Untersuchungen zur energetischen Regulation des ... · Angiotensinogen, Transforming Growth...

Aus dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Institut für Tierwissenschaften, Abteilung Physiologie und Hygiene Universität Bonn

Untersuchungen zur energetischen Regulation des Leptinsystems bei der Ziege

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von CHRISTOPH SEYBOLD

aus Heilbronn

Hannover 2008

Wissenschaftliche Betreuung: Herr Prof. Dr. Gerhard Breves Frau Prof. Dr. Dr. Helga Sauerwein 1. Gutachter: Herr Prof. Dr. G. Breves 2. Gutachter: Herr Prof. Dr. M. Ganter Tag der mündlichen Prüfung: 30. Mai 2008 Diese Arbeit wurde durch die H. Wilhelm Schaumann Stiftung finanziell unterstützt.

Für meine Familie.

Ergebnisse dieser Dissertation wurden auf der International Conference on Farm

Animal Endocrinology 2004 in Budapest, (Ungarn, Poster und Abstrakt), der 59.

Tagung der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie 2005 in Stuttgart-Hohenheim

(Vortrag und Poster), der 16. Tagung der Fachgruppe Physiologie und Biochemie der

Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft 2006 in Gießen (Vortrag und

Abstrakt), der 8th European Congress of Endocrinology 2006 in Glasgow

(Großbritannien, Poster und Abstrakt), in Journal of Animal Science 84, Suppl. 1/

Journal of Dairy Science 89, Suppl. 1: 348 (2006, Volltext und Abstrakt) und in

Journal of Livestock Science, doi:10.1016/j.livsci.2008.02.001 (2008, Volltext und

Abstrakt) veröffentlicht.

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung und Literaturübersicht 1 2 Material und Methoden 16 2.1 Versuchstiere 16 2.1.1 Haltung und Fütterung 16 2.1.2 Versuchsablauf 16 2.1.3 Tierschutz, Tierbetreuung und Belastungsbeurteilung 17 2.2 Bestimmung von Metaboliten und Hormone im Blut 18 2.2.1 Glukose 18 2.2.2 Serumgewinnung 18 2.2.3 Leptin 18 2.2.4 Insulin 19 2.2.5 Freie Fettsäuren 19 2.3 Effekte einer Propionatinfusion auf das periphere Leptin-

system und Parameter des Glukosestoffwechsels bei der Ziege 20

2.3.1 Entwicklung von real-time RT-PCR Assays für Leptin (ob), die lange Form des Leptinrezeptors (ob-Rb), den G-proteingekoppelten Rezeptor 41 (GPR41) und die 18S rRNA 20

2.3.1.1 Mengenbestimmung und Kontrolle der RNA 20 2.3.1.2 Reverse Transkription (RT) 23 2.3.1.3 Zielgene und interne Kontrolle für die PCR 24 2.3.1.4 Real-time RT-PCR 27 2.3.1.5 Statistische Auswertung 33 2.3.2 Untersuchung von Leptin, Insulin und Glukose im Blut 34 2.3.2.1 Versuchstiere 34 2.3.2.2 Euthanasie und Entnahme der Gewebeproben 34 2.3.2.3 Infusionslösungen 35 2.3.2.4 Versuchsaufbau und Blutentnahmen 36 2.3.2.5 Statistische Auswertung 37 2.4 Untersuchung von Plasmaleptingehalt und Glukosestoff-

wechsel bei Ziegen peri partum 37 2.4.1 Versuchstiere 37 2.4.2 Hyperglykämischer Clamp und Euglykämisch/hyperinsulinämischer

Clamp 38 2.4.3 Messgrößen 40 2.4.4 Vergleichsgrößen der Clampstudien 41 2.4.5 Erfassung der Milchmenge und Laktosekonzentration 41 2.4.6 Statistische Auswertung 42

Inhaltsverzeichnis

3 Ergebnisse 43 3.1 Effekte intravenöser Propionatinfusionen auf verschiedene

Zielparameter 43 3.1.1 Beeinflussung der mRNA-Mengen in verschiedenen Geweben 43 3.1.1.1 Qualität der Gesamt-RNA 43 3.1.1.2 cDNA-Sequenz der langen Form des Leptinrezeptor und

putativen G-proteingekoppelten Rezeptor bei der Ziege 43 3.1.1.3 Gelelektrophorese der real-time PCR-Amplifikate 44 3.1.1.4 Ergebnisse der mRNA-Quantifizierung 48 3.1.1.4.1 Unterschiede der mRNA-Mengen in den Fettgeweben 48 3.1.1.4.2 Leptin 49 3.1.1.4.3 Lange Form des Leptinrezeptors 49 3.1.1.4.4 Putativer G-proteingekoppelter Rezeptor GPR41 49 3.1.2 Veränderungen spezifischer Blutparameter durch intravenöse

Propionatinfusion 51 3.1.2.1 Leptin 51 3.1.2.2 Insulin 51 3.1.2.3 Glukose 52 3.1.2.4 Freie Fettsäuren 52 3.2 Veränderungen im Glukosestoffwechsel bei trächtigen und bei

laktierenden Ziegen 54 3.2.1 Hyperglykämischer Clamp 54 3.2.2 Euglykämisch/hyperinsulinämischer Clamp 55 3.2.3 Leptin 56 3.2.4 Freie Fettsäuren 59 3.2.5 Einflüsse der Glukose- und Insulininfusion auf die Milchleistung 60 4 Diskussion 62 4.1 Quantifizierende real-time RT-PCR 62 4.2 Veränderungen durch Propionatinfusion und deren Einfluss

auf die Genexpression der untersuchten mRNA-Spezies 69 4.3 Veränderungen von Leptin und Insulin, sowie Einflüsse der

Galaktopoese bei der Ziege peri partum 82 5 Zusammenfassung 91 6 Summary 93 7 Literaturverzeichnis 95

Inhaltsverzeichnis

8 Tabellenverzeichnis 113 9 Abbildungsverzeichnis 114 10 Anhang 115

Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

ad lib. ad libitum ADP Adenosindiphosphat Aq. bidest. Aqua bidestillata ATP Adenosintriphosphat BCS Body conditioning score cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat cDNA komplementäre DNA CoA Coenzym A CT Threshold cycle CV Variationskoeffizient DEPC Diethylpyrocarbonat EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EST Expressed sequence tags FFA Free fatty acid GAPDH Glyceraldehyd 3-Phosphat Dehydrogenase GIR Glukoseinfusionsrate GDP Guanosindiphosphat GLM General linear model GLUT Glukosetransporter GTC Guanidinthiocyanat GTP Guanosintriphosphat HBW Hexosaminbiosyntheseweg HHG Haushaltsgene JAK Januskinase IRS Insulin-Rezeptorsubstrat LCFA Long-chained fatty acids MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase MCR Metabolic clearance rate of insulin MOPS 3-N-Morphlino-Propansulfonsäure mRNA Messenger RNA n Anzahl der Tiere NEFA Non-esterified fatty acid NSP Nutrient-sensing pathway r Korrelationskoeffizient rRNA Ribosomale RNA RT-PCR Reverse transcription PCR PCR Polymerase chain reaction qPCR Quantitative PCR SCFA Short-chained fatty acid SDR Systemic delivery rate of insulin SEM Standard Error of Means SGLT Sodium Glucose Cotransporter STAT Signal transducer and activator of transcription TGF-ß Transforming growth factor ß TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin TNFα Tumor Nekrose Faktor TS Trockensubstanz

Einleitung und Literaturübersicht 1

1 Einleitung und Literaturübersicht

Die Tierhaltung in der modernen Landwirtschaft steht großen Herausforderungen

gegenüber. Einerseits steigen die Anforderungen an Umwelt- und Tierschutz,

andererseits erfordert ein zunehmender Preis- und Konkurrenzdruck höhere

Produktionsleistungen. Um diesen Entwicklungen nachzukommen, und gleichzeitig

eine gute Tiergesundheit zu gewährleisten ist die Erforschung und das Wissen über

die genauen Zusammenhänge der Stoffwechselphysiologie und ihrer Regulation

wichtig.

Die Leistungen der Nutztiere werden durch die Parameter Wachstum, Laktation und

Reproduktion beschrieben, einhergehend mit hohen Stoffwechselraten der Tiere.

Voraussetzung dafür ist eine ausreichende Energieversorgung. Sie ist nicht nur für

die Aufrechterhaltung der Stoffwechselvorgänge bedeutsam, sondern ist auch direkt

mit der Tiergesundheit verbunden.

Eine mangelnde Versorgung resultiert nicht nur in verminderter Leistung, sondern

birgt auch gesundheitliche Risiken für den betroffenen Bestand. Energiedefizite

treten insbesondere bei hochleistenden Tieren auf (FUHRMANN et al., 1989). Bei

der Milcherzeugung, aber auch für die Reproduktion, ist dabei gerade der Zeitraum

um die Geburt eine besonders kritische Zeit in der Versorgung des Organismus

(DRACKLEY, 1999). Namentlich stellt das Fettmobilisationssyndrom der Milchkuh

ein Problem in der Milchviehwirtschaft dar, denn damit sind weitere Erkrankungen,

wie Endometritis, Mastitis oder Dislocatio abomasi verbunden (CAMERON et al.,

1998; DRACKLEY, 1999). Auch bei anderen landwirtschaftlichen Nutztieren sind

peripartale Stoffwechselerkrankungen bekannt, wie die Trächtigkeitstoxikose bei

Schaf und Ziege (BOSTEDT u. DEDIE, 1996).

Der Organismus ermöglicht einerseits die metabolische Anpassung des Organismus

an verschiedene Belastungszustände (z.B. Nahrungsmangel), und andererseits

gleichzeitig die Aufrechterhaltung der lebens- bzw. arterhaltenden Funktionen

(Reproduktion, Gravidität, Laktation, Wachstum). Diese homöorhetische Regulation

wird durch ein fein abgestimmtes Regelwerk von Faktoren und Hormonen

ermöglicht. Dabei wird die Nährstoffversorgung des Gewebes gewährleistet, das für

die jeweilige Stoffwechselleistung im Vordergrund steht („Nutrient partitioning“). Eine

hervorgehobene Bedeutung wird dabei dem Hormon Leptin zugeschrieben (zur

Übersicht: VERNON u. POND, 1997; INGVARTSEN u. BOISCLAIR, 2001).


Hauptsyntheseort für Leptin ist bei monogastrischen und ruminierenden Spezies das

weiße Fettgewebe (zur Übersicht: FRIEDMAN und HALAAS, 1998; CHILLIARD et

al., 2001; DELAVAUD et al., 2002). Das Fettgewebe synthetisiert zudem eine Reihe

von Hormonen, Vorläufern, Gewebshormonen und Zytokinen, wie z.B. Adiponektin,

Angiotensinogen, Transforming Growth Factor-ß (TGF-ß) und Tumor Nekrose

Faktor α (TNFα). Neben seiner Funktion als Energiespeicher, auf den im Bedarfsfall

zurückgegriffen wird, wirkt es als endokrines Organ in vielfältiger Weise auf den

Energiestoffwechsel und die Körperfunktionen.

Leptin (griech. leptos = schlank) ist ein niedermolekulares Protein und besteht aus

167 Aminosäuren. Am N-terminalen Ende trägt es eine Signalsequenz aus 21

Aminosäuren, welches bei der Translokation in Mikrosomen und anschließender

Exozytose entfernt wird. Das zirkulierende Peptid hat eine Größe von 146

Aminsäuren mit einer molekularen Masse von 14–16 kDa. Aufgrund von

Strukturähnlichkeiten wird es der Familie der Zytokine zugerechnet. Leptin ist das

Produkt des ob-Gens, (ob für griech. obesitas = Fettleibigkeit), welches 1994 von

ZHANG et al. sequenziert wurde. Das zirkulierende Hormon wird durch ein

spezifisches Bindungsprotein reguliert. Bei Ratten liegt 88% des zirkulierenden

Leptins frei, und bei Menschen 24% in gebundener Form vor. Die Halbwertszeit des

Proteins beim Menschen liegt im Durchschnitt bei 25 Minuten. Bei Nagern verlängert

sich durch die Bindung die Halbwertszeit von 3,4 min auf 71 Minuten. (GARCIA et

al., 2002; MAČAJOVA et al., 2004; LIEFERS et al., 2005; ZIEBA et al., 2005).

Die Expression von Leptin in verschiedenen Fettdepots differiert zwischen den

Tierarten. CHELIKANI et al. (2003a) wiesen Leptin-mRNA bei Rindern in

subkutanem, perikardialem, perirenalem und mesenterialem Fettgewebe nach.

Konzentrationsunterschiede zwischen den Depots bestanden dabei nicht. Dies

bestätigt die Untersuchungen nach JI et al. (1998), die ebenfalls beim Rind keine

Unterschiede zwischen Unterhautfett, omentalem und perirenalem Fettgewebe

nachweisen konnten. Nach KIM et al. (2000) ist jedoch die Expression in perirenalem

Fett höher gegenüber anderen Fettdepots. Hingegen wurde bei Schafen eine

tendenziell höhere, und bei Ziegen signifikant höhere mRNA-Menge im subkutanen

Fettgewebe gegenüber perirenalem Fettgewebe gezeigt (KUMAR et al., 1998;

CHILLIARD et al., 2001). Angaben über die Expression im mesenterialen

Fettgewebe machen die Autoren nicht. Leptin-mRNA wurde außerdem in


Eutergewebe, Skelettmuskulatur, Plazenta, Magen-/ Pansenschleimhaut, braunem

Fettgewebe und Gehirn nachgewiesen (CHILLIARD et al., 2001; BARTHA et al.,

2005).

Die Hormonaktivität von Leptin wird durch membranständige Rezeptoren vermittelt.

Diese werden durch das db-Gen codiert. Man unterscheidet mindestens sechs

Isoformen, deren mRNAs durch alternatives Splicing entstehen. Die extrazelluläre

Domäne ist bei allen identisch. Sie unterscheiden sich durch ihre Transmembran-

und intrazelluläre Domäne, und werden als Splice-Varianten a bis f des Ob-R

bezeichnet (FRUHBECK, 2006).

Durch Bindung von Leptin kommt es zur Rezeptordimerisierung. Im intrazellulären

Bereich binden Abschnitte des Rezeptors an Janus-aktivierte Proteinkinasen (JAK).

Diese werden durch Bindung eines Dimers aktiviert. Die JAK wiederum aktiviert den

Signaltransduktions- und Transkriptions (STAT)-Mechanismus, der die Expression

von Genen steuert. Ein weiterer Weg der Signaltransduktion ist die Aktivierung der

mitogenaktivierten Proteinkinase (MAPK) durch die JAK (HOUSEKNECHT u.

PORTOCARRERO, 1998; ZABEAU et al., 2003).

Der Ob-Rb ist durch eine lange intrazelluläre Domäne charakterisiert, und wird

deshalb auch als die lange Form des Leptinrezeptors bezeichnet. Synonym werden

die Bezeichnungen, ob-Rl und LR geführt. Er wird bei Rind und Monogastriern in

einer Vielzahl von Geweben nachgewiesen. Beim Rind wird ob Rb unter anderem im

weißen Fettgewebe, in Skelettmuskulatur, Leber, Milz, Hoden, Hypophyse,

Blutgefäßen und Lunge, sowie im Euterparenchym beobachtet. Der ob-Rb aktiviert

den JAK-STAT und MAPK-Mechanismus. Aufgrund seines Vorkommens in vielen

Geweben ist der ob-Rb somit bestimmend für die Aktivität von Leptin in der

Körperperipherie (zur Übersicht: TARTAGLIA, 1997; INGVARTSEN u. BOISCLAIR,

2001; ZABEAU et al., 2003; FRUHBECK, 2006).

Die Splice-Variante Ob-Ra wird bei der Ratte im Hypothalamus und

Hypophysenvorderlappen, sowie in geringen Mengen in Lunge, Niere, Pankreas,

Leber und Fettgewebe gebildet (LOLLMANN et al., 1997). Nach CHELIKANI et al.

(2003a) wird ob-Ra beim Rind in der Hypophyse, Leber, Milz, Nebennierenrinde und

Hirnstamm exprimiert. YONEKURA et al. (2003) zeigten in boviner Hypophysen-

zellkultur, dass die Ob-Ra-Expression durch die Gabe von Butyrat gesenkt wird. Dies


spricht für eine Rolle des Rezeptors bei der zentralnervösen Steuerung der

Energiehomöostase.

Der Ob-Re wird auch als sekretorischer Leptinrezeptor bezeichnet. Seine Expression

steht im Zusammenhang mit Körpermasse, Trächtigkeit und Energieaufnahme. Dem

Ob-Re wird die Rolle als Bindungsprotein für freies Leptin im Blutplasma

zugeschrieben. Beim Menschen konnte dadurch eine Bedeutung bei der Regulation

der Leptinwirkung und Leptinsensitivität gezeigt werden (GAVRILOVA et al., 1997;

LEWANDOWSKI et al., 1999; YANNAKOULIA et al., 2003, YANG et al., 2004). Für

die kurzen Formen Ob-Rc, d und f ist keine Funktion bekannt.

Die allgemeinen Funktionen und Wirkungen von Leptin werden im Folgenden

skizziert. Leptin ist an der Regulation der Energiehomöostase, Steuerung der

Reproduktion, und der kardiovaskulären Entwicklung (z.B. Wundheilung), sowie der

renalen Funktion und der Immunantwort beteiligt (FRUHBECK, 2006). Die primäre

Wirkung des Leptins liegt in der Regulation der Nahrungsaufnahme und

Energiehomöostase. Diese wird hauptsächlich zentralnervös über das

Hypothalamus-Hypophysensystem vermittelt. Im Hypothalamus wird die

Ausschüttung orexigener Neuropeptide vermindert, und die der anorexigenen erhöht.

Gleichzeitig beeinflusst es Wachstum, Stoffwechsel und Fortpflanzung, indem

verschiedene hypothalamische Hormone moduliert werden.

Dabei wird Leptin durch einen negativen Feed-back-Mechanismus reguliert. Seine

Wirkung wird wiederum über diese erhöhten und erniedrigten Plasmaleptinspiegel

gesteuert. Diese Verhältnisse sind sowohl in Monogastriern, als auch bei

Wiederkäuern zu finden (zur Übersicht: INGVARTSEN und BOISCLAIR, 2001).

Für Leptin sind sowohl endokrine, als auch parakrine und autokrine Wirkungen und

Regulation beschrieben (WANG et al., 1999a; CHILLIARD et al., 2001). Bei

Wiederkäuern wird Leptin unabhängig von Tagesrhythmus sezerniert.

(INGVARTSEN u. BOISCLAIR, 2001; ZIEBA et al., 2005).

Beim Rind konnte nachgewiesen werden, dass Polymorphismen des Leptingens in

Zusammenhang mit der Fruchtbarkeit und Leistungsparametern bei den Fleisch- und

Milchrinderrassen stehen, insbesondere mit der Milchmenge, Energieverteilung und

postpartalen Gelbkörperaktivität (LIEFERS et al., 2005).

DELAVAUD et al. (2002) beschreiben, dass bei Wiederkäuern der

Plasmaleptingehalt durch mehrwöchige Futterrestriktion gesenkt wurde, der nach


Anfüttern in einigen Tagen wieder anstieg. Der Plasmaleptingehalt war dabei positiv

mit der Fettzellgröße und dem Body-conditioning-score (BCS) korreliert. Schon bei

geringer Futterrestriktion kam es jedoch zum Rückgang des Plasmaleptinspiegels,

ohne eine Änderung der Fettzellgröße oder des BCS herbeizuführen. Die

Nahrungsaufnahme führte bei gut genährten Rindern zu einem Abfall sowohl des

Plasmaleptin-, als auch des Glukosespiegels. Bei schlecht genährten Tieren kam es

dagegen zu einem Anstieg von Plasmaleptin, und einem Erhalt der

Blutglukosekonzentration. Die Konzentration an ß-Hydroxybutyrat und der

Plasmaleptinspiegel nach Nahrungsaufnahme hingegen waren negativ korreliert.

Einen Zusammenhang zwischen dem präprandialen Plasmaleptinspiegel und ß-

Hydroxybutyrat wiesen die Autoren nicht nach. Die Autoren vermuten, dass die

postprandialen Veränderungen der Glukose- und ß-Hydroxybutyratkonzentrationen

zu einer Veränderung der Glukoseaufnahme im Fettgewebe führen, die die

Leptinkonzentration beeinflusst, und so mittelfristig regulierend auf die

Leptinsekretion bei Wiederkäuern wirken.

Da bei Kühen mit geringem Körperfettanteil der niedrige Plasmaleptingehalt jedoch

nicht durch Futterentzug beeinflusst wird, schlussfolgern DELAVAUD et al. (2002),

dass langfristige Effekte von größerer Bedeutung in der Regulation sind, als

mittelfristige.

Bei der energetischen Regulation konnten für dieses Hormon zudem vielfältige

Effekte und Wechselwirkungen mit Hormonen und Metaboliten nachgewiesen

werden. Aufgrund der Komplexität des Systems wird bei der Beschreibung vor allem

auf jene Wirkungen eingegangen, die direkt mit dem Glukose- und Fettstoffwechsel

im Zusammenhang stehen.

Von diesen direkten Wirkungen auf Zellen verschiedener Gewebe sind für die

Regulation der Energiehomöostase die Wirkungen auf den Lipid- und Kohlenhydrat-,

sowie den Intermediärstoffwechsel des Muskelgewebes von besonderem Interesse.

In einer Studie über die Effekte von Insulin und Leptin auf die Leptinsynthese in

Skelettmuskelzellen von Ratten, stimulierte Leptin die Glukoseaufnahme, -oxidation

und Glykogensynthese (CEDDIA et al. 1999). SWEENEY et al. (2001) konnten

jedoch in der Myozytenzellkultur zeigen, daß Leptin keinen Einfluss auf die basale

Glukoseaufnahme, sowie die GLUT4-Translokation (Glucosetransporter 4) ausübt,

aber über verschiedene Wege den insulinabhängigen Glukosetransport senkt.


Infolgedessen scheint der Einfluss von Leptin auf den Glukosestoffwechsel indirekt

über Insulin zu erfolgen.

Zusamenfassend scheint Leptin von grundsätzlicher Bedeutung für die Ausbildung

einer verminderten systemischen Insulinsensitivität. Ein mögliches Schlüsselenzym

bei der Ausbildung leptinassoziierter Insulinresistenz ist die Stearoyl-CoA

Desaturase-1, die in der Leber durch Leptin gehemmt wird (COHEN et al., 2002;

COHEN u. FRIEDMAN, 2004).

Gleichzeitig führt Leptin zur Senkung des Plasmaspiegels von Insulin, der

Triacyglyzeride (TAG) und Glukose, und einer Erhöhung des ß-Hydroxybutyrat-

Spiegels. Bei Rindern wiederum wurde eine positive Wirkung des Plasmaleptins auf

die Glykämie und eine negative Korrelation zu ß-Hydroxybutyrat im Plasma in Folge

der Nahrungsaufnahme beobachtet (CHILLIARD et al., 2001).

WANG et al. (1999b) zeigten allerdings bei Ratten, dass Leptin die

Glukoseverwertung im Muskel- und braunen Fettgewebe erhöht, im weißen

Fettgewebe jedoch reduziert. Es bestehen somit gewebespezifische Unterschiede in

der Beeinflussbarkeit durch Leptin, was einen Erklärungsansatz für die teilweise

gegensätzlichen Wirkungen des Leptins im Energiestoffwechsel bildet. Diese

Gewebespezifität weist auf die Bedeutung dieses Hormons bei der Steuerung des

Nutrient partitioning. Freie Fettsäuren (FA) und Lipide im Blutplasma werden durch

Leptin gesenkt, indem es in monogastrischen Muskel- und Leberzellen die FA-

Oxidation erhöht und FA-Veresterung hemmt (SHIMABUKURO et al. 1997;

MINOKOSHI et al., 2002).

Bei trächtigen Ziegen wird durch exogene Leptingabe die Fettsäurenkonzentration im

Blut gesenkt, und die Insulinsensitivität erhöht, während bei laktierenden Ziegen, die

Fettsäuren unbeeinflusst bleiben, und die Insulinsensitivität reduziert wird

(HEINTGES, 2003).

Die Mechanismen der gegenseitigen Beeinflussung von Leptin und Insulin sind noch

nicht abschließend geklärt. Während HOUSEKNECHT et al. (2000) die Erhöhung der

Leptin-mRNA in boviner Adipozytenkultur durch Insulin nachwiesen, zeigten RICCI et

al. (2005), dass die insulininduzierte Leptinerhöhung in der Fettzellkultur von Ratten

und Menschen nicht über die Genexpression, sondern durch posttranskriptionale

Mechanismen reguliert wird.


Leptin ist mit Körperfettgehalt, Energiebalance und Höhe der Nahrungsaufnahme

positiv korreliert (KUMAR et al., 1998; DELAVAUD et al., 2002; GEARY et al. 2003).

Der Einfluss von Adipositas auf den Plasmaleptingehalt wurde in den Studien von

DELAVAUD et al. (2000 und 2002) und EHRHARDT et al. (2003) mit 17% bis 35%

angegeben. Allerdings zeigten EHRHARDT et al. (2003) bei nichtruminierenden

Schaflämmern, die physiologisch mit sehr geringem Körperfettgehalt geboren

werden, dass deren Plasmaleptinspiegel vom Ernährungsniveau dominiert wird.

Über die Regulationsmechanismen der Leptinsynthese in peripheren Geweben und

physiologische Zusammenhänge auf zellulärer Ebene, ist beim Wiederkäuer noch

wenig bekannt. Grundsätzlich kann der Plasmaleptinspiegel durch transkriptionale,

posttranskriptionale und posttranslationale Mechanismen gesteuert werden (GARCIA

et al., 2002; LIEFERS et al., 2005; RICCI et al., 2005). Neben hormonellen

Mechanismen wurde zudem bei Rodentia auch eine Autoregulation durch negativen

feed-back im Fettgewebe nachgewiesen, d.h. Plasmaleptin hemmt die

Leptinexpression im Fettgewebe. Da es gleichzeitig die Expression im Skelettmuskel

einleitet, wird dieser Regulationskreis als weiteren Einfluss auf das Nutrient

partitioning angesehen (WANG et al., 1999a; CHILLIARD et al., 2001).

Von größerer Bedeutung für die Regulation der Leptinsynthese sind Nutrient sensing

pathways (NSP). Beim Monogastrier konnte gezeigt werden, dass Glukose

bedeutende Effekte auf die Regulation der Leptinsynthese hat (ZHANG et al., 2002).

Bei Mensch und Nagetieren wurde in vivo wie auch in vitro eine Erhöhung der Leptin-

mRNA und des Proteins im Fettgewebe, sowie des Plasmaleptingehaltes, durch

Infusion von Insulin und Glukose nachgewiesen (MALMSTROM et al., 1996;

MIZUNO et al., 1996; WANG et al., 1998). Auch durch eine übermäßige Zufuhr von

freien Fettsäuren bzw. Glukose oder Glukosamin konnte die Leptinexpression

gesteigert werden (EMILSSON et al., 2001; WANG et al., 1998).

Diese Stoffwechselwege beeinflussen direkt die Leptinsynthese, und bilden somit ein

wichtiges Bindeglied zwischen Nahrungsangebot und –aufnahme, und hormoneller

Steuerung des Energiestoffwechsels. Insbesondere wird der Erforschung von NSP

im Zusammenhang mit der Entstehung von Diabetes Typ 2 Bedeutung beigemessen.

Ein bedeutender Pfad ist der Hexosaminbiosyntheseweg (WANG et al., 1998;

EMILSSON et al., 2001). Schlüsselenzym ist die GFAT (Glutamin:Fruktose-6-

phosphat-Amidotransferase). Als Substrat wird Glukose durch Konjugation mit einer


Aminogruppe zu Glukosamin umgebildet. Dieses wird durch Konjugation mit

Uridinphoshat zu einer aktivierten Verbindung. Durch Glykolysierung von Proteinen

können diese reguliert werden. Die Relevanz als Nahrungssensor für Glukose ist

nicht abschließend geklärt (BOSCH et al., 2003 und 2004). POUWELS et al. (2004)

schreiben dem Hexosaminbiosyntheseweg beim Menschen eine Funktion als NSP

für freie Fettsäuren im Fettgewebe zu.

Während jedoch beim Monogastrier ein Zusammenhang zwischen Leptin und der

Entstehung von Insulinresistenz bekannt ist, gibt es für die Wiederkäuer bisher nur

wenige Untersuchungen. Allgemein wird bei den Ruminantia der Blutglukosespiegel

vornehmlich über das Verhältnis von Glucagon und Insulin und die hepatische

Glukoneognense beeinflusst. Dem Insulin wird bei der Regulation der Steuerung der

Glukoseversorgung nur eine untergeordnete Rolle zugeschrieben, wobei die

Zellaufnahme von Glukose in der Körperperipherie grundsätzlich den gleichen

Mechanismen unterliegt (SALLMANN u. FUHRMANN, 2000).

Bei Rindern stimuliert Leptin in einer mittleren Konzentration die Insulinsekretion,

während bei hohen und niedrigen Konzentrationen nur geringe Veränderungen

auftreten. ZIEBA et al. (2005) werten dies so, dass Leptin die Insulinsekretion

normalisiert, und Entgleisungen der Insulinsynthese möglicherweise durch eine

verminderte Leptinsensitivität ausgelöst sein können.

Bei Nagetieren und Menschen wurde schon frühzeitig nachgewiesen, dass eine

supraphysiologische Hyperinsulinämie zu einer Erhöhung der

Plasmaleptinkonzentration führt. Diese Effekte treten jedoch nach mehreren Stunden

auf (4 Stunden) (UTRIAINEN et al., 1996). Der Einfluss von Glukose und Insulin auf

die Leptinsekretion bei Wiederkäuern wurde von verschiedenen Autoren untersucht.

KAUTER et al. (2000) und GABAI et al. (2002) konnten durch Insulininfusion keine

Erhöhung der Leptinsekretion nachweisen. LEURY et al. (2003) konnten nach 24

Stunden euglykämisch-hyperinsulinämischer Clamps eine Erhöhung des

zirkulierenden Leptins nachweisen.

Bei verschiedenen Autoren ist der ältere Begriff der volatile (engl.) oder flüchtigen

Fettsäuren (VFA) für Fettsäuren aus der Wiederkäuervormagenfermentation

gebräuchlich. Zudem findet in der Literatur der Begriff NEFA für freie, nicht veresterte

Fettsäuren Verwendung. In dieser Arbeit wird der Begriff der kurzkettigen Fettsäuren

(SCFA) verwendet für Fettsäuren mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen (BREVES, 2000;


XIONG et al., 2004; COVINGTON et al., 2006). Fettsäuren in ungebundener Form

mit mehr als 12 Kohlenstoffatomen werden als langkettige Fettsäuren (LCFA)

bezeichnet. Aus Gründen der Genauigkeit ist allerdings in Zitaten die Begrifflichkeit

der Autoren übernommen worden, und die Bezeichnungen werden dadurch teilweise

synonym gebraucht.

Die Nährstoffversorgung der Wiederkäuer erfolgt über die SCFA aus der

Vormagenfermentation. Hauptmetaboliten sind Azetat, Propionat und Butyrat, aber

auch Valerat und dessen Derivate, die jedoch im Stoffwechsel eine untergeordnete

Rolle spielen. Wenngleich Azetat prozentual überwiegt, ist besonders Propionat für

die Energieversorgung wichtig. Die Glukosebereitstellung der Wiederkäuer ist

vollständig von der hepatischen Glukoneogenese abhängig. Propionat dient als

Substrat, welches, als Succinyl-CoA, über Oxalazetat der Glukoneogenese zugeführt

wird und somit der Glukosebildung (glukoplastisch) dient. Wenngleich es Hinweise

gibt, wonach auch Azetat zur Glukosebildung herangezogen wird, wird der

überwiegende Anteil und Butyrat in den Mitochondrien als Acetyl-CoA im Citratzyklus

metabolisiert (BREVES, 2000; SALLMANN u. FUHRMANN, 2000; KIM et al., 2005).

Die Anteile der unterschiedlichen SCFA aus der mikrobiellen Fermentation im

Pansen unterliegen Schwankungen. Die Synthese ist vom Substrat abhängig und

erfolgt über unterschiedliche Stoffwechselwege. Diese Schwankungen werden durch

das Azetat-Propionat-Verhältnis charakterisiert. Raufaserreiches Futter führt zu

einem Anstieg des Azetatanteiles, energiereiches oder fein gemahlenes Futter führt

zu einem relativen Anstieg von Propionat (MENKE u. HUSS, 1987).

Propylenglykol (1,2-Propandiol) ist eine glukoplastische Verbindung, die zur

Vorbeugung und Behandlung von Ketosen in der Frühlaktation bei Milchkühen

eingesetzt werden kann. Die Ketose wird auf eine Hyperlipidämie in Folge von

peripherer Insulinresistenz zurückgeführt. In ihren Untersuchungen beim Rind wiesen

CHRISTENSEN et al. (1997) durch die Propylenglykolbehandlung einen Abfall von

Azetat nach, und eine Erhöhung des Azetat-Propionat-Verhältnisses. Der

Insulinspiegel wurde erhöht, und die NEFA-Konzentration (non-esterified fatty acids)

fiel ab. KIM et al. (2005) untersuchten weiter Effekte von Propylenglykol auf die

Leptinsynthese bei Rindern. Sie bestätigten die Untersuchungen von

CHRISTENSEN et al. (1997), und wiesen zudem eine Erhöhung des Anteiles von

Propionat im Pansen nach. Die Messung der Leptin-mRNA im Unterhautfett zeigte


keine Veränderungen. Allerdings führte die Behandlung zum Anstieg der Leptin-

mRNA im intramuskulären Fettgewebe.

LEE u. HOSSNER (2002) zeigten einen Anstieg der Leptin-mRNA im Fettgewebe

zwei Stunden nach Propionatinfusion. Die Autoren postulieren, dass dieser nicht

allein durch die Insulinwirkung zu erklären ist. In der Hypophysenzellkultur und in

Adipozytenkultur des Rindes konnte ebenfalls eine Erhöhung der Leptin-mRNA

durch kurzkettige Fettsäuren gezeigt werden. Demgegenüber senken LCFA die

Leptin-mRNA Konzentration (YONEKURA et al., 2003; SOLIMAN et al., 2007).

Allerdings bestreiten BRADFORD et al. (2006) eine bedeutende Rolle von Propionat

für die Leptinexpression. Intravenöse Bolusinfusion von Propionat hatte einen Abfall

der Plasmaleptinkonzentration zu Folge. Die intraruminale Infusion von Propionat

führte zu keiner relevanten Erhöhung der Plasmaleptinkonzentration.

Weitere Erklärungsansätze für die Zusammenhänge zwischen Energie-, Insulin- und

Leptinstoffwechsel ergaben sich aus der Erforschung der Signalwege verschiedener

Rezeptoren. Dabei rückten insbesondere Rezeptoren aus der Superfamilie der G-

proteingekoppelten Rezeptoren (GPR) in den Blickpunkt.

Von den verschiedenen Familien ist die große Gruppe der heterotrimeren G-Proteine

in die Regulation verschiedenster Stoffwechselvorgänge eingebunden, und verfügt

über eine dementsprechende Vielzahl von Liganden, und bildet therapeutisch

bedeutsame, pharmakologische Angriffspunkte. Beispielhaft sei an dieser Stelle auf

die muskarinergen und adrenergen Rezeptoren des vegetativen Nervensystems

verwiesen.

Alle heterotrimeren GPR bestehen aus drei Untereinheiten (α,β und γ), und sind in

der Zellmembran lokalisiert. Die Rezeptoren sind schleifenförmig aufgebaut, mit

einem extrazellulären N-Terminus und intrazellulären C-Terminus. Dazwischen

liegen 7 Transmembrandomänen. Die Bindung eines Liganden führt zur

Konformationsänderung des Rezeptors. Über die darauffolgende Assoziation und

Dissoziation der α-Untereinheit und den Austausch von GDP (Guanosindiphosphat)

durch GTP (Guanosintriphosphat), wird die α-Untereinheit aktiviert. Dieser Komplex

reguliert in der Signalkaskade, unter Abspaltung von Phosphat, weitere Enzyme, wie

die Phospholipasen A und C (PLA und PLC), die MAPK oder die Adenylatzyklase

(LOEFFLER, 1998a; ROZENGURT, 2007).


In den letzten Jahren wurde eine Reihe von GPR durch Klonierung identifiziert, für

die bisher keine Liganden bekannt waren. Diese werden als „orphan GPRs“

bezeichnet (orphan (engl.) = Waise) (LE POUL et al, 2003), und werden durch

Nummerierung unterschieden. Für eine Reihe dieser Rezeptoren konnten kurz-,

mittel- und langkettige Fettsäuren als Liganden nachgewiesen werden, die als

GPR40, 41, 42 und 43 klassifiziert sind (BRISCOE et al., 2003; BROWN et al., 2003;

LE POUL et al., 2003). Ihre Expression kann in verschiedenen Geweben

nachgewiesen werden, wie in den Granulozyten des Blutes und in Adipozyten. Ihrem

Vorkommen in Abwehrzellen wird eine nutritiv-regulative Rolle bei der Immunantwort

zugesprochen. Im Fettgewebe ist der GPR41 von besonderem Interesse, da dieser

Rezeptor die Leptinexpression im Fettgewebe und Plasmaleptingehalte bei Mäusen

erhöht, und somit von Bedeutung für die hormonelle Kopplung von

Nahrungsaufnahme und Energiestatus des Körpers sein könnte. Die höchste

Stimulation wird durch Propionat erreicht (XIONG et al., 2004). In Anbetracht dessen,

und der Bedeutung von Propionat beim Wiederkäuer, ist die Untersuchung des

GPR41 bei dieser Tiergruppe von großem Interesse.

