Jg. 41, Heft 17 ULgICtI G ~ n e g : Alternsabhiingigkeit der Aktivit~it sulfataktivierender Enzyme im Herzen 873 I. September 1963

(~er die Alternsabh~ingigkeit der Aktivifiit sulfataktivierender Enzyme im Herzen* (Ein Beitrag zur Bioehemie des Alterns)

Von U L ~ c ~ ~E~ACK

Aus der Medizinischen Klinik und Poliklinik der Vniversit~t l~Iiins~r i. ~,Vestf. (Direktor: Prof. Dr. W. IL ]KAuSS)

Das Altern ver/~ndert Funktion und Gestalt und damit die Leistung yon Geweben und Organen ( B ~ - ~ , L n T T ~ ) . Chemisehe Veranderungen sind die Grundiage soleher Wandlung (K~mcAv). Besondere Bedeutung gewinnt bei einer bioehemisehen Betraeh- tung der Alternsprobleme eine wohl prim/~re Leistungs- /~nderung der Mesenchymzelle (HAvss), welehe die Grundsubstanz des Bindegewebes und sekundgr die Parenehymzellen des Histion in MitMdensehaft ziehen kann. Die ~nderung des Bindegewebsstoffweehsels im AlternsprozeB wurde yon DZIEWIATKOWSKI, DYRBYE, DA¥IDSOlg e t a l . , BOSTRtiM, LAYTON e t a l . sowie yon I ~ u s s , J v ~ - H f f ~ s ~ u. Sc~vnz~ am Sulfateinbau in Chondroitinschwefelsi~ure untersueht.

I n de r vorliegenden Arbeit wird an gat tenherzen gepriift, ob bei einzeinen, definierten Syntheseschritten hn Sulfatstoffwechsel eine alternsabhi~ngige Xnderung der Enzymaktiviti~t erkennbar ist. Der Einbau yon Sulfat in grSBere Molekfile (z. B. Chondroitinsulfat, Heparitinsulfat, Steroidsulfat) geschieht im Organis- mus naeh einem generellen Schema ffir biochemische Transportvorg~nge ( L ~ ) :

In einem ersten Schritt wird eine anorganisehe oder organische Gruppe von, ,akt ivierenden" Enzymen in energiereieher Bindung an einen Donator gekoppelt (Aktivierung). Die jetzt aktivierte Gruppe wird im zweiten Sehritt dem Donator yon anderen, ,,trans- ferierenden" Enzymen abgenommen und au~ einen Acceptor/ iber t rage n. So]che Vorg~nge linden vieler- orts im intermedi~ren Stoffweehsel s tart (vgl. die Stellung yon ATP oder Aeetyl-CoA).

Sul/ataktivierung Entspreehend diesem Transportsehema wird im

Organismus aueh das anorganische Sulfat intraeellul~ir erst in die aktivierte, energiereiehe Form, das sog. ,,aktive Sutfat" = Phosphoadenosinphosphosulfat - - PAPS ( L 1 r ~ x ) iiberffihrt. Hierffir sind zwei ge- trennte enzymatisehe Reaktionen notwendig, die die erforderliche Energie dem ATP entnehmen (L~e~AN~) :

Die erste Reaktion (G1. 1) ~Srd yon d~m Enzym ATP-Su]furylase katalysiert, das aus je 1 M01ekiil ATP und Sulfat Adenosinphosphosulfat (APS) und Pyro- phosphat (PP) formiert.

In der zweiten Reaktion (G1.2) wird dutch das Enzym APS-Kinase die Ca-Iiydroxylgruppe des ent- standenen APS phosphoryliert, wofiir ein zweites ATP- Molekiil Ms Donator d ien t . Beide Enzymreaktionen (G1.1 u. 2) k6nnen als PAPS-generierendes oder sulfat- al@ivierendes System (GI. 3) zusammengefaBt werden:

(1) ATP ~- S O g - ATP-Sulfurylase APS d- P P

(2) APS ~ ATP APS-Kinase PAPS ~- ADP

(3) 2 ATP d- SO~- ) PAPS + ADP -~ PP

* Die Deutsche Forschungsgemeinsehaft unterstfitzte in dankenswerter Weise die Arbeit.

