Tierärztliche Hochschule Hannover Untersuchungen …...Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der...

Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchungen zu den Auswirkungen des Klimawandels auf die

ruminalen Fermentationsparameter von Maispflanzen sowie die

Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft in vitro

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Birgit Eva Meibaum

Pforzheim

Hannover 2013

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Gerhard Breves

Physiologisches Institut

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Gerhard Breves

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Martin Ganter

Tag der mündlichen Prüfung: 26. April 2013

Diese Studie wurde als Teilprojekt des Kooperationsprojekts „Klimafolgenforschung

in Niedersachsen (KLIFF)“ durch das Niedersächsische Ministerium für Wissenschaft

und Kultur gefördert.

Für meine Familie

Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht:

MEIBAUM, B., S. RIEDE, B. SCHRÖDER, R. MANDERSCHEID, H.-J. WEIGEL u. G. BREVES (2012): Elevated CO2 and drought stress effects on the chemical composition of maize plants, their ruminal fermentation and microbial diversity in vitro. Archives of Animal Nutrition 66, 473-489

V

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................ VIII

Abbildungsverzeichnis ............................................................................................... XI

Tabellenverzeichnis ................................................................................................. XIII

1 Einleitung ........................................................................................................ 1

1.1 Veränderung der Umweltbedingungen durch den Klimawandel ..................... 1

1.2 Auswirkungen von erhöhter [CO2] und Trockenstress auf den

Pflanzenstoffwechsel ...................................................................................... 2

1.2.1 Unterschiede zwischen C3- und C4-Photosynthese ........................................ 3

1.2.2 Auswirkungen auf Leistungsparameter von Pflanzen ..................................... 6

1.3 Mais als Futtermittel für Rinder ....................................................................... 8

1.4 Fragestellungen und Ziele dieser Arbeit ....................................................... 11

2 Material und Methoden ................................................................................. 13

2.1 Pflanzenmaterial ........................................................................................... 13

2.2 Rumen-Simulationstechnik ........................................................................... 16

2.3 Versuchsdesign ............................................................................................ 20

2.3.1 Versuchsvorbereitungen ............................................................................... 20

2.3.2 Versuchsbeginn ............................................................................................ 21

2.3.3 Probenentnahme V1 ..................................................................................... 22

2.3.4 Probenentnahme V2 ..................................................................................... 24

2.3.5 Analysen ....................................................................................................... 25

2.4 Statistische Auswertung ................................................................................ 29

2.5 Single-strand-conformation-polymorphism-Analyse...................................... 30

2.5.1 Aufbereitung der Proben ............................................................................... 31

2.5.2 Isolierung der genomischen DNA der ruminalen Mikroflora .......................... 31

2.5.3 Photometrische Quantifizierung der isolierten gDNA .................................... 33

2.5.4 Agarose-Gelelektrophorese .......................................................................... 33

2.5.5 Polymerase-Kettenreaktion ........................................................................... 33

VI Inhaltsverzeichnis

2.5.6 Aufreinigung und photometrische Quantifizierung der nested PCR-

Produkte ....................................................................................................... 36

2.5.7 Einzelstrangverdau und Aufreinigung ........................................................... 36

2.5.8 Polyacrylamid-Gelelektrophorese ................................................................. 37

2.5.9 Silbernitrat-Färbung ...................................................................................... 38

2.6 Statistische Auswertung der SSCP-Profile ................................................... 39

3 Ergebnisse .................................................................................................... 41

3.1 Pflanzenmaterial ........................................................................................... 41

3.1.1 Simulierung der Klimabedingungen .............................................................. 41

3.1.2 Analyse der Rohnährstoffzusammensetzung der vier Maisvarianten ........... 41

3.2 Ergebnisse des RUSITEC-Versuchs 1 ......................................................... 43

3.2.1 pH-Werte ...................................................................................................... 43

3.2.2 Redoxpotentiale ............................................................................................ 45

3.2.3 Produktionsraten der SCFA und deren molare Anteile ................................. 47

3.2.4 Produktionsraten und Konzentrationen der Fermentationsgase ................... 53

3.2.5 NH3-N-Konzentrationen ................................................................................ 56

3.2.6 Verdaulichkeiten der organischen Substanz ................................................. 57

3.2.7 Anzahl der Protozoa ..................................................................................... 58

3.3 Ergebnisse des RUSITEC-Versuchs 2 ......................................................... 59

3.3.1 pH-Werte ...................................................................................................... 59


3.3.3 Produktionsraten der SCFA und deren molare Anteile ................................. 61

3.4 Darstellung und Analyse der SSCP-Profile ................................................... 67

3.4.1 SSCP-Profile und Clusteranalysen zu V1 ..................................................... 67

3.4.2 SSCP-Profile und Clusteranalysen zu V2 ..................................................... 72

4 Diskussion .................................................................................................... 77

4.1 FACE-Methode und Pflanzenmaterial ........................................................... 77

4.2 Beurteilung der RUSITEC-Versuche ............................................................. 81

4.2.1 pH-Werte ...................................................................................................... 81


4.2.3 Produktionsraten und molare Anteile der SCFA ........................................... 82

Inhaltsverzeichnis VII

4.2.4 Fermentationsgase ....................................................................................... 84




4.2.8 Abschließende Beurteilung der RUSITEC-Versuche .................................... 88

4.3 Effekte der Klimaveränderungen .................................................................. 89

4.3.1 pH-Werte ...................................................................................................... 89


4.3.3 Produktionsraten und molare Anteile der SCFA ........................................... 91

4.3.4 Fermentationsgase ....................................................................................... 92




4.4 Beurteilung der Ergebnisse der SSCP-Analyse ............................................ 97

4.5 Schlussfolgerungen und Ausblick ................................................................. 99

5 Zusammenfassung ..................................................................................... 101

6 Summary .................................................................................................... 103

7 Literaturverzeichnis ..................................................................................... 105

8 Anhang ....................................................................................................... 121

8.1 Verwendete Lösungen ................................................................................ 121

8.2 Eingesetzte Chemikalien ............................................................................ 124

8.3 Rohdaten der RUSITEC-Versuche ............................................................. 126

8.3.1 Rohdaten in V1 ........................................................................................... 126

8.3.2 Rohdaten in V2 ........................................................................................... 134

9 Danksagung ................................................................................................ 139

VIII

Abkürzungsverzeichnis

In dieser Arbeit wurden neben den allgemein üblichen Abkürzungen folgende

spezielle Kurzformen verwendet:

[CO2] Kohlenstoffdioxidkonzentration in der Atmosphäre

A 380 ppm CO2

ad auffüllen bis

ADF Acid detergent fibre; saure Detergentien-Fasern

ADL Acid detergent lignin; saures Detergentien-Lignin

ANOVA Analysis of variance; Varianzanalyse

APS Ammoniumperoxodisulfat

Aqua bidest. Aqua bidestillata; zweifach destilliertes Wasser

Aqua dest. Aqua destillata; destilliertes Wasser

AT Annealingtemperatur

ATP Adinosintriphosphat

B 550 ppm CO2

bp Basenpaare

bzw. beziehungsweise

C 380 ppm CO2 + Trockenstress

ca. circa

CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid

D 550 ppm CO2 + Trockenstress

DNA Desoxyribonucleic acid; Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat

dsDNA Double-stranded DNA; Doppelstrang-DNA

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

et al. et alii

FACE Free air carbon dioxide enrichment; Freiluft-CO2-Anreicherung

fw forward

g Erdbeschleunigung

gDNA genomische DNA

hPa Hektopascal

KLIFF Klimafolgenforschung

Abkürzungsverzeichnis IX

LSD Least significant difference

LWC Leaf water content; Wassergehalt der Blätter

Mio. Millionen

MW Mittelwert

n Stichprobenumfang

NDF Neutral detergent fibre; neutrale Detergentien-Fasern

NfE stickstoff-freie Extraktionsstoffe

NH3-N Ammoniak-Stickstoff

n-m MDS nicht-metrische multidimensionale Skalierung

NPGS Neopentylglycolsuccinat

NPN Nicht-Protein-Stickstoff

ns nicht signifikant

oS organische Substanz

p Irrtumswahrscheinlichkeit

p.a. pro analysi

PAA Polyacrylamid

PAST Paleontological Statistics

PCR Polymerase chain reaction; Polymerase-Kettenreaktion

PEPC Phosphoenolpyruvat-Carboxylase

PERMANOVA Permutational multivariate analysis of variance

Ph phosphorylierender reverse Primer

ppm Parts per million

PVC Polyvinylchlorid

Ra Rohasche

Rfa Rohfaser

Rfe Rohfett

RNase Ribonuklease

Rp Rohprotein

RuBisCO Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase

RubP Ribulose-1,5-bisphosphat

RUSITEC Rumen simulation technique; Rumen-Simulationstechnik

rv reverse

SCFA Short chain fatty acids; kurzkettige Fettsäuren

SDS Sodium dodecyl sulfate; Natriumdodecylsulfat

SEM Standard error of the mean; Standardfehler des Mittelwerts

X Abkürzungsverzeichnis

SSCP Single strand conformation polymorphism; Einzelstrang-Konformationspolymorphismus

ssDNA Single-stranded DNA; Einzelstrang-DNA

SWC Soil water content; Wassergehalt des Bodens

TAE Tris-Acetat-EDTA

TBE Tris-Borat-EDTA

TCD Thermal conductivity detector; Wärmeleitdetektor

TE Tris-EDTA

TEMED N,N,N’,N‘-Tetramethylethylendiamin

TEN Tris-EDTA-NaCl

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

TS Trockensubstanz

U Enzymaktivität

uS ursprüngliche Substanz

UPGMA Unweighted pair group method using arithmetic averages

V1 Versuch 1

V2 Versuch 2

V-Faktor Verdünnungsfaktor

WUE Water use efficiency; Wassernutzungseffizienz

Z Zentrifugation

XI

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1.1: Vergleich der Blattanatomie von C3- und C4-Pflanzen; abgewandelt nach TAIZ u. ZEIGER (1991)

Abbildung 1.2: Vergleich der CO2-Fixierungsmechanismen von C3- und C4-Pflanzen; abgewandelt nach HATCH (1987)

Abbildung 1.3: Vergleich der Photosyntheseraten von C3- und C4-Pflanzen in Abhängigkeit von der CO2-Konzentration in der Atmosphäre; abgewandelt nach TAIZ u. ZEIGER (1991)

Abbildung 2.1: Schema des FACE-Versuchsaufbaus mit den Versuchsabschnitten ohne CO2-Behandlung (linker, durchgezogener Kreis) und mit CO2-Anreicherung (rechter, gestrichelter Kreis) jeweils zur Hälfte mit und ohne Trockenstressinduktion durch die Überdachung

Abbildung 2.2: 1 RUSITEC-Anlage 2 Vergrößerung eines eingebauten Fermenters (A) mit Innengefäß (B)

Abbildung 2.3: Verteilung der Substrate und Anordnung der Fermenter für V1 und V2

Abbildung 3.1: Verlauf der pH-Werte (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten

Abbildung 3.2: Verlauf der Redoxpotentiale (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten

Abbildung 3.3: Verlauf der SCFA-Produktionsraten [mmol • Tag-1

] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten

Abbildung 3.4: Verlauf der Produktionsraten von Acetat (a), Propionat (b), Butyrat (c) und Isovalerat (d) in mmol • Tag

-1 (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier

Maisvarianten

Abbildung 3.5: Verlauf der molaren Anteile von Acetat (a), Propionat (b), Butyrat (c) und Isovalerat (d) in Prozent der Gesamtproduktion (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten

Abbildung 3.6: Verlauf der Acetat:Propionat-Verhältnisse (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten

Abbildung 3.7: Verlauf der Produktion der Fermentationsgase insgesamt [ml • Tag-1


Abbildung 3.8: Verlauf der Anteile von CO2 (a) und CH4 (b) an der Fermentationsgas-produktion [%] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten

Abbildung 3.9: Verlauf der NH3-N-Konzentrationen [mmol • l-1


Abbildung 3.10: Verlauf der Verdaulichkeiten der organischen Substanz [%] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten

Abbildung 3.11: Anzahl der Protozoa [103 • ml

-1] an Tag 1, Tag 7 und Tag 14 verglichen mit

der Nativprobe (MW ± SEM; n=3) für die vier Maisvarianten

Abbildung 3.12: Verlauf der pH-Werte (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die zwei Maisvarianten

XII Abbildungsverzeichnis

Abbildung 3.13: Verlauf der Redoxpotentiale [mV] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die zwei Maisvarianten

Abbildung 3.14: Verlauf der Produktionsraten der SCFA [mmol • Tag-1

] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die zwei Maisvarianten

Abbildung 3.15: Verlauf der Produktionen von Acetat (a), Propionat (b) und Butyrat (c) in mmol • Tag

-1 (MW ± SEM; n=3; (*) = p<0,1) vergleichend für die zwei

Maisvarianten

Abbildung 3.16: Verlauf der molaren Anteile von Acetat (a), Propionat (b) und Butyrat (c) in Prozent der Gesamtproduktion (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die zwei Maisvarianten

Abbildung 3.17: Verlauf der Acetat:Propionat-Verhältnisse (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die zwei Maisvarianten

Abbildung 3.18: Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des ersten Versuchstags von V1 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse

Abbildung 3.19: Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des ersten Versuchstags von V1 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse

Abbildung 3.20: Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des 14. Versuchstags von V1 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse

Abbildung 3.21: Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des 14. Versuchstags von V1 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse

Abbildung 3.22: Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit der Tage 1 und 7 von V2 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse

Abbildung 3.23: Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit der Tage 1 und 7 von V2 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse

Abbildung 3.24:

Zwei-dimensionale nicht-metrische multidimensionale Skalierung (n-m MDS) der Abweichungsmatrizes der Clusteranalysen des Bacteria- (a) und Archaea-Profils (b) jeweils vergleichend für die Versuchstage 1 und 7

Abbildung 4.1:

Zusammenfassung der Aus- und Wechselwirkungen von Trockenstress und erhöhter [CO2] auf C4-Pflanzen. Die durchgezogenen Pfeile kennzeichnen direkte Folgen, gestrichelte Pfeile zeigen hemmende Prozesse an. Abgewandelt nach LEAKEY (2009).

Abbildung 4.2:

Der NH3-Pool in der Fermenterflüssigkeit wird gebildet durch mikrobielle Auf- (rechts) und Abbauprozesse von N-Verbindungen (links).

XIII

Tabelle 2.1: Benennung der Anbauvarianten der Maispflanzen

Tabelle 2.2: Zusammensetzung des als künstlicher Speichel eingesetzten Puffers; modifiziert nach MCDOUGALL (1948)

Tabelle 2.3: Probenentnahmeplan V1


Tabelle 2.5: Messparameter der gaschromatographischen Analyse der SCFA

Tabelle 2.6: Verdünnungsfaktoren zur Bestimmung der Protozoa-Konzentration

Tabelle 2.7: Inkubationsschritte während der DNA-Isolierung

Tabelle 2.8: Phenol-Chloroform-Extraktion

Tabelle 2.9: Die Primer für die Polymerase-Kettenreaktionen der 16S rRNA-Gene

Tabelle 2.10: Ansätze für die initiale Domäne-spezifische PCR und die nested PCR

Tabelle 2.11: Programme der initialen Domäne-spezifischen PCR und der nested PCR

Tabelle 2.12: Ansatz der Reaktionslösung für den Einzelstrangverdau pro Probe

Tabelle 3.1: Gehalte der Maisvarianten an Rohnährstoffen [g • kg-1

TS; TS in g • kg-1

uS]

Tabelle 3.2: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der pH-Werte (MW ± SEM; n=3; ** = p<0,01)

Tabelle 3.3: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Redoxpotentiale (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001)

Tabelle 3.4: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Produktionsraten der SCFA (MW ± SEM; n=3)

Tabelle 3.5: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Produktionsraten der einzelnen SCFA (MW ± SEM; n=3; * = p<0,05; *** = p<0,001)

Tabelle 3.6: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der molaren Anteile der einzelnen SCFA (MW ± SEM; n=3; ** = p<0,01; *** = p<0,001)

Tabelle 3.7: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Acetat:Propionat-Verhältnisse (MW ± SEM; n=3; ** = p<0,01; *** = p<0,001)

Tabelle 3.8: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Produktionsraten der Fermentationsgase (MW ± SEM; n=3)

Tabelle 3.9: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der CO2- und CH4-Anteile am produzierten Fermentationsgasgemisch (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001)

Tabelle 3.10: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der NH3-N-Konzentrationen (MW ± SEM; n=3; * = p<0,05; *** = p<0,001)

Tabelle 3.11: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Verdaulichkeiten der organischen Substanz (MW ± SEM; n=3; * = p<0,05)

Tabelle 3.12: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Anzahl der Protozoa (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001)

Tabellenverzeichnis

XIV Tabellenverzeichnis

Tabelle 3.13: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der pH-Werte (MW ± SEM; n=3) während der Äquilibrierungsphase

Tabelle 3.14: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der Redoxpotentiale (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001) während der Äquilibrierungsphase

Tabelle 3.15: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der SCFA-Produktionsraten (MW ± SEM; n=3; * = p<0,05; *** = p<0,001) während der Äquilibrierungsphase

Tabelle 3.16: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der Produktionsraten der einzelnen SCFA (MW ± SEM; n=3; * = p<0,05; *** = p<0,001) während der Äquilibrierungsphase

Tabelle 3.17: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der molaren Anteile der einzelnen SCFA (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001) während der Äquilibrierungs-phase

Tabelle 3.18: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der Verhältnisse von Acetat zu Propionat (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001) während der Äquilibrierungs-phase

Tabelle 3.19: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des ersten Versuchstags von V1

Tabelle 3.20: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des ersten Versuchstags von V1

Tabelle 3.21: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des 14. Versuchstags von V1

Tabelle 3.22: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des 14. Versuchstags von V1

Tabelle 3.23: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit der Tage 1 und 7 von V2

Tabelle 3.24: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit der Tage 1 und 7 von V2

Tabelle 8.1: Aufzählung der Zusammensetzungen der verwendeten Lösungen

Tabelle 8.2: Aufzählung der eingesetzten Chemikalien

Tabelle 8.3: pH-Werte in V1

Tabelle 8.4: Redoxpotentiale [mV] in V1

Tabelle 8.5: Überläufe [ml] in V1

Tabelle 8.6: Produktionsraten der gesamten SCFA [mmol • Tag-1

] in V1

Tabelle 8.7: Acetat-Produktionsraten [mmol • Tag-1

] in V1

Tabelle 8.8: Propionat-Produktionsraten [mmol • Tag-1

] in V1

Tabelle 8.9: Butyrat-Produktionsraten [mmol • Tag-1

] in V1

Tabelle 8.10: Isovalerat-Produktionsraten [mmol • Tag-1

] in V1

Tabelle 8.11: Molare Acetat-Anteile [%] in V1

Tabellenverzeichnis XV

Tabelle 8.12: Molare Propionat-Anteile [%] in V1

Tabelle 8.13: Molare Butyrat-Anteile [%] in V1

Tabelle 8.14: Molare Isovalerat-Anteile [%] in V1

Tabelle 8.15: Acetat:Propionat-Verhältnisse in V1

Tabelle 8.16: Produktionsraten der Fermentationsgase [ml • Tag-1

] in V1

Tabelle 8.17: CO2-Anteile an der Fermentationsgasproduktion [%] in V1

Tabelle 8.18: CH4-Anteile an der Fermentationsgasproduktion [%]in V1

Tabelle 8.19: Luftdruck [hPa] in V1

Tabelle 8.20: Temperatur [°C] in V1

Tabelle 8.21: NH3-N-Konzentrationen [mmol • l-1

] in V1

Tabelle 8.22: Verdaulichkeiten der organischen Substanz [%] in V1

Tabelle 8.23: Anzahl der Protozoa [103 • ml

-1] in V1




] in V2


] in V2


] in V2


] in V2





1

1 Einleitung

1.1 Veränderung der Umweltbedingungen durch den

Klimawandel

Das Klima, welches meist durch Mittelwerte von Temperaturen,

Windgeschwindigkeiten und Niederschlagsraten als Funktion der Zeit definiert wird,

gehorcht einem dynamischen Regelkreis. So hat die Zusammensetzung der

Atmosphäre entscheidenden Einfluss auf das Klima. Die atmosphärische

Zusammensetzung wiederum wird beispielsweise durch die Sonneneinstrahlung und

von Vulkanausbrüchen beeinflusst (LE TREUT et al. 2007). Zusätzlich kam mit Beginn

der industriellen Revolution (18. Jahrhundert) ein anthropogener Einfluss auf die

Zusammensetzung der Atmosphäre und damit auf das Klima hinzu (LATIF 2006; LE

TREUT et al. 2007). Die gesteigerte Nutzung fossiler Brennstoffe zur

Energiegewinnung und die damit verbundenen Kohlendioxid (CO2)-Emissionen

führten zu einem Anstieg der CO2-Konzentration in der Atmosphäre ([CO2]) von

vorindustriellen 280 ppm bis auf 367 ppm im Jahr 1999 (PRENTICE et al. 2001).

Durch eine höhere [CO2] in der Atmosphäre wird der Treibhauseffekt verstärkt. Von

der Sonne abgegebenes kurzwelliges Licht im ultravioletten Bereich dringt durch die

Atmosphäre und trifft auf die Erdoberfläche. Dort wird ein Teil der Strahlung in

Abhängigkeit von der Beschaffenheit der Oberfläche absorbiert, ein anderer Teil

reflektiert. Im Gegenzug wird Wärmestrahlung im nicht sichtbaren Infrarotbereich von

der Erdoberfläche abgegeben. Von der atmosphärischen Zusammensetzung hängt

es nun ab, wie groß der Anteil der Strahlung ist, welche die Atmosphäre wieder

verlässt. Nimmt die Konzentration der Treibhausgase wie beispielsweise

Wasserdampf, CO2 und Methan (CH4) zu, wird ein größerer Anteil der Strahlung in

der Atmosphäre reflektiert. Das reflektierte langwellige Licht führt zu einem Anstieg

der Durchschnittstemperaturen in der Atmosphäre (LE TREUT et al. 2007).

2 Einleitung

In einer Studie konnten neben signifikant sinkenden Niederschlagsraten während der

Sommermonate ebenfalls signifikant steigende Temperaturen für alle Jahreszeiten

durch die Auswertung der Daten niedersächsischer Temperatur- und

Niederschlagsmessstationen über einen Beobachtungszeitraum von 1951 bis 2005

nachgewiesen werden (HABERLANDT et al. 2010).

Um zukünftige Auswirkungen des Klimawandels vorhersagen und Strategien zur

Abwendung möglicher negativer Folgen erarbeiten zu können, wurde anhand

verschiedener Szenarien die Entwicklung der [CO2] kalkuliert. Für die Mitte des 21.

Jahrhunderts wird eine [CO2] von 550 ppm erwartet. Im Jahre 2100 könnten mehr als

1000 ppm CO2 erreicht werden (PRENTICE et al. 2001). Ebenfalls berechnet wurden

Trends für lokale Wetterphänomene wie Niederschlagsraten, Trockenperioden und

Hitzewellen. Die Ergebnisse der Szenarien für Mitteleuropa weisen auf bis zu 24%

geringere Niederschlagsraten während der Sommermonate und bereits im Frühjahr

ansteigende Evaporationsraten hin. Zusammen könnten beide Faktoren zu

geringeren Wassergehalten der Böden (soil water content; SWC) führen

(CHRISTOPHERSON u. KENNEDEY 1983; ALCAMO et al. 2007). Eine Kombination aus

ansteigenden Temperaturen und abnehmenden Niederschlägen während der

Sommermonate könnte darüber hinaus zu einem erhöhten Auftreten von extremen

Hitzewellen und ausgeprägten Trockenperioden führen (ALCAMO et al. 2007).

Die [CO2] und die Verfügbarkeit von Wasser haben großen Einfluss auf das

Wachstum und den Ertrag von Pflanzen. Wegen des Einsatzes von Nutzpflanzen als

Nahrungsmittel sowie als Futtermittel für Nutztiere ist der Einfluss des Klimawandels

auf die globale Versorgungslage mit pflanzlichen und tierischen Nahrungsmitteln

nicht zu unterschätzen.

1.2 Auswirkungen von erhöhter [CO2] und Trockenstress auf

den Pflanzenstoffwechsel

Die drei wichtigsten Nutzpflanzen weltweit sind Reis, Mais und Weizen (PINGALI

2001). Während Weizen und Reis den sogenannten C3-Pflanzen zugeordnet werden,

Einleitung 3

gehört Mais zur Gruppe der C4-Pflanzen. Unterschiede zwischen diesen

Pflanzengruppen bestehen in der Blattanatomie und im Photosynthesemechanismus.

Es wird vermutet, dass sich die C4-Photosynthese zwischen dem späten Cretaceum

(vor ca. 100 Mio. Jahren) und dem Miozän (vor ca. 5 Mio. Jahren) entwickelt hat,

während die [CO2] der Atmosphäre deutlich abfiel (LASAGA et al. 1985; SAGE 2004).

Gegenwärtig kommen C4-Pflanzen vorwiegend in trockenen Lebensräumen mit

hoher Lichteinstrahlung vor (EHLERINGER et al. 1991; GHANNOUM 2009). Aufgrund der

distinkten Photosynthesemechanismen unterscheiden sich die Auswirkungen des

Klimawandels auf verschiedene Stoffwechselparameter von C3- und C4-Pflanzen.

1.2.1 Unterschiede zwischen C3- und C4-Photosynthese

Abbildung 1.1 zeigt vergleichend den Blattquerschnitt einer C3- und einer C4-Pflanze.

Während der Dunkelreaktion der Photosynthese erfolgt die CO2-Fixierung in den

Mesophyllzellen, die in C3-Blättern ein Palisaden- und Schwammparenchym bilden.

Die Leitbündel liegen eingebettet im Schwammparenchym.

Abbildung 1.1: Vergleich der Blattanatomie von C3- und C4-Pflanzen; abgewandelt nach TAIZ u. ZEIGER (1991)

Im Gegensatz zu diesem Aufbau liegen in einem C4-Blatt die Mesophyllzellen zirkulär

um sogenannte Bündelscheidenzellen angeordnet, die wiederum die Leitbündel

umgeben. Diese spezielle Struktur wird auch als Kranzanatomie bezeichnet (HATCH

1987; TAIZ u. ZEIGER 1991).

4 Einleitung

Neben der abweichenden Blattanatomie unterscheiden sich C3- und C4-Pflanzen

auch im Mechanismus der CO2-Fixierung (Abbildung 1.2). Zunächst diffundiert bei

beiden Varianten CO2 passiv durch die Spaltöffnungen (Stomata) in den

Interzellularraum und anschließend in die Mesophyllzellen.

Bei C3-Pflanzen wird das CO2 im Cytosol aller Mesophyllzellen enzymatisch mithilfe

der Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase (RuBisCO) an den Akzeptor

Ribulose-1,5-bisphosphat (RubP; C5-Körper) gebunden. Der so entstehende C6-

Körper wird anschließend in die Chloroplasten transportiert, um dort in den

Citratzyklus eingeschleust zu werden. Im Zuge des Citratzyklus werden C3-Körper

gebildet, die zur Synthese von Biomasse (Kohlenhydrate und Proteine) verwendet

werden.

Abbildung 1.2: Vergleich der CO2-Fixierungsmechanismen von C3- und C4-Pflanzen; abgewandelt nach HATCH (1987)

RubP Ribulose-1,5-bisphosphat

RuBisCO Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase

PEP Phosphoenolpyruvat

PEPC Phosphoenolpyruvat-Carboxylase

Zellwand der Bündelscheidenzellen mit Suberin-Einlagerung

Einleitung 5

Die eigentliche CO2-Fixierung bei C4-Pflanzen erfolgt im Gegensatz dazu in den

Bündelscheidenzellen. Zunächst wird CO2 in den Chloroplasten der peripher

gelegenen Mesophyllzellen vorfixiert. Die Bindung erfolgt mithilfe des Enzyms

Phosphoenolpyruvat-Carboxylase (PEPC), das sich durch eine hohe CO2-Affinität

auszeichnet, an den Akzeptor Phosphoenolpyruvat (C3-Körper). Der entstehende

C4-Körper, der namensgebend für diesen Photosynthesemechanismus ist, wird im

weiteren Verlauf aktiv in die Bündelscheidenzellen transportiert und dort

decarboxyliert. Der C3-Rest wandert zurück in die Mesophyllzellen, um dort erneut

CO2 zu binden (HATCH 1987). Ein Vorteil der C3-Photosynthese liegt in einer

Energieersparnis von 2 Mol ATP (Adenosintriphosphat) pro Fixierung eines Mols

CO2, da der energetische Aufwand für den aktiven Transport während des

C4-Kreislaufs eingespart werden kann (HATCH u. OSMOND 1976).