Zur Klassifizierung des G-Proteins des GPR41 konnte in Untersuchungen mit

Pertussistoxin die Funktion dieses Rezeptorproteins aufgehoben werden.

Pertussistoxin hemmt spezifisch die G-Proteine der Gi/0-Familie (BROWN et al.,

2003). LE POUL et al. (2003) wiesen außerdem den Abfall des intrazellulären

zyklischen Adenosinmonophosphats (cAMP), die Bildung von Inositol-(1,4,5)-

Triphosphat (‚IP3) und Freisetzung des intrazellulären Ca2+ und die Phosphorylierung

zweier MAPK (p42 und p44), nach. Dies weist darauf hin, dass der GPR41 über drei

verschiedene intrazelluläre Signalkaskaden, die Hemmung der Adenylatzyklase,

sowie die Aktivierung der Phosphatidylinostol 3-Kinase (PI3-K), die wiederum durch

die Phospholipase C aktiviert wird, und einer MAPK, verfügt. Nach BROWN et al.

(2005) kann somit der GPR41 der Familie der (inhibitorischen) Gαi-assoziierten

Rezeptoren zugeordnet werden.

Verschiedene Autoren wiesen wechselseitige Beeinflussung der GPR und

Insulinrezeptoren nach (MOXHAM u. MALBON, 1996; KATADA et al., 1999; YU et

al., 2001). Aufgrund des funktionellen Zusammenhangs von Leptin und Insulin, und

der nachgewiesenen Sekretion von Leptin durch den GPR41, untersuchten XIONG

et al. (2004) mögliche Einflüsse von Insulin auf die Rezeptoraktivität. Dabei konnten

sie zeigen, dass die Leptinproduktion bei geichzeitiger Gabe von Propionsäure und


Insulin mehr als nur additiv erhöht war, und schließen danach auf Wechselwirkungen

zwischen Insulin und GPR41.

Der Insulinrezeptor ist ein tetrameres Molekül aus zwei identischen Teilen bestehend

aus je einer α- und β-Untereinheit. Die β-Untereinheiten durchziehen die

Cytoplasmamembran, während die beiden α-Untereinheiten extrazellulär gelegen

sind. Hier sind die beiden Teile durch eine Disulfidbrücke miteinander verbunden.

Insulin bindet an die α-Einheiten. Eine Konformationsänderung aktiviert intrazellulär

eine Tyrosinkinase. Nach der Phosphorylierung bindet das spezifische Protein IRS-1

(Insulin Rezeptor Substrat). Durch Phosphorylierung werden verschiedene Enzyme

wie die PI3-K, aktiviert (PLUM et al., 2006; KASHYAP u. DEFRONZO, 2007).

Mögliche Kreuzungspunkte der Signaltransduktion bildet bei den Monogastriern

dieses Enzym. In Untersuchungen an kultivierten humanen Adenokarzinomzellen

bestätigten KISFALVI et al. (2007), dass über die PI3-K der G-proteinvermittelte

Rezeptormechanismus und der Insulinrezeptor kommunizieren können. Der genaue

Mechanismus der Beeinflussung, die Verhältnisse am GPR41 in den Adipozyten und

die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf die Wiederkäuerzellen jedoch erfordern noch

weitere Untersuchungen (s. Abb.1).

Auf die Zusammenhänge von Insulin, Glukose, Fett und Fettsäuren auf der einen,

und Leptin auf der anderen Seite, wurde im Vorhergehenden eingegangen. Neben

der energetischen Regulation, ist dieser Sachverhalt insbesondere in der

Trächtigkeit, in der Laktation, und in der Umstellung des Metabolismus im Zeitraum

der Geburt wichtig. Dem Wechsel zwischen erhöhter und verminderter Leptin- und

Insulinresistenz in diesen Stadien, wird eine tragende Rolle beigemessen.

Bei Schafen steigt zirkulierendes Leptin zu Beginn der Trächtigkeit an, und bleibt bis

zur Geburt erhöht. Auch bei Kühen ist die Leptinplasmakonzentration im Verlauf der

späten Trächtigkeit bis vor der Geburt erhöht. Nach LIEFERS et al. (2005) ist dies

nach den bisherigen Kenntnissen auf einen Anstieg des Körperfettanteils einerseits,

andererseits auf eine Leptinresistenz zurückzuführen. Als Ursache konnte beim

Schaf in diesem Zeitraum mehr Bindungsprotein nachgewiesen werden, bei der

Ratte konnte zudem eine Abnahme der Ob-Rb-Expression, und verminderter

Transport über die Blut-Hirn-Schranke gezeigt werden. Dies führt aufgrund eines

geringen Feed-back zu einer Erhöhung der Leptin-mRNA-Expression im Fettgewebe.

Diese Expression wird durch Insulin nicht beeinflusst (CHILLIARD et al., 2005;

LIEFERS et al., 2005).


Um den Geburtszeitraum fällt Plasmaleptin innerhalb von 3-4 Wochen bei Kühen ab

(BLOCK et al., 2001; CHILLIARD et al., 2005; HACHENBERG et al., 2007). Beim

Schaf sind ähnliche Verhältnisse zu sehen, allerdings hängt der Abfall sehr von der

Energiezufuhr ab. Während der ersten drei Laktationswochen sind Leptin-mRNA und

-protein in allen Fällen niedrig (CHILLIARD et al., 2005).

Für den Verlauf der Leptinwerte peri partum bei der Ziege gibt es die Besonderheit,

dass sich bei diesen Tieren, im Gegensatz zu zum Rind, die frühe Trächtigkeit und

späte Laktation überschneiden. Vermutlich sind die Regulationsmechanismen

grundsätzlich dieselben, es überdecken sich aber dabei verschiedene Effekte.

Bei nulliparen Ziegen verläuft die Leptinkurve mit einem Anstieg um die Mitte der

Trächtigkeit, und einem deutlichen Abfall im Übergang zur Laktation. Bei primiparen

laktierenden, trächtigen Ziegen gibt es keinen Anstieg des Leptinspiegels in der

Abb. 1: Schematische Darstellung der Signalkaskaden des GPR41 und der möglichen

Überkreuzung der Signalwege mit dem Insulinrezeptor durch Stimulation der PI-

3K.

Erklärung: Giα: α-Untereinheit des inhibitorischen G-Proteins; Adenzyk.:

Adenylatzyklase; PLC: Phopholipase C; IRS-1: Insulin Rezeptorsubstrat 1; PI3-K:

Phospatidylinositol 3-Kinase; IP3: Inositol Triphosphat; MAPK: mitogen-aktivierte

Proteinkinase; PP: Pyrophosphat

(In Anlehnung an: LOEFFLER, 1998a; BROWN et al., 2005; PLUM et al., 2006;

KASHYAP u. DEFRONZO, 2007; ROZENGURT, 2007)

GTP

Giα Giα

Propionat

GTPGDP

Giα

GTP

PLC↑

GTP

Adenzyk.↓

ATP

GPR41

cAMPP P PI3-K↑

IP3 ↑ Ca++ ↑

MAPK ↑

Insulin

Insulinrezeptor

PPP P

P

PI3-K↑

IRS-1

extrazellulär

intrazellulär

GTP

Giα Giα

Propionat

GTPGDP

Giα

GTP

PLC↑

GTP

Adenzyk.↓

ATP

GPR41

cAMPP P PI3-K↑

IP3 ↑ Ca++ ↑

MAPK ↑

Insulin

Insulinrezeptor

PPP P

P

PI3-K↑

Insulin

Insulinrezeptor

PPP P

P

Insulin

Insulinrezeptor

PPP P

P

PI3-K↑

IRS-1

extrazellulär

intrazellulär


Trächtigkeit, die Kurve fällt jedoch zu Beginn der Laktation ebenfalls leicht ab.

Vergleicht man laktierende primipare trächtige Tiere mit laktierenden primiparen

güsten Tieren, kommt es nach dem Trockenstellen bei Letzteren zu einem Anstieg

von Leptin auf das Vierfache, während bei den trächtigen Ziegen, Leptin auf

demselben Niveau bleibt.

Fasst man diese Ergebnisse zusammen, zeigt sich, dass die späte Laktation einen

dominierenden Effekt darstellt, in dem der Leptinspiegel auf einem niedrigen Niveau

verläuft. Dieser Effekt überwiegt den Anstieg in der Trächtigkeit. Dies zeigt zum

einen, dass unterschiedliche Regulationsmechanismen durch Laktation und

Trächtigkeit bestehen. Zum anderen sind dies weitere Hinweise auf die Bedeutung

von Leptin beim Nutrient partitioning. Zusammen mit den erwähnten Untersuchungen

von WANG et al. (1999b) und ZIEBA et al. (2005) zeigt dies, dass dieser niedrige

Leptinspiegel in der Laktation für die Entstehung der Insulinresistenz in der Laktation

verantwortlich sein kann (BONNET et al., 2005; CHILLIARD et al., 2005).

Nach LIEFERS et al. (2005) könnte ein Teil des Leptinabfalls zu Beginn der Laktation

durch den Abbau von Fettgewebe in Folge negativer Energiebalance entstehen.

Wenn bei laktierenden Ratten oder Rindern die Laktogenese verhindert wird, und

somit der Energieverlust über die Milch abfällt, steigt der Plasmaleptinspiegel

(BLOCK et al., 2001). Nach LIEFERS et al. (2005) zeigt dies, dass die energetische

Situation den Abfall von Leptin beeinflusst. Außerdem führt erniedrigtes Insulin zu

einem Abfall von Leptin, sich also Leptin und Insulin gegenseitig beeinflussen

(BLOCK et al., 2003; LIEFERS et al., 2005). Wenngleich einzelne Zusammenhänge

bereits gezeigt werden konnten, ist das Zusammenspiel dieser Komponenten in der

homöorhetischen Gesamtbetrachtung noch nicht hinreichend bekannt.

In dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit eine intravenöse Kurzzeitinfusion

von Propionat, als dem Hauptmetaboliten der ruminalen Energieversorgung, Einfluss

auf die Leptinsynthese im Fettgewebe von Ziegen hat. Um die Rolle der

Leptinsynthese und der –sekretion abschätzen zu können, wurde sowohl die mRNA,

als auch das Protein, im Kontext der Veränderungen von Insulin, Glukose und freien

langkettigen Fettsäuren, im Blut gemessen. Zudem sollten mögliche Einflüsse auf

periphere Regulationsmechanismen durch die Propionatinfusion untersucht werden.

Dazu wurde die Menge der Ob-Rb-mRNA und des GPR41 im Fettgewebe

quantifiziert.


Ein weiteres Ziel war, die Zusammenhänge zwischen Insulinsensitivität und

Plasmaleptinspiegel bei graviden und frühlaktierenden Ziegen zu beleuchten. Im

Fokus stand dabei auch der mögliche Einfluss des Glukoseeffluxes über die Laktose

in der Milchsynthese.

Material und Methoden 16

2. Material und Methoden

2.1 Versuchstiere

2.1.1 Haltung und Fütterung

Die Tiergruppen beider Versuche wurden in einem Laufstall auf Stroheinstreu

gehalten. Heu stand in zwei Raufen zur freien Verfügung und wurde durch die

tägliche Gabe von Kraftfutter (1550 KOFU VIII, KOFU Tiernahrung Kottmann, Neuss)

ergänzt. Die Ziegenböcke erhielten 100 g/d Kraftfutter je Tier, die trächtigen Ziegen

500 g/d. Den laktierenden Ziegen wurde die Ration individuell nach Milchleistung

(300 g/l) zugeteilt. Zudem waren eine Selbsttränke sowie ein Salzleckstein (KNZ S.C.

Akzo Nobel Salz GmbH, Stade) angebracht.

2.1.2 Versuchsablauf

Am Abend vor dem Versuch wurden die Probanden durch ein Gatter von der Gruppe

abgetrennt, um die Aufnahme von Heu zu unterbinden und um vergleichbare

Ausgangsbedingungen zu schaffen. Wasser und Stroh zur Erhaltung der

Pansentätigkeit stand diesen Tieren weiter zur freien Verfügung. Als Zugabe in die

Infusionslösungen wurde, unter aseptischen Bedingungen, 10 ml Blut, zur

Herstellung tiereigenen Serums, entnommen (20 min, 3000 g; Biofuge primo R,

Heraeus Instruments GmbH, Osterode).

Am Morgen des Versuchstages wurde unter Lokalanästhesie (Procasel 2 %,

Selectavet, Weyarn-Holzolling) ein intravenöser Dauerverweilkatheter (Cavafix

Certo mit Splittocan, Braun Melsungen AG, Melsungen) über die V. jugularis

externa in die V. cava cranialis verbracht. In die V. jugularis externa der

kontralateralen Seite wurde eine Venenverweilkanüle eingeführt (Vasocan, Braun

Melsungen AG, Melsungen). Dieser Katheter diente der regelmäßigen Entnahme der

Blutproben. Für die Durchführung der Infusionen wurde das Versuchstier, unter

Sicht-, Geruchs- und Hörkontakt zur Tiergruppe, in einem Kastenstand fixiert. Stroh

und Wasser wurden ad libitum angeboten. Zum Erhalt der Durchgängigkeit und zur

Prävention von Thrombenbildung im Katheter wurde dieser regelmäßig mit

heparinhaltiger Ringerlösung (10 I.E./ ml; Braun Melsungen AG, Melsungen) gespült

(Heparin-Natrium-5000-ratiopharm, Merckle GmbH, Blaubeuren).

Material und Methoden

17

Die Lösungen wurden mittels einer kalibrierten, peristaltischen Pumpe (Meredos HP-

60 12 AC/DC, Meredos GmbH, Bovenden) infundiert.

2.1.3 Tierschutz, Tierbetreuung und Belastungsbeurteilung

Die Tiere wurden mehrmals täglich von einer Betreuungsperson beobachtet. Vor

Versuchsbeginn wurde jedes Tier einem allgemeinen klinischen Untersuchungsgang

unterzogen, und insbesondere die innere Körpertemperatur gemessen. Bei

Abweichungen von den physiologischen Werten wurde der Versuch nicht

durchgeführt. Während des Versuches wurde in regelmäßigen Abständen Atmung,

Puls, Herztöne, Pansenaktivität und Körpertemperatur überwacht. Die Nachkontrolle

erfolgte in der Regel für drei Tage mit Kontrolle und Pflege der Einstichstellen.

Die Katheterisierung und Blutentnahme sind Eingriffe, die bei Mensch und Tier

routinemäßig ohne Betäubung durchgeführt werden. Katheter, Fixation und

Manipulation schienen die Tiere in ihrem Verhalten nicht wesentlich einzuschränken.

Alle Tiere ruminierten, fraßen Stroh und käuten wieder. Sie zeigten während des

Versuches keine wesentlichen Unterschiede in den Ruhe- und Aktivitätsphasen.

Allerdings zeigten mehrere Tiere am Ende des Versuches Ermüdungsanzeichen und

Erhöhung der Kreislaufparameter, die sich in allen Fällen nach wenigen Stunden

normalisierten. Diese Belastung des Allgemeinbefindens über einen begrenzten

Zeitraum ist als mäßig einzuschätzen. Keines der Tiere zeigte aufgrund der

Versuchsbehandlung klinisch relevante Folgeerscheinungen. Die Belastung der Tiere

durch die Infusionen ist als gering bis mäßig einzustufen.

Aufgrund der Durchführung von Vorversuchen unterlagen die Ziegenböcke der

Propionatinfusion 3 bis 4 Eingriffen. Zwischen zwei Versuchen lag mindestens eine

Woche Pause.

Die angewandte Infusionsrate im Propionatversuch wurde aus Erfahrungen in

Vorversuchen als die höchstmögliche Infusionsrate bei mäßiger Beeinträchtigung der

Versuchstiere eingeschätzt. Im Anschluss an den Versuch wurden die Tiere zum

Zweck der Probengewinnung getötet.


2.2 Bestimmung von Metaboliten und Hormone im Blut

2.2.1 Glukose

Die Glukosemessungen konnten mit dem tragbaren Glukoseanalyser YSI 1500

Sidekick Version 2.2 (YSI Incorporated, Yellow Springs, Ohio, USA) zeitnah und

direkt im Versuchsstall durchgeführt werden. Dieses Gerät ist für die Messung in

Vollblut, Blutplasma und -serum von Wiederkäuern validiert. Die Messung erfolgte in

heparinisiertem Vollblut (Heparin-Natrium-5000-ratiopharm, Merckle GmbH,

Blaubeuren).

Durch die Oxidation von Glukose durch eine spezifische Glukoseoxidase wird

Wasserstoffperoxid gebildet. In einer zweiten Reaktion, die durch eine Membran, die

für Wasserstoffperoxid diffundibel ist, von der ersten räumlich abgetrennt verläuft,

wird dieses an einer Platinanode weiter oxidiert. Es entsteht ein dynamisches

Gleichgewicht der Bildung und des Abbaus des Wasserstoffperoxids. Die

Stromstärke der Elektronen, die an der Sonde freigesetzt werden, ist proportional der

Gukosekonzentration in der gemessenen Probe (Herstellerangaben).

2.2.2 Serumgewinnung

Von jeder entnommenen Blutprobe wurde unmittelbar die Glukosekonzentration im

Vollblut gemessen (sh. 2.2.1). Für weitere Analysen wurden die Proben auf Eis

gekühlt, zur Serumgewinnung zentrifugiert (20 min, 3000 g; Sigma, 1K15,

Taufkirchen) und aliquotiert. Die Lagerung erfolgte bei –20 °C.

2.2.3 Leptin

Zur Erstellung von Verlaufsprofilen der Serumleptinkonzentrationen wurden diese mit

einem kompetitiven Enzymimmuntest (EIA) nach SAUERWEIN et al. (2004)

gemessen. Als Antiserum diente polyklonales Kaninchenserum, welches gegen

rekombinantes ovines Leptin (roLeptin; GERTLER et al., 1998), sowie zwei

synthetische bovine Peptidabschnitte gerichtet ist. Zur Herstellung des Tracers

wurde roLeptin nach HENNIES et al. (2001) biotinyliert. Die Mikrotiterplatten (EIA

plate 9018, Corning Star, Cambridge, MA, USA) wurden mit Schafantikörper gegen


19

das Fc-Fragment von Kaninchen beschichtet, und freie Bindungsstellen mit Casein

abgesättigt. Als Standard wurde roLeptin verwendet.

Dieser Test wurde zur Messung von Leptin in Blutserumproben von Ziegen, Rindern,

Schafen, Schweinen und Pferden entwickelt und validiert (SAUERWEIN et al, 2004).

Der Intra-Assay und Inter-Assay Variationskoeffizient beträgt 6,3% (n=12), bzw.

13,9% (n=41).

2.2.4 Insulin

Zur Messung der Insulinkonzentrationen kam ebenfalls ein kompetitiver

Enzymimmuntest zum Einsatz. Als Antiserum dienten Meerschweinchen-

immunglobuline gegen ovines Insulin. Zur Beschichtung wurden gegen

Meerschweinchen-IgG gerichtete Kaninchenantikörper eingesetzt. Bovines Insulin

(Sigma-Aldrich) wurde als Tracer nach dem oben genannten Protokoll biotinyliert. Als

Standardverdünnungsreihe wurde ebenfalls bovines Insulin verwendet. Dieser Test

ist außer für bovine auch für caprine Blutseren validiert (Wiederfindungsrate 98%).

Intra- und Interassay Variationskoeffizient sind bei diesem Test 5,9% (n = 10) und

10,8% (n = 15). Die Abfolge der Arbeitsschritte verlief entsprechend Protokoll

(HEINTGES, 2003; SAUERWEIN et al., 2006).

2.2.5 Freie Fettsäuren

Freie (FFA) oder nicht-veresterten (NEFA) Fettsäuren wurden mit einem kommerziell

erhältlichen Testkit (Nr. 1 383 175, Roche Mannheim) gemessen. Fettsäuren

werden durch Bindung von CoenzymA aktiviert, und oxidiert. Das dabei entstehende

Wasserstoffperoxid wird durch enzymatisch katalysierte Farbentwicklung gemessen

(SHIMUZU et al., 1980). Der Test ist nach OLIVER et al. (1995), zur Anwendung in

Mikrotiterplatten modifiziert. Die kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) werden aufgrund

ihrer hohen Flüchtigkeit durch diesen Kit nicht quantifiziert. Als Standard stand eine

Palmitinsäureverdünnungsreihe zur Verfügung.


2.3 Effekte einer Propionatinfusion auf das periphere

Leptinsystem und Parameter des Glukosestoffwechsels bei

der Ziege

2.3.1 Entwicklung von real-time RT-PCR Assays für Leptin (ob), die

lange Form des Leptinrezeptors (ob-Rb), den G-

proteingekoppelten Rezeptor 41 (GPR41) und die 18S rRNA

Ziel war es, die Expression der Gene ob, ob-Rb, und des putativen GPR 41 zu

quantifizieren. Funktion und Zweck des GPR41 ist noch unzureichend geklärt, so

dass das codierende Segment als Gen des putativen GPR41 bezeichnet wird. Im

Text wird vereinfachend die Bezeichnung GPR41 verwendet.

Das ob-Gen codiert für das Proteohormon Leptin. Mit dieser Messung sollen

mögliche Veränderungen der mRNA-Menge von Leptin auf RNA-Ebene den

Veränderungen von Leptin auf Proteinebene im Blut gegenübergestellt werden. Das

ob-Rb-Gen codiert für die lange Form des Leptinrezeptors, während GPR 41, als

Rezeptor von kurzkettigen Fettsäuren, geeignet ist bei Mäusen die Leptinexpression

zu erhöhen (XIONG et al.; 2004).

Aufgrund der hohen Empfindlichkeit insbesondere von RNA, aber auch von DNA,

gegenüber Nukleasen, wurden alle Arbeitsabläufe mit Schutzhandschuhen

durchgeführt. Alle Materialien wurden autoklaviert, sofern sie nicht vom Hersteller

bereits nukleasenfrei hergestellt waren. Mit Wasser wird im Folgenden autoklaviertes

Reinstwasser bezeichnet. DEPC-Wasser ist mit Diethylpyrocarbonat behandeltes,

ribonukleasefreies Reinstwasser.

Die Extraktion der Gesamt-RNA erfolgte nach modifizierter Phenol-Chloroform-

Methode (CHOMCZYNSKI u. SACCHI, 1987; CHOMCZYNSKI u. MACKEY 1995).

Die Aufbereitung der RNA aus Fettgewebe wurde nach einem modifizierten Protokoll

nach LOUVEAU et al. (1991) durchgeführt. (s. Anhang)

2.3.1.1 Mengenbestimmung und Kontrolle der RNA

Photometrische Konzentrationsbestimmung

Nach der Gewinnung der RNA-Präparationen wurde deren Konzentration

photometrisch bestimmt. Zusätzlich erhielt man hierbei Aufschluss über


21

Proteinverunreinigungen der Probe, und somit über den Erfolg der RNA-

Aufreinigung. Die Bestimmung der Konzentration erfolgte photometrisch (Hitachi U-

2000 UV/VIS Spectrophotometer, Hitachi Scientific Instruments, Tokyo, Japan) über

die Messung der Extinktion bei einer Wellenlänge von 260 nm, da Nukleinsäuren in

diesem Wellenlängenbereich ihr Absorptionsmaximum besitzen.

Als Maß für Proteinverunreinigungen wurde das Verhältnis der beiden Wellenlängen

260/280 (OD-Ratio) verwendet, da das Absorptionsmaximum von Proteinen bei

280 nm liegt. Es wurden nur Proben verwendet, deren OD-Ratio-Werte über 1,6

lagen (WILKINSON, 2000). Andernfalls wurde die Aufreinigung mit einer anderen

Gewebeprobe des Versuchstieres wiederholt.

Die Messung erfolgte in Doppelbestimmung. Ein relativer Fehler unter 10 %

zwischen zwei Messungen wurde akzeptiert. Lag die Abweichung unter 15 % wurde

eine Dreifachbestimmung durchgeführt. Der sich daraus ergebende Mittelwert wurde

zur Berechnung der Nukleinsäurenkonzentration verwandt. Die

Nukleinsäurenkonzentration ist proportional der gemessenen Absorption. Die

Konzentrationsberechnung für RNA erfolgte anhand der Formel:

RNA (µg/ml) = OD260 · 40 µg/ml · Verdünnungsfaktor

DNase-Verdau

Um das Risiko falsch-positiver Ergebnisse durch DNA-Kontaminationen in der PCR

zu vermindern, wurde eine enzymatische Zerstörung der DNA mit DNase I

(DNaseverdau) angeschlossen. Durch diese Behandlung konnte auf die Konstruktion

intronspannender PCR-Primer verzichtet werden. Dies war aufgrund der z.T. nur

sehr kurzen bekannten RNA-Sequenzen von Vorteil und erleichterte die Auswahl der

Primer (BUSTIN, 2002). Die Gesamt-RNA aus Muskelgewebe wurde direkt dem

DNaseverdau zugeführt (s. Anhang). Für die Leber- und Fettproben konnte eine

bessere Qualität der RNA über eine DNasebehandlung mit Aufreinigung über ein

Kitsystem auf Basis der Silicagel-Membrantechnologie (Nucleospin®RNA II,

Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) erzielt werden. Prinzip der Aufreinigung ist die

Bindung der Nukleinsäuren aufgrund ihrer Ladungen unter bestimmten

Ionenkonzentrationen an die Membran. Rückstände wie z.B. Salze oder

Kohlenhydrate werden in Waschschritten entfernt. Das Protokoll wurde gemäß

Herstellerangaben durchgeführt.


Die gesamte isolierte RNA der Fettgewebsproben wurde dieser Aufreinigung

zugeführt. Von den Leberproben wurden bis zu 70 µg Gesamt-RNA je Probe

gereinigt. Die DNA-Kontaminationen aus Muskel-RNA wurden im 50 µl-Ansatz

entfernt. Dazu wurde je Probe eine Menge von 50 µg Gesamt-RNA bearbeitet (s.

Anhang)

Aus den gereinigten Stammlösungen wurden Aliquote mit einer Konzentration von

ca. 0,3 µg/µl hergestellt, und danach photometrisch exakt bestimmt. Die

Stocklösungen und Reservealiquote wurden bei –80 °C gelagert, die

Gebrauchsaliquote lagerten bei –20 °C.

Denaturierende RNA-Gelelektrophorese

Um die Verluste gering zu halten, wurde die RNA ohne vorherige Kontrolle ihrer

Integrität gereinigt. Diese Kontrolle erfolgte erst im Anschluss in einer horizontalen,

denaturierenden Gelelektrophorese in einem 1,2 % Formaldehyd-Agarosegel, mit

Ethidiumbromid als Farbstoff. Als Laufpuffer diente 1X MOPS-Puffer (s. Anhang). Zur

Beurteilung der Qualität der Nukleinsäuren wurden 2 µg Gesamt-RNA der

Fettproben, und 5 µg der Muskel- und Leberproben, eingesetzt. Dazu wurden 4 µl

Ladepuffer (s. Anhang) zugegeben, und jeweils auf 12 µl mit Wasser aufgefüllt.

Diese Ansätze wurden vor dem Auftrag zusammen bei 65 °C für zehn Minuten im

Wasserbad denaturiert. Danach wurden sie sofort auf Eis gestellt, um eine

Renaturierung zu verhindern, und in die Taschen des Gels pipettiert. Die Spannung

in der Kammer betrug 5 bis 7 V/cm für 80 bis 100 Minuten.

Die Qualität der Präparationen sowie die Länge der darin enthaltenen Fragmente

wird in einer Gelelektrophorese kontrolliert. Agarose bildet als Polysaccharid eine

dreidimensionale Netzstruktur aus. In dieser kommt es zu einer Auftrennung der

RNA-Fragmente in den Präparationen nach ihrer Größe. Fragmente gleicher Größe

werden als klar abgegrenzte Bande sichtbar. Werden diese durch Enzyme

degradiert, bilden diese unspezifischen Schlieren, da die dabei entstehenden Größen

dem Zufallsprinzip unterliegen.

Um die Banden sichtbar zu machen wurde der interkalierende Fluoreszenzfarbstoff

Ethidiumbromid, eingesetzt. Diese aromatischen Kationen lagern sich in die

Nukleotidketten ein, und fluoreszieren durch UV-Bestrahlung (s. Anhang).


23

Die bildliche Darstellung und Dokumentation der Gele erfolgte mit dem FluorImager

SI und der dazugehörigen Software ImageQuant, Version 4.1 (beide: Molecular

Dynamics, Sunnyvale, CA, USA).

2.3.1.2 Reverse Transkription (RT)

Für den indirekten Nachweis der RNA mittels PCR, wurde diese in cDNA

umgeschrieben (Reverse Transkription). Als Startmoleküle für die reverse

Transkriptase, einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase, dienten random hexamer

Primer. Diese Oligomere bestehen aus sechs nach der Wahrscheinlichkeitsverteilung

kombinierten Nukleotiden. Die damit dargestellten Sequenzen binden an die

jeweilige komplementäre Sequenz der RNA, die beliebig in der Matrize verteilt sind.

Von diesen Primern ausgehend startet die cDNA-Synthese (cDNA = engl.

complementary DNA), bis sie an der nächstliegenden Bindungsstelle eines

Hexamers gestoppt wird. Auf diese Weise wird die gesamte in der Präparation

vorhandene RNA, incl. der ribosomalen, umgeschrieben. Dadurch war die

Verwendung von 18S rRNA als interne Kontrolle in der real-time PCR möglich.

Jede RNA wurde zweimal, in voneinander unabhängigen Ansätzen, umgeschrieben

(s. 2.3.2.4). Da die Interassayvarianz in der cDNA-Synthese einen großen Einfluss

auf die weitere Quantifizierung haben kann (ØVSTEBØ et al., 2003; STÅHLBERG et

al., 2004), wurden je alle Fettproben gemeinsam, und alle Leber- und Muskelproben

in einem gemeinsamen Durchlauf, mit demselben Mastermix, transkribiert. Dieses

Design wurde dann auch für die PCR-Messungen verwendet. Die Auswertung

erfolgte zwischen den Behandlungsgruppen, sowie zum Vergleich der mRNA-Menge

zwischen den beiden Fettgeweben.

Die Reverse Transkription zur Synthese der cDNA wurde in einer von der PCR

getrennten Reaktion durchgeführt, um eine höhere Sensitivität in der PCR zu

erreichen (zur Übersicht: BUSTIN, 2002). Es wurden 1,8 µg RNA im 20 µl-Ansatz

eingesetzt (Thermocycler: MJ Research, Biozym Diagnostik, Oldendorf). Ein Teil der

hergestellten cDNA wurde gleich im Anschluss in einer zweistufigen

Verdünnungsreihe auf 1:4 und 1:40 verdünnt, um die CT (Threshold cycle), die

Messgrößen für die Quantifizierung, zwischen Ziel- und Referenzgenen einander

anzunähern. Die Lagerung mehrerer Aliquote erfolgte bei -20 °C. Jedes Aliquot

wurde zur Auswertung höchstens dreimal aufgetaut.


2.3.1.3 Zielgene und interne Kontrolle für die PCR

Als Zielgene werden im Folgenden jene Gene bezeichnet, deren Expression in

diesen Untersuchungen quantifiziert werden sollten. Das sind die bereits oben

erwähnten Gene für Leptin (ob), Leptinrezeptor (ob-Rb) und den G-

proteingekoppelten Rezeptor 41 (GPR41).

Die interne oder endogene Amplifikationskontrolle dient als Bezugsgröße zur

indirekten Quantifizierung des Transkriptionsniveaus der Zielgene. Geeignete RNA-

Spezies müssen in allen analysierten Gewebetypen in verleichbarer Menge

vorhanden sein, direkt proportional der enthaltenen Gesamt-RNA sein, und ihre

Masse darf nur geringen Variationen unterliegen. Für diese Verwendung wurde in

diesem Versuch die 18S ribosomale RNA (rRNA) als interne Kontrolle ausgewählt

(zur Übersicht: IVELL, 1998; DEINDL, 2001). Im Weiteren wird diese auch verkürzt

als 18S bezeichnet. Als aktive Referenz wird diese Kontrolle in einem eigenen

Ansatz amplifiziert. Die anhand einer Standardkurve ermittelte theoretische

Molekülmenge der Ziel-mRNA wird ins Verhältnis zur Kontrolle gesetzt. Anhand der

errechneten Quotienten werden die Einzelproben verglichen und statistisch

ausgewertet.

Produktamplifikation für die PCR-Standards

Die Quantifizierung der spezifischen RNA-Mengen erfolgte in der real-time PCR

gegen eine Standardverdünnungsreihe (s. 2.3.2.4). Die Fragmente wurden per PCR

amplifiziert (Protokolle s. Anhang). Für Leptin und 18S wurde die Zielsequenz der

real-time PCR auch zur Herstellung der Standardverdünnungsreihe verwendet. Die

Primer, welche die Fragmente für die beiden Rezeptoren festlegen, wurden je auf

Grundlage eines längeren PCR-Fragmentes bestimmt. Dieses Fragment wurde bei

diesen Assays als Standard eingesetzt.

Die Primer wurden von Invitrogen (Karlsruhe) bezogen. Die PCR-Protokolle für die

Standardamplifikation sind im Anhang aufgeführt.

Sequenzierung

Die Produkte für die Standardverdünnungsreihen von Leptin- und Leptinrezeptor-

RNA wurden nach der Didesoxy-Kettenabbruchmethode (SANGER et al., 1977) mit

dem CEQTM Dye Terminator Cycle Sequencing (DTCS) mit Quick Start Kit (Beckman

Coulter, Fullerton, CA, USA) nach folgendem Standardprotokoll sequenziert:


25

Der Sequenzier-PCR-Mix enthielt 6 µl cDNA, 2 µl Primer und 4 µl DTCS-Mastermix.

Die Cycling Reaktion wurde mit 30 Zyklen bei 96 °C für 20 s, 50 °C für 20 s und

60 °C für 4 min. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 µl Stoppreagenz (2 µl

3M NaOAc pH 5,2; 2 µl 100 mM EDTA pH8; 1 µl Glykogen) abgebrochen. Das

Produkt wurde mit 99 % Ethanol präzipitiert, gewaschen und getrocknet. Das Pellet

wurde in CEQTM-Ladepuffer suspendiert und in den Sequencer (CEQTM8000;

Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) geladen.

Die Sequenzierung der entsprechenden Fragmente von GPR41 und 18S erfolgte

durch MWG Biotech AG (Ebersberg). Alle Sequenzierungen wurden sowohl in

sense, als auch antisense-Richtung durchgeführt. Als Primer für die Sequenzierung

wurden jene aus der PCR verwendet. Die Ergebnisse wurden sowohl anhand der

Fluoreszenzpeaks, als auch den Basencodes, visuell kontrolliert. Insbesondere sich

überlappende Bereiche wurden auf Widersprüchlichkeiten miteinander verglichen. Im

Falle von Leptin und 18S wurden die Ergebnisse mit Hilfe von BLAST (engl.: basic

local alignment search tool; ALTSCHUL et al., 1990;

(http://ncbi.nlm.nih.gov/blast/; 2004)) und Multalin Version 5.4.1 (CORPET, 1988)

mit der veröffentlichten Sequenz auf Übereinstimmung überprüft.

Leptin

Bei Leptin wurde dieselbe Sequenz für die Standardverdünnungsreihe und die

quantifizierende real-time PCR verwendet. Die Primer dafür wurden von YUEN et al.

(2002) übernommen, die ein Fragment von 183 Nukleotiden festlegen. Sie wurden

von Invitrogen (Karlsruhe) bezogen. Das Ergebnis stimmte mit der veröffentlichten

Sequenz ob-mRNA AF372504 (Capra hircus) überein.

18S rRNA

Die Primer für die 18S mRNA wurden anhand der bekannten Sequenz nach

AF102857 (Sus scrofa) online mit der Software Primer 3 ( 2004, Whitehead

Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA, USA) konzipiert. Sie codieren für

81 Nukleotide. Die Bestätigung des amplifizierten Fragments erfolgte durch Vergleich

mit der veröffentlichten Sequenz für die Ziege AF379200 (Capra hircus).


Leptinrezeptor

Die partielle cDNA-Sequenz des caprinen Leptinrezeptors wurde auf Basis eines

PCR-Fragmentes analysiert, welches für einen Abschnitt von 383 Basenpaaren

codiert. Die Primer dazu wurden nach LIN et al. (2000) synthetisiert, die ursprünglich

vom Schwein (AF092422; Sus scrofa) abgeleitet sind. Das Sequenziergebnis wurde

in Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/; 2005) unter der Accession

number AY846770 veröffentlicht (Capra hircus leptin receptor long form mRNA,

partial cds). Auf Basis dieser Sequenz wurden die Primer für eine real-time PCR

konzipiert. Zum Nachweis für die lange Form des Leptinrezeptors wurde ein

TaqMan-Kit konstruiert Die Berechnung und Synthese der Primer und der MGB

TaqMan-Sonden (MGB = engl. minor groove binder) wurden von Applied

Biosystems durchgeführt. Das amplifizierte Fragment hat eine Länge von 89 Basen

und die Sonde bindet an den Plusstrang.

Putativer GPR41

Zur Ermittlung einer partiellen cDNA-Sequenz des putativen caprinen GPR41 wurden

Primer nach der humanen Sequenz (NM005304) gestaltet, die ein PCR-Produkt mit

einer Fragmentlänge von 215 Basenpaare bilden. Das Sequenzierergebnis wurde

unter der Accession number AY885226 (Capra hircus putative G-protein coupled

receptor 4 mRNA, partial cds.) in Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/;

2005) veröffentlicht.

