Untersuchungen zu lokalen Immunreaktionen nach Impfung ...

Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchungen zu lokalen Immunreaktionen nach

Impfung gegen das Newcastle Disease Virus mit einem

rekombinanten Putenherpesvirus und einer herkömmlichen

Lebendvakzine

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

( Dr. med. vet. )

vorgelegt von

Jens-Christian Cors

aus Bonn

Hannover 2013

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Silke Rautenschlein, PhD

Klinik für Geflügel der Stiftung Tierärztliche

Hochschule Hannover

1.Gutachter: Prof. Dr. Silke Rautenschlein, PhD

2.Gutachter: Apl.-Prof. Dr. med. vet. Ludwig Haas

Tag der mündlichen Prüfung: 05.11.2013

Meiner Familie

V

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ....................................................................................................... V

Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................ VIII

Abbildungsverzeichnis .............................................................................................. XII

Tabellenverzeichnis ................................................................................................. XIV

Veröffentlichungen .................................................................................................... XV

1 Einleitung ............................................................................................................. 1

2 Literaturübersicht ................................................................................................. 3

2.1 Newcastle Disease .......................................................................................... 3

2.1.1 Einleitung ................................................................................................ 3

2.1.2 Definition ................................................................................................. 3

2.1.3 Historische Entwicklung .......................................................................... 3

2.1.4 Ätiologie/Taxonomie ............................................................................... 5

2.1.5 Morphologie und Genomaufbau .............................................................. 6

2.1.6 Replikation .............................................................................................. 7

2.1.7 Virulenz im Wirt ....................................................................................... 8

2.1.8 Molekularbiologische Grundlagen der Virulenz ....................................... 8

2.1.9 Epidemiologie ....................................................................................... 10

2.1.10 Klinisches Bild ....................................................................................... 12

2.1.11 Pathologie ............................................................................................. 13

2.1.12 Histologie .............................................................................................. 14

2.1.13 Diagnose ............................................................................................... 15

2.1.14 Vorbeuge- und Kontrollmaßnahmen ..................................................... 16

2.2 Impfung gegen die Newcastle Disease .......................................................... 17

2.2.1 Einleitung .............................................................................................. 17

2.2.2 Lebendimpfstoffe .................................................................................. 18

2.2.3 Inaktivatvakzinen .................................................................................. 19

2.2.4 Zukunftsentwicklungen ......................................................................... 20

2.2.5 Impfstrategien ....................................................................................... 20

VI

2.2.6 Einschätzen des Impferfolgs ................................................................. 22

2.2.7 Rekombinante Impfstoffe ...................................................................... 23

2.3 Immunität gegen die Newcastle Disease ....................................................... 26

2.3.1 Angeborene Immunmechanismen ........................................................ 26

2.3.2 Zellvermittelte Immunität ....................................................................... 27

2.3.3 Humorale Immunität .............................................................................. 27

2.3.4 Maternal vermittelte Immunität .............................................................. 28

2.3.5 Lokale Immunität ................................................................................... 28

3 Fragestellung der eigenen Untersuchung .......................................................... 33

4 Material und Methoden ...................................................................................... 35

4.1 Tiere ............................................................................................................... 35

4.2 Impfstoffe ....................................................................................................... 35

4.2.1 Titration des Impfvirus ........................................................................... 36

4.3 Versuchsaufbau ............................................................................................. 38

4.4 Untersuchungsmethoden ............................................................................... 42

4.4.1 Serologische Untersuchungen .............................................................. 42

4.4.2 Klinischer Score .................................................................................... 43

4.4.3 Histologische Untersuchungen ............................................................. 43

4.4.4 Immunhistochemische Untersuchungen ............................................... 44

4.4.5 Virus-RNA Isolierung ............................................................................ 47

4.4.6 Nachweis von APMV-1 mittels qRT-PCR (quantitative Reverse

Transcription Polymerase Chain Reaction) ........................................... 47

4.4.7 PCR (Polymerase Chain Reaction) des Impfvirus ................................ 49

4.4.8 Zellzählung............................................................................................ 50

4.4.9 Durchflusszytometrie ............................................................................ 50

4.5 Statistische Analyse ....................................................................................... 51

5 Ergebnisse ......................................................................................................... 53

5.1 Titration des Impfvirus .................................................................................... 53

5.2 Nachweis des rHVT-ND nach Impfung durch Anzucht in vitro (Exp. 1) oder

mittels Polymerase Kettenreaktion (Exp. 2) ................................................... 53

VII

5.3 Immunhistochemische Untersuchungen von Immunzellpopulationen ........... 54

5.4 Immunzellpopulationen 5 Tage nach der Impfung bei Broilern ...................... 55

5.5 Immunzellpopulationen 10 Tage nach der Impfung bei SPF- Hühnern und

Broilern ........................................................................................................... 61

5.6 Virusdetektion von Tracheal- und Kloakaltupfern durch qRT-PCR ................ 72

5.6.1 Virusanzucht im embryonierten Hühnerei ............................................. 73

5.7 Serologische Untersuchungen - humorale Immunantwort ............................. 76

5.8 Durchflusszytometrische Untersuchungen ..................................................... 82

6 Diskussion .......................................................................................................... 86

6.1 Zielsetzung der Studie ................................................................................... 86

6.2 Klinisches Bild nach Impfung mit rHVT-ND und ND-Lebendimpfstoff sowie

nach APMV-1 Stamm LaSota Belastungsinfektion ........................................ 87

6.3 Pathologische und histopathologische Läsionen nach ND-Impfung .............. 88

6.4 Einfluss von rHVT-ND und dem ND-Lebendimpfstoff auf Immunparameter .. 89

6.4.1 Systemische Immunparameter ............................................................. 89

6.4.2 Lokale Immunität ................................................................................... 93

6.5 Virusausscheidung....................................................................................... 100

6.6 Vergleich von SPF-Hühnern und Broilern .................................................... 102

6.7 Weiterführende Untersuchungen ................................................................. 103

6.8 Fazit ............................................................................................................. 104

7 Zusammenfassung........................................................................................... 105

8 Summary .......................................................................................................... 107

9 Literaturverzeichnis .......................................................................................... 109

10 Anhang ........................................................................................................ 133

10.1 SPF-Liste ................................................................................................... 133

10.2 Lösungen, Puffer, Medien ......................................................................... 134

11 Danksagung ................................................................................................. 138

VIII

Abkürzungsverzeichnis

°C Grad Celsius

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

µm Mikrometer

Abb. Abbildung

ABC Avidin-Biotin-Complex

AGG Agglutinations-Test

AGP Agar-Gel-Präzipitationstest

AOV Analysis of variance

APMV-1 Aviäres Paramyxovirus Serotyp 1

BALT Bronchus-associated lymphoid tissue

bp Base pairs

BU Bakteriologische Untersuchung

CALT Conjunctiva-associated lymphoid tissue

Cat.No. Catalogue number

CMI Cell-mediated immunity

CpG Cytosinphosphat Guanin-Oligonukleotide

Ct Cycle threshold

DAB Diaminobenzidin

DNA Desoxyribonukleinsäure

E Glutaminsäure

EID Egg infectious dose

ELD Egg lethal dose

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay

EWG Europäische Wirtschaftsgemeinschaft

F Phenylalanin

FACS Fluorescence activated cell sorting

FAM Carboxyfluorescein Fluoreszenzfarbstoff

FAT Fluoreszenz Antikörper Test

FCS Bovines Kälberserum (fetal calf serum )

F-Protein Fusionsprotein

G Glyzin

IX

GALT Gut-associated lymphoid tissue

H&E Hämatoxylin-Eosin

H+L Heavy and light chains

H2O2 Wasserstoffperoxid

HAH-Test Hämagglutinationshemmungstest

HALT Head-associated lymphoid tissue

HA-Test Hämagglutinationstest

HAU hämagglutinierende Einheit

HN Hämagglutinin-Neuraminidase Protein

HRP Horseradish Peroxidase

HVT Herpesvirus of turkeys

ICPI Intrazerebraler Pathogenitätsindex

IgA Immunglobulin A

IgG Immunglobulin G

IgM Immunglobulin M

IgY Immunglobulin Y

K Lysin

Kbp Kilobase pairs

KCl Kaliumchlorid

KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat

KU klinische Untersuchung

L Leucin

L RNA-Polymerase

LSD-Test Fishers Least Significant Difference-Test

M Matrixprotein

MALT Mucosa-associated lymphoid tissue

MCA Monoklonaler Antikörper

min Minuten

ml Milliliter

mRNA Messenger ribonucleic acid

N Negative

Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat

NaCl Natriumchlorid

ND Newcastle Disease

X

NDV Newcastle Disease Virus

NK-Zelle Natürliche Killerzelle

nm Nanometer

NOD Nucleotide-Binding Oligomerization Domain Pattern

NP Nukleoprotein

NPPT Neomycin, Polymyxin, Pimafucin, Tylosin

NT Nicht getestet

OD Optische Dichte

OIE Weltorganisation für Tiergesundheit

P Phosphoprotein

P Positivkontrolle (IDEXX®)

P Probe (BioCheck®)

PAMP Pathogen-Associated Molecular Pattern

PBL periphere Blut-Leukozyten

PBS phosphatgepufferte Salzlösung

PCR Polymerase Chain Reaction

PFU Plaque Forming Unit

pH negativ dekadischer Logarithmus der Konzentration von Protonen (H+)

PK Positivkontrolle (BioCheck®)

PM Post mortem

PMV-1 Paramyxovirus Serotyp 1

PPMV-1 Pigeon Paramyxovirus Serotyp 1

PRR Pattern Recognition Receptor

pv Post vaccination

p-Wert Überschreitungswahrscheinlichkeit

Q Glutamin

R Arginin

rHVT-ND Rekombinantes Putenherpesvirus mit Fusionsprotein

RNA Ribonucleic acid

RNP-Komplex Ribonukleoproteinkomplex

rpm Rounds per minute

rRT-PCR Real-Time-Reverse Transkriptase-Polymerase- Kettenreaktion

XI

RT-PCR Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion

S Probe (IDEXX®)

SPF Spezifisch-pathogen frei

TLR Toll-Like Receptor

TMB Tetramethylbenzidin

tni Tage nach Impfung

V Valin

v/v Volume/volume

VNT Virus-Neutralisationstest

VVND Viszerotrope velogene Form der Newcastle Disease

w/v Weight/volume

XII

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Versuchsdurchführung des ersten Versuchs ....................................... 40

Abbildung 2: Versuchsdurchführung des zweiten Versuchs ..................................... 41

Abbildung 3 a,b (A-H): Immunhistochemische Detektion von CD4+ Zellen (A-D) und

CD8+ Zellen (E-H) in verschiedenen Organen (Hardersche Drüse, CALT, Lunge,

Zäkaltonsille) von kommerziellen Broilern am 5. Tag nach ND-Impfung. ................. 56

Abbildung 4 (A-D): Immunhistochemische Detektion von CD4+ Zellen bei 200-facher

Vergrößerung in Harderschen Drüsen von Broilern am fünften Tag nach ND-Impfung.

................................................................................................................................. 57

Abbildung 5 a, b (A-H): Immunhistochemische Detektion von Bu-1+ Zellen (A-D) und

KUL01+ Zellen (E-H) in verschiedenen Organen (Hardersche Drüse, CALT, Lunge,

Zäkaltonsille) von kommerziellen Broilern am 5. Tag nach ND-Impfung. ................. 59

Abbildung 6 (A-D): Immunhistochemische Detektion von IgA+ Zellen (A-D) in

verschiedenen Organen (Hardersche Drüse, CALT, Lunge, Zäkaltonsille) von

kommerziellen Broilern am fünften Tag nach ND-Impfung. ...................................... 60

Abbildung 7 (A-J): Immunhistochemische Detektion von verschiedene

Immunzelltypen in Harderschen Drüsen von SPF-Hühnern (A, C, E, G, I) und

Broilern (B, D, F, H, J) am 10. Tag nach ND-Impfung. ............................................. 63


Vergrößerung in Harderschen Drüsen von SPF-Hühnern am 10. Tag nach ND-

Impfung..................................................................................................................... 64

Abbildung 9 (A-J): Immunhistochemische Detektion von verschiedenen

Immunzelltypen in Lungen in Nähe eines Parabronchus unter einem lateroventralen

sekundären Bronchus von SPF-Hühnern (A, C, E, G, I) und Broilern (B, D, F, H, J)

am 10. Tag nach ND-Impfung. ................................................................................. 66

Abbildung 10 (A-D): Immunhistochemische Detektion von CD4+ Zellen bei 200-

facher Vergrößerung eines Parabronchus ventral eines lateroventralen sekundären

Bronchus in Lungen von SPF-Hühnern am 10. Tag nach ND-Impfung. ................... 67

XIII

Abbildung 11 (A-E): Immunhistochemische Detektion von verschiedenen

Immunzelltypen im Konjunktiva-assoziierten lymphatischem Gewebe (CALT) von

Broilern am 10. Tag nach ND-Impfung. .................................................................... 68


Immunzelltypen in Zäkaltonsillen von SPF-Hühnern (A, C, E, G, I) und Broilern (B, D,

F, H, J) am 10. Tag nach ND-Impfung. ..................................................................... 71

Abbildung 13 (A-C): Serum-NDV-Antikörpertiter im BioCheck®-ELISA (A), IDEXX®-

ELISA (B) und HAH-Test (C) aus Seren von SPF-Hühnern nach ND Impfung, null

und sieben Tage nach Belastungsinfektion (35 und 42 Tage nach ND Impfung). .... 78


ELISA (B) und HAH-Test (C) aus Seren von Broilern nach ND Impfung, null und

sieben Tage und 10 Tage nach Belastungsinfektion (=Challenge). ......................... 80

Abbildung 15: IDEXX®-ELISA IgG-NDV Antikörper aus Tränenflüssigkeiten von

kommerziellen Broilern am 35. Tag nach ND-Impfung. ............................................ 81

Abbildung 16 (A-R): Detektion von verschiedenen Milz- (linke Spalte) und peripheren

Blutleukozyten (rechte Spalte) von Broilern mittels Durchflusszytometrie zu

verschiedenen Zeitpunkten nach der ND-Impfung. .................................................. 84

Abbildung 17: Übersicht über signifikant erhöhte Immunzellparameter von SPF-

Hühnern am zehnten Tag nach ND-Impfung (p<0,05; Kruskal–Wallis One-way AOV

mit anschließendem paarweisem Vergleich) ............................................................ 98

Abbildung 18: Übersicht über signifikant erhöhte Immunzellparameter von Broilern

am fünften Tag nach ND-Impfung (p<0,05; Kruskal–Wallis One-way AOV mit

anschließendem paarweisem Vergleich) .................................................................. 98

XIV

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Aminosäuresequenzen an der Spaltstelle des F0-Proteins verschiedener

NDV-Stämme ............................................................................................................. 9

Tabelle 2 : Virusstämme als Lebendimpfstoffe gegen die Newcastle Disease ......... 19

Tabelle 3: Antikörper zur immunhistochemischen Detektion von verschiedenen

Immunzellpopulationen ............................................................................................. 46

Tabelle 4: Virusausscheidung über die Trachea nach Belastungsinfektion mit dem

APMV-1 Stamm LaSota am 35. Tag nach Impfung. ................................................. 74

Tabelle 5: Virusausscheidung über die Kloake nach Belastungsinfektion mit dem

APMV-1 Stamm LaSota am 35. Tag nach Impfung .................................................. 75

XV

Veröffentlichungen

Tagungsvorträge

Esser, K.-H., Cors, J.-C., Meyer-Kühling, B., Gruber, A., Günther, R., Rautenschlein,

S. (2013) Elektroenzephalographische Untersuchungen zur Betäubung beim

Geflügel. 84. Geflügelfachgespräch, Hannover, Mai 2013

Cors, J.-C., Koopman, R., Malo, A., Rautenschlein, S. (2013) Induktion lokaler

Immunität bei Hühnern nach Impfung mit einer rHVT-ND Vakzine. 84.

Geflügelfachgespräch, Hannover, Mai 2013

Rautenschlein, S., Cors, J.-C., Koopman, R., Malo, A. (2013) Induction of Local

Respiratory Immunity following Vaccination of Chickens with an HVT-NDV-

Recombinant. The American Association Of Avian Pathologists Symposium and

Scientific Program, Chicago, Juli 2013

Poster-Präsentation

Cors, J.-C., Koopman, R., Malo, A., Rautenschlein, S. (2013) A recombinant

Herpesvirus-vectored Newcastle Disease vaccine induces local immune reaction and

protection in chickens. 23rd Annual Meeting of the Society for Virology, Kiel, März

2013

1

1 Einleitung

Die Newcastle-Krankheit (ND) oder atypische Geflügelpest ist weltweit verbreitet und

führt jährlich zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten (ALEXANDER u. SENNE

2008). Bei Huhn und Pute kann die Erkrankung in Abhängigkeit von der Virulenz des

aviären Paramyxovirus Serotyp 1 (APMV-1)-Stammes vom plötzlichen perakuten

Tod bis zur subklinischen Erkrankung variieren. Es werden apathogene, lentogene,

mesogene und velogene Stämme in Abhängigkeit von ihren krankmachenden

Eigenschaften unterschieden. Die Newcastle-Krankheit liegt nach Geflügelpest-

Verordnung und Richtlinie 92/66/EWG (Gemeinschaftsmaßnahmen zur Bekämpfung

der Newcastle-Krankheit) nur dann vor, wenn die Erkrankung durch einen definierten

Pathotypen, also ein APMV-1 Isolat mit einem intrazerebralen Pathogenitätsindex

von mindestens 0,7 verursacht wurde, also eines mesogenen oder velogenen

Virusstammes.

Die sich derzeit in Deutschland im Einsatz befindlichen Impfstoffe gegen die

Newcastle-Krankheit basieren meistens auf einem entweder inaktivierten

(Totimpfstoff) oder abgeschwächten lentogenen Virusstamm (Lebendimpfstoff),

welcher eine protektive Immunität hervorruft, ohne aber in klinisch gesunden Herden

respiratorische oder systemische Symptome zu erzeugen.

Die jedoch in Europa und weltweit immer wieder auftretenden Ausbrüche der ND mit

erheblichen Verlusten zeigen, dass die Erkrankung mit diesen Impfprogrammen nicht

ausreichend kontrolliert werden kann (DORTMANS et al. 2012). Impfdurchbrüche

und eine Ausbreitung des Feldvirus unter der Impfdecke werden immer wieder

beobachtet. Möglicherweise ist dies bedingt durch fehlerhafte Impfstoffapplikation,

unzureichende Induktion lokaler Immunität an den Eintrittspforten des Newcastle

Disease Virus (NDV) und mangelnde Kreuzimmunität zwischen Feld- und Impfviren.

Rekombinante Impfstoffe auf der Basis des Putenherpesvirus (HVT), welches dann

entsprechend Proteine des NDV exprimiert, stellen eine interessante Alternative zu

den herkömmlichen avirulenten oder lentogenen NDV-Impfstämmen dar (PALYA et

al. 2012). Diese können bereits in-ovo oder direkt nach dem Schlupf verabreicht

werden. Außerdem kommt es zu keiner Interferenz mit maternalen Antikörpern,

2

wodurch die Tiere somit früh in ihrer Entwicklung die Möglichkeit haben, nach

Impfung eine protektive Immunität auszubilden (MORGAN et al. 1993). Inwieweit ein

rekombinanter HVT-ND-Impfstoff auch lokale Immunmechanismen im Bereich des

oberen Respirationstraktes, der Haupteintrittspforte von NDV, und im Bereich des

Gastrointestinaltraktes stimuliert, ist nicht bekannt.

Ziel dieser Studie war es, einen rekombinanten HVT-ND-Impfstoff (rHVT-ND) mit

einer herkömmlichen NDV-Lebendvakzine zu vergleichen sowie eine gleichzeitige

Verabreichung beider Impfstoffe auf ihre Protektion gegen eine Belastungsinfektion

zu testen. Insbesondere sollte die Induktion lokaler Immunmechanismen im oberen

Respirationstrakt sowie die Kontrolle der Ausscheidung von Belastungsvirus näher

untersucht werden. Diese Untersuchungen werden zum Verständnis der Wirksamkeit

und Protektionsmechanismen nach Vakzination mit unterschiedlichen NDV-

Impfstoffen sowie auch der Rolle der lokalen Immunität in der Protektion gegen die

atypische Geflügelpest beitragen, was nachhaltig zur Verbesserung aktueller

Bekämpfungsmaßnahmen dieser Krankheit führen kann.

3

2 Literaturübersicht

2.1 Newcastle Disease

2.1.1 Einleitung

Die Newcastle-Krankheit (ND) oder auch atypische Geflügelpest ist eine hoch

ansteckende Krankheit des Geflügels, hervorgerufen durch das aviäre

Paramyxovirus Serotyp 1 (APMV-1). Die Übertragung erfolgt von Tier zu Tier über

Inhalation und Ingestion von vermehrungsfähigen Viruspartikeln oder auch über

Vektoren (ALEXANDER 2003). Die Krankheit variiert in ihrem klinischen Bild von

milden subklinischen Verläufen bis hin zu hohen Mortalitätsraten.

2.1.2 Definition

Die Newcastle Disease ist eine Infektion mit einem aviären Paramyxovirus des

Serotyps 1 (APMV-1), welches entweder einen intrazerebralen Pathogenitätsindex

von mindestens 0,7 in Eintagsküken (Gallus gallus) aufweist und/oder mehrere

basische Aminosäuren im Virus am C-Terminus des F2-Proteins und Phenylalanin

am Rest 117, dem N-Terminus des F1-Proteins, besitzt. Der Begriff „mehrere

basische Aminosäuren“ umfasst mindestens drei Arginin- oder Lysinreste zwischen

Rest 113 und 116 (OIE 2008).

2.1.3 Historische Entwicklung

ND wurde erstmalig 1926 in Newcastle upon Tyne und auf der Insel Java (heutiges

Indonesien) beschrieben, obwohl schon vorherige Ausbrüche möglich gewesen sein

könnten (MACPHERSON 1956; ALEXANDER 2001).

4

Der seit 1926 auftretende hochpathogene Verlauf der Viruserkrankung legt nahe,

dass seitdem grundlegende Veränderungen auf Virus- oder Wirtsebene aufgetreten

sind.

Nach Hanson (HANSON 1972) gibt es drei Theorien zu dem plötzlichen Auftreten

der Krankheit. Die erste Theorie besagt, dass virulente Virenstämme schon immer

endemisch in der Geflügelpopulation waren und erst seit Beginn der kommerziellen

Geflügelhaltung auffällig wurden. In der zweiten Theorie geht man davon aus, dass

das Virus in anderen Spezies endemisch war, wo es nur einen leichteren

Krankheitsverlauf auslöste und dann auf das Nutzgeflügel überging. Diese Theorie

wurde durch die Beobachtungen in der zweiten Panzootie von 1970-1973 bestätigt,

als die Krankheit durch Import von Hauspsittaziden weltweit verbreitet wurde, ohne

aber bei diesen eine schwerwiegende Erkrankungen zu verursachen. In der dritten

Theorie geht man davon aus, dass das Virus durch Mutation hochpathogene

Eigenschaften erlangte. Die dritte Theorie könnte durch große Ähnlichkeiten der

NDV-Variante, welche bei Ausbrüchen der atypischen Geflügelpest in Irland um 1990

isoliert wurde, mit niedrig pathogenen Varianten, welche in Irland in 1987 isoliert

wurden, begründet werden (MCNULTY et al. 1988). Diese beiden sehr ähnlichen

Varianten unterschieden sich antigenetisch und genetisch von allen anderen

Newcastle Disease Viren (ALEXANDER u. SENNE 2008).

Der eigentlich nur als vorläufig gedachte Name Newcastle Disease wurde von Doyle

gewählt und blieb bis heute erhalten (DOYLE 1935). Seit 1926 sind vier

panzootische Verläufe der ND bekannt. Beim ersten Verlauf geht man davon aus,

dass sich die Krankheit von 1926 bis 1960 sehr schnell in Asien und dann langsamer

im Rest der Welt ausbreitete (ALEXANDER et al. 2012). Die zweite Panzootie verlief

deutlich schneller, breitete sich vom mittleren Osten aus und erreichte ab den späten

1960er Jahren alle Länder bis 1973. Dieser weitaus schnellere Verlauf wurde durch

einen intensiveren internationalen Handel der Geflügelindustrie ermöglicht.

Außerdem wurde die Virusverbreitung durch den rasch ansteigenden Import von

Hauspsittaziden zu dieser Zeit beschleunigt, bei dem das Virus durch diese Tiere aus

endemischen Ländern in ND-freie Länder verschleppt wurde. Der Einfluss dieser

zweiten Panzootie auf die Geflügelwirtschaft führte zur Entwicklung von Impfstoffen

5

und Impfplänen, die bei der Geflügelhaltung unerlässlich wurden. In den späten

1970er Jahren kam es zur dritten Panzootie, vermutlich hervorgerufen durch den

universellen Einsatz von Impfstoffen, welche zwar die Geflügelbestände schützten,

aber auch eine Adaption und Replikation der Virusstämme förderten, was in weiteren

Ausbrüchen der Krankheit resultierte (ALEXANDER et al. 2012). Die vierte Panzootie

ereignete sich hauptsächlich in der Brief- und Haustaubenpopulation in den Jahren

1982 und 1983 und wurde durch eine antigenetische Variante des AMPV-1

hervorgerufen. Hierbei handelte es sich um das Paramyxovirus Type 1 der Tauben

(PPMV-1), welches sich nach Untersuchungen mit monoklonalen Antikörpern als

antigenetisch unterschiedlich zu anderen AMPV-1 Varianten erwies (ALDOUS et al.

2004). Die Krankheit äußerte sich hauptsächlich in zentralnervösen Erscheinungen

und wässrig-grünlichem Durchfall. In den späten 1970er Jahren traten solche Fälle

gehäuft im mittleren Osten auf und verbreiteten sich von dort aus durch Wettflüge in

der restlichen Welt. Das hierbei involvierte Virus fand seinen Weg auch über durch

Tauben kontaminiertes Futter 1984 in Hühnerbetriebe, was zu 20 Ausbrüchen führte

(ALEXANDER et al. 1985). Bis heute wurde das Newcastle Disease Virus auf der

ganzen Welt isoliert. Endemische ND ist heutzutage trotz aller Impfprogramme ein

limitierender Faktor in der weltweit wachsenden Geflügelproduktion (ALEXANDER

2011), nicht nur durch verheerende Verluste, sondern auch durch die dadurch

resultierenden Handelsrestriktionen und Embargos der betroffenen Länder.

Im Jahre 1995 wurde in Deutschland eine Impfpflicht gegen die Newcastle Disease

für Hühner- und Putenbestände eingeführt (GEFLÜGELPEST-VERORDNUNG

2007).

2.1.4 Ätiologie/Taxonomie

Das Newcastle Disease Virus gehört in die Ordnung der Mononegavirales, die

Familie der Paramyxoviridae mit der Unterfamilie Paramyxovirinae und dem Genus

Avulavirus an. Es gibt 11 Serotypen des Aviären Paramyxovirus (APMV-1), wobei

nur Stämme des ersten Serotyps die Newcastle Disease auslösen können (BRIAND

et al. 2012). Zur Klassifizierung der Newcastle Disease Viren, welche eine hohe

6

genetische und antigenetische Diversität aufweisen, sind zwei unterschiedliche

Systeme beschrieben (MILLER et al. 2010).

Hierbei wurde eine Vielzahl von NDV-Isolaten nach phylogenetischer Analyse der

Nukleotidsequenz des F-Gens in Linien oder Genotypen eingeteilt. Das erste System

nach Aldous et al. teilt NDV in sechs Hauptlinien und dreizehn Unterlinien ein

(ALDOUS et al. 2003). Später wurde eine siebte Hauptlinie und sieben Unterlinien

hinzugefügt (DIEL et al. 2012a). Das zweite Klassifizierungssystem nach Ballargi-

Pordany et al. teilt NDV in zwei Klassen von Genotypen ein, wobei die erste in neun

und die zweite in elf Genotypen unterteilt wird (BALLAGI-PORDANY et al. 1996). Die

Genotypen I, II, VI und VII wurden weiter eingeteilt in Sub-Genotypen Ia und Ib, II

und IIa, VIa bis VIf und VIIa bis VIIh (DIEL et al. 2012a).

2.1.5 Morphologie und Genomaufbau

Paramyxoviren aus der Ordnung der Mononegavirales haben eine einzelsträngige

RNA mit negativer Polarität. Das behüllte Virion des NDV ist pleomorph und hat

einem Durchmesser von etwa 100-350 nm. Das nicht segmentierte RNA-Genom ist

über 15000 Nukleotide lang und kodiert für folgende sechs Strukturproteine:

Nukleoprotein (NP), Phosphoprotein (P), Matrixprotein (M), Fusionsprotein (F),

Hämagglutinin-Neuraminidase Protein (HN) und die RNA-Polymerase (L). Die Gene

sind folgendermaßen angeordnet: 3′-NP-P-M-F-HN-L-5′. Das Nukleoprotein,

Phosphoprotein und die RNA-Polymerase bilden mit dem RNA-Genom den

Ribonukleoproteinkomplex (RNP) (MILLER et al. 2010; RAMP 2012).

Die Virulenz des NDV ist zwar abhängig von mehreren Genen, jedoch wirken sich

Veränderungen an der F-Proteinspaltstelle am stärksten auf die Virulenz aus. Niedrig

virulente Viren besitzen weniger basische Aminosäuren an der Spaltstelle und die

Aminosäure Leucin anstelle von Phenylalanin an Position 117 (DE LEEUW et al.

2003).

Phylogenetische Untersuchungen zeigten, dass die zwei Klassen der NDV in drei

Genomgrößenkategorien aufgrund ihrer Nukleotidanzahlen eingeteilt werden

können. Alle Viren der Klasse I (Genotyp 1-9) besitzen eine Genomlänge von 15198

7

Nukleotiden. Diese Viren blieben in ihrem ursprünglichem Reservoir, den

Wildwasservögeln. Viren der zweiten Klasse gingen auf die Hühnerpopulation über

und erlangten virulente Eigenschaften. Die Genotypen I-IV der zweiten Klasse,

welche vor 1960 isoliert wurden, haben eine Länge von 15186 Nukleotiden. Die

ausschließlich pathogenen Genotypen V-VIII der zweiten Klasse (Isolierung nach

1960) weisen eine Genomlänge von 15192 Nukleotiden auf (CZEGLEDI et al. 2006).

2.1.6 Replikation

Die Virusanheftung an die Wirtszelle erfolgt über das transmembrane virale

Oberflächenprotein Hämagglutinin-Neuraminidase (HN-Protein), welches an die

sialinsäurehaltigen Oberflächenrezeptoren der Zelle bindet. Daraufhin wird die

Membranfusion durch das Fusionsprotein eingeleitet, welches mit seinen

hydrophoben Aminosäuren am Aminoterminus des F1-Proteins mit der

Wirtszellmembran interagiert (FERREIRA et al. 2004). Die Virushülle und die

Wirtszellmembran fusionieren bei neutralem pH-Wert und das Nukleokapsid wird in

die Zelle abgegeben. Die Virusreplikation findet ausschließlich im Zytoplasma statt.

Sie beginnt mit der Transkription der Virus-RNA zu mRNAs durch die Polymerase

des Virus. Zusätzlich wird durch den RNP-Komplex ein zusammenhängender

positiver RNA-Strang der Virus-RNA erzeugt (Antigenom), welcher zur Synthese

neuer Virusgenome dient. Die viralen Proteine werden am rauen endoplasmatischen

Retikulum translatiert. Parallel dazu erfolgt die Glykosylierung der HN- und F-

Proteine und die Spaltung des F0-Proteins (inaktives F-Vorläuferprotein) mithilfe der

wirtseigenen Polymerase im Golgiapparat. Dadurch ensteht die aktive Form des F-

Proteins, welches aus einer F1- und einer F2-Untereinheit besteht, die über Disulfid-

Brückenbindung zusammenhängen. Sobald genügend NP-Proteine vorhanden sind,

beginnt die Replikation, bei der die neu synthetisierten Genome umhüllt werden. Das

neue Ribonukleotid verbindet sich daraufhin mit dem Matrixprotein an der

Wirtszellmembran und das Virion wird durch „Knospung“ entlassen (LAMB 2001).

8

2.1.7 Virulenz im Wirt

Die Virulenz eines NDV Stammes ist wirtsabhängig und hängt von folgenden

Eigenschaften ab: Virus-Dosis, Übertragungsweg, Alter, Immunstatus und

Umweltbedingungen, welche sich begünstigend auf den Krankheitsverlauf

auswirken. Je jünger die Tiere, desto akuter ist der Verlauf der Erkrankung, der Tod

tritt ein, bevor klinische Symptome zu beobachten sind. Bei älteren Tieren ist ein

eher protrahierter Verlauf mit charakteristischen klinischen Symptomen zu

beobachten.

2.1.8 Molekularbiologische Grundlagen der Virulenz

Bei der Replikation des NDV wird das Vorläufer-Glykoprotein F0 des F-Proteins

durch Proteasen in die beiden Untereinheiten F1 und F2 gespalten (ROTT 1988).

Diese nach der Translation stattfindende Spaltung erfolgt durch eine zelleigene

Protease (NAGAI et al. 1976). Die Spaltbarkeit des F0-Vorläufermoleküls steht in

direktem Zusammenhang zur Virulenz des Virus in vivo (NAGAI et al. 1976;

ALEXANDER u. BELL 2004). F0-Vorläufermoleküle von virulenten Viren können von

ubiquitär vorkommenden, Furin-ähnlichen Proteasen gespalten werden (NAGAI et al.