Kiln, V/rsehr., 41. $ahrg.

Sul/atitbertragung I s t das anorganische Sulfat in alas ,,aktive SuKat"

iibergeffihrt, so steht der Schwefel in dieser, jetzt ener- ~ereiehen, Form f~r weitere biologisehe Reaktionen, z. B. ftir den Einbau in gr6Bere 5~olekiile des Binde- gewebes, etwa in Chondroitinsulfat A, B, C, Heparin oder Heparitinsulfat, bereit und ebenso ffir den Ein- bau in Steroide oder Phenole. Aueh die Sulfatiiber- tragung yore Donator iPAPS) auf den Acceptor, z. B Chondroitinsul~at, wird yon Enzymen katalysiert : Diese werden als Sulfokinasen (G1.4) bezeiehnet. Wahrseheinlich sind sie spezifiseh (L~r~xs~ et al., ADA~s u. MnA~Y) far das jeweilige AeeeptormolekfiL z . B ,

Chondroitinsulfat-Sulfokinase PAPS , Chondroitinsu]fat

(Donator) (Aeeeptor) Diese Reaktion ist nieht umkehrbar.

Der spezielIe enzymatisehe Sehritt ira Sulfatstoff- weehsel, der in der vorliegenden Arbeit untersueht wird, ist die Synthese yon a k t i v e m Sulfat (PAPS), die dutch die sulfataktivierenden Enzyme ATP-Sul- furylase und APS-Kinase katalysiert wird.

Methode~ a) Tiermaterial. Ffir die Versuche wurden 50 m~nntiche

Wistar-Ratten im Gewicht yon 32--526 g verwendet, wobei das KSrpergewicht einem LebensMter der Tiere yon etwa 20 Tagen bis zu 2 Jahren en~sprach. Die Tiere wurden mit Rattenpl~itzchen und Wasser ad libitum geffittert.

b) Enzymextrakt. Fflr die Untersuehung des PAPS-gene- rierenden Enzymsystems warden Tiere verschiedenen Alters getStet; die t~erzen wurden sofor~ entnommen mid in eis- kMter 0,1 M Phosphat-PufferlSsung yon pt~ 6,8 homogenisiert. Nachdem das Homogenat 45 rain bei 40000 UPM und 0°C im Rotor 40 einer pr~iparativen Ultrazentrifuge (Spinco) gesehleudert worden war, wurde der par~ikelfreie tJberstand, der das PAPS:generierende System enth~ilt, ffir die Aktivitiits- messung verwendet.

c) Inkubation. Der Ansatz zar Inkubation bestand aus: 0,1 ml 0,1 ~ ATP (in TRIS p~ 7,8), 0,1 ml 0,2 M. MgCl~, 0,02 ml I-I~O bzw. Tr~gersulfat in verschiedenen Konzen- trationen, 0,1 ml 1 M TRIS (PH 7,8), 0,7 ml Enzymextrakt, 0,007 ml tr~igerfreies SasO~ - (etwa 75 × i06 Imp./min).

Die Inkubation dauerte 15 rain bei 37 ° C. Nach Abstoppen der Enzymreaktion durch 2miniitiges Koehen wurde das In- kubationsgemisch 15 rain bei 0°C und 15000 × g in einer Christ-Kiihlzentrifuge geschleudert. Ein Aliquot des ?Jber- standes wurde mittels Itochspannungse]ektrophorese ge~rennt.

el) Hochspann.ungsetektrophorese. Die elektrophoretische Trennung geschah bei einer Spannung yon 40 V/em auf Sehleieher und Sehiill-Papier Nr. 2043 b Mgl. Die Laufzeit betrug 70 mill. Als PufferlSsung diente 0,07 M Citra.t-NaOH- Puffer la~ 5,9.

e) Messung der RadioaktivitSt. Naeh Beendigung der Elek- trophorese wurde die Verteilung der t~dioaktivit~it auf dem Papier zun~ehst orientierend mit einem Labor-Monitor, dann eingehend im Streifenz~Mgeriit and mit autoradiographischer Teehnik bestimmt. SehlieBlieh wurde fiir die qu&ntitative Auswertung die Radioaktivit~t yore Papier eluiert und im

Abktirzungen: ATP ~-- Adenosintriphosphat, ADP ~-~ Ade- nosindiphosphat, AMP ~ Adenosinmonophosphat, TRIS Tris(hydroxymethyI)aminomethan, APS = Adenosinphospho- sulfat, PAPS ~--- Phosphoadenosinphosphosulfat = ,,aktives Sulfat", PP = Pyrophosphat.