In den Bündelscheidenzellen erfolgt die CO2-Fixierung im Anschluss an die

Decarboxylierung mithilfe von RuBisCO entsprechend der C3-Photosynthese. Die

Diffusion von CO2 aus den Bündelscheidenzellen heraus wird durch die Einlagerung

von Suberin, einem aus phenolischen und aliphatischen Anteilen

zusammengesetzten Biopolymer, in die Zellwand erschwert (KOLATTUKUDY 1981). So

wird ein erhöhter CO2-Partialdruck in den Bündelscheidenzellen aufgebaut (HATCH

1987). Der aus einem erhöhten CO2-Partialdruck im Kompartiment der CO2-Fixierung

resultierende Vorteil der C4-Pflanzen besteht in einer gesteigerten

Photosyntheseeffizienz durch eine Verringerung der Photorespirationsrate (PEARCY

u. EHLERINGER 1984; HATCH 1987; GHANNOUM 2009). RuBisCO weist eine geringe

Affinität für CO2 auf und bindet ebenfalls Sauerstoff (O2) (PEARCY u. EHLERINGER

1984; HATCH 1987). Ein Einbringen von O2 in den Citratzyklus führt zur

Photorespiration, einem Vorgang, bei dem unter großem energetischem Aufwand

CO2 und Wasser entstehen (HATCH 1987). Durch die effektivere Nutzung von

RuBisCO weisen C4-Pflanzen höhere Photosyntheseraten im Vergleich zu C3-

Pflanzen auf. Dies gilt besonders bei niedrigen [CO2].

6 Einleitung

1.2.2 Auswirkungen auf Leistungsparameter von Pflanzen

Um die Auswirkungen des Klimawandels zu simulieren, wurde in den letzten Jahren

wiederholt das kammerlose Feldbegasungssystem (free air carbon dioxide

enrichment; FACE) eingesetzt. Die FACE-Methode wurde im Brookhaven National

Laboratory (Upton, New York, USA) entwickelt, wobei erstmals anstatt in

Gewächshäusern auf dem Feld wachsende Pflanzen (free air) mit einer definierten

[CO2] begast (carbon dioxide enrichment) wurden (LEWIN et al. 1994). Ein Vorteil

dieser Methode ist es, dass die Effekte ansteigender [CO2] auf Wachstum und Ertrag

von Pflanzen unter Feldbedingungen ohne artifizielle Beeinflussung anderer

Klimabedingungen wie der Windgeschwindigkeit, der Umgebungstemperatur und der

Sonneneinstrahlung untersucht werden können (FOYER et al. 1998).

Grundsätzlich führt eine gesteigerte [CO2] durch eine höhere CO2-Sättigung von

RuBisCO zu höheren Photosyntheseraten. Die unterschiedlichen CO2-Fixierungs-

mechanismen von C3- und C4-Pflanzen führen allerdings zu unterschiedlichen

Verläufen der Leistungssteigerung in Abhängigkeit von der [CO2] (Abbildung 1.3).

Abbildung 1.3: Vergleich der Photosyntheseraten von C3- und C4-Pflanzen in Abhängigkeit von der CO2-Konzentration in der Atmosphäre; abgewandelt nach TAIZ u. ZEIGER (1991)

Einleitung 7

Durch die CO2-Vorfixierung mithilfe der PEPC und der Steigerung der RuBisCO-

Auslastung scheint die C4-Photosynthese unter derzeitig vorherrschenden [CO2]

nahezu gesättigt zu sein. Bei einem Anstieg der [CO2] wäre die zu erwartende

Steigerung der Photosyntheserate gering (GHANNOUM et al. 2003; LEAKEY et al.

2004). Im Gegensatz dazu wird die Photosyntheserate von C3-Pflanzen bei

ansteigenden [CO2] deutlich gesteigert werden (TAIZ u. ZEIGER 1991).

Anhand von FACE-Versuchen konnte wiederholt bestätigt werden, dass eine erhöhte

[CO2] keinen signifikanten Einfluss auf Wachstum und Ertrag von C4-Pflanzen hat

(GHANNOUM et al. 2000; LEAKEY et al. 2004; LEAKEY et al. 2006). Widersprüchliche

signifikante Auswirkungen wurden durch kurzzeitiges Auftreten von Trockenstress

erklärt (GHANNOUM et al. 2000; LEAKEY et al. 2004; LEAKEY 2009; ALLEN et al. 2011).

Trockenstress ist neben der [CO2] ein weiterer abiotischer Faktor mit Wirkung auf die

Leistungsparameter von Pflanzen. Sinkt der Wassergehalt der Blätter (leaf water

content; LWC) durch Trockenstress ab, verengen sich die Öffnungen der Stomata.

Die stomatäre Leitfähigkeit, die ein Maß für die Abgaberate von Wasserdampf aus

dem Blattinneren sowie für die CO2-Aufnahmerate in das Blattinnere über die

Stomata ist, wird damit ebenfalls verringert. Geringe stomatäre Leitfähigkeiten

senken den Wasserverlust der Pflanzen auch durch verminderte Transpiration,

wodurch die Wassernutzungseffizienz (water use efficiency; WUE) gesteigert werden

kann (LEAKEY et al. 2006; ALLEN et al. 2011; MARKELZ et al. 2011). Gleichzeitig sinkt

allerdings die CO2-Aufnahmerate und damit auch die Photosyntheserate (EARL u.

DAVIS 2003). Infolge von Trockenstress nimmt die Aktivität der an der Photosynthese

beteiligten Enzyme ab (BECKER u. FOCK 1986). Zusätzlich kann eine verfrühte

Alterung der Pflanzen auftreten (GHANNOUM 2009). In den Blättern wird vermehrt

Chlorophyll abgebaut, wodurch sich die der Photosynthese zur Verfügung stehende

Fläche der grünen Blätter verringert (BECKER u. FOCK 1986; FOYER et al. 1998;

EFEOĞLU et al. 2009). Das Absorptionsvermögen von Strahlung und der

Wirkungsgrad der absorbierten für die Photosynthese nutzbaren Strahlung nehmen

ab (NESMITH u. RITCHIE 1992; EARL u. DAVIS 2003). Bei Maispflanzen kann sich

zudem die Phase der Kornfüllung verkürzen (NESMITH u. RITCHIE 1992). Die

8 Einleitung

verringerten CO2-Assimilationsraten und Chlorophyllgehalte in der Phase nach der

Anthese (Blattentwicklung) führen zu Veränderungen der chemischen

Zusammensetzung der Pflanzen. Die Gehalte an Rohprotein (Rp) und der

Zellwandbestandteile bezogen auf die Ganzpflanze steigen an. Gleichzeitig fallen der

Ansatz von Trockenmasse und der Kornertrag im Vergleich zu gut bewässerten

Pflanzen geringer aus (NESMITH u. RITCHIE 1992; ZINSELMEIER et al. 1995; EARL u.

DAVIS 2003; EFEOĞLU et al. 2009).

Eine zusätzlich erhöhte [CO2] in der Atmosphäre kann die negativen Auswirkungen

von Trockenstress abmildern. Unabhängig vom CO2-Fixierungsmechanismus bewirkt

eine erhöhte atmosphärische [CO2] ebenfalls eine Abnahme der stomatären

Leitfähigkeit (KIMBALL et al. 1993; LEAKEY et al. 2004). Gemeinsam mit geringeren

Transpirationsraten und höherer WUE kann ein höherer SWC sowie ein gesteigerter

Wassergehalt in den Blättern erreicht werden. Höhere SWC, LWC und WUE können

wiederum den Eintritt und das Ausmaß der Auswirkungen des Trockenstresses

verzögern (WARD et al. 1999; GHANNOUM et al. 2003; LEAKEY et al. 2004; ALLEN et al.

2011; MARKELZ et al. 2011).

Es wurde bereits gezeigt, dass das Klima die chemische Zusammensetzung von

Pflanzen beeinflusst. Das Klima sollte damit auch einen Effekt auf den Nähr- und

Futterwert von Pflanzen haben (WEIGEL u. MANDERSCHEID 2005; MEYER et al. 2009).

1.3 Mais als Futtermittel für Rinder

Aufgrund der Bedeutung als Nutzpflanze für die Nahrungsmittel- und Futtermittel-

produktion und als typische C4-Pflanze wurde Mais wiederholt als Modellpflanze in

Untersuchungen zu den Auswirkungen des Klimawandels eingesetzt. Bis 2020 wird

damit gerechnet, dass der weltweite Bedarf für Mais den von Reis noch übersteigen

wird (PINGALI 2001). Mit steigendem Lebensstandard steigt auch in den

Entwicklungsländern die Nachfrage nach tierischen Lebensmitteln und damit nach

Mais als Futtermittel landwirtschaftlicher Nutztiere (PINGALI 2001). Der Einsatz erfolgt

Einleitung 9

in Form von Ganzpflanzensilage, Corn-Cop-Mix oder Körnermais in der Fütterung

von Rindern, Schweinen und Geflügel (MEYER et al. 2009).

Rinder gehören zur Gruppe der Wiederkäuer (Polygastrier). Sie weisen ein

dreiteiliges Vormagensystem auf, das zusammengesetzt ist aus der Haube

(Retikulum), dem Pansen (Rumen) und dem Blättermagen (Omasum). Die

Vormägen sind dem Labmagen (Abomasum) vorgeschaltet, welcher dem

einhöhligen Magen der Monogastrier (z.B. Hund, Katze, Schwein) entspricht. Die

Vormägen, von denen der Pansen bei ausgewachsenen Wiederkäuern das größte

Volumen aufweist, haben die Funktion von Gärkammern. Aus Haube und Pansen

werden grobe Partikel wiederholt über die Speiseröhre zurück in die Maulhöhle

transportiert und zerkaut (Wiederkäuen, Rumination). Diese Oberflächen-

verkleinerung unterstützt den Aufschluss des zumeist cellulose- und faserreichen

Futters durch die in den Vormägen ansässigen Mikroorganismen (CZERKAWSKI 1986).

Die Gemeinschaft der Mikroorganismen im Pansen setzt sich aus Bacteria, Archaea

und Eukarya (Pilze und Protozoa) zusammen (HUNGATE 1960; CZERKAWSKI 1986).

Mikroorganismen und Wirtstier stehen in einer symbiotischen Wechselbeziehung.

Auf der einen Seite herrschen im konstanten Milieu des Pansens (pH-Wert und

Redoxpotential) optimale Bedingungen für Wachstum und Stoffwechsel der

Mikroorganismen. Durch die Futteraufnahme des Wirtstiers wird der mikrobiellen

Flora regelmäßig frisches Substrat zur Verfügung gestellt, wobei die Besiedlung und

Zersetzung der Pflanzenfasern durch die Oberflächenverkleinerung infolge der

Rumination des Wirtstiers erleichtert wird. Auf der anderen Seite werden die

Stoffwechselprodukte der Mikroorganismen vom Wirtstier als Substrat genutzt.

Mit der Nahrung aufgenommene Kohlenhydratverbindungen werden von den

Mikroorganismen zu kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) abgebaut (HUNGATE 1966).

Abhängig vom Substrat werden Acetat, Propionat und Butyrat in Verhältnissen

zwischen 70:15:10 und 40:40:20 gebildet. Länger- und verzweigtkettige SCFA wie

Valerat, Isobutyrat und Isovalerat treten in deutlich geringeren Konzentrationen auf

(CZERKAWSKI 1986; BERGMAN 1990). Die SCFA werden vom Wirtstier über die

Pansenwand aufgenommen und verstoffwechselt. Stickstoff(N)-Verbindungen wie

10 Einleitung

Proteine, aber auch Nicht-Protein-Stickstoff-(NPN)-Verbindungen wie Harnstoff aus

dem Pansen-Leber-Kreislauf werden von den Mikroorganismen zu Peptiden,

Aminosäuren und schließlich zu Ammoniak (NH3) abgebaut, welches im Pansen

aufgrund eines pKs-Wertes von 9,25 bei pH-Werten um 6,7 zu 95% als NH4+-Salz

vorliegt (LENG u. NOLAN 1984). Die Stoffwechselprodukte werden wiederum zur

Synthese mikrobiellen Proteins verwendet (MCDONALD 1948). Diese hochwertigen

N-Verbindungen sowie der Anteil des Rohproteins des Substrats, das nicht im

Pansen abgebaut wurde, dienen dem Wirtstier als Proteinquelle (HUNGATE 1966;

BERGMAN 1990). Während der Fermentation entstehen ebenfalls CO2 und CH4 in

einem Verhältnis von ca. 70:30 (CZERKAWSKI 1986). Die Gase sammeln sich im

dorsalen Pansensack an und bilden eine Gasblase, die über den Ruktus den Pansen

verlässt (HUNGATE 1960; CZERKAWSKI 1986). Im Gegensatz zu den SCFA und dem

mikrobiellen Protein können die während der Fermentation gebildeten Gase vom

Wirtstier nicht genutzt werden. Besonders die Abgabe von CH4 an die Umgebung

über den Ruktus ist mit energetischen Verlusten verbunden (JOHNSON u. JOHNSON

1995).

In der Fütterung von Wiederkäuern und speziell von Rindern ist Maissilage ein

Hauptbestandteil (STÄHLIN 1969; DE BOEVER 1997; KÜHN et al. 1999). Maispflanzen

wachsen schnell, der Anbau liefert einen hohen Ertrag und die hergestellten Silagen

sind reich an langsam abbaubarer Stärke und damit gut verdaulich (AKBAR et al.

2002; LECHARTIER u. PEYRAUD 2010; VÁRADYOVÁ et al. 2010). In-vivo- und In-vitro-

Studien zeigten, dass hohe Maisanteile in der Ration zu einem abnehmenden

molaren Acetat-Anteil an der SCFA-Produktion (41-45%) und daraus folgend zu

niedrigen Acetat:Propionat-Verhältnissen (1,1-1,2:1) führen (PHILLIPSON 1952;

EUSEBIO et al. 1959; FENNER et al. 1970; DE VISSER et al. 1998; RYMER u. GIVENS

2002; HILDEBRAND et al. 2010). Bei In-vitro-Inkubationen von Maissubstraten wurden

NH3-N-Konzentrationen von 5-6 mmol • l-1 und Verdaulichkeiten der organischen

Substanz (oS) von 39-54% gemessen (KLEVENHUSEN et al. 2009; HILDEBRAND et al.

2010; JALČ et al. 2010). Bei einer maisbasierten Fütterung von Rindern ergaben sich

ruminale Verdaulichkeiten der oS von 42-56% (PLASCENCIA u. ZINN 1996; OWENS et

al. 2009). Da eine Veränderung des Klimas während des Aufwuchses von

Einleitung 11

Maispflanzen deren chemische Zusammensetzung beeinflussen kann, könnten auch

die Fermentationsparameter und damit der Futterwert der hergestellten Futtermittel

(Silage) beeinflusst werden.

1.4 Fragestellungen und Ziele dieser Arbeit

Der Kenntnisstand über die Folgen veränderter Klimabedingungen wie erhöhter

[CO2] und Trockenstress auf den nutritiven Wert von Maispflanzen ist trotz intensiver

Forschung lückenhaft.

In der vorliegenden Arbeit lautet daher die erste Fragestellung: Welche

Auswirkungen haben Maispflanzen, die unter erhöhter [CO2] und Trockenstress

angebaut wurden, auf die Fermentationsparameter im Pansen? Zur Bearbeitung

dieser Fragestellung wurde Mais, der in einem FACE-Versuch mit kontrollierter

Wasserversorgung angebaut worden war, mithilfe der Rumen-Simulationstechnik

(rumen simulation technique; RUSITEC) fermentiert. Diese In-vitro-Methode erlaubt

die Untersuchung der Auswirkungen der Maisvarianten auf die ruminalen

Fermentationsprozesse unter definierten Bedingungen ohne individuellen Einfluss

eines Wirtstieres. Die Produktionsraten und die molaren Anteile der SCFA Acetat,

Propionat, Butyrat und Isovalerat und die NH3-N-Konzentration wurden in der

Pansensimulation analysiert. Des Weiteren wurden die Produktionsraten der

Fermentationsgase CO2 und CH4 und die Verdaulichkeit der organischen Substanz

der Maisvarianten untersucht. Die Anzahl der Protozoa wurde wiederholt im Laufe

des Versuchs in Abhängigkeit des eingesetzten Substrats bestimmt.

Zusätzlich wurde eine zweite Fragestellung bearbeitet: Haben die unterschiedlichen

Maisvarianten einen Einfluss auf die mikrobielle Gemeinschaft im Pansen? Die

Fragestellung wurde anhand der Single-strand-conformation-polymorphism (SSCP)-

Analyse zur Detektion qualitativer Veränderungen der Struktur der mikrobiellen

Gemeinschaft in der Fermenterflüssigkeit bearbeitet. In der vorliegenden Arbeit

wurden mit dieser Methode die Domänen der Bacteria und Archaea zu Beginn und

am Ende der Versuche untersucht.

13

2 Material und Methoden

Im Folgenden werden die angewandten Methoden und verwendeten Materialien

beschrieben. Genaue Auflistungen der verwendeten Lösungen und Chemikalien

sowie deren Bezugsquellen befinden sich im Anhang (Tabellen 8.1 und 8.2).

2.1 Pflanzenmaterial

Die Maispflanzen (Zea mays L., cv. Romario) wurden im Zuge eines

Forschungsprojekts des Instituts für Biodiversität des Johann Heinrich von Thünen-

Instituts in Braunschweig angebaut. Die Fragestellung der Studie lautete, ob

Leistungsparameter der Maispflanzen von einer erhöhten [CO2] sowie von

Trockenstress beeinflusst werden. Das für die vorliegende Arbeit untersuchte

Substrat stammt aus der finalen Ernte im September 2008. Zur Bearbeitung der oben

genannten Fragestellung wurde die FACE-Methode eingesetzt. Dieser

Versuchsaufbau wurde bereits in einer Untersuchung zum Einfluss einer erhöhten

[CO2] auf Weizen, eine typische C3-Pflanze, verwendet (WEIGEL u. MANDERSCHEID

2005) und für den Maisversuch modifiziert (Abbildung 2.1). Auf dem Versuchsfeld

wurden drei Abschnitte mit jeweils einem Durchmesser von 20 m mit je 32 vertikalen

Rohren für die CO2-Zufuhr ausgestattet. Die Länge der Rohre wurde dabei so

gewählt, dass die CO2-Versorgung der bis zu 3 m hohen Maispflanzen in jedem

Reifestadium gewährleistet war. Die CO2-Zielkonzentration lag bei 550 ppm CO2

während der Tageslichtstunden. Die Gaszuleitung wurde ab einem Blatt:Fläche-

Verhältnis von über 0,5:1 begonnen. Unterbrochen wurde die CO2-Zufuhr lediglich

bei Windstärken von über 5,5 m • s-1, um einen zu großen Gasverlust zu vermeiden.

Drei weitere Versuchsfelder wurden als CO2-Kontrolle abgesteckt.

Um den Einfluss von Trockenstress auf die Leistungsparameter der Maispflanzen

untersuchen zu können, wurden sowohl die Versuchsfelder mit CO2-Begasung als

auch die Kontrollfelder zusätzlich in bewässerte und Trockenstressabschnitte


unterteilt. Die Bewässerung der einen Hälfte wurde mithilfe von

Tropfbewässerungslinien gewährleistet. Im oberen 0,6 m Bodenhorizont wurde so

eine Bodenfeuchte von über 50% des maximalen für die Pflanzen verfügbaren

Bodenfeuchtegehalts erreicht.

Abbildung 2.1: Schema des FACE-Versuchsaufbaus mit den Versuchsabschnitten ohne CO2-Behandlung (linker, durchgezogener Kreis) und mit CO2-Anreicherung (rechter, gestrichelter Kreis) jeweils zur Hälfte mit und ohne Trockenstressinduktion durch die Überdachung.

PVC = Polyvinylchlorid

Zur Induktion von Trockenstress wurden über der anderen Hälfte der Versuchsfelder

Aluminiumrahmen installiert, die mit Polyvinylchlorid (PVC)-Planen bespannt werden

konnten (ERBS et al. 2010). Die Planen wurden bei wetterdienstlichen Vorhersagen

einer Niederschlagshöhe von über 10 mm am Tag aufgezogen. Mithilfe der

Dachkonstruktionen sollten Werte von 50% der für die Pflanzen maximal verfügbaren

Bodenfeuchte während der Sommermonate unterschritten werden. Die vier

Anbauvarianten der Maispflanzen sind in Tabelle 2.1 definiert.

Material und Methoden 15

Tabelle 2.1: Benennung der Anbauvarianten der Maispflanzen

Variante A 380 ppm CO2 (Kontrolle)

Variante B 550 ppm CO2

Variante C 380 ppm CO2 + Trockenstress

Variante D 550 ppm CO2 + Trockenstress

Die Ganzpflanzen wurden nach der finalen Ernte, der Abtrennung des Wurzelwerks

und grober Zerkleinerung bei -20 °C gelagert. Die Gefriertrocknung der Proben

wurde im Institut für Tierernährung des Friedrich Loeffler Instituts in Braunschweig

durchgeführt.

Repräsentative Proben der vier Maisvarianten wurden auf ihren Gehalt an

Rohnährstoffen und die Zusammensetzung der Faserfraktion untersucht. Die

Analysen wurden im Institut für Tierernährung des Friedrich Loeffler Instituts in

Braunschweig und im Futtermittelinstitut der LUFA Nord-West in Oldenburg

durchgeführt. Bestimmt wurden die Gehalte an Trockenmasse (TS) an der

ursprünglichen Substanz (uS) sowie die Anteile an Rohasche (Ra), oS, Rp, Rohfett

(Rfe), Rohfaser (Rfa), stickstoff-freien Extraktionsstoffen (NfE), neutralen

Detergentien-Fasern (NDF), sauren Detergentien-Fasern (ADF) und saurem

Detergentien-Lignin (ADL) (NAUMANN u. BASSLER 1997).


2.2 Rumen-Simulationstechnik

Um den Einfluss der Maisvarianten auf die ruminalen Fermentationsparameter und

die Zusammensetzung der ruminalen Mikroflora zu untersuchen, wurde die Rumen-

Simulationstechnik (RUSITEC) eingesetzt. Diese semi-kontinuierliche In-vitro-

Inkubationsmethode wurde von CZERKAWSKI u. BRECKENRIDGE (1977) zur

Untersuchung von Stoffwechselprozessen der ruminalen mikrobiellen Gemeinschaft

entwickelt.

Der Pansen als Gärkammer wurde bei dieser Methode durch sechs gasdichte

Fermenter (A; Plexiglas®, Röhm GmbH, D-64293 Darmstadt) ersetzt (Abbildung 2.2).

Von einem Spendertier (ausgewachsene Hinterwälder Kuh, trockenstehend) wurde

Panseninhalt entnommen, der durch Filtration durch eine Doppellage Gaze (Gazin®,

80 cm • 5 m, Lohmann & Rauscher International GmbH & Co. KG, D-56579

Rengsdorf) in eine flüssige und eine feste Phase (Partikel) aufgetrennt wurde. 80 g

der Pansenpartikel wurden in Nylonbeutel (Porengröße 150 μm, 16 cm • 7 cm,

Linker KG, D-34127 Kassel) eingewogen und in das an Deckel und Boden perforierte

Innengefäß (B) eingesetzt, um die partikelassoziierten Mikroorganismen in das In-

vitro-System zu inokulieren. Zusätzlich enthielt das Innengefäß einen Nylonbeutel mit

10 g TS des zu untersuchenden Substrats. Der Fermenter wurde mit circa 700 ml

flüssiger Pansenphase befüllt, mit der die flüssigkeitsassoziierten Mikroorganismen

dem System zugeführt wurden. Dieser Aufbau erlaubte die Darstellung der ersten

drei ruminalen Kompartimente. Das erste ruminale Kompartiment umfasste die

flüssige Phase im Fermenter. Dem zweiten Kompartiment konnte die flüssige Phase

im Innengefäß zugeordnet werden, während die Flüssigkeit in den Nylonbeuteln und

die Partikeloberfläche das dritte Kompartiment simulierten. Lediglich das vierte

Kompartiment in Pansenwandnähe konnte nicht dargestellt werden, da im

Versuchsaufbau eine Struktur zur Simulation der Resorptions- und

Sekretionsvorgänge fehlte.

Die Fermenter wurden zur Nachstellung der in vivo vorherrschenden

Körpertemperatur während der Dauer des Versuchs in einem Wasserbad (C)


belassen, das mithilfe eines Thermostats (D; Thermomixer®, B.Braun Melsungen AG,

D-34209 Melsungen) auf konstant 39 °C temperiert wurde.

Abbildung 2.2: 1 RUSITEC-Anlage 2 Vergrößerung eines eingebauten Fermenters (A) mit Innengefäß (B)

Die für die ruminale Verdauung wichtige Pufferfunktion des Speichels wurde durch

die kontinuierliche Zufuhr eines artifiziellen Speichels über eine Öffnung am Boden

des Fermenters ersetzt. Der täglich frisch angesetzte Puffer (modifiziert nach

MCDOUGALL (1948); Tabelle 2.2) wurde aus einem Puffergefäß (E) den Fermentern

über Tygonschläuche (F; 4,0 mm • 7,2 mm, omnilab GmbH & Co. KG, D-30989

Gehrden) mithilfe einer Mehrkanalpumpe (G; Typ B1, Ole Dich, Hvidovre, Dänemark)

zugeführt. Das tägliche Fördervolumen betrug dabei ca. 750 ml pro Tag (OEZTUERK

et al. 2005; KOCH et al. 2006; BECKER 2012). Der entstehende

Flüssigkeitsüberschuss (Überlauf) mit den Fermentationsprodukten wurde in einem

Überlaufgefäß (H; 1000 ml Erlenmeyerkolben) über 24 h gesammelt. Die Verbindung

zwischen Fermenter und Überlaufgefäß wurde über luftdichte Butylschläuche (I;

8,0 mm • 12,0 mm, YMC Europe GmbH, D-46539 Dinslaken) hergestellt. Um die

Fermentationsvorgänge im Überlauf zu stoppen, wurden die Überlaufgefäße auf Eis

in Styroporbehältern (J) gelagert. Das produzierte Fermentationsgasgemisch


gelangte über einen weiteren Butylschlauch von den Überlaufgefäßen in

angeschlossene Gassammelbeutel (K; Plastigas, Linde AG, D-80331 München), wo

es über 24 h gesammelt wurde.

Tabelle 2.2: Zusammensetzung des als künstlicher Speichel eingesetzten Puffers; modifiziert nach MCDOUGALL (1948)

Chemikalien mmol • l-1

NaCl 28,00

KCl 7,69

CaCl2 • 2 H2O 0,22

MgCl2 • 6 H2O 0,63

1 n HCl [ml] 0,50

NaH2PO4 • H2O 10,00

Na2HPO4 • 12 H2O 10,00

NH4Cl 5,00

NaHCO3 97,90

pH-Wert 7,4

Osmolarität [mosm • l-1] 304

Um die Pansenmotorik zu simulieren, wurde das Innengefäß über einen

Führungsstab mit einer horizontalen, von einem Elektromotor (L) auf und ab

bewegten Querstrebe verbunden. Durch diese Konstruktion wurden sowohl eine

regelmäßige Durchmischung (sechs Zyklen pro Minute) der flüssigen Phase als auch

eine gründliche Durchspülung der Nylonbeutel gewährleistet. Da das Wiederkäuen

nicht simuliert werden kann, wurde das zu untersuchende Substrat vor der Einwaage

in die Nylonbeutel manuell auf eine Partikellänge von ca. 10-15 mm zerkleinert.

Bei Vergleich der Ergebnisse aus RUSITEC-Versuchen mit Daten aus In-vivo-

Studien sollte beachtet werden, dass bei Inkubation des gleichen Substrats mittels

der RUSITEC-Methode niedrigere Acetat:Propionat-Verhältnisse, höhere NH3-N-

Konzentrationen, gesteigerte Verdaulichkeiten der Trockenmasse sowie niedrigere

Protozoa-Konzentrationen erreicht werden (MARTINEZ et al. 2010a). Als mögliche

Ursachen für die Unterschiede zwischen der Fermentation in vivo und in vitro werden

fehlende Absorptions- und Sekretionsvorgänge im RUSITEC-Aufbau (MANSFIELD et

al. 1995; GIZZI et al. 1998; MARTINEZ et al. 2010a) sowie die aufgrund des täglichen


Betriebs der Anlage wiederholt auftretende O2-Zufuhr in das System genannt (GIZZI

et al. 1998; MARTINEZ et al. 2010b).

Ein großer Vorteil der Rumen-Simulationstechnik ist es, dass durch einheitlichen

Betrieb der Fermenter die individuellen Einflüsse des Versuchstiers als

Varianzquellen ausgeschlossen werden können. Neben dem Habitus eines Tieres

können auch Futteraufnahme, Speichelproduktion und die ruminale Motilität einen

Effekt auf die ruminale Fermentation ausüben. Bei der Untersuchung strikt ruminaler

Abläufe wären bei In-vivo-Versuchen Tiere nötig, die sowohl mit einer Kanüle im

Pansen als auch im Dünndarm ausgestattet wurden. Auf die aufwändige Haltung und

Pflege solcher Versuchstiere kann bei Einsatz der RUSITEC-Methode verzichtet

werden. Zusätzlich unterschreitet der Substrataufwand in vitro das benötigte

Volumen eines Fütterungsversuchs deutlich. Die Bearbeitung einer Fragestellung

kann mit der RUSITEC-Methode unter kontrollierten Bedingungen erfolgen, wobei

mehrere Ansätze pro Behandlung betrieben werden können. RUSITEC-Versuche

und deren Ergebnisse sind darüber hinaus gut reproduzierbar (BECKER 2012). Des

Weiteren wurde festgestellt, dass die Ergebnisse einer Analyse der

Fermentationsmuster verschiedener Rationen mit der RUSITEC-Methode

entsprechende Daten lieferten wie ein vergleichend durchgeführter In-vivo-Versuch

(MARTINEZ et al. 2010a; MARTINEZ et al. 2010b).