1976; GOTOH et al. 1992). Dies erlaubt dem Virus eine Verbreitung in zahlreichen

Geweben und Zellen des Wirtes und resultiert in einer Schädigung lebenswichtiger

Organe. Nicht virulente Viren werden nur durch Trypsin-ähnliche Proteasen

gespalten und können sich dadurch auch nur in den Geweben vermehren, in denen

diese Enzyme häufig vorkommen, nämlich im Respirations- und Gastrointestinaltrakt

(ALEXANDER u. BELL 2004).

Die Virulenz basiert hauptsächlich auf dem Aminosäuremuster der F0-Spaltstelle,

dem Vorhandensein von basischen Aminosäuren an den Positionen 113, 115 und

116 und Phenylalanin an Position 117 in virulenten NDV-Stämmen. Die Sequenz

lautet häufig: 113RQK/RR*F117, wobei die meisten virulenten Viren auch an Position

112 eine basische Aminosäure besitzen (ALEXANDER u. BELL 2004). Tabelle 1

zeigt die Aminosäuremuster der F0-Spaltstelle von verschiedenen Virusstämmen

(Tabelle 1).

9

Neben der Aminosäurefrequenz der Spaltstelle des F-Proteins ist auch das HN-

Protein eine Virulenzdeterminante. Stämme mit gleicher Aminosäurefrequenz an der

F-Protein-Spaltstelle weisen unterschiedliche Virulenzeigenschaften auf. Eine Studie

von de Leeuw et al. zeigte eine Veränderung in der Virulenz des Virusstammes beim

Austausch der HN-Gene von verschieden virulenten Virusstämmen (DE LEEUW et

al. 2005).

Tabelle 1: Aminosäuresequenzen an der Spaltstelle des F0-Proteins verschiedener

NDV-Stämme

Virusstamm Virulenz Spaltstelle

Aminosäuren 111 bis 117

Herts 33 hoch -G-R-R-Q-R-R*F-

Essex ‘70 hoch -G-R-R-Q-K-R*F-

135/93 hoch -V-R-R-K-K-R*F-

617/83 hoch -G-G-R-Q-K-R*F-

34/90 hoch -G-K-R-Q-K-R*F-

Beaudette C hoch -G-R-R-Q-K-R*F-

La Sota niedrig -G-G-R-Q-G-R*L-

D26 niedrig -G-G-K-Q-G-R*L-

MC110 niedrig -G-E-R-Q-E-R*L-

1154/98 niedrig -G-R-R-Q-G-R*L-

(modifiziert nach Alexander 2008, Diseases of Poultry 11th edition, * zeigt die

Spaltstelle an; E= Glutaminsäure, F= Phenylalanin, G= Glycin, K= Lysin, L= Leucin,

Q= Glutamin, R= Arginin, V= Valin)

10

2.1.9 Epidemiologie

2.1.9.1 Wirte

Es ist anzunehmen, dass alle Vögel für ND empfänglich sind, jedoch mit

artabhängiger Ausprägung der Krankheit. Hauptsächlich sind jedoch Hühnervögel,

Sperlingsvögel, Tauben, Kormorane, Papageien, Raubvögel und weniger

Wasservögel klinisch betroffen. Auch andere Tiere wie Reptilien und der Mensch

sind empfänglich (LANCASTER 1966). Newcastle Disease Viren wurden regelmäßig

von ziehenden Wasservögeln isoliert. Die meisten Isolate zählten zu den niedrig-

virulenten Varianten und können asymptomatisch- enterischen Pathotypen

zugeordnet werden.

Trotzdem sind auch Ausbrüche der virulenten ND in Wildvögeln zu beobachten, wie

zum Beispiel ein Ausbruch in Nordamerika während der 1990er Jahre, bei dem

Kormorane betroffen waren. (ALEXANDER u. BELL 2004). 1992 fand ein Ausbruch

der Krankheit in der Kormoranpopulation in Westkanada und im Nordwesten der

USA statt, bei dem das Virus auf domestizierte Puten überging (MIXSON u.

PEARSON 1992).

2.1.9.2 Zoonotisches Potential

Das NDV ruft beim Menschen Augeninfektionen hervor mit uni- und bilateralen

Rötungen, Tränenfluss, Augenlidödemen, Konjunktividen und subkonjunktivalen

Blutungen (ALEXANDER 2003). Aber auch Fälle mit Fieber und Kopfschmerzen mit

und ohne Konjunktivitis wurden dokumentiert (CHANG 1981). Die Infektion heilt

schnell ab, die Hornhaut ist nicht betroffen. Meist wurden Infektionen durch direkten

Kontakt mit infizierter Allantoishöhlenflüssigkeit hervorgerufen, welche bei

Laborunfällen ins Auge spritzte, oder durch Einreiben von Viruspartikeln in die Augen

mit kontaminierten Händen, nachdem infizierte Vögel angefasst wurden. Auch bei

Sprayvakzinierung kann durch Aerosol-Augen-Kontakt eine Infektion hervorgerufen

werden (UTTERBACK u. SCHWARTZ 1973; BURRIDGE et al. 1975; JORGENSEN

et al. 2000).

11

Allgemein gilt aber menschlicher Kontakt zu infiziertem Geflügel als wenig risikoreich.

Übertragungen von Mensch zu Mensch sind bis dato nicht dokumentiert

(ALEXANDER 2003).

2.1.9.3 Verbreitung

Die Verbreitung der Newcastle Krankheit hängt von den Eradikationsversuchen und

Kontrollmaßnahmen der jeweiligen Länder ab. Auch die Haltung ist

ausschlaggebend. Länder mit hauptsächlich großen kommerziellen Geflügelherden

haben weniger Probleme mit dem Ausbruch der Krankheit als Länder, in denen

Hühner hauptsächlich in ländlichen Hinterhofherden gehalten werden (ALEXANDER

2003). Als NDV Erregerreservoir gelten einheimische Wild- und Zugvögel, ebenso

kann eine Einschleppung über die Einfuhr von Wildvogelarten aus endemischen

Gebieten erfolgen (DIEL et al. 2012b). Der Einsatz von NDV-Vakzinen beim

Nutzgeflügel rund um den Globus erschwert eine Schätzung der tatsächlichen

Verteilung des NDV. Über serologische Untersuchungen kann nicht zwischen

niedrig- und hoch-virulenten Varianten sowie Impfstoffen unterschieden werden.

Auch können in immunisierten Herden Ausbrüche der Newcastle Disease

vorkommen (ABOLNIK et al. 2004). Eine antigenetische Diversität zwischen

Impfstoffen und Feldviren könnte hierbei eine Rolle spielen (KAPCZYNSKI u. KING

2005; HU et al. 2009; MILLER et al. 2009b), jedoch zeigte eine Studie von Dortmans

et al. von 2012, dass eine klassische Lebendvakzine des Genotyps II, welche sich

antigenetisch von einem virulenten Virusstamm unterscheidet, die gleichen

protektiven Eigenschaften hat, wie eine genotypisch gleiche Lebendvakzine,

gemessen an klinischen Symptomen (DORTMANS et al. 2012). Die Autoren

machten eher schlechte Impfpraxis und Doppelinfektionen mit anderen

immunsuppressiven Krankheitserregern für Ausbrüche in immunisierten Herden

verantwortlich, als eine antigenetische Varianz zwischen Impf- und Feldvirus. Andere

Studien zeigen jedoch auch, dass durch eine Impfung mit einem dem

Belastungsvirus genotypisch gleichen Lebendimpfstoff eine signifikante Reduzierung

der Virusausscheidung bei Hühnern nach einer Belastungsinfektion erreicht werden

12

kann (MILLER et al. 2009b), was ausschlaggebend für die Verbreitung und den

Verlauf der Erkrankung ist. Die Lebendimpfstämme der letzten 50 Jahre gehören

phylogenetisch zu den Genotypen I und II und unterscheiden sich von den

Virusstämmen, welche in den letzten zwei Dekaden verantwortlich für Ausbrüche der

ND waren. Die hierbei hauptsächlich beteiligten Virusstämme aus den USA

stammten von Genotyp V (PEDERSEN et al. 2004), in Europa, Asien und Afrika vom

Genotyp IV (Pigeon Paramyxovirus Type I) und Genotyp VII (YU et al. 2001;

ABOLNIK et al. 2004; LIEN et al. 2007; LIU et al. 2007; IRVINE et al. 2009; KE et al.

2010).

2.1.10 Klinisches Bild

Die klinischen Symptome der ND hängen von verschiedenen Faktoren ab.

Virusstamm, Wirtsspezies, Alter, Immunstatus, Virusdosis und Expositionsweg,

Koinfektion mit anderen Erregern sowie Umwelt- und sozialbedingter Stress spielen

eine ausschlaggebende Rolle. Die Verläufe der ND werden anhand der klinischen

Symptome in fünf Formen eingeteilt: 1. viszerotrope velogene Form (VVND) , 2.

neurotrope velogene Form, 3. mesogene Form, 4. lentogene oder respiratorische

Form und 5. subklinisch enterische Form (ALEXANDER 2003). Bei der schweren

viszerotropen Form der Newcastle Disease kommt es sehr schnell zu extrem hohen

Mortalitätsraten mit wenigen oder ausbleibenden klinischen Symptomen. Das

Krankheitsgeschehen spielt sich im Gastrointestinaltrakt ab, aber auch leichte bis

schwere respiratorische Erscheinungen werden beobachtet. Grünlich-schleimiger Kot

wird häufig bei Vögeln beobachtet, welche nicht in der initialen Phase der Infektion

sterben. Kurz vor dem Tod zeigen sich Muskeltremor, Tortikollis, Opisthotonus sowie

Flügel- und Beinparalysen. In Herden mit voll empfänglichen Hühnern kann die

Mortalität bis zu 100% erreichen (SUSTA et al. 2011). Bei der neurotropen

velogenen Form der ND, welche hauptsächlich in den USA vorkommt, zeigen sich

schwere respiratorische Symptome, gefolgt von neurologischen Symptomen. Die

Legeleistung fällt rapide ab, die Eier sind teilweise dünnschalig bis schalenlos. Die

13

Morbidität kann bis zu 100 % betragen, die Mortalität variiert je nach Alter der Vögel,

bei jungen Vögeln bis zu 90%, bei alten Tieren um die 50% (SUSTA et al. 2011).

Mesogene Stämme verursachen vorwiegend respiratorische Symptome sowie eine

reduzierte Legeleistung, welche ein paar Wochen anhält. Auch neurologische

Symptome können auftreten. Die Mortalität ist niedrig. Lentogene ND-Viren rufen

normalerweise keine Erkrankung in erwachsenen Vögeln hervor. Junge

vollempfängliche Hühner können jedoch mit respiratorischen Symptomen erkranken.

Bei der vierten Pandemie in den späten 1970er Jahren, welche hauptsächlich die

Taubenpopulation betraf und durch eine AMPV-1 Variante, dem PPMV-1

hervorgerufen wurde, zeigten betroffene Tauben grünlichen Durchfall und

neurologische Symptome. Die Tauben fielen durch uni- und bilaterale

Bewegungsstörungen der Flügel und Beine sowie Tortikollis auf (KALETA et al.

1985). Respiratorische Symptomatik wurde hingegen kaum beobachtet.

Puten sind ebenso wie Hühner empfänglich für velogene Newcastle Disease Virus-

Stämme, zeigen aber weniger schwerwiegende klinische Symptome (BOX et al.

1970; ALEXANDER 1999). Enten und Gänse werden als natürliches Virusreservoir

angesehen und sind ebenfalls empfänglich für das Virus, zeigen aber kaum bis keine

klinischen Symptome (ZHANG et al. 2011). Die klinischen Symptome in anderen

Geflügelspezies sind unterschiedlich und von der betroffenen Spezies abhängig.

Nicht geimpfte Fasane sind empfänglich für die ND und zeigen ähnliche klinische

Symptome wie das Huhn (ALDOUS u. ALEXANDER 2008). Je empfänglicher die

Spezies, desto stärker die klinische Ausprägung (ALDOUS et al. 2010). Am

empfänglichsten ist das Huhn, gefolgt von Pute, Taube und Enten (ALDOUS et al.

2010).

2.1.11 Pathologie

Die Ausprägungen der pathologischen Veränderung bei einer AMPV-1 Infektion

variieren ähnlich wie die klinischen Symptome enorm und sind von Virusstamm, Wirt

und Begleitfaktoren abhängig. Bei der Pathologie der Newcastle Disease gibt es

keine pathognomonischen Veränderungen. Velogene viszerotrope Formen der ND

14

sind durch hämorrhagische Läsionen in der Mukosa des Verdauungstraktes der

Hühner vom Proventrikulus bis zum Kolon gekennzeichnet. Diphtheroide

Entzündungen der Peyerschen Platten führen zu nekrotisch ulzerativen Läsionen. Bei

längeren und schwereren Verläufen sind knopfförmige ulzerativ diphtheroide Herde

(„Boutons/Buttons“) in der Darmwand zu finden (MAZUMDER et al. 2012). Im

Drüsenmagen zeigen sich petechiale Blutungen, die Zäkaltonsillen sind

hämorrhagisch verändert (HANSON et al. 1973), was bei der neurotropischen Form

nicht zu beobachten ist. Bei keiner Form der ND zeigen sich makroskopische

Läsionen im Bereich des zentralen Nervensystems. Im Respirationstrakt finden sich

mukosale Blutungen und deutliche Kongestionen in der Trachea.

Luftsackentzündungen können auftreten, welche mit Verdickungen der Luftsäcke und

mit katarrhalischen oder käsigen Exsudaten durch bakterielle Sekundärinfektionen

einhergehen. Als weitere pathologische Veränderungen werden Blutungen im

unteren Augenlid, fokale Nekrosen in der Milz und paratracheales Ödem am

Brustkorbeingang beobachtet.

Bei Infektionen von Hühnern und Puten in der Legeperiode mit velogenem NDV

findet sich gewöhnlich Eidotter in der Bauchhöhle, Blutungen an Ovidukt und Uterus

sowie eine Dislokation dieser Organe (BWALA et al. 2012).

2.1.12 Histologie

Histologische Veränderungen zeigen sich in allen Hirnstrukturen außer im Großhirn.

Eine nicht eitrige Enzephalomyelitis mit neuronaler Degeneration und perivaskulären

lymphozytären Infiltrationen sowie Ansammlungen von Gliazellen und eine

Hypertrophie von Endothelzellen sind in diesen Bereichen zu beobachten (CATTOLI

et al. 2011). Ödeme und Blutungen zeigen sich in Organen in der Nähe von

Blutgefäßen. Die Kapillaren und Arteriolen sind hyalinisiert und weisen nekrotische

Endothelzellen auf. Infektionen mit virulenten Stämmen zeigen einen durch

Blutungen und Nekrosen in schleimhaut-assoziierten Lymphgeweben

gekennzeichneten Verdauungstrakt. In der Trachea finden sich einen Tag nach

Infektion hypertrophierte Becherzellen. Das Trachealepithel zeigt nach ein- bis

15

zweitägigem Infektionsverlauf zilienlose Bereiche hauptsächlich um die

Ausführungsgänge muköser Drüsen, welche mit zunehmendem Krankheitsverlauf

größer werden. Nach vier Tagen zeigen sich kleine Vakuolen mit Lymphozyten und

heterophilen Granulozyten in der Epithelzellschicht (KOTANI et al. 1987). In der

Schleimhaut des oberen Respirationstraktes finden sich zudem Ödeme und

Zellinfiltrationen, welche aus Lymphozyten und Makrophagen bestehen. Die

Reproduktionsorgane sind durch Follikelatresie mit Infiltration von Entzündungszellen

und Formierung von lymphoiden Aggregaten an Follikel und Ovidukt gekennzeichnet.

Selten werden fokale Nekrosen und Einblutungen in Leber, Gallenblase und Herz

beobachtet. Kongestionen und Petechien am Kamm der Tiere sowie Ulzerationen

und Blutungen der Haut treten bei vizerotropen velogenen NDV-Infektionen auf

(CATTOLI et al. 2011).

2.1.13 Diagnose

Zur Bekämpfung der ND muss eine Identifikation und Isolation der jeweiligen

Virusvarianten erfolgen. Eine Unterscheidung zwischen niedrig- und hoch virulenten

Varianten sowie die Unterscheidung zwischen infizierten und nicht-infizierten

Hühnern muss erfolgen, da es keine pathognomonisch-pathologischen

Veränderungen gibt. Zur Isolation des Agens eignen sich Tupfer aus Rachen,

Trachea und Kloake sowie Organproben aus Hirn, Leber, Niere, Milz und

pathologisch veränderten Organen. Das Probenmaterial wird in der Eikultur auf

replizierendes Virus und nachfolgend im HAH-Test weiter differenziert oder zu

weiteren molekularen Untersuchungen herangezogen (OIE 2012). Monoklonale

Antikörper können zur Identifikation von APMV-1 im

Hämagglutinationshemmungstest eingesetzt werden. Es stehen kommerziell

erhältliche RT-PCR/rRT-PCR Systeme zur Detektion von NDV-spezifischen

Genomabschnitten zur Verfügung. Durch Sequenzierung kann zwischen

niedrigpathogenen und hoch pathogenen Varianten des APMV-1 unterschieden

werden (MILLER et al. 2010). Virales Antigen kann direkt durch

immunhistochemische und Immunfluoreszenzuntersuchungen detektiert werden. Als

16

serologische Tests stehen der Hämagglutinationshemmungstest (HAH-Test), der

Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), sowie Multiplex Assays in

Kombination mit einem Luminex Analysesystem zur Verfügung (OIE 2008).

2.1.13.1 Molekulare Techniken zur Diagnose von ND

Bei der Identifikation des Virus wird eine reverse Transkription mit anschließender

PCR durchgeführt, wodurch eine DNA Kopie der Virus-RNA erzeugt wird. Bei der

real Time RT-PCR werden fluorogene Proben in Echtzeit amplifiziert gemessen und

detektiert. Mit gegen das M-Gen gerichteteten Primern wurden oft Viren der Klasse I

nicht detektiert (KIM et al. 2007), weswegen eine multiplex rRT-PCR entwickelt

wurde, bei der Primer zusätzlich gegen das L-Gen eingesetzt wurden (MIA KIM et al.

2008). Eine Identifizierung von virulenten Isolaten ist durch eine rRT-PCR möglich,

welche sich gegen die Spaltstelle des F-Gens richtet (WISE et al. 2004).

2.1.14 Vorbeuge- und Kontrollmaßnahmen

Kontrollstrategien gegen die Newcastle Disease obliegen den jeweiligen Ländern.

Durch Vorgabe der World Organization for Animal Health (OIE) zur internationalen

Seuchenbekämpfung ist die Newcastle Disease in allen industrialisierten Ländern

eine anzeigepflichtige Tierseuche. Bei einem Primärausbruch der ND ist eine

Virusisolation und -identifikation sowie die Einschätzung der Virulenz des Isolats

nötig, um geeignete Bekämpfungsmaßnahmen einzuleiten. Nach Ende eines

Ausbruchs gilt die ND in Deutschland als erloschen, wenn das Geflügel des

betroffenen Bestandes verendet oder getötet und beseitigt wurde, eine Desinfektion

erfolgte und seitdem 30 Tage vergangen sind. Der Verdacht gilt als beseitigt, wenn

die ND nicht durch virologische Untersuchung bestätigt werden kann und die

betroffenen Tiere verendet, getötet und beseitigt wurden (GEFLÜGELPEST-

VERORDNUNG 2007).

Die Kontrolle der Newcastle Disease besteht hauptsächlich aus Optimierung des

Managements der Betriebe, „Biosicherheit“, Hygienemaßnahmen in Kombination mit

17

präventiver Impfung von Herden, in der Verhinderung der Virusverbreitung durch das

Keulen von infizierten oder verdächtigen Tieren sowie der Einrichtung von

Sperrbezirken und Beobachtungsgebieten. Die Verhinderung der Einschleppung der

Krankheit ist in Newcastle Disease-freien Ländern die höchste Priorität. In

Deutschland besteht eine generelle Impfpflicht für Hühner und Puten, welche bei

einem ND-Seuchenausbruch oder -verdacht ausgesetzt wird. Danach ist eine

behördliche Genehmigung zur Impfung erforderlich. Die aktuelle Verordnung zum

Schutz gegen die Geflügelpest (Geflügelpest-Verordnung in der Fassung der

Bekanntmachung vom 8. Mai 2013, BGBl. I S. 1212) weist darauf hin, dass die

Vorschriften der Geflügelpest-Verordnung in der Fassung der Bekanntmachung vom

20. Dezember 2005 (BGBl. I S. 3538) hinsichtlich der Newcastle-Krankheit weiter

anzuwenden sind.

2.2 Impfung gegen die Newcastle Disease

2.2.1 Einleitung

Eine Impfung gegen die ND wird in Ländern durchgeführt, in denen virulente Stämme

der ND endemisch sind. Auch in Ländern ohne Vorkommen von virulenten Stämmen,

in denen aber durch niedrig virulente Stämme signifikante wirtschaftliche Verluste

während der Aufzucht bei Zucht- oder Legehennen oder in der Broilermast

verursacht werden, müssen Impfungen durchgeführt werden (SENNE et al. 2004).

Das Prinzip der Impfung besteht in der Induktion einer immunologischen Antwort

gegen das Virus, ohne eine Erkrankung auszulösen. Inaktivierte Vakzinen sind

abgetötete oder abgeschwächte Viren die dem Vogel direkt injiziert werden. Nicht

virulente oder lentogene Virusstämme können dem Vogel lebend verabreicht werden

und fallen unter die Kategorie Lebendimpfstoffe. Als dritte Kategorie stehen nach

neueren Entwicklungen rekombinante Impfstoffe zur Verfügung, bei denen ein

Trägervirus fremdes genetisches Material exprimiert.

18

2.2.2 Lebendimpfstoffe

Als Lebendvakzinen werden asymptomatische enterische (avirulente), mesogene

oder lentogene Virusstämme verwendet, welche lebend verabreicht werden und sich

im Wirt vermehren können. Ihre Herstellung ist verhältnismäßig einfach und sie

können über das Trinkwasser oder als Spray verabreicht werden. Einzelne Tiere

können über Augentropfen geimpft werden. Mesogene Virusstämme werden

aufgrund ihrer Virulenz nur in ND-endemischen Ländern eingesetzt und

intramuskulär oder über die Wing-Web-Methode verabreicht. Die weltweit am

meisten verwandten und bekanntesten Impfvirusstämme sind der APMV-1 Stamm

LaSota, F und Hitchner B1, welche um 1940 in den USA entwickelt wurden. Seltener

werden die Stämme Ulster und V4 (lentogene Stämme) eingesetzt (SENNE et al.

2004). Die Verabreichungsdosis bei lentogenen Impfstoffen beträgt 106.5EID50

(ALLAN u. LANCASTER 1978).

Folgende mesogene Stämme werden als Lebendvakzinen genutzt: Roakin,

Komarov, Hertfordshire (H) und Mukteswar (CZEGLEDI et al. 2003). Die Stämme

sind nach der OIE Definition Auslöser der Newcastle Disease, da sie einen

intrazerebralen Pathogenitätsindex von oder über 0,7 aufweisen (OIE 2008).

Mesogene Lebendimpfstoffe sollten nicht bei Tieren unter acht Wochen oder als

Primärimmunisierung eingesetzt werden, da sie schwerwiegende Erkrankungen in

voll empfänglichen Herden hervorrufen können (MEULEMANS 1988).

Der APMV-1 Stamm LaSota ist potenter in der Induktion einer Immunantwort als

Hitchner B1 und dadurch auch virulenter. Deswegen wird der APMV-1 Stamm

LaSota häufig nach einer intitialen B1 Impfung als Booster eingesetzt (SENNE et al.

2004).

Lebendimpfstoffe können auch mit Adjuvantien wie Aluminiumhydroxidgel parenteral

verabreicht werden. Lebendimpfstoffe bieten den Vorteil, dass nicht-geimpfte Tiere

von ausscheidenden Tieren angesteckt werden und somit ebenfalls Impfschutz

erhalten. Sie stimulieren lokale und systemische Immunität und rufen eine schnelle

Protektion hervor. Als nachteilig erweist sich ihr Potential, eine klinische Erkrankung

hervorzurufen. So sollte zum Beispiel der APMV-1 Stamm LaSota nicht als

19

Primärimpfung bei sehr jungen Tieren eingesetzt werden, da nach der Impfung

respiratorische Symptome auftreten können (ALEXANDER u. BELL 2004). Auch

maternale Immunität kann eine ausreichende Immunisierung verhindern. Um einer

virulenten ND-Infektion vorzubeugen, bedarf es mehrerer Lebendvirusimpfungen

oder einer Kombination aus Lebendvirusimpfung mit inaktivierten Öl-Adjuvant

Impfstoffen. Aber jedoch kann selbst ein hoher Antikörpertiter eine ND Infektion und

Virusauscheidung oftmals nicht verhindern (SENNE et al. 2004). Tabelle 2 zeigt die

intrazerebralen Pathogenitätsindices von verschiedenen Impfstämmen.

Tabelle 2 : Virusstämme als Lebendimpfstoffe gegen die Newcastle Disease

(modifiziert nach Alexander 2008, Diseases of Poultry 11th edition, * = (MA et al. 2009))

2.2.3 Inaktivatvakzinen

Inaktivatvakzinen werden aus infektiöser Allantoishöhlenflüssigkeit gewonnen,

nachdem das Virus in embryonierten Eiern angezüchtet wurde. Das Virus wird

hierbei mit Formalin oder β-Propiolacton abgetötet und nachfolgend mit einem

Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid oder mit Öl zu einer Emulsion vermischt (STONE

1997). Öl-basierte Inaktivatimpfstoffe sind immunogener als Aluminiumhydroxid-

basierte Inaktivatimpfstoffe (MEULEMANS 1988). Die Applikation erfolgt entweder

subkutan oder intramuskulär. Inaktivierte NDV Impfstoffe werden häufig bei

Elterntieren in Kombination mit Lebendimpfstoffen kurz vor der Eiablage eingesetzt,

um möglichst hohe maternale Antikörpertiter zu erreichen (VAN ECK 1990).

Virus Pathotyp ICPI

Queensland V4 avirulent 0

Ulster 2C avirulent 0

VG/GA lentogen 0,03*

Clone 30 lentogen 0,11*

Hitchner B1 lentogen 0,2

F (Asplin) lentogen 0,25

La Sota lentogen 0,4

Mukteswar mesogen 1,4

20

Inaktivierte Impfstoffe sind verhältnismäßig teuer in ihrer Herstellung und

umständlicher zu verabreichen, da jedes Tier einzeln geimpft werden muss. Sie

interferieren jedoch nicht so stark mit maternaler Immunität wie Lebendimpfstoffe.

Generell induzieren Inaktivatimpfstoffe keine mukosalen Immunmechanismen,

jedoch zeigte eine Studie von 2008 eine Erhöhung von IgG- Antikörpern in Tracheal-

und Nasalwaschungen nach Impfung mit einer Inaktivatvakzine (CHIMENO ZOTH et

al. 2008), was mit erhöhten Anti-NDV-IgG-Typ Antikörpertitern in Verbindung stehen

könnte, die durch das Inaktivat induziert werden.

2.2.4 Zukunftsentwicklungen

Alternativen zu herkömmlichen Newcastle Disease Vakzinen, wie die HN-Expression

in transgenen Nicotiana benthamiana- und Reispflanzen (GOMEZ et al. 2009)

(YANG et al. 2007), die Entwicklung von Immune Stimulating Complexes (ISCOMs)

(HOMHUAN et al. 2004) oder Virosomen (KAPCZYNSKI u. TUMPEY 2003) oder

Virus-Like-Particles (MCGINNES et al. 2010) (PANTUA et al. 2006) bieten neue

Ansätze zur Immunisierung. Die in-ovo Impfung zum Zeitpunkt des Überführens der

Eier in den Schlupfbrüter mit ND-Lebendimpfstoffen liefert zurzeit keine

befriedigenden Schlupfresultate (DILAVERIS et al. 2007) (RAMP et al. 2012).

2.2.5 Impfstrategien

Impfprogramme und –zeitpunkte sollten immer folgende Faktoren berücksichtigen:

Maternale Immunität, Gesundheitszustand der Herde, Interferenz mit anderen

Impfstoffen, Größe und Alter der Herde, sowie die aktuelle endemische Lage der

Newcastle Disease in den jeweiligen Gebieten. Die angestrebte Protektion, der

Immunstatus der Tiere, der lokal vorkommende Virustyp, die Verabreichungsart der

Vakzine sowie das Überwachen der Immunantwort sind ebenfalls wichtige Parameter

(ALLAN u. LANCASTER 1978). Ein angestrebtes Ziel bei der Immunisierung einer

Herde ist ein möglichst homogener Antikörpertiter der gesamten Herde. Bei Bezug

von Eiern verschiedener Elterntierherden mit unterschiedlichem Immunstatus der

21

Elterntiere muss auch immer der dadurch resultierende Unterschied in der passiv-

übermittelten Immunität beachtet werden. Bei unterschiedlich ausgeprägten

Antikörpertitern innerhalb einer Herde kommt es zu keiner homogenen

Immunisierung durch eine Lebendvakzine, da diese unterschiedlich stark durch

maternal-übertragene Antikörper gehemmt wird. Bei einer Newcastle Infektion würde

das zum Beispiel die Krankheitsdauer einer Herde verlängern, da Teile der Herde

während der Erkrankung durch zeitlich versetztes Nachlassen der Antikörpertiter neu

erkranken können (ALLAN 1975).

2.2.5.1 Impfprogramme

Bei Impfprogrammen gegen die ND müssen die Virulenz des Impfvirus sowie die

Immunkompetenz der Tiere aufeinander abgestimmt werden. Auch Impfungen gegen

andere Krankheiten, die in der Herde durchgeführt werden, müssen berücksichtigt

werden (ALLAN 1975).

2.2.5.1.1 Hühner

Legehennen werden generell in den ersten fünf Lebenswochen mit Hitchner B1 über

das Trinkwasser oder über Aerosol erstmalig immunisiert. Eine Revakzination erfolgt

um die 10. Lebenswoche mit dem APMV-1 Stamm LaSota oder bei Legebeginn und

Transfer in die Produktionseinheit entweder mit dem APMV-1 Stamm LaSota oder

einer inaktivierten Vakzine. Abhängig vom Vorkommen der ND in dem Gebiet des

Bestands werden verschiedene Impfstrategien angewandt. Hat die ND eine niedrige

Inzidenz und kommt nur sporadisch mit sehr milden Verläufen in der entsprechenden

Region vor, in der die Herde immunisiert werden soll, so kann eine Impfung am 1.-5.

oder am 18.-21. Tag mit einem milden lentogenen Stamm wie zum Beispiel B1 durch

Aerosol oder über das Trinkwasser verabreicht werden. Der APMV-1 Stamm LaSota

kann ebenfalls am 18.-21. Tag über das Trinkwasser oder am Tag 70 zur

Revakzinierung eingesetzt werden. Als „Point of Lay“ Impfung, also eine Impfung ab

der Legeperiode, kann ebenfalls der APMV-1 Stamm LaSota eingesetzt werden,

22

wobei es gelegentlich zu Legeleistungsdepressionen kommt (ALLAN 1975). In

Gebieten, in denen ND mit schwereren Verläufen endemisch ist, sollte eine

Grundimmunisierung am 1.-5. Tag mit einem milden lentogenen Stamm wie B1 über

Sprayanwendung stattfinden und zusätzlich am 21. und am 35.-42. Lebenstag eine

Revakzinierung mit B1. Nachfolgend kann zur Revakzinierung ab dem 70. Lebenstag

ein mesogener Impfstamm oder ein Inaktivatimpfstoff eingesetzt werden, welcher

auch zu Beginn der Legeperiode genutzt werden kann.

2.2.5.1.2 Broiler und Puten

In der Broilermast ist aufgrund der kurzen Lebensdauer der Tiere ein genaues

Abstimmen des Impfzeitpunkts besonders wichtig. Generell werden Broiler einmal

innerhalb der ersten beiden Lebenswochen entweder über Spray-, Aerosol- oder

über das Trinkwasser mit den APMV-1 Stämmen Hitchner B1 oder LaSota vakziniert.

Die Immunisierung junger Puten erfolgt mit dem APMV-1 Stamm LaSota durch

Augentropfen oder intranasale Instillation, Spray oder Aerosol. Hierbei können

zellproliferative histologische Veränderungen in der Trachea auftreten, welche sich

aber nach vier bis sechs Tagen wieder normalisieren (MEULEMANS 1988).

Eintagsputenküken mit maternaler Immunität können mit APMV-1 Stamm LaSota in

Kombination mit einem Inaktivatimpfstoff erfolgreich immunisiert werden

(MEULEMANS 1988). Eine Revakzinierung kann in der 5. Woche erfolgen (YADIN

1976).

