Untersuchung der tiefen Biosphäre - pmbio.icbm.de · 3 VL Mikrobiologie der Erdkruste SS 2004 Bert...

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VL Mikrobiologie der Erdkruste

SS 2004 Bert Engelen

Untersuchung der tiefen Biosphäre

Mikrobiologische und molekularbiologische Methoden



Wie werden Bakterien eigentlich gezählt?

Parkes, R.J., B.A. Cragg and P. Wellsbury, 2000

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Autofluoreszenz von Chlorophyll a

Anfärbung mit Fluoreszenz-Farbstoffen: DAPI, Acridinorange, SYBR Green

Färbung von Wattsediment mit SYBR Green

Ph

oto

: B

. K

öp

ke

Pho

tos:

H.

Cyp

ionk

a

Eisensulfidflocke im Phasenkontrast

fluoreszierende Zellen

Kombination ausPhasenkontrast und

Fluoreszenz

Mikroskopie:

FlowcytometerDNA-Menge (2-4*106 Basenpaare pro Bakteriengenom)ATP * 250 BioC (in g)

Andere Methoden:



MPN-Verfahren (Most Probable Number)Verdünnungsreihe in 3-5 Parallelen, Berechnung nach Formel (Tabelle)

auf Platten, Flüssigkultur

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6Verdünnung

9 mlMedium

1 ml plattieren

159 17 2 0 zu viele Kolonien

159 x 103 = 1,59 x 105

Kolonien x Verdünnung = Zellzahl

verändert nach Brock, 1997

A

H

G

F

E

D

C

1

B

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Kontrolle

Parallele 1

Parallele 2

Parallele 3

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

Lebendzellzahl (< 1%):

3



Möglichkeiten zur Analyse von Bakteriengemeinschaften

Kultivierung Molekularbiologie



Nachteil:

Weiterführende Untersuchungen oft nicht möglich

Viele Bakterien lassen sich nicht so einfach kultivieren

Enorm zeitintensiv

Vorteil:

Untersuchungen z.B. zur Physiologie, Gen-Regulation

oder Produktion von Metaboliten möglich

Umgehung von Kultivierungsschritten

Erfassung von bisher nicht kultivierten Organismen

Molekularbiologische Protokolle:

Kultivierungsabhängige Techniken:

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Proteobacteria

Syner

gist

es

Aci

doba

cter

ium

Nit

rosp

ira

Archaea 0,10

Fusobacteria

Spirochetes

Thermus/Deinococcus

CytophagalesGreen sulfur

FibrobacterLow G+C gram positive

Cyanobacteria

Flexistip

es

Planctomycetes

Verrucom

icrobia

Chlam

ydia

ActinobacteriaGreen non-sulfur

TM7

OP

8Te

rmite

gro

up I

OP11

WS6

TM6

Marine group A

OS-K

OP3

OP10WS1

OP5

OP9

Dictyglomus

Coprothermobacter

Thermotogales

Thermodesu

lfobacte

rium

Aquificales

Hugenholtz et al. 1997

Ca. 1/3 der Bakterienphyla

bestehen aus bisher nicht

kultivierten Bakterien!!!



Kultivierung Anreicherung

Ilsolierung

Identifizierung

5



Warum möchte man überhaupt Bakterien aus der Umwelt kultivieren?

• Biotechnologisch bzw. pharmazeutisch nutzbares Potenzial

(Produktion von Antibiotika oder Abbau von Kohlenwasserstoffen)

• In aquatischen Systemen werden 90% aller Stoffumsetzungen

durch Mikroorganismen bewirkt

• Bakterien dominieren die Biosphäre und und katalysieren

essenzielle Teile von biogeochemischen Kreisläufen

⇒ Beschreibung physiologischer Eigenschaften enorm wichtig für

das Verständnis von globalen ökologischen Prozessen



Kultivierungstechniken

•• Koch‘sches Plattengussverfahren

• Ausstrichverfahren (mit Drigalski-Spatel)

• Membranfiltration

• Dreizehn-Strich-Methode

Festmedien

(Zugabe von Agar)

• Anreicherung (als „Batch“-Kultur)

•• Kontinuierliche Kultur

• MPN (Most Probable Number)-Methode

oder „dilution to extinction“

Flüssigmedien

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Cypionka, 2003

Dreizehn-Strich-Methode



• Zusammensetzung des Mediums

• Temperatur

• pH-Wert

• O2 -Konzentration

• Salzkonzentration

• Licht

Was muss man bei der Kultivierungvon Bakterien beachten?