2.3 Versuchsdesign

Für die Bearbeitung der Fragestellungen wurden in dieser Studie zwei Versuche

durchgeführt. In Versuch 1 (V1) enthielten jeweils drei Fermenter eine der vier

Aufwuchsvarianten der Maispflanzen (Tabelle 2.1). Die Verteilung der Varianten in

den Fermentern ist in Abbildung 2.3 dargestellt. Im zweiten Versuch (V2) wurden die

beiden bewässerten Maisvarianten (A = 380 ppm CO2 und B = 550 ppm CO2)

eingesetzt. V1 wurde über eine Äquilibrierungsphase von sechs Tagen mit einer

anschließenden achttägigen Versuchsphase durchgeführt. Im Gegensatz dazu

wurden in V2 speziell die Veränderungen in den Gehalten der SCFA und deren

molaren Anteilen während der Äquilibrierungsphase untersucht.

Abbildung 2.3: Verteilung der Substrate und Anordnung der Fermenter für V1 und V2

2.3.1 Versuchsvorbereitungen

Vor Beginn beider Versuche wurden Fermenter und Innengefäße sowie alle

Butylschläuche in einer 3,7%igen Formaldehyd-Lösung (Tabelle 8.1) zur

Desinfektion für 24 h gelagert. Nach gründlicher Spülung mit destilliertem Wasser

(Aqua dest.) wurden die Bauteile in einem Trockenschrank (Modell 600, Memmert


GmbH & Co. KG, D-91107 Schwabach) über 24 h bei 60 °C getrocknet. Die

Dichtungsringe der Führungsstäbe wurden mit Schmiermittel (Glisseal® N, Borer

Chemie AG, Zuchwil, Schweiz) versetzt. Die Tygonschläuche zur Pufferversorgung

wurden vor jedem Versuch erneuert, um eine Verfälschung durch Ablagerungen

vorheriger Versuchsdurchgänge zu verhindern. Die Nylonbeutel wurden vor

Gebrauch autoklaviert (Varioklav, Dampfsterilisator Typ 500, H+P Labortechink

GmbH & Co. KG, D-85764 Oberschleißheim) und im Anschluss im Trockenschrank

für 24 h bei 60 °C getrocknet. Jeweils 10 g TS der Versuchssubstrate wurden pro

Nylonbeutel eingewogen, woraufhin die Nylonbeutel mit Kabelbindern verschlossen

und bis zur Verwendung im Exsikkator gelagert wurden. 12 h vor Versuchsbeginn

wurden die Fermenter in die Wasserbäder eingesetzt und mit Sicherungsstreben

arretiert, um ein Aufschwimmen zu verhindern. Die Wasserbäder wurden mit Aqua

dest. gefüllt und auf 39 °C temperiert. Der Puffer (Tabelle 8.1) wurde frisch angesetzt

und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert.

2.3.2 Versuchsbeginn

Nach Entnahme und Auftrennung des Panseninhalts wurden Nativproben der in

einem Wasserbad warm gehaltenen flüssigen Pansenphase zur Bestimmung der

Anzahl der Protozoa entnommen. Für jeden Fermenter wurde ein Nylonbeutel mit

80 g festem Panseninhalt befüllt und in das Innengefäß überführt. Diese Beutel

dienten zur Inokulation der partikelassoziierten ruminalen Mikroflora in das In-vitro-

System. Nach Verschluss der Innengefäße und deren Einsatz in die Fermenter

wurden letztere mit 700 ml temperiertem Pansensaft aufgefüllt. Die Fermenter

wurden nun luftdicht verschlossen, in das Wasserbad eingesetzt und dort fixiert. Im

Anschluss wurden die Tygon- und Butylschläuche angeschlossen, das Puffergefäß

gefüllt sowie Mehrkanalpumpe und Elektromotor angeschaltet. Letztlich wurde durch

Begasung der Überlaufgefäße mit Stickstoff der noch im System vorhandene O2

verdrängt.


2.3.3 Probenentnahme V1

Der Probenentnahmeplan ist in Tabelle 2.3 aufgeführt. Während der

Äquilibrierungsphase wurden alle Fermenter täglich aus der Anlage ausgebaut und in

einem separaten Wasserbad geöffnet. Nach Messung von pH-Wert und

Redoxpotential in der Fermenterflüssigkeit wurde an Tag 1 der Nylonbeutel mit dem

festen Panseninhalt entnommen und durch einen neuen Substratbeutel ersetzt. Der

Beutel mit Pansenpartikeln wurde 2 • 2 min in je 40 ml warmer Pufferlösung

ausgequetscht. Dieser Vorgang diente zu Ablösung und Ausschwemmung der

Mikroorganismen aus der unmittelbaren Umgebung und von der Oberfläche der

Partikel. Die entstandene Lösung wurde in das Fermentationsgefäß überführt. Der

übrige Inhalt des Nylonbeutels wurde verworfen. Vor dem erneuten Einbau des

Fermenters in die Anlage wurde das Überlaufvolumen im zugehörigen Überlaufgefäß

mithilfe eines Messzylinders bestimmt, der Inhalt anschließend verworfen. Der

angeschlossene Gassammelbeutel wurde sorgfältig ausgedrückt. Zum Abschluss

wurden die Überlaufgefäße mit Stickstoff begast.

In den folgenden Tagen wurde dieser Ablauf wiederholt, wobei jeweils der

Nylonbeutel entnommen und in warmer Pufferlösung ausgequetscht wurde, der sich

bereits 48 h im System befand. An Tag 1 wurde jeweils zusätzlich 1 ml der

Fermenterflüssigkeit zur Auszählung der Protozoa entnommen. Die Probe wurde

sofort mit 1 ml Methylgrünlösung (Tabelle 8.1) in einem lichtundurchlässigen

Eppendorfgefäß vermischt und bis zur Untersuchung dunkel gelagert. Außerdem

wurden vor Austausch der Substratbeutel 30 ml der Fermenterflüssigkeit zur Analyse

der mikrobiellen Gemeinschaft (des ersten Kompartiments) entnommen und in 50 ml

Weithalsflaschen auf Eis gelagert. Die Aufbereitung der Proben erfolgte stets am

gleichen Tag. Die Probenentnahme für die Auszählung der Protozoa wurde an Tag 7

wiederholt. Am letzten Versuchstag (Tag 14) wurden ebenfalls Proben der

Fermenterflüssigkeit zur Analyse der Protozoa-Konzentration und zur Untersuchung

der mikrobiellen Gemeinschaft entnommen.



Parameter Äquilibrierungsphase Versuchsphase

Tage nativ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

pH x x x x x x x x x x x x x x

Redoxpotential x x x x x x x x x x x x x x

Überlauf x x x x x x x x x x x x x x

SCFA x x x x x x x x

NH3-N x x x x x x x x

Verdaulichkeit x x x x x x x x

Protozoa x x x x

Mikroorganismen x x

Fermentationsgas x x x x x x x x

Während der Versuchsphase wurden täglich pH-Werte und Redoxpotentiale der

Fermenterflüssigkeit gemessen. Der Beutelwechsel erfolgte entsprechend dem

Ablauf während der Äquilibrierungsphase. Der Beutelinhalt wurde allerdings nicht

verworfen, sondern zur Analyse der Verdaulichkeit der oS bei -20 °C eingefroren.

Nach Messung des Überlaufvolumens wurden Proben der Überlaufflüssigkeit zur

Konzentrationsbestimmung von SCFA (7 ml) und NH3-N (3 ml) entnommen, in

Glasfläschchen mit Gewindeverschluss abgefüllt und bei -20 °C gelagert. Die

Gassammelbeutel wurden vor Öffnung des Systems durch Ausbau der Fermenter

gasdicht verschlossen und von den Überlaufgefäßen getrennt. Die Bestimmung des

Volumens des in 24 h produzierten Fermentationsgasgemisches erfolgte unter

Verwendung eines Trommelgaszählers (Ritter Apparatebau GmbH & Co. KG, D-

44982 Bochum). Zusätzlich wurden mit Monovetten zur Blutabnahme (Venosafe®,

Typ VF-109 SP, Terumo, D-65760 Eschborn) und Kanülen (Sterican, Größe: 12,

0,7 mm • 30 mm, B.Braun Melsungen AG, D-34209 Melsungen) Proben direkt aus

den Gassammelbeuteln zur Analyse der Zusammensetzung des

Fermentationsgasgemisches entnommen. Temperatur und Luftdruck der Umgebung

wurden täglich aufgezeichnet, um die Ergebnisse der Gasuntersuchung im

Anschluss normieren zu können.


2.3.4 Probenentnahme V2

Die Vorbereitungen und Inokulation erfolgten in V2 entsprechend der Beschreibung

von V1. Der Probenentnahmeplan ist in Tabelle 2.4 abgebildet. In V2 wurden wie in

V1 täglich pH-Werte und Redoxpotentiale bestimmt und die Futterbeutel

ausgetauscht. Zusätzlich wurden täglich das Überlaufvolumen bestimmt und Proben

zur Analyse der SCFA-Produktionsraten und deren molare Anteile der SCFA

entnommen. An den Versuchstagen 1 und 7 erfolgte ebenfalls eine Probenentnahme

der Fermenterflüssigkeit zur Untersuchung der mikrobiellen Gemeinschaft.


Parameter Äquilibrierungsphase

Tage 1 2 3 4 5 6 7

pH x x x x x x x

Redoxpotential x x x x x x x

Überlauf x x x x x x x

SCFA x x x x x x x

Mikroorganismen x x


2.3.5 Analysen

2.3.5.1 pH-Werte

Die Messung der pH-Werte der Fermenterflüssigkeit erfolgte täglich, stets direkt nach

Eröffnung des Fermenters mithilfe eines pH-Meters (Digital-pH-Meter 646, Knick

GmbH & Co. KG, D-14163 Berlin) und einer pH-Elektrode (InLab® Routine, Mettler-

Toledo GmbH, D-35353 Gießen). Jeweils vor Beginn der Äquilibrierungs- und

Versuchsphase wurde das pH-Meter mit standardisierter Eichlösung (pH-

Pufferlösungen, Mettler-Toledo GmbH, D-35353 Gießen) geeicht.

2.3.5.2 Redoxpotentiale

Das Redoxpotential der flüssigen Phase im Fermenter wurde ebenfalls täglich

ermittelt. Die Messung wurde über 60 s mit einem pH-Meter (Digital-pH-Meter 646,

Knick GmbH & Co. KG, D-14163 Berlin) und einer Redox-Elektrode (InLab® Redox

Pro, Mettler-Toledo GmbH, D-35353 Gießen) durchgeführt.

2.3.5.3 Produktionsraten der SCFA und deren molare Anteile

Die Konzentrationen von Acetat, Propionat, Butyrat und Isovalerat wurden

gaschromatographisch (Gaschromatograph 5890 Series II, Hewlett Packard, D-

71034 Böblingen) in der Überlaufflüssigkeit jedes Fermenters ermittelt. Die während

der Versuche entnommenen Proben (siehe Tabellen 2.3 und 2.4) wurden zunächst

bei 4 °C aufgetaut und anschließend für 20 min bei 4 °C mit 40.000 g zentrifugiert

(Rotor SM24, Sorvall® RC-5C, Instruments Du Pont Company, Wilmington, USA). Ein

ml des Überstands wurde mit 0,1 ml 98%iger Ameisensäure (Tabelle 8.2) versetzt.

Die angesäuerten Proben wurden nach einer 10 minütigen Inkubationszeit bei

4.000 g für 10 min erneut zentrifugiert (Minifuge 2, Heraeus-Christ, D-38835

Osterode) und anschließend 1 ml des Überstand in Rollrand-Ampullen (Agilent


Technologies GmbH & Co. KG, D-76337 Waldbronn) überführt. Die Ampullen

wurden im Anschluss luftdicht verschlossen (VON ENGELHARDT u. SALLMANN 1972).

Die für die Gaschromatographie verwendete Trennsäule (Länge 1,8 m;

Innendurchmesser 2 mm) wurde mit Chromosorb WAW (mesh 80/100) mit 20%

Neopentylglycolsuccinat (NPGS) und 2% ortho-Phosphorsäure (Analyt-MTC

Messtechnik GmbH, D-79379 Müllheim) von Hand gestopft. Die Messparameter der

gaschromatographischen Analyse sind in Tabelle 2.5 zusammengefasst. Nach jeder

zehnten Probe wurde ein externer Standard (Merck KGaA, D-64271 Darmstadt)

vermessen. Die Konzentration der SCFA in mmol pro Liter produzierter Überlauf

konnte so berechnet werden. Die Produktionsraten der gesamten SCFA sowie für

jede SCFA separat (mmol • Tag-1) wurden durch Miteinbeziehung des in 24 h

produzierten Überlaufvolumens (ml • Tag-1) errechnet. Abschließend wurden die

molaren Anteile der SCFA bestimmt.

Tabelle 2.5: Messparameter der gaschromatographischen Analyse der SCFA

Konditionierung 240 °C für 24 h

Ofentemperatur 130 °C

Injektionsblock 225 °C

Flammenionisationsdetektor 250 °C

Trägergas (Stickstoff) 25 ml • min-1

Wasserstoff 30 ml • min-1

synthetische Luft 420 ml • min-1

Injektionsvolumen 1 μl

Wiederholungen zwei Einspritzungen

Analysenlaufzeit ca. 9 min

2.3.5.4 Fermentationsgase

Die Untersuchung der Fermentationsgasproben wurde am Institut für

Siedlungswasserwirtschaft und Abfalltechnik (ISAH) der Leibniz Universität Hannover

durchgeführt und erfolgte gaschromatographisch (GC 2014, Shimadzu Europa

GmbH, D-47269 Duisburg). Es wurden ein Wärmeleitfähigkeitsdetektor (TCD) und

eine Glassäule (Länge; 2,1 m; Innendurchmesser 3 mm, Außendurchmesser 5 mm),


die mit Porapak Q (Sigma-Aldrich GmbH, 89555 Steinheim, D) gefüllt war,

verwendet. Als Trägergas diente Helium. Die Produktion von CO2 und CH4

[ml • Tag-1] wurde mithilfe ihrer prozentualen Anteile am Volumen des über 24 h

produzierten Fermentationsgasgemisches berechnet und eine Korrektur der Werte

auf normalisierte Bedingungen (0 °C und 1013 hPa) vorgenommen.

2.3.5.5 NH3-N-Konzentrationen

Die Konzentration von NH3-N [mmol • Tag-1] in der über 24 h gesammelten

Überlaufflüssigkeit wurde photometrisch mithilfe der Harnstoff/Ammoniak-Test-

Kombination (Roche Diagnostics, D-68305 Mannheim) bestimmt. Bei diesem Test

bilden Ammoniumionen mit dem zugesetzten Hypochlorit bei Anwesenheit von

Phenol einen blauen Farbstoff (Berthelot-Reaktion). Die Absorption dieses

Farbkomplexes wurde im Photometer (DU 640, Beckman Coulter GmbH, D-47807

Krefeld) bei einer Wellenlänge von 546 nm gemessen und ist proportional zu dem in

der Probe enthaltenen NH3-N.

2.3.5.6 Verdaulichkeiten der organischen Substanz

Die während der Versuchsphase entnommenen und eingefrorenen Beutel wurden in

einem Trockenschrank (Modell 600, Memmert GmbH & Co. KG, D-91107

Schwabach) bei 65 °C bis zur Gewichtskonstanz (ca. 48 Stunden) getrocknet. Im

Anschluss wurde eine repräsentative Probe des fermentierten Substrats in einen

Tiegel eingewogen und in einem Muffelofen (Thermo Scientific Heraeus M110,

Heraeus instruments GmbH, D-63450 Hanau) bei 600 °C über 24 Stunden verascht.

Zusätzlich wurden pro Variante je 10 g TS des unbehandelten Substrats in zwei

Nylonbeutel eingewogen und entsprechend der fermentierten Proben behandelt.

Dieses native Substrat diente als Standard. Durch Abzug des Gewichts der Ra von

der TS konnte der Anteil der oS berechnet werden. Anschließend wurde der Anteil

an verdaulicher oS als Differenz zwischen den Nativproben der jeweiligen Variante

und den fermentierten Proben bestimmt.


2.3.5.7 Anzahl der Protozoa

Die Quantifizierung der Protozoa in den mit Methylgrün (Tabelle 8.1) fixierten Proben

(1:2) erfolgte nach Herstellung von Verdünnungen je nach Probenentnahmetag

(Tabelle 2.6). Die verdünnten Proben wurden in die drei Kammern (jeweils 2,0 cm •

1,8 cm • 0,15 cm) einer McMaster-Zählkammer (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, D-

97922 Lauda Königshofen) eingegeben. Mithilfe eines Lichtmikroskops (BH-2,

Olympus Europa Holding GmbH, D-20097 Hamburg) mit einem Okular mit

Netzmikrometer (Seitenlänge des Quadrats: 0,05 cm) wurde bei einer 160-fachen

Vergrößerung in 40 Netzmikrometer-Quadraten die Anzahl der Protozoa ausgezählt.

Die Quantifizierung erfolgte damit in einem Probenvolumen von 0,015 ml (40 • 0,05

cm • 0,05 cm • 0,15 cm). Unter Anwendung der angegebenen Formel wurde die

Anzahl der Protozoa pro ml flüssiger Pansenphase bzw. pro ml Fermenterflüssigkeit

kalkuliert.

Umrechnung zur Quantifizierung der Protozoa-Konzentration pro ml Probe

Protozoa = Protozoa40 • 1

• V-Faktor [n • ml-1] 0,015

Protozoa40

= Anzahl der in 40 Quadraten bestimmten Protozoa

0,015 = Volumen der Zählkammer

V-Faktor = Verdünnungsfaktor, siehe in Tabelle 2.4

Tabelle 2.6: Verdünnungsfaktoren zur Bestimmung der Protozoa-Konzentration

Verdünnung

Nativprobe 1:28

Probenentnahmetag 1 1:14




2.4 Statistische Auswertung

Die graphische Darstellung der Daten erfolgte in Form von Säulendiagrammen der

Mittelwerte (MW) der Messergebnisse der drei gleich behandelten Fermenter mit

Angabe des Standardfehlers des MWs (SEM), um einen Überblick über die Lage und

Streuung zu erhalten. Die statistische Auswertung der biochemischen Parameter

erfolgte mit IBM® SPSS® Statistics Version 19 für Windows®. Zunächst wurde die

Normalverteilung der erhobenen Daten mithilfe des Kolmogorow-Smirnow-Tests

überprüft. Anschließend wurden die Ergebnisse der Versuche unter Anwendung

eines allgemeinen linearen Modells mit Messwiederholung ausgewertet. Für V1

wurden der Einfluss der Zeit als Innersubjektfaktor sowie die Wirkung von

Trockenstress und CO2-Konzentration als Zwischensubjektfaktoren auf die

untersuchten Parameter analysiert. Die Ergebnisse von V2 wurden auf den Einfluss

von Zeit (Innersubjektfaktor) und CO2-Konzentration (Zwischensubjektfaktor)

getestet. Aufgrund der verletzten Sphärizität der Datensätze (Mauchly-Test) wurde

eine Korrektur der Freiheitsgrade (Methoden „Untergrenze“ oder „Huynh-Feldt“)

vorgenommen. Um signifikante Einflüsse der Zwischensubjektfaktoren genauer

definieren zu können, wurde ein Fisher‘s Least Significant Difference (LSD) Test zum

Vergleich der MW der einzelnen Varianten durchgeführt. Unterschiede zwischen den

verschiedenen Parametern mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit (p) von p≤0,05

wurden als signifikant bezeichnet (* = p≤0,05; ** = p≤0,01; *** = p≤0,001).


2.5 Single-strand-conformation-polymorphism-Analyse

Die Single-strand-conformation-polymorphism (SSCP)-Analyse wurde entwickelt, um

die Zusammensetzung mikrobieller Populationen ohne aufwändige

Kultivierungsschritte qualitativ bewerten und vergleichen zu können. Die Methode

wurde ursprünglich in der Humanmedizin zur Mutationsdiagnostik eingesetzt (ORITA

et al. 1989). Dabei wurden genetische finger prints erstellt, die das Aufspüren von

Punktmutationen erlaubten. Die SSCP-Analyse wurde mittlerweile für die qualitative

Untersuchung der Zusammensetzung mikrobiologischer Populationen etabliert

(SCHMALENBERGER u. TEBBE 2003; DOHRMANN u. TEBBE 2004; BOGUHN et al. 2008).

Nach Isolierung der genomischen DNA (gDNA) werden konservierte Abschnitte der

16S rRNA-Gene spezifischer Gruppen der Mikroflora (in dieser Studie Bacteria und

Archaea) mittels der polymerase chain reaction (PCR; Polymerase-Kettenreaktion)

amplifiziert. Im Anschluss an die der Domäne spezifischen Amplifizierung wird das

PCR-Produkt als Matrize für eine weitere PCR genutzt. Das Ziel dieser nested PCR

ist es, die Spezifität der PCR-Produkte zu erhöhen sowie den enzymatischen Verdau

der Doppelstrang-DNA (dsDNA) zur Einzelstrang-DNA (ssDNA) vorzubereiten. Der

5’-Strang der dsDNA wird dafür phosphoryliert. Die im nächsten Schritt zugefügte

λ-Exonuklease bindet an den phosphorylierten DNA-Strang und baut diesen ab. Das

Produkt sind ssDNA-Fragmente einer Länge von 408 Basenpaaren (bp), die

aufgrund der spezifischen Primärstruktur individuelle Sekundärstrukturen ausbilden

(DOHRMANN u. TEBBE 2004). Aufgrund der unterschiedlichen Sekundärstrukturen

(Konformationen) der ssDNA-Stücke können diese in einem nicht-denaturierenden

Gel elektrophoretisch aufgetrennt werden. Das Ergebnis sind sogenannte

SSCP-Profile, die im Anschluss mit einer Silberfärbung sichtbar gemacht werden.

Nach Digitalisierung der fixierten SSCP-Profile ist eine computergestützte

Auswertung der Bandenmuster möglich.

Es ist zu beachten, dass die SSCP-Analyse eine rein qualitative Untersuchungs-

methode darstellt. Veränderungen in den Konzentrationen einzelner Spezies können

nicht erfasst werden (DOHRMANN u. TEBBE 2004). Zusätzlich ist es möglich, dass


mehrere Spezies ähnliche PCR-Produkte aufweisen oder deren ssDNA-Abschnitte

ähnliche Konformationen annehmen und damit in der SSCP-Analyse eine einzige

Bande bilden (SCHWIEGER u. TEBBE 1998; SCHMALENBERGER u. TEBBE 2003;

DOHRMANN u. TEBBE 2004; WITZIG et al. 2010). Umgekehrt kann die ssDNA einer

Spezies mehrere Konformationen zeigen und so für mehrere Banden verantwortlich

sein (DOHRMANN u. TEBBE 2004). In der vorliegenden Arbeit wurden Proben der

flüssigen Phase jedes Fermenters an den Tagen 1 und 14 von V1 sowie an den

Tagen 1 und 7 von V2 entnommen. Die Proben von V1 wurden auf den Einfluss der

Maisvarianten mit den Faktoren [CO2] und Trockenstress auf die mikrobielle

Gemeinschaft gesondert nach Entnahmetagen untersucht. Da in V2 nur zwei

Maisvarianten mit dem Faktor [CO2] verglichen wurden, konnte zusätzlich der Effekt

des Entnahmetags analysiert werden.

2.5.1 Aufbereitung der Proben

Die Proben der Fermenterflüssigkeit wurden für 20 min bei 4 °C und 27.255 g

zentrifugiert (Sorvall®, RC-5C, Rotor SS34, Instruments Du Pont Company,

Wilmington, USA). Da Archaea im Pansen eine enge räumliche Assoziation mit

Protozoa eingehen (VOGELS u. STUMM 1980), wurde von der üblichen

Vorgehensweise der Differentialzentrifugation abgesehen, um zu verhindern, dass

ein Großteil der Archaea-Fraktion bereits bei der Zentrifugation mit dem Pellet

verworfen wird (BECKER 2012). Die Pellets wurden an Tag 1 mit 5 ml, an den Tagen

7 und 14 mit 3,75 ml 0,9%iger NaCl-Lösung (Tabelle 8.1) resuspendiert. Zur

Konservierung wurde die Lösung in flüssigen Stickstoff getropft und die Proben bei

-80 °C gelagert.

2.5.2 Isolierung der genomischen DNA der ruminalen Mikroflora

Die Isolierung der genomischen DNA (gDNA) erfolgte aus 500 μl der schonend

aufgetauten Kryoproben (siehe Kapitel 2.5.1). Im Anschluss an einen

Zentrifugationsschritt (4 °C, 13.000 g, 5 min in Megafuge 1.0 R, Heraeus Instruments


GmbH, D-63450 Hanau) wurde das Pellet (15-45 mg) in 600 μl TEN (Tris-EDTA-

NaCl; Tabelle 8.2) resuspendiert. Es folgte der mechanische Aufschluss des

Probenmaterials unter Verwendung der bead beating Methode. In einem Ribolyser

Cell Disrupter (Hybaid GmbH, D-69111 Heidelberg) wurden die Proben unter Zusatz

von 2,5 g Ziconia/Silica-Kügelchen (0,1 mm Durchmesser, Roth GmbH & Co. KG, D-

76185 Karlsruhe) in zwei Durchgängen aufgeschlossen (6,0 m • s-1 und 4,5 m • s-1,

für je 40 s). Die Silica-Kügelchen wurden im Anschluss bei 4 °C und 13.000 g in 15

min abzentrifugiert. Es folgten mehrere Inkubationsschritte zur Spaltung von

1,4-glykosidischen Bindungen, von RNA-Stücken und Proteinen (Tabelle 2.7).

Tabelle 2.7: Inkubationsschritte während der DNA-Isolierung

Substanzen Volumen Dauer Temperatur

100 mg • ml-1 Lysozym-Lösung 50 μl 30 min 37 °C

RNase A 10 μl

Proteinase K-Lösung (20 mg • ml-1) 10 μl 1 h 37 °C

20%iger SDS-Lösung (50 °C) 15 μl

CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid)-Lösung (50 °C) 50 μl 10 min 65 °C

4 M NaCl-Lösung 125 μl

Anschließend wurden die Proben durch Fällung von Proteinen aufgereinigt (Phenol-

Chloroform-Extraktion Tabelle 2.8). Das DNA-Pellet wurde nach Abpipettieren des

Überstandes bei Raumtemperatur getrocknet und abschließend in 15 μl TE-Puffer

(Tris-EDTA; Tabelle 8.1) resuspendiert.

Tabelle 2.8: Phenol-Chloroform-Extraktion

Substanzen Volumen Z Aufreinigungsschritte

Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) 780 μl 5 min Proteinfällung: DNA in oberer, wässriger Phase; ausgefallene Proteine in Interphase

Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1)

780 μl 10 min

Isopropanol (100%) 500 μl 30 min Fällung der DNA

Ethanol (80%) 950 μl 5 min Waschen des DNA-Pellets

Z = Zentrifugation; erfolgte mit 13.000 g bei 4 °C


2.5.3 Photometrische Quantifizierung der isolierten gDNA

Zur Quantifizierung der isolierten gDNA erfolgte eine photometrische Analyse. Zu

diesem Zweck wurde die gDNA-Lösung mit autoklaviertem Aqua dest. verdünnt

(1:72). Die Extinktion der Lösung wurde mithilfe einer Quarzküvette (minimales

Füllvolumen 70 μl, Hellma GmbH & Co. KG, D-79371 Müllheim) im Photometer

(Biophotometer 6131, Eppendorf AG, D-22339 Hamburg) bei einer Wellenlänge von

260 nm vermessen. Anhand der Ergebnisse der photometrischen Quantifizierung

wurden Verdünnungen der gDNA mit autoklaviertem Aqua dest. mit einer

Zielkonzentration von 25 ng • μl-1 gDNA angesetzt.

2.5.4 Agarose-Gelelektrophorese

Zur Überprüfung der Größe der isolierten gDNA-Fragmente wurde im Anschluss an

die photometrische Quantifizierung eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt.

Die Beladung des 0,8%igen Agarose-Gels (Tabelle 8.1) erfolgte mit jeweils 3 μl der

hergestellten gDNA-Lösung, die mit 2 μl loading dye (dem Marker zugehörig; Tabelle

8.2) versetzt wurde, sowie jeweils 3 μl der beiden Marker (MassRulerTM DNA Ladder

Mix und λ-Hind III; Tabelle 8.2). Die Elektrophorese wurde für 70 min bei 80 mV

durchgeführt. Das Gel wurde im Anschluss mit einer Ethidiumbromid-Lösung gefärbt.

