Übungen Zellbiologie und Physiologie - uni-muenster.de · Woche 1 Chromatographie AG Hippler 1....

62
Übungen Zellbiologie und Physiologie Sommersemester 2014 Primär- wurzel Spross- meristem Aleuron- schicht Samen- schale GA Scutellum Endosperm (Stärke u.a. Reservestoffe) Zucker -Amylasen Embryo

Transcript of Übungen Zellbiologie und Physiologie - uni-muenster.de · Woche 1 Chromatographie AG Hippler 1....

1

Übungen Zellbiologie und Physiologie

Sommersemester 2014

Primär- wurzel

Spross- meristem Aleuron-

schicht

Samen- schale

GA

Scutellum

Endosperm (Stärke u.a. Reservestoffe)

Zucker

-Amylasen Embryo

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und

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fe si

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zen

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Lau

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-

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olya

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Vor

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t, da

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eich

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isch

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t ger

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enad

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ensc

hafte

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n.

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omat

ogra

phie

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Um

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mit

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Wec

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st z

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acer

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rote

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en

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en.

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und

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ch e

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elle

nden

Gle

ichg

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htes

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(rev

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ber

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stel

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ein

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leic

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des

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. Nur

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zu r

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e Su

bsta

nz i

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halb

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er s

char

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de a

uf d

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foku

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sic

h gr

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ich

zwei

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chie

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r Ver

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en b

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nen:

Was

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z (z.

B. e

in P

rote

in) d

abei

nic

ht d

enat

urie

rt

bzw

. and

erw

eitig

ges

chäd

igt w

ird.

4. G

röße

naus

schl

ußch

rom

atog

raph

ie

Die

ses

auch

Gel

filtra

tion

oder

Gel

perm

eatio

n ge

nann

te V

erfa

hren

tren

nt S

ubst

anze

n au

fgru

nd

ihre

r un

ters

chie

dlic

hen

Grö

ße.

Der

gen

aue

Mec

hani

smus

ist

bis

heu

te n

icht

im

Det

ail

vers

tand

en, j

edoc

h gi

bt e

s ein

e se

hr g

ute

Mod

ellv

orst

ellu

ng ü

ber d

en T

renn

vorg

ang.

Abb

. 2: S

pace

r erm

öglic

hen

die

Bin

dung

eine

s grö

ßere

n Pr

otei

nkom

plex

es

- 14

-

Woc

he 1

Chr

omat

ogra

phie

A

G H

ippl

er

Eine

Gel

filtra

tions

säul

e be

steh

t au

s ei

nem

sch

wam

mar

tigen

Gel

mit

Pore

n m

it de

finie

rtem

Grö

ßenb

erei

ch. M

olek

üle,

die

so

groß

sin

d, d

aß s

ie n

icht

in d

iese

Por

en d

iffun

dier

en k

önne

n,

wer

den

auf

kürz

este

m W

eg u

nd d

esha

lb

sehr

schn

ell e

luie

rt. M

olek

üle,

die

so k

lein

sind

, daß

sie

gut i

n di

e Po

ren

des M

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diff

undi

eren

kön

nen,

lege

n be

i der

Elu

tion

eine

se

hr

lang

e St

reck

e zu

rück

un

d

elui

eren

ent

spre

chen

d sp

ät.

Mitt

elgr

oße

Mol

ekül

e, d

ie i

n ei

nige

, ab

er n

icht

alle

Pore

n di

ffun

dier

en

könn

en,

elui

eren

dem

zufo

lge z

wis

chen

den

gan

z gro

ßen

und

den

ganz

kl

eine

n M

olek

ülen

. D

ie

Tren

nsch

ärfe

ein

er s

olch

en S

äule

nim

mt

mit

ihre

r Län

gezu

.

Der

Ein

satz

bere

ich

eine

s so

lche

n G

els

häng

t zu

dem

von

der

mol

ekul

aren

Aus

schl

uß-

und

Eins

chlu

ßgre

nze

ab. D

iese

Wer

te h

änge

n vo

n de

r Grö

ßenv

erte

ilung

der

Por

en im

Gel

mat

eria

l

(der

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rix) a

b. D

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rößt

en P

oren

def

inie

ren

die

Aus

schl

ußgr

enze

, alle

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ekül

e, d

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u gr

sind

, um

sel

bst

in d

iese

Por

en z

u di

ffun

dier

en,

elui

eren

gem

eins

am f

rüh

von

der

Säul

e

(„V

orla

uf“)

. Die

kle

inst

en P

oren

def

inie

ren

ents

prec

hend

die

Ein

schl

ußgr

enze

, alle

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ekül

e,

die

so k

lein

sin

d, d

aß s

ie s

elbs

t in

die

se P

oren

diff

undi

eren

kön

nen,

elu

iere

n eb

enfa

lls

gem

eins

am s

pät

von

der

Säul

e. N

ur M

olek

üle,

der

en G

röße

n zw

isch

en A

ussc

hluß

- un

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Eins

chlu

ßgre

nze

der

Mat

rix l

iege

n, k

önne

n m

it di

esem

Säu

lenm

ater

ial

gem

äß i

hrer

Grö

ße

getre

nnt w

erde

n. In

der

Pra

xis

char

akte

risie

rt m

an e

ine

solc

he S

äule

dur

ch d

rei v

ersc

hied

ene

Vol

umin

a:

1. d

as G

esam

tvol

umen

der

Säu

le V

t

2. d

as V

olum

en w

elch

es d

as G

el e

inni

mm

t Vx

3. d

as V

olum

en d

er u

mge

bend

en L

ösun

g V

0

V0

wird

auc

h al

s A

ussc

hluß

volu

men

bez

eich

net

und

nim

mt

in

der

Reg

el

ca.

35

%

des

Ges

amtv

olum

ens e

in. D

as A

ussc

hluß

volu

men

ist d

ie M

enge

an E

luat

, die

übe

r die

Säu

le fl

ieße

n

Abb

. 3 :

Tren

nung

von

kle

inen

und

gro

ßen

Mol

ekül

en m

it de

r

Gel

filtra

tions

-Chr

omat

ogra

phie

.

Die

Mol

ekül

e si

nd s

chem

atis

ch a

ls k

lein

e un

d gr

oße

schw

arze

Kre

ise

wie

derg

egeb

en.

Abb

. 4: C

hara

keris

tisch

e G

röße

n ei

ner G

elfil

tratio

nssä

ule

- 15

-

Woc

he 1

Chr

omat

ogra

phie

A

G H

ippl

er

muß

, um

Mol

ekül

e je

nsei

ts d

er m

olek

ular

en A

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gren

ze z

u el

uier

en. E

in e

ntsp

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ende

r

Zusa

mm

enha

ng b

este

ht z

wis

chen

dem

Ges

amtv

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en u

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r Ein

schl

ußgr

enze

.

Das

Elu

tions

volu

men

(Ve)

eine

r Sub

stan

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t die

Men

ge a

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uat,

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zwis

chen

dem

Auf

gebe

n

der

Subs

tanz

und

ihre

m A

ustre

ten

über

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Säu

le f

ließt

. Pra

ktis

ch w

ird V

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das

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umen

best

imm

t, be

i dem

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hal

bmax

imal

e Pe

akhö

he (

erm

ittel

t übe

r B

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ungs

inde

x, b

iolo

gisc

he

Akt

ivitä

t usw

.) er

reic

ht is

t.

Mit

den

ange

gebe

nen

Grö

ßen

kann

dan

n au

f dre

i ver

schi

eden

e A

rten

der R

ückh

alte

grad

ein

er

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tanz

bes

chrie

ben

wer

den.

das

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tive

Elut

ions

volu

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(REV

)

Ve

REV

=

----

----

-

V0

die

Ret

entio

ns-K

onst

ante

(rez

ipro

ker W

ert v

on R

EV)

V

0

R =

--

----

--

V

e

der

Ver

teilu

ngsk

oeff

izie

nt K

d ode

r Kav

Ve -

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=

----

----

---

Vx

Am

häu

figst

en v

erw

ende

t wird

der

Ver

teilu

ngsk

oeff

izie

nt.

Abb

. 5 :

Abh

ängi

gkei

t der

Kav

-Wer

te

vers

chie

dene

r Pro

tein

e vo

n de

ren

Mol

ekul

arge

wic

hten

exe

mpl

aris

ch

für e

in b

estim

mte

s Gel

mat

eria

l

(Sep

hade

x G

200

)

Aus

schl

ußgr

enze

:

Ve =

V0

Kav

= 0

Eins

chlu

ßgre

nze:

Ve =

Vt

Kav

= 1

- 16

-

Woc

he 1

Chr

omat

ogra

phie

A

G H

ippl

er

5. lo

nena

usta

usch

- Chr

omat

ogra

phie

Die

Ion

enau

stau

sch-

Chr

omat

ogra

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ist

ein

e be

sond

ere,

seh

r w

eit

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reite

te F

orm

der

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initä

tsch

rom

atog

raph

ie, b

ei d

er re

lativ

uns

pezi

fisch

e io

nisc

he W

echs

elw

irkun

gen

zwis

chen

den

zu tr

enne

nden

Sub

stan

zen

und

eine

r (p

ositi

v od

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egat

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gela

dene

n M

atrix

aus

genu

tzt

wer

den.

Mit

dies

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rt de

r Chr

omat

ogra

phie

kön

nen

som

it nu

r gel

aden

e Su

bsta

nzen

get

renn

t

wer

den.

Bei

der

Ion

enau

stau

sch-

Chr

omat

ogra

phie

bef

inde

n si

ch a

n ei

ner

poly

mer

en M

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gela

dene

fu

nktio

nelle

G

rupp

en.

An

dies

e ge

lade

nen

Gru

ppen

si

nd

reve

rsib

el

Geg

enio

nen

gebu

nden

. M

an

unte

rsch

eide

t gr

unds

ätzl

ich

zwis

chen

K

atio

nen-

un

d

Ani

onen

aust

ausc

hern

. B

eim

Kat

ione

naus

taus

cher

sin

d di

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funk

tione

llen

Gru

ppen

der

Mat

rix n

egat

iv g

elad

en u

nd

bind

en

dahe

r (p

ositi

v ge

lade

ne)

Kat

ione

n,

beim

Ani

onen

aust

ausc

her

sind

die

Lad

ungs

verh

ältn

isse

gen

au

entg

egen

gese

tzt.

Solc

he f

unkt

ione

llen

Gru

ppen

kön

nen

im

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ein

es K

atio

nena

usta

usch

ers

Car

boxy

l-Gru

ppen

(z.

B.

CM

-Sep

hade

x),

im

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ei

nes

Ani

onen

aust

ausc

hers

Am

inog

rupp

en (

z.B

. D

EAE-

Cel

lulo

se)

sein

. D

ie M

atrix

solc

her

Aus

taus

cher

bes

teht

wie

im

Fal

le d

er A

ffin

itäts

-Chr

omat

ogra

phie

aus

Zuc

kern

(Sep

haro

se, C

ellu

lose

usw

.), P

olys

tyro

len

oder

Pol

yam

iden

.

Nac

h Pr

oben

auftr

ag v

erdr

änge

n nu

n di

e zu

tren

nend

en g

elad

enen

Mol

ekül

e (I

onen

) der

Pro

be

die

reve

rsib

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ange

lage

rten

Geg

enio

nen

der f

unkt

ione

llen

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ppen

und

bind

en s

o an

die

Mat

rix.

Die

ser

„Ion

enau

stau

sch“

fin

det

natü

rlich

nur

stat

t, w

enn

die

zu tr

enne

nde

Subs

tanz

fest

er a

n di

e fu

nktio

nelle

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ppe

der

Mat

rix b

inde

t als

das

Geg

enio

n. A

uch

hier

ha

ndel

t es

si

ch

um

eine

Gle

ichg

ewic

htsr

eakt

ion.

D

ie

Bed

ingu

ngen

be

im

Prob

enau

ftrag

müs

sen

also

so

gew

ählt

wer

den,

daß

das

Gle

ichg

ewic

ht w

eit

auf

der

Seite

der „

Bin

dung

“ lie

gt.

Abb

. 6: T

ypis

che

funk

tione

lle G

rupp

en

an A

nion

enau

stau

sche

rn (o

ben)

und

Kat

ione

naus

taus

cher

n (u

nten

)

- 17

-

Woc

he 1

Chr

omat

ogra

phie

A

G H

ippl

er

Bei

der

ans

chlie

ßend

en E

lutio

n m

acht

man

sich

zun

utze

, daß

die

Bin

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sstä

rke

nich

t nur

von

der f

unkt

ione

llen

Gru

ppe

der M

atrix

und

dem

geb

unde

nen

Mol

ekül

abh

ängi

g is

t, so

nder

n au

ch

durc

h di

e U

mge

bung

sbed

ingu

ngen

bee

influ

ßt w

erde

n ka

nn.

So i

st d

ie B

indu

ngss

tärk

e u.

a.

abhä

ngig

von

der

Ione

nstä

rke

der m

obile

n Ph

ase.

Die

lone

nstä

rke

eine

r Lös

ung

ist w

ie fo

lgt d

efin

iert:

25,0

ii

zc

c i

ist d

abei

die

mol

are

Kon

zent

ratio

n un

d z i

die

Ladu

ng d

er S

ubst

anz

i.

Dad

urch

ist

es

mög

lich,

mit

eine

m a

ufst

eige

nden

Kon

zent

ratio

nsgr

adie

nten

ein

es I

ons

die

gebu

nden

e Su

bsta

nz

wie

der

zu

elui

eren

, da

be

i ge

nüge

nd

hohe

n lo

nens

tärk

en

das

Gle

ichg

ewic

ht d

er B

indu

ngsr

eakt

ion

auf

die

Seite

der

Dis

sozi

atio

n ve

rlage

rt w

ird:

das

zur

Elut

ion

benu

tzte

Ion

konk

urrie

rt m

it de

r zu

trenn

ende

n Su

bsta

nz u

m d

ie fu

nktio

nelle

n G

rupp

en

der M

atrix

. Die

Bin

dung

sstä

rke

eine

r Sub

stan

z zu

den

funk

tione

llen

Gru

ppen

ein

er M

atrix

ist

unte

r ge

gebe

nen

Bed

ingu

ngen

ein

e ch

arak

teris

tisch

e St

offk

onst

ante

. D

emzu

folg

e ka

nn m

it

eine

m G

radi

ente

n de

s Elu

tions

-Ion

s ein

e Tr

ennu

ng e

ines

Sub

stan

zgem

isch

es e

rfol

gen,

da

jede

s

gebu

nden

e M

olek

ül im

Idea

lfall

bei e

iner

spe

zifis

chen

lone

nstä

rke

im E

luen

ten

von

der S

äule

gelö

st w

ird.

Obi

ge B

etra

chtu

ngen

gel

ten

nich

t nu

r fü

r kl

eine

Mol

ekül

e m

it ei

ner p

ositi

ven

oder

neg

ativ

en L

adun

g,

sond

ern

auch

r gr

oße

Mol

ekül

e m

it vi

elen

Ladu

ngen

. Pr

otei

ne

z.B

. kö

nnen

an

ih

ren

Seite

ngru

ppen

so

woh

l po

sitiv

e al

s au

ch

nega

tive

Ladu

ngen

trag

en, s

ie z

eich

nen

sich

abe

r im

mer

dur

ch

eine

eind

eutig

e Net

tola

dung

aus.

Im F

alle

der

Pro

tein

e

ist

dies

e N

etto

ladu

ng

vom

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-Wer

tdes

Lösu

ngsp

uffe

rs

abhä

ngig

. O

berh

alb

des

Isoe

lekt

risch

en P

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es (p

I ode

r IEP

) lie

gt e

in P

rote

in

mit

nega

tiver

Net

tola

dung

vor

, dar

unte

r mit

posi

tiver

Net

tola

dung

. Am

Isoe

lekt

risch

en P

unkt

glei

chen

sich

die

pos

itive

n un

d ne

gativ

en L

adun

gen

aus,

die

Net

tola

dung

ist n

ull.

Abb

. 8: E

influ

ss d

es p

H-W

erte

s auf

die

Net

tola

dung

eine

s Pro

tein

s

- 18

-

Woc

he 1

Chr

omat

ogra

phie

A

G H

ippl

er

Die

s rüh

rt vo

n de

r unt

ersc

hied

liche

n Io

nisi

erba

rkei

t der

ein

zeln

en A

min

osäu

ren

eine

s Pro

tein

s

her,

die

je n

ach

dem

pH

-Wer

tder

Um

gebu

ng n

eutra

l, po

sitiv

ode

r neg

ativ

gel

aden

sein

kön

nen.

Die

Lad

ung

der

auf

der

Obe

rflä

che

des

Prot

eins

exp

onie

rten

Am

inos

äure

n ad

dier

en s

ich

zur

effe

ktiv

en N

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ladu

ng d

es P

rote

ins.

Wäh

lt m

an e

inen

gee

igne

ten

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ertla

ssen

sic

h al

so

Prot

eine

sow

ohl a

n ei

nen

Kat

ione

n-, a

ls a

uch

an e

inen

Ani

onen

aust

ausc

her b

inde

n.

Eine

wei

tere

Anw

endu

ng f

inde

t di

eses

Phä

nom

en b

ei d

er T

renn

ung

von

Prot

eine

n m

it

sign

ifika

nt u

nter

schi

edlic

hen

Isoe

lekt

risch

en P

unkt

en, S

o lä

ßt s

ich

ein

pH-W

ertfi

nden

, bei

dem

das

eine

Pro

tein

ein

e ne

gativ

e N

etto

ladu

ng, d

as a

nder

e ab

er e

ine

posi

tive

Net

tola

dung

bes

itzt.

Unt

er d

iese

n B

edin

gung

en b

inde

t das

neg

ativ

gel

aden

e Pr

otei

n an

ein

en A

nion

enau

stau

sche

r,

das

posi

tiv g

elad

ene

Prot

ein

dage

gen

nich

t meh

r. Eb

enso

läßt

sic

h üb

er e

ine

Ver

ände

rung

des

pH-W

erte

s ein

an

den

Ione

naus

taus

cher

geb

unde

nes P

rote

in w

iede

r elu

iere

n.

6. G

asch

rom

atog

raph

ie

Die

G

asch

rom

atog

raph

ie

oder

G

as/F

lüss

igke

its-C

hrom

atog

raph

ie

ist

eine

ex

trem

leis

tung

sfäh

ige A

rt de

r Ver

teilu

ngsc

hrom

atog

raph

ie. I

hre N

acht

eile

bes

tehe

n da

rin, d

aß si

ch ih

r

Eins

atzg

ebie

t auf

Sub

stan

zen

mit

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tiv h

ohem

Dam

pfdr

uck

besc

hrän

kt, d

.h. a

uf S

ubst

anze

n

die

leic

ht v

erda

mpf

bar s

ind,

und

daß

sie

nur

im a

naly

tisch

en, n

icht

im p

räpa

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en M

aßst

ab

durc

hfüh

rbar

ist.

Das

Prin

zip

beru

ht a

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er V

erte

ilung

ein

es S

toff

es z

wis

chen

ein

er st

atio

näre

n Fl

üssi

gkei

t und

eine

r m

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asph

ase.

Hie

rfür

wird

als

sta

tionä

re P

hase

ein

e sc

hwer

ver

dam

pfba

re

- 19

-

Woc

he 1

Chr

omat

ogra

phie

A

G H

ippl

er

Flüs

sigk

eit a

n di

e In

nenw

and

eine

r meh

rere

Met

er la

ngen

Kap

illar

e ad

sorb

iert.

Die

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are

wird

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eine

m in

erte

n G

as d

urch

strö

mt,

wel

ches

die

mob

ile P

hase

dar

stel

lt. G

ebrä

uchl

ich

sind

hier

für N

2, H

e od

er H

2. D

as z

u tre

nnen

de S

ubst

anzg

emis

ch w

ird im

Inje

ktor

so

star

k er

hitz

t,

daß

es v

erda

mpf

t, un

d da

nn m

it de

m in

erte

n G

as d

urch

die

Kap

illar

e ge

leite

t. Es

ste

llt s

ich,

anal

og z

ur D

C,

ein

Ver

teilu

ngsg

leic

hgew

icht

zw

isch

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tatio

näre

r flü

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nd m

obile

r

gasf

örm

iger

Pha

se e

in, d

esse

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tat e

ine

unte

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iedl

iche

Wan

deru

ngsg

esch

win

digk

eit d

er

vers

chie

dene

n Su

bsta

nzen

in

der

Kap

illar

e is

t. A

ls D

etek

tore

n di

enen

unt

er a

nder

em

Flam

men

ioni

satio

nsde

tekt

oren

(F

ID)

oder

M

asse

nspe

ktro

met

er

(MS)

am

A

usga

ng

der

Kap

illar

e.

7. B

emer

kung

en z

um H

PLC

ode

r FP

LC

Ver

fahr

en

Bei

die

sen

Ver

fahr

en h

ande

lt es

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nic

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iear

ten,

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ierte

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Die

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und

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äule

nlän

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u. G

leic

hzei

tig h

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nken

bei

her

köm

mlic

her A

nwen

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abe

r auc

h

die

Dur

chflu

ßrat

en, s

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ß de

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orde

rlich

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itauf

wan

d so

gro

ß w

ird, d

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Tren

nung

bei

der

ents

prec

hend

gro

ßen

Tren

nsch

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ktis

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t. B

ei e

iner

HPL

C (

=

high

pres

sure

liqu

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rom

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raph

y)-A

nlag

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nun

die

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chflu

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e mitt

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Drü

cke

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n. D

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erm

öglic

ht e

ine

Tren

nung

in

eine

m r

elat

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urze

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itrau

m b

ei

glei

chze

itig

hohe

r Tr

enns

chär

fe.

Prin

zipi

ell

aber

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ner

HPL

C-A

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e je

des

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ench

rom

atog

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ie-V

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me

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Bei

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C (=

fast

prot

ein

liqui

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rom

atog

raph

y) si

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ie V

erhä

ltnis

se se

hr äh

nlic

h. A

uch

hier

wird

mitt

els P

umpe

n di

e D

urch

flußr

ate

kons

tant

geh

alte

n, je

doch

wer

den

bei w

eite

m n

icht

so

hohe

D

rück

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fgeb

aut.

Die

FP

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wird

da

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auch

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PLC

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er

Mitt

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Chr

omat

ogra

phie

gen

annt

. Typ

isch

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eise

die

nt d

ie F

PLC

der

Auf

rein

igun

g vo

n

Prot

eine

n in

w

äßrig

en

Elue

nten

, di

e H

PLC

eh

er

der

Auf

trenn

ung

nied

erm

olek

ular

er

Subs

tanz

en, m

eist

in o

rgan

isch

en L

ösun

gsm

ittel

n.

- 20

-

Woc

he 1

Chr

omat

ogra

phie

A

G H

ippl

er

Ver

such

sdur

chfü

hrun

g

Das

Prin

zip

der

Ione

naus

taus

chch

rom

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ie s

oll

am B

eisp

iel

des

Häm

oglo

bins

gez

eigt

wer

den.

Häm

oglo

bin

ist d

as S

auer

stof

f-üb

ertra

gend

e Pr

otei

n im

Blu

tkre

isla

uf. E

s be

steh

t aus

vier

Unt

erei

nhei

ten,

die

jew

eils

ein

kov

alen

t geb

unde

nes E

isen

prot

opor

phyr

in (=

Häm

grup

pe)

trage

n. H

ierd

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ers

chei

nt e

s br

äunl

ich

gefä

rbt u

nd is

t dah

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chon

mit

bloß

em A

uge

gut z

u

erke

nnen

.

Zunä

chst

sol

len

die

äuße

ren

Bed

ingu

ngen

– d

ie g

ünst

igst

en p

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erte

für

Bin

dung

bzw

.

Elu

tion

des P

rote

ins u

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ie B

indu

ngsk

apaz

ität d

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äule

- be

stim

mt u

nd o

ptim

iert

wer

den,

um e

inen

erf

olgr

eich

en A

nsat

z zu

r Rei

nigu

ng d

es H

ämog

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ns a

us e

inem

Gem

isch

zu

finde

n.

Die

se V

orve

rsuc

he f

inde

n in

Epp

endo

rfre

aktio

nsge

fäße

n im

sog

enan

nten

bat

ch-V

erfa

hren

stat

t. D

ie g

ewon

nene

n Er

kenn

tnis

se s

olle

n da

nn g

enut

zt w

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n, u

m d

as H

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nüb

er

Säul

en m

it K

atio

nena

usta

usch

er-M

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aus

eine

m P

rote

inge

mis

chzu

iso

liere

n. D

as

verw

ende

te P

rote

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ch e

nthä

lt H

ämog

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n un

d da

s rö

tlich

gef

ärbt

e C

ytoc

hrom

c (

ein

Prot

ein

der

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ungs

kette

, w

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es

eben

falls

ei

ne

Häm

grup

pe

trägt

) in

gl

eich

en

Kon

zent

ratio

nen.

Ben

ötig

te G

erät

e:

„Sp

eckb

rettr

otor

“, T

isch

zent

rifug

e, E

ppen

dorf

gefä

ße m

it Sä

ulen

mat

eria

l, Ep

pend

orfp

ipet

ten

(200

-100

0μl,

20-

200μ

l),

Phot

omet

er,

Küv

ette

n,

pH-M

eter

, ge

pack

te

Säul

en

mit

Car

boxy

met

hylc

ellu

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hade

x

(Kat

ione

naus

taus

cher

-Mat

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eage

nzgl

äser

, Pas

teur

pipe

tten,

Gum

mis

auge

r

Ben

ötig

te C

hem

ikal

ien:

100

ml 2

0 m

M T

ris-P

uffe

r (Tr

is-(

hydr

oxym

ethy

l)-am

inom

etha

n)

100

ml 2

0 m

M M

alei

nsäu

re-P

uffe

r (ci

s-B

uten

disä

ure)

Säul

enm

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arbo

xym

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lcel

lulo

se-S

epha

dex

vorg

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llen

Häm

oglo

bin-

Lösu

ng (5

mg/

ml)

Häm

oglo

bin/

Cyt

ochr

om c

-Gem

isch

(je

5 m

g/m

l)

Kal

ium

chlo

rid (M

olek

ular

gew

icht

74,

55 g

/mol

)

10 μ

l Asc

orbi

nsäu

re (1

00 m

M)

- 21

-

Woc

he 1

Chr

omat

ogra

phie

A

G H

ippl

er

Vor

vers

uch

1: B

estim

mun

g de

r ge

eign

eten

pH

-Wer

te fü

r B

indu

ng u

nd E

lutio

n

Um

zu

unte

rsuc

hen,

bei

wel

chem

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-Wer

t das

Häm

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bin

am S

äule

nmat

eria

l bin

det,

soll

zunä

chst

ein

e pH

-Rei

he m

it de

n pH

-Wer

ten

5 bi

s 9 h

erge

stel

lt w

erde

n. E

in P

uffe

r, de

r aus

den

beid

en K

ompo

nent

en T

ris u

nd M

alei

nsäu

re h

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stel

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ird, h

at e

inen

Puf

ferb

erei

ch v

on e

twa

pH 5

bis

pH

9. E

s w

ird d

er T

ris-P

uffe

r vor

gele

gt u

nd m

it de

m M

alei

nsäu

re-P

uffe

r titr

iert,

bis

er ei

nen

der g

ewün

scht

en p

H-W

erte

erre

icht

hat

. Auf

die

se W

eise

wer

den

alle

ben

ötig

ten

Puff

er

herg

este

llt. V

on je

dem

pH

-Wer

t wer

den

ca. 4

0 m

l in

eine

m 5

0 m

l Fal

con-

Tube

abg

efül

lt.

Fünf

Epp

endo

rfge

fäße

n m

it Sä

ulen

mat

eria

l (V

olum

en =

25 μl

) wer

den

mit

je 1

ml P

uffe

r ein

es

best

imm

ten

pH-W

erte

s ve

rseh

en u

nd 5

Min

uten

lang

am S

peck

bret

troto

r äq

uilib

riert.

Dan

n

wer

den

die

Eppe

ndor

fgef

äße

kurz

zen

trifu

gier

t (1

min

, 13

.000

rpm

), da

mit

sich

das

Säul

enm

ater

ial

am B

oden

abs

etzt

. D

er P

uffe

r w

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bpip

ettie

rt (A

ber

Vor

sich

t! D

as

Säul

enm

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ial n

icht

mit

abpi

pett

iere

n!),

durc

h fr

isch

en e

rset

zt u

nd d

ie Ä

quili

brie

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ein

zwei

tes M

al d

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gefü

hrt.

Die

Gef

äße

wer

den

nach

ern

eute

r A

bnah

me

des

Übe

rsta

ndes

mit

jew

eils

10 μl

der

rei

nen

Häm

oglo

bin-

Lösu

ng b

esch

ickt

und

mit

dem

ent

spre

chen

den

Puff

er a

uf 1

ml

aufg

efül

lt un

d

wie

derg

ut d

urch

mis

cht.

Die

Ein

stel

lung

des

Bin

dung

sgle

ichg

ewic

htes

erfo

lgt 5

Min

uten

lang

am S

peck

bret

troto

r. N

ach

dem

Abz

entri

fugi

eren

des

Säu

lenm

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ials

wird

der

Übe

rsta

nd

abge

nom

men

, in

Küv

ette

n pi

petti

ert u

nd p

hoto

met

risch

bei

410

nm

die

Ext

inkt

ion

gem

esse

n.

Aus

den

Erg

ebni

ssen

wird

bes

timm

t, w

elch

e pH

-Wer

te fü

r die

vol

lstä

ndig

e re

vers

ible

Bin

dung

des H

ämog

lobi

ns a

n da

s Säu

lenm

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ial u

nd d

esse

n an

schl

ieße

nder

Elu

tion

am b

este

n ge

eign

et

sind

.

Vor

vers

uch

2: E

rmitt

lung

der

Bin

dung

skap

azitä

t der

Säu

le

Um

bei

ein

er A

ufre

inig

ung

eine

Übe

rladu

ng d

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äule

zu

verm

eide

n, so

llte,

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mög

lich,

auc

h

die

Auf

nahm

ekap

azitä

t der

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le ü

berp

rüft

wer

den.

Es

wer

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wie

obe

n be

schr

iebe

n, e

rneu

t

sieb

en E

ppen

dorf

gefä

ße m

it Sä

ulen

mat

eria

l zw

eim

al ä

quili

brie

rt. H

ierb

ei w

ird d

er P

uffe

r m

it

dem

gee

igne

tste

n pH

-Wer

t für

die

Bin

dung

ver

wen

det.