Dieses Fragment bildete die Ausgangssequenz für die die real-time PCR-Primer und

MGB TaqMan-Sonde. Diese wurden von Applied Biosystems konzipiert und

sythetisiert. Sie umfassen ein Fragment von 74 Basenpaaren, mit einer Sonde, die

an den Reversstrang bindet. Im Folgenden sind die Primer aufgeführt:


27

Tab. 1: Sequenzen der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Primer und Sonden für die real-

time RT-PCR Assays und die RT-PCR-Primer zur Herstellung der Verdünnungsreihen für die Ob-Rb-

und GPR41-RNA.

Ob-RNA Primer

Forward: 5`GACATCTCACACACGCAG3`

Reverse: 5`GAGGTTCTCCAGGTCATT3`

18S rRNA Primer

Forward: 5`GCTCCACCAACTAAGAACG3`

Reverse: 5`GGACACGGACAGGATTGAC3`

Ob-Rb-RNA Primer (Standard)

Forward: 5`TCGGAAGATATCAGTGTTGA3`

Reverse: 5`TTGGGATGCTGATCTGATAA3`

GPR 41-RNA Primer (Standard)

Forward: 5`ACCTGATGGCCCTGGTG3`

Reverse: 5`GGTGAGGTTTAGCAACAGCA3`

ob-Rb-RNA Primer und Sonde

Forward: 5`GGAGACAGCCCTCTGTTAAATATGC3`

Reverse: 5`TGAGCTGTTTATAAGCCCTTGCT3`

Sonde: 5`TCGGCTTCACCTGATTTA3`

GPR 41-RNA Primer und Sonde

Forward: 5`TGGTGATCTTCGTGGGCAAG3`

Reverse: 5`CGAGAGGGTGAGATTTAGCAAGAG3`

Sonde: 5`CTGCGGCGCCGCC3`

2.3.1.4 Real-time RT-PCR

Die real-time RT-PCR ist eine Weiterentwicklung der RT-PCR (MULLIS et al., 1986;

RAPPOLEE et al., 1991), bei der die Detektion der amplifizierten Fragmente nicht als

Endpunktanalyse in einem Gel durchgeführt wird, sondern durch


fluoreszenzmarkierte Farbstoffe direkt im Reaktionsgefäß erfolgt (HOLLAND et al.,

1991).

Voraussetzung für die Quantifizierung mit der real-time PCR ist die stöchiometrische

Bindung des Farbstoffes, so dass das Fluoreszenzsignal proportional der Menge

spezifischer PCR-Fragmente ist (IVELL, 1998).

Technologisch werden dabei zwei Methoden unterschieden: unspezifische Detektion

mittels DNA-bindender Farbstoffe, und die spezifische unter Verwendung von

Hybridisierungssonden (LEE et al., 1993; ISHIGURO et al., 1995; LIVAK et al.,

1995).

SybrGreen I (Molecular Probes Inc., Eugene, USA) ist ein unspezifisch DNA-

bindender Fluoreszenzfarbstoff. Die Bindung erfolgt in der kleinen Furche der

Doppelhelix, weist also nur doppelsträngige DNA nach. Dabei ist SybrGreen I nicht

interkalierend d.h., dass die Bindung der Farbstoffmoleküle die räumliche

Molekülstruktur nicht beeinflusst, und somit eine Linearität zwischen Signalintensität

und Fragmentlänge besteht (IVELL, 1998).

Die sequenzspezifische TaqMan-Sonde basiert auf dem Fluoreszenzresonanz

Energietransfer (FRET). Die Sonde ist mit einem Fluorophor (FAM;

Fluoreszeinderivat 6-Carboxy-Fluorescein) am 5`-Ende, und dem Quencher

TAMRA am 3`-Ende markiert, welcher die Fluoreszenz unterdrückt („Förster type

energy transfer“, FÖRSTER, 1948).

Die Sonde bindet neben den Primern spezifisch an eine Sequenz des Amplikons,

und wird bei der Nukleotidsynthese durch die Taq-DNA-Polymerase hydrolysiert. Der

Quencher wird dadurch vom Fluorophor getrennt und dieses setzt somit das

Fluoreszenzsignal frei. Das verwendete FAM emittiert Licht der Wellenlänge

518 nm.

Die Reaktionen wurden in einem Thermocycler des Typs Abi Prism 7000 (Applied

Biosystems (ABI), Foster City; CA, USA) durchgeführt. Dieser nutzt als Lichtquelle

eine Tungsten-Halogenlampe. Das Licht durchleuchtet die mit Folie gasdicht

verschlossenen Vertiefungen. Das emittierte Fluoreszensignal wird über ein Optik-

und Filtersystem geleitet, und von einer CCD-Kamera detektiert. Zur Korrektur

möglicher optischer Fehler wird eine passive Referenz dem Mastermix beigegeben,

welche die Referenzemission zur Messung des Reportersignals bildet. In allen

Assays wurde der Farbstoff ROX (6-Carboxy-X-rhodamin; 602 nm) verwendet.


29

Die Primer sind in Tab. 1 gelistet. Der Probenansatz und die Cyclingprotokolle sind

im Anhang aufgeführt. Jede cDNA wurde einmal in einem Doppelansatz gemessen.

Es wurden jeweils alle Proben aus einer cDNA-Synthese zusammen angesetzt.

Nach Herstellung des Mastermix wurde dieser in die Wells einer 96er Mikrotiterplatte

pipettiert. Um mögliche Kontaminationen durch den Pipettiervorgang

auszuschließen, wurden die Negativkontrollen NTCs (no template controls) als letzte

Proben, sowie in regelmäßigen Abständen (nach ca. 20 bis 26 Proben) auf die

Mikrotiterplatte gegeben. Eine Folienabdichtung schützt vor Verlusten.

Durch einen initialen 10-minütigen Erhitzungsschritt (95 °C) wurde die hot-start Taq-

Polymerase aktiviert. Annealing- und Extensionsschritt erfolgten beide bei 60 °C.

Dies ist möglich, da die im Kit verwendete Polymerase bereits ab 55°C eine

signifikante Aktivität besitzt, und somit diese beiden Reaktionsabschnitte

zusammengefasst werden können (GELFAND, 1989). Die Detektion erfolgt beim

verwendeten real-time Cycler Abi Prism 7000 (Applied Biosystems (ABI), Foster City;

CA, USA) am Ende der Elongation bei 60°C (aquisition point) jedes Zyklus.

Herstellung der Standardverdünnungsreihen

Zur indirekten Quantifizierung wurden Standardverdünnungsreihen der spezifischen

DNA-Abschnitte hergestellt (sh. 2.3.1.3). Die synthetisierten PCR-Produkte wurden

nach Herstellerangaben mit einem kommerziellen Kit gereinigt und konzentriert

(QiaQuick PCR-Purification Kit, Qiagen, Hilden). Die gereinigten Amplifikate wurden

in 10 mM Tris·Cl-Puffer (pH 8,5; Qiagen, Hilden) gelöst, und sodann auf ein DNA-Gel

aufgetragen. Als Massenstandard diente der Größenmarker ΦX174 DNA/BsuRI

(HaeIII) (MBI Fermentas, St. Leon-Rot). Mit dem Fluorimager wurde das

Fluoreszenzsignal der Bande des PCR-Produktes und Markerbanden einer

ähnlichen Länge gemessen. Die Menge des PCR-Fragmentes wurde nach folgender

Berechnungsformel bestimmt:

cPCR-Fragment = (MGPCR-Fragment · mMarkerbande / MGGes · VMarker)

cPCR-Fragment: Konzentration des PCR-Fragmentes; MGPCR-Fragment: Molekülgröße des PCR-Fragmentes;

mMarkerbande: Masse der Markerbande im Gel ; MGGes: Summe der Fragmentlängen aller Markerbanden;

VMarker: Volumen des Markerauftrags


Aus der Konzentration konnte die molare Konzentration sowie die Molekülanzahl je

Volumeneinheit berechnet werden. Diese lag für alle Amplifikate in einer

Größenordnung von 1011 Moleküle / µl. Diese Stammlösung wurde aliquotiert und bei

–80 °C gelagert. Ein Aliquot wurde auf die Ausgangskonzentration von 109 verdünnt,

und aus dieser Konzentration die Standardverdünnungsreihe hergestellt (10 mM

Tris·Cl-Puffer; pH 8,5). In der real-time PCR wurde jeweils eine Reihe über 6

Potenzen eingesetzt. Für die Zielgene erstreckte sie sich von 100 bis 105 Moleküle/µl,

für 18S rRNA wurden eine Reihe von 103 bis 108 Moleküle/µl verwendet.

Die Quantifizierung der Proben erfolgte durch Interpolation der gemessenen cT-

Werte (engl. threshold cycle) gegen die jeweilige Standardkurve, um die Menge an

Ziel-DNA zu messen. Mit den ermittelten Einzelwerten wurde für jede Proben-RNA

der Mittelwert aus den beiden Assays gebildet. Diese Werte der Zielgene wurden

durch die Werte der endogenen Kontrolle dividiert. Somit erhielt man für jede Probe

einen normalisierten Quotienten, der in die statistische Analyse einging.

Abb. 2: Beispielhafte Darstellung einer Standardkurve über 6 Dezimalverdünnungs-stufen

(GPR41) als Bildschirmausschnitt (Slope = 3,309; R² = 0,996).

x-Achse: Logarithmus der Verdünnungsstufe; y-Achse: CT


31

Standardkurve, Amplifikationseffizienz und Wiederholbarkeit

Störgrößen, wie z.B. die Einwirkung von Inhibitoren, können die Reaktionskinetik der

PCR beeinflussen. Qualitätskriterium der Reaktion ist die Effizienz. Die Erfassung

der Effizienz ist für die quantifizierende PCR von besonderer Bedeutung, da eine

genaue Messung nur bei konstanter Reaktionseffizienz gewährleistet ist (KUBISTA

et al., 2006).

Die Effizienz wurde nach der Standardkurvenmethode ermittelt. Dazu wird der CT als

Ordinate über der Startkopienzahl der Standardverdünnungsreihe dargestellt. Diese

Standardkurve wurde nach Bestimmtheitsmaß (R²) und Geradensteigung analysiert,

wobei die Steigung oder slope als Grundlage der Berechung von prominenter

Bedeutung war. Als valide erachtet wurden Geraden mit R² > 0,97 über mindestens 5

Verdünnungsstufen, wobei bis zu zwei Ausreißer aus der Doppelbestimmung und

der Berechnung genommen wurden. Die Effizienz berechnet sich dann nach

folgender Formel:

E = 10-1/m

E = Effizienz; m = Steigung der Regressionsgeraden (slope)

Auf Grundlage der validen Standards wurde zudem die Wiederholbarkeit der PCR-

Assays untersucht. Die Berechnung erfolgte für Leptin auf der Basis von n = 8

Standardkurven, Leptinrezeptor n = 6, und GPR41 sowie 18S jeweils n = 5 validen

Verdünnungsreihen (s. a. Abb. 2).

Threshold, Basislinie und CT

Die Quantifizierung erfolgte anhand des CT. Mit der Festlegung des Threshold (engl.:

Schwellenwert) wurde eine Mindestmenge an synthetisierten PCR-Fragmenten als

Detektionslimit definiert, und dann für alle Proben einer RNA-Spezies beibehalten.

Für alle vier Abschnitte wurde er mit 0,2 festgelegt. Der CT oder auch Crossing point

bezeichnet jenen Zyklus, bei dem die Amplifikationskurve diesen Threshold

schneidet. Ihr Wert ist umgekehrt korreliert mit der Menge an Matrizen-cDNA.

Mit der Basislinie wurde die Signalstärke des Hintergrundrauschens bestimmt, die als

noch nicht spezifisch betrachtet wird. Die Einstellung der Basislinie wurde nach

Herstellerempfehlung durch die Software des ABI Prism 7000 im Modus „Automatic


Baseline“ vorgenommen, die aus allen Proben eines Assays eine ideale Basislinie

berechnet. Die Stärke des Signals wird mit Delta Rn bezeichnet.

Spezifität

Sybr Green I

Sybr Green I bindet an jegliche doppelsträngige DNA. Durch unspezifische Bindung

von Primern, aber auch durch unvollständige Elongation entstehen sog.

Primerdimere, unspezifische Fragmente, die die Genauigkeit der

Fluoreszenzmessung, und damit der Quantifizierung, beeinträchtigen (ISHIGURO et

al., 1995; RIRIE et al, 1997). Insbesondere wird dann auch die Sensitivität des

Assays durch erhöhtes Hintergrundrauschen und späteren CT verringert (PETERS et

al, 2004).

Die Fragmentlänge der PCR-Produkte wurde für jede quantifizierte cDNA-Spezies in

einer Gelelektorphorese stichprobenartig bestätigt (2 % Agarose/TBE; gefärbt mit

Ethidiumbromid) Als Marker diente ΦX174 DNA/BsuRI (HaeIII). Mit der

Schmelzkurvenanalyse wurde am Ende der PCR die Spezifität jeder Reaktion

bestätigt. Durch Temperaturerhöhung wird dabei die enthaltene DNA denaturiert.

Durch die Dissoziation der PCR-Fragmente wird das gebundene Sybr Green I frei,

was in einem Abfall des Fluoreszenzsignals resultiert. Die Schmelz- oder

Dissoziationskurve wurde über ein Temperaturspektrum von 60°C bis 90 °C

aufgezeichnet, und als Graph der Fluoreszenz über der Temperatur als Abszisse

erstellt (s. Abb. 3).

TaqMan-Sonden

Die Spezifität der Sonden für Leptinrezeptor und GPR41 wurde mit BLAST bestätigt.

Da die Hydrolyse der TaqMan-Sonde nur erfolgte, wenn es zu einer

sequenzspezifischen Hybridisierung zwischen Sonde und Template kommt, wird das

Fluoreszenzsignal nur generiert, falls es zu einer Amplifikation der Zielsequenzen

kommt. Unspezifische Nebenprodukte wurden dadurch nicht detektiert, und Post-

PCR-Processing wie die Schmelztemperaturanalyse entfielen somit. Als zusätzliche

Bestätigung wurde die Größe der PCR-Fragmente von Proben und Standardkurven

beider Assays stichprobenartig in einer Gelektrophorese verifiziert.


33

2.3.1.5 Statistische Auswertung

Die gewonnenen Daten wurden mittels t-Test mit dem Programm SigmaStat (Version

2.03; Systat Software Inc., Chicago, IL, USA) ausgewertet. Für jedes Zielgen wurden

die Mittelwerte von Behandlungs- und Kontrollgruppe verglichen (Mittelwerte ± SEM).

Abb. 3: Beispielhafte Darstellung von Schmelzkurven / Dissoziationskurven der real-time

RT-PCR mit Sybr-Green I als Detektor (oben: Leptin; unten: 18S rRNA). Alle

Proben zeigen einen deutlich abgesetzten Temperaturpeak in der

1. mathematischen Ableitung, wohingegen in den Negativkontrollen kein Signal

gemessen wird (Ausschnitt der Bildschirmanzeige). X-Achsen: Temperatur (°C) y-

Achsen: Ableitung des Fluoreszenzsignals


Das Signifikanzniveau wurde bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05

festgelegt.

2.3.2 Untersuchung von Leptin, Insulin und Glukose im Blut

2.3.2.1 Versuchstiere

Der Versuch wurde an 9 männlichen Ziegen der Rasse Deutsche Edelziege

durchgeführt. Zum Versuchszeitpunkt waren die Tiere 10 – 12 Monate alt, und waren

im Alter von 2 – 4 Monaten kastriert worden. Aufgrund großer Heterogenität der

Tiergewichte (29 – 49 kg Körpergewicht) wurden die Tiere in vier Gewichtsgruppen

eingeteilt. Um mögliche Einflüsse der Gewichte auf die Ergebnisse der Untersuchung

zu minimieren, wurden die Tiere aus jeder Gewichtsgruppe gleichmäßig auf die

beiden Behandlungsgruppen verteilt. Die Versuchsdurchführung wurde, als

genehmigungspflichtiger Tierversuch, von der Bezirksregierung Köln bestätigt

(Aktenzeichen 50.203.2-BN 13, 19/03).

2.3.2.2 Euthanasie und Entnahme der Gewebeproben

Hauptziel dieser Arbeit ist die Darstellung und der Vergleich der mRNA-Expression

ausgewählter Proteine, die in der Regulation des Leptinsystems, des Glukose- und

des Fettsäurenstoffwechsel relevant sein könnten. Es wurden Proben von Leber und

Skelett- oder quergestreifter Muskulatur (kurz: Muskel), sowie retroperitoneales

Fettgewebe (kurz: Organfett) aus dem Nierenbereich und Unterhautfettgewebe

entnommen, da diese Gewebe für die Regulation dieser Stoffwechselwege von

großer Bedeutung sind (CHILLIARD et al., 2001; CHELIKANI et al., 2003a).

Unmittelbar nach Entnahme der letzen Blutprobe wurde das Tier durch die

intravenöse Applikation von Pentobarbital® (0,2 ml/kg Körpergewicht, Essex

Tierarznei, Essex Pharma, München, Deutschland) euthanasiert (WANG et al.,

1998). Der Ablauf der Probenentnahme entsprach immer demselben Muster, und

wurde unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die Haut des gesamten Tierkörpers

wurde an der rechten Seite, von der Linea alba ausgehend, abgelöst. Zuerst wurde

eine Probe des M. semitendinosus entnommen, und anschließend das subkutane

Fett der rechten Körperseite gewonnen. Danach erfolgte die Öffnung der Bauchhöhle

entlang des Rippenbogens, zur Entnahme einer Probe des rechten Leberlappens

distal der Gallenblase. Zuletzt wurden das Unterhautfett der linken Körperseite und

das Nierenkapselfett reseziert.


35

Die Gewebe wurden sofort in eisgekühlter steriler Kochsalzlösung gespült. Muskel

und Leber wurde direkt in Trockeneis gefroren, das Fettgewebe wurde zuvor in

flüssigem Stickstoff schockgefroren, und dann in Trockeneis gelegt. Gelagert wurden

die Proben bei –80° C. Die Probennahme war spätestens 1,5 Stunden nach Tötung

des Tieres abgeschlossen.

2.3.2.3 Infusionslösungen

Die Propionatlösung wurde nach einem modifizierten Protokoll in Anlehnung an die

Arbeiten von LEE u. HOSSNER (2002) und JANES et al. (1985) hergestellt. Die

Mengen wurden für die Infusionsdauer von 260 min berechnet. Die Infusion setzte

sich aus den Komponenten Propionsäure (Sigma-Aldrich, Taufkirchen),

Natriumhydroxid (NaOH, Roth, Karlsruhe), Kaliumchlorid (KCl, Roth, Karlsruhe),

Reinstwasser (s. Anhang) und tiereigenem Serum (s. 2.1.2) zusammen, mit einer

Propionatkonzentration von 1,2 M. Zur Herstellung wurde Propionsäure (100 %) mit

Reinstwasser verdünnt. Anschließend wurde der pH-Wert mittels pH-Meter (Orion,

ORI037002, pH/mV/ISE/Temp Meter, Colora, Lorch) kontrolliert, und unter Zugabe

der NaOH - Plätzchen auf pH 7,4 eingestellt. Weiter wurde Kalium (1,2 mg·100 ml-1)

zugegeben. Nach Sterilisierung im Autoklaven (Systec-Tischautoklav, 2540 EL,

Tuttnauer, Breda, Niederlande) wurde der pH-Wert erneut überprüft und bei Bedarf

korrigiert. Das Kalium diente dazu, einer Hypokaliämie (RABINOWITZ et al., 1984)

während der Behandlung vorzubeugen. Unmittelbar vor der Applikation wurde das

tiereigene Serum (0,6 ml·100 ml-1) zur zusätzlichen Pufferung des eingestellten pH-

Wertes zugefügt.

Die Zusammensetzung der Negativkontrolle wurde entsprechend der

Propionatlösung konzipiert. Aufgrund der osmotischen Aktivität von Natriumionen

und dessen Bedeutung im Organismus, wurde als Negativkontrolle eine Lösung mit

derselben Natriumkonzentration hergestellt. Auf Grundlage der zugegebenen Menge

an NaOH wurde dafür die Natriumkonzentration der Propionatlösung berechnet. Die

enthaltene Menge Natrium entsprach einer 1,15 M Lösung. Wegen der einfachen

Verfügbarkeit und aufgrund des physiologischen Vorkommens, wurden die

Natriumionen als Kochsalz (NaCl, Roth, Karlsruhe) eingesetzt. Gemäß dem

Herstellungsprotokoll wurde Kaliumchlorid zugegeben, autoklaviert, und das

tiereigene Serum für die gebrauchsfertige Lösung zugemischt.


2.3.2.4 Versuchsaufbau und Blutentnahmen

Um die Anzahl der Versuchstiere gering zu halten, wurden Vorversuche

durchgeführt, in denen die Konzentration und Dauer der Infusionen optimiert wurde.

Die Behandlungsprotokolle wurden dabei ohne Gewebeentnahme durchgeführt. Fünf

dieser Versuche mit entsprechender Konzentration wurden in die statistische

Auswertung aufgenommen. Diese unterschieden sich allerdings in Dauer

(Infusionsdauer 255 min, Gesamtdauer 315 min) und Probennahmefrequenz

(15minütig). Die Versuchsdauer im Hauptversuch betrug 320 min (Infusionsdauer

260 min). Die Tiere wurden unmittelbar am Ende der Infusion getötet, und

Gewebeproben für die molekularbiologische Untersuchung entnommen (2.3.1). Eine

60-minütige Vorperiode vor jeder Infusion diente der Ermittlung der Basalwerte, und

die Infusion startete unmittelbar im Anschluss.

Die Probennahmefrequenz unterschied sich zwischen den Versuchen und den

beiden Tiergruppen. Bei den mit Propionat behandelten Tieren wurden

durchschnittlich 1,0 ml Blut in Intervallen von fünf Minuten entnommen. Um die

Belastung niedrig zu halten wurde bei den Tieren mit Kochsalzinfusion in

zehnminütigen Abständen entnommen. Glukose wurde in allen Blutproben

gemessen, so dass in beiden Versuchsabschnitten für die Propionatgruppe alle fünf

Minuten, in der Kontrollgruppe alle zehn Minuten ein Wert ermittelt wurde.

Leptin und Insulin wurde in der Propionatgruppe in den Vorversuchen in

fünfzehnminütigen Abständen, im Hauptversuch in zehnminütigen Abständen

gemessen, während in der Behandlungsgruppe alle zehn Minuten ermittelt wurde.

Das Serumprofil der freien Fettsäuren wurde durch hochfrequente

Probenuntersuchung zum Versuchsbeginn, beim Infusionsstart und am

Versuchsende charakterisiert. Zwischen der 60. – 210. Minute, wurde in

sechzigminütigen Abständen beprobt.

Die Infusionsgeschwindigkeit berechnet sich aus der Konzentration der Lösungen

und der Infusionsrate für Propionat von 96 µmol·kg-1·min-1. Die NaCl-Kontrolle wurde

entsprechend dem Körpergewicht mit einer äquivalenten Na-Konzentration und

Infusionsgeschwindigkeit appliziert.

In die Auswertung der Blutparameter wurden die fünf Infusionen der Vorversuche,

und neun des Hauptversuches einbezogen. Bei einem Tier wurde dieselbe Infusion

zweimal durchgeführt. Diese wurde über gemittelte Werte nur einmal in die

Auswertung miteinbezogen. Für die Blutparameter ergaben sich somit


37

Gruppengrößen von n=8 in der Propionatgruppe, und n=5 in der Kontrollgruppe. Für

die molekularbiologischen Analysen betrug die Gruppengröße für Propionat n=4, und

n=5 für die Kontrolle.

2.3.2.5 Statistische Auswertung

Für die statistische Auswertung kam das Statistikprogramm SAS® System 8e (SAS

Institute, Massachusettes, USA) zur Anwendung. Die Berechnung erfolgte mit dem

Algorithmus „Mixed Procedure“, um Veränderungen der Blutspiegel unter

Berücksichtigung der fixen Effekte Zeit, Behandlung und der Interaktionen

Zeit x Behandlung über den Versuchszeitraum zu untersuchen. Dabei werden

sowohl Effekte der Behandlung auf die Gruppen im gesamten Betrachtungszeitraum

als auch Einflüsse des Zeitverlaufs auf alle Tiere berücksichtigt. Die Probenfrequenz

wurde bei der statistischen Untersuchung mit dem mixed model (repeated

measurement) berücksichtigt.

Zudem können mögliche Effekte der Behandlung auf den zeitlichen Verlauf innerhalb

und zwischen den Gruppen anhand der Betrachtung von Einzelmessungen ermittelt

werden. Ein weiterer Vorteil diese Methode ist, dass sie die unterschiedliche Anzahl

von Messungen je Zeitpunkt berücksichtigt. Diese Voraussetzung ist aufgrund der

unterschiedlichen Probenintervalle bei den Versuchsgruppen und in den

Versuchsperioden notwendig (vgl. 2.3.2.4). Die Auswertung erfolgte nach Ermittlung

der Covarianzstruktur anhand des AIC (Akaike`s Information Criterion).

2.4 Untersuchung von Plasmaleptingehalt und Glukose-

stoffwechsel bei Ziegen peri partum

2.4.1 Versuchstiere

Die Versuchsgruppen setzten sich aus sechs Milchziegen der Rasse Weiße

Deutsche Edelziege zusammen. Die Tiere befanden sich durchschnittlich in der

vierten Trächtigkeit bzw. Laktationsnummer (zwei bis sechs Laktationen). Die

Behandlungen wurden im letzten Drittel der Trächtigkeit, durchschnittlich 23 Tage (21

bis 27 Tage) ante partum, sowie in der frühen Laktation um den 9. (8. – 11.) Tag post

partum vorgenommen. Das durchschnittliche Körpergewicht betrug zum Zeitpunkt

der Clamps 65,0 ± 5,7 kg (trächtig) und 65,8 ± 4,9 kg (laktierend; Mittelwert mit


SEM). Es wurde je Versuchstag ein Tier behandelt. Der Tierversuch wurde vom

Regierungsbezirk Köln unter dem Aktenzeichen 50.203.2-BN 13,28/02 genehmigt.

2.4.2 Hyperglykämischer Clamp und Euglykämisch/hyperinsulin-

ämischer Clamp

Die Glukose Clamp Technik wurde von DEFRONZO et al. (1979) beschrieben, um

die Sensitivität der Insulinsekretion und –aktivität bei Menschen zu messen. JANES

et al. (1985) wendete diese Methode bei Schafen zur Untersuchung des Einflusses

exogener und endogener Glukosegaben auf die Insulinsekretion an. Seitdem sind

vielerlei Anwendungen dieser Technik zur Untersuchung des Insulin- und

Glukosestoffwechsels und deren Beziehung zu diversen Stoffwechselwegen bei

verschiedenen Spezies beschrieben worden. Der hyperglykämische Clamp misst die

Sensitivität der pankreatischen ß – Zellen auf exogen zugeführte Glukose. Mit dem

euglykämisch/hyperinsulinämischen Clamp wird die Gewebesensitivität gegenüber

Insulin ermittelt. An den Tieren wurden beide Techniken angewandt. Am Morgen

wurde der hyperglykämische Clamp durchgeführt, nach einer mehrstündigen

Versuchspause folgte der euglykämisch/hyperinsulinämische Clamp.

Hyperglykämischer Clamp

Beim hyperglykämischen Clamp wird die basale Blutglukosekonzentration oder

physiologische Ausgangskonzentration durch eine intravenöse Glukoseinfusion um

einen vorher festgelegten Wert erhöht, und für einen bestimmten Zeitraum auf

diesem Niveau gehalten (Plateauphase). In diesem Versuch war die angestrebte

Erhöhung 2,22 mmol/l über der Ausgangskonzentration, die über 1 h gehalten

werden sollte. Das Versuchstier erhielt zwei Jugulariskatheter. Einer diente der

Blutentnahme, an den zweiten waren über ein T-Verbindungsstück die

Infusionslösungen angeschlossen. Die Versuchsvorbereitung, Katheterisierung und

Haltungsbedingungen sind unter 2.1.2 beschrieben.

Die Blutproben (ca. 1,5 ml) wurden in fünfminütigen Abständen entnommen. In

diesen Proben wurde mit dem Glukoseanalyzer direkt die Glukosekonzentration

bestimmt, zur Blutserumgewinnung aliquotiert und weiterverarbeitet (s. 2.2). Die

Werte der ersten beiden Proben wurden gemittelt und als basale Konzentration

definiert. Danach wurde die Infusion einer 20 %igen Glukoselösung (Braun

Melsungen AG, Melsungen) gestartet. Über die regelmäßigen Messungen wurde das


39

Erreichen des Sollwertes überwacht. Sobald dieser erreicht war, wurde die

Infusionsgeschwindigkeit gedrosselt, und der Glukosewert auf einem

gleichbleibenden Wert gehalten. Schwankungen des Wertes wurden gegebenenfalls

über eine Regulation der Infusionsgeschwindigkeit ausgeglichen. Die Versuchsdauer

eines hyperglykämischen Clamps betrug ungefähr 2 Stunden.

Euglykämisch/hyperinsulimämischer Clamp

Bei diesem Clampversuch wird der physiologische Insulinspiegel durch eine Infusion

künstlich erhöht. Gleichzeitig wird dem Abfall der Blutglukose durch eine

Glukoseinfusion entgegengewirkt. Wie beim hyperglykämischen Clamp erfolgte die

Blutentnahme und Glukosemessung in fünfminütigen Abständen, von denen die

ersten beiden Proben zur Festlegung des Ausgangswertes dienten. Die beiden

Infusionslösungen wurden über ein T-Verbindungsstück über einen der beiden

Katheter verabreicht, während der zweite Katheter der Blutentnahme diente.

Die Insulinlösung setzte sich aus bovinem Insulin (I5500, Sigma-Aldrich,Taufkirchen),

Kalium (KCl, ApplicChem, Darmstadt), tiereigenem Serum und 0,9 % NaCl - Lösung

(Braun Melsungen AG, Melsungen) zusammen. Zur Herstellung einer Stammlösung

von 1 mg/ml wurde Insulin in Essigsäure (1%; pH 2,0) gelöst, aliquotiert, bei

–20°C gelagert, und unmittelbar vor Versuchsbeginn unter sterilen Bedingungen

zusammen mit den anderen Komponenten in die physiologische Kochsalzlösung

verbracht. Diese Gebrauchslösung wurde in einer Infusionsgeschwindigkeit

verabreicht, die einer Insulinmenge von 50 ng · kg-1 Körpergewicht · min-1 entspricht.

Die Lösung enthielt außerdem 2 ml tiereigenes Serum auf 50 ml Lösung. Die Zugabe

tiereigenen Serums verhindert die Adsorption des Insulin an der Oberfläche der

Infusionsinstrumente, und puffert zusätzlich den sauren pH-Wert des gelösten

Insulins (JANES et al., 1985). KCl (20 g/l) wurde zur Vorbeugung einer Hypokaliämie

zugegeben (JANES et al., 1985; UNGEMACH, 1999).

Die Glukose wurde als 20 %ige Lösung (Braun Melsungen AG, Melsungen)

infundiert.

Zu Beginn dieses Versuchsteils wurden ebenfalls zwei Blutproben im fünfminütigen

Abstand als Basalwerte entnommen. Danach wurde unmittelbar die Infusion der

Insulinlösung gestartet. Mit Anstieg der Seruminsulinkonzentration folgte ein Abfall

des Blutglukosegehaltes. Dieser wurde durch Infusion von Glukose auf dem basalen


Niveau gehalten. Dem Abfall der Blutglukose wurde mit einer Erhöhung, einem

Anstieg mit einer Verminderung der Infusionsrate (GIR) gegengesteuert.

Nachdem das Plateau für sechzig Minuten erhalten wurde, konnte der Versuch

beendet werden. Die Infusionsdauer betrug ebenfalls ungefähr zwei Stunden.

2.4.3 Messgrößen

Es wurden Glukose, Insulin, Leptin und freie Fettsäuren (FFA) gemessen (s. 2.2).

Glukose, Insulin, Leptin und die Glukoseinfusionsrate (GIR) wurden für jeden

Messpunkt ermittelt. Die basale Konzentration von Insulin und Glukose im Blut wurde

aus dem arithmetischen Mittel der beiden ersten Werte bestimmt. Diese ist die

Grundlage für die Berechnung verschiedener Kenngrößen. Die GIR wurde anhand

der Infusionsgeschwindigkeit und der Glukosekonzentration der Infusionsrate

ermittelt. Sie bezeichnet die Menge an Glukose, die pro Zeiteinheit und Körpermasse

dem Tier eingegeben wird. Die GIR wird in der Plateauphase des Clamps bestimmt.

In dieser Phase der konstanten Blutglukosekonzentration entspricht die GIR

näherungsweise dem Verbrauch bzw. der Stoffwechselrate für Glukose (s.a. 2.4.5).

Für die FFA wurden je drei Proben vor Infusionsbeginn als Ausgangswerte, und die

drei letzten Proben gemessen.

Im Hyperglykämischen Clamp ist die Insulinsekretion der pankreatischen ß-Zellen

stimuliert, was zur Erhöhung der Glukoseaufnahme in die Zelle und Glykolyse führt.

In diesem Fall stellt die GIR ein Maß für die Glukoseaufnahme in die Zelle dar. Eine

hohe GIR entspricht einer hohen Aufnahmerate und umgekehrt.

Im euglykämisch/hyperinsulinämischen Clamp wird der Insulinspiegel festgesetzt.

Hier stellt die Menge verstoffwechselter Glukose ein Maß für die Sensitivität der

Körpergewebe auf exogenes Insulin dar. Eine hohe GIR weist in diesem Falle auf

eine hohe Stoffwechselrate der Körpergewebe hin bei gleicher Insulinrate, und ist

somit ein Maß für eine hohe Insulinsensitivität der Körperperipherie.

Zur weiteren Auswertung der Clamps wurden verschiedene Vergleichsgrößen

entwickelt.

2.4.4 Vergleichsgrößen

Gewebeinsulinsensitivität

Sie kennzeichnet die Ansprechbarkeit der Körpergewebe für Insulin, und errechnet

sich aus der GIR des hyperglykämischen Clamps pro Blutinsulinspiegel [mol · ml · kg-


41

1 · min-1 · ng-1] (DEFRONZO et al., 1979). Je höher dabei die verstoffwechselte

Menge Glukose, die durch die GIR gemessen wird, desto höher ist die

Gewebesensitivität. Sie setzt allerdings voraus, dass sich die zelluläre

Glukoseaufnahme unter hyperglykämischen Bedingungen nicht verändert.

Sens = GIRhyperglykämisch · (cInsulin)-1

Metabolische Clearance Rate (MCR)

Die MCR von Insulin charakterisiert das Verhältnis der pro Zeiteinheit

ausgeschiedenen oder metabolisierten Menge Insulin zur Niveauerhöhung der

Serumkonzentration durch Insulininfusion pro Zeiteinheit. Der Quotient wird nach

JANES et al. (1985) aus der mittleren Insulininfusionsrate im euglykämischen Clamp

und der Differenz von basaler und Insulinkonzentration im Plateau gebildet. Sie wird

in Volumen pro Zeiteinheit und Körpergewicht angegeben [ml · min-1· kg-1 ].

MCR = Insulininfusionsrate · (cPlateauinsulin - cbasales Insulin)-1

Systemic Delivery Rate (SDR)

Die SDR beschreibt die endogene systemische Sekretionsrate für Insulin, und

berechnet sich als Produkt aus MCR und Plateauinsulinwert des hyperglykämischen

Clamps (DEFRONZO et al., 1979). Sie ist ein Schätzwert für die sezernierte Menge

Insulin [ng · min-1 · kg-1].

SDR = MCR · cPlateauinsulin

2.4.5 Erfassung der Milchmenge und Laktosekonzentration

Mit Erfassung von Milchmenge und deren Laktosegehalt sollten mögliche Einflüsse

eines Glukoseverbrauchs durch Laktoseefflux über die Milch bei den laktierenden

Versuchstieren untersucht werden.

Die Milchmenge wurde eine Woche vor und nach der Clampstudie für jedes Tier mit

dem regelmäßigen Melken erfasst. Die Intervalle zwischen der morgendlichen und

abendlichen Milchentnahme waren unterschiedlich lang. Sie betrugen ca. 16 und 8

Stunden. Die Milchmenge wurde in ein Verhältnis zu den Zeitintervallen (h) gesetzt.


Am Versuchstag wurden aus beiden Gemelken jeweils Proben entnommen, und

deren Laktosegehalt bestimmt. Diese Untersuchung wurde vom

Landeskontrollverband Rheinland e.V. durchgeführt. Die Messung erfolgte per

Infrarotmessung mit dem Milko Scan 6000 (Foss-electric, Hillerød, Dänemark).

2.4.6 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung der Leptinserumkonzentration erfolgt mit der Mixed

Model Anwendung des Statistikprogramms SAS® System 8e (SAS Institute,

Massachusettes, USA). Für alle anderen Parameter wurde die Varianzanalyse nach

dem Allgemeinen Linearen Modell (GLM) desselben Statistikprogramms angewandt.