2.2.6 Einschätzen des Impferfolgs

Die Anwesenheit von neutralisierenden Antikörpern gegen NDV schützt vor klinischer

Erkrankung, jedoch wird eine Infektion mit Virusvermehrung und Ausscheidung im

Wirt nicht verhindert (REYNOLDS u. MARAQA 2000a). Zur Einschätzung einer

Immunantwort auf eine ND-Impfung sind der HAH-Test und ELISA geeignete Mittel

(SIEGMANN 1973). Eine Herdenprotektion ist nach einer Studie von van Boven et al.

erst dann erreicht, wenn über 85 Prozent der Herde einen HAH- Antikörpertiter höher

23

gleich 23 besitzen (VAN BOVEN et al. 2008). Feldstudien zeigen, dass nur Tiere

einer Herde mit einem Titer von oder über 24 eine virulente ND-Infektion überleben

(KAPCZYNSKI u. KING 2005). Frühere Angaben gehen von HAH-Titern über 25 oder

höher aus, um eine Herde zu schützen (ALLAN u. LANCASTER 1978). Trotz

nachgewiesener Aktivität von rHVT-ND im HAH-Test (PALYA et al. 2012) kann

dessen Protektivität laut Kapczynski et al. nicht durch Anwesenheit von HAH-

Antikörpern eingeschätzt werden (KAPCZYNSKI et al. 2013). In einer Studie von

Palya et al. (PALYA et al. 2012) stellte sich rHVT-ND jedoch positiv im HAH-Test dar.

Bestimmte ELISA Kits eignen sich zur Erfassung der Impfantwort rekombinanter

Viren ab dem 35. Tag nach subkutaner oder in-ovo Impfung (SLACUM 2012).

Jedoch sind noch weitere Parameter neben systemischer humoraler Immunität

ausschlaggebend für eine Protektivität, wie lokale Immunmechanismen und zell-

vermittelte Immunität (CMI). CMI allein, ohne Anwesenheit von neutralisierenden

Antikörpern, schützt nicht vor einer velogenen Newcastle Disease Challenge

(REYNOLDS u. MARAQA 2000b). Jedoch reicht bei hoher CMI ein sehr niedriger

Antikörpertiter, um eine Protektion herbeizuführen (CANNON u. RUSSELL 1986),

wodurch die CMI erheblich zum Immunschutz beiträgt. Systemische Immunität allein

ist ebenfalls nicht protektiv, lokale Immunität trägt grundlegend zur Protektion bei

(MALKINSON u. SMALL 1977).

2.2.7 Rekombinante Impfstoffe

Rekombinante Impfstoffe oder Vektorimpfstoffe sind eine neue Generation von

Impfstoffen, bei denen Fremdgene in das Genom eines Trägervirus (viraler Vektor)

integriert werden. Das Fremdgen wird hierbei in Plasmiden kloniert, von Vektor-DNA

Sequenzen flankiert und in die Zelle transfiziert. Das Plasmid enthält eine

Vektorsequenz, welche durch eine „Expressionskassette“ unterbrochen ist. Diese

Expressionskassette besteht aus einem Promotor des Virusvektors und einer

einmaligen Restriktionsschnittstelle für die Spaltung und Verbindung mit der Vektor-

DNA. Dahinter befindet sich die Fremdgensequenz. Durch DNA Rekombination

während der Virusreplikation in der Zelle wird das Gen in die komplette Vektor-DNA

24

integriert. Die Immunantwort des Wirts richtet sich somit gegen Vektorproteine und

das Fremdantigen. Als Vektoren eignen sich große persistierende DNA- oder RNA-

Viren, wie zum Beispiel Adenoviren, Herpesviren, Pocken- und Paramyxoviren

(MOSS 1991). rHVT-ND kann entweder als selbständig replizierendes Lebendvirus

in-ovo am 18. Bebrütungstag oder am ersten Lebenstag intramuskulär, subkutan,

intraperitoneal oder intravenös verabreicht werden (COCHRAN 1999).

2.2.7.1 Das Putenherpesvirus als Vektor

Die Mareksche Erkrankung oder auch Marek’s Disease (MD) ist eine

lymphoproliferative Erkrankung des Hausgeflügels, welche Veränderungen an

peripheren Nerven und viszeralen Organen verursacht. Sie tritt bei Hühnern ab der

3.-4. Lebenswoche und am häufigsten zwischen der 12. und 30. Lebenswoche auf.

Als klinische Symptome zeigen sich Paralysen der Gliedmaßen mit einhergehender

Vergrößerung der peripheren Nerven (SWAYNE et al. 1989). Virulente MD–

Virusstämme können auch besonders bei Abwesenheit von maternalen Antikörpern

die Mortalität bei Hühnern zwischen der ersten und zweiten Lebenswoche durch

Immunsuppression erhöhen. Abhängig vom beteiligten Virusstamm können

Lymphome in Ovar, Leber, Milz, Nieren, Lunge, Herz und Proventrikulus und Haut

vorkommen. Diese bestehen hauptsächlich aus lymphoiden Zellen (OIE 2010).

Das Mareks Disease Virus (MDV) ist ein zell-assoziiertes Alphaherpesvirus und

gehört zu den DNA-Viren. Die 3 Serotypen werden als Gallid Herpesvirus 2 ( Serotyp

1), Gallid Herpesvirus 3 (Serotyp 2) und Meleagrid Herpesvirus 1 (Serotyp 3) oder

auch Herpesvirus of Turkeys (HVT) bezeichnet (SCHAT 2008). Viren vom Serotyp 1

können onkogene Eigenschaften besitzen, Viren des zweiten und dritten Serotyps

nicht. HVT wird als Impfvektor genutzt, hat ein 160 kbp langes Genom und beinhaltet

über 99 Gene, wovon die meisten homolog mit anderen MD-Viren sind (AFONSO et

al. 2001). HVT Impfstoffe können als zell-assoziiertes oder zell-freies Virus appliziert

werden und induzieren innerhalb von fünf Tagen eine starke zell-vermittelte

Immunantwort gegen virulente MDV-Stämme (SONDERMEIJER et al. 1993).

25

2.2.7.1.1 Konstruktion von rHVT-ND

HVT kann genetisch so modifiziert werden, dass es virusfremde Glykoproteine des

Infektösen Bursitis Virus, des Marek’s Disease Virus, des Newcastle Disease Virus,

des Infektiösen Laryngotracheitis Virus oder des Infektiösen Bronchitis Virus

exprimiert (COCHRAN 1999). Der Vektor für die rekombinante Vakzine rHVT-ND in

diesem Falle ist der HVT PB1-Stamm (CHURCHILL et al. 1973; SONDERMEIJER et

al. 1993). Der Einsatz des Putenherpesvirus (HVT) als Vektor gegen die ND, welcher

das F- oder/und das HN-Protein exprimiert, stellt eine Alternative zu herkömmlichen

ND-Vakzinen dar (MORGAN et al. 1992). Zur Insertion des F-Gens wurde eine

Region auf dem einzigartigen kurzen Sequenzelement/Unique Short Segment (US)

des Virus ausgewählt, basierend auf der von Igarashi et al. publizierten

Restriktionskarte von HVT (IGARASHI et al. 1987). Das F-Gen des rHVT-ND

befindet sich an der BG/II Restriktionsstelle an Position 138193 des HVT-Genoms.

Das F-Gen stammt von einem aus embryonierten Hühnereiern vermehrtem APMV-1

Clone 30 Stamm. Die HVT Unique Short Region US und das F-Gen wurden in

Lambda Insertionsvektoren geklont. Anschließend erfolgte ein Co-Transfektion der

Plasmide mit HVT DNA in Hühnerembryo-Fibroblastenkultur. Die Selektion des F-

Protein exprimierenden rekombinanten Virus erfolgte mittels Immunfluoreszenz.

rHVT-ND zeigt eine Viruspersistenz bis zu acht Wochen (REDDY et al. 1996). Die

Expression des F-Genes ist 30 Wochen nach einer Administration von rHVT-ND

noch messbar (COCHRAN 1999). Die Interferenz mit maternalen Antikörpern gegen

das NDV ist bei rHVT-ND nicht so hoch wie bei herkömmlichen Lebendimpfstoffen

(MORGAN et al. 1993). Die Verabreichung ist sicher und hat keinen Einfluss auf die

Schlupfrate oder das Überleben der Tiere, wie in einem Versuch mit in-ovo geimpften

spezifisch-pathogen freien SPF-Hühnern gezeigt wurde (REDDY et al. 1996; PALYA

et al. 2012). Serologische Immunantworten bilden sich langsamer aus als bei

Lebendimpfstoffen und sind erst ab der vierten Woche detektierbar (MORGAN et al.

1992; PALYA et al. 2008).

26

2.3 Immunität gegen die Newcastle Disease

Die Immunität gegen die Newcastle Disease kann in humorale, zellvermittelte und

lokale Immunität eingeteilt werden. Zusätzlich wird zwischen angeborenen und

erworbenen Immunmechanismen unterschieden. Eine Virusanheftung und –

verbreitung wird generell durch gegen F- und HN-Proteine gerichtete

neutralisierende Antikörper eingeschränkt und virusbefallene Zellen werden durch

natürliche Killerzellen (NK-Zellen) und zytotoxische T-Zellen abgetötet

(KAPCZYNSKI et al. 2013).

2.3.1 Angeborene Immunmechanismen

Als angeborene Immunmechanismen werden infektionslimitierende Faktoren

bezeichnet, welche schon vor einem primären Erregerkontakt im Wirt existieren und

auf ein Eindringen von Mikroorganismen reagieren können. Beim Geflügel sind das

physikalischen Barrieren wie Federn, Haut und lokale Schleimproduktion,

phagozytierende Zelltypen wie NK-Zellen und Makrophagen, das

Komplementsystem sowie Zytokine und Interferone (KAPCZYNSKI et al. 2013). In

der initialen Phase der Infektion werden durch Pattern Recognition Receptors (PRR),

Toll-Like Receptors (TLR) oder Nucleotide-Binding Oligomerization Domain Proteins

(NOD) Mikroben anhand ihrer spezifischen Muster, den PAMPs (Pathogen-

Associated Molecular Patterns) erkannt. Diese induzieren intrazelluläre Signale,

welche Gene für proinflammatorische Zytokine, anti-apoptotische Faktoren und

antimikrobielle Peptide aktivieren (KAPCZYNSKI et al. 2013). Bei einer NDV-

Infektion produzieren periphere mononukleare Blutlymphozyten und heterophile

Granulozyten Stickoxid. Eine Hochregulation von Interferon-α und Interferon-β mRNA

kann in Makrophagen, Interferon-γ mRNA in peripheren mononukleären

Blutmonozyten detektiert werden (CRIPPEN et al. 2003; AHMED et al. 2007).

Interferon-γ wird später von NK-Zellen gebildet, welche auch direkt virusinfizierte

Zellen töten, und aktiviert einen Tag nach Infektion die zellulär-vermittelte Immunität

(CMI) (LOWENTHAL et al. 1995; REYNOLDS u. MARAQA 2000a, b).

27

2.3.2 Zellvermittelte Immunität

Zellvermittelte Immunität (CMI) bedeutet eine spezifisch erworbene, durch T-Zellen

(CD4+ T-Helferzellen und CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten) erzeugte Immunität,

welche einen wichtigen Faktor zur Entwicklung einer Protektion gegen eine NDV

Infektion darstellt und zur lokalen Virusreduktion durch Abtöten von infizierten Zellen

beiträgt (RUSSELL et al. 1997; REYNOLDS u. MARAQA 2000b). Ebenfalls findet

eine Aktivierung von B-Zellen und Makrophagen statt. Die CMI allein reicht nicht aus,

um den Wirt vor einer ND Belastungsinfektion zu schützen, jedoch spielt die Menge

der IFN-γ-Bildung, welches von NK-Zellen und T-Zellen gebildet wird, in der

Reduktion der Mortalität und Morbidität einer ND Erkrankung eine Rolle (SUSTA et

al. 2013). Ein Zusammenspiel von CMI und antikörpervermittelter Immunität ist

essentiell für den Schutz vor ND. Beispielsweise verstärkt das von T-Zellen gebildete

Interleukin-4 die humorale Immunantwort (SAWANT et al. 2011). Ebenso werden bei

einer ND höhere Antikörpertiter bei höheren Werten von durch Markophagen

gebildetem Stickoxid beobachtet (GUIMARAES et al. 2011).

2.3.3 Humorale Immunität

Antikörper sind die Schlüsselregulatoren zur Bekämpfung einer NDV-Infektion

(KAPCZYNSKI et al. 2013). Sie können mittels des

Hämagglutinationshemmungstestes (HAH), des Enzyme-Linked Immunosorbent

Assays (ELISA) oder des Virusneutralisationstestes (VNT) bestimmt werden.

Humorale Immunantworten sind normalerweise sechs bis zehn Tage nach

Impfung/Infektion lokal sowie systemisch im Blut messbar. Nach NDV Kontakt

differenzieren B-Lymphozyten zu Plasmazellen, welche 3 Typen von

antigenspezifischen neutralisierenden Antikörpern bilden: IgG (=IgY), IgM und IgA.

Das Hühner-Aquivalent zum IgG der Säugetiere wird auch als IgY bezeichnet und

weist einige strukturelle Unterschiede auf. Als erstes wird IgM produziert und ist vier

Tage nach NDV-Infektion nachweisbar. IgY und IgA werden 7 Tage nach Infektion

gebildet (AL-GARIB et al. 2003).

28

2.3.4 Maternal vermittelte Immunität

Elterntiere mit NDV Antikörpern übertragen diese über den Dottersack an ihre

Nachkommen (HELLER et al. 1977). Im Eidotter finden sich hauptsächlich IgG-

Immunglobuline, wohingegen im Eiweiß IgA und IgM als Resultat mukosaler

Sekretion des Oviduktes dominieren (ROSE et al. 1974; HAMAL et al. 2006). Der

Transfer von IgG von dem Elterntier in das Hühnerei läuft folgendermaßen ab: IgG

wird aus dem Blut der Henne in das Eigelb übertragen (CUTTING u. ROTH 1973)

und findet dann über den embryonalen Kreislauf in das Küken. Die Menge an

Antikörpern, welche durch den Dottersack resorbiert wird, ist proportional zur

maternalen IgG Serum Konzentration (AL-NATOUR et al. 2004).

2.3.5 Lokale Immunität

Schleimhautoberflächen des Respirations-, Gastrointestinal- und Urogenitaltraktes

sind Haupteingangspforten für Pathogene. Die den Schleimhautoberflächen

zugrunde liegenden lymphoiden Gewebe werden in ihrer Gesamtheit als mucosa-

associated lymphoid tissues (MALTs) bezeichnet. Das MALT kann in gut associated

lymphoid tissue (GALT), bronchus-associated lymphoid tissue (BALT), head-

associated lymphoid tissue (HALT) und conjunctiva-associated lymphoid tissue

(CALT) unterteilt werden. Die Schleimhautoberflächen sind stark mit Immunzellen

besiedelt, deren Plasmazellanteil lokal hauptsächlich IgA produziert. IgG und IgM

sind jedoch auch in den lymphoiden Geweben zu finden (JEURISSEN et al. 1989).

Die lymphoiden Elemente des MALTs liegen entweder organisiert vor und bilden

mukosale Lymphfollikel, welche für die Induktionsphase der Immunantwort

verantwortlich sind oder unorganisiert diffus, wobei sich Leukozyten im ganzen

Epithel und dessen Lamina propria verteilen und die Effektorstelle bilden (MONTILLA

2004). Dadurch, dass Hühner keine Lymphknoten wie Säugetiere besitzen, ist das

MALT beim Huhn sehr umfangreich (JEURISSEN et al. 1989).

Lokale Immunität kann anhand des IgA Gehaltes in Tränenflüssigkeit,

Trachealspülungen und Gallenflüssigkeit nach intranasaler Verabreichung oder

Augentropfen von ND-Lebendimpfstoffen eingeschätzt werden. Die IgA-Antikörper

29

sind verantwortlich für die Neutralisierung freier Virionen (RUSSELL u. EZEIFEKA

1995; PEROZO et al. 2008). Auch IgM-Antikörper werden lokal produziert. IgG findet

sich gleichfalls lokal, eine Transsudation aus dem Blut kann hier als mögliche

Ursache gesehen werden (AL-GARIB et al. 2003).

Eine Messung der lokalen Immunität kann auch durch die Bestimmung lokaler

Immunzellpopulationen erfolgen (DUMRONGSOONTORNCHAI 1999). Nach

Newcastle Disease Impfung/Infektion finden sich vermehrt lokale T- und B-

Zellpopulationen und Makrophagen im oberen Respirationstrakt, welche eine lokale

Protektion gegen die ND erzeugen (RUSSELL et al. 1997;

DUMRONGSOONTORNCHAI 1999).

2.3.5.1 Lokale Immunität im Bereich der Harderschen Drüse

Die Hardersche Drüse (Glandula membranae nictitans) oder auch Nickhautdrüse

sitzt hinter beiden Augäpfeln retrobulbär ventral und medial zum interorbitalen

Septum und produziert hauptsächlich Tränenflüssigkeit sowie ein mukoides

lipidhaltiges Sekret, welches die Nickhaut und Kornea befeuchtet und sauber hält

und zudem auch immunogene Faktoren enthält (BUZZELL 1996). Beim Huhn ist die

Drüse verhältnismäßig groß, exokrin und tubuloazinös. Sie selbst besitzt kein

Schleimhautgewebe und keine spezifisch funktionellen Abwehrmechanismen wie ein

dichtes Lymphepithel, hochendotheliale Venolen oder follikelartige Ansammlungen

von intraepithelialen Lymphozyten (BANG u. BANG 1968). B-, T-Lymphozyten sowie

Plasmazellen befinden sich im interstitiellen Gewebe. Das IgA-haltige Sekret der

Harderschen Drüse gelangt in den Bereich des Augenlids und von dort aus über den

Tränennasenkanal in den oberen Respirationstrakt. Daher sind die Hardersche

Drüse sowie auch das Konjunktiva-assoziierte Lymphgewebe (CALT) beim Huhn

funktionelle Organe der lokalen Immunität des Respirationstrakts, obwohl sie

anatomisch nicht dazugehören (SMIALEK et al. 2011). Bei einer NDV Infektion

steigen B- und T-Zellpopulationen in der Harderschen Drüse an (RUSSELL et al.

1997), wobei der höchste Anstieg bei CD8+ Zellen zu verzeichnen ist. Bei lokaler

30

Virusreplikation einer ND steigen lakrimale Immunglobuline aller Klassen an

(RUSSELL 1993).

2.3.5.2 Lokale Immunität im Bereich des Konjunktiva-assoziierten

lymphoiden Gewebes/Conjunctiva-associated lymphoid tissue

(CALT)

Das Konjunktiva-assoziierte Lymphgewebe befindet sich in den Falten des oberen

und unteren Augenlids und bildet zusammen mit der Harderschen Drüse die

wichtigsten paraokularen Immunstrukturen (VAN GINKEL et al. 2012). Eine Woche

nach dem Schlupf ist im unteren Augenlid eine heterogene Lymphoyzytenpopulation

mit Lymphoblasten und Makrophagen zu finden. Nach 4 Wochen befinden sich dort

Plasmazellen und B-Zell Keimzentren (FIX u. ARP 1991). Im erwachsenen Vogel

befinden sich B-Zellen, T-Helfer- und zytotoxische T-Zellen mit einer ähnlichen

Verteilung wie die Lymphozytenpopulationen in der Harderschen Drüse im CALT

(VAN GINKEL et al. 2012). T-Lymphozyten umranden die B-Zellreichen

Keimzentren, wobei CD3+ T-Lymphozyten in der vierten Lebenswoche dominieren.

CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten-Konzentrationen steigen ab der ersten bis zur

vierten Lebenswoche an, was die Spekulation zulässt, dass das CALT circa vier

Wochen zur Reifung braucht (VAN GINKEL et al. 2012).

2.3.5.3 Lokale Immunität im Bereich der Trachea

Ein weiterer Bestandteil der lokalen Immunität des oberen Respirationstraktes ist die

Schleimhaut der Trachea, welche allerdings kein funktionelles Lymphgewebe besitzt.

In zwei Wochen alten Hühnern befinden sich IgM+, IgG+ und IgA+ Plasmazellen

unterhalb des Trachealepithels (JEURISSEN et al. 1989). Die Schleimhaut reagiert

im Falle einer experimentellen Mykoplasma gallisepticum-Infektion mit B-

Zellinfiltrationen und der Entstehung von sekundären Lymphfollikeln aus B-Zellen,

welche mit CD4+ Zellen umrandet sind (GAUNSON et al. 2006). Bei einer Newcastle

31

Disease verliert das Epithel seine Zilien und Lymphozyten sowie heterophile

Granulozyten wandern in die Epithelschicht ein (KOTANI et al. 1987).

2.3.5.4 Bronchus-assoziiertes Lymphgewebe/Bronchus Associated

Lymphoid Tissue (BALT)

Bienenstock et al. beschrieben 1973 das erste Mal organisierte lymphoide

Zellansammlungen und Strukturen in der Bronchialschleimhaut von Hühnerlungen

(BIENENSTOCK et al. 1973), welche sich an den Verbindungen von primären zu

sekundären Bronchien sowie an den Ostien zu den Luftsäcken befinden (MYERS u.

ARP 1987; VAN ALSTINE u. ARP 1988; FAGERLAND u. ARP 1993b). Das

Bronchus-assoziierte lymphoide Gewebe (BALT) besteht aus lymphozytären

Ansammlungen, welche durch eine deutliche Lymph-Epithelzellschicht, dem

sogenannten Lymphothel oder Follikel-assoziiertem Epithel (FAE), abgedeckt sind

(FAGERLAND u. ARP 1993a).

In sechs bis acht Wochen alten Hühnern befinden sich Keimzentren in den meisten

Lymphfollikeln des BALTs sowie Plasmazellen, Makrophagen und heterophile

Granulozyten (FAGERLAND u. ARP 1993b).

2.3.5.5 Lokale Immunität im Bereich der Zäkaltonsille

Die Zäkaltonsille ist Teil des darmassoziierten lymphatischen Gewebes (GALT)

(LILLEHOJ u. TROUT 1996). Sie besteht aus großen lymphoiden Zellansammlungen

in der Zellwand der Zäka an ihrem Eingang in das Rektum (CASTELEYN et al.

2010). Die Zellansammlungen bilden tonsillenartige Einheiten, welche durch

bindegewebige Septen voneinander getrennt sind, mit einer zentral gelegenen

Furche, welche sich in Krypten aufzweigt und direkten Kontakt zum Lumen des

Zäkums hat. Die Krypten besitzen auf ihrer Oberfläche ein hochprismatisches Epithel

mit integrierten M-Zellen. Die schon embryonal vorhandenen Zäkaltonsillen

entwickeln sich direkt nach dem Schlupf. Am ersten Tag können bereits B- und T-

Lymphozyten in der Zäkaltonsille nachgewiesen werden, wobei T-Lymphozyten

32

überwiegen. Nach sechs Wochen steigt die Anzahl der B-Lymphozyten signifikant

gegenüber den T-Lymphozyten an (GOMEZ DEL MORAL et al. 1998).

Die genaue Funktion der Zäkaltonsillen ist nicht geklärt. Nach Kitawa et al. (1998)

wird vermutet, dass sie zur Neutralisierung der Antigene beitragen, welche durch den

Harnsäurereflux in das Zäkum getragen werden (KITAGAWA et al. 1998).

Lerner et al. (1971) spekulieren hingegen, dass die Zäkaltonsille Bursa cloacalis-

ähnliche Eigenschaften besitzt, da Hühner bei einer Zerstörung der Bursa immer

noch spezifische Antikörper bilden können (LERNER et al. 1971). Die Zäkaltonsille

könnte daher eine Rolle bei der Differenzierung von Stammzellen zu funktionalen B-

Lymphozyten spielen (BEFUS et al. 1980; CASTELEYN et al. 2010).

Im Falle einer experimentellen Newcastle Disease Infektion konnten Gohm et al. vier

Wochen nach Infektion Blutungen und Nekrosen in der Zäkaltonsille feststellen

(GOHM et al. 2000). Bei einer intranasalen Newcastle Disease Impfung in SPF-

Hühnern in Kombination mit immunstimulatorischen CpG-Oligodeoxynucleotiden

zeigten Zhang et al. signifikant höhere IgA-Antikörpergehalte in intestinalen

Waschungen und Kot von geimpften Tieren im Vergleich zu ungeimpften Tieren

(ZHANG et al. 2008).

Nach einer Newcastle Disease Augentropfenimpfung zeigte sich eine signifikante

Erhöhung von IgG+ Zellen im Vergleich zu IgA+ und IgM+ Zellen in Zäkaltonsillen 14

und 28 Tage nach der Impfung (NASRIN et al. 2013). Da die Zäkaltonsillen einen

Hauptanteil des GALT darstellen, einen hohen Anteil an Lymphozyten besitzen

(JANARDHANA et al. 2009) und sich bei einer Newcastle Disease im

Krankheitsgeschehen verändert zeigen, könnten sie eine wesentliche Rolle in der

Bildung der lokalen Immunität gegen NDV spielen.

33

3 Fragestellung der eigenen Untersuchung

Die Interferenz mit maternalen Antikörpern ist oft von entscheidender Bedeutung für

einen Impferfolg einer Lebendvakzine gegen die Newcastle Disease (ND).

Rekombinante Impfstoffe wie ein rekombinantes Putenherpesvirus, welches das F-

Protein des NDV exprimiert, werden nicht durch maternale Antikörper gegen die ND

in der Ausbildung einer Immunität inhibiert und bieten daher eine interessante

Alternative zu herkömmlichen ND Lebendimpfstoffen. Die Möglichkeit zur in-ovo

Applikation der bivalenten Vakzine bietet zusätzlich Vorteile. rHVT-ND erzeugt

geringere Antikörpertiter als eine herkömmliche Lebendvakzine, bietet aber Schutz

vor einer ND Infektion. Eine Kombination von rHVT-ND mit einer Lebendvakzine

erzeugt eine länger anhaltende klinische Protektion als die alleinige Verabreichung

einer Lebendvakzine (PALYA et al. 2008). Die genauen Mechanismen dieser

Protektion sind jedoch nicht geklärt. Ob rHVT-ND lokale Immunmechanismen im

Bereich des oberen Respirationstrakts, der Haupteingangspforte von NDV induziert,

wie sie bei der Verabreichung von Lebendimpfstoffen beobachtet werden, ist unklar,

und ob sich eine Kombination von rHVT-ND und einem Lebendimpfstoff eventuell

synergistisch oder additiv auch auf diesen Bereich auswirkt, ist nicht bekannt.

In dieser Studie wurde die Wirkung eines rekombinanten Putenherpesvirus gegen

die ND (rHVT-ND) alleine und in Kombination mit einer ND-Lebendvakzine auf die

lokale und systemische Immunität sowie auf die lokale Virusausscheidung des

Respirationstrakts untersucht.

Es wurden zwei Tierversuche mit spezifisch pathogen-freien Hühnern und

kommerziellen Broilern durchgeführt, um diesbezüglich eine Nutzungslinien-

vergleichende Aussage treffen zu können. Die lokale Virusausscheidung, die

Stimulation von lokalen Immunzellpopulationen und die Höhe des serologischen Anti-

NDV Antikörpertiters wurden nach Impfung und Belastungsinfektion untersucht. T-

und B-Immunzellpopulationen sowie Makrophagen wurden in Harderscher Drüse,

der Konjunktiva, der Lunge und der Zäkaltonsille an verschiedenen Tagen nach

Impfung dargestellt. Die Virusausscheidung und -übertragung wurden nach einer

34

Challenge mit dem lentogenen APMV-1 Stamm LaSota durch Real-Time PCR in

Trachea und im zweiten Versuch zusätzlich in der Kloake detektiert. Ebenfalls

wurden im zweiten Versuch der Anti-ND IgG-Antikörpergehalt in der

Tränenflüssigkeit sowie Milzzellen- und periphere Blut- und

Lymphozytenpopulationen untersucht.

35

4 Material und Methoden

4.1 Tiere

Es wurden 220 Eier (VALO SPF flock Nos. 10704) von SPF-Hühnern vom Legetyp

der Lohmann Tierzucht GmBH (Cuxhaven) bezogen. Diese wurden vom ersten bis

zum 17. Tag bei 37,8-38,0° C und 50 – 60% Luftfeuchtigkeit in einem Brutschrank

(Firma Grumbach, Asslar) vorbebrütet. Davon schlüpften 171 Küken, nachdem sie

drei Tage zuvor in den klinikeigenen Schlupfbrüter verbracht wurden, in der Klinik für

Geflügel, bei 37°C Temperatur und 70 % Luftfeuchtigkeit. 100 nicht geimpfte

kommerzielle Broiler-Eintagsküken vom Ross-308 Typ (Weser Ems Brüterei,

Rechterfeld) beiden Geschlechts wurden in die Stallungen der Klinik für Geflügel

verbracht. Die SPF-Hühner wurden mit einem Alleinfuttermittel für Legehennen „all-

mash L“ (Firma Deuka) gefüttert. Die Broiler bekamen Landkornstarter (Firma Deuka)

in den ersten Tagen, danach Landkornmast (Firma Deuka). Futter und Wasser

wurden ad libitum bereitgestellt.

4.2 Impfstoffe

Für den ersten Versuch wurden rHVT-ND (Innovax®-ND, 4000 Dosen, Lot-Nr.:

91790017, Verfallsdatum: 05-2012) und eine auf dem FC126-Stamm basierende

HVT Vakzine (Nobilis® Marexine CA 126, 1000 Dosen, Lot-Nr: A267B,

Verfallsdatum: 04-2012) von der Firma MSD Tiergesundheit (Boxmeer, Niederlande)

zur Verfügung gestellt, in flüssigem Stickstoff transportiert und gelagert. rHVT-ND

wurde dann in einem vorgewärmten Wasserbad ca. 95 sec. bei 25°C aufgetaut und

so mit Nobilis Diluent CA (MSD Animal Health, 200 ml, Lot: LC 140) verdünnt, dass

eine Dosis 200µl enstprach. Eine Dosis enthielt 6180 Plaque Forming Units

(PFU/Dose (NDV-F)).

Der Impfstoff Clone 30 wurde in 35 Millilitern eines wässrigen Lösungsmittels (für

1000 Dosen, Diluent Oculo Nasal, B408A01, Verfallsdatum 06-2013, MSD

36

Tiergesundheit) verdünnt. Ein Tropfen entsprach einer Impfdosis von mind. 6,0 log10

Embryo-infektiöse Dosis 50 % (EID50). Der APMV-1 Stamm LaSota (Charge: A002D;

Code:027908, MSD Tiergesundheit) fungierte als Belastungsinfektionsvirus und

wurde ebenfalls mit einem wässrigen Lösungsmittel (für 1000 Dosen, Diluent Oculo

Nasal, B408A01, Verfallsdatum 06-2013, (MSD Tiergesundheit) verdünnt (1 Dosis:

mind. 6,0 log10 EID50).

Im zweiten Versuch wurde rHVT-ND (Innovax®-ND, 4000 Dosen, Lot-Nr.: 91790024,

Verfallsdatum: 01-2013 (MSD Tiergesundheit) mit 6945 PFU/Dose (200 µl)

eingesetzt. Der Titrationsstandard HVT CA 126 (Nobilis® Marexine CA 126, 1000

Dosen, Lot-Nr.: A267B, MSD Tiergesundheit) wurde als Kontrolle bei der rHVT-ND-

Impftitrierung verwendet. Der APMV-1 Stamm Lasota (Nobilis® ND LaSota, 1000

doses, Lot-Nr.: A002D, MSD Tiergesundheit) fungierte mit einer Dosis von mind. 6,0

log10 EID50 als Belastungsvirus. ND Clone 30 (Nobilis® ND Clone 30, 1000 Dosen,

MSD Tiergesundheit) wurde mit einer Dosis (mind. 6,0 log10 EID50, ein Augentropfen

pro Tier) als Lebendvakzine per Augentropfen verwendet.

4.2.1 Titration des Impfvirus

Zur Bestätigung des Titers und Quantifizierung des Virusgehalts wurde rHVT-ND auf

sekundären Hühnerembryofibroblasten (0,3 -0,4 x 106 Zellen/ml, M6B8 (MSD Animal

Health)) Medium (199/F10, MSD Animal Health/Medium+0,1% NPPT (v/v)

(Neomycin, Polymyxin, Pimafucin, Tylosin)) mit 1% bovinem Kälberserum (FCS) als

Erhaltungsmedium und 5% im Nährmedium in Polystyrene Zellkulturplatten (Corning

Cell Culture Dish, 430196, mit 2 mm Zählgitter oder Costar, cat. No. 3060 mit 2mm

Zählgitter) angezüchtet. Der Virusgehalt wurde im Plaquetest nach serienmäßiger

Verdünnung der Ausgangsimpfvirussupension unter einem flüssigen Overlay-

Medium (M6B8 (MSD Animal Health) zweimal konzentriert mit 0,2% NPPT plus

Bactoagar 2,25 % und 5% NaHCO3) bestimmt. 24 Stunden nach der Infektion wurde

das Medium gewechselt und das Agaroverlay für drei Tage hinzugefügt. Die Platten

wurden jeden Tag kontrolliert und bei Ablösen der Fibroblasten sofort für eine Stunde

mit 96% Ethanol fixiert und für 24 Stunden bei Raumtemperatur getrocknet. Jede

37

infizierte Zelle ruft im Zellmonolayer einen Plaque hervor. Die Anzahl der Plaques

wurde gezählt, zusätzlich wurde ein Titrationsstandard mit bekanntem Titer, hier mit

dem Marekimpfstoff Marexine CA, durchgeführt.

