Untersuchung der Wechselwirkungen von Mangan- und Calciumionen mit Alginat von

Algen und von verschiedenen mucoiden Stämmen des Bakteriums Pseudomonas

aeruginosa

Von der Fakultät der Naturwissenschaften der Universität Duisburg-Essen

(Campus Duisburg) zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation

von

Natascha Emmerichs

aus

Sevelen jetzt Issum

Duisburg 2004

Berichterstatter: Prof. Dr. Christian Mayer

Prof. Dr. Wibren S. Veeman

Tag der mündlichen Prüfung: 21. Juli 2004

Danksagung: Für die Betreuung dieser Arbeit und seine unermüdliche Diskussionsbereitschaft bedanke ich mich ganz herzlich bei Herrn Prof. C. Mayer. Bei Herrn Prof. W.S. Veeman bedanke ich mich für die Übernahme des Korreferates. Der mikrobiologische Teil der experimentellen Arbeiten wurde in den Räumlichkeiten der aquatischen Mikrobiologie durchgeführt. Mein Dank gilt deshalb Herrn Prof. H.-C. Flemming und seinen stets hilfsbereiten Mitarbeitern. Martin und Hermann danke ich für die Unterstützung bei allen auch noch so geringen Problemen, insbesondere bei allen Dingen die mit dem PC zusammenhängen. Christian danke ich für seine stets konstruktiven Verbesserungsvorschläge an meiner Arbeit. Herrn Manfred Zähres danke ich herzlich für seine Unterstützung bei der Aufnahme der NMR-Spektren. Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Jost Wingender für die häufig in Anspruch genommene Unterstützung bei den mikrobiologischen Arbeiten und die vielen anregenden Diskussionen. Für die Durchführung der Fällungsexperimente und viele fröhliche Stunden in der Geibelstrasse danke ich Sabine Dietl. Sascha Broekmann danke ich für die unermüdliche Ein- und Abschaltung der Gefriertrocknungsanlage. Liebe Christiane und liebe Ilka die Zeit mit Euch in einem Büro war häufig sehr produktiv und trotzdem immer entspannt und lustig. Frei nach dem Motto: „Hey, lasst uns mal was ganz verrücktes machen!“ Besonderer Dank geht an die DFG für die finanzielle Unterstützung. Ich möchte meinen Eltern Emil und Karin danken, die mir während des Studiums immer den Rücken frei gehalten und stets an mich geglaubt haben. Der letzte Dank gilt meinem Mann Guido: Du hast mich immer wieder motiviert und selbst in den schlimmsten Situationen dafür gesorgt, dass ich wieder lachen kann.

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

1.Einleitung 1

2. Theorie 3

2.1 Biofilme 3

2.1.1 Wirtschaftliche Bedeutung von Biofilmen 4

2.1.2 Entstehung von Biofilmen 6

2.2 Extrazelluläre polymere Substanzen (EPS) 8

2.2.1 Definition 8

2.2.2 Zusammensetzung der EPS 9

2.3 Pseudomonas aeruginosa 11

2.4 Polysaccharide 12

2.4.1 Typische Formen von Polysacchariden 15

2.5 Bakterielle Polysaccharide 17

2.6 Charakterisierung von Polysacchariden in Lösung 19

2.6.1 Mittlere Molmasse 21

2.6.2 Viskosimetrie 23

2.6.3 Ausschlusschromatographie 25

2.6.3.1 Verteilungskoeffizient kSEC 26

2.6.3.2 Elutionsvolumen Ve 27

2.6.3.3 Ausschlussgrenze 28

2.6.3.4 Permeationsgrenze 28

2.7 NMR-Untersuchungen an Polysacchariden 29

2.7.1 Nachweis anomerer Kohlenstoffe 31

2.7.2 Bestimmung der Sequenz 32

2.8 Alginate 33

2.8.1 Entdeckung von Alginaten 33

Kapitel 1

Kapitel 2

Inhaltsverzeichnis II

2.8.2 Die chemische Zusammensetzung von Alginaten 34

2.8.3 Die Blockstruktur von Alginaten 35

2.8.4 Eigenschaften von Alginaten 38

2.8.5 Molekülgrößen von Alginaten 38

2.8.6 Eigenschaften von Alginaten 39

3. Material 41

3.1 Bakterien 41

3.2 Nährmedium 42

3.3 Polysaccharide 42

3.4 Lösungen und Puffersysteme 43

3.5 Chemikalien 43

4. Methoden 45

4.1 Biochemisch-präparative Methoden 45

4.1.1 Reinigung von kommerziellen Alginaten 45

4.1.2 Milde saure Hydrolyse von Alginaten 45

4.1.3 Saure Hydrolyse von Alginaten 46

4.1.4 Fraktionierung von Alginaten 46

4.1.5 Chemische Acetylierung von Algenalginat 47

4.1.6 Chemische Deacetylierung von bakteriellem Alginat 47

4.1.7 Enzymatischer Abbau von Alginaten 48

4.1.8 Fällung von Alginaten durch Calcium- und Manganionen 48

4.2 Mikrobiologische Methoden 49

4.2.1 Stammhaltung der Bakterien 49

4.2.2 Reinigung von bakteriellen Alginaten 49

4.2.3 Isolierung der EPS 50

4.3 Chemisch-analytische Methoden 51

4.3.1 Bestimmung der Acetylgruppen 51

4.3.2 Bestimmung der Uronsäuren 52

4.4 Physikalisch-analytische Methoden 53

Kapitel 3

Kapitel 4

Inhaltsverzeichnis III

4.4.1 NMR-Analyse der teilweise abgebauten Alginate 53

4.4.2 Berechnung einer statistischen Verteilung der Triaden 55

4.4.3 Infrarotspektroskopie von Alginaten 56

4.4.4 Viskosimetrie von Alginaten 56

4.4.5 Dichtemessung 57

4.4.6 Bestimmung der Viskosität von Alginatproben in Gegenwart von Calcium- und Manganionen 58

4.4.7 Leitfähigkeitstitrationen von Alginatlösungen gegen Calcium- und Manganionen 59

4.4.8 Bestimmung der Molmasse von Alginaten mit SEC-Malls 59

5. Ergebnisse 61

5.1 Charaktersierung des Algenalginats Manucol LB 61

5.1.1 Fraktionierung des Algenalginats Manucol LB 61

5.1.2 Milde saure Hydrolyse des Algenalginats Manucol LB 67

5.1.3 Ermittlung der optimalen Hydrolysezeit 72

5.2 Acetylierung des Algenalginats Manucol LB 77

5.3 Wechselwirkungen von Algenalginat und acetyliertem Alginat mit Calcium und Mangan 81

5.3.1 Wechselwirkungen der homopolymeren Fraktionen 81

5.3.2 Wechselwirkungen des Algenalginats und des acetylierten Alginats mit Mangan 83

5.3.3 Einfluss von Calcium- und Manganionen auf das Algenalginat und das acetylierte Alginat 87

5.4 Charakterisierung von bakteriellen Alginaten aus P. aeruginosa-Stämmen 91

5.5 Wechselwirkungen der bakteriellen Alginate mit zweiwertigen Kationen 100

5.5.1 13C-NMR-spektroskopische Untersuchung der Wechselwirkung Der bakteriellen Alginate mit zweiwertigen Manganionen 100

5.5.2 Fällungsversuche von bakteriellen Alginaten mit Calcium- und Manganionen 108

6. Diskussion 111

6.1 Untersuchungen am Algenalginat Manucol LB 111

Kapitel 5

Kapitel 6

Inhaltsverzeichnis IV

6.1.1 Fraktionierung des Algenalginats Manucol LB 112

6.1.2 Milde saure Hydrolyse von Manucol LB 115

6.1.3 Ermittlung des optimalen Hydrolysezeit 117

6.1.4 Acetylierung des Algenalginats Manucol LB 123

6.1.5 Wechselwirkungen des Algenalginats und des acetylierten Manucol LB mit Mangan 125

6.1.6 13C-NMR-Spektroskopie des acetylierten Alginats in Gegenwart von Manganionen 132

6.1.7 Einfluss des Kationen Mangan und Calcium auf die Eigenschaften des Manucol LB und des acetylierten Manucol LB 133

6.2 Charakterisierung von bakteriellen Alginaten 136

6.3 Wechselwirkungen der bakteriellen Alginate mit den zweiwertigen Kationen Calcium und Mangan 139

6.3.1 13C-NMR-spektroskopische Untersuchung der Wechselwirkungen der bakteriellen Alginate mit Manganionen 139

6.3.2 Affinitätschromatographie von Alginat aus P. aeruginosa SG81 143

6.3.3 Fällungsversuche bakterieller Alginate mit Calcium-und Manganionen 145

7. Zusammenfassung 147

8. Literatur 149

Anhang A

Anhang B: Abbildungsverzeichnis

Anhang C: Tabellenverzeichnis

Anhang D: Abkürzungsverzeichnis

Kapitel 7

Kapitel 8

Anhang

1 Einleitung 1

Kapitel 1

Einleitung

Biofilme sind biotische Ablagerungen an Grenzflächen, ihre Zusammensetzungen hängen

stark von den Bedingungen ab, unter denen sie sich bilden. Ein Biofilm besteht im

Wesentlichen aus Wasser (bis zu 95% des Feuchtgewichtes), Mikroorganismen und

extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) [Christensen u. Characklis, 1990].

Die EPS besteht aus Kohlehydraten, Proteinen und Nukleinsäuren. Sie bilden die Matrix, die

den Biofilm beim weiteren Wachstum zusammenhält. Die EPS liefert den Hauptanteil des

gesamten organischen Kohlenstoffs der Biomasse und spielt eine Schlüsselrolle für die

physikalischen Eigenschaften von Biofilmen.

Um die Biofilme in ihrer komplexen Gesamtheit besser zu verstehen, betrachtet man die

Eigenschaften der isolierbaren Einzelkomponenten, wie das Alginat, ein Polysaccharid, das in

Algen vorkommt und auch von einigen Bakterien gebildet wird.

Zu den alginatbildenden Bakterien zählt z. B. das Bodenbakterium Azotobacter vinelandii

oder Pseudomonas aeruginosa [Evans u. Linker, 1973; Rehm u. Winkler, 1996]. Bei

Alginaten handelt es sich um Exopolysaccharide mit relativ hoher Molmasse (ca. 2 x 104 bis 7

x 106 g/mol; [Evans u. Linker, 1973; Grobe, 1996]). Sie bestehen aus den Uronsäureresten β-

D-Mannuronat und seinem C-5-Epimer α-L-Guluronat. Die Monomere sind innerhalb des

Alginatmoleküls in Blockstrukturen angeordnet. Es können also homopolymere Regionen

vorhanden sein, die aus Poly-β-D-Mannuronat (M-Blöcken) oder Poly-α-L-Guluronat (G-

Blöcken) bestehen. Ebenso können heteropolymere Regionen (MG-Blöcke) innerhalb des

Alginatmoleküls vorliegen.

1 Einleitung 2

In den Heteropolymerbereichen kommen die Uronsäurereste statistisch verteilt vor. Im

Gegensatz zu Algenalginaten oder Alginaten von Azotobacter vinelandii ist für das Alginat

von Pseudomonas aeruginosa das Fehlen von G-Blöcken charakteristisch [Skjåk-Bræk et al.,

1986]. Ferner ist für Bakterienalginate im Gegensatz zu Algenalginaten eine partielle O-

Acetylierung charakteristisch.

Die biofunktionellen Eigenschaften des Alginats korrelieren mit dem Verhältnis und der

Sequenz der Uronsäuren. Eine vielseitige und informative Möglichkeit zur Untersuchung der

Alginate liefert die NMR-Technik. Hierbei wird zur Senkung der Viskosität alginer Lösungen

und damit zur Erhöhung der Beweglichkeit der Polysaccharide eine sehr milde saure

Hydrolyse durchgeführt. Anschließend werden hochauflösende Spektren von den wenig

depolymerisierten Alginaten in Lösung aufgenommen. Grasdalen et al., [1979] interpretierten 1H- und 13C-NMR-Spektren von Algenalginaten. Die Verwendung der 1H-NMR-Spektros-

kopie ist besonders nützlich für quantitative Arbeiten, in Fällen wo nur geringe Mengen

Material vorhanden sind.

Mit Hilfe der hochauflösenden 13C-NMR-Technik werden Spektren von teilweise abgebauten

Alginaten aufgenommen. Aus ihnen kann man die Verteilung der acht möglichen

Triadensequenzen MMM, MMG, GMM, MGM, MGG, GGM, GMG, GGG entlang der

Copolymerkette bestimmen. Die so ermittelten experimentellen Werte liefern eine

Möglichkeit, die Genauigkeit der mit einem einfachen statistischen Model berechneten

Verteilungen zu überprüfen [Grasdalen et al., 1981].

In dieser Arbeit sollen die von Grasdalen et al. beschriebenen Ergebnisse der 13C-NMR-

Spektroskopie an einer Modellsubstanz, einem durch saure Hydrolyse schwach

depolymerisierten Algenalginat, nachvollzogen und überprüft werden. Das verwendete

Alginat soll durch verschiedene physikalisch chemische Methoden weiter charakterisiert

werden. Des weiteren sollen die Wechselwirkungen von zweiwertigen Kationen mit Alginat,

sowie ihr Einfluss auf einige physikalische Eigenschaften des Alginats untersucht werden.

Schließlich werden ebenso moderat abgebaute Bakterienalginate durch die Sequenzanalyse

charakterisiert und die Wechselwirkungen dieser Alginate mit zweiwertigen Kationen

untersucht. Hierzu sollen die Wechselwirkungen mit dem paramagnetischen Ion Mangan (2+)

durch 13C-NMR-Spekroskopie bestimmt werden und die Fällungseigenschaften der Alginate

mit Calcium und Mangan untersucht werden. Es werden Alginate von vier mucoiden

Stämmen von Pseudomonas aeruginosa untersucht. Hierbei handelt es sich um ein

Umweltisolat, ein klinisches Isolat und zwei Mutanten des klinischen Isolates.

2 Theorie

3

Kapitel 2

Theorie

2.1 Biofilme Biofilme stellen die älteste bislang bekannte Form von Lebensgemeinschaften dar [Schopf et

al., 1983]. Sie entstehen aus Mikroorganismen und bilden sich an allen Grenzflächen, an

denen Bedingungen herrschen, die mikrobielles Wachstum erlauben. Mit dem Begriff Biofilm

werden filmähnliche Strukturen aber auch Flocken oder Schlämme bezeichnet, wobei letztere

durch besonders dicke Schichten charakterisiert sind. Ihnen allen ist gemeinsam, dass es sich

um mikrobielle Aggregate handelt. Fast alle Mikroorganismen auf der Erde leben in solchen

Aggregaten, im Boden, in Gewässersedimenten, auf Gesteinsoberflächen und -erwünscht oder

unerwünscht- in technischen Systemen wie Kläranlagen, Wasserbehältern und -leitungen,

Bioreaktoren, Kraftwerken oder an Schiffsrümpfen.

Der Hauptbestandteil des Biofilms ist Wasser (bis zu 98% des Feuchtgewichtes). Der größte

Teil des organischen Materials des Biofilms besteht aus extrazellulären polymeren

Substanzen, den so genannten EPS. Die Mikroorganismen selbst machen in der Regel nur

einen kleinen Anteil des organischen Gehaltes aus. Abiotische Partikel können eingelagert

sein und beeinflussen die Zusammensetzung des Biofilms. Die Mikrobiozönose kann aus

Bakterien, Algen (nur bei Lichtzutritt), Pilzen und Protozoen bestehen. Auch Viren und

Bakteriophagen können darin vorkommen [Christensen und Characklis, 1990].

Der Zusammenschluss von Mikroorganismen zu Biofilmen schützt diese unter anderem gegen

äußere Einflüsse. So kann das Bakterium Pseudomonas aeruginosa in der Lunge von

2 Theorie

4

Patienten, die an Mukoviszidose leiden, Biofilme bilden, mit denen sich die Bakterien gegen

Antibiotika schützen [Govan, 1990]. Die an Biofilmen beteiligten Bakterien kommunizieren

mit Hilfe von Signalmolekülen, durch die sie benachbarte Zellen z. B. veranlassen, bestimmte

Gene zu aktivieren. Auch ein Gentransfer zwischen den Nachbarn ist möglich [Wingender et

al., 1999].

2.1.1 Wirtschaftliche Bedeutung von Biofilmen

Eines der technischen Anwendungsgebiete von Biofilmen ist die Abwasserreinigung. Hier

kommen verschiedene Technologien zum Einsatz, die nach den jeweils verwendeten

Reaktortypen benannt werden, z.B. Tropfkörperreaktoren, Scheibentauchkörper, Schlauch-

und Membranreaktoren.

Fixierte Mikroorganismen werden bei der Behandlung schwer abbaubarer Substanzen

[Duncan, 1988], bei der Reinigung von Abluft [Laurentzis, 2000] und beim Abbau fester

Abfälle eingesetzt. Die Vorteile der technischen Nutzung immobilisierter Mikroorganismen

liegen in der Rückhaltung der Biomasse und einer wesentlich verlängerten

stoffwechselphysiologischen Aktivität [Flemming, 1994].

Die unerwünschten Biofilme verursachen in vielen Bereichen enorme Kosten. Biofilme

können sich z.B. in Wärmetauschern großtechnischer Anlagen bilden, wodurch die

Wärmeregulation gestört wird. Dies verursacht Kosten während des Betriebes, aber auch

Kosten durch die Stillstandszeiten der Anlagen wegen notwendig gewordener

Reinigungsmaßnahmen. Eine Vielzahl weiterer Probleme bringt der Biofilmbewuchs in

klinischen Bereichen mit sich. Biofilme bilden sich häufig auf künstlichen Implantaten;

erfolgt eine Besiedlung an solchen Implantaten, so müssen diese schnellstmöglich entfernt

werden. Das bedeutet, es fallen zusätzliche Operations- und Heilkosten an, die häufig

abhängig sind vom Zeitpunkt der Entdeckung einer derartigen Infektion. Auch auf temporären

Implantaten wie Kathetern können sich Biofilme bilden, dies führt zu schmerzhaften

Entzündungen, die teilweise langwierige postoperale Behandlungen erforderlich machen. Bei

Reinluftsystemen treten ebenfalls immer wieder Probleme durch mikrobielle Kontamination

auf. Diese Systeme werden im OP-Bereich aber auch u.a. bei der Herstellung von

Computerchips eingesetzt. Gerade bei diesen Chips ist Keimfreiheit in der Herstellungsphase

obligatorisch. Bereits kurze Phasen, in denen die Umgebung nicht steril ist, führen zum

kompletten Ausschluss der Charge.

Die Problematik der Kolonialisierung von Mikroorganismen tritt in fast allen Lebens- und

Industriebereichen auf und wird dementsprechend häufig in der Literatur diskutiert. Einige

2 Theorie

5

Beispiele werden in Tab. 2.1 aufgeführt und verdeutlichen die Komplexität der

Biofilmproblematik.

Aufgrund der weit reichenden oben erläuterten Aspekte ist es unabdingbar, die gezielte

Nutzung und Vermeidung von Biofilmen zu erforschen, sowie ihre Eigenschaften zu

untersuchen.

Tab. 2.1: Beispiele für unerwünschte Biofilmbildung

System Auswirkungen des

Biofilmbewuchses Referenzen

Sanitäranlagen Rückstände Pitts et al. (1998)

Wärmetauscher reduzierter Wärmetransfer Bott (1992)

Papierherstellung verminderte Papierqualität Vaisanen et al. (1998)

Lebensmittelindustrie Kontamination Carpentier u. Cerf (1983)

Trinkwasserpipelines Gesundheitsrisiken LeChevallier et al. (1996)

medizinischer

Bereich

generell persistente Infektionen Costerton et al. (1999)

Potera (1999)

Zahnbelag Karies, Parodontitis, Gingivitis Marsh u. Bradshaw (1995)

Implantate

z.B.:

Kontaktlinsen

Blasenkatheter

persistente Infektionen

Endocarditis, Kontamination,

Drainageblockierung

vielfältige Publikationen

z.B.:

Khardori u. Yassien (1994)

Phillips et al. (1994)

Chronische

Krankheiten

z.B. cystische Fibrose

persistente Infektionen Potera (1999)

[Quelle: Center for Biofilm Engineering, NSF Engineering Research Center an der Montana

State University-Bozeman]

2 Theorie

6

2.1.2 Entstehung von Biofilmen

Die Bildung von Biofilmen soll hier an der Grenzfläche fest/flüssig erläutert werden. Bei

diesem heterogenen System sind drei Phasen an der Entstehung beteiligt. Das Medium (die

flüssige Phase) wird durch Temperatur, pH-Wert, gelöste organische und anorganische Stoffe,

Oberflächenspannung, Viskosität und hydrodynamische Parameter wie Scherkräfte,

Turbulenz und Druck beeinflusst. Die zweite Phase ist die feste Phase, das Substratum.

Hierbei beeinflussen chemische Zusammensetzung, Hydrophobizität, Oberflächenspannung,

Rauhigkeit, Porosität und die biologische Besiedelbarkeit die Entstehung eines Biofilms. Die

dritte Phase enthält die Mikroorganismen. Ihre Entwicklung hängt von Spezies, Zellzahl,

Ernährungszustand, Hydrophobizität und Ladung der Zelloberfläche, den extrazellulären

polymeren Substanzen und der Wachstumsphase ab.

Diese Vielzahl an Einflussfaktoren macht klar, dass man kaum einen einheitlichen

Adhäsionsmechanismus für alle Mikroorganismen an allen Oberflächen erwarten kann.

Allerdings können die verschiedenen Entwicklungsstadien eines Biofilms allgemein

formuliert werden. Man unterscheidet fünf Stadien der Biofilmentstehung, die in Abb.2.1 am

Beispiel P. aeruginosa erläutert werden. Im ersten Stadium kommt es zu einer Anheftung

(Adhäsion) von Mikroorganismen an das Substratum. Der Transport von Bakterienzellen zu

einer Oberfläche erfolgt hauptsächlich durch Konvektion bis zu einer laminaren Grenzschicht

mit einem abnehmenden Fließgeschwindigkeitsgradienten zur Oberfläche. Diese

Grenzschicht müssen die Bakterien durchdringen, um mit der Oberfläche Kontakt aufnehmen

zu können. Die Bakterien begegnen in der Regel nicht direkt dem Substratum, sondern dem

sogenannten „Conditioning film“, der sich innerhalb weniger Sekunden an von Wasser

benetzten Oberflächen durch irreversible Adsorption von Makromolekülen bildet [Loeb u.

Neihof, 1975; Baier, 1980].

Anfänglich ist der Kontakt zwischen Zelle und Oberfläche noch reversibel. Die

Mikroorganismen zeigen noch eine gewisse Brown´sche Molekularbewegung und sind durch

leichte Scherkräfte von der Oberfläche zu entfernen [Marshall et al., 1971]. Es kann zu

verschiedenen Interaktionen zwischen Mikroorganismen und Oberfläche, wie z.B.

Wasserstoffbrückenbindungen, hydrophoben und elektrostatischen Wechselwirkungen

kommen, die die irreversible Adhäsion (2.Stadium) bewirken.

Nach erfolgreicher Adhäsion an der Oberfläche beginnt das dritte Stadium. Die

Primärbesetzer wachsen und Sekundärbakterien anderer Arten können anheften (Koadhäsion),

so dass diese indirekt über die Zellen der Primärbesiedler an der Oberfläche fixiert werden.

2 Theorie

7

Für die mikrobielle Akkumulation ist die Förderung oder Auslösung der Produktion

extrazellulärer polymerer Substanzen (EPS) charakteristisch. Die EPS sind am Vorgang der

Primäradhäsion von Zellen an Oberflächen maßgeblich beteiligt. Sie stellen den Klebstoff

dar, mit dem die Zellen im Anschluss an die Adhäsion irreversibel angelagert bleiben und

bilden auch die Matrix, die den Biofilm beim weiteren Wachstum zusammenhält.

Im vierten Stadium bildet sich ein konfluenter Biofilm, der weiter anwächst. Zwischen dem

Wachstum und der Ablösung eines Biofilms stellt sich ein Gleichgewicht ein, die so genannte

Plateauphase. Die Ablösung der Biofilme kann kontinuierlich durch die Wirkung von

Scherkräften erfolgen, es gibt aber auch Hinweise darauf, dass freigesetzte Enzyme eine

Ablösung von Bakterien als Schwärmerzellen bewirken. Diese Zellen können dann erneut mit

der Besiedlung von Oberflächen beginnen. Dies bezeichnet man als fünftes Stadium der

Biofilmentstehung.

Abb. 2.1: 5 Stadien der Biofilmentwicklung von P.aeruginosa 1) conditioning film, 2) reversible und irreversible Adhäsion, 3) EPS-Produktion und Bildung von Mikrokolonien, 4) reifer, konfluenter Biofilm, 5) Ablösung einzelner Bestandteile und weitere Ausbreitung [P. Dirckx und D. Davies, 2003 Center of Biofilm Engineering at Montana State University-Bozeman]

2 Theorie

8

Die Lebensgemeinschaft Biofilm ist nicht nur einfach der Zusammenschluss von

Mikroorganismen wie Bakterien und Algen an einer Oberfläche. Die Bakterien interagieren

mit ihrer Umgebung, und in der Entstehung eines Biofilms steckt mehr Organisation als

physikalisch-chemische Wechselwirkungen von Medium und Substrat. Bereits bei der

Besiedelung einzelner, frei schwimmender Bakterien an der Oberfläche ordnen sich diese

passend zueinander an. In dieser Phase werden verschiedene Proteine erzeugt, die speziell für

diesen Zweck im Erbgut verankert sind.

Auch die Vermehrung der Bakterien im Biofilm wird über Botenstoffe reguliert. Hat diese

Lebensgemeinschaft einen stabilen, geschlossenen Film gebildet, beginnen am Rand der

Kolonien befindliche Bakterien damit, ins Medium (flüssige Phase) überzugehen und den

Befall auf andere Bereiche auszudehnen.

2.2 Extrazelluläre Polymere Substanzen (EPS) 2.2.1 Definition

Die Abkürzung „EPS“ bezieht sich hier auf „extrazelluläre polymere Substanzen“; sie wird

auch für „extrazelluläre Polysaccharide“, „Exopolysaccharide“ und „Exopolymere“

verwendet [Wingender et. al, 1999, Wolfaardt et. al, 1999]. Geesey, [1982] definiert die EPS

als „extrazelluläre polymere Substanzen biologischen Ursprungs, die an der Bildung

mikrobieller Aggregate beteiligt sind“. Eine andere Definition gibt das Glossar des

Berichtsbandes der Dahlem-Konferenz über Struktur und Funktion von Biofilmen in Berlin

1988: Hier werden EPS als „organische Polymere mikrobiellen Ursprungs, die in Biofilmen

häufig für die Bindung von Zellen und anderem partikulären Material untereinander

(Kohäsion) und an das Substratum (Adhäsion) verantwortlich sind“ bezeichnet [Characklis

und Wilderer, 1989].

Von wesentlicher Bedeutung für die Zusammensetzung, Struktur und Funktion von Biofilmen

sind die Eigenschaften der EPS, welche die Schlüsselmoleküle für die Organisationsform des

Biofilms darstellen. Daher ist die Erforschung der EPS sehr wichtig für das Verständnis der

Bedeutung mikrobieller Biofilme an natürlichen Standorten und in technischen Systemen,

aber auch im medizinischen Bereich, wo Biofilme maßgeblich an Infektionsprozessen

beteiligt sein können [Costerton et. al, 1987].

2 Theorie

9

2.2.2 Zusammensetzung und Struktur der EPS

Der Begriff EPS umfasst eine ganze Reihe von Biopolymeren wie Polysaccharide, Proteine,

Glycoproteine, Lipide, Phospholipide, Glycolipide und Nukleinsäuren [Geesey, 1982,

Wingender et al., 1999]. Diese Makromoleküle bilden das wassergefüllte Netzwerk

(Hydrogel), mit Poren und Kanälen für die Mikroorganismen. Dieses Netzwerk ist sehr

heterogen aufgebaut, seine Bestandteile können stark variieren, je nachdem welche

Mikroorganismen zugegen sind, unter welchen Nährstoffbedingungen sie sich befinden und

welche hydrodynamischen Bedingungen vorliegen [Flemming und Wingender, 2000].

Die meisten EPS sind Makromoleküle, die sich aus wiederholenden, ähnlichen oder

identischen Untereinheiten („repeating units“) zusammensetzen. Diese können nichtpolymere

Substituenten niedrigen Molekulargewichtes enthalten, von denen die Struktur und die

physikochemischen Eigenschaften der EPS stark beeinflusst werden. Beispielsweise tragen

extrazelluläre Polysaccharide häufig Acetyl, Succinyl- oder Pyruvyl-Gruppen oder auch

anorganische Substituenten wie z.B. Sulfat. Proteine können durch Oligosaccharide

glykolisiert sein (Glykoproteine) oder Fettsäure-Reste enthalten (Lipoproteine).

Definitionsgemäß sind die EPS außerhalb der Zellen lokalisiert. Die Makromoleküle gelangen

auf verschiedenen Wegen in die extrazelluläre Matrix. Ein möglicher Weg wäre die aktive

Sekretion, die Ablösung von Bestandteilen der äußeren Membran Gram-negativer Zellen bzw.

der Zellwand Gram-positiver Zellen, die Lysis von Zellen oder die Sorption aus der wässrigen

Umgebung. Gram-negative Bakterien wie P. aeruginosa weisen einen weiteren Mechanismus

der Freisetzung von zellulärem Material auf, das blebbing: Sie geben während des normalen

Wachstums Membranvesikel nach außen ab [Cadieux et al., 1983, Beveridge et al. 1997, Li et

al. 1990]. Diese können Enzyme (Peptidglykan-Hydrolysen) enthalten, mit denen benachbarte

Zellen im Biofilm lysiert werden [Beveridge et al., 1997]. Material, das durch Absterben oder

Lysis freigesetzt wird, kann in der Biofilmmatrix zurückgehalten und durch die verbleibenden

Biofilmpopulationen in einer Art von Recycling wieder verwertet werden [Flemming und

Wingender, 2000].

Da sich die EPS aus verschiedensten Materialien zusammensetzen können, erscheint es

schwer, Aussagen über die Struktur einer solchen Matrix zu treffen. Man weiß, dass die

Mikroorganismen über einen längeren Zeitraum immobilisiert werden und sich synergetische

Gemeinschaften ausbilden [Flemming, 1994]. Die Kräfte, die diesen Biofilm

zusammenhalten, beruhen nicht auf kovalenten Bindungen, sondern sind jede für sich

betrachtet sogar recht schwache Kräfte. Das Zusammenspiel dieser Kräfte macht die

2 Theorie

10

Beständigkeit der Biofilmmatrix aus. Drei Bindungstypen werden für eine solche Interaktion

von schwachen Kräften postuliert [Flemming et al., 2000]:

• Dispersions-Wechselwirkungen („hydrophobe Wechselwirkungen“,

Bindungsenergie: 2,5 kJ/mol)

• elektrostatische Wechselwirkungen (Bindungsenergie: 12-29 kJ/mol) und

• Wasserstoffbrückenbindungen (Bindungsenergie: 10-30 kJ/mol).

Diese Kräfte wirken nicht nur zwischen den EPS-Molekülen, sie erstrecken sich auch auf

Partikel. Aus diesem Grunde wird die EPS auch als „Klebstoff“ beschrieben, der das

Konsortium aus Bakterien, abiotischen Partikeln und anderen Biofilmbestandteilen

zusammenhält [Flemming u. Wingender 2000]. Aufgrund der schwachen Wechselwirkungen

entwickelt sich ein Netzwerk fluktuierender Haftpunkte, die sich ständig lösen und wieder

verbinden. Je nach Art der Scherkräfte, die auf das Netzwerk einwirken, finden sich die

gleichen Haftpunkte wieder, und der Biofilm verhält sich als Gel. Sind es verschiedene

Haftpunkte, verhält sich der Biofilm wie eine hochviskose Flüssigkeit [Flemming et al.,

2000]. Sehr viele Aspekte sprechen für die gezielte Bildung der verschiedenen EPS-

Strukturen. Diese Strukturen spiegeln sehr genau die Konditionen wider, unter denen die

Mikroorganismen existieren. Die EPS ist das Gebäude für die Ausbildung einer Kommune

von verschiedenen Mikroorganismen [Flemming, 2002 Gesprächsnotiz Forscherrunde].

Abb. 2.2: Darstellung der verschiedenen Wechselwirkungsarten innerhalb der EPS-Matrix

EPS TA M CM Cy

CH2

CH2OH

COO-

OHCOO -

Ca2+

COO

CH2

OH

CH2OH

OOC-

+ + + + ++

+

- - - - - --

- - - -

+ +OH

CH2OH

CH2+ ++

-

ionische Anziehungs-kräfteionische

Abstoßungs-kräfte

Wasserstoff-brücken-bindungen

elektrostatischeAnziehungs-kräfte

v. d. Waals Wechselwirkungen

EPS TA M CM Cy

CH2

CH2OH

COO-

OHCOO -

Ca2+

COO

CH2

OH

CH2OH

OOC-

+ + + + ++

+

- - - - - --

- - - -

+ +OH

CH2OH

CH2+ ++

-

ionische Anziehungs-kräfteionische

Abstoßungs-kräfte

Wasserstoff-brücken-bindungen

elektrostatischeAnziehungs-kräfte

v. d. Waals Wechselwirkungen

EPS TA M CM Cy

CH2

CH2OH

COO-

OHCOO -

Ca2+

COO

CH2

OH

CH2OH

OOC-

+ + + + ++

+

- - - - - --

- - - -

+ +OH

CH2OH

CH2+ ++

-

EPS TA M CM CyEPS TA M CM Cy

CH2

CH2OH

COO-

OHCH2

CH2OH

COO-

OHCOO -

Ca2+

COO -

Ca2+Ca2+

COO

CH2

OH

CH2OH

OOC-

+ + + + ++

+

- - - - - --

- - - -

+ +OH

CH2OH

CH2+ ++

-

COO

CH2

OH

CH2OH

OOC-

+ + + + ++

+

- - - - - --

- - - -

+ +OH

CH2OH

CH2+ ++

-

ionische Anziehungs-kräfteionische

Abstoßungs-kräfte

Wasserstoff-brücken-bindungen

elektrostatischeAnziehungs-kräfte

v. d. Waals Wechselwirkungen

2 Theorie

11

2.3 Pseudomonas aeruginosa Bakterien des Stammes Pseudomonas aeruginosa gehören zur Familie der

Pseudomonadaceae. Es handelt sich um ein Gram-negatives, polar begeißeltes Bakterium mit

gerader oder gekrümmter Zellform, das keine Sporen ausbildet.

Abb. 2.3: SEM Aufnahme von P. aeruginosa Bakterien

Es entwickelt verschiedene stammspezifische Kolonietypen, die von Phillips (1969) aufgrund

von Untersuchungen des Aussehens ausschließlich klinischer Stämme in sechs verschiedene

Typklassen eingeteilt werden. Er benannte sie mit den Kategorien klassisch, coliformen-

ähnlich, rau, runzelig, mucoid und winzig [Schlegel, 1992]. Die mucoide Form beschränkt

sich auf solche Stämme, die nach Übernachtkultur auf Standard-Agarnährmedien ein

wässriges, schleimiges Aussehen besitzen, das auf die Überproduktion des extrazellulären

Polysaccharids Alginat zurückzuführen ist [Govan, 1990].

Es handelt sich bei P. aeruginosa um ein anspruchsloses, chemoorganotrophes Bakterium,

das seine Energie durch aerobe Atmung gewinnt. Es kann eine große Zahl organischer

Verbindungen, z.B. einfache organische Säuren und Zucker, Aminosäuren, Gelatine, sowie

aromatische Verbindungen (Benzoat, Phthalsäure, p-Kresol u.a.) stoffwechselphysiologisch

umsetzen. Zucker werden im Allgemeinen über den ENTNER-DOUDOROFF-WEG

abgebaut.

P. aeruginosa ist ein Bakterium, das zahlreiche oligotrophe aquatische und terrestrische

Standorte in der Umwelt und wässrige bzw. feuchte Standorte in technischen Systemen

besiedeln kann [Shoreit und Soltan, 1992; Botzenhart und Döring, 1993]. Dort können sie

sowohl von unbelebten als auch von belebten Oberflächen isoliert werden.

P. aeruginosa ist in der Lage, bei Pflanzen, Tieren und Menschen Krankheiten zu

verursachen. Es ist ein opportunistischer Erreger, das heißt, es handelt sich um einen

2 Theorie

12

fakultativ pathogenen Keim, der nur bei Patienten mit reduziertem Allgemeinzustand zu

Infektionen führen kann. Besonders betroffen sind Patienten mit Immundefekten,

Frischoperierte, Rauschmittel- und Alkoholabhängige und Frühgeborene. Die Übertragung

erfolgt durch indirekte Kontaktinfektion [Pschyrembel, 1990]. Menschen die durch P.

aeruginosa infiziert werden, leiden unter Mittelohrvereiterungen, Wundinfektionen mit

Bildung eines blaugrünen Eiters (vornehmlich bei Brandwunden) und geschwächte

Individuen sogar an Bakteriämien.

Gehäuft wird P. aeruginosa im Sputum von Patienten mit der autosomal rezessiven

Erbkrankheit Cystische Fibrose (CF) gefunden. Die Bakterien können bei diesem

Krankheitsbild zu besonders schweren und lebensbedrohlichen Lungeninfektionen beitragen,

die häufig zum vorzeitigen Tod des Patienten führen [Clarke, 1990].

P. aeruginosa bildet zahlreiche extrazelluläre Produkte, von denen eine Reihe als

Pathogenitätsfaktoren angesehen werden. Dazu zählen unter anderem das extrazelluläre

Polysaccharid Alginat sowie Exotoxin A, Exotoxin S, alkalische Protease, Elastase und

Phospholipase C [Susanne Grobe, 1996].

2.4 Polysaccharide Polysaccharide gehören neben Proteinen zu den wesentlichen Bestandteilen der EPS. Sie

bestimmen maßgeblich die Eigenschaften von Biofilmen. Eine Betrachtung der speziellen

Wesensmerkmale von Polysacchariden ist also unumgänglich und liefert eine Erklärungsbasis

für das Verhalten von komplexen Biofilmsystemen.

Polysaccharide sind hochpolymere Kohlenhydrate, d.h. Makromoleküle der allgemeinen

Form CnHmOx. Sie werden wegen ihrer charakteristischen glykosidischen Bindungen

zwischen den Zuckerresten auch Glycane genannt. Homopolysaccharide sind aus nur einem

Monomer aufgebaut, Heteropolysaccharide bestehen aus zwei oder mehreren. Man

unterscheidet ferner lineare und verzweigte Moleküle. Im ersten Fall spricht man von Ketten-

oder Fadenmolekülen [Pilnik u. Voragen, 1980].

Die wichtigsten Bausteine der Polysaccharide sind die Hexosen wie D-Glucose, D-Mannose,

D-Galaktose und D-Fructose. In Algen kann auch die L-Galaktose vertreten sein. Als

Pentosebausteine finden sich L-Arabinose und D-Xylose sowie L-Fructose und L-Rhamnose.

Weitere Bausteine sind die am C-6 oxidierten Uronsäuren mit D-Glucoron und D-

Galakturonsäure, ferner findet man bei Algen die L-Mannuron- und D-Guluronsäure (s. Abb.

2 Theorie

13

2.4). Bei tierischen Polysacchariden kommen die stickstoffhaltigen Bausteine Glucosamin

und Galaktosamin vor, ferner die Iduronsäure als Baustein des Heparins [G. Franz, 1991].

Abb. 2.4: Häufig auftretende Zuckerbausteine pflanzlicher Polysaccharide

Der Vergleich von Polysacchariden und Proteinen verdeutlicht die enorme Vielfalt der

glykosidischen Bindung. Betrachtet man die Struktur eines simplen Dipeptids mit einer Art

von Aminosäure, so kann nur eine einzelne Struktur resultieren, nämlich zwei

Aminosäurereste verbunden durch eine Peptidbindung. Dagegen kann eine viel breitere

Auswahl von verschiedenen Disacchariden aus einem Monosaccharidtyp entstehen, da jede

O

HO

OH

OH

OH

Pentosen

β-D-Xylose

OHO OHOH

OH

α-L-Arabinopyranose

HOH2C

OH

OH

OHO

α-L-Arabinofuranose

O

HO

OH

OH

OH

CH2OH

Hexosen

O

HO

OHOH

CH2OH

OH

β-D-Mannose

β-D-Glucose

O

HO

OH

OH

OH

α-D-Galactose

O

COOH

OH

OH

OHOH

Uronsäuren

β-D-Glucuronsäure

O

COOH

OH

OH

H3CO OH

α-D-4-O-Methyl-glucuronsäure

O

COOH

OH

OH

OH

HO

β-D-Galacturonsäure

O

OH

HO OHCH3

OH

Desoxyhexosen

α-L-Rhamnose

O OHCH3

OH

HOOH

α-L-Fucose

O

HO

OH

OH

OH

Pentosen

β-D-Xylose

OHO OHOH

OH

α-L-Arabinopyranose

HOH2C

OH

OH

OHO

α-L-Arabinofuranose

O

HO

OH

OH

OH

CH2OH

Hexosen

O

HO

OHOH

CH2OH

OH

β-D-Mannose

β-D-Glucose

O

HO

OH

OH

OH

α-D-Galactose

O

COOH

OH

OH

OHOH

Uronsäuren

β-D-Glucuronsäure

O

COOH

OH

OH

H3CO OH

α-D-4-O-Methyl-glucuronsäure

O

COOH

OH

OH

OH

HO

β-D-Galacturonsäure

O

OH

HO OHCH3

OH

Desoxyhexosen

α-L-Rhamnose

O OHCH3

OH

HOOH

α-L-Fucose

2 Theorie

14

der 5 verschiedenen glykosidischen Bindungen (1-1, 1-2, 1-3, 1-4 oder 1-6, Nummerierung

der C-Atome im glykosidischen Ring s. Abb. 2.5) gebildet werden kann.