Wie bereits erwähnt wird die Auswertung der Clampstudien in der Phase konstanter

Infusionsbedingungen hyper- oder euglykämischer Bedingungen (Plateauphase)

vorgenommen. Um diese Zeitfenster zu ermitteln, wurde tierindividuell die Phase der

geringsten Schwankungen der Blutglukosekonzentrationen identifiziert. Die beiden

Untersuchungsgruppen T (trächtig) und L (laktierend) wurden daraufhin untersucht,

ob sich die Abweichungen der Blutglukosewerte signifikant voneinander

unterscheiden. Zur Auswertung wurde der t-Test für gepaarte Stichproben, bzw. der

Rangsummentest nach Mann und Whitney für nicht-normalverteilte Messreihen

angewandt. Sie wurden auf die Nullhypothese, dass keine Unterschiede zwischen

den Werten im vorgegebenen Zeitraum vorliegen für die Gruppen getestet. Bei

keinem der Tiere waren in dieser Phase signifikante Schwankungen der GIR-Werte

gegeben, und so konnte für alle Tiere eine Plateauphase angenommen werden.

Gleichzeitig wurde die Übereinstimmung der Blutwerte in der Vorperiode und die

Glukoseniveaus zwischen den Gruppen getestet (SigmaStat 2.03; Systat Software

Inc.).

Für die FFA wurden die Werte nach Tiergruppe, Clampart und Probenzeitpunkt

(Versuchsbeginn oder –ende) unterschieden.

Ebenso wurden die Veränderungen der Milchleistung nach dem allgemeinen linearen

Modell auf Veränderungen eine Woche vor und nach dem Versuch, sowie direkte

Veränderungen am Versuchstag und dem darauffolgenden Tag, untersucht.

Ergebnisse 43

3 Ergebnisse

3.1 Effekte intravenöser Propionatinfusionen auf verschiedene

Zielparameter

3.1.1 Beeinflussung der mRNA-Mengen in verschiedenen Geweben

3.1.1.1 Qualität der Gesamt-RNA

Die Gesamt-RNA wurde nach Integrität und Reinheit beurteilt. Die Integrität wurde

anhand der 28S und 18S-Bande bestimmt. Ein Verhältnis von 2 : 1 spricht für eine

undegradierte, intakte RNA (Ivell, 1998). Wie aus Abb. 4 ersichtlich ist, wurden diese

Anforderungen an die Qualität der Gesamt-RNA erfüllt. Bei deutlichen Abweichungen

von diesem Qualitätsmerkmale wurde die RNA verworfen, und eine äquivalente

Gewebeprobe extrahiert.

3.1.1.2 cDNA-Sequenz der langen Form des Leptinrezeptor und putativen G-

proteingekoppelten Rezeptor GPR41 bei der Ziege

Die analysierte partielle cDNA des Leptinrezeptors umfasst 383 Basenpaare

(s. Abb. 5), was auch durch die Sequenzierung bestätigt wird. Abzüglich der Primer

konnte somit ein 343 Basenpaare umfassendes Segment des langen Leptinrezeptors

unter der Accession number AY846770 (Capra hircus leptin receptor long form

mRNA, partial cds.) in Genbank veröffentlicht werden. Nukleotid 123 zeigte sowohl

bei der Sequenzierung des Plusstranges, als auch des komplementären Stranges

28S rRNA 18S rRNA

Abb. 4: Beispiel einer denaturierenden Gelelektrophorese (Formaldehyd/MOPS) von

Gesamt-RNA zur Kontrolle der Qualität nach Extraktion und DNasebehandlung.

Ergebnisse 44

ein uneindeutiges Signal, das für Cytidin oder Thymidin spricht. Der

Homologievergleich weist an dieser Stelle für Schaf (Ovis aries) und Rind (Bos

taurus) Cytidin aus.

Die Übereinstimmung zu diesen Wiederkäuern nach BLAST liegt bei 97 % (U62124)

und 94 % (NM001012285), die Sequenz des Schweines weist 83 % (AF036908)

Übereinstimmung auf. Die Sequenz stimmt zu 80 % mit jener von Homo sapiens

(NM_005304) überein (s. Abb. 7).

Das zu sequenzierende Fragment des GPR41 bestand aus 215 Nukleotiden (Abb.

5). Ohne Primer entspricht das 178 Nukleotiden, die unter der Accession number

AY885226 (Capra hircus putative G-protein coupled receptor 41 mRNA, partial cds.)

in Genbank veröffentlicht wurden.

Der Homologievergleich mit bereits bekannten Sequenzen zeigt eine

Übereinstimmung von 99 % mit der des Schafes (DQ361027), 97 % Rind

(XM_605910), und 88 % zur humanen Sequenz (NM_005304) (sh. Abb. 8).

3.1.1.3 Gelelektrophorese der real-time PCR-Amplifikate

In der beispielhaften Darstellung in Abb. 6 sind die amplifizierten Fragmente der real-

time RT-PCR-Assays gezeigt. Zum Vergleich der Fragmentlängen ist der

Größenmarker ΦX174 DNA/BsuRI (HaeIII) aufgetragen. Die Banden der kurzen

Markerfragmente sind in dieser Abbildung allerdings nicht darstellbar. Im Original

sind diese jedoch deutlich zu unterscheiden. Alle Banden der PCR-Produkte sind klar

abgegrenzt und ohne Schlieren.

Ergebnisse 45

1 2 3

1353

1078

872

692

310

281

271

234

194

118

72

383 bp

215 bp

1 2 3

1353

1078

872

692

310

281

271

234

194

118

72

383 bp

215 bp

Abb. 5: Darstellung der PCR-

Fragmente zur

Sequenzierung in einem

2%igen Agarosegel mit

Puffersystem TBE, gefärbt

mit Ethidiumbromid:

1: Marker ΦX174

DNA/BsuRI (HaeIII) (Banden

der kurzen Markerfragmente

sind in dieser Abbildung

nicht darstellbar, im Original

jedoch deutlich zu

unterscheiden); 2:

Leptinrezeptor; 3: G-

proteingekoppelter

Rezeptor 41 (GPR41).

Abb. 6: Darstellung der Fragmente von Zielgenen und interner Kontrolle aus der real-time

RT-PCR in einem 2%igen Agarosegel mit Puffersystem TBE, gefärbt mit

Ethidiumbromid.

1 u. 6: Marker ΦX174 DNA/BsuRI (HaeIII); 2: 18S rRNA; 3: Leptin; 4:

Leptinrezeptor; 5: G-proteingekoppelter Rezeptor 41 (GPR41).

1 2 3 4 5 6

183 bp

74 bp 89 bp 81 bp

1353

1078

872

692

310

281

271

234

194

118

72

1353

1078

872

692

310

281

271

234

194

118

72

Ergebnisse 46

cLEPR 1 TACATCATGGAAAAATAAAGATGAGATGGTGCCAACAACTACAGATGCTCTGCTTTT 57

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||

oLEPR 102 TACATCATGGAAAAATAAAGATGAGATGGTGCCAACAACTACAGATGCCCTGCTTTT 158

cLEPR 58 GACGACTCCAGATCTTGGAAAGGGTTCTATTTGTATTAGTGACCAGTGCAGCAGTGC 114

||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

oLEPR 159 GAC---TCCAGATCTTGGAAAGGGTTCTATTTGTATTAGTGACCAGTGCAGCAGTGC 212

cLEPR 115 TCAGTTCTYTGAGGCTGAGAGCACAGACATAACCTGTGAGGATGGAAGCAGGAGACA 171

| |||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

oLEPR 213 TGAGTTCTCTGAGGCTGAGAGCACAGACATAACCTGTGAGGATGGAAGCAGGAGACA 269

cLEPR 172 GCCCTCTGTTAAATATGCCACCCTGCTCGGCAGCTCTAAATCAGGTGAAGCCGAGGA 228

|||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||

oLEPR 270 GCCCTCTGTTAAATATGCCACCCTCGTCGGCAGCTCTAAATCAGGTGAAGCCGAGGA 326

cLEPR 229 GGAGCAAGGGCTTATAAACAGCTCAGCCAGCAAGTGCTTCTTGAGCAACCATTCTTC 385

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |

oLEPR 327 GGAGCAAGGGCTTATAAACAGCTCAGCCAGCAAGTGCTTCTTGAGCAACCATTCTCC 383

cLEPR 386 ACCAAAGGAGTCTTCCTCTAAGAGATCATGGGAAATAGAAACCCAGGCATTTTTTATA 343

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

oLEPR 384 ACCAAAGGAGTCTTCCTCTAAGAGATCATGGGAAATAGAAACCCAGGCATTTTTTATA 441

cLEPR 1 TACATCATGGAAAAATAAAGATGAGATGGTGCCAACAACTACAGATGCTCTGCTTTT 57

|||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||| |||||

bLEPR 2772 TACATCATGGAAAAATAAAGATGAGATGGTGCCAGCAACTACAGATGCTCTACTTTT 2828

cLEPR 58 GACGACTCCAGATCTTGGAAAGGGTTCTATTTGTATTAGTGACCAGTGCAGCAGTGC 114

||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||

bLEPR 2829 GACGACTCCAGATCTTGAAAAGGGTTCTATTTGTATTAGTGACCAATGCAGCAGTGC 28985

cLEPR 115 TCAGTTCTYTGAGGCTGAGAGCACAGACATAACCTGTGAGGATGGAAGCAGGAGACA 1871

||| |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||

bLEPR 2886 TCAATTCTCTGAGGCTGAGAGCACAGACATAACCTGTGAGGATGAGAGCAGGAGACA 2942

cLEPR 172 GCCCTCTGTTAAATATGCCACCCTGCTCGGCAGCTCTAAATCAGGTGAAGCCGAGGA 228

|||||||||||||||||||||||||||| ||| |||||||||||||||| | |||||

bLEPR 2943 GCCCTCTGTTAAATATGCCACCCTGCTCAGCAACTCTAAATCAGGTGAAACTGAGGA 2999

cLEPR 229 GGAGCAAGGGCTTATAAACAGCTCAGCCAGCAAGTGCTTCTTGAGCAACCATTCTTC 285

||||||||| |||||||| ||||||| |||||| ||||| ||||||||| ||||| |

bLEPR 3000 GGAGCAAGGACTTATAAATAGCTCAGTCAGCAAATGCTTTTTGAGCAACAATTCTCC 3056

cLEPR 286 ACCAAAGGAGTCTTCCTCTAAGAGATCATGGGAAATAGAAACCCAGGCATTTTTTATA 343

||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

bLEPR 3067 ACCAAAGGATTCTTCCTCTAAGAGATCATGGGAAATAGAAACCCAGGCATTTTTTATA 3114

Abb. 7: Vergleichende Darstellung der partiellen cDNA-Sequenzen der langen Form des

Leptinrezeptors mit ausgewählten Arten: AY846770 Capra hircus (cLEPR);

U62124 Ovis aries (oLEPR); NM001012285 Bos taurus (bLEPR), mit

Bindungsstellen der real-time PCR Primer (unterstrichen) und TaqMan-Sonde

(Fettdruck).

Quelle: PubMed, Basic local alignment search tool (BLAST) (ALTSCHUL et al.,

1990)

Ergebnisse 47

cGPR41: 1 ATCTTCGTGGGCAAGCTGCGGCGCCGCCCGGTGGCCGTGGACGTGCTCTTGCTAAAT 57

|||||||||||||||||||||||||||||| |||| ||||||||||||||||||||

bGPR41: 137 ATCTTCGTGGGCAAGCTGCGGCGCCGCCCGCTGGCTGTGGACGTGCTCTTGCTAAAC 193

cGPR41: 58 CTCACCCTCTCGGACCTGGTCCTGTTGCTCTTCCTGCCGTTCCGCATGGTGGAGGCG 114

||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||

bGPR41: 194 CTCACCCTCTCGGATCTGGTCCTGTTGCTCTTCCTGCCGTTCCGCATGGTGGAGGCA 250

cGPR41: 115 GCCAGTGCCATGCACTGGTCCCTGCCCTTCGTCTTCTGCCCCTTCTCCAGGTTCCTC 171

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

bGPR41: 251 GCCAGTGCCATGCACTGGTCCCTGCCCTTCGTCTTCTGCCCCTTCTCCAGGTTCCTC 307

cGPR41: 172 TTCTTCA 178

|||||||

bGPR41: 308 TTCTTCA 314

cGPR41: 14 AGCTGCGGCGCCGCCCGGTGGCCGTGGACGTGCTCTTGCTAAATCTCACCCTCTCGG 70

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||

oGPR41: 1 AGCTGCGGCGCCGCCCGGTGGCCGTGGACGTGCTCTTGCTAAACCTCACCCTCTCGG 57

cGPR41: 71 ACCTGGTCCTGTTGCTCTTCCTGCCGTTCCGCATGGTGGAGGCGGCCAGTGCCATGC 127

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

oGPR41: 58 ACCTGGTCCTGTTGCTCTTCCTGCCGTTCCGCATGGTGGAGGCGGCCAGTGCCATGC 114

cGPR41: 128 ACTGGTCCCTGCCCTTCGTCTTCTGCCC 155

||||||||||||||||||||||||||||

oGPR41: 115 ACTGGTCCCTGCCCTTCGTCTTCTGCCC 142

cGPR41: 2 TCTTCGTGGGCAAGCTGCGGCGCCGCCCGGTGGCCGTGGACGTGCTCTTGCTAAATC 58

|||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||| |||| || |

hGPR41: 123 TCTTCGTGGGCAAGCTGCAGCGCCGCCCGGTGGCCGTGGACGTGCTCCTGCTCAACC 179

cGPR41: 59 TCACCCTCTCGGACCTGGTCCTGTTGCTCTTCCTGCCGTTCCGCATGGTGGAGGCGG 115

| ||| |||||||||| ||||| |||| |||||||| ||||||||||||||||| |

hGPR41: 180 TGACCGCCTCGGACCTGCTCCTGCTGCTGTTCCTGCCTTTCCGCATGGTGGAGGCAG 236

cGPR41: 116 CCAGTGCCATGCACTGGTCCCTGCCCTTCGTCTTCTGCCC 155

|||| |||||||||||| ||||||||||| || |||||||

hGPR41: 237 CCAATGGCATGCACTGGCCCCTGCCCTTCATCCTCTGCCC 276

cGPR41: 2 TCTTCGTGGGCAAGCTGCGGCGCCGCCCGGTGGCCGTGGACGTGCTCTTGCTAAATC 58

|||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| |||| || |

hGPR42: 123 TCTTCGTGGGCAAGCTGCGGTGCCGCCCGGTGGCCGTGGACGTGCTCCTGCTCAACC 179

cGPR41: 59 TCACCCTCTCGGACCTGGTCCTGTTGCTCTTCCTGCCGTTCCGCATGGTGGAGGCGG 115

| ||| |||||||||| ||||| |||| |||||||| ||||||||||||||||| |

hGPR42: 189 TGACCGCCTCGGACCTGCTCCTGCTGCTGTTCCTGCCTTTCCGCATGGTGGAGGCAG 236

cGPR41: 116 CCAGTGCCATGCACTGGTCCCTGCCCTTCGTCTTCTGCCC 155

||| |||||||||||| ||||||||||| || |||||||

hGPR42: 237 CCAATGGCATGCACTGGCCCCTGCCCTTCATCCTCTGCCC 276

Abb. 8: Vergleichende Darstellung der partiellen cDNA-Sequenzen des GPR41 mit

ausgewählten Arten: AY885226 Capra hircus (cGPR41); XM_605910 Bos taurus

(bGPR41); DQ361027 Ovis aries (oGPR41); NM_005304 Homo sapiens FFA(3)R/

hGPR41,

Ergebnisse 48

3.1.1.4 Ergebnisse der mRNA-Quantifizierung

Die Ergebnisse der Standardkurvenvalidierung sind in Tab. 2 dargestellt. Die

Ergebnisse der relativen Quantifizierung sind im Anhang, sowie graphisch in Abb. 9

dargestellt (Mittelwerte ± SEM).

Der Variationskoeffizient der cDNA-Synthesen wurde anhand der

Quantifizierungsergebnisse (DNA-Menge) von 18S für die beiden cDNA-Proben

einer RNA-Präparation ermittelt. Er liegt für alle Reaktionen zwischen 5-84%. Nach

Geweben geordnet betragen diese 21-84% in Leber-, 5-45% in Muskelgewebe und

8-30% in Organ- bzw. Subkutanfettgewebe.

Der durchschnittliche Variationskoeffizient der Duplikate (DNA-Menge) in den PCR-

Assays beträgt 9-19% (18S rRNA), 9-14% (Leptin), 8-16% (Leptinrezeptor) und 10-

16% (putativer GPR41).

Tab. 2: Effizienz und Wiederholbarkeit der real time RT-PCR

Fragment Effizienz

(Mittelwert ± SEM)

Interassay -

Variationskoeffizient

Leptin 1,95 ± 0,02 (n = 8) 9,4% (n = 9)

Leptinrezeptor 2,05 ± 0,09 (n = 6) 11,8% (n = 5)

G-proteingekoppelter

Rezeptor

1,98 ± 0,04 (n = 5) 4,0% (n = 5)

18S rRNA 2,01 ± 0,05 (n = 5) 11,9% (n = 6)

3.1.1.4.1 Unterschiede der mRNA-Mengen in den Fettgeweben

Es bestanden keine signifikanten Unterschiede der mRNA-Menge von Leptin,

Leptinrezeptor und putativem GPR41 zwischen Subkutanfett und Perirenalfett.

Allerdings ist die mRNA von Leptin (p = 0,060) und des Leptinrezeptors (p = 0,095)

im Subkutanfett tendenziell höher exprimiert, als im Perirenalfett. Demgegenüber

mit Bindungsstellen der real-time PCR Primer (unterstrichen) und TaqMan-Sonde

(Fettdruck).

Quelle: PubMed, Basic local alignment search tool (BLAST) (ALTSCHUL et al.,

1990)

Ergebnisse 49

wird tendenziell mehr GPR41-mRNA im Perirenalfett als im Subkutanfett

nachgewiesen (p = 0,062).

3.1.1.4.2 Leptin

Die Propionatinfusion führt im perirenalen Fettgewebe zu einer tendenziellen

Erhöhung der Leptin-mRNA um das 3,2-fache (p = 0,081). Im subkutanen Fett ist der

Mittelwert etwas erhöht, erreichte jedoch kein signifikantes Niveau (1,9-fach,

p = 0,106).

3.1.1.4.3 Lange Form des Leptinrezeptors

Die Mittelwerte der ob-Rb-mRNA sind in allen vier untersuchten Gewebearten in der

Propionatgruppe geringer als in der Kontrollgruppe. Signifikante Unterschiede lassen

sich allerdings nur im perirenalen Fett nachweisen (4,2-fach; p= 0,042). Die

Absenkungen durch die Behandlung um das 4,5, 2,6 bzw. 1,7-fache im Unterhautfett,

Muskel- und Lebergewebe sind nicht signifikant (p = 0,286; p = 0,127 u. p = 0,338).

3.1.1.4.4 Putativer G-proteingekoppelter Rezeptor GPR41

Der Vergleich der GPR41-mRNA in den beiden Fettgewebsarten zeigt eine deutliche

Erhöhung in den subkutan entnommenen Proben bei der Propionatgruppe (12-fach;

p=0,029). In den perirenal entnommen Proben ist kein Unterschied zwischen den

beiden Gruppen zu verzeichnen (p = 0,756).

Ergebnisse 50

Rel

ativ

e G

ene

xpre

ssio

n [L

eptin

/ 1

8S r

RN

A] Perirenalfett

p < 0,1

Subkutan-fett

n.s.

0,01

0,008

0,006

0,004

0

0,002

Rel

ativ

e G

ene

xpre

ssio

n [L

eptin

reze

ptor

/ 18

S r

RN

A]

Muskel

n.s.

Leber

n.s.

10-3

10-4

10-5

10-6

Rel

ativ

e G

ene

xpre

ssio

n [G

PR

41 /

18S

rR

NA

] Perirenalfett

n.s.

Subkutanfett

p < 0,05

10-3

10-4

10-5

10-6

Rel

ativ

e G

ene

xpre

ssio

n [L

eptin

reze

ptor

/ 18

S r

RN

A]

Perirenalfett

p < 0,05

Subkutan-fett

n.s.

10-3

10-4

10-5

10-6

Kontrolle (n=5) Propionat (n=4)

Rel

ativ

e G

ene

xpre

ssio

n [L

eptin

/ 1

8S r

RN

A] Perirenalfett

p < 0,1

Subkutan-fett

n.s.

0,01

0,008

0,006

0,004

0

0,002

Rel

ativ

e G

ene

xpre

ssio

n [L

eptin

reze

ptor

/ 18

S r

RN

A]

Muskel

n.s.

Leber

n.s.

10-3

10-4

10-5

10-6

Rel

ativ

e G

ene

xpre

ssio

n [G

PR

41 /

18S

rR

NA

] Perirenalfett

n.s.

Subkutanfett

p < 0,05

10-3

10-4

10-5

10-6

Rel

ativ

e G

ene

xpre

ssio

n [L

eptin

reze

ptor

/ 18

S r

RN

A]

Perirenalfett

p < 0,05

Subkutan-fett

n.s.

10-3

10-4

10-5

10-6


Rel

ativ

e G

ene

xpre

ssio

n [L

eptin

/ 1

8S r

RN

A] Perirenalfett

p < 0,1

Subkutan-fett

n.s.

0,01

0,008

0,006

0,004

0

0,002

Rel

ativ

e G

ene

xpre

ssio

n [L

eptin

reze

ptor

/ 18

S r

RN

A]

Muskel

n.s.

Leber

n.s.

10-3

10-4

10-5

10-6

Rel

ativ

e G

ene

xpre

ssio

n [G

PR

41 /

18S

rR

NA

] Perirenalfett

n.s.

Subkutanfett

p < 0,05

10-3

10-4

10-5

10-6

Rel

ativ

e G

ene

xpre

ssio

n [L

eptin

reze

ptor

/ 18

S r

RN

A]

Perirenalfett

p < 0,05

Subkutan-fett

n.s.

10-3

10-4

10-5

10-6


Rel

ativ

e G

ene

xpre

ssio

n [L

eptin

/ 1

8S r

RN

A] Perirenalfett

p < 0,1

Subkutan-fett

n.s.

0,01

0,008

0,006

0,004

0

0,002

Rel

ativ

e G

ene

xpre

ssio

n [L

eptin

reze

ptor

/ 18

S r

RN

A]

Muskel

n.s.

Leber

n.s.

10-3

10-4

10-5

10-6

Rel

ativ

e G

ene

xpre

ssio

n [G

PR

41 /

18S

rR

NA

] Perirenalfett

n.s.

Subkutanfett

p < 0,05

10-3

10-4

10-5

10-6

Rel

ativ

e G

ene

xpre

ssio

n [L

eptin

reze

ptor

/ 18

S r

RN

A]

Perirenalfett

p < 0,05

Subkutan-fett

n.s.

10-3

10-4

10-5

10-6


Abb. 9: Vergleich der mRNA-Expression zwischen Propionat- und Kontrollgruppe.

Die Darstellung zeigt die relative mRNA-Menge von Leptin, Leptinrezeptor und

GPR41 zu 18S rRNA in Leber, Muskel, perirenalem und subkutanem Fett

(Mittelwerte ± SEM).

NaCl-Kontrolle Propionat

Ergebnisse 51

3.1.2 Veränderungen spezifischer Blutparameter durch intravenöse

Propionatinfusion

3.1.2.1 Leptin

Aufgrund der geringen Tierzahlen, der unterschiedlichen Untersuchungsfrequenz

zwischen Vorversuch und Hauptversuch und der großen individuellen Variabilität der

Leptinkonzentrationen, wurden für die statistische Auswertung die Werte zu

Intervallen zusammengefasst. Die Größe dieser Intervalle wurde, nach der

geringsten durchgeführten Untersuchungsfrequenz, mit 15 Minuten festgelegt, und

umfasst alle Messpunkte des jeweiligen Zeitraumes. Eine Einschränkung dieses

Systems ergibt sich für das letzte Intervall. Bei konsequenter Anwendung fallen in

diesen Bewertungsabschnitt nur die Werte der letzten Blutentnahmen in der 260.

Minute, mit einer reduzierten Tierzahl. Dies kann allerdings vernachlässigt werden,

da eine veränderte Intervallbildung keinen Einfluss auf die statistischen Ergebnisse

hat (Daten nicht gezeigt).

Die Ausgangswerte der Serumleptinkonzentrationen in den beiden Tiergruppen

unterscheiden sich nicht, mit Beginn der Infusionen trennen sich jedoch die

Verlaufskurven von Propionat- und Kontrollgruppe. Es bestehen hochsignifikante

Interaktionen zwischen der Behandlung und dem Zeitverlauf (p ≤ 0,001). Der Graphik

(Abb. 10) ist zu entnehmen, dass die Werte in der Vorphase, bis zur 30.

Infusionsminute, keine relevanten Unterschiede aufweisen. Danach beginnen die

beiden Kurven zu divergieren, wobei die Kurve der Propionatgruppe oberhalb der

Kontrollgruppe verläuft. Über die Auswertung der Einzelwerte (vgl. 2.3.1.5) können

zudem in der Kontrollgruppe signifikant erniedrigte Werte zwischen der 75. und 90.

Minute, sowie zwischen der 105. und 150. Minute, gegenüber den Werten zu Beginn

des Versuches, beobachtet werden (p ≤ 0,01). In der Propionatgruppe hingegen lässt

sich ein signifikanter Anstieg von Leptin in den letzten beiden Zeitintervallen

gegenüber einzelnen Intervallen der Vorperiode und des ersten Drittels der

Behandlungsphase nachweisen (p ≤ 0,01).

3.1.2.2 Insulin

Bei Insulin zeigt sich ein hochsignifikanter Effekt der Interaktion BehandlungxZeit

(p ≤ 0,001; Abb. 10). Wie aus dem Schaubild ersichtlich, verläuft die Insulinkurve der

Ergebnisse 52

Kontrollgruppe auf einem Niveau, das über den gesamten Versuchszeitraum

beibehalten wird.

Dagegen zeigt die Behandlungsgruppe einen deutlichen Anstieg nach Beginn der

Infusion (Behandlung x Zeit p ≤ 0,001). Die Auswertung der einzelnen

Messzeitpunkte weist einen Spitzenwert zwischen 15 und 30 Minuten nach

(p ≤ 0,001). Die Kurve flacht zwischen der 45. und 60. Behandlungsminute ab. Sie

verläuft anschließend auf einem erhöhten Niveau. Die Auswertung der einzelnen

Messzeitpunkte weist ab der 225. Minute einen Anstieg gegenüber dem

davorliegenden Plateau nach (p ≤ 0,01).

3.1.2.3 Glukose

Auch die Glukose zeigt eine hochsignifikante Interaktion aus Behandlung und Zeit

(p ≤ 0,001; Abb. 10). Nach einem überlappenden Verlauf der beiden Kurven in der

Vorperiode kommt es zum Anstieg der Glukosekurve der Propionatgruppe nach Start

der Infusion, während die Kontrollgruppe bis zum Ende des Versuches keiner

Veränderung unterliegt. Der Anstieg ist zwischen der 10. und 30. Minute gegenüber

der Vorperiode signifikant erhöht (p ≤ 0,001), mit dem Höhepunkt um die 20. Minute

(4,84 mmol/l). Zwischen der 45. und der 80. Minute fallen die Werte auf das

Ausgangsniveau zurück, worauf wiederum ein signifikanter Anstieg folgt

(7,44 mmol/l), der bis zum Versuchsende anhält und den ersten Höhepunkt

übertrifft, während die Kurve allmählich abflacht (p ≤ 0,001).

3.1.2.4 Freie Fettsäuren

Die Propionatbehandlung der Ziegen führt im Vergleich zu den Kontrolltieren zu

signifikant unterschiedlichem Verlauf der freien Fettsäuren im Blutserum über den

Versuchszeitraum (Behandlung x Zeit p ≤ 0,01). Die Ausgangswerte unterscheiden

sich nicht zwischen den beiden Gruppen. Wenngleich sich keine Signifikanzen bei

Vergleich der Einzelwerte bilden, ist aus dem Schaubild ein Abfall der Werte nach

Start der Propionatinfusion zu verzeichnen, dessen Scheitelpunkt mit der Messspitze

bei Insulin und Glukose zusammenfällt. Im 2. Drittel der Infusionsphase gleichen sich

die Fettsäurenwerte der beiden Gruppen an, wobei sich die beiden Kurven

tendenziell reziprok verhalten. Während bei den Behandlungstieren gegen

Versuchsende die Fettsäurenwerte erneut abfallen, steigen diese bei den

Kontrolltieren steil an.

Ergebnisse 53

8,0

6,0

4,0

2,0

0

-60 -30 0 30 60 90 120 150 180 210 240 260

3,2

3,0

2,8

2,6

2,4

2,2

2,0

25

20

15

10

5

0

Glu

kose

(mm

ol/l)

Insu

lin (

ng/m

l)Le

ptin

(ng/

ml)

min

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

Fre

ie F

etts

äure

n (m

mol

/l)

Behandlung x Zeit: p ≤ 0,01




KontrollePropionat KontrollePropionat

8,0

6,0

4,0

2,0

0

-60 -30 0 30 60 90 120 150 180 210 240 260

3,2

3,0

2,8

2,6

2,4

2,2

2,0

25

20

15

10

5

0

Glu

kose

(mm

ol/l)

Insu

lin (

ng/m

l)Le

ptin

(ng/

ml)

min

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

Fre

ie F

etts

äure

n (m

mol

/l)






8,0

6,0

4,0

2,0

0

-60 -30 0 30 60 90 120 150 180 210 240 260

3,2

3,0

2,8

2,6

2,4

2,2

2,0

25

20

15

10

5

0

Glu

kose

(mm

ol/l)

Insu

lin (

ng/m

l)Le

ptin

(ng/

ml)

min

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

Fre

ie F

etts

äure

n (m

mol

/l)





KontrollePropionat KontrollePropionat KontrollePropionat KontrollePropionat

8,0

6,0

4,0

2,0

0

-60 -30 0 30 60 90 120 150 180 210 240 260

3,2

3,0

2,8

2,6

2,4

2,2

2,0

25

20

15

10

5

0

Glu

kose

(mm

ol/l)

Insu

lin (

ng/m

l)Le

ptin

(ng/

ml)

min

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

Fre

ie F

etts

äure

n (m

mol

/l)






Abb. 10: Verlauf der Serumkonzentrationen von Leptin, Insulin und freien Fettsäuren, und

Glukosewerte im Vollblut, in Behandlungs- (n = 8) und Kontrollgruppe (n = 5)

(Mittelwerte ± SEM).

Ergebnisse 54

3.2 Veränderungen im Glukosestoffwechsel bei trächtigen und

bei laktierenden Ziegen

3.2.1 Hyperglykämischer Clamp

Die während des hyperglykämischen Clamps beobachteten Blutwerte und die

verschiedenen berechneten Infusionsparameter sind in Tabelle 3 zusammengefasst.

In beiden Gruppen wurde eine Erhöhung der basalen Glukosewerte um 2,22 mM

erreicht, und über eine Phase von einer Stunde aufrechterhalten. Die Abweichungen

der Glukosewerte von den Mittelwerten der beiden Gruppen im

Untersuchungszeitraum sind normalverteilt, und zeigen keine signifikanten

Abweichungen. Somit kann in beiden Gruppen ein hyperglykämisches Plateau für

eine Stunde angenommen werden.

Die Glukoseinfusionsrate unterschied sich zwischen den beiden Gruppen. Bei den

laktierenden Tieren lag diese gegenüber den trächtigen Tieren annähernd doppelt so

hoch. Um das Glukoseplateau möglichst rasch zu erreichen, wurde die Behandlung

mit einer Sturzinfusion eingeleitet, die sich in der Kurve mit einem initialen Anstieg

darstellt (s. Abb. 11). Nach der Überwindung des Volumeneffektes, stellt sich dann

bei beiden Gruppen im Beobachtungszeitraum eine Phase der konstanten

Infusionsrate (Plateau) ein.

Wenngleich die Basiswerte von Insulin bei den trächtigen Tieren um ca. 20% höher

liegen als bei den laktierenden, unterschieden diese sich nicht signifikant. Mit Beginn

der Glukoseinfusion kommt es bei allen Tieren zu einem Anstieg. Nach 25 Minuten

flacht die Kurve bei beiden Gruppen ab, und beide verlaufen über den gesamten

Beobachtungszeitraum parallel zur x-Achse. In dieser Plateauphase sind die

Insulinwerte bei den trächtigen Tieren gegenüber den Ausgangswerten verdreifacht,

und damit signifikant höher als die der laktierenden Tiere, welche das zweifache

Niveau der Vorperiode aufweisen.

Die geschätzte endogene Sekretionsrate an Insulin (SDR) und die

Gewebesensitivität für Insulin ist bei den laktierenden Tieren signifikant erhöht.

Während die SDR jedoch nur mäßig erhöht ist, ist die Sensitivität bei den

laktierenden Tieren mehr als verdoppelt.

Dagegen ist der Glukosegehalt/GIR-Quotient bei den Tieren in der Gravidität erhöht.

Zum Erhalt derselben Blutglukosekonzentration muss weniger Glukose infundiert

werden.

Ergebnisse 55

Tab. 3: Vergleich der Blut- und Infusionsparameter im hyperglykämischen

Clamp (Mittelwerte ± SEM).

Trächtig Laktierend p-Wert

Glukoseerhöhung 2,19 ± 0,02 mM 2,23 ± 0,02 mM > 0,1

GIR 10,4 ± 0,3 mmol·kg-1·min-

1

19,6 ± 0,5 mmol·kg-1·min-1 ≤ 0,05

Insulin

(Basalwerte)

0,41 ± 0,04 ng/ml;

Gruppe 0,31 ± 0,04 ng/ml > 0,1

Insulin

(Plateauphase) 1,4 ± 0,09 ng/ml

0,8 ± 0,03 ng/ml). ≤ 0,05

SDR 15,6 ± 1,04 mol·ml·kg-

1·min-1·ng-1

20,0 ± 1,19 mol·ml·kg-

1·min-1·ng-1 ≤ 0,05

Sensitivität 10,1 ± 0,66 mg·min·g-1 26,9 ± 1,18 mg·min·g-1 ≤ 0,05

Glukose/GIR 0,46 ± 0,017 kg·min·l-1 0,24 ± 0,007 kg·min·l-1 ≤ 0,05

3.2.2 Euglykämisch/hyperinsulinämischer Clamp

Die während des euglykämisch/hyperinsulinämischen Clamps beobachteten

Blutwerte und die verschiedenen berechneten Infusionsparameter sind in Tabelle 4

zusammengefasst.

In den euglykämischen Clamps konnten ebenfalls zwischen den beiden Gruppen

keine signifikanten Unterschiede der Abweichungen der Glukosegehalte im

Untersuchungszeitraum nachgewiesen werden (s. Abb. 12). Somit wurde auch bei

dieser Anwendung die Bedingung einer euglykämischen Plateauphase erreicht. Im

Gegensatz zum hyperglykämischen Clamp unterschieden sich hier allerdings die

Basalwerte, und auch im weiteren Verlauf lagen die Glukosewerte der trächtigen

Tiere über denen der laktierenden. Die GIR der Gruppen unterscheiden sich nicht

signifikant voneinander, sie sind aber tendenziell höher bei den laktierenden Tieren.

Im Gegensatz zum hyperglykämischen Clamp sind die basalen Blutinsulinwerte beim

euglykämischen Clamp signifikant unterschiedlich. Mit Start der Insulininfusion

kommt es unmittelbar zu dem erwarteten Anstieg. Die Plateauphase ist ungefähr

nach 45 Minuten erreicht, in der die Kurven abflachen und wie auch im

Ergebnisse 56

hyperglykämischen Clamp parallel der x-Achse verlaufen. Auch hier sind die

Insulinwerte der trächtigen Gruppe höher als die der laktierenden. Betrachtet man die

metabolische Clearance Rate von Insulin (MCR), zeigt sich, dass diese bei

laktierenden Tieren erhöht ist. Das Verhältnis aus Glukosegehalt/GIR ist wiederum

bei den trächtigen Tieren erhöht.

3.2.3 Leptin

Die Leptinwerte wurden durch die Clamps geringgradig beeinflusst. Sowohl die

euglykämisch-hyperinsulinämische als auch die hyperglykämische Behandlung führt

bei den Serumleptinkurven zu keinem signifikanten Unterschied zwischen trächtigen

und laktierenden Ziegen. Vergleicht man allerdings die Leptinkonzentrationen der

beiden Clamps für jede Versuchsgruppe isoliert, können durchaus unterschiedliche

Einflüsse festgestellt werden. Bei den laktierenden Ziegen besteht dabei kein

Unterschied zwischen den Behandlungen wohingegen die trächtigen Tiere eine

Erhöhung der Leptinwerte beim euglykämisch-hyperinsulinämischen Clamp und ein

Absinken der Leptinwerte unter hyperglykämischen Bedingungen zeigen. Diese

Veränderungen konnten mit einem hochsignifikanten Effekt auf die Interaktion

Zeit x Behandlung bestätigt werden (p ≤ 0,001), und zeigt, dass die Regulation des

Glukosestoffwechsels und seine Beziehung zur Leptinsekretion um den Zeitpunkt der

Geburt eine Veränderung erfährt (s. Abb. 13).

Tab. 4: Vergleich der Blut- und Infusionsparameter im euglykämisch/hyperinsulinämischen

Clamp (Mittelwert ± SEM).