Der

Puf

fer w

ird a

bpip

ettie

rt, d

ie 2

5 μl

Säu

lenm

ater

ial m

it je

5 /

10 /

25 /

50 /

75 /

100 μl

der

Häm

oglo

bin-

Lösu

ng v

erse

tzt u

nd a

uf 1

ml m

it de

m g

eeig

nete

n Pu

ffer

auf

gefü

llt. D

ann

wird

5

Min

uten

lang

am

Spe

ckbr

ettro

tor i

nkub

iert.

Nac

h er

neut

er Z

entri

fuga

tion

wird

der

Übe

rsta

nd

in K

üvet

ten

pipe

ttier

t und

pho

tom

etris

ch b

ei 4

10 n

m d

er re

lativ

e Häm

oglo

bin-

Geh

alt b

estim

mt.

- 22

-

Woc

he 1

Chr

omat

ogra

phie

A

G H

ippl

er

Aus

der

Men

ge d

es v

erw

ende

ten

Säul

enm

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ials

und

der

erm

ittel

ten

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skap

azitä

t sol

l

bere

chne

t wer

den,

wie

viel

Pro

be a

uf d

ie v

orge

ferti

gten

Säu

len

(Vol

umen

: 1 m

l) th

eore

tisch

aufg

etra

gen

wer

den

könn

te, o

hne

sie

zu ü

berla

den.

Säul

ench

rom

atog

raph

ie: I

solie

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des

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bins

aus

ein

em P

rote

inge

mis

ch

Tip

:zur

Bes

chle

unig

ung

der

Flus

srat

e ka

nn m

it ei

nem

Gum

mis

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r ei

n le

icht

er D

ruck

auf

die

Säul

e au

sgeü

bt w

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n; v

gl. F

PLC

-Ver

fahr

en.

Übe

rste

hend

e Fl

üssi

gkei

t w

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o w

eit

abge

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en, d

ass

die

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e ge

rade

nic

ht t

rock

enfä

llt.

Ans

chlie

ßend

wird

die

Säu

le m

it ei

nem

Säu

lenv

olum

en (

= 1

ml)

des

Puff

ers

mit

dem

zuv

or

erm

ittel

ten

optim

alen

pH

-Wer

t fü

r di

e H

ämog

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nbin

dung

äqu

ilibr

iert.

Ist

der

Puf

fer

durc

hgel

aufe

n, w

erde

n 20

0 μl

des

Pro

tein

gem

isch

es a

ufge

trage

n un

d ei

nsin

ken

gela

ssen

.

Prot

eine

m

it ei

nem

pI

kl

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r al

s de

r ak

tuel

le

pH-W

ert

wer

den

mit

eine

m

halb

en

Säul

envo

lum

en P

uffe

r (0,

5 m

l) el

uier

t und

als

Vor

lauf

ver

wor

fen.

Im z

wei

ten

Schr

itt w

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as H

ämog

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n el

uier

t. D

azu

wer

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eini

ge M

illili

ter

desj

enig

en

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ers

auf d

ie S

äule

geg

eben

, des

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ert a

ls o

ptim

al fü

r die

Elu

tion

des

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bins

best

imm

t w

urde

(s.

oben

). D

er D

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lauf

kan

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lan

ge v

erw

orfe

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n, b

is d

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ge

Ban

de d

as E

nde

der S

äule

err

eich

t, ab

dan

n m

uss d

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luat

auf

gefa

ngen

wer

den.

Prot

eine

mit

eine

m p

I grö

ßer a

ls d

er E

lutio

nspu

ffer

ver

blei

ben

wei

terh

in a

uf d

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äule

. Die

se

könn

en d

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Puf

fer

mit

noch

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eren

pH

-Wer

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(Em

pfin

dlic

hkei

t de

s Sä

ulen

mat

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ls

beac

hten

!) o

der

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n Io

nens

tärk

en e

luie

rt w

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n. H

ier

soll

letz

tere

Met

hode

ang

ewan

dt

wer

den.

Daz

u w

erde

n 5

ml d

es fü

r die

Elu

tion

des H

ämog

lobi

n ve

rwen

dete

n Pu

ffer

s auf

1,3

4 M

an K

Cl e

inge

stel

lt (W

ievi

el K

Cl m

uß a

bgew

ogen

wer

den?

)und

das

ver

blie

bene

Pro

tein

mit

eini

ge M

illili

ter d

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lzha

ltige

n Pu

ffer

s von

der

Säu

le v

erdr

ängt

. Das

Elu

at w

ird a

ufge

fang

en.

Von

be

iden

Fr

aktio

nen

wird

je

wei

ls

ein

Spek

trum

(

=300

-600

nm

) am

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otom

eter

aufg

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und

mit

Ref

eren

zspe

ktre

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rglic

hen.

Nac

hdem

die

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ktre

n au

fgen

omm

en

wur

den,

wird

zu

dem

Elu

at d

er le

tzen

Fra

ktio

n 10

μl e

iner

100

mM

Asc

orbi

nsäu

re-L

ösun

g in

die

Küv

ette

pip

ettie

rt, d

urch

mis

cht u

nd fü

r 2 m

in b

ei R

aum

tem

pera

tur i

nkub

iert.

Ans

chlie

ßend

wird

aber

mal

s ein

Spe

ktru

m (

=300

-600

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) am

Pho

tom

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aufg

enom

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und

mit

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zuvo

r

aufg

enom

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en S

pekt

rum

ver

glic

hen.

Lite

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1997

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und

PA

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r un

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die

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keit.

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nu

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r A

naer

obio

se (

nebe

n de

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limiti

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n ox

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spho

rylie

rung

) ged

eckt

wer

den

kann

. Fun

ktio

nsbe

ding

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obio

se k

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wer

den

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aktio

n, E

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r Beu

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.ä.).

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er b

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nder

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ben

Stof

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. Le

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. H

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Küs

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erei

ch, i

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der

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. In

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n an

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be S

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wec

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ch ü

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eine

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ung

der

Gew

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hosp

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erbi

ndun

gen

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echt

erha

lten.

Fu

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ding

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naer

obio

se u

nter

sche

idet

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n de

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edin

gten

Ana

erob

iose

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htlic

h de

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ik,

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h hi

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htlic

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met

abol

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en

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en

(z.B

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usio

nsan

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ung,

“m

etab

olic

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pres

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fisch

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wec

hsel

weg

e).

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n ne

ben

der

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re-

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wei

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Sto

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echs

elw

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l, O

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tratio

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ebe

bzw

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dika

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für

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n an

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ben

Stof

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disc

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wird

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rt.

- 25

-

Woc

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M

etab

olitb

estim

mun

g A

G P

aul/Z

eis

Die

opt

isch

en E

igen

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eine

r Lös

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iner

bes

timm

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Wel

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änge

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sche

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sich

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nd w

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der

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oder

von

der

“op

tisch

en

Dic

hte”

de

r Lö

sung

ge

spro

chen

. D

ie

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Abh

ängi

gkei

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r Ex

tinkt

ion

von

der

Kon

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s Chr

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ist n

ur in

ver

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Lösu

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s ka

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g vo

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t und

NA

DH

(Chr

omop

hor,

s.u.)

durc

h di

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ktat

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drog

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e (L

DH

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also

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e U

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der

Lakt

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zym

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La

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da

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La

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----

----

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Py

ruva

t + N

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H +

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In e

inem

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wird

das

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Prob

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und

LD

H

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setz

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N

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H

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Das

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nspe

ktru

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eide

n N

ukle

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ters

chei

det

sich

im

Wel

lenl

änge

nber

eich

von

34

0 nm

: hie

r abs

orbi

ert N

AD

nic

ht, w

ähre

nd N

AD

H e

in E

xtin

ktio

nsm

axim

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ufw

eist

( =

6,

3 L

* m

mol

-1 *

cm

-1).

Anh

and

der o

ptis

chen

Dic

hte

bei 3

40 n

m k

ann

also

die

enz

ymat

isch

um

gese

tzte

Met

abol

itmen

ge q

uant

ifizi

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n. D

ie U

mse

tzun

g vo

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/NA

DH

in e

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R

edox

reak

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stel

lt ei

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lgem

eine

s Pr

inzi

p en

zym

atis

cher

Ana

lyse

dar

, das

dur

ch g

eeig

nete

W

ahl e

ines

Enz

ymsy

stem

s nah

ezu

belie

bige

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abol

ite q

uant

itativ

erf

asse

n ka

nn.

I =

Inte

nsitä

t des

dur

chtre

tend

en L

icht

s I 0

= In

tens

ität d

es e

inge

stra

hlte

n Li

chts

c

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ntra

tion

des C

hrom

opho

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= m

olar

er E

xtin

ktio

nsko

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omop

hors

d

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nge

des L

icht

s dur

ch d

ie P

robe

CO

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|

HO

–C–H

L

akta

t

|

C

H3

CO

O-

|

C=O

Pyr

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|

C

H3

- 26

-

Woc

he 2

M

etab

olitb

estim

mun

g A

G P

aul/Z

eis

Zu

näch

st k

ann

mit

eine

r St

anda

rdlö

sung

bek

annt

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tkon

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n di

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nktio

n de

s en

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atis

chen

Te

stsy

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s un

d di

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eare

K

onze

ntra

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abhä

ngig

keit

der

Rea

ktio

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üft

und

eine

Eic

hger

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erst

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den.

Die

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inkt

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ände

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nac

h Zu

gabe

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ters

chie

dlic

her

Lakt

atm

enge

n w

ird

dazu

um

ei

nen

Leer

wer

t ko

rrig

iert,

de

r di

e Ex

tinkt

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ber

ücks

icht

igt,

die

bere

its o

hne

Zuga

be d

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robe

(zu

m B

eisp

iel d

urch

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e A

bsor

ptio

n de

s En

zym

s o.

ä.)

erfo

lgt.

Dan

n ka

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it H

ilfe

der

Eich

gera

den

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Kon

zent

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n de

r Pr

obe

unbe

kann

ter

(zu

best

imm

ende

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akta

tkon

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n an

hand

der

er

folg

ten

Extin

ktio

nsän

deru

ng b

erec

hnet

wer

den.

M

ater

ial:

- 20

Kra

bben

(Car

cinu

s mae

nas)

- F

angn

etz

- Epp

endo

rfpi

pette

n - 1

ml-S

pritz

en u

nd K

anül

en (0

,4 m

m)

- Epp

endo

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ntrif

uge

- Hei

zblo

ck

- Gly

cin-

Hyd

razi

n-Pu

ffer

pH

9,0

(0,9

mol

/l G

lyci

n; 0

,75

mol

/l H

ydra

zin.

Vor

sich

t: G

iftig

) - N

AD

+ -Lös

ung

40 m

mol

/l *

- Lak

tat-S

tand

ard

5 m

mol

/l *

- LD

H-L

ösun

g 2,

5 m

g/m

l *

Die

mit

* ge

kenn

zeic

hnet

en L

ösun

gen

sind

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Eis

auf

zube

wah

ren.

Dur

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die

sem

Kur

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ktat

konz

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ämol

ymph

e ru

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er u

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ktiv

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vera

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Tie

re b

estim

mt

und

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inan

der

verg

liche

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n. D

azu

wird

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abbe

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arci

nus m

aena

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hne

und

nach

loko

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oris

cher

Akt

ivitä

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nktio

nsbe

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te A

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olym

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entn

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en.

Die

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t m

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ner

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ze a

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tren

von

NA

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Kre

ise)

und

N

AD

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ise)

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er E

xtin

ktio

nsun

ters

chie

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i 340

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öglic

ht d

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Kon

zent

ratio

nsbe

stim

mun

g im

enz

ymat

isch

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est.

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lson

, P:

Kur

zes

Lehr

buch

der

Bio

chem

ie,

Thie

me-

Ver

lag,

Stu

ttgar

t)

- 27

-

Woc

he 2

M

etab

olitb

estim

mun

g A

G P

aul/Z

eis

Gel

enkh

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hen

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wer

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sie

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Hilf

e ei

nes

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Akt

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. N

ach

der

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ivitä

t w

ird d

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ier

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tnom

men

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der

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tatg

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t bes

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sgru

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wird

der

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iche

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ivitä

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uer n

ach

folg

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chem

a un

ters

ucht

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ie H

ämol

ymph

prob

en w

erde

n 10

min

hitz

eden

atur

iert,

10

min

bei

130

00 rp

m z

entri

fugi

ert

und

der Ü

bers

tand

mit

Hilf

e de

s enz

ymat

isch

en T

ests

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he u

nten

) ana

lysi

ert.

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ktat

-Tes

t: D

urch

führ

ung:

Phot

omet

risch

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essu

ng b

ei 3

40 n

m.

Der

N

ulla

bgle

ich

des

Phot

omet

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mit

eine

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K

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Eins

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Prob

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R

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n du

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tem

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tur

die

Bes

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ung

der

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ktio

n na

ch a

bges

chlo

ssen

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atis

cher

Um

setz

ung.

V

erm

eide

n Si

e di

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rung

der

Spi

tzen

von

Rüh

rspa

teln

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ette

nspi

tzen

mit

den

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ern,

um

Kon

tam

inat

ione

n m

it pr

oben

frem

dem

Lak

tat z

u ve

rhin

dern

.

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ert

Bes

timm

ung

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ktio

nsän

deru

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setz

tes

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dur

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henf

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pip

ettie

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N

AD

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μl

H2O

: 10

0 μl

Gru

ppe

Akt

ives

Tie

r: H

ämol

ymph

entn

ahm

e na

ch

1 / 2

1

min

3

/ 4

2 m

in

5 / 6

3

min

7

/ 8

4 m

in

9 / 1

0 6

min

11

/ 12

8

min

- 28

-

Woc

he 2

M

etab

olitb

estim

mun

g A

G P

aul/Z

eis

Dur

chm

isch

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ie d

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brin

gen

Sie

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n ei

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üvet

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elle

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ese

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enga

ng. N

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ren

Sie

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Extin

ktio

n. P

ipet

tiere

n Si

e di

e Lö

sung

in

das

Eppe

ndor

fgef

äß z

urüc

k. F

ügen

Sie

20 μl

LD

H z

u un

d m

isch

en S

ie d

ie

Lösu

ng g

ut d

urch

(V

orte

x).

Lass

en S

ie d

ie R

eakt

ion

1h a

blau

fen

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ttier

en S

ie d

ie

Lösu

ng i

n di

e K

üvet

te.

Bes

timm

en S

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en E

ndw

ert

der

Extin

ktio

n im

Pho

tom

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. D

er

Mitt

elw

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ktio

nsän

deru

ng b

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r L

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robe

n w

ird a

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eerw

ert v

on a

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B

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mun

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r Ex

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ände

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beka

nnte

Sub

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gen

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rufe

n w

ird. F

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n Si

e di

e ob

en b

esch

riebe

ne M

essu

ng m

it de

m S

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(Lak

tatlö

sung

bek

annt

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Kon

zent

ratio

n)

durc

h.

Pipe

ttier

en

Sie

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zw

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(Dop

pelb

estim

mun

g)

in

Eppe

ndor

fgef

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St

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rd

I II

II

I

Puff

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860 μl

86

0 μl

86

0 μl

NA

D+ :

20 μ

l 20

μl

20 μ

l St

anda

rd (5

mm

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Lakt

at)

10 μ

l 20

μl

30 μ

l W

asse

r 90

μl

80 μ

l 70

μl

Dur

chm

isch

en S

ie d

ie S

ubst

anze

n un

d be

stim

men

Sie

jew

eils

in e

iner

Küv

ette

die

Ext

inkt

ion.

N

ach

dem

Um

fülle

n in

ein

Epp

endo

rfge

fäß

20 μ

l LD

H z

ufüg

en u

nd g

ut d

urch

mis

chen

. La

ssen

Sie

die

Rea

ktio

n je

wei

ls 1

h ab

lauf

en u

nd n

otie

ren

Sie

die

Endw

erte

der

Ext

inkt

ion.

3. P

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n B

estim

mun

g de

r Ex

tinkt

ions

ände

rung

dur

ch e

ine

Lösu

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it un

beka

nnte

r (z

u m

esse

nder

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bstra

tkon

zent

ratio

n. F

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ie M

essu

ng d

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robe

pip

ettie

ren

Sie

in p

aral

lele

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nsät

zen

jewe

ils zw

eim

al (D

oppe

lbes

timm

ung)

in E

ppen

dorf

gefä

ße:

Puff

er:

860 μl

86

0 μl

NA

D+ :

20 μ

l 20

μl

Prob

e 10

μl

20 μ

l W

asse

r 90

μl

80 μ

l D

urch

mis

chen

Sie

die

Sub

stan

zen,

pip

ettie

ren

Sie

sie

in e

ine

Küv

ette

und

brin

gen

Sie

dies

e in

de

n St

rahl

enga

ng. N

otie

ren

Sie

die

Extin

ktio

n. N

ach

dem

Um

fülle

n in

das

Epp

endo

rfge

fäß

20 μ

l LD

H z

ufüg

en u

nd m

isch

en. L

asse

n Si

e di

e R

eakt

ion

1h a

blau

fen

und

notie

ren

Sie

die

- 29

-

Woc

he 2

M

etab

olitb

estim

mun

g A

G P

aul/Z

eis

Endw

erte

. Fal

ls S

ie e

ine

sehr

nie

drig

e od

er s

ehr

hohe

Ext

inkt

ion

erha

lten,

ver

ände

rn S

ie d

ie

Prob

emen

ge. M

esse

n Si

e di

e Ex

tinkt

ions

ände

rung

der

Pro

ben

I (R

uhe)

und

II (A

ktiv

ität)

. Er

stel

lung

der

Eic

hger

aden

: Er

mitt

eln

Sie

für

die

gem

esse

nen

Stan

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lösu

ngen

die

Ver

ände

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in d

er E

xtin

ktio

n (

E)

durc

h di

e En

zym

reak

tion,

inde

m S

ie d

en A

nfan

gsw

ert v

om E

ndw

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bzie

hen.

Von

dem

so

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ltene

n W

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für

E zi

ehen

Sie

den

E-

Wer

t fü

r de

n Le

erw

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ab.

Die

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ultie

rend

en

Wer

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agen

Sie

nac

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estim

mun

g de

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ittel

wer

tes

gege

n di

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ntra

tion

auf.

Der

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st T

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er G

erad

en (N

ullp

unkt

). D

ie

E-W

erte

für d

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robe

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naus

o er

mitt

elt (

Leer

wer

t abz

iehe

n!).

Nun

kön

nen

Sie

aus

der

mit

Hilf

e de

r St

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rdm

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ngen

sel

bst e

rste

llten

Eic

hger

aden

die

Lak

tatk

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ntra

-tio

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den

Pro

ben

bere

chne

n. G

eben

Sie

den

Mitt

elw

ert

der

Lakt

atko

nzen

tratio

n in

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ämol

ymph

e de

r Tie

re je

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ls fü

r die

Mes

sung

en in

Ruh

e (I

) und

nac

h A

ktiv

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II) a

n.

Mög

liche

Feh

lerq

uelle

n:

- Pro

be is

t nic

ht g

enug

dur

chge

mis

cht -

-> K

üvet

te m

it Pa

rafil

m v

ersc

hlie

ßen,

schü

tteln

- L

uftb

lase

n in

der

Küv

ette

-->

mit

dem

Fin

ger v

orsi

chtig

geg

en d

ie K

üvet

te k

lopf

en o

der m

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ührs

pate

l Luf

tbla

sen

entfe

rnen

Au

swer

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:V

ergl

eich

en S

ie d

ie L

akta

tkon

zent

ratio

nen

in d

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ymph

e vo

n R

uhet

iere

n un

d ak

tiven

Ti

eren

. N

otie

ren

Sie

die

Mes

swer

te a

ller

Gru

ppen

. W

elch

en E

influ

ss h

at d

ie D

auer

der

A

ktiv

ität

auf

die

Lakt

atko

nzen

tratio

n? F

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en S

ie e

in D

iagr

amm

an,

in

dem

Sie

die

A

bhän

gigk

eit d

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akta

tkon

zent

ratio

n in

der

Häm

olym

phe

von

der A

ktiv

itäts

daue

r dar

stel

len.

Pr

otok

oll:

1. E

inle

itung

: Zie

l des

Ver

such

s 2.

Erg

ebni

sse:

-

Tabe

lle d

er O

rigin

al-M

essw

erte

(eig

ene

Gru

ppe)

-

Eich

gera

de (D

iagr

amm

und

Ger

aden

funk

tion,

eig

ene

Gru

ppe)

-

Ber

echn

ete

Lakt

atko

nzen

tratio

nen

der H

ämol

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prob

en (e

igen

e G

rupp

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-Ta

belle

der

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sse

alle

r Gru

ppen

-

Gra

fisch

e D

arst

ellu

ng d

es Z

eitv

erla

ufs (

Abh

ängi

gkei

t von

CLa

ktat v

on d

er A

ktiv

itäts

daue

r)

-B

esch

reib

ung

der E

rgeb

niss

e in

Tex

tfor

m

3. D

isku

ssio

n

- 30

-

Woc

he 2

M

etab

olitb

estim

mun

g A

G P

aul/Z

eis

Frag

en zu

m V

erst

ändn

is:

-W

elch

e St

offw

echs

elw

ege

führ

en b

ei a

usre

iche

nder

Sau

erst

offv

erso

rgun

g zu

r B

ildun

g vo

n A

TP, w

elch

e un

ter S

auer

stof

fman

gel?

-

Was

ver

steh

t m

an u

nter

fun

ktio

nelle

r A

naer

obio

se,

was

unt

er b

ioto

pbed

ingt

er A

naer

o-bi

ose?

-

Wel

che

Rea

ktio

n ka

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sier

t die

Lak

tatd

ehyd

roge

nase

in d

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elle

? -

Was

ist d

ie E

xtin

ktio

n ei

ner L

ösun

g un

d vo

n w

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en F

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ren

wird

sie

best

imm

t?

-D

ie M

alat

dehy

drog

enas

e (M

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) kat

alys

iert

folg

ende

Rea

ktio

n:

M

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M

alat

+ N

AD

+ --

----

----

O

xala

ceta

t + N

AD

H +

H+

Wel

che

Kom

pone

nten

mus

s ei

n en

zym

atis

ches

Tes

tsys

tem

ent

halte

n, m

it de

ssen

Hilf

e di

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xala

ceta

tkon

zent

ratio

n ei

ner

Prob

e be

stim

mt

wer

den

kann

? W

elch

e Ä

nder

ung

der

Extin

ktio

n er

war

ten

Sie

bei e

iner

Pro

be m

it ei

nem

Oxa

lace

tatg

ehal

t, vo

n 0,

1 m

mol

/l (in

de

r Küv

ette

). (Z

u-/A

bnah

me,

Zah

lenw

ert d

er E

xtin

ktio

nsän

deru

ng)?

Li

tera

tur:

B

ergm

eyer

, Han

s Ulri

ch: G

rund

lage

n de

r enz

ymat

isch

en A

naly

se. V

erla

g C

hem

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einh

eim

. K

arls

on, P

eter

: Kur

zes L

ehrb

uch

der B

ioch

emie

. Thi

eme

Ver

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Stu

ttgar

t. Lo

ttspe

ich,

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Zorb

as, H

: Bio

anal

ytik

. Spe

ktru

m V

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g H

eide

lber

g, B

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ul, R

üdge

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ysio

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e de

r Tie

re. S

yste

me

und

Stof

fwec

hsel

. Thi

eme

Ver

lag,

Stu

ttgar

t.

- 31

-- 3

2 -

Pr

oben

- V

olum

en

(µl)

Ver

- dü

nnun

g E v

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ktio

n vo

rher

E n

Ex

tinkt

ion

nach

her

E

E n

– E

v

Eko

rr

E

- Le

erw

ert

Ēko

rr

M

ittel

wer

t

CLK

(m

mol

/l)

Lakt

atko

nzen

-tra

tion

in d

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Küv

ette

CLa

ktat

(m

mol

/l)

Lakt

atko

nzen

-tra

tion

in d

er

Häm

olym

phe

Leer

wer

t 1

0

*

X

Leer

wer

t 2

0

*

Stan

dard

I 1

10

X

Stan

dard

I 2

10

Stan

dard

II 1

20

X

Stan

dard

II 2

20

Stan

dard

III 1

30

X

Stan

dard

III 2

30

Prob

e I 1

10

Prob

e I 2

10

Prob

e I 3

20

Prob

e I 4

20

Prob

e II

1

10

Prob

e II

2

10

Prob

e II

3

20

Prob

e II

4

20

* Le

erw

ert:

Mitt

elw

ert a

us b

eide

n Ex

tinkt

ions

diffe

renz

en o

hne

Prob

e : _

____

____

____

____

____

____

__

Prob

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Ruh

e

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: Akt

ivitä

t

X

: ber

echn

et a

us Z

ugab

e de

r Sta

ndar

dlös

ung

Woc

he 3

Met

abol

ism

usA

G W

eber

Mec

hani

smen

der

Mus

kelk

ontr

aktio

n

Them

en, d

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ur V

orbe

reitu

ng g

ehör

en:

-M

uske

ltype

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ufba

u de

s Ske

lettm

uske

ls, m

olek

ular

er M

echa

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us d

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lkon

trakt

ion,

B

edeu

tung

von

ATP

und

Ca2+

-S

teue

rung

der

Mus

kelk

ontra

ktio

n

Lite

ratu

r:

Silv

erth

orn:

„Ph

ysio

logi

e“, P

ears

on S

tudi

um

K

apite

l 12:

„M

usku

latu

r“

Cam

pbel

l et a

l.: „

Bio

logi

e“, S

pekt

rum

Ver

lag,

200

9

Kap

itel 4

9: „

Sens

orik

und

Mot

orik

“ H

ickm

an e

t al.:

„Zo

olog

ie“,

Pea

rson

Stu

dium

, 200

8

Kap

itel 2

9: „

Hal

t, Sc

hutz

, Bew

egun

g“

Allg

emei

nes

Die

Fäh

igke

it zu

r B

eweg

ung

ist e

in K

ennz

eich

en d

er T

iere

und

erm

öglic

ht ih

nen

nich

t nur

N

ahru

ng z

u er

lang

en, s

onde

rn a

uch

Gef

ahre

n ab

zuw

ehre

n un

d Pa

rtner

zu

finde

n. U

m s

ich

fortz

ubew

egen

, müs

sen

die

Tier

e - u

nabh

ängi

g vo

n de

r Art

der B

eweg

ung

- aus

reic

hend

Kra

ft ge

gen

die

Um

wel

t aus

üben

, um

Rei

bung

skrä

fte u

nd S

chw

erkr

aft z

u üb

erw

inde

n. D

iese

Kra

ft w

ird

durc

h en

ergi

ever

brau

chen

de

zellu

läre

Pr

ozes

se

erze

ugt

(->

Bio

ener

getik

). D

en

unte

rsch

iedl

iche

n A

rten

der

Bew

egun

g lie

gen

Mec

hani

smen

zug

rund

e, d

ie a

llen

Tier

en

gem

eins

am s

ind.

Auf

der

zel

lulä

ren

Eben

e be

ruht

jeg

liche

Bew

egun

g au

f ko

ntra

ktile

n Sy

stem

en u

nd m

olek

ular

en M

otor

en.

Eine

Mus

kelk

ontra

ktio

n al

lein

e fü

hrt

jedo

ch n

icht

un

mitt

elba

r zu

ein

er B

eweg

ung

des

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es:

alle

Bew

egun

gsar

ten

basi

eren

ent

sche

iden

d da

rauf

, das

s M

uske

ln g

egen

ein

fest

es (H

ydro

,- Ex

o- o

der E

ndo-

) Ske

lett

arbe

iten

könn

en. D

a M

uske

ln s

ich

nur

kont

rahi

eren

kön

nen,

müs

sen

sie

in a

ntag

onis

tisch

wirk

ende

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aren

am

Sk

elet

t ans

etze

n um

ein

zeln

e K

örpe

rteile

hin

- und

her

bew

egen

zu

könn

en.

Der

Ske

lettm

uske

l de

r W

irbel

tiere

ist

an

Kno

chen

ver

anke

rt un

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mög

licht

, di

ese

zu

bew

egen

. Er b

este

ht a

us la

ngen

Mus

kelfa

serb

ünde

ln (

0,1

– 1

mm

), di

e si

ch m

eist

übe

r die

ge

sam

te L

änge

des

Mus

kels

ers

treck

en. E

in B

ünde

l bes

teht

aus

meh

rere

n M

uske

lfase

rn (

10

– 90

μm

). D

ie M

uske

lfase

r ist

ein

e ei

nzel

ne, m

ehrk

erni

ge Z

elle

, die

aus

der

Fus

ion

meh

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r em

bryo

nale

r Ze

llen

gebi

ldet

wird

. Je

de M

uske

lfase

r be

steh

t au

s ru

nd 1

000

long

itudi

nal

ange

ordn

eten

Myo

fibril

len.

Jed

e M

yofib

rille

ist

dur

ch Z

-Sch

eibe

n in

ca.

2,5

μm

lan

ge

‚Fäc

her’

(Sa

rkom

ere)

unt

erte

ilt. D

ie S

arko

mer

e si

nd d

ie k

ontra

ktile

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nhei

ten

des

Mus

kels

. Si

e be

steh

en a

us z

wei

Arte

n vo

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yofil

amen

ten:

Dün

ne F

ilam

ente

bes

tehe

n au

s je

zw

ei

Act

inst

räng

en u

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ropo

myo

sin-

Strä

ngen

. Dic

ke F

ilam

ente

wer

den

aus

zahl

reic

hen

Myo

sin

Mol

ekül

en g

ebild

et.

Eine

Mus

kelk

ontra

ktio

n er

folg

t da

nn,

wen

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e Fi

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ente

ane

inan

der

vorb

eigl

eite

n un

d da

bei d

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arko

mer

e ve

rkür

zen.

D

as M

yosi

nmol

ekül

bes

itzt e

inen

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eige

teilt

en K

opf,

der d

ie A

TPas

e-A

ktiv

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nthä

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r ist

ge

lenk

artig

mit

eine

m H

alss

tück

ver

bund

en (

Kop

f +

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s =

schw

eres

Mer

omyo

sin)

, an

das

sich

, w

iede

rum

ge

lenk

artig

ve

rbun

den,

da

s Sc

hwan

zstü

ck

ansc

hlie

ßt

(=

leic

htes

M

erom

yosi

n). E

in M

yosi

nfila

men

t bes

teht

aus

ca.

150

-360

sol

cher

Mol

ekül

e, d

ie b

ünde

larti

g zu

sam

men

gefa

sst s

ind.

Die

gel

enka

rtige

Bew

eglic

hkei

t des

Kop

f-H

als-

Stüc

kes e

rmög

licht

die

re

vers

ible

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dung

des

Myo

sins

mit

dem

Akt

in (

der

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in-M

yosi

n-K

ompl

ex).