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Klinische 874 U~IeH G]~RnACH: Alternsabhangigkeit der Aktivitat su]fataktivierender Enzyme im Herzen Wochensehrif~

fensterlosen G~sdurchflu~z~hler gez~hlt. Die Radioaktivit~t ist in Imp./min/mg Protein des partfl~elfreien Enzymextraktes angegebem

Die Angabe ,Imp./min" ist das Ma~ fiir die Synthese yon PAPS ~ und APS ~ in der Inkubation und damit unter unseren Versuehsbedingungen ein Mal~ ffir die Aktivit~t der sulfat- aktivierenden Enzyme ATP-Sulfurylase und APS-Kinase. Die AJktivit~t ,,Imp./min" ist au~ 1 mg extrahiertes Protein (Biuret-l~ethode) bereehnet und ~st so auf den Gewebsgehalt an aktivem Enzym zu beziehen.

Abb. 1 . Verteilung der Radioak~ivit~t in einem Hoehspannungselektro- pherogramm mi t Inkubationsgemisch a m ]~nde der "Inkubationszeit (s. Text). Die Gipiel der t~adioaktivit~t entsprechen (in der Wanderangs- riehtung) Adenosinphosphosulfat (APS ~) und Phosphoadenosinphospho-

sulfat (PA:P~ ~)

5

4a ~5 4~m~, En~ym

kbb . 2. Proportionate Abh~ngigkeR der 8ynthese yon . a k t i v e m Sulfat" (PAPS ~) yon verschiedenen ~gngen des partikelfreien Herzextraktes.

Ordinate: PAPS~-Bi ldung pro Zeiteinheit

°

#

~ 2 oo ° , ~ I , I ] _ i , I

~0 220 JO0 JO0

o I

#~o Gr

Abb. 3, Alternsabh~ngige Aktivit~t der sulfataktivierenden Enzyme im Herzen yon Rat teu . Ordinate: PAPS~-Bi ldung pro Zeiteinheit

]) Prgparation yon radioal~tivem, akt~vem Sulfa~. Bei der Preparation und Reindarstellung von PAPS a~ folgten wir den methodischen Angaben yon F. L I P ~ et al. sowie SvzvK£ u. S ~ o ~ v , m Zun~ehst wurden die PAPS-generierenden Enzyme n~ch SvzuKz u. S~RO~r~E~ aus Hiihnereileitern gewormen: Aus legef'~higen Hiihnern wurde der Isthmus des Eileiters excidiert und in Saccharose homogenisiert. Im partikelfreien ~berstand des Homogenates befindet sieh das PAPS-generierende Enzymsystem. 5,0 ml Uberstand wurde mit 1,0 ml 1 NI TRIS-Puffer (p~ 7,8), 0,2 ml 0,1 N[ K~SO a, 1,0 ml 0,2 M l~gCl~, 1,0 ml 0,1 M ATP und 10 mC Sa50~ - bei 370 C inkubiert. Die Reaktion wurde naeh 90 rain dutch Kochen abgestoppt. Naeh Zentrifuga?~ion (15 min bei 18000 g und 0 e C) wurde der ~berstand an eine Chromatographies~ule mit Dowex 1 × 2 (200--400 mesh) adsorbier~. Die S~ule wurde sodann stufenweise zuerst mit 0,5 N[ NaC1-LSsung, dauaeh mit 1,0 IV[ NaC1-LSsung eluiert. Das Elu~t wurde "im Fraktionenkollektor gesammelt und au~ se~nen Gehalt an

PAPS ~5 gepriift. Die Fraktionen mit PAPS 35 wurden ver- einigt, an Kohle adsorbiert, gewaschen ~md mit einem Am- moniak-AlkohoI-Gemisch eluiert. Dieses Eluat wurde im Rotationsverdampfer eingeengt und der Rfickstand in 0,02 M Trispuffer (pg 7,8) aufgenommen. Die Reinheit des Praparates priiften wir im Hoehspannungselektropherogramm. Die Radio- aktivitgt des Pr~i, parates wurde im GasdurchfluBz~tfler, die Ausbeute an PAPS an Hand des molaren Extinktionskoeffi- zienten bestimmt. Die spezifische Aktivita.~ betrug 3 × 107 Imp./min//A~Iol PAPS sS.

