** p≤ 0,001).

Ergebnisse

95

Fura

Red

39,95% 33,80% 16,39%

Fluo 4

15 Sek. 30 Sek. 45 Sek.

Gruppe 1; SP 3x10-6 mol/L

8,43% 4,69% 3,95%

Gruppe 2; SP 3x10-6 mol/L

15 Sek. 30 Sek. 45 Sek.

Fluo 4

Fura

Red

A)

B)

Abb. 17: Durchflusszytometrische Erfassung des Calcium-Einstroms bei Zellen der

unterschiedlichen Phänotypen. Bovine PMN wurden mit Fura Red und Fluo 4 beladen und direkt nach Zugabe von SP (3x10-6 mol/L) durchflusszytometrisch erfasst. Zur Überprüfung transienter Verläufe wurden drei Messungen im Abstand von 15 Sek. durchgeführt (15 Sek., 30 Sek. und 45 Sek.). Dargestellt sind Punktediagramme der drei Messungen nach SP-Zugabe von einem Tier der Gruppe 1 (mit SP-Effekt) und einem Tier der Gruppe 2 (ohne SP-Effekt) in der Doppelfluoreszenz Fura Red (FL-3) gegen Fluo 4 (FL-1). Der Anteil Zellen im rechten unteren Quadranten stellt den prozentualen Anteil aktivierter Zellen dar.

Um einen möglichen vorbereitenden „Priming“-Effekt von Substanz P auf den durch CXCL8

induzierten Calcium-Einstrom zu überprüfen, wurden außerdem PMN drei Minuten mit

Substanz P (3x10-6 mol/L) oder Medium vorinkubiert und anschließend mit CXCL8

(1 nmol/L) stimuliert. Es konnte weder ein vorbereitender Effekt von Substanz P noch eine

phänotypische Einteilung in zwei Gruppen beobachtet werden. Alle 6 untersuchten Tiere

Ergebnisse

96

verhielten sich vergleichbar und wurden daher nicht getrennt dargestellt (Abb. 18). In den

Kontroll-Ansätzen verlief die Zellaktivierung von 50 ± 4% über 40 ± 5% auf 34 ± 7%. Bei

den mit Substanz P vorinkubierten Ansätzen wurden durchschnittlich 51 ± 5% bei der ersten

Messung, 43 ± 4% bei der zweiten und 34 ± 5% der Zellen bei der dritten Messung aktiviert.

Akt

ivie

rte

Zelle

n (%

)

15 30 45Zeit nach Anregung

(Sek.)

20

30

40

50

60 Medium + CXCL8 SP + CXCL8

Abb. 18: CXCL8-induzierter Calcium-Einstrom bei bovinen PMN nach

Vorinkubation mit Substanz P. Bovine PMN wurden mit Fura Red und Fluo 4 beladen und über 3 Minuten mit SP (3x10-6 mol/L) oder Medium inkubiert und danach mit CXCL8 (1 nmol/L) stimuliert. Die Verschiebung der Fura Red und Fluo 4 Fluoreszenz wurde durchflusszytometerisch erfasst. Dargestellt ist der Anteil aktivierter Zellen 15, 30 und 45 Sekunden nach Stimulation von 6 Tieren (Mittelwerte ± SEM).

4.3.2 Beeinflussung der Überlebensrate neutrophiler Granulozyten

Einfluss von Substanz P auf die Überlebensrate in reinen Granulozyten-Kulturen

In 4.3.1 wurde gezeigt, dass Substanz P direkt aktivierend auf neutrophile Granulozyten

wirkt. Im Folgenden sollte überprüft werden, ob Substanz P auch einen direkten Einfluss auf

die konstitutive Absterberate von neutrophilen Granulozyten in vitro hat.

Dazu wurden Kulturen von hochreinen PMN über 24 Stunden mit Substanz P (1x10-8 bis

1x10-12 mol/L) inkubiert und anschließend durchflusszytometrisch erfasst. Die mittels

Referenzzellverfahren (3.3.5) berechnete Anzahl neutrophiler Granulozyten in den

Ergebnisse

97

verschiedenen Ansätzen ist in Abb. 19 dargestellt. Substanz P hat in keiner der eingesetzten

Konzentrationen einen Einfluss auf die Überlebensrate neutrophiler Granulozyten.

Vita

le Z

elle

n (x

103 )

Medium

SP -8SP -1

0SP -1

20

40

80

120

160

Abb. 19: Zahl vitaler neutrophiler Granulozyten nach 24-stündiger Inkubation mit

Substanz P. Dargestellt ist die Anzahl vitaler neutrophiler Granulozyten (x103) nach 24 h Inkubation mit Medium oder SP (1x10-8 mol/L (SP -8), 1x10-10 mol/L (SP -10) und 1x10-12 mol/L (SP-12)). Es handelt sich um Mittelwerte ± SEM von 3 Tieren.

Einfluss von Substanz P auf die Überlebensrate von neutrophilen Granulozyten in

Mischkulturen mit mononukleären Zellen

Eine Stimulation mononukleärer Zellen mit Stimuli bakterieller Herkunft, wie zum Beispiel

LPS, Superantigen oder CpG-Motiven führt zur Freisetzung löslicher Mediatoren, welche zu

einem beschleunigten Absterben neutrophiler Granulozyten in vitro führen (SCHUBERTH et

al. 2000). Im Folgenden wurde geprüft, ob Substanz P die stimulations-abhängige Freisetzung

der löslichen Faktoren von MNC und damit die Absterbekinetik der neutrophilen

Granulozyten beeinflusst.

Bovine MNC/PMN-Mischkulturen wurden nach 24-stündiger Inkubation mit Substanz P

(1x10-8 bis 1x10-13 mol/L) und LPS (1 µg/mL) durchflusszytometrisch erfasst und mittels

Referenzzellverfahren die Anzahl vitaler Zellen berechnet. Unstimulierte Kontrollansätze

enthielten nur Substanz P.

Ergebnisse

98

Die Stimulation mit LPS führte bei allen Tieren zu einer signifikanten Reduktion vitaler

neutrophiler Granulozyten (p≤0,01). Verglichen mit der Mediumkontrolle ging die Zahl

vitaler PMN in den Mischkulturen mit MNC nach 24-stündiger LPS-Stimulation im Mittel

um mehr als die Hälfte zurück (Abb. 20). Substanz P in den geprüften Konzentrationen hatte

darauf keinen Einfluss.

Direkte Inkubation Vorinkubation (2 h)

Vita

le P

MN

(x10

3 )

Medium LPS (1µg/mL)

Konrolle SP-8SP-10

SP-120

102030405060

Konrolle SP-8SP-10

SP-120

102030405060

Abb. 20: MNC-vermittelte Reduktion vitaler PMN nach LPS-Stimulation und

Einfluss von Substanz P. Mischkulturen von MNC und PMN (Verhältnis 1:1) wurden entweder nach 2 h Vorinkubation mit SP (1x10-8 (SP -8), 1x10-10 (SP-10) und 1x10-12 (SP-12) mol/L) oder ohne Vorinkubation direkt mit SP und LPS (1 µg/mL) stimuliert. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM der Anzahl vitaler PMN (x103) nach 24 h (n=5).

In einer zweiten Versuchsreihe sollte geprüft werden, ob eine Vorinkubation mit Substanz P

vor der Stimulation mit LPS einen vorbereitenden Effekt auf die Zellen hat, und so die

Absterberate von neutrophilen Granulozyten beeinflusst. Wie in Abb. 20 gezeigt, hatte diese

Modifikation ebenfalls keinen Einfluss auf die Zahl vitaler PMN, weder in den

unstimulierten, noch in den mit LPS stimulierten Ansätzen.

Aufgrund der nach Stimulationsversuchen mit neutrophilen Granulozyten gemachten

Beobachtung individueller Phänotypen (4.3.1) wurden die vorliegenden Daten ebenfalls

individuell analysiert. Bei der Betrachtung der Einzeltiere fällt auf, dass bei Tier Nr. 4 eine

Ergebnisse

99

Vorinkubation mit SP (1x10-12 mol/L) die Zahl der vitalen neutrophilen Granulozyten nach

LPS-Stimulation sehr deutlich von 53% (alleinige Stimulation mit LPS) auf bis zu 24% senkt

(Tab. 10). Bei Tier Nr. 3 kam es ebenfalls durch die Vorinkubation mit SP (1x10-8 mol/L) zu

einer Verstärkung der Reduktion vitaler neutrophiler Granulozyten von 48% auf 36%.

Tab. 10: Anteil vitaler PMN nach 24 h Stimulation mit LPS und Einfluss von

Substanz P, Vergleich von Einzeltieren mit und ohne Vorinkubation.

Anteil vitaler PMN (% von Mediumkontrolle) nach 24 h Stimulation mit LPS

Tier Vorinkubation mit SP (h)

Kontrolle SP -8 SP -10 SP -12

0 42 45 48 54 1 2 55 54 57 57

0 47 39 42 44 2 2 60 60 57 62

0 58 51 55 55 3 2 48 36 40 41

0 40 31 34 37 4 2 53 40 29 24

0 12 11 10 16 5 2 15 14 14 17

SP-12 (1x10-12 mol/L), SP-10 (1x10-10 mol/L), SP-8 (1x10-8 mol/L).

Ergebnisse

100

4.3.3 Beeinflussung der In-vitro-Migration neutrophiler Granulozyten

durch Substanz P

Extravasation und Migration zu einem Infektionsherd sind essentielle Funktionen von

Leukozyten. Die Zellen reagieren auf einen chemotaktischen Reiz und wandern entlang eines

Konzentrationsgradienten bestimmter chemotaktischer Faktoren in betroffenes Gewebe ein

(WILKINSON 1998). Ob Substanz P das Migrationsverhalten neutrophiler Granuloyzten

beeinflusst, wurde in vitro durch die quantitative Transmigration (3.3.8) untersucht.

Chemotaktische Eigenschaften von Substanz P

Zunächst wurde geprüft, ob Substanz P chemotaktisch auf bovine neutrophile Granulozyten

wirkt. Substanz P wurde in den Konzentrationen 1x10-8 mol/L und 1x10-7 mol/L eingesetzt.

Als Positivkontrolle für die Migration neutrophiler Granulozyten wurde ein Ansatz mit

CXCL8 (100 ng/mL) mitgeführt. Um einen möglichen zeitlichen Einfluss zu beobachten,

wurden die Migrationsansätze für 1 Stunde und 2 Stunden durchgeführt.

Eine chemotaktische Wirkung von Substanz P auf neutrophile Granulozyten konnte für keine

der eingesetzten Konzentrationen und keinen der untersuchten Zeitpunkte nachgewiesen

werden (Abb. 21). In der Positiv-Kontrolle konnte eine CXCL8-induzierte Migration

neutrophiler Granulozyten von 63 ± 3% (1 h Migration) bzw. 70 ± 3% (2 h Migration)

gemessen werden. In den Negativ-Kontrollen lag die spontane Migrationsrate mit 1 ± 0,2%

(1 h Migration) und 2 ± 0,3% (2 h Migration) auf dem gleichen niedrigen Niveau wie die

Ansätze mit Substanz P. Um eventuelle Zellverluste in den Ansätzen zu überprüfen, wurde

die Summe der Anzahl vitaler neutrophiler Granulozyten aus oberem und unterem

Kompartiment berechnet und verglichen. Es bestand kein signifikanter Unterschied in der

Anzahl vitaler neutrophiler Granulozyten zwischen den mit Substanz P inkubierten Ansätzen

und den Kontrollansätzen.

Ergebnisse

101

Mig

ratio

nsra

te(%

)

Vita

le N

eutr

ophi

le (x

103 )

CXCL8

Medium

SP -8SP -7

0100200300400500600

1 h Migration 2 h Migration

CXCL8

Medium

SP -8SP -7

0

20

40

60

80

Abb. 21: Vergleich der CXCL8- und Substanz P- induzierten Migrationsrate von

neutrophilen Granulozyten nach quantitativer In-vitro-Transmigration.

In der oberen Kammer wurden bovine Leukozyten eingesetzt, die unteren Kammern enthielten CXCL8 (100 ng/mL), Medium (Negativ-Kontrolle) oder SP (1x10-8 mol/L (SP-8) oder 1x10-7 mol/L (SP-7)). Die Migrationsrate (%) und die Anzahl vitaler neutrophiler Granulozyten wurde nach 1 Stunde oder nach 2 Stunden Inkubationszeit ermittelt. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM von 6 Tieren.