Die angefärbten Banden wurden durch Bestrahlung mit UV-Licht (Biometra Ti 1,

Biometra GmbH, 37079 Göttingen, D) sichtbar gemacht und deren Emission

detektiert (BioDoc IITM).

2.5.5 Polymerase-Kettenreaktion

Mithilfe der PCR wurden spezifische Abschnitte der 16S rRNA-Gene durch Einsatz

definierter Primerpaare amplifiziert. Die eingesetzten Primer (Biomers.net GmbH D-

89077 Ulm) sind mit Sequenz, Position und Annealingtemperatur in Tabelle 2.9

aufgeführt (LANE 1991; STAHL u. AMANN 1991; WEISBURG et al. 1991; GROSSKOPF et

al. 1998; SCHWIEGER u. TEBBE 1998; BOGUHN et al. 2010).


Zunächst erfolgte die Domäne-spezifische PCR mit den Primern F27 und R1492

(Bacteria) bzw. A109f und A934b (Archaea). In doppelten Ansätzen wurde jeweils 1

μl der gDNA-Lösung (25 ng • μl-1) als Matrize oder aber autoklaviertes Aqua dest. als

Negativkontrolle eingesetzt.

Tabelle 2.10: Ansätze für die initiale Domäne-spezifische PCR und die nested PCR

Ansatz pro Probe Initiale PCR „nested“ PCR

Angaben in μl

autoklaviertes Aqua dest. 20,375 41,75

10x Puffer 2,5 5

dNTP 0,5 1

forward primer 0,25 0,5

revers primer 0,25 0,5

taq Polymerase 0,125 0,25

Template 25 ng • μl-1 1 1

Gesamtvolumen 25 50

Die Ansätze der Reaktionslösungen sind in Tabelle 2.10, die gewählten Programme

des verwendeten Thermocyclers (Eppendorf AG, D-22339 Hamburg) in Tabelle 2.11

aufgelistet.

Tabelle 2.11: Programme der initialen Domäne-spezifischen PCR und der nested PCR

Phase

initiale PCR nested PCR

Temperatur [°C]

Dauer [min]

Temperatur

[°C] Dauer [min]

Aufheizen des Deckels 105 - 105 -

Initiale Denaturierung 95 15 95 15

Denaturierung 94 1 30

Zyklen

94 ¾ 25

Zyklen Annealing Tabelle 2.7 1 Tabelle 2.7 ¾

Elongation 72 1 72 1

Finale Elongation 72 5 72 5

Das Ergebnis des initialen PCR-Schritts wurde mithilfe eines 1%igen Agarose-Gels

(Tabelle 8.1) überprüft, wobei abweichend von Kapitel 2.5.4 der Gene RulerTM 50 bp

DNA Ladder als Marker mit zugehörigem loading dye (Tabelle 8.2) verwendet wurde.


Es erfolgte zudem eine photometrische Quantifizierung des PCR-Produktes (siehe

Kapitel 2.5.3).

Im weiteren Verlauf wurde eine zweite PCR (nested PCR) durchgeführt, bei der 1 μl

des ersten PCR-Produkts (25 ng • μl-1) als Template diente. Pro Probe wurde diese

PCR in einem Dreifachansatz (Zusammensetzung der Reaktionslösung Tabelle 2.10)

durchgeführt. Es wurde zusätzlich eine Negativkontrolle mit autoklaviertem Aqua

dest. angesetzt. Der reverse Primer (Tabelle 2.9) phosphorylierte im Zuge der PCR

den 5’-Strang in Vorbereitung des enzymatischen Verdaus der dsDNA zur ssDNA.

Die Bedingungen für die nested PCR sind in Tabelle 2.11 zusammengefasst. Die drei

Reaktionslösungen einer Probe wurden im Anschluss an die PCR zusammengeführt

und entsprechend dem Ablauf der ersten PCR in einem 1%igen Agarosegel

kontrolliert.

2.5.6 Aufreinigung und photometrische Quantifizierung der nested PCR-

Produkte

Das gesamte Produkt der nested PCR einer Probe (150 μl) wurde unter Verwendung

des QIAquick PCR Purification Kits (Qiagen GmbH, D-40724 Hilden) nach dem

microcentrifuge protocol aufgereinigt. Nach Zugabe von 750 μl PB-Puffer (erfolgte in

zwei Schritten) wurden die Proben zentrifugiert und in 50 μl EB-Puffer eluiert. Die

anschließende photometrische Quantifizierung der aufgereinigten Proben erfolgte in

Einmal-Küvetten (UVette®, Eppendorf AG, D-22339 Hamburg). In Vorbereitung des

Einzelstrangverdaus wurden anhand der Ergebnisse der photometrischen

Bestimmung Verdünnungen der Proben hergestellt (38 ng • μl-1 in 26 μl = ca. 1000

ng DNA).

2.5.7 Einzelstrangverdau und Aufreinigung

Für den Einzelstrangverdau wurde den aufgereinigten und verdünnten Proben eine

λ-Exonuklease (Tabelle 8.2) zugesetzt. Die Zusammensetzung der Reaktionslösung


ist Tabelle 2.12 zu entnehmen. Während der Inkubationszeit von 45 min im

Wasserbad bei 37°C erfolgte der enzymatische Abbau des phosphorylierten

5‘-Strangs der dsDNA.

Tabelle 2.12: Ansatz der Reaktionslösung für den Einzelstrangverdau pro Probe

Reagenzien Volumen [μl]

autoklaviertes Aqua dest. 9,5

10x λ-Exonuklease-Puffer 4,0

λ-Exonuklease (5000 U • ml-1) 0,5

dsDNA 26

Gesamtvolumen 40

Die ssDNA wurde entsprechend dem microcentrifuge protocol unter Verwendung des

MinElute PCR Purification Kits (Quiagen GmbH, D-40724 Hilden) aufgereinigt.

Abschließend wurden die Proben 1 min bei Raumtemperatur inkubiert und in 10 μl

EB-Puffer eluiert.

2.5.8 Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Für die Elektrophorese der ssDNA wurden zwei 0,625%ige Polyacrylamid-Gele

(PAA-Gel; Tabelle 8.1) mit Hilfe von zwei Glasplatten und 0,75 mm Spacern

(Geldicke = 0,75 mm) hergestellt. Ein Gelsandwich setzte sich aus einer kleineren

Trägerplatte (20 cm • 20 cm), die mit Bind Silane Lösung (Tabelle 8.1) zur

Verbesserung der Gelhaftung beschichtet wurde, sowie einer größeren Platte

(20 cm • 22,4 cm) zusammen, die hingegen mit PlusOne Repel Silane Lösung

(Tabelle 8.1) beschichtet wurde, um ein leichtes Ablösen des Gels von der Platte zu

ermöglichen.

Beide Gelsandwichs wurden 2 h bis zur vollständigen Polymerisation der PAA-Gele

waagerecht gelagert. Anschließend wurden sie in das DCodeTM Universal Mutation

Detection System (Bio-Rad GmbH, D-80939 München) eingebaut.

7 μl der aufgereinigten ssDNA-Proben sowie 4 μl eines Speziesstandard (zur

Verfügung gestellt von Dr. M. Witzig; Universität Hohenheim) wurden mit 8 μl SSCP-


loading dye (Tabelle 8.1) versetzt und vor Verwendung für 2 min bei 95 °C

denaturiert. Bis zur Beladung des Gels wurden die Proben auf Eis gelagert. Der Tank

des DCodeTM Universal Mutation Detection Systems wurde mit TBE (Tris-Borat-

EDTA; Tabelle 8.1) als Laufpuffer gefüllt. Die Gelelektrophorese erfolgte bei 300 V

über 22,5 h bei einer Temperatur von 20°C.

2.5.9 Silbernitrat-Färbung

Im Anschluss an die Gelelektrophorese wurde eine Silbernitrat-Färbung der Gele zur

Sichtbarmachung und Fixierung der SSCP-Profile durchgeführt. Nach 22,5 h wurden

die PAA-Gele in 10%iger Essigsäure (Tabelle 8.1) für 30 min unter ständiger

Bewegung (Schüttler Typ 3017, GFL GmbH, D-30938 Burgwedel) inkubiert. Es

folgten drei Waschschritte mit Aqua dest. (je 5 min).

Die Färbung der PAA-Gele mit Silbernitrat-Lösung erfolgte für 30 min unter

Lichtausschluss auf dem Schüttler. Nach Abgießen der Färbelösung (Tabelle 8.1)

wurden die SSCP-Profile durch Zugabe von 600 ml einer Entwicklerlösung (Tabelle

8.1) sichtbar gemacht. Bei Erreichen der gewünschten Farbintensität wurden die

PAA-Gele 5 min in 10%iger Essigsäure fixiert. Nach Spülung mit Aqua dest. wurden

die PAA-Gele unter einem Abzug getrocknet.


2.6 Statistische Auswertung der SSCP-Profile

Die Analyse der SSCP-Profile wurde mit der GelCompar II Software (Applied Maths,

Sint-Martens-Latem, Belgium), der PERMANOVA Software (Permutational

multivariate analysis of variance; Version 1.6) (ANDERSON 2001; MCARDLE u.

ANDERSON 2001) sowie der PAST Software (Paleontological Statistics; Version 2.14)

(HAMMER et al. 2001) durchgeführt. Zunächst wurden die PAA-Gele zur

Digitalisierung der SSCP-Profile gescannt (ScanMaker i800, Mikrotek, D-47877

Willich). Mithilfe des rolling disk-Mechanismus wurde im nächsten Schritt der

Hintergrund der SSCP-Profile eliminiert. Die GelCompar II Software wurde dazu

genutzt, die einzelnen Spuren der PAA-Gele nach der Ähnlichkeit ihrer

Bandenmuster zu sortieren. Zu diesem Zweck wurde eine densitometrische Kurve

jeder Spur erstellt. Diese Kurven wurden anschließend unter Verwendung des

Pearson product-moment Korrelationskoeffizienten in einer Clusteranalyse

verglichen. Visualisiert wurden die Ergebnisse der Clusteranalyse in einem

Dendrogramm unter Anwendung des UPGMA (unweighted pair group method using

arithmetic averages).

Die den Dendrogrammen zugrunde liegenden Ähnlichkeitsmatrizes wurden

anschließend in Unähnlichkeitsmatrizes umgewandelt und mithilfe der PERMANOVA

Software analysiert. Unter Verwendung des Permutationstests wurden die Matrizes

auf einen Einfluss der Faktoren Trockenstress und CO2-Konzentration für die Proben

von V1 bzw. Tag und CO2-Konzentration für die Proben von V2 untersucht. Die

verschiedenen Parameter wurden mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit (p) von p≤0,05

als signifikant bezeichnet (* = p≤0,05; ** = p≤0,01; *** = p≤0,001).

Für V2 erfolgte eine graphische Darstellung der Unähnlichkeitsmatrizes in Form von

Entfernungen in einer zwei-dimensionalen nicht-metrischen multidimensionalen

Skalierung (n-m MDS) mithilfe der PAST Software unter Anwendung des Gower

Ähnlichkeitskoeffizienten. Der angegebene „Stress“ wurde bei Werten von <0,15 als

Maß für eine zutreffende Wiedergabe der ursprünglichen Daten durch die n-m MDS

angesehen (KRUSKAL 1964a, b; BOGUHN et al. 2010).

41

3 Ergebnisse

Um den Erfolg des FACE-Versuchs zu überprüfen, wurde das Pflanzenmaterial auf

seinen Gehalt an Rohnährstoffen untersucht (Kapitel 3.1). V1 wurde durchgeführt,

um die Fermentationsparameter der vier Maisvarianten sowie deren Einfluss auf die

Konzentration der Protozoa in der Fermenterflüssigkeit zu vergleichen (Kapitel 3.2).

In V2 wurden speziell die Veränderungen der Produktionsraten und der molaren

Anteile der SCFA während der Äquilibrierungsphase bei Einsatz der zwei

bewässerten Maisvarianten analysiert (Kapitel 3.3). Anhand der SSCP-Analyse

wurde der Einfluss der Maisvarianten auf die mikrobielle Gemeinschaft (Archaea und

Bacteria) zu Beginn und am Ende der Versuche mithilfe von Clusteranalysen und der

Darstellung in einer n-m MDS untersucht (Kapitel 3.4).

3.1 Pflanzenmaterial

3.1.1 Simulierung der Klimabedingungen

Während 95% der Versuchsdauer wurde mithilfe des FACE-Aufbaus eine [CO2] von

550 ppm ± 10% erreicht. Die durchschnittliche [CO2] im Bereich der Kontrollfelder lag

bei 378,5 ppm. Der obere 0,6 m Bodenhorizont wies in den bewässerten Versuchs-

feldern einen Bodenwassergehalt von über 50% des maximal pflanzenverfügbaren

Bodenwassers während der gesamten Versuchsdauer auf. Mithilfe der

Dachkonstruktion (ERBS et al. 2010) konnte eine um 50% geringere Wasserzufuhr in

den Trockenstressplots erreicht werden (MANDERSCHEID et al. 2012).

3.1.2 Analyse der Rohnährstoffzusammensetzung der vier Maisvarianten

Die Ergebnisse der Analysen der Rohnährstoffgehalte und der Zusammensetzung

der Faserfraktion der vier Maisvarianten sind in Tabelle 3.1 aufgelistet.

42 Ergebnisse

Alle Varianten zeigten identische Werte an TS sowie an oS und Ra. Während die

bewässerten Varianten A und B ähnliche Rp-Gehalte aufwiesen (48,8 g • kg-1 TS

und 50,4 g • kg-1 TS), ergab sich für Variante C (380 ppm CO2 + Trockenstress) der

höchste Wert. Der Rp-Gehalt von Variante D (550 ppm CO2 + Trockenstress) war mit

48,5 g Rp • kg-1 TS mit den Werten der bewässerten Varianten vergleichbar. Für

Variante B (550 ppm CO2) wurde der höchste Rfe-Gehalt ermittelt. Die

Trockenstressvarianten C und D zeigten höhere Anteile von Rfa, NDF und ADF im

Vergleich zu den bewässerten Varianten, bei denen sich wiederum höhere NfE-

Werte nachweisen ließen. Die mit 550 ppm CO2 behandelten Varianten wiesen

zudem höhere ADL-Gehalte verglichen mit den 380 ppm Varianten auf, wobei die

Trockenstressvarianten jeweils höhere Werte als die bewässerten Maisvarianten

zeigten.

Tabelle 3.1: Gehalte der Maisvarianten an Rohnährstoffen [g • kg-1

TS; TS in g • kg-1

uS]

Behandlung

Bewässert Trockenstress$

380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 550 ppm CO2

A B C D

TS# 354 352 397 400

oS 966 961 960 962

Ra 34,4 38,7 39,7 37,9

Rp 48,8 50,4 58,6 48,5

Rfe 26,6 31,9 17,6 20,8

Rfa 153 163 219 243

NfE 724 705 654 646

NDF 387 383 518 541

ADF 196 201 264 288

ADL 19,7 22,8 22,3 29,5

# Trockensubstanz der frischen Maispflanzen (R. Manderscheid, unveröffentlichte Daten)

$ 50% weniger verfügbares Wasser während der gesamten Versuchsperiode im Vergleich zu den bewässerten Varianten (MANDERSCHEID et al. 2012)

Ergebnisse 43

3.2 Ergebnisse des RUSITEC-Versuchs 1

3.2.1 pH-Werte

Die Messungen in den Fermenterflüssigkeiten ergaben für alle Varianten an allen

Tagen pH-Werte zwischen 6,6 und 6,9 (Abbildung 3.1). Die statistische Auswertung

ergab einen signifikanten Unterschied zwischen den pH-Werten der einzelnen

Bewässerungsvarianten (Tabelle 3.2). Bei Fermentation der Maispflanzen, die

Trockenstress ausgesetzt waren, ergaben sich höhere pH-Werte. An den Tagen 11

bis 13 stellten sich die Unterschiede zu den bewässerten Varianten als signifikant

heraus, welche in der Abbildung durch verschiedene Buchstaben dargestellt wurden.

Ein Einfluss der CO2-Varianten auf den pH-Wert konnte ebenso wie ein Zeiteffekt

ausgeschlossen werden.

Tabelle 3.2: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der pH-Werte (MW ± SEM; n=3; ** = p<0,01)

Intersubjekteffekt Signifikanz Zeit ns Zeit • Trockenstress ns Zeit • [CO2] ns Zeit • Trockenstress • [CO2] ns

Zwischensubjekteffekte Trockenstress ** [CO2] ns Trockenstress • [CO2] ns

44 Ergebnisse

Ab

bild

un

g: 3

.1 V

erla

uf d

er p

H-W

erte

(MW

± S

EM

; n=

3) v

erg

leic

hen

d fü

r die

vie

r Ma

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aria

nte

n

a

-c: V

ers

ch

ied

en

e B

uch

sta

ben

ste

llen

sig

nifik

an

te U

nte

rsch

ied

e (p

<0,0

5) d

ar

Ergebnisse 45

3.2.2 Redoxpotentiale

Die Redoxpotentiale aller Ansätze zeigten keinen Einfluss des Substrats, allerdings

einen Zeiteffekt (Tabelle 3.3). Während die Redoxpotentiale 24 h nach

Versuchsbeginn durchschnittlich für alle Varianten bei -250 mV lagen, erreichten die

Werte an Tag 4 ca. -150 mV. Bis Versuchsende bewegten sich die Redoxpotentiale

für alle Behandlungen in einem Bereich zwsichen -150 und -102 mV (Abbildung 3.2).

Tabelle 3.3: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Redoxpotentiale (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001)

Intersubjekteffekt Signifikanz Zeit *** Zeit • Trockenstress ns Zeit • [CO2] ns Zeit • Trockenstress • [CO2] ns

Zwischensubjekteffekte Trockenstress ns [CO2] ns Trockenstress • [CO2] ns

46 Ergebnisse

Ab

bild

un

g 3

.2: V

erla

uf d

er R

ed

oxp

ote

ntia

le (M

W ±

SE

M; n

=3) v

erg

leic

hen

d fü

r die

vie

r Mais

va

rian

ten

Ergebnisse 47

3.2.3 Produktionsraten der SCFA und deren molare Anteile

3.1.3.1 Produktionsraten der gesamten SCFA

Während der Fermentation der Maisvarianten wurden pro Tag 27-40 mmol SCFA

produziert (Abbildung 3.3). Es ergaben sich weder zwischen den Substraten noch

zwischen den Versuchstagen signifikante Unterschiede (Tabelle 3.4).

7 8 9 10 11 12 13 140

10

20

30

40

50

A = 380 ppm CO2

B = 550 ppm CO2

C = 380 ppm CO2 + Trockenstress

D = 550 ppm CO2 + Trockenstress

Tage

SC

FA

-Pro

du

ktio

nsra

ten

[mm

ol

Tag

-1]

Abbildung 3.3: Verlauf der SCFA-Produktionsraten [mmol • Tag-1


Tabelle 3.4: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Produktionsraten der SCFA (MW ± SEM; n=3)



48 Ergebnisse

3.1.3.2 Produktionsraten der einzelnen SCFA

Die tägliche Acetat-Produktion belief sich an Tag 7 auf 14-18 mmol (Abbildung

3.4a). Im Verlauf des Versuchs sanken die Produktionsraten kontinuierlich ab und

lagen an Tag 14 zwischen 12 und 15 mmol • Tag-1. Dieser Zeiteffekt erwies sich als

statistisch signifikant (Tabelle 3.5). Derartige Veränderungen waren für alle

Maisvarianten im gleichen Maß zu beobachten.

Die Propionat-Produktionsraten lagen zwischen 9 und 15 mmol • Tag-1 (Abbildung

3.4b). Die statistische Analyse der Daten zeigte keinen Zeiteffekt (Tabelle 3.5). Auch

die Maisvarianten hatten keinen Einfluss auf die Propionat-Produktion.

Die Butyrat-Produktion erreichte an Tag 7 Raten von 5,6-6,1 mmol pro Tag

(Abbildung 3.4c). Im Verlauf des Versuchs sanken die täglichen Produktionsraten

signifikant ab und beliefen sich an Tag 14 auf Werte zwischen 4,7 und 6,0 mmol

Butyrat • Tag-1 (Tabelle 3.5). Ein Einfluss des Substrats konnte nicht ermittelt

werden.

Die tägliche Isovalerat-Produktion zeigte ebenfalls eine signifikante

Zeitabhängigkeit über die Versuchsdauer (Tabelle 3.5). Während an Tag 7 0,4-0,5

mmol Isovalerat in 24 h produziert wurden, zeigten sich an Tag 14 Raten von

0,5-0,7 mmol • Tag-1 (Abbildung 3.4d). Auch für die Produktion von Isovalerat konnte

ein Einfluss der Maisvarianten ausgeschlossen werden.

Tabelle 3.5: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Produktionsraten der einzelnen SCFA (MW ± SEM; n=3; * = p<0,05; *** = p<0,001)

Acetat Propionat Butyrat Isovalerat

Intersubjekteffekt Signifikanz

Zeit *** ns * *

Zeit • Trockenstress ns ns ns ns

Zeit • [CO2] ns ns ns ns

Zeit • Trockenstress • [CO2] ns ns ns ns

Zwischensubjekteffekte

Trockenstress ns ns ns ns

[CO2] ns ns ns ns

Trockenstress • [CO2] ns ns ns ns

Ergebnisse 49

A

bb

ild

un

g 3

.4:

Ve

rla

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der

Pro

du

kti

on

sra

ten

vo

n A

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vale

rat

(d)

in m

mo

l •

Tag

-1 (

MW

±

S

EM

; n

=3)

verg

leic

hen

d f

ür

die

vie

r M

ais

vari

an

ten

50 Ergebnisse

3.1.3.3 Molare Anteile der einzelnen SCFA

Die molaren Anteile des Acetats an der SCFA-Gesamtproduktion betrugen an Tag

7 46-47% (Abbildung 3.5a). Die molaren Acetat-Anteile sanken über die

Versuchsdauer für alle Maisvarianten signifikant ab (Tabelle 3.6). An Tag 14 ergaben

die Messungen Acetat-Anteile von 43-44%. Ein signifikanter Einfluss der Substrate

konnte nicht festgestellt werden.

Die molaren Propionat-Anteile an der totalen SCFA-Produktion lagen an Tag 7 bei

34-35%. Die Anteile stiegen bei allen Maisvarianten bis zu Tag 14 signifikant auf

37-38% (Abbildung 3.5b). Es war kein Behandlungseffekt zu ermitteln (Tabelle 3.6).

Die molaren Anteile des Butyrats an der SCFA-Gesamtproduktion reichten von

13-22% (Abbildung 3.5c). Es konnte weder ein Einfluss der Maisvarianten noch ein

Zeiteffekt festgestellt werden (Tabelle 3.6).

Die molaren Isovalerat-Anteile an der gesamten SCFA-Produktion zeigten an Tag

7 Werte von 1,2-1,3% (Abbildung 3.5d). Im Verlauf des Versuchs stiegen die Werte

für Isovalerat an. An Tag 14 wurden Anteile von 1,9-2,1% erreicht. Neben dem

signifikanten Zeiteffekt konnte kein Einfluss der Maisvarianten bestimmt werden

(Tabelle 3.6).

Tabelle 3.6: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der molaren Anteile der einzelnen SCFA (MW ± SEM; n=3; ** = p<0,01; *** = p<0,001)

Acetat Propionat Butyrat Isovalerat


Zeit *** *** ns **

Zeit • Trockenstress ns ns ns ns

Zeit • [CO2] ns ns ns ns

Zeit • Trockenstress • [CO2] ns ns ns ns


Trockenstress ns ns ns ns

[CO2] ns ns ns ns

Trockenstress • [CO2] ns ns ns ns

Ergebnisse 51

A

bb

ild

un

g 3

.5:

Ve

rlau

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er

mo

lare

n A

nte

ile v

on

Aceta

t (a

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at

(b),

Bu

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) u

nd

Iso

vale

rat

(d)

in P

rozen

t d

er

Ge

sam

t-

pro

du

kti

on

(M

W ±

SE

M;

n=

3)

verg

leic

hen

d f

ür

die

vie

r M

ais

vari

an

ten

52 Ergebnisse

3.1.3.4 Verhältnisse von Acetat zu Propionat

Für die Acetat:Propionat-Verhältnisse ergaben sich an Tag 7 Werte von 1,3-1,4:1

(Abbildung 3.6). Bis Tag 14 sanken für alle Maisvarianten die Verhältnisse von

Acetat zu Propionat auf Werte von 1,1-1,2:1 ab. Der signifikante Zeiteffekt trat

parallel zu einer Interaktion der Zeit und der Trockenstressbehandlung auf (Tabelle

3.7). So zeigten die beiden Trockenstressvarianten (C und D) von Tag 7 bis Tag 11

geringere, ab Tag 12 höhere Acetat:Propionat-Verhältnisse im Vergleich zu den

bewässerten Varianten (A und B). Ein Einfluss der CO2-Behandlung auf das

Acetat:Propionat-Verhältnis konnte ausgeschlossen werden.

7 8 9 10 11 12 13 140.0

0.5

1.0

1.5

2.0

A = 380 ppm CO2

B = 550 ppm CO2



Tage

Aceta

t:P

rop

ion

at-

Verh

ältn

isse [

x:1

]

Abbildung 3.6: Verlauf der Acetat:Propionat-Verhältnisse (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten

Tabelle 3.7: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Acetat:Propionat-Verhältnisse (MW ± SEM; n=3; ** = p<0,01; *** = p<0,001)

Intersubjekteffekt Signifikanz Zeit *** Zeit • Trockenstress ** Zeit • [CO2] ns Zeit • Trockenstress • [CO2] ns


Ergebnisse 53

3.2.4 Produktionsraten und Konzentrationen der Fermentationsgase

3.1.4.1 Produktionsraten der Fermentationsgase

Die Produktion der Fermentationsgase schwankte zwischen 217 und 412 ml • Tag-1

(Abbildung 3.7). Es konnte weder ein Einfluss der Maisvarianten noch ein Zeiteffekt

ermittelt werden (Tabelle 3.8).

7 8 9 10 11 12 13 140

100

200

300

400

500

A = 380 ppm CO2

B = 550 ppm CO2



Tage

Pro

du

ktio

nsra

ten

der

Ferm

en

tatio

nsg

ase

[ml

Tag

-1]

Abbildung 3.7: Verlauf der Produktion der Fermentationsgase insgesamt [ml • Tag-1


Tabelle 3.8: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Produktionsraten der Fermentationsgase (MW ± SEM; n=3)



54 Ergebnisse

3.1.4.2 Anteile von CO2 und CH4 an der Fermentationsgasproduktion

Der CO2-Anteil an der gesamten Fermentationsgasproduktion belief sich an

Tag 7 auf 75-80% und stieg bis zu Tag 14 signifikant auf Werte von 77-82% an

(Abbildung 3.8a). Die Maisvarianten hatten keinerlei Einfluss auf die CO2-Anteile an

der Gasproduktion (Tabelle 3.9).

Der CH4-Anteil am produzierten Fermentationsgasgemisch lag an Tag 7 bei

20-25% und sank signifikant auf 18-23% an Tag 14 ab (Abbildung 3.8b). Es konnte

ebenfalls kein Einfluss der Substrate auf den CH4-Anteil der Gasproduktion ermittelt

werden (Tabelle 3.9).

Tabelle 3.9: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der CO2- und CH4-Anteile am produzierten Fermentationsgasgemisch (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001)

CO2 CH4


Zeit *** ***

Zeit • Trockenstress ns ns

Zeit • [CO2] ns ns

Zeit • Trockenstress • [CO2] ns ns


Trockenstress ns ns

[CO2] ns ns

Trockenstress • [CO2] ns ns

Ergebnisse 55

7 8 9 10 11 12 13 140

20

40

60

80

100

Tage

CO

2-A

nte

ile [

%]

7 8 9 10 11 12 13 140

20

40

60

80

100

Tage

CH

4-A

nte

ile [

%]

a

b

Abbildung 3.8: Verlauf der Anteile von CO2 (a) und CH4 (b) an der Fermentationsgas-produktion [%] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten

56 Ergebnisse

3.2.5 NH3-N-Konzentrationen

Die NH3-N-Konzentrationen lagen an Tag 7 zwischen 3,8 (B) und 4,7 mmol • l-1 (C)

(Abbildung 3.9). Für alle Maisvarianten sanken die Werte bis zu Tag 14 auf 3,1-4,0

mmol • l-1 ab. Die statistische Analyse ergab sowohl Effekte der

Zwischensubjektfaktoren Trockenstress und CO2-Konzentration als auch einen

Zeiteffekt (Tabelle 3.10). So lagen die NH3-N-Konzentrationen der

Trockenstressvarianten (C und D) bei jeder Messung signifikant über denen der

bewässerten Varianten (A und B). Hingegen zeigten die 380 ppm CO2 Varianten (A

und C) höhere Werte im Vergleich zu den 550 ppm CO2 Varianten (B und D).