7



„Dilution to extinction“ ⇒ Kultivierung abundanter aber langsamer wachsender

Bakterien

K-Strategen ⇒ langsam wachsende Arten, angepasst an geringe

Substratkonzentrationen

r-Strategen ⇒ schnellwüchsige Arten, hohe Wachstumsraten nur bei hohen

Substratkonzentrationen

Mikroorganismen, die an niedrige Substratkonzentrationen angepasst sind bezeichnet

man als oligotroph oder oligocarbophil.

Mikroorganismen, die hohe Substratkonzentration benötigen, bezeichnet man als

copiotroph.

Wen kann ich anreichern?



Habitat Kultivierungseffizienz

Meerwasser 0.001 - 0.1 %

Mesotropher See 0.1 - 1 %

Belebtschlamm 1 - 15 %

Boden 0.3 %

Kultivierungseffizienz von Bakterien aus der Umwelt

Amann et al. 1995

Kultivierungseffizienz (%):

MPN-Zahl x 100

Gesamtzellzahlder Ursprungsprobe

(%) =

8



Potenzielle Gründe für den geringen Kultivierungserfolg

Manche Bakterien gehen in einen sogenannten „viable but non

culturable“ –Zustand über, wenn sie unter Stress geraten (z.B.

geringe Temperatur, geringe Nährstoffkonzentrationen)

VBNC

ZellschädenZellmembranen, Proteine oder DNA können durch chemische oder

physikalische Einflüsse beschädigt werden

Alter Das Altern ist ein Prozess, der beginnt, wenn das Wachstum endet.

Es kommt zu einem Verlust des Replikationspotenzials



Was sind VBNC-Zellen?

„viable but non culturable“

Lebend + metabolisch aktiv aber nicht „kultivierbar“ bzw. teilungsfähig

Übergang in den VBNC-Zustand führt zu morphologischen Änderungen sowie zu

Veränderungen wichtiger Biopolymere (Proteine, Membran-lipide, Nukleinsäuren)

Welche Bedeutung haben VBNC-Zellen?

VBNC-Zellen können „wiederbelebt“ werden

Der Cholera-Erreger Vibrio cholerae geht durch osmotischen und Nährstoff-Stress in den

VBNC-Zustand über.... z.B. wenn die Zellen ins Meerwasser geraten sind

⇒ Überdauerung im Meerwasser, Kontaminationsquelle da Zellen

irgendwann wiederbelebt werden können und dann infektiös sind!

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Kultivierung unter verschiedenen Inkubationsbedingungen

25°C

15°C 4°C

21 % O2 20°C

21%

O2

3% O

2

0% O

2

Bruns et al. 2003

Mögilichkeit: Kultivierung in

Gradienten, da nur ein Bruchteil der

zu kultivierenden Bakterien

geeignete Bedingungen vorfindet!

Temperatur

Sauerstoff

Sub

stra

t

Kultivierungsmaschine?



Molekularbiologie

10



V2

V1

V3

V5

V6V7

V8

V9

5’

3’

Yve

s V

ande

Pee

r(1

996)

, mod

ifiz

iert

hoch variabel

absolut konserviert

E. coli, aber nicht in > 75% aller Bakterien

Die prokaryontische 16S rRNA

In einzelnen Bereichen der rRNA

geht die „molekulare Uhr“

unterschiedlich schnell.

Mutationen in konservierten

Regionen sind entwicklungs-

geschichtlich früher entstanden, als

Änderungen in variablen Regionen.



Kary B. Mullis, 1983

Prinzip der Polymerase Chain Reaction

Denaturierung- Schmelzen der DNA

Annealing- Primeranlagerung

Elongation- Kettenverlängerung

DNA-Doppelstrang 5´

5´

3´

3´

5´

5´

3´

3´

5´

5´

3´

3´

5´

5´

3´

3´

5´

5´

3´

3´

5´ 3´

5´3´

94 °C

50-65 °C

72 °C

n ×

- eine „ molekularbiologische Pinzette“

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Vereinzelung von Sequenzen aus der Umweltdurch Klonierung