Be/unde

1: Sul/atalctiv~ie~sndes E n z y m s y s t e m aus Herzmuskel . Zuerst sell gezeigt werden, dal~ aus dem Herzen

yon Ra t t en ein sulfataktivierendes E n z y m s y s t e m extrahiert werden kann.

Priift man am Ende des geschilderten Inkubabions- versuehes die elektrophoretisehe Verteitung der Radio- akt ivi tgt , so ergeben sich bei Registrierung mit einem Streifenz~hler die in Abb. 1 dargestell ten Verh~Itnisse: Man sieht zwei Gipfel der Radioakt ivi t~t . Diese ent- sprechen radioal~iven Verbindungen, die w~hrend der Inkuba t ion yon den Enzyme n des Herzmuskel- extraktes neu gebilde~ wurden. U m festzustellen, ob diese Verbindungen P A P S ss bzw. APS 35 entspreehen (wie in Abb. 1 eingezeiehnet), wurde zun~chst in einem gesonderSen Versuehsansatz ein PAPSSS-Pr~parat naeh L~PMA~ et al. synthetisiert und isoliert. Die elektro- phoretisehe Beweglichkeit des gereLrdgten PAPS-Prg - parates wurde mit dem radioakt iven Produk t ver- gliehen, das w~hrend der Inkuba t ion mi t Herzmuskel- ex t rakt entsteht . AuBerdem vergliehen wir das In- kubat ionsprodukt mi t der Wanderungsgeschwindigkeit yon ATP, A D P und AMP. Dabei zeigte sieh, da~] das radioakt ive Haup tp roduk t , das in unserem Inkuba- t ionsansatz mi t E n z y m e n des Herzmuskelextraktes aus SSS0~ - entsteht, die gleiehe Wanderungsgeschwin- digkeit ~de gereinigtes P A P S ~ hat . Verglichen rmt A T P , A D P und AMP wandert das I t a u p t p r o d u k t - - ebenso wie das gereinigte P A P S s~ - - sehneller und entspricht dami t der bekannten Mobflit~t.

Bei der Darstel lung des gereinigten P A P S ~ - P r a - parates Iallt aueh ein Tefl der , ,Vors tu fe" APS ~ an. Sie ha t die gleiehe Wanderungsgesehwindigkeit im Hoehspamuungsfeld wie der niedrigere Gipfet mi t Radioakt ivi t~t in Abb. 1, der den APS~-Antef l in unserem Ansatz mi t Herzmuskelext rakt darstellt."

U m festzustellen, ob unser Inkuba t ionsprodukt radioak~iv markiertes ChondroRinsu]fat ~ enthalt , wurde der ~bers tand , der naeh Abs toppen der In- kubationsperiode gewonnen wurde, in absteigender Papierehromatographie mi t dem LSsungsmittel Iso- but ters~ure-Ammoniak (ffinf Teile Isobu~ters~ure, drei Teile 0,5 n Ammoniak) aufgetrennt. Bei dieser Me- rhode bleibt vorhandenes Chondroitinsulfat an der Auftragstelle liegen, wogegen P A P S ~ und Sulfat ~ absteigend w~ndern, uncl zwar Sulfat rascher als P A P S (vgl. SVZUKz u. S T r O n G E r ) . Bei einer der- a r t i gen chromatographisehen Auf t rennung unseres Uberstancles nach Inkuba t ion zeigte sieh an der Auf- tragsstelle prakt isch keine Radioakt iv i ta t , w~hrend sieh - - bei autoradiographischer Darstellung - - die dem PAPS-Gipfe l in Abb. 1 entspreehende Radio- ~ktiVitat vor dem anorganisehen Sulfat wiederf~nd. D a r a u s ]st zu sehliel~en, da~ in der Inkuba t ion keine wesentliehe Markierung yon Polysaeeharidsulfat ein- t r i t t .