7 8 9 10 11 12 13 140

1

2

3

4

5

6

A = 380 ppm CO2

B = 550 ppm CO2



aab

cac

a

b

a

b

a

b

a ab

c ac

aab

c acb

a

b

a

b

cac

a

b

c

a

Tage

NH

3-N

-Ko

nzen

trati

on

en

[mm

ol

l-1]

Abbildung 3.9: Verlauf der NH3-N-Konzentrationen [mmol • l-1

] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten a-c: Verschiedene Buchstaben stellen signifikante Unterschiede (p<0,05) dar

Tabelle 3.10: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der NH3-N-Konzentrationen (MW ± SEM; n=3; * = p<0,05; *** = p<0,001)


Zwischensubjekteffekte Trockenstress *** [CO2] * Trockenstress • [CO2] ns

Ergebnisse 57

3.2.6 Verdaulichkeiten der organischen Substanz

Die Verdaulichkeiten der oS lagen zwischen 39% und 52% (Abbildung 3.10). Die

Varianzanalyse ergab einen signifikanten Einfluss der Trockenstressbehandlung

(Tabelle 3.11). Anhand des Fisher-LSD-Tests konnte an Tag 13 ein signifikanter

Unterschied zwischen Variante B zu den anderen Substraten ermittelt werden. An

Tag 14 ergaben sich für Variante B signifikant höhere Verdaulichkeiten als für

Variante D.

7 8 9 10 11 12 13 140

10

20

30

40

50

60

A = 380 ppm CO2

B = 550 ppm CO2



ab

a ab

a

Tage

Verd

au

lich

keiten

der

org

an

isch

en

Su

bsta

nz [

%]

Abbildung 3.10: Verlauf der Verdaulichkeiten der organischen Substanz [%] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die vier Maisvarianten a-b: Verschiedene Buchstaben zeigen signifikante Unterschiede (p<0,05) an

Tabelle 3.11: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Verdaulichkeiten der organischen Substanz (MW ± SEM; n=3; * = p<0,05)


Zwischensubjekteffekte Trockenstress * [CO2] ns Trockenstress • [CO2] ns

58 Ergebnisse

3.2.7 Anzahl der Protozoa

Die Anzahl der Protozoa belief sich in der Nativprobe auf durchschnittlich 169 • 103

pro ml Pansensaft (Abbildung 3.11). Bereits an Tag 1 war die Protozoa-Zahl auf

45-58 • 103 pro ml Fermenterinhalt gesunken. Die Auszählung der Proben von Tag 7

ergab Protozoa-Konzentrationen von 8-11 • 103 pro ml flüssiger Fermenterphase. An

Tag 14 waren 7-14 • 103 Protozoa pro ml Fermenterinhalt nachzuweisen. Die drei-

faktorielle Varianzanalyse ergab einen signifikanten Zeiteffekt, während ein Einfluss

der Substrate auf die Anzahl der Protozoa nicht festzustellen war (Tabelle 3.12).

Abbildung 3.11: Anzahl der Protozoa [103 • ml

-1] an Tag 1, Tag 7 und Tag 14 verglichen mit

der Nativprobe (MW ± SEM; n=3) für die vier Maisvarianten

Tabelle 3.12: Ergebnisse der drei-faktoriellen Varianzanalyse der Anzahl der Protozoa (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001)



Ergebnisse 59

3.3 Ergebnisse des RUSITEC-Versuchs 2

3.3.1 pH-Werte

Die Messung in der Fermenterflüssigkeit ergab während der Äquilibrierungsphase

pH-Werte zwischen 6,7 und 6,8 (Abbildung 3.12). Weder ein Einfluss der CO2-

Konzentration als Zwischensubjektfaktor noch ein Zeiteffekt konnten ermittelt werden

(Tabelle 3.13).

1 2 3 4 5 6 70

16.6

6.7

6.8

6.9

B = 550 ppm CO2A = 380 ppm CO2

Tage

pH

-Wert

e

Abbildung 3.12: Verlauf der pH-Werte (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die zwei Maisvarianten

Tabelle 3.13: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der pH-Werte (MW ± SEM; n=3) während der Äquilibrierungsphase

Intersubjekteffekt Signifikanz Zeit ns Zeit • [CO2] ns

Zwischensubjekteffekte [CO2] ns

60 Ergebnisse


Die Redoxpotentiale zeigten für beide Varianten einen parallelen Verlauf, ähnlich

dem in V1 (Abbildung 3.2). An Tag 1 wurden Werte zwischen -184 und -176 mV

gemessen (Abbildung 3.13). Die Redoxpotentiale wurden im Verlauf der ersten drei

Tage kontinuierlich weniger negativ und wiesen ab Tag 4 bis zu Tag 7 Werte von

-120 bis -100 mV auf. Die statistische Analyse ergab einen signifikanten Zeiteffekt

(Tabelle 3.14). Ein Einfluss der Maisvarianten konnte ausgeschlossen werden.

1 2 3 4 5 6 7

-200

-150

-100

-50

0

A = 380 ppm CO2 B = 550 ppm CO2

Tage

Red

oxp

ote

ntiale

[m

V]

Abbildung 3.13: Verlauf der Redoxpotentiale [mV] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die zwei Maisvarianten

Tabelle 3.14: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der Redoxpotentiale (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001) während der Äquilibrierungsphase

Intersubjekteffekt Signifikanz Zeit *** Zeit • [CO2] ns


Ergebnisse 61

3.3.3 Produktionsraten der SCFA und deren molare Anteile

3.2.3.1 Produktionsraten der gesamten SCFA

Die Produktion der SCFA belief sich an Tag 1 für die Kontrollvariante A auf

48 mmol • Tag-1 und für Variante B auf 51 mmol • Tag-1. Die Produktionsraten beider

Varianten sanken kontinuierlich ab und lagen ab Tag 4 bei 31-35 mmol • Tag-1

(Abbildung 3.14). Die statistische Auswertung ergab einen signifikanten Zeiteffekt

sowie einen Einfluss der CO2-Behandlung (Tabelle 3.15). Variante B zeigte außer an

Tag 2 im Mittel höhere Produktionsraten im Vergleich zu Variante A mit signifikanten

Unterschieden an den Tagen 4 und 5.

1 2 3 4 5 6 70

10

20

30

40

50

60


ab

a b

Tage

SC

FA

-Pro

du

ktio

nsra

ten

[mm

ol T

ag

-1]

Abbildung 3.14: Verlauf der Produktionsraten der SCFA [mmol • Tag-1

] (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die zwei Maisvarianten

a-b: Verschiedene Buchstaben stehen für signifikante Unterschiede (p<0,05)

Tabelle 3.15: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der SCFA-Produktionsraten (MW ± SEM; n=3; * = p<0,05; *** = p<0,001) während der Äquilibrierungsphase


Zwischensubjekteffekte [CO2] *

62 Ergebnisse

3.2.3.2 Produktionsraten der einzelnen SCFA

Die Acetat-Produktion betrug an Tag 1 für Variante A 32 mmol • Tag-1, für Variante

B 34 mmol • Tag-1 (Abbildung 3.15a). Die Produktionsraten sanken ab und zeigten

ab Tag 4 Werte um 13-15 mmol • Tag-1. Die statistische Analyse ergab sowohl einen

signifikanten Zeiteffekt als auch an den Tagen 4 und 5 eine Tendenz ((*) = p<0,1) zu

höheren Produktionsraten von Acetat für Variante B gegenüber Variante A (Tabelle

3.16).

Die Produktion von Propionat belief sich an Tag 1 für Variante A auf

10,7 mmol • Tag-1 und für Variante B auf 11,4 mmol • Tag-1 (Abbildung 3.15b). Die

Produktionsraten stiegen im Verlauf des Versuchs signifikant an und wiesen Werte

ab Tag 4 von 11,9-13,9 mmol • Tag-1 auf. Neben dem Zeiteffekt konnte kein Einfluss

des Substrats auf die Propionat-Produktion festgestellt werden (Tabelle 3.16).

Die Butyrat-Produktion lag für beide Varianten über die gesamte Versuchsdauer

bei Werten um 5,3-6,3 mmol • Tag-1 (Abbildung 3.15c). Bei der statistischen Analyse

konnte kein Einfluss der untersuchten Faktoren auf die Butyrat-Produktionsraten

ermittelt werden (Tabelle 3.16).

Tabelle 3.16: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der Produktionsraten der einzelnen SCFA (MW ± SEM; n=3; * = p<0,05; *** = p<0,001) während der Äquilibrierungsphase

Acetat Propionat Butyrat


Zeit *** *** ns

Zeit • [CO2] ns ns ns


[CO2] (*) ns ns

Ergebnisse 63

1 2 3 4 5 6 70

10

20

30

40

(*)

a

(*)

Tage

Aceta

t-

Pro

du

ktio

nsra

ten

[mm

ol

Tag

-1]

1 2 3 4 5 6 70

5

10

15

20

b

Tage

Pro

pio

nat-

Pro

du

ktio

nsra

ten

[mm

ol

Tag

-1]

1 2 3 4 5 6 70

2

4

6

8

10

c

Tage

Bu

tyra

t-

Pro

du

ktio

nsra

ten

[mm

ol T

ag

-1]

Abbildung 3.15: Verlauf der Produktionen von Acetat (a), Propionat (b) und Butyrat (c) in mmol • Tag

-1 (MW ± SEM; n=3; (*) = p<0,1) vergleichend für die zwei

Maisvarianten

64 Ergebnisse

3.2.3.3 Molare Anteile der einzelnen SCFA

Die molaren Anteile des Acetats an der gesamten SCFA-Produktion betrugen an

Tag 1 67% (Abbildung 3.16a). Im Laufe der folgenden zwei Tage sanken die Acetat-

Anteile ab und erreichten ab Tag 4 Werte von 41-43%. Die statistische Analyse

ergab keinen Einfluss der Maisvarianten, wohingegen sich ein signifikanter Zeiteffekt

ermitteln ließ (Tabelle 3.17).

Die molaren Propionat-Anteile an der produzierten SCFA-Menge beliefen sich an

Tag 1 auf 22% (Abbildung 3.16b). Der Prozentsatz von Propionat stieg im weiteren

Verlauf signifikant an und betrug ab Tag 4 38-40% (Tabelle 3.17). Es konnte kein

Einfluss der Maisvarianten festgestellt werden.

Die molaren Anteile des Butyrats an der SCFA-Produktion zeigten für beide

Varianten an Tag 1 Werte von 11% (Abbildung 3.16c). Im Verlauf der

Äquilibrierungsphase stiegen die Butyrat-Anteile auf Werte zwischen 18% und 19%

an. Auch bei den molaren Anteilen von Butyrat konnte ein Zeiteffekt ohne Einfluss

der Maisvarianten festgestellt werden (Tabelle 3.17).

Tabelle 3.17: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der molaren Anteile der einzelnen SCFA (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001) während der Äquilibrierungs-phase

Acetat Propionat Butyrat


Zeit *** *** ***

Zeit • [CO2] ns ns ns


[CO2] ns ns ns

Ergebnisse 65

1 2 3 4 5 6 70

20

40

60

80

a

Tage

Mo

lare

Aceta

t-

An

teile

[%

]

1 2 3 4 5 6 70

10

20

30

40

50

b

Tage

Mo

lare

Pro

pio

nat-

An

teile

[%

]

1 2 3 4 5 6 70

5

10

15

20

25

c

Tage

Mo

lare

Bu

tyra

t-

An

teile

[%

]

Abbildung 3.16:

Verlauf der molaren Anteile von Acetat (a), Propionat (b) und Butyrat (c) in Prozent an der Gesamtproduktion (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die zwei Maisvarianten

66 Ergebnisse

3.2.3.4 Verhältnisse von Acetat zu Propionat

An Tag 1 der Äquilibrierungsphase ergaben sich Acetat:Propionat-Verhältnisse um

3,0:1 (Abbildung 3.17). Im Laufe der nächsten drei Tage sanken die Verhältnisse für

beide Maisvarianten auf 1,0-1,1:1 ab. Die statistische Analyse ergab einen

signifikanten Zeiteffekt (Tabelle 3.18). Zwischen den Maisvarianten mit dem

Zwischensubjektfaktor CO2-Konzentration konnte kein signifikanter Unterschied

festgestellt werden.

1 2 3 4 5 6 70.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5


Tage

Aceta

t:P

rop

ion

at-

Verh

ältn

isse [

x:1

]

Abbildung 3.17: Verlauf der Acetat:Propionat-Verhältnisse (MW ± SEM; n=3) vergleichend für die zwei Maisvarianten

Tabelle 3.18: Ergebnisse der zwei-faktoriellen Varianzanalyse der Verhältnisse von Acetat zu Propionat (MW ± SEM; n=3; *** = p<0,001) während der Äquilibrierungsphase



Ergebnisse 67

3.4 Darstellung und Analyse der SSCP-Profile

In diesem Kapitel werden die erstellten SSCP-Profile mit den Ergebnissen der

Clusteranalyse vorgestellt, um mögliche Behandlungseffekte auf die mikrobielle

Diversität nachzuweisen. Für die SSCP-Profile der Proben aus V2 werden zusätzlich

zwei-dimensionale n-m MDS dargestellt, um die Ähnlichkeiten der Proben

weiterführend beurteilen zu können.

3.4.1 SSCP-Profile und Clusteranalysen zu V1

3.3.1.1 Bacteria-Fraktion an Entnahmetag 1

Die Clusteranalyse des SSCP-Profils der Bacteria-Domäne von Entnahmetag 1

zeigte Ähnlichkeiten von 84,0-96,6% zwischen den verschiedenen Spuren

(Abbildung 3.18). Es kam zu keiner den Behandlungen entsprechenden

Gruppenbildung. Die Permutationsanalyse der Unähnlichkeitsmatrix ergab keine

signifikanten Unterschiede (Tabelle 3.19).

68 Ergebnisse

Abbildung 3.18: Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des ersten Versuchstags von V1 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse

A = 380 ppm CO2 C = 380 ppm CO2 + Trockenstress

B = 550 ppm CO2 D = 550 ppm CO2 + Trockenstress

Tabelle 3.19: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des ersten Versuchstags von V1

Signifikanz

Trockenstress ns

[CO2] ns

Trockenstress • [CO2] ns

Ergebnisse 69

3.3.1.2 Archaea-Fraktion an Entnahmetag 1

Die Clusteranalyse des SSCP-Profils der Archaea-Fraktion von Tag 1 zeigte

Ähnlichkeiten von 85,0-99,4% zwischen den Spuren (Abbildung 3.19). Es ergab sich

eine Gruppenbildung, wobei die obere Gruppe vier Spuren von Trockenstress-

varianten (C und D) mit Ähnlichkeiten von 92,6-99,2% umfasst. Das untere Cluster

schließt alle übrigen Spuren mit Ähnlichkeiten von 97,4-99,4% ein. Die statistische

Auswertung zeigte keinen Einfluss der Maisvarianten auf die Profile (Tabelle 3.20).

Abbildung 3.19: Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des ersten Versuchstags von V1 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse



Tabelle 3.20: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des ersten Versuchstags von V1

Signifikanz

Trockenstress ns

[CO2] ns


70 Ergebnisse

3.3.1.3 Bacteria-Fraktion an Entnahmetag 14

Das SSCP-Profil der Bacteria-Domäne der Proben von Entnahmetag 14 zeigte in der

Clusteranalyse eine Anordnung der Spuren in zwei Gruppen mit einer Ähnlichkeit

von 53,2% (Abbildung 3.20). Sowohl im oberen als auch im unteren Cluster wurden

Spuren aller Maisvarianten mit einer Ähnlichkeit von 63,9-97,1% bzw. 76,1-90,9%

zusammengefasst. Mit der Permutationsvarianzanalyse konnte kein Einfluss der

Behandlungen auf die SSCP-Profile festgestellt werden (Tabelle 3.21).

Abbildung 3.20: Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des 14. Versuchstags von V1 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse



Tabelle 3.21: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des 14. Versuchstags von V1

Signifikanz

Trockenstress ns

[CO2] ns


Ergebnisse 71

3.3.1.4 Archaea-Fraktion an Entnahmetag 14

Das SSCP-Profil der Archaea-Domäne von Entnahmetag 14 zeigte in der

Clusteranalyse eine Gruppenbildung (Abbildung 3.21) mit einer Ähnlichkeit der

beiden Cluster von 82,3%. Die untere Gruppe umfasste vier Spuren der

Trockenstressvarianten (C und D) mit Ähnlichkeiten von 96,8-98,6%. Die übrigen

Spuren wurden in einem oberen Cluster zusammengefasst, die sich zu 86,5-96,8%

ähnelten. Auch hier ergab die statistische Permutationsanalyse keine signifikanten

Effekte der Maisvarianten (Tabelle 3.22).

Abbildung 3.21: Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des 14. Versuchstags von V1 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse



Tabelle 3.22: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit des 14. Versuchstags von V1

Signifikanz

Trockenstress ns

[CO2] ns


72 Ergebnisse

3.4.2 SSCP-Profile und Clusteranalysen zu V2

3.3.2.1 Vergleich der Bacteria-Fraktionen an den Entnahmetagen 1 und 7

Die SSCP-Profile der Bacteria-Domäne aus Proben vom Anfang und Ende der

Äquilibrierungsphase zeigten in der Clusteranalyse eine deutliche Gruppenbildung

entsprechend der Tage der Probenentnahme (Abbildung 3.22). Beide Cluster wiesen

eine Ähnlichkeit von 51,7% auf. Für die Gruppe der Spuren von Probenentnahmetag

7 (oben) ergaben sich in der Clusteranalyse Ähnlichkeiten von 82,6-95,2%. Das

Cluster mit den Spuren der Entnahmetag-1-Proben zeigte Ähnlichkeiten von 92,0-

96,8%. Trotz dieser deutlichen Sortierung der Spuren nach Probenentnahme ergab

die Permutationsanalyse keinen signifikanten Zeiteffekt (Tabelle 3.23). Die

Maisvariante hatte ebenfalls keinen Einfluss auf die Ähnlichkeit der Spuren-Profile.

Ergebnisse 73

Abbildung 3.22: Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit der Tage 1 und 7 von V2 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse

A1 = 380 ppm CO2; Entnahmetag 1 A7 = 380 ppm CO2; Entnahmetag 7

B1 = 550 ppm CO2; Entnahmetag 1 B7 = 550 ppm CO2; Entnahmetag 7

Tabelle 3.23: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Bacteria-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit der Tage 1 und 7 von V2

Signifikanz

Entnahmetag ns

[CO2] ns

Entnahmetag • [CO2] ns

74 Ergebnisse

3.3.2.2 Vergleich der Archaea -Fraktionen an den Entnahmetagen 1 und 7

Die SSCP-Profile der Archaea-Domäne der Proben der Entnahmetage 1 und 7

ergaben in der Clusteranalyse zwei Gruppen mit einer Ähnlichkeit von 74,3%

(Abbildung 3.24). Das obere Cluster umfasste alle Spuren der Proben des siebten

Tags mit Ähnlichkeiten von 86,1-98,8% unabhängig von der Maisvariante. Die untere

Gruppe bezog alle Spuren der Proben des ersten Versuchstags ein mit Ähnlichkeiten

von 90,0-99,0%. Die Permutationsanalyse ergab keinen Hinweis auf einen Einfluss

der Probeentnahmetage oder der Maisvariante auf die SSCP-Profile (Tabelle 3.24).

Abbildung 3.23: Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit der Tage 1 und 7 von V2 mit Dendrogramm als Ergebnis der Clusteranalyse

A1 = 380 ppm CO2; Entnahmetag 1 A7 = 380 ppm CO2; Entnahmetag 7

B1 = 550 ppm CO2; Entnahmetag 1 B7 = 550 ppm CO2; Entnahmetag 7

Tabelle 3.24: Ergebnisse der multivarianten Permutationsvarianzanalyse mit den Faktoren Trockenstress und [CO2] für das Archaea-Profil der Proben der Fermenterflüssigkeit der Tage 1 und 7 von V2

Signifikanz

Entnahmetag ns

[CO2] ns

Entnahmetag • [CO2] ns

Ergebnisse 75

3.3.2.3 Zwei-dimensionale n-m MDS der SSCP-Profile von V2

Zur Abklärung der Befunde der Clusteranalysen wurden die Unähnlichkeiten der

Spuren-Profile der Proben aus V2 in einer zwei-dimensionalen n-m MDS als

Abstände abgebildet.

In der Skalierung des SSCP-Profils der Bacteria-Domäne wiesen die Varianten von

Entnahmetag 1 eine Gruppierung mittig auf der linken Seite des Rasters auf

(Abbildung 3.24a). Die Proben von Entnahmetag 7 lagen weitläufig verteilt auf der

rechten Rasterseite.

In der Skalierung des SSCP-Profils der Archaea-Domäne lagen die Proben von

Entnahmetag 1 verstreut auf der linken Seite des Rasters (Abbildung 3.24b). Die

Proben von Entnahmetag 7 traten ebenfalls verstreut auf, allerdings auf der rechten

Rasterseite. Auch in dieser Skala war eine deutliche räumliche Trennung der

Varianten von Entnahmetag 1 zu den Varianten von Entnahmetag 7 festzustellen.

76 Ergebnisse

Abbildung 3.24: Zwei-dimensionale nicht-metrische multidimensionale Skalierung (n-m MDS) der Abweichungsmatrizes der Clusteranalysen des Bacteria- (a) und Archaea-Profils (b) jeweils vergleichend für die Versuchstage 1 und 7

77

4 Diskussion

4.1 FACE-Methode und Pflanzenmaterial

Mithilfe der FACE-Methode in Kombination mit der Dachkonstruktion nach ERBS et al.

(2010) ist es MANDERSCHEID et al. (2012) gelungen, eine erhöhte [CO2] und

Trockenstress als abiotische Stressoren im Feldversuch für die angebauten

Maispflanzen zu simulieren. In den Versuchsabschnitten mit CO2-Behandlung konnte

in 95% der Versuchsdauer die Ziel-[CO2] von 550 ppm aufrechterhalten werden. Die

Trockenstressbehandlung war ebenfalls erfolgreich. So standen den Maispflanzen in

den Trockenstressabschnitten der Versuchsfelder verglichen mit den bewässerten

Pflanzen über die Versuchsdauer eine um 50% geringere Wassermenge zur

Verfügung (MANDERSCHEID et al. 2012).

Die Analyse der Maispflanzen auf deren Gehalt an Rohnährstoffen zeigte deutliche

Unterschiede zwischen den bewässerten und den Trockenstressvarianten

unabhängig von der CO2-Behandlung. Die Trockenstressbehandlung führte zu

höheren Trockensubstanz (TS)-Gehalten in der ursprünglichen Substanz (uS;

Tabelle 3.1). Im Gegensatz dazu war der Gesamtertrag an TS der bewässerten

Varianten größer (MANDERSCHEID et al. 2012). In ihrer Studie zur Untersuchung der

physiologischen Antwort von Maispflanzen auf Trockenstress konnten EFEOǦLU et al.

(2009) signifikant geringere TS- und uS-Erträge bei Maispflanzen mit

Trockenstressbehandlung im Vergleich zur bewässerten Kontrolle feststellen.

Infolge der Behandlung mit 550 ppm CO2 unabhängig vom Bewässerungsstatus

konnten MANDERSCHEID et al. (2012) keine Steigerung des TS-Ertrags feststellen

(Tabelle 3.1). Dies deckt sich mit Ergebnissen anderer FACE-Studien, bei denen

eine alleinige Erhöhung der [CO2] ebenfalls keinen Einfluss auf den Ertrag von

Maispflanzen hatte (LEAKEY et al. 2006; MARKELZ et al. 2011).

78 Diskussion

Hingegen führte die Trockenstressbehandlung zu einem signifikant reduzierten

Kornertrag. Die Strohernte wurde im Gegensatz dazu nicht beeinflusst

(MANDERSCHEID et al. 2012). Während der Phase der Kornfüllung hemmt

Trockenstress die Translokation der Assimilate (organische N- und

Kohlenhydratverbindungen) in den Kolben (NESMITH u. RITCHIE 1992). Zusätzlich

sinkt die Photosyntheserate (GHANNOUM 2009; LEAKEY et al. 2009). Die Analyse der

Kohlenhydratfraktion der Maispflanzen spiegelt dies wider. Während die bewässerten

Maisvarianten höhere Gehalte an stickstoff-freien Extraktionsstoffen (NfE) aufwiesen,

zeigten beide Maisvarianten mit Trockenstress höhere Anteile an Rohfaser (Rfa) und

Detergentien-Fasern (NDF und ADF) an der TS (Tabelle 3.1).

Mit der Trockenstressbehandlung wurde im FACE-Versuch von MANDERSCHEID et al.

(2012) begonnen, nachdem die Anthese der Pflanzen abgeschlossen war, das heißt,

nachdem alle Blätter ausgebildet worden waren. Mit Erreichen dieses Stadiums ist

die Stickstoff (N)-Assimilation der Pflanzen nahezu abgeschlossen (MEßNER 2000). In

der Folge werden die gebildeten organischen N-Verbindungen während der Phase

der Kornfüllung remobilisiert und in den Kolben umgelagert. Im Gegensatz dazu

hängt die Kohlenhydrateinlagerung in den Kolben von der während der

Kornfüllungsphase aktuellen Photosyntheseleistung ab (MEßNER 2000). Der hohe

Rohprotein (Rp)-Gehalt der Maisvariante C verglichen mit den Werten der anderen

Varianten könnte sich dadurch erklären lassen. Infolge von Trockenstress sinkt nicht

nur die Photosyntheserate, sondern auch die Masse der zur Translokation zur

Verfügung stehenden organischen Kohlenhydratverbindungen. Die Verfügbarkeit

organischer N-Verbindungen ist hingegen nicht eingeschränkt. So steigt der

Rp-Gehalt im Kolben an. Da sich mit zunehmender Kornfüllung der Massenanteil des

Kolbens an der Gesamt-TS der Pflanze ebenfalls erhöht (CONE et al. 2008), wird der

Rp-Anteil an der TS insgesamt gesteigert.

Durch die zusätzliche CO2-Behandlung wurde dieser Trockenstresseffekt

abgeschwächt, was sich mit Ergebnissen vergleichbarer Studien deckt (LEAKEY et al.

2004; LEAKEY et al. 2009).

Diskussion 79

Eine Übersicht der Wechselwirkungen zwischen einer erhöhten [CO2] und

Trockenstress auf C4-Pflanzen ist in Abbildung 4.1 dargestellt.

Abbildung 4.1: Zusammenfassung der Aus- und Wechselwirkungen von Trockenstress und erhöhter [CO2] auf C4-Pflanzen. Die durchgezogenen Pfeile kennzeichnen direkte Folgen, gestrichelte Pfeile zeigen hemmende Prozesse an. Abgewandelt nach LEAKEY (2009).

LWC Leaf water content; Wassergehalt der Blätter

SWC Soil water content; Wassergehalt des Bodens

Eine erhöhte [CO2] führt zu einem größeren CO2-Partialdruck in den Mesophyllzellen.

Dieser Effekt wirkt den Folgen von Trockenstress wie abnehmender

Photosyntheserate durch sinkenden CO2-Partialdruck in den Mesophyllzellen als

Folge abnehmender stomatärer Leitfähigkeit entgegen. Eine weitere Wirkung der

[CO2]-Erhöhung ergibt sich aus der sinkenden stomatären Leitfähigkeit, die zu einer

geringeren Transpirationsrate und zu einem höheren Wassergehalt des Bodens

(soil water content; SWC) führt. Der höhere CO2-Partialdruck in den Mesophyllzellen

und der größere SWC bewirken, dass die Auswirkungen von Trockenstress wie

sinkende Photosyntheseraten und Abnahme der Blattfläche später und/oder

schwächer ausfallen (GHANNOUM 2009; LEAKEY 2009).

Das könnte auch für Maisvariante D gelten. Infolge der Trockenstressbehandlung

hätte der prozentuale Rp-Gehalt an der TS größer sein müssen verglichen mit den

Rp-Gehalten der bewässerten Varianten A und B. Dieser Trockenstresseffekt wurde

80 Diskussion

allerdings durch die zusätzliche Erhöhung der [CO2] und der dadurch resultierenden

gesteigerten Photosyntheserate und besonders durch den größeren SWC

abgemildert. So liegt der Rp-Gehalt von Variante D im Bereich der bewässerten

Varianten, bei denen sich kein Einfluss der [CO2] auf die Rp-Gehalte der Pflanzen

ergab. In einem Kooperationsprojekt wurden Maispflanzen der gleichen Ernte des

Versuchs von MANDERSCHEID et al. (2012) siliert. Die Analyse der

Rohnährstoffzusammensetzung der Maispflanzensilagen zeigte im Vergleich der

Varianten untereinander entsprechende Ergebnisse analog zu den Daten der

vorliegenden Arbeit (MEYER et al. 2009).

Schlussfolgernd ist zu erwarten, dass Maispflanzen sowie deren Silagen als Folge

von steigender [CO2] und Trockenstress höhere Anteile von Rp sowie NDF und ADF

bei niedrigeren NfE-Gehalten aufweisen werden.

Diskussion 81

4.2 Beurteilung der RUSITEC-Versuche

Auf Basis der in Kapitel 3 dargelegten Ergebnisse werden im folgenden Kapitel der

Einsatz der Rumen-Simulationstechnik als In-vitro-Untersuchungsmethode bewertet

und die erzielten Ergebnisse mit Daten aus der Literatur verglichen.