Abb. 2.5: Darstellung der 6 verschiedenen Kohlenstoffatome in einem Monosaccharid (Hexose)

Zusätzlich zu dem anomerischen Kohlenstoffatom an der 1-Position kommt die α- oder β-

Konformation, z.B. ist die Hydroxylgruppe an C-1 entweder oberhalb oder unterhalb der

Ebene der D-Serie der Zuckerringstruktur angeordnet. Somit sind insgesamt 11 verschiedene

Disaccharidstrukturen möglich. Mit Rücksicht auf eine korrekte Polysaccharidstruktur wird

die 1-1 Bindung ausgelassen, dies ergibt für den Kettenschluss 8 mögliche

Disaccharidstrukturen. Somit erhält man eine 8-mal größere Divergenz von

Polysaccharidstrukturen im Vergleich zu Proteinen. Ein weiterer Anstieg der Divergenz

entsteht durch die 30 verschiedenen Monosaccharide, welche in Polysacchariden im

Gegensatz zu den 20 möglichen Aminosäuren der Proteine gefunden werden können.

Außerdem können die Polysaccharide mit verschiedenen „nicht-Kohlehydrat“-Gruppen

substituiert sein.

Polysaccharide sind wasserlösliche oder stark quellbare Stoffe, die kolloidale, hochviskose

Lösungen oder Dispersionen mit plastischem und pseudoplastischem Fließverhalten ergeben.

Daraus leiten sich die funktionellen Eigenschaften wie Verdickung, Wasserbindevermögen,

Stabilisierung von Suspensionen und Emulsionen sowie Gelbildung ab, die zu verschiedenen

Sammelbegriffen geführt haben: Pflanzenschleime, Pflanzengummis, Hydrokolloide,

Quellstoffe, Bindemittel, Gelier- und Verdickungsmittel.

Die Grenze zwischen Oligo- und Polysacchariden lässt sich nicht durch einen numerischen

Wert des Polymerisationsgrades oder der Molekularmasse angeben. Die für den kolloidalen

Charakter verantwortlichen Eigenschaften sind jedoch sicher mit hochpolymeren

Polysacchariden verknüpft.

OH

O

CH2OHOH

OH

OH 1 4

3 2

5

6

2 Theorie

15

2.4.1 Typische Formen von Polysacchariden

Die dreidimensionale Form eines Polysaccharids wird durch die Strukturen der

Monosaccharide bestimmt, aus denen es zusammengesetzt ist. In diesem Überblick werden

nur die Strukturen von Hexosen, genauer gesagt der Pyranosering, betrachtet.

Es gibt vier Hauptpyranoseringformen, namentlich zwei Sessel- und zwei Wannenformen

(Abb. 2.5). Die Monosaccharide sind in der Lage, zwischen diesen verschiedenen Ringformen

zu konvertieren, obwohl eine Form energetisch bevorzugt ist.

Abb. 2.6: Sessel- und Wannenformen der Pyranose-6-ringstruktur von Monosacchariden. Diese Strukturen stehen im Gleichgewicht miteinander, sowie mit dem Furanose-5-ring und den geraden Kettenformen der Monosaccharide.

Weil die Wannenformen relativ instabil sind, existieren die Hexosen vornehmlich in einer der

beiden Sesselformen. Für die meisten D-Zucker ist die 4C1 Sesselformation bevorzugt, wobei

die L-Zucker normalerweise in der 1C4-Form konfigurieren. Die Präferenz für die Sesselform

begründet sich durch die Substituenten. Der größte Teil der Substituenten, z.B. am C-5

gebundene, wird in der energetisch bevorzugten äquatorialen Position gehalten. Die

Anbindung von Substituenten verursacht dadurch den Wechsel in die bevorzugte Sesselform

und verändert somit die dreidimensionale Struktur der Polysaccharide.

O

O

OO

Sesselform

Wannenform

1C4 4C1

B1,41,4B

O

O

OO

Sesselform

Wannenform

1C4 4C1

B1,41,4B

2 Theorie

16

Die Form der durch glykosidische Bindungen geknüpften Polysaccharide wird zum größten

Teil durch die Konformation der enthaltenen Monosaccharideinheiten diktiert. Zwei Faktoren

bei der Verknüpfung von Monosacchariden müssen berücksichtigt werden:

1. Die Form des Sessels beeinflusst die Orientierung der glykosidischen Bindung.

2. Position und Orientierung der glykosidischen Bindung beeinflussen den Rotationsgrad

um die glykosidische Bindung.

Die einfachste Polysaccharidstruktur ist die homopolymere D-Glucose mit der β-D-Glucose

und der 1C4-Form, bei der alle Substituenten äquatorial zur Ringebene angeordnet sind. Die

α-D-Glucose hat im Gegensatz dazu einen axialen Substituenten am C-1 (Abb. 2.7).

Abb. 2.7: Die vorherrschende Ringform von α-D-Glukose mit axialer Hydroxylgruppe am C1

und β-D-Glukose mit äquatorialer Hydroxylgruppe am C1.

Diese relativ kleine Veränderung in der Monosaccharidkonformation hat einen enormen

Effekt auf die daraus resultierende Polysaccharidstruktur. Theoretisch sind bis zu acht

Polysaccharidstrukturen möglich. D-Glucose formuliert eine von nur 4 Typen von

Polysaccharidformen. Die vier Arten einfacher Polysaccharidformen wurden von Rees 1977

ausgearbeitet (Abb. 2.8). Mathematisch werden sie als Helices beschrieben, obwohl nur ein

Typ als konventionelle Helix erscheint. Polyglycane die als β1-4 (Celluose) oder α1-3

verknüpft sind, formen eine erweiterte Rippenstrukur, in der die planaren Zuckerringe

hauptsächlich parallel zur Längsachse der Helix stehen.

Neutrale Polysaccharide dieses Typus sind nahezu unlöslich, weil die Oberflächen der Helix

axial relativ hydrophob sind, d.h. hydrophobe H-Atome sind axial angeordnet und dem

Lösungsmittel ausgesetzt. Polyglucane mit α1-4 (Amylose) oder β1-3 (Curdlan)

Verknüpfungen können hohle Helices formen, obwohl in Lösung wahrscheinlich nur flexible

Fäden existieren.

O H O H 2C

OH

O H

HO H O O HO H 2C

OH HO

HO

O H α-D-Glucose

β-D-Glucose axial

äquatorial

2 Theorie

17

gestreckt helical gefaltet flexibel β1-4 Glucan α1-4 Glucan α1-2 Glucan α1-6 Glucan α1-3 Glucan β1-3 Glucan β1-2 Glucan β1-6 Glucan Abb. 2.8: Die vier Basisformen einfacher Polysaccharide. Die Form der Polysaccharide wird durch die enthaltenen Monosaccharide und durch die Art der glykosidischen Bindung bestimmt. [Powell, 1979] Die α oder β1-2 Verknüpfung resultiert in Polysacchariden, die eine rigide Struktur bilden.

Sie werden häufig als gefaltetes Band beschrieben. Die sterische Behinderung, die aus der

nahen Nachbarschaft der Bindungen resultiert, schränkt die freie Rotation der glykosidischen

Bindung ein. Polyglycane mit einer α oder β1-6 Bindung (z.B. Dextrane) bilden wegen der

anwachsenden Bewegung, die um die glykosidischen Bindungen möglich sind, flexible

Windungen.

2.5 Bakterielle Polysaccharide

Bakterielle Polysaccharide variieren hauptsächlich in ihrer strukturellen Komplexität. Die

einfachsten Beispiele sind die Homopolymeren, z.B. Cellulose. Sie enthalten einen Typ von

Monosaccharideinheiten, die durch eine Art von glykosidischer Bindung verbunden sind.

Die Heteropolymere können im Gegensatz dazu verzweigte Moleküle sein, wobei

verschiedene Monosaccharide mit verschiedenen glycosidischen Verknüpfungen beteiligt sein

können. Das komplexeste Polysaccharid ist das durch Rhizobium trifolii abgesonderte mit

acht sich wiederholenden Zuckerresten [Mc Neil et al., 1986].

Es ist wichtig, die große Diversität der Polysaccharidstruktur hervorzuheben. Es gibt nicht

weniger als 83 verschiedene Arten von Kapselpolysacchariden (die K antigene) in der

Gattung Klebsiella [Atkins et al., 1979]. Ähnliche Verhältnisse liegen bei vielen anderen

Bakterienarten vor.

2 Theorie

18

Es ist sehr wahrscheinlich, dass viele Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen und

ihrer externen Umgebung von der biologischen Spezifität dieser Polymere beherrscht werden.

Die Gegenwart von negativen Ladungen ist ein Merkmal der meisten bakteriellen

Polysaccharide. Normalerweise sind diese negativen Ladungen ein Ergebnis der Aufnahme

von Uronsäuren in das Polymer. Uronsäuren sind Hexosen, in denen die primäre

Alkoholgruppe am C-6 zur korrespondierenden Carbonsäure oxidiert wurde, folglich wird D-

Guluronsäure derivatisiert durch Oxidation von D-Glucose. Negative Ladungen können durch

Substitution von einigen der Monosaccharidbestandteilen, mit Pyruvyl-, Succinyl-, Acetyl-

oder Formyl-Gruppen eingetragen werden. Die vorherrschende negative Ladung, gekoppelt

mit dem charakteristisch hohen Molekulargewicht von vielen Polysacchariden, bewirkt

normalerweise die Ausbildung von hochhydratisierten, gelartigen Netzwerken, wobei ein

kleiner Anteil der Polymere mit vergleichbar großen Wassermengen wechselwirkt.

Bakterielle Polysaccharide variieren enorm in ihren Strukturen, vom simplen

Homopolysaccharid bis zum komplexen, hochsubstituierten, verzweigten Hetero-

polysaccharid. Die chemische Analyse der Strukturen dieser Polysaccharide hat oft schwer

interpretierbare Ergebnisse produziert. Ein Hauptgrund hierfür ist die partielle Resistenz der

glykosidischen Bindungen gegen eine saure Hydrolyse. Folglich muss die Hydrolyse in einem

stark sauren Milieu durchgeführt werden, dies kann aber wiederum zu einer partiellen

Decarboxylierung der Uronsäuren führen. Diese starken Säuren können auch andere Hexosen

und Substituenten abbauen. Dies führt zu Unterschätzungen oder Fehlidentifikationen der

Zuckerprodukte. Dennoch wurden analytische Techniken entwickelt und verbessert, um

Analysen von vielen bakteriellen Polysacchariden durchzuführen.

Die exakte Funktion vieler bakterieller Polysaccharide ist immer noch eine offene Debatte,

obwohl es keinen Mangel an Vorschlägen für die biologische Rolle dieser Materialien gibt

[Dudman, 1977]. Es ist ebenfalls noch nicht klar, warum einige Bakterien einzelne Kapseln

bilden (wie Klebsiella pneumoniae), während andere eine viel lockerere Verbindung haben,

wie P. aeruginosa. Bei einigen Bakterien ist es ganz einfach, die mögliche Rolle der

Polysaccharide zuzuschreiben, wie als Virulenzfaktoren, adhäsive oder schützende Schichten,

während andere Funktionen obskur erscheinen. Den Polysacchariden aus mucoiden Stämmen

von P. aeruginosa werden zahlreiche Rollen einschließlich des Schutzes gegen Angriffe

durch das Gastimmunsystem, Adhäsionsvermittlung und Kontrolle der Exoenzymaktivität

zugeschrieben. Es sollte hervorgehoben werden, dass bakterielle Polysaccharide

normalerweise antigen sind, und es wird diskutiert, dass die Uronsäuren die hauptantigenen

Faktoren sind [Dudman u. Wilkinson, 1965].

2 Theorie

19

2.6 Charakterisierung von Polysacchariden in Lösung

Polysaccharide besitzen aufgrund intra- und intermolekularer Wechselwirkungen bestimmte

Konformationen in Lösung. Diese lassen sich oft in idealisierte Strukturkategorien einteilen.

Unverzweigte Polysaccharide, die nur eine geringe Wechselwirkung zwischen ihren

Seitengruppen aufweisen, bilden in Lösung oft Zufallsknäuel. Für Zufallsknäuel lässt sich nur

eine mittlere Konformation bzw. eine mittlere Größe angeben. Sie kann durch den so

genannten Streumassenradius (Gyrationsradius) RG charakterisiert werden. Wenn die

Polymerkette aus Monomereinheiten i gleicher Masse mi besteht, ist RG definiert als

N

R

m

RmR i

i

ii

iii

G

∑∑

∑==

22

(Gl. 2.1),

wobei 2iR das mittlere Abstandsquadrat der Einheit i vom Massenschwerpunkt des

Makromoleküls angibt (N Anzahl der Monomereinheiten). RG kann experimentell mit Hilfe

von Streumethoden bestimmt werden. Eine Analyse der Gestalt des Zufallsknäuels zeigt, dass

im Mittel die Segmente sphärisch symmetrisch um den Massenschwerpunkt angeordnet sind.

Für den quadratisch gemittelten End-zu-End-Abstand h eines idealen, frei beweglichen

Polysaccharidknäuels ergibt sich

Nlh ⋅= (Gl. 2.2),

wobei l die Bindungslänge der N Monomereinheiten ist.

Bei einer Erhöhung der Anzahl der Monomere in einem ungeordneten Knäuel nimmt die

Ausdehnung des Knäuels also mit N zu. Als Wert für 2GR ergibt sich für das Knäuel

6hR

22G = (Gl. 2.3) .

Der experimentell bestimmbare Streumassenradius RG stellt somit ein Maß für die

Ausdehnung des Zufallsknäuels in der Lösung dar (s. Abb. 2.9).

2 Theorie

20

Abb. 2.9: Idealisierte Struktur eines linearen Polysaccharids in Lösung. Zufallsknäuel mit Massezentrum ⊗

Das ungeordnete Knäuel ist die am wenigsten strukturierte Konformation, die eine

Polymerkette in Lösung annehmen kann. Sie entspricht dem Zustand maximaler

Konformationsentropie. Der größte Teil des Volumens eines Zufallsknäuels in Lösung besteht

aus Lösemittel, die Raumerfüllung des Polysaccharids beträgt oft nur einige Prozent.

Eventuell vorhandene Oberflächenladungen der Makromoleküle besitzen auch einen großen

Einfluss auf die Konformation des Makromoleküls in Lösung. Aus der Debye-Hückel-

Theorie der Elektrolytlösungen folgt, dass bei geringen Salzkonzentrationen im Lösemittel

die Potentiale der Oberflächenladungen des geladenen Makromoleküls (Makroions) relativ

weitreichend sind. Gleichartige Ladungen auf dem Makroion, deren Potentiale große

Reichweiten besitzen, versuchen sich abzustoßen (s. Abb. 2.10). Bei hohen Salzkonzen-

trationen dagegen können die Salzionen die Oberflächenladungen des Makromoleküls

abschirmen.

Abb. 2.10: Konformation eines Polysaccharids mit negativen Oberflächenladungen bei verschiedenen Ionenstärken des Lösemittels

l l l l

N1

l l l l

N1

----

--

-

-----

---

---

--

-

-- - --

--

- -- -

--

--

-

--

-

- -

- --

---

----

kleine

großeIonenstärke

----

--

-

-----

---

---

--

-

-- - --

--

- -- -

--

--

-

--

-

- -

- --

---

----

kleine

großeIonenstärke

H2O

2 Theorie

21

2.6.1 Mittlere Molmasse

Viele Polysaccharide sind nicht molekulareinheitlich, d.h. sie sind polydispers. Das bedeutet,

dass ihre Molmasse eine gewisse Verteilung um einen zu definierenden Mittelwert M besitzt.

Zur Charakterisierung von Makromolekülen wie Polysacchariden ist es daher sinnvoll, diese

Mittelwerte anstelle vollständiger Verteilungsfunktionen anzugeben. Die gebräuchlichsten

Mittelwerte sind das Zahlenmittel Mn und das Gewichtsmittel Mw der Molmasse. Welcher der

Mittelwerte relevant ist, bestimmt die Methode mit der das Makromolekül untersucht wird.

Stützt man sich bei der Bestimmung der Molmasse auf eine so genannte kolligative

Eigenschaft, wie z.B. die Osmose, oder auf chemische Analysenmethoden (Endgruppen-

bestimmung), so kommt es lediglich auf die Anzahl der Moleküle in der Lösung an. Damit

wird hierbei das Zahlenmittel bestimmt:

∑

∑∑

∑−==

iii

ii

ii

iii

n Mc

c

N

MNM 1 (Gl. 2.4).

Bei der Ermittlung der Molmasse aus Lichtstreuexperimenten oder der Sedimentations-

geschwindigkeit hängt das statistische Gewicht einer Massenfraktion nicht nur von der

Anzahl der Moleküle, sondern auch von der Molekülmasse ab.

Hier misst man das Massenmittel:

∑

∑∑

∑∑∑

===

ii

iii

ii

iii

iii

iii

w m

Mm

c

Mc

MN

MNM

2

(Gl. 2.5).

Mit Hilfe der Ultrazentrifuge kann man das z-Mittel bestimmen, es wird daher auch als

Zentrifugenmittel bezeichnet:

∑∑

=

iii

iii

z MN

MNM 2

3

=∑∑

iii

iii

Mc

Mc 2

(Gl. 2.6).

Hier wird kubisch über die Teilchenzahl gemittelt.

2 Theorie

22

Da die Eigenschaften von Polymeren nicht nur von der Molmasse, sondern auch von deren

Verteilung abhängen, ist zur Charakterisierung von Makromolekülen neben der mittleren

Molmasse auch die Polydispersität (d) der Probe bedeutend:

n

w

MM

d = (Gl. 2.7).

Für polydisperse Systeme gilt allgemein: zWn MMM ≤≤ und demzufolge d ≥ 1. Dabei

bezieht sich das Gleichheitszeichen auf eine molekulareinheitliche (monodisperse) Probe.

Abbildung 2.11 zeigt eine differentielle Massenverteilungskurve einer breitverteilten

Polymerprobe mit den zuvor definierten Größen.

Abb. 2.11: Differentielle Massenverteilungskurve einer Polymerprobe

In der Praxis wird oft auch der sog. viskosimetrische Mittelwert verwendet:

a

iii

i

aii

MN

MNM

11

⎥⎥⎥

⎦

⎤

⎢⎢⎢

⎣

⎡=

∑∑ +

η (Gl. 2.8),

wobei a (0,5<a<2,0) der Exponent der MARK-HOUWINK-Gleichung (s. Gl. 2.13) ist. Mη

liegt meist zwischen Mn und Mw.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0 500000 1000000

Molmasse (g/mol)Mn Mw Mz

Ant

eil (

%)

2 Theorie

23

2.6.2 Viskosimetrie

Das Fließverhalten von Lösungen makromolekularer Substanzen wird weitgehend durch die

Größe und Form der gelösten Makromoleküle bestimmt. Aus diesem Grund erlauben

Viskositätsmessungen eine, wenn auch nur grobe, Charakterisierung der Molekülgestalt und

Bestimmung der Masse gelöster Biomoleküle.

Der von Staudinger eingeführten viskosimetrischen Methode [Hoffmann et al., 1977] zur

Bestimmung des mittleren Molekulargewichtes liegt die Erscheinung zugrunde, dass

Fadenmoleküle die Viskosität eines Lösungsmittels, in welchem sie gelöst sind, schon bei

verhältnismäßig niedrigen Konzentrationen beträchtlich erhöhen, und zwar umso stärker, je

höher ihr Molekulargewicht ist. Diese Methode eignet sich für lineare, wenig verzweigte

Moleküle; sie versagt jedoch bei kugelförmigen oder stark verzweigten Molekülen. Man kann

den Zusammenhang zwischen η, der Viskosität der Lösung, und η*, der Viskosität des reinen

Lösemittels durch folgende Reihe beschreiben:

[ ]{ }...1* ++= Pcηηη (Gl. 2.9).

cP: Konzentration Polymer, [η]: intrinsische Viskosität (Dimension: Konz.-1)

Die intrinsische Viskosität [η], auch als Staudinger-Index bezeichnet, kann hier als eine Art

Virialkoeffiezient angesehen werden. Man bestimmt die intrinsische Viskosität indem man

folgenden Grenzwert bildet:

[ ] [ ]⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ −=

→ P

*

0c c1/

limP

ηηη (Gl. 2.10)

(Einheit:cm3/g). Sie wird im Allgemeinen experimentell ermittelt und als Richtwert

angegeben, da sie stoffspezifische Vergleiche der Systeme ermöglicht.

Für die experimentelle Bestimmung von Viskositäten gibt es verschiedene Methoden. In

einem Ostwald-Viskosimeter werden die Durchlaufzeiten der Proben und des Lösungsmittels

ermittelt. Der Quotient aus der Differenz der Durchlaufzeiten der Probe [tP in s] und des

Lösemittels [tL in s] durch die Durchlaufzeit des Lösungsmittels ergibt die sogenannte

spezifische Viskosität [ηspez]:

L

LPspez t

tt −=η (Gl. 2.11).

2 Theorie

24

Aus dem Verhältnis der spezifischen Viskosität und der Polymerkonzentration cP erhält man

dann die sogenannte reduzierte Viskosität [ηred]:

P

spezred c

ηη = (Gl. 2.12).

cP: Polymerkonzentration in g/100mL

Durch Extrapolation der reduzierten Viskosität gegen die Konzentration der Polysaccharide

auf 0g/100mL erhält man die konzentrationsunabhängige intrinsische Viskosität [η].

Den Einfluss der unterschiedlichen Konformation der Fadenmoleküle unter verschiedenen

Bedingungen (Lösemittel, Temperatur) auf das Knäuelvolumen und damit auf die Form der

Viskosität-Molmassen-Beziehung berücksichtigten Mark und Houwink durch einen

allgemeinen Exponenten a der Molmasse:

[ ] aMK ηη ⋅= (Gl. 2.13),

wobei K und a Konstanten sind, die vom Lösemittel und von der Art des Makromoleküls

abhängen. So fand z. B. Smidsrød (1970) für das Polysaccharid Alginat in wässriger Lösung

für K einen Wert von 2,0x10-5 cm3/g und für a wurde ein Wert von 1 angenommen.

Die Gleichung gilt streng genommen nur für monodisperse Substanzen. Die experimentelle

Bestimmung der Konstanten erfolgt mit einheitlichen Faktoren und bei Kenntnis der

Molmasse, welche mit Hilfe anderer Messmethoden (z.B. Lichtstreuung oder

Sedimentationsmessungen) bestimmt wird. Der Zahlenwert von Mη liegt gewöhnlich

zwischen dem Zahlenmittel und dem Massenmittel der Molmasse, in der Regel jedoch näher

beim Massenmittel. Wenn a=1 ist, wird Mη = Mm.

In Tabellenwerken sind Werte für K und a von Makromolekülen angegeben, so dass man im

Falle bekannter Makromolekülsorten mit Hilfe von Kalibrationsmessungen an Standard-

polymeren aus der Messung von [η] die Molmasse abschätzen kann.

Umgekehrt kann, wenn M bekannt ist, die grobe Form a des Moleküls aus Visko-

sitätsmessungen bestimmt werden. Bei Polyelektrolyten ist wiederum zu beachten, dass die

Grenzviskositätszahl von der Ionenstärke abhängt.

Bei den bisher betrachteten Lösungen wurde vorausgesetzt, dass die Teilchen nicht

intramolekular wechselwirken. In konzentrierten Lösungen oder hochmolekularen Substanzen

treten jedoch hydrodynamische Wechselwirkungen auf, wodurch Assoziatstrukturen,

mesomorphe Phasen und Gelnetzwerke entstehen können. Ihre Viskositätseigenschaften

bezeichnet man als „Strukturviskosität“. Unter dem Einfluss von Scherbeanspruchung, z.B.

2 Theorie

25

im Strömungsgefälle, können Strukturänderungen auftreten: Die Moleküle orientieren sich

oder werden gestreckt, Aggregate können zerfallen und mesoskopische Strukturen (z.B.

Assoziationskolloide) können Phasenumwandlungen durchlaufen.

2.6.3 Ausschlusschromatographie

Die Ausschlusschromatographie SEC (engl. Size Exclusion Chromatography) ist eine

Methode zur Bestimmung der Molmasse und der Molmassenverteilung von Polymeren. Da

häufig Gele als Füllmaterialien verwendet werden, wird die Ausschlusschromatographie

häufig noch als Gel Permeations Chromatographie GPC bezeichnet. In der neueren Literatur

hat sich der Oberbegriff Ausschlusschromatographie SEC durchgesetzt. Sie basiert auf dem

Prinzip der Flüssigkeitschromatographie. Die Trennung der Oligomere bzw. Polymere erfolgt

aufgrund ihres hydrodynamischen Volumens und somit nach Molekülgröße.

Die SEC-Säule ist mit einem porösen Material definierter Porengröße gefüllt. Man bezeichnet

sie als stationäre Phase. Die Trennung beruht im Unterschied zu anderen

chromatographischen Methoden nicht auf chemischen oder physikalischen

Wechselwirkungen mit der stationären Phase. Effekte, die auf diesen Mechanismen beruhen,

müssen sogar ausgeschlossen werden, da adsorbierte Moleküle das Trennergebnis

verfälschen, bzw. die verwendete Säule unbrauchbar machen können. Häufig verwendete

Säulenfüllmaterialien sind Dextran, Agarose und andere modifizierte Polysaccharide.

Aufgrund der nicht vorhandenen chemischen und physikalischen Wechselwirkungen des

Makromoleküls mit dem Säulenmaterial werden im Gegensatz zu anderen

chromatographischen Methoden die Teilchen hinsichtlich ihrer Größe getrennt und zwar in

abnehmender Reihenfolge ihrer Größe. Die Fraktionierung der Probe erfolgt durch die Poren

des Füllmaterials. Die Moleküle werden in den Poren zurückgehalten und somit aus dem

Fluss der mobilen Phase entfernt. Die effektive Größe der Makromoleküle bestimmt die

Aufenthaltszeit in den Poren. Moleküle, die größer sind als die Porengröße der Packung,

werden ausgeschlossen und wandern vorbei, sie verlassen die Säule zuerst. Dagegen können

Moleküle, deren Durchmesser viel kleiner ist als der der Poren, in das gesamte Porensystem

eindringen. Sie werden deshalb als letzte eluiert. Dazwischen liegen die Moleküle mit

mittlerer Größe, deren durchschnittliche Retention in den Poren von ihrem Durchmesser

abhängt [Skoog u. Leary, 1996] (s. dazu Abb. 2.12 und Abb. 2.13)

2 Theorie

26

Abb. 2.12: Schematische Darstellung des Trennprinzips der SEC bei einem Säulenfüllmaterial (S) mit Poren (P) gleicher Geometrie und Größe für Teilchen (A-F) mit unterschiedlichen hydrodynamischen Volumina [Theisen A., 1993] 2.6.3.1 Verteilungskoeffizient kSEC

Unter typischen chromatographischen Bedingungen stellt sich ein Gleichgewicht zwischen

der Anzahl der gelösten Moleküle in der mobilen und der stationären Phase ein. Es ist deshalb

sinnvoll, einen Verteilungskoeffizienten kSEC einzuführen, der den Zusammenhang zwischen

der Konzentration der Polymerteilchen in der mobilen und in der stationären Phase

beschreibt.

kSEC = cm/cs ≤ 1 (Gl. 2.14).

cm = Konzentration der Polymerteilchen in der mobilen Phase

cs = Konzentration der Polymerteilchen in der stationären Phase

Die für die Praxis entscheidenden Parameter, die kSEC beeinflussen, sind

1. die Porengröße, die Porengrößenverteilung, die Porenform der stationären Phase

und

2. die Güte des Lösemittels, die Form der gelösten Teilchen und das hydrodynamische

Volumen der gelösten Teilchen.

S = Säulenfüllmaterial P = Pore A - F = Teilchen unterschiedlicher Größe

2 Theorie

27

Abb. 2.13:Schematische Darstellung des Trennprinzips der SEC für Teilchen mit zwei unterschiedlichen hydrodynamischen Volumina nach verschiedenen Durchflusszeiten der mobilen Phase (I<II<III). [Theisen, A., 1993]

2.6.3.2 Elutionsvolumen Ve

Das Elutionsvolumen Ve einer Probe, welche die Poren vollständig durchdringen kann, setzt

sich aus zwei Anteilen zusammen:

Ve = V0 + Vi (Gl. 2.15).

Vi = Volumen des Lösemittels, das in den Poren zurückgehalten wird

V0 = Freies Volumen außerhalb der Gelpartikel

Moleküle mittlerer Größe sind dazu in der Lage, in eine Fraktion K des Lösemittels überzugehen, die sich in den Poren befindet. Das Elutionsvolumen Ve für diese retardierten Moleküle wird durch folgende Gleichung

beschrieben:

Ve = V0 + K⋅Vi (Gl. 2.16).

K = Verteilungskoeffizient der gelösten Substanz

Für Moleküle, die zu groß sind, um in das Gel einzudringen, wird K = 0 und Ve = V0. Für

Moleküle, die ungehindert in das Gel eindringen können, wird K = 1 und Ve = (V0 + Vi). Im

ungünstigen Fall einer Wechselwirkung zwischen den gelösten Teilchen und der

Geloberfläche (z.B. Adsorption) erhöht sich der in den Poren zurückgehaltene Anteil an

gelösten Teilchen. K wird also größer als 1.

2 Theorie

28

Durch Auflösen der Gleichung 2.13 nach dem Verteilungskoeffizienten K erhält man:

cs = Konzentration der Polymerteilchen in der stationären Phase

cM = Konzentration der Polymerteilchen in der mobilen Phase

2.6.3.3 Ausschlussgrenze

Die Ausschlussgrenze legt die Molekularmasse einer Komponente fest, ab der keine

Retention mehr erfolgt. Alle Moleküle, die eine höhere Molekularmasse als die

Ausschlussgrenze aufweisen, sind so groß, dass sie nicht mehr retardiert werden und

zusammen in einem Peak eluieren.

2.6.3.4 Permeationsgrenze

Die Permeationsgrenze stellt die obere Grenze der Molekularmasse dar, bei der die gelösten

Moleküle vollständig in alle Poren eindringen können. Alle Moleküle mit dieser oder

geringerer Molekularmasse sind so klein, dass sie in einer einzigen Bande stark verzögert am

Ende eluieren.

Somit wird jedes Molekül, das weder ausgeschlossen wird noch vollständiger Permeation

unterliegt, entsprechend seines hydrodynamischen Volumens von der SEC- Säule eluiert. Die

Kalibrierung erfolgt üblicherweise mit Molmassenstandards. Da allerdings die Übertragung

auf andere Polymertypen aufgrund von physikalisch-chemischen Eigenschaften nur mit

geringer Genauigkeit möglich ist und Molmassenstandards nur in kleiner Auswahl erhältlich

sind, verwendet man auch die Methode der universellen Kalibrierung. Aus dem

Einstein´schen Viskositätsgesetz folgt, dass die Größe [η]M proportional zum

Teilchenvolumen ist. Folglich besteht auch eine Proportionalität zum Elutionsvolumen bei der

Ausschlusschromatographie.

Folgende Gleichung müsste also annähernd erfüllt sein:

log([η]M) = C - DVe (Gl. 2.18).

[η] = Grenzviskositätszahl; M = Molmasse

mcsc

iV

)0Ve(VK =

−= (Gl. 2.17).

2 Theorie

29

Die Parameter C und D müssen durch Kalibration mittels Polymerproben bekannter

Molmasse bestimmt werden.

Eine optimale Trennung des polymeren Materials wird in vielen Fällen nur dann erreicht,

wenn Säulen mit Füllungen verschiedener Porendurchmesser hintereinander geschaltet sind.

Dies sorgt jedoch für steigende Retentionszeiten.

2.7 NMR Untersuchungen an Polysacchariden

Bei der Polysaccharid-Analyse werden sowohl Protonen (1H) als auch 13C-Kernresonanz-

(NMR) Verfahren angewendet. Die magnetische Abschirmung von Protonen oder C-Atomen

eines Moleküls durch ihre Umgebung, d.h. der Einfluss der Molekülstruktur, führt zu

charakteristischen Signallagen im Kernresonanzspektrum, die als chemische Verschiebungen

bezeichnet werden. Sie werden auf die Signale von Referenzsubstanzen wie z.B.

Tetramethylsilan bezogen und in ppm ausgedrückt. Typische Gruppierungen, wie anomere

Protonen und C-Atome, Methylgruppen oder Carbonylgruppen können anhand ihrer

charakteristischen chemischen Verschiebungen identifiziert werden (s. Tab. 2.2).

Tab. 2.2: Chemische Verschiebungen typischer Gruppierungen in Polysacchariden für 1H- und 13C-NMR Spektren

1H δ (ppm) 13C δ (ppm) CH3C ~1,5 CH3C ~15

CH3CON 1,8-2,1 CH3COH CH3CO2 2,0-2,2 CH2CO2

20-23

CH(NH) 3,0-3,2 CH2C 38 CH3O 3,3-3,5 CH3O 55-61

H-2 bis H-6´ 3,5-4,5 CH(NH) 58-61 H-5 4,5-4,6 CH2OH 60-65

H-1 (axial) 4,5-4,8 C-2 bis C-5 65-75 H-C(OH)2 5,2 C-Xa 80-87

HO 5,0-5,4 C-1 (ax.-O, red.) 90-95 H-1 (äqu.) 5,3-5,8 C-1 (äqu.-O, red.) 95-98

HCO2 5,9 C-1 (ax.-O, glyk..) 98-103 C-1 (äqu.-O, glyk.) 103-106

COOH 174-175

C=O 175-180 Abkürzungen: ax.→axial, äqu.→äquatorial, red.→reduziert, glyk.→glykosidisch

a) an glykosidischer Bindung beteiligte nicht-anomere 13C

2 Theorie

30

Bei der 1H-NMR beeinflussen Protonen an Nachbar-C-Atomen die Protonensignale. Durch

Spinkopplungen entstehen dadurch Multipletts, wobei n benachbarte Protonen eine

Signalaufspaltung in n+1 Untersignale ergeben. So ist z. B. das Methylsignal von Ramnose

wegen des Einflusses des Protons an C5 ein Dublett (Abb. 2.13). Die Signale anomerer

Protonen werden durch Protonen an C2 in gleicher Weise aufgelöst. Aus der Lage und

Feinstruktur solcher anomerer Dubletts kann man die anomere (α- oder β-) Konfiguration der

glycosidischen Bindungen erkennen [Lemieux und Stevens, 1966].

Abb. 2.14: Kopplung der Protonen der Methylgruppe mit dem Proton am C-5 des glykosidischen Ringes am Beispiel α-L-Ramnose

Wegen der geringen Häufigkeit natürlicher 13C Isotope (ca. 1%) spielt in der 13C-NMR-

Spektroskopie eine C-C Kopplung keine Rolle. Daher sind 13C-Resonanzspektren meist

übersichtlicher als Protonenresonanzspektren, vor allem wenn durch Entkopplungstechniken

der Einfluss der Protonen auf 13C-Signale aufgehoben wird. In derartigen (Breitband

entkoppelten) 13C-Spektren ergibt jedes C-Atom nur ein Signal. Die Signale von α- und β-

glykosidischen C-Atomen erscheinen an verschiedenen Stellen im Spektrum. Um zu

unterscheiden, ob ein Signal vom anomeren C-Atom einer Aldose oder einer Ketose stammt,

verwendet man die Technik der „off-resonance“-Spektroskopie [Bock und Pederson, 1983;

Benn und Günther, 1983]. Dabei werden nur die Spin-Spin-Kopplungen zwischen den

untersuchten C-Atomen und weiter entfernten Protonen im Molekül, nicht aber die direkten

C-H-Kopplungen ausgeschaltet. In so aufgenommen Spektren ergeben anomere C-Atome von

Ketosen nach wie vor Singulett-Signale, die von Aldosen jedoch Dublett-Signale (s. Abb.

2.14). Die Substitution eines C-Atoms durch andere Substituenten wie O-Acetylgruppen führt

zu einer Veränderung seiner chemischen Verschiebung, die als α-Shift bezeichnet wird; das

Signal erscheint bei höherem Feld als das des unsubstituierten C-Atoms. Mittels

Vergleichssubstanzen kann also die Substitutionsstelle an einem Zuckerbaustein erkannt

werden [Hall, 1964; Jennings und Smith, 1978; Gorin, 1981].

O

OH

HO OHCH3

OH

H

2 Theorie

31

Abb. 2.15:„off-resonance“ Spektroskopie an Aldosen (hier: α-L-Glucopyranose) und Ketosen (hier: β-D-Fructopyranose)

2.7.1 Nachweis anomerer Konfiguration

Die anomeren Konfigurationen glykosidischer Bindungen von Aldosen lassen sich in vielen

Fällen relativ gut mit der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmen. Die Basis dafür ist die

winkelabhängige Kopplungsstärke anomerer Protonen an C1 mit den Protonen an C2. Bei

axialem Proton an C2 (Gluco-Konfiguration) sind die Kopplungen derart, dass α-Anomere

Singulett-Signale oder sehr schwach aufgelöste Dublett-Signale (Kopplungskonstanten J1,2

=1-4Hz) und β-Anomere ausgeprägte Dublett-Signale (Kopplungskonstanten J1,2=7-12 Hz)

ergeben. Eine genaue Zuordnung der Bindungen in einem Polysaccharid ergibt sich jedoch

praktisch immer aus der Kombination chemischer Reaktionen (Periodatoxidation, Smith-

Abbau, Fragmentierungen, Oligosaccharidanalyse) mit der Kernresonanzspektroskopie

[Schmidt et al., 1983].

Für die Bestimmung anomerer Konfigurationen eignet sich auch die 13C-Kernresonanz-

spektroskopie, wobei verschiedene Entkopplungstechniken verwendet werden. In einfachen

Fällen ist eine Charakterisierung durch Bestimmung der chemischen Verschiebung, im

Vergleich mit Referenzsubstanzen oder mit Literaturwerten, möglich. Eine elegante Technik

zur Bestimmung von anomeren Konfigurationen der Zuckerbausteine eines Polysaccharids

besteht in einer als „Gated Decoupling“ bezeichneten Methode [Bock und Pederson, 1983;

Benn und Günther, 1983]. Hier werden durch Kopplung von anomeren C1-Atomen mit den

anomeren 1H Protonen charakteristische Werte zusammengehöriger Signale für α-Anomere

(ca. 170Hz) und für β-Anomere (ca. 160 Hz) erhalten. Diese Technik ist vor allem bei der

Analyse von solchen Polysacchariden von Interesse, die Zucker der manno-Konfiguration

(z.B. Mannose oder Ramnose) enthalten, deren äquatoriale Position des Protons an C2 eine

Charakterisierung über Kopplungskonstanten im 1H-NMR-Spektrum nicht gestattet; sowohl

O CH2OH

OHOH

OH

OH

1

2

34

5

6

β-D-Fructopyranoseα-L-Glucopyranose

O

CH2OH

OH

OH

OHOH

H1

23

4

5

6

O CH2OH

OHOH

OH

OH

1

2

34

5

6

β-D-Fructopyranose

O CH2OH

OHOH

OH

OH

1

2

34

5

6

β-D-Fructopyranoseα-L-Glucopyranose

O

CH2OH

OH

OH

OHOH

H1

23

4

5

6

α-L-Glucopyranoseα-L-Glucopyranose

O

CH2OH

OH

OH

OHOH

H1

23

4

5

6

2 Theorie

32

α- als auch β-Anomere zeigen in diesen Fällen Singulett- oder sehr schwach aufgelöste

Dublettsignale.

2.7.2 Bestimmung der Sequenz

Die chemischen Verschiebungen in NMR-Spektren beinhalten wegen der Empfindlichkeit zu

Nachbargruppen ebenfalls den Einfluss der Sequenz. Dieser Einfluss ist ziemlich deutlich bei

Heteropolysacchariden, wird aber ebenfalls in 13C-NMR Spektren von Homopolysacchariden

mit unterschiedlichen Bindungsarten beobachtet. In Blockcopolymeren wie Alginaten zeigen

sich unterschiedliche 1H- und 13C-Signale durch verschiedene Sequenzen von D-Mannuron-

und L-Guluronsäure [Grasdalen et al., 1977, 1979 u. 1981; Grasdalen, 1983].

So entwickelte die Gruppe um Grasdalen eine Zuordnung der einzelnen Signale in 1H- und 13C-NMR-Spektren. Sie untersuchten hierfür Alginate, die durch chemische oder

enzymatische Methoden teilweise degradiert wurden. Der Abbau der Alginate ist notwendig,

um die molekulare Beweglichkeit in Lösung zu erhöhen und ein besseres Signal-Rausch-

Verhältnis zu erzielen. Für die Zuordnung wurden verschiedene Alginate mit bereits

bekannter Zusammensetzung eingesetzt. Zusätzlich wurde eine Fraktionierung des Alginats in

seine drei charakteristischen Bestandteile vorgenommen, der Mannuronat-, der Guluronat-

und der alternierenden Fraktion. Die Signale insbesondere der Kohlenstoffe an den

Verknüpfungs-stellen (C-1 und C-4) erscheinen bei unterschiedlichen chemischen

Verschiebungen in Abhängigkeit von ihren Nachbarn zur rechten und zur linken Seite. Das

heißt, man kann ein 13C-Signal einer bestimmten Dreiereinheit der Monomerbausteine

zuordnen, einer sogenannten Triade. Bei zwei Monomerbausteinen im Alginat, dem α-L-

Guluronat (G) und dem β-D-Mannuronat (M), ergeben sich somit acht verschiedene

Kombinationsmöglichkeiten für die Triaden: MMM, MMG, GMM, GMG, MGG, GGM,

MGM und GGG. Aus einem 13C-NMR-Spektrum eines teilweise abgebauten Algenalginats

erhält man somit Informationen über die Monomerzusammensetzung, die Monomersequenz

und die Zusammensetzung der Kettenenden.