Ligation von PCR-Produkten an überhängende Ts

Klonierung von PCR-Produkten in eine „multiple cloning site“

Selektion von Plasmid tragenden Zellen durch Antibiotika-Resistenz

Blue/white-Screening von Zellen mit Insert tragenden Plasmiden

Reamplifikation der Inserts durch flankierende Primer



Analyse einer Klonbank

Amplifikation der 16S rDNA

TA-cloning

blue-white screening

A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12

B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12

C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12

D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12

E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12

G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12

H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12

Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft

Sequenz Analyseeinzelner Klone

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Doppelstrang

Einzelstränge

Teilweise geschmolzen

PCR-Produkt

Den

atur

iere

nder

Gra

dien

t

Ele

ktro

ph

ore

se

+

-

DGGE (engl.: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)Trennung in denaturierenden Gelen

anhand des Schmelzverhaltens der PCR-Produkte, chemischer Gradient



Den

atur

iere

nder

Gra

dien

t

Schematischer Verlauf einer DGGE

BakterienReinkulturen

BakterienGemeinschaften

Ele

ktro

phor

ese

+

-

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Clusteranalyse

Bildanalyse

Digitalisierung

Umwelt-Probe

Extraktion

PCR

16S rDNA der Bakteriengemeinschaft

NukleinsäurenDNA

DGGE

Fingerprints der Bakterien-

gemeinschaft

Sequenzierung

16S rDNA/rRNASequenzen

PhylogenetischeZuordnung

„Fingerprinting“ von Bakteriengemeinschaften



Beispiele zur Untersuchung von Bakteriengemeinschaften der tiefen Biosphäre

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The deep biosphere and the subseafloor ocean New evidence suggests that vast microbial populations may live within a broad range of temperatures and pressures, where sediment and rock appear to provide life-sustaining resources. Microbes that characterize these extreme environments are now broadly considered a potential source of new bio-materials and are the basis of ideas for new biotechnical applications, such as water treatment and microbially enhanced oil recovery...

IODP will probe this environment globally, providing the first comprehensive characterization of this ocean below the seafloor.

The international ocean drilling program (IODP) will focus on three broad scientific themes:

Environmental change, processes and effects

Solid earth cycles and geodynamics



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Meteor Ausfahrt 51/3 (11.11.2001 – 10.12.2001)



Beprobung von tieferen Sedimentschichten mit dem Schwerelot

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Top Bottom

Schwerelot-Kern mit Sapropelen S1, S3, S4 und S5 (85 cm)



0 1 2 3 4 5 6 7

Depth

(cm

)

0

100200

300

400

Total cell count (107 cm3)0 1 2

S1

S3

S4

S5

Station 567-1

/ /

/ / /

/

ATP-Konzentrationen (ll) und Zellzahlen (¡¡) an der Sedimentoberfläche, in Sapropelen und Corg-armen Zwischenschichten

Erste Ergebnisse zur Abundanz und Aktivität

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Kultivierungseffizienz



International Continental Scientific Drilling Program

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Mallik 2002 Gas Hydrate Research Well Program

The project focused on geophysical and geological studies, and extended production testing. On this website you can get information about the drillhole advance and the works of scientists from various fields. So have a look at the scientific data and the drilling region, north of Canada, beyond the Artic Circle.

This is the homepage of the Mallik 2002 Drilling Program, an international research project on Gas Hydrate Production in the Northwest Territories of Canada.

http://www.icdp-online.de/sites/mallik/index/index.html



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Detaillierter Nachweis von thermophilen sulfatreduzierenden Prokaryonten (SRP) in einer Erdöllagerstätte mit angeschlossenem Betrieb

Bearbeitung der Projekte:

Katja Ziegelmüller

Zeynep Yeðin

Dr. Michael Böttcher

Dr. Bert Engelen

Maren Fröhlich

Dipl.-Biol. Andrea Schlingloff

Dr. Andrea Sass

Dr. Bert Engelen

Oliver Roß

Gerke Kunz

Dr. Bert Engelen



ÖL

Gas

Slopgrube

Fördersonden

Lagerstätte

Molch

Feldleitungen

Einpressleitung+ Coupon

Tank

Führung des Lagerstättenwassers bei der Erdölförderung

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Wie unterscheidet sich die mikrobielle Zusammensetzung in

Fördersonden und Leitungssystemen?

- Gesamtzellzahlbestimmung der Standortproben

- molekularbiologischer Nachweis von (hyper)thermophilen

sulfatreduzierenden Bakterien und Archaeen

Ist Wachstum bei in situ-Temperaturen möglich?

- Anreicherung bei 55°C und bei 90°C

Fragestellung des Auftraggebers:

Wird H2S in Lagerstätte oder im Betrieb produziert?

Behindern die H2S-Gehalte die geplante Einrichtung eines Erdgasspeichers?