Modulierender Einfluss von Substanz P auf die CXCL8-induzierte Migration

Im Folgenden wurde überprüft ob Substanz P die CXCL8-induzierte Migration neutrophiler

Granulozyten beeinflusst. Dazu wurden bovine Leukozyten zusammen mit SP (1x10-7 mol/L

und 1x10-8 mol/L) in das obere Kompartiment der Transmigrationskammer eingesetzt. Im

unteren Kompartiment wurde CXCL8 mit einer Konzentration von 100 ng/mL eingesetzt. Als

Kontrolle dienten Ansätze ohne Substanz P. Auch hier wurde die Migration in Parallel-

ansätzen über 1 und 2 Stunden untersucht. Die Versuche wurden mit Leukozyten von

6 Tieren in Duplikaten durchgeführt.

Bei einer Migrationsdauer von 1 Stunde konnte eine Migrationsrate von 45 ± 7% in den

Kontrollansätzen gemessen werden. Bei mit Substanz P inkubierten Ansätzen war nach

1 Stunde eine Migrationsrate von 34 ± 7% (SP 1x10-8 mol/L) bzw. 28 ± 3% (SP 1x10-7

mol/L) zu beobachten (Abb. 22). Dieser Rückgang migrierter neutrophiler Granulozyten ist

für beide SP-Konzentratioen signifikant (p≤0,01). Bei einer Migrationsdauer von 2 Stunden

konnte gegenüber der Dauer von 1 Stunde eine leicht höhere Migrationsrate (58 ± 6%) in den

Ergebnisse

102

Kontrollansätzen gemessen werden. Die Migrationsrate in den mit SP inkubierten Ansätzen

lag durchschnittlich bei 63 ± 5% (SP 1x10-8 mol/L) bzw. bei 53 ± 5% (SP 1x10-7 mol/L).

**

Mig

ratio

nsra

te(%

)

**

Kontrolle

SP -8SP -7

20

40

60

80

Vita

le N

eutr

ophi

le (x

103 )

Kontrolle

SP -8SP -7

0

200

400

600

800

1000

1 h Migration 2 h Migration

Abb. 22: CXCL8 induzierte Migrationsrate von neutrophilen Granulozyten 1 bzw.

2 Stunden nach Zugabe von Substanz P. In den oberen Teil der Transmigrationskammer wurden PMN mit SP (1x10-7 mol/L (SP-7) und 1x10-8 mol/L (SP-8)) eingesetzt. Im unteren Teil befand sich CXCL8 (100 ng/mL). Nach 1 bzw. 2 h Migrationszeit wurde die Migrationsrate (%) und die Anzahl vitaler neutrophiler Granulozyten (x103) ermittelt. Dargestellt sind Mittelwerte von 6 Tieren ± SEM. Angegebene Signifikanzen beziehen sich auf die Kontrolle (** p≤0,01).

Um zu prüfen, ob es sich bei der Reduktion der Migrationsrate nach 1 Stunde Inkubation mit

Substanz P um einen Verlust der neutrophilen Granulozyten handelt, wurde aus der Summe

der Zellen in oberem und unterem Kompartiment die Anzahl vitaler neutrophiler

Granulozyten berechnet. Wie in Abb. 22 dargestellt, ließ sich eine leichte nicht-signifikante

Reduktion der Zahl vitaler PMN sowohl nach 1 Stunde als auch nach 2 Stunden Migration im

Vergleich zum Kotrollansatz feststellen Eine mögliche lineare Korrelation zwischen

Migrationsrate und Anzahl der vitalen neutrophilen Granulozyten nach 1 Stunde

Migrationsdauer wurde anhand des Pearson Korrelations Koeffizient überprüft. Für Substanz

P in der Konzentration 1x10-8 mol/L ergab sich ein Pearson Koeffizient von r = 0,664, für SP

in der Konzentration 1x10-7 mol/L ein Koeffizient von r = 0,254. Bei der untersuchten

Stichprobenzahl von n=6 sind diese Korrelationskoeffizienten statistisch nicht signifikant.

Ergebnisse

103

4.3.4 Aggregation von Thrombozyten und Granulozyten

In 4.3.3 wurde gezeigt, dass Substanz P die CXCL8-induzierte Migration von neutrophilen

Granulozyten hemmt. Die in das obere Kompartiment eingesetzte Zellsuspension bestand aus

Gesamtleukozyten, was bedeutet dass auch ein gewisser Anteil von Thrombozyten enthalten

war. Im Folgenden sollte der Einfluss von Substanz P auf die Interaktion zwischen

neutrophilen Granulozyten und Thrombozyten untersucht werden.

Dazu wurde die Bildung von Zell-Aggregaten nach Inkubation mit Medium, LPS (5 µg/mL)

oder Substanz P (1x10-6 mol/L) in Zellsuspensionen von PMN und Thrombozyten licht- und

fluoreszenzmikroskopisch erfasst. Aktivierte Thrombozyten wurden durch einen

Fluorochrom-gekoppelten Antikörper gegen P-Selektin markiert. Als Kontrolle dienten

Ansätze ohne Thrombozyten.

Bei reinen PMN wurde weder nach Inkubation mit LPS (Abb. 23, C) noch nach Inkubation

mit Substanz P (Abb. 23, E) eine Bildung von Zell-Aggregaten beobachtet. Bei der

Inkubation von PMN/Thrombozyten Mischkulturen konnten bei Ansätzen mit LPS (Abb. 23,

D) oder Substanz P (Abb. 23, F) deutliche Zell-Aggregate beobachtet werden. In den

Medium-Kontrollen wurden weder bei den reinen PMN noch bei der Mischkultur von PMN

und Thrombozyten Aggregate beobachtet (Abb. 23, A und B).

Ergebnisse

104

A)

Medium

B)

C)

LPS (5 µg/mL)

D)

E)

SP (1x10-6 mol/L)

F)

Abb. 23: Bildung von Zell-Aggregaten nach Stimulation mit LPS oder Substanz P

bei reinen PMN und Mischkulturen mit Thrombozyten. Zellsuspensionen von reinen PMN (A, C und E) und PMN mit Thrombozyten (B, D und F) wurden mit Medium (A und B), LPS (5 µg/mL, C und D) oder SP (1x10-6 mol/L, E und F) über 1 h bei 37°C inkubiert. Dargestellt sind lichtmikroskopische Aufnahmen im Phasenkontrast in 100-facher Vergrößerung.

In den Fluoreszenzaufnahmen wurden in der Medium-Kontrolle vereinzelt aktivierte

Thrombozyten beobachtet (Abb. 24, B), die entweder nicht mit PMN assoziiert waren oder

mit einzelnen bzw. paarweise liegenden PMN vergesellschaftet waren (Abb. 24, A). Die Zell-

Aggregate in den mit LPS inkubierten Ansätzen zeigten in der Fluoreszenz deutliche

Ansammlungen von aktivierten Thrombozyten (Abb. 24, C und D). Ein ähnliches Bild ergab

Ergebnisse

105

sich bei den Ansätzen mit Substanz P. Auch hier waren die Zell-Aggregate mit einer starken

Grünfluoreszenz verbunden (Abb. 24, E und F).

A) B)

D)

F)

C)

E)

Medium

LPS (5 µg/mL)

SP (1x10-6 mol/L)

Abb. 24: Nachweis von aktivierten Thrombozyten in Zell-Aggregaten mit

Granulozyten. Dargestellt sind sequentielle Aufnahmen von Thrombozyten/PMN Mischkulturen in Phasenkontrast (A, C und E) und mit einem Filter für Grünfluoreszenz (B, D und F) in 400-facher Vergrößerung. Die Zellsuspensionen wurden mit einem Fluorochrom gekoppelten Antikörper gegen P-Selektin versetzt und über 1 h mit Medium (A und B), LPS (5 µg/mL, C und D) oder Substanz P (1x10-6 ml/L, E und F) inkubiert. Die Kreise markieren Zell-Aggregate mit aktivierten Thrombozyten.

Ergebnisse

106

4.4 Modulation von Monozyten und Makrophagen durch Substanz P

Eine typische Eigenschaft von Makrophagen und ihren Vorläuferzellen Monozyten ist neben

der Phagozytose und der Antigenpräsentation die Sekretion von Chemokinen und Zytokinen,

mit denen sie den Verlauf des Entzündungsgeschehens maßgeblich beeinflussen. Es sollte

geprüft werden, ob Substanz P die mRNA-Expression der Chemokine CXCL1, CXCL8 und

CCL5 sowie der Zytokine TNF-α und IL-1β von Monozyten und von aus Monozyten

generierten Makrophagen (MdM) moduliert. Außerdem wurde die biologische Wirksamkeit

der Produkte in Zellkulturüberständen von MdM überprüft.

4.4.1 Regulation von Chemokinen und Zytokinen

Monozyten

Bovine Monozyten wurden nach der MAC-Separation und einer 24stündigen Ruhephase mit

SP (1x10-6 mol/L, 1x10-8 mol/L, 1x10-10 mol/L und 1x10-12 mol/L) inkubiert und über 3

Stunden mit LPS (1 µg/mL) stimuliert oder unstimuliert belassen. In der qRT-PCR wurde die

Anzahl der mRNA-Kopien von verschiedenen Chemokinen und Zytokinen ermittelt

(3.3.12.3). Außerdem wurden stimulierte und unstimulierte Ansätze zueinander ins Verhältnis

gesetzt und so das Vielfache der Expression durch die LPS-Stimulation berechnet.

Bei Betrachtung der Chemokin-Regulation in den unstimulierten Ansätzen fällt eine relativ

starke Streuung der Anzahl von Kopien durch die Inkubation mit Substanz P im Vergleich mit

der Medium-Kontrolle auf (Abb. 25). Eine statistisch signifikante Hochregulation ergab sich

für CCL5 bei der SP-Konzentration 1x10-6 mol/L und für CXCL8 bei Substanz P 1x10-8

mol/L (p≤0,05). Bei mit LPS stimulierten Ansätzen fand eine signifikante (p≤0,05)

Hochregulation der Expression von CXCL1 und CCL5 um das 4- (CXCL1) bis 8-fache

(CCL5) statt. Die Expression von CXCL8 wurde durch LPS nicht signifikant hochreguliert.

Im Vergleich zum nur mit LPS stimulierten Ansatz wurde durch eine Inkubation mit Substanz

P (1x10-8 mol/L) die Expression von CCL5 signifikant hochreguliert (p≤0,05). Die

Expression von CXCL1 in LPS-stimulierten Monozyten wurde durch die Anwesenheit von

SP (1x10-8 mol/L, 1x10-10 mol/L und 1x10-12 mol/L) erhöht, die Unterschiede waren jedoch

nicht statistisch signifikant. Ein Effekt von Substanz P auf die CXCL8-Expression nach

Stimulation mit LPS konnte nicht beobachtet werden.

Ergebnisse

107

Auch bei den beiden untersuchten Zytokinen TNF-α und IL-1β wurde bei den mit SP

inkubierten Monozyten eine starke Streuung der Kopienanzahl im Vergleich zur Medium-

Kontrolle beobachtet (Abb. 26). Eine statistisch signifikante Beeinflussung der mRNA-

Expression durch Substanz P konnte nicht gezeigt werden. Durch die Stimulation mit LPS

wurde die Expression von IL-1β im Mittel um das 8-fache (8 ± 1), die von TNF-α um das 15-

fache (15 ± 4) gesteigert. In beiden Fällen war die Hochreguation statistisch signifikant

(p≤0,05). Bei einer zusätzlichen Inkubation der Monozyten mit Substanz P (1x10-6 mol/L)

wurde die Expression von IL-1β nur um das 4-fache (4 ± 1) gesteigert. Somit kommt es bei

Monozyten durch die Inkubation mit Substanz P zu einer wenn auch nicht statistisch

signifikanten so doch stärkeren Basisexpression von IL-1β, die durch eine Stimulation mit

LPS in schwächerem Maße heraufreguliert als im Kontrollansatz.

Ergebnisse

108

CCL5

CXCL8

CXCL1

Anz

ahl K

opie

n

**

**

**

Medium

SP-6SP-8

SP-10SP-12

020000400006000080000

100000120000

LPS

SP-6 +LPS

SP-8 +LPS

SP-10 +LPS

SP-12 +LPS

0

100000

200000

300000

400000

Medium

SP-6SP-8

SP-10SP-12

020000400006000080000

100000120000

LPS

SP-6 +LPS

SP-8 +LPS

SP-10 +LPS

SP-12 +LPS

050000

100000150000200000250000

Medium

SP-6SP-8

SP-10SP-12

0200000400000600000800000

10000001200000

LPS

SP-6 +LPS

SP-8 +LPS

SP-10 +LPS

SP-12 +LPS

0200000400000600000800000

1000000

Abb. 25: Chemokin-Expression in Monozyten unter dem Einfluss von Substanz P

und LPS. Monozyten (n=6) wurden nach 24-stündiger Ruhephase mit SP (1x10-6 mol/L (SP-6), 1x10-8 mol/L (SP-8), 1x10-10 mol/L (SP-10) und 1x10-12 mol/L (SP-12)) inkubiert und über 3 Stunden mit LPS (1 µg/mL) stimuliert oder unstimuliert belassen. Die mRNA-Expression der Chemokine CCL5, CXCL1 und CXCL8 ist in der Anzahl der Kopien in 50 ng Gesamt-RNA angegeben (* p≤0,05).