Die Titrationen werden für zwei Verdünnungen (1:50 und 1:500) jeweils im

Doppelansatz ausgeführt. Der Titer wird als Plaque Forming Units pro Milliliter

(PFU/ml) angegeben und folgendermaßen kalkuliert:

Titer pro Milliliter (log10) =

Durchschnitt gezählter Plaques x x

4.2.1.1 rHVT-Detektion mittels Immunfluoreszenztest

Replizierendes rHVT-ND wurde am 10. Tag nach rHVT-ND Impfung aus Milzzellen in

Cokultivierung mit Hühnerembryofibroblasten nach dem oben genannten Protokoll

von MSD Tiergesundheit nachgewiesen. Sekundäre Hühnerembryofibroblasten

wurden mit 37° C warmen, 1% FCS-haltigen M6B8 (MSD Animal Health)

Erhaltungsmedium in Polystyrene Zellkulturplatten (Corning Cell Culture Dish,

430196, mit 2 mm Zählgitter oder Costar, cat. No. 3060 mit 2mm Zählgitter) für 24

Stunden mit Milzzellen der geimpften Tiere cokultiviert. Bei der Milzentnahme wurde

die Milzkapsel entfernt, die Milz mechanisch zerkleinert und zertrennt, mit phosphat-

gepufferter Salzlösung (PBS 0,01M, Na2HPO4 2,9 g, NaCl 8g, KCl 2g, KH2PO4 0,2 g,

pH 7,4) durch einen 100 µm Filter (BD Falcon, Heidelberg) in ein Falcon Tube (50 ml

Röhre, 114 x28 mm, PP, lot. 3040401, Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Deutschland)

überführt und in Zellkulturmedium M6B8 (MSD Animal Health) mit 5%FCS gelöst.

Anschließend wurden die restlichen Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS

0,01 s.o.) aus dem Filter gewaschen. Dann wurden die Zellen für 10 Minuten bei

1500 rpm und 4°C zentrifugiert, der Überstand verworfen, das Zellpellet in zwei

Milliliter Medium (M6B8 (MSD Animal Health, 5% FCS)) resuspendiert und eine

Zellkonzentration von 5 x 106 Zellen pro Milliliter hergestellt (Neubauer Zählkammer).

Ein Milliliter dieser Zelllösung (5 x 106 Zellen) wurde dann auf die Platten mit

konfluenten Monolayern aus sekundären Hühnerembryofibroblasten, welche fünf

38

Milliliter frisches Erhaltungsmedium (1% FCS, 37°C) enthielten, gegeben. Die Zellen

wurden drei Tage unter warmen Erhaltungsmedium (37° C, 1% FCS) belassen und

jeden Tag kontrolliert. Nach drei Tagen wurden die Plaques nach einstündiger

Ethanol-Fixierung (96%) und 24-stündiger Raumtemperatur-Lufttrocknung mit einem

monoklonalen Antikörper gegen das F-Protein (MCA NDV-F, lot. MAB040226DM,

exp. MAB-0320-102D, MSD Tiergesundheit) und einem fluoreszierenden

Zweitantikörper (Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG (H+L), Lot: 861163,

InvitrogenTM Eugene, Oregon, USA) sichtbar gemacht. Anschließend wurde unter

einem Inversmikroskop bei 25-facher Vergrößerung ausgezählt (Inverses Mikroskop

IM 35, Carl Zeiss, Göttingen, Deutschland). Zytopathische Effekte (Plaques) wurden

mikroskopisch detektiert und die Anzahl der positiven immunfluoreszierenden

Plaques gezählt. Die positiven Plaques wurden drei Tage nach Inkubation gezählt,

die Durchschnittsanzahl der Plaque Forming Units (PFU) pro Tier und pro Tiergruppe

angegeben (Daten nicht gezeigt).

4.3 Versuchsaufbau

Es wurden zwei Tierversuche mit SPF-Hühnern und kommerziellen Broilern

durchgeführt (Abbildungen 1 und 2). Im ersten Versuch wurden Eier von SPF-

Hühnern in der Klinik für Geflügel in Hannover ausgebrütet. Die Tiere wurden per

Zufall in vier verschiedene Gruppen eingeteilt und gegen die Newcastle Disease

geimpft. Die erste Gruppe wurde ungeimpft als Kontrollgruppe belassen. Der dritten

und vierten Gruppe wurde die ND-Lebendvakzine per Augentropfen verabreicht.

rHVT-ND wurde der zweiten sowie vierten Gruppe subkutan im Nackenbereich

appliziert. Am 10. und 35. Tag nach der Impfung wurden 7 Tiere pro Gruppe durch

Kopfschlag betäubt, durch Blutentzug getötet und anschließend seziert. HVT wurde

am 10. Tag nach Impfung durch Co-Kultivierung der Milzellen in

Hühnerembryofibroblasten detektiert. Hardersche Drüse, Konjunktiva, Trachea,

Lunge und Zäkaltonsille wurden zur immunhistochemischen Analyse auf

verschiedene Immunzellpopulationen entnommen. Ebenfalls wurden Proben zur

histologischen Untersuchung von Lunge, Trachea und Harderschen Drüsen am 10.

39

Tag entnommen. Die Belastungsinfektion fand am 35. Tag nach dem Schlupf mit

einer Impfdosis mit dem APMV-1 Stamm LaSota statt. Die Tiere (n=5-10) wurden zur

Belastungsinfektion und im Zeitraum danach in Isolationseinheiten vom Horsfall-

Bauer Typ verbracht und gehalten, die restlichen Tiere (n=5) verblieben ohne

Belastungsinfektion in den Ställen. Am 35. Tag nach der Impfung vor der APMV-1

Stamm LaSota Inokulation wurden Trachealtupferproben entnommen (7/Gruppe),

pro Gruppe zusammengelegt und auf APMV-1 mittels qRT-PCR untersucht. Am 36.

und 40. Tag nach dem Schlupf (einen und fünf Tage nach der APMV-1 Stamm

LaSota Challenge) wurden Kontaktsentineltiere (5/Gruppe) zu den

belastungsinfizierten Tieren hinzugesetzt. Die zweite Gruppe Sentinels wurde fünf

Tage nach Belastungsinfektion für fünf Tage hinzugesetzt, nachdem die erste

entfernt worden war. Die Tiere wurden jeden Tag auf klinische Symptome

untersucht, Trachealtupfer wurden am 3., 5., 7. und 10. Tag nach Challenge

gesammelt, um NDV durch qRT-PCR zu detektieren. Serumproben wurden am 36.

und am 43. Tag (sowie im zweiten Versuch am 46. Tag von nicht

belastungsinfizierten Tieren) nach dem Schlupf entnommen (5-7/Gruppe), um sie

mittels ELISA und HAH-Test auf NDV spezifische Antikörper zu untersuchen. Am 46.

Tag nach der Impfung wurden alle Vögel durch Kopfschlag betäubt, durch Blutentzug

getötet und seziert.

Der zweite Versuch hatte neben einigen Abweichungen den gleichen

Versuchsaufbau wie der erste und wurde mit kommerziellen Broilern durchgeführt

(Abb. 2). Zusätzlich zum ersten Versuch wurden anstelle von sieben Tieren fünf

Tiere pro Gruppe eingesetzt. Am 35. Tag nach der Impfung wurden drei bis vier

Vögel pro Gruppe getötet und seziert. Auch wurden Milz und Blutlymphozyten am

sechsten, 11. und 36. Tag des Versuchs entnommen und auf verschiedene

Immunzellpopulationen wie bei der Immunhistochemie in der Durchflusszytometrie

untersucht. Tränenflüssigkeitsproben wurden am Tag der Challenge entnommen (35

Tage nach der Impfung), welche im ELISA auf APMV-1 Antikörper untersucht

wurden. Die PCR Untersuchung auf rHVT-ND fand ebenfalls nur im zweiten Versuch

statt und wurde mit Milzzellen vom 36. Versuchstag durchgeführt.

40

*= zu den grau-unterlegten Zeitpunkten befanden sich die Tiere in Isolationseinheiten

vom Horsfall-Bauer Typ

Abbildung 1: Versuchsdurchführung des ersten Versuchs

41

*= zu den grau-unterlegten Zeitpunkten befanden sich die Tiere in Isolationseinheiten

vom Horsfall-Bauer Typ

=Tränenflüssigkeitsentnahme zur Anti-NDV Bestimmung

=Milzentnahme zur durchflusszytometrischen Analyse von Splenozyten

=Blutentnahme zur durchflusszytometrischen Analyse von peripheren

Blutleukozyten

Abbildung 2: Versuchsdurchführung des zweiten Versuchs

42

4.4 Untersuchungsmethoden

4.4.1 Serologische Untersuchungen

4.4.1.1 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Zur Bestimmung des Antikörpertiters wurden folgende, kommerziell erhältliche Test-

Kits von BioCheck® („(NDV) Newcastle Disease Antibody Test Kit“, Product Code:

CK 116, Smart Veterinary Diagnostics, Niederlande) und von IDEXX Laboratories®,

Inc. (IDEXX® FlockChek, „Newcastle Disease Virus Antibody Test Kit“, Product Code

5080.00, Maine, USA) untereinander verglichen. Das zu untersuchende Serum

wurde 1: 500 verdünnt und mit den mitgelieferten Positiv- und Negativkontrollen in

den Vertiefungen der mitgelieferten Mikrotiterplatten für 30 Minuten bei

Raumtemperatur belassen, sodass die NDV Antikörper an die mit Virusantigen

beschichteten Wellböden binden konnten. Nach den folgenden Waschschritten

wurde das Konjugat (BioCheck®: Anti-Huhn: Konjugiert mit Alkalischer Phosphatase

in Tris-Puffer mit Proteinstabilisatoren, IDEXX®: Ziege Anti-Huhn, konjugiert mit

Meerrettichperoxidase und Zusatz von Proteinstabilisatoren) für 30 Minuten bei

Raumtemperatur in den Vertiefungen der Mikrotiterplatten belassen. Nach erneuten

Waschschritten wurde das TMB (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin)-Substrat für 15

Minuten bei Raumtemperatur zugegeben und anschließend eine Stop-Lösung

(Natriumhydroxid in Diaethanolaminpuffer) zugegeben. Der entstandene

Farbumschlag wurde mittels OD-Wertmessung bei einer Wellenlänge von 405 nm

(BioCeck®) und 650 nm (IDEXX®) mit dem Spektrometer Tecan Sunrise (Tecan

Group AG, Österreich) gemessen. Zur Auswertung wurde das Programm MagellanTM

(V6.5, Tecan Austria GmbH) genutzt. Die Titer wurden folgendermaßen berechnet:

Log10Titer = 1,0(Log(P/PK)+3,52 (BioCheck®)*1

Log10Titer = 1,09(log10S/P)+3,36 (IDEXX®)*2

Proben mit Titer ≥ 396 (BioCheck®) und ≥ 1159 (IDEXX®) wurden als positiv

betrachtet.

*1 = P = Probe; PK = Positivkontrolle = BioCheck®

*2 = S = Probe; P = Positivkontrolle =IDEXX®

43

4.4.1.2 Hämagglutinations-Hemmungstest

Durch die Neutralisation der Viren durch NDV-Antikörper kann die durch APMV-1

verursachte Erythrozytenagglutination gehemmt werden und somit der NDV-

Antikörpergehalt in Seren nach Erstellen einer Verdünnungsreihe (log 2-Verdünnung)

bestimmt werden. Der Hämagglutinations-Hemmungstest (HAH-Test) wurde nach

den Richtlinien der Welttiergesundheitsorganisation (OIE 2008) in Mikrotiterplatten

mit rundem Boden durchgeführt. Anstelle von phosphatgepufferter Salzlösung wurde

sterile Kochsalzlösung (9 g/L) verwendet. Der HAH-Test wurde mit einer

Antigenkonzentration von vier hämagglutinierenden Einheiten (HAU) des APMV-1

Stammes LaSota durchgeführt. Die Serumproben wurden mit der Antigenlösung in

Kochsalzlösung 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde eine

1%ige Hühnererythrozyten-Suspension für 30 Minuten in jede Reaktionsvertiefung

gegeben. Als Hemmtiter gilt die höchste Antiserumverdünnung, die vier

Viruseinheiten vollständig hemmt. Die Nummer der letzten Vertiefung, bei dem eine

Hämagglutinationshemmung vorliegt, ist die Titerkennzahl. Der Titer ist dargestellt

als 2er Potenz.

4.4.2 Klinischer Score

Der klinische Score für respiratorische klinische Symptome wurde nach dem Scoring

System von Jones et al. (JONES et al. 1992) durchgeführt. Er wurde jeden Tag für

10 Tage nach der Belastungsinfektion erhoben. Score 0 = keine klinischen

Symptome; Score 1 = klares nasales Exsudat; Score 2 = trübes nasales Exsudat;

Score 3 = Schwellung des Sinus Infraorbitalis.

4.4.3 Histologische Untersuchungen

Histologische Proben von Harderscher Drüse, Trachea und Lunge wurden sofort

nach ihrer Entnahme in 4 %igem gepuffertem Formalin fixiert, in Paraffinwachs

eingebettet und nach herkömmlichen Methoden bearbeitet

(DUMRONGSOONTORNCHAI 1999). Hierbei wurden die Proben in einer

44

aufsteigenden Alkoholreihe (Isopropanol 50 %, 70 %, 80%, 90%, 100% für jeweils 60

min 2x, Isopropanol/Azeton 1:1 für 90 min, Aceton für 60 min, 2x) entwässert und

anschließend in Paraffinblöcke eingebettet. Die Paraffinblöcke wurden über Nacht im

Kühlschrank (4°C) gelagert und anschließend mit einem Mikrotom (Model 2040

Autocut (Reichert-Jung, Cambridge Instrument GmbH, Nußloch) mit einer

Schnittdicke von 2 µm geschnitten. Die Gewebeschnitte wurden in ein 40°C warmes

Wasserbad überführt und anschließend von dort aus auf mit Serum-Glycerin

(Waldeck GmbH, Division Chroma, Münster, Deutschland) beschichtete

Glasobjektträger verbracht. Im Anschluss erfolgte eine Trocknung für eine Stunde bei

Raumtemperatur. Anschließend wurden die Schnitte mittels Hämatoxylin-Eosin

(H&E) gefärbt. Hierbei wurde zuerst eine Deparaffinierung und Rehydratation der

Schnitte mit absteigender Alkoholreihe durchgeführt. Anschließend wurden die

Objektträger in Hämatoxylin- und Eosin (1%)- Lösungen gefärbt. Die Schnitte wurden

danach mit DePEx Mounting Medium (BDH Laboratory Supplies, England)

überschichtet und mit einem Deckglas abgedeckt. Danach erfolgte die

mikroskopische Begutachtung und wurde nach folgendem Score, angelehnt an die

histopathologischen Veränderung nach NDV-Infektion (CATTOLI et al. 2011),

bewertet: Score 0 - keine Veränderung; Score 1 - milde lymphozytäre oder

heterophilzellige Infiltrationen in Epithelschicht oder lamina propria und ein oder

mehrere lymphoide Zellansammlungen; Score 2 - massive Infiltration von

Entzündungszellen in Epithelschicht oder Lamina propria, fokal oder diffus,

Hypertrophie von mukösen Drüsen; Score 3 - massive fokale und diffuse Infiltration

von Entzündungszellen im Epithel oder in der Lamina propria und Ablösung des

zilientragenden Epithels.

4.4.4 Immunhistochemische Untersuchungen

Hardersche Drüse, Konjunktiva, Trachea, Lunge und Zäkaltonsille wurden den

Tieren während der Sektion entnommen, mit Einbettmedium für Gefrierschnitte

(Jung, Leica Microsystems Nussloch GmBH, Heidelberg, Batch-Nr.:03655539) auf

herkömmlichem Papier fixiert, in flüssigem Stickstoff gefroren und anschließend bei

45

-70 °C gelagert. Die tiefgefrorenen Organe wurden mit einem Kryostaten (Model

2800 Frigocut (Reichert-Jung, Leica GmbH, Beasheim)) mit einer Schnittdicke von 5

µm bei -22°C geschnitten und auf Glasobjektträger (Thermo Scientific, Superfrost

Ultra Plus ®, Objektträger, geschliffen, Braunschweig, Deutschland) überführt. Die

Kryostatschnitte wurden in einem Exsikkator bei Raumtemperatur für 24 Stunden

getrocknet. Danach wurden die Schnitte in -20°C kaltem Aceton für 10 Minuten bei

Raumtemperatur fixiert und bei Raumtemperatur getrocknet. Diese Azeton-fixierten

Schnitte können für 6 Monate in einem Exsikkator bei Raumtemperatur gelagert oder

direkt bearbeitet werden. Zwischen jedem der nun folgenden Arbeitsschritte erfolgte

eine kurze (10 Sekunden) und eine lange Waschung (fünf Minuten) der Schnitte mit

phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 0,01M, Na2HPO4 2,9 g, NaCl 8g, KCl 2g,

KH2PO4 0,2 g, pH 7,4) in einer Glaskammer. Pro Objekträger wurden 500 µl der

jeweiligen Lösungen aufgetragen. Nach dem Fixierungsschritt wurden alle Schnitte

zur Inaktivierung von endogenen Peroxidaseaktivitäten der Organe bei 0,03 % H2O2

für 15 Minuten in einer Glasküvette belassen. Danach wurde ein Blocking Antikörper

(Pferdeserum in PBS verdünnt, Vectastain ®, Vector Laboratories, Inc., Burlingame.

USA plus Avidin D) für 20 Minuten auf den Schnitten belassen, um freie

Proteinstrukturen, welche unspezifische Bindungen hervorrufen können, zu

blockieren. Nach diesem Schritt erfolgte die Zugabe der primären Antikörper, welche

für eine Stunde bei 37°C inkubiert wurden. Die Erstantikörper wurden von der Firma

Southern Biotech (Alabama, USA) über Biozol Diagnostica Vertrieb GmbH (Eching,

Deutschland) bezogen: CD4+ ,CD8+ (T-Zellen), BU-1+ (unreife und reife B-Zellen,

keine Plasmazellen (HOUSSAINT et al. 1989) , KUL01+ (Hühner Monozyten und

Makrophagen sowie interdigitierende dendritische Zellen und aktivierte

Mikrogliazellen) und IgA+ Zellen wurden mit den in Tabelle 3 gelisteten primären

Antikörpern markiert (Tabelle 3).

46

Tabelle 3: Antikörper zur immunhistochemischen Detektion von verschiedenen

Immunzellpopulationen

Antikörper Cat.No.* µg/ml

Mouse Anti-Chicken CD 4 8210-01 1

Mouse Anti-Chicken CD 8β 8280-01 1

Mouse Anti-Chicken BU-1 8395-01 1

Mouse Anti-Chicken KUL01 8420-01 1

Mouse Anti-Chicken IgA 8330-01 0,05

(*=Cat.No., Southern Biotechnology Associates, Inc. (Alabama, USA))

Alle Antikörper außer Mouse Anti-Chicken IgA wurden 1:500 in PBS verdünnt und

mit Biotin versetzt (Vectastain ®, Vector Laboratories, Inc., Burlingame. USA). Mouse

Anti-Chicken IgA wurde 1:10000 in PBS verdünnt. Nach einem Waschschritt wurde

der biotinylierte Zweitantikörper für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf die

Objektträger gegeben. Als Zweitantikörper wurde ein biotinylierter Antikörper aus

dem Vectastain ABC Kit (Mouse IgG, PK-6102, Vectastain ®, Vector Laboratories,

Inc., Burlingame, USA) verwendet. Danach wurde das ABC Konjugat für 30 Minunten

auf die Schnitte gegeben. Dieses besteht aus einem Avidin und biotinyliertem

Enzymkomplex (Horseradisch Peroxidase=HRP), welcher sich durch die hohe

Affinität von Avidin zu Biotin irreversibel an den Zweitantikörper bindet. Die Färbung

erfolgte mittels DAB (3,3'-Diaminobenzidin) als Enzymsubstrat, welches nach

Reaktion mit der HRP des Enzym-Avidinkomplexes ein braunes Endprodukt erzeugt

und somit positive Zellen braun darstellt. Anschließend wurde noch eine

Gegenfärbung mit Hämatoxylin für 10 Sekunden durchgeführt und die Schnitte unter

fließendem Wasser für zwei Minuten gespült. Dann wurden die Objektträger mit drei

bis vier Tropfen eines wässrigen Eindeckmittels (Aquatex ®, Merck KGaA,

Darmstadt, Deutschland) und Deckgläßchen (24 x 60 Millimeter) abgedeckt und für

einen Tag zum Trocknen bei Raumtemperatur belassen.

Die positiv markierten Zellen wurden bei 400-facher Vergrößerung in drei bis fünf

Feldern mikroskopisch ausgezählt und ein Mittelwert pro Tier gebildet. Aus den

47

Einzelwerten/Tier wurde ein Mittelwert pro Gruppe gebildet, welche miteinander

verglichen wurden.

Bei Zellpopulationsbestimmungen in Konjunktiva-assoziertem lymphoiden Gewebe

und in der Zäkaltonsille wurde aufgrund der hohen Zellzahlen ein alternatives

Scoring System angewandt. Dieses basierte auf dem Score von McDonald und

Pilgram (MCDONALD u. PILGRAM 1999), bei dem bei 200-facher mikroskopischer

Vergrößerung Zellvorkommen prozentual eingeschätzt wurden: Score 0 = 0% der

Zellen im mikroskopischen Sichtfeld sind bräunlich gefärbt; Score 1 = weniger als 25

% der Zellen im mikroskopischen Sichtfeld sind bräunlich gefärbt; Score 2 = weniger

als 50 % der Zellen im mikroskopischen Sichtfeld sind bräunlich gefärbt; Score 3 =

mehr als 50 % der Zellen im mikroskopischen Sichtfeld sind bräunlich gefärbt.

4.4.5 Virus-RNA Isolierung

Gesamt-RNA wurde von Tracheal- und Kloakal-Tupferproben mit peqGOLD

TriFast™ (peqlab, Erlangen, Deutschland) entsprechend den Angaben des

Herstellers isoliert. Die RNA in den Tupferproben wurde mit Chloroform, Isopropanol

und Ethanol (75%) isoliert und anschließend in 30 µl RNAse/DNAse-freiem Wasser

gelöst. Die Probe wurde daraufhin mit einem Spektrophotometer auf den RNA-

Gehalt und ihre Qualität untersucht und entweder bei -80°C gelagert oder direkt

untersucht.

4.4.6 Nachweis von APMV-1 mittels qRT-PCR (quantitative Reverse

Transcription Polymerase Chain Reaction)

Vermehrungsfähige und inaktive Viruspartikel des APMV-1 können mit der qRT-PCR

nachgewiesen werden. Bei der APMV-1 One-Step Real-Time PCR wird eine

Gensequenz auf dem Polymerase L-Gen über mehrere Vervielfältigungszyklen

amplifiziert und durch Fluoreszenzfärbung sichtbar gemacht. Hierbei ist ein

qualitativer und quantitativer Nachweis des Virus möglich. Der Cycle threshold (Ct)

gibt den Zyklus an, bei dem die Fluoreszenz signifikant über das

48

Hintergrundfarbsignal steigt. Die Fluoreszenz stammt von sogenannten

Reporterfarbstoffen, die mit der Sonde gekoppelt sind. FAM ist der Fluoreszenz-

Farbstoff, welcher synchron sequenzspezifisch mit der Anreicherung der PCR-

Produkte (142 bp) ansteigt. Nicht korrekt gebundene und daher nicht durch die

Polymerase hydrolisierte Sonden werden durch einen sogenannten Quencher

(BHQ1) daran gehindert, zu fluoreszieren. Als Reference Dye, also ein weiterer

Reporterfarbstoff, welcher ebenfalls eingesetzt wird, um nicht PCR-bedingte

Variationen in der Fluoreszenz auszugleichen, wurde ROX eingesetzt. Alle Proben

bis auf die Kontrollen wurden im Doppelansatz untersucht. Es wurde das PCR Kit

Ambion Ag Path-ID™ One-Step RT-PCR Kit verwendet.

Pro PCR-Mix (25 µl) wurden 3 µl RNase-freies Wasser, 12,5 µl Reaktionsmix (2x RT-

PCR Buffer), 1,875 µl des Vorwärtsprimers (NDF; 10 pmol/µl), 0,625 µl des

Rückwärtsprimers (NDR; 10pmol/µl), je 0,5 µl jeder Sonde (NDpro1, NDpro2; 1,25

pmol/µl), 1 µl Enzym-Mix (25x RT-PCR Enzyme Mix) und 5 µl der Proben-RNS

verwendet. Die Primersequenzen lauten wie folgt:

NDforward primer: GAGCTAATGAACATTCTTTC, Position 12679-12696;

NDreverse primer: AATAGGCGGACCACATCTG, Position 12820-12838;

ND-probe 1: [FAM]TCATTCTTTATAGAGGTATCTTCATCATA[BHQ1],

Position 12738-12766;

ND-probe 2: [FAM]TCATACACTATTATGGCGTCATTCTT[BHQ1],

Position 12759-12784.

Zur APMV-1 rRT-PCR wurde das real time PCR-Gerät Stratagene MX 3005P

(Stratagene, La Jolla, CA) eingesetzt. Das Thermalprofil wurde mit einem Zyklus bei

45°C für 10 Minuten, einem Zyklus bei 95°C für weitere 10 Minuten, 40 Zyklen bei

95°C für 15 Sekunden und 55°C für 45 Sekunden eingestellt. Insgesamt wurden 40

Zyklen durchgeführt. Sobald die Fluoreszenz der Probe 0,018 Fluorescence dRn

(delta Rn = normalisiertes Reportersignal) überschritt, wurde die Probe als positiv

bewertet.

49

4.4.7 PCR (Polymerase Chain Reaction) des Impfvirus

Aufgrund technischer Schwierigkeiten beim Nachweis von replizierendem rHVT-ND

wurde im zweiten Versuch parallel zum rHVT-Plaquetest eine HVT-PCR

durchgeführt. HVT-DNA wurde aus Milzzellen isoliert, welche am 36. Tag nach

Schlupf entnommen wurden. Hierbei wurde nach Angaben des Herstellers

vorgegangen. Zur Isolation wurde das InnuPrep DNA Minikit (Analytik Jena Bio

Solutions, Lot-Nr.: 016-08) benutzt. Die Primer wurden nach Becker et al. (1992)

modifiziert (BECKER et al. 1992) und mithilfe des Programms Primer3 (v. 0.4.0;

http://primer3.wi.mit.edu/) erstellt.

Forward Primer: CGTCGATACCCATCATATCC (20 mer);

Reverse Primer: ACATTCTTTTCGTTGGCGTGGTAT (24mer);

Die Herstellung und Lieferung der Primer erfolgte durch die Firma Eurofins MWG

Operon (Ebersberg; Germany). Das Takara ExTaq PCR Kit® (Takara BioInc, Japan,

Lot-Nr.: KA5501EA) wurde mit folgenden Mastermixkonzentrationen eingesetzt:

50

ExTaq Polymerase 0,25 µl

ExTaq 10x Buffer 5,00 µl

dNTPmix 4,00 µl

HVT-F 2,00 µl

HVT-R 2,00 µl

H20 31,75 µl

DNA 5,00 µl (200 ng/µl)

Die folgenden PCR Zyklen wurden mit dem SensoQuest Labcycler (Biomedizinische

Elektronik, Göttingen, Germany) durchgeführt: Ein Zyklus bei 94 °C für 240

Sekunden, 45 Zyklen für 94°C für 15 Sekunden, 56°C für 60 Sekunden, 72°C für 95

Sekunden und anschließend ein Zyklus bei 72°C für 120 Sekunden.

4.4.8 Zellzählung

Die Zellen wurden mithilfe einer Neubauer Zählkammer gezählt. Jede Probe wurde

1:10 in Trypan Blau Farbe 0,4% (Gibco, Invitrogen cooperation, Darmstadt) verdünnt

und die Zellen unter dem Lichtmikroskop gezählt. Die Zellzahl wurde unter einem

Großquadrat (Volumen 0,1 µl) ermittelt und auf 1 ml hochgerechnet (Faktor 104).

4.4.9 Durchflusszytometrie

Im zweiten Versuch wurden am sechsten und am 36. Tag nach dem Schlupf die Milz,

am 11. und 36. Tag nach dem Schlupf Blutproben in heparinisierten

Reagenzröhrchen zur durchflusszytometrischen Analyse nach bekannter Methode

(SCHWARZ et al. 2011) entnommen. Bei der Milzentnahme wurde die Milzkapsel

entfernt, die Milz zerkleinert und zerteilt mit und Phosphat-gepufferter Salzlösung

(PBS 0,01M) durch einen 70 µm Filter (BD Falcon, Heidelberg) in ein Falcon Tube

(50 ml Röhre, 114 x28 mm, PP, lot. 3040401, Sarstedt AG & Co, Nümbrecht,

Deutschland) überführt. Anschließend wurde die frisch gewonnene Zellsupsension

bei 1500 rpm für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Die folgenden Antikörper der Firma

Southern Biotech (Alabama, USA), bezogen über Biozol Diagnostica Vertrieb GmbH

51

(Eching, Deutschland) wurden verwendet: Maus-Anti-CD4; CD4/αβ; CD4/δγ;

CD8/αβ; CD8/γδ; CD8; BU-1; KUL01; IgA. Die Antikörper waren alle bis auf CD4

(PE), CD8β und IgA FITC markiert. CD4 war PE-markiert, CD8β und IgA wurden

Spectral Red konjugiert (Antikörper: Konjugat-Verhältnis = 2:1). Alle Antikörper

wurden 1:100 verdünnt. Diese optimale Verdünnungstufe wurde mittels einer

Titration der Antikörper mit Milzzellen im Vorversuch ermittelt. Vor dem Färben der

Zellen wurden die isolierten Milzzellen auf eine Zellkonzentration von 1 x 106 Zellen

eingestellt und davon 100 µl pro Well auf eine 96-well Platte gegeben. Die Zellen

wurden für vier Minuten bei 4 °C mit 2000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde

verworfen und das Zell-Pellet mit 100 µl FACS-Puffer (1% Bovines Serumalbumin in

PBS) mit den darin gelösten Antikörpern für 30 Minuten bei 4 °C in Dunkelheit

inkubiert. Anschließend wurden die Zellen wieder mit 100 µl FACS-Buffer bei 2000

rpm für 5 Minuten gewaschen.

4.4.9.1 Durchflusszytometrische Analyse

Die gefärbten Zellen wurden mit dem Beckman Coulter Epics XL Flow Zytometer

(Beckman Coulter, Krefeld) gemessen und mit Hilfe des EXPO 32 ADC Programmes

analysiert. Die Lymphozyten wurden nach Größe und Granularität mittels ihrer

Foward- und Sideward-Laser Streuung zugeordnet. Ungefärbte Zellen und einzel-

gefärbte Zellen dienten als Kontrollen. Eine Kompensation fand jedes Mal vor den

Messungen mithilfe dieser Kontrollen statt. Bei Milz sowie auch Blutzellen wurden

10000 Einheiten für 180 Sekunden gemessen.

4.5 Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit der SAS-Software (SAS 9.3) für die Tracheal-

Tupfer Ergebnisse und mit der Statistix® 9 Software für alle anderen Ergebnisse

durchgeführt. Für die Tracheal-Tupferproben wurde der Fishers Exact Test

angewendet. Bei der Bewertung der Ergebnisse der Serologie, Durchflusszytometrie

und Immunhistochemie wurde die Kruskal-Wallis One-Way AOV mit anschließendem

52

paarweisem Vergleich durchgeführt. Bei einem p-Wert <0.05 wurden Unterschiede

als statistisch signifikant angesehen. Werte, welche mit unterschiedlichen kleinen

Buchstaben (a, b) gekennzeichnet wurden, unterscheiden sich signifikant

voneinander.

53

5 Ergebnisse

Die Ergebnisse der Versuche 1 (SPF-Hühner) und 2 (Broiler) werden vergleichend

dargestellt. In beiden Tierversuchen wurden die lokale und systemische

Immunantwort nach Newcastle Disease Impfung untersucht. Es wurden lokale T- und

B-Zellpopulationen sowie Makrophagen in Harderscher Drüse, CALT, Trachea,

Lunge und Zäkaltonsille sowie lokale Virusausscheidung aus der Trachea

untersucht. Lokale und systemische Antikörperbildung sowie ein Impfvirusnachweis

wurden ebenfalls durchgeführt. Eine rHVT-ND vakzinierte Gruppe und eine mit

Lebendimpfstoff vakzinierte Gruppe als auch eine mit beiden Impfstoffen geimpfte

Gruppe wurden mit einer ungeimpften Kontrollgruppe und untereinander verglichen.

5.1 Titration des Impfvirus

Die Titer der rHVT-ND Vakzine stimmten in beiden Versuchen annähernd mit den

Angaben des Herstellers überein. Die Impfstoffe wurden auf Zellkulturplatten mit

sekundären Hühnerembryofibroblasten gegeben. Im ersten Versuch wurde der Titer

der Vakzine vom Hersteller mit 7,3 log10 PFU/ml angegeben. Die direkt im Anschluss

erfolgende Titration ergab einen Titer von 6,9 log10 PFU/ml. Im zweiten Versuch

wurde der Titer vom Hersteller mit 7,0 log10 PFU/ml angegeben. Nach Verdünnung

und Impfung wurde der Impfstoff einen Tag später (24 h) titriert und wies den

gleichen Titer von 7,0 log10 PFU/ml auf.