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in is

t ein

gl

obul

äres

Pro

tein

(G

-Akt

in),

von

dem

jew

eils

~40

0 ei

ne p

erls

chnu

rarti

ge K

ette

bild

en (

F-A

ktin

). Je

wei

ls z

wei

mite

inan

der

verd

rillte

Akt

in-K

ette

n bi

lden

ein

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infil

amen

t. D

as

eben

falls

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nför

mig

e Tr

opom

yosi

n w

inde

t sic

h um

das

Akt

infil

amen

t, w

obei

ca.

alle

40

nm

ein

Trop

onin

mol

ekül

ang

ehef

tet

ist.

Wäh

rend

der

Kon

trakt

ion

legt

sic

h de

r Tr

opom

yosi

n-

- 33

-

Woc

he 3

Met

abol

ism

usA

G W

eber

Fade

n in

die

Rin

ne z

wis

chen

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ei A

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-F-K

ette

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d gi

bt d

eren

Bin

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sste

llen

für

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Myo

sin

frei

. Als

mol

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arer

Sch

alte

r wirk

t dab

ei d

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a2+-s

ensi

tive

Trop

onin

. D

er K

ontra

ktio

nsm

echa

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us d

es W

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tierm

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ls i

st h

eute

bis

in

sein

e m

olek

ular

en

Det

ails

bek

annt

. Der

ers

te S

chrit

t bei

der

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ivie

rung

ein

es M

uske

ls is

t die

Dep

olar

isat

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der

Mus

kelz

elle

. A

us d

em S

arko

plas

mat

isch

en R

etik

ulum

wird

Ca2+

ins

Cyt

osol

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gese

tzt.

Die

C

a2+K

onze

ntra

tion

in d

er M

uske

lzel

le e

rhöh

t da

bei

sich

inn

erha

lb v

on 2

0 m

s um

das

ca.

50

0fac

he.

Ca2+

verb

inde

t si

ch

mit

Trop

onin

, w

odur

ch

Trop

omyo

sin

sein

e he

mm

ende

W

irkun

g au

f di

e A

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-Myo

sin-

Ver

bind

ung

verli

ert.

Die

ene

rgie

liefe

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Rea

ktio

n lä

uft a

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Kop

f des

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sinm

olek

üls

ab, w

elch

er A

TP b

inde

n un

d in

AD

P +

P i h

ydro

lisie

ren

kann

. Ein

Te

il de

r H

ydro

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rung

sene

rgie

übe

rträg

t si

ch a

uf d

as M

yosi

n, w

odur

ch d

iese

s in

ein

e en

ergi

erei

che

Kon

form

atio

n üb

erfü

hrt

wird

. D

er a

nger

egte

Myo

sink

opf

glei

cht

nun

eine

m

gesp

annt

en H

ebel

und

bin

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n ei

ne s

pezi

fisch

e B

indu

ngss

telle

am

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in u

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ildet

so

eine

Q

uerb

rück

e zw

isch

en A

ctin

und

Myo

sin

(Act

omyo

sin-

Kom

plex

). Je

tzt w

ird d

ie g

espe

iche

rte

Ener

gie

frei

gese

tzt u

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er M

yosi

nkop

f geh

t wie

der i

n di

e en

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eärm

ere

Kon

form

atio

n üb

er,

wod

urch

sic

h de

r W

inke

l änd

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unte

r de

m d

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opf

an d

en S

chw

anz

gebu

nden

ist.

Dur

ch

dies

es U

mkl

appe

n w

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ine

Kra

ft au

f da

s A

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filam

ent

ausg

eübt

und

die

ses

wird

in

Ric

htun

g de

s Sa

rkom

er-Z

entru

ms

gezo

gen.

Die

Bin

dung

zw

isch

en M

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n un

d A

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wird

w

iede

r ge

löst

, w

enn

ein

Mol

ekül

ATP

am

Myo

sink

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bind

et (

‚Wei

chm

ache

rwirk

ung

des

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’) u

nd d

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yklu

s ka

nn v

on n

euem

beg

inne

n: d

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eie

Kop

f kan

n da

s ne

ue A

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palte

n,

die

ener

gier

eich

e, g

espa

nnte

Kon

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atio

n ei

nneh

men

und

an

die

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sste

lle e

ines

an

dere

n A

ctin

mol

ekül

s an

dock

en. J

eder

der

ca.

350

– 4

00 K

öpfe

ein

es d

icke

n Fi

lam

ents

kan

n 5

Que

rbrü

cken

pro

Sek

unde

bild

en u

nd lö

sen,

so d

ass d

ie F

ilam

ente

kon

tinui

erlic

h an

eina

nder

vo

rbei

gezo

gen

wer

den.

Ei

n ei

nzel

ner

Gle

itzyk

lus

führ

t ‚n

ur’

zu e

iner

Mus

kelv

erkü

rzun

g um

ca.

1 %

. Fü

r ei

ne

norm

ale

Mus

kelv

erkü

rzun

g (m

ax. 3

0 %

) is

t des

halb

ein

oft

wie

derh

olte

r A

blau

f de

s Zy

klus

no

twen

dig:

Bin

dung

der

Köp

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Abk

nick

en u

nd G

leite

n –

Lösu

ng d

er B

indu

ng –

Bin

dung

an

eine

r nac

hfol

gend

en S

telle

des

Fila

men

ts.

- 34

-

Woc

he 3

Met

abol

ism

usA

G W

eber

Ver

such

V

iele

ele

men

tare

Sch

ritte

des

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ekul

aren

Kon

trakt

ions

mec

hani

smus

kön

nen

an i

solie

rten

Myo

fibril

len

("Fi

brill

enm

odel

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dem

onst

riert

wer

den.

Für

die

sen

Ver

such

ben

utze

n w

ir ha

ndel

sübl

iche

s H

ackf

leis

ch (

som

it ka

nn d

iese

r V

ersu

ch g

gf.

auch

gut

in

der

Schu

le

durc

hgef

ührt

wer

den)

. Sie

sol

len

am F

ibril

lenm

odel

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gen,

das

s di

e M

uske

lkon

trakt

ion

von

Cal

cium

ione

n ( C

a2+)

und

ATP

abh

ängt

und

das

s da

bei

ATP

ges

palte

n w

ird (

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ase-

Akt

ivitä

t). D

ie A

TP-S

paltu

ng s

oll

quan

tifiz

iert

wer

den.

Im

ein

zeln

en w

erde

n di

e Fi

brill

en

folg

ende

n B

edin

gung

en u

nter

wor

fen:

-Z

ugab

e vo

n A

TP

-Zug

abe

von

Ca2+

-Zug

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von

EGTA

(2

-Am

inoe

thyl

-Gly

colä

ther

-N,N

,N',N

'-Tet

raes

sigs

äure

), ei

nes

Che

latb

ildne

rs,

der

Ca2+

kom

plex

iert

(„w

egfä

ngt“

). K

ontra

ktio

nen

sind

an

eine

r de

utlic

hen

Vol

umen

abna

hme,

sc

hnel

lere

n Se

dim

enta

tion

der

Fibr

illen

un

d/od

er

eine

s si

ch

zusa

mm

enzi

ehen

den

Gel

zylin

ders

aus

den

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rille

n er

kenn

bar.

Das

Aus

maß

der

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-Sp

altu

ng w

ird ü

ber d

as fr

eige

setz

te a

norg

anis

che

Phos

phat

bes

timm

t. M

ater

ial

5 g

Rin

derh

ackf

leis

ch;

1.2

mol

/l Tr

ichl

ores

sigs

äure

(TC

A);

0.2

mol

/l A

TP i

n Pu

ffer

* (*

Pu

ffer

= 4

0 m

mol

/l Im

idaz

ol, 8

0 m

mol

/l K

Cl,

5 m

mol

/l M

gCl 2

, pH

7.2

), 0.

002

mol

/l C

aCl 2

in P

uffe

r*; 0

.4 m

ol/l

EGTA

in P

uffe

r*

Phos

phat

test

:Lö

sung

1: A

mm

oniu

mva

nada

t-Sal

pete

rsäu

reLö

sung

2: A

mm

oniu

mm

olyb

dat-S

chw

efel

säur

eLö

sung

3: P

hosp

hats

tand

ard

(200

μm

ol/l)

Dur

chfü

hrun

g 1.

H

erst

elle

n de

r Fib

rille

nsus

pens

ion

Das

Hac

kfle

isch

wird

mit

ca.

45 m

l ei

skal

tem

Puf

fer

vers

etzt

und

mit

dem

Ultr

a-Tu

rrax

ho

mog

enis

iert

(3 x

20

sec)

, um

die

Myo

fibril

len

frei

zuse

tzen

. Das

Hom

ogen

at w

ird d

urch

Pe

rlong

aze

filtri

ert

und

ansc

hlie

ßend

in

eine

m g

ewog

enen

Zen

trifu

genb

eche

r (F

alco

ntub

e)

bei 3

000U

pM fü

r 10

min

zen

trifu

gier

t. D

er Ü

bers

tand

(lös

liche

Pro

tein

e u.

a.) w

ird v

erw

orfe

n,

das

Myo

fibril

len-

Sedi

men

t w

ird z

um A

usw

asch

en l

öslic

her

Prot

eine

mit

45 m

l ei

skal

tem

Puff

er

vers

etzt

un

d m

it de

m

Ultr

a-Tu

rrax

se

hr

kurz

re

susp

endi

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Nac

h er

neut

er

Zent

rifug

atio

n (w

ie o

ben)

wird

das

Myo

fibril

len-

Sedi

men

t im

20-

fach

en V

olum

en s

eine

s G

ewic

hts i

n Pu

ffer

auf

geno

mm

en u

nd se

hr k

urz

resu

spen

dier

t.

- 35

-

Woc

he 3

Met

abol

ism

usA

G W

eber

2.V

ersu

chsa

nsät

zeIn

den

Ans

ätze

n 1

- 4 w

erde

n je

wei

ls 2

ml v

erdü

nnte

Fib

rille

nsus

pens

ion

(FS)

, im

Ans

atz

5w

erde

n 2

ml

Puffe

r an

stel

le v

on F

ibril

lens

uspe

nsio

n un

d 10

0 μl

der

ang

egeb

enen

Zus

ätze

zu

sam

men

pip

ettie

rt (in

Rea

genz

gläs

ern!

!).

Dan

n w

ird

mit

Puff

er

auf

ein

Endv

olum

en

von

2.2

ml

aufg

efül

lt.

Vor

dem

Ans

etze

n de

r V

ersu

che

müs

sen

Sie

sich

ein

Pip

ettie

rsch

ema

über

lege

n, d

enn

die

Kon

trakt

ion

star

tet m

it de

r Zug

abe

von

ATP

!

Ans

atz

1:

FS +

CaC

l 2A

nsat

z 2:

FS

+ A

TP

Ans

atz

3:

FS +

CaC

l 2 +

ATP

A

nsat

z 4:

FS

+ E

GTA

+ A

TP

Ans

atz

5:

Puff

er +

ATP

Sie

solle

n di

e V

orgä

nge

ca. 1

5 m

in la

ng b

eoba

chte

n un

d si

ch a

lle V

erän

deru

ngen

not

iere

n.

3.Ph

otom

etris

che

Phos

phat

best

imm

ung:

Zu

r B

estim

mun

g de

r in

den

jew

eilig

en V

ersu

chen

fre

iges

etzt

en P

hosp

hatm

enge

wer

den

die

Fibr

illen

wie

der r

esus

pend

iert.

100

μl d

er S

uspe

nsio

n w

erde

n en

tnom

men

und

in e

inem

1,5

-m

l-Rea

ktio

nsge

fäß

mit

1 m

l TC

A (

Tric

hlor

essi

gsäu

re,

1,2

mol

/l) v

erse

tzt.

Die

dad

urch

au

sgef

ällte

n Pr

otei

ne

wer

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abze

ntrif

ugie

rt (1

m

in,

Eppe

ndor

f-Ze

ntrif

uge)

. Zu

r Ph

osph

atbe

stim

mun

g w

erde

n D

oppe

lbes

timm

unge

n ge

mac

ht:

In

2-m

l-Rea

ktio

nsge

fäße

n w

erde

n fü

r di

e R

eage

nzie

nlee

rwer

te j

e 40

0 μl

TC

A v

orge

legt

, für

die

Sta

ndar

ds j

e 40

0 μl

ei

ner

200 μm

ol/l

Phos

phat

-Lös

ung,

für

die

Tes

tans

ätze

1-5

je

400 μl

der

jew

eilig

en

Übe

rstä

nde

nach

TC

A-F

ällu

ng.

Zu a

llen

Prob

en w

erde

n je

wei

ls 4

00 μ

l Lö

sung

1 u

nd 4

00 μ

l Lö

sung

2 g

egeb

en u

nd g

ut

gem

isch

t. N

ach

10 m

in p

hoto

met

risch

e B

estim

mun

g de

r Ext

inkt

ion

bei 4

05 n

m.

Das

Pho

tom

eter

wird

vom

Bet

reue

r in

Bet

rieb

geno

mm

en u

nd d

emon

strie

rt.

Prot

okol

l

Das

Pro

toko

ll so

ll en

thal

ten

(neb

en d

en ü

blic

hen

Abs

chni

tten)

: - P

ipet

tiers

chem

a fü

r die

ver

schi

eden

en F

ibril

lena

nsät

ze

- Ein

e Ta

belle

zum

Kon

trakt

ions

verh

alte

n in

den

ver

schi

eden

en F

ibril

lena

nsät

zen

- Die

Mes

sdat

en d

er P

hosp

hatb

estim

mun

g

- Die

Ber

echn

ung

der u

mge

setz

ten

ATP

-Men

gen

- Pr

ozen

t der

um

gese

tzte

n A

TP-M

enge

n be

zoge

n au

f de

n Fi

brill

enan

satz

mit

dem

höc

hste

n U

msa

tz

- 36

-

Ans

atz

E40

5nm

Ø

E

ΔE

c PO

43- in

TC

A

[

µmol

/l ]

FS-V

erd.

f 1/F

S c

PO43-

in A

ns. 2

-5

[

µm

ol/l

] %

-Ver

glei

ch

Ans

. 2-4

L

eerw

ert =

0

Stan

dard

(200

µm

ol/l)

1 (F

S+C

a2+)

E

1

2 (F

S+ A

TP)

E

2

3 (F

S+C

a2++A

TP)

E3

4

(FS+

EGTA

+ATP

) E4

5 (P

uffe

r + A

TP)

E

5

A

nsat

z

(c

AT

P-Ls

g: 0

,2 m

ol/l)

A

TP-

Ver

d.

f 2

/AT

P ei

nges

etzt

e A

TP-

Kon

z.

je A

ns.

[

µm

ol/l

] R

est-

AT

P-K

onz.

je A

ns=1

00%

(c

ATP

/Ans

- c 5

)

[ µ

mol

/l ]

PO43-

- Kon

z. c

in A

ns. 2

-5

[ µ

mol

/l ]

% U

msa

tz

an A

TP

2 (F

S+ A

TP)

3 (F

S+C

a2++A

TP)

4 (F

S+EG

TA+A

TP)

5 (P

uffe

r + A

TP)

Woc

he 4

Prot

ein-

Ele

ktro

phor

ese

AG

Klä

mbt

/Lam

mel

Gru

ndla

gen

Wen

n ge

lade

ne T

eilc

hen

bzw

. Mol

ekül

e in

ein

ele

ktris

ches

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d ge

brac

ht w

erde

n, w

ird a

uf d

ie

Mol

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e, e

ntsp

rech

end

ihre

r N

etto

ladu

ng (

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nd d

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erw

ende

ten

Feld

stär

ke (

E v),

eine

besc

hleu

nige

nde K

raft

(Fe)

ausg

ewirk

t (F e

= q

* E

), di

e zu

eine

r Wan

deru

ng d

er M

olek

üle f

ührt.

Die

in ei

ner E

lekt

roph

ores

e ver

wen

dete

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dstä

rke e

rgib

t sic

h au

s der

ange

legt

en S

pann

ung

(U)

und

der

Dis

tanz

der

Ele

ktro

den

(l) (

E v =

U/l)

. D

ie W

ande

rung

sric

htun

g de

s M

olek

üls

ist

abhä

ngig

von

sei

ner

Ladu

ng (

posi

tiv o

der

nega

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Die

Ges

amtla

dung

ist

das

Pro

dukt

der

Ladu

ngsz

ahl (

z) u

nd d

er E

lem

enta

rladu

ng (e

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= z

*e).

Die

erz

eugt

e B

eweg

ung

des M

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üls

wird

dur

ch d

ie V

isko

sitä

t des

Med

ium

s bzw

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Por

engr

öße d

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ende

ten

Mat

rix g

ebre

mst

.

Die

Rei

bung

seig

ensc

hafte

n de

s Med

ium

s / d

er M

atrix

wer

den

durc

h de

n R

eibu

ngsk

oeff

izie

nten

(fc)

bes

chrie

ben.

Die

wirk

ende

Rei

bung

skra

ft (F

fr) i

st d

as P

rodu

kt d

es R

eibu

ngsk

oeff

izie

nten

und

der W

ande

rung

sges

chw

indi

gkei

t des

Mol

ekül

s (v)

(Ffr =

f c*

v).

Das

Ver

hältn

is d

er b

eweg

ende

n K

raft

(Fe)

und

der

bre

mse

nden

Kra

ft (F

fr)

bew

irkt

eine

kons

tant

e B

eweg

ung

des M

olek

üls i

m e

lekt

risch

en F

eld

(v =

q *

E/ f

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Die

Bew

egun

g vo

n kl

eine

n ku

gelfö

rmig

en K

örpe

rn i

n ei

ner

Flüs

sigk

eit

wird

dur

ch d

as

Stok

e´sc

he G

eset

z be

schr

iebe

n:

W

= 6

rv

Wob

ei W

der

Rei

bung

swid

erst

and,

v d

ie B

eweg

ungs

gesc

hwin

digk

eit d

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ugel

, V

isko

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t

der F

lüss

igke

it un

d r d

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adiu

s der

Kug

el is

t.

Die

Mob

ilitä

t ( v

on M

olek

ülen

kan

n be

schr

iebe

n w

erde

n du

rch

die

Gle

ichu

ng:

= z

* e

/ 6

r

Aus

die

ser

Gle

ichu

ng w

ird e

rsic

htlic

h, d

ass

die

Mob

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t ein

es M

olek

üls,

das

sich

in e

inem

elek

trisc

hen

Feld

dur

ch e

in M

ediu

m o

der e

ine

Gel

mat

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eweg

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häng

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sei

ner L

adun

g

und

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. Die

obe

n ge

zeig

te F

orm

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esch

reib

t die

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t ein

es k

ugel

förm

igen

Kör

pers

, da

Prot

eine

abe

r nic

ht d

iese

r ide

alis

ierte

n Fo

rm e

ntsp

rech

en, g

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For

mel

für P

rote

ine

nur m

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Kor

rekt

urfa

ktor

en. D

ie T

renn

ung

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ekül

en d

urch

Ele

ktro

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ese

ist d

amit

abhä

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von

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unte

rsch

iedl

iche

n La

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s- u

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eibu

ngse

igen

scha

ften

der M

olek

üle.

Das

bed

eute

t, da

ss

Mol

ekül

e, d

ie s

ich

in d

iese

n Ei

gens

chaf

ten

star

k un

ters

chei

den,

gut

von

eina

nder

get

renn

t

wer

den

könn

en u

nd so

lche

mit

ähnl

iche

n Ei

gens

chaf

ten

schl

echt

er z

u tre

nnen

sind

. Die

Län

ge

der

Lauf

stre

cke

wäh

rend

der

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ktro

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ist b

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uftre

nnun

g vo

n Pr

otei

nen

eben

falls

ein

Fakt

or,

da M

olek

üle

mit

ähnl

iche

n M

obili

täts

eige

nsch

afte

n er

st b

ei l

ange

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ufdi

stan

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deut

lich

vone

inan

der g

etre

nnt w

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n kö

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.

Elek

troph

oret

isch

e A

uftre

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gen

könn

en in

flü

ssig

en M

edie

n du

rchg

efüh

rt w

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n, je

doch

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di

e en

tste

hend

en Z

onen

, in

den

en s

ich

die

Mol

ekül

e s

amm

eln,

anf

ällig

(D

iffus

ion,

- 37

-

Woc

he 4

Prot

ein-

Ele

ktro

phor

ese

AG

Klä

mbt

/Lam

mel

Bew

egun

gen)

. Dah

er w

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n m

eist

fes

te S

ubst

anze

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s M

atric

es f

ür d

ie e

lekt

roph

oret

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e

Auf

trenn

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genu

tzt.

Es

könn

en

z.B

. Pa

pier

, Ze

llulo

se-A

ceta

t, St

ärke

, A

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se

oder

Poly

acry

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id in

Ver

bind

ung

mit

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dene

n El

ektro

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esep

uffe

rn v

erw

ende

t wer

den.

Bei

der V

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endu

ng v

on G

elm

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es fü

r die

ele

ktro

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etis

che

Auf

trenn

ung

kom

mt z

u de

n ob

en

besc

hrie

bene

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obili

täts

para

met

ern

(Lad

ung

und

Rei

bung

seig

ensc

hafte

n) d

ie G

röße

der

zu

trenn

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n M

olek

üle

vers

tärk

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Tre

nnkr

iteriu

m h

inzu

. Bei

der

Auf

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in fe

sten

Med

ien

ist d

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oren

größ

e der

ver

wen

dete

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atrix

für d

en L

aufw

ider

stan

d de

r zu

trenn

ende

n M

olek

üle

maß

gebl

ich.

Gro

ße M

olek

üle

wer

den

unte

r di

esen

Bed

ingu

ngen

stä

rker

geb

rem

st a

ls k

lein

e

Mol

ekül

e, so

das

s ein

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ekul

arsi

ebef

fekt

bei

der

Auf

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ung

in G

elen

hin

zuko

mm

t.

Von

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obe

n ge

nann

ten

fest

en E

lekt

roph

ores

emed

ien

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Aga

rose

und

Pol

yacr

ylam

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wei

test

ver

brei

tete

n. A

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se is

t ein

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ysac

char

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as s

ich

nach

Auf

koch

en b

eim

Abk

ühle

n

zu F

aser

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sam

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lage

rt un

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ele

mit

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tiv g

roße

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reng

röße

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ldet

. A

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sege

le

wer

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häuf

ig v

erw

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t be

i de

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uftre

nnun

g vo

n N

ukle

insä

uren

, kö

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r au

ch z

ur

Auf

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ung

von

groß

en P

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inen

, Pro

tein

kom

plex

en o

der

Nuk

lein

säur

e/Pr

otei

nkom

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en

verw

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t wer

den.

Für

die

Auf

trenn

ung

kom

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er P

rote

inge

mis

che

ist P

olya

cryl

amid

das

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figst

ver

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dete

Gel

med

ium

. Gel

e au

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lyac

ryla

mid

wer

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durc

h ra

dika

lisch

e Po

lym

eris

atio

n er

zeug

t. D

ie

Pore

ngrö

ße d

er p

olym

eris

ierte

n A

cryl

amid

gele

ist d

urch

das

leic

ht z

u va

riier

ende

Ver

hältn

is

der

verw

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ten

Rea

genz

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gut

zu b

eein

fluss

en,

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die

Gen

erie

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en m

it

geei

gnet

en

Tren

neig

ensc

hafte

n fü

r M

olek

üle

unte

rsch

iedl

iche

r G

röße

er

laub

t.

Poly

acry

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idge

le k

önne

n üb

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eite

pH

-Ber

eich

e ei

nges

etzt

wer

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sin

d tra

nspa

rent

und

chem

isch

wei

tgeh

end

iner

t. D

adur

ch la

ssen

sic

h Pr

otei

nban

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durc

h ei

ne F

ärbu

ng w

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.B.

Coo

mas

sie-

Bla

u im

Gel

nac

hwei

sen.

Die

von

uns

im P

rakt

ikum

ver

wen

dete

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lyac

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mid

gele

sind

flac

he G

ele,

die

sich

zw

isch

en

zwei

Gla

spla

tten

befin

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Zum

Anf

ertig

en e

ines

Pol

yacr

ylam

idge

ls w

ird e

ine

Mis

chun

g au

s

Acr

ylam

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,N´-

Met

hyle

nbis

acry

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, N, N

´, N

´– T

etra

met

hyl-e

thyl

endi

amin

(TEM

ED)

und

Am

mon

ium

pero

xodi

sulfa

t (A

PS)

in w

ässr

iger

Puf

ferlö

sung

gem

isch

t und

zw

isch

en d

ie

abge

dich

tete

n G

lasp

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goss

en.

Dur

ch

die

Mis

chun

g de

r K

ompo

nent

en

wird

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e

Poly

mer

isat

ions

reak

tion

gest

arte

t. B

ei

der

radi

kalis

chen

Po

lym

eris

atio

n di

ent

Am

mon

ium

pero

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sulfa

t al

s R

adik

alst

arte

r un

d TE

MED

kat

alys

iert

die

Ents

tehu

ng f

reie

r

Rad

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e au

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mm

oniu

mpe

roxo

disu

lfat.

Aus

den

Mon

omer

en d

es A

cryl

amid

wer

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linea

re

Poly

mer

e ge

bild

et,

die

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h da

s ei

nges

etzt

e N

, N

´-M

ethy

lenb

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ryla

mid

que

r ve

rnet

zt

wer

den.

Die

Por

engr

öße

der

so e

rzeu

gten

Gel

e hä

ngt a

b vo

n de

m V

erhä

ltnis

von

Acr

ylam

id

und

N,N

´-M

ethy

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ryla

mid

(C

-Wer

t )

und

von

der

Men

ge d

iese

s G

emis

ches

, da

s zu

r

- 38

-

Woc

he 4

Prot

ein-

Ele

ktro

phor

ese

AG

Klä

mbt

/Lam

mel

Rea

ktio

nsm

isch

ung

zuge

gebe

n w

ird (T

-Wer

t). D

er T

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t bes

chre

ibt d

ie M

enge

der

insg

esam

t

eing

eset

zten

Mon

omer

e (A

cryl

amid

und

N,N

´-M

ethy

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mid

) in

Gew

icht

spro

zent

pro

Vol

umen

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w/v

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d er

rech

net

sich

aus

fol

gend

er F

orm

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T =

Acr

ylam

id (

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N,N

´-

Met

hyle

nbis

acry

lam

id (

g)*

100

/ 10

0 m

l. D

er C

-Wer

t gi

bt d

as V

erhä

ltnis

von

N,N

´-

Met

hyle

nbis

acry

lam

id z

u A

cryl

amid

im G

emis

ch in

Gew

icht

spro

zent

(%

w/w

) an

und

wird

bere

chne

t mit

der F

orm

el: C

= N

,N´-

Met

hyle

nbis

acry

lam

id (g

) *

100

/ A

cryl

amid

(g) +

N,N

´-

Met

hyle

nbis

acry

lam

id (

g).

Bei

kon

stan

tem

C-W

ert

und

stei

gend

em T

-Wer

t si

nkt

die

Pore

ngrö

ße. B

ei h

ohen

und

nie

drig

en C

-Wer

ten

nim

mt d

ie P

oren

größ

e zu

und

ein

Min

imum

liegt

bei

C =

5%

. Die

Acr

ylam

idko

nzen

tratio

n, u

nd d

amit

die

erze

ugte

Por

engr

öße

des

Gel

s,

beei

nflu

sst d

en T

renn

bere

ich

der P

rote

ine.

Wir

verw

ende

n hi

er e

in M

onom

erge

mis

ch a

us 3

0%

Acr

ylam

id u

nd 0

,8%

N,N

´-M

ethy

lenb

isac

ryla

mid

. Um

ein

e op

timal

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uftre

nnun

g de

r Pro

tein

e

vers

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dene

r G

röße

n zu

err

eich

en, s

ollte

die

gee

igne

te K

onze

ntra

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Acr

ylam

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erw

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t

wer

den.

Die

Acr

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idko

nzen

tratio

n fü

r di

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uftre

nnun

g vo

n Pr

otei

nen

vers

chie

dene

r

Grö

ßenb

erei

che

ist i

n de

r Tab

elle

auf

gefü

hrt.

Prot

eing

röße

(kD

a)

% fi

nale

Acr

ylam

id K

onze

ntra

tion

40-2

05

5%

25-2

05

7,5%

15-2

05

10%

15-6

6 12

,5%

15-4

5 15

%

Elek

troph

ores

en

könn

en

unte

rteilt

w

erde

n in

ko

ntin

uier

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un

d di

skon

tinui

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he

Elek

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ores

en.

In

kont

inui

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hen

Gel

elek

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ores

en

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dies

elbe

n Pu

ffer

m

it

kons

tant

em p

H-W

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m G

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en E

lekt

rode

nkam

mer

n un

d Pr

oben

ver

wen

det,

wen

n au

ch b

ei

spez

ielle

n A

pplik

atio

nen

in u

nter

schi

edlic

hen

Kon

zent

ratio

nen.

Im G

egen

satz

daz

u kö

nnen

bei

disk

ontin

uier

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n El

ektro

phor

esen

unt

ersc

hied

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Puf

ferk

onze

ntra

tione

n, p

H-W

erte

und

Pore

ngrö

ßen

inne

rhal

b de

s Gel

s und

der

Ele

ktro

denk

amm

ern

verw

ende

t wer

den.

Bei

der

hie

r ve

rwen

dete

n di

skon

tinui

erlic

hen

Gel

elek

troph

ores

e (L

aem

mli

1970

) w

ird i

m

unte

ren

Ber

eich

der

Gla

spla

tten

zunä

chst

das

Tre

nnge

l ge

goss

en.

Im T

renn

gel

wird

die

Puff

erko

nzen

tratio

n vo

n 0,

375m

ol/L

Tris

-Cl

(pH

8,8

), 0,

1% S

DS

eing

eset

zt.

Übe

r de

m

Tren

ngel

wird

spä

ter e

in S

amm

elge

l geg

osse

n m

it ei

ner P

uffe

rkon

zent

ratio

n vo

n 0,

125m

ol/L

Tris

-Cl (

pH 6

.8),

0,1%

SD

S. D

er v

erw

ende

te E

lekt

rode

npuf

fer i

st z

usam

men

gese

tzt a

us 2

5mM

Tris

(p

H

8,3)

, 0,

192M

G

lyci

n,

0,1%

SD

S.

Es

wer

den

hier

al

so

unte

rsch

iedl

iche

Puff

erko

nzen

tratio

nen

und

pH-W

erte

in T

renn

- und

Sam

mel

-Gel

ver

wen

det.