Ergebnisse

109

TNF α

IL-1ß

Anz

ahl K

opie

n

Medium

SP-6SP-8

SP-10SP-12

0500

10001500200025003000

LPS

SP-6 +LPS

SP-8 +LPS

SP-10 +LPS

SP-12 +LPS

02000400060008000

1000012000

Medium

SP-6SP-8

SP-10SP-12

050000

100000150000200000250000300000

LPS

SP-6 +LPS

SP-8 +LPS

SP-10 +LPS

SP-12 +LPS

0200000400000600000800000

1000000

Abb. 26: Zytokin-Expression in Monozyten unter dem Einfluss von Substanz P und

LPS. Monozyten (n=6) wurden nach 24-stündiger Ruhephase mit SP (1x10-6 mol/L (SP-6), 1x10-8 mol/L (SP-8), 1x10-10 mol/L (SP-10) und 1x10-12 mol/L (SP-12)) inkubiert und über 3 Stunden mit LPS (1 µg/mL) stimuliert oder unstimuliert belassen. Die mRNA-Expression der Zytokine TNF-α und IL-1β ist in der Anzahl der Kopien in 50 ng Gesamt-RNA angegeben. Die Zytokinexpression wurde durch SP nicht signifikant beeinflusst.

Ergebnisse

110

Makrophagen

Aus Monozyten wurden in vitro über 7 Tage Makrophagen (MdM) generiert. Diese

Ausdifferenzierung fand in Anwesenheit von Substanz P (1x10-6 mol/L und 1x10-8 mol/L)

oder in Abwesenheit von Substanz P statt. Nach Abschluss der Ausdifferenzierung wurden

die Zellen über 3 Stunden mit LPS (1 µg/mL) stimuliert oder als unstimulierte Kontrolle

belassen. Wie bei den Monozyten wurden auch für die MdM die Anzahl der Kopien und das

Vielfache der Expression nach Stimulation mit LPS berechnet.

Eine Ausdifferenzierung von MdM in Anwesenheit von Substanz P (1x10-6 mol/L) führte zu

einer Hochregulation der untersuchten Chemokine (Abb. 27). Im Vergleich zur Medium-

Kontrolle war die Expression von CXCL1 nur schwach erhöht, für CCL5 und CXCL8 war die

Steigerung deutlich und statistisch signifikant (p≤0,05). Auffällig war, dass die Anzahl der

mRNA-Kopien weniger stark streuten als bei den Monozyten. Eine Stimulation mit LPS

führte bei den MdM bei allen untersuchten Chemokinen zu einer statistisch sigifikanten

Hochregulation der mRNA-Expression (p≤0,05). Eine Ausdifferenzierung unter Einfluss von

Substanz P führte nach Stimulation mit LPS ebenso zu einer stärkeren Streuung der mRNA-

Kopienanzahlen der Chemokine. Die Expression von CXCL8 nach LPS-Stimulation wurde

durch die Ausdifferenzierung in Anwesenheit von SP (1x10-6 mol/L und 1x10-8 mol/L)

signifikant erhöht im Vergleich zu LPS-Stimulierten MdM ohne SP-Ausdifferenzierung (Abb.

27) (p≤0,05). Betrachtet man die Expression von CCL5 nach Stimulation mit LPS in MdM,

so wurde diese durch die Anwesenheit von Substanz P während der Ausdifferenzierung nicht

erhöht im Vergleich zum Kontrollansatz. Es fiel jedoch auf, dass das Vielfache der

Expression in den unter SP-ausdifferenzierten MdM deutlich geringer ausfiel als in den

Kontrollansätzen. Die durch die Anwesenheit von SP erhöhte Basisexpression wurde durch

die Stimulation mit LPS nicht im gleichen Maße verstärkt wie in den ohne SP-Einfluss

ausdifferenzierten MdM.

Die Expression von TNF-α wurde durch eine Ausdifferenzierung mit Substanz P nicht

signifikant beeinflusst. In LPS-stimulierten MdM konnte für beide Zytokine im Vergleich zu

unstimulierten MdM eine siginifkant höhere mRNA-Expression gemessen werden (p≤0,05).

Bei IL-1β wurde durch Substanz P (1x10-6 mol/L) sowohl bei stimulierten als auch bei

unstimulierten MdM eine signifikante Steigerung der Expression gemessen (Abb. 28)

(p≤0,05).

Ergebnisse

111

CCL5

CXCL1

CXCL8

Anz

ahl K

opie

n

**

**

*

**

Medium

SP-6SP-8

0

500

1000

1500

LPS

SP-6 +LPS

SP-8 +LPS

020000400006000080000

100000120000

Medium

SP-6SP-8

0

500

1000

1500

2000

LPS

SP-6 +LPS

SP-8 +LPS

0250050007500

1000012500

Medium

SP-6SP-8

020000400006000080000

100000

LPS

SP-6 +LPS

SP-8 +LPS

0100000200000300000400000500000

Abb. 27: Chemokin-Expression in MdM nach Ausdifferenzierung unter Substanz

P-Einfluss und Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS).

MdM (n=6) wurden nach Ausdifferenzierung über 7 Tage in Ab- und Anwesenheit von SP (1x10-6 mol/L (SP-6) und 1x10-8 mol/L (SP-8)) mit LPS (1 µg/mL) stimuliert oder unstimuliert belassen. Die mRNA-Expression der Chemokine CCL5, CXCL1 und CXCL8 ist in der Anzahl der Kopien in 50 ng Gesamt-RNA angegeben (* p≤0,05).

Ergebnisse

112

TNF-α

IL-1ß

Anz

ahl K

opie

n

****

Medium

SP-6SP-8

010002000300040005000

LPS

SP-6 +LPS

SP-8 +LPS

0

50000

100000

150000

200000

Medium

SP-6SP-8

05000

100001500020000

LPS

SP-6 +LPS

SP-8 +LPS

0

150000

300000

450000

600000

Abb. 28: Zytokin-Expression in MdM nach Ausdifferenzierung unter Sbstanz P-

Einfluss und Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS).

MdM (n=6) wurden nach Ausdifferenzierung über 7 Tage in Ab- und Anwesenheit von SP (1x10-6 mol/L (SP-6) und 1x10-8 mol/L (SP-8)) mit LPS (1 µg/mL) stimuliert oder unstimuliert belassen. Die mRNA-Expression der Zytokine TNF-α und IL-1β ist in der Anzahl der Kopien in 50 ng Gesamt-RNA angegeben (* p≤0,05).

Ergebnisse

113

4.4.2 Sezernierte Produkte von in-vitro-generierten Makrophagen

Die Regulation der mRNA auf zellulärer Ebene lässt nicht automatisch auf Bildung und

Exozytose des biologisch wirksamen Produkts schließen. Um zu überprüfen, ob die

kultivierten MdM biologisch aktive Produkte bilden, wurden Überstände aus den MdM-

Zellkulturen gewonnen. Zum einen wurde die Modulation des Migrationsverhaltens boviner

Granulozyten durch die Zellkulturüberstände überprüft, zum anderen wurde getestet,

inwieweit Apoptose und Nekrose neutrophiler Granulozyten durch die Überstände beeinflusst

werden.

Die Überstände stammten aus MdM-Kulturen, die in Anwesenheit oder Abwesenheit von

Substanz P (1x10-6 mol/L) ausdifferenzierten und über 24 Stunden mit LPS (1 µg/mL)

stimuliert oder unstimuliert belassen wurden.

4.4.2.1 Modulation der Migrationsrate boviner Granulozyten durch Makrophagen-

Zellkulturüberstände

Im oberen Kompartiment der Transmigrationskammer wurden PMN eingesetzt, im unteren

Kompartiment die Zellkulturüberstände 1:4 in serumfreiem Medium (I0) verdünnt. Nach 2-

stündiger Migration wurden die Proben am Durchflusszytometer getrennt nach neutrophilen

und eosinophilen Granulozyten ausgewertet, die Anzahl der vitalen Zellen in oberem und

unterem Kompartiment mittels Referenzzellmethode bestimmt und die Migrationsrate

berechnet. Als Kontrolle der Spontanmigration diente Medium mit dem entsprechenden

Gehalt an Serum (I 2,5 F). Aus der MdM-Kultur wurden die Überstände (SN) MdM (MdM

ohne Zusatz), MdM + LPS (MdM mit LPS stimuliert), SP-MdM (MdM in Anwesenheit von

SP ausdifferenziert) und SP-MdM + LPS (MdM in Anwesenheit von SP ausdifferenziert und

mit LPS stimuliert) eingesetzt.

Sowohl neutrophile als auch eosinophile Granulozyten zeigten eine relativ hohe

Spontanmigration in den Kontrollansätzen von 43 ± 2% bei den neutrophilen Granulozyten

und 38 ± 5% bei den eosinophilen Granulozyten (Abb. 29). Der Einsatz von Überständen aus

MdM-Kulturen, die in Ab- oder Anwesenheit von SP ausdifferenzierten führte bei

neutrophilen Granulozyten zu einer gesteigerten Migrationsrate. Ebenso führten die

Überstände aus LPS-stimulierten MdM-Kulturen, die in Abwesenheit von SP

ausdiffernzierten, zu einer nicht signifikanten Steigerung der PMN-Migrationsrate. Nur der

Ergebnisse

114

Einsatz von Überständen aus MdM-Kulturen, die unter dem Einfluß von SP ausdiffernzierten,

und die mit LPS stimuliert wurden zeigten eine signifikant (p≤0,01) erhöhte Migration

neutrophiler Granulozyten (61 ± 2%) im Vergleich zu den Überständen aus LPS-stimulierten

MdM-Kulutren (52 ± 2%) (Abb. 29).

Die Migration eosinophiler Granulozyten wurde durch die Überstände insgesamt wenig

beeinflusst (Abb. 29). Allerdings wurde auch hier die Migration durch die Überstände aus SP-

ausdifferenzierten und LPS-stimulierten Kulturen signifikant hochreguliert (p≤0,05).

Damit konnte gezeigt werden, dass die unter SP-Einfluss ausdifferenzierten MdM nach

Stimulation mit LPS mehr chemotaktisch aktive Mediatoren für neutrophile und eosinophile

Granulozyten freisetzen als MdM, die unter SP-freien Bedingungen ausdifferenzierten.

Medium

SN MdM

SN SP-MdM

SN MdM + LPS

SN SP-MdM + LPS

10

20

30

40

50

60

Medium

SN MdM

SN SP-MdM

SN MdM +LPS

SN SP-MdM +LPS

30

40

50

60

70

Mig

ratio

nsra

te%

Mig

ratio

nsra

te%

Neutrophile Granulozyten Eosinophile Granulozyten

***** **** *

Abb. 29: Zellkulturüberstand-induzierte Migrationsrate boviner Granulozyten. In den oberen Kompartimenten der Transmigrationskammer wurden bovine Leukozyten eingesetzt, in den unteren Teil Zellkulturüberstände aus MdM-Kulturen mit SP (1x10-6 mol/L) und LPS (1 µg/mL) in I10F+. Die Überstände wurden 1:4 verdünnt und lagen mit einem Gehalt von 2,5% fetalem Kälberserum (FCS) vor. Als Kontrollansatz diente Medium mit 2,5% FCS. Die Zellen wurden nach 2-stündiger Inkubation quantifiziert und die Migrationsrate berechnet. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM von PMN von 5 Tieren (* p≤0,05; ** p≤0,01).

Ergebnisse

115

4.4.2.2 Modulation der Apoptose und Nekrose boviner Granulozyten

Im Folgenden sollte geprüft werden, ob die Überstände der unter SP-Einfluss kultivierten

MdM den Anteil apoptotischer und die Zahl vitaler neutrophiler Granulozyten nach 24-

stündiger Inkubation modulieren. Dazu wurden die Zellkulturüberstände mit PMN über

24 Stunden inkubiert. Der Anteil von Zellen, die den intrinsichen Pfad der Apoptose

durchlaufen haben, wurde anhand der Bestimmung der Mitochondrien-Depolarisation

durchflusszytometrisch erfasst (3.3.7). Die Anzahl vitaler Zellen wurde mittels Referenz-

zellmethode bestimmt.