Die Kernresonanzspektroskopie ist ein unersetzliches Werkzeug in der Strukturaufklärung

von Polysacchariden. Die verschiedenen Variationen, in der sie eingesetzt werden kann, und

die Tatsache dass es sich um eine nichtinvasive Methode handelt, die, im Falle von 1H-NMR,

nur geringe Substanzmengen benötigt, sind die enormen Vorteile der NMR-Spektroskopie.

Dennoch soll darauf hingewiesen werden, dass für eine zuverlässige Strukturanalyse

chemische Methoden unerlässlich sind. Daher ist das sicherste Verfahren zur

Strukturaufklärung von Polysacchariden die Kombination von chemischen Methoden und

2 Theorie

33

physikalischen Verfahren, wie NMR-Spektroskopie, Massenspektrometrie und Methoden zur

Molmassenbestimmung, wie sie hier bereits erwähnt wurden.

2.8 Alginate

2.8.1 Entdeckung von Alginaten

Das Polysaccharid Alginat wurde 1881 zuerst von Stanford aus Braunalgen isoliert. Die erste

Charakterisierung erfolgte 1883 von Stanford. Hierbei wurden viele physikalische und

chemische Eigenschaften, die heute noch gültig sind, beschrieben. Nachfolgende Studien an

Alginaten verwenden die meist technisch ausgereifteren chemischen und/oder

physikochemischen Techniken, einschließlich NMR, Lichtstreuung, Viskosimetrie, und

Elektronenmikroskopie. Diese Techniken haben das Wissen über diese Polysaccharide

verfeinert und erweitert. Was zunächst nur vermutet wurde, bestätigte sich nach wenigen

Jahren [1933 von Schoeffel und Link], nämlich dass es sich beim Alginat um ein

Uronsäurepolymer handelt. Die Uronsäuren sind Monosaccharide, welche am C-6 oxidiert

wurden, um eine Carboxylgruppe zu schaffen und sind deshalb negativ geladen. Schoeffel

und Link fanden fälschlicherweise, dass die β-D-Mannuronsäure das einzige Monosaccharid

ist, aus dem Alginat aufgebaut wird. Erst nachfolgende Arbeiten etablierten die Gegenwart

von verschiedenen Anteilen einer zweiten Uronsäure, dem α-L-Guluronat [Fischer und

Doerfel, 1955], seitdem ist Alginat als Copolymer bekannt.

Die Beobachtung, dass P. aeruginosa in der Lage ist, „alginatähnliches“ Polysaccharid zu

synthetisieren, wurde als erstes von Linker und Jones [1964] publiziert. Mucoide Stämme

dieses Bakteriums wurden schon vorher von Sonnenschein [1927] isoliert. In nachfolgenden

intensiveren Studien bestätigten Linker und Jones [1966], dass O-acetyliertes Alginat die

Hauptkomponente des P. aeruginosa-Schleims ist. Später entdeckte man, dass verwandte

Pseudomonaden wie P. fluorescens, P. mendocina, P. putida [Govan et al., 1981] und P.

syringae p.v. glycina [Fett et al., 1986] unter bestimmten Wachstumsbedingungen Alginat

produzieren können. Alginat wurde außerdem nur von einer nicht-pseudomonaden Spezies

isoliert, von einem Bakterium namens Azotobacter vinelandii [Gorin und Spencer, 1966].

2 Theorie

34

2.8.3 Die chemische Zusammensetzung von Alginaten

Die Alginate sind eine Familie von ähnlichen Molekülen. Die meisten strukturellen

Informationen dieser Polysaccharide wurden aus Material, dass aus Braunalgen isoliert

wurde, gewonnen. Die bakteriellen Polysaccharide ähneln einander, weisen jedoch kleine

wichtige Unterschiede in der Zusammensetzung und in strukturellen Details auf. Alginate

sind unverzweigte (1-4)-verknüpfte Polysaccharide aus β-D-Mannuronat (M) und seinem C-5

Epimer α-L-Guluronat (G) (s. Abb. 2.16).

Abb. 2.16: Monomereinheiten des Alginats: β-D-Mannuronat (M) und α-L-Guluronat (G)

Das relative Verhältnis der beiden Uronsäuren variiert von Alginat zu Alginat und ist ein

Hauptfaktor für die Bestimmung der Eigenschaften dieser Polysaccharide. Der

Mannuronat/Guluronat-Anteil (M/G-Verhältnis) und weitaus wichtiger die Anordnung der

Uronsäuren im Polysaccharid sind Indikatoren für die Eigenschaften eines einzelnen

Alginatpräparates. Das M/G-Verhältnis von Alginaten aus Braualgen [Stockton et al., 1980]

und aus A. vinelandii [Larsen und Haug, 1971] basiert auf den Wachstumsverhältnissen des

Organismus. Bakterielle Alginate aus P. aeruginosa sind ausnahmslos substituiert mit O-

Acetylgruppen [Sherbrock-Cox et al., 1984]. Experimente unter Einsatz des selektiven

enzymatischen Abbaus des Alginats und der Analyse der Abbauprodukte durch

Gelpermeationschromatographie implizieren, dass die O-Acetylgruppen nur an Mannuronat-

resten gebunden sind [Davidson et al., 1977]. Weitere Experimente haben gezeigt, dass bei

Alginatproben aus P. aeruginosa das Molverhältnis der O-Acetylgruppen zu D-Mannuronat

größer als eins ist [Sherbrock-Cox et al., 1984]. Detaillierte Analysen von bakteriellem

Alginat durch 1H-NMR offenbarten, dass einige Mannuronatreste 2,3-di-O-acetyliert waren,

obwohl die mono-O-acetylierte Form stärker vorherrscht [Skjåk-Bræk et al., 1986].

O

R O

O R

O

O C O O -6

5

4

3 2

1

O

OH

O

OH

O

COO-

6

5

4

3

21

M G

2 Theorie

35

2.8.3 Die Blockstruktur von Alginaten

Aus den Haworthprojektionen von β-D-Mannuronat und α-L-Guluronat ist zu entnehmen,

dass keine Unterschiede in den Strukturen bestehen. Die Epimerisierung am C-5 bewirkt

einen Konformationswechsel der zwei Monosaccharideinheiten. Weil die Carboxylgruppe der

größte Substituent am Zuckerring ist, wird sie in der energetisch günstigsten Konformation in

äquatorialer Position gehalten. Deshalb existiert β-D-Mannuronat bevorzugt in der 4C1

Sesselform und α-L-Guluronat in der 1C4 Konformation. Die Kombination der beiden

Ringformen ergibt verschiedene dreidimensionale Strukturen. Mit β-D-Mannuronat sind die

Verknüpfungen durch die C-1 und C-4 Positionen beide äquatorial zum planaren Zuckerring.

Die Verknüpfungen über dieselben C-Atome bei α-L-Guluronat sind im Gegensatz zum

Mannuronat axial. Die Sequenz der Uronsäuren in den einzelnen Alginatmolekülen hat starke

Effekte auf die Alginatstruktur. Die zwei verschiedenen Uronsäuren können innerhalb des

Alginatmoleküls in drei verschiedenen Formen angeordnet sein, um Blockstrukturen

auszubilden. Es können homopolymere Regionen wie poly-β-D-Mannuronat oder poly-α-L-

Guluronat oder heteropolymere Regionen mit einem „Zufallsarrangement“ von Monomeren

gebildet werden (s. Abb. 2.16).

O

-OOC OH

O OO

HO

-OOC OH

O O

HO

OH-OOC

OO

HO

-OOC OH

O

O

O OH

-OOC

OH

O

O

OH

OH

-OOC

O

OOH

-OOC

OH

O

O

OH

OH

-OOC

O

O

O OH

-OOC

OH

O

-OOC OH

OO

O

OH

OH

-OOC

OO

HO

OH-OOC

O

Abb. 2.17: Struktur der verschiedenen Alginatblöcke in einem Alginatmakromolekül

MMM-Block

GGG-Block

GMGM-Block

2 Theorie

36

Diese drei Typen können in einem einzigen Alginatmolekül enthalten sein. Polymannuronat -

Bereiche enthalten diäquatoriale Verknüpfungen und bilden bandartige Strukturen ähnlich

wie Cellulose. Die Gegenwart von negativen Ladungen am C-6 sichert die Löslichkeit des

Polysaccharids. Polyguluronatblöcke sind diaxial verknüpft und bilden Zickzackketten. Die

Struktur ist analog zum Polyuronidpektat, das hauptsächlich für die Geleigenschaft von

Marmelade, Konservierungen und anderen Produkten aus Früchten verantwortlich ist.

Alginat ist ein Polyanion und als solches in der Lage, mit Kationen Wechselwirkungen zu

erzeugen. Wie bei Kationenaustauschern basiert die Selektivität und die Bindungsstärke auf

der Art des Kations und den Eigenschaften des Polymers. Divalente und polyvalente Kationen

werden durch alle Alginattypen fest gebunden und verknüpfen die Polysaccharide zu einer

Gelmatrix. Bereiche des Polysaccharids bilden teilweise starke Chelatkomplexe mit

divalenten Kationen, speziell mit Calcium. Das so genannte „Egg-Box Modell“ (Abb. 2.17)

erklärt diese spezielle Wechselwirkung für Guluronat-Blöcke [Rees, 1972].

Abb. 2.18: Die Chelatisierung von Calcium durch Polyguluronat (Egg-Box Struktur). Die grauen Kugeln stellen die Calciumionen dar [Rees, 1972].

O

O

OH

OHO

O OO

O O

COO

Ca2+

Ca2+

Ca2+

2 Theorie

37

Polyguluronateinheiten bilden mit Calciumionen eine Struktur wie Eier (Ca2+) in einem

Eierkarton (Alginat). Die Calciumionenbindung ist stark, weil zusätzlich zur ionischen

Bindung mit den Carboxylgruppen verschiedene Ring- und Hydroxyl-O-Atome in der Lage

sind, die Kationen zu chelatisieren. Die Polyguluronatbereiche unterscheiden Kationen

aufgrund ihrer Hydratationsvolumina (Ionenradius). Deswegen bindet Polyguluronat

Calciumionen sehr stark und andere divalente Kationen schwächer [Smidsrød und Grasdalen,

1984]. Polyguluronatreiche Alginate bilden feste, aber spröde Gele. Solche, in denen

Polymannuronat oder alternierende Sequenzen vorherrschen, sind elastischer. Für eine

effektive Gelierung ist es wichtig, dass die Guluronatblöcke wenigstens 20

Monomereinheiten lang sind. Die Gelierung basiert auf einer kooperativen Kationenbindung.

Damit dieser Prozess stattfindet, sind Verbindungszonen ausreichender Länge notwendig.

In Braunalgen und A. vinelandii sind alle drei Blockstrukturtypen enthalten [Gacesa, 1988].

Alginate aus P. aeruginosa enthalten kein Polyguluronat [Sherbrock-Cox et al., 1984]. Es ist

noch nicht ganz klar, ob andere Pseudomonaden Alginat mit Guluronatblöcken produzieren.

Osman et al., 1986 fanden nach einer 1H-NMR Untersuchungen Spuren von Polyguluronat in

zwei Pseudomonaden. Es ist schwer, diese Beobachtungen mit den chemischen Daten zu

vergleichen, insbesondere weil diese guluronathaltigen Alginate ein niedriges M/G-Verhältnis

besitzen und somit nur geringe Anteile an G-Blöcken enthalten. Ein anderes Bild zeigt sich

bei einem Alginat, das von Hacking et al. [1983] aus P. mendocina isoliert und analysiert

wurde. Man fand für dieses Polysaccharid ein M/G-Verhältnis von 0,5. Dieser ausgewogene

Wert legt die Vermutung nahe, dass hier auch einige Polyguluronatblöcke enthalten sein

können. Zusammenfassend kann man sagen, dass Alginat aus P. aeruginosa keine

Polyguluronatblöcke enthält, aber andere Pseudomonaden davon abweichende Alginate

produzieren können.

2 Theorie

38

2.8.4 Eigenschaften von Alginaten

Die physikalischen Eigenschaften von Alginaten entsprechen in charakteristischer Weise

denen eines hochmolekularen Polyanions. Lösungen von Natriumalginaten sind hochviskos

und die Makromoleküle „binden“ Wasser und geladene Moleküle.

Alginat fällt aus, wenn der pH-Wert niedriger ist als die pKa-Werte der

Uronsäurekomponenten. Der pKa-Wert für D-Mannuronat beträgt 3,38 und der für L-

Guluronat 3,65 [Haug und Larsen, 1961]. Obwohl die pKa-Werte für die Uronsäuren im

Polymer leicht unterschiedlich sind, sind sie annährend identisch mit denen der Monomeren

[Haug et al., 1967]. Polymannuronat- und Polyguluronatblöcke können durch Mineralsäuren

partiell hydrolysiert und anschließend durch selektive Fällung bei pH 2,85 fraktioniert werden

[Haug et al., 1967].

Die Monomerzusammensetzung und der O-Acetyl-Gruppengehalt sind hauptsächlich

verantwortlich für das Ionisierungsverhalten der bakteriellen Alginate [Delben et al., 1982].

O-Acetylgruppen modifizieren die Ionisierungseigenschaften der Polysaccharide. Die O-

Acetylgruppen haben drastische Auswirkungen auf die Eigenschaften der Alginate. Dies zeigt

sich besonders deutlich bei den Charakteristika der Gelbildung und den Eigenschaften der

daraus resultierenden Gele. Demnach ist klar, dass die Polysaccharidsubstitution ein

Haupteinflussfaktor auf die chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der

Alginate ist.

2.8.5 Molekülgrößen der Alginate

Obwohl es allgemein bekannt ist, dass Alginate große Makromoleküle sind, ist es schwer, ihre

Molekulargröße zu bestimmen. Polysaccharide sind polydispers, deshalb enthält eine

Alginatextrakt keine Alginate einer einzigen Molekülgröße. Außerdem werden zur Extraktion

und Reinigung von Alginaten Methoden eingesetzt, die diese teilweise abbauen. Trotzdem

wurden viele Versuche zur Molekülgrößenbestimmung besonders an Alginaten aus P.

aeruginosa durchgeführt. Donnan und Rose (1950) fanden, dass die intrinsische Viskosität

von Algenalginaten direkt proportional zu ihrer Molekülgröße ist. Diese Methode wurde dann

verwendet, um die Molekülgrößen von Alginaten aus mucoiden P. aeruginosa Stämmen zu

bestimmen. Diese Polysaccharide wurden von Patienten mit chronischen Krankheiten

2 Theorie

39

einschließlich cystischer Fibrose isoliert. Es wurden Molmassen zwischen 120000 g/mol und

480000 g/mol gefunden.

Bei Alginatlösungen verringert sich durch Bearbeitung und Lagerung die Molmasse. So

wurde bei Alginaten aus P. aeruginosa-Isolaten durch bestimmte Lagerungs- und

Verarbeitungsbedingungen eine partielle Depolymerisation festgestellt. Dieses Phänomen

wurde von Swann, 1970 auch bei anderen Polysacchariden beobachtet. Ein weiteres Problem

bei der Lagerung von Alginaten stellt die Gegenwart von alginatabbauenden Enzymen

(Lyasen) dar. Es ist bekannt, dass 60% der mucoiden P. aeruginosa Stämme eine

polymannuronsäurespezifische Lyase produzieren [Dunne und Buckmire, 1985]. Russel und

Gacesa bestimmten die Molmassen von Alginaten aus P. aeruginosa [Russel und Gacesa,

1989]. Sie fanden Werte von 28.000 g/mol bis zu 1.550.000 g/mol, wobei mehr als die Hälfte

der Proben in einem Bereich von 277.000 bis 885.000 lagen. Diese Alginate wurden auch auf

eine Lyaseaktivität hin untersucht, es wurde jedoch keine detektiert.

Die Größenbestimmung der Makromoleküle ist immer mit Schwierigkeiten verbunden, nicht

zuletzt wegen des Risikos der Scherkraftzerstörung der Moleküle während des

Reinigungsprozesses. Die Molmasse sollte durch mehrere Methoden bestimmt werden.

Hierfür bieten sich u.a. die Methoden der dynamischen Lichtstreuung, die

Gelpermeationschromatographie und die Ultrazentrifugation an.

2.8.6 Eigenschaften von Alginatgelen

Praktisch alle Alginate bilden in Gegenwart von divalenten oder polyvalenten Kationen,

unabhängig von der Blockstruktur der Polysaccharide, Gele. Die einzige Ausnahme dieser

Regel sind Proben, in denen ein extensiver Abbau der Alginate stattgefunden hat.

Alginat aus P. aeruginosa enthält keine Polyguluronatanteile, deshalb sind die Gele aus den

Polysacchariden dieses Organismus flexibel und elastisch. Alginatlösungen aus P.

aeruginosa-Alginaten bilden ein Gel bei einer Ca2+-Konzentration von 3 mM Ca2+ [Haug und

Larsen, 1971]. Govan und Harris (1986) haben gezeigt, dass Kulturen mucoider P.

aeruginosa gelartige Mikrokolonien bilden, wenn sie bei dieser Calciumionenkonzentration

wachsen. Diese Konzentration wurde gewählt, weil man das schleimbildende Verhalten in

den Lungen von Patienten mit cystischer Fibrose untersuchen wollte. Man findet ein ca. 3mM

Ca2+-Konzentration in der extrazellulären Flüssigkeit eines solchen Patienten [Case, 1984]. Es

handelt sich hierbei um eine sinnvolle, weitgehend akzeptierte Abschätzung. Daher ist klar,

2 Theorie

40

dass vermutlich ausreichend Calcium in der CF-Lunge ist, um sicherzustellen, dass das

Alginat mucoider P. aeruginosa Stämme gelieren wird.

Eine signifikante Eigenschaft von Algenalginaten ist die heteropolymere Zufallsblockstruktur.

Studien haben gezeigt, dass ein Überwiegen von statistischen Blockstrukturen zu Gelen führt,

die in der Lage sind, große Mengen von Wasser zu binden [Smidsrød, 1974]. Die

Wasserbindung in ionischen Gelen wird durch zwei Hauptfaktoren bestimmt. Der positive

osmotische Druck, der sich durch Mischung von Gegenionen mit Wasser ergibt, wird

ausgeglichen durch die begrenzte Elastizität der Gelnetzwerke [Skjåk-Bræk et al., 1989b].

Folglich sind die Hydrophilie und die Flexibilität der Ketten, genauso wie die Zahl der

Verknüpfungsstellen, dafür verantwortlich, wie viel Wasser von Alginatgelen gebunden

werden kann.

3 Material

41

Kapitel 3

Material

3.1 Bakterien

Für diese Arbeit wurden unterschiedliche Pseudomonaden verwendet. Zum einen ein

mucoides Isolat von P. aeruginosa aus dem Sputum eines CF-Patienten, der Stamm FRD1

(Ohman und Chakrabarty, 1981). Aus diesem Stamm wurden zwei Mutanten entwickelt. Der

Stamm FRD1152 besitzt eine Mutation im algF2-Gen, er hat einen Defekt in der O-

Acetylierung von Alginat (Franklin und Ohman, 1993). Der Stamm FRD1153 besitzt eine

Mutation im algJ3-Gen, die ebenfalls zu einem Defekt in der O-Acetylierung von Alginat

führt. Aus einem Fleischzerlegebetrieb wurde ebenfalls ein mucoides Isolat erhalten, der

Stamm SG81 (Grobe, 1995)

Die Stammhaltung erfolgte auf Pseudomonas-Isolierungs-Agar (siehe 3.2). Nach jeweils vier

Wochen wurden die Stämme auf neue Nährplatten geimpft.

3 Material

42

3.2 Nährmedium

Es wurde Pseudomonas-Isolierungs-Agar (PIA) zur Anzucht und Stammhaltung der

Bakterien verwendet.

Zusammensetzung:

20g Bacto-Pepton, 1,4g MgCl2, 10g K2SO4, 0,025g Irgasan DP-300, 13,6g Bacto-Agar

(Ciba-Geigy), 2g Glycerin (Merck)

45g des Fertiggranulats (Difco) wurden in 998 mL destilliertem Wasser gelöst und mit 2g

Glycerin (Merck) versetzt.

Die Nährmedien wurden 20min bei 120°C autoklaviert, zu je 20 mL in Petrischalen gegossen

und bei 4°C aufbewahrt (max. 4 Wochen).

3.3 Polysaccharide

a) Algenalginat: Manucol LB, Natrium-Salz, aus Braunalgen (ISP Alginates)

b)Bakterienalginate: gewonnen auf Kulturen von:

Pseudomonas aeruginosa FRD1

Pseudomonas aeruginosa FRD1152

Pseudomonas aeruginosa FRD1153

Pseudomonas aeruginosa SG81

(gereinigt nach Wingender et al., 2001 siehe auch 4.2.2)

3 Material

43

3.4 Lösungen und Puffersysteme

physiologische Kochsalzlösung (0,14 mol/L NaCl-Lösung)

8,18 g Natriumchlorid (Merck) wurden mit destilliertem Wasser auf 1000 mL aufgefüllt und

portionsweise autoklaviert.

Tris-HCl-Puffer

Für den 0,05 mol/L Tris-HCl-Puffer wurden 6,06 g Tris(hydroxyl)-aminomethan eingewogen,

zu 2/3 auf 1000mL aufgefüllt. Der jeweilige pH-Wert (7,2 bzw. 7,5) wurde mit 25%iger

Salzsäure eingestellt und anschließend die Lösung bis 1000 mL aufgefüllt. Die Puffer wurden

20 min bei 121°C autoklaviert und bei 4°C aufbewahrt.

Natriumacetatpuffer

Für den 1 mmol/L Natriumacetatpuffer wurden 82,03 mg Natriumacetat eingewogen und zu

2/3 auf 1000 mL mit destilliertem Wasser aufgefüllt. Der pH-Wert (4,5) wurde mit 1 mol/L

Salzsäure eingestellt und anschließend die Lösung bis 1000 mL aufgefüllt. Der Puffer wurde

20 min bei 121°C autoklaviert.

3.5 Chemikalien

NaOH p.A. Fluka

Salzsäure konz. Merck

Ethanol reinst DAB Merck

Ethanol absolut Riedel-de Haen

Diethylether Riedel-de Haen

CaCl2·2H2O p.A. Fluka

Pyridin p.A. Riedel-de Haen

Essigsäureanhydrid p.A. Merck

Titriplex III p.A.(Ethylendiamintetraessigsäure-di-Natriumsalz) Merck

Natriumazid p.A. Merck

MnCl2·4H2O p.A. J. T. Baker

3 Material

44

NaCl p.A. Riedel-de Haen

Sicapent mit Indikator Merck

Hydroxylamin-Hydrochlorid Sigma

FeCl3·6H2O Fluka

Acetylcholinchlorid Fluka

Sulfaminsäure (Amidoschwefelsäure) Sigma

KOH Riedel-de Haen

Natriumtetraborat·10H2O Fluka

H2SO4 konz. p.A. Merck

m-Hydroxybiphenyl(3-Phenolphenol), 90% Sigma

D2O 98% Sigma

KBr p.A. Riedel-de Haen

Glycerin p.A. Merck

Tris(hydroxymethyl)aminomethan Merck

Natriumacetat p.A. Merck

Enzyme

Alginatlyase aus Flavobakterium multivolum Sigma (A-6973)

Proteinase K aus Tritirachium album Sigma (P-6556)

Benzonase, Reinheitsgrad 1 aus Serratia mavescens Merck (101694)

4 Methoden

45

Kapitel 4

Methoden

4.1 Biochemisch-präparative Methoden

4.1.1 Reinigung von kommerziellen Algenalginaten Das Natriumalginat wird in destilliertem Wasser mit einer Konzentration von 20 g/L gelöst

und 1h bei 4000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird nochmals 1h bei 4000 rpm

zentrifugiert. Der dabei erhaltene Überstand wird über Nacht gegen zweimal 5 L destilliertes

Wasser dialysiert (Visking Dialyseschlauch, Serva Heidelberg, Deutschland; Molmassen-

ausschlussgrenze 12.000-14.000 g/mol) und anschließend lyophilisiert.

4.1.2 Milde saure Hydrolyse von Alginaten Die verschiedenen gereinigten Alginate werden mit destilliertem Wasser versetzt, bis eine

homogene Lösung entsteht. Anschließend wird die Lösung mit 0,3 mol/L auf einen pH-Wert

von 3,0 eingestellt. Das Substrat wird nun für 30-60 Minuten hydrolysiert, abgekühlt und mit

Natronlauge 0,3 mol/L neutralisiert, gegen zweimal 5 L destilliertes Wasser dialysiert

(Visking Dialyseschlauch, Serva Heidelberg, Deutschland; Molmassenauschlussgrenze

12.000-14.000 g/mol) und lyophilisiert.

4 Methoden

46

4.1.3 Saure Hydrolyse von Alginaten 2 g der verschiedenen gereinigten Alginate werden in 200 mL destilliertem Wasser gelöst.

Die Lösung wird mit verdünnter Salzsäure auf eine Konzentration von 0,3 mol/L HCl

eingestellt und bei 100°C für 30 Minuten hydrolysiert. Nach dem Abkühlen wird mit 1 mol/L

Natronlauge neutralisiert und über Nacht gegen zweimal 5 L destilliertes Wasser dialysiert

(Visking Dialyseschlauch, Serva Heidelberg, Deutschland; Molmassenauschlussgrenze

12.000-14.000 g/mol) und lyophilisiert.

4.1.4 Fraktionierung von Alginaten (modifiziert nach Haug et al., 1974)

Das gereinigte Alginat wird mit 20 Teilen 0,3 mol/L Salzsäure bei 100 °C hydrolysiert. Nach

20 min wird die Lösung vom unlöslichen Material durch Filtration befreit, neutralisiert und

durch Eindampfen aufkonzentriert. Die Lösung wird gegen dest. Wasser dialysiert und das

Oligosaccharid durch Gefriertrocknung isoliert. Man erhält die so genannte MG-Fraktion.

Das verbleibende unlösliche Material wird in frischer 0,3 mol/L Salzsäure suspendiert und die

Hydrolyse wird für weitere 20 h fortgesetzt. Die Suspension wird filtriert und die gewonnene

Lösung wird verworfen. Das unlösliche Material wird in dest. Wasser suspendiert und durch

Zugabe von Natronlauge gelöst. Die Lösung wurde gegen dest. Wasser dialysiert, das

Volumen wird auf 0,5% Alginat eingestellt, Natriumchlorid wird zugegeben bis 0,1 mol/L .

Diese Lösung wird mit ungefähr gleichen Volumenteilen 0,025 mol/L Salzsäure versetzt, bis

sich ein pH-Wert von 2,85 einstellt. Die resultierende Suspension wird zentrifugiert, das

unlösliche Material wird in dest. Wasser suspendiert und beide Fraktionen werden

neutralisiert und dialysiert. Die beiden Fraktionen werden isoliert durch Fällung mit eiskaltem

Ethanol (Eiswasserbad), gewaschen mit eiskaltem Ethanol und Ether und schließlich

getrocknet. Die getrockneten Fraktionen werden in wenig dest. Wasser gelöst, dialysiert

(Visking Dialyseschlauch, Serva Heidelberg, Deutschland; Molmassenauschlussgrenze

12.000-14.000 g/mol) und gefriergetrocknet. (M-Fraktion: löslich bei pH 2,85 und G-

Fraktion: unlöslich bei pH 2,85.

4 Methoden

47

4.1.5 Chemische Acetylierung von Algenalginat (modifiziert nach Skjåk-Bræk et al., 1988)

250 mL der gereinigten Algenalginatlösung werden unter Rühren mit Hilfe einer

Injektionskanüle in 500 mL 0,1 mol/L CaCl2-Lösung getropft. Die dabei entstehenden

Calciumalginatperlen werden über Nacht bei 4°C in der CaCl2-Lösung gelagert. Nach

Dekantierung der überstehenden Lösung wurden die Alginatperlen mit 250 mL Pyridin

versetzt und bei Raumtemperatur 22 h stehengelassen. Nach Entfernen des Pyridins wurden

die Alginatperlen mit 250 mL einer Mischung aus Pyridin und Essigsäureanhydrid

(Mischungsverhältnis 1:1) überschichtet. Die Mischung wurde über einem 40°C temperiertem

Wasserbad 2,5 h gerührt. Nach Beendigung der Reaktionszeit wurde das Pyridin-Essigsäure-

anhydrid-Gemisch entfernt und die Perlen wurden dreimal mit 250 mL Aceton und dreimal

mit 250 mL destilliertem Wasser gewaschen. Die Alginatperlen wurden unter Rühren in

250 mL 0,05mol/L Na2EDTA gelöst. Die Lösungen wurden 24h gegen zweimal 5 L

0,1 mol/L NaCl, anschließend 24h gegen zweimal 5 L destilliertem Wasser dialysiert

(Visking Dialyseschlauch, Serva Heidelberg, Deutschland; Molmassenauschlussgrenze

12.000-14.000 g/mol) und zum Abschluss lyophilisiert.

4.1.6 Chemische Deacetylierung von bakteriellen Alginaten (modifiziert nach Evans und Linker, 1973)

250 mg der jeweiligen gereinigten Alginate werden in 50 mL destilliertem Wasser gelöst und

mit 25 mL 0,3 mol/L NaOH versetzt. Der Ansatz wird für 2 h bei Raumtemperatur gerührt.

Nach der Inkubation wurde das Substrat neutralisiert, über Nacht gegen zweimal 5 L

destilliertes Wasser dialysiert (Visking Dialyseschlauch, Serva Heidelberg, Deutschland;

Molmassenauschlussgrenze 12.000-14.000 g/mol) und anschließend lyophilisiert.

4 Methoden

48

4.1.7 Enzymatischer Abbau von Alginaten Enzymlösung

Alginatlyase aus Flavobakterium multivolum mit 1 mg/mL in Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) lösen.

Alginatlösung

400 mg greinigtes Alginat (nach 4.1.1) in 50 mL Tris-HCl-Puffer pH 7,5 lösen.

Die Alginatlösung wurde auf 37°C temperiert und unter Rühren 5 mL der Enzymlösung

zugegeben (Verhältnis 10:1). In mehreren Zeitintervallen ( 3min bis 48h ) wurden jeweils 4

mL der Lösung abgenommen. Die Enzymreaktion in der entnommen Probe wurde durch

erhitzen (10 Minuten) in einem 80°C heißen Wasserbad gestoppt. Die so erhaltenen Lösungen

wurden abgekühlt und am SEC-Malls vermessen (s.4.3.5).

4.1.8 Fällung von Alginaten durch Calcium- und Manganionen Die Fällung der Alginate erfolgte nach der von Lee et al. 1996 beschriebenen Methode. Für

die Kationenlösungen wurden CaCl2x2H2O und MnCl2x4H2O der Firma VWR International

GmbH, Darmstadt verwendet. Die Salze wurden in destilliertem Wasser gelöst und

verschiedene Konzentrationen bis zu 0,3 mol/L eingestellt. In sterilen Zentrifugenröhrchen

(PP) wurden 8 mL der jeweiligen Alginatlösung (Konzentration 4 mg/mL in dest. Wasser)

vorgelegt. Anschließend wurden 2 mL der Salzlösung dazugetropft. Die Lösungen wurden

mit dem Reagenzglasschüttler gut durchgemischt und 20 h bei 20°C stehengelassen.

Anschließend wurden die Proben bei 40.000xg bzw. 15.000xg für eine Stunde bei 10°C

zentrifugiert und der Überstand abdekantiert. Die Alginatkonzentration im Überstand wurde

durch den modifizierten Sulfamat/m-Hydroxydiphenyl-Assay von Filisetti-Cozzi und Carpita

(s. 4.3.2) bestimmt. Als Standard wurden gereinigte Alginate eingesetzt. Die Menge des

gefällten Alginats wurde zurückgerechnet aus der Menge des Alginats im Überstand und der

ursprünglich eingesetzten Alginatmenge.

4 Methoden

49

4.2 Mikrobiologische Methoden

4.2.1 Stammhaltung der Bakterien Die Stammhaltung von P. aeruginosa FRD1, FRD1152, FRD1153 und SG81 erfolgte auf

Pseudomonas-Isolierungsagar (PIA). Die Überimpfung auf frische Agar-Nährmedien erfolgte

alle drei bis vier Wochen. Dazu wurden Einzelkolonieausstriche jeweils für 24 h bei 36°C

bebrütet. Die Lagerung der Kulturen erfolgte bei 4°C im Kühlschrank.

4.2.2 Reinigung von bakteriellen Alginaten (modifiziert nach Wingender et al., 2001)

Mucoide Einzelkolonien von Übernachtkulturen auf PIA von P. aeruginosa SG81, FRD1 und

FRD1152 werden jeweils in 10 mL 0,14 mol/L NaCl-Lösung mit einer Zelldichte von 2·108

Zellen mL-1 suspendiert. Auf PIA-Platten werden jeweils 0,1 mL dieser Suspension

ausplattiert. Nach Bebrütung der Platten für 24 h bei 36°C wird der konfluente

Bakterienbewuchs von jeweils 8 Platten vorsichtig mit einem Metallspatel abgenommen, in

100 mL steriler 0,14 mol/L NaCl-Lösung suspendiert und unter Rühren bei Raumtemperatur

30 min homogenisiert. Die Suspension wird 2h bei 40000 x g (10°C) zentrifugiert. Die

Überstände wurden anschließend durch Celluloseacetat-Membranfilter (0,2µm Porengröße,

pyrogenfrei Sartorius, Minisart) filtriert. Die so erhaltenen EPS-haltigen Lösungen werden

unter Rühren mit der dreifachen Menge eiskaltem, vergällten Ethanol versetzt und 30 min im

Eisbad gerührt. Die entstandenen Präzipitate werden über eine Nutsche filtriert und auf der

Nutsche zweimal mit eiskaltem Ethanol und anschließend einmal mit eiskaltem absoluten

Ethanol gewaschen. Die Präzipitate werden fünf Tage im Vakuum-Exsikkator über P2O5

getrocknet, wobei das P2O5 täglich gewechselt wurde.

Die trockenen Rohpräparate wurden in sterilem 50 mmol/L Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 in einer

Konzentration von 2,5 mg/mL gelöst. Nach Zugabe von MgCl2 (Endkonzentration 2 mmol/L)

und 5U/mL Benzonase (Merck, Reinheitsgrad 1, 25 U/µL) wird der Ansatz 4 h bei 36°C

inkubiert. Nach Zugabe frisch hergestellter sterilfiltrierter Proteinase K-Lösung (Sigma, aus

Tritirachium album, 11,6 U/mg; gelöst in 50 mmol/L Tris-HCl-Puffer pH 7,5;

Endkonzentration 5 µg/mL) wurde weitere 24 h bei 36°C inkubiert und anschließend bei

20.000xg für 30 min bei 10°C zentrifugiert.

4 Methoden

50

Der erhaltene Überstand wurde zweimal gegen 5 L destilliertes Wasser für 24 h dialysiert

(Visking Dialyseschlauch, Serva Heidelberg, Deutschland; Molmassenauschlussgrenze

12.000-14.000 g/mol) und anschließend lyophilisiert.

4.2.3 Isolierung der EPS Mit Hilfe eines Metallspatels wurde der konfluente Bakterienrasen von ca. 20 Platten

vorsichtig abgeerntet und in einem Gewichtsverhältnis von 1:16 in destilliertem Wasser

suspendiert. Die Bakteriensuspension wurde im Anschluss 2h bei 10°C und 40.000xg

zentrifugiert, der Überstand dekantiert und durch Celluloseacetat-Membranfilter (0,2 µm

Porengröße, pyrogenfrei) steril filtriert. Zur Abtrennung niedermolekularer Verbindungen

wurde die EPS-Lösung über Nacht zweimal gegen 5L einionisiertes Wasser dialysiert

(Visking Dialyseschlauch, Serva Heidelberg, Deutschland; Molmassenauschlussgrenze

12.000-14.000 g/mol) und anschließend lyophilisiert.

4 Methoden

51

4.3 Chemisch-analytische Methoden

4.3.1 Bestimmung von Acetylgruppen (Hestrin, 1949)

Lösung 1:

1 Volumen 2mol/L Hydroxylamin in dest. Wasser + 1 Volumen 3,5 mol/L NaOH

(vor Gebrauch frisch ansetzen)

Lösung 2:

37%ige HCl, 1:3 mit dest. Wasser verdünnt

Lösung 3:

0,37 mol FeCl3 x 6 H2O ( c=0,1 mol/L)

Standard:

5 mmol Acetylcholinchlorid (Sigma) in Natriumacetat-Puffer (c=0,001 mol/L, pH 4,5)

1 mL Alginatlösung (2 mg/mL) in 0,001 mol/L Natriumacetat-Puffer, pH 4,5, wurde mit 2

mL Lösung 1 vermischt. Nach 1 min Inkubation bei Raumtemperatur erfolgte die Zugabe von

Lösung 2. Nach kurzem Durchmischen wurde 1 mL Lösung 3 zugesetzt und sofort die

Absorption bei 540 nm gegen einen Leerwert, der anstelle der Probe A dest. Wasser enthielt,

gemessen.

4 Methoden

52

4.3.2 Bestimmung von Uronsäuren (Filisetti-Cozzi und Carpita, 1991)

Lösung 1: 4 mol/L Sulfaminsäure in destilliertem Wasser mit gesättigter KOH-Lösung

(0,792 g/mL destilliertes Wasser) aus pH 1,6 eingestellt

Lösung 2: 0,075 mol/L Natriumtetraborat-Decahydrat in konz. H2SO4

Lösung 3: 0,15% m-Hydroxybiphenyl in 0,5%iger NaOH-Lösung

Standard: 200 µg gereinigtes Alginat (Manucol LB, FRD1, FRD1153, SG81) in 1mL

destilliertem Wasser

Zu 0,4 mL Probe bzw. destilliertem Wasser (Blindwert) werden jeweils 40 µL Lösung 1

pipettiert und durchgemischt. Dann werden 2,4 mL Lösung 2 hinzu gegeben und

durchgemischt. Die Ansätze werden für 20 min bei 100°C im Wasserbad erhitzt und

anschließend 5 min im Eisbad abgekühlt. Es werden 80 µL Lösung 3 hinzu gegeben und die

Proben gut durchgemischt. Nach weiteren 10 min bei Raumtemperatur wird die Absorption

aller Ansätze bei 525 nm im Photometer gegen destilliertes Wasser gemessen. Die Proben

werden dreifach angesetzt.

4 Methoden

53

4.4 Physikalisch-analytische Methoden

4.4.1 NMR-Analyse der teilweise abgebauten Alginate

Die Proben wurden in D2O bei pD 7,0 gelöst (75mg/ml). Die 13C-NMR Spektren wurden mit

einem DRX 500 NMR-Spektrometer mit 64K x 1024 Datenpunkten, einer spektralen Weite

von 32680Hz, einem 90° Puls und einer Wartezeit von 2,5 s zwischen den Pulsen

aufgenommen.

Die Deuteriumresonanz wurde als „field-frequency-lock“ verwendet. Die Temperatur im

Messkopf betrug 60°C, um die Viskosität der Probe zu verringern und somit einer

Linienverbreiterung vorzubeugen.

Die Spektren wurden entkoppelt ohne NOE aufgenommen, d.h. ein Reversed Gated-

Decoupling-Experiment wurde durchgeführt. Bei diesem Experiment ist der 1H-BB-

Entkoppler nur während des Radiofrequenzpulses und der Datenaufnahme im 13C-Kanal

eingeschaltet.

Die aufgenommenen Spektren wurden mit Hilfe des Bruker 1D-Win-NMR Programmes

ausgewertet.

Die chemische Verschiebung wird sowohl von der Position des 13C-Atoms im C-6-Ring als

auch von der Sequenz der Monomereinheiten (ME) α-L-Guluronat (G) und β-D-Mannuronat

(M) bestimmt. Da die Resonanzlinien von der vorangehenden bzw. folgenden

Monomereinheit abhängig sind, können pro Position im C-6-Ring theoretisch insgesamt acht

Triadenresonanzlinien unterschieden werden. Mit Kenntnis der zugehörigen chemischen

Verschiebungen ist es möglich, die Signale in einem 13C-NMR-Spektrum einer bestimmten

Triadensequenz zuzuordnen.

Grasdalen et al. haben Algenalginatspektren aufgenommen und die Signale zugeordnet

[Grasdalen et al., 1981]. Die Zuweisung der Signale erfolgte durch Referenzen zu

Spektraldaten für Alginatfraktionen, durch Doppelresonanzexperimente, durch Änderung von

pD und durch Verwendung von Proben unterschiedlicher bekannter chemischer

Zusammensetzung und unterschiedlichen Graden der Polymerisation [Grasdalen et al., 1981].

4 Methoden

54

M G

Abb. 4.1:M-Monomereinheit eines Alginats mit R = H, COCH3 , G-Monomereinheit eines Alginats

Die Signale der einzelnen Kohlenstoffatome C-1 bis C-6 (s. Abb. 4.1) erscheinen bei

unterschiedlichen chemischen Verschiebungen und spalten aufgrund unterschiedlicher

Nachbarn in der Copolymerkette auf. Die C-1 Resonanzen lieferten die Möglichkeit alle 8

Triadensequenzen zuzuordnen. In den C-6 Resonanzen waren MMM und GGG

unterscheidbar, in den C-4 und C-5 Resonanzsignalen des Mannuronates konnten alle vier

Triaden mit M als Zentralatom zugeordnet werden (MMG, MMM, GMM und GMG).