4.2.1 pH-Werte

Die gemessenen pH-Werte in den RUSITEC-Versuchen 1 und 2 (V1 und V2) lagen

zwischen 6,6 und 6,9. Die Werte blieben sowohl während der Äquilibrierungsphase

(V1: Abbildung 3.1 Tage 1-6; V2: Abbildung 3.12) als auch im Laufe der

Versuchsphase (V1; Abbildung 3.1 Tage 7-14) konstant. Diese Konstanz der Werte,

welche durch den Einsatz des artifiziellen Speichels mit hoher Pufferkapazität

(MCDOUGALL 1948) sichergestellt wurde, ist ein Hinweis auf beständige Verhältnisse

im System.

Für physiologische pH-Werte im Pansen wurde ein Rahmen von 6 bis 7 angegeben

(CZERKAWSKI 1986). Bei anderen RUSITEC-Versuchen wurden vergleichbare

pH-Werte von 6,8-7,0 bzw. von 6,4-6,9 erzielt (OEZTUERK et al. 2005; MARTINEZ et al.

2010a). In einem Fütterungsversuch an Rindern mit einem hohen Anteil von

Maissilage in der Ration wurden pH-Werte zwischen 6,8 und 6,9 gemessen (RICHTER

et al. 2010). Somit können die Bedingungen in den Fermentern während V1 und V2

bezogen auf die pH-Werte als physiologisch und stabil angesehen werden.


Nach Redoxpotentialen von -250 mV (V1) bzw. -180 mV (V2) am Inokulationstag

ergaben die Messungen nach vier bis fünf Tagen weniger negative Werte zwischen

-150 und -115 mV. Bis Versuchsende blieben die Werte in diesem Bereich

(Abbildungen 3.2 und 3.13). Die Veränderungen während der Äquilibrierungsphase

82 Diskussion

(V1 Tage 1-6 und V2) lassen sich durch Anpassung des Systems an

In-vitro-Bedingungen und an das neue Substrat erklären (CZERKAWSKI u.

BRECKENRIDGE 1977; CZERKAWSKI 1986; PREVOT et al. 1994). Zwar wurden die

Redoxpotentiale im Vergleich zu Versuchsbeginn positiver, lagen aber stets im

negativen Bereich, was für stabile anaerobe Verhältnisse im Fermenter spricht.

MAROUNEK et al. (1991) gaben einen physiologischen Rahmen für das Redoxpotential

im Pansen von -250 mV bis -100 mV an. In der Literatur sind allerdings auch

negativere Redoxpotentiale (-270 mV und -350 mV) als MW angegeben (HUNGATE

1960; RICHTER et al. 2010).

KOCH (2008) stellte in einem RUSITEC-Versuch mit Maissilage als Substrat Werte

und Verläufe der Redoxpotentiale fest, die mit den Ergebnissen der vorliegenden

Studie vergleichbar sind. Zusätzlich führte KOCH (2008) Messungen des

Redoxpotentials in der Pansenflüssigkeit der fistulierten Spendertiere durch, wobei

ähnliche Werte und Verläufe erreicht wurden. Die Redoxpotentiale in der

Fermenterflüssigkeit wurden daraufhin als im physiologischen Bereich liegend

eingeordnet (KOCH 2008). Da auch für die Versuche der vorliegenden Arbeit

Panseninhalt von fistulierten Rindern zur Inokulation verwendet wurde, können auch

die ermittelten Redoxpotentiale als physiologisch bewertet werden.

4.2.3 Produktionsraten und molare Anteile der SCFA

Im Verlauf von V1 (nach abgeschlossener Äquilibrierung) wurden konstante

Produktionsraten der kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) von 28-36 mmol • Tag-1

gemessen (Abbildung 3.3). Im Gegensatz dazu zeigte sich in V2 eine deutliche

Abnahme der SCFA-Gesamtproduktion von 48-51 auf 32-35 mmol • Tag-1 innerhalb

der ersten vier bis fünf Tage der Äquilibrierungsphase (Abbildung 3.14). Diese

Veränderungen wurden besonders durch die Halbierung der Acetatproduktion

(Abbildung 3.15a) hervorgerufen, woraufhin auch der molare Acetat-Anteil von 67%

auf 42% absank (Abbildung 3.16a). Hingegen wurde der molare Anteil von Propionat

größer (Abbildung 3.16b). Das führte zu einem Absinken des Acetat:Propionat-

Diskussion 83

Verhältnisses von 3,0:1 auf 1,1-1,0:1 innerhalb der ersten vier bis fünf Tage (3.17).

Auch nach abgeschlossener Äquilibrierung fiel in V1 der molare Acetat-Anteil bei

steigenden Propionat-Anteilen ab (Abbildungen 3.5a und b), sodass das

Acetat:Propionat-Verhältnis von 1,3-1,4:1 an Tag 7 stetig bis auf Werte von 1,1-1,2:1

an Tag 14 absank.

HILDEBRAND et al. (2010) untersuchte Fermentationsparameter von Maissilage mithilfe

der RUSITEC-Methode. Die Bestimmung der Produktionsrate der SCFA, des

molaren Acetat-Anteils und des Acetat:Propionat-Verhältnisses ergab Werte von

36,2 mmol • Tag-1, 41,9% bzw. 1,1:1. Damit sind die von HILDEBRAND et al. (2010)

bestimmten SCFA-Muster nahezu identisch mit den Ergebnissen der vorliegenden

Arbeit. In Fütterungsversuchen mit Schafen (PHILLIPSON 1952) und Rindern (EUSEBIO

et al. 1959) mit Einsatz reiner Maiskorn-Rationen (Maisflocken bzw. Maismehl)

ergaben sich mit 51-63% bzw. 44-45% molaren Acetat-Anteilen sowie mit

Acetat:Propionat-Verhältnissen von 1,2-1,7:1 bzw. 1,1-1,2:1 ebenfalls zu den Daten

der vorliegenden Studie vergleichbare Ergebnisse. Weitere In-vivo-Studien zeigten

den negativen Einfluss erhöhter Maisanteile an der Ration auf die molaren Acetat-

Anteile und Acetat:Propionat-Verhältnisse (FENNER et al. 1970; DE VISSER et al. 1998;

RYMER u. GIVENS 2002).

Neben dem Einfluss des Substrats zeigen Vergleichsstudien zwischen In-vivo- und

In-vitro-Ansätzen zusätzliche Effekte des RUSITEC-Systems auf die SCFA-

Produktion und die molare Verteilung der SCFA. Bei der Fermentation im RUSITEC-

Aufbau sind niedrigere Acetat:Propionat-Verhältnisse durch gesteigerte

Propionatproduktion sowie höhere molare Anteile von Propionat, Butyrat und

Isovalerat typisch (PREVOT et al. 1994; MARTINEZ et al. 2010a).

Die Veränderung des Fermentationsmusters der SCFA in dieser Studie scheint

daher durch eine Kombination aus substratspezifischen Anpassungsreaktionen und

einem Einfluss der In-vitro-Methode hervorgerufen zu werden.

84 Diskussion

4.2.4 Fermentationsgase

Das Verhältnis der bei der ruminalen Fermentation produzierten Gase an der

Gesamtproduktion ist abhängig vom inkubierten Substrat und der Zusammensetzung

der mikrobiellen Population (HUNGATE 1960; VAN NEVEL u. DEMEYER 1996).

Grundsätzlich besteht in der Gasblase im oberen Pansensack das

Fermentationsgasgemisch zu 30% aus CH4 und zu 70% aus CO2 (HUNGATE 1960).

Ergebnisse der Gasproduktion aus In-vitro-Studien sind aufgrund unterschiedlicher

In- und Output-Mengen des Substrats sowie abweichender Volumina der

Fermentationskammern nicht uneingeschränkt mit Resultaten von In-vivo-Versuchen

vergleichbar (CARRO et al. 2009; MARTINEZ et al. 2010b).

In In-vitro-Studien wurden Produktionsraten der Fermentationsgase von 300 ml bis

über 1500 ml pro Tag angegeben (CZERKAWSKI u. BRECKENRIDGE 1977; CARRO u.

MILLER 1999; KLEVENHUSEN et al. 2009; HILDEBRAND et al. 2010). Diese große

Variation kommt wiederum durch den Einsatz verschiedener Substrate und die

Einstellung unterschiedlicher Pufferdurchflussraten zustande. Die in V1 ermittelten

Produktionsraten der Fermentationsgase von 217-412 ml pro Tag (Abbildung 3.7)

und CH4-Anteile zwischen 17,9% und 25,7% (Abbildung 3.8b) liegen damit im

unteren Bereich der in der Literatur angegebenen Grenzen.

Der geringe CH4-Anteil könnte durch die Maisfütterung hervorgerufen worden sein.

Auch im Batch-Versuch konnte eine maiskornbasierte Fütterung und damit eine

stärkereiche Versorgung eine sinkende CH4-Produktion bei gesteigerter CO2- und

Propionatproduktion bewirken (CALLAWAY u. MARTIN 1996).

Die Anzahl der Protozoa im Medium hat ebenfalls Einfluss auf die Methanproduktion.

Die Protozoa setzen im Zuge ihres Stoffwechsels Protonen frei. Die verfügbaren

Protonen werden von anderen Mikroorganismen (z.B. Archaea) genutzt, um CH4 zu

bilden (HUNGATE 1966). Geht die Zahl der Protozoa durch den Zusatz protozoa-

hemmender Stoffe (z.B. Monensin), höheren Rohfett (Rfe)-Gehalten in der Ration

oder aufgrund von In-vitro-Bedingungen zurück, sinkt ebenfalls die CH4-Produktion

(VAN NEVEL u. DEMEYER 1996; DOHME et al. 2000; KLEVENHUSEN et al. 2009; GARCIA-

Diskussion 85

GONZALEZ et al. 2010). Zusätzlich reagieren Archaea empfindlich auf gering negative

Redoxpotentiale (HUNGATE 1966). Die im Laufe der Äquilibrierungsphase (V1:

Abbildung 3.2 Tage 1-6; V2: Abbildung 3.13) weniger negativen Redoxpotentiale

könnten daher zu niedrigeren CH4-Anteilen an der Fermentationsgasproduktion

geführt haben.

Nichtsdestotrotz kann die Gasproduktion abschließend in Bezug auf Höhe und

Zusammensetzung als physiologisch und für die Fütterung typisch bewertet werden.


Ammoniak (NH3) ist ein zentraler Metabolit des ruminalen N-Stoffwechsels

(PISULEWSKI 1981; LENG u. NOLAN 1984). Der sogenannte NH3-Pool wird gespeist

durch den mikrobiellen Abbau der zur Verfügung stehenden N-Quellen (Abbildung

4.2). Das sind erstens der im Futter enthaltene Rp-Gehalt, zweitens endogene N-

Verbindungen, die dem Pansen über den Speichel und dem Fermenter über den

Puffer zugeführt werden, und drittens mikrobielles Protein. Verringert wird der NH3-

Pool durch die Nutzung von NH3 als Baustein der mikrobiellen Proteinsynthese

(STERN u. HOOVER 1979; HOOVER u. STOKES 1991) und unter In-vivo-Bedingungen

auch durch die NH3-Resporption über die Pansenwand.

Abbildung 4.2: Der NH3-Pool in der Fermenterflüssigkeit wird gebildet durch mikrobielle Auf- (rechts) und Abbauprozesse von N-Verbindungen (links).

In vivo können für dieses Gleichgewicht zwischen Ab- und Aufbau Werte zwischen

5 und 45 mmol • l-1 erreicht werden (HUNGATE 1966). Zusätzlich abhängig ist die zu

86 Diskussion

erreichende NH3-N-Konzentration von der zur Verfügung stehenden Energie und

dem Kohlenhydratgehalt des Substrats (TILLMAN 1969; CARRO u. MILLER 1999;

BOGUHN et al. 2006).

Bei der Fermentation der Maisvarianten ergaben sich NH3-N-Konzentrationen

zwischen 3,0 und 4,7 mmol • l-1 (Abbildung 3.9). Die Untersuchungen von Proben

aus anderen RUSITEC-Versuchen mit Maissilage als alleinigem Substrat zeigten

NH3-N-Konzentrationen von 5,4-5,8 mmol • l-1 (HILDEBRAND et al. 2010; JALČ et al.

2010). Damit liegen die in diesen Versuchen erzielten Werte in einem vergleichbaren

Bereich.


Die Verdaulichkeit der organischen Substanz (oS) der Maisvarianten betrug bei

Inkubation von 48 h im Fermenter zwischen 39% und 52% (Abbildung 3.10). Zwar

haben unter anderem die Maissorte und der Erntezeitpunkt der Maispflanzen sowie

die Zusammensetzung der Kohlenhydratfraktion und der Rfe-Gehalt einen Einfluss

auf die Verdaulichkeit des Substrats (CYMBALUK et al. 1973; DANLEY u. VETTER 1973;

JENKINS u. FOTOUHI 1990; AKBAR et al. 2002), doch wurden in verschiedenen

RUSITEC-Versuchen vergleichbare Werte erzielt. So ergaben sich bei Fermentation

von Maisstroh und -körnern bzw. Maissilage Verdaulichkeiten der oS von 53,5%

(KLEVENHUSEN et al. 2009) bzw. 39-41% (HILDEBRAND et al. 2010). In

Fütterungsversuchen, bei denen Rinder mit Rationen mit hohem Maisanteil versorgt

wurden, wurden ruminale Verdaulichkeiten der oS von 42-56% festgestellt

(PLASCENCIA u. ZINN 1996; OWENS et al. 2009). Damit sind die in diesen Versuchen

ermittelten Verdaulichkeiten der oS in Übereinstimmung mit Werten anderer In-vitro-

Untersuchungen und In-vivo-Studien bei Einsatz vergleichbarer Substrate.

Diskussion 87


Die Zahl der Protozoa nahm mit der Dauer des Versuchs ab. Von durchschnittlich

168 • 103 Protozoa pro ml Pansenflüssigkeit in der Nativprobe sanken die Protozoa-

Konzentrationen zunächst auf 45-58 • 103 pro ml Fermenterflüssigkeit an Tag 1 ab

und blieben bis zum Versuchsende konstant bei Werten von 7-14 • 103 Protozoa pro

ml Fermenterflüssigkeit (Abbildung 3.11).

In vivo wurden abhängig von der verfütterten Ration Protozoa-Konzentrationen von

100-900 • 103 pro ml Panseninhalt nachgewiesen (HUNGATE 1960; HUNGATE et al.

1964; MICHALOWSKI 1975; DEHORITY 1984; MICHALOWSKI et al. 1986). So liegt der

Nativwert dieser Studie im erwarteten Bereich (Abbildung 3.11 Nativ).

Die Beobachtung abnehmender Protozoa-Konzentrationen in In-vitro-

Versuchsansätzen wurde vielfach wiederholt (SLYTER et al. 1964; SLYTER u. PUTNAM

1967; CZERKAWSKI u. BRECKENRIDGE 1977; CRAWFORD et al. 1980; PREVOT et al.

1994; CARRO et al. 1995; MANSFIELD et al. 1995; RYMER u. GIVENS 2002;

KLEVENHUSEN et al. 2009; MOUMEN et al. 2009; MARTINEZ et al. 2010b). Trotzdem

wurden die Schwierigkeiten bei der Etablierung hoher Protozoa-Zahlen in In-vitro-

Ansätzen bis heute nicht gelöst. Mögliche Gründe für die abnehmenden Protozoa-

Konzentrationen im RUSITEC wären zum einen längere Reproduktionszeiten der

Protozoa im Verhältnis zu Retentionszeiten der Partikel im Fermenter (CZERKAWSKI u.

BRECKENRIDGE 1977; CRAWFORD et al. 1980). Zum anderen könnten zu engmaschige

Nylonbeutel ein mechanisches Hindernis für die Protozoa darstellen, um die Partikel

zu erreichen (CARRO et al. 1995).

Wie auch von SLYTER u. PUTNAM (1967) beschrieben, verblieben die Protozoa-

Konzentrationen in der vorliegenden Studie nach einer Anpassungsphase bis

Versuchsende kontinuierlich auf einem niedrigen Niveau. Dieser steady state spricht

für konstante Bedingungen im System.

88 Diskussion

4.2.8 Abschließende Beurteilung der RUSITEC-Versuche

Die RUSITEC-Methode wurde ursprünglich entwickelt, um Prozesse der ruminalen

Fermentation in kontrollierten Bedingungen unabhängig von Futteraufnahme,

Speichelproduktion und individueller mikrobieller Gemeinschaft eines Wirtstiers

simulieren und untersuchen zu können (CZERKAWSKI u. BRECKENRIDGE 1977). Die

Rumen-Simulationstechnik wurde in mehreren Arbeitsgruppen erfolgreich etabliert

und für die Untersuchung des Einflusses verschiedener Substrate oder einzelner

Substanzen auf die Fermentation und die mikrobielle Population eingesetzt (CARRO

u. MILLER 1999; DOHME et al. 2000; BOGUHN et al. 2008; MARTINEZ et al. 2010a;

MARTINEZ et al. 2010b). Die erfolgreiche Simulation der ruminalen Bedingungen ist

die Voraussetzung der Beurteilung der Fermentationsmuster unterschiedlicher

Substrate.

Die in der vorliegenden Studie erhobenen Fermentationsparameter wiesen nach

Anpassung während der Äquilibrierungsphase konstante Werte auf, die sowohl im

physiologischen Rahmen lagen als auch mit anderen In-vitro-Versuchen vergleichbar

waren. Auf der Grundlage der erfolgreichen Simulation der ruminalen Fermentation

kann die Interpretation der Einflüsse der Klimabehandlung der Maispflanzen auf die

Fermentationsparameter und die mikrobielle Gemeinschaft erfolgen.

Diskussion 89

4.3 Effekte der Klimaveränderungen

In diesem Kapitel werden die Auswirkungen der Klimabehandlung auf die

Untersuchungsparameter der RUSITEC-Versuche beurteilt.

4.3.1 pH-Werte

In V1 ergab die Messung der pH-Werte in der Fermenterflüssigkeit an den Tagen 11

bis 13 signifikant höhere Werte bei Inkubation der beiden Maisvarianten mit

Trockenstressbehandlung verglichen mit den Werten der bewässerten Varianten

(Abbildung 3.1). Weder in V1 noch in V2 konnte ein Einfluss der CO2-Behandlung der

inkubierten Maispflanzen auf den pH-Wert in der Fermenterflüssigkeit festgestellt

werden (Abbildungen 3.1 und 3.12).

Der pH-Wert der Pansenflüssigkeit wird unter anderem bestimmt durch die

Zusammensetzung des aufgenommenen Substrats, dessen Beschaffenheit und der

Speichelproduktion des Wirtstiers, die wiederum mit der Rumination

zusammenhängt. Die Partikelgröße des Substrats hat wiederum einen Einfluss auf

die Futteraufnahme und die Rumination (JASTER u. MURPHY 1983; KRAUSE u. COMBS

2003). Mit abnehmender Ruminationsrate sinkt auch die Speichelproduktion. Der

Speichel des Wiederkäuers fungiert als Puffer für die während des mikrobiellen

Abbaus produzierten SCFA (CZERKAWSKI u. BRECKENRIDGE 1977). Wird die

Pansenflüssigkeit durch herabgesetzte Ruminationsrate mit zu wenig Puffer versorgt,

sinkt der pH-Wert (MAEKAWA et al. 2002; BEAUCHEMIN et al. 2008; DEVRIES et al.

2009). Darüber hinaus führen Futtermittel mit einem hohen Anteil leicht abbaubarer

Kohlenhydrate durch deren rasche Fermentation zu SCFA zu einer Abnahme des

pH-Wertes (BALCH u. ROWLAND 1957; SUTTON 1977; ALDRICH et al. 1993).

Ein Vorteil der RUSITEC-Methode ist es, dass sowohl die Substratzufuhr, die

Substratpartikelgröße als auch die Pufferzufuhr für alle Fermenter gleich sowie über

die Versuchsdauer kontrolliert und konstant eingesetzt werden können. Somit

90 Diskussion

können diese Faktoren als Varianzquelle für signifikant unterschiedliche pH-Werte

ausgeschlossen werden. So bleiben die Zusammensetzung des Substrats und die

Konzentrationen der Fermentationsprodukte als mögliche Gründe für die

Abweichungen.

Der Gehalt leicht verdaulicher Kohlenhydrate der Maisvarianten wurde in Form der

NfE-Fraktion bestimmt. Beide Trockenstressvarianten zeigten bei der Analyse

niedrigere NfE-Gehalte im Vergleich zu den bewässerten Varianten (Tabelle 3.1).

Allerdings ergab sich in V1 weder ein signifikanter Effekt der Maisvarianten auf die

Produktionsraten der SCFA noch auf die Verteilung der molaren Anteile

(Abbildungen 3.3 bis 3.5). Damit können die signifikanten Abweichungen der pH-

Werte nicht auf diese Faktoren zurückgeführt werden. Die höheren pH-Werte der

Fermenterflüssigkeit bei Inkubation der Trockenstressvarianten könnten allerdings

durch Unterschiede in der NH3-N-Konzentration hervorgerufen worden sein, da die

Inkubation der Trockenstressvarianten der Maispflanzen zu höheren

NH3-N-Konzentrationen in der Überlaufflüssigkeit im Vergleich zu den bewässerten

Varianten führte (Abbildung 3.9; siehe Kapitel 4.3.5).

Insgesamt lagen die pH-Werte aller Fermenter in einem Bereich zwischen 6,6 und

6,9 mit geringen Abweichungen und blieben darüber hinaus über die gesamte

Versuchsdauer in einem physiologischen Bereich.


Es konnte kein Einfluss der Behandlungen der Maispflanzen auf die Redoxpotentiale

in der Fermenterflüssigkeit bei Inkubation der verschiedenen Maisvarianten

festgestellt werden (Tabellen 3.3 und 3.14). Die Werte aller Maisvarianten

veränderten sich im Zuge der Anpassung an das neue Substrat und die In-vitro-

Bedingungen über die Versuchsdauer in gleicher Weise (Abbildungen 3.2 und 3.13).

Diskussion 91

4.3.3 Produktionsraten und molare Anteile der SCFA

In V1 konnten keine signifikanten Einflüsse der Maisvarianten auf die

Produktionsraten und die molare Verteilung der SCFA festgestellt werden

(Abbildungen 3.3 bis 3.5). In Bezug auf das Acetat:Propionat-Verhältnis zeigte sich

lediglich eine Interaktion der Versuchsdauer und der Trockenstressbehandlung

(Tabelle 3.7). In V2 ergab die Messung der SCFA-Produktion an den Tagen 4 und 5

der Äquilibrierungsphase signifikant höhere Werte bei Inkubation der 550 ppm

CO2-Variante (Abbildung 3.14). An diesen Tagen konnte ebenfalls eine tendenziell

höhere Acetat-Produktion dieser Variante ermittelt werden (Abbildung 3.15a). Weder

die Propionat- und Butyratproduktion noch die molaren Anteile der SCFA zeigten

signifikante oder tendenzielle Unterschiede bei Inkubation der beiden CO2-Varianten

während der Äquilibrierungsphase (Abbildungen 3.15 b und c, 3.16).

Die Produktionsraten und die molaren Anteile der SCFA im Pansen und im

Fermenter sind abhängig von der Futteraufnahme und der Verweildauer der

Substratpartikel in der Gärkammer (CRAWFORD et al. 1980; CZERKAWSKI 1986;

BERGMAN 1990). Durch die Anwendung der RUSITEC-Methode kann sowohl die

Menge als auch die Verweildauer des Substrats überprüft und gesteuert werden.

Einen großen Einfluss üben auch die Rohnährstoffgehalte des Substrats aus

(CZERKAWSKI 1986; BERGMAN 1990). Setzt sich die Ration zu einem großen Anteil

aus leicht verdaulichen Nicht-Struktur-Kohlenhydraten (z.B. Stärke, Zucker und

Pektine) zusammen, so steigt die SCFA-Produktion (ALDRICH et al. 1993). Die

Analyse der Rohnährstoffzusammensetzung der für diese Studie verwendeten

Maispflanzen zeigte allerdings vergleichbare Konzentrationen von NfE, Rfa, NDF und

ADF der beiden in V2 fermentierten Varianten (Tabelle 3.1; A und B). Der NfE-Gehalt

der Variante B war sogar numerisch kleiner im Vergleich zu Variante A.

Ein signifikanter Unterschied bei Fermentation der CO2-Varianten ergab sich lediglich

während der Äquilibrierungsphase. Im Laufe dieser Anpassungsperiode adaptiert

sich die mikrobielle Pansenflora an das In-vitro-System. Es ist möglich, dass diese

Adaptation unterschiedlich effizient abgelaufen ist. Während der Versuchsphase und

damit nach Abschluss der Anpassung zeigte die CO2-Behandlung der Maispflanzen

92 Diskussion

keinen Einfluss auf die Produktionsraten der SCFA. Abschließend kann festgehalten

werden, dass eine erhöhte [CO2] und Trockenstress während des Aufwuchses von

Maisvarianten deren Fermentation bezogen auf die Produktionsraten und molaren

Anteile der SCFA nicht dauerhaft beeinflusst haben.

4.3.4 Fermentationsgase

Die Fermentation der vier Maisvarianten führte weder zu signifikanten Unterschieden

in der totalen Gasproduktion noch in den Anteilen von CO2 und CH4 an der

Gesamtproduktion (Abbildungen 3.7 und 3.8). Wie bereits für die Produktionsraten

der SCFA und deren molare Anteile während der Versuchsphase konnte kein

Einfluss einer erhöhten [CO2] oder Trockenstress festgestellt werden (Tabellen 3.8

und 3.9).


Die Messung der NH3-N-Konzentrationen in den Überläufen der Fermenter ergab

Werte von 3,8-4,7 mmol • l-1 (Abbildung 3.9). Die Inkubation der Maispflanzen mit

Trockenstressbehandlung führte zu signifikant höheren NH3-N-Konzentrationen im

Vergleich zur Fermentation der bewässerten Varianten. Zusätzlich zu dem Einfluss

der Bewässerung konnte ein Einfluss der CO2-Behandlung festgestellt werden. So

konnte in jeder Bewässerungsgruppe separat eine höhere NH3-N-Konzentration bei

Inkubation der 380 ppm CO2 Varianten gemessen werden (Tabelle 3.10).

Wie bereits erläutert, ergibt sich die NH3-N-Konzentration zum einen durch den

mikrobiellen Abbau von N-Verbindungen (endogen, diätetisch, mikrobiell) und zum

anderen durch die mikrobielle Proteinsynthese in der Fermenterflüssigkeit (Abbildung

4.2). Die Zufuhr von endogenen N-Verbindungen erfolgt im RUSITEC-Aufbau über

den Puffer und betrug für alle Behandlungen entsprechend 5 mmol NH4Cl • l-1 und

kann damit als Varianzquelle ausgeschlossen werden. Alle Fermenter wurden mit

der gleichen Substratmenge bezogen auf die TS versorgt. Allerdings zeigten die

Diskussion 93

inkubierten Maispflanzen Unterschiede in der Zusammensetzung der Rohnährstoffe

(Tabelle 3.1).

Aus In-vivo-Studien ist bekannt, dass die NH3-N-Konzentration in der

Pansenflüssigkeit besonders von der Menge des mit dem Futter aufgenommenen Rp

und dessen Abbaubarkeit abhängt (HUME et al. 1970; LENG u. NOLAN 1984). Für

Maisvariante C ergab sich der höchste Rp-Gehalt in der Messung der Rohnährstoffe

der Maispflanzen (Tabelle 3.1). Entsprechend erzielte die Fermentation dieser

Variante während der gesamten Versuchsdauer die höchste NH3-N-Konzentration

(Abbildung 3.9). Der Rp-Gehalt der Variante D war hingegen vergleichbar mit denen

der bewässerten Varianten A und B, obwohl sich bei Inkubation dieser Variante

ausgenommen an Tag 14 stets die zweithöchste NH3-N-Konzentration im Überlauf

ergab. Sowohl die Rp-Gehalte als auch die NH3-N-Konzentrationen der beiden

bewässerten Varianten waren vergleichbar, ausgenommen der Tage 13 und 14, an

denen Variante B eine signifikant geringere NH3-N-Konzentration zeigte

(Tabellen 3.1, 3.10 und Abbildung 3.9). Die signifikant abweichenden

NH3-N-Konzentrationen in den Überlaufflüssigkeiten können also nicht ausschließlich

mit unterschiedlichen Rp-Gehalten der fermentierten Maispflanzen erklärt werden.

Ein möglicher Faktor könnte die Abbaubarkeit des Rp der Maispflanzen gewesen

sein, die in der vorliegenden Arbeit allerdings nicht untersucht wurde. Es ist jedoch

ein negativer Zusammenhang zwischen dem Rfe-Gehalt im Substrat und der

Abbaubarrate der Proteinquellen aus Fütterungsversuchen mit Schafen und Rindern

bekannt (JENKINS u. FOTOUHI 1990; DOREAU et al. 1991). Auch in der vorliegenden

Arbeit zeigten die bewässerten Maisvarianten höhere Rfe-Gehalte in der TS und

erzielten bei Inkubation geringere NH3-N-Kozentrationen in der Überlaufflüssigkeit

verglichen mit den Trockenstressvarianten (Tabelle 3.1 und Abbildung 3.9). So

könnte eine höhere Abbaubarkeit der Rp der Trockenstressvarianten im Vergleich zu

den bewässerten Varianten angenommen werden.