- 39

-

Woc

he 4

Prot

ein-

Ele

ktro

phor

ese

AG

Klä

mbt

/Lam

mel

Zusä

tzlic

h zu

den

dis

kont

inui

erlic

hen

pH-W

erte

n w

ird im

Sam

mel

gel e

ine

höhe

re P

oren

größ

e

verw

ende

t. D

ie P

robe

n w

erde

n da

nn in

Gel

tasc

hen

auf d

as S

amm

elge

l auf

getra

gen.

Dur

ch d

en

nied

rigen

pH

-Wer

t im

Sam

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gel

und

die

Ver

wen

dung

von

Gly

cin

(Fol

ge-I

onen

) im

Elek

trode

npuf

fer

und

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onen

(L

eit-I

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) im

Tr

enn-

/Sam

mel

gel-P

uffe

r w

ird

ein

Sam

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effe

kt d

er P

rote

ine

in d

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robe

erz

eugt

. Die

Pro

tein

e sa

mm

eln

sich

zu

eine

r sch

mal

en

Ban

de z

wis

chen

Lei

t- un

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lge-

Ione

n an

. Bei

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berg

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rote

ine

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Sam

mel

gel i

ns

Tren

ngel

erh

öht s

ich

der

Lauf

wid

erst

and

aufg

rund

der

ger

inge

ren

Pore

ngrö

ße im

Tre

nn-G

el

und

der p

H-W

ert i

st im

Tre

nnge

l höh

er a

ls im

Sam

mel

gel.

Die

Gly

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Ione

n üb

erho

len

weg

en

ihre

r ger

inge

ren

Mol

ekül

größ

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s ve

ränd

erte

n pH

-Wer

tes

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Prot

eine

, die

sic

h zu

ein

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n de

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renn

gel

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n. N

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gt d

ie A

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nnun

g de

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Prot

eine

in e

inem

hom

ogen

en P

uffe

r im

Tre

nnge

l.

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eine

si

nd

aus

Am

inos

äure

n zu

sam

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gese

tzt,

die

sich

be

zügl

ich

ihre

r

Ladu

ngse

igen

scha

ften

in

den

Seite

nres

ten

zum

Te

il st

ark

unte

rsch

eide

n.

Da

die

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troph

oret

isch

e M

obili

tät

von

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eine

n au

ch v

on d

er L

adun

g ab

häng

t, sp

ielt

nebe

n de

r

Mol

ekül

größ

e eb

enfa

lls d

ie A

min

osäu

rese

quen

z ei

ne R

olle

. Is

t ei

ne P

rote

inau

ftren

nung

unab

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ig ih

rer E

igen

ladu

ng e

rwün

scht

, z.B

. zur

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ekul

arge

wic

htsb

estim

mun

g, w

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ine

Poly

acry

lam

id-G

elel

ektro

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ese

in A

nwes

enhe

it vo

n SD

S (e

ngl.

Sodi

um-D

odec

ylsu

lfate

Na+ [C

H3-

(CH

2)10

-CH

2OSO

3- ]),

eine

s an

ioni

sche

n D

eter

gens

, du

rchg

efüh

rt. S

DS

bind

et a

n

hydr

opho

be R

egio

nen

des

Prot

eins

und

ent

falte

t es

. M

ultim

ere

Prot

eine

dis

sozi

iere

n na

ch

Erhi

tzen

in S

DS

halti

ger L

ösun

g (<

95°

C) i

n ih

re U

nter

einh

eite

n. M

it de

r Bin

dung

von

ca.

1,4

g

SDS

/ g P

rote

in w

erde

n st

arke

neg

ativ

e La

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en e

inge

führ

t, de

ren

Sum

me

prop

ortio

nal z

ur

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einm

asse

ist

. D

isul

fidbr

ücke

n w

erde

n du

rch

Zuga

be r

eduz

iere

nder

Sub

stan

zen,

wie

-

Mer

capt

oeth

anol

(HO

-CH

2-C

H2-

SH) o

der D

ithio

thre

itol (

DTT

, HS-

CH

2-C

HO

H-C

HO

H-C

H2-

SH)

gelö

st.

Die

Bew

eglic

hkei

t de

r Pr

otei

ne d

urch

die

Tre

nnge

lmat

rix i

st u

nter

die

sen

Bed

ingu

ngen

übe

r w

eite

Ber

eich

e lin

ear

zu d

en L

ogar

ithm

en i

hrer

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ekul

arge

wic

hte.

Dad

urch

ist e

s m

öglic

h, d

as re

lativ

e M

olek

ular

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icht

ein

es P

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ins

durc

h V

ergl

eich

mit

der

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troph

oret

isch

en M

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tät v

on P

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inen

bek

annt

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olek

ular

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icht

s (G

röße

nmar

ker)

zu

erm

ittel

n.

Für

die

Bes

timm

ung

des

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arge

wic

hts

von

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eine

n w

ird

eine

Gel

elek

troph

ores

e du

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efüh

rt, b

ei d

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uf e

inem

Gel

die

Pro

be d

es P

rote

ins

und

ein

Grö

ßenm

arke

r in

un

ters

chie

dlic

hen

Spur

en

nebe

nein

ande

r au

fget

renn

t w

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n.

Nac

h

Aus

mes

sen

der

Wan

deru

ngss

treck

en

der

einz

elne

n G

röße

nmar

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n na

ch

der

Elek

troph

ores

e ka

nn e

ine

Eich

gera

de e

rste

llt w

erde

n.

- 40

-

Woc

he 4

Prot

ein-

Ele

ktro

phor

ese

AG

Klä

mbt

/Lam

mel

Anf

ertig

en v

on A

cryl

amid

gele

n fü

r di

e SD

S-PA

GE

D

ie G

ele

für

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Kur

s w

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n ge

stel

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er A

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r da

s G

ieße

n de

r G

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wird

im K

urs

geze

igt w

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n. D

a di

e R

eakt

ions

mis

chun

g fü

r die

Pol

ymer

isat

ion

der A

cryl

amid

gele

zun

ächs

t

flüss

ig is

t, m

uss v

or d

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efül

len

der A

ppar

atur

sich

erge

stel

lt w

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ass d

iese

dic

ht is

t. D

ies

kann

get

este

t wer

den,

inde

m m

an E

than

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chen

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Gla

spla

tten

gibt

und

beo

bach

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ob d

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ober

e Fl

üssi

gkei

tssp

iege

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inkt

. Wen

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s de

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ll is

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uss

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App

arat

ur n

eu a

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baut

wer

den.

Wen

n di

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ele

in d

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ießs

tänd

en d

icht

sin

d, k

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Rea

ktio

nsm

isch

ung

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mm

enge

setz

t w

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n (e

ntsp

rech

end

der

unte

n be

schr

iebe

nen

Rez

eptu

r).

Bei

de

r

Anf

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ung

der G

ele

ist d

arau

f zu

acht

en, d

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cryl

amid

in fl

üssi

ger

Form

gift

ig is

t! A

lso

wer

den

alle

Arb

eite

n m

it de

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tigen

Sor

gfal

t, un

ter

Ver

wen

dung

gee

igne

ter

pers

önlic

her

Schu

tzau

srüs

tung

, unt

er e

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Abz

ug d

urch

gefü

hrt.

Die

Res

te d

er R

eakt

ions

mis

chun

g w

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n

vor

der

Ents

orgu

ng

poly

mer

isie

rt.

Alle

ko

ntam

inie

rten

Abf

älle

w

erde

n in

di

e da

für

vorg

eseh

enen

Son

dera

bfal

lbeh

älte

r geg

eben

.

Ver

wen

dete

Lös

unge

n zu

r A

nfer

tigun

g ei

nes A

cryl

amid

-Gel

s

Acr

ylam

id S

tam

mlö

sung

:

30%

(w/v

) Acr

ylam

id

0,

8% (w

/v) N

,N´-

Met

hyle

nbis

acry

lam

id

SDS

10%

(w/v

)

A

mm

oniu

mpe

roxo

disu

lfat:

10

% (w

/v)

TE

ME

D

pr

o an

alys

is 9

9%

Sam

mel

gelp

uffe

r:

0,5M

Tris

-Cl p

H 6

,8

Tre

nnge

lpuf

fer:

1,

5M T

ris-C

l pH

8,8

E

lekt

rode

npuf

fer:

0,

025M

Tris

, 0,1

92M

Gly

cin,

0,1

% S

DS

pH 8

.3

Zus

amm

ense

tzun

g de

r R

eakt

ions

mis

chun

g fü

r da

s Tre

nnge

l D

ie R

eakt

ions

mis

chun

g fü

r zw

ei G

ele

eine

r Kon

zent

ratio

n vo

n 10

% w

ird b

este

ht a

us:

Tren

ngel

puff

er

7,5m

ldd

H2O

12

ml

SDS

10%

0,

3ml

Acr

ylam

id-S

tam

mlö

sung

10m

l TE

MED

10l

APS

10%

15

0l

Das

Tre

nnge

l wird

bis

zu

eine

r Höh

e vo

n et

wa

6 cm

zw

isch

en d

ie v

orbe

reite

ten

Plat

ten

gefü

llt,

vors

icht

ig m

it w

enig

Isop

ropa

nol ü

bers

chic

htet

und

die

Pol

ymer

isat

ion

wird

abg

ewar

tet.

- 41

-

Woc

he 4

Prot

ein-

Ele

ktro

phor

ese

AG

Klä

mbt

/Lam

mel

Zus

amm

ense

tzun

g de

r R

eakt

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mis

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g fü

r da

s Sam

mel

gel

Die

Rea

ktio

nsm

isch

ung

für

zwei

Gel

e m

it ei

ner

Sam

mel

gelk

onze

ntra

tion

von

4% w

ird

zusa

mm

enge

setz

t aus

:

Sam

mel

gelp

uffe

r 2,

5ml

ddH

2O

6ml

SDS

10%

0,

1ml

Acr

ylam

id-S

tam

mlö

sung

1,

3ml

TEM

ED5

lA

PS 1

0%50

l

Vor

der

Zug

abe

der

Sam

mel

gellö

sung

mus

s da

s Is

opro

pano

l en

tfern

t w

erde

n, m

it de

m d

as

Tren

ngel

übe

rsch

icht

et w

urde

. N

achd

em d

ie S

amm

elge

llösu

ng z

ugeg

eben

wur

de,

wird

der

Prob

enka

mm

in d

ie S

amm

elge

llösu

ng zw

isch

en d

ie G

lasp

latte

n ge

stec

kt. W

enn

das S

amm

elge

l

ausg

ehär

tet i

st, w

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er P

robe

nkam

m e

ntfe

rnt u

nd d

as G

el w

ird m

it Sp

acer

n un

d G

lasp

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n

in d

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lekt

roph

ores

ekam

mer

übe

rfüh

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ie P

ositi

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robe

ntas

chen

und

die

Gre

nze

von

Sam

mel

- un

d Tr

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Gel

wer

den

mar

kier

t. V

or d

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elad

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elta

sche

n m

it de

n Pr

oben

wird

der

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ktro

denp

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r in

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fapp

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ur g

efül

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evor

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Pro

ben

eing

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n,

bitte

dar

auf a

chte

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ass

das

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luftb

lase

nfre

i an

beid

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nden

mit

dem

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ktro

denp

uffe

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Kon

takt

ste

ht. N

achd

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robe

n in

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Pro

bent

asch

en e

inge

brac

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orde

n si

nd k

ann,

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Elek

troph

ores

e ge

star

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n.

Prot

einp

robe

n fü

r di

e SD

S-Pa

ge

Bei

der

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ktro

phor

etis

chen

Auf

trenn

ung

von

kom

plex

en P

rote

inge

mis

chen

, w

ie s

ie d

urch

eine

n A

ufsc

hluß

von

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len

oder

von

Ges

amto

rgan

ism

en e

ntst

ehen

, bi

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sic

h be

i de

r

Auf

trenn

ung

eine

Vie

lzah

l vo

n B

ande

n, d

ie d

ie g

roße

Men

ge u

nter

schi

edlic

her

Prot

eine

wid

ersp

iege

ln,

die

von

Zelle

n od

er O

rgan

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en p

rodu

zier

t w

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n. E

ine

groß

e Za

hl v

on

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eine

n is

t in

alle

n Ze

llen

vorh

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n, d

a si

e fü

r den

Sto

ffw

echs

el o

der d

ie Z

ells

trukt

ur a

ller

Zelle

n es

sent

iell

sind

. Den

noch

unt

ersc

heid

et si

ch d

er S

atz

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eine

n in

nerh

alb

der Z

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n

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s O

rgan

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us

oder

ve

rsch

iede

ner

Entw

ickl

ungs

stad

ien,

da

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rsch

iede

ne

Zellt

ypen

unte

rsch

iedl

iche

Fun

ktio

nen

besi

tzen

und

dah

er P

rote

ine

synt

hetis

iere

n, d

ie f

ür d

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u

erfü

llend

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nktio

n be

nötig

t wer

den.

Die

Dar

stel

lung

der

diff

eren

tiell

expr

imie

rten

Prot

eine

erfo

rder

t ent

wed

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ocha

uflö

send

e Tre

nnsy

stem

e (2D

-Ele

ktro

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ese)

und

/ode

r ein

e vor

herig

e

Frak

tioni

erun

g.

Unt

er g

ünst

igen

Bed

ingu

ngen

kan

n ei

n un

ters

chie

dlic

her

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einb

esta

nd j

edoc

h au

ch i

n

Ges

amte

xtra

kten

da

rges

tellt

w

erde

n.

Als

B

eisp

iel

eine

r na

chw

eisb

aren

di

ffer

entie

llen

- 42

-

Woc

he 4

Prot

ein-

Ele

ktro

phor

ese

AG

Klä

mbt

/Lam

mel

Prot

eine

xpre

ssio

n di

enen

für

das

Pra

ktik

um D

otte

rpro

tein

e vo

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roso

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anog

aste

r.

Dot

terp

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ine

wer

den

von

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Mut

terti

eren

in

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Ooc

yten

ein

gela

gert

und

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Nah

rung

s-

liefe

rant

für d

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ntw

ickl

ung

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n ge

nutz

t. D

ie H

aupt

kom

pone

nte

des D

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rs w

ird

von

drei

Pol

ypep

tiden

ges

tellt

, die

als

Vite

lloge

nin

1-3

beze

ichn

et w

erde

n. D

ie G

ene,

die

die

se

Prot

eine

kod

iere

n un

d al

s YP

(1-3

) (en

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otte

r = y

olk)

bez

eich

net w

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n, li

egen

auf

dem

X-

Chr

omos

om. D

ie V

itello

geni

ne w

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n na

ch p

osttr

ansl

atio

nale

n M

odifi

katio

nen

in d

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ocyt

e

eing

elag

ert.

Prob

envo

rber

eitu

ngfü

r di

e SD

S -P

AG

E

Es w

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pend

orfm

ikro

reak

tions

gefä

ße g

este

llt,

in d

enen

sic

h ad

ulte

Wei

bche

n, a

dulte

Män

nche

n un

d Em

bryo

nen

in je

wei

ls 5

0l P

BS/

2%SD

S in

ein

gefr

oren

em Z

usta

nd b

efin

den.

Mit

eine

m H

omog

enis

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nspi

stel

l wer

den

die

Prob

en m

echa

nisc

h au

f Eis

zer

klei

nert,

mit

50l

2xPr

oben

puff

er v

erse

tzt,

für 5

Min

uten

in e

inem

Was

serb

ad (>

95°C

) erh

itzt,

auf E

is a

bgek

ühlt

und

für 5

Min

uten

mit

13.0

00 rp

m in

ein

er T

isch

zent

rifug

e ze

ntrif

ugie

rt. D

ann

wer

den

je 1

0l

für d

en G

ella

uf in

die

Pro

bent

asch

en d

es G

els ü

berf

ührt.

Die

se P

robe

n un

d w

eite

re v

orbe

reite

te

Prob

en m

it Pr

otei

nen

vers

chie

dene

n M

olek

ular

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icht

s für

die

Ele

ktro

phor

ese w

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n ge

stel

lt.

Lös

unge

nPB

S/2%

SDS

0,13

M N

aCl

2x

Prob

enpu

ffer

0,

125M

Tris

-Cl (

pH 6

,8)

7mM

Na 2

HPO

4

4%SD

S

3m

M N

aH2P

O4

20

% G

lyce

rol (

v/v)

2%

SD

S (w

/v)

0,

2M D

TT

(pH

7,6

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0,

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enol

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2

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bum

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0,

2

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lbum

in, H

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glyc

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27

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rase

29

0,

13

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sin

Inhi

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r, So

ja

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-130

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ella

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Mol

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Grö

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gen

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Der

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kerp

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gen.

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Cel

lulo

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etat

stre

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auf

getra

gen.

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den

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lulo

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uten

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- 45

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Woc

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Ele

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AG

Klä

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Färb

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den

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stre

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ng g

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t und

leic

ht

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ie E

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Lösu

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ehre

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bis

die

Hin

terg

rund

färb

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inde

t. D

ie F

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lösu

ng w

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r ver

wen

det u

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ie b

enut

zte

Entfä

rbe-

Lösu

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ird

in S

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elbe

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r für

Lös

emitt

elab

fälle

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.

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chw

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Färb

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Am

idos

chw

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l Met

hano

l

400m

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2O

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50

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600m

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l

200m

l ddH

2O

Farb

lösu

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0,

25%

w/v

Bro

mph

enol

blau

0,

25%

w/v

Xyl

enec

yano

l FF

30%

v/v

Gly

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Ban

den

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und

die

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r G

luco

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-

Phos

phat

Deh

ydro

gena

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6PD

) mit

eine

r Far

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chw

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ie A

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l (F

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1991

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er G

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troph

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unte

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n. D

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s A

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den.

Die

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. D

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den

vorb

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tet

und

müs

sen

vor

dem

A

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gen

der

Prob

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Min

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der

Elek

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wer

den.

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n w

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n je

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der

Pro

ben

mit

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arbl

ösun

g

- 46

-

Woc

he 4

Prot

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Ele

ktro

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AG

Klä

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(s. o

.) in

die

Gel

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t. D

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Sei

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er K

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latz

iert

und

die

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rtet.

Nac

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m G

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as G

el a

uf e

in m

it Fä

rbel

ösun

g

geträ

nkte

s Fi

lterp

apie

r ge

legt

und

bei

37°

C i

n ei

ner

feuc

hten

Kam

mer

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rt, b

is d

ie

Farb

reak

tion

sich

tbar

wird

.

Lau

fpuf

fer:

13,6

mM

Tris

pH

9,1

15

mM

Bor

säur

e

4m

M E

DTA

Gel

:

0,

9% A

garo

se in

Lau

fpuf

fer

0,13

mM

NA

DP

G6P

D-F

ärbe

lösu

ng:

4mM

MgC

l 2

10

mM

Glu

kose

-6-P

hosp

hat

0,19

6mM

Phe

nazi

n m

etho

sulfa

t (PM

S)

12m

M 3

-(4,

5-di

-met

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iazo

l-2-y

l)-2,

5-di

phen

ylte

trazo

lium

bro

mid

Aus

wer

tung

:

Ver

glei

chen

Sie

die

Lau

fspu

ren

mit

den

vers

chie

dene

n Pr

oben

nac

h de

r Fär

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. Ist

ein

Unt

ersc

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zw

isch

en d

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n de

r jew

eilig

en P

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n zu

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lulo

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A

and

Prot

ein

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and

enl

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. Wile

y-V

CH

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nhei

m (2

005)

- 47

-

Woc

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Prot

ein-

Ele

ktro

phor

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AG

Klä

mbt

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Frag

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Wel

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Med

ium

s

Ladu

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des

Tei

lche

ns

O

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ieru

ng d

es e

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risch

en F

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s

Wel

che

Kom

pone

nten

bes

timm

en d

ie P

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von

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ylam

id-G

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A

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amid

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ED

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N

, N´-

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lam

id

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S

Wel

che

Kom

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tzun

g in

Acr

ylam

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elen

not

wen

dig?

A

mm

oniu

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disu

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N

, N´-

Met

hyle

nbis

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lam

id

TEM

ED

Acr

ylam

id

SD

S

Wel

che

Kom

pone

nten

wer

den

als

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ikal

star

ter

bei

der

Erze

ugun

g vo

n A

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amid

-Gel

en

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N

, N´-

Met

hyle

nbis

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lam

id

A

cryl

amid

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Tr

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t

Wel

che

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wel

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Ele

ktro

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esen

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die

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getre

nnte

n Pr

otei

ne in

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ivem

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?

- 48

-

Woc

he 5

Res

piro

met

rie

AG

Pau

l/Boi

ani

1. A

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eine

Bem

erku

ngen

Res

piro

met

risch

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n in

der

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nen

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den

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nen.

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er

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te

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wel

tbed

ingu

ngen

. Je

nac

hdem

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es

sich

um

Luf

tatm

er o

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tmer

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delt,

kom

men

unt

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ng. I

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esem

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chni

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ll m

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resp

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cher

Met

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n di

e Te

mpe

ratu

rabh

ängi

gkei

t de

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Stof

fwec

hsel

rate

ein

es h

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ther

men

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tatm

ers

und

eine

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ikilo

ther

men

Was

sera

tmer

s

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ht w

erde

n.

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rund

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n 2.

1.

Mes

sung

de

r O

2-V

erbr

auch

srat

e ei

nes

Luf

tatm

ers

in

eine

m

gesc

hlos

sene

n

Res

piro

met

er

Prin

zipi

ell

könn

en

Gas

wec

hsel

mes

sung

en

in

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gesc

hlos

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n Sy

stem

un

ter

Kon

stan

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tung

des

Dru

cks

oder

unt

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onst

anth

altu

ng d

es V

olum

ens

durc

hgef

ührt

wer

den.

Im K

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ersu

ch s

oll

der

O2-

Ver

brau

ch e

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Luf

tatm

ers

bei

kons

tant

em D

ruck

bes

timm

t

wer

den.

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wird

das

in A

bb. 1

dar

gest

ellte

Res

piro

met

er v

erw

ende

t. N

ach

Auf

setz

en d

es

Kam

mer

deck

els

und

Ver

schl

ieße

n de

s D

reiw

egeh

ahns

kom

mt

es v

orüb

erge

hend

zu

eine

m

Dru

ckab

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in d

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amm

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a de

r Sa

uers

toff

ver

atm

et u

nd d

as a

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eben

e K

ohle

ndio

xid

durc

h K

OH

geb

unde

n w

ird.

Nac

h Er

reic

hen

eine

r be

stim

mte

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diff

eren

z w

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as

Kam

mer

volu

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übe

r ein

e Sp

ritze

ver

ringe

rt un

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z au

f Nul

l zur

ückg

efüh

rt.

Das

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rbra

ucht

e" S

pritz

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lum

en V

(ml)

ents

pric

ht d

er M

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htem

Sau

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ch a

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pres

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, dry

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um

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chne

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den.

Nac

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m a

llgem

eine

n G

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setz

gilt

:

0

0

0

PV

PV

TT

(1

)

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der

Dru

ck (

kPa)

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das

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rauc

hte

O2-

Vol

umen

(m

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d T

die

abso

lute

Mes

stem

pera

tur

T (in

Kel

vin!

) is

t. P 0

, V0

und

T 0 s

ind

fest

e G

röße

n un

d be

zieh

en s

ich

auf

Stan

dard

bedi

ngun

gen

(sie

he T

ab. 1

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er D

ruck

P m

uss

aus

der D

iffer

enz

von

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ruck

PL

(mB

ar)

und

Was

serd

ampf

druc

k P W

(kP

a) b

erec

hnet

wer

den

(P=P

L–P W

; Ei

nhei

ten

vorh

er

umre

chne

n!).

Der

Was

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ampf

druc

k P W

ent

spric

ht d

em P

artia

ldru

ck d

es W

asse

rs, d

er si

ch b

ei

100

%ig

er L

uftfe

ucht

e ei

nste

llt. E

r ist

abh

ängi

g vo

n de

r Ver

such

stem

pera

tur u

nd k

ann

aus T

ab.

3 en

tnom

men

wer

den.

Nac

h U

mst

ellu

ng v

on G

l. (1

) ka

nn d

as v

erbr

auch

te O

2-V

olum

en

(kor

rigie

rt au

f STP

D) w

ie fo

lgt b

erec

hnet

wer

den:

- 49

-

Woc

he 5

Res

piro

met

rie

AG

Pau

l/Boi

ani

0

00

PV

TV

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(2

)

Die

Sau

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offv

erbr

auch

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e V

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t sic

h na

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ivis

ion

durc

h di

e M

essd

auer

t (

h):

t

VV

0

(3)

Um

die

O2-

Ver

brau

chsr

ate

vers

chie

den

groß

er T

iere

ver

glei

chen

zu

könn

en, w

ird s

chlie

ßlic

h

noch

ein

e N

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ieru

ng a

uf G

ram

m K

örpe

rmas

se v

orge

nom

men

. Die

se so

gen

annt

e sp

ezifi

sche

O2-

Ver

brau

chsr

ate

spez

V (m

l h–1

g–1

) erh

ält m

an n

ach:

mV

Vsp

ez

(4)

Tab.

1. P

aram

eter

zur

Ber

echn

ung

der O

2-V

erbr

auch

srat

e ei

nes L

ufta

tmer

s

Sy

mbo

l W

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inhe

it B

esch

reib

ung

Bem

erku

ngen

m

g

Kör

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asse

des

Tie

res

P kP

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ruck

unt

er V

ersu

chsb

edin

gung

en

P 0

101.

3 kP

a St

anda

rddr

uck

unte

r Ver

such

sbed

ingu

ngen

P L

m

bar

Luftd

ruck

10

mba

r = 1

kPa

P W

kP

a W

asse

rdam

pfdr

uck

sieh

e Ta

b. 3

T

K

Ver

such

stem

pera

tur

0 °C

= 2

73.1

5 K

T 0

27

3.15

K

Stan

dard

tem

pera

tur

V m

l ve

rbra

ucht

es O

2-V

olum

en (g

emes

sen)

V 0

m

l ve

rbra

ucht

es O

2-V

olum

en (k

orrig

iert

auf S

TPD

) V

m

l h–1

O

2-V

erbr

auch

srat

e sp

ezV

m

l h–1

g–1

sp

ezifi

sche

O2-

Ver

brau

chsr

ate

t h

Mes

sdau

er

- 50

-

Woc

he 5

Res

piro

met

rie

AG

Pau

l/Boi

ani

Abb.

1.��

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es��

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���

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s����

Ve��

����

�s��

����

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t�e�

����

���

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��es

��e�

��es

��e�

���e

t�s��

��e�

�e��

��ss

����

e��

�t�e�

�e�

��

���

��s�

��e�

s���

��

���s

����

����s

�T�e

�����

����

���e�

�pe�

����

e�te

����

�s��

e���

�e��

�ese

tzt��

���

e��e

���

��t�

�t��

�t��e

���t

ze��

e���

��

���s

����

z���

e��

e��e

����

����

��st

��t�

��t�

����

e��

Te�

pe��

t����

� ���

��s��

ess�

e���

����e

��e�

�te�

pe��

e���

�e��

��s

se��

����

e�se

��t��

2.2.

M

essu

ng

der

O2-

Ver

brau

chsr

ate

eine

s W

asse

ratm

ers

in

eine

m

gesc

hlos

sene

n

Res

piro

met

er

Die

Sau

erst

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erbr

auch

srat

e ei

nes

Was

sera

tmer

s ka

nn in

ein

em g

esch

loss

enen

�es

piro

met

er

mitt

els e

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Sau

erst

offe

lekt

rode

gem

esse

n �

erde

n. D

as M

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rinzi

p be

ruht

auf

der

�ed

uktio

n

von

Saue

rsto

ff a

n de

r (ne

gativ

gel

aden

en) P

latin

-Kat

hode

2

22

2O

2�O

2e�

O2O

�.

�us

dem

geb

ildet

en �

2O2 e

ntst

ehen

nac

h �

ufna

hme

von

z�ei

�ei

tere

n �l

ektro

nen

z�ei

O�

– -

�one

n. �

n de

r �ef

eren

z-Si

lber

-�no

de �

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leic

hzei

tig S

ilber

unt

er �

bgab

e ei

nes �

lekt

rons

zu

�g�

o�id

iert.

D

ie

�ed

uktio

n vo

n Sa

uers

toff

f�

hrt

zu

eine

m

Stro

mflu

ss�

�el

cher

de

r

Saue

rsto

ffko

nzen

tratio

n in

der

�es

piro

met

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mm

er p

ropo

rtion

al is

t.

Vor

�ede

r Mes

sung

ist d

ie S

auer

stof

fele

ktro

de m

it gu

t bel

�fte

tem

Was

ser (

100

� L

ufts

�ttig

ung)

und

O2-

frei

em W

asse

r (0

� L

ufts

�ttig

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zu

kalib

riere

n. �

ach

�ins

etze

n de

s Ti

eres

in

bel�

ftete

m W

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r kom

mt e

s au

fgru

nd d

er �

tmun

gsak

tivit�

t zu

eine

m �

bfal

l des

O2-

�eh

alts

in d

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espi

rom

eter

kam

mer

. �s �

ird d

ie �

eitd

auer

t (

h) b

is z

um �

rrei

chen

ein

er b

estim

mte

n

- 5�

-

Woc

he 5

Res

piro

met

rie

AG

Pau

l/Boi

ani

Lufts

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ungs

diff

eren

z �

(�)

gem

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n.

�us

di

esen

be

iden

r��e

n ka

nn

die

Saue

rsto

ffve

rbra

uchs

rate

des

Tie

res

� (n

mol

h–1

) �ie

folg

t ber

echn

et �

erde

n�

t

��

��

100

(5

)

Die

r��e

(n

mol

) st

ellt

die

in

bel�

ftete

m

Was

ser

(100

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�ttig

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ge

l�st

e

Saue

rsto

ffm

enge

da

r. Si

e �

ird

aus

dem

�l

�ssi

gkei

tsvo

lum

en

V (l)

� de

m

L�sl

ichk

eits

koef

fizie

nten

von

O2

in W

asse

r (�

mol

l–1 k

Pa–1

) un

d de

m O

2-Pa

rtial

druc

k P O

2

(kPa

) err

echn

et�

2

O�

VP

. (�

)

Der

O

2-Pa

rtial

druc

k er

gibt

si

ch

aus

der

Diff

eren

z vo

n Lu

ftdru

ck

P L

(m�

ar)

und

Was

serd

ampf

druc

k P W

(P=P

L–P W

� �in

heite

n vo

rher

um

rech

nen�

)� �

obei

der

�ak

tor 0

.20�

den

frak

tione

llen

�nt

eil v

on O

2 in

der L

uft �

ider

spie

gelt�

W

LO

20�

.02

PP

P.

(7)

Tab.