Der Anteil apoptotischer neutrophiler Granulozyten nahm bereits durch Kultivierung in

Überständen von MdM, die ohne Einfluss von SP ausdifferenzierten, signifikant ab (Abb. 30)

(p≤0,01). Die Überstände aus MdM-Kulturen, die unter dem Einfluss von Substanz P

ausdifferenzierten (SP-MdM) senkten ebenfalls den Anteil apoptotischer Zellen. Dieser

Abfall war gegenüber den SN-MdM-Überständen signifikant (p≤0,05). Eine Inkubation mit

Überständen von MdM, die mit LPS stimuliert wurden, führte zu einem deutlichen,

signifikanten Abfall des Anteils apoptotischer PMN auf 10 ± 1% (Abb. 30) (p≤0,01).

Die Anzahl vitaler Zellen wurde durch Inkubation mit SP-MdM-Überständen gegenüber

Überständen von MdM, die in Abwesenheit von SP ausdifferenzierten signifikant gesteigert

(Abb. 30) (p≤0,05). Dieser positive Einfluss von Überständen SP-differenzierter MdM konnte

nach dem Einsatz von LPS-stimulierten Zellkulturüberständen, welche die Zahl vitaler PMN

signifikant reduzierte (p≤0,01), nicht beobachtet werden.

Damit konnte gezeigt werden, dass das sezernierte Mediatorspektrum von MdM, die unter

dem Einfluss von Substanz P ausdifferenzierten, sowohl die Apoptose als auch die Nekrose

von bovinen PMN hemmt, ohne das von LPS-induzierte Sterben der PMN deutlich zu

beeinflussen.

Ergebnisse

116

SN MdM

SN SP-MdM

SN MdM + LPS

SN SP-MdM + LPS

05

101520253035 *

**

**

SN MdM

SN SP-MdM

SN MdM + LPS

SN SP-MdM + LPS

100120140160180200220 *

**

**

Vita

le P

MN

(x10

3 )

Apo

ptot

isch

e PM

N (%

)

Abb. 30 : Anteil apoptotischer PMN und Anzahl vitaler PMN nach Inkubation mit

Makrophagen-Zellkulturüberständen. PMN von 24 Tieren wurden 24 h mit Zellkulturüberständen von MdM in vitro inkubiert. Der Anteil apoptotischer Zellen unter Membran-intakten Zellen sowie die Zahl vitaler Zellen wurde durchflusszytometrisch quantifiziert. Geprüft wurden die Überstände von MdM, die nur in Medium ausdifferenzierten (SN MdM) und mit LPS stimuliert wurden (SN MdM+LPS), von MdM, die in Anwesenheit von 1x10-6 mol/L SP ausdifferenzierten (SN SP-MdM), und die mit LPS stimuliert wurden (SN SP-MdM+LPS). LPS wurde in einer Konzentration von 1 µg/mL eingesetzt. Alle Überstände wurden 1:4 mit I0+ verdünnt. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM (* p<0,05, ** p≤0,01).

Diskussion

117

5 Diskussion

In der peripartalen Periode kommt es bei Milchkühen häufig zu schweren Mastitiden, bedingt

durch eine dysregulierte Immunantwort. Über den neuroendokrinen Regelkreis greifen

Neuromediatoren in die Steuerung des Entzündungsgeschehens maßgeblich mit ein. Das

Neuropeptid Substanz P wird sowohl von Immun- als auch von Nervenzellen produziert und

wird beim Menschen mit der Pathophysiologie mehrerer entzündlich bedingter Erkrankungen

in Verbindung gebracht (O'CONNOR et al. 2004). Ein therapeutischer Einsatz von Substanz-

P-Antagonisten wird bei Asthma, Inflammatory Bowel Disease und bei rheumatoider

Arthritis diskutiert (JACOBY et al. 2000; LAVAGNO et al. 2001; KOON u.

POTHOULAKIS 2006). Beim Rind sind die immunmodulatorischen Wirkungen von

Substanz P bisher kaum untersucht worden. In dieser Arbeit wurde die Expression und

Regulation des Substanz-P-Rezeptors sowie die Modulation boviner Immunzellen durch

Substanz P charakterisiert. Die Ergebnisse sollen eine Basis für weitere Studien zur Klärung

der Rolle von Substanz P bei der bovinen Mastitis bieten. Darüber hinaus sollen die

gewonnenen Erkenntnisse dazu beitragen, die Entwicklung möglicher prophylaktischer oder

therapeutischer Konzepte zur Bekämpfung der bovinen Mastitis zu fördern.

5.1 Expression und Regulation des Substanz-P-Rezeptors in vivo und

in vitro

Unter den zurzeit bekannten drei Neurokininrezeptoren (NKR) besitzt Substanz P die höchste

Affinität für den NKR1. Für das Rind konnte die Expression des NKR1 in

Alveolarmakrophagen und Lutealzellen sowie ovariellen Makrophagen nachgewiesen werden

(REIBIGER et al. 2001; BRYLLA et al. 2005; ROGERS et al. 2006). Aus diesem Grund

wurde in der vorliegenden Arbeit ausschließlich die Expression und die Regulation des

hauptsächlichen Substanz-P-Rezeptors NKR1 untersucht.

Diskussion

118

Expression und Regulation in vivo

Eine Beteiligung von Substanz P an der Immunregulation beim Rind setzt voraus, dass SP-

Rezeptoren in dem von der Entzündung betroffenen Gewebe exprimiert werden. In der

vorliegenden Arbeit wurde daher Eutergewebe aus zwei zeitlich und räumlich voneinander

getrennten Mastitismodellen retrospektiv auf die Expression des NKR1 untersucht. In dem

von PETZL (2005) beschriebenen Modell zeigte sich bei einer sequentiellen Infektion von

drei Eutervierteln mit E. coli oder S. aureus eine um mehr als das 10-fache geringere

Expression des SP-Rezeptors bei den mit E. coli infizierten Tieren. Dieser Effekt war bei

allen Infektionszeitspannen (6 h, 12 h und 24 h) und auch bei den Placebovierteln zu

beobachten (Abb. 12). Bei dem von MEYER (2008) beschriebenen Mastitismodell wurde

jeweils eine Gruppe gesunder Kühe (Goldstandard) und eine Gruppe experimentell mit E. coli

infizierter Kühe auf die Expression von NKR1 untersucht. Eine Basisexpression von NKR1

konnte sowohl im Eutergewebe gesunder als auch infizierter Tiere nachgewiesen werden

(Abb. 13). Auffallend war bei diesem Modell, dass die NKR1-Expression bei Tieren, die

6 Stunden mit E. coli infiziert waren, im Bereich der Rezeptor-Expression gesunder Tiere lag.

In den beiden voneinander getrennt durchgeführten Mastitismodellen konnte 24 Stunden nach

der Inokulation mit E. coli eine deutliche Herabregulation der NKR1-Expression beobachtet

werden. Da sich in dem Modell nach MEYER (2008) in der frühen Phase (bis 6 h) einer E.-

coli-Infektion die Expression des Rezeptors nicht von der in gesunden Tieren unterschied,

kann geschlussfolgert werden, dass die Herabregulation kein unmittelbares und schnelles

Ereignis nach Erregerkontakt darstellt. Interessanterweise konnte die Herabregulation nicht

nur im infizierten Viertel sondern auch in den benachbarten nicht infizierten Kontroll- und

Placebovierteln beobachtet werden. Da diese Viertel nachweisbar keinen direkten

Erregerkontakt hatten, kann daraus geschlossen werden, dass die Herabregulation des NKR1

systemisch über induzierte Zytokine oder andere - noch nicht identifizierte - Regelsysteme

induziert wurde. Der in diesem Modell nachgewiesene systemische Effekt erklärt die

Herabregulation der Expression bei den nach PETZL (2005) infizierten Tieren in den

Placebovierteln und in den Vierteln, die kürzer als 24 Stunden infiziert waren. Mit den beiden

zeitlich und räumlich voneinander getrennten Modellen konnte somit reproduzierbar

nachgewiesen werden, dass eine intramammäre Infektion mit E. coli zwischen 6 und

24 Stunden zu einer signifikanten Herabregulation des NKR1 führt.

Diskussion

119

Die Regulation der NKR1-Expression in akuten Stadien der Entzündung ist in der Literatur

kaum beschrieben. In einer Studie von BHATIA et al. (2008) konnte bei akuter Pankreatitis

und damit einhergehenden Lungenschäden eine signifikante Hochregulation des NKR1

sowohl im Pankreas- als auch im Lungengewebe festgestellt werden. Bei chronischen

Entzündungen wird in vielen Studien ebenfalls eine Hochregulation des Substanz P-Rezeptors

beschrieben (ADCOCK et al. 1993; KRAUSE et al. 1995; KINCY-CAIN u. BOST 1996;

CHU et al. 2000; KING et al. 2001). Lediglich GOODE et al. (2000) konnten eine

verminderte Expression von NKR1 in Kolonepithelien von Patienten mit ulzerativer Colitis

feststellen, und führen dies auf eine Herabregulation durch eine verstärkte Substanz-P-

Sekretion im Kolon zurück.

Das Absinken der mRNA-Expression des NKR1 24 Stunden nach einer Infektion mit E. coli

unter die Basisexpression gesunder Tiere könnte verschiedene Ursachen haben. Die

Expression des NKR1 wird unter anderem durch den Transkriptionsfaktor NFκB reguliert

(O'CONNOR et al. 2004). NOTEBAERT et al. (2008) konnten zeigen, dass die Aktivität von

NFκB 6 bis 8 Stunden nach Infektion mit E. coli ihr Maximum erreicht, während sie nach

24 Stunden wieder basale Werte erreicht hat. Bei akuten, durch E. coli ausgelösten

Mastitiden, erreicht die Produktion pro-inflammatorischer Mediatoren, deren Regulation

ebenfalls durch NFκB reguliert wird, 16 Stunden nach Infektion ihren Höhepunkt und

befindet sich nach 24 Stunden bereits wieder im Rückgang (BANNERMAN et al. 2004). Dies

deutet darauf hin, dass zwischen 6 und 24 Stunden nach der Infektion ein negativer

Rückkopplungsmechanismus eingeleitet wird, der die Produktion pro-inflammatorischer

Mediatoren herabreguliert und möglicherweise auch zu einer verminderten Expression des

NKR1 führt. Damit ist jedoch nicht geklärt, warum die NKR1-Expression unter die

Basalwerte gesunder Tiere fiel. Möglicherweise wird durch eine übermäßige Freisetzung von

Substanz P innerhalb der ersten 24 Stunden der Infektion die Expression des NKR1 negativ

beeinflusst, ähnlich wie GOODE et al. (2000) es bei der ulzerativen Colitis vermuten. Die

Herabregulation des SP-Rezeptors während einer akuten E.-coli-Mastitis spielt bei den

Überlegungen zur Entwicklung neuer Behandlungskonzepte eine wichtige Rolle. Der in

humanmedizinischen Studien häufig diskutierte Einsatz von Substanz-P-Antagonisten bei

inflammatorischen Prozessen erscheint während der akuten Phase der E.-coli-Mastitis

aufgrund der systemischen Herabregulation der Rezeptoren zunächst weniger sinnvoll. Ist

Diskussion

120

jedoch die verstärkte Freisetzung von SP während den ersten Stunden und ein damit

verbundener Rückgang der NKR1-Expression wesentlich für die Pathogenese, könnten SP-

Antagonisten durchaus in der Lage sein, den Verlauf einer E.-coli-induzierten Mastitis zu

beeinflussen. Zunächst müssen jedoch weitere Untersuchungen durchgeführt werden, um den

zeitlichen Verlauf der Regulation zwischen 6 und 24 Stunden näher zu beleuchten, und um

vor allem die Expression von Substanz P im Eutergewebe zu bestimmen.

Expression und Regulation in vitro

Unter der Grundhypothese, dass Substanz P die Funktion boviner Leukozyten modulieren

kann, wurde zunächst auf Genexpressionsebene geprüft, ob die eingesetzten Zelltypen

(Lymphozyten, Granulozyten, Monozyten, in-vitro-differenzierten Makrophagen, MdM) den

NKR1 exprimieren (Tab. 8). Eine Basisexpression von NKR1 konnte dabei in allen Zelltypen

festgestellt werden. Interessanterweise lag die Anzahl der mRNA-Kopien in Lymphozyten

und Granulozyten ungefähr um den Faktor 10 höher als bei Monozyten und MdM. Generell

liegen mRNA-Transkripte von G-Protein gekoppelten Rezeptoren in geringen Mengen in der

Zelle vor (O'CONNOR et al. 2004). Die Anzahl der Kopien allein ist daher kein Hinweis auf

eine verminderte Ansprechbarkeit von Monozyten und Makrophagen gegenüber Substanz P.