Die mikrobielle Proteinsynthese als weiterer Einflussfaktor ist nicht nur vom Input an

N-Verbindungen abhängig, sondern auch von den zur Verfügung stehenden

Energiequellen (STERN u. HOOVER 1979; HOOVER u. STOKES 1991). Mithilfe einer

94 Diskussion

kontinuierlichen In-vitro-Methode ermittelten SATTER u. SLYTER (1974) für die

Inkubation maisbasierter Rationen eine maximale Effektivität der mikrobiellen

Proteinsynthese bei NH3-N-Konzentrationen zwischen 3 bis 5 mmol • l-1. In den

Versuchen zur vorliegenden Arbeit wurden dem System über den Puffer

kontinuierlich 5 mmol NH4Cl • l-1 zugeführt. Dass in allen Überlaufflüssigkeiten

NH3-N-Konzentrationen unter diesen 5 mmol • l-1 gemessen wurden, spricht für eine

genügende Energiezufuhr und zusätzlich für eine ausgeprägte mikrobielle

Proteinsynthese.

Die Abbaubarkeit der oS und der NDF sowie der Gehalt von leicht verdaulichen

Kohlenhydraten haben dementsprechend Einfluss auf die Effektivität der mikrobiellen

Proteinsynthese (STERN u. HOOVER 1979) und damit auf die NH3-N-Konzentration im

Überlauf. Über die mikrobielle Proteinsynthese und die Abbaubarkeit der

NDF-Fraktion liegen keine Werte vor. Die Verdaulichkeit der oS war allerdings

ausgenommen der Tage 7 und 8 größer für die bewässerten Varianten (Abbildung

3.10). Es ist möglich, dass durch eine größere Verdaulichkeit der oS der

bewässerten Varianten mehr Energie zur mikrobiellen Proteinsynthese zur

Verfügung stand. Das könnte zu einer gesteigerten mikrobiellen Proteinsynthese und

damit geringeren NH3-N-Kozentrationen in den Ansätzen der bewässerten Varianten

im Vergleich zur Inkubation der Trockenstressvarianten geführt haben.

Die Ursache der signifikant höheren NH3-N-Konzentrationen der Trockenstress-

sowie der 550 ppm CO2 Varianten konnte mit den zur Verfügung stehenden Daten

nicht abschließend geklärt werden.


Die Analyse der Verdaulichkeit der oS der vier Maispflanzen zeigte ausgenommen

an den Tagen 7 und 8 höhere Werte für die bewässerten im Vergleich zu den

Trockenstressvarianten (Abbildung 3.10). An Tag 12 war die Verdaulichkeit der

Variante B signifikant größer als die der anderen Varianten. Für Variante B konnte

auch an Tag 13 die höchste Verdaulichkeit festgestellt werden, die allerdings nur im

Diskussion 95

Vergleich zum Wert von Variante D signifikant größer war (Abbildung 3.10).

Insgesamt ergab die drei-faktorielle Varianzanalyse einen signifikanten Einfluss der

Trockenstressbehandlung auf die Verdaulichkeit der oS der Maispflanzen

(Tabelle 3.11).

In einem Kooperationsprojekt wurden die von MANDERSCHEID et al. (2012)

angebauten Maispflanzen siliert und auf die In-Sacco-Abbaubarkeit der TS

untersucht (MEYER et al. 2009). Die Silagen der bewässerten Varianten zeigten

signifikant höhere In-Sacco-Abbaubarkeiten der TS im Vergleich zu den Silagen der

Trockenstressvarianten (MEYER et al. 2009). Dieses Ergebnis konnte in einer

weiteren Studie zur In-vitro-Verdaulichkeit von Maissilage reproduziert werden

(SIMSEK et al. 2011). Im Gegensatz dazu hatte die CO2-Behandlung der

Maispflanzen keinen Einfluss auf die Verdaulichkeit der oS, was ebenfalls für

Sudangras, ein C4-Gras, gezeigt werden konnte (AKIN et al. 1994; MEYER et al.

2009).

Die Verdaulichkeit der oS eines Substrats wird bestimmt durch dessen

Zusammensetzung an Rohnährstoffen und Detergentien-Fasern sowie durch dessen

Beschaffenheit. So hat die Partikelgröße eines Futtermittels einen Einfluss auf die

Futteraufnahme, die Ruminationsrate und die Verweildauer der Partikel im Fermenter

(CAMPLING u. FREER 1962; JASTER u. MURPHY 1983; MARTZ u. BELYEA 1986). Da

diese Faktoren im RUSITEC-System kontrolliert und einheitlich simuliert wurden,

haben der Rohnährstoffgehalt und die Zusammensetzung der Faserfraktion des

inkubierten Substrats eine größere Bedeutung in Bezug auf die Verdaulichkeit der

oS.

Die bewässerten Maispflanzen wiesen einen höheren Anteil leicht verdaulicher

Kohlenhydrate (NfE) im Vergleich zu den Trockenstressvarianten auf (Tabelle 3.1).

Die höhere Verdaulichkeit der oS dieser Varianten könnte damit einhergehen

(Abbildung 3.10). Neben der Größe des NfE-Anteils an der TS könnte allerdings

auch eine unterschiedliche Abbaubarkeit der Faserfraktion (Rfa, NDF, ADF), welche

nicht gemessen wurde, signifikante Unterschiede hervorgerufen haben. Des

Weiteren besteht eine negative Korrelation zwischen dem Lignin-Gehalt eines

96 Diskussion

Substrats und dessen ruminaler Verdaulichkeit (CYMBALUK et al. 1973; IDSO u. IDSO

2001). Die Untersuchung der für diese Arbeit verwendeten Maispflanzen auf ihren

Gehalt an ADL ergab für Variante D den höchsten Wert, während die drei anderen

Varianten vergleichbare ADL-Gehalte aufwiesen. Die signifikant geringeren

Verdaulichkeiten der oS der Trockenstressvarianten können damit nicht allein auf die

ADL-Gehalte der inkubierten Maispflanzen zurückgeführt werden.

GHANNOUM (2009) beschrieb eine abnehmende ruminale Verdaulichkeit von

Pflanzenmaterial als Folge von Trockenstress und vorzeitiger Alterung. Der zugrunde

liegende Mechanismus ist noch nicht bestimmt worden. Im Vergleich zu den

bewässerten Pflanzen zeigten die Pflanzen in den Trockenstressbereichen im

Feldversuch eine verfrühte Alterung und gerollte Blätter (MANDERSCHEID et al. 2012).

In Kombination führten die Veränderungen der Maispflanzen, hervorgerufen durch

Trockenstress unabhängig von der CO2-Behandlung, die sowohl den Habitus der

Pflanzen als auch deren Zusammensetzung an Rohnährstoffen betraf, zu einer

Abnahme der Verdaulichkeit der oS.


Die Protozoa-Konzentration in der Fermenterflüssigkeit blieb nach der

Äquilibrierungsphase für alle Varianten konstant und zeigte keinen Einfluss der

Inkubation der mit CO2 und Trockenstress behandelten Maispflanzen (Abbildung

3.11 und Tabelle 3.12).

Diskussion 97

4.4 Beurteilung der Ergebnisse der SSCP-Analyse

Die SSCP-Analyse der Proben der Fermenterflüssigkeit wurde durchgeführt, um den

Einfluss der inkubierten Maisvarianten auf die mikrobielle Gemeinschaft zu

untersuchen. Die verwendeten Maispflanzen zeigten als Folge der Behandlung mit

erhöhter [CO2] und Trockenstress unterschiedliche Gehalte an Rohnährstoffen und

Detergentien-Faser-Fraktionen. In verschiedenen In-vitro-Ansätzen konnten mithilfe

der SSCP-Analyse qualitative Veränderungen der mikrobiellen Diversität durch

Fermentation unterschiedlicher Substrate erfolgreich nachgewiesen werden (BOGUHN

et al. 2008; RANILLA et al. 2009).

Die für die vorliegende Arbeit generierten Profile der Bacteria- und Archaea-

Domänen aus den Proben der Fermenterflüssigkeit zeigten homogene Muster

(Abbildungen 3.18 bis 3.21). Es konnten makroskopisch keine Banden identifiziert

werden, die entweder in einzelnen Spuren fehlen oder zusätzlich auftauchen. Mithilfe

der densitometrischen Untersuchung der SSCP-Profile war es dennoch möglich, eine

Clusteranalyse durchzuführen. Allerdings ergaben weder die Clusteranalysen noch

die statistische Auswertung der Ähnlichkeitsmatrizes einen signifikanten Einfluss der

Maisvarianten auf die SSCP-Profile und damit auf die mikrobielle Diversität (Tabellen

3.19 bis 3.22).

Bei den SSCP-Profilen des zweiten Versuchs kam es bei dem direkten Vergleich der

Spuren der Proben eines Fermenters der Tage 1 und 7 zu einer deutlichen

Clusterbildung entsprechend der Entnahmetage (Abbildungen 3.22 und 3.23).

Statistisch ließ sich dieser Effekt jedoch nicht bestätigen (Tabellen 3.23 und 3.24).

Die nicht-metrische zweidimensionale Skalierung der Ähnlichkeitsmatrizes zeigte

ebenfalls eine deutliche räumliche Trennung zwischen den Proben der

verschiedenen Entnahmetage. Jedoch war die Streuung der Proben insbesondere

des 7. Entnahmetags untereinander zum Teil größer als der Abstand zu den Proben

des ersten Entnahmetags (Abbildung 3.24a und b).

98 Diskussion

Die mikrobielle Gemeinschaft zeigte vergleichbar zu Ergebnissen anderer In-vitro-

Versuche eine Anpassung an die In-vitro-Bedingungen sowie an das neue Substrat

während der Äquilibrierungsphase (BRYANT u. BURKEY 1953; PREVOT et al. 1994;

BOGUHN et al. 2012). Die Adaptation erfolgte für alle Fermenter unabhängig von der

inkubierten Maisvariante.

Es ist möglich, dass Einflüsse des inkubierten Substrats auf die mikrobielle

Gemeinschaft mit der gewählten Methode nicht feststellbar waren. Quantitative

Veränderungen können mit der SSCP-Analyse nicht erfasst werden (DOHRMANN u.

TEBBE 2004). Zusätzlich kann die Interpretation einzelner Banden irreführend sein.

So können sich hinter einer Bande mehrere Spezies verbergen sowie der

ssDNA-Abschnitt einer Spezies mehrere Konformationen annehmen und so im

PAA-Gel mehrere Banden hervorrufen (SCHWIEGER u. TEBBE 1998; SCHMALENBERGER

u. TEBBE 2003; DOHRMANN u. TEBBE 2004; WITZIG et al. 2010). Zur Erhöhung der

Spezifität der ssDNA-Abschnitte wurde eine nested PCR eingesetzt (siehe Kapitel

2.5.6). Dabei wurden PCR-Produkte der 16S rRNA-Gene von über 400 bp

amplifiziert, die aufgrund ihrer Länge von DOHRMANN u. TEBBE (2004) als ausreichend

genaue Marker für die strukturelle Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft

bewertet wurden. Die Auflösung des PAA-Gels stellt eine weitere Limitierung der

Erfassung qualitativer Unterschiede der mikrobiellen Diversität dar (LOISEL et al.

2006).

Die gesammelten Daten lassen die Interpretation zu, dass die Veränderungen in der

Zusammensetzung der Maispflanzen aufgrund einer erhöhten [CO2] und

Trockenstress durch die dynamische Anpassungsfähigkeit der mikrobiellen

Gemeinschaft keinen dauerhaften Einfluss auf die ruminale mikrobielle Diversität

haben werden.

99

4.5 Schlussfolgerungen und Ausblick

Eine erhöhte [CO2] und Trockenstress während der Aufwuchsphase von

Maispflanzen führte zu unterschiedlichen TS-, Gesamt- und Kornerträgen

(MANDERSCHEID et al. 2012) sowie zu veränderten Gehalten des Rp und der

Detergentien-Fasern der Pflanzen. Die Effekte durch Trockenstress waren dabei

ausgeprägter im Vergleich zu den Auswirkungen einer erhöhten [CO2].

Die Inkubation der vier unter verschiedenen klimatischen Bedingungen

aufgezogenen Maisvarianten zeigte lediglich geringe Auswirkungen auf die

Fermentationsparameter im In-vitro-Modell. Auf die Zusammensetzung der

mikrobiellen Gemeinschaft konnte kein gerichteter Einfluss festgestellt werden.

Signifikante Effekte der Maisvarianten auf die NH3-N-Konzentration und die

Verdaulichkeit der oS in vitro weisen allerdings auf einen Einfluss einer erhöhten

[CO2] und insbesondere von Trockenstress auf den Futterwert der Pflanzen hin. In

einem Kooperationsprojekt wurde Pflanzenmaterial der gleichen Ernte

(MANDERSCHEID et al. 2012) zunächst siliert und anschließend in einem

Fütterungsversuch eingesetzt (MEYER et al. 2009). Ein Vergleich der Ergebnisse des

Kooperationsprojektes mit den Daten der vorliegenden Arbeit lässt darauf schließen,

dass die Einflüsse von Trockenstress auf die Verdaulichkeit von Maispflanzen auch

nach Silierung bestehen bleiben. MANDERSCHEID et al. (2012) stellten bei

Trockenstressbehandlung eine verfrühte Alterung der Maispflanzen fest. GHANNOUM

(2009) beschrieb einen Zusammenhang einer verfrühten Alterung von C4-Pflanzen

durch Trockenstress und einer Abnahme der Verdaulichkeit, die auch in dieser Arbeit

nachvollziehbar war. Der zugrunde liegende Mechanismus bleibt weiterhin unklar.

Eine Überprüfung der mikrobiellen Proteinsyntheseraten sowie der Verdaulichkeiten

der Fraktionen Rp, NDF und ADF des Pflanzenmaterials sollte die Interpretation und

die Abschätzung der Auswirkungen des Klimawandels auf die ruminalen

Fermentationsparameter erleichtern.

100 Schlussfolgerungen und Ausblick

Aufgrund ihres hohen Adaptationsvermögens scheint die mikrobielle Gemeinschaft

die Anpassung an Pflanzenmaterial, das durch erhöhte [CO2] oder Trockenstress

während der Aufwuchsphase beeinflusst wurde, ohne signifikante Einschränkungen

der Fermentationsvorgänge vollziehen zu können. Eine Bestimmung quantitativer

Veränderungen der mikrobiellen Gemeinschaft könnte darüber hinaus Aufschluss

über diese Adaptationsvorgänge liefern.

101

5 Zusammenfassung

Birgit Eva Meibaum

Untersuchungen zu den Auswirkungen des Klimawandels auf die ruminalen Fermentationsparameter von Maispflanzen sowie die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft in vitro.

Im Zuge des Klimawandels werden zukünftig die Kohlendioxid-Konzentration in der

Atmosphäre ([CO2]) ansteigen und die Trockenperioden während der

Sommermonate zunehmen. Die Auswirkungen dieser Klimaänderungen auf den

Stoffwechsel von Nutzpflanzen werden intensiv untersucht. Für die bedeutende Nutz-

und C4-Pflanze Mais wurden Veränderungen in Photosyntheseleistung sowie

Trockensubstanz (TS)-, Korn- und Gesamtertrag festgestellt, die zu unterschied-

lichen Zusammensetzungen der Pflanzen bezogen auf die Rohnährstoffe und

Detergentien-Fasern an der TS führen.

Mithilfe der Rumen-Simulationstechnik (RUSITEC) wurde in dieser Arbeit der

Einfluss von Maispflanzen (Zea mays L., cv. Romario), die während der

Aufwuchsphase einer erhöhten [CO2] (550 ppm CO2) und Trockenstress ausgesetzt

waren, auf die ruminalen Fermentationsparameter und die Zusammensetzung der

mikrobiellen Gemeinschaft in vitro untersucht. Es standen vier definierte

Maisvarianten zur Verfügung, die pro Variante in drei RUSITEC-Fermentern inkubiert

wurden: (A) 380 ppm CO2; (B) 550 ppm CO2; (C) 380 ppm CO2 + Trockenstress; (D)

550 ppm CO2 + Trockenstress. In einem zweiten Versuch wurden speziell die

Veränderungen der Produktionsraten und der molaren Anteile der kurzkettigen

Fettsäuren (SCFA) während der Äquilibrierungsphase bei Inkubation der beiden

bewässerten Varianten (A und B) untersucht.

Es wurden charakteristische Ergebnisse für die In-vitro-Inkubation maisbasierter

Substrate festgestellt: Sinkende molare Acetatanteile, steigende molare Propionat-,

Butyrat- und Isovalerat-Anteile sowie sinkende Protozoa-Konzentrationen

insbesondere während der Äquilibrierungsphase.

102 Zusammenfassung

Allerdings konnten auch Einflüsse der Maisvarianten gezeigt werden. Die Inkubation

der 550 ppm CO2 Varianten (B und D) ergab im Vergleich zu den 380 ppm CO2

Varianten (A und C) höhere Ammoniak (NH3)-N-Konzentrationen (p<0,05). Die

Fermentation der Trockenstressvarianten (C und D) führte zu höheren pH-Werten

(p<0,01) und NH3-N-Konzentrationen (p<0,001) sowie zu geringeren

Verdaulichkeiten der oS (p<0,05). Während der Äquilibrierungsphase konnten an

zwei Tagen höhere SCFA- (p<0,05) und tendenziell höhere Acetat-Produktionsraten

(p<0,1) der Variante B im Vergleich zu Variante A festgestellt werden. Im Gegensatz

dazu konnte während der Versuchsphase kein Effekt der Maisvarianten auf die

Produktionsraten und die molaren Anteile der SCFA, die Redoxpotentiale, die

Produktion oder die Anteile der Fermentationsgase sowie die Anzahl der Protozoa

gezeigt werden. Ferner ergab die Single-strand-conformation-polymorphism (SSCP)-

Analyse keinen signifikanten Einfluss der Maisvarianten auf die Zusammensetzung

der mikrobiellen Gemeinschaft.

Die Inkubation der vier unter verschiedenen klimatischen Bedingungen

aufgezogenen Maispflanzen zeigte lediglich geringe Auswirkungen auf die

Fermentationsparameter im In-vitro-Modell. Ein Grund dafür könnte das große

Adaptationsvermögen der ruminalen mikrobiellen Gemeinschaft sein. Allerdings

könnten die signifikanten Einflüsse auf die NH3-N-Konzentration und die

Verdaulichkeit der oS in vitro auf einen veränderten Futterwert der Maisvarianten

hinweisen.

Schlagwörter: Klimawandel, C4-Pflanzen, RUSITEC, SSCP

103

6 Summary

Birgit Eva Meibaum

Study on the impact of climate changes on rumen fermentation parameters of maize plants and the microbial diversity in vitro.

In response to climate changes CO2-concentrations in the atmosphere ([CO2]) will

rise and drought stress during summer months will increase. The influence of climate

changes on crop plant metabolism is studied intensively. For maize, an important

C4-plant and agricultural crop, changes in photosynthesis rate and dry matter (DM),

kernel and total yield were observed, resulting in different crude nutrient and

detergent fibre concentrations in relation to DM.

In this study the influence of maize plants growing under elevated [CO2] (550 ppm)

and drought stress on rumen fermentation patterns, and microbial diversity in vitro

was analyzed applying the rumen simulation technique (RUSITEC). Four defined

maize variants were available to incubate in three RUSITEC-fermenters,

respectively: (A) 380 ppm CO2; (B) 550 ppm CO2; (C) 380 ppm CO2 + drought stress;

(D) 550 ppm CO2 + drought stress. In a second experiment only the well-watered

variants (A and B) were used to analyze the particular changes in production rates

and molar percentages of short chain fatty acids (SCFA) during the initial

equilibration period of the in-vitro-system.

Typical results for in vitro incubation of maize based substrates were determined, as

decreased molar percentage of acetate, increased molar percentages of propionate,

butyrate, and iso-valerate, as well as decreased concentration of protozoa in the

course of equilibration period.

Nevertheless, significant influences of maize variants have been detected. Incubation

of 550 ppm CO2 variants (B and D) resulted in higher ammonia

(NH3)-N concentrations (p<0.05) in comparison to 380 ppm CO2 variants (A and C).

Fermentation of drought-stressed variants (C and D) entailed increased pH values

104 Summary

(p<0.01) and NH3-N concentrations (p<0.001) along with decreased digestibilities of

organic matter (p<0.05). On two days during equilibration period variant B showed

higher SCFA (p<0.05) and a tendency to increased acetate production rates (p<0.1)

compared to variant A. In contrast, there was no effect of maize variants determined

on redox potentials, productions rates and molar percentages of SCFA, productions

rates and composition of fermentations gases, and concentration of protozoa during

the experimental period. Furthermore, the single strand conformation polymorphism

(SSCP)-analysis showed no significant influence of maize variants on microbial

diversity.

The incubation of maize variants grown under different climatic conditions showed

only minor influence on fermentation patterns in vitro. The reason for these findings

might have been the pronounced adaptation capability of the rumen microbial

community. Though, the significant effect on NH3-N concentration and digestibility of

organic matter in vitro might suggest an alteration in nutritional value of maize plants.

Keywords: climate change, C4-plant, RUSITEC, SSCP

105

7 Literaturverzeichnis

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121

8 Anhang

8.1 Verwendete Lösungen

Tabelle 8.1: Aufzählung der Zusammensetzungen der verwendeten Lösungen

Lösungen Zusammensetzung

0,9%ige NaCl-Lösung

Natriumchlorid 9 g

0,8%iges Agarose-Gel

Agarose 0,8 g ad 100 ml 1x TAE-Puffer Lösen unter Aufkochen

1%iges Agarose-Gel

Agarose 1 g ad 100 ml 1x TAE-Puffer Lösen unter Aufkochen

APS-Lösung (40%)

Ammoniumperoxodisulfat 0,4 g ad 1000 μl Aqua bidest.

Bind Silane Lösung

Ethanol (96%) 5 ml Essigsäure (96%) 50 μl PlusOne Bind Silane 50 μl

Bromphenolblau-Lösung (2,5%)

Bromphenolblau 0,05 g ad 2000 μl autoklaviertes Aqua bidest.

CTAB-Lösung (10%)

Cetyltrimethylammoniumbromid 20 g Natriumchlorid (4 M) 35 ml (0,7 M) ad 200 ml Aqua bidest. 5 h verrühren, autoklavieren

Entwicklerlösung

Natriumcarbonat-Dehydrat 33,75 g ad 550 ml Aqua bidest. Formaldehyd (37%) 1,2 ml Natriumthiosulfat (0,2%) 0,6 ml ad 600 ml Aqua bidest.

122 Anhang

Essigsäure (10%)

Essigsäure (96%) 52 ml ad 500 ml Aqua bidest.

Ethanol (80%)

Ethanol (99,8%) 40 ml ad 50 ml Aqua bidest.

Ethidiumbromid-Lösung

Ethidiumbromid (0,5%) 5 Tropfen in 500 ml 1x TAE-Puffer

Lysozym-Lösung (100 mg ml-1)

Lysozym 100 mg ad 1000 μl Aqua bidest.

Methylgrün-Lösung

Methylgrün 0,6 g Natriumchlorid 8 g Formaldehyd (37,7%) 92,8 ml ad 1000 ml Aqua bidest.

NaCl (4 M)

Natriumchlorid 58,44 g ad 250 ml autoklaviertes Aqua bidest.

Na2EDTA-Lösung (0,5 M)

Titriplex III EDTA 37,22 g NaOH-Plätzchen 4 g ad 200 ml Aqua bidest. pH-Wert auf 8,0 einstellen

Natriumthiosulfat (0,2%)

Natriumthiosulfat 0,2 g ad 100 ml Aqua bidest.

Polyacrylamid (PAA)-Gel (0,625%ig)

MDE®-Gel Solution 7,8 ml 10x TBE 2,5 ml Aqua dest. 14,7 ml TEMED 10 μl APS (40%) 25 μl

Proteinase K-Lösung (20 mg ml-1)

Proteinase K 20 mg ad 1000 μl autoklaviertes Aqua bidest.

SDS-Lösung

Natriumdodecylsulfat 20 g ad 100 ml Aqua bidest.

Silbernitrat-Lösung

Silbernitrat 0,5 g Formaldehyd (37%) 0,75 ml ad 500 ml Aqua bidest.

Anhang 123

SSCP-Ladepuffer

Formamid 950 μl NaOH (1 M) 10 μl Bromphenolblau (2,5%) 10 μl

TAE-Puffer (50x)

Trizma® Base 242 g Eisessig 57,1 ml Na2EDTA-Lösung (0,5 M bei pH 8,0) 100 ml ad 1000 ml autoklaviertes Aqua bidest.

TAE-Puffer (1x)

TAE-Puffer (50x) 1:50 mit autoklaviertem Aqua bidest. verdünnt

TBE-Puffer (10x)

Trizma® Base 108 g (0,89 M) Borsäure 55 ml (0,89 M) Na2EDTA-Lösung (0,5 M bei pH 8,0) 40 ml ad 1000 ml autoklaviertes Aqua bidest.

TBE-Puffer (1x)

TBE-Puffer (10x) 1:10 mit autoklaviertem Aqua bidest. verdünnt

TE-Puffer

Tris-HCl (1 M bei pH 8,0) 1 ml (10 mM) Na2EDTA-Lösung (0,5 M bei pH 8,0) 0,2 ml (1 mM) ad 100 ml autoklaviertes Aqua bidest.

TEN-Puffer (2x)

Tris-HCl (1 M bei pH 8,0) 2,5 ml (10 mM) Na2EDTA-Lösung (0,5 M bei pH 8,0) 5 ml (10 mM) NaCl (4 M) 9,375 ml (150 mM) ad 250 ml autoklaviertes Aqua bidest.

Tris-HCl (1 M)

Trizma® Base 24,22 g HCl (32%) 8 ml ad 200 ml Aqua bidest. pH-Wert auf 8,0 einstellen

124 Anhang

8.2 Eingesetzte Chemikalien

Tabelle 8.2: Aufzählung der eingesetzten Chemikalien

Produkt Hersteller

100 bp DNA Ladder New England Biolabs GmbH, D-65926 Frankfurt

Agarose NEEO Ultra-Qualität Roth GmbH & Co. KG, D-76185 Karlsruhe

Ameisensäure (98-100%; p.a.) Merck KGaA, D-64271 Darmstadt

Ammoniumacetat Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim

Ammoniumchlorid (NH4Cl; p.a.) Merck KGaA, D-64271 Darmstadt

APS (Ammoniumperoxodisulfat ≥ 98%; p.a.) Roth GmbH & Co. KG, D-76185 Karlsruhe

Borsäure Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim

Bromphenolblau (Natriumsalz, reinst) Serva GmbH, D-69115 Heidelberg

CaCl2 • 2 H2O (Calciumchlorid-Dihydrat; p.a.) Merck KGaA, D-64271 Darmstadt

Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim

CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid) Roth GmbH & Co. KG, D-76185 Karlsruhe

dNTPs (pH 7,0) Fermentas GmbH, D-68789 St. Leon-Rot

Eisessig (100%; p.a.) Roth GmbH & Co. KG, D-76185 Karlsruhe

Essigsäure (96%) Roth GmbH & Co. KG, D-76185 Karlsruhe

Ethanol (≥ 99,8%; p.a.) Roth GmbH & Co. KG, D-76185 Karlsruhe

Ethidiumbromid (0,5%) Roth GmbH & Co. KG, D-76185 Karlsruhe

Formaldehyd (37,7%) Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim

Formaldehyd (37%) zur Desinfektion AppliChem GmbH, D-64291 Darmstadt

Formamid Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim

GeneRulerTM 50 bp DNA Ladder Fermentas GmbH, D-68789 St. Leon-Rot

Glycerol (99%) Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim

HCl (konzentrierte Salzsäure, 32%, reinst) Merck KGaA, D-64271 Darmstadt

HotStarTaq DNA Polymerase (5 U • μl-1) Quiagen GmbH, D-40724 Hilden

Isopropanol Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim

KCl (Kaliumchlorid; p.a.) Merck KGaA, D-64271 Darmstadt

λ-Exonuklease (5000 U ml-1) New England Biolabs GmbH, D-65926 Frankfurt

λ-Exonuklease-Puffer (10x) New England Biolabs GmbH, D-65926 Frankfurt

Anhang 125

λ-Hind III Marker Fermentas GmbH, D-68789 St. Leon-Rot

Lysozym Serva-Aldrich, D-69115 Heidelberg

MassRulerTM DNA Ladder Mix Fermentas GmbH, D-68789 St. Leon-Rot

MDE®-Gel Solution Biozym, D-31840 Hessisch Oldendorf

Methylgrün Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim

MgCl2 • 6 H2O (Magnesiumchlorid-Hexahydrat, p.a.)

Merck KGaA, D-64271 Darmstadt

MinElute PCR Purification Kit Quiagen GmbH, D-40724 Hilden

NaCl (p.a.) Merck KGaA, D-64271 Darmstadt

Na2HPO4 • 12 H2O (Dinatriumhydrogen-phosphat-Dodecahydrat, kristallin, reinst)


NaH2PO4 • H2O (Natriumdihydrogen-phosphat-Monohydrat, p.a.)