Jg. 41, Heft 17 UL~ICJ~ G ~ c ~ : Alternsabh~ngigkeit der Aktivit~t sulfataktivierender Enzyme im Herzen 875 1. September 1963

Um zu prfifen, ob grSBere Mengen yon eventuell nieht markiertem Polysaeeharidsulfat in unserem partikelfreien l~lberstand vorhanden sind, wurde ein Aliquot des ~berstandes nach Spineozentrifugation auf Papier mit Gentianaviolett behandelt. Naeh Waschen in Alkohol blieb eine F~rbung der auf- getragenen Probe aus. Naeh dem Ergebnis dieses Versuches sind aueh grSBere Mengen von nicht mar- kier~em Polysaccharidsulfat in unserem ~ s a t z aus- zuschliegen.

In einem weiteren Versuch sollte kontrolliert werden, ob die PAPS-Synthese unter den geschilderten Versuchsbedingungen der eingesetzten Enzymmenge proportional ist. Deshalb wurde gemessen, wieviel PAPS a~ yon versehiedenen Mengen ein und derselben Enzymprgparation gebildet wird: Die Abb. 2 zeigt, dab in den angegebenen Grenzen die PAPS-Synthese der Enzymmenge proportional ist.

Fehlt im Inkubationsansatz ATP, finder m a n --- wie nach dem Reaktionsschema zu erwarten - - keine meBbare Synthese yon PA]?S a~.

Bei der Inkubation yon tterzextrak~ mit radio- aktivem, aktivem Sulfat, das mit Enzymen aus Hfihnereileiter hergestellt wurde, kann gemessen wer- den, wieviel vorgelegtes aktives Sulfat (PAPS ~a) w/~h- rend der Versuehsdauer gespMten wird und ob diese Spaltungsrate mit Extrakten aus Herzen yon Tieren versehiedenen Alters unterschiedlich is}. Es wurde festgestellt, dab keine alternsabhiingige Differenz besteht, was fiir die Beurteilung unserer Versuehs- ergebnisse wesentlich ist. Die Spaltungsrate selbst liegt in unserer Versuehsanordnung unter 10%.

Aus den bisher mitgeteilten Befunden ergibt sieh, dab aus Rattenherzen ein Enzymsystem extrahiert werden kann, das in dem geschflderten Inkubations- versuch aktives Sulfat (PAPS) synthetisiert. Das Ex- periment kann so angesetzt werden, dab die Aktivit/~t der PAPS-generierenden Enzyme limitierend fiir die Syntbeserate ist, so dab die AktLdtg~ dieser Fermente in" den Herzen verschiedener Tiere verglichen werden k&nn.

2. Ein/lufi des Lebensalters an/da~ sul/atalctivierende Enzymsystem im Herzen.

Nachdem gezeig~ wurde, dab die Aktiviti~t der sulfataktivierenden Enzyme im Rattenherzen ge- messen werden karm, wird jetzt dargestellt, w~e sieh die Aktiviti~t dieser Fermente mit dem Lebensalter der Tiere ver£ndert. Diese Untersuehung wurde an 16 Rat ten im Alter yon etwa 20 Tagen bis zu 2 Jahren, entspreehend einem K6rpergewicht zwisehen 32 und 526 g, durehgeffihrt.

Wie die Abb. 3 demonstriert, findet'sieh die h6chste Enzymaktivitgt bei den jfingsten Tieren. Mit steigen- dem Lebensalter sinkt die Fermentaktivit~t auf weniger als ein Viertel ab. Dabei sind in~ alterns- abh/ingigen Verlauf der Aktivitgtskurve deutlich zwei Phasen erkennbar: In der Lebensperiode zwisehen 32 und 150 g K6rpergewieht f~llt die Aktivit/~tskurve der sulfataktivierenden Enzyme stefl ab, wogegen die Fermenta,ktivit/it in dem dann folgenden Lebens- absehnitt nur noch langsam abnimmt.