5.2 Nachweis des rHVT-ND nach Impfung durch Anzucht in vitro

(Exp. 1) oder mittels Polymerase Kettenreaktion (Exp. 2)

Im ersten Versuch wurde replizierendes rHVT-ND aus Milzzellen nach Cokultivierung

mit sekundären Hühnerembryofibroblasten in der Zellkultur nachgewiesen. Jedoch

konnten nicht alle Platten ausgewertet werden, da eine vorzeitige Ablösung der

Hühnerembryofibroblasten von den Zellkulturböden das Auszählen der Plaques

verhinderte. Beide Gruppen der mit rHVT-ND geimpften Tiere zeigten HVT-

54

spezifische Plaques, welche mit einem monoklonalen Antikörper, der gegen das ND-

F-Protein gerichtet war, angefärbt und ausgezählt werden (Daten nicht gezeigt). Im

zweiten Versuch konnten bei drei von drei Tieren aus der rHVT-ND geimpften

Gruppe und bei drei von vier Tieren aus der rHVT-

ND/Lebendimpfstoffkombinationsgruppe rHVT-ND mittels PCR nachgewiesen

werden. Die restlichen Tiere verblieben negativ auf rHVT-ND.

5.3 Immunhistochemische Untersuchungen von

Immunzellpopulationen

Bei den SPF-Hühnern in Versuch 1 wurden die immunhistochemischen

Untersuchungen der Immunzellpopulationen am 10. Tag nach der Impfung (post

vaccination=pv) durchgeführt, bei Broilern am fünften und 10. Tag pv. Die Ergebnisse

vom 10. Tag pv der SPF-Hühner und Broiler werden vergleichend dargestellt (Abb. 7,

9, 11, 12) während die Ergebnisse des fünften Tages pv nur für den Broilerversuch

dargestellt werden. Es wurden lokale T- und B- Zellpopulationen sowie Makrophagen

in Harderscher Drüse, Konjunktiva, Lunge und Zäkaltonsille 10 Tage pv in

Experiment 1 dargestellt. Im zweiten Experiment wurden am fünften sowie 10. Tag

pv die gleichen Zellpopulationen bei Broilern in Harderscher Drüse, Konjunktiva,

Lunge und Zäkaltonsille dargestellt.

55

5.4 Immunzellpopulationen 5 Tage nach der Impfung bei Broilern

Abb. 3a: CD4+ Zellen bei Broilern 5 Tage nach ND-Impfung

Abb. 3b: CD8+ Zellen bei Broilern 5 Tage nach ND-Impfung

B

C D

A

E F

G H

56

Abbildung 3 a,b (A-H): Immunhistochemische Detektion von CD4+ Zellen (A-D) und

CD8+ Zellen (E-H) in verschiedenen Organen (Hardersche Drüse, CALT, Lunge,

Zäkaltonsille) von kommerziellen Broilern am 5. Tag nach ND-Impfung.

Dargestellt ist der jeweilige Durchschnitt der Anzahl (A, C, E, G) bzw. der Scores (B,

D, F, H) der unterschiedlichen Immunzellpopulationen pro Gruppe und Organ. Es

wurden 3-5 Blickfelder pro Tier bei 400x (Score 200x) Vergrößerung evaluiert.

Unterschiedlich kleine Buchstaben (a, b) über den Säulen kennzeichnen Gruppen,

die sich signifikant voneinander unterscheiden (p<0,05; Kruskal–Wallis One-way

AOV mit anschließendem paarweisem Vergleich).

In Harderschen Drüsen zeigten am fünften Tag nach der Impfung beide mit dem

Lebendimpfstoff geimpften Broilergruppen signifikant erhöhte CD4+, CD8+ und BU-

1+ Zellenzahlen im Vergleich zur ungeimpften Gruppe (p<0,05), (Abb. 3 A, E, 5 A).

KUL01+ Zellen waren ebenfalls in beiden mit Lebendimpfstoff geimpften im Vergleich

zur ungeimpften Gruppe erhöht, signifikant jedoch nur in der Gruppe, welche mit dem

Lebendimpfstoff allein geimpft wurde (p<0,05), (Abb. 5 E).

Eine Zellzahlerhöhung findet sich ebenfalls bei CD4+ und CD8+ Zellen im

Konjunktiva-assoziiertem lymphoidem Gewebe bei Tieren aus der Gruppe, welche

alleinig mit dem Lebendimpfstoff geimpft wurden im Vergleich zu den restlichen

Gruppen (Abb. 3 B, F).

In der Lunge zeigten sich erhöhte CD4+ und CD8+ Zellen in den Lebend-geimpften

Gruppen im Vergleich zur ungeimpften Gruppe (Abb. 3 C, G). Ein signifikanter

Anstieg von CD4+ Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe wurde ebenfalls in der

rHVT-ND Gruppe beobachtet (p<0,05) (Abb. 3 C). CD4+ Zellen waren in

Zäkaltonsillen von Broilern in Gruppen, welche mit einer Kombination beider

Impfstoffe geimpft wurden, erhöht im Vergleich zu den restlichen Gruppen (Abb.3 D).

57


Vergrößerung in Harderschen Drüsen von Broilern am fünften Tag nach ND-Impfung.

A - ungeimpfte Kontrollgruppe, B - rHVT-ND geimpfte Gruppe, C - mit

Lebendimpfstoff geimpfte Gruppe, D - mit rHVT-ND und Lebendimpfstoff geimpfte

Gruppe. CD4+ Zellen stellen sich braun dar.

Generell zeigten sich im interstitiellen Gewebe, um den Hauptausführungsgang und

um die Nebenausführungsgänge der Harderschen Drüse erhöhte Zellzahlen in ND-

vakzinierten Tieren im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildung 4 A-D).

A B

C D

58

Abb. 5a: Bu-1+ Zellen bei Broilern 5 Tage nach ND-Impfung

Abb. 5b: KUL01+ Zellen bei Broilern 5 Tage nach ND-Impfung

A B

C D

E F

G H

59

Abbildung 5 a, b (A-H): Immunhistochemische Detektion von Bu-1+ Zellen (A-D) und

KUL01+ Zellen (E-H) in verschiedenen Organen (Hardersche Drüse, CALT, Lunge,

Zäkaltonsille) von kommerziellen Broilern am 5. Tag nach ND-Impfung.

Dargestellt ist der jeweilige Durchschnitt der Anzahl (A, C, E, G) bzw. Scores (B, D,

F, H) der unterschiedlichen Immunzellpopulationen pro Gruppe und Organ. Es

wurden 3-5 Blickfelder pro Tier bei 400x (Score 200x) Vergrößerung evaluiert.

Unterschiedlich kleine Buchstaben (a, b) über den Säulen kennzeichnen Gruppen,

die sich signifikant voneinander unterscheiden (p<0,05; Kruskal–Wallis One-way

AOV mit anschließendem paarweisem Vergleich).

60

Abb. 6: IgA+ Zellen bei Broilern 5 Tage nach ND-Impfung

Abbildung 6 (A-D): Immunhistochemische Detektion von IgA+ Zellen (A-D) in

verschiedenen Organen (Hardersche Drüse, CALT, Lunge, Zäkaltonsille) von

kommerziellen Broilern am fünften Tag nach ND-Impfung.

Dargestellt ist der jeweilige Durchschnitt der Anzahl (A, C) bzw. Scores (B, D) der

unterschiedlichen Immunzellpopulationen pro Gruppe und Organ. Es wurden 3-5

Blickfelder pro Tier bei 400x (Score 200x) Vergrößerung evaluiert. Unterschiedlich

kleine Buchstaben (a, b) über den Säulen kennzeichnen Gruppen, die sich signifikant

voneinander unterscheiden (p<0,05; Kruskal–Wallis One-way AOV mit

anschließendem paarweisem Vergleich).

Eine signifikante Erhöhung im Vergleich zur rHVT-ND und zur rHVT-

ND/Lebendimpfstoff-geimpften Gruppe von IgA+ Zellen in Harderschen Drüsen fand

bei Tieren statt, welche nur mit dem Lebendimpfstoff geimpft wurden (p<0,05) (Abb.

6 A).

A B

C D

61

In der Lunge zeigen sich IgA+ Zellen in der Kombinationsgruppe signifikant erhöht zu

den restlichen Gruppen (p<0,05) (Abb. 6 C).

5.5 Immunzellpopulationen 10 Tage nach der Impfung bei SPF-

Hühnern und Broilern

Bei den SPF-Hühnern war ein signifikanter Anstieg der CD4+, BU-1+ und KUL01+

Zellzahlen in Harderschen Drüsen bei den mit Lebendimpfstoff geimpften Tieren im

Vergleich zur Kontrollgruppe zu beobachten (Abb. 7 A, E, G) (p<0,05).

In der rHVT-ND geimpften Gruppe waren CD4+, CD8+, BU-1+, KUL01+ und IgA+

Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht (Abb. 7 A, C, E, G, I). Bei der

Doppelvakzinierung zeigten sich im Vergleich zur Kontrollgruppe eine signifikant

Zellzahlerhöhung der CD8+ Zellen in Harderschen Drüsen (p<0,05) (Abb. 7 C).

Bei Broilern war eine Erhöhung der CD8+ Zellzahlen am 10. Tag in allen geimpften

Gruppen in Harderschen Drüsen zu beobachten (Abb. 7 D). Die Kombinationsgruppe

unterschied sich hierbei signifikant von der ungeimpften Gruppe (p<0,05) (Abb. 7 D).

Bei den restlichen Zellzahlpopulationen konnten keine signifikanten Unterschiede im

Vergleich zur Kontrollgruppe und innerhalb der Gruppen festgestellt werden (p>0,05).

CD4+ Zellen bei Broilern in Harderschen Drüsen zeigten sich in der

Lebendimpfstoffgruppe erhöht im Vergleich zu den restlichen Gruppen (Abb. 7 B).

62

Abb. 7: Verschiedene Immunzellpopulationen in Harderschen Drüsen am 10. Tag

nach ND-Impfung

A B

C D

E

G

F

H

63

Abb. 7: Fortsetzung: Verschiedene Immunzellpopulationen in Harderschen Drüsen

am 10. Tag nach ND-Impfung

Abbildung 7 (A-J): Immunhistochemische Detektion von verschiedene

Immunzelltypen in Harderschen Drüsen von SPF-Hühnern (A, C, E, G, I) und

Broilern (B, D, F, H, J) am 10. Tag nach ND-Impfung.

Dargestellt ist der jeweilige Durchschnitt der Anzahl der unterschiedlichen

Immunzellpopulationen pro Gruppe und Organ. Es wurden 3-5 Blickfelder pro Tier

bei 400x Vergrößerung evaluiert. Unterschiedlich kleine Buchstaben (a, b) über den

Säulen kennzeichnen Gruppen, die sich signifikant voneinander unterscheiden

(p<0,05; Kruskal–Wallis One-way AOV mit anschließendem paarweisem Vergleich).

I J

64


Vergrößerung in Harderschen Drüsen von SPF-Hühnern am 10. Tag nach ND-

Impfung.



Gruppe. CD4+ Zellen stellen sich bräunlich dar.

Es wurde eine Erhöhung der CD4+ Zellzahlen im Interstitium der Drüse und um den

Ausführungsgang bei SPF-Hühnern aus ND-geimpften Gruppen beobachtet (Abb.8

B, C, D).

A B

C D

65

Abb. 9: Verschiedene Immunzellpopulationen in Lungen am 10. Tag nach ND-

Impfung

A B

C D

E

G

F

H

66

Abb. 9: Fortsetzung: Verschiedene Immunzellpopulationen in Lungen am 10. Tag

nach ND-Impfung


Immunzelltypen in Lungen in Nähe eines Parabronchus unter einem lateroventralen

sekundären Bronchus von SPF-Hühnern (A, C, E, G, I) und Broilern (B, D, F, H, J)

am 10. Tag nach ND-Impfung.

Dargestellt ist der jeweilige Durchschnitt der Anzahl der unterschiedlichen

Immunzellpopulationen pro Gruppe und Organ. Es wurden 3-5 Blickfelder pro Tier

bei 400x Vergrößerung evaluiert. Unterschiedlich kleine Buchstaben (a, b) über den

Säulen kennzeichnen Gruppen, die sich signifikant voneinander unterscheiden

(p<0,05; Kruskal–Wallis One-way AOV mit anschließendem paarweisem Vergleich).

rHVT-ND und lebend-geimpfte SPF-Hühner (Gruppe vier) zeigten eine signifikante

Erhöhung der CD4+ Zellpopulationen in Lungenanschnitten in Bereichen der

Parabronchien ventral der sekundären Bronchien im Vergleich zur Kontrollgruppe

(p<0,05) (Abb. 9 A). KUL01+ Zellzahlen zeigten eine signifikante Verringerung in der

rHVT-ND/Lebendimpfstoff-Kombinationsgruppe im Vergleich zu der rHVT-ND und

der Lebend-ND Gruppe (p<0,05) (Abb. 9 G).

Die Zellzahlen der Immunzellen in Lungen von Broilern wiesen am 10. Tag nach

Impfung keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen auf

(p>0,05) (Abb. 9 B, D, F, H, J). Hier zeigten sich CD8+, Bu-1+ und IgA+ Zellenzahlen

in mit Lebendimpftoff geimpften Gruppen im Vergleich zur ungeimpften Gruppe

erhöht (Abb. 9 D, F, J).

I J

67

Im immunhistochemischen Schnitt stellen sich positiv gefärbte Zellen braun dar. Abb.

10 (A-D) zeigt CD4+ gefärbte Zellen um einen Parabronchus in den verschiedenen

Gruppen.

Abbildung 10 (A-D): Immunhistochemische Detektion von CD4+ Zellen bei 200-

facher Vergrößerung eines Parabronchus ventral eines lateroventralen sekundären

Bronchus in Lungen von SPF-Hühnern am 10. Tag nach ND-Impfung.



Gruppe. CD4+ Zellen stellen sich braun dar.

A B

C D

68

Abb. 11: Verschiedene Immunzellpopulationen des Konjunktiva-assoziierten

lymphatischen Gewebes am 10. Tag nach ND-Impfung

Abbildung 11 (A-E): Immunhistochemische Detektion von verschiedenen

Immunzelltypen im Konjunktiva-assoziierten lymphatischem Gewebe (CALT) von

Broilern am 10. Tag nach ND-Impfung.

Dargestellt sind die jeweiligen Scores der unterschiedlichen Immunzellpopulationen

pro Gruppe und Organ. Es wurden 3-5 Blickfelder pro Tier bei 200x Vergrößerung

evaluiert.

A B

C D

E

69

Die Immunzellen in Konjunktiva-assoziierten lymphoiden Geweben von Broilern

wiesen am 10.Tag nach Impfung keine signifikanten Unterschiede zwischen den

einzelnen Gruppen auf (Abb.11 A-E) (p<0,05). Eine Erhöhung zeigte sich bei CD4+

Zellen in der mit Lebendimpfstoff geimpften Gruppe sowie bei IgA+ Zellen in der mit

beiden Impfstoffen geimpften Gruppe (Abb. 11 A, E).

70

Abb. 12:

Verschiedene Immunzellpopulationen in Zäkaltonsillen am 10. Tag nach ND-Impfung

A B

C D

E F

G H

71

Abb. 12: Fortsetzung: Verschiedene Immunzellpopulationen in Zäkaltonsillen am 10.

Tag nach ND-Impfung


Immunzelltypen in Zäkaltonsillen von SPF-Hühnern (A, C, E, G, I) und Broilern (B, D,

F, H, J) am 10. Tag nach ND-Impfung.

Dargestellt sind die jeweiligen Scores der unterschiedlichen Immunzellpopulationen

pro Gruppe und Organ. Es wurden 3-5 Blickfelder pro Tier bei 200x Vergrößerung

evaluiert.

Bei SPF-Hühnern zeigten CD4+ Zellzahlen in Zäkaltonsillen am 10. Tag nach

Impfung eine Verringerung in der kombiniert geimpften Gruppe im Vergleich zu der

Kontrollgruppe (Abb. 12 A). Die CD8+ Zellzahlen erhöhten sich nach rHVT-ND

Impfung verglichen mit den Zellzahlen der restlichen Gruppen (Abb. 12 B). BU-1+

Zellen waren in ND-geimpften Gruppen niedriger als in der Kontrollgruppe (Abb.12

E). Eine Erhöhung fand im Bereich der KUL-01+ Zellen beider mit Lebendimpfstoff

geimpfter Gruppen statt (Abb. 12 G). IgA+ Zellzahlen zeigten eine Reduktion in der

rHVT-ND geimpften Gruppe im Vergleich zu den restlichen Gruppen (Abb. 12 I).

Bei Broilern wurde eine Erhöhung von Bu-1+ Zellen in den ND-geimpften Gruppen im

Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtet (Abb. 12 F). KUL01+ Zellen waren in der

Gruppe erhöht, welche nur mit dem ND-Lebendimpfstoff geimpft wurde (Abb. 12 H).

I J

72

5.6 Virusdetektion von Tracheal- und Kloakaltupfern durch qRT-

PCR

Im ersten und zweiten Versuch wurde bei SPF-Hühnern und kommerziellen Broilern

die Virusausscheidung aus der Trachea nach Belastungsinfektion mit dem APMV-1

Stamm LaSota mittels qRT-PCR detektiert. Im zweiten Versuch wurde zusätzlich die

Virusausscheidung aus der Kloake durch qRT-PCR von Tupferproben untersucht.

Am 35. Tag nach der Impfung wurden vor der Belastungsinfektion im ersten und

zweiten Versuch Trachealtupfer von sieben Tieren pro Gruppe entnommen.

Fünf Sentineltiere wurden jeweils einen Tag nach der Belastungsinfektion zu den

Tieren hinzugegeben und fünf Tage später entfernt. An dem Tag, an dem die erste

Gruppe der Sentineltiere entfernt wurde, wurde eine neue Gruppe von fünf Sentinels

für fünf weitere Tage hinzugesetzt. Am dritten, fünften, siebten und zehnten Tag

nach der Belastungsinfektion wurden Trachealtupfer der belastungsinfizierten SPF-

Hühner und Sentinels entnommen, sowie an den gleichen Tagen zusätzlich

Kloakentupfer der Broiler.

Am 35. Tag nach Impfung wurde bei keinem Tier Virus in der qRT-PCR detektiert

(Tabelle 4). Alle SPF-Hühner der Kontrollgruppe schieden den APMV-1 Virusstamm

LaSota bis zum siebten Tag nach der Belastungsinfektion aus. Am 10. Tag nach der

Belastungsinfektion war nur noch ein Tier aus der Kontrollgruppe positiv (Tabelle 4).

Alle Tiere der rHVT-ND geimpften Gruppe schieden Virus bis zum siebten Tag nach

der Belastungsinfektion aus. Am 10. Tag nach Belastungsinfektion war keines dieser

Tiere mehr Paramyxovirus Serotyp 1-positiv in der qRT-PCR. In der ersten

Sentinelgruppe der rHVT-ND Gruppe wurde bei keinem Tier rHVT-ND detektiert.

Diese Sentinelgruppe unterschied sich signifikant in der Virusausscheidung von der

ersten Sentinelgruppe der ungeimpften Gruppe, wo fünf von fünf Tieren das

Belastungsvirus ausschieden (p<0,05) (Tabelle 4). Keines der mit Lebendimpfstoff

inokulierten Tiere sowie die Sentinels aus diesen Gruppen schieden das

Belastungsvirus aus.

Im zweiten Versuch bei Broilern konnte am Tag der Belastungsinfektion in keinem

Trachealtupfer APMV-1 nachgewiesen werden (Tabelle 4). Am dritten und fünften

73

Tag nach der Belastungsinfektion schieden vier bis fünf Tiere der insgesamt fünf

belastungsinfizierten Tiere und Sentinels der Kontrollgruppe und rHVT-ND geimpften

Gruppe Belastungsvirus aus. Tiere aus der dritten und vierten Gruppe, welche mit

dem Lebendimpfstoff immunisiert worden waren, zeigten nur ein positives Tier aus

der vierten Gruppe am dritten Tag nach der Belastungsinfektion. In der dritten

Gruppe (Lebend ND) schieden am dritten Tag nach der Belastungsinfektion drei von

fünf Sentinels den APMV-1 Stamm LaSota aus, aus der vierten Gruppe (rHVT-

ND/Lebend ND) drei von fünf Tieren am dritten Tag nach Belastungsinfektion und

zwei von fünf Tieren am fünften Tag nach Belastungsinfektion.

APMV-1 wurde auch aus Kloakaltupferproben bei jeweils einem von fünf Tieren am

dritten und fünften und zehnten Tag nach der Belastungsinfektion in nicht geimpften

Tieren nachgewiesen (Tabelle 5). Am dritten Tag nach der Belastungsinfektion

wurde bei einem Tier von fünf aus der rHVT-ND/Lebend ND Gruppe APMV-1

nachgewiesen. Keines der Sentineltiere schied APMV-1 über die Kloake aus (Tabelle

5).

5.6.1 Virusanzucht im embryonierten Hühnerei

Bei der Lebendvirusdetektion wurden Tracheal- und Kloakaltupfer der

belastungsinfizierten Broiler aus dem zweiten Versuch entnommen und mittels

Eianzucht auf APMV-1 untersucht.

Aus Trachealtupfern konnte in der ungeimpften Gruppe infektiöses APMV-1 am

dritten und fünften Tag nach der Belastungsinfektion nachgewiesen werden sowie

am dritten Tag nach der Belastungsinfektion aus der rHVT-ND Gruppe (Tabelle 4).

Aus Kloakaltupfern konnte nur am fünften und siebten Tag nach Belastungsinfektion

APMV-1 in der ungeimpften Gruppe nachgewiesen werden (Tabelle 5).

74

Tabelle 4: Virusausscheidung über die Trachea nach Belastungsinfektion mit dem APMV-1 Stamm LaSota am 35. Tag

nach Impfung.

Tierart Tage nach Challenge ungeimpft Sentinels rHVT-ND Sentinels Lebend ND Sentinels rHVT-ND/ Sentinels

1 2 1 2 1 2 Lebend ND 1 2

SPF 0

0/7

0/7

0/7

0/7

3

5/5a

5/5

a

5/5a

0/5

b

0/5b

0/5

b

0/5b

0/5

b

5

5/5a

3/5

a

5/5a

2/5

a

0/5b

0/5

b

0/5b

0/5

7

5/5a

2/5 5/5a

1/5 0/5b

0/5 0/5b

0/5

10

1/5

1/5 0/5

1/5 0/5 0/5 0/5

0/5

Broiler 0

0/7

0/7

0/7

0/7

3

5/5a (+) 5/5

4/5ac

(+) 5/5

0/5b (-) 3/5

1/5bc

(-) 3/5

5

5/5a (+) 5/5

a

5/5a (-) 5/5

a

0/5b (-) 0/5

b

0/5b (-) 2/5

7

1/5ab

(-)

3/5 4/5a (-)

1/5 0/5b (-)

0/5 0/5b (-)

0/5

10

0/5 (-)

5/5a 0/5 (-)

4/5a 0/5 (-)

0/5b 0/5 (-)

0/5b

Sentinels 1 – zugesetzte Gruppe von Sentinels (n=5) am 36. Tag nach Impfung. Sentinels 2 – zugesetzte Gruppe von

Sentinels (n=5) am 41. Tag nach Impfung. Mit qRT-PCR wurde APMV-1 aus Trachealtupfern von spezifisch-pathogenen

Hühnern (SPF) und Broilern nach Belastungsinfektion (Challenge) detektiert. „/“ trennt die Anzahl positiver Tiere von der

an diesem Versuchstag getesteten Gesamtzahl. Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen Gruppen und Sentinels, die

sich innerhalb einer Zeile signifikant voneinander unterscheiden (Fisher’s Exact Test; p<0,05). (+)/(-) = Detektion von

APMV-1 Lebendvirus in Einanzucht, (+) = Virus detektiert, (-) = Virus nicht detektiert

75

Tabelle 5: Virusausscheidung über die Kloake nach Belastungsinfektion mit dem APMV-1 Stamm LaSota am 35. Tag nach

Impfung

Tierart Tage nach Challenge ungeimpft Sentinels rHVT-ND Sentinels Lebend ND Sentinels rHVT-ND/ Sentinels

1 2 1 2 1 2 Lebend ND 1 2

Broiler 3

1/5 (-) 0/5

0/5 (-) 0/5

0/5 (-) 0/5

1/5 (-) 0/5

5

1/5 (+) 0/5

0/5 (-) 0/5

0/5 (-) 0/5

0/5 (-) 0/5

7

0/5 (+)

0/5 0/5 (-)

0/5 0/5 (-)

0/5 0/5 (-)

0/5

10

1/5 (-)

0/5 0/5 (-)

0/5 0/5 (-)

0/5 0/5 (-)

0/5

Sentinels 1 – zugesetzte Gruppe von Sentinels (n=5) am 35. Tag nach Impfung. Sentinels 2 – zugesetzte Gruppe von

Sentinels (n=5) am 41. Tag nach Impfung. Mit qRT-PCR wurde APMV-1 aus Kloakaltupfern von Broilern nach

Belastungsinfektion (Challenge) detektiert. „/“ trennt die Anzahl positiver Tiere von der an diesem Versuchstag getesteten

Gesamtzahl. Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen Gruppen und Sentinels, die sich innerhalb einer Zeile signifikant

voneinander unterscheiden (Fisher’s Exact Test; p<0,05). (+)/(-) = Detektion von APMV-1 Lebendvirus in Eianzucht, (+) =

Virus detektiert, (-) = Virus nicht detektiert

76

5.7 Serologische Untersuchungen - humorale Immunantwort

Für die Versuche 1 und 2 wurden von den SPF-Hühnern und den kommerziellen

Broilern am 36. und 43. Tag nach dem Schlupf Blutproben entnommen und der

Antikörperspiegel mit Hilfe eines NDV-Antikörper ELISAs und

Hämagglutinationshemmungstests (HAH) zu den zwei Zeitpunkten (am Tag der

Challenge und sieben Tage nach der Challenge) bestimmt. Bei Broilern wurden

zusätzlich die Titer von nicht belastungsinfizierten Tieren vom 45. Tag nach Impfung

im Säulendiagramm mit aufgeführt (Abb. 14 A, C).

Im ersten Versuch mit SPF-Hühnern zeigten alle Tiere aus geimpften Gruppen

höhere APMV-1 Antikörpertiter als Tiere aus der ungeimpften Kontrollgruppe (Abb.

13 A, B, C). Die Titer beider Gruppen, welche mit dem ND Lebendimpfstoff inokuliert

wurden, zeigten signifikant erhöhte Titer im Vergleich zur Kontrollgruppe (p<0,05) am

Tag der Belastungsinfektion (35 Tage nach Impfung) im BioCheck®- sowie im

IDEXX®-ELISA Test Kit (Abb. 13 A, B). Sieben Tage nach der Belastungsinfektion

stiegen die Titer in allen Gruppen an (Abb. 13 A, B, C). Im HAH-Test zeigten alle

geimpften Gruppen höhere Titer im Vergleich zur Kontrollgruppe zu beiden

Zeitpunkten (Abb. 13 C). Am Tag der Belastungsinfektion sowie sieben Tage danach

war der Titer der mit beiden Impfstoffen geimpften Gruppe signifikant erhöht im

Vergleich zur Kontrollgruppe (p<0,05)(Abb.13 C).

Im zweiten Versuch mit kommerziellen Broilern zeigten Tiere aus den geimpften

Gruppen am Tag sowie sieben und zehn Tage nach der Belastungsinfektion erhöhte

Titer im Vergleich zur Kontrollgruppe im ELISA und HAH-Test (Abb. 14 A, B, C).

Sieben Tage nach der Belastungsinfektion wurde eine Titererhöhung aller Gruppen

im Vergleich zum Titer der Gruppen am Tag der Belastungsinfektion detektiert

(Abb.14 A, B, C).

Im IDEXX® ELISA Test Kit zeigte sich eine signifikante Titererhöhung der rHVT-

ND/Lebendimpfstoffgruppe am Tag und sieben Tage nach der Belastungsinfektion

im Vergleich zur Kontrollgruppe (p<0,05) (Abb. 14 B). Sieben Tage nach ND-

Challenge erhöhten sich die Titer der Gruppen (Abb. 14 B).

77

Im HAH-Test zeigten sich am Tag der Belastungsinfektion die Titer der

Lebendimpfstoffgruppe und die der rHVT-ND/Lebendimpfstoff Kombinationsgruppe

signifikant erhöht zu dem der Kontrollgruppe (p<0,05) (Abb. 14 C).

In den nichtbelastungsinfizierten Gruppen wurde ein signifikanter Unterschied 10

Tage nach der Belastungsinfektion zwischen der mit beiden Impfstoffen geimpften

Gruppe und der nicht geimpften Gruppe (p<0,05) im ELISA und im HAH-Test

detektiert (Abb. 14 A, C).

Die Deklaration sowie die Gesamthöhen der Titer von positiven und negativen Tieren

fiel in den beiden ELISA Kits unterschiedlich aus (Abb. 13 A, B; Abb. 14 A, B).

78

Abb. 13


ELISA (B) und HAH-Test (C) aus Seren von SPF-Hühnern nach ND Impfung, null

und sieben Tage nach Belastungsinfektion (35 und 42 Tage nach ND Impfung).

A

B

C

79

Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen Gruppen, die sich signifikant

unterscheiden (p<0,05; Kruskal-Wallis One-Way AOV), gestrichelte Linie = „Cut-Off“

(BioCheck® ≥ 396, IDEXX® ≥ 1159) zwischen positiven und negativen Tieren.

80

Abb. 14


ELISA (B) und HAH-Test (C) aus Seren von Broilern nach ND Impfung, null und

sieben Tage und 10 Tage nach Belastungsinfektion (=Challenge).

A

B

C

81

Bei den am 10. Tag nach Challenge beprobten Tieren handelte es sich um nicht-

belastungsinfizierte Tiere. Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen Gruppen, die

sich signifikant unterscheiden (p<0,05; Kruskal-Wallis One-Way AOV), gestrichelte

Linie = „Cut-Off“ (BioCheck® ≥ 396, IDEXX® ≥ 1159) zwischen positiven und

negativen Tieren.

Abb. 15

Abbildung 15: IDEXX®-ELISA IgG-NDV Antikörper aus Tränenflüssigkeiten von

kommerziellen Broilern am 35. Tag nach ND-Impfung.

Unterschiedliche Buchstaben über den Säulen (a, b) kennzeichnen Gruppen, die sich

signifikant unterscheiden (p<0,05; Kruskal-Wallis One-Way AOV).

Die Antikörpertiter in Tränenflüssigkeiten von geimpften Broilern zeigten erhöhte

Durchschnittswerte im Vergleich zur Kontrollgruppe. Signifikante Erhöhung im

Vergleich zum Antikörpertiter der Kontrollgruppe und der rHVT-ND Gruppe zeigte die

Gruppe, welche mit dem ND-Lebendimpfstoff und dem rHVT-ND Impfstoff in

Kombination inokuliert wurde (p<0,05) (Abb. 15).

82

5.8 Durchflusszytometrische Untersuchungen

Abb. 16: Detektion von verschiedenen Milz- (linke Spalte) und peripheren

Blutleukozyten (rechte Spalte) von Broilern mittels Durchflusszytometrie.

C

E F

A B

D

G H

83

Abb. 16: Fortsetzung: Detektion von verschiedenen Milz- (linke Spalte) und

peripheren Blutleukozyten (rechte Spalte) von Broilern mittels Durchflusszytometrie.

I J

K L

M N

O P

84

Abb. 16: Fortsetzung: Detektion von verschiedenen Milz- (linke Spalte) und

peripheren Blutleukozyten (rechte Spalte) mittels Durchflusszytometrie von Broilern.

Abbildung 16 (A-R): Detektion von verschiedenen Milz- (linke Spalte) und peripheren

Blutleukozyten (rechte Spalte) von Broilern mittels Durchflusszytometrie zu

verschiedenen Zeitpunkten nach der ND-Impfung.

Unterschiedlich kleine Buchstaben (a, b) kennzeichnen Gruppen, die sich signifikant

unterscheiden (p<0,05; Kruskal-Wallis One-Way AOV), (5, 10 pv = 5, 10 Tage nach

Impfung = post vaccination).

Generell zeigten sich bei Milz- und Blutleukozyten zum späteren Zeitpunkt (35 Tage

pv) erhöhte relative Zellzahlen in geimpften und nicht geimpften Gruppen im

Vergleich zu den früheren Zeitpunkten (5,10 Tage pv) außer bei CD4+, IgA+ und

KUL01+ Milzzellen, und bei KUL01+ peripheren Blutleukozyten (Abb. 16 C, O, Q, R).

In Milzzellpopulationen konnte am fünften Tag pv Erhöhungen bei CD4+, CD4/αβ+,

CD4/γδ+, CD8+ und KUL01+ Zellen in ND-geimpften Gruppen im Vergleich zur

ungeimpften Gruppe detektiert werden (Abb. 16 C, E, G, I, Q).

Am 35. Tag pv zeigten sich prozentuale Erhöhungen der relativen Milzzellzahlen von

Bu-1+, CD4+, CD4/γδ+ und CD8/γδ+ in ND-geimpften Gruppen im Vergleich zur

Kontrollgruppe (Abb. 16 A, C, G, M).

Bei peripheren Blutleukozytenpopulationen wurde eine Zellzahlerhöhung bei Bu-1+,

CD4+, CD4/γδ+, CD8+, CD8/γδ+ und KUL01+ Zellen in mit ND-Lebendimpfstoff

Q R

85

geimpften Gruppen im Vergleich zur ungeimpften Gruppe am zehnten Tag pv

detektiert (Abb. 16 B, D, H, J, L, R).

Am 35. Tag pv wurden bei peripheren Blutleukozyten höhere Bu-1+, CD4/γδ+, IgA+

und KUL01+ Zellzahlen in der rHVT-ND Gruppe detektiert (Abb 16 B, H, P, R).