Die Zuordnung erfolgte mit Hilfe des Bruker 1-D Win-NMR-Programmes. Die

Integralgrenzen wurden manuell eingegeben, für jedes Triadensignal jeweils 5-mal unter

leichter Variation der Integralgrenzen. Anschließend wurden die durchschnittlichen

Integralgrenzen und die durchschnittlichen relativen Intensitäten dieser Signale ermittelt. Die

relativen Integralintensitäten wurden normiert.

Es gilt:

FM + FG = 1 (4.1)

daraus folgt:

FMMM + FMMG + FGMM + FMGM + FGGG + FGGM + FMGG + FGMG =1 (4.1a)

Das Verhältnis von Mannuronsäure zu Guluronsäure (M/G-Verhältnis) ermittelt man mit:

FM = FMMM + FMMG + FGMM + FGMG

FG = FGGG + FGGM + FMGG + FMGM

nach:

G

M

FF

GM

= (4.2)

O

R O

O R

O

O C O O-6

5

4

3 2

1

O

OH

O

OH

O

COO-

6

5

4

3

21

4 Methoden

55

Aus den Triadensequenzverteilungen ließen sich die Diadensequenzverteilungen berechnen:

FMM = FMMM + FGMM

FMG = FMMG + FGMG (4.3)

FGG und FGM erhält man durch Ersetzen der Indices M durch G.

4.4.2 Berechnung einer statistischen Verteilung der Triade aus dem M/G-

Verhältnis

Aus den unter 4.3.1 ermittelten Werten für das Mannuronat/Guluronat-Verhältnis lassen sich

unter Einbeziehung einer einfachen Statistik Wahrscheinlichkeiten für die Häufigkeit

einzelner Triaden in den Alginaten bestimmen. Die Berechnungen erfolgten auf Grundlage

des statistischen Modells von Bernoulli („ultimate model“). Es berücksichtigt den Einfluss der

letzten Monomereinheit am Ende der wachsenden Kette beim Anlagerungsschritt einer neuen

Einheit.

Die Berechnung dieser Zahlenwerte kann der Abbildung 4.2 entnommen werden.

M G

p(M) p(G)

MM MG GG

p(M)·p(M) 2·p(M)·p(G) p(G)·p(G)

MMM MMG MGM GMG GGM GGG

p(M)·p(M)·p(M) 2·p(M)·p(M)·p(G) p(M)·p(G)·p(M) p(G)·p(M)·p(G) 2·p(G)·p(G)·p(M) p(G)·p(G)·p(G)

wobei p(M)=F(M) aus Gl.4.1 und p(G)=F(G) aus Gl.4.1 Abb. 4.2: Ermittlung der Wahrscheinlichkeiten von Diaden und Triaden aus dem M/G-Verhältnis.

4 Methoden

56

4.4.3 Infrarotspektroskopie von Alginaten Es wurden verschiedene Alginate, wie gereinigtes Manucol LB, acetyliertes Manucol LB und

bakterielles Alginat aus P.aeruginosa SG81 vermessen. Hierzu wurden 10 mg über P2O5 im

Exsikkator getrocknetes Alginat mit 20 mg KBr in einem Achat-Mörser feinst vermahlen und

unter Druck zu KBr-Presslingen (Schichtdicken ca. 1mm) verarbeitet. Mit Hilfe eines FT-IR-

Spektrometers (FT-F 155 Spektrometer der Firma BioRad, Krefeld) erfolgte die Aufnahme

von IR-Spektren im Wellenzahlbereich von 4000 cm-1 bis 400 cm-1.

4.4.4 Viskosimetrie von Alginaten Die Viskosität von Alginaten wurde mit Hilfe eines Ostwaldviskosimeters im Vergleich zum

verwendeten Lösungsmittel bei 20 °C bestimmt.

Bestimmung des mittleren Molekulargewichtes von Alginaten

Für die Bestimmung des mittleren Molekulargewichts werden verschieden konzentrierte

Alginatlösungen in 0,1 mol/L NaCl hergestellt. Die Proben werden im Viskosimeter 5 min bei

20°C temperiert, anschließend werden die Durchflusszeiten ermittelt. Es werden mindestens

fünf Messwerte pro Probe ermittelt. Die spezifische und die reduzierte Viskosität werden mit

Hilfe der Durchflusszeiten berechnet:

spezifische Viskosität reduzierte Viskosität

l

lpspez t

tt −=η (4.4)

cspez

red

ηη = (4.5)

ηspez: spezifische Viskosität ηred: reduzierte Viskosität tl : Durchlauf des Lösungsmittels (s) c : Alginatkonzentration (g/100mL) tp : Durchlaufzeit der Probe (s)

Durch Extrapolation der reduzierten Viskosität gegen die Konzentration der Alginate auf 0

g/100mL wird die intrinsische Viskosität [η] ermittelt. Mit Hilfe der Mark-Houwink-

Beziehung und den Konstanten K und α wurde das mittlere Molekulargewicht errechnet

[Smidsrød, 1970].

4 Methoden

57

Mark-Houwink-Beziehung:

[η]=K x Mα (4.6)

[η]: intrinsische Viskosität (100 mL/g) M: mittleres Molekulargewicht K: 2,0x105 α: 1,0

Weiterhin wurde mit Hilfe der intrinsischen Viskosität nach Donnan und Rose [1950] der

Polymerisationsgrad der Alginate bestimmt. Unter der Annahme, dass ein Uronsäurebaustein

ein durchschnittliches Molekulargewicht von 200 besitzt, wurde damit das mittlere

Molekulargewicht des Alginats bestimmt. [McDowell, 1977]

Gleichung nach Donnan und Rose D.P.= [η] x 58 (4.7) D.P.: Polymerisationsgrad [η] : intrinsische Viskosität (100 mL/g)

4.4.5 Dichtemessungen Die Dichtemessungen erfolgten mittels einer digitalen Dichtemesseinrichtung für

Flüssigkeiten und Gase (Dichtemesser DMA 60/Messzelle DMA 602). Die

Dichtebestimmung mit dieser Apparatur beruht auf der Messung der Schwingungsdauer einer

mit der Messflüssigkeit gefüllten oder von der Messflüssigkeit durchströmten

Biegeschwingers in Form eines schwingenden U-Rohres. Die Dichtemessungen wurden für

die Ermittlung der Viskosität benötigt, aus diesem Grunde wurde zur Dichtebestimmung die

gleiche Temperatur eingestellt wie bei der Viskositätsmessung. Das Gerät wird kalibriert,

indem die Schwingungsdauer für Luft und für destilliertes Wasser gemessen wird. Diese

beiden Messwerte liegen als Literaturwerte vor. Aus den Messwerten und den Literaturwerten

wird eine Apparatekonstante K ermittelt. Danach wurden die Alginatlösungen vermessen.

Für jede Messung wurde das U-Rohr mit ca 1 mL der entsprechenden Probe gefüllt. Das

Einbringen der Probe in den Schwinger erfolgte mittels einer Injektionsspritze. Nach dem

Temperaturangleich wurde der Schwingwert für die Probe abgelesen. Die Messungen wurden

für jede Probe fünfmal wiederholt.

4 Methoden

58

Es gilt für die Ermittlung von K:

Luft2

OH2

LuftOH

TTK

2

2

−

−=

ρρ (4.8)

Für die Dichte der Probe gilt:

)TT(K 2OH

2obePrOHobePr 22

−+= ρρ (4.9)

obePrρ : Dichte der Probe bei der Temperatur T [g/cm3]

OH2ρ : Dichte von destilliertem Wasser bei der Temperatur T [g/cm3]

obePrT : Schwingungsdauer der zu untersuchenden Flüssigkeit bei T

OH2T : Schwingungsdauer von destilliertem Wasser bei T

4.4.6 Bestimmung der Viskosität von Alginatproben in Gegenwart von Calcium-

und Manganionen

Die Viskositäten der verschiedenen Alginatlösungen wurden mit einem Ostwald-

Viskosimeter gemessen. Dazu wurden 5 mL der zu untersuchenden Flüssigkeit über einen

Trichter mit einer G2-Fritte in das Viskosimeter gegeben. Dann wurde die Flüssigkeit bis über

die erste Marke angesaugt und die Zeit gemessen, in der der Flüssigkeitsmeniskus beim

Zurückfließen von Marke 1 bis zur Marke 2 fällt. Die Messungen wurden bei 25°C

durchgeführt.

Die Viskosimeterkonstante wurde berechnet nach:

tC 25

OH

25OH

2

2

⋅=

ρ

η (4.10)

mit: t : mittlere Durchlaufzeit; 25OH2

ρ = 0,997g/cm3; 25OH 2

η =899,85µPa·s

Die Viskosität η kann dann nach folgender Gleichung berechnet werden:

tC ⋅⋅= ρη (4.11)

mit: C: Viskosimeterkonstante t: Durchlaufzeit ρ : Dichte der Lösung

4 Methoden

59

4.4.7 Leitfähigkeitstitration von Alginatlösungen gegen Calcium- und Manganionen Von den verschiedenen Alginaten werden je 150mg in 100mL Wasser gelöst und gegen 0,1

mol/L Calciumchlorid und Manganchloridlösung titriert. Die jeweiligen Leitwerte werden

gegen die zugetropfte Konzentration der Kationen aufgetragen. Durch diesen Graphen werden

Ausgleichsgeraden gelegt und somit die Diskontinuität ( ∞→2

2

dcd λ ) (Äquivalenzpunkt) und

die Steigungen der Geraden bestimmt.

4.4.8 Bestimmung der Molmasse von Alginaten mit SEC-Malls Die Lösungen wurden in einer SEC-Malls Anlage untersucht. Die SEC-Einheit der Anlage

besteht aus drei Säulen. Eine Vorsäule (Knauer Säulen, Einlassfilter A0109) soll das

Eindringen von sehr großen Partikeln in die beiden eigentlichen SEC-Säulen verhindert. Bei

den SEC-Säulen handelt es sich um eine „PSS SUPREMA linear XL“, Partikelgröße 20µm

und eine „PSS SUPREMA 100“, Partikelgröße 10µm. Das Streulichtphotometer ist ein Dawn

F der Firma Wyatt Technology. Bei der eingesetzten Glaszelle handelt es sich um eine K5

Durchflusszelle. Hinter der Streulichteinheit ist noch ein Differentialrefraktometer geschaltet

hierbei handelt es sich um ein Optilab Multiref 902b der Firma Wyatt Technology.

Die aufgezeichneten Daten wurden ausgewertet mit dem „Astra for Windows 4.90.07 QELSS

2.xx.Ink“ der Firma Wyatt Technology ausgewertet.

Mit Hilfe der GPC wurden die zwei verschiedenen Möglichkeiten für den Abbau des Alginats

getestet. Im Rahmen der ersten Versuchsreihe wurde das Algenalginat Manucol LB mit Hilfe

der sauren Hydrolyse abgebaut. Es wurden verschieden Hydrolysezeiten von 30 min bis zu

48h getestet. Die zweite Versuchreihe beinhaltet den enzymatischen Abbau mit einer

kommerziell erwerblichen Alginatlyase. Hier wurden die Inkubationszeiten in einem

Zeitfenster von 3 min bis 48h variiert.

Zusätzlich wurden SEC-Malls Analysen der Mannuronat-, der Guluronat-, der MG-Fraktion

und der bakteriellen EPS durchgeführt.

200 mg des getrockneten Alginats der jeweiligen Hydrolysestufe wurden in einen 25mL-

Kolben überführt. Der Kolben wird mit einer 0,5 molaren Tris-Lösung aufgefüllt und die

Probe gelöst.

4 Methoden

60

Nach einer Betriebsdauer des Lasers von mindestens einer Stunde und einer entsprechenden

Durchspülzeit mit filtrierter entgaster 0,5 molarer Tris-Lösung kann die Probe an der SEC-

Malls Apparatur vermessen werden. Die Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase beträgt

1mL/min.

Die Probe wurde, um eine möglichst vollständige Füllung der 100µL Probenschleife des

Injektors zu erreichen, im Überschuss zugegeben und zur nochmaligen Reinigung über einen

Sterilfilter (0,2µm Porengröße) filtriert. Die Probenmenge betrug 8g/L und die injizierte

Menge damit 8·10-4g. Es wurden für jede Probe mindestens 3 Wiederholungsmessungen

durchgeführt.

5 Ergebnisse

61

Kapitel 5

Ergebnisse

5.1 Charakterisierung des Algenalginats Manucol LB Bei Manucol LB handelt es sich um ein kommerziell erwerbliches Natriumalginat der Firma

ISP Alginates (U.K.) Ltd, das aus Braunalgen gewonnen wird. Das Manucol LB wird in

pharmazeutischer Qualität hergestellt und z.B. Antaziden zugesetzt. Es ist ein hellbraunes

Pulver mit einem relativ geringen Guluronatanteil. Seine Lösungen sind im Vergleich zu

anderen Alginaten niedrigviskos.

5.1.1 Fraktionierung des Algenalginats Manucol LB Das Alginat setzt sich zusammen aus den Monomeren α-L-Mannuronat und β-D-Guluronat,

und entlang eines Alginatpolymerstranges findet man homopolymere und alternierende

Bereiche. Die fraktionierende Hydrolyse ermöglicht die Isolierung alternierender und

homopolymerer Bereiche der Alginatkette (s. Kapitel 4.1.4). Hierzu wurde gereinigtes

Manucol LB in (10mg/mL) 0.3mol/L Salzsäure suspendiert und erst einmal 0,5 h

hydrolysiert. Die Suspension wurde heiß filtriert. Der Rückstand der Filtration wurde erneut

in 0,3 mol/L Salzsäure über Nacht (19h) hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde erneut filtriert

und der Rückstand neutralisiert, wobei eine klare Lösung entstand. Diese Lösung wurde

solange mit NaOH behandelt, bis sich ein pH-Wert von 2,85 einstellte. Hierbei entstand

erneut eine Suspension. Der Feststoff wurde durch Zentrifugation abgetrennt und enthält die

5 Ergebnisse

62

guluronatreiche Fraktion (G-Fraktion). Der Überstand enthält die mannuronatreiche Fraktion

(M-Fraktion).

Von der M-Fraktion und der G-Fraktion wurden jeweils 75 mg/mL in D2O gelöst und 13C-

NMR spektroskopisch untersucht. Die so gewonnenen Spektren wiesen beide 6 deutlich

getrennte Linien auf, wie es aufgrund der unterschiedlichen Kohlenstoffatome im Monomeren

erwartet wurde. Die Zuordnung der Signale erfolgte wie von Grasdalen et al. beschrieben und

kann den Abbildungen 5.1 und 5.2 entnommen werden.

Abb. 5.1: Mannuronatfraktion mit sechs klar unterscheidbaren Linien für die jeweiligen Kohlenstoffatome

Abb. 5.2: Guluronatfraktion mit sechs klar unterscheidbaren Linien für die jeweiligen Kohlenstoffatome

(ppm)60708090100110120130140150160170180190

M-6

M-1 M-4, M-5

M-3, M-2

(ppm)60708090100110120130140150160170180190

G-6

G-1 G-4G-3

G-5,G-2

5 Ergebnisse

63

Die jeweiligen chemischen Verschiebungen der Signale wurden mit THF als externen

Standard relativiert und sind in Tabelle 5.1 aufgeführt (SDBS, Integrated Spectral Data Base

System for organic compounds).

Tab. 5.1: Chemische Verschiebungen der Mannuronat- und Guluronatkohlenstoffe in wässriger Lösung. Die Signale wurden mit THF als Standard bei 68,00 ppm relativiert [Quelle: SDBS-Datenbank]

C-Atom Mannuronat

(ppm)

Guluronat

(ppm)

1 101,29 101,89

2 71,19 66,31

3 72,60 70,31

4 79,19 81,17

5 77,19 68,44

6 176,02 176,21

Eine weitere Charakterisierung der Fraktionen erfolgte durch die SEC-Malls Analyse (s.

Kapitel 4.4.8). Hierzu wurden die jeweiligen Alginate in Tris-HCl-Puffer pH 7,2 gelöst und

vermessen. In Abb. 5.4 und 5.5 sind die Ergebnisse der Messungen vom Streulichtphotometer

(Detektor 11) und Differentialrefraktometer (RI) aufgeführt.

0,29

0,30

0,31

0,32

0,33

0,34

0 5 10 15 20 25

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

Det

ekto

r 11

(Vol

t)

Guluronatfraktion

RI (

Vol

t)

Volumen (mL)

Abb. 5.3: SEC-Malls der Guluronatfraktion

5 Ergebnisse

64

0 5 10 15 20 25

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

0,29

0,30

0,31

0,32

0,33

0,34

RI (

Vol

t)

Volumen (mL)

Det

ekto

r 11

(Vol

t) Mannuronatfraktion

Abb. 5.4: SEC-MALLS der Mannuronatfraktion

Die Daten, die mit der SEC-Malls Methode gewonnen werden konnten, wurden für die

Ermittlung der Molmassen der einzelnen Fraktionen verwendet (s. Tab.5.2).

Eine weitere Methode, die molare Masse von Makromolekülen zu bestimmen, ist die

Viskosimetrie (s.4.4.4). Nach der Mark-Houwink-Beziehung (Gl. 4.6) ist es möglich, die

Molmasse von Makromolekülen über die Ermittlung der intrinsischen Viskosität zu

extrapolieren. In den folgenden Graphen ist die reduzierte Viskosität gegen die Konzentration

g/100mL aufgetragen. Die Extrapolation der Werte für die reduzierte Viskosität gegen die

Konzentration Null liefert die intrinsische Viskosität. Dieser Wert wird in die Mark-Houwink-

Beziehung (s. Kap. 4 Gl. 4.6) eingesetzt und die Gleichung nach der Molmasse aufgelöst. Die

so bestimmten Molmassen sind mit den aus der SEC-Malls Methode ermittelten Daten in

Tabelle 5.2 aufgeführt.

5 Ergebnisse

65

0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

0,180

0,182

0,184

0,186

0,188

0,190

0,192

0,194

0,196

0,198

0,200

redu

zier

te V

isko

sitä

t

Konzentration [g/100mL]

Abb. 5.5: Auftragung der reduzierten Viskosität gegen die Konzentration g/100mL. Der Achsenabschnitt liefert die intrinsische Viskosität hier am Beispiel Polymannuronat

Tab. 5.2: Molare Massen der beiden homopolymeren Fraktionen

Alginat intrinsische

Viskosität

molare Masse [g/mol]

aus Viskosimetrie

molare Masse (Mn)

[g/mol] aus SEC-Malls

Mannuronat 0,174 8675 10220

Guluronat 0,169 8450 9986

Zur weiteren Charakterisierung der beiden Fraktionen wurden FT-IR-Spektren aufgezeichnet.

Hierzu wurden einige mg des getrockneten Alginats mit KBr verrieben und anschließend

Presslinge hergestellt. Diese Presslinge wurden im FT-IR-Spektrometer der Firma BioRad

vermessen (s. Kapitel 4.4.3). Der hier abgebildete Bereich entspricht dem gemessenen

Wellenzahlenbereich von 4000 bis 500 cm-1.

5 Ergebnisse

66

3500 300 0 2 500 2000 150 0 1 000 50020

30

40

50

60

70

80 M -Fraktion

Tran

smis

sion

sgra

d (in

%)

W ellenzahl (cm -1)

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

20

30

40

50

60G-Fraktion

Tran

smis

sion

sgra

d (in

%)

W ellenzahl (cm -1)

Abb. 5.6 FT-IR-Spektren der M-Fraktion und der G-Fraktion

5 Ergebnisse

67

5.1.2 Milde saure Hydrolyse des Algenalginats Manucol LB Zunächst einmal sollten die von Grasdalen et al. 1986 publizierten Ergebnisse reproduziert

werden. Hierfür wurde das kommerziell erwerbliche Algenalginat Manucol LB gereinigt (s.

Kapitel 4.1.1), in dest. Wasser gelöst (10 mg/mL) und die Lösung mit 1 mol/L Salzsäure auf

einen pH-Wert von 3,0 eingestellt (s. Kapitel 4.1.2). Die entstandene Suspension wurde bei

100°C hydrolysiert und nach Vorschrift aufgearbeitet.

Aus dem so gewonnenen Alginat wurde eine Lösung mit 75mg/mL in D2O angesetzt und ein

hochauflösendes 13C-NMR-Spektrum bei 60°C aufgezeichnet. Die Zuordnung und

Bezeichnung der einzelnen Resonanzsignale, z.B. M-1 oder G-6, wurde von Grasdalen et al.

übernommen. Es handelte sich bei M-1 um das Signal einer Mannuronateinheit, das dem

Kohlenstoffatom an der C-1-Position im glykosidischen C-6-Ring zugeordnet wird. Die

Nummerierung der C-1 bis C-6 wurde bereits unter Kapitel 4.4.1, Abb. 4.1 eingeführt. Bei

dem G-6-Signal handelte es sich um das Resonanzsignal des C-6-Atoms einer Guluronat-

einheit. Im Folgenden wurden auch Bezeichnungen wie z.B. C-1 verwendet. Hierbei handelte

es sich um die Resonanzsignale des C-1-Atoms von Mannuronat- und Guluronat-Einheiten.

Die Zuweisung der jeweiligen Positionen im glykosidischen Ring ist in den folgenden

Abbildungen dargestellt. Die C-6-Peaks liegen bei ca. 180 ppm und stammen von der

Carboxyl-Gruppe der jeweiligen Monomerbausteine. Bei ca. 101,5 ppm bis 100,5 ppm findet

man die Signale für die anomeren Kohlenstoffatome in der C-1-Position des jeweiligen

glykosidischen Rings. Die Signale der übrigen Kohlenstoffatome erscheinen im

Resonanzbereich von 81,5 bis 68,4 ppm.

5 Ergebnisse

68

(ppm)

708090100110120130140150160170180190

Abb. 5.7: 13C-NMR-Spektrum von Manucol LB nach 0,5 h Hydrolyse in D2O

Weil die Signale gerade im Bereich von 101 bis 62 ppm sehr dicht beieinander liegen, wurde

dieser Bereich gesondert in Abbildung 5.8 dargestellt.

(ppm)646872768084889296100104108

Abb. 5.8: Ausschnitt des 13C-NMR Spektrums von Manucol LB nach 0,5 h Hydrolyse

Carboxyl-Resonanzen C-6-Position

Anomere C-1-Position

übrige Kohlenstoffresonanzen

C-1 (M u. G)

G-4M-4

M-5

M-3;M-2; G-3

G-5

G-2

5 Ergebnisse

69

Eine weitere Vergrößerung einzelner Teilbereiche des Spektrums zeigt deutlich die

Feinstruktur der Signale. Grasdalen et al. [1981] haben diese einzelnen Signale zugeordnet.

Für die anomeren Kohlenstoffe an der C-1-Position, ca. 103-100 ppm, können acht Signale

zugeordnet werden. Diese Signale erhält man aus dem kompletten Satz von acht

Triadensequenzen. Es handelt sich hierbei um die verschiedenen Möglichkeiten, die beiden

Monomerbausteine Mannuronat (M) und Guluronat (G) zu Dreiersequenzen, so genannten

Triaden, zu kombinieren. Das jeweilige Signal stammt vom Zentralmonomeren M oder G, das

abhängig von den Nachbarn zur Rechten und zur Linken ein Signal bei bestimmter

chemischer Verschiebung aufweist. Die Zuordnung zu den jeweiligen Triaden ist in

Abbildung 5.9 dargestellt.

(ppm)100,2100,6101,0101,4101,8102,2102,6103,0103,4

MMG

GMG

MGG/GGG

MMM

GMM

GGM

MGM

Abb. 5.9: Zuordnung der Triadensequenzen im Bereich der anomeren Kohlenstoffe

Die C-1 Resonanzen liefern als einzige den kompletten Satz der Triadensequenz. Die übrigen

C-Atome der beiden Monomereinheiten ermöglichen lediglich die Zuordnung einzelner

Triadenkombinationen. Die Carboxylresonanzen enthalten zwei Signale, die von den

homomolekularen MMM und GGG Sequenzen stammen (Abb. 5.10). Mit den C-4(M) und C-

5(M) Signalen existiert eine weitere Möglichkeit, die Häufigkeit der Kombinationen der

Monomerbausteine M und G mit M als Zentralmolekül zu bestimmen. Die Zuordnung in den

Spektren ist in Abb. 5.11 dargestellt.

5 Ergebnisse

70

MMM

GGG

(ppm)173174175176177178179

Abb. 5.10: Zuordnung einzelner Triadensequenzen im Resonanzbereich der Carboxyl-Signale

MMG MMM

GMMGMG

GMM

MMMGMG

MMG

(ppm)76,077,078,079,080,0

Abb. 5.11: Zuordnung einzelner Triadensequenzen im Resonanzbereich der C-4(M)- und C-5(M)-Signale

übrige Kombinationen

C-4(M) C-5(M)

5 Ergebnisse

71

Die genauen Verschiebungswerte für die einzelnen Signale wurden mit Hilfe von THF

normiert (s. Tabelle 5.3)

Tab. 5.3: Zuordnung der Signale zu einzelnen Triaden in 13C-NMR-Spektren vom Algenalginat Manucol LB*

MMM MMG GMM GMG MGM MGG GGM GGG

C-1 101,3 102,5 101,2 102,4 100,7 102,0 100,8 101,9

C-4 79,2 79,5 78,7 78,7

C-5 77,3 76,9 77,6 77,2

C-6 176,1 176,4

*Die chemischen Verschiebungen, in ppm, sind normiert gegen THF (68,00 ppm u. 25,77

ppm) (Resonanzsignale THF aus SDBS-Datenbank).

Tab. 5.4: Chemische Verschiebungen (in ppm) der restlichen Signale, die nicht einzelnen Triaden zugeordnet werden können

C-6 177,0-176,6

G-5 68,9-68,5

G-4 81,2

G-3 70,6

M-3 73,0-72,5

G-2 66,3-65,8

M-2 71,9 u. 71,25

5 Ergebnisse

72

5.1.3 Ermittlung der optimalen Hydrolysezeit Die Dauer der Hydrolyse bestimmt das Molekulargewicht des Alginats. Es gilt, die

Alginatmoleküle so wenig wie möglich zu spalten, aber trotzdem eine geringviskose,

hochkonzentrierte Lösung für die NMR-Spektroskopie zu erhalten. Aus diesem Grunde

wurde die Hydrolysezeit variiert. Das Manucol LB wurde 30 Min, 2h und 4h hydrolysiert.

Von den aufgearbeiteten Hydrolysaten wurde hochauflösende 13C-NMR-Spektren

aufgenommen. Löst man nun die einzelnen Signale in den drei verschiedenen Spektren auf,

erkennt man, dass sich das Spektrum während der Hydrolyse verändert. Wie die Veränderung

aussieht, soll am Beispiel der anomeren Kohlenstoffe an der C-1-Position gezeigt werden.

(Abb. 5.12). Die Resonanzsignale der C-6, C-5 und C-4 Kohlenstoffe werden im Anhang

unter A.7 und A.8 gezeigt. Auch in diesen Bereichen wurde eine Veränderung detektiert. Die

kürzeren Ketten der stärker hydrolysierten Alginaten bewirken ein besseres Signal-zu-

Rausch-Verhältnis, die Einzelsignale spalten sich aber auf und erschweren damit die

Zuordnung zu den unterschiedlichen Triadensequenzen.

(ppm)100,6101,4102,2103,0

(ppm)100,6101,4102,2103,0

Abb. 5.12: C-1 Resonanzen bei unterschiedlichen Hydrolysezeiten

5 Ergebnisse

73

Das Verhältnis der Signale zueinander wird verschoben. Die Peaks MMG/GMG,

MMM/GMM und GGM/MGM der C-1 Resonanzen sind nach 30 min Hydrolyse annähernd

gleich groß. Nach vier Stunden Hydrolyse ist die größte Signalgruppe die der MMG/GMG

Triaden, die der MMM/GMM und GGM/MGM Triaden hat um ca. 30% abgenommen. Die

Signale der MGG/GGG Triade verändern sich während der Hydrolyse kaum.

Die Signale im Bereich der Resonanzen für die Kohlenstoffpositionen C-6, C-1, C-4 (M) und

C-5 (M) wurden zugeordnet. Im nächsten Schritt erfolgte die Bestimmung der relativen

Intensitäten dieser Signale durch Integration (s. Kapitel 4.3.1). Die Grenzen der Integrale

wurden für jedes Signal manuell eingegeben. Dies wurde, um eine höhere Genauigkeit zu

erreichen, jeweils 5 mal durchgeführt, dabei wurden die Integralgrenzen leicht variiert. Die

erhaltenen Werte für die Integrationsgrenzen und die relativen Integrale wurden gemittelt. Die

relativen Intensitäten der einzelnen Triadensignale wurden gemäß Gleichung 4.1 (Kapitel

4.1.3) normiert und lieferten dann die Verteilung der Triadensequenzen des Alginats. Mit

Gleichung 4.2 konnte das M/G-Verhältnis berechnet werden.

Es wurden Werte von 1,43 (59%/41%) nach 30 min, 1,34 (57%/43%) nach 2h und 1,46

(59%/41%) nach 4h Hydrolyse gefunden. Diese Ergebnisse sind der Tabelle 5.3 zu

entnehmen. Aus den ermittelten Triadensequenzverteilungen lassen sich durch Addition der

einzelnen Werte nach Einsetzen in Gl. 4.3 aus Kapitel 4.3.1 die Diadensequenzverteilungen

berechnen. Diese Werte sind auch in Tabelle 5.3 aufgeführt.

Mit den wie oben beschrieben berechneten M/G-Verhältnissen ließen sich gemäß der in

Kapitel 4.3.2 unter 4.4 aufgeführten Gleichungen die statistischen Verteilungen der

Diadensequenzen berechnen. Grundlage für diese berechneten Verteilungen waren die

statistischen Aussagen von Bernoulli. Demnach ist die Anlagerung eines Monomers in eine

Copolymerkette unabhängig von der Art der vorherigen Monomereinheit.

5 Ergebnisse

74

Tab. 5.5: Verteilung der Diaden- und Triadensequenzen in Manucol LB, die roten Werte sind die statistisch berechneten

Hydrolyse-

rate FMM

FMG

FGM FGG FMMM

FMMG

FGMM FGMG FMGM

FGGM

FMGG FGGG M/G

0,5 h 0.29

0,35

0,27

0,24

0,15

0,17

0,14

0,20

0,30

0,28

0,15

0,10

0,18

0,14

0,16

0,20

0,07

0,07

1,43

59%/41%

2 h 0,30

0,30

0,27

0,25

0,17

0,18

0,15

0,18

0,30

0,28

0,12

0,10

0,19

0,14

0,14

0,21

0,09

0,08

1,34

57%/43%

4 h 0,28

0,35

0,28

0,24

0,15

0,17

0,15

0,20

0,20

0,28

0,20

0,10

0,26

0,14

0,07

0,20

0,13

0,07

1,46

59%/41%

MMM MMG MGM GGM GMG GGG0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0,5 h Hydrolyse

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

MMM MMG MGM GGM GMG GGG0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

2 h Hydrolyse

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

MMM MMG MGM GGM GMG GGG0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

4 h Hydrolyse

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

Abb. 5.13: Verteilung der einzelnen Triadenbausteine im Algenalginat Manucol LB, die Säulen sind die experimentell ermittelten Daten, die Punkte die statistischen Werte

5 Ergebnisse

75

Der hydrolytische Abbau des Algenalginats Manucol LB wurde mit Hilfe der SEC-Malls

Methode für verschiedene Hydrolysezeiten untersucht (s. Kapitel 4.4.8). Das Manucol wurde

bis zu 48 h hydrolysiert und nach Vorschrift 4.1.3 aufgearbeitet. Das so erhaltene getrocknete

Alginat wurde in Tris-HCl-Puffer gelöst und mit der SEC-Malls-Anlage analysiert. In der

folgenden Abbildung (5.14) wurde das mittlere Retentionsvolumen, das in direkter

Abhängigkeit zur Molmasse steht, gegen die jeweilige Hydrolysedauer aufgetragen. Durch

die Datenpunkte wurde eine klassische exponentielle Zerfallsfunktion gelegt.

0 10 20 30 40 50

15,0

15,5

16,0

16,5

17,0

17,5

18,0

mitt

lere

s Ret

entio

nsvo

lum

en

Zeit (h)

FIT exponentieller Zerfallsaure Hydrolyse

Abb. 5.14: Abbau des Algenalginats Manucol LB durch saure Hydrolyse mit Salzsäure

Neben der sauren Hydrolyse existiert eine weitere Möglichkeit, die Makromoleküle

abzubauen. Es handelt sich hierbei um den enzymatischen Abbau mit Hilfe einer

Alginatlyase. Die hier eingesetzte Lyase ist kommerziell erwerblich (Sigma) und wurde vom

Flavobakterium sp. isoliert. Das Manucol LB wurde in Tris-HCl-Puffer gelöst und bei 36°C

mit verdünnter Lyaselösung versetzt. Nach verschiedenen Bebrütungszeiten wurde der Abbau

durch das Erhitzen der Lösung auf über 80°C unterbrochen. Die Alginatlösungen wurden

dialysiert und lyophilisiert. Anschließend wurden die Proben für die SEC-Malls-Analyse

präpariert. In der folgenden Abbildung (Abb. 5.15) wurde, wie beim hydrolytischen Abbau,

das mittlere Retentionsvolumen gegen die Bebrütungszeit aufgetragen. Die Messwerte

wurden korreliert mit einer klassischen exponentiellen Zerfallsfunktion.

5 Ergebnisse

76

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

15,0

15,5

16,0

16,5

17,0

17,5

18,0

FIT exponentieller Zerfallenzymatischer Abbau

mitt

lere

s R

eten

tions

volu

men

Zeit (min)

Abb. 5.15: Enzymatischer Abbau des Algenalginats Manucol LB

5 Ergebnisse

77

5.2 Acetylierung des Algenalginats Manucol LB

Bei bakteriellen Alginaten können die C-2 und/oder C-3 Positionen acetyliert sein. Um nun

im Vorfeld den Einfluss der Acetylgruppen auf die Eigenschaften der Alginate zu

untersuchen, wurde das Algenalginat Manucol LB chemisch acetyliert.

Diese Acetylierung wurde bereits von Skjåk-Bræk (1988) beschrieben. Die dort beschriebene

Methode wurde leicht modifiziert und am Manucol LB angewendet (s. Kapitel 4.1.5). Ob im

Versuchsverlauf eine Acetylierung stattgefunden hat, wurde mit Hilfe von FT-IR

Spektroskopie überprüft. Die beiden folgenden Spektren (Abb. 5.16 und Abb. 5.17) wurden

vom unbehandelten und chemisch acetyliertem Manucol LB aufgenommen. Man sieht sehr

deutlich die Veränderung der Signale im Bereich 1740 cm-1 und 1250 cm-1. Signale in diesen

Bereichen werden den C-O-Streckschwingungen der Acetylgruppen zugeordnet.

3500 3000 2500 2000 1500 1000 50025

30

35

40

45

50

55

60

Tran

smis

sion

sgra

d (in

%)

Wellenzahl (cm-1)

Manucol LB gereinigt

Abb. 5.16: FT-IR-Spektrum des gereinigten Algenalginats Manucol LB

5 Ergebnisse

78

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60acetyliertes Manucol LB

Tran

smis

sion

sgra

d (in

%)

Wellenzahl (cm-1)

Abb. 5.17: FT-IR-Spektrum des chemisch acetylierten Algenalginats Manucol LB

Zur weiteren Charakterisierung der beiden Alginate (acetyliert und unbehandelt) wurden die

Molmassen über die intrinsische Viskosität ermittelt (s. Kapitel 4.3.3). Hier wird, wie bereits

in Abschnitt 5.1.1 beschrieben, die reduzierte Viskosität der Alginate für jede

Verdünnungsreihe gegen die Konzentration aufgetragen (Abb. 5.18 und 5.19). Die

Extrapolation auf die Konzentration 0 liefert dann als Ordinatenabschnitt den Wert der

intrinsischen Viskosität.

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,01,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

2,8

3,0gereinigtes Manucol LB

redu

zier

te V

isko

sitä

t (10

0mL/

mg)

Konzentration (g/100mL)

Abb. 5.18: Verdünnungsreihe des gereinigten Alginats

1740

cm

-1

1250

cm

-1

5 Ergebnisse

79

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,01,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0 acetyliertes Alginat

redu

zier

te V

isko

sität

(100

mL/

g)

Konzentration (g/100mL)

Abb. 5.19: Verdünnungsreihe des acetylierten Alginats

Unter Verwendung der Mark-Houwink-Beziehung (mit K= 2.0 .10-5 und α=1.0; s. Gleichung

4.6) wurden die in Tabelle 5.6 aufgeführten Werte für die mittleren Molmassen der Alginate

berechnet. Aus der Gleichung nach Donnan und Rose [1950] (s. Gleichung 4.7) wurde der

Polymerisationsgrad berechnet, diese Werte sind ebenfalls der Tabelle 5.6 zu entnehmen.

Tab. 5.6: Mittlere Molmassen der verschiedenen Alginate ermittelt aus den jeweiligen intrinsischen Viskositäten

Alginat η mittl. Molmasse (g/mol)

D.P.

gereinigtes Alginat 1.477 73874 85,7

acetyliertes Alginat 1.452 72614 84,2

hydrolysiertes Alginat 0.613 30606 36,6

hydrol., acetyl. Alginat 0.791 36766 45,9

Die molaren Massen der beiden nicht abgebauten Alginate wurden mit der SEC-Malls-

Methode und weiterhin durch Ultrazentrifugation ermittelt. Die SEC-Malls Methode lieferte

Werte von 61171g/mol für das Manucol LB und 60243g/mol für das acetylierte Alginat.

Durch Ultrazentrifugation konnten Molmassen von ca. 60000g/mol ermittelt werden für beide

Alginate (mündliche Aussage von Andrea Straatmann).

5 Ergebnisse

80

Abschließend wurde ein hochauflösendes 13C-NMR-Spektrum des 1h nach Kapitel 4.1.3

hydrolysierten, acetylierten Alginats aufgenommen (Abb. 5.20). Man sieht sehr deutlich die

den Acetylgruppen zugeordneten Signale im Carboxylgruppenbereich und das CH3-Signal.

Desweiteren erkennt man, dass im Bereich der anomeren und der übrigen Kohlenstoffe die

Anzahl der Signale im Spektrum zugenommen hat. Eine eindeutige Triadenzuordnung ist in

diesem Spektrum nicht mehr möglich.

(ppm)

2030405060708090100170180

Abb. 5. 20: 13C-NMR-Spektrum des acetylierten Manucol LB

Carboxylgr. der Acetylgr.

CH3- der Acetylgr.

5 Ergebnisse

81

5.3 Wechselwirkungen von Algenalginat und acetyliertem Alginat mit Mangan und Calcium

5.3.1 Wechselwirkungen der homopolymeren Fraktionen mit Mangan Ein wesentliches Merkmal der Alginate ist ihre Fähigkeit, mit zweiwertigen Kationen Gele zu

bilden. Mit Calciumionen bilden sich besonders stabile Gele aus. Diese Gele können sogar

sehr spröde sein, wenn das Alginat hohe Guluronatanteile besitzt. In den folgenden

Versuchsreihen wurde mit Calcium und für die NMR-Untersuchung mit Mangan gearbeitet.

Das paramagnetische Mangan wurde als Sonde für die Wechselwirkungen zweiwertiger

Kationen mit dem Polyanion Alginat eingesetzt. Zunächst einmal wurde das Verhalten von

Mangan gegenüber den homopolymeren Fraktionen getestet.

Abb. 5.21 zeigt zwei Spektren der M-Fraktion, das obere ohne Zusatz von Mangan und das

untere bei einer Mangankonzentration von 0,75 mmol/L.

708090100170180[ ]

(ppm )708090100170180

[ ]

Abb. 5.21: Hochauflösende 13C-NMR-Spektren der Mannuronatfraktion aus Manucol LB ohne Zusatz von Kationen (oben) und in 0,75 mmol/L Mn2+-Lösung

M-Fraktion

M-Fraktion in 0,75 mmol/L Mn2+

M-6 M-1 M-4

M-5

M-3

M-2

5 Ergebnisse

82

Die gesamten Konzentrationsreihen der beiden homopolymeren Fraktionen werden in Abb.

5.22 und 5.23 gezeigt. Hier wurden die jeweiligen Habwertsbreiten der Kohlenstoffe des

glykosidischen Ringes als Funktion der Konzentration aufgetragen.

00.3

0.50.75

1

2

3

4

5

6

0

50

100

150

200

250

Abb. 5.22: Veränderung der Halbwertsbreiten der Signale im 13C-NMR-Spektrum der M-Fraktion mit zunehmender Mangankonzentration

00.3

0.50.75

1

2

34

56

0

50

100

150

200

250

Abb. 5.23: Veränderung der Halbwertsbreiten der Signale im 13C-NMR-Spektrum der G-Fraktion mit zunehmender Mangankonzentration

Kohlenstoffposition

Konzentration (mmol/L)

Hal

lbw

erts

brei

te (H

z)

M-Fraktion

Hal

lbw

erts

brei

te (H

z)

Konzentration (mmol/L)

Kohlenstoffposition

G-Fraktion

5 Ergebnisse

83

5.3.2 Wechselwirkungen des Algenalginats und des acetylierten Alginats mit Mangan Hierzu wurde das Alginat nach Abschnitt 4.1.1 gereinigt und nach Abschnitt 4.1.3

hydrolysiert und weiter aufgearbeitet. Es wurde eine Konzentrationsreihe mit

unterschiedlichen Mangankonzentration angesetzt und hochauflösende NMR-Spektren

aufgezeichnet. In Abb. 5.24 sind die kompletten Spektren dargestellt. Zur besseren Übersicht

wurde auch hier der Bereich zwischen 160 ppm und 110 ppm ausgeschnitten und der Bereich

zwischen 110 ppm und 60 ppm vergrößert.