Trächtig Laktierend p-Wert

GIR 10,5 ± 0,78 mmol·kg-1·min-1 12,2 ± 0,39 mmol·kg-1·min-1 ≤ 0,06

Insulin

(Basalwerte) 0,39 ± 0,04 ng/ml 0,26 ± 0,16 ng/ml ≤ 0,05

Insulin

(Plateauphase) 4,9 ± 0,18 ng/ml 2,6 ± 0,09 ng/ml ≤ 0,05

MCR 12,2 ± 0,37 ml·kg-1·min-1 24,4 ± 1,11 ml·kg-1·min-1 ≤ 0,05

Glukose/GIR 0,28 ± 0,033 kg·min·l-1 0,16 ± 0,006 kg·min·l-1 ≤ 0,05

Ergebnisse 57

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

60

50

40

30

20

10

0

2,0

1,5

1,0

0,5

0

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

Glu

kose

(m

mol

/l)In

sulin

(ng/

ml)

GIR

(µm

ol/m

in)

min

Trächtig LaktierendTrächtig

p ≤ 0,05

n.s.

p ≤ 0,05

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

60

50

40

30

20

10

0

2,0

1,5

1,0

0,5

0

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

Glu

kose

(m

mol

/l)In

sulin

(ng/

ml)

GIR

(µm

ol/m

in)

min


0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

60

50

40

30

20

10

0

2,0

1,5

1,0

0,5

0

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

Glu

kose

(m

mol

/l)In

sulin

(ng/

ml)

GIR

(µm

ol/m

in)

min

Trächtig LaktierendTrächtigTrächtig LaktierendTrächtig

p ≤ 0,05

n.s.

p ≤ 0,05

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

60

50

40

30

20

10

0

2,0

1,5

1,0

0,5

0

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

Glu

kose

(m

mol

/l)In

sulin

(ng/

ml)

GIR

(µm

ol/m

in)

min


0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

60

50

40

30

20

10

0

2,0

1,5

1,0

0,5

0

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

Glu

kose

(m

mol

/l)In

sulin

(ng/

ml)

GIR

(µm

ol/m

in)

min


p ≤ 0,05

n.s.

p ≤ 0,05

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

60

50

40

30

20

10

0

2,0

1,5

1,0

0,5

0

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

Glu

kose

(m

mol

/l)In

sulin

(ng/

ml)

GIR

(µm

ol/m

in)

min


0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

60

50

40

30

20

10

0

2,0

1,5

1,0

0,5

0

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

Glu

kose

(m

mol

/l)In

sulin

(ng/

ml)

GIR

(µm

ol/m

in)

min


p ≤ 0,05

n.s.

p ≤ 0,05

Abb.11: Verlauf der Glukoseinfusionsrate sowie Serumkonzentrationen von Insulin und

Glukose im hyperglykämischen Clamp (Mittelwert ± SEM; n=6).

Ergebnisse 58

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

18

15

12

9

6

3

0

6,0

5,0

4,0

3,0

2,0

1,0

0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0

Glu

kose

(m

mol

/l)In

sulin

(ng/

ml)

GIR

(µm

ol/m

in)

min


p ≤ 0,01

p ≤ 0,06

n.s.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

18

15

12

9

6

3

0

6,0

5,0

4,0

3,0

2,0

1,0

0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0

Glu

kose

(m

mol

/l)In

sulin

(ng/

ml)

GIR

(µm

ol/m

in)

min


0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

18

15

12

9

6

3

0

6,0

5,0

4,0

3,0

2,0

1,0

0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0

Glu

kose

(m

mol

/l)In

sulin

(ng/

ml)

GIR

(µm

ol/m

in)

min


p ≤ 0,01

p ≤ 0,06

n.s.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

18

15

12

9

6

3

0

6,0

5,0

4,0

3,0

2,0

1,0

0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0

Glu

kose

(m

mol

/l)In

sulin

(ng/

ml)

GIR

(µm

ol/m

in)

min


0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

18

15

12

9

6

3

0

6,0

5,0

4,0

3,0

2,0

1,0

0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0

Glu

kose

(m

mol

/l)In

sulin

(ng/

ml)

GIR

(µm

ol/m

in)

min


p ≤ 0,01

p ≤ 0,06

n.s.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

18

15

12

9

6

3

0

6,0

5,0

4,0

3,0

2,0

1,0

0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0

Glu

kose

(m

mol

/l)In

sulin

(ng/

ml)

GIR

(µm

ol/m

in)

min


0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

18

15

12

9

6

3

0

6,0

5,0

4,0

3,0

2,0

1,0

0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0

Glu

kose

(m

mol

/l)In

sulin

(ng/

ml)

GIR

(µm

ol/m

in)

min


p ≤ 0,01

p ≤ 0,06

n.s.

Abb. 12: Verlauf der Glukoseinfusionsrate sowie Serumkonzentrationen von Insulin und

Glukose im euglykämisch-hyperinsulinämischen Clamp (Mittelwerte ± SEM; n=6).

Ergebnisse 59

3.2.4 Freie Fettsäuren

Die Basalkonzentrationen unterscheiden sich nicht (s. Anhang). Die Infusionen

führten dann in allen Fällen zu einem signifikanten Abfall der freien Fettsäuren im

Blutserum (s. Abb. 14). Während jedoch bei den trächtigen Tieren die FFA nach dem

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Lept

in (

ng/

ml)

Lept

in (

ng/

ml)

min

4,0

3,83,6

3,4

3,2

3,02,8

2,6

2,4

4,0

3,83,6

3,4

3,2

3,0

2,8

2,62,4


n.s.

n.s.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Lept

in (

ng/

ml)

Lept

in (

ng/

ml)

min

4,0

3,83,6

3,4

3,2

3,02,8

2,6

2,4

4,0

3,83,6

3,4

3,2

3,0

2,8

2,62,4


0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Lept

in (

ng/

ml)

Lept

in (

ng/

ml)

min

4,0

3,83,6

3,4

3,2

3,02,8

2,6

2,4

4,0

3,83,6

3,4

3,2

3,0

2,8

2,62,4


n.s.

n.s.

Zeit x Behandlung

p ≤ 0,001

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Lept

in (

ng/

ml)

Lept

in (

ng/

ml)

min

4,0

3,83,6

3,4

3,2

3,02,8

2,6

2,4

4,0

3,83,6

3,4

3,2

3,0

2,8

2,62,4


n.s.

n.s.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Lept

in (

ng/

ml)

Lept

in (

ng/

ml)

min

4,0

3,83,6

3,4

3,2

3,02,8

2,6

2,4

4,0

3,83,6

3,4

3,2

3,0

2,8

2,62,4


0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Lept

in (

ng/

ml)

Lept

in (

ng/

ml)

min

4,0

3,83,6

3,4

3,2

3,02,8

2,6

2,4

4,0

3,83,6

3,4

3,2

3,0

2,8

2,62,4


n.s.

n.s.

Zeit x Behandlung

p ≤ 0,001

Abb. 13: Unterschiedliches Verhalten der Serumleptinkonzentrationen bei trächtigen und

laktierenden Ziegen im hyperglykämischen Clamp (oben) und im euglykämisch/

hyperinsulinämischen Clamp (unten) (Mittelwerte ± SEM; n = 6).

Ergebnisse 60

hyperglykämischen Clamp zum Beginn des euglykämischen Clamps wieder auf das

Ausgangsniveau zurückgehen, sind die FFA-Werte bei den laktieren-

den Tieren zu Beginn des euglykämischen Clamps hochsignifikant gegenüber dem

hyperglykämischen Clamp erhöht. Gleichzeitig unterscheiden sie sich auch von den

Konzentrationen zu Beginn des euglykämischen Clamps bei den trächtigen Tieren.

Zudem ist ein höheres Signifikanzniveau bei den laktierenden Ziegen gegenüber der

Vergleichsgruppe zu verzeichnen.

Die Endwerte unterscheiden sich jedoch zwischen den Gruppen und Clamparten

nicht. Die Fettsäurenwerte fallen auf dasselbe Niveau.

Abb. 14: Unterschiedliche Veränderungen der Serumwerte von freien Fettsäuren durch die

Clamps bei trächtigen und laktierenden Ziegen. Die Messungen erfolgten bei

jedem Clamp jeweils in drei Proben zum Versuchsbeginn (Basalwerte B), und in

den letzten drei Blutproben (E) (Mittelwerte ± SEM; n=6; Hypglyk:

hyperglykämischer Clamp; Euglyk: euglykämisch/hyperinsulin-ämischer Clamp ∗

p ≤ 0,05, ∗∗ p ≤ 0,01 und ∗∗∗ p ≤ 0,001).

B E B E B E B E

Hypglyk Euglyk Hypglyk Euglyk

Trächtig Laktierend

Fre

ie F

etts

äure

n (m

M)

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0

***

** *** * *

***

n. s.

n. s. ***

B E B E B E B E

Hypglyk Euglyk Hypglyk Euglyk


Fre

ie F

etts

äure

n (m

M)

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0

***

** *** * *

******

n. s.n. s.

n. s. ***

Ergebnisse 61

3.2.5 Einflüsse der Glukose- und Insulininfusionen auf die Milchleistung

Die Laktosegehalte in den gepaarten Milchproben zeigen keine Abweichungen

(morgens: 4,84 ± 0,04 %; abends: 4,84 ± 0,04 %).

Der Verlauf der Milchleistung im Beobachtungszeitraum wurde für das morgendliche

und abendliche Gemelk getrennt aufgenommen. Der Vergleich der beiden Kurven

zeigt geringere Veränderungen in den Abendgemelken als in den morgendlichen (sh.

Abb. 15). Die Morgenmilchleistung steigt allmählich an und ist in der ersten Hälfte

des Beobachtungszeitraumes (vor dem Versuch) niedriger als in der zweiten (nach

dem Versuch; p ≤ 0,05), Demgegenüber wird in der Abendmenge keine Steigerung

nachgewiesen.

Am Versuchstag kommt es zu keiner Beeinflussung der Milchleistung, resp. nicht in

der direkt dem Versuch folgenden Abendmelkung. Am darauffolgenden Morgen zeigt

der Graph augenscheinlich eine Verminderung der Milchmenge. Dieser Rückgang ist

jedoch nicht signifikant. Der Rückgang vollzieht sich insbesondere bei Tieren mit

hoher Milchleistung (Daten nicht dargestellt). Ebenso unverändert ist die Milchmenge

am Abend des Folgetages.

-8 -4 0 4 8

150

120

90

60

30

0

Milc

hmen

ge (

g/h)

Tage um Versuchszeitpunkt

morgens

abends

-8 -4 0 4 8

150

120

90

60

30

0

Milc

hmen

ge (

g/h)

Tage um Versuchszeitpunkt

morgens

abends

morgens

abends

Abb. 15: Verlauf der Milchleistung im Beobachtungszeitraum. Die Milchmenge ist als

Mittelwert der morgendlichen und abendlichen Gemelke mit Standardfehler (SEM)

dargestellt (n = 6). Die Laktationstage beziehen sich auf den Versuchszeitpunkt.

Diskussion 62

4 Diskussion

4.1 Quantifizierende real-time RT-PCR

Die real-time RT-PCR ist ein indirektes Verfahren zur Bestimmung der mRNA-

Masse. Für die Genauigkeit der quantifizierenden PCR ist neben der

Reaktionsoptimierung die Probenbearbeitung von Bedeutung. Die Messung ist zum

einen von der Qualität der Gesamt-RNA, zum anderen der cDNA-Synthese

abhängig.

Aufbereitung der Gesamt-RNA-Präparationen

Ein kritischer Punkt der RNA-Gewinnung ist die Dauer der Probennahme.

FITZPATRICK et al. (2002) untersuchten die Stabilität der RNA von Geweben des

bovinen Genitaltraktes bei der Probennahme, bevor sie durch Einfrieren vor dem

enzymatischen Abbau geschützt ist. Er zeigte an ribosomaler und messenger RNA,

dass sich innerhalb der ersten 24 h die Quantität nicht, und die Qualität nur in

geringem Maße verändert. Mit seinen Untersuchungen bestätigt er auch

Untersuchungen zum Abbau von RNA in verschiedenen humanen Geweben von

LARSEN et al. (1992). Um die Wahrscheinlichkeit eines RNA-Abbaus bei der

Probennahme gering zu halten, wurde die Probennahme bis zum Einfrieren in einem

Arbeitsschritt durchgeführt. Sie war spätestens nach 1,5 Stunden abgeschlossen,

und die Proben wurden bis zur RNA-Extraktion bei –80°C tiefgefroren gelagert. Bei

der Extraktion wurde zu Beginn das Gewebe in flüssigem Stickstoff mechanisch

zerkleinert, um die Ausbeute zu erhöhen, und um gleichzeitig die Integrität der RNA

zu erhalten (MCKENNA et al., 2000).

Bei guter RNA-Qualität ist die 28S-Bande doppelt so stark ausgeprägt wie die 18S

rRNA -Bande (IVELL, 1998). Weiter führt IVELL zur Beurteilung der Integrität aus,

dass RNase-abhängige Degradierung in einem Ethidiumbromidgel zu diskreten 18S

und 28S rRNA-Banden und einer Zunahme der dazwischenliegenden Fragmenten

führt. Bei diesen Fragmenten handelt es sich primär um einzelsträngige ribosomale

RNA, welche zuerst gespalten wird. Ein Vorkommen dieser Banden macht eine

Degradierung der einzelsträngigen mRNA wahrscheinlich. Eine partielle

Degradierung ist auch bei deutlich vorhandenen 18S und 28S-Banden nicht gänzlich

auszuschließen.

Diskussion 63

Auch SCHOOR et al. (2003) bestätigten, dass eine Beurteilung nur aufgrund des

18S/28S-Verhältnisses nicht ausreichend für eine Einschätzung der Qualität ist.

Neben der Verwendung des 28S/18S-Verhältnisses, ist immer auch die Menge der

durch Degradierung entstandenen RNA-Fragmente mit einzubeziehen. Kommen

zusätzliche Fragmente, die kleiner als 28S und 18S sind, nur gering vor, spricht dies

für eine intakte RNA.

Die gewonnenen Gewebeextrakte zeigen alle ein 28S/18S-Verhältnis von annähernd

2/1, und beinhalten die Hauptmasse der RNA. Fragmente zwischen diesen beiden

Banden und unterhalb der 18S-Bande sind nur in geringem Maße vorhanden. Nach

den beschriebenen Kriterien kann die RNA-Qualität als hoch eingeschätzt werden.

Auch bei eventuell vorhandener Degradierung können jedoch noch verlässliche

Ergebnisse in der Quantifizierung erreicht werden, wenn die 28S rRNA etwa 5% der

Gesamt-RNA ausmacht, und die RNA-Masse von Fragmenten kleiner als 18S 60%

der Gesamtmasse nicht übersteigt. Dies kann bedeuten, dass ein Verhältnis von

28S/18S = 1 bei einer Gesamt-RNA in einem denaturierenden Gel, noch als mäßig

degradiert eingeschätzt werden kann. Dies bestätigt die Einschätzung einiger

Autoren, wonach gleich stark ausgeprägte 18S und 28S rRNA-Banden noch für eine

hohe RNA-Qualität sprechen (CHOMCZYNSKI u. SACCHI, 1987; MCKENNA et al.,

2000). Neuere Untersuchungen von FLEIGE et al. und FLEIGE u. PFAFFL (beide

2006) wiesen allerdings nach, dass eine schlechte RNA-Qualität den CT, und damit

direkt die Ergebnisse der quantifizierenden real-time PCR, beeinflusst. Die Autoren

empfehlen zum einen eine Kontrolle der RNA-Integrität durch Kapillarelektrophorese.

In den eigenen Untersuchungen wurde diese Untersuchung nicht durchgeführt, und

somit ist, gemessen an diesen Untersuchungen, eine Degradierung der eigenen

Proben, trotz Kontrolle in einer Gelelektrophorese, nicht gänzlich auszuschließen.

Auf die Problematik wurde jedoch bereits bei der Probennahme und –bearbeitung

durch die beschriebenen Maßnahmen eingegangen. Die weitere Empfehlung der

Autoren, der Normalisierung gegen eine interne Kontrolle zur Generierung

verlässlicher Genexpressionsergebnisse erfolgte in den eigenen Untersuchungen, so

dass mögliche Einschränkungen der RNA für die Quantifizierung ausgeglichen

wurden.

Die Konstruktion möglichst kurzer PCR-Fragmente verringert ebenfalls die

Fehlerwahrscheinlichkeit, da bei kürzeren Abschnitten die Wahrscheinlichkeit eines

Strangbruches in diesem Abschnitt reduziert ist.

Diskussion 64

Zusammenfassend können die RNA-Qualität, und die ergriffenen Maßnahmen, als

ausreichend für die Auswertung quantitativer Expressionsunterschiede eingeschätzt

werden.

Selbst bei hoher Reinheit der Gewebeextrakte können noch Inhibitoren (z.B. Salze)

in den Präparationen enthalten sein, die sich negativ auf die Effizienz, und damit die

Verlässlichkeit der Quantifizierung auswirken (BUSTIN u. NOLAN, 2004; KUBISTA et

al., 2006). Die zusätzliche Reinigung über die Membransäule und anschließende

Lösung in einem niedermolekularen Puffer minimieren diese Einflüsse.

Einflüsse der cDNA-Synthese

Die Effizienz der cDNA-Synthese wird von der Art und Charge der Primer und der

RNA-Konzentration beeinflusst. Bei den Primern werden unspezifische und

spezifische Primer unterschieden. Die Auswahl des am besten geeigneten Priming

hängt vom jeweiligen Assaydesign ab.

Das im Versuch verwendete Random Hexamer-Priming bindet unspezifisch RNA. Da

die größte Masse der Gesamt-RNA ribosomalen Ursprungs ist (95%), kann die

Umschreibung mit Random Hexamers bei gering exprimierten Genen vermindert

sein. Ebenso ist die Überschätzung von mRNA bei Random-Priming beschrieben

(BUSTIN u. NOLAN, 2004; STÅHLBERG et al., 2004).

Ein Vorteil ist, dass der Fehler durch geringgradige Integritätsverluste bei der

Verwendung von Random Primers geringer ist, da hierbei die gesamte Sequenz,

auch fragmentierter Nukleotide, vollständig umgeschrieben wird. (SCHOOR et al.,

2003). Zudem ist dies das Mittel der Wahl bei Verwendung von 18S rRNA als

interner Kontrolle (KUBISTA et al., 2006).

Verdünnungsreihe, Standardkurve und Effizienz der real-time PCR

Die Verwendung einer Verdünnungsreihe eines spezifischen gereinigten PCR-

Produktes zur indirekten Ermittlung der Anzahl der Transkripte in einer Probe wird

von SCHMITTGEN et al. (2000) und ØVSTEBØ et al. (2003) beschrieben.

Über die logarithmische Darstellung der Standardverdünnungsreihe mit dem CT als

Funktion der Kopienanzahl, wird zum einen die Effizienz näherungsweise berechnet,

zum anderen, über das Bestimmtheitsmaß (R²), die Linearität der Messung direkt

nachgewiesen. Die Detektionsgrenze bildet jener Punkt, an dem die Beziehung von

CT und cDNA-Konzentration nicht mehr linear verläuft (SCHMITTGEN et al., 2000).

Diskussion 65

In allen Assays war diese Linearität über alle Konzentrationsstufen von 100 bis 105

(Zielgene), bzw. 103 bis 108 (18S rRNA) der Verdünnungsreihen gegeben

(R² > 0,98). Abweichend davon wurde die Linearität allerdings mit Verdünnungen von

PCR-Amplifikaten der Zielgene ermittelt.

Nach der PCR-Theorie bindet in jedem Zyklus ein Primer je Amplikon. Nach diesem

Modell ist die maximale Effizienz eine Verdopplung (E = 2). Aufgrund einer Vielzahl

von Faktoren erreicht die PCR-Effizienz diesen Wert nur näherungsweise. In den

Assays von Leptinrezeptor und 18S ist die Effizienz >2,0. Dies ist darauf

zurückzuführen, dass die Effizienzberechnung eine theoretische Annäherung für die

tatsächliche Effizienz bildet. Die Standardkurvenmethode ist eine geeignete

Methode, zur Schätzung der Effizienz, jedoch wird sie damit geringgradig

überschätzt (KUBISTA et al., 2006).

Der Vergleich von TaqMan und SybrGreen zeigt bei beiden Detektionssystemen

eine vergleichbare Sensitivität und dynamische Breite. Die Linearität zwischen CT

und Template ist bei SybrGreen allerdings größer als bei TaqMan-Sonden

(SCHMITTGEN et al., 2000). KUBISTA et al. (2006) schreibt beiden Systemen eine

vergleichbare Effektivität zu. Beide Systeme sind somit für den Versuchszweck

geeignet.

Sensitivität und Spezifität der real-time PCR

Die Spezifität der Produkte in der real-time PCR wurde stichprobenweise durch

Größenvergleich in einer Gelelektrophorese gezeigt. Zudem konnten keine

Primerdimere in den TaqMan- und SybrGreen- Proben nachgewiesen werden.

Die Unterscheidung unspezifischer Amplifikation, z.B. durch Primerdimere, von

spezifischer Amplifikation, spielt bei gering exprimierten Genen, wie dem GPR41 und

Ob-Rb in Fettgewebe, eine Rolle (BUSTIN u. NOLAN, 2004). Zur Abgrenzung geben

diese Autoren eine Differenz von 5 Zyklen gegenüber einem unspezifischen

Fluoreszenzsignal der NTC als Richtwert an. Die maximale Zyklusanzahl sollte nicht

45 überschreiten. Demgegenüber werteten STÅHLBERG et al. (2004) in ihren

Assays ein Signal, das nach mehr als 32 Zyklen gemessen wird, schon als

unspezifische Primerdimere. In ihren Untersuchungen entsprach dieser CT etwa 100

cDNA-Molekülen/µl, was als statistisch signifikante Detektionsgrenze festgelegt

wurde.

Diskussion 66

Die Konzentration der Zielsequenz beeinflusst die Reproduzierbarkeit der

Ergebnisse. Im unteren Messbereich kann eine statistisch verifizierbare

Quantifizierung einer unbekannten Probe, durch die Varianz der Probenvorbereitung

und mögliche Inhibition, beeinträchtigt sein. Nach RADONIĆ et al. (2004) ist die

Quantifizierung erst nach mehr als 40 Zyklen nicht mehr verlässlich, und die Effizienz

der PCR unzureichend. Die Sensitivität der eigenen Messungen in den

aufgereinigten Verdünnungsreihen entspricht dieser Nachweisgrenze. In den

eigenen Assays wurden 10² Moleküle/µl bereits nach 26 – 27 (Leptin), 30 - 31

(Leptinrezeptor) und 33 – 34 Zyklen (GPR41) erreicht. Ein CT über 40 wurde als

unspezifisch gewertet. Der CT der der niedrigsten Verdünnungsstufe (100) betrug

< 40. In den Negativkontrollen waren keine Signale detektierbar.

Varianz der real-Time RT-PCR

GORZELNIAK et al. (2001) berichten von einer zulässigen Varianz bei

Referenzgenen von ∆CT<0,5 als methodisch zulässige Abweichung. Dieser Wert ist

aber nicht statistisch abgesichert, sondern beruht auf Erfahrungswerten zur

Einschätzung einer zulässigen Abweichung der CT-Werte der internen Kontrolle, die

nicht einer Änderung der Genexpressionsrate zuzuschreiben ist. Differenzen des CT-

Wertes, die den Wert 1 überschreiten, werden als eindeutige Regulation gewertet.

Werte dazwischen, sind als mögliche Erhöhungen einzuschätzen. Ein ∆CT > 1

entspricht annähernd einem Unterschied von 100%.

Die Möglichkeit Mengenunterschiede zwischen zwei RNAs nachzuweisen, ist von der

Replikatanzahl und Varianz der cDNA-Proben abhängig. In Abhängigkeit von der

Replikatanzahl und dem p-Wert liegen die messbaren Mengenunterschiede

zwischen 40 und 100% (ØVSTEBØ et al., 2003).

Die Reverse Transkription selbst unterliegt Schwankungen, die die Genauigkeit der

PCR beeinflussen, und die Varianz der PCR-Reaktion übertreffen.

Zur Minimierung der Varianz der cDNA-Synthese wurden die Konzentrationen der

RNA-Proben vor der RT angeglichen. Für alle Proben wurden Random Hexamers

eingesetzt, und es wurden, wie auch in der PCR, nur Primeraliquote aus einer

Herstellungscharge verwendet. Jedes Aliquot wurde zudem nur dreimal aufgetaut,

um Qualitätsverluste gering zu halten. Auch die Trennung der RT- und PCR-

Reaktionen erhöht die Genauigkeit (ØVSTEBØ et al., 2003; STÅHLBERG et al.,

2004).

Diskussion 67

Der Wert des gesetzten Threshold ist nach KUBISTA et al. (2006) von geringer

Bedeutung, vorausgesetzt, es wird in allen Untersuchungen derselbe verwendet, und

die Amplifikationskurven verlaufen parallel. Dies wiederum setzt eine gute

Reaktionseffizienz voraus. Im vorliegenden Versuch wurde der Threshold in allen

Assays manuell auf 0,2, bei automatisch gesetzter Basislinie, festgelegt.

Entgegen dem CT-Vergleich von GORZELNIAK et al. (2001) erfolgte die Auswertung

der real-time PCR nach KUBISTA et al. (2006) über den Vergleich der Molekülanzahl

in der DNA-Standardkurve. Die Variationskoeffizienten zur Untersuchung von

Abweichungen sind dabei größer. Hierbei werden die Duplikate einzeln ausgewertet.

Die größte Variabilität erfolgt durch die cDNA-Synthese. Zur Reduktion der Variation

wurde jede RNA-Probe zweimal umgeschrieben, und mit der PCR ausgewertet

(ØVSTEBØ et al., 2003). Zum Ausgleich der Varianzen in der RT wurden, neben der

Normalisierung gegen eine Standardverdünnungsreihe, die ermittelten Ergebnisse

für das jeweilige Zielgen gegen 18S normalisiert. Diese Werte wiederum wurden

direkt zwischen den beiden Gruppen verglichen, und in einem gemeinsamen Assay

gemessen. Die signifikant und tendenziell nachgewiesenen

Konzentrationsunterschiede zwischen den beiden Versuchsgruppen übersteigen in

allen Fällen eine Verdopplung der mRNA-Mengen, wie sie von verschiedenen

Autoren für signifikante Ergebnisse gefordert wird (GPR41: 12-fach, Leptinrezeptor:

4,2-fach und Leptin: 3,2-fach).

Sowohl die Interassayvariationskoeffizienten, als auch die Varianzen der Replikate in

diesem Versuch, waren unter 0,15 beim Vergleich der CT, und damit deutlich unter

dem von GORZELNIAK et al. (2001) empfohlenen Wert von 0,5.

Trotz der Verwendung von Duplikaten in der PCR und cDNA-Synthese (4 Ansätze je

Probe), lagen die Variationskoeffizienten der cDNA-Synthese zwischen 5 und 84%

(Molekülanzahl). Bei einer Erhöhung der experimentellen Replikate auf drei oder vier,

würde der CV gesenkt. Eine Verminderung der cDNA-Variabilität ist möglicherweise

auch durch eine effektivere Transkriptase der neuesten Generation zu erreichen. In

eigenen Vorversuchen wurden durch verschiedene Enzyme unterschiedliche

Transkriptionsraten gemessen. Zum anderen dürfte eine Erhöhung der Tierzahlen zu

mehr signifikanten Effekten, und höheren p-Werten führen, da die zur Verfügung

stehende Tierzahl möglicherweise als Stichprobe zu klein war.

Die ermittelten RNA-Unterschiede sind als biologisch relevant einzuschätzen. Die

fehlende Signifikanz der Leptin-mRNA Menge zwischen den Fettgeweben und

Diskussion 68

zwischen den Versuchsgruppen ist möglicherweise den beschriebenen Effekten

zuzuschreiben.

Die Verwendung von 18S rRNA als interne Kontrolle

Zum Vergleich der mRNA-Menge in Geweben von verschiedenen Individuen ist die

Verwendung einer internen Kontrolle wichtig. Diese soll in allen untersuchten

Geweben und bei allen Individuen in gleicher Menge vorliegen, und nur einer

geringen Regulation unterliegen (IVELL, 1998).

In Gewebeproben kann dazu Gesamt-RNA, ribosomale RNA und mRNA von

sogenannten Haushaltsgenen verwendet werden. Als Haushaltsgene finden häufig

Strukturproteine wie z.B. ß-Actin, Tubuline oder Enzyme wie die GAPDH

(Glyceraldehyd 3-Phosphat Dehydrogenase) Verwendung (GORZELNIAK et al,

2001; RADONIÇ et al., 2004).

Nach TRICARICO et al. (2002) wird das Zielgen idealerweise ins Verhältnis zur

Gesamt-RNA gesetzt. Demgegenüber hält BUSTIN (2000) die Quantifizierung gegen

Gesamt-RNA aus Gewebeproben für ungenau, denn in der Praxis ist die Messung

Einschränkungen unterlegen. So differiert die Menge der Gesamt-RNA aus

unterschiedlichen Geweben, die Qualität der RNA entnommener Gewebeproben ist

uneinheitlich und die Quantifizierung der Gesamt-RNA ist meist unzureichend exakt.

Neben der Verwendung von Haushaltsgenen zur Quantifizierung ist auch der

Vergleich mit ribosomaler RNA möglich. GORZELNIAK et al. (2001) untersuchte die

Verwendung von 18S als Referenz in einer Adipozytenzellkultur. Er wies in der

Zelkultur bei 18S Unterschiede der CT-Werte zwischen reifen Fettzellen und

Vorläuferzellen von mehr als 0,5 nach. Die Schwankungsbreite ist vergleichbar mit

jener anderer Referenzgene, bzw. liegt noch darunter. Bei Erfahrung mit der

Quantifizierung mit 18S in einer Anwendung ist die Verwendung von 18S möglich.

Bei Unterschieden von ∆CT>0,5 ist ein Transkriptionsunterschied von ∆CT=1

darstellbar. Durch die Extraktion von Gesamt-RNA und der Reversen Transkription

mit Random hexamers ist 18S als interne Kontrolle Mittel der Wahl.

Nach THELLIN et al. (1999) eignet sich 18S gut als interne Kontrolle. Viele der

gebräuchlichen Haushaltsgene werden in situ nämlich unter bestimmten

Experimentalbedingungen reguliert. Zudem führt die Veränderung der

Genexpression, die möglicherweise eine Nettoerhöhung der mRNA-Synthese in der

Zelle bewirkt, zu einer Verschiebung des Verhältnisses von Ziel- und Referenzgen,

Diskussion 69

die aufgrund der Dominanz von 18S zu vernachlässigen ist. Zusammenfassend

schätzten THELLIN et al. (1999) diese Methode als robust und geeignet bei der

Verwendung von Gewebsproben, z.B. auch in der klinischen Anwendung, ein.

Ebenso bewerten BUSTIN u. NOLAN (2004) 18S rRNA als eine geeignete Referenz.

18S erreicht den CT sehr früh. Eine Problematik der Quantifizierung gegen 18S ist

die große Differenz zwischen den beiden CT-Werten von Zielgen und interner

Kontrolle. Vor allem bei sehr gering exprimierten Genen wie dem des GPR41 können

somit Probleme bei der Quantifizierung auftreten (GORZELNIAK et al. 2001).

Um den CT zu senken, waren die cDNA-Proben für 18S zehnfach höher verdünnt als

bei den Zielgenen.

4.2 Veränderungen durch Propionatinfusion und deren Einfluss

auf die Genexpression der untersuchten mRNA-Spezies

Einfluss von Propionat auf die Insulin- und Glukosekonzentration in Serum und Blut

FUHRMANN et al. (1989), SANO et al. (1993a; 1995) und HUSVETH et al. (1996)

zeigen beim Wiederkäuer, dass in Folge einer Propionatinfusion, Blutglukose und

Insulin unmittelbar nach Infusionsbeginn erhöht werden. Der Insulinpeak und der

Glukoseanstieg nach dem Start der Infusion treten erwartungsgemäß in zeitlicher

Nähe auf (DICOSTANZO et al., 1999; LEE u. HOSSNER, 2002). Die Insulinsekretion

erfolgt biphasisch. FUHRMANN et al. (1989) zeigen, dass dies nur bei Färsen der

Fall ist, nicht jedoch bei laktierenden Kühen. Die im Versuch verwendeten kastrierten

Ziegenböcke stehen in ihrer hormonellen Regulation den Färsen näher als den

laktierenden Kühen, und zeigen dementsprechend ähnliche Insulinverläufe. Nach der

ersten Sekretion von gespeichertem Insulin, folgt eine zweite Phase der chronischen

Insulinsynthese eine Stunde nach Behandlungsbeginn (FUHRMANN et al., 1989;

CUNNINGHAM, 2002). RUSTENBECK (2002) führt dies auf eine Desensibilisierung

der Insulinsekretion zurück. Die Sekretion in den ß-Zellen beim Menschen durch

einen anhaltenden Glukosestimulus beschreibt er folgendermaßen: nach einem

initialen Anstieg ist der Höhepunkt nach 15 Minuten erreicht. In einer zweiten Phase

steigt der Insulinspiegel langsam an, und erreicht sein Maximum nach 2-4 Stunden.

In einer dritten Phase verläuft die Insulinkonzentration auf einem Niveau von ca. 20%

des zweiten Peaks für 8-12 Stunden. Das Zeitintervall der ersten Phase stimmte

zwischen den Untersuchungen beim Menschen und denen der eigenen

Diskussion 70

Untersuchungen überein, wie auch von weiteren Autoren beim Wiederkäuer

beschrieben (FUHRMANN et al., 1989; SANO et al., 1993a, 1995; LEE u.

HOSSNER, 2002). Die zweite Phase fiel jedoch beim Wiederkäuer länger aus (4-5

Stunden). Nach FUHRMANN et al. (1989) ist dies sowohl nach Propionatinfusion, als

auch nach Glukose der Fall. Während jedoch bei FUHRMANN et al. (1989) und

CUNNINGHAM (2002) der Insulinanstieg wieder abfiel, war dieser in den eigenen

Untersuchungen kontinuierlich. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass

in den eigenen Versuchen der Peak nach 4 Stunden gerade erreicht wurde.

RUSTENBECK (2002) schreibt weiter, dass auch freie Fettsäuren, als

glukoseinduzierte Desensibilisierung, diese Effekte auslösen. Dem widersprechen

Untersuchungen von CHELIKANI et al. (2003b), die Effekte auf Blutparameter durch

Lipidinfusion nachwiesen, jedoch ohne dass die Insulinkonzentration verändert

wurde. Die genauen Zusammenhänge zwischen Propionat, Glukose und dem

Anstieg von Insulin sind noch nicht vollständig geklärt.

Einfluss der Propionatinfusion auf die Leptinsekretion

Die Leptinexpression unterscheidet sich zwischen verschiedenen Lokalisationen des

Fettgewebes, sowie zwischen verschiedenen Wiederkäuerspezies. Zudem kann bei

verschiedenen Spezies die Expression in den verschiedenen Fettdepots vom

energetischen und nutritiven Status beeinflusst werden. Bei der Ziege ist Leptin-

mRNA im subkutanen Depot höher als im perirenalen Fett exprimiert (zur Übersicht:

AHIMA, 2006; CHILLIARD et al., 2001). Die Leptin-mRNA wurde in subkutanem und

perirenalem Fettgewebe untersucht. Muskel- und intramuskuläres Fettgewebe

wurden nicht untersucht, da durch die Gewebshomogenisierung in der

Probenaufbereitung die beiden Gewebsarten nicht zu unterscheiden sind.

Untersuchungen mittels In situ-Hybridisierung und Immunhistologie wären hier für

weiterführende Untersuchungen geeignet.

Trotz eines Anstieges in den beiden untersuchten Fettdepots wurden keine

signifikanten Veränderungen der Leptin-mRNA-Konzentration durch

Propionatinfusion nachgewiesen, allerdings fand sich eine Tendenz im perirenalen

Fettgewebe.

Diese Unterschiede zwischen den beiden Fettdepots sind ein weiterer Hinweis, dass

den Fettgewebsarten unterschiedliche physiologische Bedeutung zugeschrieben

werden kann. Welche Bedeutung die einzelnen Fettdepots und die Höhe ihrer

Diskussion 71

Expressionsraten auf die Höhe des Serumleptingehaltes haben, ist unklar. KIM et al.

(2000) untersuchten die Expressionsraten in verschiedenen Fettdepots des Rindes.

Demnach ist bei dieser Tierart die mRNA in Perirenalfett am höchsten, mäßig

vorhanden in subkutanem und intermuskulärem Fett, und am geringsten im

intramuskulären Fett. Nach einer 48-stündigen Nahrungskarenz sank die mRNA-

Menge vor allem im subkutanen und intermuskulären Fettgewebe. In den beiden

anderen Geweben wurde die Transkription nicht verändert. Die Expressionsraten

unterscheiden sich zwischen verschiedenen Wiederkäuerspezies, so dass ein

Vergleich mit den eigenen Daten nicht sinnvoll ist. Dennoch bestätigt sich die

unterschiedliche Ansprechbarkeit der Fettdepots durch energetische Regulation.

Eine weitere mögliche Einflussgröße ist die Masse des Fettgewebes in den Depots.