Bei peripheren Blutleukozyten zeigte sich am zehnten Tag nach Impfung zusätzlich

eine signifikante Erhöhung der CD4+ Zellen in der mit beiden Impfstoffen geimpften

Gruppe im Vergleich zur rHVT-ND geimpften Gruppe (p<0,05) (Abb. 16 D).

86

6 Diskussion

6.1 Zielsetzung der Studie

Die ständige Gefahr einer NDV-Infektion erfordert neben umfangreichen Hygiene-

und Abschirmungsmaßnahmen eine möglichst frühe protektive Immunität. ND-

Lebendvakzinen sind dafür bekannt, eine gute Immunantwort zu generieren, doch

können sie je nach verwendetem Virusstamm und Zeitpunkt der Anwendung auch

mit klinischen Symptomen und Leistungsdepression einhergehen. Das Ziel einer

Impfung sollte neben der Stimulation von spezifischen und unspezifischen

Immunantworten die Induzierung einer systemischen und lokalen Immunantwort

sein.

ND-Lebendvakzinen können bei einer frühen Applikation durch maternale Antikörper

neutralisiert werden und somit bei der Ausbildung einer protektiven Immunität

gehemmt werden (WESTBURY et al. 1984; BELL et al. 1991; CZIFRA et al. 1998).

Rekombinante HVT-Impfstoffe bieten die Möglichkeit einer sehr frühen Applikation in-

ovo oder am ersten Lebenstag und weisen eine geringere Interferenz als ND-

Lebendimpfstoffe mit maternalen Antikörpern auf (MORGAN et al. 1992; MORGAN

et al. 1993). Tierversuche, in denen klinische Protektion und Virusausscheidung nach

einer Belastungsinfektion untersucht wurden, zeigten, dass durch eine in-ovo rHVT-

ND Impfung eine verbesserte klinische Protektion und eine signifikante Verringerung

der Virusausscheidung im Vergleich zu den Kontrollgruppen ermöglicht wurde

(PALYA et al. 2012). Fünf Wochen nach Impfung konnten vergleichbare

Antikörpertiter (IgG) in Tränenflüssigkeiten nach Impfung mit rHVT-ND und einem

ND-Lebendimpfstoff gemessen werden (RAUW et al. 2010). Eine Kombination der

rHVT-ND Vakzine mit einer ND-Lebendvakzine erhöht die klinische Protektion

(RAUW et al. 2010). Ob nach einer Applikation von rHVT-ND auch eine lokale

zellvermittelte Immunität an der Haupteintrittsspforte des APMV-1, dem oberen

Respirationstrakt erzeugt wird, wie bei einer Lebendvakzine, ist unklar.

Untersuchungen zur möglichen Vermehrung von lokalen Immunzellzahlpopulationen

87

in Organen des oberen Respirationstraktes sowie der Lunge und Zäkaltonsille als

weitere ND-Zielorgane liegen nicht vor.

In unserer Studie wurde der Vektorimpfstoff rHVT-ND mit der ND-Lebendvakzine

„Clone 30“, basierend auf dem lentogenen APMV-1 Clone 30 Stamm, hinsichtlich der

Induktion unterschiedlicher Immunparameter verglichen und auch kombininert

getestet. Es wurde die Induktion von lokalen und systemischen Immunreaktionen

nach subkutaner rHVT-ND und Augentropfen-Lebendimpfstoff-Applikation sowohl bei

SPF-Hühnern als auch bei kommerziellen Broilern festgestellt. Im Vergleich zu einer

ND-Lebendvakzine fielen die lokalen, humoralen und zell-vermittelten

Immunantworten bei einer rHVT-ND-Impfung niedriger aus. Die Kombination beider

Impfstoffe führte jedoch bei einigen Immunparametern zu einer noch höheren

Immunantwort als die alleinige Applikation der Lebendvakzine. Diese Effekte stellten

sich bei SPF-Hühnern deutlicher dar als bei Broilern.

6.2 Klinisches Bild nach Impfung mit rHVT-ND und ND-

Lebendimpfstoff sowie nach APMV-1 Stamm LaSota

Belastungsinfektion

Bei einer Impfung mit HVT zeigen Hühner normalerweise keine klinischen

Symptome, da HVT für Hühner apathogen ist (SONDERMEIJER et al. 1993). In

unseren Versuchen wurden nach alleiniger subkutaner rHVT-ND-Applikation sowie

auch in Kombination mit dem ND-Lebendimpfstoff keine klinischen Symptome nach

der Impfung beobachtet. Unter Feldbedingungen mit höherem Infektionsdruck und

zusätzlichen Stressfaktoren für die Tiere können sich nach einer sehr frühen ND-

Lebendimpfung jedoch durchaus auch gelegentlich milde respiratorische Symptome

entwickeln und je nach Infektionsdruck komplizieren (NAKAMURA et al. 1994). Es

können hierbei auch pathologische und histopathologische Veränderungen auftreten.

Respiratorische Symptome nach einer ND-Lebendimpfung werden zum Beispiel bei

einer Mycoplasma gallisepticum Co-Infektion beschrieben (SATO et al. 1970).

88

Die Belastungsinfektion mit dem APMV-1 Stamm LaSota fand am 35. Tag nach der

Impfung statt. Wie erwartet, wurden keine klinischen Symptome beobachtet.

6.3 Pathologische und histopathologische Läsionen nach ND-

Impfung

Es konnten bei keinem der untersuchten Tiere pathologisch-anatomische Läsionen,

weder nach Impfung noch nach Belastungsinfektion, detektiert werden. Zehn Tage

nach der ND-Lebendimpfung wurden geringgradige histopathologische

Veränderungen bei SPF-Hühnern beobachtet. Bei okularer, intranasaler oder

Sprayverabreichung von lentogenen ND-Lebendvakzinen werden häufig zu frühen

Zeitpunkten milde respiratorische Symptome beobachtet (ALLAN u. LANCASTER

1978). Auch milde histopathologische Veränderungen im Respirationstrakt, wie sie

hier beobachtet wurden, können nach Impfung auftreten (KOTANI et al. 1987).

Nach rHVT-ND- oder ND-Lebendimpfung von kommerziellen Broilern wurden in

dieser Studie keine histopathologischen Veränderungen beobachtet.

HVT gelangt nach Applikation über die Lunge in den Organismus. Hierbei wird es

von phagozytierenden Zellen aufgenommen, bleibt ab diesem Zeitpunkt strikt

intrazellulär und wird zu lymphoiden Geweben transportiert, wo es zuerst B-

Lymphozyten und dann aktivierte T-Lymphozyten infiziert (HOLLAND et al. 1998;

DAVISON 2004a). Diese Phase dauert etwa sieben Tage an. Danach wird die

Latenzphase eingeleitet, in der das Virus hauptsächlich in CD4+ T-Lymphozyten und

anderen Lymphozytenpopulationen persistiert. Während dieser Phasen führte HVT

zu keinen pathologischen oder zytolytischen Veränderungen in lymphoiden Organen

(FABRICANT et al. 1982). Auch kommt es zu keinen immunsuppressiven Einflüssen

oder zu Beeinträchtigungen der Integrität der mukosalen Oberflächen (FRIEDMAN et

al. 1992).

89

6.4 Einfluss von rHVT-ND und dem ND-Lebendimpfstoff auf

Immunparameter

6.4.1 Systemische Immunparameter

6.4.1.1 Humorale Immunparameter

rHVT-ND und die ND-Lebendvakzine induzierten sowohl bei den SPF-Hühnern als

auch bei Broilern messbare APMV-1 Serum-Antikörpertiter, welche sich fünf Wochen

nach der Impfung im HAH-Test und ELISA nachweisen ließen. Der durch rHVT-ND

induzierte Antikörpertiter ist niedriger als der der Lebendvakzine. Nach einer

Belastungsinfektion erhöhten sich die Serum-Antikörpertiter in allen Gruppen (Abb.

13+14).

Der von rHVT-ND induzierte Antikörpertiter war vermutlich niedriger als der der

Lebendvakzine, da rHVT-ND nur das F-Protein exprimierte. Neben weiteren

Faktoren, wie der unterschiedlichen Verteilung und Replikationsrate der beiden

Impfstoffe, könnte die Tatsache, dass bei einer ND-Lebendimpfung Antikörper gegen

weitere APMV-1 spezifische virale Polypeptide gebildet werden, eine Ursache für die

unterschiedlichen Höhen der Antikörpertiter sein (REYNOLDS u. MARAQA 2000a).

Die Anti-F-Antikörper gegen rHVT-ND stellten sich in unserer Studie auch durch den

HAH-Test detektierbar dar. Auch Palya et al. zeigten in ihrer Studie von 2012, dass

die durch rHVT-ND induzierten, gegen das APMV-1 F-Protein gerichteten Antikörper

HAH-Eigenschaften besitzen. Palya et al. (2012) spekulierten, dass hierfür eine

sterische Hinderung der Virusanhaftung an die Erythrozyten durch die gegen das F-

Protein gerichteten Antikörper verantwortlich sein könnte (PALYA et al. 2012).

Im Gegensatz dazu wurden in einer Studie von Morgan et al. von 1992 praktisch

keine Antikörper im HAH-Test und ELISA nach einer rHVT-ND Impfung bei Hühnern

detektiert (MORGAN et al. 1992). Jedoch ist der detektierbare Antikörpertiter auch

abhängig vom eingesetzten ELISA Kit, bzw. der Antigenkonzentration im HAH-Test.

In unserer Studie zeigte ein sensitiveres ELISA Test-Kit durchaus messbare

Antikörpertiter, wohingegen sich in einem anderen ELISA Test-Kit die Antikörpertiter

generell niedriger darstellten (Abb. 13+14). Morgan et al. setzten eine

90

Antigenkonzentration von zehn hämagglutinierenden Einheiten (HAU) ein (MORGAN

et al. 1992), während in unserer Studie vier HAUs genutzt wurden. In einem

Übersichtsartikel von 2013 bewerteten Kapczynski et al. die durch rHVT-ND

induzierten HAH- und ELISA-Antikörpertiter als nicht geeignetes Mittel, um für diese

Vakzine eine Aussage über die Immunität zu treffen, da diese häufig zu niedrig

ausfallen (KAPCZYNSKI et al. 2013). Dies ist jedoch abhängig von der

angewendeten serologischen Untersuchungsmethode.

Die Titer der SPF-Hühner, welche mit beiden Impfstoffen vakziniert wurden, waren

höher als die Titer der Tiere, welche nur eine Vakzine erhalten hatten (Abb. 13 A, B,

C). Bei SPF-Hühnern waren alle ND-Antikörper-Titer der Kombinationsgruppen zu

beiden Probezeitpunkten signifikant erhöht im Vergleich zu der Kontrollgruppe, außer

im IDEXX® ELISA Test Kit (Abb.13). Bei Broilern zeigten sich diese signifikanten

Unterschiede der mit beiden Impfstoffen geimpften Gruppe nur in einem ELISA-Test

Kit (Abb. 14 B).

Im zweiten Versuch wurden zusätzlich die ND-Antikörpertiter aus Tränenflüssigkeiten

im ELISA Test-Kit bestimmt. Fünf Wochen nach Impfung konnte ein erhöhter Gehalt

an ELISA-IgG-Antikörpern in Tränenflüssigkeiten in allen geimpften Gruppen gezeigt

werden. Am höchsten waren diese Titer in der Kombinationsgruppe. Unsere

Ergebnisse bestätigen die auch von Rauw et al. gezeigten Ergebnisse. Hier zeigten

ebenfalls die mit rHVT-ND in Kombination mit einem Lebendimpfstoff geimpften

Gruppen die höchsten ND-Antikörpertiter in Tränenflüssigkeiten im Vergleich zu

einzeln geimpften Gruppen (RAUW et al. 2010).

Sieben Tage nach der Belastungsinfektion mit dem APMV-1 Stamm LaSota zeigten

sich sowohl im ELISA- als auch im HAH-Titer deutliche Boostereffekte (MAJIYAGBE

u. HITCHNER 1977). Dieser Boostereffekt entsteht, wenn sich nach einem primären

Antigenkontakt Gedächtnis B-Zellen im ganzen Körper verteilt haben und diese

Zellen auf einen wiederholten Antigenkontakt mit einer erneuten und schnelleren

Immunantwort als bei primärem Antigenkontakt reagieren (JEURISSEN et al. 2000).

Dadurch werden schnellere humorale und lokale Immunantworten ermöglicht. Dieser

Effekt zeigte sich im ELISA sowie im HAH-Test in beiden Versuchen.

91

Bei SPF-Tieren wurden fünf Wochen nach der Impfung deutlich höhere Titer in den

Lebendimpfstoffgruppen detektiert als bei kommerziellen Broilern, welche maternale

Antikörper besaßen. Die Hemmung des ND-Lebendimpfstoffes durch maternale

Antikörper ist hier vermutlich ausgeprägter als die des rHVT-ND. Diese durch

maternale Antikörper induzierte Hemmung einer Lebendvakzine wurde auch in

anderen Studien gezeigt (MORGAN et al. 1993). Bei rHVT-ND beeinträchtigt die

Hemmung durch maternale Antikörper, welche gegen den Vektor oder das

Fremdantigen gerichtet sein können, die Replikationsrate des Virus und somit die

Ausbildung einer Protektivität nur unwesentlich (MORGAN et al. 1993).

Die Kombination von rHVT-ND mit dem Lebendimpfstoff induzierte in unserer Studie

die höchsten Antikörpertiter. Dies konnte auch bei einer Kombination von einem ND-

Lebendimpfstoff mit einem inaktivierten Impfstoff beobachtet werden (FOLITSE et al.

1998).

Es kann spekuliert werden, dass durch den Lebendimpfstoff ein „Priming“ des

Immunsystems stattfindet, bei dem eine spezifische Immunität gebildet wird. Bei

einer parallelen rHVT-ND Applikation befindet sich rHVT-ND etwa ab dem siebten

Tag nach Impfung in der Latenzphase, wodurch eine kontinuierliche

beziehungsweise wiederholende Stimulation des Immunsystems aufrechterhalten

bleibt.

Am 45. Tag nach der Impfung registrierten wir in nicht belastungsinfizierten Tieren

einen Rückgang der Antikörperproduktion, welcher bei der lebendgeimpften Gruppe

deutlicher ausfiel als bei der Kombinationsgruppe (Abb. 14 A,C).

6.4.1.2 Zell-vermittelte Immunität

Eine durchflusszytometrische Untersuchung erlaubt eine Messung der relativen

Zahlen von Immunzellpopulationen und ermöglicht somit einen Hinweis auf eine

Impfstoff-induzierte Stimulation des Immunsystems. In Experiment 2 dieser Studie

wurden periphere Blut-Leukozyten zehn und 35 Tage nach Impfung und Milzzellen

fünf und 35 Tage nach der Impfung auf CD4+, CD8+, BU-1+, KUL01 und IgA+ Zellen

sowie auf die αβ- und γδ- T-Zellsubpopulationen untersucht.

92

Zwischen den beiden Zeitpunkten war ein Unterschied in den relativen Zellzahlen der

ungeimpften und geimpften Gruppen zu erkennen. Diese zeigten sich am 35. Tag

nach der Impfung bis auf einige Ausnahmen prozentual erhöht. Bei peripheren

Blutleukozyten waren diese Unterschiede deutlicher als bei den Milzzellen. Diese

Zellzahlerhöhungen an einem späteren Zeitpunkt nach der ND-Impfung könnten auf

einen altersbedingten Unterschied in den relativen Zellzahlen hindeuten, da sich die

gleichen Unterschiede auch in den nicht geimpften Gruppen außer bei BU-1+

Milzzellen zeigen. Hier befanden sich die Zellzahlen der ungeimpften Tiere an beiden

Zeitpunkten auf einer Höhe.

In Milzen zeigte sich am fünften Tag nach der Impfung eine Erhöhung des relativen

Anteils von CD4+ Zellen in geimpften Gruppen. Diese Erhöhung fiel noch deutlicher

in der dual-vakzinierten Gruppe aus, was in Zusammenhang mit der Kombination

von rHVT-ND mit dem Lebendimpfstoff stehen kann und auf einen additiven Effekt

der beiden Impfstoffe hindeutet (Abb. 16 C). In diesem Experiment wurde rHVT-ND

am 10. Tag nach Applikation in Milzen von SPF-Hühnern nachgewiesen. In anderen

Studien konnte HVT vier bis 14 Tage nach Einbringung in den Organismus in der

Milz nachgewiesen werden (FABRICANT et al. 1982). Eine Replikation von rHVT-ND

in der Milz könnte hier in Zusammenhang mit dem erhöhten CD4+ Zellanteil stehen.

Eine Erhöhung fand sich auch am fünften Tag bei CD4+/αβ+, CD4+/γδ und

CD8+/αβ+ Milzzellen in rHVT-ND geimpften Gruppen.

35 Tage nach der Impfung zeigten sich deutlichere Erhöhungen in der rHVT-ND

Gruppe im Vergleich zu der Kontrollgruppe bei Bu-1+, CD4+, CD4+/γδ+, CD8+,

CD8+/αβ+ und CD8+/γδ+ Milzzellen. Die Erhöhung dieser Zellzahlparameter könnte

ebenfalls mit einer rHVT-ND Replikation in Verbindung stehen.

Der prozentuale Anteil von KUL01+ Zellen zeigte sich hier in zirkulierenden

Blutleukozyten 10 Tage nach rHVT-ND Impfung, aber auch nach ND-

Lebendimpfung, erhöht. Der Transport von HVT von der Lunge in die lymphoiden

Organe erfolgte durch Makrophagen, was eine Erhöhung dieser Zellzahlen

verursachen könnte (DAVISON 2004b).

93

Eine antivirale Immunität gegen Herpesviren wird prinzipiell durch CD8αβ+

zytotoxische T-Lymphozyten und CD4+ Helferzellen eingeleitet (DAVISON 2004a).

CD4+ und CD4/γδ+ Zellzahlen zeigten Erhöhungen in Milzen in rHVT-ND geimpften

Gruppen an beiden Zeitpunkten. Eine deutliche Erhöhung von CD8αβ+ in Milz und

PBL konnte jedoch nicht in rHVT-ND geimpften Gruppen beobachtet werden.

CD4+ periphere Blut-Leukozyten zeigten am zehnten Tag nach der Impfung eine

Erhöhung in den mit Lebendimpfstoff geimpften Gruppen im Vergleich zur

ungeimpften und rHVT-ND Gruppe. Dies bestätigt die Studie von Dalgaard et al. von

2010, wo durch eine ND-Lebendimpfung oder -Infektion eine antigenspezifische

Proliferation von zirkulierenden CD4+ und CD8+ T-Zellen hervorgerufen wurde

(DALGAARD et al. 2010). Diese am zehnten Tag pv erfolgte Erhöhung in den mit

Lebendimpfstoff geimpften Gruppen zeigte sich nicht am 35. Tag pv.

6.4.2 Lokale Immunität

6.4.2.1 Effekt auf lokale Immunzellpopulationen

Die erste zelluläre Immunantwort gegen virale Erreger erfolgt durch natürliche

Killerzellen (NK-Zellen), Granulozyten und Makrophagen. Sobald APMV-1 die

Barrieren der angeborenen Immunität überwunden hat, wird eine weitere, pathogen-

spezifische Immunantwort durch T- und B-Zellen eingeleitet, welche sich in lokaler

Erhöhung dieser Zellzahlen äußert. In Abbildung 17 und 18 sind die signifikanten

Anstiege von Immunzellpopulationen in den einzelnen Organen nach ND-Impfung

von SPF-Hühnern und Broilern des Ergebnisteils zusammengefasst.

Interstitielle CD8+ und CD4+ Zellpopulationen wurden rund um die

Ausführungsgänge der Harderschen Drüse bereits am ersten Tag nach dem Schlupf

gefunden und stiegen bei ungeimpften Tieren dann bis zur achten Lebenswoche an

(DUMRONGSOONTORNCHAI 1999). Nach ND-Lebendimpfung zeigten sich in

dieser Studie jedoch schon früher erhöhte T- und B-Zellpopulationen in Harderschen

Drüsen.

94

Bei SPF-Hühnern zeigte sich zehn Tage nach der ND-Lebendimpfung ein Anstieg

von CD4+, CD8+, BU-1+, KUL01+ und IgA+ Zellen in der Harderschen Drüse im

Vergleich zur Kontrollgruppe. Dieses Ergebnis steht in Zusammenhang mit dem

Lebendimpfstoff, welcher die Erhöhung dieser Zellzahlen induziert (RUSSELL et al.

1997). CD8+ Zellen tragen zur viralen Clearance bei, da sie lokal APMV-1-befallene

Zellen töten (AL-GARIB 2003).

Bei Broilern zeigten sich am fünften Tag nach Lebendimpfung CD4+, CD8+, Bu-1+,

KUL01+ und IgA+ Zellen in Harderschen Drüsen ebenfalls erhöht. Bei CD4+, CD8+,

Bu-1+ und KUL01+ Zellen fielen diese Erhöhungen signifikant im Vergleich zur nicht

geimpften Gruppe aus (Abb 18).

Bei SPF-Tieren zeigten sich in der Harderschen Drüse am zehnten Tag nach rHVT-

ND Impfung ebenfalls Anstiege in der zweiten Gruppe von CD4+, CD8+, Bu-1+ und

KUL01+ Zellen in der Harderschen Drüse im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb. 7 A,

C, E, G). Falls rHVT-ND die Hardersche Drüse erreicht, könnte dies mit einer

Herpesvirus-spezifischen Zellabwehr in Verbindung stehen (DAVISON 2004a).

Bei SPF-Hühnern wurde ein signifikanter Anstieg von BU-1+ Zellen in Harderschen

Drüsen im Vergleich zur ungeimpften Gruppe am zehnten Tag pv in der mit dem ND-

Lebendimpfstoff allein geimpften Gruppe festgestellt. Bei Broilern zeigte sich ein

signifikanter Anstieg von B-Zellen fünf Tage nach der ND-Impfung bei beiden mit ND-

Lebendimpfstoff geimpften Gruppen, am zehnten Tag stiegen nur Bu-1+ Zellen der

dual-vakzinierten Gruppe an, jedoch nicht signifikant. Der BU-1 Marker wird auf jeder

B-Zelle, außer auf Plasmazellen, detektiert (HOUSSAINT et al. 1987). Nach einer

konjunktivalen Impfung mit einer ND Lebendvakzine stiegen BU-1 Zellpopulationen

in der Harderschen Drüse um das Zweifache an (RUSSELL et al. 1997). Dies konnte

in unserer Studie nach ND-Lebendimpfung bei SPF-Tieren bestätigt werden.

In der rHVT-ND einzeln geimpften Gruppe zeigten sich erkennbare, aber nicht

signifikante Anstiege von Bu-1+ Zellen bei Broilern fünf Tage nach der Impfung und

bei SPF-Hühnern zehn Tage nach der Impfung in der Harderschen Drüse.

Die Hardersche Drüse bei Hühnern besitzt interstitielle Plasmazellpopulationen,

welche bis zur vierten Lebenswoche prozentual ansteigen und von dem Zeitpunkt an

95

ein Plateau erreichen (DUMRONGSOONTORNCHAI 1999). IgA+ Zellen können

bereits einen Tag nach dem Schlupf in den Harderschen Drüsen von nicht-geimpften

Broilern detektiert werden (DUMRONGSOONTORNCHAI 1999). Durch ND-

Lebendimpfung erfolgte eine Erhöhung dieser Zellen in dieser Studie.

Bei der Untersuchung von Zellzahlen in der Lunge war eine serienmäßige

Anfertigung und Auswertung von Anschnitten des Bronchus-assoziierten lymphoiden

Gewebes (BALT) aufgrund der Kleinheit der BALT-Areale nicht möglich. Es wurden

stattdessen Lungenparenchymbereiche um Parabronchien in unmittelbarer Nähe der

BALT-Areale ventral der Ausmündungen der Sekundärbronchien untersucht und

bewertet. Diese Bereiche eigneten sich gut zur Auszählung von Immunzellen und

erlauben durch ihre Nähe zu den Sekundärbronchien eine Bewertung von lokalen

Immunreaktionen.

In dieser Studie wurden Anstiege von T-Zellpopulationen im Lungenparenchym bei

SPF-Hühnern und Broilern registriert, was mit einer Virusreplikation in Verbindung

stehen könnte. Hierbei wurde eine signifikante Erhöhung von CD4+ Zellen im

Vergleich zur Kontrollgruppe in dual vakzinierten SPF-Tieren festgestellt (Abb. 17).

Bei Broilern zeigten sich signifikante Anstiege der CD4+ Zellzahlen am fünften Tag

nach Impfung in der rHVT-ND geimpften Gruppe (Abb. 18).

HVT sowie rekombinante Varianten von HVT replizieren lokal in der Lunge (GIMENO

et al. 2011). In dieser Studie wurden Anstiege von CD4+ und CD8+ Zellpopulationen

in Lungen von SPF-Hühnern und Broilern detektiert, was mit der lokalen

Virusreplikation in Verbindung stehen könnte. rHVT persistiert und zirkuliert für

mindestens 30 Wochen in lokalen Lymphozyten und peripheren Blutleukozyten

(TSUKAMOTO et al. 2002). Diese dringen in lymphoide Gewebe des Respirations-

und Gastrointestinal-Traktes ein, wo lokal Fremdantigene präsentiert werden

(TSUKAMOTO et al. 2002). Es ist bekannt, dass Marek’s Disease Herpesviren in der

zytolytischen Phase der Erkrankung von Makrophagen aus den Lungen in den

Blutkreislauf transportiert werden und von dort aus strikt zell-assoziiert über

lymphoide Zellen in die lymphoiden Gewebe gelangen. Virales MDV-Genom kann in

der Milz, dem GALT, der Zäkaltonsille, der Harderschen Drüse und dem CALT vom

zweiten bis zum siebten Infektionstag nachgewiesen werden (BARROW et al. 2003;

96

DAVISON 2004b). Inwieweit rHVT-ND bei einer subkutanen oder in-ovo Applikation

diese Gewebe erreicht, ist nicht bekannt.

In der Zäkaltonsille konnte ein Anstieg von CD8+ Zellen in der rHVT-ND einzeln

geimpften Gruppe bei SPF-Tieren festgestellt werden (Abb. 12 C). KUL01+ Zellen

zeigten sich in den beiden mit ND-Lebendimpfstoff geimpften Gruppen zu diesem

Zeitpunkt ebenfalls erhöht (Abb 12 G). Bei Broilern konnte in Zäkaltonsillen in allen

geimpften Gruppen am fünften Tag pv leicht erhöhte CD4+ Zellzahlen detektiert

werden (Abb. 3 D) und zehn Tage nach Impfung leicht erhöhte B-Zellzahlen (Abb. 12

F). CD8+ Zellen zeigen sich bei SPF-Tieren 10 Tage pv in der rHVT-ND Gruppe

erhöht (Abb. 12 C). Wenn rHVT-ND die Zäkaltonsille erreicht, könnte auch hier eine

Herpesvirus spezifische CD8-T-Zellabwehr eine Erklärung für die erhöhten CD8+

Zellen sein (DAVISON 2004a), jedoch findet sich hier keine Erhöhung von CD8+

Zellen in der rHVT-ND mit Lebendimpstoff kombinierten Gruppe (Abb. 12 C).

Die Erhöhung von KUL01+ Zellen bei SPF-Tieren am zehnten Tag nach ND-

Lebendimpfung in Zäkaltonsillen könnte mit einer APMV-1 Replikation in Verbindung

stehen, jedoch repliziert der hier beteiligte APMV-1 Stamm LaSota-Klon „Clone 30“

normalerweise nur im Respirationstrakt (WAKAMATSU et al. 2006).

Bei der Auswertung des Konjunktiva-assoziierten lymphatischen Gewebes(CALT)

konnten im ersten Versuch bei SPF-Hühnern aufgrund der aufrechten Einbettung der

Augenlider auf dem Papier zu wenige BALT-Areale serienmäßig angeschnitten

werden, um eine statistische Beurteilung durchzuführen. Im zweiten Versuch wurde

das Augenlid flach mit der Rückseite auf das Filterpapier gelegt. Somit waren

serienmäßige Anschnitte möglich. Bei Broilern zeigten sich Anstiege von CD4+ und

CD8+ Zellzahlen in ND-lebendgeimpften Gruppen, welche vermutlich durch eine

lokale APMV-1 Virusreplikation des Impfvirus Clone 30 hervorgerufen wurden

(RUSSELL et al. 1997).

Zusammengefasst zeigte sich in Harderschen Drüsen nach einer rHVT-ND Impfung

eine Erhöhung von CD4+, CD8+, Bu-1+ und KUL01+ Zellen und eine Erhöhung

dieser Zellen in der Lunge am zehnten Tag nach Impfung von SPF-Hühnern. In der

97

Lunge von Broilern wurde ein signifikanter Anstieg von CD4+ T-Zellen am fünften

Tag nach rHVT-ND Impfung festgestellt (Abb. 18). Der ND-Lebendimpfstoff erzeugt

in Harderschen Drüsen von SPF-Hühnern eine signifikante Erhöhung von CD4+, Bu-

1+ und KUL01+ Zellen im Vergleich zur ungeimpften Gruppe (Abb. 17).

In der Harderschen Drüse von Broilern sind die signifikanten Unterschiede zur

ungeimpften Gruppe am fünften Tag nach ND-Lebendimpfung bei CD4+, CD8+, Bu-

1+ und KUL01+ Zellen detektiert worden (Abb. 18). In der Lunge zeigten sich bei

Broilern fünf Tage nach ND-Lebendimpfung erhöhte CD4+ und CD8+ Zellzahlen.

Diese Zellinfiltrate interferieren lokal mit der Virusreplikation und bieten somit Schutz

vor einer NDV-Infektion (AL-GARIB 2003). rHVT-ND erhöht lokale

Immunzellpopulationen in Harderscher Drüse und Lunge. Diese sind niedriger als

nach einer Impfung mit der Lebendvakzine.

98

SPF

Zelltypen

R L R+L R L R+L R L R+L

CD4+

CD8+

Bu-1+

KUL01+

IgA+

Hardersche Drüse Lunge Zäkaltonsille

Abbildung 17: Übersicht über signifikant erhöhte Immunzellparameter von SPF-

Hühnern am zehnten Tag nach ND-Impfung (p<0,05; Kruskal–Wallis One-way AOV

mit anschließendem paarweisem Vergleich)

Weißer Pfeil: signifikant erhöhte Immunzellzahlen im Vergleich zur ungeimpften

Gruppe am zehnten Tag nach Impfung;

R = rHVT-ND-geimpfte Gruppen; L = ND-Lebendimpfstoff-geimpfte Gruppen; R+L =

mit rHVT-ND und Lebendimpfstoff-geimpfte Gruppen

Broiler

Zelltypen

R L R+L R L R+L R L R+L R L R+L

CD4+

CD8+

Bu-1+

KUL01+

IgA+

CALTLunge ZäkaltonsilleHardersche Drüse

Abbildung 18: Übersicht über signifikant erhöhte Immunzellparameter von Broilern

am fünften Tag nach ND-Impfung (p<0,05; Kruskal–Wallis One-way AOV mit

anschließendem paarweisem Vergleich)

99

Schwarzer Pfeil: signifikant erhöhte Immunzellzahlen im Vergleich zur ungeimpften

Gruppe am fünften Tag nach Impfung;

R= rHVT-ND-geimpfte Gruppen; L = Lebendimpfstoff-geimpfte Gruppen; R+L = mit

rHVT-ND und Lebendimpfstoff-geimpfte Gruppen; CALT= Konjunktiva-assoziiertes

lymphatisches Gewebe

6.4.2.2 Antikörper in Tränenflüssigkeiten

Lokale Anti-APMV-1 IgG Antikörper wurden im zweiten Versuch nach Impfung von

kommerziellen Broilern aus Tränenflüssigkeiten am 36. Versuchstag bestimmt. Eine

Studie von Rauw et al. von 2010 (RAUW et al. 2010) zeigte eine lokale, gegen

APMV-1 gerichtete IgG-Antikörper-Antwort in Tränenflüssigkeiten von Hühnern fünf

Wochen nach Impfung mit rHVT-ND. Dort zeigten Gruppen, welche mit einer

Lebendvakzine geimpft worden waren, erhöhte lokale IgG-Titer in

Tränenflüssigkeiten. Dies wurde auch durch unsere Studie bestätigt. Die Höhen der

lokalen IgG-Titer korrelierten hierbei mit den Antikörper-Serumwerten. Die mit beiden

Impfstoffen vakzinierten Gruppen zeigten eine signifikante Erhöhung der Titer und

den höchsten Titer aller Gruppen in Tränenflüssigkeiten im Vergleich zur

Kontrollgruppe, ähnlich wie bei den Serumtitern.

Eine mögliche Ursache für das Vorkommen dieser IgG-Antikörper in und auf den

Schleimhäuten kann eine partielle Transsudation aus dem Blut in lokale lymphoide

Gewebe sein (AL-GARIB et al. 2003). Jedoch werden IgG-Antikörper auch lokal in

der Submukosa produziert (KAETZEL et al. 1994). Ein ähnliches Phänomen kann

nach Impfung mit inaktivierten ND-Vakzinen beobachtet werden, welche bei

parenteraler Applikation hauptsächlich eine humorale Immunantwort generieren.