708090100170180

708090100170180(ppm )

708090100170180

Abb. 5.24: Gesamtalginatspektren Manucol LB mit zunehmender Mangankonzentration (0;0,3mmo/L und 0,75mmol/L)

0,3 mmol/L Mn2+

0,75 mmol/L Mn2+

C-1 GGM MGM

M-5 G-2

C-6

C-6

C-6

G-5

5 Ergebnisse

84

In Abb 5.24 kann man die Auswirkungen der Manganzugabe auf das gesamte Spektrum

nachvollziehen. Man sieht hier wie bei den beiden homopolymeren Fraktionen, dass nur

einige Signale in Wechselwirkung mit den Manganionen treten und aus diesem Grunde

verbreitert werden. Die stärkste Wechselwirkung erfolgt an den C-6 Kohlenstoffen; die C-1

Resonanzlinien werden teilweise beeinflusst. Der genaue Einfluss auf die C-1 Resonanzen mit

zunehmender Mangankonzentration ist in Abb. 5.25 dargestellt.

1 0 0 , 01 0 1 ,01 0 2 ,01 0 3 ,0

1 0 0 ,01 0 1 , 01 0 2 , 01 0 3 ,0

( p p m )1 0 0 ,01 0 1 ,01 0 2 ,01 0 3 ,0

Abb. 5.25: C-1 Resonanzen des Algenalginats Manucol LB, ohne Zusatz von Kationen (oben), in 0,3 mmol/L Mn2+-Lösung und in 0,75 mmol/L Mn2+-Lösung

Man beobachtet bereits bei einer Mangankonzentration von 0,3 mmol/L den kompletten

Einbruch des Signals für GGM/MGM und eine starke Wechselwirkung mit dem MGG/GGG

Signal. Es gilt festzuhalten, dass die Signale, die Mannuronatmonomere als Zentraleinheit

besitzen nahezu keine Veränderung zeigen. Im Bereich zwischen 84 ppm und 60 ppm

beobachtet man starke Auswirkungen auf das M-5 und G-2 Signal.

0,3 mmol/L Mn2+

0,75 mmol/L Mn2+

MMG GMG

MGG GGG

MMM GMM

MGG MGM

5 Ergebnisse

85

In der nächsten Versuchsreihe wurden die Wechselwirkungen des chemisch acetylierten

Alginats mit Mangan untersucht. Hierzu wurde das Alginat nach Vorschrift 4.1.5 acetyliert

und anschließend nach Vorschrift 4.1.3 hydrolysiert. Das so erhaltene moderat abgebaute

Alginat wurde wiederum eingesetzt, um eine Mangankonzentrationsreihe hochauflösend

NMR-spektroskopisch zu untersuchen. Die gesamten Spektren sind in Abb. 5.26 dargestellt.

20406080100180 170

20406080100170180

( p p m )

20406080100170180

Abb. :5.26: Gesamtalginatspektrum des acetylierten Manucol LB

Carboxylgr. der Acetylgr. C-6

CH3- der Acetylgr.

0,3 mmol/L Mn2+

0,75 mmol/L Mn2+

5 Ergebnisse

86

Das Gesamtalginatspektrum zeigt weniger signifikante Verbreiterungen als das nicht

acetylierte Manucol LB. Die C-6 Resonanzlinien werden verbreitert. Die Carboxyl-

kohlenstoffe der Acetylgruppen zeigen keinerlei Veränderung, genauso wie die Methyl-

Kohlenstoffe, die den Acetylgruppen zugeordnet werden.

Der direkte Vergleich des Manucol LB und des chemisch acetylierten Manucol LB ist am

Beispiel der C-1 Resonanzen in Abbildung 5.27 dargestellt.

(ppm)100,8101,6102,4103,2

MMGGMG

MGGGGG

MMMGMM

GGMMGM

(ppm)102,4103,2104,0104,8

MMGGMG

MGGGGG

MMMGMM

GGMMGM

(ppm)100,8101,6102,4103,2

GGMMGM

(ppm)102,4103,2104,0104,8

GGMMGM

(ppm)100,8101,6102,4103,2

GGMMGM

(ppm)102,4103,2104,0104,8

GGMMGM

Abb. 5.27: Vergleich der C-1 Resonanzen des Manucol LB (unbehandelt und acetyliert) bei verschiedenen Mangankonzentrationen

0,75 mmol/L Mn2+

0,3 mmol/L Mn2+

5 Ergebnisse

87

Im direkten Vergleich der C-1 Resonanzen lässt sich festhalten, dass die Peaks des

acetylierten Manucol LB in dem hier gewählten Mangankonzentrationsbereich weniger stark

beeinflusst werden als die des nicht acetylierten Alginats.

5.3.3 Einfluss von Calcium- und Manganionen auf das Algenalginat und das acetylierte Alginat Zur weiteren Charakterisierung der Wechselwirkung mit zweiwertigen Kationen wurden

Leitfähigkeitstitrationen mit Calcium und Mangan durchgeführt. Hierzu wurden in

Alginatlösungen mit definierten Massenkonzentrationen Lösungen der beiden Kationen-

chloride mit definierten Molmassenkonzentrationen in 0,1 mL Schritten zugetropft und die

jeweiligen Leitfähigkeiten notiert.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

200

400

600

800

1000

1200

Leitf

ähig

keit

(µS/

cm)

CaCl2-Konzentration (mmol/L)

Leitfähigkeitstitration acetyliertes Alginat 1mg/mL

Abb. 5.28: Leitfähigkeitstitration des acetylierten Alginats gegen CaCl2-Lösung

Gemessen wurde die spezifische Leitfähigkeit κ mit einer Leitfähigkeitsmesszelle, die den

Wert von κ sofort angibt. Die Titrationen wurden bei 25°C durchgeführt. Die Leitfähigkeiten

wurden gegen die Konzentration (Mn2+ oder Ca2+) aufgetragen. Anschließend wurden die

Datenpunkte durch lineare Funktionen korreliert. Hierzu wurden die Datensätze von 5

Messkoordinaten verwendet. Die einzelnen linearen Funktionen wurden über ihre Steigungen

5 Ergebnisse

88

miteinander verglichen und die größte Steigungsdifferenz wurde ermittelt. Die Datenpunkte

mit dem größten Sprung in der Steigung lieferten die Äquivalenzpunkte.

Die so ermittelten Punkte sind in Tabelle 5.7 aufgeführt. Zusätzlich wurden in der Tabelle die

jeweiligen Korrelationswerte der Ausgleichsgeraden unter Korrelation FIT; sowie das

Verhältnis der beiden Steigungen der Ausgleichsgeraden unter m2/m1 aufgeführt. Die

Titrationsverläufe der anderen Proben sind im Anhang unter A.1 bis A.3 aufgeführt.

Tab. 5.7: Ergebnisse der Titrationen für 1mg/mL Alginatlösungen gegen Mangan und Calcium

Kation Äquivalenzpunkt

(mmol/L)

Korrelation

FIT

Steigungsverhältnis

m2/m1

Ca2+ 0,17 1.r=0,9990

2. r=0.9996 1,45

acetyliertes Alginat

Ca2+ 0,20 1. r=0,9986

2. r=0,9997 1,66

Mn2+ 0,20 1. r=0,9982

2. r=0,9999 1,38

acetyliertes Alginat

Mn2+ 0,19 1. r=0,9977

2. r=0,9998 1,24

Des weiteren wurden Fällungsexperimente der beiden Alginate mit den Ionen Mangan und

Calcium durchgeführt. In den Abbildungen 5.29 und 5.30 wird die Fällbarkeit der Alginate

durch Calcium und Mangan dargestellt. Hierzu wurden, wie von Lee et al. [1990]

beschrieben, Alginatlösungen angesetzt und mit den Kationen versetzt. Nach Reifung des

Niederschlages über Nacht wurde der Überstand durch Zentrifugation abgetrennt. Die

restliche Alginatkonzentration des Überstandes wurde mit Hilfe des Uronsäuretestes nach

Fillisetti-Cozzi und Carpita [1991] (s. Kapitel 4.3.2) bestimmt. Die so ermittelten Massen

wurden von der Ausgangsmasse subtrahiert. Die Differenz ergab die ausgefällte Masse

Alginat. Diese Massen werden gegen die jeweiligen Kationenkonzentrationen aufgetragen

und man erhält die folgenden Fällungsdiagramme:

5 Ergebnisse

89

0 10 20 30 40 50 600

20

40

60

80

100

Calciumkonzentration (mM)

gefä

lltes

Alg

inat

(%)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Abb. 5.29: Calcium induzierte Fällung von acetyliertem (blau) und nicht acetyliertem (schwarz) Manucol LB

0 10 20 30 40 50 600

10

20

30

40

50

60

70

Mangankonzentration (mM)

gefä

lltes

Alg

inat

(%)

0

20

40

60

Abb. 5.30: Mangan induzierte Fällung von acetyliertem (blau) und nicht acetyliertem

(schwarz) Manucol LB

5 Ergebnisse

90

Abschließend wurde der Einfluss der beiden Ionen (Ca2+ und Mn2+) auf die Viskosität der

Alginatlösungen ermittelt. Hierzu wurden wie in Kapitel 4.3.5 beschrieben, Lösungen der

Alginate mit fünf verschiedenen Ionenkonzentrationen angesetzt und mit einem

Ostwaldviskosimeter die Durchlaufzeiten ermittelt. Zur Berechnung der Viskosität nach

Gleichung 4.11, Kapitel 4.4.6 mussten die Dichten der untersuchten Lösungen bestimmt

werden. Dies geschah nach Kapitel 4.4.5 mit Hilfe eines Dichteschwingers. Abb. 5.31 zeigt

nun die Viskositäten der beiden unterschiedlichen Alginate mit zunehmender Ca2+ bzw.

Mn2+-Konzentration.

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Mangan- bzw. Calciumionenkonzentration (mmol/L)

Visk

ositä

t Pa *

s x 1

0-2

acetyliert, Ca2+ acetyliert, Mn2+ unbehandelt, Ca2+ unbehandelt, Mn2+ Abb. 5.31: Viskositäten Manucol LB (acetyliert und hydrolysiert sowie unbehandelt und

hydrolysiert) in Abhängigkeit von der Mangan- bzw. Calciumionenkonzentration

5 Ergebnisse

91

5.4 Charakterisierung von bakteriellen Alginaten aus P. aeruginosa Stämmen

In dieser Arbeit wurden vier verschiedene bakterielle Alginate untersucht. Diese Alginate

stammen von vier verschiedenen P. aeruginosa Stämmen. Das erste wurde aus einem 24h

alten Biofilm des mucoiden P. aeruginosa SG81 Stammes gewonnen. Es handelt sich hierbei

um eine Umweltisolat aus einem Aufwuchs eines Abflusses in einem Fleischzerlegebetrieb

[Susanne Grobe, 1995].

Beim nächsten Stamm handelt es sich um ein mucoides Isolat von P. aeruginosa aus dem

Sputum eines Patienten mit cystischer Fibrose, dem FRD1 Stamm [Ohman und Chackrabarty,

1981]. Der Stamm FRD1152 besitzt eine Mutation im algF2-Gen, er hat einen Defekt in der

O-Acetylierung von Alginat [Franklin und Ohman, 1993]. Der Stamm FRD1153 besitzt eine

Mutation im algJ3-Gen, die ebenfalls zu einem Defekt in der O-Acetylierung von Alginat

führt [Franklin und Ohman, 1993]. Die Stammhaltung und die Anzucht der Biofilme erfolgte

wie unter 4.2.1 beschrieben. Die Alginate wurden grundsätzlich aus 24h alten Biofilmen mit

konfluentem Plattenbewuchs nach Vorschrift 4.2.2 isoliert und gereinigt.

Vom Alginat aus SG81 wurde ein FT-IR-Spektrum nach Abschnitt 4.4.3 aufgenommen. Abb.

5.31 zeigt dieses Spektrum. Man sieht hier die charakteristischen Signale bei 1740 cm-1 und

1250 cm-1. Diese Signale stammen von den C-O-Streckschwingungen der Acetylgruppen, die

im bakteriellen Alginat enthalten sind.

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

10

20

30

40

50

60

Tran

smis

sion

sgra

d (%

)

Wellenzahl (cm-1)

bakterielles Alginat aus P. aeruginosa SG81

Abb. 5.32: FT-IR Spektrum des Alginats isoliert aus dem Bakterium P. aeruginosa SG81

5 Ergebnisse

92

Von allen Alginaten wurden SEC-Malls Analysen zur Bestimmung der Molmassen

durchgeführt (s. Kapitel 4.4.8). Für die Analysen wurden die EPS der Stämme FRD1 und

FRD1153 nach 4.2.3 gereinigt, in Tris-HCl-Puffer gelöst und nach 4.4.8 analysiert. Die SEC-

Malls Analysen der Alginate aus SG81 und FRD1152 wurden nach einer einstündigen

Hydrolyse (4.1.2) vermessen. Zur Veranschaulichung wurden die Daten des RI-Detektors und

des Streulichtdetektors 11 für das Alginat aus FRD1 in diese Arbeit aufgenommen (Abb.

5.32), die übrigen Analysen sind im Anhang unter A.4 bis A.6 aufgeführt. Die aus den

Analysen bestimmten Molmassen sind in Tabelle 5.8 aufgeführt.

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28-0.0050.0000.0050.0100.0150.0200.0250.0300.035

RI-

Det

ekto

r (V

olt)

Volumen in mL

0.28

0.30

0.32

0.34

0.36

Det

ekto

r 11

Abb. 5.33: SEC-Malls Analyse des bakteriellen Alginats aus P. aeruginosa FRD1

Tab.5.8: Mittlere Molmassen der Alginate aus den verschiedenen P. aeruginosa Stämmen, ermittelt durch SEC-MALLS

M [g/mol] SG81 abgebaut

FRD1 FRD1152 abgebaut

FRD1153

Mn 179 000 1 330 000 209 000 685 000

Mw 190 000 1 450 000 232 000 765 000

Mz 204 000 1 590 000 254 000 843 000

5 Ergebnisse

93

Es ist bekannt, dass sich die Alginate aus den vier verschiedenen Pseudomonaden im

Acetylierungsgrad und in der Molmasse unterscheiden. Da die Molmassen und auch die

Acetylierung die Hydrolysierbarkeit beeinflussen, wurden auch hier Voruntersuchungen zum

Abbauverhalten durchgeführt.

Am Beispiel des Alginats aus dem FRD1 Stamm soll gezeigt werden, wie stark sich die

Acetylgruppen auf die Qualität der NMR-Spektren auswirken. Das Alginat wurde 1h

hydrolysiert. Das obere Spektrum in Abb. 5.34 zeigt dieses Alginat.

Die Abbaubarkeit der Alginate wurde durch den Acetylierungsgrad stark beeinflusst; so

zeigte sich, dass Spektren der Alginate der beiden Mutanten bereits nach 1 h Hydrolyse ein

gutes Signal zu Rausch-Verhältnis aufweisen. Beim Alginat aus SG81 und FRD1 konnten

auch nach 2 h Hydrolyse keine exakten Zuordnungen getroffen werden.

Da die Acetylierung keinen Einfluss auf die Sequenz hat, wurde das Alginat deacetyliert.

Hierzu wurden die beiden Alginate aus SG81 und FRD1 in dest. Wasser gelöst und mit 0,1

mol/L Natronlauge versetzt. Die Lösungen wurden bei Raumtemperatur gerührt und nach

Abschnitt 4.1.6 aufgearbeitet. Die so erhaltenen getrockneten Alginate wurden in D2O gelöst

und hochauflösende 13C-NMR-Spektren aufgezeichnet. Die enorme Verbesserung der

Qualität kann dem unterem Spektrum von FRD1 in Abb. 5.34 entnommen werden.

Man fand beim Alginat aus FRD 1 einen C-6-Resonanzenbereich von 178,29 ppm bis 176,00

ppm. Die C-1-Resonanzfrequenzen liegen zwischen 103,07 und 101,58 ppm, hier konnten

alle Triadensequenzen bis auf GGG zugeordnet werden. Das C-4(G) Resonanzsignal liegt bei

82,97 ppm und das C-5(G) Signal bei 70,66 ppm.

5 Ergebnisse

94

(ppm)708090100110120130140150160170180

(ppm)708090100110120130140150160170180

Abb. 5.34:Spektrum des gereinigten Alginats gewonnen aus P.aeruginosa FRD1 nach 1h Hydrolyse (oben). Spektrum des hydrolysierten und deacetylierten Alginats aus P. aerunginosa FRD1 (unten)

Für FRD 1152 und FRD 1153 konnten die Zuordnungen aufgrund der guten Qualität der

Spektren leichter vorgenommen werden. Aber auch hier zeigten sich starke Unterschiede zu

den Algenalginatspektren. Die Zuordnung der Kohlenstoffresonanzen im Bereich 120 ppm

bis 10 ppm wurde exemplarisch für das Alginat aus FRD1152 in Abb. 5.35 durchgeführt.

Die C-1-Resonanzen der Bakterienalginate von FRD 1152 und FRD 1153 liegen im Bereich

von 104,28 ppm und 102,48 ppm. Die Signale beider Mutanten erscheinen bei gleichen

chemischen Verschiebungen. Dies findet man auch für das G-4 und G-5 Signal der beiden

Alginate, G-4 liegt bei 82,94 ppm und G-5 bei 70,66 ppm (70,64 ppm). Diese chemischen

Verschiebungen wurden für alle Bakterienalginate gefunden. Der Bereich der M-4 und M-5

Resonanzen liegt zwischen 81,01 ppm und 79,02 ppm. Die beiden Bakterienalginate lieferten

im M-4- und M-5-Bereich gleiche Aufspaltungsmuster, aber in ihrer Feinstruktur konnten

5 Ergebnisse

95

keine Triadensignale zugeordnet werden. Alle Werte für die chemischen Verschiebungen sind

der Tabelle 5.10 zu entnehmen.

(ppm)2030405060708090100110

C-1(M),(G)

G-4

M-4,M-5

M-3,M-2,G-4 G-5

G-2

-CH3der Acetylgr.

Abb. 5.35: Ausschnitt aus dem 13C-NMR Spektrum von FRD1152 ohne die Carboxyl-resonanzen (C-6)

Die Triadenzuordnung im Bereich der C-1 Resonanzen wird in dieser Arbeit exemplarisch für

das Alginat aus SG81 gezeigt. Abbildung 5.36 enthält zum einen das Gesamtalginatspektrum

für das SG81 und zum anderen eine Vergrößerung der C-1 Resonanzen. Man sieht sehr

deutlich, dass im Vergleich zum Algenalginat aufgrund der Abwesenheit von G-Blöcken nur

drei Hauptpeaks vorhanden sind. Aus diesem Grunde konnten auch nur sechs der acht

möglichen Triaden zugeordnet werden. Die zugeordneten Triaden sind ebenfalls der

Abbildung zu entnehmen.

5 Ergebnisse

96

40 60 80 100 120 140 160 180

[ppm]

102,2 103,0 103,8 104,6 105,4

MMGGMG

MMM

GMM

GGMMGM

Abb. 5.36: Gesamtspektrum des aus P. aeruginosa SG81 gewonnenen Alginats; vergrößert wurde der Bereich der C-1 Resonanzen und die Signale wurden den jeweiligen Triaden zugeordnet

Die Triadenzuordnung erfolgte bei den anderen hier nicht explizit aufgeführten bakteriellen

Alginaten auf die gleiche Weise. In Tabelle 5.9 sind für alle Alginate die chemischen

Verschiebungen der einzelnen Signale aufgeführt. Die chemischen Verschiebungen wurden

relativiert gegen Glycerin. Das Glycerin ist aufgrund der Anzuchtbedingungen im Alginat in

Spuren enthalten. Die chemischen Verschiebungen der Glycerinsignale wurden der SDBS-

Datenbank (Integrated Spectral Data Base System for Organic Compunds, s. Tab. 5.9)

entnommen.

5 Ergebnisse

97

Tab. 5.9: Chemische Verschiebungen im Bereich 105 ppm – 63 ppm der einzelnen Signale in 13C-NMR-Spektren der verschiedenen Alginate aus den vier verschiedenen P. aeruginosa Stämmen

SG81 FRD1 FRD1152 FRD1153

C-1(M & G)

MMG

GMG

MGG

MMM

GMM

GGM

MGM

104,62

104,49

103,55

103,42

103,22

103,13

104,52

104,06

103,07

102,64

102,10

101,58

104,57

103,42

104,19

103,37

103,16

102,88

102,76

104,68

104,51

104,37

103,50

103,31

103,07

102,87

C-1(red. end) 96,93 - - -

G-4 83,33 82,97 83,22 83,37

M-4 81,42

80,73

80,99

80,42

81,29

80,62

81,47

80,71

M-5 79,67 79,06 79,30 79,40

M-nonred.

end 76,06 - - -

M-3 74,95

74,76 74,43

74,84

74,67

74,95

74,79

M-2 74,10

73,33

73,78

72,97

74,02

72,23

74,14

73,35

G-3 72,75 72,31 72,55 72,64

G-5 71,09 70,67 70,94 70,97

G-2 68,28 67,79 68,03 68,15

Glycerin 63,05 63,05 63,05 63,05

5 Ergebnisse

98

Wie beim Algenalginat wurden die den einzelnen Triaden zugeordneten Peaks quantitativ

untersucht. Die Vorgehensweise entsprach der in Abschnitt 4.4.1 beschriebenen. Hierzu

wurde durch Integration die Fläche der Peaks bestimmt und die Gesamtfläche der Peaks (ohne

GGG) auf 1 normiert. Die so erhaltenen Triadensequenzverteilungen sind der Tabelle 5.10 zu

entnehmen. Bei den bakteriellen Alginaten wurden ebenfalls Werte für eine einfache

statistische Verteilung der Triaden nach 4.4.2 aufgrund des Mannuronat/Guluronat-

verhältnisses ermittelt. Diese Werte sind rot in der Tabelle 5.10 aufgeführt.

Tab. 5.10: Triadensequenzverteilungen der verschiedenen Alginate isoliert aus den vier untersuchten P. aeruginosa Stämmen

Alginat isoliert aus: FM FG FMMM FMMG FMGM FGGM FGMG FM/FG

P. aeruginosa SG81 0,76 0,24 0,11

0,44

0,51

0,28

0,13

0,14

0,09

0,09

0,16

0,04 3,17

P. aeruginosa FRD1 0,68 0,32 0,18

0,31

0,32

0,30

0,13

0,15

0,20

0,13

0,17

0,07 2,13

P. aeruginosa FRD1152 0,67 0,34 0,31

0,30

0,16

0,30

0,24

0,15

0,08

0,15

0,21

0,08 2,21

P. aeruginosa FRD1153 0,69 0,31 0,34

0,33

0,16

0,29

0,24

0,15

0,03

0,13

0,21

0,07 2,61

Zur visuellen Verdeutlichung der Differenzen zwischen statistischen und experimentellen

Werten wurde auch hier die Darstellung über kombinierte Säulen-/Liniendiagramme gewählt.

Die Säulen in den in Abbildung 5.37 aufgeführten Diagrammen entsprechen den

experimentellen Werten, die Linien setzen sich aus den statistischen Werten zusammen.

5 Ergebnisse

99

MMM MMG MGM GGM GMG GGG

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

SG81

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

MMM MMG MGM GGM GMG GGG0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

FRD1

MMM MMG MGM GGM GMG GGG0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

FRD1152

MMM MMG MGM GGM GMG GGG

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

FRD1153

Abb. 5.37: Triadensequenzverteilungen der verschiedenen Alginate (Balken) im Vergleich zu den statistischen Verteilungen der Alginate (Punkte)

5 Ergebnisse

100

5.5 Wechselwirkung der bakteriellen Alginate mit zweiwertigen Kationen

5.5.1 13C-NMR-spektroskopische Untersuchung der Wechselwirkungen der bakteriellen Alginate mit zweiwertigen Manganionen Das gute Gelierungsvermögen von Algenalginaten wird durch das Egg-Box-Modell

beschrieben. Hierbei komplexieren die Kationen mit den Guluronateinheiten in

homopolymeren Sequenzen der Alginatketten (s. Abb. 2.17 in Kapitel 2.8.3). Die hier

untersuchten Alginate aus P. aeruginosa Stämmen enthalten keine Guluronatblöcke, d.h. das

Egg-Box-Modell beschreibt nicht die Wechselwirkungen von zweiwertigen Kationen mit

diesem Alginaten.

In dieser Arbeit sollen die Interaktionen von zweiwertigen Kationen mit den bisher

beschriebenen bakteriellen Alginaten untersucht werden. Hierzu wurden die Stämme zu

konfluenten Biofilmen ausgestrichen und die Alginate nach Abschnitt 4.2.2 gereinigt. Die so

erhaltenen Alginate wurden hydrolysiert, dialysiert und lyophilisiert.

Die Wechselwirkungen mit zweiwertigen Kationen wurde mittels hochauflösender 13C-NMR-

Spektroskopie untersucht. Hierzu wurden wie beim Algenalginat paramagnetische

Manganionen als Sonde eingesetzt, die in zwei verschiedenen Konzentrationen (0,3mmol/L

und 0,75mmol/L) vorlagen. Die Hydrolysate wurden in destilliertem Wasser und den

Manganlösungen gelöst und bei 60°C vermessen. In Abb. 5.38 sind die Spektren vom Alginat

des Stammes FRD1153 mit zunehmender Manganionenkonzentration dargestellt.

5 Ergebnisse

101

20708 090100170180

2 07 08 09 0100170180

( p p m )

2 07 08 09 01 0 01 7 01 8 0

Abb. 5.38: Mangankonzentrationsreihe mit Alginat, das aus FRD1153 gewonnen wurde

Die stärkste Wechselwirkung zeigen die Carboxylatkohlenstoffe (C-6) bei 180 ppm und die

anomeren Kohlenstoffe (C-1) bei 105 bis 102 ppm. Zur besseren Veranschaulichung wurde

der Bereich der C-1 Resonanzen in Abb. 5.39 gesondert dargestellt.

0,5mmol/L Mn2+

0,75mmol/L Mn2+

C-6

GGM/MGM

M-5

G-5 G-2

Glycerin

5 Ergebnisse

102

101102103104105106

101102103104105106

(ppm)101102103104105106

Abb. 5.39: C-1 Resonanzen des aus FRD1153 gewonnenen Alginats mit zunehmender Mangankonzentration

Die Signale, die vollkommen ausgelöscht sind, zeigen die stärksten Wechselwirkungen mit

dem Mangan. Die übrigen Signale zeigen schwache bzw. gar keine Verbreiterung. Nach einer

Bestimmung der chemischen Verschiebungen dieser Peaks wurde deutlich, dass einige Peaks

einem Shift unterliegen. Diese Änderung der chemischen Verschiebung wird durch eine

örtliche Nähe des Mangans zu den Kohlenstoffatomen im glykosidischen Ring der beiden

Monomerbausteine hervorgerufen. Es handelt sich also auch um eine Wechselwirkung mit

den Manganionen. In der Tabelle 5.11 sind alle Änderungen der chemischen Verschiebungen

durch Manganionen aufgeführt. Ein wirklicher Shift wurde ab einer Änderung, die größer als

0,20 ppm ist, angenommen. Diese Werte sind in der Tabelle fett hervorgehoben.

0,5 mmol/L Mn2+

0,75 mmol/L Mn2+

GGM/MGM

5 Ergebnisse

103

Tab. 5.11:

Chemische Verschiebungen (ppm) des Alginats FRD1153 bei unterschiedlichen Mangankonzentrationen, normiert an der chem. Verschiebung von Glycerin bei 63,05 ppm[SDBS Datenbank].

chemische Verschiebungen

Signal o. Mn2+

(ppm)

0,5mmol/L

(ppm)

0,75mmol/L

(ppm)

∆

(ppm)

G-4 83,20 83,22 83.29 0,09

C-4

MMG/MMM 81,23 81,26 81,30 0,07

C-4

GMM/GMG 80,62 80,60 80,66 0,06

M-5 79,29 79,36 79,59 0,30

M-3 74,91 74,92 74,96 0,05

M-2 74,08 74,09 74,10 0,02

G-3 72,62 72,64 72,73 0,11

G-5 70,92 70,99 71,02 0,10

G-2 68,15 68,22 68,38 0,23

In der nächsten Versuchsreihe wurde der Einfluss auf das Alginat, das aus dem Bakterium des

Stammes FRD1 isoliert wurde, untersucht. Hierfür wurde im Gegensatz zur vorangegangenen

Bestimmung der Sequenzverteilung das Alginat nicht deacetyliert. Aus diesem Grunde zeigt

das Spektrum wieder zusätzliche Peaks. Das Alginat wurde hydrolysiert und eine

Konzentrationsreihe mit Mangan angesetzt.

In Abb. 5.40 sind die Spektren dargestellt. Hier zeigt sich wie beim Algenalginat, dass die

Acetylgruppenpeaks keinerlei Veränderung erfahren. Die Wechselwirkung mit den

Manganionen findet ausschließlich mit den Ringkohlenstoffatomen der Monomerbausteine

statt.

5 Ergebnisse

104

20708 090100170180

180 708090100 20

(ppm )

207 0809010017 01 8 0

Abb. 5.40: Konzentrationsreihe mit Alginat aus FRD1 mit zunehmender Mangan-konzentration

In Abb. 5.41 wurde der Bereich der C-1 Resonanzen vergrößert. Eine genaue Zuordnung zu

einzelnen Triaden konnte wegen der Acetylgruppen nicht durchgeführt werden. Es zeigt sich

aber, dass bei einer Konzentration von 0,3 mmol/L noch alle Signale, wenn auch verbreitert

erkennbar sind. Erst bei einer Konzentration von 0,75 mmol/L findet eine Auslöschung der

Signale im Bereich 102 ppm bis 100 ppm statt. Für die übrigen Signale wurden wie beim

Alginat aus FRD1153 die chemischen Verschiebungen ermittelt. Hier fand ebenfalls ein Shift

einiger Signale statt. Dieser Shift wird in Tabelle 5.12 aufgeführt, die Verschiebungen größer

0,20 ppm sind fett hervorgehoben.

0,75mmol/L Mn2+

0,5mmol/L Mn2+

5 Ergebnisse

105

9799101103105107109

(ppm)9799101103105107109

9799101103105107109

Abb. 5.41: C-1 Resonanzen des aus FRD1 gewonnenen Alginats mit zunehmender Mangankonzentration

Tab. 5.12:

Chemische Verschiebungen (ppm) der einzelnen Signale aus Alginat aus FRD1 normiert gegen Glycerin bei 63,05 ppm

chemische Verschiebung

Signal o. Mn2+

(ppm)

0,5mmol/L

(ppm)

0,75mmol/L

(ppm)

∆

(ppm)

G-2 68,14 68,25 68,36 0,22

G-2 67,08 67,27 67,31 0,23

M-2 74,06 74,07 74,09 0,03

G-3 72,39 72,41 72,43 0,04

M-3 74,72 74,78 74,94 0,22

G-4 83,19 83,25 83,27 0,08

M-4 81,23 81,27 81,29 0,06

G-5 70,65 70,84 70,89 0,24

M-5 79,79 79,83 80,44 0,65

0,5 mmol/L Mn2+

0,75 mmol/L Mn2+

5 Ergebnisse

106

Die Tabelle 5.13 enthält eine Zusammenstellung der durch die Wechselwirkungen mit

Mangan hervorgerufenen Verschiebung der Resonanzsignale für die Alginate aus den

Stämmen FRD1 und FRD1153. Zusätzlich wurde ein relativer Abstand der Kohlenstoffe zum

Mangan über Gleichung 6.1 ermittelt.

Tab. 5.13:

Veränderungen der chemischen Verschiebung (Shift) der Resonanzsignale durch Zugabe von Mn2+-Ionen. Die verwendeten Alginate wurden aus mucoiden Aufwüchsen der Stämme FRD1 und FRD1153 isoliert.

Stamm C-Atom Shift (ppm) rrel aus 1/r3

FRD1 M-5 0,65 1,15

M-3 0,22 1,65

G-5 0,24 1,61

G-2 0,22 1,88

G-2 0,23 1,63

FRD1153 M-5 0,30 1,49

G-5 0,10 2,15

G-2 0,23 1,63

Die verschiedenen Alginate die von den vier verschiedenen Stämmen isoliert werden konnten,

wurden im Rahmen einer Diplomarbeit affinitätschromatographisch untersucht. Bei der

verwendeten Methode handelt es sich um eine Lectinaffinitätschromatographie. Hierzu wurde

das Alginat in 10 mM Phosphat-Puffer pH 7,5 gelöst (1mg/mL) und auf eine mit ConA-

Sepharose 4B gepackten Säule gegeben. Es handelt sich hierbei um Concanavalin A, das an

Sepharose 4B durch die Cyanbromidmethode gebunden ist. Auf diesem Wege konnten drei

verschiedene Fraktionen gewonnen werden. Die Fraktionen des Alginats aus SG81 wurden

von Straatmann, 2003 charakterisiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde von einer Fraktion des

Alginats aus P. aeruginosa SG81 ein hochauflösendes 13C-NMR-Spektrum aufgezeichnet

(Abb. 5.42). Es handelt sich hierbei um die Fraktion die als erste von der Säule eluiert. Dieses

Spektrum zeigte Charakteristika, die bereits durch die Messung der

Mangankonzentrationsreihen detektiert wurden. Aus diesem Grunde wurde das Alginat dieser

Fraktion mit EDTA-Lösung behandelt, dialysiert, lyophilisiert und erneut ein Spektrum

aufgezeichnet. Dieses Spektrum ist ebenfalls in Abb. 5.41 aufgeführt.

5 Ergebnisse

107

7 08 09 01 0 0170180

7 08 09 01001 7 0180

( p p m )

7 08 09 01 0 01 7 01 8 0

Abb. 5.42: 13C-NMR-Spektren von Alginat, das aus SG81 gewonnen wurde. Oben: gereinigtes Alginat, Mitte: Oberes Alginat fraktioniert durch ConA-Sepharose™ 4B (Fraktion1), Unten: fraktioniertes Alginat nach einer Behandlung mit EDTA

gereinigtes Alginat aus SG81

Alginat aus SG81 fraktioniert über ConA-Sephacrylsäule

Alginat aus SG81 fraktioniert über ConA-Sephacrylsäule nach Behandlung mit EDTA

5 Ergebnisse

108

5.5.2 Fällungsversuche von bakteriellen Alginaten mit Calcium- und Manganionen

Wie schon unter Abschnitt 5.3 beschrieben wurden auch an bakteriellen Alginaten

Fällungsexperimente durchgeführt. Hierzu wurden die nach 4.2.2 gereinigten Alginate des

Stammes FRD1 und FRD1153 eingesetzt. Zusätzlich wurden Fällungsexperimente an den

nach 4.1.6 deacetylierten Alginaten des Stammes FRD1 durchgeführt. Die Fällung erfolgte

wie unter 4.1.8 beschrieben. Die Bestimmung des in der Lösung verbleibenden Alginats

erfolgte nach dem Sulfamat/m-Hydroxydiphenyl-Assay von Filisetti-Cozzi und Carpita (s.

4.3.2). In der Abb. 5.44 und 5.44 wird die Fällbarkeit in Abhängigkeit von der

Ionenkonzentration des jeweiligen Kations (Ca2+ und Mn2+) dargestellt.

0 10 20 30 40 50 600

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

FRD1153 FRD1

Calciumkonzentration (mmol/L)

gefä

lltes

Alg

inat

(%)

0

20

40

60

80

100

Abb. 5.43: Vergleich der Fällbarkeit der beiden Alginate FRD1153 und FRD1 mit Calcium

5 Ergebnisse

109

0 10 20 30 40 50 600

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

FRD1 FRD1153

Mangankonzentration (mmol/L)

gefä

lltes

Alg

inat

(%)

0

20

40

60

80

100

Abb. 5.44: Vergleich der Fällbarkeit der beiden Alginate aus FRD1 und FRD1153 mit Manganionen

5 Ergebnisse

110

6 Diskussion

111

Kapitel 6

Diskussion

6.1 Untersuchungen am Algenalginat Manucol LB

Das Manucol LB wird aus Braunalgen der Gattung Laminara digitata gewonnen. Die

Gewinnung von Alginat aus Braunalgen erfolgt durch eine Reihe von

Ionenaustauschprozessen. Zur Reinigung und zur Isolierung wird das in den Pflanzen

enthaltene Calciumalginat in wasserlösliches Natriumalginat überführt. Die Algen werden

direkt aus dem Meer oder bei Ebbe vom Strand geerntet [Pilnik und Voragen, 1980]. Die

Algen werden zunächst maschinell getrocknet und zerkleinert. Anschließend werden Salze

und andere Verunreinigungen durch einen Waschprozess entfernt. Das Calciumalginat wird

durch einen Aufschluss mit Soda in lösliches Natriumalginat überführt. Die reine

Natriumalginat-Lösung wird dann gefriergetrocknet. Die Monomerzusammensetzung der

Natriumalginate hängt von der Art der Braunalge und von den Wachstumsbedingungen ab

[Ertesvag und Valla, 1997].

6 Diskussion

112

6.1.1 Fraktionierung des Algenalginats Manucol LB

Beim Algenalginat Manucol LB handelt es sich um ein Blockcopolymer mit drei

unterschiedlichen Sequenzen. In einer Alginatkette existieren Bereiche homopolymerer und

alternierender Zusammensetzung. Es ist möglich, die Bereiche durch fraktionierende

Hydrolyse voneinander zu trennen [Haug et al., 1967]. Die Hydrolyse mit Salzsäure erfolgt

wie jede andere saure Hydrolyse von Alginaten in einer Suspension. Das Hydrolyselimit liegt

bei 30% und die Depolymerisationsrate nimmt in der unlöslichen Phase drastisch ab. Die

Substanzen, die getrennt werden sollen enthalten äquivalente Mengen der Carboxylgruppen

und unterscheiden sich nur in ihren Uronsäurezusammensetzungen. Der durchschnittliche

Polymerisationsgrad der Fraktionen nach der Hydrolyse liegt bei 20 Monomereinheiten [Haug

et al., 1967]. Die durch Viskosimetrie und SEC-Malls bestimmten Molmassen des Manucol

LB liegen zwischen 8450 g/mol und 10220 g/mol (s. Tabelle 5.2). Die Polymerisationsgrade

dieser Alginate liegen also zwischen 40 und 50 Monomereinheiten. Diese Abweichung von

den von Haug et al. publizierten Daten lässt sich auf die hier durchgeführte Dialyse

zurückführen. Nach der Fällung der Alginate durch Ethanol und der Trocknung wurden sie

erneut in entionisiertem Wasser gelöst und gegen Wasser dialysiert. Dieser zusätzliche

Verfahrensschritt entfernt die niedermolekularen Bestandteile des Alginats: Die SEC-Malls

Analysen der beiden homopolymeren Fraktionen (Abb. 5.3 und Abb. 5.4) zeigen im

Streulichtphotometer (Detektor 11) einen scharfen Peak, die Auftragung der

Brechungsindizes gegen das Volumen liefert zwei Peaks: einen bei 17,5 mL mit einer

Intensität von 0,8 V und einen kleineren bei ca. 20 mL mit einer Intensität von 0,2 V. Man

erhält durch fraktionierende saure Hydrolyse und anschließender Dialyse homopolymere

Substanzen mit einer schmalen Molmassenverteilung. Bei dem zweiten Peak des RI-

Detektors handelt es sich um den Brechungsindex des eingesetzten Tris-Puffers.

Die Molmassenbestimmung durch Viskosimetrie beruht auf dem Zusammenhang zwischen

der Molekülgröße und der Lösungsviskosität. Systematische Untersuchungen auf diesem

Gebiet wurden von Berl, Blitz und Ostwald sowie später von Staudinger, Kuhn, Mark,

Fikentscher und Houwink durchgeführt. Die Untersuchungen Staudingers deuten auf einen

einfachen Zusammenhang zwischen der Grenzviskositätszahl (intrinsische Viskosität) von

Polymerlösungen und der mittleren Molmasse des gelösten Polymeren hin.

6 Diskussion

113

Zur Bestimmung der intrinsischen Viskosität der Alginate wird für jede Verdünnungsreihe die

reduzierte Viskosität gegen die Konzentration aufgetragen. Die Extrapolation auf die

Konzentration 0 liefert dann als Ordinatenabschnitt den Wert für die intrinsische Viskosität.

Die gemessenen Werte sind exemplarisch für Polymannuronat in Abbildung 5.5 dargestellt.

Die molare Masse der Proben wurde dann über die Mark-Houwink-Beziehung (Kapitel 4,

Gleichung 4.6) berechnet. Diese Molmassen sowie die über SEC-Malls ermittelten sind der

Tabelle 5.2 zu entnehmen.

Von den beiden Fraktionen wurden hochauflösende 13C-NMR-Spektren aufgezeichnet, diese

werden in den Abbildungen 5.1 und 5.2 gezeigt. Die Spektren enthalten jeweils sechs

hervorstechende Linien. Diese Linien konnten nach Grasdalen et al., 1981 zugeordnet werden.

Die chemischen Verschiebungen wurden gegen THF normiert und sind der Tabelle 5.1 zu

entnehmen. Man sieht in den beiden Spektren sehr kleine Signale, die von einer geringen

Verunreinigung mit der jeweils anderen Komponente stammen. Diese Signale können von

einem geringen Anteil niedermolekularer Alginatbausteine stammen. Abschließend wurden

FT-IR-Spektren zur Charakterisierung der beiden homopolymeren Fraktionen aufgezeichnet.