In Studien mit Monozyten und Makrophagen von Mensch und Ratte kam es zu einer

Hochregulation des NKR1 nach Simulation mit Lipopolysaccharid (LPS) (BOST et al. 1992;

GERMONPRE et al. 1999). Lipopolysaccharide binden an Toll-like Rezeptoren (TLR),

wodurch der Transkriptionsfaktor NFκB aktiviert wird. Dieser induziert die Expression

zahlreicher pro-inflammatorischer Zytokine und Chemokine. Aus diesem Grund erschien es

interessant, ob durch eine Stimulation mit LPS auch die Expression des Substanz-P-Rezeptors

in bovinen Makrophagen und Monozyten reguliert wird. Allerdings konnte nach einer 3-

stündigen Stimulation mit LPS keine Regulation des NKR-1-Rezeptors in Monozyten und

MdM beobachtet werden (Abb. 14), obwohl die nachgewiesene Hochregulation pro-

inflammatorischer Mediatoren (TNF-α, IL-1β, CXCL1, CXCL8, CCL5) die erfolgreiche

Stimulation durch LPS bestätigte (4.4.1). Dies stützt die oben ausgeführte Hypothese, dass ein

direkter Kontakt mit Erregern beim Rind die NKR1-Rezeptorexpression zunächst unberührt

lässt und wahrscheinlich andere Mediatoren für die spätere Herabregulation verantwortlich

sind.

Diskussion

121

5.2 Modulatorischer Einfluss von Substanz P auf bovine Immunzellen

5.2.1 Beeinflussung von Lymphozyten

Aktivierte Lymphozyten können sich je nach Zytokinmilieu in funktionell unterschiedliche

Zellen entwickeln. Voraussetzung hierfür ist die Aktivierbarkeit und die Zellteilung. Daher

wurde die Proliferationsfähigkeit nach einem Stimulus in vitro herangezogen, um

modulierende Effekte von Substanz P zu untersuchen. Die Superantigen-induzierte

Proliferation boviner mononukleärer Zellen wurde in der vorliegenden Studie durch Substanz

P in einem breiten Konzentrationsbereich (1x10-8 bis 1x10-12 mol/L) negativ beeinflusst (Abb.

15), wobei der hemmende Effekt von Substanz P erst nach einer Inkubationszeit von 6 Tagen

auftrat. Es ist nicht klar, ob Substanz P direkt über Bindung an Lymphozyten oder indirekt

über andere Zellen diesen hemmenden Effekt ausübte. In der hier eingesetzten Population der

mononukleären Zellen sind neben T- und B-Lymphozyten auch Blutmonozyten enthalten. Im

Laufe der 6-tägigen Inkubation differenzieren die in den Ansätzen enthaltenen Monozyten

weiter zu Makrophagen aus. Somit kann ein Lymphozytenproliferations-hemmender Effekt

auch dadurch zustande kommen, dass SP die Monozyten bzw. Makrophagen beeinflusst. Von

Substanz P ist bekannt, dass sie zu einer vermehrten Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies

und zu einer verstärkten Produktion von Prostaglandin E2 (PGE2) von Monozyten und

Makrophagen führt (MURRIS-ESPIN et al. 1995; CUESTA et al. 2002). Prostaglandin E2

wiederum kann die Proliferation von Lymphozyten negativ beeinflussen. HENDRICKS et al.

(2000) zeigten, dass eine Stimulation mit dem Superantigen SEA die Produktion von

monozytärem PGE2 induziert. Eine Hemmung der PGE2-Bildung führte zu einer verstärkten

T-Zell-Proliferation zwischen Tag 4 und 6 der In-vitro-Kultur. Eine SP-vermittelte

Produktion von PGE2 könnte somit durchaus zu der beobachteten Beeinträchtigung der T-

Zell-Proliferation geführt haben.

Aus Studien mit humanen lymphoiden Zellen gibt es gegensätzliche Aussagen über die

Beeinflussung der Proliferation mononukleärer Zellen durch Substanz P. Einige Autoren

beschrieben einen proliferationsfördernden Einfluss von Substanz P (PAYAN et al. 1983;

CALVO et al. 1992; RAMESHWAR et al. 1993), während Andere keinen Einfluss der

Proliferation mononukleärer Zellen durch Substanz P feststellen konnten (ZHU et al. 1984;

KRCO et al. 1986; ROBERTS et al. 1992). COVAS et al. (1994) zeigten eine SP-verstärkte

Diskussion

122

Proliferation bei T-Zellen von gesunden Individuen, während es bei immunsupprimierten

Patienten zu einer Hemmung der Proliferation durch Substanz P kam.

In den oben genannten Studien wurde die T-Zell-Proliferation über den Einbau von [3H]-

Thymidin quantifiziert. Die Stärke der Proliferation wird bei dieser Methode gleichgesetzt mit

der Menge der von den Zellen aufgenommenen radioaktiv markierten Nukleotide. So können

einzelne, stark proliferierende Zellen unter vielen toten Zellen dieselbe Signalstärke hervor-

rufen wie eine große Zahl lebender, aber schwächer proliferierender Zellen.

Damit kann jedoch weder die Anzahl der tatsächlich blastisch transformierten Zellen noch die

der durch die Stimulation abgestorbenen Zellen erfasst werden. So konnten nach Stimulation

mit bakteriellen Superantigenen trotz eines signifikanten Zellsterbens hohe Einbauraten von

[3H]-Thymidin gezeigt werden (KABELITZ u. WESSELBORG 1992). Aus diesen Gründen

wurde in der vorliegenden Arbeit die Aktivierung und blastische Transformation von

Lymphozyten nach morphologischen Kriterien über die Anzahl vitaler Blasten

durchflusszytometrisch quantifiziert. Auf diese Weise werden alle Aktivierungsformen

erfasst, die zu einer morphologisch nachweisbaren Proliferation der Zellen führen

(PECHHOLD et al. 1994; HENDRICKS 1998; SCHUBERTH et al. 2001). In der Literatur

wird eine erhöhte Einbaurate von [3H]-Thymidin nach SP-Stimulation mit einer

Proliferationsinduktion durch Substanz P gleichgesetzt. Die für das Rind vorliegenden

Ergebnisse zeigen anhand der reduzierten Blastenzahl eine Proliferationshemmung durch

Substanz P. Kombiniert man die Befunde aus der Literatur mit den vorliegenden Ergebnissen,

so scheint es möglich, dass Substanz P nach initialer Aktivierung der Zellen zu deren

verstärkten Absterben in vitro und zur Hemmung der Zellteilung führt. Eine tiefergehende

Analyse dieses hypothetischen Mechanismus wurde in dieser Arbeit nicht durchgeführt.

5.3 Beeinflussung von Granulozyten

Aktivierung neutrophiler Granulozyten

Ein Schlüsselereignis in aktivierten neutrophilen Granulozyten ist der intrazelluläre Anstieg

von Calcium-Ionen (HALLETT u. LLOYDS 1995). Die Bindung von Substanz P an den G-

Protein-gekoppelten NK-Rezeptor führt über einen Anstieg von Inositol-tri-phosphat und

Diacylglycerol zur Mobilisierung von Calcium-Ionen aus intrazellulären Speichern und zur

Diskussion

123

Bereitstellung von ATP für nachfolgende Stoffwechselleistungen (O'CONNOR et al. 2004).

Die Untersuchungen zur direkten Aktivierung neutrophiler Granulozyten durch Substanz P

ergaben starke individuelle Unterschiede (Abb. 16). Die Zellen von drei der sechs

untersuchten Tiere zeigten eine signifikante Erhöhung des Anteils aktivierter Zellen nach

Stimulation mit Substanz P, während bei den anderen drei Tieren keine Reaktion auf SP

messbar war. Die Substanz-P-sensitiven Tiere zeigten einen transienten Anstieg des Anteils

aktivierter Zellen, der mit 29 ± 7% bei der ersten Messung ungefähr der Hälfte des durch

CXCL8 aktivierbaren Zell-Anteils entsprach. Da sich die Zellen aller Tiere nicht in ihrer

Aktivierbarkeit durch das Calcium-Ionophor Ionomycin oder den physiologischen Stimulus

CXCL8 unterschieden, kann daraus gefolgert werden, dass individuelle Faktoren die

Stimulierbarkeit durch SP beeinflussen. Eine unterschiedliche Rezeptorexpression kann

zumindest für den NKR1 ausgeschlossen werden, da die Zellen aller untersuchten Tiere

zumindest auf mRNA-Ebene den Rezeptor exprimierten. Eine zu geringe Konzentration von

Substanz P, die bei drei Tieren zum Ausbleiben der Reaktion geführt haben könnte, ist eher

unwahrscheinlich. Sie lag mit 3x10-6 mol/L relativ hoch und in einem Bereich, der auch von

anderen Arbeitsgruppen verwendet wurde und zu einem Calcium-Einstrom bei humanen

PMN geführt hat (SERRA et al. 1988; IWAMOTO et al. 1990; LLOYDS u. HALLETT

1993). DIANZANI et al. (2001) konnten jedoch in ihren Studien mit humanen Granulozyten

in der oben genannten Konzentration keinen SP-vermittelten Calcium-Einstrom messen.

Welches die „physiologischere“ Reaktion beim Rind darstellt, kann momentan nicht gesagt

werden. Somit bleibt offen, ob es sich bei den Zellen der drei Rinder, die auf Substanz P mit

einem Calcium-Einstrom reagierten, um in vivo oder durch die Separation bedingt

voraktivierte Zellen gehandelt hat. Für humane neutrophile Granulozyten wurde eine stärkere

und verlängerte Aktivierung durch physiologische Stimuli nach vorherigem Kontakt mit

TNF-α, GM-CSF oder PAF beschrieben (CADWALLADER et al. 2002; BROWN et al.

2004). Eine solches „Priming“ durch höhere Konzentrationen von pro-inflammatorischen

Mediatoren bei den SP-sensitiven Tieren könnte zu einer deutlich messbaren Zell-Aktivierung

durch Substanz P geführt haben. In keinem Fall, weder bei den SP-reaktiven Zellen noch bei

den SP-inerten Zellen, war Substanz P in der Lage den CXCL8-induzierten Calcium-Einstrom

in bovine neutrophile Granulozyten zu verstärken (Abb. 18). Insofern kann SP unter den

Diskussion

124

gewählten In-vitro-Bedingungen eher nicht als vorbereitendes („priming“) Agens für die

Wirkung des Chemokins CXCL8 angesehen werden.

Alle für die Untersuchung verwendeten Tiere wurden in einer Gruppe gehalten, waren also

denselben Haltungs- und Fütterungsbedingungen unterworfen, und zeigten zum Zeitpunkt der

Blutentnahme keine äußerlichen Anzeichen für entzündliche Erkrankungen. HERRMANN et

al. (2007) konnten bei humanen PMN nach Aktivierung eine Wiederherstellung der

intrazellulären Calciumspeicher bei Bereitstellung von Calcium-Ionen im Medium feststellen.

Die Arbeitsgruppe beschrieb jedoch auch, dass die Zellen bei einer erneuten Stimulation mit

einem schwächren Calcium-Einstrom reagierten. Bei den gegenüber Substanz P inerten

Tieren könnte somit eine vorherige Aktivierung die Sensibilität der Zellen soweit

herabgesetzt haben, dass sie erst bei einem stärkeren physiologischen Stimulus wie CXCL8

wieder mit einem messbaren Calcium-Einstrom reagierten.

Beeinflussung der Überlebensrate neutrophiler Granulozyten

Die Regulation der Überlebensrate neutrophiler Granulozyten in entzündetem Gewebe ist ein

wichtiger Mechanismus, um die Funktion dieser Zellpopulation zu gewährleisten, aber auch

um Gewebeschäden zu vermeiden und die Homöostase wiederherzustellen. Dabei spielt

neben der konstitutiven Absterberate auch das durch Mediatoren anderer Zellen vermittelte

Sterben von PMN eine wichtige Rolle. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss von

Substanz P auf die konstitutive Absterberate boviner neutrophiler Granulozyten sowie auf die

Absterberate von PMN in Mischkulturen mit mononukleären Zellen untersucht. Auf die

konstitutive Absterberate von bovinen neutrophilen Granulozyten hatte Substanz P in einem

breiten Konzentrationsbereich (1x10-8 bis 1x10-12 mol/L) keinen Einfluss (Abb. 19). In den

beiden Studien, die den Einfluss von SP auf die konstitutiven Absterberate humaner

neutrophiler Granulozyten untersuchten, wurde dagegen ein anti-apoptotischer Effekt von

Substanz P beschrieben (BOCKMANN et al. 2001; MACKINNON et al. 2002).

In Mischkulturen von bovinen neutrophilen Granulozyten und MNC konnte nach Stimulation

mit molekularen Erregermustern (SEA, LPS, CpG-Motive) ein akzeleriertes Sterben

neutrophiler Granulozyten beobachtet werden (KRÜGER 2001; SCHUBERTH et al. 2004).