Als Bildungsstätten für Leptin könnten diese für die mangelnde Signifikanz der

Leptin-mRNA-Erhöhung verantwortlich sein. Größere Depots könnten selbst bei

geringerer Expressionsrate so durch ihre absolute Masse zu einem Anstieg des

Proteinspiegels beitragen. DELAVAUD et al. (2002), GEARY et al. (2003) und

HIGASHIYAMA et al. (2003) untersuchten die Korrelation des Plasmaleptingehaltes

mit dem Körperfettanteil. GEARY et al. (2003) wiesen eine positive Korrelation von

Leptin mit der Fettschichtdicke in verschiedenen Depots und der

Fleischmarmorierung bei verschiedenen Fleischrinderrassen nach. Die

Marmorierung ist ein Maß für den Muskelfettanteil. HIGASHIYAMA et al. (2003)

verglichen die Fettmenge zwischen männlichen japanischen Fleischrindern mit

Rindern einer Milchrasse (Holstein Friesian). Die Gehalte an Unterhautfett und

viszeralem Fett unterschieden sich nicht zwischen den Rassen. Bei der Fleischrasse

waren jedoch der Muskelfettanteil (die Marmorierung des Fleisches), der

Plasmaleptingehalt und die Leptin-mRNA-Expression im Unterhautfett höher.

HIGASHIYAMA et al. (2003) untersuchten allerdings nicht die Expression im intra-

und intermuskulären Fett. Wie bereits nach KIM et al. (2000) beschrieben, ist die

Leptinexpression im inter- und intramuskluären Fett mäßig bis gering. Sie unterliegt

vor allem im Unterhautfett und im intermuskulären Anteil des Muskelfetts der

Regulation. Um zu unterscheiden, ob die höhere Expression im Unterhautfett die

höhere Gewichtung hat, oder ein möglicherweise höherer Anteil des Muskelfetts am

Gesamtkörperfettgehalt, ist eine genaue Quantifizierung des Muskelfettanteils nötig.

Allerdings weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass bei Rindern vor allem das

Unterhautfett und Teile des Muskelfetts verantwortlich für die Regulation der

Diskussion 72

Leptinsekretion sind. Dies passt auch zu den Untersuchungen nach DELAVAUD et

al. (2002), wonach bei Rindern der Plasmaleptingehalt mit der Fettzellgröße, also der

Höhe der adipösen Energiespeicherung, und dem BCS positiv korreliert.

LEE u. HOSSNER (2002) konnten nach intravenöser Verabreichung einer

Propionatlösung bereits einen Anstieg der Leptinexpression im Subkutanfett von

Schafen zeigen. Die Autoren erwähnen nicht, ob auch eine Erhöhung auf

Proteinebene im Fettgewebe oder im Blut erfolgt. In den eigenen Ergebnissen konnte

eine Erhöhung des Plasmaleptinspiegels nachgewiesen werden. Die propionat-

induzierten Veränderungen der Leptin-mRNA-Menge im Subkutanfett und

Perirenalfett erreichen jedoch kein signifikantes Niveau.

Demgegenüber fielen in der Kontrollgruppe die Plasmaleptinwerte ab.

Möglicherweise liegt hier ein Verdünnungseffekt durch das Volumen der NaCl-

Kontrolllösung vor. Der folgende Wiederanstieg könnte danach durch eine verzögerte

Verteilung des Infusionsvolumens in den Intrazellulärraum zu erklären sein. Bereits

1996 zeigten MALMSTRÖM et al. einen Abfall der Leptinwerte durch eine NaCl-

Infusion bei Menschen, der auf einen Volumeneffekt deutet.

LEE u. HOSSNER (2002) infundierten, wie SANO et al. (1993a; 1995) 64 µmol·kg-1

·min-1 Propionat für 30 Minuten. Die im eigenen Versuch verwendete

Propionatkonzentration betrug 96 µmol·kg-1·min-1. Möglicherweise ist die höhere

Konzentration ein Grund, dass die Leptinerhöhung in den eigenen Versuchen auch

auf Proteinebene zu messen war. BRADFORD et al. (2006) zeigen, dass eine

Bolusinfusion (8 Minuten; 1040 µmol·kg-1) keine Leptinerhöhung zur Folge hat,

während durch kontinuierliche intraruminale Infusion (18 Stunden) eine geringe

Erhöhung der Plasmaleptinkonzentration erreicht wird. Dies passt zu den

Ergebnissen nach KIM et al. (2005). In ihren Untersuchungen über den Einfluss von

Propylenglykol auf die Schlachtkörperzusammensetzung und die Veränderungen bei

damit in Beziehung stehenden Proteinen wiesen sie eine Erhöhung der Leptin-mRNA

im Muskelfett nach mehrtägiger Fütterung von Propylenglykol (1,2-Propandiol) nach.

Als glukoplastische Verbindung wird intraruminal Propionat erhöht, während die

Konzentration an Azetat abfällt (KIM et al., 2005).

Ein Vergleich der eigenen Studie und der dargestellten Arbeiten ist nur eingeschränkt

möglich, da keine vergleichbaren Messwerte der verschiedenen Versuche vorhanden

sind. Der Nachweis von erhöhten Propionatkonzentrationen nach Propylengabe im

Diskussion 73

Pansen und eine Erhöhung der Leptin-mRNA nach KIM et al., (2005) sind jedoch ein

Hinweis, dass Propionatkonzentrationen, die auch in vivo auftreten, bereits einen

Einfluss darauf haben können.

Die Ergebnisse der verschiedenen Autoren zur Erhöhung der Leptin-mRNA oder des

Plasmaleptinspiegels führen zu der Fragestellung, inwieweit ein linearer

Zusammenhang in der Translation besteht. Darauf gehen RAMSAY u. RICHARDS

(2004) ein. In ihren Untersuchungen an subkutanen Adipozyten von Schweinen in

einer Zellkultur zeigen sie, dass das Protein durch Dexamethason und Insulin

überproportional zur mRNA erhöht wird, was die Autoren auf mögliche

posttranslationale Regulation zurückführen. Ähnliche Ergebnisse zeigen auch RICCI

et al. (2005) und LEE et al. (2007) in humanem und in Rattenfettgewebe. Eine

fehlende Korrelation zwischen zirkulierendem Leptin und Leptin-mRNA im

Unterhautfettgewebe zeigen auch GARCIA et al. (2002) bei Wiederkäuern in vivo. In

ihren Untersuchungen der Leptinveränderungen um die Pubertät bei Färsen,

korrelieren mRNA und Proteinkonzentration nicht. GARCIA et al. (2002) führen das

auf die geringe Anzahl von Gewebeproben, im Gegensatz zu den Blutproben zurück.

Ein Bindungsprotein, welches möglicherweise die Messung im Blut beeinflusst,

können sie nicht nachweisen.

Zum Einfluss von Insulin auf die Leptinsynthese beschrieben RICCI et al. (2005) eine

insulinvermittelte Erhöhung der Leptinsekretion, und führten diese allein auf

posttranskriptionale Mechanismen zurück. Auch nach LEURY et al. (2003) werden

im hyperinsulinämischen Clamp die Plasmaleptinwerte erhöht. Bei verschiedenen

anderen Autoren wird der Plasmaleptingehalt beim Wiederkäuer durch eine

Insulininfusion nicht erhöht (KAUTER et al., 2000; GABAI et al., 2002; SOLIMAN et

al., 2002). Auf Einflüsse von Insulin wird zudem in Kapitel 4.3 eingegangen.

In den eigenen Versuchen zeigte sich durch die Propionatbehandlung in beiden

Fettdepots ein Anstieg der Varianz der Leptin-mRNA-Menge bei der

Propionatgruppe, im Gegensatz zur Kontrollgruppe. Im Perirenalfett besteht zudem

eine Tendenz einer Erhöhung. Es liegt nahe, dass mit größeren Tierzahlen auch die

Erhöhung der Leptin-mRNA nachzuweisen ist. Dennoch weisen die eigenen

Ergebnisse der RNA- und Proteinuntersuchungen zunächst daraufhin, dass die

Leptinsekretion bei der Ziege sowohl durch posttranskriptionale, als auch durch

posttranslationale Modifikation reguliert wird. Wie in diesem Versuch gezeigt wurde,

Diskussion 74

sollte in Studien zur Regulation von Leptin immer sowohl die mRNA, als auch das

Protein gemessen werden.

Neben der Abschätzung des Körperfettgehaltes durch die Klassifizierung des

Schlachtkörpers und Messung der Fettdicke an verschiedenen Lokalisationen

(GEARY et al., 2003; HIGASHIYAMA et al., 2003), könnte der Muskelfettanteil über

eine Impedanzmessung und Erfassung der Fettzellgrößen abgeschätzt werden.

Nachweis der mRNA des putativen GPR41 bei der Ziege

Die Gensequenz des GPR41 ist, ebenso wie die der verwandten Rezeptoren GPR40

und GPR43, speziesübergreifend konserviert, weshalb vergleichbare

Wirkungsmechanismen wahrscheinlich sind. Der GPR43 stimmt mit dem GPR41 in

42% der Aminosäurensequenz überein (LE POUL et al., 2003). Aufgrund der

Sequenzunterschiede ist eine Unterscheidung der mRNA dieser Rezeptoren durch

die PCR, und damit der Ausschluss unspezifischer Amplifikation in der PCR möglich.

Eine hohe Übereinstimmung der Sequenz des GPR41 besteht mit einem anderen

Genabschitt. Bei Nagetieren besteht zusätzlich eine Sequenz, deren Produkt als

GPR42 bezeichnet wird, und die BROWN et al. (2003) als eine Genduplikation ohne

biologische Funktion beschreiben. Nach BROWN et al. (2003 u. 2005) ist der

Funktionsverlust des GPR42 mit dem Austausch von Arginin 174 durch Tryptophan

174 der Aminosäuresequenz assoziiert. Zwei weitere heterologe Basen sind auf den

Basen 151 und 153 gelegen (Acc. Number NM_005303 und NM_005304) (BROWN

et al., 2003 u. 2005). Auch bei Menschen ist eine entsprechende Genduplikation

nachweisbar.

Beim Rind konnte eine orthologe Sequenz in überlappenden ESTs nachgewiesen

werden (BROWN et al., 2003). Die Anzahl der Homologien der bovinen DNA-

Sequenz liegt zwischen der des humanen GPR41 und GPR42, wobei mehr

Übereinstimmung mit dem GPR41 besteht. Bei Ziege, Schaf und Rind sind die

Sequenzen im untersuchten Genabschnitt homolog. Die drei Spezies unterscheiden

sich jedoch vom humanen GPR41 und GPR42 jeweils nur in einer der beiden Basen.

Das Vorkommen, und damit auch ein unspezifischer Nachweis des GPR42 bei der

Ziege, ist nicht gänzlich auszuschließen, wenngleich die Sequenzierung keine

uneindeutigen Ergebnisse in diesen Basen zeigt. Es muss darauf hingewiesen

werden, dass der in den eigenen Untersuchungen sequenzierte Genabschnitt für

eine abschließende Betrachtung zu kurz ist.

Diskussion 75

Um in den eigenen Untersuchungen eine möglichst optimale Reaktionsspezifität für

den sequenzierten Abschnitt des putativen GPR41 zu erhalten, bindet die Sonde des

entwickelten Taq-Man® Assays in einem Abschnitt der Sequenz mit zwei zur

Sequenz des GPR42 heterologen Basen (BROWN et al., 2003). Weitere

Untersuchungen zum GPR41 und orthologer Sequenzen bei der Ziege sind

erforderlich.

Rezeptoren der GPR40-Subfamilie

Der GPR41 gehört zur GPR40-Subfamilie der G-proteingekoppelten Rezeptoren. Die

Rezeptoren dieser Rezeptorsubfamilie werden durch die Carbonsäuregruppe

aktiviert (BROWN et al., 2005). Veresterte Fettsäuren sind inaktiv, und somit auch

Triacylglyzeride keine Agonisten.

Der GPR40 wird spezifisch in den pankreatischen ß-Zellen von Ratten und

Menschen exprimiert, und verstärkt dort die glukoseinduzierte Insulinsekretion. Der

GPR40 wird durch gesättigte und ungesättigte LCFA aktiviert. Die Liganden des

GPR40 unterscheiden sich von denen des GPR41 und GPR43. Eine

Überschneidung der Aktivität von GPR40 und GPR41 ist aufgrund der

unterschiedlichen Liganden, Lokalisation und Funktion nicht beschrieben, und somit

ist eine GPR40-vermittelte Aktivierung der Leptinsekretion unwahrscheinlich

(POITOUT, 2003; COVINGTON et al., 2006).

Der GPR43 hat wie GPR41 eine hohe Affinität für Azetat, Propionat und Butyrat. Er

hat eine geringere Affinität zu Pentanoat, was eine deutliche funktionelle Abgrenzung

dieser beiden Rezeptoren ermöglicht (BROWN et al., 2003 u. 2005; COVINGTON et

al., 2006). Exprimiert wird der GPR43 nach BROWN et al. (2005) in verschiedenen

Geweben, auch im Fettgewebe. Aufgrund der Überschneidung der Liganden ist eine

gleichzeitige Aktivierung des GPR41 und GPR43, vor allem im Fettgewebe,

wahrscheinlich. Im Fokus der Untersuchung steht jedoch die Wirkung des GPR41 im

Fettgewebe auf die Leptinsynthese im Fettgewebe.

BROWN et al. (2003), NILSSON et al. (2003), XIONG et al. (2004) und LE POUL et

al. (2003) wiesen den GPR41 in allen weißen Fettgeweben nach. HONG et al. (2005)

dagegen wiesen zwar die Erhöhung der Adipogenese und GPR43-Expression in

subkutanem, perirenalem, mesenterialem und epididymalem Fettgewebe sowie in

3T3-L1-Adipozytenzellkultur nach, konnten jedoch in den genannten Matrices keine

mRNA des GPR41 nachweisen.

Diskussion 76

In den eigenen Versuchen wurde erstmals der putative GPR41 bei der Ziege

nachgewiesen. Dieser konnte sowohl in den Kontrolltieren, als auch nach

Behandlung mit Propionat, in allen Fettgewebsproben nachgewiesen werden.

Im Vergleich der mRNA-Mengen zwischen den Fettgeweben, war der GPR41

tendenziell (p < 0,06) im Perirenalfett gegenüber dem Subkutanfett erhöht.

BRADFORD et al. (2006) untersuchten bei laktierenden Milchkühen die Wirkung von

Propionat auf Leptin. Durch intraruminale Propionatgabe erhöhte sich der

Plasmaleptinwert gering, und korrelierte mit dem Plasmapropionatgehalt. Diese

geringe Erhöhung erklären BRADFORD et al. (2006) mit der assoziierten

Insulinerhöhung. Insulin dagegen korreliert mit Propionat. Wenngleich die

Leptinwirkung nur gering ausgeprägt ist, kann jedoch eine G-proteinvermittelte

Wirkung auf die Leptinsekretion nicht ausgeschlossen werden, wie im Folgenden im

Detail diskutiert wird.

Zusammenhänge zwischen dem putativen GPR41 und der Leptinsynthese und

mögliche Einflüsse der LCFA in Folge einer Propionatinfusion

Die Ergebnisse zeigten eine signifikante Erhöhung der GPR41-mRNA-Menge in

Folge einer Propionatinfusion im Subkutanfett. Perirenal war kein Unterschied

zwischen der Propionat- und der Kontrollgruppe zu beobachten. Die Leptin-mRNA

verhielt sich in beiden Geweben bei beiden Gruppen ähnlich. Sie war zwar nicht

signifikant erhöht, es war aber der Trend einer Erhöhung im Perirenalfett zu

verzeichnen.

Die Expression der GPR41-mRNA im Perirenalfett blieb durch die Propionatinfusion

unverändert. Beim Gewebevergleich der Kontrollgruppe wurde im Perirenalfett

tendenziell eine höhere mRNA-Menge verzeichnet als im Subkutanfett. Nach

Propionatinfusion überstieg dagegen der Wert für das Subkutanfett tendenziell die

Expression im Perirenalfett. Gleichzeitig zeigte sich, in diesem Versuch mit geringen

Tierzahlen, eine deutlichere Erhöhung der Leptin-mRNA im Perirenalfett als im

Subkutanfett. Unter Beachtung der tendenziellen mRNA-Veränderungen, gibt es

mehrere mögliche Erklärungsansätze.

Vorausgesetzt die Translation der GPR41-mRNA ist nicht verzögert, könnte das

etwas erhöhte Auftreten im Perirenalfett die Erklärung für die deutlichere Erhöhung

der Leptin-mRNA im Perirenalfett sein.

Diskussion 77

Zum anderen kann dies dafür sprechen, dass in den beiden Fettgeweben

unterschiedliche Mechanismen wirken, was gegen eine GPR41-vermittelte Erhöhung

der Leptin-mRNA in diesem Versuch spräche. Sowohl die Transkription, als auch die

Translation des Rezeptors können verzögert ablaufen, was sich durch

unterschiedliche mRNA-Mengen nach der 4,5-stündigen Infusion andeutet. Daten

über die Beeinflussung von GPR40-Familie durch spezifische Agonisten sind nicht

verfügbar. KIMURA et al. (2001) beschrieben für den GPR41, nach einer artifiziellen

Ischämie, eine Erhöhung der mRNA an H9c2-Zellen in vitro schon innerhalb von 2

Stunden, was als übliche Zeitspanne vom Zeitpunkt der Stimulation bis zur

messbaren mRNA-Erhöhung gewertet werden kann. Vergleichbare Daten über die

Zeitspanne, wann die GPR41-Expression in vivo messbar erhöht ist, sind bei

Monogastriern oder Wiederkäuern allerdings nicht bekannt.

Es bestehen deutliche Unterschiede zwischen den beiden Fettgeweben in der

Ansprechbarkeit der GPR41-mRNA Expression, der Effekt des GPR41 wird jedoch

direkt vermittelt. SOLIMAN et al. (2007) wiesen in einer bovinen

Primäradipozytenkultur eine direkte Stimulation von Leptin durch SCFA nach. Diese

Erhöhung ließ sich durch Pertussistoxin, das spezifisch die Funktion von Gi/0-

Proteinen aufhebt, unterdrücken. So vermuten die Autoren den Mechanismus eines

inhibitorischen G-proteingekoppelten Rezeptors. Die Nachweisbarkeit der

Rezeptorproteine oder der mRNA wurde in dieser Studie allerdings nicht untersucht.

Eine weitere Einflussgröße bildet in diesem Zusammenhang Insulin. XIONG et al.

(2004) konnten zeigen, dass Insulin die GPR41-Wirkung verstärkt. Schon

LEFEBRVRE et al. (1998) vermuten, dass die Insulinrezeptorbindung für

unterschiedliche Leptin-mRNA-Expression verantwortlich ist. Sie zeigten in humanen

Bioptaten des viszeralen und subkutanen Fetts, dass die Expression des

Insulinrezeptors im viszeralem Fett höher war, wiesen dort aber eine Splicevariante

des Insulinrezeptors nach. Mit fehlender Transkription von Exon 11 verfügt diese

Variante über eine verminderte Signaleffizienz. Diese verminderte Effizienz geben

die Autoren als mögliche Ursache der vermindeten Leptinexpression an. Die IRS-1-

Expression (Insulin Rezeptor Substrat) unterschied sich in dieser Studie nicht

zwischen den Geweben.

BENMANSOUR et al. (1991) untersuchten bereits die Bedeutung der Fettlokalisation

auf die Insulinwirkung in Fettzellen von Ebern. Danach war der antilipolytische Effekt

von Insulin in perirenalem Fett höher ausgeprägt als in Subkutanfett. Allerdings war

Diskussion 78

kein Unterschied der Insulinbindung nachzuweisen. Eine mögliche Erklärung bieten

die Untersuchungen von PERRINI et al. (2008). In Untersuchungen zu

unterschiedlicher Genexpression in humanen Adipozytenvorläuferzellkultur wiesen

die Autoren eine höhere Proteinexpression, und gleichzeitig eine höhere und

schnellere IRS-1-Phosphorylierung in perirenalen Zellen als in subkutanen Zellen

nach. Wenngleich diese Untersuchungen nicht direkt auf die eigenen

Untersuchungsergebnisse übertragbar sind, deuten diese an, dass auch Insulin eine

Bedeutung bei der GPR41-vermittelten Regulation der Leptinexpression spielen

könnte.

Die allein anhand der Genexpressionsstudien dargestellten Ergebnisse lassen keine

genauen Rückschlüsse auf Zusammenhänge zwischen GPR41- und

Leptinexpression zu. Zum einen wird eine enge Verknüpfung der GPR41-Menge mit

Propionat gezeigt. Andererseits erhärten die Ergebnisse aufgrund der

unterschiedlichen Expression des GPR41 in verschiedenen Fettgeweben die

Hypothese, dass eine unterschiedliche Ansprechbarkeit und damit auch Funktion als

Energiespeicher oder endokrines Organ in den Fettgewebsarten besteht (AHIMA et

al., 2006; PERRINI et al., 2008).

Zusammen mit den erhöhten Plasmaleptinwerten ist ein Zusammenhang zwischen

Rezeptorexpression und Leptinexpression wahrscheinlich. Auch wenn die Bedeutung

für eine physiologisch relevante Erhöhung des zirkulierenden Leptins durch

physiologische Propionatinfusionen noch unklar ist, bestehen deutliche Hinweise,

dass Propionat eine Rolle bei der hormonellen Steuerung in den Geweben, und auch

beim nutrient-partitioning beim Wiederkäuer zukommt.

Der Abfall der ungebundenen Fettsäuren durch Propionatbehandlung fällt zeitlich mit

den Peaks bei Glukose und Insulin zusammen. Auch der erneute Abfall am Ende fällt

entsprechend mit signifikant erhöhten Insulinwerten zusammen. Dieser Effekt stimmt

mit den Ergebnissen von DICOSTANZO et al. (1999) und LEE u. HOSSNER (2002)

überein. In den eigenen Versuchen verhielten sich die Plasma-LCFA bei den beiden

Versuchsgruppen unterschiedlich. Während bei der Kontrollgruppe die Werte

während der Infusion weitgehend unverändert blieben, sanken die LCFA in der

Propionatgruppe ab. SOLIMAN et al. (2007) unterstützten die These einer GPR41-

vermittelten Ansprechbarkeit der Leptinsynthese auf SCFA. In ihren Untersuchungen

in bovinen Adipozytenzellkulturen wurde die Leptinexpression durch Gabe von

Diskussion 79

Azetat, Propionat und Butyrat, sowie durch kombinierte Insulingabe, erhöht.

Demgegenüber hob die Gabe von LCFA diese Wirkung auf. Durch einen Einfluss der

LCFA auf die Wirkung der SCFA auf die Leptinexpression, wirken die LCFA indirekt

über den GPR41 auf die Leptinexpression (SOLIMAN et al., 2007). Möglicherweise

ist eine Umkehrung dieser Effekte, ein Abfall der LCFA durch die Propionatinfusion in

den eigenen Untersuchungen von Relevanz für die Leptinexpression. Dies spräche

dafür, dass auch die LCFA-Konzentration im Blutplasma von Bedeutung für die

Regulation der GPR-vermittelten Leptinsynthese in vivo ist.

Mögliche Bedeutung des GPR41 beim Wiederkäuer

Der GPR41 des Menschen wird synonym auch als FFA(3)R (engl: free fatty acid

receptor 3) (Genbank NM_005304) bezeichnet, analog der Nomenklatur, die für die

humanen G-proteingekoppelten Rezeptoren nach NILSSON et al. (2003) und

SALEHI et al. (2005) vorgeschlagen wurde. Danach wird der G-proteingekoppelte

Rezeptor 40 (GPR40) als FFA(1)R bezeichnet, und der GPR43 als FFA(2)R.

COVINGTON et al. (2006) verwenden jedoch die Bezeichnungen GPR40-43.

Bei Nagetieren ist die Aktivierung der FFAR weitgehend geklärt, und ihre Funktion,

insbesondere die Bedeutung des GPR41 für die Regulation von Leptin teilweise

bekannt. Inwieweit dies von praktischer bzw. physiologischer Bedeutung ist, muss

noch weiter untersucht werden. Bei den Wiederkäuern sind weitere Untersuchungen

über die Zusammenhänge von GPR-vermittelter Propionatwirkung auf die

Leptinexpression notwendig. Allerdings bestehen starke Hinweise für derartige

Zusamenhänge. In dieser Arbeit wird die Bezeichnung der Rezeptoren nach ihrer

Klassifikation als G-proteingekoppelte Rezeptoren beibehalten (BONINI et al., 1997;

SAWZDARGO et al., 1997). Ob der GPR41 bei der Ziege und möglicherweise

anderen Ruminantia von Bedeutung als FFAR ist, wie bei Monogastriern, ist bisher

noch unklar. Die Ergebnisse der Expressionsuntersuchung erhärten jedoch die

Hypothese, dass der GPR41 eine Rolle als „nutrient-sensing-receptor“, wie es von

KOTARSKY et al. (2003) für diese Rezeptorsubfamilie vorgeschlagen wurde, spielt.

Weitere Untersuchungen, insbesondere über die Wirkung bei physiologischen

Propionatkonzentrationen, die Variationen unterliegen, mit verschiedenen SCFAs

und über einen längeren Zeitraum sind dabei interessant. Der Energiemetabolismus

ist vollständig von der Pansenfermentation abhängig. Der GPR41 und insbesondere

der GPR43, welcher dieselben SCFA bindet, werden von verschiedenen Zellen des

Diskussion 80

Immunsystems exprimiert und aktivieren diese. Möglicherweise besteht hier ein

Bindeglied zwischen Futterration und Fermentationsprodukten auf der einen Seite,

sowie Leptinsekretion, Insulinresistenz und Immunsystem, auf der anderen Seite (LE

POUL et al., 2003; GOFF, 2006).

Nachweis der mRNA der langen Form des Leptinrezeptors (Ob-Rb) bei der Ziege

Während nach dem bisherigen Kenntnisstand die aktiven Rezeptorformen a und e

wichtig bei der Hormonbindung und dem –transport sind, ist die lange Form wichtig

für die Vermittlung der biologischen Wirkung des Leptins. Nur bei der langen Form

kommen die Strukturen vor, die für die Aktivierung des JAK/STAT-Mechanismus

benötigt werden (MAČAJOVA et al., 2004). Durch ihre Expression in einer Vielzahl

von Geweben ist diese Rezeptorform für die integrative Leptinwirkung in der

Regulation von Energiestoffwechsel und Endokrinium von großer Bedeutung.

Die verwendeten Primer zur Teilsequenzierung des caprinen ob-Rb sind von LIN et

al. (2000) entnommen, und sind von der Sequenz des langen Rezeptors des

Schweines abgeleitet (Genbank Acc. Number: AF369908). Damit wurde erstmals ein

Abschnitt der cDNA der langen Form des Leptinrezeptors bei der Ziege sequenziert

(AY846770).

Der Vergleich der mit diesen Primern ermittelten partiellen cDNA aus Geweben der

Ziege mit bekannten Basensequenzen zeigt eine hohe Übereinstimmung des cDNA-

Abschnittes der caprinen Sequenz mit der langen Form des Leptinrezeptors von

Schwein (83%), Rind und Schaf (94% und 97%).

Die enge Verwandtschaft der Isoformen zwischen verschiedenen Spezies zeigten

BARTHA et al. (2005). Wenngleich BARTHA et al. (2005) den ob-Rb der Ziege nicht

untersuchten, entsprechen die Größenordnungen der Basenübereinstimmungen

denen der eigenen Untersuchungen. Abweichungen können auch darin begründet

sein, dass BARTHA et al. (2005) die gesamten Gene verglichen, während die

eigenen Untersuchungen sich auf das sequenzierte Segment beschränken.

Gewebeverteilung und mögliche Beeinflussung der Ob-Rb-mRNA

Der Leptinrezeptor wurde in einer Vielzahl von Geweben nachgewiesen (CHILLIARD

et al., 2001; CHELIKANI et al., 2003a; ZABEAU et al., 2003, BARTHA et al., 2005).

In allen Geweben, die im Rahmen dieses Versuches untersucht wurden, konnte

Diskussion 81

seine Expression nachgewiesen werden, und somit die bei Monogastriern und

Wiederkäuern etablierten Ergebnisse bestätigt werden.

Die differenzierte Betrachtung der eigenen Ergebnisse zeigt, dass dieser Rezeptor

im Subkutanfett tendenziell mehr exprimiert ist als im Perirenalfett (p ≤ 0,01). Vor

allem ist jedoch interessant, dass erstmals eine Beeinflussung der ob-Rb-RNA durch

Propionatinfusion, im Perirenalfett, gezeigt wurde. Diese fällt durch die Behandlung

ab (p ≤ 0,05). Im Subkutanfett, sowie im Muskel und in der Leber besteht keine

signifikante Verringerung, wobei dies möglicherweise auf die geringe Tierzahl

zurückzuführen ist, da in den drei Geweben eine numerische Reduktion verzeichnet

wurde.

Während Untersuchungen zur Rezeptorverteilung, Rezeptoraktivierung und

Signaltransduktion vorhanden sind, gibt es nur wenige Daten über die Regulation der

Rezeptorexpression. Bereits GAVRILOVA et al. (1997) zeigten bei Mäusen, dass die

Leptinaktivität über die Regulation der Expression des löslichen Rezeptors (ob-Re)

gesteuert werden kann. YANG et al. (2004) bestätigten dies in humaner embryonaler

Nierenzellkultur. Dieses Bindungsprotein bindet freies Leptin, und vermindert

dadurch die Bindung von Leptin an den ob-Rb, es beeinflusst jedoch nicht die

Affinität des freien Leptins an diesen Rezeptor.

YONEKURA et al. (2003) beschreiben, dass die ob-Ra-Expression in boviner

Hypophysenzellkultur durch Butyrat gesenkt wird. Dieser Rezeptor aktiviert nicht den

JAK/STAT-Mechanismus. Seine Bedeutung im Hypothalamus ist wie beim ob-Re

ebenfalls der Transport sowie die Translokation des Leptin über die Blut-Hirn-

Schranke (MAČAJOVA et al., 2004). Somit ist bisher nachgewiesen, dass der

Transport des Leptins über Bindungsproteine durch SCFA reguliert wird. Über die

Regulation des aktiven ob-Rb Rezeptors und seiner Bindungskapazität ist dagegen

wenig bekannt. In den dargelegten Ergebnissen konnte an Ziegen die Regulation der

ob-Rb-RNA im Fettgewebe in vivo durch Propionat gezeigt werden. Eine

Verminderung der Leptinrezeptor-mRNA durch Insulin und Dexamethason

beschreiben RAMSAY u. RICHARDS (2004) in porziner Adipozytenzellkultur. Diese

Untersuchungen bekräftigen die eigenen Ergebnisse.

Grundsätzlich besteht der Verdacht, dass Insulin auch die Leptinrezeptorexpression

in vivo vermindert. Weitere Untersuchungen mit der ausschließlichen Infusion von

Insulin, können diese Hypothese abklären. Zudem zeigt dies, dass in der Regulation

Diskussion 82

des Leptinrezeptors grundsätzlich dieselben Verhältnisse zu finden sind, wie beim

Monogastrier.

Ein weiterer Punkt, der von Interesse ist, ist die Rolle von Leptin im Sinne einer

Autoregulation, da das weiße Fettgewebe zudem Hauptsyntheseort des Hormones,

und damit des Liganden des ob-Rb ist (WANG et al., 1999a).

4.3 Veränderungen von Leptin und Insulin, sowie Einflüsse der

Galaktopoese bei der Ziege peri partum

Vergleich der Insulinsensitivität zwischen Hochträchtigkeit und Frühlaktation

Um den Geburtszeitraum entsteht ein Ungleichgewicht zwischen Energieaufnahme

und Energiebedarf bei Rindern. Verschiedene Autoren führen dies darauf zurück,

dass die Milchsekretion zu einem massiven Anstieg des Energiebedarfs führt, bei

gleichzeitig unzureichendem Anstieg der Nahrungsaufnahme. Das hieraus

resultierende Energiedefizit führt dann zu einem Abfall von Leptin mRNA und -protein

(BLOCK et al., 2001). Eine große Bedeutung wurde dabei der Regulation durch

Insulin zugesprochen (BLOCK et al., 2003; LEURY et al., 2003).

Laktation und Milchleistung hängen mit einem niedrigen Insulinspiegel zusammen.

HAMMON et al. (2007) untersuchten inwieweit bei Kühen die Insulinkonzentration

und glukoseabhängige Insulinantwort von der Milchleistung, die in hohem Maße

genetisch determiniert ist, abhängig ist. Dabei zeigten sie, dass die Laktation, und

vor allem eine hohe Milchleistung, den Insulinspiegel und die glukoseabhängige

Insulinsekretion bestimmen.

CHELIKANI et al. (2003b) zeigten eine Erhöhung von Plasmaleptin durch

Glukoseinfusion bei spätlaktierenden Kühen, jedoch keinen Effekt bei

frühlaktierenden. Zudem zeigten sie einen Effekt durch eine Lipidlösung bei

spätlaktierenden Kühen, ohne dass sich der Plasmainsulingehalt verändert.

Die Blutglukosekonzentration wird in erster Linie von der Glukoseaufnahme in die

Skelettmuskulatur bestimmt. Diese wird durch den insulinabhägigen GLUT4

gesteuert (LOEFFLER, 1998b). Zur Untersuchung der Veränderungen in der

insulingesteuerten Glukoseverwertung der Körperperipherie wurden

Glukoseinfusionsstudien durchgeführt. Dabei war insbesondere der Vergleich der

Insulinwirkung in Trächtigkeit und Laktation von Interesse.

Diskussion 83

LOMAX et al. (1979) und SARTIN et al. (1985) zeigten bei Milchkühen, dass in der

Laktation sowohl die basale Insulinkonzentration geringer ist, als auch eine geringere

Insulinantwort auf einen Glukosestimulus erfolgte. In den eigenen Untersuchungen

unterschieden sich die Ausgangskonzentrationen von Insulin bei hochträchtigen

Ziegen und frühlaktierenden nicht. Gleichzeitig ist die Glukoseinfusionsrate bei den

Laktierenden höher und die GIR wie auch die berechnete Gewebesensitivität für

Insulin bei trächtigen Tieren niedriger. LOMAX et al. (1979) erklären dies damit, dass

trächtige Tiere den Glukosestimulus durch eine Erhöhung der Insulinkonzentration

ausgleicht, während in der Laktation die hepatische Glukoneogenese zum Ausgleich

gesenkt wird. Auf der Basis der Rechenparameter der Clamps ist nicht direkt auf die

Ansprechbarkeit der peripheren Körpergewebe für Insulin per se rückzuschließen.

Demgegenüber wurde allerdings bei Fleischrindern eine erhöhte Insulinantwort bei

laktierenden Tieren gezeigt (SANO et al., 1993a).

Der Rechenparameter der Insulinsensitivität war bei den trächtigen Tieren geringer,

was für eine verminderte Aufnahme von Glukose spricht. Dies zeigt sich an den

erhöhten Insulinwerten und den erhöhten Glukosewerten im hyperinsulinämischen

Clamp. Die erhöhten Quotienten von Glukose/Glukoseinfusionsrate bei den

trächtigen Ziegen verdeutlichen diese Beobachtung. Dies bedeutet, dass die

infundierte Glukose langsamer in die Zelle aufgenommen wird. Bestätigt wird dies

durch die weiteren Parameter, wie der erhöhten Clearancerate für Insulin (MCR) bei

den laktierenden Ziegen, und der höheren SDR der trächtigen Ziegen.

Auch in der Arbeit von HEINTGES (2003) zur Bedeutung von Leptin bei

Wiederkäuern untersuchte die Autorin die Wirkungen exogener Leptingabe und

aktiver Immunisierung gegen Leptin bei trächtigen und laktierenden Ziegen mit

hyperglykämischen und euglykämisch/hyperinsulinämischen Clamps. Im Gegensatz

zu den eigenen Ergebnissen, in denen die endogene Sekretionsrate an Insulin (SDR)

bei den laktierenden Ziegen erhöht war, unterschied sie sich bei HEINTGES (2003)

nicht zwischen laktierenden und trächtigen Tieren. Grund dafür kann die

unterschiedliche statistische Methode der Datenanalyse sein. Während HEINTGES

(2003) den t-Test verwandte, wurde in dieser Arbeit die Varianzanalyse nach dem

allgemeinen linearen Modell angewandt. Die Ergebnisse stimmen jedoch ansonsten

mit der vorangegangenen Arbeit überein und können deren Aussage noch erhärten.

DEBRAS et al. (1989) zeigten allerdings bei laktierende Ziegen erhöhte

Insulinspiegel. Insbesondere in der Frühlaktation war die MCR erhöht. Allerdings

Diskussion 84

verglichen sie die Werte mit trocken stehenden Ziegen und nicht mit trächtigen

Tieren. Die basale Blutglukosekonzentration ist bei laktierenden Ziegen gegenüber

trockenstehenden Ziegen dreifach erhöht. Gleichzeitig ist auch die insulinvermittelte

Glukoseverwertung, die in erster Linie im Muskelgewebe stattfindet, erhöht.

Die physiologische Insulinresistenz in der Trächtigkeit sichert die Versorgung des

Fetus, indem genügend Glukose zur Aufnahme über die Plazenta bereit steht. Um

die Versorgung der Milchdrüse zu gewährleisten, ist der gesamte

Glukosestoffwechsel erhöht, es muss jedoch die Glukoseaufnahme unabhängig von

der Blutglukosekonzentration stattfinden. Zudem scheint diese insulinunabhängig zu

sein (DEBRAS et al., 1989; ZHAO u. KEATING, 2007), da somit eine konstante

Versorgung auch in der Laktation gewährleistet werden kann.