Diskussion Die mitgeteilten Be]unde erweisen, dab aus dem

Herzen sulfat~ktivierende Fermente extrahiert werden k6nnen, und dab die Aktivit~t dieses Enzymsystems

an der Synthese yon markiertem ,akt iven Sulfat" quantitativ meBbar ist. Bei Anwendung dieser Ver- suchstechnik an Rat~en verschiedenen Alters zeigte sieh, dab die Aktivit~t des sulfutaktivierenden Enzym- systems vom Lebensalter der Versuchstiere abMingt, und dab die alternsabh~ngige Aktivitiitskurve ex- ponentiell verl~nft.

Es I/illt auf, dag die hSehste Enzymaktivit/i t bei den jugendliehen Tieren mi~ st/~rks~em Wadhstum ge- messen wurde, und dab yon einem Reifepunkt ab - - etwa 150 g K6rpergewieht - - die Fermentaktivit/~t sich nur noch langsam welter vermindert. Die erste Wachstumsperiode ist naturgemi~g mit zahlreiehen Synthesevorg~ngen im Proteinstoffwechsel verbunden. F/Jr diese Leistungen ist die Zelle mit entspreehenden Enz~nen a.usgestat~e~. Die Synthese der Enzyme selbst stellt wieder einen Spezialfall der gesamten Eiweil]synthese dar und ist wie diese yon Desoxyribo- nucleinsgure fiber Ribonuc]eins~uren gesteuert.

Im waehsenden Organismus nehmen Zellzahl und Organgr6ge zu. Bedeutsamen Anteil am Aufbau eines jeden Histion hat das Bindegewebe, das die einzelnen Zellen, ZeIlverb~nde, Gewebe und Organe umsehlieBt. Die Mesenchymzellen des Bindegewebes produzieren die Grundsubst, anz, die reich an Polysaccharidsulfa£ ist und als Transitst, reeke dem Stofftransport dient (HAvss); im Rahmen der ,,unspezi~ischen Mesenchym- reaktion" (ItAvss u. JU~OE-HffLSIN(~) beeinfluBt das Bindegewebe die funktionelle Leistung der Organe.

Die Bildung neuen Bindegewebes w~hrend der Waehstumsperiode durch die Mesenehymzellen er- fordert u .a . die Synthese yon Polysacchariden, die under Vermittlung des ,,aktiven. Sulfates" sulfatiert werden. Es ist verst~ndlich, dag in dieser Periode der Gewebsgehalt an sulfataktivierenden Enzymen besonders hoeh ist.

Mit zunehmendem Alter verlangsamen die syn- thetisierenden Prozesse a]lmghli.ch. Die Zellzahl der Organe vermindert sich (HILZ i. Auch die Synthese yon Enzymen ist eingeschrgnkt (RICHTERICg, K i ~ - NAY). In diesen generellen Vorgang ffigt sich unser Be/und, nach dem der Gehalt des tterzens an sulfat- aktivierenden Fermenten w/ihrend des Alterns ab- sinkt. Die alternsabMngige Aktivit~tsiinderung der sulfataktivierenden Enzyme erklgrt sieh aus der ver- /~nderten Leistung des alternden Gewebes. Unsere Be- obachtung ist ein weiterer Hinweis daffir, dab die Kenntnis der Enzymmuster a~ ein Urteil fiber bi0logi- sche Alternsvorg/inge in einem Gewebe erlaubt.

Zusammen]assung. Aus Rattenherzen wurde ein sulfataktivierendes Enzymsystem extrahiert.

Hiermit konnte bei Verwendung yon $350i - mar- kiertes ,,a.ktives Sulfat" ( L I p ~ - ~ ) synthetisiert werden.

Es zeigte sich,dag die Aktiviti~t des Enzymsystems yore LebensMter der Versuchstiere abh~ngig ist. Die biologisehe Bedeutung des Befundes wird besprochen.