Dieses System wurde hier aufgegriffen und um den Zusatz von Substanz P erweitert. Hierbei

zeigte sich ebenfalls keine Beeinflussung der Überlebensrate neutrophiler Granulozyten durch

Diskussion

125

Substanz P (Abb. 20). Auch das nach Stimulation mit LPS durch mononukleäre Zellen

vermittelte, akzelerierte Absterben neutrophiler Granulozyten wurde bei zeitgleicher

Inkubation mit Substanz P nicht beeinflusst (Abb. 20). Jedoch konnten bei einer

Vorinkubation der Mischkultur mit Substanz P über 2 Stunden vor Zugabe von LPS in der

Einzeltieranalyse bei 2 von 5 Tieren individuelle Modulationen durch Substanz P festgestellt

werden (Tab. 10). Die Tiere zeigten eine deutliche Reduktion des Anteils lebender

neutrophiler Granulozyten im Vergleich zu den Kontrollansätzen. Bei diesen beiden Tieren

war Substanz P offensichtlich in der Lage, die Reaktionsfähigkeit der Zellen gegenüber dem

PAMP zu steigern. Bei einem Tier konnte in den Ansätzen mit geringen Konzentrationen von

Substanz P (1x10-10mol/L und 1x10-12 mol/L) eine Reduktion des Anteils vitaler Zellen um

etwa die Hälfte beobachtet werden, während in der höheren SP-Konzentration (1x10-8 mol/L)

der Effekt schwächer ausfiel. Bei Ansätzen mit den Zellen des anderen Tieres hingegen zeigte

sich eine SP-bedingte Reduktion der vitalen PMN nur in der höchsten SP-Konzentration.

Diese heterogenen Ergebnisse deuten an, dass Substanz P auf eine individuelle Weise die

Reaktionsfähigkeit der eingesetzten Zellen auf das Erregermuster LPS moduliert. Unklar

bleibt, ob die Modulation durch Substanz P die Expression der Toll-like Rezeptoren (TLR)

für LPS, oder die Induktion von Zytokinen und anderen apoptose-förderden Mediatoren

betrifft. Wie auch bei der beobachteten Hemmung der Blastogenese (5.2.1) scheint Substanz

P nach Stimulation mit molekularen Erregermustern in mononukleären Zellen die Sekretion

von Mediatoren zu fördern, die das Absterben von PMN beschleunigen. Die individuelle

Varianz könnte, ähnlich wie bei der Aktivierung boviner PMN, auch hier von nicht

identifizierten individuellen Faktoren abhängig sein.

Beeinflussung der Migration neutrophiler Granulozyten und deren Interaktion mit

Thrombozyten

Die rasche Migration einer ausreichenden Zahl neutrophiler Granulozyten in entzündetes

Gewebe ist Voraussetzung einer erfolgreichen Erregerelimination. Eine direkte

chemotaktische Wirkung von Substanz P auf bovine neutrophile Granulozyten konnte in den

vorliegenden Studien nicht gezeigt werden (Abb. 21). Daraufhin wurde die Modulation der

CXCL8-induzierten Migration von neutrophilen Granulozyten untersucht. Die Anwesenheit

von Substanz P reduzierte die Migrationsrate neutrophiler Granulozyten nach einer Stunde

Diskussion

126

zwar schwach, aber signifikant um 10% (SP 1x10-8mol/L) bzw. 17% (SP 1x10-7mol/L) (Abb.

22). Nach 2-stündiger Migration in vitro konnte keine SP-vermittelte Modulation der

Migrationsraten festgestellt werden. Damit wurde eine transiente Beeinflussung der

Migrationsfähigkeit durch Substanz P nachgewiesen.

Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu In-vitro-Studien mit neutrophilen Granulozyten von

Menschen und Nagern, in denen Substanz P eine chemotaktische Wirkung aufwies

(PERIANIN et al. 1989; IWAMOTO et al. 1990; FRANCO-PENTEADO et al. 2005).

Möglicherweise hängt dies mit dem weiter oben beschriebenen Priming-Effekt von Substanz

P für CXCL8 zusammen, der für humane Granulozyten beschrieben wurde, für bovine PMN

aber nicht bestätigt werden konnte. Damit stützen sich der fehlende SP-Priming-Effekt für

CXCL8 und die transiente Inhibition der Migration boviner PMN.

Die Anzahl vitaler Zellen in den Ansätzen mit Substanz P war verglichen mit der Kontrolle zu

beiden Messzeitpunkten leicht, jedoch nicht signifikant reduziert (Abb. 22). Somit kann für

die transiente Hemmung der Migration eine verringerte Vitalität der PMN ausgeschlossen

werden.

Im Gegensatz zu anderen humanen Studien beschrieben WIEDERMANN et al. (1991)

ebenfalls eine hemmende Wirkung von Substanz P auf die CXCL8-induzierte Migration

humaner neutrophiler Granulozyten. Die Arbeitsgruppe führte den Effekt auf den N-

terminalen Teil von Substanz P zurück, der in der Sequenz dem Peptid Tuftsin ähnelt. Tuftsin

reduziert ebenfalls die Migration humaner neutrophiler Granulozyten. Der Einsatz eines

Tuftsin-Antagonisten konnte die durch Substanz P ausgelöste Hemmung der Migration

teilweise aufheben. Dieser Mechanismus erklärt jedoch nicht die zeitliche Beschränkung der

hemmenden Wirkung von Substanz P bei bovinen PMN.

In der hier eingesetzten Zellsuspension waren neben neutrophilen Granulozyten und MNC

auch Thrombozyten enthalten. Thrombozyten spielen bei der Aktivierung und Rekrutierung

von neutrophilen Granulozyten eine wichtige Rolle, die auch für das Rind beschrieben ist

(COOMBER et al. 2001; ZARBOCK et al. 2007). Die Bindung von Thrombozyten an

Endothelzellen einerseits und die Adhäsion von PMN an Thrombozyten andererseits führt zu

einer verstärkten Rekrutierung und Aktivierung neutrophiler Granulozyten. Das Anhaften und

Rollen von PMN über Thrombozyten wird durch P-Selektin auf Thrombozyten und den P-

Selektin-Ligand-1 auf PMN vermittelt (DE GAETANO et al. 1999). GRAHAM et al. (2004)

Diskussion

127

konnten eine Aktivierung von humanen Thrombozyten durch Substanz P feststellen. So

könnte die in der vorliegenden Studie beobachtete temporäre Hemmung der Migration

boviner PMN in der Anwesenheit von Substanz P auf einer initial verstärkten Aktivierung

von Thrombozyten beruhen. Diese Thrombozyten-Aktivierung könnte zu einer reversiblen

Adhäsion von PMN und Thrombozyten geführt haben, die im Verlauf der Inkubation durch

den CXCL8-Gradienten größtenteils wieder aufgehoben wurde. Die leicht reduzierte Anzahl

vitaler PMN kann durch die Bildung von größeren Aggregaten erklärt werden. Diese konnten

aufgrund ihrer Größe und Komplexität unter Umständen durch das Durchflusszytometer

morphologisch nicht als PMN erfasst werden.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde exemplarisch untersucht, ob Substanz P bei Mischkulturen

von bovinen Thrombozyten und Granulozyten zur Aktivierung und Aggregat-Bildung führt.

Um aktivierte Thrombozyten in den Zellaggregaten nachzuweisen, wurde ein fluorochrom-

gekoppelter Antikörper gegen P-Selektin eingesetzt. Die Versuche zeigten nach Stimulation

mit LPS oder Substanz P eine deutliche Aggregat-Bildung in Thrombozyten-Granulozyten

Mischkulturen (Abb. 23; D und F). Bei Kulturen von reinen PMN führte keiner der beiden

Stimuli zur Entstehung von Zell-Aggregaten (Abb. 23, C und E). Die Thrombozyten-

Granulozyten-Aggregate entstanden nach 1 Stunde Inkubation mit den Stimuli und wiesen

einen hohen Gehalt von aktivierten, P-Selektin-positiven Thrombozyten auf (Abb. 24, D und

F). Das an der Oberfläche aktivierter Thrombozyten ausgebildete P-Selektin spielt eine

wichtige Rolle bei der Entstehung von Aggregaten mit neutrophilen Granulozyten (LARSEN

et al. 1989; HAMBURGER u. MCEVER 1990; EVANGELISTA et al. 1996). Die

Stimulation der Mischkulturen mit LPS sollte laut CLARK et al. (2007) zu einer Aggregat-

Bildung von PMN und Thrombozyten ohne die Expression von P-Selektin führen. Die in der

vorliegenden Studie beobachteten P-Selektin-positiven Aggregate nach LPS-Stimulation

könnten auf eine tierartspezifische Reaktion boviner Thrombozyten zurückzuführen, oder

sekundär durch Wechselwirkungen zwischen den Zellen entstanden sein. Die Aktivierungs-

mechanismen von Substanz P und LPS sind jedoch nicht gleichzusetzen, da die beiden

Stimuli an unterschiedliche Rezeptoren binden. Der Rezeptor für LPS (TLR4) ist ein Typ-I-

Transmembranrezeptor, während Substanz P an einen G-Protein gekoppelten Rezeptor bindet.

Dadurch werden jeweils unterschiedliche „Second messenger“ aktiviert.

Diskussion

128

Damit konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Substanz P die Aggregation

von bovinen neutrophilen Granulozyten mit Thrombozyten fördert. Diese Aggregation ist mit

einer Aktivierung der Thrombozyten und der Expression von P-Selektin an deren Oberfläche

verbunden. Die Interaktion von neutrophilen Granulozyten mit P-Selektin ist unter

physiologischen Bedingungen einer schnellen Assoziation und Dissoziation unterworfen

(LAWRENCE u. SPRINGER 1991; ALON et al. 1995). Somit könnte die temporäre, SP-

bedingte Hemmung der Migrationsrate durch das Entstehen von Thrombozyten-PMN-

Aggregaten erklärt werden, die im Verlauf der Inkubationszeit wieder dissoziieren.

5.3.1 Beeinflussung von Monozyten und Makrophagen

In den durchgeführten Studien zur Blastogenese von Lymphozyten (5.2.1) und zur

Überlebensrate neutrophiler Granulozyten (5.3) wurde der Effekt von Substanz P

hypothetisch auf die Produktion von Mediatoren von Monozyten oder Makrophagen

zurückgeführt. Um dies näher zu analysieren, wurde im Rahmen dieser Arbeit der Einfluss

von Substanz P auf die Expression von pro-inflammatorischen Mediatoren in Monozyten und

aus Monozyten generierten Makrophagen (MdM) untersucht. Überdies wurde untersucht,

inwieweit sich die Anwesenheit von Substanz P auf den Differenzierungsprozess von

Monozyten in Makrophagen auswirkt. Von besonderem Interesse war neben der Basis-

expression von Mediatoren auch die Expression nach LPS-Stimulation. Die Ergebnisse

belegen, dass eine Anwesenheit von Substanz P (1x10-6-1x10-8 mol/L) während der

Monozytendifferenzierung die Basisexpression von Chemokinen, die zentral sind für die

Rekrutierung und Aktivierung von Granulozyten und Monozyten (CXCL8, CCL5) in

Monozyten und MdM heraufreguliert (Abb. 25, Abb. 27). Bei MdM wird außerdem die

Expression von IL-1β, einem klassischen pro-inflammatorischen Zytokin signifikant verstärkt

(Abb. 28). Bei Monozyten konnte im Vergleich zu den ausdifferenzierten Zellen eine deutlich

stärkere Streuung der Expressionsstärken in Anwesenheit von Substanz P beobachtet werden.

Dies deutet auf eine individuell unterschiedliche Reaktion auf das Neuropeptid hin (Abb. 25,

Abb. 26). Nach einer 3-stündigen Stimulation mit LPS kam es sowohl bei Monozyten als

auch bei MdM zu einer deutlichen Heraufregulation aller Mediatoren. Dabei fiel auf, dass die

MdM generell mit einer stärkeren Heraufregulation der mRNA-Expression reagierten als die

Monozyten, was auf eine höhere Reaktionsbereitschaft ausdifferenzierter Zellen hinweist.

Diskussion

129

Dieses Phänomen wird auch von AHMED et al. (2007) für bovine Monozyten und

Makrophagen beschrieben. Makrophagen, die in Anwesenheit von Substanz P kultiviert

wurden, zeigten nach einer Stimulation mit LPS eine signifikant höhere Expression von

CXCL8 und IL-1β, während in Monozyten unter SP-Einfluss nach LPS-Stimulation nur das

Chemokin CCL5 signifikant heraufreguliert wurde. Die Expression von TNF-α wurde weder

in Monozyten noch in MdM signifikant durch die Anwesenheit von Substanz P beeinflusst.

Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zu der bei bovinen Alveolarmakrophagen beschriebenen

Heraufregulation von TNF-α durch Substanz P (ROGERS et al. 2006). Die in der Studie

verwendeten Alveolarmakrophagen unterliegen jedoch ganz anderen Bedingungen als die für

die vorliegende Studie verwendeten MdM. Dies könnte eventuell die unterschiedliche

Beeinflussbarkeit in der mRNA-Expression durch Substanz P erklären.

Die Anwesenheit von Substanz P während der Ausdifferenzierung von bovinen Makrophagen

beeinflusst deren Reaktion auf LPS maßgeblich. Das auf mRNA-Ebene vermehrt exprimierte

Chemokin CXCL8 fördert die Rekrutierung und Aktivierung von neutrophilen Granulozyten.

Durch die gesteigerte Expression von IL-1β werden auf Endothelzellen vermehrt

Adhäsionsmoleküle gebildet und die Expression von Chemokinen heraufreguliert

(DINARELLO 1994), so dass die Migration von neutrophilen Granulozyten in entzündetes

Gewebe weiter begünstigt wird. Außerdem wirken sowohl CXCL8 als auch IL-1β anti-

apoptotisch auf PMN (MAIANSKI et al. 2004b; LUO u. LOISON 2008) und verlängern so

deren Überlebenszeit in entzündetem Gewebe. Dieser „Priming“-Effekt von Substanz P auf

die Expression von IL-1β in Makrophagen steht in Analogie zu bereits beschriebenen

Effekten von Substanz P auf murine Zellen (BERMAN et al. 1996).

Insgesamt deuten diese Ergebnisse beim Rind auf eine pro-inflammatorische Rolle von

Substanz P hin.

Die Heraufregulation eines Mediators auf mRNA-Ebene kann nicht automatisch mit einer

gesteigerten Sekretion des biologisch wirksamen Produkts gleichgesetzt werden. Daher

wurden Zellkulturüberstände von MdM, die in An- oder Abwesenheit von Substanz P

generiert wurden auf ihre chemotaktische Wirkung auf PMN sowie auf die Beeinflussung der

Absterberate von PMN untersucht. Um die bekannte chemotaktische Wirkung des fetalen

Kälberserums im Kulturmedium (FRANCEY et al. 1992; KADRI et al. 2007) nicht dominant

werden zu lassen, und um nicht den Effekt der von MdM sezernierten Mediatoren zu

Diskussion

130

überlagern, wurden die Zellkulturüberstände der in-vitro-generierten Makrophagen 1:4 mit

serumfreiem Medium verdünnt.

Dennoch führte der Gehalt von 2,5% fetalem Kälberserum zu einer relativ hohen

Spontanmigration der PMN in der Transmigrationskammer von etwa 43% (Abb. 29).

Allerdings erhöhte der Einsatz von Kulturüberständen von MdM den Anteil migrierter

neutrophiler Granulozyten im Vergleich zur Mediumkontrolle. Dies belegt, dass die in-vitro-

kultivierten MdM in der Lage waren, biologische aktive Chemokine zu sezernieren. Die

Überstände der unter SP-Einfluss kultivierten unstimulierten MdM steigerten die Migration

neutrophiler Granulozyten nur geringfügig. Allerdings vermochten die unter SP-

ausdifferenzierten MdM nach LPS-Stimulation signifikant mehr „Neutrophilen-Chemokine“

zu sezernieren als Zellen, die ohne Einfluss von SP ausdifferenzierten. Die Migration von

eosinophilen Granulozyten wurde insgesamt weniger stark durch die Zellkulturüberstände

beeinflusst (Abb. 29). Eine leichte, aber signifikante Steigerung der Migrationsrate konnte

jedoch auch durch die Überstände von SP-ausdifferenzierten, LPS-Stimulierten MdM

beobachtet werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Makrophagen, die unter In-vitro-

Bedingungen in Anwesenheit von Substanz P ausdifferenzieren, nicht nur auf mRNA-Ebene

vermehrt chemotaktische Mediatoren exprimieren, sondern diese auch nach Stimulation

verstärkt sezernieren.

Das Absterbeverhalten neutrophiler Granulozyten ist ein kritischer Prozess für die Regulation

der Immunantwort. Im In-vitro-Modell wurde der modulierende Einfluss der Zellkultur-

überstände auf Apoptose und Nekrose von bovinen PMN untersucht. Mit der hier

angewandten Methode wurde der Anteil PMN erfasst, die den intrinsischen Pfad der

Apoptose durchlaufen hatten. Dieser Mechanismus ist am bedeutendsten für das konstitutive

Absterben von neutrophilen Granulozyten (MAIANSKI et al. 2004b; LUO u. LOISON 2008).

Der Anteil nekrotischer Zellen ist durchflusszytometrisch schwer zu erfassen, daher wurde die

Anzahl vitaler Zellen zur Beurteilung herangezogen.

Eine 24-stündige Inkubation mit Überständen aus MdM-Kulturen führte zu einer

signifikanten Verringerung des Anteils apoptotischer PMN (Abb. 30). Interessanterweise

koinzidierte dies mit einer Verringerung der Zahl vitaler Zellen. Dies kann so interpretiert

werden, dass das Mediatorspektrum im Medium zu einer akzelerierten Sekundärnekrose der

PMN in vitro geführt hat. Die Überstände wirken somit nicht, wie man aus der geringeren

Diskussion

131

Apoptoserate ableiten könnte, anti-apoptotisch. Überstände von unter SP-Einfluss aus-

differenzierten MdM konnten den Anteil apoptotischer Zellen noch weiter senken. Die

Unterschiede waren zwar geringfügig aber signifikant und belegen auch hier den Einfluss des

Neuromediators. Überdies führten die Überstände aus SP-ausdifferenzierten Kulturen zu einer

signifikant höheren Zahl vitaler PMN als in den Kontrollen. Somit belegt dies den sowohl

anti-apoptotischen Charakter des SP-induzierten Mediatorspektrums, welches zudem noch die

Sekundärnekrose von PMN hemmt.

Neutrophile Granulozyten, die mit Überständen von LPS-stimulierten MdM inkubiert

wurden, zeigten einen starken Rückgang apoptotischer Zellen auf unter 10%. Dieses

Phänomen ist auch für humane PMN beschrieben und wird auf eine Modulation der pro-

apoptotischen Bcl-2-Proteinen zurückgeführt (POWER et al. 2004; FRANCOIS et al. 2005).

Diese LPS-induzierte Hemmung der Apoptose wurde durch eine SP-beeinflusste

Ausdifferenzierung der MdM nicht verändert. Ebenso führte die Inkubation mit Überständen

LPS-stimulierter MdM-Kulturen zu einem signifikanten, akzelerierten Absterben von

neutrophilen Granulozyten, das ebenfalls durch eine Ausdifferenzierung in Anwesenheit von

Substanz P nicht beeinflusst wurde.

Die Anwesenheit von Substanz P während der Ausdifferenzierung von MdM führt zur

Freisetzung eines Mediatorspektrums, das sowohl die Apoptose als auch die Nekrose von

neutrophilen Granulozyten hemmt. Dadurch kommt es zu einer verlängerten Aktivität der

PMN am Ort der Entzündung.

Insgesamt haben diese Analysen bestätigt, dass die auf mRNA-Ebene gesteigerte Expression

von Chemokinen und Zytokinen sich in der Expression von biologisch wirksamen Produkten

widerspiegelt. Substanz P scheint durch seine Effekte auf monozytäre Zellen zu einer

vermehrten Rekrutierung und Aktivierung neutrophiler Granulozyten zu führen sowie deren

Lebensspanne zu verlängern.

Diskussion

132

5.4 Ausblick

Die vorliegende Arbeit sollte möglichst breit gefächert eine Charakterisierung der

modulatorischen Wirkung von Substanz P auf bovine Immunzellen liefern. Zum

überwiegenden Teil wurden die bearbeiteten Fragestellungen noch nicht beim Rind

untersucht. Die zentralen Ergebnisse dieser Arbeit liegen in der Modulation boviner

Granulozyten und Makrophagen. Substanz P ist in der Lage bovine PMN zu aktivieren. Eine

Ausdifferenzierung von Makrophagen in Anwesenheit von Substanz P verstärkt die Bildung

von Mediatoren, die zentral für die Rekrutierung neutrophiler Granulozyten sind und deren

Lebensspanne verlängern. Diese Ergebnisse legen einen maßgeblichen Einfluss von Substanz

P bei der Ausbildung der Immunantwort während der initialen Phase einer Entzündung nahe.

Die Untersuchungen auf zellulärer Ebene zeigten eine individuell unterschiedliche

Reaktionsbereitschaft von neutrophilen Granulozyten auf Substanz P. Weiterführende Studien

sollten der wiederholt beobachteten Individualität zellulärer Reaktionen stärker Rechnung

tragen und genauer prüfen, inwieweit eine In-vivo-Voraktivierung der Zellen bereits

stattgefunden hat. Dies schließt eine breiter gefächerte Analyse möglicher

Entzündungsmediatoren im Blut mit ein. Die Wirkung von Substanz P auf bovine

Thrombozyten ist ein weiterer viel versprechender Aspekt des immunmodulatorischen

Potentials von Substanz P, der in dieser Arbeit gegen Ende nur ansatzweise und exemplarisch

untersucht werden konnte. Hier gilt es genauer zu analysieren, wie sich Art und Dauer der

Thrombozytenaktivierung durch Substanz P von einer Aktivierung durch physiologische

(Thrombin, ADP) und bakterielle Produkte (z.B. LPS) unterscheidet.

Neutrophile Granulozyten und Makrophagen stellen die Haupteffektorzellen zu Beginn der

bovinen Mastitis dar. Die Fähigkeit von Substanz P, Anzahl und Funktion dieser

Haupteffektorzellen zu modulieren, lässt das Neuropeptid als guten Kandidaten für einen

therapeutischen oder prophylaktischen Behandlungsansatz erscheinen. In der Humanmedizin

wird vermehrt der Einsatz von Substanz-P-Antagonisten diskutiert, um bei chronischen

Entzündungen wie rheumatoider Arthritis und Inflammatory Bowel Disease die

Immunantwort zu modulieren (LAVAGNO et al. 2001; KOON u. POTHOULAKIS 2006).

JACOBY et al. (2000) liefern einen Ansatz für einen möglichen therapeutischen Nutzen von

SP-Antagonisten bei Viruserkrankungen des Respirationstrakts. BOOT et al. (2007) bewerten

den Einsatz von SP-Antagonisten bei allergischem Asthma jedoch kritisch. Die Arbeitsgruppe

Diskussion

133

konnte bei multiplen Anwendungen eine verstärkte allergen-induzierte Reaktion der

Atemwege beobachten. Die vorliegenden Ergebnisse aus den In-vivo-Versuchen am

Mastitismodell legen sowohl therapeutische als auch prophylaktische

Anwendungsmöglichkeiten für Substanz-P-Antagonisten nahe. Für die weitere Entwicklung

therapeutischer oder prophylaktischer Konzepte beim Rind ist der Zusammenhang zwischen

SP-Sekretion und Rezeptorregulation in der frühen Phase der E.-coli-Masitis ein

entscheidender Punkt und sollte daher in weiterführenden Studien geklärt werden.

Zusammenfassung

134

6 Zusammenfassung

Anja Sipka Charakterisierung der immunmodulatorischen Wirkung des Neuro-

mediators Substanz P auf bovine Immunzellen

Eine Dysregulation der Immunantwort ist bei Milchkühen in der peripartalen Periode häufig

die Ursache für schwerwiegende Mastitiden. Über den neuroendokrinen Regelkreis greifen

Neuromediatoren in die Steuerung des Entzündungsgeschehens maßgeblich mit ein. Das

Neuropeptid Substanz P wirkt modulatorisch auf humane und murine Immunzellen, und wird

mit der Pathophysiologie verschiedener entzündlicher Erkrankungen beim Menschen in

Verbindung gebracht. Die Auswirkungen von Substanz P auf das bovine Immunsystem sind

bisher nur sehr wenig erforscht. In der vorliegenden Arbeit wurden daher die Expression und

Regulation des hauptsächlichen Substanz-P-Rezeptors NKR1 beim Rind sowie die

Modulation boviner Immunzellen durch Substanz P untersucht.

Die Expression und Regulation des NKR1 wurde mittels quantitativer rt-PCR in

Eutergewebeproben aus zwei konzeptionell unterschiedlichen Mastitismodellen analysiert.

Während die mRNA-Expression bei mit S. aureus infizierten Tieren unbeeinflusst auf dem

Niveau nicht-infizierter Tiere blieb, konnte in beiden Tiermodellen bei den mit E. coli

infizierten Tieren frühestens nach 24 Stunden eine systemische Herabregulation der mRNA-

Expression um mehr als das 10-fache festgestellt werden. Somit konnte reproduzierbar eine

Regulation des hauptsächlichen Substanz-P-Rezeptors während der initialen Phase einer

akuten Mastitis in vivo demonstriert werden.