Die beiden Spektren zeigen keine signifikanten Unterschiede. Leichte Abweichungen findet

man im Fingerprintbereich. Die Variationen schwanken aber ebenfalls mit der

Probenzubereitung. Da die Alginate sehr hygroskopisch sind variiert die Qualität der

aufgezeichneten Spektren stark. Die Arbeitsgruppe um Fillipov und Kohn [1974] führte eine

quantitative Bestimmung des Mannuronat/Guluronat-Verhältnisses durch Einsatz von FT-IR

Spektroskopie ein. Unter den in dieser Arbeit angewandten Probevorbereitungsbedingungen

konnten diese Ergebnisse allerdings nicht verifiziert werden. Die quantitative Bestimmung

des M/G-Verhältnisses durch FT-IR-Spektroskopie scheint aber aufgrund der Hygroskopie

und der Empfindlichkeit der Signale im Fingerprintbereich sehr schwierig und ist wohl nur als

Richtwert zu sehen.

In den folgenden Abbildungen (6.1 u. 6.2) wurden die beiden homopolymeren Fraktionen mit

ChemOffice 8.0 modelliert und einer einfachen Energieminimierung in einem MM2 Kraftfeld

unterzogen.

6 Diskussion

114

Abb. 6.1: Energieminimierte Struktur des Poly-α-L-Guluronates

Abb. 6.2: Energieminimierte Struktur des Poly-β-D-Mannuronats

Das α-L-Guluronat bildet die erwartete α-helicale Struktur (s. Abb. 6.1). Da das Mannuronat

β-Konformation besitzt wurde eine Faltblattstruktur erwartet. Diese Struktur konnte ebenfalls

mit dem Chem3D Programm simuliert werden.

6 Diskussion

115

6.1.2 Milde saure Hydrolyse von Manucol LB

Im vorherigen Abschnitt wurde die Fraktionierung der beiden homopolymeren Komponenten

des Algenalginats beschrieben. Die Auftragung der Spektren der beiden Monomerbausteine

gegen das Gesamtalginatspektrum (Abb. 6.3) verdeutlicht sehr schön, wie sich das

Gesamtalginatspektrum aus den beiden Einzelkomponenten zusammensetzt.

180 170 160 110 100

(ppm)

90 80 70

Abb. 6.3:Vergleich der Spektren, gewonnen aus den Mannuronat-, Guluronat- und Gesamtalginatfraktionen.

Polymannuronatspektrum

Polyguluronatspektrum

Gesamtalginatspektrum

6 Diskussion

116

Das Gesamtalginatspektrum enthält zusätzliche Signale. Diese Signale entstehen aufgrund der

Sensibilität der Kohlenstoffatome im Monomerbaustein zu den Kohlenstoffatomen im

Nachbarmonomerbaustein. So hat ein C-1 Kohlenstoff des Mannuronats mit zwei

„Guluronaten“ rechts und links als Nachbarn eine andere chemische Verschiebung als ein C-1

Mannuronat mit zwei „Mannuronaten“ als Nachbarn. Aufgrund dieser spezifischen

chemischen Verschiebungen ist es möglich, die acht verschiedenen

Kombinationsmöglichkeiten der Monomereinheiten mit einem Nachbarn zur Linken und

einem Nachbarn zur Rechten zu unterscheiden. Die Zuordnung dieser verschieden

chemischen Verschiebungen wurde ebenfalls von Grasdalen et al. [1981] durchgeführt und im

Rahmen dieser Arbeit übernommen. Die Abbildung 6.3 soll die Komplexität des

Gesamtalginatspektrums durch Betrachtung der Einzelkomponenten des Copolymers

vereinfachen.

Die Zuordnungen von Grasdalen et al. [1981] wurden vollständig übernommen und können

den Abbildungen 5.7 bis 5.11 entnommen werden. Die chemischen Verschiebungen der in

dieser Arbeit zugeordneten Signale wurden gegen THF normiert und sind in den Tabellen 5.3

und 5.4 aufgeführt.

6 Diskussion

117

6.1.3 Ermittlung der optimalen Hydrolysezeit

Die geringe natürliche Häufigkeit von 13C-Kernen bedingt für die NMR-Spektroskopie ohne

zusätzliche Verstärkung der Signale durch den Kern-Overhauser-Effekt (NOE) relativ lange

Messzeiten. Bei Polymeren, die hochviskose Lösungen bilden, verlängert sich die Messzeit

noch stärker, da die Moleküle und damit auch die Atome in den Molekülen weniger

beweglich sind. Die in dieser Arbeit untersuchten Alginate waren nicht angereichert. Eine

Verstärkung der NMR-Signale über den NOE kam ebenfalls nicht in Frage, da derart

verstärkte Signale keine quantitative Analyse erlauben. Um dennoch das Signal-Rausch-

Verhältnis zu bessern und die Messzeit zu verkürzen, wurde die Beweglichkeit der Atome

erhöht. Dies wurde zum einen durch Messung bei höherer Temperatur und zum anderen durch

Abbau der Alginate gewährleistet. Es wurden zwei Abbaumethoden für Alginate getestet, die

saure Hydrolyse [Haug et al., 1967] und der enzymatisch bedingte Abbau [P. Tielen, 1999].

In den Abbildungen 5.14 und 5.15 sind die Zerfallsreihen vom Alginat für beide Methoden

dargestellt. Der Abbau entspricht bei beiden Methoden einem exponentiellen Zerfall, einer

Reaktion erster Ordnung. Es handelt sich bei beiden Reaktionen um eine β-

Eliminierungsreaktion. Diese Reaktion spaltet die Kette und bildet zwei verschiedenen Enden

aus, eine Hydroxygruppe (Abb. 6.4 Produkt A) und eine ungesättigte Uronsäure (Abb. 6.4,

Produkt B). Dieser Spaltungsmechanismus wurde von Haugen et al. [1990] für Alginatlyasen

aus Klebsiella aerogenes und Haliotis sp. gefunden. Die so gebildeten Endgruppen werden im

NMR-Spektrum bei fortgeschrittener Hydrolyse detektiert. Die Signale der reduzierten Enden

erscheinen bei ca. 97 ppm und die der nicht reduzierten Enden bei ca.76 ppm.

Die β-Eliminierungsreaktion verläuft in drei Phasen. Im ersten Schritt erfolgt eine

Kompensation der negativen Ladung des Carboxylatanions. Dann wird das Proton am C-5

Kohlenstoff basenkatalysiert, abstrahiert und schließlich die 4-O-glykosidische Bindung β-

eliminert. Bei der enzymatischen Spaltung erfolgt diese Reaktion über die

Aminosäuregruppen der Lyase und bei der sauren Hydrolyse über die Hydroniumionen als

elektrophil und Wasser als nukleophil.

6 Diskussion

118

COO-

RO

RO

RO

OR

COO-

COO-

OH

OH

OO

OO O

O

O

COO-

RO

OR

COO-

OH

OH

OO

OOH

COO-

RO

OR

COO-

RO

RO

RO

OR

COO- OO

O

+

β Eliminierung

Produkt A Produkt B Abb. 6.4: β-Eliminierungsreaktion zur Spaltung der Alginatketten

Eine genauere Betrachtung der Abbauprodukte über die SEC-Malls Analyse zeigt jedoch

signifikante Unterschiede in der Entstehung der Abbauprodukte. Während bei der sauren

Hydrolyse die Alginate nach und nach einheitlich verkürzt werden, liegen bei der

enzymatischen Methode abgebaute Fragmente neben ursprünglichen Ketten vor.

Abb. 6.5: Auftragung des Retentionsvolumens gegen die Hydrolysedauer der einzelnen Bestandteile des abgebauten Alginats

Enzymatische Hydrolyse von Manucol LB

12131415161718

192021

0 100 200 300 400

Hydrolysedauer (min)

Ret

entio

nsvo

lum

en (m

l)

unlösliche Partikellösl. Polysaccharid alösl. Polysaccharid bSalzpeak

1440 2880

Enzymatische Hydrolyse von Manucol LB

12131415161718

192021

0 100 200 300 400

Hydrolysedauer (min)

Ret

entio

nsvo

lum

en (m

l)

unlösliche Partikellösl. Polysaccharid alösl. Polysaccharid bSalzpeak

1440 2880

6 Diskussion

119

Abb. 6.6: Auftragung des Retentionsvolumens der einzelnen Bestandteile des Hydrolysats gegen die Hydrolysedauer Die durch hydrolytische und enzymatische Spaltung ermittelten Zerfallsreihen geben

Aufschluss über das Abbauverhalten des Manucol LB und dienen als Orientierungshilfe um

definierte Abbauprodukte dieses Alginats herzustellen. Mit Hilfe dieser Daten ist es möglich,

durch die Wahl des Abbauverfahrens, Alginatfragmente nach den Anforderungen die sie

erfüllen sollen zu generieren.

Die Abbildung 6.5 zeigt, dass mit zunehmender Bebrütungsdauer der Enzym-Alginat-Lösung

ausschließlich hochmolekulare Bestandteile (nicht abgebaute Alginate, rote Dreiecke) und

kurze Fragmente (blaue Rauten) vorhanden sind. Moleküle mittlerer Länge können nicht

mehr detektiert werden. Dies spricht für einen Abbaumechanismus, der direkt an der

einzelnen Kette stattfindet. Das Enzym baut das Alginat also Kette für Kette ab.

Bei der sauren Hydrolyse finden sich zu jedem Zeitpunkt der Reaktion unabgebaute Alginate,

mittlere Alginatketten und kurze Alginatfragmente (Abb. 6.6). Dies spricht für einen Abbau,

der nicht auf einzelne Ketten gerichtet ist. Die Hydroniumion greifen zufällige Positionen der

Ketten an und spalten diese. Eine graphische Veranschaulichung dieser Abbaumechanismen

wird in Abbildung 6.7 gezeigt.

Saure Hydrolyse von Manucol LB

12131415161718192021

0 10 20 30 40 50 60

Hydrolysedauer (h)

Ret

entio

nsvo

lum

en (m

l)unlösliche Partikellösl. Polysaccharid alösl. Polysaccharid bSalzpeak

6 Diskussion

120

Abb. 6.7: Schematische Darstellung der Abbauprozesse während der sauren Hydrolyse (links) und des enzymatischen Abbaus (rechts) mit zunehmender Hydrolyse- bzw. Bebrütungsdauer

Die quantitative Analyse der Alginate sollte an gleichmäßig abgebauten Polymeren erfolgen,

deshalb wurden das Manucol LB und auch die bakteriellen Alginate durch saure Hydrolyse

behandelt.

Als nächsten Schritt galt es, die optimale Hydrolysedauer für die im Rahmen dieser Arbeit

gestellten Anforderungen an das Manucol LB zu finden. Die saure Hydrolyse der Alginate ist

eine Reaktion in zwei Phasen, da unter sauren Bedingungen 20% des Alginats in Lösung

vorliegen, der größte Teil jedoch als nicht gelöster Anteil im Substrat verbleibt [Haug et al.,

1967]. Die Hydrolyse erfolgt in der ersten Phase relativ zügig, da ausschließlich gelöste

Bestandteile abgebaut werden. Mit fortschreitender Hydrolysedauer nimmt die

Geschwindigkeit des Abbaus allerdings ab. Für ein optimales 13C-NMR-Spektrum von

Polymeren ist es notwendig die Polymere gerade so stark zu verkürzen, dass die Viskosität

der Lösung sinkt und die Mobilität der Moleküle steigt, denn so erhält man gute Werte für das

Signal-Rauschverhältnis ohne zusätzliche Isotopenanreicherung. Es wurden NMR-Spektren

saure Hydrolysemit 1m HCl bei 100°C

enzymatischer Abbaumit Alginat-Lyase bei 37°C und pH 7,5

Manucol LB in wässriger Lösung

1 1

2 2

t

t

saure Hydrolysemit 1m HCl bei 100°C

enzymatischer Abbaumit Alginat-Lyase bei 37°C und pH 7,5

Manucol LB in wässriger Lösung

1 1

2 2

t

t

6 Diskussion

121

für Hydrolysezeiten von 30 min, 2h und 4h Stunden aufgezeichnet. Hier zeigte sich, dass für

längere Hydrolysezeiten das Signal-Rausch-Verhältnis besser wird, die einzelnen Signale aber

weniger eindeutig zugeordnet werden können (s. Abbildung 5.12). Für die Sequenzanalyse

wurden die NMR-Spektren quantitativ ausgewertet. Es wurde die Fläche der den einzelnen

Triaden zugeordneten Signale integrativ ermittelt, das Verhältnis der einzelnen Flächen

bestimmt und die Gesamtsumme der acht Triaden auf eins normiert (s. Kapitel 4.4.1,

Gleichungen 4.1 bis 4.3). Die experimentell ermittelten Werte für die Sequenzverteilungen

wurden in Abbildung 5.13 zusammen mit statistisch berechneten Werten aufgetragen.

Grundlage für die Berechnung dieser Werte lieferte eine einfache Statistik, die den

Gleichungen aus Abb. 4.2 in Kapitel 4.4.2 entnommen werden kam. Die Sequenzverteilungen

zeigen bei Hydrolysedauern bis zu einer Stunde eine relativ gute Übereinstimmung der

experimentellen und der berechneten Werte. Daraus lässt sich folgern, dass sich die einzelnen

Copolymerbausteine, im Algenalginat Manucol LB, gemäß einer einfachen Statistik mit

leichtem Überschuss an alternierenden Bereichen anordnen.

Vergleicht man die Sequenzanalysen der drei Proben, so zeigen sich deutliche Unterschiede

in den Triadenverteilungen (s. Abbildung 5.13). Man findet eine Abnahme des MMG/GMM

Signals um 33% und des GGM/MGG Signals um 50% mit fortschreitender Hydrolysedauer.

Eine prozentuelle Zunahme wird für die Häufigkeit von GGG Triaden (40%) sowie für die

GMG und MGM (ca. 35%) gefunden. Diese Resultate decken sich mit den von Smidsrød et

al. [1969] gemachten Beobachtungen, dass im pH-Bereich von 2 bis 4 die Guluronatblöcke

und strikt alternierende Bereiche nur wenig abgebaut werden. Die Abnahme der MMG/GMM

und GGM/MGG Signale spricht für eine bevorzugte Spaltung gerade dieser Bereiche der

Alginatkette. Smidsrød et al. [1969] fanden in ihrer Untersuchung, dass die

Mannuronatblöcke am stärksten abgebaut werden, durch einen bevorzugten Angriff am C-4

des Mannuronats. Diese Ergebnisse konnten im Rahmen dieser Arbeit nicht bestätigt werden.

Die Häufigkeit der MMM Triaden hat während der hier gewählten Hydrolysedauer nicht

abgenommen.

Da für die weiteren Untersuchungen die ursprüngliche Triadenzusammensetzung

weitestgehend erhalten bleiben sollte, wurden alle NMR-Messungen am Manucol LB nach

einer Hydrolysedauer zwischen 30 Minuten und einer Stunde durchgeführt.

6 Diskussion

122

Die folgende Abbildung zeigt eine Alginatkette mit statistisch angeordneten Bausteinen. Sie

wurde ebenfalls mit ChemOffice 8.0 modelliert und im MM2 Kraftfeld einer einfachen

Energieminimierung unterzogen.

Abb. 6.8: Energieminimierte Struktur eines Algenalginatstranges mit statistischer Anordnung.

Man sieht trotz der relativ geringen Anzahl von Monomeren sehr deutlich die Tendenz des

Copolymeren, knäuelartige Strukturen auszubilden. Die Knäuelbildung kann jedoch durch

Gegenionen und pH-Wert der Lösung beeinflusst werden. Diese Faktoren wurden in der

einfachen Energieminimierung nicht berücksichtigt.

6 Diskussion

123

6.1.4 Acetylierung des Algenalginats Manucol LB

Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden bakterielle Alginate von verschiedenen P. aeruginosa

Stämmen untersucht. Diese Alginate können an der C-2 und/oder der C-3 Position acetyliert

sein. Um die Auswirkungen der Acetylgruppen auf die Eigenschaften der Alginate im Vorfeld

bestimmen zu können, wurde das Manucol LB acetyliert.

Das Manucol LB wurde nach einer Vorschrift von Skjåk-Bræk et al., 1989a acetyliert. Die

von Skjåk-Bræk et al. [1989a] beschriebene Präparation wurde leicht modifiziert. Für die

Acetylierung wurde das Natriumalginat in stabile Calciumalginatperlen umgewandelt. Die

Abb 6.9 zeigt eine TEM-Aufnahme von einer solche Perle. Calciumalginatperlen werden zur

Immobilisierung von Zellen und Enzymen eingesetzt. Die Aufnahme zeigt der deutlich die

Porosität und die große Oberfläche einer solchen Perle.

Abb. 6.9: TEM Aufnahme einer Calciumalginatperle Dr. G. Bickerstaff, Department of Biological Sciences, University Paisley]

Diese Perlen schrumpfen nicht durch Zugabe von organischen Lösungsmitteln [Grasdalen et

al., 1974]. Die Calciumionen koordinieren bevorzugt an den Guluronatgruppen des Alginats,

dies ist ein weiterer Aspekt für die Verwendung von Calciumalginatperlen. Die Koordination

von Calcium schützt das Guluronat vor Acetylierung, somit können die Mannuronatbausteine

selektiv acetyliert werden. Die selektive Acetylierung des Mannuronates ermöglicht eine

relativ genaue Modellierung des im zweiten Teil dieser Arbeit untersuchten Bakterienalginats.

Zur qualitativen Überprüfung der Acetylierung wurde von dem getrockneten Alginat ein FT-

IR-Spektrum aufgenommen (s. Abbildung 5.17). Der Vergleich mit dem nicht acetylierten

Alginat (Abb. 5.16) zeigt deutlich die zusätzlichen CO-Streckschwingungssignale im

6 Diskussion

124

Spektrum des acetylierten Manucols. Der Acetylierungsgrad wurde weiterhin durch den

photometrischen Test von Hestrin bestimmt. Hier wurde ein Wert von 26% bezogen auf den

Mannuronatanteil detektiert. Dieser Acetylierungsgrad entspricht den Werten der ebenfalls in

dieser Arbeit untersuchten bakteriellen Alginate (s. Tab. 6.2).

Zur vollständigen Charakterisierung des acetylierten Alginats wurde die Molmasse durch

Viskosimetrie (s. Kapitel 4.4.4), durch SEC-Malls (s. Kapitel 4.4.8) und durch

Ultrazentrifugation bestimmt. Die Molmassen sind in Tabelle 6.1 aufgeführt.

Tabelle 6.1: Molmassen (g/mol) des gereinigten und acetylierten Manucol LB

Alginat Molmasse

Viskosimetrie

Molmasse

SEC-Malls

Molmasse

Ultrazentrifug.

gereinigtes Alignat 73.874 61.171 ca. 60.000

acetyliertes Alginat 72.614 60.243 ca. 60.000

Die Molmassen weichen, wie der Tabelle zu entnehmen ist, nicht stark voneinander ab. Das

bedeutet, die Acetylierung erfolgt trotz der stark sauren Bedingungen nicht unter Abbau des

Algenalginats. Diese Beobachtung entspricht den Aufzeichnungen von Skjåk-Bræk et al.

[1989b]. Die relativ geringen Abweichungen der durch die verschiedenen Methoden

gewonnenen Molmassen sind ebenfalls hervorzuheben. Die mit geringem apparativen

Aufwand durchzuführende Methode der Molmassenbestimmung durch Viskosimetrie zeigt

eine gute Näherung zu den beiden aufwendigeren Methoden (SEC-Malls und

Ultrazentrifugation). Das bedeutet, dass die in der Mark-Houwink-Gleichung eingesetzten

Konstanten in dem hier gewählten Molmassenbereich die Eigenschaften des Alginatmoleküls

sehr genau widerspiegeln.

6 Diskussion

125

6.1.5 Wechselwirkungen des Manucol LB und des acetylierten Manucol LB mit

Mangan

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Wechselwirkungen der beiden zweiwertigen Kationen

Calcium und Mangan mit Alginat untersucht. Ziel dieser Untersuchen war es, den

Bindungsmechanismus der Alginate mit zweiwertigen Kationen näher zu beschreiben. Hierfür

wurden hochauflösende 13C-NMR-Spektren der Alginate in Gegenwart unterschiedlicher

Kationenkonzentrationen aufgezeichnet. Es wurde vermutet, dass sich das Spektrum bei einer

koordinativen Bindung der Kationen zu einzelnen Monomerbausteinen bzw. zu funktionellen

Gruppen der einzelnen Bausteine verändert. Da die Kohlenstoffatome keine direkte Bindung

mit den Kationen eingehen, erwartete man zwei Änderungen des Spektrums. Die erste

Möglichkeit ist eine Verschiebung der Signale aufgrund der neuen chemischen Umgebung.

Die zweite mögliche Änderung ist eine Verbreiterung der betroffenen Signale aufgrund der

eingeschränkten Beweglichkeit koordinativ gebundener funktioneller Gruppen.

Zunächst wurden Konzentrationsreihen mit unterschiedlichen Calciumionengehalten

angesetzt und vermessen. Hierbei detektierte man in hochaufgelösten Spektren keine

signifikanten Veränderungen. Eine Erklärung für diese Beobachtungen wäre, dass bei den

gewählten Konzentrationen immer noch ein großer Überschuss nicht gebundenen Alginats

vorlag. Das gebundene Alginat wurde als Calciumkomplex ausgefällt und konnte somit

hochauflösend nicht detektiert werden. Festkörper NMR-Untersuchungen wurden an den

Algenalginaten aufgrund der geringen natürlichen 13C-Isotopenhäufigkeit nicht durchgeführt.

An dieser Stelle sollte jedoch auf die Veröffentlichung von Lattner et al. [2003] hingewiesen

werden. Lattner et al. machten Festkörperuntersuchungen an 13C angereicherter bakterieller

EPS, die Alginat als Hauptkomponente enthielten. Diese EPS zeigte mit zunehmender

Calciumionenkonzentration eine selektive Linienverbreiterung. Da Festkörper NMR-

Experimente keine genaue Zuordnung der Triadensequenzen ermöglichen, wurde nach einem

Ion gesucht, welches die gleiche Ladungszahl besitzt, einen ähnlichen Ionenradius, aber

weniger starke Effekte auf die Gelbildung der Alginatlösung hat. Mangan ist ein Element der

siebten Nebengruppe mit der Ordnungszahl 25. Calcium ist ein Erdalkalimetall mit der

Ordnungszahl 20. Eine wichtige Oxidationszahl des Mangans ist +2 das entspricht der

Elektronenkonfigurationen d5. Calciumionen besitzen hauptsächlich die Oxidationszahl +2.

Für beide Ionen Ca2+ und Mn2+ ist sechs die häufigste Koordinationszahl. Der Ionenradius des

Ca2+ liegt bei 100 pm, der von Mn2+ bei 83 pm für highspin-Konfiguration. Die zweiwertigen

Manganionen liegen in neutraler bzw. saurer Lösung als Hexaaquamangan(II)-Ion

6 Diskussion

126

[Mn(H2O)6]2+ [Holleman u. Wiberg, 1976]. Das Mn(II) besitzt ein ungepaartes Elektron.

Ionen in denen ungepaarte Elektronen vorhanden sind, besitzen ein permanentes

magnetisches Moment. Ohne äußeres Feld sind die magnetischen Momente statistisch verteilt

und heben sich gegenseitig auf. Legt man ein äußeres Feld an, so richten sich die

magnetischen Momente in Feldrichtung aus, es entsteht eine Magnetisierung, die dem

äußeren Feld gleichgerichtet ist (s. Abbildung 6.10). Die paramagnetische Suszeptibilität ist

unabhängig von der Feldstärke, aber temperaturabhängig, da eine Temperaturzunahme der

Ausrichtung der permanenten Magnete im äußeren Feld entgegenwirkt [Riedel, 1990]. Das

zweiwertige Manganion ist relativ stabil in wässriger Lösung, was einen weiteren Vorteil für

die hier gemachten Untersuchungen darstellte.

Abb. 6.10: Orientierung der Spins paramagnetischer Mn2+-Ionen (in Lösung ) in einem äußeren Magnetfeld B0

Paramagnetische Ionen spielen in der NMR-Spektroskopie eine wichtige Rolle. Bei 13C-

NMR-Messungen wird normalerweise darauf geachtet, paramagnetische Verunreinigungen zu

vermeiden. Sie verkürzen die Relaxationszeiten und verbreitern damit die Linien. Die

Gegenwart von paramagnetischen Ionen verursacht zusätzlich eine Verschiebung der Signale.

Da aber nicht alle Signale eines Moleküls gleichmäßig beeinflusst werden, lässt sich der

Effekt gezielt bei der Spektrenanalyse einsetzen. Hickley fand 1969, dass mit den

paramagnetischen Ionen der Lanthanoiden Verschiebungen ohne wesentliche

Linienverbreiterung zu erreichen sind. Durch Zugabe eines Verschiebungsreagenzes sind die

untersuchten Kerne schwächer abgeschirmt, die Signale sind nach tiefem Feld verschoben.

Die Verschiebung ist umso größer, je geringer der Abstand des beobachteten Kerns ist. Die

Verschiebung der Signale lässt sich zurückführen auf eine Wechselwirkung zwischen dem

N

S

NN

S

M n 2+

B 0

N

S

NN

S

N

S

NN

S

M n 2+M n 2+

B 0

6 Diskussion

127

Spin des ungepaarten Elektrons und dem Kernspin. Hierbei muss man zwei Arten der

Wechselwirkung unterscheiden, die beide zu Signalverschiebungen führen: die Kontakt- und

die Pseudokontaktwechselwirkung. Beide setzen eine Komplexbildung zwischen dem

Substrat und dem paramagnetischen Metall-Ion voraus, wobei sich in Lösung ein

Gleichgewicht zwischen freien Komponenten und Komplexen einstellen wird. Durch die

Kontaktwechselwirkung wird im Komplex Spindichte des ungepaarten Elektrons auf das

Substratmolekül übertragen. Da die Spindichteverteilung am Ort der beobachteten Kerne sehr

unterschiedlich ist, wird auch der Verschiebungseffekt nicht überall im Molekül gleich groß

sein.

Die Pseudokontaktwechselwirkung ist eine dipolare Wechselwirkung zwischen dem

magnetischen Dipolfeld des ungepaarten Elektrons und dem des beobachteten Kernes. Diese

Wechselwirkung geht durch den Raum. Gleichung 6-1 gibt den Zusammenhang zwischen

Verschiebung durch Dipol-Dipol-Wechselwirkung und den geometrischen Daten des

Komplexes wieder:

3

2

Dip r1cos3K −

=υ∆ (6-1),

wobei r der Abstand des paramagnetischen Liganden zum beobachteten Kern und υ der

Winkel zwischen der Verbindungslinie und der Achse des Komplexes ist. K ist eine

Konstante, die das magnetische Moment des paramagnetischen Metallions berücksichtigt.

Aus der Gleichung 6-1 folgt, dass der Verschiebungseffekt mit r3 abnimmt, ∆Dip für alle

Kerne gleich groß ist und ∆Dip positiv oder negativ sein kann, je nachdem ob (3cos2υ-1)

größer oder kleiner Null ist [Friebolin, 1999].

Im dieser Arbeit sollte das Komplexierungsverhalten zweiwertiger Kationen mit Alginat

näher untersucht werden. Man vermutet für Mangan einen ähnlichen

Anlagerungsmechanismus wie bei Calciumionen. Aufgrund des Effektes der

paramagnetischen Ionen des Mangans wurde eine Veränderung des Alginatspektrums

erwartet. Die Beeinflussung der Resonanzsignale des Alginats sollte Informationen über den

Komplex Mangan-Alginat liefern und somit indirekt auch Informationen über Calcium-

Alginatkomplexe. Die Untersuchungen wurden zunächst an den homopolymeren Fraktionen,

die nach Kapitel 4.1.4 gewonnen wurden, durchgeführt. Hierfür wurden Konzentrationsreihen

mit gleichen Alginatanteilen, aber unterschiedlichen Mangankonzentrationen angesetzt. Von

diesen Lösungen wurden hochauflösende 13C-NMR-Spektren nach der reversed gated

decoupling Methode (s. Kapitel 4.4.1) aufgezeichnet. Die homopolymeren Fraktionen wurden

6 Diskussion

128

zuerst untersucht, um die Wechselwirkung der einzelnen Monomerbausteine des Alginats

unabhängig voneinander zu betrachten. Die Spektren wurden verglichen und zeigten

signifikante Linienverbreiterungen an bestimmten Kohlenstoffatomen des glykosidischen

Ringes. Zwei dieser Spektren sind in Abbildung 5.21 für die M-Fraktion exemplarisch

dargestellt. Man sieht hier sehr deutlich, dass beim Mannuronat nur zwei Signale verbreitert

werden, siehe dazu auch Abb. 5.22. Dort sind die Halbwertsbreiten der einzelnen Signale

gegen die Mangankonzentration aufgetragen. Aus der Grafik lässt sich entnehmen, dass die

stärkste Beeinflussung an der C-6 Position gefunden wird. Das C-6 ist der Kohlenstoff der in

dissoziierter Form negativ geladenen Carboxylgruppe. Die zweite Verbreiterung findet sich

am Kohlenstoff der Position 5, also der direkt benachbarte Kohlenstoff. Man kann also von

einer Wechselwirkung der Manganionen mit der negativ geladenen Carboxylgruppe

ausgehen. Das Manganion befindet sich in direkter Nähe zum C-6 Kohlenstoff und verursacht

aufgrund des zusätzlichen Magnetfeldes eine starke Verbreiterung des Signals. Dieses

Magnetfeld strahlt auch auf das C-5-Atom aus und verbreitert somit auch sein Signal. Diese

Linienverbreiterungen sprechen für eine ausschließliche Wechselwirkung der Manganionen

mit der Carboxylatgruppe.

Bei der Konzentrationsreihe des Guluronates findet sich ein anderes Ergebnis (s. Abb. 5.23).

Hier detektiert man wiederum die starke Verbreiterung des Carboxyl-Kohlenstoffsignals, eine

mäßige Verbreiterung des C-5 Resonanzsignals, aber zusätzlich auch eine Verbreiterung des

C-1-Signals. Diese zusätzliche Wechselwirkung lässt sich auf verschiedene

Komplexstrukturen der Manganionen mit Mannuronat bzw. Guluronat zurückführen.

Diese verschiedenen Möglichkeiten beruhen auf den unterschiedlichen Strukturen der beiden

homopolymeren Fraktionen. Das Mannuronat enthält diaxiale Verknüpfungen und bildet

bandartige Strukturen aus. Die Guluronateinheiten sind axial verknüpft und bilden Zick-Zack-

Ketten [Gacesa und Russel, 1990]. Die bandartige Struktur des Mannuronats ermöglicht den

Manganionen lediglich eine Anlagerung entlang der Kette. Die Form der Kette verhindert

Koordinationen mit anderen Sauerstoffen im Ring, somit werden auch keine weiteren

Kohlenstoffsignale verändert. In Abb. 6.11 ist eine im MM2 Kraftfeld energieminimierte

Struktur eines Mannuronathexamers in Gegenwart eines Manganions dargestellt.

Auch die zusätzliche Wechselwirkung des Mangans mit dem C-1 Kohlenstoff des

Polyguluronats lässt sich auf die Struktur des Homopolymers zurückführen. Die durch

Guluronat ausgebildeten Zick-Zack-Ketten verursachen einen leichten Versatz der einzelnen

Bausteine. Die Manganionen wechselwirken bevorzugt mit dem Carboxylat-Sauerstoff.

Durch den leichten Versatz ist aber genügend Platz, um zusätzliche Elektronendichte der

6 Diskussion

129

freien Elektronenpaare des Ringsauerstoffs auf das Mangan zu übertragen. Aus dieser

Wechselwirkung ergibt sich die zusätzliche Verbreiterung des C-1 Kohlenstoffsignals, das in

direkter Nachbarschaft zum Ringsauerstoff steht.

In Abbildung 6.12 ist eine einfache Energieminimierung eines Guluronathexamers in

Gegenwart eines Manganions dargestellt.

Abb. 6.11: Energieminimierte Struktur eines Mannuronathexamers in Gegenwart eines Manganions

C-6 C-6

C-5 C-5

6 Diskussion

130

Abb. 6.12: Energieminimierte Struktur eines Guluronathexamers in Gegenwart eines zweiwertigen Manganions

Die beiden Abbildungen zeigen einfache energieminimierte Strukturen der jeweiligen

Uronsäurehexamere. Sie sollen die NMR-Daten graphisch verdeutlichen. Man sieht in Abb.

6.11 sehr deutlich die Anlagerung des Mangans an zwei Carboxylatgruppen des

Mannuronathexamers. Diese Anlagerung erfolgt entlang der Kette und die anderen

Kohlenstoffatome der Monomereinheiten werden nicht von dem Paramagnetismus des

Manganions beeinflusst. Dies ist eine mögliche Interpretation der durch NMR-Spektrokopie

gefundenen Verbreiterungen. In Abbildung 6.12 erkennt man deutlich, dass das C-1

Kohlenstoffatom in direkter Nähe zu dem Manganion steht und somit sein Resonanzsignal im 13C-NMR-Spektrum der Guluronatfraktion verbreitert ist.

Wie schon vorher beschrieben, dienen die Abbildungen 6.11 und 6.12 zur Veranschaulichung

der durch NMR gefundenen Resultate. Die Abbildungen zeigen mögliche Anlagerungen des

Manganions an die beiden Homopolymeren. Die Struktur der Hexamere wurde in Chem3D

Ultra energieminimiert, anschließend ein Manganion zugefügt und erneut eine Minimierung

durchgeführt. Die Minimierung erfolgte bei 300 K und basiert auf einem MM2 Kraftfeld und

liefert die energetisch günstigste Konformation. Die ermittelte Energie liegt bei -149 kcal für

das Mannuronathexamer und bei -264 kcal für das Hexamer des Guluronats. Da es sich bei

der Minimierung um eine einfache Konformationsenergieermittlung handelt und allgemeine

Parameter zur Berechnung eingesetzt wurden, sind die Zahlenwerte der aus dem Programm

C-6

C-6

C-1C-5

C-5

6 Diskussion

131

ermittelten Bindungsabstände nicht in diese Arbeit aufgenommen worden. Diese Abbildungen

sollen als Visualisierung der gemessenen NMR-Ergebnisse dienen. Sie stellen keine

theoretische Arbeit dar. Es zeigt sich jedoch eindeutig, dass das hier verwendetet MM2

Kraftfeld die NMR-Ergebnisse reproduziert.

Als nächstes wurden die Einflüsse von Manganionen auf das gesamte Alginat betrachtet.

Hierfür wurde das Manucol LB nach Kapitel 4.1.2 hydrolysiert und ebenfalls eine

Konzentrationsreihe mit Mangan angesetzt. Die 13C-NMR-Spektren sind in Abbildung 5.24

aufgeführt. Die Einflüsse des Mangans auf das Alginat sind deutlich in den aufgenommenen

Spektren zu erkennen. Wie unter Kapitel 6.3 beschrieben, ist es möglich, die Signale im

Spektrum einzelnen Triaden zuzuordnen. Diese Sensibilität der Kohlenstoffatome auf die

nächsten Nachbarn ermöglicht eine präzise Zuordnung der von den Manganionen

bevorzugten Bausteine der Alginatkette. In diesem Falle würden für die Signale der

Kohlenstoffatome einer Position mit unterschiedlichen Triaden unterschiedliche

Verbreiterungen erwartet werden. Dies findet man tatsächlich in den aufgezeichneten

Spektren. Besonders deutlich zeigt sich dieser Effekt bei den Resonanzsignalen der C-1

Kohlenstoffe des Guluronats (s. Abbildung 5.25). Man sieht eine Verbreiterung des

GGM/MGM Signals. Dieses Signal ist bereits bei einer Konzentration von 0,3mmol/L Mn2+

aufgrund der extremen Verbreiterung kaum detektierbar. Eine geringere Verbreiterung findet

man für das MGM/GGG Signal. Die C-1 Resonanzsignale der Triaden mit Mannuronat als

Zentralatom werden nicht verbreitert. Diese Ergebnisse sprechen für einen bevorzugten

Aufenthaltsort der Manganionen an GM Einheiten der Alginatketten mit Präferenz zum

Guluronat. Auch hierfür wurde eine Energieminimierung im MM2 Kraftfeld durchgeführt,

diese ist in Abbildung 6.13 dargestellt.

Abb. 6.13: Energieminimierte Struktur eines MG-Hexamers (M: grün; G: grau) in Gegenwart von zweiwertigen Manganionen

C-1 C-1

6 Diskussion

132

Die Energieminimierung zeigt, dass der C-1 Kohlenstoff der Mannuronatgruppe die größte

Entfernung zum Manganionion hat und aus diesem Grunde auch keinerlei Wechselwirkung

der C-1(M) Kohlenstoffe detektiert werden kann. Das bedeutet weiterhin, dass auch für diese

Wechselwirkung des Mangans mit alternierenden Ketten zur die Energieminimierung im

MM2 Kraftfeld eine plausible Struktur liefert.

Es wurden noch weitere Wechselwirkungen der einzelnen Kohlenstoffe des Manucol mit

Mangionen detektiert. Man fand eine Verbreiterung der M-5 und G-5 Signale sowie eine

Verbreiterung des G-2 Signals. Diese Verbreiterungen können nicht eindeutig durch eine

Energieminimierung visualisiert werden. Bei der starken Wechselwirkung der

Carboxylkohlenstoffe (C-6) der einzelnen Monomerbausteine mit den Manganionen wirkt

wiederum ein Teil des Magnetfeldes auf die direkt benachbarten C-5 Kohlenstoffe. Das G-2

Signal kann natürlich auch aufgrund eines solchen Effektes betroffen sein. Nimmt man an,

dass weitere Elektronendichte vom glykosidischen Sauerstoff auf das Manganion übertragen

wird, so ist nicht nur der C-1 Kohlenstoff betroffen, sondern auch der direkte Nachbar, der C-

2 Kohlenstoff des Guluronates. Dies würde die Verbreiterung des G-2 Signals erklären.

6.1.6 13C-NMR-Spektroskopie an acetyliertem Alginat in Gegenwart von

Manganionen

Die Untersuchungen am Algenalginat Manucol LB repräsentieren eine erste Näherung der

Wechselwirkungen bakterieller Alginate mit Mangan. Da sich die bakteriellen Alginate aber

nicht nur in ihrer Sequenz, sondern auch durch die Anwesenheit von Acetylgruppen

unterscheiden, wurde das Manucol LB, wie unter Kapitel 4.1.5 beschrieben, acetyliert. Den

Effekt der Acetylgruppen auf die Hydrolysierbarkeit und Sequenzanalyse der Alginate wurde

bereits unter Kapitel 6.1.4 der Diskussion beschrieben. In den folgenden Abschnitten soll der

Effekt der Acetylierung der Mannuronateinheiten des Manucol LB auf die Wechselwirkungen

mit Mangan diskutiert werden. Die NMR-Spektren dieser Mangankonzentrationsreihe finden

sich in Abb. 5.26 des Ergebnisteils. Man sieht deutlich, dass aufgrund der geänderten

chemischen Umgebung die Anzahl der Signale zugenommen hat. Weiterhin sieht man, dass

der Effekt von Mangan auf die Kohlenstoffe, die im unacetylierten Zustand am stärksten

beeinflusst werden, wesentlich geringer ist. Vergleicht man die C-6 Resonanzen aus Abb.

5.24 (ca.180 ppm) mit denen der Abb. 5.26, erkennt man bei den letzteren ein zusätzliches

Signal, dass von den Acetylgruppenkohlenstoffen stammt. Dieses Signal verändert sich in

dem hier gewählten Mangankonzentrationsbereich nicht. Dies ist ein eindeutiges Zeichen,

6 Diskussion

133

dass die Acetylgruppen in keiner Weise mit den Manganionen in Wechselwirkung treten.

Außerdem sieht man, dass die Carboxylresonanzen der Monomereinheiten weniger stark

verbreitert werden. Das bedeutet, die Wechselwirkung von Manganionen mit den

Alginatketten nimmt generell ab. Eine acetylierte Alginatkette zeigt hydrophobere

Eigenschaften als das Alginat mit Hydroxylgruppen am C-2 bzw. C-3 Kohlenstoff.

Der Vergleich der C-1 Resonanzen der beiden verschiedenen Alginate verdeutlicht die

schwächere Wechselwirkung des acetylierten Polysaccharids im Vergleich zum nicht

acetylierten. Hier findet man, dass der Zerfall des GGM/MGM Signals wesentlich schwächer

ist. Das bedeutet nicht nur, dass die acetylierten Mannuronateinheiten schwächere

Wechselwirkungen zeigen, sondern dass sich die Acetylierung auf das gesamte Molekül aus

wirkt und die Affinität des Guluronats zum Mangan in gleicher Weise wie die des acetylierten

Mannuronats zum Mangan beeinträchtigt.

6.1.7 Einfluss der Kationen Mangan und Calcium auf die Eigenschaften des

Manucol LB und des acetylierten Manucol LB

Zur weiteren Charakterisierung der Wechselwirkungen von Mangan mit Manucol LB und

acetyliertem Manucol LB wurden Leitfähigkeitstitrationen durchgeführt. An dieser Stelle

erfolgte ebenfalls ein Vergleich der Wechselwirkungen von Mangan und Calcium mit den

beiden Alginaten. Der jeweilige Leitwert wurde in µS/cm notiert. Der Verlauf einer solchen

Titration ist in Abb. 5.28 am Beispiel des acetylierten Alginats mit Calcium dargestellt. Die

anderen Titrationsverläufe sind im Anhang unter A.1 bis A.3 aufgeführt.

Aus den eingesetzten Alginatkonzentrationen von 1mg/mL konnten Stoffmengen-

konzentrationen von 5 mmol/L bezogen auf das jeweilige Alginatmonomer berechnet werden.