Diese Vakzinen erzeugen einen sehr hohen und langanhaltenden humoralen Titer

durch lange Antigenpräsentation. Auch hier können lokale Anstiege in

Tränenflüssigkeiten und trachealen Waschungen von spezifischen Anti-APMV-1

Antikörpern beobachtet werden, wie eine Studie von Zoth et al. von 2008 zeigte

(CHIMENO ZOTH et al. 2008). Al-Garib et al. zeigten 2003 in ihrer Studie, dass

sowohl spezifische IgM als auch IgG, aber nicht IgA nach Impfung mit einer

100

inaktivierten Vakzine in Trachealflüssigkeiten anstiegen (AL-GARIB et al. 2003). Die

in unserer Studie detektierten IgG-Antikörper aus den Tränenflüssigkeiten sind daher

Bestandteil der lokalen Immunität, aber wahrscheinlich hauptsächlich systemischen

Ursprungs. Diese Antikörper tragen durch Neutralisierung der Viren und

Verhinderung der initialen Replikation lokal an den Eingangspforten des APMV-1 zur

protektiven Immunität gegen die ND bei.

6.5 Virusausscheidung

Eine Infektion, Ausscheidung und Übertragung von APMV-1 kann ohne klinische

Erkrankung stattfinden. Impfprogramme reduzieren die klinische Erkrankung und

Mortalität während eines Newcastle Disease Ausbruches, die Virusausscheidung

und Übertragung wird aber nicht in jedem Fall reduziert, sodass sich die Erkrankung

endemisch ausbreiten kann (DORTMANS et al. 2012). APMV-1 wird über

oropharyngeale Sekrete und auch über Faeces ausgeschieden. Immunisierte Hühner

scheiden APMV-1 normalerweise für sechs bis acht Tage nach einer

Belastungsinfektion aus (KAPCZYNSKI u. KING 2005).

rHVT-ND bietet vollen klinischen Schutz nach in-ovo und subkutan- Applikation

gegen eine Newcastle Disease Virus Belastungsinfektion (Stamm TEXAS G.B./48)

(REDDY et al. 1996). Bei Untersuchungen zur lokalen respiratorischen Immunität in

diesem Versuch wurde eine Virusausscheidung jedoch nicht verhindert. Das

Belastungsvirus konnte fünf Tage nach einer in der vierten Lebenswoche

stattgefundenen Belastungsinfektion aus Tracheen fast aller Tiere isoliert werden,

was bei einer in diesem Experiment verwandten Lebendvakzine nicht der Fall war

(REDDY et al. 1996). Die Erhöhung der rHVT-ND Impfdosis hatte in dem Versuch

von Reddy et al. keinen Einfluss auf die lokale Virusausscheidung. Ebenfalls wurde

in jener Studie spekuliert, dass die unterschiedlichen Ausbreitungswege der beiden

Vakzinen einen unterschiedlichen Einfluss auf die Immunität haben. Herkömmliche

respirotrope Lebendvakzinen replizieren vermehrt lokal, infizieren den

Respirationstrakt und erzeugen dort eine lokale Immunität, wohingegen rHVT-ND

zell-assoziiert repliziert und sich systemisch verbreitet.

101

Klinische Ausbrüche der ND können jedoch auch nach ND-Impfung stattfinden (KE

et al. 2010). Eine antigenetische und/oder phylogenetische Variation zwischen Impf-

und Feldvirus kann als mögliche Ursache für eine ungenügende Immunisierung und

dadurch resultierende Feld-Virusausscheidung in Frage kommen. Die heutzutage

gängigsten Lebendimpsftoffe basieren auf APMV-1 Virusstämmen, welche

phylogenetisch zu den Genotypen I und II gehören. APMV-1 Virusstämme, welche in

den letzen zwei Jahrzehnten verantwortlich für Ausbrüche der ND waren, gehörten

zu Genotyp IV, V und VII (YU et al. 2001; ABOLNIK et al. 2004; PEDERSEN et al.

2004; LIEN et al. 2007; LIU et al. 2007; IRVINE et al. 2009; KE et al. 2010).

Eine genetische Übereinstimmung von Impf- und Feldviren, kann, muss aber nicht

mit einer besseren Protektion in Verbindung stehen (KAPCZYNSKI u. KING 2005;

MILLER et al. 2007; HU et al. 2009; MILLER et al. 2009a). Genotypisch

unterschiedliche Impfstoffe besitzen in einer von Dortmans et al. gezeigten Studie die

gleichen protektiven Eigenschaften wie eine Lebendvakzine des gleichen Genotyps

(DORTMANS et al. 2012). Für einen Impferfolg sind gute Impfpraxis, Hygiene- und

Stallmanagement ebenso ausschlaggebend wie die Wahl des richtigen

Impfprogrammes. Ein möglichst hoher homogener Antikörpertiter innerhalb der

Herde sowie eine möglichst geringe Virusausscheidung sind Hauptziele einer ND-

Immunisierung. Eine Lebenvakzine kann neben Anpassung an phylogenetische und

antigenetische Gegebenheiten auch mit inaktivierten Impfstoffen gegen die ND

kombiniert werden, um eine stärkere humorale Immunantwort herbeizuführen

(GIAMBRONE u. CLAY 1986; FOLITSE et al. 1998). Eine Kombination von rHVT-ND

mit einem Lebendimpfstoff ist eine Alternative zu gängigen Lebendimpfstoff-Inaktivat

Kombinationen.

In unserem Versuch war bei SPF-Hühnern die Virusausscheidung in der rHVT-ND

Gruppe und in der Kontrollgruppe am dritten, fünften und siebten Tag vergleichbar

hoch. In der rHVT-ND-Gruppe fand somit keine signifikante Reduzierung der

Virusausscheidung statt, wie in ND-Lebendgeimpften Gruppen. Die Virusübertragung

auf die Kontaktsentinels war in der rHVT-ND Gruppe jedoch im Vergleich zur

Kontrollgruppe signifikant verringert. rHVT-ND induzierte also eine Teilimmunität, die

zu einer Reduktion der Virusübertragung nach Belastungsinfektion führte. Die

102

Lebendimpfstoffgruppe und die Kombinationsgruppe zeigten protektive

respiratorische Immunität, kein Tier schied Virus nach Belastungsinfektion aus.

Bei kommerziellen Broilern wurde die bei SPF-Tieren beschriebene Teilimmunität

nicht beobachtet, in der rHVT-ND Gruppe fand eine volle Virusausscheidung und

Übertragung statt. Die Lebendvakzine zeigte eine signifikante Reduzierung der

trachealen Virusausscheidung im Vergleich zu ungeimpften Tieren. Bei SPF-Tieren

stellte sich eine signifikante Reduzierung der Übertragung von Belastungsvirus auf

naive Empfängertiere in der rHVT-ND Gruppe dar, was bei Broilern nicht

beobachetet wurde. Weiterführende Untersuchungen mit unterschiedlichen

Belastungsvirusstämmen von unterschiedlicher Virulenz könnten hilfreich sein, um

die Protektivität von rHVT-ND zu prüfen.

6.6 Vergleich von SPF-Hühnern und Broilern

Aufgrund genetischer Selektion unterscheiden sich Broiler und Hühner vom Legetyp

in ihren immunologischen Eigenschaften (KOENEN et al. 2002). Humorale und

zelluläre Immunantworten fallen bei Legehennen generell höher aus als bei Broilern,

welche wahrscheinlich aufgrund der gezielten Selektion auf Körpergewicht und

Futterverwertung immunologische Nachteile besitzen (KOENEN et al. 2002). So

reagierten Legehennen beispielsweise nach intravenöser Applikation von 2,4,6-

Trinitrophenyl mit einer höheren IgG-Antwort als Broiler (KOENEN et al. 2002).

Diese linienbedingten Unterschiede konnten auch in dieser Studie beobachtet

werden. Humoral systemische Immunantworten fielen in dieser Studie bei SPF-

Hühnern vom Legetyp höher aus als bei kommerziellen Broilern. Die lokal zellulären

Immunantworten fielen in diesem Versuch auch bei SPF-Hühnern höher aus, außer

bei Harderschen Drüsen, bei denen die gezählten Zellzahlen der Broiler am elften

Versuchstag höher waren als bei SPF-Hühnern (Abb.7).

Die APMV-1-Antikörperfreiheit bei SPF-Hühnern spielt ebenfalls in der Ausbildung

der Immunität eine große Rolle. Die ND-Lebenvakzine wird hierbei nicht von

maternalen Antikörpern gehemmt, was zu einer ausgeprägteren Immunantwort führt,

103

als bei Broilern. Auch zeigte eine Studie mit dem Hitchner B1-Stamm bei SPF-

Hühnern einen besseren Schutz vor einer Belastungsinfektion als bei Broilern

(MORGAN et al. 1993). Bei kommerziellen Broilern interferieren maternale Antikörper

mit den Impfstoffen und verhindern somit die Ausbildung einer vollen Immunität. Die

Immunantworten verliefen aber in unserer Studie tendenziell ähnlich im Vergleich zu

SPF-Hühnern.

6.7 Weiterführende Untersuchungen

Ob eine lokale rHVT-ND Replikation in Verbindung mit erhöhten

Immunzellpopulationen steht, könnten immunhistochemische Untersuchungen nach

rHVT-ND Antigenen in der Lunge und weiteren Organen klären. Ein Nachweis von

rHVT-ND in der Harderschen Drüse und dem CALT des Augenlids könnten

beispielweise klären, inwieweit rHVT-ND in diese lymphatischen Gewebe vordringt.

Auch könnte die Konstruktion eines neuen rHVT-ND Vektors mit mehreren F-Genen

eine Verbesserung des Schutzes vor einer Belastungsinfektion erwirken, wie es eine

Studie mit einem rekombinanten HVT gegen die Infektiöse Bursitis des Huhns zeigte,

wo sich die Menge des exprimierten Antigens weitaus mehr auf die Immunität

auswirkte als die Replikationsrate des Vektors (TSUKAMOTO et al. 2002).

Impfstoffe, welche sero- und genotypisch an den Feldstamm angepasst sind,

könnten die Virusausscheidung effizienter verringern als nicht-homologe Impfstoffe

(SUAREZ et al. 2006; VAN BOVEN et al. 2008). Der APMV-1 Stamm LaSota,

welcher hier als Challengevirus fungierte, ist, wie auch der APMV-1 Stamm Clone

30, vom Genotyp II. Das F-Protein, welches hier in den Vektor integriert wurde,

wurde ebenfalls vom APMV-1 Stamm Clone 30 kloniert. Die Vakzinen und das

Belastungsvirus stimmten in unserem Versuch geno- sowie serotypisch überein.

Weiterführende Untersuchungen mit einem genotypisch unterschiedlichen

Belastungsvirus könnten Aufschluss über die Wirksamkeit von rHVT-ND im Feld mit

verschieden Virustypen geben. Untersuchungen mit einem velogenen Virusstamm

könnten weitere Erkenntnisse über die klinische Protektion und Virusausscheidung

geben.

104

6.8 Fazit

In dieser Studie wurde erstmals der Einfluss eines rekombinanten Putenherpesvirus,

welches das F-Protein des APMV-1 exprimiert, auf die zell-vermittelte lokale

Immunität nachgewiesen. Hierbei wurde eine Einzelapplikation und eine Kombination

mit einer Lebendvakzine untersucht.

Wir konnten zeigen, dass es bei einer rHVT-ND Immunisierung zu einer lokalen

respiratorischen Teilimmunität kommt. Die mit APMV-1 Stamm LaSota belasteten

Tiere schieden das Belastungsvirus nach rHVT Impfung zwar aus, jedoch wurde es

bei SPF-Tieren signifikant reduziert auf naive Empfängertiere übertragen. Dies war

bei Broilern nicht der Fall. Lokale Immunzellpopulationen zeigten sich nach rHVT-

ND-Impfung im Vergleich zur Kontrollgruppe leicht erhöht. rHVT-ND induziert einen

durch HAH und ELISA messbaren Antikörper-Titer. Bei einer Kombination von rHVT-

ND mit einer Lebendvakzine zeigten sich stärkere Immunantworten als bei

Applikation der einzelnen Vakzinen allein. Die Antikörpertiter waren in der dual-

vakzinierten Gruppe immer höher als in den restlichen Gruppen. Eine Kombination

beider Vakzinen bietet somit neben der Erhöhung und Verlängerung der

Immunantwort weitere Vorteile, wie die in-ovo Applikation, eine geringere Interferenz

mit maternalen Antikörpern und längere Expression des Antigens, sowie einem

additiven, wenn nicht sogar synergistischen Effekt aus Priming der Lebendvakzine

und parallel stattfindend anhaltender Antigenexprimierung des latenten rHVT-ND.

Die Kombination von rHVT-ND mit einer Lebendvakzine bietet eine

zukunftsweisende Alternative zur ansonsten üblichen Kombination eines

Lebendimpfstoffes und einer Inaktivatvakzine, da rHVT-ND eine lokale Teilimmunität

induziert und einen Boosterfeffekt durch eine lange Latenzzeit mit langer

Antigenexprimierung herbeiführt. Auch ist durch die in-ovo Methode und

Verabreichung des Lebendimpfstoffs über das Trinkwasser eine Massenapplikation

dieser Kombination möglich (RAUW et al. 2010).

105

7 Zusammenfassung

Jens-Christian Cors (2013):

Untersuchungen zu lokalen Immunreaktionen nach Impfung gegen das

Newcastle Disease Virus mit einem rekombinanten Putenherpesvirus und einer

herkömmlichen Lebendvakzine

Die Newcastle Disease (ND) wird durch das aviäre Paramyxovirus Serotyp 1 (APMV-

1) verursacht. Bei Huhn und Pute kann die Erkrankung in Abhängigkeit von der

Virulenz des APMV-1 Stammes vom perakuten Tod bis zur subklinischen

Erkrankung variieren. Trotz umfangreicher Impfprogramme und Schutzmaßnahmen

werden durch die Erkrankung weltweit erhebliche wirtschaftliche Verluste verursacht.

Herkömmliche Impfprogramme induzieren lokale und systemische Immunität, jedoch

gehen sie teilweise mit Impfreaktionen einher und verhindern nicht in allen Fällen

eine Erkrankung und Virussauscheidung.

Rekombinante Vakzinen auf der Basis eines Putenherpesvirus (HVT), welche das F-

Protein des APMV-1 exprimieren (rHVT-ND), stellen eine interessante Alternative zu

herkömmlichen Impfstoffen dar. Durch rHVT-ND kann eine Immunität sowohl gegen

die Newcastle Disease als auch die Marek’s Disease erzeugt werden.

In dieser Arbeit wurde die Wirkung einer rHVT-ND-Vakzine auf systemische sowie

lokale Immunreaktionen des oberen Respirationstraktes, der Lunge und der

Zäkaltonsillen untersucht. Die Effekte wurden bei spezifisch pathogen-freien Hühnern

(Experiment 1) und kommerziellen Broilern (Experiment 2) untersucht und mit der

Wirkung einer herkömmlichen Lebendvakzine verglichen. rHVT-ND wurde zusätzlich

mit dieser Lebendvakzine kombiniert, um eine mögliche Steigerung der Immunität zu

untersuchen.

Folgende Parameter wurden zwischen ungeimpften, rHVT-ND-, ND-Lebend- und

rHVT-ND+ND-Lebend-geimpften Gruppen verglichen: 1) Die Anzahl zirkulierender

sowie lokaler B-, T-Zell- und Makrophagenpopulationen in Harderscher Drüse, in

Konjunktiva-assoziiertem lymphatischem Gewebe, in Lunge und in Zäkaltonsille. 2)

106

Die systemische und lokale ND-Antikörperproduktion. 3) Die tracheale und kloakale

Virusauscheidung nach einer Belastungsinfektion.

In dieser Studie waren nach einer rHVT-ND Impfung lokale Immunzellpopulationen

im Vergleich zur Kontrollgruppe leicht erhöht. Bei Broilern wurde eine signifikante

Erhöhung von CD4+ Zellen in Lungen fünf Tage nach rHVT-ND Impfung beobachtet

(p<0,05).

Zudem wurde nach rHVT-ND-Impfung ein durch den HAH-Test und ELISA

messbarer Antikörpertiter erzeugt.

Es konnte gezeigt werden, dass eine rHVT-ND-Impfung zur einer Verringerung der

Virusübertragung von belastungsinfizierten SPF-Tieren auf naive Empfängertiere

führte. Nach einer Belastungsinfektion mit dem APMV-1 Stamm LaSota von rHVT-

ND geimpften SPF-Tieren schieden diese das Virus zwar aus, jedoch war die

Übertragung auf naive Empfängertiere signifikant reduziert (p<0,05). Bei Broilern

zeigte sich diese verringerte Übertragung aufgrund von Interferenz mit maternal

vermittelter Immunität nicht.

Es wurden stärkere Immunantworten bei einer Kombination von rHVT-ND und der

Lebendvakzine beobachtet. Neben der Erhöhung und Verlängerung der

Immunantwort bietet die Kombination durch rHVT-ND weitere Vorteile, wie die

Möglichkeit der in-ovo Applikation, den Vorteil einer geringeren Interferenz mit

maternalen Antikörpern und einer längeren Expression des Antigens im Vergleich zu

herkömmlichen Lebendvakzinen. Die Erhöhung der Immunantworten kommt

wahrscheinlich durch einen additiven, wenn nicht sogar synergistischen Effekt der

beiden Vakzinen zustande. Dieser beruht wahrscheinlich auf dem Priming der

Lebendvakzine und der parallel dazu stattfindenden konstanten Antigenexprimierung

und dadurch Boosterung des latenten rHVT-ND.

Somit bietet eine rHVT-ND-Kombination mit einer Lebendvakzine eine

zukunftsweisende Alternative zu der in herkömmlichen Impfprogrammen

verwendeten Kombination eines Lebendimpfstoffes mit einer Inaktivatvakzine, wobei

rHVT-ND eine lokale respiratorische Teilimmunität bei SPF-Tieren stimuliert und

zusätzlich einen verstärkten Effekt mit der ND-Lebendvakzine bewirkt.

107

8 Summary

Jens-Christian Cors (2013):

Investigations of local immunity following vaccination with a recombinant

Herpesvirus of turkeys against Newcastle Disease (rHVT-ND) and a commercial

Newcastle Disease-live vaccine

Newcastle Disease (ND), caused by the Avian Paramyxovirus Serotype 1 (APMV-1),

is responsible for severe damages and economical losses in the poultry industry

worldwide. The development of clinical disease is dependent on the virulence of the

involved AMPV-1 strain, the host species and the immune status of the host.

Symptoms may vary from subclinical infection to peracute death with high mortality in

a flock. Conventional vaccination regimes stimulate local and systemic immunity and

may provide clinical protection in most cases, but viral shedding and spreading of

disease still may occur. Therefore, optimisation of existing vaccination strategies is

required. New generation vaccines like a recombinant herpesvirus of turkeys

expressing the F-protein of APMV-1 are interesting alternatives to conventional

vaccines. If and to what extent they may induce local immunity, and reduce or

prevent viral shedding in the upper respiratory tract is not clear.

In this study, we investigated the effect of rHVT-ND on systemic as well as local

immunity in the upper respiratory tract, the lung and cecal tonsils.

The following parameters were compared between non-vaccinated, rHVT-ND-, live

ND- and rHVT-ND + live ND-vaccinated SPF-chickens (experiment 1) and

commercial broilers (experiment 2): 1) Circulating as well as local B-, T-cell and

macrophage populations in the Harderian gland, in the conjunctiva-associated

lymphoid tissue, in lung and cecal tonsil. 2) Local and systemic antibody production.

3) Tracheal and cloacal virus shedding after a challenge infection.

The study has shown that local immune cell populations were raised slightly in rHVT-

ND groups compared to the control group. CD4+ cells were raised significantly in the

lung on day five post rHVT-ND vaccination in broilers (p<0,05).

108

rHVT-vaccination alone induced partial local respiratory immunity. After challenge

with APMV-1 strain LaSota SPF-chickens from the rHVT-ND vaccinated group shed

virus comparable to the control group, but spreading to naive sentinels was reduced

significantly (p<0,05). Possibly due to interference with maternal immunity, these

effects were not seen in broiler chickens.

Vaccination with rHVT-ND induced detectable serological HI- and ELISA-titers.

Immune responses were higher in the dual-vaccinated groups as seen in higher

humoral antibody titers. Furthermore, application of rHVT-ND provides several

advantages such as the possibility of in-ovo application, lower interference with

maternal antibodies and a longer antigen expression compared to conventional ND-

vaccines, especially inactivated ND-vaccines.

The enhancement of the immunological response in dual-vaccinated chickens may

be explained by an additive or synergistic effect of the both vaccines, which consists

of priming of the ND-live vaccine and steady antigen expression and thereby

boostering by the latent rHVT-ND.

Therefore, a combination of rHVT-ND and ND-live vaccine provides an alternative to

conventional vaccination regimes, where ND-live is combined with inactivated ND-

vaccines. rHVT-ND provides next to partial local immunity and a long latency period

with long antigen expression an increased immunological effect in combination with a

live vaccine.

109

9 Literaturverzeichnis

ABOLNIK, C., R. F. HORNER, S. P. BISSCHOP, M. E. PARKER, M. ROMITO u. G. J. VILJOEN (2004):

A phylogenetic study of South African Newcastle disease virus strains isolated between 1990 and 2002 suggests epidemiological origins in the Far East.

Archives of Virology 149, 603-619

AFONSO, C. L., E. R. TULMAN, Z. LU, L. ZSAK, D. L. ROCK u. G. F. KUTISH (2001):

The genome of turkey herpesvirus.

Journal of Virology 75, 971-978

AHMED, K. A., V. K. SAXENA, A. ARA, K. B. SINGH, N. R. SUNDARESAN, M. SAXENA u. T. J. RASOOL (2007):

Immune response to Newcastle disease virus in chicken lines divergently selected for cutaneous hypersensitivity.

International Journal of Immunogenetics 34, 445-455

AL-GARIB (2003):

Review of Newcastle disease virus with particular references to immunity and vaccination.

Worlds Poultry Science Journal 59, 185-200

AL-GARIB, S. O., A. L. GIELKENS, D. E. GRUYS, L. HARTOG u. G. KOCH (2003):

Immunoglobulin class distribution of systemic and mucosal antibody responses to Newcastle disease in chickens.

Avian Diseases 47, 32-40

AL-NATOUR, M. Q., L. A. WARD, Y. M. SAIF, B. STEWART-BROWN u. L. D. KECK (2004):

Effect of diffferent levels of maternally derived antibodies on protection against infectious bursal disease virus.


ALDOUS, E. W. u. D. J. ALEXANDER (2008):

Newcastle disease in pheasants (Phasianus colchicus): a review.

Veterinary Journal 175, 181-185

110

ALDOUS, E. W., C. M. FULLER, J. K. MYNN u. D. J. ALEXANDER (2004):

A molecular epidemiological investigation of isolates of the variant avian paramyxovirus type 1 virus (PPMV-1) responsible for the 1978 to present panzootic in pigeons.

Avian Pathology 33, 258-269

ALDOUS, E. W., J. K. MYNN, J. BANKS u. D. J. ALEXANDER (2003):

A molecular epidemiological study of avian paramyxovirus type 1 (Newcastle disease virus) isolates by phylogenetic analysis of a partial nucleotide sequence of the fusion protein gene.


ALDOUS, E. W., J. M. SEEKINGS, A. MCNALLY, H. NILI, C. M. FULLER, R. M. IRVINE, D. J. ALEXANDER u. I. H. BROWN (2010):

Infection dynamics of highly pathogenic avian influenza and virulent avian paramyxovirus type 1 viruses in chickens, turkeys and ducks.


ALEXANDER, D. (2003):

Newcastle Disease.

In: Diseases of Poultry

11th Edition, Blackwell Publishing

63-88 ALEXANDER, D. u. J. BELL (2004):

A technology review: Newcastle Disease - with special emphasis on its effects on village chickens.

FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS

Rome, 2004

ALEXANDER, D. u. D. SENNE (2008):

Newcastle Disease, Other Avian Paramyxoviruses, and Pneumovirus Infections.


12th Edition, Blackwell Publishing

75-100

ALEXANDER, D. J. (1999):

111

Experimental assessment of the pathogenicity of the

Newcastle disease viruses from outbreaks in Great Britain in 1997 for chickens and turkeys, and the protection afforded by vaccination.

Avian Pathology 28, 501-511 ALEXANDER, D. J. (2001):

Newcastle disease.

British Poultry Science 42, 5-22

ALEXANDER, D. J. (2011):

Newcastle disease in the European Union 2000 to 2009.


ALEXANDER, D. J., E. W. ALDOUS u. C. M. FULLER (2012):

The long view: a selective review of 40 years of Newcastle disease research.


ALEXANDER, D. J., G. W. WILSON, P. H. RUSSELL, S. A. LISTER u. G. PARSONS (1985):

Newcastle disease outbreaks in fowl in Great Britain during 1984.

The Veterinary Record 117, 429-434

ALLAN (1975):

Newcastle disease.

Developments in Biological Standardization 28, 445-450

ALLAN u. LANCASTER (1978):

Newcastle disease vaccines: their production and use

In: FAO Animal Production and Health Series

1-163

BALLAGI-PORDANY, A., E. WEHMANN, J. HERCZEG, S. BELAK u. B. LOMNICZI (1996):

Identification and grouping of Newcastle disease virus strains by restriction site analysis of a region from the F gene.

Archives of Virology 141, 243-261

BANG, B. G. u. F. B. BANG (1968):

112

Localized lymphoid tissues and plasma cells in paraocular and paranasal organ systems in chickens.

The American Journal of Pathology 53, 735-751

BARROW, A. D., S. C. BURGESS, S. J. BAIGENT, K. HOWES u. V. K. NAIR (2003):

Infection of macrophages by a lymphotropic herpesvirus: a new tropism for Marek's disease virus.

Journal of General Virology 84, 2635-2645

BECKER, Y., Y. ASHER, E. TABOR, I. DAVIDSON, M. MALKINSON u. Y. WEISMAN (1992):

Polymerase chain reaction for differentiation between pathogenic and non-pathogenic serotype 1 Marek's disease viruses (MDV) and vaccine viruses of MDV-serotypes 2 and 3.

Journal of Virological Methods 40, 307-322

BEFUS, A. D., N. JOHNSTON, G. A. LESLIE u. J. BIENENSTOCK (1980):

Gut-associated lymphoid tissue in the chicken. I. Morphology, ontogeny, and some functional characteristics of Peyer's patches.

Journal of Immunology 125, 2626-2632

BELL, I. G., P. J. NICHOLLS, C. NORMAN, K. COOPER u. G. M. CROSS (1991):

The serological responses of chickens to mass vaccination with a live V4 Newcastle disease virus vaccine in the field and in the laboratory. 1. Meat chickens.

Australian Veterinary Journal 68, 85-89

BIENENSTOCK, J., N. JOHNSTON u. D. Y. PEREY (1973):

Bronchial lymphoid tissue. I. Morphologic characteristics.

Laboratory Investigation 28, 686-692

BOX, P. G., B. I. HELLIWELL u. P. H. HALLIWELL (1970):

Newcastle disease in turkeys. Determination of the 50 per cent. Lethal dose of the Herts (1933) Weybridge strain of Newcastle disease virus and the potency of B.P.L. inactivated Newcastle disease vaccine in turkeys.


BRIAND, F. X., A. HENRY, P. MASSIN u. V. JESTIN (2012):

Complete genome sequence of a novel avian paramyxovirus.

Journal of Virology 86, 7710.

113

BURRIDGE, M. J., H. P. RIEMANN u. W. W. UTTERBACK (1975):

Methods of spread of velogenic viscerotropic Newcastle disease virus in the southern Californian epidemic of 1971-1973.


BUZZELL, G. R. (1996):

The Harderian gland: perspectives.

Microscopy Research and Technique 34, 2-5

BWALA, D. G., S. CLIFT, N. M. DUNCAN, S. P. BISSCHOP u. F. F. OLUDAYO (2012):

Determination of the distribution of lentogenic vaccine and virulent Newcastle disease virus antigen in the oviduct of SPF and commercial hen using immunohistochemistry.

Research in Veterinary Science 93, 520-528

CANNON, M. J. u. P. H. RUSSELL (1986):

Secondary in vitro stimulation of specific cytotoxic cells to Newcastle disease virus in chickens.


CASTELEYN, C., M. DOOM, E. LAMBRECHTS, W. VAN DEN BROECK, P. SIMOENS u. P. CORNILLIE (2010):

Locations of gut-associated lymphoid tissue in the 3-month-old chicken: a review.


CATTOLI, G., L. SUSTA, C. TERREGINO u. C. BROWN (2011):

Newcastle disease: a review of field recognition and current methods of laboratory detection.

Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 23, 637-656

CHANG, P. W. (1981):

Newcastle Disease.

In: Handbook of Zoonoses

Second Edition, CRC Press, Ames, 261-264

CHIMENO ZOTH, S., E. GOMEZ, E. CARRILLO u. A. BERINSTEIN (2008):

114

Locally produced mucosal IgG in chickens immunized with conventional vaccines for Newcastle disease virus.

Brazilian Journal of Medical and Biological Research 41, 318-323

CHURCHILL, A. E., W. BAXENDALE u. G. CARRINGTON (1973):

Viraemia and antibody development in chicks following the administration of turkey herpesvirus.


COCHRAN (1999):

Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof.

Erteilung / Patent Veröffentlichungsnummer: US5,928,648 A, 1-139 CRIPPEN, T. L., C. L. SHEFFIELD, H. HE, V. K. LOWRY u. M. H. KOGUT (2003):

Differential nitric oxide production by chicken immune cells.

Developemental and Comparative Immunology 27, 603-610

CUTTING, J. A. u. T. F. ROTH (1973):

Changes in specific sequestration of protein during transport into the developing oocyte of the chicken.

Biochimica Et Biophysica Acta 298, 951-955

CZEGLEDI, A., D. UJVARI, E. SOMOGYI, E. WEHMANN, O. WERNER u. B. LOMNICZI (2006):

Third genome size category of avian paramyxovirus serotype 1 (Newcastle disease virus) and evolutionary implications.

Virus Research 120, 36-48

CZEGLEDI, A., E. WEHMANN u. B. LOMNICZI (2003):

On the origins and relationships of Newcastle disease virus vaccine strains Hertfordshire and Mukteswar, and virulent strain Herts'33.


CZIFRA, G., J. MESZAROS, E. HORVATH, V. MOVING u. B. E. ENGSTROM (1998):

Detection of NDV-specific antibodies and the level of protection provided by a single vaccination in young chickens.


115

DALGAARD, T. S., L. R. NORUP, A. R. PEDERSEN, K. J. HANDBERG, P. H. JORGENSEN u. H. R. JUUL-MADSEN (2010):

Flow cytometric assessment of chicken T cell-mediated immune responses after Newcastle disease virus vaccination and challenge.

Vaccine 28, 4506-4514

DAVISON (2004a):

Marek's Disease; Immunity to Marek's disease. Marek's Disease: An Evolving Problem Elsevier Academic Press Biology of Animal Infections, 127-141 DAVISON (2004b):

Marek’s disease virus: Biology and life cycle. Marek's Disease: An Evolving Problem Elsevier Academic Press Biology Of Animal Infections, 62-76 DE LEEUW, O. S., L. HARTOG, G. KOCH u. B. P. PEETERS (2003):

Effect of fusion protein cleavage site mutations on virulence of Newcastle disease virus: non-virulent cleavage site mutants revert to virulence after one passage in chicken brain.

The Journal of General Virology 84, 475-484

DE LEEUW, O. S., G. KOCH, L. HARTOG, N. RAVENSHORST u. B. P. PEETERS (2005):

Virulence of Newcastle disease virus is determined by the cleavage site of the fusion protein and by both the stem region and globular head of the haemagglutinin-neuraminidase protein.

The Journal of General Virology 86, 1759-1769

DIEL, D. G., L. H. DA SILVA, H. LIU, Z. WANG, P. J. MILLER u. C. L. AFONSO (2012a):

Genetic diversity of avian paramyxovirus type 1: proposal for a unified nomenclature and classification system of Newcastle disease virus genotypes.

Infection, Genetics and Evolution 12, 1770-1779

DIEL, D. G., P. J. MILLER, P. C. WOLF, R. M. MICKLEY, A. R. MUSANTE, D. C. EMANUELI, K. J. SHIVELY, K. PEDERSEN u. C. L. AFONSO (2012b):

116

Characterization of Newcastle disease viruses isolated from cormorant and gull species in the United States in 2010.


DILAVERIS, D., C. CHEN, P. KAISER u. P. H. RUSSELL (2007):

The safety and immunogenicity of an in ovo vaccine against Newcastle disease virus differ between two lines of chicken.

Vaccine 25, 3792-3799

DORTMANS, J. C., B. P. PEETERS u. G. KOCH (2012):

Newcastle disease virus outbreaks: Vaccine mismatch or inadequate application?

Veterinary Microbiology 160, 17-22

Veterinary Microbiology DOYLE (1935):

Newcastle Disease of Fowls.

Journal of Comparative Pathology and Therapeutics 48, 1-20

DUMRONGSOONTORNCHAI, P. (1999)

Investigations on immune cell populations of the head-associated lymphoid tissues (HALT): Immunohistochemical aspects, cell-mediated and humoral immune response in unvaccinated and vaccinated commercial broilers.

Dissertation, Hannover, Klinik für Geflügel FABRICANT, J., B. W. CALNEK u. K. A. SCHAT (1982):

The early pathogenesis of turkey herpesvirus infection in chickens and turkeys.


FAGERLAND, J. A. u. L. H. ARP (1993a):

Distribution and quantitation of plasma cells, T lymphocyte subsets, and B lymphocytes in bronchus-associated lymphoid tissue of chickens: age-related differences.