NaHCO3 (Natriumhydrogencarbonat, p.a.) Merck KGaA, D-64271 Darmstadt

NaOH (Natriumhydroxid, 1 M) AppliChem GmbH, D-64291 Darmstadt

NaOH-Plätzchen Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim

Natriumthiosulfat (Na2S2O3 • 5 H2O, 99,5%, p.a.)

Roth GmbH & Co. KG, D-76185 Karlsruhe

PCR-Puffer (10x) Quiagen GmbH, D-40724 Hilden

Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) Roth GmbH & Co. KG, D-76185 Karlsruhe

PlusOne Bind Silane Amersham Biosciences GmbH, D-79111 Freiburg

PlusOne Repel Silane Amersham Biosciences GmbH, D-79111 Freiburg

Proteinase K Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim

QIAquick PCR Purification Kit Quiagen GmbH, D-40724 Hilden

RNase A (10 mg • ml-1) Fermentas GmbH, D-68789 St. Leon-Rot

SDS (Natriumdodecylsulfat) Serva GmbH, D-69115 Heidelberg

Silbernitrat Roth GmbH & Co. KG, D-76185 Karlsruhe

TEMED (N,N,N’,N‘- Tetramethylethylen-diamin)

Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim

Titriplex III EDTA (Dinatriumsalz-Dihydrat, p.a.)


Trizma® Base (99,9%) Sigma-Aldrich GmbH, D-89555 Steinheim

126 Anhang

8.3 Rohdaten der RUSITEC-Versuche

8.3.1 Rohdaten in V1


380 ppm CO2 550 ppm CO2 380 ppm CO2 + Trockenstress

550 ppm CO2 + Trockenstress

Phase Tag A E I B F J C G K D H L

Äqu

ilibri

eru

ng

1 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,8 6,7 6,8 6,8 6,7 6,8 6,8

2 6,8 6,7 6,7 6,6 6,7 6,8 6,8 6,7 6,8 6,7 6,8 6,9

3 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,8 6,8 6,7 6,8 6,7 6,7 6,8

4 6,7 6,6 6,8 6,7 6,7 6,7 6,8 6,7 6,8 6,7 6,8 6,7

5 6,7 6,6 6,8 6,6 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,8 6,7

6 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,8 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7

Vers

uchsphase

7 6,7 6,7 6,7 6,6 6,8 6,7 6,8 6,8 6,8 6,7 6,8 6,7

8 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,8 6,8 6,7 6,7 6,7

9 6,8 6,7 6,7 6,8 6,7 6,7 6,8 6,7 6,8 6,8 6,7 6,7

10 6,8 6,6 6,7 6,8 6,7 6,7 6,7 6,7 6,8 6,8 6,7 6,8

11 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,8 6,8 6,8 6,7 6,8 6,8

12 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,8 6,8 6,8 6,7 6,8 6,7

13 6,8 6,7 6,7 6,7 6,6 6,7 6,7 6,8 6,8 6,7 6,8 6,7

14 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,7 6,8 6,7 6,8 6,8

Anhang 127





Äqu

ilibri

eru

ng

1 -244 -256 -253 -229 -244 -258 -249 -256 -255 -245 -254 -262

2 -212 -213 -217 -180 -218 -225 -208 -213 -222 -209 -198 -232

3 -153 -178 -184 -140 -173 -176 -177 -186 -190 -167 -167 -181

4 -139 -153 -169 -128 -146 -155 -146 -167 -162 -140 -145 -162

5 -134 -151 -157 -125 -152 -149 -139 -162 -156 -127 -147 -151

6 -133 -143 -138 -124 -142 -143 -143 -150 -152 -128 -135 -141

Vers

uchsphase

7 -130 -127 -121 -119 -130 -126 -140 -133 -145 -121 -124 -136

8 -110 -118 -132 -104 -126 -135 -128 -133 -130 -122 -125 -141

9 -118 -113 -127 -109 -129 -122 -141 -123 -126 -124 -120 -134

10 -115 -114 -123 -112 -119 -115 -123 -123 -120 -118 -113 -130

11 -112 -118 -123 -108 -117 -109 -121 -121 -115 -111 -112 -117

12 -101 -99 -110 -86 -102 -100 -116 -104 -109 -99 -88 -105

13 -102 -104 -109 -88 -103 -133 -126 -114 -113 -103 -97 -107

14 -109 -121 -114 -95 -111 -102 -106 -117 -111 -106 -99 -104

Tabelle 8.5: Überläufe [ml] in V1




Vers

uchsphase

7 630 690 720 580 660 690 755 710 780 700 710 630

8 630 650 680 650 650 650 750 710 770 690 675 570

9 650 680 680 575 650 650 660 690 760 710 680 590

10 650 640 550 640 650 625 620 690 750 620 690 610

11 640 675 600 570 660 650 690 710 770 630 675 620

12 640 650 600 590 650 640 660 700 730 655 660 590

13 670 680 620 590 625 630 680 710 760 670 705 590

14 610 630 620 600 610 640 670 670 660 590 675 610

128 Anhang


] in V1




Vers

uchsphase

7 29,9 33,5 34,5 34,2 28,6 36,5 31,5 36,3 40,2 29,7 31,0 32,6

8 29,8 31,0 32,8 38,1 29,9 32,6 33,9 32,8 39,5 29,8 29,0 29,1

9 29,7 34,6 33,4 30,2 30,4 31,3 28,1 33,0 35,8 30,0 30,5 30,8

10 28,0 33,7 31,7 30,1 32,9 33,0 28,9 34,4 35,3 26,5 31,6 31,2

11 30,8 34,2 33,7 26,8 34,2 35,2 29,8 34,3 35,6 28,4 29,7 30,0

12 30,2 32,3 31,5 31,4 33,8 32,7 28,2 32,2 33,3 31,4 27,6 29,2

13 29,6 33,4 31,7 30,1 34,6 33,4 28,6 32,3 32,6 31,1 30,4 28,3

14 28,9 27,7 31,9 29,1 33,7 34,6 29,8 32,6 30,3 27,6 27,6 28,8


] in V1




Vers

uchsphase

7 13,9 15,5 15,8 15,5 13,7 17,1 14,9 16,9 18,3 13,9 14,7 14,7

8 14,0 14,0 15,3 17,5 14,6 14,8 15,6 15,4 17,8 13,7 13,7 13,3

9 14,2 16,0 15,2 14,2 15,1 14,1 12,8 15,4 16,5 14,1 14,5 14,4

10 13,0 16,6 14,3 13,9 16,1 14,4 12,6 16,1 15,8 12,4 14,9 14,4

11 14,6 16,5 14,7 11,7 16,1 15,6 13,5 16,0 15,8 13,5 14,0 13,6

12 13,9 14,6 13,2 13,1 15,5 14,3 12,5 15,2 14,5 14,5 12,6 12,9

13 13,4 14,2 13,0 13,0 15,7 14,0 12,7 15,4 13,8 14,1 13,5 12,7

14 12,7 12,2 13,1 12,5 15,0 14,0 13,4 15,0 12,2 12,3 12,0 12,9


] in V1




Vers

uchsphase

7 10,1 11,5 12,0 11,3 10,0 12,2 11,0 12,7 14,7 10,5 10,6 11,2

8 10,1 11,0 11,6 12,9 10,1 11,1 11,8 11,5 14,4 10,9 9,9 9,8

9 9,74 12,5 11,9 10,2 9,80 10,7 9,42 11,5 12,7 10,7 10,3 10,4

10 8,96 11,3 11,2 10,1 10,9 11,6 9,60 11,9 12,7 9,59 10,6 10,4

11 10,1 11,9 11,7 9,05 12,0 12,2 9,92 12,1 13,1 10,5 10,1 10,3

12 10,7 11,4 11,0 11,0 12,6 11,6 9,49 11,2 12,2 11,7 9,6 10,6

13 10,7 12,7 11,5 10,5 13,0 12,2 9,81 11,4 11,8 11,8 10,8 10,4

14 11,3 10,3 12,1 10,2 12,6 13,3 10,7 12,0 11,6 11,0 10,0 10,2

Anhang 129


] in V1




Vers

uchsphase

7 5,9 6,2 6,3 6,9 4,4 6,7 5,2 6,3 6,8 5,3 5,3 6,3

8 5,7 5,5 5,6 7,3 4,7 6,4 5,9 5,5 6,7 5,2 4,9 5,7

9 5,8 5,6 5,8 5,4 5,1 6,1 5,4 5,6 6,2 5,2 5,2 5,8

10 6,1 5,3 5,6 5,6 5,5 6,5 6,2 5,8 6,2 4,5 5,6 6,1

11 6,1 5,4 6,7 5,7 5,5 6,9 6,0 5,6 6,2 4,4 5,1 5,6

12 5,6 5,7 6,6 6,8 5,1 6,3 5,8 5,3 6,1 4,8 4,9 5,3

13 5,0 5,7 6,6 6,1 5,2 6,6 5,5 4,9 6,3 4,6 5,4 4,9

14 4,4 4,5 6,3 5,9 5,5 6,6 5,2 5,1 5,9 3,9 5,0 5,1

Tabelle 8.10: Isovalerat-Produktionsraten [mmol • Tag-1

] in V1




Vers

uchsphase

7 -- 0,4 0,4 0,4 0,4 0,5 0,5 0,5 0,5 -- 0,5 0,4

8 -- 0,5 0,4 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 -- 0,5 0,3

9 -- 0,5 0,5 0,4 0,5 0,4 0,4 0,5 0,5 -- 0,5 0,3

10 -- 0,5 0,6 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,6 -- 0,5 0,3

11 -- 0,6 0,7 0,4 0,6 0,6 0,3 0,6 0,6 -- 0,5 0,4

12 -- 0,6 0,7 0,5 0,6 0,5 0,5 0,5 0,6 0,5 0,5 0,4

13 0,4 0,6 0,6 0,5 0,6 0,6 0,5 0,6 0,7 0,5 0,6 0,4

14 0,5 0,7 0,6 0,5 0,7 0,7 0,6 0,6 0,7 0,6 0,6 0,5

-- unter Nachweisgrenze (0,3 mmol • l-1

)





Vers

uchsphase

7 46,6 46,2 45,9 45,3 48,0 46,8 47,1 46,4 45,4 46,8 47,2 45,1

8 46,9 45,2 46,5 45,9 48,7 45,2 46,0 46,9 45,2 46,0 47,3 45,7

9 47,8 46,2 45,5 46,9 49,6 45,0 45,6 46,7 46,0 46,9 47,5 46,6

10 46,4 49,2 44,9 46,1 48,9 43,6 43,6 46,8 44,9 46,9 47,2 46,1

11 47,3 48,1 43,6 43,5 47,1 44,2 45,3 46,7 44,3 47,4 47,1 45,5

12 46,0 45,0 41,9 41,6 45,8 43,8 44,2 47,2 43,4 46,1 45,7 44,2

13 45,3 42,6 41,1 43,1 45,4 41,8 44,5 47,7 42,4 45,4 44,6 44,6

14 44,1 44,1 40,9 42,9 44,5 40,5 44,8 45,9 40,3 44,4 43,5 44,9

130 Anhang





Vers

uchsphase

7 33,7 34,3 34,7 33,2 35,2 33,4 34,9 34,9 36,5 35,2 34,3 34,5

8 33,8 35,5 35,2 33,8 33,7 33,9 34,9 35,0 36,6 36,5 34,3 33,8

9 32,8 36,0 35,7 33,8 32,2 34,3 33,6 34,9 35,4 35,8 34,0 33,6

10 31,9 33,5 35,5 33,4 32,9 35,2 33,2 34,8 36,0 36,2 33,6 33,4

11 32,8 34,6 34,6 33,7 35,2 34,5 33,3 35,3 36,7 36,9 34,0 34,5

12 35,4 35,3 34,9 35,0 37,2 35,4 33,6 34,8 36,5 37,1 34,7 36,1

13 36,2 38,1 36,3 35,0 37,7 36,4 34,4 35,2 36,3 38,1 35,6 36,6

14 39,1 37,2 37,8 35,0 37,5 38,5 35,7 36,7 38,1 39,7 36,2 35,6





Vers

uchsphase

7 19,7 13,2 18,2 20,2 15,4 18,4 16,6 17,4 16,8 17,9 17,0 19,2

8 19,3 15,3 17,1 19,0 15,8 19,5 17,5 16,6 17,1 17,5 16,8 19,5

9 19,4 14,7 17,3 18,0 16,7 19,6 19,3 16,9 17,3 17,4 17,0 18,7

10 21,7 16,3 17,8 18,7 16,6 19,6 21,4 17,0 17,5 16,9 17,7 19,4

11 19,8 16,1 19,9 21,2 16,1 19,6 20,3 16,4 17,3 15,7 17,3 18,7

12 18,6 15,9 21,0 21,7 15,2 19,3 20,5 16,4 18,3 15,4 17,7 18,3

13 17,0 15,7 20,8 20,3 15,2 19,8 19,3 15,3 19,3 14,8 17,9 17,2

14 15,1 19,7 19,6 20,4 16,2 19,1 17,4 15,5 19,3 14,0 17,9 17,9

Tabelle 8.14: Molare Isovalerat-Anteile [%] in V1




Vers

uchsphase

7 -- 1,1 1,2 1,3 1,5 1,3 1,4 1,3 1,3 -- 1,5 1,2

8 -- 1,5 1,1 1,3 1,8 1,4 1,6 1,4 1,2 -- 1,6 1,0

9 -- 1,5 1,4 1,3 1,5 1,1 1,6 1,5 1,3 -- 1,6 1,0

10 -- 1,5 1,9 1,8 1,5 1,6 1,8 1,5 1,6 -- 1,5 1,1

11 -- 1,4 1,9 1,7 1,7 1,6 1,1 1,7 1,8 -- 1,7 1,3

12 -- 2,0 2,3 1,6 1,8 1,5 1,6 1,6 1,8 1,5 1,9 1,4

13 1,5 2,2 1,8 1,6 1,8 1,9 1,8 1,8 2,0 1,7 2,0 1,5

14 1,8 2,5 1,7 1,7 1,9 1,9 2,1 1,9 2,4 2,0 2,3 1,7

-- unter Nachweisgrenze (0,3 mmol • l-1

)

Anhang 131





Vers

uchsphase

7 1,4:1 1,4:1 1,3:1 1,4:1 1,4:1 1,4:1 1,4:1 1,3:1 1,3:1 1,3:1 1,4:1 1,3:1

8 1,4:1 1,3:1 1,3:1 1,4:1 1,4:1 1,3:1 1,3:1 1,3:1 1,2:1 1,3:1 1,4:1 1,4:1

9 1,5:1 1,3:1 1,3:1 1,4:1 1,5:1 1,3:1 1,4:1 1,3:1 1,3:1 1,3:1 1,4:1 1,4:1

10 1,5:1 1,5:1 1,3:1 1,4:1 1,5:1 1,2:1 1,3:1 1,4:1 1,3:1 1,3:1 1,4:1 1,4:1

11 1,4:1 1,4:1 1,3:1 1,3:1 1,3:1 1,3:1 1,4:1 1,3:1 1,2:1 1,3:1 1,4:1 1,3:1

12 1,3:1 1,3:1 1,2:1 1,2:1 1,2:1 1,2:1 1,3:1 1,4:1 1,2:1 1,2:1 1,3:1 1,2:1

13 1,3:1 1,1:1 1,1:1 1,2:1 1,2:1 1,2:1 1,3:1 1,4:1 1,2:1 1,2:1 1,3:1 1,2:1

14 1,1:1 1,2:1 1,1:1 1,2:1 1,2:1 1,1:1 1,3:1 1,3:1 1,1:1 1,1:1 1,2:1 1,3:1

Tabelle 8.16: Produktionsraten der Fermentationsgase [ml • Tag-1

] in V1




Vers

uchsphase

7 203 427 354 199 137 331 366 212 116 333 321 356

8 255 395 281 311 348 326 452 208 352 291 240 345

9 288 497 317 342 416 384 296 307 232 162 310 372

10 311 442 322 287 421 232 394 277 322 140 329 349

11 247 460 332 431 434 373 305 159 311 120 256 357

12 441 422 292 396 433 337 334 222 304 159 242 327

13 211 361 278 394 467 190 332 264 280 94 277 281

14 247 309 285 352 362 159 382 127 146 189 257 297

Tabelle 8.17: CO2-Anteile an der Fermentationsgasproduktion [%] in V1




Vers

uchsphase

7 80,6 78,2 73,6 79,2 80,4 80,3 79,2 74,1 71,2 76,6 73,2 77,4

8 79,6 79,2 73,3 79,3 79,1 80,0 78,6 73,1 71,7 78,5 72,6 78,1

9 77,7 78,0 73,4 79,3 77,4 80,8 78,8 73,8 70,3 77,9 72,5 78,3

10 79,9 77,5 74,4 79,9 77,7 81,0 80,4 74,1 72,3 79,7 72,4 78,4

11 79,9 77,8 73,8 80,4 78,2 80,3 79,2 73,2 72,2 79,3 73,6 78,7

12 80,2 79,7 75,8 80,6 79,8 81,3 80,8 73,9 72,6 80,2 75,0 80,6

13 81,4 81,4 77,0 80,8 79,7 81,9 81,0 74,4 73,4 81,1 74,4 79,6

14 84,3 80,6 76,8 82,0 79,7 84,4 81,5 75,3 75,5 82,8 76,2 81,3

132 Anhang

Tabelle 8.18: CH4-Anteile an der Fermentationsgasproduktion [%]in V1




Vers

uchsphase

7 19,4 21,8 26,4 20,8 19,7 19,7 20,8 25,9 28,8 23,4 26,8 22,6

8 20,5 20,8 26,7 20,7 20,9 20,0 21,4 26,9 28,3 21,5 27,5 21,9

9 22,3 22,0 26,7 20,7 22,6 19,2 21,2 26,2 29,8 22,1 27,5 21,7

10 20,1 22,5 25,7 20,2 22,3 19,0 19,6 25,9 27,7 20,3 27,6 21,6

11 20,1 22,2 26,2 19,6 21,8 19,8 20,8 26,8 27,8 20,7 26,4 21,3

12 19,8 20,3 24,3 19,4 20,2 18,7 19,2 26,2 27,4 19,8 25,0 19,4

13 18,6 18,7 23,0 19,2 20,3 18,1 19,0 25,6 26,6 18,9 25,7 20,4

14 15,7 19,5 23,2 18,0 20,3 15,6 18,5 24,7 24,5 17,2 23,8 18,7

Tabelle 8.19: Luftdruck [hPa] in V1




Vers

uchsphase

7 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033

8 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033

9 1031 1031 1031 1031 1031 1031 1031 1031 1031 1031 1031 1031

10 1034 1034 1034 1034 1034 1034 1034 1034 1034 1034 1034 1034

11 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037

12 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037

13 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033 1033

14 1015 1015 1015 1015 1015 1015 1015 1015 1015 1015 1015 1015

Tabelle 8.20: Temperatur [°C] in V1




Vers

uchsphase

7 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5

8 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0

9 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5

10 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0 22,0

11 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5

12 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5

13 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5

14 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5 21,5

Anhang 133

Tabelle 8.21: NH3-N-Konzentrationen [mmol • l-1

] in V1




Vers

uchsphase

7 3,9 4,4 4,2 3,5 3,8 4,0 4,5 5,0 4,5 4,0 4,5 4,4

8 3,6 3,9 4,2 3,6 3,6 4,2 4,4 4,9 4,1 4,0 4,3 4,5

9 3,8 3,4 4,0 3,9 3,4 4,0 4,8 4,6 4,4 4,1 4,2 4,6

10 3,8 3,5 3,9 4,1 3,4 3,5 4,5 4,2 4,3 3,9 4,1 4,8

11 2,9 3,7 4,0 3,6 3,4 3,4 4,4 4,5 4,1 3,6 4,4 4,5

12 3,4 3,9 4,1 3,4 3,0 3,4 4,5 3,9 4,1 3,5 4,3 3,9

13 3,8 3,4 3,5 3,2 2,7 3,1 4,3 4,3 4,0 3,6 3,9 3,9

14 3,6 3,8 3,4 3,2 2,9 3,2 4,0 4,2 3,9 3,5 3,6 3,6

Tabelle 8.22: Verdaulichkeiten der organischen Substanz [%] in V1




Vers

uchsphase

7 43,5 50,3 53,4 48,1 42,7 47,2 46,9 48,7 51,6 47,4 45,8 47,3

8 43,9 47,7 46,0 49,9 42,2 49,3 47,5 44,3 49,2 45,9 44,6 46,7

9 50,9 49,6 50,1 53,8 51,3 49,8 49,7 48,0 52,2 51,7 47,2 47,1

10 38,6 58,3 50,2 38,8 50,3 47,0 45,5 47,3 42,4 41,2 50,7 43,1

11 49,2 52,3 53,7 42,7 49,4 55,9 49,6 45,0 46,4 45,8 47,7 45,9

12 49,6 49,6 47,2 52,8 52,2 49,4 43,2 45,0 51,9 51,5 39,7 42,2

13 44,2 45,1 47,0 48,1 49,1 48,6 44,9 43,2 43,7 43,5 44,6 43,2

14 38,1 51,4 49,2 45,4 47,8 47,3 42,6 39,8 43,8 41,2 35,9 39,4

Tabelle 8.23: Anzahl der Protozoa [103 • ml

-1] in V1



Tag A E I B F J C G K D H L

nativ 187 183 138

1 68,7 60,7 44,8 62,2 60,3 45,1 62,8 39,2 31,7 56,3 47,0 30,8

7 7,7 8,7 9,1 8,8 6,8 10,7 9,9 16,2 6,9 7,3 9,7 11,3

14 4,4 11,4 9,5 5,2 3,9 11,1 11,3 21,7 11,1 3,6 8,4 9,7

134 Anhang

8.3.2 Rohdaten in V2


380 ppm CO2 550 ppm CO2

Phase Tag A C E B D F Ä

qu

ilibri

eru

ng

1 6,7 6,8 6,8 6,7 6,8 6,7

2 6,7 6,8 6,7 6,7 6,8 6,7

3 6,8 6,8 6,8 6,8 6,7 6,7

4 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8

5 6,8 6,8 6,8 6,9 6,8 6,7

6 6,7 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8

7 6,8 6,7 6,8 6,8 6,8 6,8



Phase Tag A C E B D F

Äqu

ilibri

eru

ng

1 -177 -189 -186 -171 -174 -183

2 -150 -159 -151 -138 -159 -152

3 -128 -128 -130 -113 -117 -123

4 -108 -113 -121 -91 -103 -107

5 -112 -105 -113 -115 -116 -108

6 -113 -101 -101 -107 -119 -99

7 -122 -120 -115 -111 -127 -122


] in V2



Äqu

ilibri

eru

ng

1 47,9 46,2 51,1 50,6 54,4 48,8

2 36,9 38,6 38,1 36,9 35,3 36,6

3 33,2 35,4 34,0 35,1 36,5 34,4

4 30,3 33,5 32,5 35,9 35,2 35,1

5 31,5 31,9 32,2 34,8 33,9 32,7

6 32,6 28,2 31,7 31,4 32,4 33,4

7 32,9 29,8 29,8 30,8 33,6 34,1

Anhang 135


] in V2



Äqu

ilibri

eru

ng

1 31,9 30,9 34,3 33,8 36,6 32,6

2 20,3 21,2 20,6 21,1 20,5 20,0

3 15,8 17,4 16,7 17,2 17,1 16,2

4 12,7 14,8 13,3 15,7 15,5 14,6

5 13,0 13,5 13,1 14,5 14,3 13,4

6 14,0 12,1 12,7 13,3 13,4 13,8

7 14,5 12,9 12,3 13,1 14,2 14,2


] in V2



Äqu

ilibri

eru

ng

1 10,7 10,3 11,3 11,4 12,1 10,8

2 10,6 10,9 11,3 10,3 9,7 10,3

3 11,4 12,0 11,6 12,0 13,9 11,8

4 11,6 12,6 14,0 13,9 14,3 13,4

5 12,3 12,3 13,4 13,8 13,8 12,9

6 12,6 10,9 13,1 12,5 13,4 13,4

7 12,4 11,6 11,9 12,2 13,6 13,8


] in V2



Äqu

ilibri

eru

ng

1 5,4 5,0 5,5 5,4 5,6 5,4

2 6,0 6,5 6,2 5,6 5,1 6,3

3 6,1 6,1 5,8 5,9 5,5 6,4

4 6,0 6,1 5,2 6,4 5,5 7,1

5 6,2 6,1 5,8 6,5 5,8 6,5

6 6,1 5,3 5,9 5,6 5,6 6,2

7 6,1 5,3 5,7 5,5 5,7 6,2

136 Anhang




Äqu

ilibri

eru

ng

1 66,5 66,8 67,2 66,7 67,4 66,9

2 54,9 55,1 54,0 57,1 58,1 54,8

3 47,4 49,2 49,0 48,9 46,9 47,1

4 42,0 44,3 40,8 43,7 43,9 41,5

5 41,2 42,3 40,5 41,6 42,2 40,8

6 42,8 42,8 40,2 42,2 41,5 41,2

7 43,9 43,3 41,1 42,5 42,4 41,6




Äqu

ilibri

eru

ng

1 22,2 22,3 22,1 22,6 22,3 22,1

2 28,8 28,2 29,8 27,9 27,3 28,0

3 34,4 33,8 34,0 34,2 38,1 34,2

4 38,3 37,6 43,1 38,6 40,5 38,2

5 39,0 38,6 41,6 39,7 40,8 39,4

6 38,5 38,4 41,2 39,9 41,3 40,2

7 37,6 38,8 39,8 39,7 40,6 40,3




Äqu

ilibri

eru

ng

1 11,3 10,9 10,7 10,7 10,3 11,0

2 16,3 16,7 16,2 15,1 14,5 17,2

3 18,2 17,1 17,0 16,8 15,0 18,7

4 19,7 18,1 16,1 17,7 15,6 20,3

5 19,8 19,0 17,9 18,7 17,0 19,8

6 18,7 18,8 18,6 17,8 17,2 18,6

7 18,5 17,9 19,1 17,8 17,0 18,1

Anhang 137




Äqu

ilibri

eru

ng

1 3,0:1 3,0:1 3,0:1 3,0:1 3,0:1 3,0:1

2 1,9:1 2,0:1 1,8:1 2,0:1 2,1:1 2,0:1

3 1,4:1 1,5:1 1,4:1 1,4:1 1,2:1 1,4:1

4 1,1:1 1,2:1 0,9:1 1,1:1 1,1:1 1,1:1

5 1,1:1 1,1:1 1,0:1 1,0:1 1,0:1 1,0:1

6 1,1:1 1,1:1 1,0:1 1,1:1 1,0:1 1,0:1

7 1,2:1 1,1:1 1,0:1 1,1:1 1,0:1 1,0:1

139

9 Danksagung

Zum Gelingen dieser Arbeit haben viele Personen beigetragen, denen ich an dieser Stelle meinen Dank ausdrücken möchte:

Herrn Prof. Dr. Gerhard Breves für die Überlassung des interessanten Themas, die freundliche Aufnahme in seine Arbeitsgruppe und die Betreuung dieser Arbeit.

Herrn Apl. Prof. Dr. Bernd Schröder für die Unterstützung bei Vorbereitung und Präsentation von Postern und Vorträgen.

Frau Dr. Susanne Riede für die Einarbeitung in die RUSITEC- und SSCP-Thematik sowie die engagierte Betreuung und das jederzeit offene Ohr.

Frau Dr. Mirja Wilkens und Frau Imke Cohrs für die Einweisung in SPSS.

Herrn Dr. Remy Manderscheid vom Institut für Biodiversität des vTIs in Braunschweig für die Bereitstellung des Pflanzenmaterials und die enge Zusammenarbeit an dem Artikel.

Marion Burmester, Kerstin Kiri, Marion Loh und Sandra Finke für ungezählte Liter Puffer und die große Unterstützung bei der Probenanalyse sowie Klaus Grunert und Dirk Voigtländer für ihre Hilfsbereitschaft während der RUSITEC-Versuche.

Yvonne Armbrecht und Michael Rohde für Rat und Tat im Stall und den Kaffee.

Den besten Kollegen der Welt für die hervorragende Arbeits- und Pausenatmosphäre. Vielen Dank an Susi, Steffi und Hannah für das Korrekturlesen und meiner Büromitbewohnerin Imke für die schöne Zeit auch in Bautzen. Ich wünsche Euch alles Gute.

Meiner Tante Christa für das sorgfältige Korrigieren der Arbeit.

Meinem Bruder Dr. Martin Rehberg für seine Unterstützung und die vielen Soforthilfen während der Entstehung des Manuskripts trotz stressiger Zeiten und weiter Entfernung.

Meinen Eltern für den Rückhalt, die wiederholten Versicherungen, dass mir der Himmel nicht auf den Kopf fallen wird, und die nicht abreißende Versorgung mit Suppe.

Meinem Jörn!

Tierärztliche Hochschule Hannover Untersuchungen …...Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der...

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