2. P

aram

eter

zur

�er

echn

ung

des O

2-V

erbr

auch

s ein

es W

asse

ratm

ers

S�m

bol

inhe

it �

esch

reib

ung

�em

erku

ngen

nm

ol

Saue

rsto

ffm

enge

nm

ol h

–1

O2-

Ver

brau

chsr

ate

2OP

kP

a Sa

uers

toff

parti

aldr

uck

P L

mba

r Lu

ftdru

ck

10 m

bar =

1 k

Pa

P W

kPa

Was

serd

ampf

druc

k si

ehe

Tab.

3

V l

�l�s

sigk

eits

volu

men

si

ehe

Ver

such

sanl

eitu

ng

�m

ol l–1

kPa

–1

L�sl

ichk

eits

koef

fizie

nt v

on O

2 in

Was

ser

sieh

e Ta

b. 3

Lufts

�ttig

ungs

diff

eren

z t

h M

essd

auer

3.

U

nter

such

unge

n zu

r T

empe

ratu

rabh

ängi

gkei

t de

r St

offw

echs

elra

te

eine

s

hom

öoth

erm

en L

ufta

tmer

s und

ein

es p

oiki

loth

erm

en W

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ratm

ers

Die

Tem

pera

tur b

eein

fluss

t ein

e V

ielz

ahl v

on p

h�si

olog

isch

en P

roze

ssen

. �in

e �r

h�hu

ng d

er

Tem

pera

tur f

�hrt

dabe

i mei

st z

u ei

ner �

esch

leun

igun

g di

eser

Vor

g�ng

e. S

o st

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zum

�ei

spie

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die

Sto

ff�

echs

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te e

ines

Tie

res

bei e

iner

�rh

�hun

g de

r K�r

perte

mpe

ratu

r um

10

°C in

der

�eg

el

um

das

2–3-

fach

e.

Ver

�nde

rung

en

der

�m

gebu

ngst

empe

ratu

r k�

nnen

�e

doch

unte

rsch

iedl

iche

us�

irkun

gen

auf

K�r

perte

mpe

ratu

r un

d St

off�

echs

elra

te

habe

n.

�ei

- 5�

-

Woc

he 5

Res

piro

met

rie

AG

Pau

l/Boi

ani

p���

���t�

e��

e�

Tier

en

pass

t si

ch

die

K�r

perte

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r m

ehr

oder

enig

er

der

�m

gebu

ngst

empe

ratu

r an

. St

eige

nde

�m

gebu

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ren

f�hr

en s

omit

auch

zu

eine

r

�una

hme

der

Stof

f�ec

hsel

rate

. �m

�eg

ensa

tz d

azu

sind

��

���

t�e��

e Ti

ere

(V�g

el u

nd

S�ug

er)

bef�

higt

� ih

re

K�r

perte

mpe

ratu

r in

nerh

alb

eine

s be

stim

mte

n �

erei

ches

de

r

�m

gebu

ngst

empe

ratu

r ko

nsta

nt z

u ha

lten

(The

rmor

egul

atio

n).

Die

Sto

ff�

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elra

te v

on

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�oth

erm

en

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en

zeig

t da

bei

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ga

nz

ande

re

�bh

�ngi

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t vo

n de

r

�m

gebu

ngst

empe

ratu

r. �n

nerh

alb

eine

r so

gena

nnte

n th

erm

isch

neu

trale

n �o

ne� e

inem

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ige

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erei

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emec

hani

smen

(S

ch�

itzen

� �

eche

ln)

bz�

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�rm

epro

dukt

ions

mec

hani

smen

(Mus

kelz

itter

n� z

itter

frei

e Th

erm

ogen

ese)

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ivie

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erde

n. D

ie S

toff

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hsel

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ein

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iere

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n.

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–1 g

–1)

eine

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Mau

s bei

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gebu

ngst

empe

ratu

ren

von

5 °C

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mte

mpe

ratu

r und

30

°C.

Tier

e �

Mat

eria

l�

Mau

s (�

�s��

�s��

��s)

� �es

piro

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erge

f��

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ckse

nsor

und

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e K

O�

-

L�su

ng� t

empe

rierte

Was

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ecke

n (5

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tem

pera

tur�

30 °C

)

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chf�

hrun

g un

d �

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ertu

ng�

�un�

chst

mus

s ein

e �i

chun

g de

s Dru

ckse

nsor

s f�r

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stem

pera

tur d

urch

gef�

hrt �

erde

n.

Daz

u �

ird d

as �

ef��

(si

ehe

�bb

. 1)

vers

chlo

ssen

und

der

Dre

i�eg

ehah

n so

ein

gest

ellt�

das

s

eine

Ver

bind

ung

z�is

chen

Kam

mer

und

Spr

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nic

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u�en

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best

eht.

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en�

eise

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�nt

erdr

uck

erh�

ht�

inde

m d

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tem

pel

der

Sprit

ze i

n Sc

hritt

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on 2

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ezog

en �

ird. D

ie er

halte

nen

Mes

s�er

te �

erde

n no

tiert

und

es �

ird ei

ne �

ichg

erad

e ers

tellt

.

�ur

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sung

de

s Sa

uers

toff

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rauc

hs

das

�es

piro

met

erge

f��

mit

KO

�-g

etr�

nkte

m

�ilte

rpap

ier

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2-�

bsor

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) be

f�lle

n un

d Tr

ennb

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ein

setz

en� d

amit

das

Tier

nic

ht m

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KO

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) in

Ver

bind

ung

kom

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die

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skam

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er h

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chlo

ssen

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den.

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mpe

l der

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ktio

nssp

ritze

auf

die

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ml-M

arke

brin

gen.

Der

Dre

i�eg

ehah

n is

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uste

llen�

das

s ein

e

Ver

bind

ung

zur

�u�

enlu

ft er

halte

n bl

eibt

. M

essk

amm

er 1

0 m

in t

empe

riere

n. �

ach

dies

er

Vor

bere

itung

spha

se d

en D

rei�

egeh

ahn

so v

erst

elle

n� d

ass

die

Ver

bind

ung

zur

�u�

enlu

ft

- 5�

-

Woc

he 5

Res

piro

met

rie

AG

Pau

l/Boi

ani

unte

rbro

chen

�ird

� �e

doch

die

Ver

bind

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z�is

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�n�

ektio

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und

Mes

skam

mer

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lten

blei

bt. S

topp

uhr

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ten�

Das

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r ve

rbra

ucht

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erst

off

und

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Koh

lend

io�i

d ab

�el

ches

dur

ch K

O�

abs

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�ird

. �n

folg

edes

sen

ents

teht

im

�es

piro

met

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f��

ein

�nt

erdr

uck�

der

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Ma�

f�r d

ie M

enge

des

ver

atm

eten

Sau

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offs

ist.

Der

in d

er M

essk

amm

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sich

aus

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ende

�nt

erdr

uck

�ird

mit

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e de

s Dru

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es �

ber�

acht

.

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ersu

ch �

ird d

ie �

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gem

esse

n� d

ie f

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as �

rrei

chen

ein

es �

nter

druc

kes

ben�

tigt

�ird

� der

ein

em �

asvo

lum

en v

on 5

ml e

ntsp

richt

. �st

die

ser W

ert e

rrei

cht�

�ird

�be

r die

Spr

itze

das

Vol

umen

ve

rkle

iner

t (�

kom

prim

iert�

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s de

r �

nter

druc

k be

seiti

gt

ist.

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�ede

�m

gebu

ngst

empe

ratu

r si

nd M

essz

eit

und

verb

rauc

htes

Spr

itzen

volu

men

zu

prot

okol

liere

n

(min

dest

ens

3 M

essu

ngen

). D

as K

�rpe

rge�

icht

des

Tie

res

�ird

am

�nd

e de

s V

ersu

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imm

t. �

us d

en M

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aten

�ird

die

spez

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he S

auer

stof

fver

brau

chsr

ate

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l h–1

g–1

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f�r �

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�m

gebu

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empe

ratu

r ber

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et u

nd in

ein

em D

iagr

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dar

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�us

den

Dat

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ppen

�er

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f�r �

ede

Ver

such

stem

pera

tur m

ittle

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erbr

auch

srat

en b

erec

hnet

und

es

�ird

mit

�ilf

e de

s �-

Test

s un

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ests

gep

r�ft�

ob

sich

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mitt

lere

n V

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auch

srat

en b

ei d

en

vers

chie

dene

n Te

mpe

ratu

ren

stat

istis

ch u

nter

sche

iden

.

Ver

such

II:

�es

timm

en S

ie d

ie S

auer

stof

fver

brau

chsr

ate

� (

nmol

h–1

) be

im g

ro�e

n

Was

serf

loh

bei 1

5 °C

und

25

°C.

Tier

e �

Mat

eria

l�

Was

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(��p

����

��

����

� C

rust

acea

)� �

espi

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eter

gef�

� m

it O

2-�l

ektro

de

und

�eg

istri

erge

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(Sch

reib

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��h

rfis

ch�

Mag

netr�

hrer

� Th

erm

osta

t� be

l�fte

tes

Med

ium

�at

rium

dith

ioni

t (�

a 2S 2

O�)

� Pla

stik

pipe

tten�

Kam

mer

volu

men

auf

1.5

ml e

inst

elle

n

Dur

chf�

hrun

g un

d �

us�

ertu

ng�

Die

O2-

�lek

trode

ist �

e���e

�e��

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ste�

pe��

t��

mit

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perie

rtem

� bel

�fte

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ser

(100

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�ttig

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und

mit

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unte

r �u

satz

von

ein

igen

Kris

talle

n �

atriu

mdi

thio

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(0�

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�ttig

ung)

zu

kalib

riere

n. �

atriu

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nit e

ntfe

rnt d

en S

auer

stof

f im

Was

ser �

ie fo

lgt�

2

2�

22

�3

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SO

O�

O�

a�SO

�a�

SO.

Die

Kal

ibra

tion

ist a

uf d

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chre

iber

papi

er z

u no

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n. �

ach

meh

rmal

igem

Sp�

len

�ird

die

Kam

mer

mit

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ftete

m W

asse

r be

f�llt

� de

r W

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rflo

h ei

nges

etzt

und

die

Kam

mer

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vers

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ssen

� das

s ke

ine

Luftb

lase

n vo

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den

sind

. Die

�bn

ahm

e im

O2-

�eh

alt �

ird d

urch

- 5�

-

Woc

he 5

Res

piro

met

rie

AG

Pau

l/Boi

ani

den

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eibe

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ichn

et. �

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a. 7

0 �

Luf

ts�t

tigun

g �

ird d

ie T

ierm

essu

ng b

eend

et. �

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eine

�bn

ahm

e au

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icht

inne

rhal

b vo

n 30

min

m�g

lich

ist�

�ird

nac

h �

bspr

ache

mit

dem

Kur

slei

ter

die

Mes

sung

nac

h 30

min

bee

ndet

. �ac

h �n

tnah

me

des

Tier

es u

nd �

uff�

llen

des

Kam

mer

med

ium

s �

ird

die

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mer

er

neut

ve

rsch

loss

en

und

eine

Le

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ertm

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ng

durc

hgef

�hrt�

um

sp�t

er d

en �

igen

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rauc

h de

r O2-

�lek

trode

und

der

�ak

terie

n zu

erm

ittel

n.

�us

dem

zei

tlich

en �

bfal

l de

s Sa

uers

toff

geha

ltes

in d

er K

amm

er l

asse

n si

ch a

nhan

d de

r

�le

ichu

ngen

5–7

die

O2-

Ver

brau

chsr

aten

f�r

die

Tie

r- u

nd d

ie L

eer�

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ng b

erec

hnen

.

Die

O2-

Ver

brau

chsr

ate

des

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es �

(nm

ol h

–1)

erh�

lt m

an� i

ndem

man

den

Wer

t au

s de

r

Leer

�er

tmes

sung

von

dem

der

Tie

rmes

sung

sub

trahi

ert.

�us

den

Dat

en a

ller

�ru

ppen

des

Kur

ses

�er

den

f�r d

ie b

eide

n V

ersu

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empe

ratu

ren

die

mitt

lere

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erbr

auch

srat

en b

erec

hnet

.

Pr�f

en S

ie m

it �

ilfe

des

�-Te

sts

und

t-Tes

ts� o

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ch d

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ittle

ren

Ver

brau

chsr

aten

bei

den

beid

en V

ersu

chst

empe

ratu

ren

stat

istis

ch u

nter

sche

iden

.

4. L

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tur

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er, H

. C.,

Hof

er, R

., K

napp

, W. u

nd M

oser

, H. (

1�7�

). �o

olog

isch

e ��

perim

ente

.

M�n

chen

� Deu

tsch

er T

asch

enbu

chve

rlag.

Eck

ert,

R. (

2000

). Ti

erph

�sio

logi

e. S

tuttg

art�

Thie

me.

Eck

ert,

M. u

nd H

erte

l, W

. (1�

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tikum

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Tie

rph�

siol

ogie

. �en

a� S

tuttg

art�

�us

tav

�isc

her V

erla

g.

Em

mer

ich,

H. (

1��0

). St

off�

echs

elph

�sio

logi

sche

s Pra

ktik

um. S

tuttg

art�

�e�

�or

k� �

eorg

Thie

me

Ver

lag.

Nac

htig

all,

W. (

1�72

). �o

oph�

siol

ogis

cher

�ru

ndku

rs. �

rbei

tsb�

cher

�io

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e� T

asch

ente

�t

�. W

einh

eim

��er

gstr.

� Ver

lag

Che

mie

.

5. F

rage

n un

d A

ufga

ben

zur

theo

retis

chen

Vor

bere

itung

Was

bes

agt d

ie a

llgem

eine

�as

glei

chun

g�

Was

ver

steh

t man

unt

er d

em P

artia

ldru

ck e

ines

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es�

Was

ver

steh

t man

unt

er d

em L

�slic

hkei

ts- o

. �bs

orpt

ions

koef

fizie

nten

ein

es �

ases

�rkl

�ren

Sie

die

ph�

siol

ogis

chen

�eg

riffe

hom

�oth

erm

� poi

kilo

ther

m� h

eter

othe

rm� e

ndot

herm

ekto

ther

m�

Was

ver

steh

t man

unt

er z

itter

frei

er T

herm

ogen

ese�

- 55

-

Woc

he 5

Res

piro

met

rie

AG

Pau

l/Boi

ani

6. A

nhan

g

T���

����

�sse

����

p���

����

�P����

����

�s���

��e�

t�����

����

��e�

st��

�����

����

����

��ee

���s

se���

����

����

���e

�t���

���e

��Te�

pe��

t���

T

(°C

) P �

(kPa

) (�

mol

l–1 k

Pa–1

)

T (°

C)

P � (k

Pa)

(�m

ol l–1

kPa

–1)

S���

asse

r M

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r S�

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r�as

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5.

0 0.

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.�

1�.�

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1�.5

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10

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0.��

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1�.�

2�.5

3.��

212

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7.

0 1.

002

1�.1

1�

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10

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1.03

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1�.2

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1.07

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1�.0

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1.11

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13.�

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Kud

la/B

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n in

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M

essu

ng v

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krip

tions

fakt

orak

tivitä

t mitt

els d

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abak

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Met

hode

Ein

leitu

ng:

Die

Rol

le d

er C

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ophy

lle u

nd a

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er T

etra

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Jähr

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wer

den

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hlor

ophy

lle,

der

men

gen-

mäß

ig g

rößt

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rrol

e, sc

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iert

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ie

Ber

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hem

isch

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tions

äqui

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nten

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bar

gem

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Chl

orop

hyllm

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von

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2,

4 x

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r V

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. D

ie

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lich

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ynth

etis

ierte

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amtm

enge

wird

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x 1

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gesc

hätz

t. C

hlor

ophy

lle si

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yclis

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ole,

d.

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ntru

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sich

ei

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agne

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m

als

Zent

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bef

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ung

1).

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tein

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rocy

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stel

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che

Gru

ppe

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ktas

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ten.

D

as in

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hano

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n B

akte

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Tet

rapy

rrol

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kel a

ls Z

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lato

m. C

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t is

t in

das

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min

s B

12 ei

ngeb

aut.

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en d

en c

yclis

chen

Tet

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en g

ibt e

s au

ch

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nket

tige

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den

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alge

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en u

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en C

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bakt

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n. A

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der C

hrom

opho

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Phy

toch

rom

sis

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s Te

trapy

rrol

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nso

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bioche

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ktrum,

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er

Chl

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den

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l a u

nd b

in d

en „

Ant

enne

n“ d

er

Phot

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iert.

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ktro

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Zu-

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de,

Chl

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ei

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egun

gszu

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D

er

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gier

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ere

Anr

egun

gszu

stan

d („

2. A

nreg

ungs

zust

and“

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dur

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ion

eine

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erei

chen

bl

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Lic

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ants

err

eich

t. Er

ent

-sp

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der

bla

uen

Abs

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band

e de

r Chl

orop

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iese

r Z

usta

nd i

st j

edoc

h se

hr u

nsta

bil

und

zerf

ällt

inne

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b vo

n 10

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in e

inen

ene

rgie

ärm

eren

A

nreg

ungs

zust

and,

de

ssen

En

ergi

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Lic

htqu

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Mol

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herm

isch

e En

ergi

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ben.

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drig

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Anr

egun

gszu

stan

d („

1. A

nreg

ungs

zust

and“

) w

ird d

urch

Abs

orpt

ion

von

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n Li

chtq

uant

en e

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cht

(rot

e A

bsor

ptio

nsba

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der C

hlor

ophy

lle) u

nd is

t etw

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r (Le

bens

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Nur

die

Ene

rgie

des

„st

abile

ren“

1. A

nreg

ungs

zust

ande

s ka

nn p

hoto

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hetis

ch v

erw

erte

t wer

den.

Die

zu

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des

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n. A

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und

der e

ngen

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sche

n K

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ung

der

Chl

orop

hylle

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n“ d

ie 1

. A

nreg

ungs

zust

ände

inn

erha

lb d

er A

nten

ne v

on C

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ophy

ll zu

C

hlor

ophy

ll, w

erde

n sc

hlie

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m R

eakt

ions

zent

rum

des

jew

eilig

en P

hoto

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ferie

rt un

d lö

sen

dort

die

Frei

setz

ung

eine

s El

ektro

ns a

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rst i

n de

n R

eakt

ions

zent

ren

von

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und

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det

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dung

stre

nnun

g un

d da

mit

die

Abg

abe

eine

s El

ektro

ns s

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it de

n C

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den

den

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elko

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engl

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nner

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es w

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und

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sog.

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ster

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fer o

der E

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nenw

ande

rung

wei

terg

egeb

en, e

bens

o w

ie in

der

Cor

e-A

nten

ne,

die

aus C

hlor

ophy

ll a

und

Car

otin

oide

n be

steh

t. N

ur in

den

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ktio

nsze

ntre

n vo

n PS

II, P

680,

und

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P 7

00, f

inde

t die

Prim

ärre

aktio

n de

r Pho

tosy

nthe

se st

att,

die

wie

folg

t for

mul

iert

wer

den

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a (P

680)

+ h

v

Chl

a*

Chl

a+ +

e-

Der

gle

iche

Pro

zess

find

et a

m P

700 d

es P

S I s

tatt.

Das

Chl

a+ -R

adik

al d

es P

680 w

ird d

urch

die

Ele

ktro

nen,

di

e de

r w

asse

rspa

ltend

e M

anga

n-K

ompl

ex l

iefe

rt, w

iede

r re

duzi

ert,

also

reg

ener

iert.

Ver

einf

acht

fo

rmul

iert:

2 H

20

4 H

+ + O

2 +

4 e-

P 700

wird

von

den

Ele

ktro

nen

rege

nerie

rt, d

ie ü

ber d

ie E

lekt

rone

ntra

nspo

rtket

te v

on P

S II

kom

men

. Die

El

ektro

nen,

die

P70

0 abg

ibt,

redu

zier

en le

tzte

ndlic

h da

nn N

AD

P+ zu

NA

DPH

2.

Chl

orop

hyll

Fluo

resz

enz

Ein

durc

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cht a

nger

egte

s Pi

gmen

t kan

n en

twed

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nter

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bgab

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er d

urch

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ung

eine

s Li

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den

Gru

ndzu

stan

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rück

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eakt

ivie

rung

dur

ch L

icht

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ung

beze

ichn

et m

an

als

Fluo

resz

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ktur

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Chl

orop

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tarr

es“

ringf

örm

iges

Te

trapy

rrol

) wer

den

durc

h de

n 1.

Anr

egun

gszu

stan

d w

enig

„th

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isch

e“ V

orgä

nge

im M

olek

ül (z

.B.

Abbildun

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aCh

loroph

yllanregun

g

- 5�

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Woc

he 6

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enpi

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te

AG

Kud

la/B

öhm

er

Mol

ekül

vibr

atio

n) a

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kan

n ei

n Te

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r vo

n C

hlor

ophy

llen

abso

rbie

rten

Lich

tene

rgie

w

iede

r in

For

m v

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luor

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nz a

bges

trahl

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n. D

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nnoc

h st

ets

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as E

nerg

ie d

urch

in

tram

olek

ular

e V

orgä

nge

verlo

ren

geht

, ist

der

Ene

rgie

geha

lt de

s em

ittie

rten

Lich

tqua

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erin

gfüg

ig,

aber

nic

ht w

esen

tlich

nie

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üngl

iche

Ene

rgie

geha

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s Anr

egun

gszu

stan

ds. A

us d

iese

m

Gru

nd

ist

die

Chl

orop

hyll

Fluo

resz

enz

imm

er

dunk

elro

t, w

ähre

nd

der

Ener

gieg

ehal

t de

s 1.

A

nreg

ungs

zust

and

dem

ein

es h

ellro

ten

Lich

tqua

nts e

ntsp

richt

(s���

�e��

�es�

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����

e�).

Wen

ngle

ich

nur

ein

rela

tiv g

erin

ger

Teil

der

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hlte

n Li

chte

nerg

ie w

iede

r al

s Fl

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z ab

gest

rahl

t w

ird,

so i

st d

ie F

luor

esze

nz a

n is

olie

rten

Chl

orop

hylle

n do

ch s

ehr

gut

sich

tbar

. In

den

C

hlor

opla

sten

sel

bst,

z.B

. im

Bla

ttgew

ebe

ist d

ie C

hlor

ophy

ll Fl

uore

szen

z w

esen

tlich

sch

wäc

her.

Nur

1–

3 %

der

ein

gest

rahl

ten

Lich

tene

rgie

wird

wie

der

als

Fluo

resz

enz

emitt

iert.

Phy

siol

ogis

ch i

st d

ie

Chl

orop

hyll

Fluo

resz

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dam

it be

deut

ungs

los.

Jedo

ch h

at s

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rheb

liche

Bed

eutu

ng in

der

For

schu

ng

und

dem

opt

isch

en „

mon

itorin

g“ d

er P

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ende

cke

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ioto

pen.

Das

hän

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amit

zusa

mm

en, d

ass

die

„Flu

ores

zenz

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eute

“ vo

n ph

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ynth

etis

chem

Gew

ebe

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t ve

rsta

nden

en Z

usam

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hang

mit

der

phot

osyn

thet

isch

en L

eist

ung

aufw

eist

. So

läss

t si

ch z

.B. e

ine

Schw

ächu

ng d

er P

hoto

synt

hese

leis

tung

dur

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tress

gut

sich

tbar

mac

hen.

Stru

ktur

und

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der

Car

otin

oide

D

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inoi

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groß

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nter

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pe d

er Is

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rund

baus

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Die

in

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Bio

synt

hese

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des

Iso

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ie C

5-Kör

per

lsop

ente

nylp

yrop

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hat (

IPP)

und

sei

n Is

omer

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ethy

l-al

lyl-P

P (P

reny

l-PP)

. Zw

ei I

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n G

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sam

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gela

gert,

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A

dditi

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der

Rei

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ach

zum

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nesy

l-PP

und

dann

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Ger

anyl

gera

nyl-P

P, d

em

Aus

gang

spro

dukt

für

den

Phy

tolre

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es C

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und

b. Z

wei

Ger

anyl

gera

nyl-P

P sc

hlie

ßlic

h bi

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Tet

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erpe

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lsop

rene

n, C

40) P

hyto

en, d

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ersc

hied

ene

Zwis

chen

stuf

en

zu

-und

ß-C

arot

in u

mge

wan

delt

wird

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iese

Ver

bind

unge

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steh

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ur a

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und

bild

en d

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e de

r C

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g 1)

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toff

grup

pen,

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Ethe

r-,

Ald

ehyd

-, K

eto-

, C

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xyl-u

nd a

uch

Epox

y-G

rupp

en,

in d

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arot

ine

eing

efüh

rt,

gela

ngt m

an z

u de

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anth

ophy

llen.

Dur

ch d

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lekt

rone

gativ

ität d

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auer

stof

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ktio

nen

erha

lten

die

Xan

thop

hylle

ei

nen

etw

as

pola

rere

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hara

kter

al

s da

s ex

trem

lip

ophi

le

�-C

arot

in.

Wic

htig

e X

anth

ophy

lle s

ind

Lute

in, V

iola

xant

hin

und

Zeax

anth

in (

Abb

ildun

g 1)

. Car

otin

e un

d X

anth

ophy

lle

bild

en z

usam

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die

Obe

rgru

ppe

der C

arot

inoi

de.

Car

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oide

flu

ores

zier

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icht

, obg

leic

h si

e si

chtb

ares

Lic

ht s

ehr

gut a

bsor

bier

en. D

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ängt

dam

it zu

sam

men

, da

ss i

n la

ngge

stre

ckte

n C

arot

inoi

den

(40

C-A

tom

e, 2

0 ko

njug

ierte

Dop

pel-b

indu

ngen

) du

rch

Lich

tabs

orpt

ion

Mol

ekül

vibr

atio

nen

ausg

elös

t w

erde

n, d

urch

wel

che

die

Anr

egun

gsen

ergi

e te

ilwei

se th

erm

isch

dea

ktiv

iert

wird

. Dah

er s

ind

Car

otin

oide

als

pho

tosy

nthe

tisch

e A

nten

nenp

igm

ente

("

akze

ssor

isch

e Pi

gmen

te")

w

eit

wen

iger

ge

eign

et

als

Chl

orop

hylle

. Fu

nktio

nell

erfü

llen

die

Car

otin

oide

den

noch

meh

rere

wic

htig

e A

ufga

ben.

So

sind

sie

, wie

ber

eits

erw

ähnt

, zu

eine

m g

ewis

sen

Um

fang

an

der L

icht

abso

rptio

n de

r Pho

tosy

nthe

se b

etei

ligt u

nd s

chlie

ßen

dabe

i zu

eine

m T

eil d

ie s

og.

"Grü

nlüc

ke"

der

Chl

orop

hylla

bsor

ptio

n. E

ine

wei

tere

wic

htig

e Fu

nktio

n de

r C

arot

inoi

de i

st i

hre

Bet

eilig

ung

am s

trukt

urel

len

Auf

bau

vor

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m v

on P

hoto

syst

em I

I. O

hne

Car

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oide

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t es

kei

n fu

nktio

nsfä

hige

s PS

II.

Eine

drit

te u

nd w

ohl w

icht

igst

e Fu

nktio

n is

t der

Sch

utz

der

Chl

orop

hylle

vor

Ph

otoo

xida

tion.

Dur

ch L

icht

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ereg

tes

Chl

orop

hyll

kann

Sau

erst

off i

n di

e se

hr a

ggre

ssiv

e Fo

rm d

es

sog.

Sin

glet

t-Sau

erst

offs

übe

rfüh

ren,

der

dan

n da

s Chl

orop

hyll

irrev

ersi

bel o

xidi

ert.

Car

otin

oide

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en

die

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gkei

t, Si

ngle

tt-Sa

uers

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zu

��e�

��e�

�d.h

. sei

ne E

nerg

ie z

u üb

erne

hmen

, ohn

e da

bei s

elbs

t ze

rstö

rt zu

wer

den.

Auc

h kö

nnen

sie

Chl

orop

hylle

, die

ihre

Ene

rgie

nic

ht so

fort

über

trage

n kö

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, �e�

e���

t�e�e

�(a

breg

en)

und

dam

it di

e B

ildun

g vo

n Si

ngle

tt-Sa

uers

toff

von

vor

n he

rein

ver

hind

ern.

- 5�

-

Woc

he 6

Pf

lanz

enpi

gmen

te

AG

Kud

la/B

öhm

er

Schl

ießl

ich

fung

iere

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e C

arot

inoi

de a

uch

noch

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gel

be u

nd o

rang

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bene

bis

bra

une

Blü

ten-

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Fruc

htfa

rbst

offe

.

Stru

ktur

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Fun

ktio

n de

r A

ntho

cyan

e A

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idin

e un

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e si

nd fü

r die

Rot

-Vio

lettf

ärbu

ng v

on P

flanz

enor

gane

n (B

lätte

r, B

lüte

n,

Spro

sse)

ver

antw

ortli

ch. I

m G

egen

satz

zu

den

Chl

orop

hylle

n un

d C

arot

inoi

den

sind

sie

was

serlö

slic

h un

d lie

gen

dahe

r in

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Vak

uole

n vo

r.

Abs

orpt

ions

spek

tros

kopi

e

Spek

trosk

opis

che

Met

hode

n w

ie z

. B

. die

heu

te a

nzuw

ende

nde

Abs

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ions

spek

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opie

sin

d zu

r Id

entif

izie

rung

und

Qua

ntifi

zier

ung

von

(unb

ekan

nten

) Sub

stan

zen

heut

e ni

cht m

ehr w

egzu

denk

en. S

ie

beru

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uf d

em P

rinzi

p de

r Mes

sung

der

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htab

sorp

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beim

Dur

chtri

tt ei

nes L

icht

stra

hles

dur

ch e

ine

Prob

e be

i ein

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der

meh

rere

n W

elle

nlän

gen.

Ver

schi

eden

e Su

bsta

nzen

zei

gen

bei u

nter

schi

edlic

hen

Wel

lenl

änge

n un

ters

chie

dlic

he

Abs

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ione

n vo

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cht.

Die

au

f di

ese

Wei

se

gew

onne

nen

Abs

orpt

ions

spek

tren

sind

oft

char

akte

ristis

ch f

ür d

ie j

ewei

ligen

Rei

nsub

stan

zen.