Untersuchungen folgender Fragenkomplexe:



DGGE-Gel A: Originalproben Juli 2003

Std

E 2

2

E 2

9

E 2

7

Kö

2

FL

E

FL

Kö

T2

Cou

p

EL

E 2

5

EL

H2

H2

Slo

p

Std

-3

-8a

-15a

-24

-1

-12a

-9

-21

-7

-10a

-18e

-23a

-2a

-13

-16a

-17a

-19a

-22a

-4

-18b

-20a

-25a-26a

-5

-6

-11

-14a

A26a Thermacetogenium phaeum 99%

A1 Flavobacterium sp. 99%A2a Chryseobacterium meningosepticum 99%A3 Flexibacter tractuosus 88% A4 Cytophaga fermentans 93%

A5 Bacillus sp. MK 03 97%

A10a R. solanacearum / Ps. syzygii 96%

A6 Bacillus methanolicus 89%

A7 Thiomicrospira sp. 97%A8a Delftia acidovorans 98%A9 Uncultured vent bacterium 88%

A11 Bacillus sp. MK03 95%A12a Gluconacetobacter sp. (alpha proteob.) 96%A13 Pseudomonas saccharophila 95%A14a Bacillus sp. MK03 95%

A15a Caulobacter sp. 95%A16a Pelobacter venetianus 90%A17a Desulfotomaculum geothermicum 88%A18a Desulfotom. geotherm. 91% / A18e Aminomonas sp. 88%A19a Thermosipho sp. 99%A20a Dethiosulfovibrio acidaminovorans 92%A21 Polyangium vitellinum 93%A22a Dethiosulfovibrio acidaminovorans 94%A23a Uncultured Acidobacteriales 89%

A25a Thermosipho ferriphilus 85%A24 Thermotoga sp. 98%

-2c -2b-2d

-8b -8c -8d-10b

-12b -12c -12d -12e -12f -12g

-15b -15c-16b -16c-16d -16e -16f

-17b -17c -17d -17e

-18c -18d-18a-19b-20b

-22b

-25b-23c -23b

-25c

-22c

-26a

rote Schrift: Sulfat-, Thiosulfat- und Schwefelreduzierer

Sonden Leitungssysteme

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55° Anreicherungen

E 2

7

FL

E

T 2

Cou

p

EL

E 2

5

EL

H2

H2

Slo

p

Std

-6

-1

-12a

-2a

-11a

-10a-9a-9b

-7

-5a

B1 Petrotoga sp. 98%

B2a Petrotoga olearia 97%

B5a Thermosipho sp. 98%B6 Microbacteriaceae sp. 98%B7 Thermosipho geolei 97%

B9a Anaerobaculum thermoterrenum 87%B10a Thermosipho sp. 97% B11a Desulfacinum sp. 96%B12a Thermotoga sp. 98%

90° Anreicherungen

E 2

9

FL

E

T2

EL

E 2

5

H2

Slo

p

Std

-8a

-3a

-13

-4

B3a Burkholderia sp. 99%

B4 Marinilactibacillus psychrotolerans 93%

B8a Microbacteriaceae 92%

B13 Thermotoga maritima 96%

-2b -2b -2c -2d

-5b -5c -5d

-8a

-8b -8c

-10b -10c -10d -10e-10f

-11b -11c -11d -11e

-9c

-3b

DGGE-Gel B: Kultivierungsansätze 2003



Zusammenfassung der Ergebnisse

Gesamtzellzahl: etwa 106 Zellen/ml (wie 2002)

Anreicherung: 7 von 11 bei 55°C und 5 von 11 bei 90°C

Nachweis von: (hyper)thermophilen H2S-Produzenten und erdöltypischen Begleitorganismen

Allgemein: größerer Anteil von H2S-Produzenten in Leitungssystemen

Vergleich mit einer früheren Untersuchung:

dynamisches System in Lagerstätte und Betrieb

à schwankende H2S-Gehalte durch unterschiedliche mikrobielle Zusammensetzung

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• Kultivierung von Bakterien aus der Umwelt:

⇒ Erklärung bedeutender ökologischer Prozesse

⇒ unentdecktes Potenzial (z.B. Antibiotika-Produktion)

• Mögliche Gründe für die sog. „Great Plate Count Anomaly“ (< 1%)

⇒ Substratschock, VBNC, Sauerstoffradikale

⇒ Mangelnde Kommunikation

• Die Kombination von molekularbiologischen und klassischen mikrobiologischen

Methoden hilft bei der Aufdeckung ökologischer Fragestellungen.

Was haben wir gelernt?

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