Regional Immunology 5, 28-36

FAGERLAND, J. A. u. L. H. ARP (1993b):

Structure and development of bronchus-associated lymphoid tissue in conventionally reared broiler chickens.

117


FERREIRA, L., E. VILLAR u. I. MUNOZ-BARROSO (2004):

Gangliosides and N-glycoproteins function as Newcastle disease virus receptors.

The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 36, 2344-2356

FIX, A. S. u. L. H. ARP (1991):

Morphologic characterization of conjunctiva-associated lymphoid tissue in chickens.

American Journal of Veterinary Research 52, 1852-1859

FOLITSE, R., D. A. HALVORSON u. V. SIVANANDAN (1998):

Efficacy of combined killed-in-oil emulsion and live Newcastle disease vaccines in chickens.


FRIEDMAN, A., E. SHALEM-MEILIN u. E. D. HELLER (1992):

Marek's disease vaccines cause temporary U-lymphocyte dysfunction and reduced resistance to infection in chicks.


GAUNSON, J. E., C. J. PHILIP, K. G. WHITHEAR u. G. F. BROWNING (2006):

The cellular immune response in the tracheal mucosa to Mycoplasma gallisepticum in vaccinated and unvaccinated chickens in the acute and chronic stages of disease.

Vaccine 24, 2627-2633

GEFLÜGELPEST-VERORDNUNG (2007):

Verordnung zum Schutz gegen die Geflügelpest (Geflügelpest-Verordnung). "Geflügelpest-Verordnung in der Fassung der Bekanntmachung vom 8. Mai 2013 (BGBl. I S. 1212)" 1-44 GIAMBRONE, J. J. u. R. P. CLAY (1986):

Vaccination of day-old broiler chicks against Newcastle disease and infectious bursal disease using commercial live and/or inactivated vaccines.


GIMENO, I. M., A. L. CORTES, J. S. GUY, E. TURPIN u. C. WILLIAMS (2011):

118

Replication of recombinant herpesvirus of turkey expressing genes of infectious laryngotracheitis virus in specific pathogen free and broiler chickens following in ovo and subcutaneous vaccination.


GOHM, D. S., B. THUR u. M. A. HOFMANN (2000):

Detection of Newcastle disease virus in organs and faeces of experimentally infected chickens using RT-PCR.


GOMEZ DEL MORAL, M., J. FONFRIA, A. VARAS, E. JIMENEZ, J. MORENO u. A. G. ZAPATA (1998):

Appearance and development of lymphoid cells in the chicken (Gallus gallus) caecal tonsil.

The Anatomical Record 250, 182-189

GOMEZ, E., S. C. ZOTH, S. ASURMENDI, C. VAZQUEZ ROVERE u. A. BERINSTEIN (2009):

Expression of hemagglutinin-neuraminidase glycoprotein of newcastle disease Virus in agroinfiltrated Nicotiana benthamiana plants.

Journal of Biotechnology 144, 337-340

GOTOH, B., Y. OHNISHI, N. M. INOCENCIO, E. ESAKI, K. NAKAYAMA, P. J. BARR, G. THOMAS u. Y. NAGAI (1992):

Mammalian subtilisin-related proteinases in cleavage activation of the paramyxovirus fusion glycoprotein: superiority of furin/PACE to PC2 or PC1/PC3.


GUIMARAES, M. C., L. V. GUILLERMO, M. F. MATTA, S. G. SOARES u. R. A. DAMATTA (2011):

Macrophages from chickens selected for high antibody response produced more nitric oxide and have greater phagocytic capacity.

Veterinary Immunology and Immunopathology 140, 317-322

HAMAL, K. R., S. C. BURGESS, I. Y. PEVZNER u. G. F. ERF (2006):

Maternal antibody transfer from dams to their egg yolks, egg whites, and chicks in meat lines of chickens.

Poultry Science 85, 1364-1372

HANSON (1972):

119

World wide spread of viscerotropic Newcastle Disease. Proceedings of the 76th Meeting of the U.S. Animal Health Association 276-279 HANSON, J. SPALATIN u. G. S. JACOBSON (1973):

The viscerotropic pathotype of Newcastle disease virus.


HELLER, E. D., D. B. NATHAN u. M. PEREK (1977):

The transfer of Newcastle serum antibody from the laying hen to the egg and the chick.


HOLLAND, M. S., C. D. MACKENZIE, R. W. BULL u. R. F. SILVA (1998):

Latent turkey herpesvirus infection in lymphoid, nervous, and feather tissues of chickens.


HOMHUAN, A., S. PRAKONGPAN, P. POOMVISES, R. A. MAAS, D. J. CROMMELIN, G. F. KERSTEN u. W. JISKOOT (2004):

Virosome and ISCOM vaccines against Newcastle disease: preparation, characterization and immunogenicity.

European Journal of Pharmaceutical Sciences 22, 459-468

HOUSSAINT, E., E. DIEZ u. J. R. PINK (1987):

Ontogeny and tissue distribution of the chicken Bu-1a antigen.

Immunology 62, 463-470

HOUSSAINT, E., O. LASSILA u. O. VAINIO (1989):

Bu-1 antigen expression as a marker for B cell precursors in chicken embryos.

European Journal of Immunology 19, 239-243

HU, S., H. MA, Y. WU, W. LIU, X. WANG, Y. LIU u. X. LIU (2009):

A vaccine candidate of attenuated genotype VII Newcastle disease virus generated by reverse genetics.

Vaccine 27, 904-910

IGARASHI, T., M. TAKAHASHI, J. DONOVAN, J. JESSIP, M. SMITH, K. HIRAI, A. TANAKA u. M. NONOYAMA (1987):

120

Restriction enzyme map of herpesvirus of turkey DNA and its collinear relationship with Marek's disease virus DNA.

Virology 157, 351-358

IRVINE, R. M., E. W. ALDOUS, R. J. MANVELL, W. J. COX, V. CEERAZ, C. M. FULLER, A. M. WOOD, J. C. MILNE, M. WILSON, R. G. HEPPLE, A. HURST, C. E. SHARPE, D. J. ALEXANDER u. I. H. BROWN (2009):

Outbreak of Newcastle disease due to pigeon paramyxovirus type 1 in grey partridges (Perdix perdix) in Scotland in October 2006.


JANARDHANA, V., M. M. BROADWAY, M. P. BRUCE, J. W. LOWENTHAL, M. S. GEIER, R. J. HUGHES u. A. G. BEAN (2009):

Prebiotics modulate immune responses in the gut-associated lymphoid tissue of chickens.

The Journal of Nutrition 139, 1404-1409

JEURISSEN, S. H., A. G. BOONSTRA-BLOM, S. O. AL-GARIB, L. HARTOG u. G. KOCH (2000):

Defence mechanisms against viral infection in poultry: a review.

The Veterinary Quarterly 22, 204-208

JEURISSEN, S. H., E. M. JANSE, G. KOCH u. G. F. DE BOER (1989):

Postnatal development of mucosa-associated lymphoid tissues in chickens.

Cell and Tissue Research 258, 119-124

JONES, R. C., C. J. NAYLOR, A. AL-AFALEQ, K. J. WORTHINGTON u. R. JONES (1992):

Effect of cyclophosphamide immunosuppression on the immunity of turkeys to viral rhinotracheitis.


JORGENSEN, P. H., K. J. HANDBERG, P. AHRENS, R. J. MANVELL, K. M. FROST u. D. J. ALEXANDER (2000):

Similarity of avian paramyxovirus serotype 1 isolates of low virulence for chickens obtained from contaminated poultry vaccines and from poultry flocks.


KAETZEL, C. S., J. K. ROBINSON u. M. E. LAMM (1994):

121

Epithelial transcytosis of monomeric IgA and IgG cross-linked through antigen to polymeric IgA. A role for monomeric antibodies in the mucosal immune system.


KALETA, E. F., D. J. ALEXANDER u. P. H. RUSSELL (1985):

The first isolation of the avian PMV-1 virus responsible for the current panzootic in pigeons ?


KAPCZYNSKI, D. R., C. L. AFONSO u. P. J. MILLER (2013):

Immune responses of poultry to Newcastle disease virus.

Developmental and Comparative Immunology 41, 447-53 KAPCZYNSKI, D. R. u. D. J. KING (2005):

Protection of chickens against overt clinical disease and determination of viral shedding following vaccination with commercially available Newcastle disease virus vaccines upon challenge with highly virulent virus from the California 2002 exotic Newcastle disease outbreak.

Vaccine 23, 3424-3433

KAPCZYNSKI, D. R. u. T. M. TUMPEY (2003):

Development of a virosome vaccine for Newcastle disease virus.


KE, G. M., S. W. YU, C. H. HO, P. Y. CHU, L. Y. KE, K. H. LIN, Y. C. TSAI, H. J. LIU u. M. Y. LIN (2010):

Characterization of newly emerging Newcastle disease viruses isolated during 2002-2008 in Taiwan.

Virus Research 147, 247-257 KIM, L. M., D. J. KING, D. L. SUAREZ, C. W. WONG u. C. L. AFONSO (2007):

Characterization of class I Newcastle disease virus isolates from Hong Kong live bird markets and detection using real-time reverse transcription-PCR.

Journal of Clinical Microbiology 45, 1310-1314

KITAGAWA, H., Y. HIRATSUKA, T. IMAGAWA u. M. UEHARA (1998):

Distribution of lymphoid tissue in the caecal mucosa of chickens.

Journal of Anatomy 192, 293-298

122

KOENEN, M. E., A. G. BOONSTRA-BLOM u. S. H. M. JEURISSEN (2002):

Immunological differences between layer- and broiler-type chickens.

Veterinary Immunology and Immunopathology 89, 47-56 KOTANI, T., Y. ODAGIRI, J. NAKAMURA u. T. HORIUCHI (1987):

Pathological changes of tracheal mucosa in chickens infected with lentogenic Newcastle disease virus.


LAMB, R. A. K., D. (2001):

Paramyxoviridae: The Viruses and Their Replication.

In: Fundamental Virology

4th Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 689 - 725

LANCASTER, J. E. (1966):

Newcastle Disease A Review 1926-1964.

Queen's Printer, Ottawa, Canada, 1-75

LERNER, K. G., B. GLICK u. F. C. MCDUFFIE (1971):

Role of the bursa of Fabricius in IgG and IgM production in the chicken: evidence for the role of a non-bursal site in the development of humoral immunity.


LIEN, Y. Y., J. W. LEE, H. Y. SU, H. J. TSAI, M. C. TSAI, C. Y. HSIEH u. S. S. TSAI (2007):

Phylogenetic characterization of Newcastle disease viruses isolated in Taiwan during 2003-2006.

Veterinary Microbiology 123, 194-202

LILLEHOJ, H. S. u. J. M. TROUT (1996):

Avian gut-associated lymphoid tissues and intestinal immune responses to Eimeria parasites.

Clinical Microbiology Reviews 9, 349-360

LIU, H., Z. WANG, Y. WU, D. ZHENG, C. SUN, D. BI, Y. ZUO u. T. XU (2007):

Molecular epidemiological analysis of Newcastle disease virus isolated in China in 2005.

Journal of Virological Methods 140, 206-211

123

LOWENTHAL, J. W., M. R. DIGBY u. J. J. YORK (1995):

Production of interferon-gamma by chicken T cells.

Journal of Interferon & Cytokine Research 15, 933-938

MA, O., D. JÚNIOR, REISCHAK, D. SILVA, SPILKI, BUZINARO u. ARNS (2009):

Newcastle Disease Virus Vaccine Strains:Immunogenicity is not Influenced by ICPI.

Brazilian Journal of Poultry Science 11, 129 - 133

MACPHERSON, L. (1956):

Some Observations On The Epizootiology Of NewCastle Disease.

Canadian Journal of Comparative Medicine and Veterinary Science 20, 155–168

MAJIYAGBE, K. A. u. S. B. HITCHNER (1977):

Antibody response to strain combinations of Newcastle disease virus as measured by hemagglutination-inhibition.


MALKINSON, M. u. P. A. SMALL, JR. (1977):

Local immunity against Newcastle disease virus in the newly hatched chicken's respiratory tract.

Infection and Immunity 16, 587-592

MAZUMDER, K. S., N. M., C. E.H., D. P.M. u. I. M.R. (2012):

Isolation and identification of Newcastle disease viruses from field outbreaks in chickens and pigeons.

Bangladesh Veterinarian 29, 41-48

MCDONALD, J. W. u. T. K. PILGRAM (1999):

Nuclear expression of p53, p21 and cyclin D1 is increased in bronchioloalveolar carcinoma.

Histopathology 34, 439-446

MCGINNES, L. W., H. PANTUA, J. P. LALIBERTE, K. A. GRAVEL, S. JAIN u. T. G. MORRISON (2010):

Assembly and biological and immunological properties of Newcastle disease virus-like particles.


124

MCNULTY, M. S., B. M. ADAIR, C. J. O'LOAN u. G. M. ALLAN (1988):

Isolation of an antigenically unusual paramyxovirus type 1 from chickens.


MEULEMANS, G. (1988):

Newcastle Disease: Control by vaccination.

Developments in Veterinary Virology 119, 318-332 MIA KIM, L., D. L. SUAREZ u. C. L. AFONSO (2008):

Detection of a broad range of class I and II Newcastle disease viruses using a multiplex real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay.

Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 20, 414-425

MILLER, C. ESTEVEZ, Q. YU, D. L. SUAREZ u. D. J. KING (2009a):

Comparison of viral shedding following vaccination with inactivated and live Newcastle disease vaccines formulated with wild-type and recombinant viruses.


MILLER, D. J. KING, C. L. AFONSO u. D. L. SUAREZ (2007):

Antigenic differences among Newcastle disease virus strains of different genotypes used in vaccine formulation affect viral shedding after a virulent challenge.

Vaccine 25, 7238-7246

MILLER, P. J., E. L. DECANINI u. C. L. AFONSO (2010):

Newcastle disease: evolution of genotypes and the related diagnostic challenges.

Infection, Genetics and Evolution 10, 26-35

MILLER, P. J., C. ESTEVEZ, Q. YU, D. L. SUAREZ u. D. J. KING (2009b):

Comparison of viral shedding following vaccination with inactivated and live Newcastle disease vaccines formulated with wild-type and recombinant viruses.


MIXSON, M. A. u. J. E. PEARSON (1992):

Velogenic neurotropic Newcastle disease (VNND) in cormorants and commercial turkeys.

Proceedings of the 96th annual meeting of the United States Animal Health Association

125

357-360

MONTILLA (2004):

Mucosal immune system: A brief review.

Inmunología 23, 207-216

MORGAN, R. W., J. GELB, JR., C. R. POPE u. P. J. SONDERMEIJER (1993):

Efficacy in chickens of a herpesvirus of turkeys recombinant vaccine containing the fusion gene of Newcastle disease virus: onset of protection and effect of maternal antibodies.


MORGAN, R. W., J. GELB, JR., C. S. SCHREURS, D. LUTTICKEN, J. K. ROSENBERGER u. P. J. SONDERMEIJER (1992):

Protection of chickens from Newcastle and Marek's diseases with a recombinant herpesvirus of turkeys vaccine expressing the Newcastle disease virus fusion protein.


MOSS, B. (1991):

Vaccinia virus: a tool for research and vaccine development.

Science 252, 1662-1667

MYERS, R. K. u. L. H. ARP (1987):

Pulmonary clearance and lesions of lung and air sac in passively immunized and unimmunized turkeys following exposure to aerosolized Escherichia coli.


NAGAI, Y., H. D. KLENK u. R. ROTT (1976):

Proteolytic cleavage of the viral glycoproteins and its significance for the virulence of Newcastle disease virus.

Virology 72, 494-508

NAKAMURA, K., H. UEDA, T. TANIMURA u. K. NOGUCHI (1994):

Effect of mixed live vaccine (Newcastle disease and infectious bronchitis) and Mycoplasma gallisepticum on the chicken respiratory tract and on Escherichia coli infection.

Journal of Comparative Pathology 111, 33-42

126

NASRIN, M., M. Z. KHAN, M. N. SIDDIQI u. M. A. MASUM (2013):

Mobilization of immunoglobulin (Ig)-containing plasma cells in Harderian gland, cecal tonsil and trachea of broilers vaccinated with Newcastle Disease Vaccine.

Tissue & Cell 45, 191-197

OIE (2008):

Newcastle Disease.Manual of Diagnostic Tests And Vaccines For Terrestrial Animals OIE Manual 1 1-14

OIE (2010):

Marek's Disease.

OIE Terrestrial Manual 2010, 1-10

OIE (2012):

Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2012.

OIE Terrestrial Manual 2, 1-19

PALYA, V., I. KISS, T. TATAR-KIS, T. MATO, B. FELFOLDI u. Y. GARDIN (2012):

Advancement in vaccination against Newcastle disease: recombinant HVT NDV provides high clinical protection and reduces challenge virus shedding with the absence of vaccine reactions.


PALYA, V., Z. PENZES, T. HORVATH, V. KARDI, K. MOORE u. Y. GARDIN (2008):

Comparative Efficacy of Several Vaccination Programs including or not including Recombinant HVT-ND Vaccine against Challenge with Mexican Chimahuacan NDV strain.

In: Proc.75th Western Poultry Dis.Conf.Puerto Vallarta Mexico, 36-227 PANTUA, H. D., L. W. MCGINNES, M. E. PEEPLES u. T. G. MORRISON (2006):

Requirements for the assembly and release of Newcastle disease virus-like particles.


PEDERSEN, SENNE, WOOLCOCK P.R., KINDE H., KING DJ., WISE MG., PANIGRAHY B. u. S. BS. (2004):

Phylogenetic relationships among virulent Newcastle disease virus isolates from the 2002-2003 outbreak in California and other recent outbreaks in North America.


127

PEROZO, F., P. VILLEGAS, R. DOLZ, C. L. AFONSO u. L. B. PURVIS (2008):

The VG/GA strain of Newcastle disease virus: mucosal immunity, protection against lethal challenge and molecular analysis.


RAMP, K. (2012)

Rekombinante Newcastle Disease Viren für die Entwicklung von Markervakzinen- Möglichkeit der simultanen Impfung gegen die Newcastle Krankheit und die Aviäre Influenza.

Dissertation, Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald, Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie RAMP, K., E. TOPFSTEDT, R. WACKERLIN, D. HOPER, M. ZILLER, T. C. METTENLEITER, C. GRUND u. A. ROMER-OBERDORFER (2012):

Pathogenicity and immunogenicity of different recombinant Newcastle disease virus clone 30 variants after in ovo vaccination.


RAUW, F., Y. GARDIN, V. PALYA, S. ANBARI, S. LEMAIRE, M. BOSCHMANS, T. VAN DEN BERG u. B. LAMBRECHT (2010):

Improved vaccination against Newcastle disease by an in ovo recombinant HVT-ND combined with an adjuvanted live vaccine at day-old.

Vaccine 28, 823-833

REDDY, S. K., J. M. SHARMA, J. AHMAD, D. N. REDDY, J. K. MCMILLEN, S. M. COOK, M. A. WILD u. R. D. SCHWARTZ (1996):

Protective efficacy of a recombinant herpesvirus of turkeys as an in ovo vaccine against Newcastle and Marek's diseases in specific-pathogen-free chickens.

Vaccine 14, 469-477

REYNOLDS, D. L. u. A. D. MARAQA (2000a):

Protective immunity against Newcastle disease: the role of antibodies specific to Newcastle disease virus polypeptides.


REYNOLDS, D. L. u. A. D. MARAQA (2000b):

Protective immunity against Newcastle disease: the role of cell-mediated immunity.


ROSE, M. E., E. ORLANS u. N. BUTTRESS (1974):

128

Immunoglobulin classes in the hen's egg: their segregation in yolk and white.

European Journal of Immunology 4, 521-523

ROTT, R., KLENK H.-D. (1988):

Molecular Basis of Infectivity and Pathogenicity of Newcastle Disease Virus. In: Newcastle Disease Developments in Veterinary Virology Kluwer Academic Publishers 98-112 RUSSELL, P. H. (1993):

Newcastle disease virus: virus replication in the harderian gland stimulates lacrimal IgA; the yolk sac provides early lacrimal IgG.

Veterinary Immunology and Immunopathology 37, 151-163 RUSSELL, P. H., P. N. DWIVEDI u. T. F. DAVISON (1997):

The effects of cyclosporin A and cyclophosphamide on the populations of B and T cells and virus in the Harderian gland of chickens vaccinated with the Hitchner B1 strain of Newcastle disease virus.


RUSSELL, P. H. u. G. O. EZEIFEKA (1995):

The Hitchner B1 strain of Newcastle disease virus induces high levels of IgA, IgG and IgM in newly hatched chicks.

Vaccine 13, 61-66

SATO, S., I. NONOMURA, F. SHIMIZU, S. SHOYA u. T. HORIUCHI (1970):

Mixed infection with Mycoplasma gallisepticum and the B1 strain of Newcastle disease virus in chickens.

National Institute of Animal Health Quarterly 10, 58-65

SAWANT, P. M., P. C. VERMA, P. K. SUBUDHI, U. CHATURVEDI, M. SINGH, R. KUMAR u. A. K. TIWARI (2011):

Immunomodulation of bivalent Newcastle disease DNA vaccine induced immune response by co-delivery of chicken IFN-gamma and IL-4 genes.


SCHAT, K. A. (2008):

Marek's Disease.


129

Blackwell Publishing

452-514

SCHWARZ, A., M. GAULY, H. ABEL, G. DAS, J. HUMBURG, A. T. WEISS, G. BREVES u. S. RAUTENSCHLEIN (2011):

Pathobiology of Heterakis gallinarum mono-infection and co-infection with Histomonas meleagridis in layer chickens.


SENNE, D. A., D. J. KING u. D. R. KAPCZYNSKI (2004):

Control of Newcastle disease by vaccination.

Developments in Biologicals 119, 165-170

SIEGMANN, O. K., E. F. (1973):

Control of the efficacy of vaccinations against Newcastle disease.

Archiv für Geflügelkunde, 121-126

SLACUM, G. (2012):

The use of elisa (biocheck) to detect antibodies following vaccination with differrent recombinant hvt vectored vacccines for NDV, ILTV and IBDV.

61st Western Poultry Disease Conference 2012, 41-42

SMIALEK, M., B. TYKALOWSKI, T. STENZEL u. A. KONCICKI (2011):

Local immunity of the respiratory mucosal system in chickens and turkeys.

Polish journal of veterinary sciences 14, 291-297

SONDERMEIJER, P. J., J. A. CLAESSENS, P. E. JENNISKENS, A. P. MOCKETT, R. A. THIJSSEN, M. J. WILLEMSE u. R. W. MORGAN (1993):

Avian herpesvirus as a live viral vector for the expression of heterologous antigens.

Vaccine 11, 349-358

STONE, H. D. (1997):

Newcastle disease oil emulsion vaccines prepared with animal, vegetable, and synthetic oils.


SUAREZ, D. L., C. W. LEE u. D. E. SWAYNE (2006):

Avian influenza vaccination in North America: strategies and difficulties.

130

Developments in Biologicals 124, 117-124

SUSTA, L., I. CORNAX, D. G. DIEL, S. C. GARCIA, P. J. MILLER, X. LIU, S. HU, C. C. BROWN u. C. L. AFONSO (2013):

Expression of interferon gamma by a highly virulent strain of Newcastle disease virus decreases its pathogenicity in chickens.

Microbial Pathogenesis 61-62, 73-78 SUSTA, L., P. J. MILLER, C. L. AFONSO u. C. C. BROWN (2011):

Clinicopathological characterization in poultry of three strains of Newcastle disease virus isolated from recent outbreaks.

Veterinary Pathology 48, 349-360

SWAYNE, D. E., O. J. FLETCHER u. L. W. SCHIERMAN (1989):

Marek's disease virus-induced transient paralysis in chickens. 1. Time course association between clinical signs and histological brain lesions.


TSUKAMOTO, K., S. SAITO, S. SAEKI, T. SATO, N. TANIMURA, T. ISOBE, M. MASE, T. IMADA, N. YUASA u. S. YAMAGUCHI (2002):

Complete, long-lasting protection against lethal infectious bursal disease virus challenge by a single vaccination with an avian herpesvirus vector expressing VP2 antigens.


UTTERBACK, W. W. u. J. H. SCHWARTZ (1973):

Epizootiology of velogenic viscerotropic Newcastle disease in southern California, 1971-1973.

Journal of the American Veterinary Medical Association 163, 1080-1088

VAN ALSTINE, W. G. u. L. H. ARP (1988):

Histologic evaluation of lung and bronchus-associated lymphoid tissue in young turkeys infected with Bordetella avium.

American Journal of Veterinary Research 49, 835-839

VAN BOVEN, M., A. BOUMA, T. H. FABRI, E. KATSMA, L. HARTOG u. G. KOCH (2008):

Herd immunity to Newcastle disease virus in poultry by vaccination.


131

VAN ECK, J. H. (1990):

Protection of broilers against Newcastle disease by hyperimmunisation of the dams.

The Veterinary Quarterly 12, 139-145

VAN GINKEL, F. W., S. L. GULLEY, A. LAMMERS, F. J. HOERR, R. GURJAR u. H. TORO (2012):

Conjunctiva-associated lymphoid tissue in avian mucosal immunity.

Developmental & Comparative Immunology 36, 289-297

WAKAMATSU, N., D. J. KING, B. S. SEAL, B. P. H. PEETERS u. C. C. BROWN (2006):

The effect on pathogenesis of Newcastle disease virus LaSota strain from a mutation of the fusion cleavage site to a virulent sequence.


WESTBURY, H. A., G. PARSONS u. W. H. ALLAN (1984):

Comparison of the immunogenicity of Newcastle disease virus strains V4, Hitchner B1 and La Sota in chickens. 2. Tests in chickens with maternal antibody to the virus.

Australian Veterinary Journal 61, 10-13

WISE, M. G., D. L. SUAREZ, B. S. SEAL, J. C. PEDERSEN, D. A. SENNE, D. J. KING, D. R. KAPCZYNSKI u. E. SPACKMAN (2004):

Development of a real-time reverse-transcription PCR for detection of newcastle disease virus RNA in clinical samples.


YADIN, H. (1976):

Spray vaccination of turkeys against Newcastle disease.


YANG, Z. Q., Q. Q. LIU, Z. M. PAN, H. X. YU u. X. A. JIAO (2007):

Expression of the fusion glycoprotein of Newcastle disease virus in transgenic rice and its immunogenicity in mice.

Vaccine 25, 591-598

YU, L., Z. WANG, Y. JIANG, L. CHANG u. J. KWANG (2001):

Characterization of newly emerging Newcastle disease virus isolates from the People's Republic of China and Taiwan.

132


ZHANG, M. ZHANG, J. LI, T. CAO, X. TIAN u. F. ZHOU (2008):

Enhancement of mucosal immune responses by intranasal co-delivery of Newcastle disease vaccine plus CpG oligonucleotide in SPF chickens in vivo.


ZHANG, S., X. WANG, C. ZHAO, D. LIU, Y. HU, J. ZHAO u. G. ZHANG (2011):

Phylogenetic and pathotypical analysis of two virulent Newcastle disease viruses isolated from domestic ducks in China.

Plos One 6, e25000

133

10 Anhang

10.1 SPF-Liste

Die folgenden Tests wurden gemäß den Vorgaben der "European Pharmacopoiea"

durchgeführt.

Erreger Testmethode Ergebnis

Aviäre Adenoviren, Gruppe 1 AGP N

Aviäre Adenoviren, Gruppe 3, EDS HAH N

Aviäre Leukoseviren/RSV ELISA N

Aviäre Orthoreoviren ELISA N

Aviäres Metapneumovirus (TRT) ELISA N

Aviäres Nephritis Virus ELISA N

Hühnerpockenvirus KU/PM N

Inluenzavirus Typ A AGP N

Marek’s Disease Virus AGP N

Mycobacterium avium KU/PM N

Mycoplasma gallisepticum AGG N

Mycoplasma synoviae AGG N

Newcastle Disease Virus HAH N

Reticuloendotheliose-Virus ELISA N

Salmonella pullorum AGG N

Salmonella spp. BU N

Virus der aviären Enzephalomyelitits ELISA N

Virus der Infektiösen Bronchitits ELISA N

Virus der Infektiösen Bursitis Serotyp 1 ELISA N

Virus der Infektiösen Bursitis Serotyp 2 VN N

Virus der Infektiösen Laryngotracheitis ELISA N

Virus der Infektösen Kükenanämie (CAV) ELISA N

N = Negativ P = Positiv

NT = nicht getestet KU = klinische Untersuchung

HAH = Hämagglutinationshemmungstest PM = post mortem

AGP = Agar-Gel-Präzipitationstest FAT = Fluoreszenz Antikörper Test

AGG = Agglutinations-Test VN = Virus-Neutralisationstest

BU = bakteriologische Untersuchung ELISA = Enzyme Linked Immunosorbent Assay

134

10.2 Lösungen, Puffer, Medien

Phosphat-Puffer (PBS) 0,01 M

NaCL 8 g 137 mM

KCl 0,2 g 2,7 mM

Na2HPO4 2,17 g 10 mM (0,01 M)

KH2PO4 0,2 g 2 mM

Aqua bidest. ad 1000 ml

pH 7,4

gepuffertes Formalin

Na2HPO4 6,5 g

Na2HPO4*H2O 4,0 g

Aqua bidest. Ad 900 ml

Formaldehyd 37% (entsäuert) 100 ml

pH 7,0

Eosin-Stammlösung

Eosin 1 g

Aqua bidest. 100 ml

Eosin-Gebrauchslösung

Eosin-Stammlösung 80 ml

Aqua bidest. 160 ml

Thymolkristalle einige kleine Kristalle

135

Hämalaun-Stammlösung

Lösung A

Hämatoxylin-Kristalle 1 g

Aqua bidest. 400 ml

Lösung B

KAl(SO4)2*12 H2O 59 g

NaJO3 0,2 g

Aqua bidest. 600 ml

Hämalaun-Gebrauchslösung

Lösung C

Chloralhydrat-Kristalle 50 g

Zirtonensäure-Kristalle 1 g

Aqua bidest. 100 ml

200 ml Hämalaun Stammlösung (A+B) mit 10 ml Lösung C vermischen und vor Gebrauch mindestens 24 Stunden ruhen lassen.

Leibowitz/McCoy Medium

Leibwotz/McCoy Medium (Biochrom AG, Berlin) 1:1

Antibiotikum (Penicillin (100 U/ml)/Streptomycin (100 µg / ml))

Biochrom AG, Berlin)

Fetales Bovines Serum (Biochrom AG, Berlin) 1%

M6B8 Medium

CaCl2 (wasserfrei)

CaCl2*2H2O

Fe(NO3)3*9H2O

MgSO4 (wasserfrei)

KCl

136

NaCl

NaHCO3

NaH2PO4 (wasserfrei)

NaH2PO4*H2O

L-Alanin

L-Arginin HCl

L-Asparagin H2O

L- Asparaginsäure

L-Cystein HCI*H2O

L-Cystin 2HCl

L-Glutaminsäure

L-Glutamin

Glycin

L-Histidin HCI*H2O

L-Isoleucin

L-Leucin

L-Lysin HCl

L-Methionin

L-Phenylalanin

L-Prolin

L-Serin

L-Threonin

L-Tryptophan

L-Tryosin 2Na*2H2O

L-Valin

D-Ca Pantothenat

Cholinchlorid

Folsäure

Myo-Inositol

Nicotinamid

Pyridoxal HCl

Riboflavin

Thiamin HCl

D-Glukose

137

Phenol Rot

Natriumpyruvat

TPB 8.3% (w/v) TC

Tryptose 10% (w/v) TC

Lactalbumin Hydrolysat 12% (w/v)

TAE-Puffer

(für Gelelektrophorese)

Stocklösung 50x:

Tris-Base 242 g

Eisessig 57,1 ml

EDTA (0,5 mM pH 8,0) 100 ml

Herstellen der Gebrauchslösung: 10 ml TAE 50x in 490 ml Aqua bidest.

TAE Gebrauchslösung = 40mM Tris-Acetat, 1mM EDTA

Agargelelektrophorese 2% mit Biozym LE Agarose

138

11 Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die mich bei der Durchführung

dieser Arbeit hilfreich unterstützt haben.

Ich möchte mich recht herzlich bei meiner Betreuerin Prof. Dr. Silke Rautenschlein

für die sehr gute Betreuung bedanken.

Großer Dank gilt auch der Firma MSD Animal Health, speziell Aris Malo, Rik

Koopman, Sigrid Spies, Gerdy ten Dam, Sandra Vogels, Maaike Bekkers, Ennie

Willems und Ans Peters.

Ebenfalls möchte ich mich bei Christine Haase für die Einarbeitung und Hilfe bei

meinem Projekt bedanken.

Vielen Dank an Sonja Bernhard, Sabrina Techel und Katja Stolpe, welche mich bei

der Tierhaltung unterstützt haben.

Dank gilt auch Herrn Dr. Martin Ryll und Hans Bertram, welche bei technischen

Arbeiten unterstützten.

Vielen Dank an meine Kollegen Henning Petersen, Colin Pielsticker, Lydia Teske,

Sandra Hartmann, Annette Kaiser, Tamiru Alkie Negash, Diana Petzoldt, Samuel

Fischer, Arne Jung, Andreas Stamm, Martina Hesse, Hicham Sid und Zifeng Han

welche mich in meinem Projekt mit tatkräftiger Hilfe und fachlichem Rat unterstützt

haben.

Vielen Dank an meine Eltern und meinen Bruder, die mich während meiner

Dissertationszeit unterstützt haben.

Untersuchungen zu lokalen Immunreaktionen nach Impfung ...

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