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Die Haltbarkeit der Serum-Kreatin-Phosphokinase Von

HAI~s-WERNE]~ ROTTHAUWE u n d MANUEL CERQUEmO*

Aus der Universit~tts-KinderkIinik Bonn

Auf die Instabilit~,t der Kreatin-Phosphokinase (KPK) im Serum wurde schon van COLOMBO et al. 3, KAFFARh~IK und KLAUS 6 sowie anderen Untersuehern hingewiesen. Systematisehe Untersuchungen fiber die Abh£ngigkeit der KPK-Aktivitgt im Serum yon Auf- bewa, hrungsdauer und -temperatur liegen abet bislang nieht vor. Wegen der zunehmenden diagnostisehen Bedeutung der KPK sind derartige Untersuchungen aber dringend erforderlieh, da erfahrungsgemi~ nieht selten sehr untersehiedliche Zeiten zwisehen B]utab- nahme, Serumgewinnung und Aktivit~tsbestimmung liegen. Aul~erdem werden Blur und Serum in den ver- sehiedenen Kliniken und Laboratorien oft bei sehr differierenden Temperaturen bis zur Weiterverarbei- tung aufbewahrt. Haufig hande]t es sich bei den zu analysierenden Proben auch um Einsendematerial. Eine Aktivitatsbestimmung hut aber nur dann diagno- stisehen ~Wert, wenn siehergestellt ist, da~ es wghrend der Aufbewahrung nieht zu einem wesentlichen Akti- v i t i ~ t s v e r l u s t g e k o m m e n is t , z u m a l w e n n ks s ich u rn S e r u m p r o b e n m i t n i ed r ige r A u s g a n g s a k t i v i t ~ t h a n d e l t .

Methodi]~ Es wurden die Aktiviti~tsverluste ermittelt, die bei

verschieAener Aufbewahrungsdauer und Aufbewah- nmgstemperatur uuftreten. Die Untersuchungen wur- den an sechs Se ren y o n P a t i e n t e n m i t p rog re s s ive r M u s k e l d y s t r o p h i e d u r c h g e f i i h r t . D a s S e r u m ~ m r d e

* TechnLsehe Assistenz: H. HA~2~A~.

(Direktor: Prof. Dr. H. H~C~SR~AND)

genau 30 rain n~eh der Blutabn~hme durch 10 rain langes Zentrifugieren bei 4000---5000 Touren abge- trennt. Unmittelbar darauf wurde die KPK-Aktivit~t gemessen und gleiehzeitig der Rest des Serums in zwSIf RShrchen aufgeteilt. Je vier der lest versehtos- senen R6hrchen warden bei ~20°C (ZimmeI~empera- fur), d-4°C (Kiihlschr~nk) und --160C (Tiefk/ihl- truhe) aufbewahrt. 6, 24 und 48 Std sowie eine Woche sparer wurde in je einem RShrchen die Aktivit~t er- neut bestimmt. Die Aktivit~tsbestimmung wurde n aeh ROT~HAUW~ et al. 12 im optisehen Test (,,Hin- reaktion") vorgenommen. Die sofort nach Serumge- winnung gemessene Akti~dtgt wurde gleieh ]00% ge- setzt und alle spi~teren Ergebnisse in % des Ausgangs- wer~es ausgedrfiekt. Ffir die jeweils sechs Werte wur- den das arithmetisehe Mittel und die Standard&bwei- ehung bereehnet. Aui3erdem wurde die KPK-Aktivit~t in vier weiteren Seren sofort und nach 6stfindiger Aufbew~hrung im Eisb~d ermittelt.

Ergebnisse und Disl~ussion A b b . I zeig~ das A b s i n k e n de r A k t i v i t ~ t t ier S e r u m -

K P K bei d e n d re i v e r s e h i e d e n e n T e m p e r a t u r e n inner - h a l b e iner W o e h e . B e i Z i m m e 2 t e m p e r a t u r u n d -~4°C t r a t sehr r a s e h t i n A k t i v i t ~ t s v e r l u s t t i n , d e r be i 20°C n a c h 6 S t d r u n d 55% u n d n a e h 24 S t d e t w a 75% be t rug . B e i de r f ib l iehen K f i h ] s e h r ~ n k t e m p e r a t u r y o n d 4 0 C h a t t e die K P K n a e h 6 S t d 15% l ind n a e h 24 S t d 35% ih re r A n s g a n g s a k t i v i t ~ t e ingebfiBt . D ie A k t i v i - t g t s a b n a h m e in d e n f o l g e n d e n 6 T a g e n w a r d a n n