Verhalten der Serumleptinkonzentrationen um den Geburtszeitpunkt

Das Verhalten der Plasmaleptinwerte um den Geburtszeitpunkt unterscheidet sich

zwischen den Wiederkäuerspezies. Bei Ziegen werden die Leptinwerte durch die

Laktation stark vermindert. Der Abfall beginnt noch im letzten Drittel der Trächtigkeit,

und erreicht um den Geburtszeitpunkt bereits den niedrigen Wert (zur Übersicht:

CHILLIARD et al., 2005; BONNET et al., 2005). Dies erklärt, dass im eigenen

Versuch keine Unterschiede der Leptinwerte zwischen den trächtigen und

laktierenden Ziegen bestanden, da die Leptinwerte bei Ziegen um den

Geburtszeitraum keinen gravierenden Veränderungen unterliegen. Erstmals wurde

bei trächtigen Ziegen jedoch eine Veränderlichkeit der Serumleptinkonzentration

durch Glukose und Insulin nachgewiesen. Danach erhöht der euglykämische Clamp

die Leptinwerte, während im hyperglykämischen Clamp Leptin abfällt. WANG et al.

(1998) zeigten bei Ratten, dass Leptin nicht durch Glukose per se, sondern

zusammen mit einem Insulinclamp erhöht werden kann. LEURY et al. (2003)

erreichten bei hochträchtigen und frühlaktierenden Kühen ebenfalls durch einen

euglykämisch-hyperinsulinämischen Clamp einen Anstieg der mRNA und

Proteinmenge von Leptin. Wie in der vorliegenden Studie gezeigt wurde, sind bei den

trächtigen Ziegen die provozierten Insulinwerte höher als bei laktierenden Ziegen.

Dies könnte einen Einfluss auf die Leptinsekretion haben. Allgemein gibt es mehr

Hinweise dafür, dass keine Beeinflussung durch das Insulin besteht (KAUTER et al.,

2000; GABAI et al., 2002; SOLIMAN et al., 2002), und wahrscheinlich ist der Einfluss

vom hormonellen Status abhängig (BLOCK et al., 2003, LEURY et al., 2003).

Diskussion 85

Insbesondere in der Trächtigkeit, ist die Erhöhung der Leptin-mRNA

insulinunabhängig (CHILLIARD et al., 2005; LIEFERS et al., 2005). Eine mögliche

Erklärung für die Veränderungen könnten in der Regulation des Bindungsproteins

liegen. Abschließende Erklärungsansätze bestehen jedoch zur Zeit noch nicht.

Regulation der LCFA

Die Zusammenhänge bei der Regulation der Fettsäurekonzentration im Blut sind

sehr komplex. Die Steuerung erfolgt über die Regulation der Triacylglyzeridsynthese,

der Fettsäuresynthese und der ß-Oxidation.

Um den Geburtszeitraum zeigten GABAI et al. (2002) bei Kühen, dass die freien

LCFA-Werte um die Spätträchtigkeit und Frühlaktation gegenüber der Spätlaktation

erhöht sind. Diese konnten nicht durch Glukose- oder Aminosäureinfusion beeinflusst

werden. Nach BLOCK et al. (2001) erhöhen sich die LCFA-Werte im Übergang vom

spätträchtigen ins frühlaktierende Stadium. Bei den frühlaktierenden Kühen können

diese Werte durch Insulininfusion gesenkt werden.

Nach SHIMABUKURO et al. (1997) senkt Leptin freie Fettsäuren bei Ratten durch

Erhöhung der ß-Oxidation. Dies wäre ein möglicher Erklärungsansatz für den Anstieg

der Fettsäuren bei BLOCK et al. (2001). Dieser steht allerdings im Widerspruch zu

den unveränderten Fettsäurekonzentrationen nach GABAI et al. (2002) um den

Geburtszeitraum. Sie bieten aber eine mögliche Erklärung des Abfalls der LCFA in

der Spätlaktation, wenn sich bei Milchkühen die Leptinwerte erhöhen.

Insulin senkt die Konzentration an LCFA durch Erhöhung der Fettsäureveresterung

(CUNNINGHAM, 2002). Bei FUHRMANN et al. (1989) besteht bei weiblichen

Rindern ein Unterschied zwischen laktierenden Kühen und Färsen. Bei Kühen sind

die LCFA-Ausgangswerte höher als bei den Färsen, und fallen dann durch

Glukoseinfusion sehr stark ab. Bei den Färsen sinken die LCFA-Konzentrationen nur

gering. Die Plasmainsulinkonzentration bei den Kühen ist niedriger als bei den

Färsen. Vergleichbare Verhältnisse sind auch bei Schafen zu finden (REGNAULT et

al., 2004). REGNAULT et al. (2004) führen dies auf die verminderte

Insulinfreisetzung in der Laktation zurück.

Das Dargelegte zeigt, dass die LCFA durch Glukose gesenkt wird. Während bei

trächtigen Tieren dies auf einen Anstieg von Insulin zurückzuführen ist, ist dieser bei

den laktierenden weniger stark ausgeprägt. Dabei ist der Abfall bei den laktierenden

Tieren noch deutlicher ausgeprägt. Somit scheint ein weiterer Zusammenhang der

Diskussion 86

Regulation zu bestehen, als jener über die Erhöhung von Insulin. Die im eigenen

Versuch bei den laktierenden Ziegen erhöhten Fettsäurewerte zu Beginn des

euglykämisch-hyperinsulinämischen Clamps, sowie der ausgeprägtere Abfall durch

die Behandlung, könnte auf eine höhere Insulinsensitivität zurückzuführen sein. Dem

widersprechen allerdings die Erkenntnisse nach LOMAX et al. (1979), der bei

Milchkühen eine verminderte Gewebesensitivität nachweisen konnte. REGNAULT et

al. (2004) verweisen auf unbekannte Faktoren als mögliche Einflussfaktoren.

Möglicherweise spielt hier Leptin eine Rolle, das in den beiden Clamps

unterschiedlich reguliert wurde.

Insulinsensitivität, Laktosegehalt der Milch und Milchleistung

Bei laktierenden Tieren ist der Glukoseumsatz höher als bei trächtigen Tieren. Nicht

bilanziert ist allerdings die renale Clearance, sowie die Ausscheidung mit der Milch.

Es ist nicht davon auszugehen, dass sich die Nierenschwelle bei laktierenden Tieren

senkt, und damit mehr Glukose mit dem Urin ausgeschieden wird. DEBRAS et al.

(1989) zeigten, dass die Plasmaglukosekonzentrationen zu verschiedenen

Laktationszeitpunkten nicht von jenen bei trocken stehenden Ziegen abweichen. In

den Clampstudien ist Insulin zwar von Bedeutung für den Erhalt der Laktation, es

spielt aber keine Rolle bei der Glukoseaufnahme, der initialen Reaktion der

Galaktopoese.

Die physiologischen Laktosegehalte in der Ziegenmilch werden von

unterschiedlichen Autoren mit 4,10 % bis 4,30 % angegeben (BOSTEDT u. DEDIE,

1996; GÜRTLER u. SCHWEIGERT, 2000). Demgegenüber stehen die mit

Infrarotmessungen von BEQUETTE et al. (2001), die mit 4,71 % bis 4,76 % unseren

Werten vergleichbar sind. Eine mögliche Erklärung der Abweichung der ermittelten

Ergebnisse von den Referenzwerten liegt in der angewandten Meßmethode. Die

Messung erfolgte mittels Infrarotmessung. In Ermangelung standardisierter

Ziegenmilch erfolgte die Kalibrierung in unserem Versuch mit Kuhmilch. Aufgrund

unterschiedlicher Fett-, Protein- und Elektrolytgehalte, sowie abweichender

Zusammensetzung der Bestandteile in der Milch, ist eine Abweichung der Werte

möglich. Der Vergleich des Zuckergehaltes in der Morgen- und Abendmilch, zeigten,

wie zu erwarten war, keine Abweichungen. Dieser Versuch kann somit die

Hypothese bestätigen, dass der Laktosegehalt in Milch nur geringen Abweichungen

unterliegt.

Diskussion 87

Laktose wird durch die Laktosesynthase in der Alveolarepithelzelle der Milchdrüse

aus Glukose und Galaktose gebildet. Dabei kommt der Glukose die bestimmende

Rolle in der Milchsynthese zu. Als Substrat zur Bildung von ATP und NADPH ist sie

wichtiger Energieträger für den Stoffwechsel der Alveolarepithelzelle. 60-70 % der

Glukose gehen jedoch, über die Bildung von Glukose-6-Phosphat und UDP-

Galaktose, als direkter Baustein in die Laktosesynthese beim Rind ein (ACCORSI et

al., 2005). Aufgrund der osmotischen Wirksamkeit von Laktose erfolgt die

Wassersekretion in das Lumen der Milchdrüse. Sie bildet den bestimmenden Faktor

der Milchmenge, und dadurch unterliegt die Laktosekonzentration der Milch nur

geringen Schwankungen. Die sezernierte Laktosemenge, resp. Glukosemenge, und

Milchmenge sind proportional (zur Übersicht: GÜRTLER u. SCHWEIGERT, 2000;

HOCQUETTE u. ABE, 2000).

Nach NIELSEN et al. (1993 u. 2001) unterliegt die Glukoseaufnahme, in

Abhängigkeit vom Zellmetabolismus in der kaprinen Milchdrüse, Schwankungen, die

jedoch unabhängig von der arteriellen Glukosekonzentration bzw. vom

Glukoseangebot und dem Insulinspiegel sind. Daraus schließen sie auf aktive

Translokation mittels eines insulinunabängigen Transporters, wie z.B. dem GLUT1.

Weitere Arbeiten bestätigen dies. BEQUETTE et al. (2001) untersuchten den

Einfluss von Insulin auf den Blutfluss in der Tarsal- und Eutervene, und die

Verteilung der Glukose. Nach einer fünftägigen Aminosäureninfusion wurde ein

zweieinhalbtägiger euglykämisch-hyperinsulinämischer Clamp durchgeführt, wobei

die Infusion beibehalten wurde. Unter diesen Bedingungen ergab die

Blutflussmessung eine Erhöhung der Euterdurchblutung, bei unveränderter

Durchblutung der Hintergliedmaße. Gleichzeitig wurde eine erhöhte

Glukoseaufnahme im Euter, und eine Zunahme der Milchmenge nachgewiesen.

Ebenso konnten RIGOUT et al. (2002) eine Erhöhung der Glukoseaufnahme und

Laktosesynthese zeigen. Auch in diesem Fall war dies mit einer erhöhten

Euterdurchblutung verbunden.

Untersuchungen von KOMATSU et al. (2005) zur Expression von GLUT1- und

GLUT4-mRNA in der Milchdrüse, Skelettmuskulatur und intestinalem Fettgewebe

bestätigen dies. So wurde im Drüsengewebe bei laktierenden Kühen die Expression

von GLUT1 nachgewiesen, wie auch im Fettgewebe von trocken stehenden und

spätlaktierenden Kühen. In diesem Gewebe wurde der GLUT1 in der Phase der

Hochlaktation, sowie in der Milchdrüse bei trocken stehenden Kühen, nicht

Diskussion 88

exprimiert. Dagegen konnte der GLUT4 in der Milchdrüse auch bei laktierenden

Kühen nicht nachgewiesen werden, und im Muskel- und Fettgewebe scheint die

GLUT4-Expression keiner Beeinflussung durch Laktation und Trockenstellen zu

unterliegen. Daraus sei zu schließen, dass dem GLUT4 keine Bedeutung bei der

Entwicklung der peripartalen Insulinresistenz beikommt.

Als weitere Glukosetransporter wurden in diversen Geweben der GLUT8, sowie

verschiedene Natrium-Glukose-Cotransporter (SGLT) identifiziert. Aus der Gruppe

der SGLTs konnten der SGLT1 und SGLT2 in bovinem Milchdrüsengewebe

nachgewiesen werden, wobei der SGLT nur eine geringe Affinität zu Glukose

aufweist. Bei allen drei Transportern erhöhen sich die Expressionsraten in der späten

Trächtigkeit und Frühlaktation um das vier- (SGLT1) bis zehnfache (SGLT1 und

GLUT8), was für eine mögliche Bedeutung dieser Transporter beim Nutrient-

partitioning im peripartalen Zeitraum spricht (ZHAO et al., 2004; ZHAO et al. 2005;

ZHAO u. KEATING, 2007).

Der GLUT8 ist zu Glukose hoch affin, und wird, ähnlich dem GLUT1, über Regulation

der Genexpression gesteuert. Da seine Wirkung insulinunabhängig vermittelt wird,

steht dies im Einklang mit dem Modell der insulinunabhängigen Glukoseaufnahme in

der Milchdrüse. Dagegen ist über den Wirkungsmechanismus der SGLTs im Euter

bisher nur wenig bekannt. Zusammenfassend bestehen deutliche Hinweise, dass die

Milchmenge in einem Zusammenhang mit der Blutglukosekonzentration steht, und

somit eine Beeinflussung der Glukoseinfusionsstudien nicht ausgeschlossen werden

kann. Als Mechanismen sind allerdings andere als Insulinabhängige wahrscheinlich.

Der Abgang von Glukose mit der Milch kann über die Milchmenge und die

Laktosekonzentration (4,84 %) annäherungsweise berechnet werden. Die

Milchmenge des Versuchstages betrug im Mittel 3070 g, die enthaltene Laktose

betrug damit ungefähr 149 g oder 0,43 mol Laktose (molare Masse: 342,3 g/mol).

Die Bildung von einem mol Laktose sind zwei mol Glukose nötig. Entsprechend

beträgt die Menge Glukose (molare Masse: 180,2 g/mol), die in die Milch

übergegangen ist 860 mmol. Wie bereits erwähnt, gehen 60-70% der in die

Milchdrüse aufgenommenen Glukose als Laktose in die Milch über (ACCORSI et al.,

2005), während der Rest der Energiegewinnung dient. Somit beträgt die, auf

Grundlage der Milchleistung berechnete Glukosemenge, die zur Milchbildung

benötigt wurde, ca. 1300 mmol pro 24h.

Diskussion 89

Um die Menge der in den Clamps infundierten Glukose abzuschätzen, kann die

Glukoseinfusionsrate und der Zeitraum (60 min) der Plateauphase herangezogen

werden. Danach wurden in der Plateauphase bei laktierenden Ziegen

durchschnittlich 77,4 mmol im hyperglykämischen Clamp und 48,2 mmol im

euglykämisch/ hyperinsulinämischen Clamp infundiert. Demgegenüber erhielten die

trächtigen Tiere 40,6 mmol (hyperglykämischer Clamp) und 40,0 mmol

(euglykämisch/ hyperinsulinämischen Clamp) Glukose.

Zur Quantifizierung applizierter Substanzen kann die area under the curve (AUC)

berechnet werden. Sie bildet das Integral einer Verlaufskurve von

Blutkonzentrationen (zur Übersicht: PIDGEN, 1992). Mit der Quantifizierung über die

GIR kann dies allerdings direkt abgeschätzt werden. Der Vergleich der infundierten

Glukose mit dem geschätzten Wert des Milcheffluxes macht deutlich, dass die

Menge Glukose, die in die Milch übergeht, bis zum deißigfachen der in diesem

Versuchsaufbau infundiblen Menge ist. Eine überschlagsmäßige Beurteilung über

die Quantifizierung in der Plateauphase kann dadurch ausreichend genau sein.

Der Faktor weist darauf hin, dass die Clamps die Milchmenge nur marginal

beeinflussen könnten, weshalb auch daraufhin ein Einfluss der Glukoseapplikation

auf Laktose- und Milchmenge unwahrscheinlich erscheint.

Die Laktationskurve bei Ziegen erreicht, in Abhängigkeit von der Ernährung, um den

29. Laktationstag (22. bis 44 Tag p.p.) ihren Höhepunkt (MIN et al., 2005). Der

Anstieg in der Milchleistung im eigenen Versuch entspricht dem physiologischen

Laktationsverlauf.

Die Milcheinbuße am Folgetag des Versuches ist wahrscheinlich auf den

karenzbedingten Energiemangel, und die Behandlung der Tiere am Vortag

zurückzuführen. Der Einbruch betraf in besonderem Maße Tiere mit hoher

Milchleistung. Da die Milchmenge in erster Linie vom Nahrungsangebot abhängt,

führt ein Nahrungsmangel zu einer geringeren Milchausbeute. Dies passt zu der

Beobachtung von SORENSEN et al (2002), wonach mit zunehmender Milchleistung

bis zum Tag 18, die Laktationsleistung nachmittags ansteigt. Was die Rolle des

Laktoseeffluxes angeht, so ist die Bildung von Laktose aus Glukose der

bestimmende Faktor der Milchsynthese, und steuert somit die Milchleistung, bzw. die

Milchmenge. Umgekehrt bedeutet dies, dass Glukoseefflux mit der Milch mit einer

Erhöhung der Milchleistung einhergeht. Die Tagesmilchmenge war unverändert, und

Diskussion 90

somit ist davon auszugehen, dass der Clamp keinen Einfluss auf den Laktoseeflux

hat.

Diese Versuche stehen mit der Hypothese einer insulinunabhängigen

Laktosesynthese in Einklang, und es konnten Zusammenhänge zwischen

Plasmaleptingehalt und Insulinresistenz um den Geburtszeitraum bei der Ziege

gezeigt werden. Zudem wurde eine veränderte Ansprechbarkeit für die Regulation

der Leptinsekretion peri partum gezeigt.

Mit der Entwicklung einer quantifizierenden PCR zum Nachweis der mRNA von

Leptin, Ob-Rb und putativem GPR41 konnte ein grundsätzlicher Zusammenhang

zwischen Propionatinfusion, der mRNA des propionatabhängigen putativen GPR41

und der Leptinsynthese bei Ziegen nachgewiesen werden. Wenngleich ein Einfluss

der G-proteingekoppelten Rezeptoren 40 und 43, und/oder eine gleichzeitige

Insulinwirkung nicht auszuschließen ist, führt dies zu weiteren Erkenntnissen einer

direkten peripheren Regulation der Leptinsynthese bei Wiederkäuern. Die genauere

Abgrenzung und Unterscheidung der Wirkungen, die parallel verlaufen, bietet

Ansatzpunkte für zusätzliche Studien.

Die Entwicklung verschiedener quantifizierender RT-PCR-Assays bietet das

Werkzeug für die Untersuchung der Expression wichtiger Faktoren, die die periphere

Regulation des Leptinsytems beeinflussen.

Die gewonnen Erkenntnisse untermauern den Bedarf für weiterführende

Untersuchungen. Von Interesse ist insbesondere die Untersuchung der

Mechanismen in der Zellkultur. Interessant ist zudem, wo die Leptinsekretion und

Regulation der Rezeptoren lokalisiert ist, und welche Gewebe, insbesondere welche

Fettdepots, bei der Regulation im Vordergrund stehen.

Durch gleichzeitige Untersuchung von Leptin in einem ELISA (SAUERWEIN et al.,

2004) konnte gezeigt werden, dass ein komplexes Zusammenspiel von

Leptinexpression und –synthese, sowie Expression der mRNA der aktiven Form des

Leptinrezeptors (ob-Rb) und des im Rahmen der vorliegenden Studie identifizierten

putativen GPR41 bei der Ziege, besteht, welches an der Steuerung dieser

Regulationsmechanismen beteiligt ist. Zudem wurde die Hypothese bestärkt, wonach

Leptin eine herausragende Bedeutung bei der Steuerung des Energiestoffwechsels,

des Nutrient-partitioning, beim Wiederkäuer zukommt.

Zusammenfassung 91

5 Zusammenfassung

Christoph Seybold: Untersuchungen zur energetischen Regulation des

Leptinsystems bei der Ziege

Von Leptin ist bekannt, dass es hormonell und durch die Nahrungszufuhr reguliert

wird. Bei Menschen und Nagetieren konnte nachgewiesen werden, dass kurzkettige

Fettsäuren (SCFA) die Leptinexpression verändern. Im Wiederkäuermetabolismus,

der von SCFA als Substrat für die hepatische Glukoneogenese abhängt, sind diese

Stoffwechselwege möglicherweise von großer Bedeutung. In dieser Studie sollte

untersucht werden, ob Propionat bei Ziegen die Leptinsynthese beeinflusst.

In einem weiteren Versuch sollte der Zusammenhang von Leptin und Insulin weiter

untersucht werden. Die Regulation dieser beiden Hormone ist eng miteinander

verbunden. Bei Monogastriern, wie auch bei Wiederkäuern, konnte gezeigt werden,

dass Leptin einen Einfluss auf die Insulinsekretion und –sensitivität hat.

Insbesondere im Wechsel von der Spätträchtigkeit zum Beginn der Laktation ändert

sich das Hormonmuster und die Insulinsenstivität. Mit Hilfe von hyperglykämischen

Clamps und euglykämisch-hyperinsulinämischen Clamps bei Milchziegen, sollte

dieser Wechsel weiter charakterisiert werden.

Im ersten Teil wurden 9 kastrierte Böcke mit einer Propionatlösung oder einer NaCl-

lösung äquimolarer Konzentration intravenös infundiert. Nach einer einstündigen

Vorperiode erfolgte die Infusion für bis zu 260 Minuten. In regelmäßigen Abständen

wurden Blutproben entnommen und die Glukosekonzentration gemessen. Als

weitere Parameter wurden Leptin, Insulin und langkettige Fettsäuren (LCFA)

untersucht. Mit Ende der Infusion wurden die Tiere euthanasiert, und Gewebeproben

aus M. semitendinosus, Leber, Subkutanfett und Perirenalfett entnommen .

In den Gewebeproben wurde die Genexpression untersucht. Dazu wurden real-time

RT-PCR-Assays für Leptin, Leptinrezeptor und für den putativen G-

proteingekoppelten Rezeptor (GPR) 41, sowie für 18S rRNA als internen Standard,

entwickelt und validiert.

Die Untersuchung ergab, dass die mRNA von Leptin und von Leptinrezeptor

tendenziell höher im Subkutanfett als im Perirenalfett exprimiert wird. Die Leptin-

mRNA stieg im Perirenalfett tendenziell um das 3,2-fache während der

Propionatinfusion. Die mRNA des Leptinrezeptors fiel signifikant um das 4,2-fache

Zusammenfassung 92

ab. Dies weist auf die bisher nur wenig untersuchte mögliche Bedeutung des

Leptinrezeptors für die periphere Leptinregulation hin. Es wurde eine höhere GPR41-

mRNA-Menge im Perirenalfett nachgewiesen. Durch den Nachweis einer

signifikanten Erhöhung im Subkutanfett um das 12-fache, konnte gezeigt werden,

dass der GPR41 bei Ziegen grundsätzlich im Zusammenhang mit einer Erhöhung

von Leptin nach einer Propionatinfusion steht. In den Serumproben konnten die

Konzentrationsverläufe der Hormone, Glukose und LCFA charakterisiert werden. Die

Erhöhung der Leptin-mRNA wurde durch einen Anstieg von Leptin in den Blutproben

bestätigt. Die Serumwerte von Insulin und Glukose unterschieden sich zwischen den

beiden Gruppen, wobei in der Behandlungsgruppe die Werte höher lagen. Die LCFA-

Werte unterschieden sich ebenfalls. Hier fielen allerdings die Werte in der

Propionatgruppe initial ab, und errreichten zum Ende wieder dasselbe Niveau.

Im zweiten Teil wurden an 6 Milchziegen ca. 25 Tage a.p. und 9 Tage p.p. die beiden

intravenösen Clamps durchgeführt. Die Blutproben wurden auf Glukose, Insulin,

LCFA und Leptin untersucht. Die Ergebnisse zeigten Unterschiede im

Glukosestoffwechsel zwischen trächtigen und laktierenden Ziegen. In der

Trächtigkeit ist die Insulinsekretion durch Glukoseinfusion höher, und die infundierte

Glukose wird langsamer verstoffwechselt. Entsprechend war bei den laktierenden

Ziegen die Gewebesensitivität und die metabolische Clearance Rate für Insulin

höher. Die LCFA-Konzentration war in der Laktation erhöht, und unterlag größeren

Schwankungen durch die Infusionen. Bei den trächtigen Ziegen wurde ein Einfluss

der Infusionen auf die Leptinsekretion nachgewiesen. Es konnte hingegen kein

signifikanter Effekt der Clamps während der Laktation nachgewiesen werden.

Es bestehen klare Hinweise, dass die mit der Propionatinfusion induzierten

metabolischen Veränderungen die Leptinsynthese bei Ziegen erhöhen, und dabei in

ein komplexes System der energetischen Regulation durch Energiesubstrate und

Hormone eingebettet ist. Das Verhältnis zwischen Leptin, Insulin- und

Glukosemetabolismus um die Geburt ist ebenso eng wie vielschichtig, und bestätigt

deren hervorragende Rolle im Ausgleich zwischen Insulinsensitivität und

Energieversorgung.

Summary 93

6 Summary

Christoph Seybold: Investigations on the energetic regulation of the leptin

system in goats

Leptin is known to be hormonally and nutritionally regulated. In human and rodents

there is evidence that SCFA (short-chained fatty acids) alter leptin expression. In

ruminant metabolism, depending on SCFA as fuel for the hepatic gluconeogenesis,

these metabolic pathways are potentially important. This study aimed to investigate

whether propionate influences leptin synthesis in goats.

In a following trial, the correlation between leptin and insulin was further assessed.

The regulation of these hormones is closely related. It was shown in monogastrics as

well as in ruminants that leptin influences insulin secretion and sensitivity. Particularly

between late pregnancy and the beginning of lactation, the pattern of hormones

secreted and insulin sensitivity change. This change ought to be further

characterised by means of hyperglycaemic and euglycemic-hyperinsulinemic clamps

in dairy goats.

In the first part, 9 castrated bucks were allocated to an intravenous infusion with

either a propionate solution or an equimolar NaCl solution. After a pre-period of one

hour, the following infusion started for up to 260 minutes. Frequent blood samples

were taken regularly and the concentration of glucose was measured immediately.

Further parameters were leptin, insulin and long-chained fatty acids (LCFA). Finally

the animals were euthanised and tissue samples were taken from M.

semitendinosus, liver, subcutaneous fat and perirenal fat.

In the tissue samples gene expression was investigated. Therefore real-time RT-

PCR assays for the assessment of leptin, leptin receptor, putative G-protein coupled

receptor (GPR) 41 and 18S rRNA as internal standard were designed and validated.

The investigation showed that mRNA of leptin and leptin receptor tended to be

expressed at a higher rate in subcutaneous fat than in perirenal fat. Leptin mRNA

was raised 3,2 fold by the propionate infusion in the perirenal fat. Leptin receptor

mRNA was reduced significantly 4,2 fold. This points out the potential importance of

leptin receptor in peripheral regulation of leptin that has only marginally been

investigated yet. GPR41 mRNA abundance was higher in perirenal fat. By detecting

a significant increase in subcutaneous fat, it could be shown that GPR41 is basically

Summary 94

correlated to an increase of leptin through propionate infusion in goats. In the serum

samples, the concentration profiles of hormones, glucose and LCFA were

characterised. The increase of leptin mRNA was confirmed by a raise of leptin in the

blood samples. Serum concentrations of insulin and glucose were different between

the two groups with higher levels in the treatment group. The concentrations of LCFA

were also different, but there was an initial decline in the propionate group. Finally

the concentration reached the base level again.

In the second part, the two intravenous clamps were performed in six dairy goats at

about 25 days a.p. and 9 days p.p. The blood samples were assessed for glucose,

insulin, LCFA and leptin. The results showed differences in glucose metabolism

between pregnant and lactating goats. In pregnancy, glucose infusion increased

insulin at a higher rate. The amount of glucose infused was metabolised more slowly.

Accordingly, tissue sensitivity and metabolic clearance rate of insulin in lactating

goats were higher. LCFA concentration was higher in lactation and was strongly

affected by the infusions. In pregnant goats, leptin was evidentially influenced by the

infusions, whereas there was no significant effect of the clamps during lactation.

There was strong evidence that changes in metabolism induced by propionate

infusion increased leptin synthesis in goats, embedded into a complex system of

energetic regulation by fuel and hormones. The relationship between leptin, insulin

metabolism and glucose metabolism around parturition is close and complex, thus

confirming a prominent role in balancing insulin sensitivity and energy supply.

Literaturverzeichnis 95

7 Literaturverzeichnis

AHIMA, R.S. (2006): Adipose tissue as an endocrine organ. Obesity (Silver Spring). 14 Suppl 5, 242S-249S ACCORSI, P.A., M. GAMBERONI, G. ISANI, N. GOVONI, R. VIGGANI, M. MONARI, M. de AMBROGI, A. MUNNO, C. TAMANINI u. E. SEREN (2005): Leptin does not seem to influence glucose uptake by bovine mammary explants. J. Physiol. Pharmacol. 56, 689-698 ALTSCHUL, S.F., W. GISH, W. MILLER, E.W. MYERS u. D.J. LIPMAN (1990): Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215, 403-410 BARTHA, T., A. SAYED-AHMED, P. RUDAS (2005): Expression of leptin and its receptors in various tussues of ruminants. Domest. Anim. Endocrinol. 29, 193-202 BENMANSOUR, N.M., Y. DEMARNE, M.J. LECOURTIER u. C. LHUILLERY (1991) : Effects of dietary fat and adipose tissue location on insulin action in young boar adipocytes. Int. J. Biochem. 23, 499-506 BEQUETTE, B.J., C.E. KYLE, L.A. CROMPTON V. BUCHAN u. M.D. HANIGAN (2001): Insulin regulates milk production and mammary gland and hind-leg amino acid fluxes and blood flow in lactating goats. J. Dairy Sci. 84, 241-255 BLOCK, S.S., W.R. BUTLER, R.A. EHRHARDT, A.W. BELL, M.E. VAN AMBURGH u. Y.R. BOISCLAIR (2001): Decreased concentration of plasma leptin in periparturient dairy cows is caused by negative energy balance. J. Endocrinol. 171, 339-348 BLOCK, S.S., R.P. RHOADS, D.E. BAUMAN, R.A. EHRHARDT, M.A. MCGUIRE, B.A. CROOKER, J.M. GRIINARI, T.R. MACKLE, W.J. WEBER, M.E. VAN AMBURGH u. Y.R. BOISCLAIR (2003): Demonstration of a role for insulin in the regulation of leptin in lactating dairy cows. J. Dairy Sci. 86, 3508-3515 BONINI, J.A., S.M. ANDERSON u. D.F. STEINER (1997): Molecular cloning and tissue expression of a novel orphan G protein-coupled receptor from rat lung. Biochem. Biophys. Res. Commun. 234, 190-193


BONNET, M., C. DELAVAUD, J. ROUEL u. Y. CHILLIARD (2005) : Pregnancy increases plasma leptin in nulliparous but not primiparous goats while lactation depresses it. Domest. Anim. Endocrinol. 28, 216-223 BOSCH, R.R., S.W. JANSSEN, P.N. SPAN, A. OLTHAAR, S.E. VAN ERNST-DE VRIES, P.H. WILLEMS, J.M.G. MARTENS, A.R. HERMUS u. C.C. SWEEP (2003): Exploring levels of hexosamine biosynthesis pathway intermediates and protein kinase C isoforms in muscle and fat tissue Diabetic Fatty rats. Endocrine 20, 247-252 BOSCH, R.R., M.J. POUWELS, P.N. SPAN, A.J. OLTHAAR, A.R. HERMUS u. C.G. SWEEP (2004): Hexosamines are unlikely to function as a nutrient-sensor in 3T3-L1 adipocytes: a comparison of UDP-hexosamine levels after glucose flux and glucosamine treatment. Endocrine 23, 17-24 BOSTEDT, H. u. K. DEDIE (1996): Schaf- und Ziegenkrankheiten. 2.Auflage, Ulmer-Verlag, Stuttgart, 441 BRADFORD, B.J., M. OBA, R.A. EHRHARDT, Y.R. BOISCLAIR u. M.S. ALLEN (2006): Propionate is not an important regulator of plasma leptin concentration in dairy cattle. Domest. Anim. Endocrinol. 30, 65-75 BREVES, G. (2000): Physiologie des Magen-Darm-Kanals. In: ENGELHARDT, W.v. u. G.BREVES (Hrsg.): Physiologie der Haustiere Enke-Verlag, Stuttgart, 348-350 BRISCOE, C.P., M. TADAYYON, J.L. ANDREWS, W.G. BENSON, j.K. CHAMBERS, M.M. EILERT, C. ELLIS, N.A. ELSHOURBAGY, A.S. GOETZ, D.T. MINNICK, P.R. MURDOCK, H.R. Jr. SAULS, U. SHABON, L.D. SPINAGE, J.C. STRUM, P.G. SZEKERES,K.B. TAN, J.W. WAY, D.M. IGNAR, S. WILSON u. A.I. MUIR (2003): The orphan G protein-coupled receptor GPR40 is activated by medium and long chain fatty acids. Trends Endocrinol. Metab. 14, 201-203 BROWN, A.J., S.M. GOLDSWORTHY, A.A. BARNES, M.M. EILERT, L. TCHEANG, D. DANIELS, A.I. MUIR, M.J. WIGGLESWORTH, I. KINGHORN, N.J. FRASER, N.B. PIKE, J.C. STRUM, K.M. STEPLEWSKI, P.R. MURDOCK, J.C. HOLDER, F.H. MARSHALL, P.G. SZEKERES, S. WILSON, D.M. IGNAR, S.M. FOORD, A. WISE u. S.J. DOWELL (2003): The Orphan G protein-coupled receptors GPR41 and GPR43 are activated by propionate and other short chain carboxylic acids. J. Biol. Chem. 278, 11312-11319 BROWN, A.J., S. JUPE und C.P. BRISCOE (2005): A family of fatty acid binding receptors. DNA Cell Biol. 24, 54-61


BUSTIN, S.A. (2000): Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J. Mol. Endocrinol. 25, 169-193 BUSTIN, S.A. (2002): Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J. Mol. Endocrinol. 29, 23-29 BUSTIN, S.A. u. T. NOLAN (2004): Pitfalls of quantiative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. J. Biomol. Tech. 15, 155-166 CAMERON, R.E.B., P.B. DYK, T.H. HERDT, J.B. KANEENE, R. MILLER, H.F. BUCHOLTZ, J.S. LIESMAN, M.J. VANDEHAAR u. R.S. EMERY (1998): Dry cow diet, management, and energy balance as risk factors for displaced abomasum in high producing dairy herds. J. Dairy Sci. 81, 132-139 CEDDIA R.B., W.N. Jr. WILLIAM u. R. CURI (1999): Comparing effects of leptin and insulin on glucose metabolism in skeletal muscle: evidence for an effect of leptin on glucose uptake and decarboxylation. Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 23, 75-82 CHELIKANI, P.K., D.R. GLIMM u. J.J. KENNELLY (2003a): Tissue distribution of leptin and leptin receptor mRNA in the bovine. J. Dairy Sci. 86, 2369-2372 CHELIKANI, P.K., D.H. KEISLER u. J.J. KENNELLY (2003b): Response of plasma leptin concentration to jugular infusion of glucose or lipid is dependent on the stage of lactation of holstein cows. J. Nutr. 133, 4163-4171 CHILLIARD, Y., M. BONNET, C. DELAVAUD, Y. FAULCONNIER; C. LEROUX, J. DJIANE u. F. BOCQUIER (2001): Leptin in ruminants. Gene expression in adipose tissue and mammary gland, and regulation of plasma concentration. Domest. Anim. Endocrinol. 21, 271-295 CHILLIARD, Y., C. DELAVAUD u. M. BONNET (2005): Leptin expression in ruminants: Nutritional and physiological regulations in relation with energy metabolism Domest. Anim. Endocrinol. 29, 3-22 CHOMCZYNSKI, P. u. K. MACKEY (1995): Substitution of chloroform by bromo-chloropropane in the single-step method of RNA isolation. Anal. Biochem. 225, 163-164


CHOMCZYNSKI, P., u. N. SACCHI (1987): Single-step method of RNA-isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159 CHRISTENSEN, J.O., R.R. GRUMMER, F.E. RASMUSSEN u. S.J. BERTICS (1997): Effect of method of delivery of propylene glycol on plasma metabolites of feed-restricted cattle. J. Dairy Sci. 80, 563-568 COHEN, P., M. MIYAZAKI, N.D. SOCCI, A. HAGGE-GREEBERG, W.LIEDTKE, A.A. SOUKAS, R. SHARMA, L.C. HUDGINS, J.M. NTAMBI u. J.M. FRIEDMAN (2002): Role for stearoyl-CoA desaturase-1 in leptin-mediated weight loss. Science. 297, 240-243 COHEN, P., J.M. FRIEDMAN (2004): Leptin and the control of metabolism: role for stearoyl-CoA desaturase-1 (SCD-1). J.Nutr. 134, 2455S-2463S CORPET, F. (1988): Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucl. Acids Res. 16, 10881-10890 COVINTON, D.K., C.A. BRISCOE, A.J. BROWN u. C.K. JAYAWICKREME (2006): The G-protein-coupled receptor 40 family (GPR40-43) and its role in nutrient sensing Biochem. Trans. Soc. 34, 770-773 CUNNINGHAM, I.G. (2002): Textbook of veterinary physiology. W.B. Saunders, 3/E, Philadelphia, 320, 361 DEBRAS, E. J. GRIZARD, E. AINA, S. TESSERAUD, C. CHAMPREDON u. M. ARNAL (1989): Insulin sensitivity and responsiveness during lactation and dry period in goats. Am. J. Physiol. 256, E295-E302 DEFRONZO, R.A., J.D. TOBIN, R. ANDRES (1979): Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance Am. J. Physiol. 237, E214-E223 DEINDL, E. (2001): 18S ribosomal RNA detection on Northern blot employing a specific oligonucleotide. Biotechniques 31, 1250,1252 DELAVAUD, C. F. BOCQUIER, Y. CHILLIARD, D.H. KEISLER, A. GERTLER u. G. KANN (2000): Plasma leptin determination in ruminants: effect of nutritional status and body fatness on plasma leptin concentration assessed by a specific RIA in sheep. J. Endocrinol. 165, 519-526