Mis

st m

an d

ie

Abs

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ion

eine

r Lös

ung

in d

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ine

rein

e Su

bsta

nz in

ein

em in

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sem

Ber

eich

nic

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bsor

bier

ende

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sung

smitt

el g

elös

t is

t, so

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man

inn

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lb e

ines

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isse

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onze

ntra

tions

bere

iche

s ei

nen

quas

iline

aren

Zus

amm

enha

ng z

wis

chen

der

Abs

orpt

ion

und

der

Kon

zent

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n ei

ner

Lösu

ng. D

iese

r Zu

sam

men

hang

wird

dur

ch d

as L

ambe

rt-B

eer's

che

Ges

etz

besc

hrie

ben:

� =

·c·d

Dab

ei i

st �

= E

xtin

ktio

n,

= m

olar

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nsko

effiz

ient

, c =

Kon

zent

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n in

Mol

·L-1

und

d =

Sc

hich

tdic

ke d

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ösun

g in

cm

. Ext

inkt

ion

beze

ichn

et d

en d

ekad

isch

en L

ogar

ithm

us d

er in

ein

e Pr

obe

eing

estra

hlte

n Li

chtin

tens

ität I

0 im

Ver

hältn

is z

u de

r nac

h de

r Pro

be g

emes

sene

n In

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:

Dur

ch d

as L

ambe

rt-B

eer’

sche

Ges

etz

wird

al

so e

ine

e-Fu

nktio

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earis

iert.

Des

halb

da

rf b

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esse

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nwen

dung

nur

der

unt

ere,

qu

asi-l

inea

re B

erei

ch d

er F

unkt

ion

benu

tzt

wer

den

(es

gilt

also

nu

r fü

r ge

ringe

K

onze

ntra

tione

n,

für

quan

titat

ive

Bes

timm

unge

n so

llte

E 0

,8 se

in!)

.

Pigm

entk

onze

ntra

tione

n kö

nnen

mit

Hilf

e ei

nes

Spek

troph

otom

eter

s un

d de

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Lam

berts

chen

G

eset

zes

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r Zu

hilfe

-na

hme

des

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ktio

nsko

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ient

en

für

Chl

orop

hyll

bere

chne

t w

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n. U

m d

ie

Kon

zent

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nen

von

Chl

orop

hyll,

Car

o-tin

oide

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ntho

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en z

u m

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n, s

ind

vers

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dene

B

erec

hnun

gen

besc

hrie

ben

wor

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die

meh

r ode

r wen

iger

akk

urat

arb

eite

n [1

-4].

Sim

s un

d G

amon

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zten

dab

ei z

ur E

xtra

ktio

n de

r Chl

orop

hylle

ein

e M

isch

ung

aus

Ace

ton

und

Tris

Puff

er (8

0:20

Vol

; pH

=7.8

) und

ver

öffe

ntlic

hten

G

leic

hung

en, w

elch

e de

n Ei

nflu

ss v

on A

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en b

erüc

ksic

htig

en:

Abbildun

g3Extin

ktionskoeffizienten

fürC

hlorop

hyll,Carotin

oide

undAn

thocyane

inAb

hängigkeitvonde

rWellenlänge.

- �0

-

Woc

he 6

Pf

lanz

enpi

gmen

te

AG

Kud

la/B

öhm

er

Mes

sung

en in

Ace

ton/

Tris

-Puf

fer:

Chl

orop

hyll

a (μ

mol

ml-1

) = 0

.013

73 A

663

- 0.0

0089

7 A

537

- 0.0

0304

6 A

647

Chl

orop

hyll

b (μ

mol

ml-1

) = 0

.024

05 A

647

- 0.0

0430

5 A

537

- 0.0

0550

7 A

663

Car

otin

oide

(μm

ol m

l-1) =

(A47

0 - (

17.1

x (C

hl a

+ C

hl b

) - 9

.479

x a

ntho

cyan

in))

/119

.26

Mes

sung

en in

saur

em M

etha

nol:

Ant

hocy

ane

(μm

ol m

l-1) =

0.0

3333

3 A

529

– 0.

0075

99 A

650

Tab

ak-1

-Hyb

rid

Die

Met

hode

des

Tab

ak-1

-Hyb

rid b

asie

rt au

f de

r U

nter

such

ung

von

Prot

ein-

DN

A-I

nter

-ak

tione

n,

ähnl

ich

dem

H

efe-

1-H

ybrid

w

elch

er d

ie B

indu

ng e

ines

Tra

nskr

iptio

nsf-

akto

rs a

n ei

ne D

NA

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nac

hwei

st. D

er

Vor

teil

des T

abak

-1-H

ybrid

bes

teht

neb

en d

er

Nut

zung

ein

es p

flanz

liche

n O

rgan

ism

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n de

r B

estim

mun

g de

r Tr

ansk

riptio

nsfa

ktor

-ak

tivitä

t.

Daf

ür w

ird d

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u un

ters

uche

nde

Prom

otor

-se

quen

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r ein

Rep

orte

rgen

(hie

r Luc

ifera

se)

fusi

onie

rt un

d m

it H

ilfe

der

Agr

obak

teriu

m-

verm

ittel

ten

Tran

sfor

mat

ion

in

Taba

k ex

prim

iert

(Abb

ildun

g 4

A).

Die

Pro

mot

or-

aktiv

ität k

ann

über

die

Luc

ifera

seex

pres

sion

er

mitt

elt

wer

den.

D

afür

w

erde

n di

e tra

nsfo

rmie

rten

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kblä

tter

mit

Luci

ferin

in

filtri

ert

und

die

Men

ge

an

Che

milu

min

esze

nz g

emes

sen.

Die

zu

anal

y-si

eren

den

Tran

skrip

tions

fakt

oren

wer

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co-

expr

imie

rt um

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Änd

erun

g de

r Rep

orte

rgen

-ak

tivitä

t im

V

ergl

eich

zu

er

mitt

eln

(Abb

ildun

g 4

B).

Dad

urch

wird

die

Akt

ivitä

t de

s Tr

ansk

riptio

nsfa

ktor

s (a

ktiv

iere

nd/ r

epri-

mie

rend

) auf

den

zu

unte

rsuc

hend

en P

rom

oter

be

stim

mt.

Bra

ssic

a ra

pa

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ses

Ver

such

stag

es is

t zw

eier

lei.

Zum

ein

en w

erde

n Si

e ��

�ss�

����

�p�

als

schn

ell w

achs

ende

n M

odel

lorg

anis

mus

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um d

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gmen

tzus

amm

ense

tzun

gen

zu s

tudi

eren

und

in v

ersc

hied

enen

G

enot

ypen

zu

quan

tifiz

iere

n. Z

um a

nder

en le

rnen

Sie

die

Met

hode

des

Tab

ak-1

-Hyb

rid a

ls M

etho

de z

ur

Mes

sung

von

Tra

nskr

iptio

nsfa

ktor

aktiv

itäte

n ke

nnen

. Wild

typ

���s

s���

���p

� Pf

lanz

en h

aben

vio

lette

St

iele

und

grü

ne B

lätte

r. D

ie V

iole

ttfär

bung

erg

ibt s

ich

aus d

er P

rodu

ktio

n vo

n A

ntho

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en.

Abbildun

g4Tabak1Hy

brid

ASche

matisc

heDa

rstellung

des

verw

ende

ten

Prom

otor

Repo

rtergen

Konstrukt.

BDe

tektion

derLucife

raseaktivitä

tmittelse

ines

Imagers(bildlich).

- ��

-

Woc

he 6

Pf

lanz

enpi

gmen

te

AG

Kud

la/B

öhm

er

Ver

such

:N

ach

eine

r che

mis

chen

Mut

agen

ese

mit

Ethy

lmet

hans

ulfo

nat

(EM

S) w

urde

ein

e M

utan

te id

entif

izie

rt,

die

grün

e St

iele

(��

�) un

d ge

lbgr

üne

Blä

tter

(���

) be

sitz

t. Fo

lgen

de F

rage

stel

lung

en e

rgeb

en s

ich

aus

dem

Phä

noty

pen

dies

er M

utan

te:

1.H

at d

iese

Mut

ante

(���

) ger

inge

re K

onze

ntra

tione

n vo

n A

ntho

cyan

en a

ls W

ildty

ppfla

nzen

(AN

L)?

2.H

at d

iese

gel

bgrü

ne (�

��) M

utan

te g

erin

gere

Kon

zent

ratio

nen

an C

hlor

ophy

ll al

s W

ildty

ppfla

nzen

(Y

GR

)?

3.H

at d

ie g

elbg

rüne

Mut

ante

(��

�) h

öher

e K

onze

ntra

tione

n vo

n C

arot

enoi

den

als

Wild

typp

flanz

en

(YG

R)?

4.

Hab

en d

ie N

achk

omm

en (

F1)

von

Kre

uzun

gen

von

Wild

typp

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en (

AN

L/Y

GR

) m

it di

eser

M

utan

te (�

��/�

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ine

mitt

lere

Kon

zent

ratio

n de

r zu

unte

rsuc

hend

en P

igm

ente

? 5.

Wie

wird

die

Exp

ress

ion

des

YG

R G

ens

durc

h di

e Tr

ansk

riptio

nsfa

ktor

en Y

GI1

, YG

I2 u

nd Y

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re

gulie

rt?

Mes

sung

von

Car

oten

oid

und

Chl

orop

hyll-

Kon

zent

ratio

nen

Wir

verw

ende

n 10

Tag

e al

te �

��ss

����

��p�

Pfla

nzen

zur

Ana

lyse

der

Pig

men

tzus

amm

ense

tzun

g. M

it ei

nem

Kor

kboh

rer d

er G

össe

#5

wer

den

2 B

latts

chei

ben

aus

den

Blä

ttern

der

���

ss��

����

p� P

flanz

en

entn

omm

en.

Bes

timm

en s

ie d

en D

urch

mes

ser

der

Bla

ttsch

eibe

n (L

inea

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d be

rech

nen

sie

die

Bla

ttflä

che!

Geb

en s

ie j

ewei

ls 1

Bla

ttsch

eibe

in

ein

1,5

mL

Rea

ktio

nsge

fäß

zusa

mm

en m

it 40

0 μL

A

ceto

n/Tr

is P

uffe

r (80

:20

Vol

; pH

=7.8

) und

mör

sern

sie

die

se m

it H

ilfe

des

Pist

ills.

Tran

sfer

iere

n Si

e di

e Su

spen

sion

in e

in 1

0 m

L R

eakt

ions

gefä

ß (F

alco

n). W

asch

en si

e da

s 1,5

mL

Rea

ktio

nsge

fäß

und

das

Pist

ill m

it 1

mL

Ace

ton/

Tris

und

geb

en s

ie d

ie S

uspe

nsio

n eb

enfa

lls in

das

15

mL

Rea

ktio

nsge

fäß.

llen

sie

ansc

hlie

ßend

die

Sus

pens

ion

im R

eakt

ions

gefä

ß au

f 6 m

L m

it A

ceto

n/Tr

is P

uffe

r (80

:20

Vol

; pH

=7.8

) auf

.

Mes

sen

Sie

nun

die

Abs

orpt

ion

des

Übe

rsta

ndes

bei

den

Wel

lenl

änge

n 47

0, 5

37, 6

47, u

nd 6

63 n

m

(not

iere

n si

e di

e M

essw

erte

in T

abel

le 1

). M

esse

n Si

e au

ch d

ie Ü

bers

tänd

e in

den

Rea

ktio

nsge

fäße

n ih

rer T

isch

nach

barn

bis

sie

5 M

essw

erte

pro

Gen

otyp

vor

liege

n ha

ben.

Mes

sung

der

Ant

ocya

nkon

zent

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nen

Wei

l di

e G

leic

hung

en f

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ie B

erec

hnun

g de

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ntho

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-Kon

zent

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nen

die

oben

bes

chrie

ben

wur

den,

nic

ht b

eson

ders

akk

urat

sin

d, w

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ir ei

ne m

odifi

zier

te M

etho

de v

erw

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n. E

ntne

hmen

si

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iede

rum

mit

Hilf

e ei

nes

Kor

kboh

rers

der

Gös

se #

5 2

Bla

ttsch

eibe

n au

s de

n B

lätte

rn d

er �

��ss

����

��p�

Pfla

nzen

. B

estim

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sie

den

Dur

chm

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r de

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chei

ben

(Lin

eal)

und

bere

chne

n si

e di

e B

lattf

läch

e. G

eben

sie

die

Bla

ttsch

eibe

n in

ein

1,5

mL

Rea

ktio

nsge

fäß,

die

smal

zus

amm

en m

it 40

0μl

saur

em M

etha

nol

(Met

hano

l/HC

l/Was

ser;

90:1

:1),

und

mör

sern

sie

die

se m

it H

ilfe

des

Pist

ills.

Tran

sfer

iere

n Si

e di

e Su

spen

sion

in

ein

15 m

L R

eakt

ions

gefä

ß (F

alco

n).

Was

chen

sie

das

1,5

mL

Rea

ktio

nsge

fäß

und

das

Pist

ill m

it 1

mL

saur

em M

etha

nol u

nd g

eben

sie

die

Sus

pens

ion

eben

falls

in

das

Rea

ktio

nsge

fäß.

Fül

len

sie

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rat.

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Enzy

me

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ert d

er K

M

Wer

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isch

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und

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mol

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ym-S

ubst

rat-

Kom

plex

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atis

chen

Kat

alys

e is

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ildun

g ei

nes

Kom

plex

es

zwis

chen

frei

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nzym

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nd S

ubst

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erlic

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ie U

mse

tzun

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nte

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heid

et. D

ie E

nzym

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zer

lege

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ratb

indu

ng a

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ll“: �

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mt

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tigun

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tigun

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Die

wic

htig

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isch

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M u

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sen

sich

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form

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stra

tsät

tigun

gsfu

nktio

n ab

leite

n (d

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uftra

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c S g

egen

1/�

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n er

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dies

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isch

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nzym

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rativ

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indu

ng i

st d

ie S

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ratb

indu

ng

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ch k

ompl

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ungs

funk

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dann

ein

e si

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orm

und

die

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urk-

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mat

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ist n

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- ��

-

Woc

he 7

Enz

yme

AG

Kud

la/B

atis

tic

Die

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Deh

ydro

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DH

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alys

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und

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ilchs

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ng. I

n de

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ersu

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ird d

ie A

bhän

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eit d

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nzym

aktiv

ität v

on

der S

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ratk

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tion

best

imm

t. D

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angs

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digk

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ird b

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hied

enen

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n an

hand

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gem

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n: d

ie Z

unah

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von

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DH

mit

der

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wird

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zuna

hme

bei

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nm g

emes

sen.

Die

Erg

ebni

sse

wer

den

als

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trats

ättig

ungs

kurv

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n,

aus

der

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Bur

k-Tr

ansf

orm

atio

n w

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die

Mic

hael

isko

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timm

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Für

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s En

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liegt

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der

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hen,

w

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das

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, al

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der

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dukt

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H

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ndem

1.

di

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+ sehr

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, 2.

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dukt

Pyr

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mis

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ns

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bild

ung)

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Gle

ichg

ewic

ht g

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en w

ird.

Die

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ndig

e G

leic

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et d

aher

:

L-(+

)-La

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+ N

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+ + H

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zin

Pyr

uvat

-hyd

razo

n +

NA

DH

+ H

+

Die

Gle

ichg

ewic

htsk

onst

ante

die

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eakt

ion

liegt

bei

ca.

102 m

ol/l.

Ent

spre

chen

d de

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H

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imum

der

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H w

ird d

ie M

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H 9

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urch

gefü

hrt.

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l

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n:

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AD

(M

G 6

63,4

g/m

ol)

G

lyci

n (z

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uffe

rung

; MG

75,

07 g

/mol

)

L-(+

)-La

ctat

(Na-

Salz

; MG

112

,1 g

/mol

)

Hyd

razi

nhyd

roch

lorid

(MG

50,

06 g

/mol

)

L-LD

H (5

mg/

ml;

550

units

/mg)

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acta

t-Deh

ydro

gena

se (E

nzym

)

Stam

mlö

sung

en (v

orha

nden

):

R

eakt

ions

puff

er: 0

,4 M

Hyd

razi

n, 0

,5 M

Gly

zin,

pH

9.0

NA

D, 3

0 m

g/m

l (be

rech

nen

Sie

die

Mol

aritä

t, vo

r Kur

sbeg

inn!

)

LDH

, 0,

01 m

g/m

l

L-(+

)-La

ctat

500

mg/

ml

(ber

echn

en S

ie d

ie M

olar

ität,

vor K

ursb

egin

n!)

Prak

tisch

e T

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xper

imen

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eite

n

Mik

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gibt

es i

n ve

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nen

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en, e

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eder

mit

fest

ein

gest

ellte

n od

er m

it ve

rste

llbar

em

Vol

umen

(z.B

. 10-

100 μl

).

- ��

-

Woc

he 7

Enz

yme

AG

Kud

la/B

atis

tic

Pi

pett

ensp

itzen

:B

lau:

für V

olum

ina

bis 1

000 μl

G

elb:

für V

olum

ina

bis 2

00 μ

l W

eiß:

für V

olum

ina

bis 1

0 μl

B

edie

nung

von

aut

omat

isch

en M

ikro

liter

pipe

tten

Zu d

en P

ipet

ten

gibt

es

Kun

stst

offs

pitz

en

(gel

b, b

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und

wei

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ie je

wei

ls n

ur a

uf d

ie

ents

prec

hend

en P

ipet

ten

pass

en. D

ie P

ipet

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habe

n m

eist

dr

ei

Dru

ckpu

nkte

: de

r er

ste

Dru

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nkt

ist

derje

nige

, vo

n de

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am

(!!!

) au

fges

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der

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wird

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Kol

ben

lang

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bis

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dies

em

erst

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punk

t gef

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zur

vol

lstä

ndig

en

Entle

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g (d

ies i

st d

as g

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scht

e Vol

umen

) de

r Spi

tze

wird

nun

vol

lend

s bi

s zu

m z

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Dru

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durc

hged

rück

t. B

eim

dr

itten

D

ruck

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t wird

zum

inde

st b

ei d

en M

odel

len

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Eppe

ndor

f die

Spi

tze

abge

wor

fen.

Bei

den

ver

stel

lbar

en P

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ten

(bei

Epp

endo

rf-P

ipet

ten

Her

ausz

iehe

n de

s Bed

ienu

ngsk

nopf

es u

nd v

orsi

chtig

es D

rehe

n) w

ird d

as e

inge

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lte V

olum

en

in μ

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ezei

gt.

Ach

tung

! Pip

ette

n nu

r bis

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Max

imal

volu

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auf

dreh

en. N

iem

als g

egen

ein

en W

ider

stan

d w

eite

rdre

hen!

Pip

ette

n ni

emal

s ohn

e Pi

pette

nspi

tze

verw

ende

n.

Her

stel

len

eine

r L

acta

t–K

onze

ntra

tions

reih

e:A

us d

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t-Sta

mm

lösu

ng w

ird e

ine

Ver

dünn

ungs

reih

e he

rges

tellt

. Pi

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eren

Sie

in

num

mer

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Röh

rche

n (N

r.1-9

) na

ch d

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olge

nden

Sch

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bere

chne

n Si

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ginn

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Nr.

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sung

m

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Err

echn

ete

Kon

zent

ratio

n im

R

öhrc

hen

(mm

ol/l)

Err

echn

ete

Kon

zent

ratio

n in

de

r K

üvet

te

(mm

ol/l)

1

0,5

--

2 0,

2 0,

2

3

0,2

0,3

4 0,

1 0,

4

5

0,1

0,9

6 0,

1 1,

4

7

0,1

2,4

8 0,

1 4,

9

9

--

1,0

- ��

-

Woc

he 7

Enz

yme

AG

Kud

la/B

atis

tic

Vor

bere

itung

:

Phot

omet

er u

nd a

nges

chlo

ssen

en M

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ompu

ter a

nste

llen.

Pr

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mm

zur

Auf

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e vo

n En

zym

kine

tiken

star

ten.

D

ie E

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eisu

ng e

rfol

gt v

om A

ssis

tent

en.

Mac

hen

Sie

sich

mit

dem

Abl

auf a

m M

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ompu

ter v

ertra

ut in

dem

Sie

ein

e Te

stm

essu

ng (a

n N

r. 1)

dur

chfü

hren

.B

enöt

igte

Lös

unge

n un

d Pi

pette

n be

reits

telle

n.

Mes

sabl

auf:

Pipe

ttier

en S

ie in

die

Mes

sküv

ette

(seh

r gen

au!)

:

1,25

ml R

eakt

ions

puff

er (H

ands

chuh

e!)

+

0,1

ml N

AD

Sta

mm

lösu

ng

+ 50

μl L

acta

t au

s der

Kon

zent

ratio

nsre

ihe

(Sta

rten

Sie

mit

Nr.1

)

Ans

atz

mit

eine

m R

ührs

pate

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mis

chen

, Küv

ette

in d

as P

hoto

met

er st

elle

n un

d de

n R

efer

enzw

ert a

ufne

hmen

+ 50

μl (

sehr

gen

au) L

-LD

H z

upip

ettie

ren

Erne

ut m

it de

m R

ührs

pate

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und

rasc

h m

isch

en!

Phot

omet

erde

ckel

schl

ieße

n un

d R

egis

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ung

am C

ompu

ter s

ofor

t sta

rten.

Rei

nige

n Si

e di

e be

nutz

te K

üvet

te in

tens

iv m

it H

2O u

m E

nzym

rest

e fü

r die

näc

hste

Mes

sung

ko

mpl

ett z

u en

tfern

en. D

iese

r Flü

ssig

abfa

ll w

ird g

eson

dert

gesa

mm

elt!

Wie

derh

olen

Sie

die

sen

Abl

auf f

ür a

lle L

acta

tkon

zent

ratio

nen.

- �0

-

Woc

he 7

Enz

yme

AG

Kud

la/B

atis

tic

Aus

wer

tung

:

Die

Aus

wer

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wird

wäh

rend

des

Pra

ktik

ums m

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icro

soft

Exce

l aus

gefü

hrt.

Aus

der

Extin

ktio

nszu

nahm

e pr

o Ze

it w

ird d

ie R

eakt

ions

gesc

hwin

digk

eit

v o b

erec

hnet

(mol

NA

DH

, bzw

. Lac

tat *

sec-1

* m

g En

zym

-1).

Die

s erf

olgt

mit

Hilf

e des

Lam

bert-

Bee

rsch

en-

Ges

etze

s (

NA

DH

, 340

nm

= 6

,3 L

* m

mol

-1 *

cm-1

). D

abei

ist

dar

auf

zu a

chte

n, d

ass

nur

die

Stei

gung

de

s lin

eare

n A

nfan

gsbe

reic

hs

zur

Aus

wer

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he

rang

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en

wird

(„

Anf

angs

gesc

hwin

digk

eit“

vo;

sieh

e Ei

nfüh

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obe

n).

Jede

r Sub

stra

tkon

zent

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n c S

(mol

/l) k

ann

dann

ein

Wer

t für

vo z

ugeo

rdne

t wer

den.

Tra

gen

Sie

in e

inem

Dia

gram

m v

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en c

S auf

(Su

bstra

tsät

tigun

gsfu

nktio

n; s

. Abb

ildun

g). I

n ei

nem

zw

eite

n D

iagr

amm

trag

en S

ie 1

/vo g

egen

1/c

S auf

(Lin

ewea

ver-

Bur

kD

arst

ellu

ng;

s. A

bb.).

In

dies

er D

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ollte

n di

e M

essp

unkt

e au

f ei

ner

Ger

aden

lie

gen

(Lin

ewea

ver-

Bur

k D

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ellu

ng; s

. Abb

.). In

die

ser D

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ng s

ollte

n di

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e au

f ein

er G

erad

en li

egen

. A

us d

en S

chni

ttpun

kten

der

extra

polie

rten

Aus

glei

chsg

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en m

it O

rdin

ate u

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sse l

asse

n si

ch d

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erte

für v

max

(mol

Lac

tat *

sec-1

* m

g En

zym

-1) u

nd K

M fü

r Lac

tat (

mol

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-1) a

blei

ten

Abb

ildun

g: S

ubst

ratfu

nktio

n de

r Lac

tat D

ehyd

roge

nase

- 71

-

Woc

he 7

Enz

yme

AG

Kud

la/B

atis

tic

Ver

such

2: P

erox

idas

eIs

olie

rung

, Tre

nnun

g un

d hi

stoc

hem

isch

er N

achw

eis p

flanz

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r Pe

roxi

dase

-Iso

enzy

me

Ver

such

szie

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In d

iese

m V

ersu

chst

eil s

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n pf

lanz

liche

Iso

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am B

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iel d

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idas

enzu

näch

stau

s pf

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n G

eweb

en i

solie

rt, ü

ber

eine

nat

ive

Gel

-Ele

ktro

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ese

aufg

etre

nnt

und

ansc

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ßend

im

Gel

mitt

els

eine

r sp

ezifi

sche

n Fä

rber

eakt

ion

sich

tbar

gem

acht

wer

den

(Ver

such

2a)

. Ein

dire

kter

Nac

hwei

s de

r Pe

roxi

dase

n in

pfla

nzlic

hen

Gew

eben

erf

olgt

dur

ch

eine

wei

tere

Fär

bere

aktio

n (V

ersu

ch 2

b).

The

oret

isch

er H

inte

rgru

nd

Isoe

nzym

e si

nd E

nzym

e, d

ie i

dent

isch

e ch

emis

che

Rea

ktio

nen

kata

lysi

eren

, si

ch a

ber

in

wei

tere

n Ei

gens

chaf

ten

(z.B

. Mol

mas

se, i

soel

ektri

sche

r Pun

kt, L

okal

isat

ion

im G

eweb

e et

c.)

vone

inan

der u

nter

sche

iden

. Iso

enzy

me

könn

en z

.B. P

rodu

kte

vers

chie

dene

r Gen

e se

in, w

elch

e si

ch in

der

Prim

ärst

rukt

ur (A

min

osäu

rese

quen

z de

s Pr

otei

ns) u

nter

sche

iden

. Neb

en g

enet

isch

be

ding

ten

Isoe

nzym

en k

önne

n ab

er a

uch

post

trans

latio

nale

Mod

ifika

tione

n ei

nes

Prot

eins

zu

meh

rere

n En

zym

varia

nten

füh

ren.

Da

die

gena

ue E

ntst

ehun

g vo

n m

ultip

len

Form

en e

ines

En

zym

s im

Ein

zelfa

ll hä

ufig

nic

ht le

icht

zu

klär

en is

t, ve

rwen

det m

an d

en I

soen

zym

begr

iff

mei

st „

oper

atio

nal“

, d.

h. f

ür a

lle f

unkt

ione

ll äh

nlic

hen

Enzy

me

eine

s O

rgan

ism

us (

glei

che

Nac

hwei

srea

ktio

n).

Pero

xida

sen

sind

ubi

quitä

r in

Pfla

nzen

, Tie

ren

und

Mik

roor

gani

smen

ver

brei

tet.

Die

Meh

rzah

l de

r Pe

roxi

dase

n si

nd

eise

nhal

tige

Porp

hyrin

-Gly

copr

otei

ne

(„H

ämin

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yme“

), an

dere

hi

ngeg

en

besi

tzen

ei

n C

ytoc

hrom

e-C

ty

pisc

hes-

, ei

n Se

len-

od

er

Van

adiu

m-Z

entru

m.

Pero

xida

sen

benö

tigen

als

Sub

stra

t ent

wed

er H

2O2 o

der O

2, um

ein

e V

ielz

ahl v

on R

eduk

tand

en

oxid

iere

n zu

kön

nen.

Es w

urde

n bi

sher

ber

eits

übe

r 200

mög

liche

Sub

stra

te id

entif

izie

rt.

Pero

xida

sen

RH

2 + H

2O2

2 H

2O +

R

Pfla

nzlic

he P

erox

idas

en d

er K

lass

e II

I (P

OX

, EC

1.1

1.1.

7; E

C =

enz

yme

com

mis

sion

) si

nd

Häm

-hal

tige

Gly

copr

otei

ne u

nd k

omm

en s

owoh

l int

ra-,

als

auch

ext

raze

llulä

r vor

und

kön

nen

aufg

rund

ihre

s is

oele

ktris

chen

Pun

ktes

(3,

5 -

10)

als

neut

ral,

saue

r od

er b

asis

ch k

lass

ifizi

ert

wer

den.

Höh

ere P

flanz

en b

esitz

en in

der

Reg

el ei

ne V

ielz

ahl P

erox

idas

e-Is

oenz

ymen

, die

dur

ch

eine

Mul

tigen

-Fam

ilie

codi

ert

wer

den.

Bis

zu

100

vers

chie

dene

Iso

enzy

me

wur

den

z.B

. in

Arab

idop

sise

ntde

ckt.

Die

Fu

nktio

nen

von

Pero

xida

sen

sind

vi

elfä

ltig;

si

e sp

iele

n ei

ne

Rol

le

bei

der

Bio

synt

hese

/Abb

au v

on L

igni

n in

der

Zel

lwan

d, d

er V

erkn

üpfu

ng v

on Z

ellw

andp

rote

inen

, dem

„E

ntgi

ften“

von

H2O

2, de

r Pro

dukt

ion

von

antim

ikro

biel

len

Rad

ikal

en, d

er W

undh

eilu

ng, d

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Oxi

datio

n vo

n to

xisc

hen

Red

ukta

nden

, de

m A

uxin

-Kat

abol

ism

us u

nd d

er A

bweh

r ge

gen

Path

ogen

e un

d In

sekt

en.

- 72

-

Woc

he 7

Enz

yme

AG

Kud

la/B

atis

tic

Bes

onde

rs g

ut s

ind

die

Funk

tione

n de

r pf

lanz

liche

n Pe

roxi

dase

n be

i de

r Li

gnifi

zier

ung

(rad

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isch

e Po

lym

eris

atio

n de

r Li

gnin

mon

omer

e) u

nter

such

t w

orde

n. Z

ellw

andg

ebun

dene

Pe

roxi

dase

n la

ssen

sich

dah

er h

isto

chem

isch

in g

roße

n M

enge

n im

ent

steh

ende

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ylem

in d

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Näh

e de

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ambi

en

nach

wei

sen.

D

a ei

ne

vers

tärk

te

Lign

ifizi

erun

g hä

ufig

au

ch

bei

Abw

ehrr

eakt

ione

n un

d V

erw

undu

ngen

ein

e R

olle

spi

elt,

ist

es n

icht

ver

wun

derli

ch,

dass

Pa

thog

enbe

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Stre

ss u

nd V

erle

tzun

g zu

r Ind

uktio

n vo

n Pe

roxi

dase

n fü

hren

.

Im �

nter

schi

ed z

u tie

risch

en e

ntha

lten

pfla

nzlic

he P

erox

idas

en v

iele

Koh

lenh

ydra

te

(

max

. 25

� d

er M

olek

ülm

asse

). D

ies

schü

tzt

sie

vor

dest

abili

sier

ende

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nflü

ssen

, w

ie z

.B.