Die ermittelten Äquivalenzpunkte liegen zwischen den Werten 0,17 und 0,20 mmol/L für

Calcium- bzw. Manganionen bei den beiden Alginaten bedeutet. Das bedeutet eine

Anbindung der Ionen erfolgt an jedem zwanzigsten Monomer.

Das verwendete Algenalginat Manucol LB enthält homopolymere Guluronatbereiche die

durch das in dieser Arbeit gewählte Verfahren (Kap. 4.1.5) nicht acetyliert werden. Eine

Acetylierung macht das Gesamtmolekül zwar hydrophober aber die

Monomerzusammensetzung wird nicht verändert. Es ist bekannt, dass zweiwertige Kationen

bevorzugt mit Guluronatmonomeren wechselwirken. Aufgrund des durchgeführten

Experimentes kann man sagen, dass die Mangan- bzw. Calciumionen mit den

homopolymeren G-Blöcken dieses Alginats wechselwirken müssen da keine signifikanten

6 Diskussion

134

Unterschieden bei den Äquivalenzpunkten detektiert werden konnten und dieser Bereich des

Alginats nicht verändert wurde.

Die Titration der Alginate gegen die beiden Kationen zeigte einige Schwierigkeiten auf. Um

lokale Leitfähigkeitsmaxima durch Gelbildung an der Eintropfstelle zu vermeiden musste

während der Bestimmung stark gerührt werden. Die Umdrehungszahl des Rührers wurde für

alle Bestimmungen gleich gehalten, um somit einem Fehler vorzubeugen. Die Titrationen

konnten auch nur in sehr niedrigem Konzentrationsbereich durchgeführt werden, sodass

lediglich Aussagen über die Wechselwirkungen der Kationen entlang einer Alginatkette

gemacht werden können. Eine weitere Erhöhung der Kationenkonzentration führt zur

Gelbildung und zur Ausfällung von unlöslichen Calcium- bzw. Manganalginaten. Die relativ

geringen Änderungen in den Steigungen stellten ebenfalls ein Problem dar, da die

Äquivalenzpunkte nur schwer sehr eindeutig zu bestimmen waren.

Unter Berücksichtigung dieser Faktoren kann man aus den in Tabelle 5.7 aufgeführten

Ergebnissen schließen, dass die Monomerzusammensetzung entscheidend für

Wechselwirkung der beiden Kationen Mn2+ und Ca2+ ist. Zusätzlich kann man festhalten, das

beide Ionen Mn2+ und Ca2+ wohl hauptsächlich mit den nicht acetylierten homopolymeren G-

Blöcken wechselwirken. Diese Wechselwirkung findet aufgrund der niedrigen

Kationenkonzentrationen entlang einer Alginatkette statt. Mit dem hier gewählten Experiment

und den eingestellten Bedingungen war es nicht möglich Unterschiede zwischen acetyliertem

Manucol LB und nicht acetyliertem Manucol LB sowie zwischen den beiden Kationen Mn2+

und Ca2+ hervorzuheben.

Zum Abschluss wurde die Fällbarkeit der Alginate durch Mangan- und Calciumionen getestet

(s. Abb. 5.29 und 5.30). Hierzu wurden Alginatlösungen mit bestimmten Mengen der

jeweiligen Kationenlösungen versetzt, stehengelassen und anschließend zentrifugiert. Der

verbliebene, nicht gefällte Alginatanteil wurde durch den Uronsäuretest (4.3.2) bestimmt und

somit die gefällte Menge zurückgerechnet. Hier bestätigten sich wiederum die Erwartungen.

Das Alginat lässt sich deutlich besser durch Calcium fällen. Es wurden bis zu ca. 90% des

gesamten Alginats gemessen, wohingegen durch Mangan nur ca. 50% des gesamten Alginats

gefällt werden konnten. Hier wurden die Unterschiede zwischen acetyliertem und

unbehandeltem Manucol LB sehr deutlich. Die Fällbarkeit des acetylierten Alginats durch

Calciumionen sank um etwa 30%. Noch größer war der Effekt beim acetylierten Alginat und

den Manganionen, hier sank die Fällbarkeit um 80%.

6 Diskussion

135

Als letztes wurden die Veränderungen der Viskositäten der verschiedenen Alginate in

Gegenwart unterschiedlicher Calcium- bzw. Mangankonzentrationen gemessen. Diese

Ergebnisse sind in Abbildung 5.31 aufgeführt. Hier sieht man sehr deutlich die Zunahme der

Viskosität durch Calciumionen. Dieser Effekt wurde bereits vielfach in der Literatur

beschrieben. Des weiteren beobachtet man niedrigere Viskositäten der acetylierten Alginate

sowie eine schwächere Zunahme der Viskosität mit steigender Calciumionenkonzentration.

Die Viskositäten der Manganionen zeigen keine signifikanten Veränderungen.

Zusammenfassend lässt sich zur Charakterisierung der Wechselwirkungen von Manganionen

und Calciumionen mit acetylierten Algenalginaten sagen:

- die Acetylierung verringert die Wechselwirkungen des paramagnetischen Ions

Mangan mit den Monomerbausteinen des Alginats

- die Acetylierung beeinträchtigt die durch Calcium- und Manganionen induzierte

Fällung des Alginats

- die Acetylierung beeinträchtigt kaum die Anzahl der möglichen

Anknüpfungspunkte zweiwertiger Kationen im Konzentrationsbereich von 5

mmol/L Manucol LB

- die Acetylierung bewirkt einen geringeren Anstieg der Viskosität des Alginats

durch Zugabe von Calcium.

Durch die chemische Acetylierung wird aber weder die Molmasse (Tab. 6.1) noch die

Polydispersität der Moleküle erhöht. Die hohe Affinität von Algenalginat zu divalenten

Kationen basiert auf den strukturellen Charakteristika des Polymers. Die Polyguluronatanteile

im Alginat mit ihren Carboxyl- und Hydroxylgruppen und der polyanionische Charakter des

Moleküls sind in dieser Wechselwirkung einbezogen [Atkins et al.; 1973; Nilsson, 1992;

Ress, 1972]. Durch die Acetylierung des Algenalginats wird weder der Guluronatanteil noch

die Dissoziation der Carboxylgruppe signifikant beeinflusst. Dentini et al. [1984] fanden eine

Modifizierung der Ionisierungseigenschaften dieser Alginate Die Acetylierung setzt die

negative Nettoladung des Polymers herab und erhöht damit seinen hydrophoben Charakter.

Eine weitere Erklärung für die schwächeren Effekte divalenter Kationen auf acetylierte

Alginate ist die sterische Behinderung der Bindung der Ionen zum Polymer [Morris et al.,

1978; Morris u. Rees, 1980].

6 Diskussion

136

6.2 Charakterisierung bakterieller Alginate von P. aeruginosa

Im Rahmen dieser Arbeit wurden vier verschiedene mucoide Stämme von P. aeruginosa

untersucht. Von diesen Stämmen wurden nach 4.2.1 und 4.2.2 Biofilme gezogen; aus den

Filmen wurde das extrazelluläre Polysaccharid Alginat durch Reinigung nach 4.2.2 isoliert.

Bei zwei der untersuchten Stämme handelt es sich um Kulturen von ehemals nativen

Biofilmen. Die beiden anderen Stämme sind Mutanten mit Defekten in der O-Acetylierung.

Ein Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung der Sequenz dieser Alginate. Insbesondere sollte

der Einfluss der Mutation auf die Zusammensetzung des Alginats untersucht werden.

Zunächst jedoch wurde ein IR-Spektrum des Alginats aus P. aeruginosa aufgenommen. Hier

sieht man wiederum deutlich die Acetylgruppen des Mannuronats. Der Bande bei 1730 cm-1

wird der Absorption der C=O Streckschwingung zugeschrieben. Dies ist eine

charakteristische Bande der O-Acetylgruppen des Alginats [Evans u. Linker, 1973;

Sherbrock-Cox et al., 1984]. Eine weitere für die Acetylgruppe charakteristische Bande ist die

der C-O-C-Streckschwingung bei 1250 cm-1. Bei allen bakteriellen Alginaten wurden diese

Banden registriert, bei den beiden Mutanten waren sie jedoch nur sehr schwach ausgeprägt.

Von den Stämmen FRD1 und FRD1153 wurde nach Kapitel 4.2.3 EPS isoliert. Diese EPS

wurde mit Hilfe der SEC-Malls Analyse untersucht. Die Daten zeigen, dass die Molmassen

dieser bakteriellen Alginate bei ungefähr 1 ·106 g/mol liegen (Tab. 5.8). Die Alginate aus den

vier verschiedenen Pseudomonaden unterschieden sich im Acetylierungsgrad. Da die

Acetylierung die Hydrolysierbarkeit stark beeinflusst (s. Abb. 5.33), wurden die beiden

Alginate aus den nativen Stämmen nach 4.1.6 deacetyliert und anschließend hydrolysiert. Von

zwei hydrolysierten Alginaten wurden SEC-Malls Analysen gemacht. Die ermittelten

Molmassen lagen beim Alginat aus SG81 und beim Alginat aus FRD1152 bei ca. 200.000

g/mol (Tab. 5.8). Von allen Stämmen wurden hochauflösende 13C-NMR-Spektren

aufgezeichnet und die Resonanzsignale nach Grasdalen et al. [1981] zugeordnet. Die Spektren

der bakteriellen Alginate unterschieden sich von denen des Algenalginats Manucol LB. Der

signifikanteste Unterschied findet sich bei den Resonanzsignalen der Kohlenstoffe der C-1

Position im glykosidischen Ring. Man sieht deutlich, dass die Signale der GGG/MGG

Triaden fehlen. Es ist bereits bekannt, dass Alginate des Bakteriums P. aeruginosa keine G-

Blöcke enthalten [Haug et al., 1973]. Die anderen Signale konnten den restlichen Triaden

zugeordnet werden und durch Integration konnte die Sequenz eines jeden bakteriellen

Alginats bestimmt werden (Kap. 4.4.1 Gl. 4.1-4.2). In der Tabelle 5.10 sind diese Werte

6 Diskussion

137

aufgeführt. Die Abb. 5.36 zeigt einen Vergleich der vier verschiedenen bakteriellen Alginate.

In den Abbildungen werden die experimentell ermittelten Werte mit den aus dem M/G-

Verhältnis nach 4.4.2 berechneten statistischen Werten aufgeführt. Ein direkter Vergleich der

M/G-Verhältnisse der Alginate aus den vier Stämmen von P. aeruginosa zeigt nur marginale

Unterschiede. Die relativen Mannuronatanteile liegen bei 0,76 (SG81) und 0,68 (FRD1) für

die Wildtypen und bei 0,67 (FRD1151) bzw. 0.69 (FRD1153) für die beiden Mutanten. Die

Unterschiede zwischen den Stämmen sind unerheblich und liegen innerhalb der

experimentellen Ungenauigkeit.

Wie erwartet unterschieden sich die Alginate signifikant durch ihre Acetylierungsgrade. Das

Alginat der Mutante FRD1152 enthält nur 17% der Acetylgruppen des Alginats aus FRD1.

Diese durch die NMR-Spektroskopie gewonnenen Zahlen stehen in guter Übereinstimmung

mit den über Hestrin [1949] ermittelten Acetylierungsgraden aus Tab. 6.2. Der Acetylierungs-

grad für das Alginat aus FRD1153 lag unterhalb der Detektionsgrenze (5%) und konnte

deshalb durch die NMR-Spektroskopie nicht ermittelt werden.

Über den Acetylgruppentest von Hestrin wurde ein Acetylierungsgrad von 0,02 ermittelt.

Dieser Wert liegt bei 7% des Acetylierungsgrades des Ausgangsstammes FRD1.

Tab. 6.2: Acetylgruppengehalt der vier verschiedenen bakteriellen Alginate und des chemisch acetylierten Manucol LB. Ermittelt nach Hestrin, 1949

Alginat (% w/w)

Acetylierungsgrad

bez. auf

Gesamtmolekül

SG81 *1 6,79 0,23

FRD1 *2 8,06 0,27

FRD1152 *2 1,33 0,05

FRD1153 *2 0,70 0,02

Manucol LB 7,68 0,26

*1) aus S. Grobe, 1994; *2) aus P. Tielen 1999

Der interessanteste Unterschied zwischen den verschiedenen Alginaten zeigt sich bei der

Betrachtung der Monomersequenzen. Abb. 5.36 enthält einen Vergleich zwischen der

relativen Verteilung verschiedener Triaden FXYZ, die experimentell bestimmt wurden

(Balken), mit den korrespondierenden Häufigkeiten PXYZ=PX · Py · PZ einer komplett

6 Diskussion

138

statistischen Kettenverteilung, die auf dem M/G-Verhältnis basiert (Linien). Während das

Algenalginat Manucol LB (Abb. 5.13) nur schwache Abweichungen zwischen

experimentellen und berechneten Triadenhäufigkeiten zeigen, stellt sich die Situation für die

bakteriellen Alginate aus SG81 und FRD1 komplett anders dar. Die Häufigkeit der Triade

MMM ist wesentlich geringer als durch das M/G-Verhältnis berechnet. Bei einem

Mannuronatgehalt von 0,76 für den Stamm SG81 wird eine Häufigkeit von PMMM=(0,76)3=

0,44 erwartet. Stattdessen wurde nur ein Wert von FMMM=0,11 gemessen. Gleichzeitig sind

die Häufigkeiten der MMG/GMM Triaden sowie der GMG Triade stark erhöht. Im Gegensatz

zum Algenalginat sind die GGG Triaden nicht präsent.

Diese Beobachtungen deuten auf die Gegenwart eines aktiven Kontrollmechanismus während

der Biosynthese eines bakteriellen Alginats. Offensichtlich existiert ein Mechanismus, der die

Ausbildung von MMM Triaden vermeidet und die Bildung von MMG/GMM sowie GMG

Triaden bei der Alginatsynthese bevorzugt. Dieser Mechanismus scheint bei den Mutanten

FRD1152 und FRD1153 beeinflusst zu sein. Im Gegensatz zu den beiden Wildtypen

produzieren diese Stämme Alginate, denen die signifikanten Abweichungen von den

statistisch ermittelten Werten fehlen. In diesen Fällen ist die experimentell detektierte

Häufigkeit der MMM Triade weitestgehend identisch mit den statistisch berechneten

Häufigkeiten. Die Acetylierung der Mannuronateinheiten während der Biosynthese des

Alignats ist offensichtlich gekoppelt mit dem Mechanismus, homo-M-Blöcke zu vermeiden

und alternierende Bereiche bevorzugt auszubilden.

Die biologische Motivation für die bevorzugte Produktion alternierender Blöcke in

bakteriellem Alginat ist nicht bekannt. Im folgenden Abschnitt werden jedoch einige

Spekulationen für eine solche Motivation aufgeführt. Die potentiellen Vorteile des

resultierenden Alginats bezüglich der mechanischen Stabilität der in Wasser geformten

Gelphase könnte ein solcher Grund sein. Messungen der Mobilität der Monomereinheiten in

Alginatketten [Mayer et al., 2001] zeigen, dass Calciumionen fester durch MG- oder GM-

Blöcke gebunden werden als durch Mannuronat gebildete M-Blöcke [Lattner et al., 2003].

Die Tendenz von zweiwertigen Kationen zu MG oder GM Paaren, wurde auch für

Calciumionen in Gegenwart von G-Blöcken detektiert [Wang et al, 1993]. Diese Ergebnisse

sprechen für einen weiteren, zusätzlich dem von Rees [1970] postulierten

Komplexierungsmechanismus. Im Gegensatz zu dem von Wang et al. untersuchten

Algenalginat fehlen den in dieser Arbeit untersuchten bakteriellen Alginaten aus P.

aeruginosa G-Blöcke. Aus diesem Grunde können stabile Gele nicht über den „egg-box“-

Mechanismus ausgebildet werden. Verwendet man die von Wang et al. gemachten

6 Diskussion

139

Beobachtungen, dass selbst Alginate mit G-Blöcken an den GM- bzw. MG-Positionen des

Alginatstrangs in Wechselwirkung mit zweiwertigen Kationen treten, lassen sich die in Tab.

5.10 beobachteten überproportionalen Häufigkeiten von alternierenden Sequenzen erklären.

Die beiden nativen Stämme von P. aeruginosa produzieren Alginate mit größeren

Häufigkeiten an MG- oder GM-Paaren, damit diese bakteriellen Alginate stabile Gele mit

zweiwertigen Kationen, bevorzugt Calciumionen, bilden können. Diese Hypothese soll durch

die Untersuchung der Wechselwirkungen dieser Alginate mit Calcium und Mangan in den

nächsten Abschnitten bestätigt werden.

6.3 Wechselwirkung der bakteriellen Alginate mit den

zweiwertigen Kationen Calcium und Mangan

6.3.1 13C-NMR-spektroskopische Untersuchung der Wechselwirkungen der

bakteriellen Alginate mit Manganionen

Für die Wechselwirkungen der bakteriellen Alginate mit Manganionen wurden die Alginate

aus FRD1 als Wildtyp und das Alginat aus FRD1153 als Mutante ausgewählt. Das Alginat

aus FRD1153 enthält den niedrigsten Acetylgruppenanteil. Die Alginate wurden nach 4.2.2

isoliert, gereinigt und nach 4.1.3 hydrolysiert. Für die Untersuchung der Wechselwirkungen

mit Mangan wurde das Alginat aus FRD1 nicht deacetyliert, da der Effekt dieser für P.

aeruginosa Alginate charakteristischen Bausteine einbezogen werden sollte.

Es wurden wie bei der Untersuchung des Algenalginats Konzentrationsreihen der Alginate

mit Mangan angesetzt und hochauflösende 13C-NMR-Spektren aufgezeichnet. Die Spektren

des Alginats aus der Mutante FRD1153 sind in Abb. 5. 38 aufgeführt. In Abb. 5.39 sind die

C-1 Resonanzen des Alginats mit zunehmender Mangankonzentration dargestellt. Das

Spektrum des acetylierten Alginats aus FRD1 enthält zusätzliche Signale aufgrund der durch

die O-Acetylgruppen veränderten chemischen Umgebung (s. Abb. 5.40) Aus diesem Grunde

war eine Zuordnung einzelner Triaden in diesem Spektrum nicht möglich (s. Abb. 5.41).

6 Diskussion

140

Doch zunächst einmal die Ergebnisse aus der Mangankonzentrationsreihe mit dem nahezu

unacetyliertem Alginat der Mutante FRD1153. Eine starke Verbreiterung der Signale und

damit die stärkste Wechselwirkung mit den Manganionen wird für die C-6 Resonanzen und

die Resonanz der GGM/MGM Triaden detektiert. Eine starke Wechselwirkung mit

Manganionen bedeutet in diesem Zusammenhang die größte Nähe bzw. die längste

Aufenthaltsdauer des Manganions in der Nähe der C-1 bzw. C-6 Resonanzen. Schwächere

Wechselwirkungen in Form von Linienverbreiterungen werden für die M-5, G-5 und G-2

Signale gefunden. Für diese drei Signale wurden auch Änderungen der chemischen

Verschiebung detektiert. Für das Signal des C-5 Kohlenstoffs des Mannuronats wurde ein

Shift von 0,30 ppm gefunden. Der Shift für das G-2 Signal beträgt 0,23 ppm und für das G-5

Signale 0,10 ppm. Die starken Wechselwirkungen mit C-6 und dem MGM/GGM Triaden sind

auch beim Algenalginat Manucol LB detektiert worden. Die beiden Alginate aus FRD1153

und das Manucol LB besitzen einige Gemeinsamkeiten. Die M/G-Verhältnisse von 0,59/0,41

für das Algenalginat und 0,69/0,31 für das Alginat aus FRD1153 liegen in ähnlicher

Größenordnung. Die Sequenz beider Alginate entspricht annähernd statistischen

Anordnungen. Der einzige signifikante Unterschied der beiden Alginate ist die komplette

Abwesenheit von GGG Triaden bei dem bakteriellen Alginat. Aus diesem Grunde erstaunt es

nicht, dass die Wechselwirkungen ähnlicher Natur sind.

Das Alginat, das von dem Bakterium des Stammes FRD1 gebildet wird, besitzt ein M/G-

Verhältnis von 0,68 zu 0,32 und ist also ebenfalls mit dem Alginat aus FRD1153 und

Manucol LB vergleichbar. Die Spektren zeigen die gleichen Auffälligkeiten wie bei dem

chemisch acetylierten Manucol LB (Abb. 5.39). Im Bereich der Carboxyl-Kohlenstoffe bei

ca. 180 ppm wird das Signal der Carboxylgruppen des Alginats vollkommen ausgelöscht. Das

Signal der Acetylgruppen zeigt hingegen keinerlei Veränderung. Die Signale der C-1

Resonanzen werden im Bereich der MGM/GGM Triaden ausgelöscht. Es wurde ebenfalls

eine Verbreiterung der M-5, G-5 und G-2 Resonanzen gefunden. Eine Bestimmung der

chemischen Verschiebungen der einzelnen Signale brachte auch hier einen Shift bestimmter

Signale hervor (Tab. 5.12). Detektiert wurde Veränderungen der chemischen Verschiebungen

für G-2 von 0,22 ppm, für G-5 von 0,24 und für M-5 von 0,65 ppm. Diese

Kohlenstoffatomresonanzen wurden ebenfalls beim Alginat aus FRD1153 verschoben.

Zusätzlich wurde das Signal der M-3 Resonanz um 0,22 ppm verschoben. Diese zusätzlich

Verschiebung spricht für leicht veränderte Wechselwirkung des Manganions mit der

acetylierten Alginatkette aus FRD1. Für dieses bakterielle Alginat wurde eine

energieminimierte Struktur über ChemOffice 8.0 ermittelt, sie wird in der Abbildung 6.14

6 Diskussion

141

gezeigt. Die Struktur macht deutlich, das eine Wechselwirkung unter Mitwirkung der OH-

Gruppe am M-3 nur durch eine 1-4-verknüpfte GM-Sequenz erfolgen kann. In diesem Falle

liegt die OH-Gruppe des C-3 Kohlenstoffs direkt neben der glykosidischen Bindung am C-4

des Mannuronats.

Abb. 6.14: Energieminimierte Struktur einer M-G-M(ac)-G-M-M(ac)-Sequenz in Gegenwart eines Manganions

Die über die Änderung der chemischen Verschiebung aus Gl. 6.1 ermittelten relativen

Abstände der Kohlenstoffe zum Mangan ergeben, dass das G-5 Atom die größte Nähe besitzt,

die Atome M-3 und G-2 etwa den gleichen Abstand haben und das M-5 den größten Abstand

besitzt. Für das Alginat aus FRD1153 wurden ebenfalls über Gleichung 6.1 aus den

Änderungen der chemischen Verschiebungen die relativen Abstände der Kohlenstoffatome

zum Manganion bestimmt. Hier fand man den größten Abstand für das G-5, gefolgt vom G-2

und schließlich das M-5 mit der größten Nähe zum Mangan.

Diese Unterschiede zwischen dem Alginat aus FRD1 und FRD1153 beruhen vermutlich auf

den strukturellen Unterschieden der beiden Alginate. Der signifikanteste Unterschied sind die

im FRD1 enthaltenen Acetylgruppen. Zusätzlich besitzen die beiden Alginate eine andere

Sequenz. Das Bakterium P. aeruginosa FRD1 bildet bevorzugt Alginate mit alternierenden

Ketten und vermeidet homopolymere M-Blöcke. Das Alginat der Mutante FRD1153 bildet

nahezu statistisch angeordnete Alginatketten [Schürks et al., 2002]. Aus diesem Grunde ist

der Unterschied in den Wechselwirkungen der Alginate mit Mangan nicht eindeutig den

G-6 M-6

G-2 M-3

6 Diskussion

142

Acetylgruppen zuzuschreiben. Es ist jedoch sehr wahrscheinlich, dass zweiwertige Kationen

wie das Mangan mit den GM-Sequenzen des acetylierten Alginats eine andersartige

Wechselwirkung eingehen. Dies liegt an der durch die Acetylierung veränderten negativen

Nettoladung. Es liegen also zwei unterschiedliche Wechselwirkungen von acetyliertem und

acetylgruppenfreiem, bakteriellem Alginat mit Manganionen vor. Diese Beobachtungen

werden unterstützt durch die vom chemisch acetyliertem Manucol gefundenen Ergebnisse.

Die starken Wechselwirkungen der GM-Sequenz mit Mangan wurden auch bei CD-

Experimenten von Wang et al., 1994 mit Alginaten und Calcium detektiert. Bei dieser starken

Wechselwirkung waren die Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen und Ring-Sauerstoffe

beteiligt. Die im Rahmen dieser Arbeit detektierten Verbreiterungen der M-5 und M-3

Signale indizieren, dass M-Reste ebenso an der Manganwechselwirkung beteiligt sind. Die

Beteiligung von Mannuronatresten an Wechselwirkung mit Mangan wurde für alle in Rahmen

dieser Arbeit detektierten Alginate beobachtet. Das ist besonders bemerkenswert für das

Algenalginat Manucol LB, da es über homopolymere G-Blöcke verfügt und trotzdem starke

Wechselwirkungen mit MG-Blöcken detektiert wurden. Dies gibt einen Hinweis darauf, dass

nicht ausschließlich G-Reste, sondern ebenso GM (oder MG)-Sequenzen an der

Wechselwirkung beteiligt sind. Das bedeutet, dass M-Reste ebenfalls eine Rolle im

Gelierungsprozess von Alginat mit Calcium spielen.

6 Diskussion

143

6.3.2 Affinitätschromatographie von Alginat aus P. aeruginosa SG81

Im Rahmen einer Diplomarbeit wurde von den vier hier untersuchten verschiedenen Stämme

Alginat nach 4.2.2 isoliert und affinitätschromatographisch untersucht. Bei der verwendeten

Methode handelte es sich um eine Lectinaffinitätschromatographie bei der das Lectin

Concanavalin A (ConA) an die Sepharose 4B gebunden wurde. Concanavalin A ist ein

tetrameres Metalloprotein, das aus Canavalia ensiformis isoliert wurde.

Das ConA bindet Moleküle, die α-D-Mannopyranosyl, α-D-glucopyranosyl und sterisch

verwandte Reste besitzen. Die bindenden Zucker benötigen Hydroxylgruppen. ConA mit

Sepharose 4B wird zur Trennung und Reinigung von Glykoproteinen, Polysacchariden und

Glykolipiden routinemäßig eingesetzt. Essentiell für die Bindungseigenschaften von ConA

Sepharose 4B ist die Gegenwart von Mn2+ und Ca2+. Die beiden Ionen sind im ConA komplex

gebunden. Strathmann [2003] zeigte, dass Alginat mit fluoreszenzmarkiertem ConA

visualisiert werden kann und geht von einer Bindung des ConA an die Alginatbausteine aus.

Zur Untersuchung der Spezifität und Art der Bindung von gereinigtem Alginat von

P.aeruginosa SG81 an ConA wurde eine Lektin-Affinitätschromatographie mit der oben

beschriebenen Säulenpackung durchgeführt. Das aufgegebene Alginat eluierte in drei

verschiedenen Fraktionen. Es wurde vermutet, dass die drei Fraktionen drei verschiedene

Alginate enthalten. Aus diesem Grunde sollte eine Sequenzanalyse der verschiedenen

Alginate erfolgen.

Von der ersten Fraktion wurde ein hochauflösendes NMR-Spektrum aufgezeichnet (s. Abb.

5.42). Diese Fraktion enthält Alginat, welches nicht an ConA bindet. Das NMR-Spektrum

zeigte Charakteristika, die bei Alginaten in Gegenwart des paramagnetischen Ions Mangan

gefunden werden. Es wurde festgestellt, dass die Aktivität der ConA Sepharose 4B Säule mit

jedem neuen Chromatographiedurchlauf sinkt und somit die Trennbarkeit der Alginate durch

die Säule verschlechtert wurde. Dies ist ein wichtiges Indiz für die Affinität von Manganionen

zu Alginaten. Das in der Säule enthaltene Mangan wird mit jedem Chromatographie-

durchgang ausgewaschen und somit nimmt die Mangankonzentration in der Säule ab. Für die

Bindungseigenschaften von ConA ist die Gegenwart von Mn2+ essentiell. Eine sinkende

Manganionenkonzentration erklärt den Abfall der Aktivität der Säule.

Wenn man nun bedenkt, dass die Affinität von Alginat zu Calciumionen, die ebenfalls in der

Säule enthalten sind, viel größer ist, liegt die Vermutung nahe, dass diese Ionen ebenfalls

nach und nach ausgewaschen werden. Ein Beweis dieser Vermutung konnte durch die NMR-

6 Diskussion

144

Spektroskopie nicht erbracht werden, da ein hochauflösendes Alginatspektrum in Gegenwart

von Caliumionen keine besonderen Charakteristika aufweist (s. 6.1.5).

Das Alginat der ersten Fraktion wurde mit EDTA-Lösung behandelt, dialysiert und

lyophilisiert. Dieses Alginat wurde 13C-NMR-spektroskopisch untersucht. Das Spektrum ist

ebenfalls in Abb.5.41 (unten) aufgeführt. Die Abbildung 5.41 enthält weiterhin ein Spektrum

des nach 4.2.2 gereinigten Alginats aus P.aeruginosa SG81 (oben). Vergleicht man die drei

Spektren miteinander, so sieht man, dass der Fraktion 1 durch die EDTA-Behandlung die

Manganionen entzogen wurden. Das resultierende Spektrum (unten) ist nahezu identisch mit

dem Spektrum des gereinigten Alginats (oben). Es zeigt schärfere Linien, da durch die

Behandlung mit EDTA andere zweiwertige Ionen (z.B. Ca2+-Ionen) ebenfalls entfernt werden.

Bei der Lektin-Affinitätschromatographie muss also die Affinität der Alginate zu

zweiwertigen Ionen berücksichtigt werden. Die Säule sollte nach jedem

Chromatographiedurchgang mit den beiden Ionen behandelt werden und somit erneut

aktiviert werden. Genaue Aspekte über das Bindungsverhalten von ConA zu Alginaten

konnten durch diese Untersuchung bisher nicht beleuchtet werden.

6 Diskussion

145

6.3.3 Fällungsversuche bakterieller Alginate mit Calcium- und Manganionen

In der folgenden Tabelle wurde bei einer Konzentration von 10 mmol/L des jeweiligen Ions

der Anteil des gefällten Alginats bestimmt.

Tab. 6.3: Fällbarkeit der verschiedenen Alginate bei Kationenkonzentrationen von 10 mmol/L für Calcium und Mangan

Alginat Kation

(10mmol/L)

Alginat gefällt

(%)

Ca 44,7 FRD1

Mn 0

Ca 99,3 FRD1153

Mn 72,2

Ca 98,6 FRD1 deacetyliert

Mn 68,9

Ca 74,1 Manucol LB

Mn 20,8

Ca 17,6 Manucol LB acetyliert

Mn 0

Die Fällungsversuche zeigen die gleichen Tendenzen die bereits bei Manucol LB und

acetyliertem Manucol LB beobachtet wurden. Das nicht acetylierte Alginat aus FRD1153

lässt sich besser fällen als das Alginat aus FRD1. Die Fällbarkeit mit Calciumionen ist bei

allen Alginaten besser als mit Manganionen.

6 Diskussion

146

Fasst man die unter 6.3.1 und 6.3.3 diskutierten Ergebnisse für die bakteriellen Alginate aus

P. aeruginosa zusammen, so lassen sich folgende Aspekte festhalten:

- Die Manganionen zeigen eine große Präferenz zu GM- bzw. MG-Sequenzen der

Alginate von FRD1 und FRD1153

- Das Alginat aus FRD1153 zeigt eine dem Algenalginat Manucol LB analoge

Wechselwirkungen mit Mangan- und Calciumionen. Dies lässt sich auf die

Sequenz und die Acetylierung des Alginats zurückführen.

- Das Alginat aus FRD1 zeigt aufgrund seiner Acetylierung und seiner Sequenz eine

andere Wechselwirkung als das Alginat aus FRD1153 oder das Manucol LB. Hier

werden zusätzlich M-3 Kohlenstoffe durch das durch Mangan erzeugte

magnetische Moment beeinflusst

- Die Manganionen im Alginat der Fraktion 1 aus der Lektin-Affinitätschroma-

tographie von Alginat aus SG81 lassen sich durch EDTA-Behandlung entfernen.

Dies zeigt die Reversibilität dieser Wechselwirkung an

- Die Fällbarkeit der bakteriellen Alginate aus P. aeruginosa FRD1 und FRD1153

ist analog zu der bei Manucol LB beobachteten Fällbarkeit

Diese Ergebnisse unterstützen die unter 6.2 aufgestellte Hypothese für Alginate aus mucoiden

P. aeruginosa Stämmen. Es wurde vermutet, das diese Bakterien bevorzugt alternierende

Ketten produzieren. Die überproportionale Häufigkeit von alternierenden Sequenzen lässt sich

auf das Komplexierungsverhalten mit zweiwertigen Kationen zurückführen. Das durch die

Bakterien extrazellulär ausgeschiedene Alginat bildet mit den anderen Bestandteilen der EPS

eine stabile Matrix für Biofilme dieser Bakterien.

7 Zusammenfassung

147

Kapitel 7

Zusammenfassung

Im ersten Teil dieser Arbeit wurde das Algenalginat Manucol LB untersucht und durch verschiedene Methoden charakterisiert. Ein IR-Spektrum wurde aufgezeichnet und die Molmasse wurde durch Viskosimetrie, SEC-Malls und Ultrazentrifugation ermittelt. Das Manucol LB diente als Modellsubstanz, woran die für die Untersuchungen der wesentlich teureren bakteriellen Alginate benötigten Bedingungen eingestellt wurde. Es wurden zwei Abbaumethoden getestet, die saure Hydrolyse mit verdünnter Salzsäure und der enzymatische Abbau. Es zeigte sich, dass die saure Hydrolyse für die weiteren Untersuchungen die günstigere Abbaumethode darstellt. Durch die an den Abbau anschließende Charakterisierung der Monomersequenz mit hochauflösender 13C-NMR-Spektroskopie nach Grasdalen et al. [1986] wurde eine nahezu statistische Anordnung der einzelnen Monomerbausteine entlang der Kette ermittelt. Eine Fraktionierung des Alginats erfolgte ebenfalls durch saure Hydrolyse. Hierbei konnten zwei Fraktionen gewonnen werden, die zu jeweils über 90% aus Polymeren der beiden Monomerbausteine α-L-Guluronat und β-D-Mannuronat bestehen. Mit Hilfe der hochauflösenden 13C-NMR-Spektroskopie wurden die Wechselwirkungen mit paramagnetischen, zweiwertigen Manganionen an der M-Fraktion, der G-Fraktion und dem moderat abgebauten Manucol LB untersucht. Hierbei wurden zwei verschiedene Anlagerungsmechanismen für das Mangan an homopolymeres Mannuronat und Guluronat gefunden. Dieser Unterschied konnte durch eine einfache Energieminimierung simuliert werden. Das moderat abgebaute Manucol LB diente zur Bestimmung der Wechselwirkungen der Manganionen mit den einzelnen Blockbausteinen des Alginats. Dies erfolgte über die den einzelnen Triaden zugeordneten Signale im 13C-NMR-Spektrum. Hier fand man eine Bevorzugung der GGG-Triade und der alternierenden Bestandteile der Alginatkette, wobei die Signale mit Guluronat als Zentralmolekül stärker beeinflusst wurden. Als nächstes wurde das Manucol LB chemisch acetyliert. Durch die Acetylierung sollten die bakteriellen Alginate so gut wie möglich simuliert werden. An diesem Alginat wurden ebenfalls die Wechselwirkungen mit paramagnetischen Manganionen und mit Calciumionen untersucht. Die 13C-NMR-spektroskopische Untersuchung lieferte im Vergleich zum nicht

7 Zusammenfassung

148

acetylierten Alginat eine schwächere Wechselwirkung der Manganionen mit den Monomerbausteinen des Alginats. Die Acetylierung erschwert die durch Calcium- und Manganionen induzierte Fällung des Alginats. Es wurde ein geringerer Anstieg der Viskosität des acetylierten Manucols durch Zugabe von Calcium- und Manganionen beobachtet als dies beim nicht acetylierten Manucol LB der Fall war. Bei den durchgeführten Leitfähigkeitstitrationen konnte allerdings keine Unterscheidung zwischen acetyliertem und nicht acetyliertem Manucol LB sowie zwischen den beiden verwendeten Kationen Ca2+ und Mn2+ getroffen werden. Dies wurde zurückgeführt auf die durch die Acetylierung unveränderte Sequenz des Alginats. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Alginate aus vier mucoiden Stämmen von P. aeruginosa isoliert und untersucht. Die Monomersequenzen wurden bestimmt und die Verteilung der Triadenbausteine mit einer einfachen Statistik verglichen. Hier fand man für die Alginate der beiden „Wild-Stämme“ SG81 und FRD1 eine signifikante Abweichung von einer rein statistischen Anordnung. Bei diesen Alginaten wurde ein hoher Anteil alternierender Sequenzen detektiert. Die aus FRD1 mutierten Stämme FRD1152 und FRD1153 zeigten diese Tendenz nicht mehr. Aus diesen Ergebnissen wurde die Hypothese aufgestellt, dass ein Kontrollmechanismus während der Biosynthese von bakteriellen Alginaten aktiv ist. Dieser Mechanismus vermeidet die Ausbildung homopolymerer Sequenzen und bevorzugt die Bildung alternierender Bereiche. Im nächsten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob die Wechselwirkungen mit Kationen eine Ursache für die bevorzugte Bildung alternierender Ketten sein kann. Mit Hilfe der 13C-NMR-Untersuchungen der bakteriellen Alginate mit Manganionen konnte eine große Präferenz der Ionen zu GM- bzw. MG-Sequenzen dieser Alginate beobachtet werden. Das Alginat aus FRD1 zeigte aufgrund seiner Acetylierung und seiner stark alternierenden Sequenz eine andere Wechselwirkung als die Alginate mit statischen Verteilungen der Monomerbausteine (Mutanten und Manucol LB). Diese Ergebnisse konnten durch Energieminimierungen in einem MM2-Kraftfeld simuliert werden. Die Fällbarkeit der bakteriellen Alginate aus P. aeruginosa ist analog zu der bei Manucol LB beobachteten Fällbarkeit. Das nicht acetylierte Alginat lässt sich besser fällen als das acetylierte und durch Calciumionen lassen sich die Alginate vollständiger ausfällen als durch Manganionen. Diese Ergebnisse unterstützen die aufgestellte Hypothese für Alginate aus mucoiden P. aeruginosa Stämmen. Die überproportionale Häufigkeit von alternierenden Sequenzen lässt sich auf das Komplexierungsverhalten mit zweiwertigen Kationen zurückführen. Das durch die Bakterien extrazellulär ausgeschiedene Alginat bildet mit den anderen Bestandteilen der EPS eine stabile Matrix für Biofilme dieser Bakterien.