Die Expression des NKR1 konnte überdies in Lymphozyten-Subpopulationen, Granulozyten,

Monozyten und in in-vitro-differenzierten Makrophagen (MdM) nachgewiesen werden. Eine

3-stündige Stimulation mit Lipopolysaccharid in vitro war nicht in der Lage das NKR1-

Expressionsniveau in Monozyten und in MdM zu verändern. Dies stützt die aus den In-vivo-

Modellen erhaltenen Ergebnisse, die ebenfalls keine Beeinflussung der Rezeptor-Regulation

innerhalb der ersten 6 Stunden einer E.-coli-Mastitis zeigten.

Im zweiten Teil der Arbeit wurde der modulatorische Einfluss von Substanz P auf

funktionelle Eigenschaften von Lymphozyten, Granulozyten, Monozyten und in vitro

generierter Makrophagen untersucht.

Zusammenfassung

135

Die Superantigen-induzierte Proliferation boviner Lymphozyten wurde durch Substanz P in

einem breiten Konzentrationsbereich (1x10-8 - 1x10-12 mol/L) gehemmt. Dieser nach 6 Tagen

In-vitro-Kultur auftretende Effekt ist vermutlich auf eine initiale Aktivierung monozytärer

Zellen und eine darauf folgende Produktion proliferations-hemmender Mediatoren

zurückzuführen.

Gemessen am intrazellulären Calcium-Einstrom konnte Substanz P (3x10-6 mol/L) bei der

Hälfte der untersuchten Tiere neutrophile Granulozyten direkt aktivieren. Da die Zellen aller

Tiere in gleichem Maße auf das Chemokin CXCL8 reagierten, lässt dies darauf schließen,

dass individuelle Faktoren die Stimulierbarkeit durch Substanz P beeinflussen. Bei keinem

der beiden Phänotypen konnte eine Vorinkubation mit Substanz P den nachfolgenden

CXCL8-induzierten Calcium-Einstrom verstärken.

Substanz P hatte im Konzentrationsbereich von 1x10-8 - 1x10-12 mol/L keinen Einfluss auf die

konstitutive Absterberate von neutrophilen Granulozyten (PMN). Auch das nach Stimulation

mit LPS durch mononukleäre Zellen vermittelte, akzelerierte Sterben neutrophiler

Granulozyten wurde in Anwesenheit von Substanz P nicht beeinflusst. Substanz P erwies sich

überdies als nicht direkt chemotaktisch aktiv für bovine neutrophile Granulozyten. Allerdings

wurde die CXCL8-induzierte Migration neutrophiler Granulozyten in Anwesenheit von

Substanz P transient gehemmt. Hierfür könnte eine Aggregatbildung zwischen neutrophilen

Granulozyten und Thrombozyten verantwortlich sein, da fluoreszenzmikroskopisch gezeigt

werden konnte, dass SP zur Aktivierung von Thrombozyten (gemessen an der P-Selektin-

Expression) und deren Bindung an PMN führt. Ob dieses Phänomen auch in vivo zur

Hemmung der Migration von neutrophilen Granulozyten beiträgt, sollte in weiterführenden

Studien geklärt werden.

Die Anwesenheit von Substanz P (1x10-6-1x10-8 mol/L) während der Monozyten-

differenzierung erhöhte signifikant die Basisexpression von Chemokinen, die zentral für die

Rekrutierung und Aktivierung von Granulozyten und Monozyten sind (CXCL8, CCL5),

sowie die Expression von IL-1β, einem klassischen pro-inflammatorischen Zytokin.

Makrophagen, die in Anwesenheit von Substanz P kultiviert wurden, zeigten nach einer

Stimulation mit LPS eine signifikant höhere Expression von CXCL8 und IL-1β, während in

Monozyten unter SP-Einfluss nach LPS-Stimulation nur CCL5 signifikant herauf reguliert

wurde. Kulturüberstände in vitro aktivierter MdM, die in Gegenwart von Substanz P

Zusammenfassung

136

ausdifferenzierten wirkten chemotaktisch auf PMN und hemmten sowohl die Apoptose als

auch die Nekrose von neutrophilen Granulozyten. Dies belegte indirekt die funktionelle

Bedeutung des durch Substanz P veränderten Expressionsmusters auf mRNA-Ebene.

Insgesamt konnte eine hauptsächlich pro-inflammatorische Wirkung von Substanz P auf

bovine Immunzellen gezeigt werden. Substanz P kann durch die Förderung der Aktivierung

und der Rekrutierung neutrophiler Granulozyten sowie durch die Modulation des

exprimierten Mediatorspektrums von Makrophagen einen Einfluss auf entscheidende

Prozesse in der initialen Phase der Mastitis nehmen. Die Eigenschaften dieses Neuropeptids

bieten somit potentielle Ansatzpunkte für prophylaktische oder therapeutische Konzepte zur

Bekämpfung der bovinen Mastitis.

Summary

137

7 Summary

Anja Sipka: Charakterization of modulatory properties of the neuromediator

substance P on cells of the bovine immune system

Dairy cows are particularly susceptible to severe mastits during the perparturient period which

is associated with an impaired regulation of the immune response. Neuromediators have a

decisive influence on inflammatory processes via the neuro-endocrine regulation circuit. The

neuropeptide substance P modulates human and murine immune cells and is involved in the

pathophysiology of several inflammatory diseases in human. Thus far the effects of substance

P on cells of the bovine immune system are widely unknown. The aim of the present study

was therefore to evaluate the expression and regulation of the main substance-P-receptor

NKR1 in cattle as well as the modulatory properties of substance P on bovine immune cells.

Expression and regulation of the main substance-P-receptor NKR1 was analyzed by

quantitative rtPCR in mammary gland tissue obtained from two distinct mastits models.

While mRNA-expression of S. aureus infected animals was on the same level as in healthy

subjects, animals infected with E. coli showed a systemic, more than 10-fold decrease of

mRNA-expression after 24 hours post infection in both models. This reproducibly

demonstrates a regulation of the main substance-P-receptor during the initial phase of acute

mastits in vivo.

Moreover the expression of NKR1 was detected in subsets of lymphocytes, granulocytes,

monocytes and in-vitro-generated macrophages (MdM). Stimulation of monocytes and MdM

with lipopolysaccahrid (LPS) for 3 hours did not alter the expression-level of NKR1,

supporting similar findings obtained during the first 6 hours of E. coli mastitis from the in

vivo model.

The second part of the study focused on the modulatory influence of substance P on the

function of lymphocytes, granulocytes, monocytes and in-vitro-generated macrophages.

Superantigen-induced proliferation of bovine lymphocytes was inhibited in the presence of

substance P in concentrations from 1x10-12 to 1x10-8 mol/L after 6 days of in-vitro-culture.

Underlying cause may be a substance P mediated activation of monocytes resulting in the

production of mediators that inhibited the proliferation of lymphocytes.

Summary

138

In neutrophil granulocytes substance P (3x10-6 mol/L) was shown to directly activate the cells

of 50% of the tested animals using the intracellular calcium-influx as read-out-system.

Stimulation of the cells with the chemokine CXCL8 resulted in a homogenous activation,

indicating the possibility of individual differences in the response to substance P. The pre-

incubation with substance P did not increase the CXCL8-induced calcium-influx in any of the

two groups of responders.

In a concentration-range of 1x10-8-1x10-12 mol/L substance P showed no influence on

constitutive cell death of PMN. Also the accelerated death of PMN, mediated by mononuclear

cells after LPS-stimulation, was not altered by substance P. Moreover substance P showed no

direct chemoattractant properties on neutrophil granulocytes. However CXCL8-induced

migration of PMN was transiently inhibited in the presence of substance P. This effect is

possibly due to the interaction of PMN with platelets; hence substance P caused the formation

of cell-aggregates between activated platelets and PMN as demonstrated with fluorometric

microscopy analyses. Further studies should be performed to clarify wether this phenomenon

could also be responsible for reduced migration of neutrophil granulocytes in vivo.

In MdM generated in the presence of substance P (1x10-6-1x10-8 mol/L) mRNA-expression of

chemokines, which are crucial for the attraction and activation of granulocytes and monocytes

(CXCL8, CCL5) as well as the expression of IL-1β, a classically pro-inflammatory cytokine

were significantly elevated. After stimulation with LPS, MdM generated in the presence of

substance P showed an elevated expression of CXCL8 and IL-1β, while in SP-influenced

monocytes only the expression of CCL5 was significantly up-regulated after LPS-stimulation.

In addition, supernatants of MdM culutered in the presence of substance P induced neutrophil

migration and ihibited both necrosis and apoptosis of neutrophil granulocytes. Thus, it can be

assumed that the modulation of the expression pattern of chemokines and cytokines by

substance P has functional relevance for the attraction and activation of immune cells.

In general a pro-inflammatory influence of substance P on bovine immune cells could be

demonstrated. Substance P may influence the initial phase of bovine mastitis by activation

and recruitment of neutrophil granulocytes and modulation of resident macrophages. Thus,

the properties of this neuropeptide provide potential starting points to develop new concepts

for prophylaxis and therapy in bovine masitis.

139

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Danksagung An erster Stelle bedanke ich mich herzlich bei Herrn Apl. Prof. Dr. H.-J. Schuberth für die

Überlassung des Themas und die kompetente Betreuung. Durch sein Engagement und seinen

unschlagbaren Optimismus konnte er mich auch nach Rückschlägen immer wieder aufbauen

und für neue, innovative Versuchsansätze begeistern. Jederzeit stand seine Tür offen für alle

möglichen und unmöglichen Fragen und Probleme. Das in mich gesetzte Vertrauen, aber auch

die richtige Mischung aus Anerkennung, Humor sowie der ein oder anderen kritischen

Anmerkung spornten mich immer zu Höchstleistungen an.

Der Firma Pfizer Animal Health danke ich für die Finanzierung des Projekts. Mein

besonderer Dank gilt hierbei Herrn Dr. Leopold Götze, der durch sein Engagement und sein

Vertrauen sowie durch konstruktive Gespräche einen nicht unerheblichen Beitrag für den

Fortbestand der Studien leistete.

Ein ganz herzlicher Dank geht an die Mitarbeiter des Labors der Arbeitsgruppe Immunologie:

Frau Silke Schöneberg, Frau Sonja Kordex und Herrn Udo Rabe. Mit großer fachlicher

Kompetenz und unerschüttlerlicher Geduld halfen sie bei allen (auch wiederholt auftretenden)

Fragen und Problemen weiter. Die entspannte Arbeitsatmosphäre und der unkomplizierte,

respektvolle Umgang machten das Labor zu einem Ort an dem man sich immer gerne aufhielt,

und ließen selbst lange, von Frustration gekrönte Versuchstage erträglich werden. Ein ganz

besonders herzliches Dankeschön geht an Dr. Kathrin Langner, die mit großem Tatendrang

den Aufbau des molekularbiologischen Labors leitete. Durch ihren Optimismus, ihre

Hilfsbereitschaft sowie ihre tatkräftige Unterstützung hat sie maßgeblich zur Fertigstellung

der Arbeit beigetragen.

Ein Dankeschön geht auch nach Dummerstorf an Dr. Juliane Günther, Angelika Deike und

Prof. Dr. Hans-Martin Seyfert für die freundliche und unkomplizierte Hilfe in Primer- und

Plasmid-Fragen. Auch bei Prof. Dr. Holm Zerbe und Dr. Wolfram Petzl aus der Klinik für

Wiederkäuer der LMU München bedanke ich mich herzlich für wertvolle Tipps und

lehrreiche Gespräche.

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All meinen ehemaligen und derzeitigen Kollegen und Mitdoktoranden der Arbeitsgruppe

Immunologie ein herzliches Dankeschön. Das freundschaftliche Klima, die gegenseitige

Hilfsbereitschaft und der Zusammenhalt ließen mich immer gerne zur Arbeit gehen. Durch

viele geselligen Abende, Bastelstunden, Spielerunden und dergleichen mehr wurde die oft

nervenaufreibende Doktorandenzeit auch zu einer schönen Zeit.

Ein ganz besonders großer Dank geht an meine Eltern Gamze Lamprecht-Sipka und

Hanspeter Lamprecht, die mir durch ihre bedingungslose Unterstüzung und ihren Rückhalt

diesen Lebensweg ermöglichten.

Der größte Dank geht an meinen Freund Meik Becker, der mir durch seine Liebe und den

Trost in schweren Zeiten die Kraft zum Durchhalten gab.

Tierärztliche Hochschule Hannover Arbeitsgruppe Immunologie · von Substanz P an der...

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