Prot

eoly

se. A

ufgr

und

der

leic

hten

Zug

ängl

ichk

eit

und

hohe

n St

abili

tät

wer

den

Pero

xida

sen

viel

fach

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Hilf

senz

yme

in b

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chen

ode

r im

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olog

isch

en A

naly

seve

rfah

ren

(z.B

. EL

ISA

-Tes

t, W

este

rn-B

lots

, Sch

wan

gers

chaf

tste

st e

tc.)

eing

eset

zt.

Da

die

Ele

ktro

phor

ese

in V

ersu

chsw

oche

5 a

usfü

hrlic

h be

hand

elt w

ird, s

oll d

as P

rinzi

p di

eser

M

etho

de

an

dies

er

Stel

le

nur

kurz

be

schr

iebe

n w

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n:

Die

El

ektro

phor

ese

ist

ein

bioc

hem

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es

Tren

nver

fahr

en,

das

auf

unte

rsch

iedl

iche

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ysik

alis

ch-c

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en

Eige

nsch

afte

n vo

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akro

mol

ekül

en b

eruh

t. M

ittel

s El

ektro

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ese

lass

en s

ich

Gem

isch

e ge

lade

ner S

ubst

anze

n (z

.B. P

rote

ine)

tren

nen.

Dab

ei h

ängt

die

Wan

deru

ngsg

esch

win

digk

eit d

er

Subs

tanz

en v

on d

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elds

tärk

e un

d vo

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röße

, Ges

talt

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Ladu

ng d

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eilc

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ab. B

ei d

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Prot

eint

renn

ung

durc

h ei

ne P

olya

cryl

amid

-Gel

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ktro

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�PA

GE

� w

ird a

ls M

ediu

m

ein

Poly

acry

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idge

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wen

det.

Poly

acry

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id (

sieh

e A

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ung)

ist

ein

Pol

ymer

, he

rges

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dur

ch d

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erke

ttung

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cryl

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-Ein

heite

n un

d de

ren

�ue

rver

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ung

über

N,N

�-M

ethy

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isac

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mid

.

D

ie

Poly

mer

isat

ion

erfo

lgt d

urch

den

Rad

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star

ter A

mm

oniu

mpe

rsul

fat.

Zur S

tabi

lisie

rung

d

er

so

ents

tehe

nden

fr

eien

R

adik

ale

wird

de

m

Gem

isch

Te

tram

ethy

lend

iam

in

(T

EMED

) zu

gese

tzt.

Die

Po

reng

röße

de

s G

els

wird

du

rch

die

Acr

ylam

id-

und

N,N

�-M

ethy

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isac

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mid

-Kon

zent

ratio

n be

stim

mt.

Abb

ildun

g. H

erst

ellu

ng v

on

Poly

acry

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urch

V

erne

tzun

g vo

n A

cryl

amid

un

dN

,N�M

ethy

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isac

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mid

. A

ls R

adik

alst

arte

r wird

A

mm

oniu

mpe

rsul

fat

zuge

setz

t. ( D

. Voe

t � J.

G.

Voe

t, B

ioch

emis

try, W

iley,

N

ew �

ork,

1��

5).

Die

PA

GE

kann

entw

eder

unt

er n

ativ

en o

der u

nter

den

atur

iere

nden

Bed

ingu

ngen

erfo

lgen

. Ein

e na

tive P

AG

E tr

ennt

Pro

tein

e in

eine

m g

egen

über

dem

in��

i�o-

Zust

and

unve

ränd

erte

n Zu

stan

d.

Enzy

me

beha

lten

ihre

kat

alyt

isch

e A

ktiv

ität,

Olig

omer

e w

erde

n (m

öglic

hst)

erha

lten.

- 7�

-

Woc

he 7

Enz

yme

AG

Kud

la/B

atis

tic

Im K

urs w

ird e

ine

Ver

tikal

gelk

amm

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ach

Stud

ier v

erw

ende

t (si

ehe

unte

n). D

ie G

ele

wer

den

in d

iese

r Ver

such

swoc

he g

este

llt u

nd w

urde

n, w

ie in

Ver

such

swoc

he 5

bes

chrie

ben,

geg

osse

n.

Abb

ildun

g. V

ertik

alge

lkam

mer

nac

h St

udie

r

Akt

ivit�

tsf�

r�un

gen

im G

el o

der

im G

eweb

e si

nd n

eben

den

ber

eits

ken

neng

eler

nten

ge

kopp

elte

n En

zym

test

s ei

ne

wei

tere

M

etho

de

der

Enzy

mbe

stim

mun

g.

Mitt

els

dies

er

soge

nann

ten

„kol

orim

etri

sche

n E

nzym

test

s“ l

asse

n si

ch E

nzym

e od

er a

uch

Met

abol

ite

kolo

rimet

risch

sow

ohl

qual

itativ

, al

s au

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uant

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nac

hwei

sen.

Kol

orim

etris

che

Test

s w

erde

n in

der

Ind

ustri

e un

d de

r M

ediz

in r

outin

emäß

ig e

inge

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t z.B

. zur

Bes

timm

ung

des

Blu

tzuc

kers

pieg

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nd z

ur B

estim

mun

g vo

n Pe

stiz

iden

im G

rund

was

ser.

Exp

erim

ente

ller

Tei

l

Ver

such

2a:

Isol

ieru

ng v

on P

erox

idas

e Is

oenz

ymen

, Auf

tren

nung

�er

nativ

e E

lekt

roph

ores

e un

d ��

r�un

g im

Gel

Zum

Nac

hwei

s de

r Pe

roxi

dase

Akt

ivitä

t ve

rwen

det

man

sta

tt de

r w

enig

abs

orbi

eren

den

natü

rlich

en P

heno

le a

rtifiz

ielle

Akz

epto

ren,

die

bei

ihre

r enz

ymat

isch

en �

mw

andl

ung

eine

m

star

ken

Farb

wec

hsel

unt

erlie

gen.

Im v

orlie

gend

en T

est v

erm

ittel

t die

Per

oxid

ase

die

Oxi

datio

n de

s in

der r

eduz

ierte

n Fo

rm fa

rblo

sen

Was

sers

toff

dona

tors

4-C

hlor

-1-n

apht

hol z

um o

xidi

erte

n,

blau

schw

arz

gefä

rbte

n 4-

Chl

or-1

-nap

htho

l.

Pfla

nzen

mat

eria

l: �

�e 2�

� m

g�

T

omat

e:

gro�

e B

l�tt

er

Ta�

ak:

gro�

e B

l�tt

er, k

lein

e B

l�tt

er, W

urze

l

Ger

�te:

N

2-B

ehäl

ter,

Eisk

iste

, Waa

ge, R

asie

rklin

ge, B

rettc

hen,

Stö

ßel,

Eppe

ndor

fgef

äße,

vor

gekü

hlte

Epp

endo

rftis

chze

ntrif

uge,

Sch

utzb

rille

, Sca

nner

��s

unge

n/�

hem

ikal

ien:

Auf

schl

ussp

uffe

r

0,1

M K

H2P

O4/

M K

2HPO

4, pH

7,0

- 7�

-

Woc

he 7

Enz

yme

AG

Kud

la/B

atis

tic

3 m

M E

DTA

0,

5� (w

/v) P

olyc

lar A

T

5 m

M D

ithio

eryt

hrito

l, D

TE

nativ

es G

el (1

0�ig

)

4,�

ml A

. bid

est

3,0

ml 1

,5 M

Tris

/HC

l, pH

�,�

4,0

ml 3

0� A

cryl

amid

(fer

tig a

nges

etzt

, gift

ig!!

�10

0 �l

10�

Am

mon

ium

pers

ulfa

t

10

�l T

EMED

Elek

troph

ores

elau

fpuf

fer

0,1�

M G

lyci

n 0,

0125

M T

ris, p

H �

,�

Prob

enpu

ffer

3 m

l Gly

cerin

1

Spat

elsp

itze

Bro

mph

enol

blau

7

ml A

. bid

est

Inku

batio

nspu

ffer

50 m

M K

2HPO

4/KH

2PO

4, p

H 7

,350

0 m

M N

aCl

Färb

elös

ung

20

ml I

nkub

atio

nspu

ffer

5

ml M

eOH

3,75

mg

4-C

hlor

-1-n

apht

hol

(Han

dsch

uhe�

)

H2O

2-Lö

sung

(30�

ig)

(ätze

nd!!

!)

Auf

ar�e

itung

der

Pro

�en

Je

200

mg

fris

ch g

eern

tete

s Pfla

nzen

mat

eria

l (W

aage

) wur

den

in e

in b

esch

rifte

tes 1

,5

ml E

ppen

dorf

gefä

ß ge

gebe

n un

d m

it H

ilfe

in fl

üssi

gen

Stic

ksto

ff g

efro

ren

(�ch

utz�

rille

���)

G

efro

rene

Pro

be m

it ei

nem

Stö

ßel f

ein

pulv

eris

iere

n,an

schl

ieße

nd 4

00 �

l Auf

schl

ussp

uffe

r daz

ugeb

en

Pr

oben

15

min

bei

140

00 rp

m u

nd 4

oC

zent

rifug

iere

n

die

klar

en �

bers

tänd

e m

ittel

s Pip

ette

in 1

,5 m

l Epp

endo

rfge

fäße

übe

rfüh

ren

Sollt

en si

ch n

och

Zellb

ruch

stüc

ke e

tc. i

m �

bers

tand

bef

inde

n er

neut

zen

trifu

gier

en

(s.o

.)

10 �

l aus

dem

�be

rsta

nd in

ein

neu

es E

ppi ü

berf

ühre

n

Alle

4 P

robe

n m

it �e

2,5

�l P

robe

npuf

fer v

erse

tzen

Prob

en b

is z

ur E

lekt

roph

ores

e au

f Eis

auf

bew

ahre

n

Vor

�ere

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und

�ur

chf�

hrun

g de

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ores

e

M

arki

eren

Sie

die

Tas

chen

böde

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Gla

spla

tte m

it ei

nem

Edd

ing

Pr

oben

-Kam

m v

orsi

chtig

nac

h ob

en a

us d

em G

el z

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n

D

ie G

lasp

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n in

die

Ele

ktro

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esea

ppar

atur

ein

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en

Ei

nmal

den

Dec

kel a

ufse

tzen

, um

zu

test

en, d

ass e

r ric

htig

sitz

t

- 7�

-

Woc

he 7

Enz

yme

AG

Kud

la/B

atis

tic

V

orra

tsbe

hälte

r (ob

en u

nd u

nten

) mit

Lauf

puff

er b

efül

len;

dab

ei d

arau

f ach

ten,

das

s sic

h

kein

e Lu

ftbla

sen

an d

er u

nter

en G

elka

nte

befin

den

D

as G

esam

tvol

umen

der

Pro

ben

mit

eine

r Pip

ette

in d

ie T

asch

en fü

llen

St

rom

stär

ke v

on 3

0 M

illi-A

mpe

re p

ro G

el e

inst

elle

n un

d de

n La

uf st

arte

n

(Lau

fzei

t ca.

1h)

Anf

�r�e

n de

r Pe

roxi

dase

-Ban

den

im G

el

G

lass

chei

ben

aus E

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ores

e-A

ppar

atur

ent

fern

en u

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orsi

chtig

auf

hebe

ln

Gel

ent

nehm

en u

nd in

ein

er P

last

iksc

hale

in 3

0 m

l Ink

ubat

ions

puff

er 5

min

inku

bier

en

Puff

er a

bgie

ßen

und

die

Färb

elös

ung

(Han

dsch

uhe�

) auf

s Gel

gie

ßen

10

0 �l

30�

iges

H2O

2 in

die

Färb

elös

ung

pipe

ttier

en (�

chut

z�ri

lle�

) und

vor

sicht

ig

sc

hwen

ken

rbun

g de

r Ban

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könn

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bere

llins

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Synt

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en. K

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n K

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hälft

en s

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abe

r zu

eine

r Ind

uktio

n de

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myl

ase-

Synt

hese

führ

en, u

nd z

war

gen

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ie d

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halti

gen

Kör

nern

ode

r Kor

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t. b)

Es

ist z

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ansa

tz z

usät

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h m

it ei

nem

Pro

tein

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hese

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ubie

rt (z

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ion

oder

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lo-

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d ei

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nen

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n (S

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nten

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he �

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wen

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atriu

mhy

poch

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und

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jew

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dest

. ge

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chen

. N

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tzte

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A

nsat

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ch m

it ca

. 20

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rech

ende

n In

kuba

tions

lösu

ng g

ewas

chen

: A

nsat

z 1)

A

qua

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st.

2)

A

qua

bide

st.

3)

10

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GA

3-Lö

sung

(99

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qua

bide

st. +

1 m

l 10-4

M G

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Lösu

ng)

4)

10-6

M G

A3-

Lösu

ng (9

8 m

l Aqu

a bi

dest

. + 1

ml 1

0-4 M

GA

3-Lö

sung

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s 1 m

l C

hx. (

Cyc

lohe

xim

id-L

ösun

g, 2

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Dan

n w

erde

n di

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nsät

ze in

ca.

50

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er e

ntsp

rech

ende

n In

kuba

tions

lösu

ng b

ei 4

°C im

Küh

l-sc

hran

k üb

er N

acht

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uolle

n.

Am

näc

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n Ta

g w

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ornh

älfte

n ab

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ntie

rt. V

ier P

VC

-Pe

trisc

hale

n w

erde

n m

it 8-

lagi

gem

Zel

lsto

ff a

usge

legt

und

mit

so v

iel

der

jew

eils

fris

ch

ange

setz

ten

Inku

batio

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sung

get

ränk

t, da

ss d

ie F

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it ge

rade

noc

h in

den

tief

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Del

len

des

Papi

ers

frei

ste

ht (

das

Papi

er s

oll

also

seh

r na

ss,

aber

nic

ht ü

berf

lute

t se

in).

Die

10

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nhäl

ften

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jede

m d

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Ans

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wer

den

dann

so in

die

Pet

risch

alen

ein

gebr

acht

, das

s die

Sc

hnitt

fläch

en n

ach

oben

in d

ie L

uft r

agen

. D

ie v

ersc

hlos

sene

n Pe

trisc

hale

n w

erde

n nu

n bi

s zu

m n

ächs

ten

Tag

bei 3

0°C

im B

ruts

chra

nk

inku

bier

t und

ans

chlie

ßend

bei

-20°

C a

ufbe

wah

rt.

2� T

eil:

�Eig

ene

�ur

chf�

hrun

g - V

ersu

chst

ag �

� E

xtra

ktio

n de

r K

ornh

�lft

en:

�Her

stel

len

des R

ohex

trak

ts�

Gru

ppen

1, 5

, 6 u

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0 ex

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eren

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s A

nsat

z 2

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bryo

�rei

e K

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hälft

en in

Aqu

a bi

dest

.), G

rupp

en 3

und

8 e

xtra

hier

en R

E au

s A

nsat

z 3

(em

bryo

�rei

e K

orn-

hälft

en in

GA

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sung

), G

rupp

en 4

und

9 e

xtra

hier

en R

E au

s A

nsat

z 4

(em

bryo

�rei

e K

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hälft

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n G

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3 m

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schi

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ylas

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5

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je 1

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6

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myl

ase

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dest

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ontro

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n na

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ckel

n im

Bru

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rank

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iert

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vors

icht

ig t

rans

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eren

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un k

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n di

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schi

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ndiff

undi

eren

und

die

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e ab

baue

n. N

ach

3 h

30 m

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stag

es) u

nd n

ach

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td. (

am n

ächs

ten

Kur

stag

) wird

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te a

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chra

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stag

� u

nd 2

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ie A

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wird

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l ver

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-Jod

-Kal

ium

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)-Lö

sung

übe

rgos

sen

und

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en g

elas

sen.

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n w

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K-L

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g in

ein

e A

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che

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ntie

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ie

Aga

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rflä

che

mit

Leitu

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r abg

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lt un

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e Pl

atte

geg

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s Lic

ht b

etra

chte

t und

da

s Er

gebn

is d

okum

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rt (m

öglic

hst d

urch

Fot

ogra

fiere

n, D

igita

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era

mitb

ringe

n!).

Noc

h im

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r ver

blie

bene

Stä

rke

wird

dur

ch Jo

d-Ei

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g (S

tärk

espi

rale

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obei

nic

ht

gesp

alte

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tärk

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ett

und

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xtrin

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ukt

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ylas

en)

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er

sche

int.

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ke b

zw.

das

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ein

lage

rn k

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ers

chei

nen

Ber

eich

e m

it vo

llstä

ndig

abg

ebau

ter S

tärk

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eiß

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wei

s auf

-A

myl

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ivitä

t).

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ein

gela

gerte

Jod

sub

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rt re

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sch

nell,

dah

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t es

wic

htig

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s ze

itnah

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graf

iert

wird

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ich

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dem

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bella

risch

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wer

den!

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ei s

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auch

auf

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und

die

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lität

der

Ent

färb

ungs

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n be

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ilt w

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n.

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Sie

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ebni

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Bew

egun

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G v

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B� �

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trec

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Hor

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hr g

erin

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Men

gen

vor.

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en N

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und

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Ver

fügu

ng (z

.B. r

adio

aktiv

mar

kier

te H

orm

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Rad

ioim

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test

). Zu

r qu

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g ve

rwen

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an a

ber

auch

den

sog

. „B

iote

st“.

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sen

Prin

zip

best

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arin

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s man

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, auf

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mon

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isst

. Die

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ktio

n w

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mit

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eche

nde

Hor

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olch

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ch e

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Unt

ersu

chun

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öglic

hkei

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an k

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dam

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üfen

, ob

syn

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isch

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rges

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die

gle

iche

Rea

ktio

n he

rvor

rufe

n w

ie d

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flanz

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Hor

mon

. Fü

r ein

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st v

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ende

t man

sol

che

Pfla

nzen

teile

, die

auf

das

zu

unte

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e H

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Bei

den

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(wie

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oles

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) ist

das

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und

auch

heu

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erw

ende

te O

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oleo

ptile

(K

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sche

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A�

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m e

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Zust

and

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keln

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n w

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kal)

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uzie

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ipet

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zone

n st

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s Wac

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ird d

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ptilg

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M

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n (D

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der

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ungs

wac

hstu

m).

Ver

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7 E

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kolb

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l ein

er 1

0-3, 1

0-4, 1

0-5, 1

0-6, 1

0-7, 1

0-8 u

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mol

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IE

S-Lö

sung

bef

inde

n. D

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wird

ein

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olar

e IE

S-Lö

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folg

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lt:

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S w

erde

n in

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st.

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gebe

n. D

ie L

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ird m

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N H

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stel

lt un

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titat

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ein

en 1

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l Mes

skol

ben

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h. 3

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ca. 5

ml A

qua

bide

st. n

ach-

spül

en).

Ans

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wird

mit

Aqu

a bi

dest

. au

f 10

0 m

l au

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üllt.

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eich

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eit

halb

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en d

er Z

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rspa

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wird

die

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M IE

S-Lö

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ges

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tions

med

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die

Kol

eopt

ilen:

In e

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nmey

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wer

den

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l Aqu

a bi

dest

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ontro

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atz

ohne

IES)

. Aus

de

r 10

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olar

en I

ES-L

ösun

g w

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n di

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dere

n IE

S-Lö

sung

en d

urch

Ver

dünn

en i

n 10

er

Schr

itten

her

gest

ellt.

Daz

u w

erde

n 10

ml d

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0-3 m

olar

en L

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ein

en E

rlenm

eyer

kolb

en

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ttier

t. H

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ml i

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nen

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ten

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nmey

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ipet

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und

9 m

l Aqu

a bi

dest

. da

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n. N

ach

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dlic

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Dur

chm

isch

en w

ird a

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r 10

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olar

en I

ES-L

ösun

g w

iede

r 1 m

l ent

nom

men

(usw

.).

Her

stel

len

der

Kol

eopt

ilseg

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te:

Etio

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erko

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ucht

scha

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mm

en (

Kol

eopt

ile n

icht

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ücke

n S

chäd

igun

g!)

und

das

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rnt.

Mit

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chne

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at w

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n m

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um

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m d

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itier

t und

5 m

m la

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tück

e gew

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n. D

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K

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ptilz

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n so

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mith

ilfe

eine

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zette

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ie E

rlenm

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ösun

g ge

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n, d

.h. j

e 15

Seg

men

te p

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ösun

g. D

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rlenm

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den

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4 St

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n du

nkel

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wen

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hkei

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sung

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e R

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dlän

ge d

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Kol

eopt

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men

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angs

läng

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gefü

hrt.

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lwer

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wer

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n

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10.

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wer

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die

Ein

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stre

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z.B

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1.

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srei

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2. M

essr

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:

x 1i

19

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10

20

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21

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1 =

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2 =

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1 =

1 n-

1 =

10

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te v

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chun

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Von

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G

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rste

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stge

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n, w

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eide

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reck

en b

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n m

üsse

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Kol

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X

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cke

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Stre

cke

t =

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cke

t =

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cke

t =

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Stre

cke

t = 1

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und

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falls

ein

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unkt

ion

in E

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rindi

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r Y).

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00 -

Woc

he 1

0 M

olek

ular

biol

ogie

II

AG

Kud

la/W

einl

Plas

mid

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ieru

ng, R

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iktio

n &

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nsfo

rmat

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D

er h

eutig

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ersu

chst

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s be

schä

ftige

n si

ch m

it de

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hode

n de

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ekul

arge

netik

, die

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te in

pra

ktis

ch a

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Ber

eich

en d

er B

iolo

gie

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n.

Heu

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e Pl

asm

id-D

NA

aus

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terie

n is

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ren,

rei

nige

n un

d zu

r K

ontro

lle e

inen

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estri

ktio

nsve

rdau

dur

chfü

hren

. Si

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n ko

mpe

tent

e B

akte

rien

mit

dem

ger

eini

gten

Pl

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id

trans

form

iere

n un

d w

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n de

n Tr

ansf

orm

atio

nser

folg

au

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lekt

iven

M

edie

n üb

erpr

üfen

.

Plas

mid

ePl

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omos

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der

Reg

el ri

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e (zi

rkul

äre)

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träng

ige D

NA

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olek

üle,

die

in

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en M

ikro

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nism

en h

äufig

auc

h na

türli

ch v

orko

mm

en.

Sie

besi

tzen

G

röße

n zw

isch

en 2

und

200

kb u

nd d

iene

n vi

elfä

ltige

n bi

olog

isch

en F

unkt

ione

n.

Die

in d

er M

olek

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gene

tik v

erw

ende

ten

Plas

mid

e (a

uch

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Vek

tore

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zeic

hnet

, da

sie

zur

Übe

rtrag

ung

zu k

loni

eren

der G

ene

in B

akte

rien

dien

en) s

tam

men

nur

von

ein

er k

lein

en Z

ahl

bakt

erie

ller

Plas

mid

e ab

, di

e üb

er g

ezie

lte D

NA

-Rek

ombi

natio

n fü

r di

e ve

rsch

iede

nen

Anw

endu

ngen

opt

imie

rt w

urde

n. A

lle d

iese

Pla

smid

e (i.

d.R

. 2 –

15k

b) tr

agen

ein

Gen

für e

ine

Ant

ibio

tika-

Res

iste

nz, d

amit

Plas

mid

-hal

tige,

tran

sgen

e B

akte

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im G

egen

satz

zu

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mid

-lo

sen

Wild

typ-

Bak

terie

n au

f A

ntib

iotik

a-ha

ltige

m

Sele

ktio

nsm

ediu

m

wac

hsen

nnen

. D

aneb

en en

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ten

alle

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smid

e ein

en R

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nsur

spru

ng (O

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„orig

in o

f rep

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ion“

), de

r si

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aut

onom

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atio

n im

Bak

teriu

m b

efäh

igt.

Der

OR

I ent

sche

idet

übe

r die

Kop

ienz

ahl

des

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mid

s pr

o B

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elle

(u

nd

dam

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er

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mid

ausb

eute

pr

o M

illili

ter

Kul

turm

ediu

m):

man

unt

ersc

heid

et lo

w-c

opy-

Plas

mid

e (<

20 K

opie

n je

Zel

le) u

nd h

igh-

copy

-Pl

asm

ide

(>20

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ien

je Z

elle

). V

iele

mod

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Lab

or-P

lasm

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enth

alte

n de

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olE1

-Orig

in,

der

zu e

iner

Kop

ienz

ahl

von

meh

rere

n hu

nder

t Pl

asm

iden

pro

Bak

terie

nzel

le f

ührt.

Zur

A

ufna

hme

zu k

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eren

der

Gen

e tra

gen

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rpla

smid

e m

eist

ein

en P

olyl

inke

r (m

ultip

le

clon

ing

site

, m

cs)

– ei

ne

kurz

e sy

nthe

tisch

e D

NA

-Seq

uenz

, di

e an

eina

nder

gere

iht

Erke

nnun

gsse

quen

zen

zahl

reic

her

gäng

iger

und

sel

tene

r R

estri

ktio

nsen

zym

e en

thäl

t. D

er

Poly

linke

r wird

häu

fig a

uf b

eide

n Se

iten

flank

iert

von

unte

rsch

iedl

iche

n Pr

omot

oren

(z.B

. den

Pr

omot

oren

T3

und

T7, d

ie v

on d

en R

NA

-Pol

ymer

asen

des

T3-

bzw

. T7-

Phag

en s

pezi

fisch

er

kann

t wer

den)

, so

dass

das

klo

nier

te G

en u

nabh

ängi

g vo

n se

iner

Orie

ntie

rung

tran

skrib

iert

wer

den

kann

. G

ängi

ge P

lasm

ide

sind

pB

R32

2 (1

5-20

Kop

ien)

, pU

C (

500-

700

Kop

ien)

, pB

lues

crip

t (30

0-50

0 K

opie

n) u

nd p

GEM

(300

-400

Kop

ien)

.

E. c

oli

Esch

eric

hia

coli

ist e

in m

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har

mlo

ses,

Gra

m-n

egat

ives

Dar

mba

kter

ium

. Pra

ktis

ch a

lle im

La

bor v

erw

ende

ten

E.-c

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täm

me

gehe

n au

f den

Sic

herh

eits

stam

m K

-12

zurü

ck. V

on K

-12

abge

leite

te S

täm

me,

die

sich

gut

für d

ie K

loni

erun

g vo

n Pl

asm

iden

eign

en, s

ind

z.B

. DH

1, D

H5

und

XL1

-Blu

e. B

eson

ders

häu

fig v

erw

ende

t w

ird d

er S

tam

m X

L1-B

lue,

der

zw

ar e

twas

la

ngsa

mer

wäc

hst,

aber

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Vor

teil

hat,

reko

mbi

natio

nsde

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nt (

recA

- ) zu

sei

n, s

o da

ss

uner

wün

scht

e R

ekom

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tione

n de

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A, d

ie so

nst v

orko

mm

en k

önnt

en, n

icht

auf

trete

n.

E. c

oli

ist

ein

sehr

gen

ügsa

mes

Bak

teriu

m,

das

in e

inem

flü

ssig

en o

der

auf

eine

m f

este

n M

inim

alm

ediu

m a

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luko

se (

C-

und

Ener

gieq

uelle

) un

d ei

nige

n Sa

lzen

(u.

a. N

-Que

lle)

- �0�

-

Woc

he 1

0 M

olek

ular

biol

ogie

II

AG

Kud

la/W

einl

wac

hsen

kan

n. U

m e

in s

chne

llere

s W

achs

tum

zu

erre

iche

n, v

erw

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t man

jedo

ch m

eist

ein

ko

mpl

exer

es M

ediu

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.B. L

B (L

uria

-Ber

tani

, mit

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eext

rakt

, Bac

totry

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und

NaC

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roth

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ansg

ene

Bak

terie

n en

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ten

in d

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egel

ein

Pla

smid

, das

neb

en d

em z

u kl

onie

rend

en G

en a

ls M

arke

r ei

n G

en f

ür e

ine

Ant

ibio

tika-

Res

iste

nz t

rägt

. In

die

sem

Fal

l w

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e B

akte

rien

in o

der a

uf e

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Ant

ibio

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halti

gen

Med

ium

ang

ezog

en, s

o da

ss n

ur

trans

gene

Bak

terie

n, n

icht

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r B

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des

Wild

typs

wac

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kön

nen.

Vie

le A

ntib

iotik

a,

z.B

. das

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fig v

erw

ende

te A

mpi

cilli

n, s

ind

tem

pera

ture

mpf

indl

ich,

so

dass

sie

dem

Med

ium

er

st n

ach

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Aut

okla

vier

en u

nd A

bküh

len

zuge

setz

t wer

den

dürf

en.

Um

ein

gut

es u

nd g

leic

hmäß

iges

Wac

hstu

m z

u er

ziel

en, w

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akte

rien,

aus

gehe

nd v

on

eine

r ein

zeln

en K

olon

ie a

uf e

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Aga

rpla

tte, z

unäc

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n ei

ner V

orku

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n flü

ssig

em M

ediu

m

über

Nac

ht v

erm

ehrt

(ÜN

-Kul

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, be

vor

die

eige

ntlic

he H

aupt

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r in

der

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ünsc

hten

M

enge

an

Flüs

sigm

ediu

m a

us d

iese

r V

orku

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ange

impf

t wird

. Je

nach

Pla

smid

beda

rf u

nd

dem

ents

prec

hend

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olum

en d

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ultu

r unt

ersc

heid

et m

an z

wis

chen

Min

i-Prä

p(ar

atio

n) (2

-10

ml),

Mid

i-Prä

p (2

5-10

0ml)

und

Max

i-Prä

p (>

100m

l).

Plas

mid

-Iso

lieru

ng u

nd R

eini

gung

r vie

le m

olek

ular

gene

tisch

e A

rbei

ten

ist d

ie Q

ualit

ät d

er e

inge

setz

ten

DN

A (o

der R

NA

) von

en

tsch

eide

nder

Wic

htig

keit.

Kon

zent

ratio

n au

f so

rgfä

ltige

s un

d sa

uber

es A

rbei

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bei

der

Isol

ieru

ng u

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eini

gung

der

Nuk

lein

säur

en is

t dah

er n

icht

nur

bes

onde

rs w

icht

ig, s

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rn

ersp

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äufig

auc

h vi

el F

rust

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n be

i den

folg

ende

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tssc

hritt

en. I

nsbe

sond

ere

ist a

uf d

ie

Ver

mei

dung

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Kon

tam

inat

ione

n du

rch

DN

Ase

n (b

zw. R

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sen)

zu

acht

en.