8 Literatur

149

Kapitel 8

Literatur

Atkins und Nieduszynski, 1973 Atkins ED, Nieduszynski IA. Structural components of alginic acids II The crystalline structure of poly-α-L guluronic acid. Results of Y-ray diffraction and polarized infrared studies. Biopolymer Vol.:12, S. 1879-1887, 1973 Atkins et al., 1979 Aktins EDT, Isaac DH, Elloway HF. Conformations of microbial extracellular polysaccharides by X-Ray diffraction: progress on the Klebsiella serotypes In: Berkely RCW, Gooday GW, Ellwood DC (Hrsg.) Microbial Polysaccharides and Polysaccharases Academis press, London, 161-189; 1974 Baier, 1980 Baier RE, Substrata influences an adhesion of microorganisms and their resultant new surface properties In: Bitton G, Marshall KC (Hrsg.): Adsorption of microorganisms to surfaces, John Wiley, New York 59-104 1980 Benn und Günther, 1983 Benn R, Günther H. Moderne Pulsfolgen in der hochauflösenden NMR-Spektroskopie. Angew Chem 95:381-411 Beveridge et al., 1997 Beveridge, T.J. ; Makin, S.A. ; Kadurugamuwa, J.L. and Li, Z. : Interactions between biofilms and the enviroment. FEMS Microbiol. Lett. 20, 291-303, 1997

8 Literatur

150

Bock und Pederson, 1983 Bock K, Pederson Ch. Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy of monosaccharides. Adv Carbohydr Chem Biochem 41: 27-67, 1983 Bott, 1992 Bott TR, Industrial monitoring-cooling water systems In: Meto LF, Bott TR, Capdeville B, Fletcher M (Hrsg.): Biofilms-science and technology, Kluwer Academic Publ., Dordrecht, S.661-669 (1992) Botzenhart und Döring, 1993 Botzenhart K, Döring G. Ecology and epidemiology of Pseudomonas aeruginosa In: Campa M, Bendinelle M, Friedman H (Hrsg.);Pseudomonas aeruginosa as an opportunistic pathogen; Plenum Press, S.1-18 1993 Cadieux et al., 1983 Cadieux JE, Kuzio J, Milazzo FH, Kropinski AM. Spontaneuos release of lipopolysaccharide by Pseudomonas aeruginosa ; J Bacteriol,Vol:155, S.817-825, 1983 Carlstedt et al., 1983 Carlstedt I, Lindgren H, Sheehan JK, Ulmsten U, Wingenes L. Isolation and characterization of Human cervical- mucus glycoproteins Biochem J 211 13-22 1983 Carney and Muir, 1988 Carney SL, Muir H. The structure and function of cartilage proteoglycans Physiol Rev 68, 858-910 1988 Carpenter und Cerf, 1993 Carpenter B, Cerf O. Biofilms and their consequences with particular reference to hygiene in the food industry J Appl Bacteriol Vol:75(6), S.499-511 1993 Charackralis und Wilderer, 1989 Charackralis WG, Wilderer DA. Introduction In: Chackralis WG, Wilderer PA (Hrsg.): Structure and function of biofilms; John Wiley, New York, S.5-17

8 Literatur

151

Case, 1984 Case RM. Ca2+, stimulus-secretion coupling and cystic fibrosis In: Lawson D (Hrsg.) Cystic Fibrosis: Horizons, Wiley, Chichester S.53-67, 1984 Christensen und Characklis, 1990 Christensen BE, Characklis WG. Physical and chemical Properties of Biofilms In: Characklis WG, Marshall KC (Hrsg.) Biofilms, John Wiley, S.93-130, 1990 Clarke, 1990 Clarke PH, Introduction: Pseudomonas aeruginosa, an opportunist pathogen In: Gacesa P, Russel NJ (Hrsg.): Pseudomonas infection and alginates, Biochemistry genetics and pathology, Chapman and Hall, London, S.1-12; 1990 Costerton et al., 1999 Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP. Bacterial Biofilms: A common cause of persistent infections. Science 284 (5418): S.1318-1322 1999 Costerton et al., 1987 Costerton JW, Cheng KJ, Geesey GG et al. Bacterial Biofilms in nature and disease Annual Rev Microbiol 59, S. 1181-1186 Davidson et al., 1977 Davidson IW, Sutherland IW, Lawson CJ. Localization of O-acetyl groups in bacterial alginate J Gen Microbiol Vol:98, S. 603-606, 1997 Delben et al., 1982 Delben F, Cesaro A, Paoletti S, Crescenzi V Monomer composition and acetyl content as main determinants of the ionization behaviour of alginates Carbohydr Res Vol:100, S. C46-C50, 1982 Dentini et al., 1984 Dentini M, Crescenzi V, Blasi D. Conformational properties of xanthan derivates in dilute aqueous solution. Int J Biol Macromol, Vol.:6, S. 93-98, 1984

8 Literatur

152

Dirckx u. Davies, 2003 Dirckx P, Davies D. Mit freundlicher Genehmigung von p. Dirckx, per e-Mail vom 17.09.2003, Center for Biofilm Engineering Montana State University-Bozerman, 2003 Donnan und Rose, 1950 Donnan FG, Rose RC. Osmotic pressure, molecular weight and viscosity of sodium alginate Can J Res 28(b), S.105-113, 1950 Dudman, 1977 Dudman WF. The role of surface polysaccharides in natural environments In: Sutherland IW (Hrsg.) Surface Carbohydrates of the prokaryote Cell; Academic Press, London, S.357-414 1977 Dudman u. Wikinson, 1965 Dudman WF, Wilkinson SG. The composition of the extracellular polysaccharides of Azotobacter and Klebsiella. Biochem J Vol:62, S.289-295, 1965 Duncan, 1988 Duncan A. The ecology of slow sand filters. In: Graham, NJD (Hrsg.): Slow sand filtration: recent development in water treatment technology. Ellis Horwood Publ., Chichester; 1988 164-180 Dunne und Buckmire, 1985 Dunne WM jr, Buckmire FLA. Partial purification and mucoid strain of Pseudomonas aeruginosa isolated from a patient with cystic fibrosis Appl Environ Microbiol Vol.:50, S.562-567, 1985 Ertesvag und Valla, 1997 Ertesvag H, Valls S. Biosynthesis and applications of alginates. Polymer Degration and stability Vol.:59 S. 85-91, 1998 Evans u. Linker, 1973 Evans LR, Linker A. Production and characterization of slime polysaccharide of Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol, Vol.:116, S. 915-924

8 Literatur

153

Fett et al., 1986 Fett WF, Osman SF, Fishman MC, Siebles TS. Alginate production by plant pathogenic pseudomonads. Appl Environ Microbiol. Vol.:52, S. 466-473, 1986 Filippov und Kohn, 1974 Filippov MP, Kohn R. Determination of composition of alginates by infra-red spectroscopic methods Chem Zvesti Vol.:28, S.817-819, 1974 Fillisetti-Cozzi u. Carpita, 1991 Fillisetti-Cozzi TMCC, Carpita Nc. Measurement of uronic acids without interference from neutral sugars. Anal Biochem, Vol.:197, S. 157-162, 1991 Fischer und Doerfel, 1955 Fischer FG, Doerfel H. Die Polyuronsäuren der Braunalgen (Kohlenhydrate der Algen I). Z. Physiol. Chem. Hoppe-Seylers Vol.:302, S.186-203, 1955 Flemming, 1994 Flemming HC. Biofilme und mikrobielle Schädigung von Werkstoffen, Stuttgarter Berichte zur Siedlungswasserwirtschaft, 1994 Flemming und Wingender, 2000 Flemming HC, Wingender J. Extrazelluläre Polymere Substanzen- Baustoffe der Biofilme. Vom Wasser 94, 2000, S.245-266 Flemming et al. 2000 Flemming HC, Wingender J, Mayer C, Körstgens, V, Borchard W. Cohensivenes in biofilm matrix polymers. In: Lappin-Scott H, Gilbert P, Wilson M, Allison D. Community structure and co-operation in biofilms. SGM symposium 59. Cambrige University Press, S.87-105 Franklin u. Ohman, 1993 Franklin MJ, Ohman DE. Identification of algF in the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa which is required for alginate acetylation. J Bacteriol, Vol.:176, S. 1821-1830, 1993

8 Literatur

154

Franz, 1991 Franz G. Polysaccharide: Eine Einführung In: Franz G (Hrsg.) Polysaccharide, Springer Verlag Berlin, 1991 Friebolin, 1999 Friebolin H. Ein- und zweidimensionale NMR-Spektroskopie, 3. Auflage Wiley VCH Verlag Weinheim, 1999 Gacesa,1988 Gacesa P. Alginates Carbohydr Polymers 8, S.161-182 1988 Gacesa und Russel, 1990 Gacesa P, Russel NJ. The structure and properties of alginate In: Gacesa P. Russel NJ (Hrsg.), Pseudomonas Infection and alginates. Biochemistry, genetics and pathology, Chapman and Hall, S.29-49, 1990 Geesey, 1982 Geesey GG. Microbial exopolymers: ecological and aconomic considerations. ASM news 48 S.9-14 (1982) Gorin, 1981 Gorin PA. Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy of polysaccharides. Adv Carbohydr Chem Biochem Vol.:38, S.13-104, 1981 Govan 1990 Govan JRW, Characteristics of mucoid Pseudomonas aeruginosa in vitro in vivo. In: Pseudomonas infection and alginates Gacesa P, Russel NJ, (eds.); Chapman and Hall, New York, S.50-75, 1990 Govan et al., 1981 Govan JRW, Fyfe JAM, Jarman TR. Isolation of alginate-producong mutants of Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putita and Pseudomonas mendocina J Gen Microbiol Vol.:125, S.217-220, 1981

8 Literatur

155

Govan und Harris, 1986 Govan JRW, Harris GS Pseudomonas aeruginosa and cystic fibrosis:unusual bacterial adaption and pathogenisis Microbiol Sci Vol.:3, S.302-308, 1986 Grasdalen et al., 1977 Grasdalen H, Larsen B, Smidsrød O. 13C-NMR studies of alginate. Carbohydr Res. Vol.:56, S. C-11-C-15, 1977 Grasdalen et al., 1979 Gradalen H, Larsen B, Smidsrød O. A.p.m.r. study of the composition and sequence of uronate residues in alginate. Carbohydr Res, Vol.:68, Issue 1, S.23-31, 1979 Grasdalen et al., 1981 Grasdalen H, Larsen B, Smidsrød O. 13C-N.M.R. studies of monomeric composition and sequence in alginate. Carbohydr Res. Vol.:89, Issue 2, S.179.191, 1981 Grasdalen et al., 1983 Grasdalen H. High field 1H-NMR spectroscopy of alginate: sequential structure and linkage conformations Carbohydr Res Vol.118, S.255-260, 1983 Grobe, 1995 Grobe S, Wingender J, Trüper HG. Journal of Applied Bacteriology, Vol.:79, S.63-69 Grobe, 1996 Grobe S. Bedeutung des extrazellulären Polysaccharids Alginat für die Resistenz aquatischer Stämme von P. aeruginosa gegenüber Chlor, Bonn, 1995 Hacking et al., 1983 Hacking AJ, Taylor IWF, Jarman TR, Govan JRW. Alginate biosynthesis by Pseudomonas aeruginosa J Gen Microbiol Vol.:129, S.3473-3480, 1983 Hall LD, 1964 Hall LD. Nuclear magnetic resonance. Adv Carbohydr Chem Vol.:19, S.51-93, 1964

8 Literatur

156

Haug und Larsen, 1961 Haug A, Larsen B. Separation of uronic acids by paper electrophoresis Acta Chem Scand Vol.:15, S.1395-1396, 1961 Haug und Larsen, 1971 Haug A, Larsen B. Biosynthesis of alginate: Part II Polymannuronic acid C-5 epimerase from Azotobacter vinelandii (Lipman) Carbohydr Res Vol.:17, S.297-308, 1971 Haug et al., 1967 Haug, A. Larsen B, Smidsrød O. Studies on the sequence of uronic acid residues in alginic acid Acta chem Scand Vol.:21, S.691-704, 1967 Haug et al., 1974 Haug A, Larsen B, Smidsrød O. Uronic acid sequence in alginate from different sources. Carbohydr Res, Vol.:32, S. 217-225, 1974 Haugen et al., 1990 Haugen F, Kortner F, Larsen B. Kinetics and specifity of alginate lyases: Part I, A case study. Carbohydr Res Vol.: 198, S. 101-109, 1990 Hestrin, 1949 Hestrin S. The reaction of acetylcholine and other carboxylic acid derivates with hydroxylamine and its analytical application. J Biol Chem, Vol.: 180, S. 249-261, 1949 Hoffmann et al., 1977 Hoffmann M, Krömer H, Kuhn R. Polymeranalytik I, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1977 Holleman u. Wiberg, 1976 Holleman AF, Wiberg E. Lehrbuch der Anorganischen Chemie, Walter de Gruyter Verlag Berlin, New York, 1976 Isaac, 1985 Isaac DH. Bacterial polysaccharides In: Atkins EDT (Ed) Polysaccharide: Topics in structure and morphology Macmillan, London, S.141-184, 1985

8 Literatur

157

Jennings und Smith,1978 Jennings H, Smith ICP. Polysaccharide structures using carbon-13-nuclear magnetic resonance. Methods Enzymol L, S.39-49, 1978 Khadori und Yassien, 1995 Khadori N. Yassien M. Biofilms in device related infedtions J Ind Microbiol Vol.:15(3), S.141-147, 1995 Larsen und Haug, 1971 Larsen B, Haug A. Biosynthesis of alginate Part 1: Composition and structure of alginate produced produced by Azotobacter vinelandii Carbohydr Res Vol.:17, S.287-296, 1971 Lattner et al., 2003 Lattner D, Flemming HC, Mayer C.C-13-NMR study of the interaction of bacterial alginate with bivalent cations.Int J Biol Macromol Vol:33 (1-3), S. 81-88, 2003 Laurentzis, 2000 Laurentzis, Anke, Zum Einsatz eines Airlift Schlaufenreaktors als Drei-Phasen-Biowäscher bei der biologischen Abluftreinigung, Aachen Shaker, 2000 LeChevallier et al. 1996 LeChevallier MW, Welch NJ, Smith DB. Full-scale studies of factors related to coliform regrowth in drinking water. App Envirom microb Vol.:62(7), S.2201-2211, 1996 Lee et al., 1996 Lee JW, Ashby RD, Day DF. Role of acetylation on metal induced precipitation of alginates. Carbohydr Res, Vol.:29, S. 337-345, 1996 Lemieux und Stevens, 1966 Lemieux RU, Stevens JD. The proton magnetic resonance spectra and tautomeric equilibria of aldoses in deuterium oxide. Canad J Chem Vol.:44, S.249-262, 1966

8 Literatur

158

Li et al., 1990 Li DH, Ganzarczyk JJ. Structure at activated sludge flocs. Biotechnol Bioeng Vol.:35, S.57-65, 1990 Linker u. Jones, 1964 Linker A, Jones RS. A new polysaccharide resembling alginic acid from a Pseudomonas organism. Nature Vol.204, S.187-188 Linker und Jones, 1966 Linker A, Jones RS A new polysaccharide resembling alginic acid isolated from pseudomonads J Biol Chem Vol.:241, S.3845-3851, 1966 Loeb u. Neihof, 1975 Loeb FI, Neihof RA. Marine Conditioning films. In: Baier RE (Hrsg.): Applied chemistry at protein interfaces. Am Chem Soc, Washington; 319-335 Marsh und Bradshaw, 1995 Marsh PD, Bradshaw DJ. Dental Plaque as a biofilm. J Ind Microbiol Vol.:15(3), S.169-175, 1995 Marshall et. al., 1971 Marshall KC, Stout R, Mitchell R. Mechanism of the initial events in the sorption of marine bacteria to surfaces. J Gen Microbiol Vol.:68, S.337-348, 1971 McDowell, 1977 McDowell RH. Properties of alginates. Alginate industries limited London, 1977 Mc Neil et al., 1986 McNeil N, Darvill AG, Albersheim P, vanVeen R, Hooykaas P, Schilperoot R, Dell A. The discernible, structural features of the acidic polysaccharides secreted by different Rhizobium species are the same; Carbohydr Res Vol.:146, S.307-326, 1986 Morris et al., 1978 Morris EA, Rees DA, Thorn D. Chiroptical and stoichiometric evidence of a specific primary dimerization process in alginate gelation. Carbohydr Res, Vol.: 66, S. 145-154, 1978

8 Literatur

159

Morris und Rees, 1980 Morris EA, Rees Da. Competitive inhibition of interchain interactions in polysaccharide systems. J Mol Biol, Vol.: 138, S. 363-374, 1980 Nilsson, 1992 Nilsson S. A thermodynamic analysis of calciumalginate gel formation in the presence of inert electrolyte. Biopolymer Vol.: 32, S. 1311-1315, 1992 Ohman u. Chackrabarty, 1981 Ohman DE, Chackrabarty AM. Genetic mapping of chromosomal determinants for the production of the exopolysaccharide alginate in a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolate, Infect Immun, Vol.:33, S. 142-148, 1981 Osman et al. 1986 Osman SF, Fett WF, Fishman ML Exopolysaccharides of the phytopathogen Pseudomonas synringae pv. Glycina J Bacteriol Vol.:166, S.66-71, 1986 Phillips, 1969 Phillips I. Identification of Pseudomonas aeruginosa in clinical laboratory. J Med Microbiol, Vol:2, S-9-16, 1969 Phillips et al., 1994 Phillips G, Hudson S, Stewart WK. Persistence of microflora in biofilm within fluid pathways of contemporary halmodialysis monitors (Gambro AK-10) J Hosp Infec Vol.:27(2), S. 117-125, 1994 Pilnik und Voragen, 1980 Pilnik W, Voragen F. Polysaccharide In: Ullmann´s Enzyklopädie der technischen Chemie, Band 19, 234-261, Verlag Chemie Pitts et al., 1998 Pitts B, Stewart PS, McFetter GA. Bacterial Characterization of tiolet bowl biofilm, Biofouling Vol.:13(1), S.19-30, 1998

8 Literatur

160

Potera, 1999 Microbiology-Forging a link between biofilms and disease Science Vol.:283, S.1837, 1999 Powell, 1979 Powell DA. Structure, solution properties and biological interactions of some microbial extracellular polysaccharides. In: Berkeley RCW, Gooday GW, Ellwood DC (Hrsg.). Microbial Polysaccharides and Polysacharases, Academic Press, London, S. 117-160, 1979 Pschyrembel,1999 Pschyrembel Klinisches Wörterbuch (258. Auflage) De Gruyter Berlin, 1999 Rees, 1972 Rees DA. Shapely polysaccharides, Biochem J Vol.:126, S.257-273, 1972 Rees, 1977 Rees DA. Polysaccharide Shapes, 2nd Edn., Chapman and Hall, London, 1977 Rehm und Winkler, 1996 Rehm BHA, Winkler UK. Alginatbiosynthese bei P. aeruginosa und A. vinelandii: Molekularbiologie und Bedeutung; Biospekrum 2, S. 31-36, 1996 Riedel, 1990 Riedel E. Anorganische Chemie. Walter de Gruyter Verlag Berlin, New York, 1990 Russel und Gacesa, 1989 Russel NJ, Gacesa P The purificatation and chemical characterization of the alginate present of extracellular material produced by mucoid strains of Pseudomonas aeruginosa Carbohydr Res Vol.:135, S.147-154, 1989 Schlegel, 1992 Schlegel, H.G.; Allgemeine Mikrobiologie, Thieme Verlag Stuttgart, 1992

8 Literatur

161

Schmidt et al., 1983 Schmidt MA, Jann B, Jann K. Cell wall lipopolysaccharide of the urinary-tract-infective Escherichia coli O4:K12:H-. Structure of the polysaccharide chain. Eur J Biochem Vol.:137, S.163-171, 1983 Schoeffel und Link, 1933 Schoeffel E, Link KP. Isolation of α- and β-D-mannuronic acid J Biol Chem Vol.:100, S. 397-405 1993 Schopf et al., 1983 Schopf JW, Hayes JM, Walter MR. Aus: Earth´s earliest biosphere (Hrsg.: Schopf JW), Princeton University Press, New Jersey, 1983, S.361-384 Schürks et al., 2002 Schürks N, Wingender J, Flemming HC, Mayer C. Monomer composition and sequence of alginates from p. aeruginosa. Int J Biol Macromol Vol.: 30, S. 105-111, 2002 Sherbrock-Cox et al., 1984 Sherbrock-Cox V, Russel NJ, Gacesa P. The purification and chemical characterization of the alginate present in extracellular material produced by mucoid strains of Pseudomonas aeruginosa Carbohydr Res Vol.:135, S.147-154, 1984 Shoreit und Soltan, 1992 Shoreit AAM, Soltan ES, Selective isolation of fluorescent and nonflourescent Pseudomonas species from Sohag Governate (Upper Egypt) J Basic Microbiol, Vol.:32, S.397-403, 1992 Skjåk-Bræk et al., 1986 Skjåk-Bræk G, Grasdalen H, Larsen B Monomersequence and acetylation patterns in some bacterial alginates Carbohydr Res Vol.:154, S.239-250, 1986 Skjåk-Bræk, 1989a Skjåk-Bræk G. Selective acetylation of mannuronic acid residues in calcium alginate gels, Carbohydr Res, Vol.: 185, S. 119-129, 1989

8 Literatur

162

Skjåk-Bræk, 1989b Skjåk-Bræk G, Zanetti F, paoletti S. Effect of acetylation on some solution and gelling properties of alginates Carbohydr. Res. Vol.:185, S.131-138, 1989 Skjåk-Bræk et al., 1988 Skjåk-Bræk G, Paoletti S, Gianferrara T. Selective acetylation of mannuronic residues in calcium alginate gels. Carbohydr Res, Vol.:185, S. 1-11, 1988 Skoog u. Leary, 1996 Skoog DA, Leary JJ. Instrumentelle Analytik, Springer Berlin, Heidelberg, New York, 1996 Smidsrød et al., 1973 Smidrød O, Glover RM, Whittington SG. The relative extension of alginates having different chemical composition Carbohydr Res Vol.:27, S.107-118, 1973 Smidsrød und Grasdalen, 1984 Smidsrød O, Grasdalen H. Polyelectrolytes from seaweeds. Hydrobiologia Vol.:116/117, S.19-28, 1984 Smidsrød, 1974 Smidsrød O. Molecular basis for some physical properties of alginates in the gel state. Farad Disc Chem Soc Vol.:57, S.263-274, 1974 Smidsrød, 1970 Smidsrød O. Solution properties of Alginate, Carbohydr Res, Vol.:13, S.359-372, 1970 Sonnenschein, 1927 Sonnenschein C. Die Mucosus-form des pyocyaneus-bakteriums, Bacterium pypcyaneum mucosum. Zentr Bakt Parsit Orig Vol.:104, S. 365-373, 1927 Stanford (1883) Stanford ECC. On algin: a new substance obtained from some of the commoner species of marine algae Chem. New. Vol.:47, S.254-257, 1883

8 Literatur

163

Stockton et al., 1980 Stockton B, Evan LV, Morris ER, Rees DA. Circular dichroism analysis of the block structure of alginates from Alaria esculenta Int j Biol Macromol Vol.:2, S.176-178, 1980 Swann, 1970 Swann DA On the state of hyaluronic acid in a connective tissue matrix. In: Balazs EA (Hrsg.) Chemistry and molecular Biology of the intercellular Matrix, Vol.: 2, S.743-748, Academic Press, London 1970 Theisen, 1993 Theisen A. Untersuchungen zu Möglichkeiten und Grenzen der Ausschlusschromatografie-Vielwinkelstreulichtphotometer-Kopplung in Polymeranalytik, Dissertation Universität Duisburg, 1993 Tielen, 1999 Tielen P. Rolle der O-Acetylgruppen in Alginat für die Eigenschaften von Biofilmen von Pseudomonas aeruginosa, Diplomarbeit angefertigt am Lehrstuhl für Biologie der Mikroorganismen, Bochum, 1999 Vaisanen et al., 1998 Vaisanen OM, Weber A, Bennasar A et al.Microbial communities of printing paper machines. J Appl Microbiol Vol.:8416, S.1069-1084, 1998 Wingender, Neu, Flemming 1999b Wingender J, Neu TR, Flemming H-C (Hrsg.): Microbial extracellular polymeric substances, 1999 Wingender et al., 1999a Wingender J, Jaeger KE, Flemming H-C. Interaction between extracellular Polysaccharides and Enzymes. In: Wingender J, Neu TR, Flemming H-C (Hrsg.) Microbial Extracellular Polymeric Substances, 1999 Wingender et al., 2001 Wingender J, Strathmann M, Rode A, Leis A, Flemming HC. Isolation and biochemical characterization of extracellular polymeric substances from Pseudomonas aeruginosa, Methods Enzymol, Vol.: 336, S. 302-314, 2001

8 Literatur

164

Winter und Noll, 1998 Winter R, Noll F. Methoden der biophysikalischen Chemie, Teubner Studienbücher, Stuffgart 1998 Wolfaardt et al., 1999 Wolfaardt GM, Lawrence JR, Korber DR: Function of EPS In: Wingender J, Neu TR, Flemming HC (Hrsg.): Microbial extracellular polymeric substances, S. 171-200, Springer Heidelberg, New York, 1999

Anhang

165

Anhang Anhang A

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

200

400

600

800

1000

1200

Leitf

ähig

keit

(µS/

cm)

CaCl2-Konzentration (mmol/L)

Leitfähigkeitstitration Alginat 1mg/mL

Abb. A.1: Leitfähigkeitstitration des Algenalginats gegen CaCl2-Lösung

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Leitf

ähig

keit

(µS/

cm)

MnCl2-Konzentration (mmol/L)

Leitfähigkeitstitration Alginat 1mg/mL

Abb. A.2: Leitfähigkeitstitration des Algenalginats gegen MnCl2-Lösung

Anhang

166

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Leitf

ähig

keit

(µS/

cm)

MnCl2-Konzentration (mmol/L)

Leitfähigkeitstitration acetyliertes Alginat 1mg/mL

Abb. A.3: Leitfähigkeitstitration des acetylierten Alginats gegen MnCl2-Lösung

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

-0.0050.0000.0050.0100.0150.0200.0250.0300.035

RI-D

etek

tor (

Vol

t)

Volumen in mL

0.2850.2900.2950.3000.3050.3100.3150.320

Det

ekto

r 11

Abb. A.4: SEC-Malls Analyse der EPS isoliert aus P. aeruginosa SG81

Anhang

167

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28-0.0050.0000.0050.0100.0150.0200.0250.0300.0350.040

RI-

Det

ekto

r (V

olt)

Volumen in mL

0.2750.2800.2850.2900.2950.3000.3050.3100.315

Det

ekto

r 11

Abb. A.5: SEC-Malls Analyse der EPS isoliert aus P. aeruginosa FRD1152

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

-0.005

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

RI-D

etek

tor (

Vol

t)

Volumen in mL

0.27

0.28

0.29

0.30

0.31

0.32

0.33

Det

ekto

r 11

Abb. A.6: SEC-Malls Analyse der EPS isoliert aus P. aeruginosa FRD1153

Anhang

168

76,276,677,077,477,878,278,679,079,8

0,5h Hydrolyse

76,276,677,077,477,878,278,679,079,479,8

2h Hydrolyse

76.276.677,077,477,878,278,679,079,479,8

4h Hydrolyse

79,4

Abb. A.7: Resonanzen der C-4 und C-5 Position von Manucol LB nach unterschiedlichen

Hydrolysezeiten.

MMG

MMM

GMMGMG

GMM

MMM GMG

MMG

Anhang

169

174,8175,6176,4177,2178,0178,8

174,8175,6176,4177,2178,0178,8

174,8175,6176,4177,2178,0178,8

0,5 h Hydrolyse

2 h Hydrolyse

4 h Hydrolyse

Abb. A.8: Carboxylresonanzen (C-6) von Manucol LB nach unterschiedlichen Hydrolysezeiten

MMM

GGG

Anhang

170

Anhang B Abbildungsverzeichnis Abb. 2.1: 5 Stadien der Biofilmentwicklung von P.aeruginosa 1) conditioning film,

2) reversible und irreversible Adhäsion, 3) EPS-Produktion und Bildung von Mikrokolonien, 4) reifer, konfluenter Biofilm, 5) Ablösung einzelner Bestandteile und weitere Ausbreitung [P. Dirckx und D. Davies, 2003] 7

Abb. 2.2: Darstellung der verschiedenen Wechselwirkungsarten innerhalb der EPS-Matrix 10

Abb. 2.3: SEM Aufnahme von P. aeruginosa Bakterien 11 Abb.2.4: Häufig auftretende Zuckerbausteine pflanzlicher Polysaccharide 13

Abb. 2.5: Darstellung der 6 verschiedenen Kohlenstoffatome in einem Monosaccharid (Hexose) 14

Abb. 2.6: Sessel- und Wannenformen der Pyranose-6-ringstruktur von Monosacchariden. Diese Strukturen sind im Gleichgewicht miteinander, sowie mit dem Furanose-5-ring und den geraden Kettenformen der Monosaccharide 15

Abb. 2.7: Die vorherrschende Ringform von α-D-Glukose mit axialer Hydroxylgruppe am C1 und β-D-Glukose mit äquatorialer Hydroxyl- gruppe am C1 16

Abb. 2.8: Die vier Basisformen einfacher Polysaccharide. Die Form der Poly- saccharide wird bestimmt durch die enthaltenen Monosaccharide und durch die Art der glykosidischen Bindung. [Powell, 1979] 17

Abb. 2.9: Idealisierte Struktur eines linearen Polysaccharids in Lösung Zufallsknäuel mit Massezentrum ⊗ 20

Abb. 2.10: Konformation eines Polysaccharids mit negativen Oberflächen- ladungen bei verschiedenen Ionenstärken des Lösemittels 20

Abb.2.11: Differentielle Massenverteilungskurve einer Polymerprobe 22

Abb.2.12: Schematische Darstellung des Trennprinzips der SEC bei einem

Anhang

171

Säulenfüllmaterial (S) mit Poren (P) gleicher Geometrie und Größe für Teilchen (A-F) mit unterschiedlichen hydrodynamischen Volumina [Theisen A., 1993] 26

Abb.2.13: Schematische Darstellung des Trennprinzips der SEC für Teilchen mit zwei unterschiedlichen hydrodynamischen Volumina nach verschiedenen Durchflusszeiten der mobilen Phase (I<II<III). [Theisen, A., 1993] 27

Abb. 2.14: Kopplung der Protonen der Methylgruppe mit dem Proton am C-5 des glykosidischen Ringes am Beispiel α-L-Ramnose 30

Abb. 2.15: „off-resonance“ Spektroskopie an Aldosen (hier: α-L-Glucopyranose) und Ketosen (hier: β-D-Fructopyranose) 31

Abb. 2.16: Monomereinheiten des Alginats β-D-Mannuronat (M) und α-L-Guluronat (G) 34

Abb. 2.17: Struktur der verschiedenen Alginatblöcke in einem Alginatmakromolekül 35

Abb. 2.18: Die Chelatisierung von Calcium durch Polyguluronat (Egg-Box Struktur). Die grauen Kugeln stellen die Calciumionen dar (Rees, 1970) 36

Abb. 4.1: M-Monomereinheit eines Alginats mit R = H, COCH3 , G-Monomer- einheit eines Alginats 54

Abb. 4.2: Ermittlung der Wahrscheinlichkeiten von Diaden und Triaden aus dem M/G-Verhältnis 55

Abb.5.1: Mannuronatfraktion mit sechs klar unterscheidbaren Linien für die jeweiligen Kohlenstoffatome 62

Abb.5.2: Guluronatfraktion mit sechs klar unterscheidbaren Linien für die jeweiligen Kohlenstoffatome 62

Abb. 5.3: SEC-Malls der Guluronatfraktion 63

Abb. 5.4: SEC-MALLS der Mannuronatfraktion 64

Abb. 5.5: Auftragung der reduzierten Viskosität gegen die Konzentration g/100mL. Der Achsenabschnitt liefert die intrinsische Viskosität hier am Beispiel Polymannuronat

65

Anhang

172

Abb. 5.6 FT-IR Spektren der M-Fraktion und der G-Fraktion 66

Abb. 5.7: 13C-NMR-Spektrum von Manucol LB nach 0,5 h Hydrolyse in D2O 68

Abb. 5.8: Ausschnitt des 13C-NMR Spektrums von Manucol LB nach 0,5 h Hydrolyse 68

Abb. 5.9: Zuordnung der Triadensequenzen im Bereich der anomeren Kohlenstoffe 69

Abb. 5.10: Zuordnung einzelner Triadensequenzen im Resonanzbereich der Carboxyl-Signale 70

Abb. 5.11: Zuordnung einzelner Triadensequenzen im Resonanzbereich der C-4(M)- und C-5(M)-Signale 70

Abb. 5.12: C-1 Resonanzen bei unterschiedlichen Hydrolysezeiten 72

Abb. 5.13: Verteilung der einzelnen Triadenbausteine im Algenalginat Manucol LB, die Säulen sind die experimentell ermittelten Daten die Punkte die statistischen Werte 74

Abb. 5.14: Abbau des Algenalginats Manucol LB durch saure Hydrolyse mit Salzsäure 75

Abb. 5.15: Enzymatischer Abbau des Algenalgantes Manucol LB 76

Abb. 5.16: FT-IR-Spektrum des gereinigten Algenalginats Manucol LB 77

Abb 5.17: FT-IR-Spektrum des chemischen acetylierten Algenalginats Manucol LB 78

Abb. 5.18: Verdünnungsreihe des gereinigten Alginats 78

Abb. 5.19: Verdünnungsreihe des acetylierten Alginats 79

Abb. 5. 20: 13C-NMR Spektrum des acetylierten Manucol LB 80

Abb. 5.21: Hochauflösende 13C-NMR-Spektren der Mannuronatfraktion aus Manucol LB ohne Zusatz von Kationen (oben) und in 0,75 mmol/L Mn2+-Lösung 81

Anhang

173

Abb. 5.22: Veränderung der Halb^swertbreiten der Signale im 13C-NMR-Spektrum der M-Fraktion mit zunehmender Mangankonzentration 82

Abb. 5.23: Veränderung der Halbwertsbreiten der Signale im 13C-NMR-Spektrum der G-Fraktion mit zunehmender Mangankonzentration 82

Abb. 5.24: Gesamtalginatspektren Manucol LB mit zunehmender Mangankonzentration (0;0,3mmo/L und 0,75mmol/L). 83

Abb. 5.25: C-1 Resonanzen des Algenalginats Manucol LB, ohne Zusatz von Kationen (oben), in 0,3 mmol/L Mn2+-Lösung und in 0,75 mmol/L Mn2+-Lösung 84

Abb.:5.26: Gesamtalginatspektrum des acetylierten Manucol LB 85

Abb. 5.27: Vergleich der C-1-Resonanzen des Manucol LB (unbehandelt und acetyliert) bei verschiedenen Mangankonzentrationen 86

Abb. 5.28: Leitfähigkeitstitration des acetylierten Alginats gegen CaCl2-Lösung 87

Abb. 5.29: Calcium induzierte Fällung von acetyliertem (schwarz) und nicht acetyliertem (rot) Manucol LB 89

Abb. 5.30: Mangan induzierte Fällung von acetyliertem und nicht acetyliertem Manucol LB 89

Abb. 5.31: Viskositäten des Manucol LB (acetyliert und hydrolysiert sowie Unbehandelt und hydrolysiert) in Abhängigkeit von der Mangan- bzw.

Calciumionenkonzentration 90

Abb. 5.32: FT-IR Spektrum des Alginats isoliert aus dem Bakterium P. aeruginosa SG81 91

Abb. 5.33: SEC-Malls Analyse des bakteriellen Alginats aus P. aeruginosa FRD1 92

Abb. 5.34: Spektrum des gereinigten Alginats gewonnen aus P.aeruginosa FRD1 nach 1h Hydrolyse (oben). Spektrum des hydrolysierten und deacetylierten Alginats aus P. aerunginosa FRD1 (unten) 94

Abb. 5.35: Ausschnitt aus dem 13C-NMR Spektrum von FRD1152 ohne die Carboxylresonanzen (C-6) 95

Anhang

174

Abb. 5.36: Gesamtspektrum des aus P. aeruginsa SG81 gewonnenen Alginats; vergrößert wurde der Bereich der C-1 Resonanzen und die Signale wurden den jeweiligen Triaden zugeordnet 96

Abb. 5.37: Triadensequenzverteilungen der verschiedenen Alginate (Balken) im Vergleich zu den statistischen Verteilungen der Alginate (Punkte) 99

Abb. 5.38: Mangankonzentrationsreihe mit Alginat, dass aus FRD1153 gewonnen wurde 101

Abb. 5.39: C-1 Resonanzen des aus FRD1153 gewonnenen Alginats mit zunehmender Mangankonzentration 102

Abb. 5.40: Konzentrationsreihe mit Alginat aus FRD1 mit zunehmender Mangankonzentration 104

Abb. 5.41: C-1 Resonanzen des aus FRD1 gewonnenen Alginats mit zunehmender Mangankonzentration 105

Abb. 5.42: 13C-NMR-Spektren von Alginat, das aus SG81 gewonnen wurde. Oben: gereinigtes Alginat, Mitte: Oberes Alginat fraktioniert durch ConA-Sepharose™ 4B (Fraktion1), Unten: fraktioniertes Alginat nach einer Behandlung mit EDTA 107

Abb. 5.43: Vergleich der Fällbarkeit der beiden Alginate FRD1153 und FRD1 mit Calcium bei einer Zentrifugationsgeschwindigkeit von 40.000xg 108

Abb. 5.44: Vergleich der Fällbarkeit der beiden Alginate aus FRD1 und FRD1153 mit Manganionen bei einer Zentrifugationsgeschwindigkeit von 40.000xg 109

Abb.6.1: Energieminimierte Struktur des Poly-α-L-Guluronats 114

Abb.6.2: Energieminimierte Struktur des Poly-β-D-Mannuronats 114

Abb.6.3:Vergleich der Spektren gewonnen aus den Mannuronat-, Guluronat- und Gesamtalginatfraktionen. 115

Abb. 6.4: β-Eliminierungsreaktion zur Spaltung der Alginatketten 118

Abb. 6.5: Auftragung des Retentionsvolumens gegen die Hydrolysedauer der einzelnen Bestandteile des abgebauten Alginats 118

Anhang

175

Abb. 6.6: Auftragung des Retentionsvolumens der einzelnen Bestandteile des Hydrolysats gegen die Hydrolysedauer 119

Abb. 6.7: Schematische Darstellung der Abbauprozesse während der sauren Hydrolyse (links) und des enzymatischen Abbaus (rechts) mit zunehmender Hydrolyse- bzw. Bebrütungsdauer 120

Abb. 6.8: Energieminimierte Struktur eines Algenalginatstranges mit statistischer Anordnung 122

Abb. 6.9: TEM Aufnahme einer Calciumalginatperle [Dr. G. Bickerstaff, Department of biological Sciences, University Paisley] 123

Abb. 6.10: Orientierung der Spins paramagnetischer Mn2+-Ionen (in Lösung ) in einem äußeren Magnetfeld B0 126

Abb. 6.11: Energieminimierte Struktur eines Mannuronathexamers in Gegenwart eines Manganions 129

Abb. 6.12: Energieminimierte Struktur eines Guluronathexamers in Gegenwart eines zweiwertigen Manganions 130

Abb. 6.13: Energieminimierte Struktur eines MG-Hexamers (M: grün; G: grau) in Gegenwart von zweiwertigen Manganionen 131

Abb. 6.14: Energieminimierte Struktur einer M-G-M(ac)-G-M-M(ac)-Sequenz in Gegenwart eines Manganions 141

Anhang

176

Anhang C Tabellenverzeichnis

Tab. 2.1: Beispiele für unerwünschte Biofilme 5

Tab. 2.2: Chemische Verschiebungen typischer Gruppierungen in Polysacchariden

für 1H- und 13C-NMR Spektren 29

Tab. 5.1: Chemische Verschiebungen der Mannuronat- und Guluronatkohlen- stoffe in wässriger Lösung. Die Signale wurden mit THF als Standard normiert[Quelle: SDBS-Datenbank] 63

Tab. 5.2: Molare Massen der beiden homopolymeren Fraktionen 65

Tab. 5.3: Zuordnung der Signale zu einzelnen Triaden in13C-NMR Spektren vom Algenalginat Manucol LB (in ppm) 71

Tab. 5.4: Chemische Verschiebungen (in ppm) der restlichen Signale, die nicht einzelnen Triaden zugeordnet werden können 71

Tab. 5.5: Verteilung der Diaden- und Triadensequenz in Manucol LB, die roten Werte sind die statistisch berechneten 74

Tab. 5.6: Mittlere Molmassen der verschiedenen Alginate ermittelt aus den jeweiligen intrinsischen Viskositäten 79

Tab. 5.7: Ergebnisse der Titrationen für 1 mg/mL Alginatlösungen gegen Mangan und Calcium 88

Tab. 5.8: Mittlere Molmassen der Alginate aus den verschiedenen P. aeruginosa Stämmen ermittelt durch SEC-Malls 92

Tab. 5.9: Chemische Verschiebungen im Bereich 105 ppm – 63 ppm der einzelnen Signale in 13C-NMR-Spektren der verschiedenen Alginate aus den vier verschiedenen P. aeruginosa Stämmen 97

Tab. 5.10: Triadensequenzverteilungen der verschiedenen Alginate isoliert aus den vier untersuchten P. aeruginosa Stämmen 98

Anhang

177

Tab. 5.11: Chemische Verschiebungen (ppm) des Alginats aus FRD1153 bei unterschiedlichen Mangankonzentrationen, normiert an der chem. Verschiebung von Glycerin bei 63,05 ppm (SDBS-Datenbank) 103

Tab. 5.12: Chemische Verschiebungen (ppm) der einzelnen Signale aus Alginat aus FRD1 normiert gegen Glycerin bei 63,05 ppm (SDBS-Datenbank) 105

Tab. 5.13: Veränderungen der chemischen Verschiebung (Shift) der Resonanzsignale durch Zugabe von Mn2+-Ionen. Die verwendeten Alginate wurden aus mucoiden Aufwüchsen der Stämme FRD1 und FRD1153 isoliert 106

Tab. 6.1: Molmassen (g/mol) des gereinigten und acetylierten Manucol LB 124

Tab. 6.2: Acetylgruppengehalt der vier verschiedenen bakteriellen Alginate und des chemisch acetylierten Manucol LB. Ermittelt nach Hestrin,1949) 137

Tab. 6.3: Fällbarkeit der verschiedenen Alginate bei Kationenkonzentrationen von 10 mmol/L für Calcium und Mangan 145

Anhang

178

Curriculum Vitae

Persönliche Daten Name Natascha Emmerichs Geburtsname Schürks Geburtstag 08.03.1973 Geburtsort Sevelen jetzt Issum Familienstand verheiratet, keine Kinder

Schulbildung 1979 – 1983 Gemeinschaftsgrundschule Borth-Wallach 1983 – 1989 priv. Mädchenrealschule, Marienschule in Xanten, mittlere Reife 1993 - 1994 Berufsbildende Schulen des Kreises Kleve in Geldern,

allgemeine Fachhochschulreife

Berufsausbildung 1989 – 1993 Ausbildung zur Chemielaborantin, Bayer AG, Werk Uerdingen

Hochschulbildung an der Gerhard-Mercator-Universität Duisburg 1994 – 2000 Studium der Chemie mit dem Wahlpflichtfach Technische Chemie Abschluss: Diplom Chemikerin

Promotion 2000 – 2004 Promotion im Fachbereich Physikalische Chemie der Universität Duisburg-Essen, Campus Duisburg Thema: „Untersuchung der Wechselwirkungen von zweiwertigen Mangan- und Calciumionen an Algen- alginat und an Alginaten aus verschiedenen Stämmen des Bakteriums Pseudomonas aeruginosa“

Berufstätigkeit 04/2000 – 01/2004 Wissenschaftliche Mitarbeiterin im Fachbereich Physikalische Chemie der Universität Duisburg-Essen Campus Duisburg seit 02/2004 Referendariat für Sekundarstufe II am Gymnasium für die Fächer Chemie und Physik Duisburg, den 13.04.2004

Selbständigkeitserklärung Hiermit erkläre ich, die vorliegende Arbeit selbständig ohne fremde Hilfe verfasst zu haben und nur die angegebene Literatur und Hilfsmittel verwendet zu haben. Natascha Emmerichs 13.April 2004