Der

ers

te S

chrit

t der

Pla

smid

isol

ieru

ng is

t das

Auf

brec

hen

der B

akte

rienz

elle

n. D

ies g

esch

ieht

m

eist

übe

r ei

ne a

lkal

isch

e Ly

se. F

ür d

ie a

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e Ly

se, d

ie a

uch

den

mei

sten

kom

mer

ziel

l er

hältl

iche

n K

its z

ur P

lasm

idis

olat

ion

zugr

unde

lieg

t, w

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n di

e B

akte

rien

pelle

tiert

und

nach

En

tfern

en d

es M

ediu

ms

in E

DTA

-hal

tigem

Puf

fer r

esus

pend

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Das

ED

TA k

ompl

exie

rt di

e zw

eiw

ertig

en K

atio

nen

(Ca2+

, Mg2+

, and

ere

Schw

erm

etal

le) a

us d

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akte

rielle

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llwan

d un

d de

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ilisi

ert

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e. D

aneb

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nthä

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ffer

RN

Ase

n, u

m u

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ünsc

hte

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A M

olek

üle

abzu

baue

n. D

ie a

nsch

ließe

nde

Inku

batio

n in

SD

S (N

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m-D

odec

ylsu

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NaO

H

dena

turie

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llmem

bran

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mac

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NA

des

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teriu

ms

zugä

nglic

h. N

aOH

de

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die

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vor

hand

ene

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A u

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rote

ine.

Ein

e vo

llstä

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e Ly

se

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Den

atur

ieru

ng is

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sche

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d fü

r die

Qua

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t und

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lität

der

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ierte

n Pl

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id-

DN

A. A

nsch

ließe

nd w

ird d

ie a

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isch

e Ly

se d

urch

den

Zus

atz

von

saur

em K

aliu

mac

etat

-Pu

ffer

ges

topp

t. H

ierb

ei b

ilden

sich

Kom

plex

e au

s unl

öslic

hem

Kal

ium

-Dod

ecyl

sulfa

t und

den

de

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rierte

n Pr

otei

nen

aus

den

Bak

terie

nzel

len.

Die

chr

omos

omal

e D

NA

ble

ibt

mit

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Prot

eink

ompl

exen

ass

oziie

rt un

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t sch

wer

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ls d

ie P

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NA

und

kan

n zu

sam

men

mit

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Zellt

rüm

mer

n (D

ebris

) abz

entri

fugi

ert w

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n. D

ie k

lein

eren

Pla

smid

e re

natu

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ter

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neut

rale

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edin

gung

en u

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leib

en im

Übe

rsta

nd.

Die

Pla

smid

e kö

nnen

aus

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nd d

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en L

yse

durc

h Zu

gabe

von

eis

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m

Etha

nol

oder

Iso

prop

anol

gef

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und

ansc

hlie

ßend

abz

entri

fugi

ert

wer

den.

DN

A i

st i

n de

r G

egen

war

t mon

oval

ente

r Kat

ione

n in

Eth

anol

unl

öslic

h. Z

unäc

hst w

ird d

er P

lasm

id-h

altig

en

Lösu

ng N

atriu

mac

etat

, ans

chlie

ßend

100

%ig

er E

than

ol (

2,5

– 3

fach

es V

olum

en)

zuge

setz

t. D

ie F

ällu

ng e

rfol

gt d

ann

mei

st b

ei 4

°C, u

m d

ie A

usbe

ute

zu v

erbe

sser

n. A

nsch

ließe

nd w

ird d

ie

präz

ipiti

erte

D

NA

du

rch

Zent

rifug

atio

n au

s de

r Lö

sung

ab

getre

nnt.

Je

nach

V

erw

endu

ngsz

wec

k m

üsse

n di

e Pl

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ide

jedo

ch n

och

wei

ter

aufg

erei

nigt

bzw

. en

tsal

zt

- �0�

-

Woc

he 1

0 M

olek

ular

biol

ogie

II

AG

Kud

la/W

einl

wer

den.

Der

let

zte

Schr

itt d

er P

lasm

idis

olie

rung

ist

dah

er d

ie R

eini

gung

der

DN

A d

urch

W

asch

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verw

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Was

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ager

t.

Qua

ntitä

t und

Qua

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ukle

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sung

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g/m

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pels

träng

iger

DN

A (d

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ne o

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hte

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träng

ige

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l, ss

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me

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trikt

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me

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B

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nen

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gen-

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NA

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ktio

nsen

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schü

tzt.

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ekul

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w

erde

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estri

ktio

nsen

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hen

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sche

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den

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trikt

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me

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eset

zt,

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nsen

zym

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che

Nuk

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z au

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8

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olek

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me

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men

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nds)

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. Die

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bers

tehe

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die

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Res

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dem

Gen

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itten

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für

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sen

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NA

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r (up

stre

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wns

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G

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die

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hend

en

Erke

nnun

gsse

quen

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n,

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G

en

dies

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enz

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kom

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dar

f), s

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ngss

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nder

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A-M

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trikt

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men

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ular

biol

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ent

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n je

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chen

und

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lindr

omis

chen

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uenz

kom

plem

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bers

tehe

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Ende

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f. D

iese

kön

nen

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iere

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ein

wie

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m z

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äres

Pla

smid

aus

der

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prün

glic

hen

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tors

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nz u

nd d

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nier

ende

n G

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erei

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wird

dan

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ieße

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durc

h di

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ktiv

ität

eine

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gase

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rble

iben

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rset

zten

Ei

nzel

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üche

dur

ch K

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on P

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este

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dung

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ndet

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rtig

gest

ellt

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ombi

nant

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NA

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igat

ion

zwei

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mit

glat

ten

Ende

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t wei

t sch

wie

riger

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es

ke

ine

stab

ilisi

eren

den

Hyb

ridis

ieru

ngsm

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chen

de

n be

iden

zu

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dend

en D

NA

-Mol

ekül

en g

ibt.

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die

sen

Effe

kt z

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mpe

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ren,

wer

den

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tione

n vo

n Fr

agm

ente

n m

it gl

atte

n En

den

bei e

iner

Tem

pera

tur v

on 1

5°C

dur

chge

führ

t. H

ierb

ei is

t die

th

erm

isch

e B

eweg

ungs

ener

gie

der

Ende

n w

esen

tlich

ger

inge

r un

d di

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fizie

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igat

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wird

deu

tlich

erh

öht.

Die

Klo

nier

ung

unte

r zu

Hilf

enah

me

nur

eine

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ktio

nsen

zym

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t ab

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uch

bei

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häng

ende

n En

den

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htei

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rend

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n zw

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ersc

hied

enen

O

rient

ieru

ngen

in d

en V

ekto

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iert

wer

den

kann

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robl

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durc

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n Ei

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z vo

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hied

enen

Res

trikt

ions

enzy

men

um

gang

en w

erde

n, d

ie u

nter

schi

edlic

he ü

bers

tehe

nde

Ende

n er

zeug

en (

in d

iese

m F

all m

uss

das

eine

Res

trikt

ions

enzy

m v

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em G

en, d

as a

nder

e hi

nter

dem

Gen

schn

eide

n, u

nd d

ie E

rken

nung

sseq

uenz

en fü

r bei

de R

estri

ktio

nsen

zym

e müs

sen

im P

olyl

inke

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den

sein

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mat

isch

kan

n be

i die

sem

Vor

gehe

n di

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tsac

he s

ein,

da

ss v

ersc

hied

ene R

estri

ktio

nsen

zym

e unt

ersc

hied

liche

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ingu

ngen

für d

ie o

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ale A

ktiv

ität

benö

tigen

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. Puf

fers

ubst

anz

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st T

ris),

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e (m

eist

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l 2, N

aCl o

der

KC

l), p

H-W

ert

(mei

st p

H 7

,5-8

), Te

mpe

ratu

r (m

eist

37°

C).

Die

Akt

ivitä

t der

Res

trikt

ions

enzy

me

unte

r de

n je

wei

ligen

Bed

ingu

ngen

wird

in E

inhe

iten

(Uni

ts)

ange

gebe

n: 1

Uni

t spa

ltet 1

μg

DN

A (

als

Stan

dard

wird

DN

A d

es B

akte

rioph

agen

Lam

bda

verw

ende

t) in

1 S

tund

e vo

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ndig

.

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rose

-Gel

elek

trop

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ein

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ent

steh

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n, D

NA

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gmen

te v

onei

nand

er

trenn

en z

u kö

nnen

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zt m

an d

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hem

isch

en E

igen

scha

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der D

NA

aus

: alle

DN

A-M

olek

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trage

n au

fgru

nd i

hres

Zuc

ker/P

hosp

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ückg

rats

zah

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he n

egat

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Ladu

ngen

, wob

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ie

Ladu

ngsd

icht

e alle

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A-M

olek

üle i

st g

leic

h. D

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folg

e ist

die

elek

troph

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isch

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t, al

so d

ie W

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rung

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chw

indi

gkei

t in

eine

m e

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risch

en F

eld,

für

alle

DN

A-M

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üle

in

frei

er L

ösun

g gl

eich

gro

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inde

t die

Ele

ktro

phor

ese

dage

gen

in e

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fes

ten

Mat

rix s

tatt,

so

wer

den

die

DN

A-M

olek

üle

je n

ach

ihre

r G

röße

unt

ersc

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lich

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k zu

rück

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lten:

kle

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DN

A-F

ragm

ente

wan

dern

schn

elle

r dur

ch d

ie M

atrix

als

gro

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NA

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gmen

te. E

ntsc

heid

end

ist,

dass

zwei

gle

ich

groß

e DN

A-F

ragm

ente

, una

bhän

gig

von

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r Nuk

leot

idse

quen

z, au

fgru

nd

ihre

r gl

eich

en L

adun

gsdi

chte

gle

ich

schn

ell

wan

dern

(K

raft

= M

asse

x B

esch

leun

igun

g).

Nat

ürlic

h hä

ngt

die

Wan

deru

ngsg

esch

win

digk

eit

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r D

NA

-Fra

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te

nebe

n de

r K

onze

ntra

tion

der M

atrix

und

dam

it de

r Por

engr

öße

zusä

tzlic

h vo

n de

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eleg

ten

Span

nung

, de

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des L

aufp

uffe

rs (i

.d.R

. Tris

/Ace

tat,

TAE)

und

geg

eben

enfa

lls d

er A

nwes

enhe

it w

eite

rer

Subs

tanz

en (z

.B. E

thid

ium

brom

id, S

alz)

ab.

Je n

ach

Grö

ße d

er z

u tre

nnen

den

DN

A-F

ragm

ente

wäh

lt m

an a

ls M

atrix

Aga

rose

(rel

ativ

gro

ße

Pore

n, d

aher

für

rel

ativ

gro

ße D

NA

-Fra

gmen

te g

eeig

net)

oder

Pol

yacr

ylam

id (

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tiv k

lein

e Po

ren,

dah

er b

eson

ders

für r

elat

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lein

e D

NA

-Fra

gmen

te g

eeig

net).

Pol

yacr

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idge

le e

igne

n si

ch n

ur f

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ie T

renn

ung

von

DN

A-F

ragm

ente

n m

it G

röße

n zw

isch

en e

twa

5 un

d 1.

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Bas

enpa

aren

. Die

Tre

nnsc

härf

e so

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ent

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,

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he 1

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biol

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II

AG

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te, d

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Län

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ich

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unt

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trenn

t wer

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garo

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tione

n vo

n 0,

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s 2,

0% (

Gew

icht

spro

zent

, wei

ght/v

olum

e, w

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erge

ben

Gel

e, d

ie fü

r die

Auf

trenn

ung

von

linea

ren

DN

A-F

ragm

ente

n m

it Lä

ngen

von

60

kb

bis h

inun

ter z

u et

wa

100

bp g

eeig

net s

ind.

Wäh

rend

line

are

DN

A-F

ragm

ente

im A

garo

se-G

el n

ur a

ufgr

und

ihre

r Grö

ße g

etre

nnt w

erde

n,

ist d

ie S

ituat

ion

für z

irkul

äre

Plas

mid

e ko

mpl

izie

rter.

Zirk

ulär

e Pl

asm

ide

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sen

in d

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egel

ve

rsch

iede

ne K

onfo

rmat

ione

n au

f: si

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gen

sow

ohl a

ls o

ffen

es zi

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äres

Mol

ekül

vor

, wei

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aber

auc

h ve

rsch

iede

ne G

rade

der

Übe

rdre

hung

(Su

perh

elix

, sup

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oil)

auf.

Die

kom

pakt

e su

perh

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ale

Form

ei

nes

zirk

ulär

en

Plas

mid

s w

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rt sc

hnel

ler

als

das

glei

ch

groß

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earis

ierte

Pla

smid

. D

ie s

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ige

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ne F

orm

des

zirk

ulär

en P

lasm

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e Su

perh

elix

) da

gege

n w

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rt hi

ngeg

en d

eutli

che

lang

sam

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ls d

ie b

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n an

dere

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rmen

. Is

t ei

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estri

ktio

nsve

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unv

olls

tänd

ig, s

o si

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ie v

ersc

hied

enen

Kon

form

atio

nen

des

Plas

mid

s im

A

garo

sege

l na

chw

eis-

und

unt

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heid

bar.

Die

se T

atsa

che

kann

man

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um

mitt

els

Gel

elek

troph

ores

e de

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folg

ei

ner

Line

aris

ieru

ng

zu

über

prüf

en.

Supe

rhel

ikal

e K

onfo

rmat

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iden

sin

d fü

r Res

tiktio

nsen

zym

e au

f Gru

nd d

er S

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lisie

rung

nur

sc

hwer

zug

ängl

ich

und

wer

den

desh

alb

schl

echt

er g

esch

nitte

n un

d si

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ft im

Gel

noc

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chtb

ar.

Zur B

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ung

eine

s Aga

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gels

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den

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A-P

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n in

ein

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r, de

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ein

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uffe

r, G

lyce

rin u

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rom

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olbl

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este

ht a

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nom

men

. Dur

ch d

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lyce

rin w

ird d

ie

Dic

hte

des P

uffe

r-D

NA

-Gem

isch

s sow

eit e

rhöh

t, da

ss d

ie L

ösun

g si

cher

er in

die

Pro

bent

asch

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s G

els

gela

den

wer

den

kann

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mph

enol

blau

die

nt a

ls f

arbi

gen

Mar

ker,

der

etw

a gl

eich

sc

hnel

l wie

ein

300b

p gr

oßes

DN

A-F

ragm

ent w

ande

rt un

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der

For

tsch

ritt d

er E

lekt

roph

ores

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suel

l nac

hver

folg

t wer

den

kann

und

der

Gel

lauf

rech

tzei

tig b

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et w

erde

n ka

nn. P

aral

lel m

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n au

fzut

renn

ende

n Pr

oben

wird

im

mer

ein

en L

änge

nsta

ndar

d (M

arke

r) a

uf d

as G

el

aufg

etra

gen,

der

Fra

gmen

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it ge

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ierte

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röße

n en

thäl

t. R

elat

iv z

u di

esem

Mar

ker

läss

t si

ch d

ann

die

Grö

ße d

er g

etre

nnte

n D

NA

-Fra

gmen

te l

eich

t be

stim

men

. Geb

räuc

hlic

he

Mar

ker

sind

die

100

bp-L

eite

r, di

e 1k

b-Le

iter,

die

Ban

den

in 1

00bp

- bz

w. 1

000b

p-Sc

hritt

en

enth

alte

n.

Nac

h A

bsch

luss

der

Gel

elek

troph

ores

e m

üsse

n di

e D

NA

-Fra

gmen

te z

ur L

änge

naus

wer

tung

si

chtb

ar g

emac

ht w

erde

n. D

ies

gelin

gt m

it Et

hidi

umbr

omid

(3,

8-D

iam

ino-

5-et

hyl-6

-phe

nyl-

phen

anth

ridin

ium

brom

id),

das

aufg

rund

se

iner

pl

anar

en

Stru

ktur

in

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e D

NA

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ix

inte

rkal

iere

n, si

ch a

lso

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chen

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Bas

en d

er D

NA

schi

eben

kan

n. D

er in

terk

alie

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arbs

toff

flu

ores

zier

t in

Ver

bind

ung

mit

der D

NA

bei

ein

er W

elle

nlän

ge v

on 5

90nm

, wen

n er

mit

UV

-Li

cht (

254

– 36

6nm

) ang

ereg

t wird

. Bei

m U

mga

ng m

it Et

hidi

umbr

omid

ist d

esha

lb V

orsi

cht

gebo

ten:

zum

ein

en i

st E

thid

ium

brom

id a

ufgr

und

sein

er i

nter

kalie

rend

en E

igen

scha

ften

ein

pote

ntie

lles

Mut

agen

, zu

m a

nder

en k

ann

das

zur

Det

ektio

n ve

rwen

dete

UV

-Lic

ht b

ei

unge

schü

tzte

n A

ugen

sc

hnel

l ei

ne

äuße

rst

schm

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afte

B

inde

haut

entz

ündu

ng

(Sch

neeb

lindh

eit)

veru

rsac

hen.

Ethi

dium

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ird m

eist

ber

eits

in d

as A

garo

se-G

el e

inpo

lym

eris

iert,

kan

n da

s Gel

nac

h de

r El

ektro

phor

ese

in e

inem

Eth

idiu

mbr

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bad

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rbt w

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n. M

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umbr

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lass

en si

ch

auf d

em U

V-L

euch

ttisc

h (T

rans

illum

inat

or) e

twa 1

0 –

20ng

dsD

NA

in ei

ner B

ande

nac

hwei

sen.

- �0�

-

Woc

he 1

0 M

olek

ular

biol

ogie

II

AG

Kud

la/W

einl

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nsfo

rmat

ion

von

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teri

en

Als

Tra

nsfo

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ion

beze

ichn

et d

ie V

erän

deru

ng d

es G

enot

yps e

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Zel

le d

urch

die

Auf

nahm

e fr

emde

r, na

ckte

r DN

A a

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mge

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. Tra

nsdu

ktio

n be

zeic

hnet

die

Übe

rtrag

ung

der D

NA

(o

der R

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) ein

es P

hage

n od

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irus

in e

ine

prok

aryo

ntis

che

oder

euk

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(als

o ei

ne F

orm

der

Inf

ektio

n); K

onju

gatio

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t die

dire

kte

Übe

rtrag

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der

Kop

ie e

ines

Tei

ls d

er

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A e

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terie

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le in

ein

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dere

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le B

akte

rien

besi

tzen

ein

en s

olch

en s

pezi

fisch

en

Auf

nahm

emec

hani

smus

für

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A a

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mge

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, w

obei

sie

ihr

Res

trikt

ions

enzy

m-

basi

erte

s „Im

mun

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em“

vor a

rtfre

mde

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A sc

hütz

t.

Das

im L

abor

vie

lfach

ein

gese

tzte

Bak

teriu

m E

. col

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fügt

jedo

ch n

atür

liche

rwei

se n

icht

übe

r ei

nen

solc

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Mec

hani

smus

, so

das

s di

ese

Bak

terie

n zu

näch

st f

ür d

ie T

rans

form

atio

n m

it fr

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A v

orbe

reite

nt, d

.h. k

ompe

tent

gem

acht

wer

den

müs

sen.

Die

s ge

schi

eht i

n ei

nem

em

piris

ch o

ptim

ierte

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ozes

s, de

r di

e In

kuba

tion

der

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terie

n in

ein

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a2+-L

ösun

g,

wie

derh

olte

Ink

ubat

ion

auf

Eis

und

Zent

rifug

atio

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hritt

e be

inha

ltet.

Kom

pete

nte

E.-c

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n kö

nnen

dan

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i -80

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efge

fror

en w

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n un

d be

halte

n ih

re K

ompe

tenz

auc

h na

ch

dem

Auf

taue

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r ei

ne g

ewis

se Z

eit b

ei. D

ie e

igen

tlich

e Tr

ansf

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atio

n de

r B

akte

rien

kann

da

nn n

ach

vers

chie

dene

n V

erfa

hren

erf

olge

n, b

eson

ders

ein

fach

ist

die

Cal

cium

chlo

rid-

Met

hode

, bes

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rs e

ffiz

ient

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Ele

ktro

pora

tion.

Bei

der

Cal

cium

chlo

rid-M

etho

de w

ird d

ie

DN

A m

it C

aCl 2

auf

der

Obe

rflä

che

der

kom

pete

nten

Bak

terie

nzel

len

präz

ipiti

ert.

Von

hie

r ge

lang

t di

e D

NA

en

twed

er

dire

kt

durc

h di

e M

embr

an,

dere

n In

tegr

ität

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alci

umch

lorid

kris

talle

ges

tört

wird

, od

er d

urch

End

ocyt

ose

ins

Inne

re d

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elle

. B

ei d

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Elek

tropo

ratio

n w

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e ko

mpe

tent

en B

akte

rienz

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n in

ein

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NA

-Lös

ung

in e

in

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trisc

hes

Feld

geb

rach

t un

d ku

rzen

Pul

sen

hohe

r Fe

ldst

ärke

aus

gese

tzt.

Dab

ei w

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rzze

itig

Pore

n in

der

Zel

lmem

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eugt

zu

wer

den,

dur

ch d

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akro

mol

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e un

d se

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ga

nze

Plas

mid

e in

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le g

elan

gen

könn

en. N

ach

der

Tran

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mat

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als

o de

r A

ufna

hme

der

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A,

benö

tigen

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jet

zt t

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gene

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llen

zunä

chst

ein

e Er

holu

ngsp

hase

in

flüss

igen

Kul

turm

ediu

m, b

evor

sie

in A

ntib

iotik

a-ha

ltige

Sel

ektio

nsm

edie

n um

gese

tzt w

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n kö

nnen

. In

dies

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rhol

ungs

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kom

mt e

s zu

r Exp

ress

ion

des

auf d

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lasm

id b

efin

dlic

hen

Ant

ibio

tika-

Res

iste

nzge

ns, w

elch

es d

ie tr

ansg

enen

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len

(und

nur

die

se) i

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e La

ge v

erse

tzt,

auf d

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ntib

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a-ha

ltige

n Se

lekt

ions

med

ium

zu

wac

hsen

.

Für d

ie S

elek

tion

von

E.co

li w

ird o

ft da

s A

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a A

mpi

cilli

n ei

nges

etzt

. Am

pici

llin

gehö

rt zu

r K

lass

e de

r -L

acta

m-A

ntib

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a un

d he

mm

t in

den

Bak

terie

n da

s En

zym

Ala

nin-

Tran

spep

tidas

e da

ss b

ei d

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ellte

ilung

und

der

dam

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rbun

dene

n Ze

llwan

dneu

synt

hese

be

teili

gt i

st.

Wei

tere

wic

htig

e A

ntib

iotik

a in

der

Mol

ekul

arbi

olog

ie s

ind

Kan

amyc

in u

nd

Tetra

cycl

in w

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e di

e ba

kter

ielle

Pro

tein

bios

ynth

ese

durc

h B

lock

ieru

ng d

er ri

boso

mal

en 3

0S

Unt

erei

nhei

t hem

men

.

Bla

u/W

eiß-

Sele

ktio

n vo

n T

rans

form

ande

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iotik

a-ha

ltige

Med

ien

erla

uben

zw

ar d

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tion

der w

enig

en tr

ansf

orm

ierte

n, P

lasm

id-

halti

gen

Zelle

n au

s de

r V

ielz

ahl

der

untra

nsfo

rmie

rten

Wild

typ-

Bak

terie

n. S

ie e

rlaub

en

alle

rdin

gs n

icht

die

Unt

ersc

heid

ung

von

trans

form

ierte

Bak

terie

n, d

ie d

as P

lasm

id m

it de

m z

u kl

onie

rend

en G

en (I

nser

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ten,

von

sol

chen

tran

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mie

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Bak

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n, d

ie le

digl

ich

das

Plas

mid

ohn

e In

sert

trage

n (b

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igat

ion

kann

sich

, wen

n m

it nu

r ein

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estri

ktio

nsen

zym

ge

arbe

itet w

urde

, das

line

aris

ierte

Pla

smid

auc

h w

iede

r zum

Rin

g sc

hlie

ßen,

ohn

e da

ss d

as z

u kl

onie

rend

e G

en e

inge

baut

wur

de).

Die

se U

nter

sche

idun

g w

ird d

urch

die

Ver

wen

dung

des

Pl

asm

ids p

Blu

escr

ipt (

pKS)

ode

r ver

wan

dter

Vek

tore

n er

mög

licht

.

- �0�

-

Woc

he 1

0 M

olek

ular

biol

ogie

II

AG

Kud

la/W

einl

Solc

he V

ekto

ren,

die

ein

e so

gen

annt

e B

lau/

Wei

ß-Se

lekt

ion

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uben

, ent

halte

n ne

ben

dem

A

ntib

iotik

a-R

esis

tenz

gen

noch

den

5‘-

Teil

des l

acZ-

Mar

kerg

ens

(-F

ragm

ent),

das

für d

as N

-te

rmin

ale

Frag

men

t der

-G

alak

tosi

dase

cod

iert.

Der

C-te

rmin

ale

Ber

eich

des

lacZ

-Gen

s (

-Fr

agm

ent)

wird

hin

gege

n im

Gen

om d

er v

erw

ende

ten

E.co

li Ze

llen

kodi

ert.

Bei

de l

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Gen

frag

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te st

ehen

unt

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er K

ontro

lle e

ines

indu

zier

bare

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omot

ors,

der n

ur in

Geg

enw

art

der

Indu

ktor

mol

ekül

en

Lact

ose

oder

IP

TG

(Iso

prop

ylth

ioga

lakt

osid

, ei

nem

La

ctos

e-A

nalo

gon)

, akt

ivie

rt w

ird. I

m G

egen

satz

zu

Lact

ose

kann

IPTG

jedo

ch v

on d

en B

akte

rien

nich

t ab

geba

ut w

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n un

d ak

tivie

rt di

e G

enex

pres

sion

der

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-Gen

-Fra

gmen

te d

auer

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Hat

das

B

akte

rium

nu

n be

i de

r Tr

ansf

orm

atio

n ei

n Pl

asm

id

das

für

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-Fra

gmen

t ko

dier

t au

fgen

omm

en so

wer

den

auf I

PTG

-hal

tigem

Med

ium

bei

de la

cZ-G

en-F

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ente

aktiv

iert,

und

di

e be

iden

Pr

otei

nunt

erei

nhei

ten

un

d

der

-Gal

akto

sida

se

wer

den

gebi

ldet

un

d re

kons

titui

eren

zu

eine

m f

unkt

ione

llen

Prot

ein.

Ent

hält

das

Med

ium

dar

über

hin

aus

das

farb

lose

, abe

r ch

rom

ogen

e X

-Gal

(Su

bstra

t 5-B

rom

o-4-

chlo

ro-3

-indo

lyl-

-D-G

alak

tosi

d), s

o w

ird d

ie c

hrom

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re G

rupp

e vo

n de

r -G

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tosi

dase

vom

Res

t abg

espa

lten

und

bild

et u

nter

Sa

uers

toff

einw

irkun

g ei

nen

chro

mop

hore

s D

imer

: K

olon

ien

eine

s en

tspr

eche

nden

E.-c

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Klo

ns fä

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sich

bla

u.

In p

Blu

escr

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lasm

iden

ist d

ie „

mul

tiple

clo

ning

site

“ ku

rz h

inte

r dem

Sta

rtcod

on A

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es

lacZ

-Gen

-Fra

gmen

ts ei

ngef

ügt w

orde

n so

das

s den

noch

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funk

tions

fähi

ges

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sida

se-

Frag

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t geb

ildet

wer

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kann

(de

r Po

lylin

ker

ist s

o ko

nstru

iert,

das

s er

das

Les

eras

ter

des

Gen

s nic

ht v

ersc

hieb

t; es

wer

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nur e

inig

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sätz

liche

, in

der u

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üngl

iche

n -G

alak

tosi

dase

ni

cht v

orha

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e A

min

osäu

ren

eing

ebau

t, di

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ie T

ertiä

tstru

ktur

des

Pro

tein

s un

d da

mit

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Akt

ivitä

t des

Enz

yms n

icht

wes

entli

ch b

eein

fluss

en).

Träg

t der

Vek

tor j

edoc

h ei

n In

sert,

ist

also

ein

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A-F

ragm

ent i

n de

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ylin

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ligie

rt w

orde

n, s

o un

terb

richt

die

ses

Inse

rt in

den

m

eist

en F

älle

n da

s la

cZ-G

en u

nd e

s w

ird k

eine

akt

ive

-Gal

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sida

se m

ehr

gebi

ldet

(z.

B.

durc

h V

ersc

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en d

es L

eser

aste

rs, d

urch

Ein

füge

n ei

nes S

topp

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ns o

der d

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Ver

ände

rung

de

r Ter

tiärs

trukt

ur d

es g

ebild

eten

Fus

ions

prot

eins

). E.

-col

i-Klo

ne m

it In

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gem

Pla

smid

er

sche

inen

dah

er au

f der

IPTG

/X-G

al-P

latte

wei

ß. D

as la

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en is

t eig

entli

ch T

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es L

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se-

Ope

rons

von

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oli.

Für d

as B

lau/

Wei

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reen

ing

dürf

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aher

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täm

me v

erw

ende

t w

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n, d

ie k

ein

endo

gene

s Lak

tose

-Ope

ron

meh

r tra

gen.

- �0�

-

Woc

he 1

0 M

olek

ular

biol

ogie

II

AG

Kud

la/W

einl

Prax

is V

ersu

chsü

bers

icht

Als

bio

logi

sche

s A

usga

ngsm

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n dr

ei I

hnen

unb

ekan

nte

bakt

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lle „

Übe

r-N

acht

“-

Kul

ture

n (Ü

N) b

erei

tges

tellt

. Ihr

e Auf

gabe

ist d

ie Is

olat

ion

der P

lasm

ide a

us d

en zu

r Ver

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ng

gest

ellte

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ultu

ren

und

anha

nd d

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rgeb

niss

e des

Res

trikt

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verd

aus u

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rans

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atio

n

von

E.co

li Ze

llen

die

enth

alte

nen

Kon

stru

kte

zu id

entif

izie

ren.

Fol

gend

e K

onst

rukt

e gi

lt es

zu

best

imm

en:

1.pB

lues

crip

t (30

00bp

) + c

DN

A G

en 1

(600

bp)

2.pB

lues

crip

t (30

00bp

) + c

DN

A G

en 2

(120

0bp)

3.pB

lues

crip

t (30

00bp

)

Jede

Gru

ppe

wäh

lt zw

ei d

er d

rei

unbe

kann

ten

Prob

en z

u A

naly

se a

us.

Zur

volls

tänd

igen

Aus

wer

tung

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den

dann

auc

h di

e Er

gebn

isse

der

Nac

hbar

grup

pe h

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gezo

gen.

Dur

chfü

hrun

g:

Die

Bak

terie

n w

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n ge

ernt

et u

nd d

ie P

lasm

id-D

NA

nac

h de

r M

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