DELAVAUD, C., A. FERLAY, Y. FAULCONNIER, F. BOCQUIER, G. KANN u. Y. CHILLIARD (2002): Plasma leptin concentration in adult cattle: effects of species, breed, adiposity, feeding level and meal intake. J. Anim. Sci. 80, 1317-1328 DICOSTANZO A., J.E. WILLIAMS u. D.H. KEISLER (1999): Effects of short- or long-term infusions of acetate or propionate on luteinizing hormone, insulin, and metabolite concentrations in beef heifers. J. Anim. Sci. 77, 3050-3056 DRACKLEY, J.K. (1999): Biology of dairy cows during the transition period: the final frontier? J. Dairy Sci. 82, 2259-2273 EHRHARDT, R.A., P.L. GREENWOOD, A.W. BELL u. Y.R. BOISCLAIR (2003): Plasma leptin is regulated predominantly by nutrition in preruminant lambs. J. Nutr. 133, 4196-4201 EMILSSON, V., J. O`DOWD, A.L. NOLAN u. M.A. CAWTHORNE (2001): Hexosamines and nutrient excess induce leptin production and leptin receptor activation in pancreatic islets and clonal beta-cells. Endocrinology 142, 4414-4419 FITZPATRICK, R., O.M. CASEY, D. MORRIS, T. SMITH, R. POWELL u. J.M. SREENAN (2002): Postmortem stability of RNA isolated from bovine reproductive tissue. Biochim. Biophys. Acta 1574, 10-14 FLEIGE, S. u. M.W. PFAFFL (2006): RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol. Aspects. Med. 27, 126-139 FLEIGE, S., V. WALF, S. HUCH, C. PRGOMET, J. SEHM u. M.W. PFAFFL (2006): Comparison of relative mRNA quantification models and the impact of RNA integrity in quantitative real-time PCR. Biotechnol. Lett. 28, 1601-1613 FÖRSTER, V.T. (1948): Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annals of Physics, Leipzig FRIEDMAN, J.M. u. J.L. HALAAS (1998): Leptin and the regulation of body weight in mammals. Nature 395, 763-770 FRUHBECK,G.A. (2006): Intracellular signalling pathways activated by leptin. Biochem. J. 393(Pt1), 7-20


FUHRMANN, H., C. EULITZ-MEDER, H. GELDERMANN u. H.P. SALLMANN (1989): Zur Evaluierung von Hormon- und Metabolitprofilen nach Infusion von Glucose, Propionat und Butyrat beim Rind. Berl. Münch. Tierärztl. Wschr. 102, 188-193 GABAI, G., G. COZZI, F. ROSI, I. ANDRIGHETTO u. G. BONO (2002): Glucose or essential amino acid infusionsin late pregnant and early lactating Simmenthal cows failed to induce a leptin response. J. Vet. Med. A 49, 73-80 GARCIA, M.R., M. AMSTALDEN, S.W. WILLIAMS, R.L. STANKO, C.D. MORRISON, D.H. KEISLER, S.E. NIZIELSKI u. G.L. WILLIAMS (2002): Serum leptin and ist adipose gene expression during pubertal development, the estrous cycle, and different seasons in cattle. J. Anim. Sci. 80, 2158-2167 GAVRILOVA, O., V. BARR, B. MARCUS-SAMUELS u. M. REITMAN (1997) : Hyperleptinemia of pregnancy associated with the appearance of a circulating form of the leptin receptor. J. Biol. Chem. 48, 30546-30551 GEARY, T.W., E.L. MCFADIN, M.D. MACNEIL, E.E. GRINGS, R.E. SHORT, R.N. FUNSTON u. D.H. KEISLER (2003): Leptin as a predictor of carcass composition in beef cattle. J. Anim. Sci 81, 1-8 GELFAND, D.H. (1989): Current communications in molecular biology: polymerase chain reaction. In: H.A. EHRLICH, R. GIBBS, H.H. KAZAZIAN (Hrsg.). CSHL Cold Spring Harbor, NY 11-17 GERTLER, A., J. SIMMONS u. D.H. KEISLER (1998): Large-scale preparation of biologically active rcombinant ovine obese prtein (leptin).. FEBS Lett. 422, 137-140 GOFF, J.P. (2006): Major advances in our understanding of nutritional infuences on bovine health. J. Dairy Sci. 89, 1292-1301 GORZELNIAK, K., J. JANKE, S. ENGELI u. A.M. SHARMA (2001): Vaidation of endogenous controls for gene expression studies in human adipocytes and preadipocytes. Horm. Metab. Res. 33, 625-627 GÜRTLER, H. u. F.J. SCHWEIGERT (2000): Physiologie der Laktation. In: ENGELHARDT, W.v. u. G. BREVES (Hrsg.): Physiologie der Haustiere. Enke-Verlag, Stuttgart, 580-589


HACHENBERG, S., C. WEINKAUF, S. HISS u. H. SAUERWEIN (2007): Evaluation of classification modes potentially suitable to identify metabolic stress in healthy dairy cows during the peripartal period. J. Anim. Sci. 85, 1923-1932 HAMMON, H.M., O. BELLMANN, J. VOIGT, F. SCHNEIDER u. C. KÜHN (2007): Glucose-dependent insulin response and milk production in heifers within a segregating resource family population. J. Dairy Sci. 90, 3247-3254 HEINTGES, U (2003): Untersuchungen zur Bedeutung von Leptin bei Wiederkäuern. Shaker Verlag, Aachen Bonn, Univ., Fachber. Agrarwiss. Diss. HENNIES, M., J.K. VOGLMAYR, E. DIETRICH, M. STOLLMANN, R. MOELLER u. W. HOLTZ (2001): Hormonal response of female goats to active immunization against a recombinant human inhibin alpha-subunit, and establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay for caprine follicle-stimulating hormone Reprod. Domest. Anim. 36, 65-71 HIGASHIYAMA, Y., H. ABE, M. HAYASHI u. K. HODATE (2003): The comparism of plasma level and mRNA expression of leptin from Japanese Black steers and Holstein steers. Livest. Prod. Sci. 81, 247-255 HOCQUETTE, J.F. u. H. ABE (2000): Facilitative glucose transporters in livestock species. Reprod. Nutr. Dev. 40, 517-533 HOLLAND, P.M., R.D. ABRAMSON, R. WATSON u. D.H. GELFAND (1991): Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5` 3` exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 7276-7280 HONG, Y.-H., Y. NISHIMURA, D. HISHIKAWA, H. TSUZUKI, H. MIYAHARA, C. GOTOH, K.-C. CHOI, D. D. FENG, C. CHEN, H.-G. LEE, K. KATOH, S.-G. ROH u. S. SASAKI (2005): Acetate and propionate short chain fatty acids stimulate adipogenesis via GPCR43. Endocrinology 146, 5092-5099 HOUSEKNECHT, K.L. u. C.P. PORTOCARRERO (1998): Leptin and its receptors: regulators of whole-body energy homeostasis. Domest. Anim. Endocrinol. 15, 457-475 HOUSEKNECHT, K.L., C.P. PORTOCARRERO, R. LEMENAGER u. M.E. SPURLOCK (2000): Growth hormone regulates leptin gene expression in bovine adipose tissue: correlation with adipose tissue IGF-1 expression. J. Endocrinol. 164, 51-57


HUSVETH, F., S. SZEGLETI u. Z. NEOGRADY (1996): Infusion of various short chain acids causes different changes in the blood glucose and insulin concentrations in growing lambs deprived of food overnight. J. Vet Med. A 43, 437-444 INGVARTSEN, K.L. u. Y.R. BOISCLAIR (2001): Leptin and the regulation of food intake, energy homeostasis and immunity with special focus on periparturient ruminants. Domest. Anim. Endocrinol. 21, 215-250 ISHIGURO, T., J. SAITOH, H. YAWATA, H. YAMAGISHI, S. IWASAKI u. Y. MITOMA (1995): Homogeneous quantitative assay of hepatitis C virus RNA by polymerase chain reaction in the presence of a fluorescent intercalater. Anal. Biochem. 229, 207-213 IVELL, R (1998): A question of faith – or the philosophy of RNA controls. J. Endocrinol. 159, 197-200 JANES, A.N., T.E.C. WEEKES, u. D.G. ARMSTRONG (1985): Insulin action and glucose metabolism in sheep fed on dried-grass or ground, maize-based diets. Br. J. Nutr. 54, 459-471 JI, S., G.M. WILLIS, R.R. SCOTT, M.E. SPURLOCK (1998): Partial cloning and expression of the bovine leptin gene. Biotechnol. 9, 1-14 KASHYAP, S.R. u. R.A. DEFRONZO (2007): The insulin resistance syndrome: physiological considerations. Diab. Vasc. Dis. Res. 4, 13-19 KATADA, T., H. KUROSU, T. OKADA, N. TSUJIMOTO, S. TAKASUGA, K. KONTANI, O. HAZEKI u. M. UI (1999): Synergistic activation of a family of phosphoinositice 3-kinase via G-protein coupled and tyrosine kinase-related receptors. Chem. Phys. Lipids 98, 79-86 KAUTER, K., M. BALL, P. KEARNEY, R. TELLAM u. J.R. MACFARLANE (2000): Adrenaline, insulin and glucagon do not have acute effects on plasma leptin levels in sheep: development and characterisation of an ovine leptin ELISA. J. Endocrinol. 166, 127-135 KIM, H., Y. CHI, K. CHUNG, K. KIM, Y. CHOI u. M. BAIK (2000): Differential response of obese gene expression from fasting on bovine adipose tissue. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64, 2240-2242


KIM, Y.K., H. CHOI u. K.H. MYUNG (2005): Effects of propylene glycol on carcass traits and its related gene expression in korean native steers. J. Anim. Sci. 83, 344-349 KIMURA, M., Y. MIZUKAMI, T. MIURA, K. FUJIMOTO, S. KOBAYASHI u. M. MATSUZAKI (2001): Orphan G protein-coupled receptor, GPR41, induces apoptosis via a p53/Bax during ischemic hypoxia and reoxygenation. J. Biol. Chem. 276, 26453-26460 KISFALVI, K., O. REY, S.H. YOUNG, J. SINNETT-SMITH u. E. ROZENGURT (2007): Insulin potentiates Ca2+ signaling and phosphatidylinositol 4,5-biphosphate hydrolysis inducedby Gq protein-coupled receptor agonists through an mTOR-dependent pathway. Endocrinology 148, 3246-3257 KOMATSU, T., F. ITOH, S. KUSHIBIKI u. K. HODATE (2005): Changes in gene expression of glucose transporters in lactating and nonlactating cows. J. Anim. Sci. 83, 557-564 KOTARSKY, K., N.E. NILSSON, E. FLODGREN, C. OWMAN u. B. OLDE (2003): A human cell surface receptor activated by free fatty acids and thiazolidinedione drugs. Trends Endocrinol. Metab. 14, 201-203 KUBISTA, M., J.M. ANDRADE, M. BENGTSSON, A. FOROOTAN, J. JONAK, K. LIND, R. SINDELKA, R. SJÖBACK, B. SJÖGREEN, L. STRÖMBOM, A. STÅHLBERG u. N. ZORIC (2006): The real-time polymerase chain reaction. Mol. Aspects Med. 27, 95-125 KUMAR, B., S.M. FRANCIS, J.M. SUTTIE u. M.P. THOMPSON (1998): Expression of obese mRNA in genetically lean and fat selection lines of sheep. Comp. Biochem. Physiol. Part B 120, 543-548 LARSEN, S., K. RYGAARD, S. ASNAES u. M. SPANG-THOMSEN (1992): Northern andSouthern blot analysis of human RNA and DNA in autopsy material. APMIS 100, 498-502 LEE, C.G., C.R. CONNELL u. W. BLOCH (1993): Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes. Nucl. Acids. Res. 21, 3761-3766 LEE, S. H. u. K.L. HOSSNER (2002): Coordinate regulation of ovine adipose tissue gene expression by propionate. J. Anim. Sci. 80, 2840-2849


LEE, M.J., Y.WANG, M.R. RICCI, S. SULLIVAN, C.D. RUSSELL u.S.K. FRIED (2007): Acute and chronic regulation of leptin synthesis, storage, and secretion by insulin and dexamethasone in human adipose tissue. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 292, E858-864 LEFEBVRE, A.M., M. LAVILLE, N.VEGA, J.P. RIOU, L. VAN GAAL,J. AUWERX u. H. VIDAL (1998): Depot-specific differences in adipose tissue gene expresion in lean and obese subjects. Diabetes 47, 98-103 LE POUL, E., C. LOISON, S. STRUYF, J.Y. SPRINGAEL, V. LANNOY, M.-E. DECOBEQ, S. BREZILON, V. DUPRIEZ, G. VASSART, J.V. DAMME, M. PARMENTIER u. M. DETHEUX (2003): Functional characterization of human receptors for short chain fatty acids and their role in polymorphonuclear cell activation. J. Biol. Chem. 278, 25481-25489 LEURY, B.J., L.H. BAUMGARD, S.S. BLOCK, N. SEGOALE, R.A. EHRHARDT, R.P. RHOADS, D.E. BAUMAN, A.W. BELL u. BOISCLAIR (2003): Effect of insulin and growth hormone on plasma leptin in periparurient dairy cows. Am. J. Physiol Regul. Integr. Comp. Physiol. 285, R1107-R1115 LEWANDOWSKI, K., R. HORN, C.J. O`CALLAGHAN, D. DUNLOP, G.F. MEDLEY, P. O`HARE u. G. BRABANT (1999): Free leptin, bound leptin, and soluble leptin receptor in normal and diabetic pregnancies. J. Clin. Endocrinol. Metab. 84, 300-306 LIEFERS, S.C., R.F. VEERKAMP, M.F.W. TE PAS, Y. CHILLIARD u. T. VAN DER LENDE (2005): Genetics and physiology of leptin in periparturient dairy cows. Domest. Anim. Endocrinol. 29, 227-238 LIN, J., C.R. BARB, R.L. MATTERI, R.R. KRAELING, X. CHEN, R.J. MEINERSMANN u. G.B. RAMPACEK (2000): Long from leptin receptor mRNA expression in the brain, pituitary and other tissues in the pig. Domest. Anim. Endocrinol. 19, 53-61 LIVAK, K., S.J. FLOOD, J. MARMARO, W. GIUSTI u. K. DEETZ (1995): Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Met. And Applic. 4, 357-362 LOEFFLER, G. (1998a): Endokrine Gewebe I: Grundlagen der endokrinen Regulation von Lebensvorgängen. In: LOEFFLER G. u. P.E. PETRIDES (Hrsg.): Biochemie und Pathobiochemie (6. Aufl.) Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, NewYork, 761-787


LOEFFLER, G. (1998b): Stoffwechsel der Kohlenhydrate. In: LOEFFLER G. u. P.E. PETRIDES (Hrsg.): Biochemie und Pathobiochemie (6. Aufl.) Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, NewYork, 378-423 LOLLMANN, B., S. GRUNIGER, A. STRICKER-KRONGRAD u. M. CHIESI (1997): Detection and quantification of the leptin receptor splce variants Ob-Ra, b, and,e in different mose tissues. Biochem. Biophys. Res. Commun. 241, 648-652 LOMAX, M.A., G.D. BAIRD, C.B. MALLINSON u. H.W. SYMONDS (1979): Differences between lactating and non-lactating dairy cows in concentration and secretion rate of insulin. Biochem. J. 180, 281-289 LOUVEAU, S., S. CHAUDHURI, u. D. ETHERTON (1991) : An improved method for isolating RNA from porcine adipose tissue. Anal. Biochem. 196, 308-310 MAČAJOVA, M., D. LAMOŠOVA u. M. ZEMAN (2004): Role of leptin in farm animals: a review. J. Vet. Med. A Physiol. Pathol. Clin. Med. 51, 157-166 MALMSTROM, R., M.R. TASKINEN, S.L. KARONEN u. H. YKI-JARVINEN (1996): Insulin increases plasma leptin concentrations in normal subjects and patients. Diabetologia 39, 993-998 MCKENNA, L.A., A. GEHRSITZ, S. SÖDER, W. EGER, T. KIRCHNER u. T. AIGNER (2000): Effective isolation of high-quality total RNA from human adult articular cartilage. Anal. Biochem. 286, 80-85 MENKE, K.-H. U. W. HUSS (1987): Tierernährung und Futtermittelkunde. 3. neubearb. Aufl., Ulmer, Stuttgart, 68, 69 MIN, B.R., S.P. HART, T. SAHLU u. L.D. SATTER (2005): The effect of diets on milk production and composition, and on lactation curves in pastured dairy goats. J. Dairy Sci. 88, 2604-2615 MINOKOSHI, Y., Y.B. KIM, O.D. PERONI, L.G. FRYER, C. MULLER, D. CARLING u. B.B. KAHN (2002): Leptin stimulates fatty-acid oxidation by activating AMP-activated proteinkinase. Nature 415, 268-269


MIZUNO, T., H. BERGEN, S. KLEOPOULOS, W.A. BAUMAN u. C.V. MOBBS (1996): Effects of nutritional status and aging on leptin gene expression in mice: importance of glucose. Horm. Metab. Res. 28, 679-684 MOXHAM, C.M. u. C.C. MALBON (1996): Insulin action impaired by deficiency of the G-protein subunit Gialpha2. Nature 379, 840-844 MULLIS, K.B., F. FALOONA, S. SCHARF; R. SAIKI, u. H. EHRLICH (1986): Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biology 51, 263-267 NIELSEN, M.O. u. K. JACOBSEN ( 1993): Changes in mammary glucose and protein uptake inrelation to milk synthesis during lactation in high-yielding and low-yielding goats. Comp. Biochem. Physiol. Comp. Physiol. 106, 359-365 NIELSEN, M.O., T.G. MADSEN u. A.M. HEDEBOE (2001): Regulation of mammary glucose uptake in goats. role of mammary gland supply, insulin, IGF-1 and synthetic capacitiy. J. Dairy Res. 68, 337-349 NILSSON, N.E., K. KOTARSKY, C. OWMAN u. B. OLDE (2003): Identification of a free fatty acid receptor, FFA2R, expressed on leukocytes and activated by short-chain fatty acids. Biochem. Biophys. Res. Commun. 303, 1047-1052 OLIVER, M.H., J.E. HARDING, B.H. BREIER, P.C. EVANS, B.W. GALLAGHER u. P.D. GLUCKMAN (1995): The effects ovine placental lactogen infusion on metabolites, insulin – like growth factors and binding proteins in the fetal sheep. J. Endocrinol. 144, 333-338 ØVSTEBØ, R., K.B.F. HAUG, K. LANDE u. P. KIERULF (2003): PCR-based calibration curves for studies of quantitative gene expression in human monocytes: development and evaluation. Clin. Chem. 49, 425-432 PERRINI, S., L. LAVIOLA, A. CARELLI, M. MELCHIORRE, F. DE STFANO, C. CACCIOPPOLI, A. NATALICCHIO, M.R. ORLANDO, G. GARRUTI, M. DE FAZIO, G. CATALANO, V. MEMEO, R. GIORGIO u. F. GIORGIO (2008): Fat depot-related differences in gene expression, adiponectin secretion, and insulin action and signalling in human adipocytes differentiated in vitro from precursor stromal cells. Diabetologia 51, 155-164 PETERS, I.R., C.R. HELPS, E.J. HALL u. M.J. DAY (2004): Real-time PCR: considerations for efficient and sensitive assay design. J. Immunol. Methods 275, 213-222


PIDGEN, A.W. (1992): Statistical aspects of bioequivalence – a review. Xenobiotica 22, 881-893 PLUM, L., B. F. BELGARDT u. J.C. BRÜNING (2006): Central insulin action in energy and glucose homeotasis. J. Clin. Invest. 116, 1761-1766 POITOUT, V. (2003): The ins and outs of fatty acids on the pancreatic ß cell. Trends Endocrinol. Metab. 14, 201-203 POUWELS, M.J., C.J. TACK, P.N. SPAN, A.J.OLTHAAR, C.G. SWEEP, F.C. HUVERS, J.A. LUTTERMAN u. A.R. HERMUS (2004): Role of hexosamines in insulin resistance and nutrient sensing in human adipose and muscle tissue. J. Clin. Endocrinol. Metab. 89, 5132-5137 RABINOWITZ, L., R.L. SARASON, C. TANASOVICH, V.E. MENDEL u. R.P. BROCKMAN (1984): Effects of glucagon, insulin, propionate, acetate, and HCO3 on K excretion in sheep. Am. J. Physiol. 246, R197-204 RADONIĆ, A., S. THULKE, I.M. MACKAY, O. LANDT, W. SIEGERT u. A. NITSCHE (2004): Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem. Biophys. Res. Commun. 313, 856-862 RAMSAY, T.G. u. M.P. RICHARDS (2004): Hormonal regulation of leptin and leptin receptor expression in porcine subcutaneous adipose tissue. J. Anim. Sci. 82, 3486-3492 RAPPOLEE, D.A., D. MARK, M.J. BANDA, u. Z. WERB (1991): Wound macrophages express TGF-α and other growth factors in vivo: analysis by mRNA phenotyping. Science 241, 708-712 REGNAULT, T.R., H.V. ODDY, C. NANCARROW, N. SRISKANDARAJAH u. R.J. SCARAMUZZI (2004): Glucose-stimulated insulin response in pregnant sheep following acute suppression of plasma non-esterified fatty acid concentrations. Reprod. Biol. Endocrinol. 2, 64-74 RIGOUT S., S. LEMOSQUET, A. BACH, J.W. BLUM u. H. RULQUIN (2002) : Duodenal infusion of glucose decreases milk fat production in grass silage-fed cows. J. Dairy Sci. 85, 2541-2550


RICCI, M.R., C.D. RUSSELL, Y. WANG, S. SULLIVAN, S.H. SCHNEIDER, R.E. BROLIN u. S.K. FRIED (2005): Isoproterenol decreases leptin release from rat and human adipose tissue through posttranscriptional mechanisms. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 288, E798-804 RIRIE, K.M., R.P. RASMUSSEN u. C.T. WITTWER (1997): Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Anal. Biochem. 245, 194-204 ROZENGURT, E. (2007): Mitogenic signaling pathways induced by G protein-coupled receptors. J. Cell Physiol. 213, 589-602 RUSTENBECK, I. (2002): Desensitization of insulin secretion. Biochem. Pharmacol. 63, 1921-1935 SALEHI, A., E. FLODGREN, N.E. NILSSON, J. JIMENEZ-FELTSTROM, J. MIYAZAKI, C. OWMAN u. B. OLDE (2005): Free fatty acid receptor 1 (FFA(1)R/GPR40) and its involvement in fatty-acid-stimulated insulin secretion. Cell Tissue Res. 322, 207-215 SALLMANN, H.-P u. H. FUHRMANN (2000): Physiologische Aspekte der Leberfunktion. In: ENGELHARDT, W.v. u. G. BREVES (Hrsg.): Physiologie der Haustiere. Enke-Verlag, Stuttgart, 428-430 SANGER, F., S. NICKLEN u. A.R. COULSON (1977): DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 SANO, H., N. HATTORI, Y. TODOME, J. TSURUOKA, H. TAKAHASHI u. Y. TERASHIMA (1993a): Plasma insulin and glucagon responses to intravenous infusion of propionate and their autonomic control in sheep. J. Anim. Sci. 71, 3414-3422 SANO, H., S. NARAHARA, T. KONDO, A. TAKAHASHI u. Y. TERASHIMA (1993b): Insulin responsiveness to glucose and tissue responsiveness to insulin during lactation in dairy cows. Domest . Anim. Endocrinol. 10, 191-197 SANO, H., S. HAYAKAWA, H. TAKAHASHI u. Y. TERASHIMA (1995): Plasma insulin and glucagon responses to propionate infusion into femoral and mesenteric veins in sheep. J. Anim. Sci. 73, 191-197


SARTIN, J.L., K.A. CUMMINS, R.J. KEMPPAINEN, D.N. MARPLE, C.H. RAHE u. J.C. WILLIAMS (1985): Glucagon, insulin and growth hormone responses to glucose infusion in latating dairy cows. Am. J. Physiol. 248, E108-E114 SAUERWEIN, H., U. HEINTGES, M. HENNIES, T. SELHORST, u. A. DAXENBERGER (2004): Growth hormone induced alterations of leptin serum concentrations in dairy cows as measured by a novel enzyme immunoassay. Livestock Production Science 87, 189-195 SAUERWEIN, H., U. HEINTGES, S.C: BRUHNS, M. HENNIES u. A. GERTLER (2006): Active immunization against leptin fails to affect reproduction and exerts only marginal effects on glucose metabolism in young female goats. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. (Berl). 90, 278-288 SAWZDARGO, M., S.R. GEORGE, T. NGUYEN, S. XU, L.F. KOLAKOWSKI u. B.F. O`DOWD (1997): A cluster of four novel human G protein-coupled receptor genes occurring in close proximity to CD22 gene on chromosome 19q13. Biochem. Biophys. Res. Commun. 239, 543-547 SCHMITTGEN, T.D., B.A. ZAKRAJSEK, A.G. MILLS, V. GORN, M.J. SINGER, M.W: REED (2000): Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction to study mRNA decay: comparison of endpoint and real-time methods. Anal. Biochem. 285, 194-204 SCHOOR, O., T. WEINSCHENK, J. HENNENLOTTER, S. CORVIN, A. STENZL, H.-G. RAMMENSEE u. S. STEFANOVIĆ (2003): Moderate degradation does not preclude microarray analysis of small amounts of RNA. Biotechniques 35, 1192-1201 SHIMABUKURO, M., K. KOYAMA, G. CHEN, M.Y. WANG, F. TRIEU, Y. LEE, C.B. NEWGARD u. R.H. UNGER (1997): Direct antidiabetic effect of leptin through triglyceride depletion of tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 4242-4245 SHIMUZU, S., Y. TANI, H. YAMADA, M. TABATA u. T. MURACHI (1980): Enzymatic determination of serum – free fatty acids: a colorimetric method. Anal. Biochem. 107, 193-198 SOLIMAN, M., K. ISHIOKA, C. OWMAN u. B. OLDE (2002): Plasma leptin responses to lipopolysaccharide and tumor necrosis factor-α in cows. Jpn. J. Vet. Res. 50, 107-114


SOLIMAN, M., K. KIMURA, M. AHMED, D. YAMAJI, Y. MATSUSHITA, Y. OKAMATSU-OGURA, K. MAKONDO u. M. SAITO (2007). Inverse regulation of leptin mRNA expression byshort- and long-chain fatty acids in the cultured bovine adipocytes. Domest. Anim. Endocrinol. 33, 400-409 SORENSEN, A., C.L. ADAM, P.A. FINDLAY, M. MARIE, L. THOMAS, M.T. TRAVERS u. R. VERNON (2002): Leptin secretion and hypothalamic neuropeptide and receptor gene expression in sheep. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, R1227-1235 STÅHLBERG, A., J. HÅKANSSON, X. XIAN, H. SEMB u. M. KUBISTA (2004): Properties of the reverse transcription reaction in mRNA quantification. Clin. Chem. 50, 509-515 SWEENEY, G., J. KEEN, R. SOMWAR, D. KONRAD, R.GARG u. A. KLIP (2001): High leptin levels acutely inhibit insulin-stimulated glucose uptake without affecting glucose transporter 4 transocation in 16 rat skeletal muscle. Endocrinology. 142, 4806-4812 TARTAGLIA, L.A. (1997): The leptin receptor. J. Biol. Chem. 272, 6093-6096 THELLIN, O., W. ZORZI, B. LAKAYE, B. DE BORMAN, B. COUMANS, G. HENNEN, T. GRISAR, A. IGOUT u. E. HEINEN (1999) : Housekeeping genes as internal standards : use and limits. J. Biotechnol. 75, 291-295 TRICARICO, C., P.PINZANI, S: BIANCHI, M. PAGLIERANI, V. DISTANTE, M. PAZZAGLI, S.A. BUSTIN u. C. ORLANDO (2002): Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction: normalization to rRNA or single housekeeping genes is inappropriate for human tissue biopsies. Anal. Biochem. 309, 293-300 UNGEMACH, F.R. (1999): Wasser- und Elektrolythaushalt – Infusionstherapie. In: LÖSCHER, W., F.R. UNGEMACH u. R. KROKER: Pharmakotherapie bei Haus- und Nutztieren. Parey Buchverlag, Berlin, 159-161 UTRIAINEN, T., R. MALMSTRÖM, S. MÄKIMATTILA u. H. YKI-JÄRVINEN (1996): Supraphysiological hyperinsulinemia increases plasma leptin concentrations after 4 h in normal subjects. Diabetes 45, 1364-1366 VERNON, G. u. M. POND (1997): Adaptations of maternal adipose tissue to lactation. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 2, 231-241


WANG, J., R. LIU, M. Hawkins, N. Barzilai u. L. Rossetti (1998): A nutrient-sensing pathway regulates leptin gene expression in muscle and fat. Nature 393, 684-688 WANG, J., R. LIU, L. LIU, R. CHOWDHURY, N. BARZILAI, J. TAN u.L.ROSSETTI (1999a): The effect of leptin on Lep expression is tissue-specific and nutritionally regulated. Nat. Med. 8, 895-899 WANG, J.L., N. CHINOOKOSWONG, S. SCULLY,M. QI u. Z.Q. SHI (1999b): Differential effects of leptin in regulation of tissue glucose utilization in vivo. Endocrinology. 140, 2117-2124 WILKINSON, M. (2000): Purification of RNA. in: T.A. BROWN (Hrsg.). Essential Molecular Biology - A Practical Approach Vol. 1, 2. Aufl. Oxford University Press, Oxford XIONG, Y., N. MIYAMOTO, K. SHIBATA, M.A. VALASEK, T. MOTOIKE, R.M. KEDZIERSKI u. M. YANAGISAWA (2004): Short-chain fatty acids stimulate leptin production in adipocytes through the G protein-coupled receptor GPR41. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 1045-1050 YANG, G., H. GE, A. BOUCHER, X. YU u. C. LI (2004): Modulation of direct leptin signaling by soluble leptin receptor. Mol. Endocrinol. 18, 1354-1362 YANNAKOULIA, M., N. YIANNAKOURIS, S. BLÜHER, A.-L. MATALAS, D. KLIMIS-ZACAS u. C.S. MANTZOROS (2003): Body fat mass and macronutrient intake in relation to circulating soluble leptin receptor, free leptin index, adiponectin, and resistin concentrations in healthy humans. J. Clin. Endocrinol.Metab. 88, 1730-1736 YONEKURA, S., T. SENOO, Y. KOBAYASHI, T. YONEZAWA, K. KATOH u. Y. OBARA (2003): Effects of acetate and butyrate on the expression of leptin and short-form leptin receptor in bovine and rat anterior pituitary cells Gen. Comp. Endocrinol. 133, 165-172 YU, S., A. CASTLE, M. CHEN, R. LEE, K. TAKEDA u. L.S. WEINSTEIN (2001): Increased insulin sensitivity in Gsalpha knockout mice. J. Biol. Chem. 276, 19994-19998


YUEN, B.S., P.C. OWENS, J.R. MCFARLANE, M.E. SYMONDS, L.J. EDWARDS, K.G. KAUTER u. I.C. MCMILLEN (2002): Circulating leptin concentrations are positively related to leptin messenger RNA expression in the adipose tissue of fetal sheep in the pregnant ewe fed at or below maintenance energy requirements during late gestation. Biol. Reprod. 67, 911-916 ZABEAU, L., D. LAVENS, F. PEELMAN, S. E, J. VANDEKERCKHOVE u. J. TAVERNIER (2003). The ins and outs of leptin receptor activation. FEBS Lett. 546, 45-50 ZHANG, Y., R. PRCENCA, M. MAFFEI, M. BARONE, L. LEOPOLD u. J.M. FRIEDMAN (1994): Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature 372, 425-432 ZHANG, P., E.S. KLENK, M.A. LAZZARO, L.B. WILLIAMS u. R.V. CONSIDINE (2002): Hexosamines regulate leptin production in 3T3-L1 adipocytes through transcriptional mechanisms. Endocrinology 143, 99-106 ZHAO, F.Q., P.J. MILLER, E.H. WAL, Y.C. ZHENG, B. DONG, M.C. NEVILLE u. T.B. MCFADDEN (2004): Bovine glucose transporter GLUT8: cloning, expression, and developmental regulation in mammary gland. Biochim. Biophys. Acta 1680, 103-113 ZHAO, F.Q., Y.C. ZHENG, E.H. WALL u. T.B. MCFADDEN (2005): Cloning and expression of bovine sodium/glucose cotransporters. J. Dairy Sci. 88, 182-94 ZHAO, F.Q. u. A.F. KEATING (2007): Expression and regulation of glucose transporters in the bovine mammary gland. J. Dairy Sci. 90, E76-E86 ZIEBA, D.A., M. AMSTALDEN u. G.L. WILLIAMS (2005): Regulatory roles of leptin inreproduction and metabolism: A comparative review. Domest. Anim. Endocrinol. 29, 166-185


8 Tabellenverzeichnis

Tab. 1 Sequenzen der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Primer und Sonden für die real-time RT-PCR Assays und die RT-PCR-Primer zur Herstellung der Verdünnungsreihen für die Ob-Rb- und GPR41-RNA 27

Tab. 2 Effizienz und Wiederholbarkeit der real-time RT-PCR 48 Tab. 3 Vergleich der Blut- und Infusionsparametern im hyper-

glykämischen Clamp 55 Tab. 4 Vergleich der Blut- und Infusionsparameter im euglykämisch/

hyperinsulinämischen Clamp 56 Tab. 5 Vergleichende Übersicht der Mittelwerte und Quotienten

aus der relativen RNA-Quantifizierung in den verschiedenen Geweben 125

Tab. 6 Freie Fettsäuren im Blutserum. Ergebnisse der Messungen in

jeweils den ersten und letzten drei Blutproben eines Versuchsteiles 125


9 Abbildungsverzeichnis

Abb. 1 Schematische Darstelung der GPR41-Funktion 13 Abb. 2 Beispielhafte Darstellung einer Standardkurve 30 Abb. 3 Beispielhafte Darstellung von Schmelzkurven 33 Abb. 4 Beispiel einer denaturierenden Gelelektrophorese 43 Abb. 5 Darstellung der PCR-Fragmente zur Sequenzierung 45 Abb. 6 Darstellung der Real-time PCR-Fragmente 45 Abb. 7 Sequenzvergleich des Leptinrezeptors 46 Abb. 8 Sequenzvergleich des G-proteingekoppelten Rezeptors 41 47 Abb. 9 Vergleich der mRNA-Expression 50 Abb. 10 Verlauf der Serumkonzentrationen nach Propionatinfusion 53 Abb. 11 Serumwerte im hyperglykämischen Clamp 57 Abb. 12 Serumwerte im euglykämisch-hyperinsulinämischen Clamo 58 Abb. 13 Verlauf der Serumleptinwerte 59 Abb. 14 Verlauf der freien Fettsäuren 60 Abb. 15 Verlauf der Milchmenge im Versuchszeitraum 61

Anhang 115

10 Anhang

Reinstwasser

Wasser wurde über einen Ionenaustauscher, UV-Bestrahlung (185 nm) und

Ultrafiltration (0,2 µm) bis zu einem elektrischen Widerstand von 18,2 MΩ hoch

gereinigt, und vor Gebrauch autoklaviert (Elga Labwater, PureLab PlusTM UV/UF,

Celle).

Enzymimmuntest

Beschichtungspuffer

0,05 M NaHCO3 Roth, Karlsruhe

200 µl/l Proteaseninhibitor (Complete ) Roche, Mannheim

20 ml/l ProClin 150 (1 %) Supelco, Bellefonte, PA, USA

pH 9,6

Caseinlösung

0,05 M NaOH Roth, Karlsruhe

2,5 % Casein Sigma-Aldrich,Taufkirchen

1,5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) AppliChem, Darmstadt

200 µl/l Proteinaseinhibitor (Complete ) Roche, Mannheim

20 ml/l ProClin 150(1 %) Supelco, Bellefonte, PA, USA

pH 7,2

Testpuffer

0,12 M NaCl Roth, Karlsruhe

0,02 M Na2HPO4 Merck, Darmstadt

0,01 M EDTA AppliChem, Darmstadt

0,005 % Chlorhexidin Sigma-Aldrich, Taufkirchen

0,01 M Gelatine(Gelatin Hydrolysat) Sigma-Aldrich,Taufkirchen

0,05 % Tween 20 AppliChem, Darmstadt

0,002 % Phenolrot Sigma-Aldrich,Taufkirchen

200 µl/l Proteaseninhibitor (Complete ) Roche, Mannheim


pH 7,2

Anhang 116

Waschpuffer (PBS)

0,136 M NaCl Roth, Karlsruhe

8,1 mM Na2HPO4 AppliChem, Darmstadt

2,7 mM KCl Roth, Karlsruhe

1,5 mM KH2PO4 Merck, Darmstadt

5,5 g/l Tween 20 AppliChem, Darmstadt

2,0 ml/l ProClin 150(1 %) Supelco, Bellefonte, PA, USA

pH 6,9

Substratpuffer

0,05 M Zitronensäure Roth, Karlsruhe

0,055 M Na2HPO4 Merck, Darmstadt

0,05 % Harnstoffperoxid Sigma-Aldrich,Taufkirchen


pH 4,05

TMB-Stammlösung

12,5 mg TMB (3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin) AppliChem, Darmstadt

1 ml DMSO (Dimethylsulfoxid) Merck, Darmstadt

Substratlösung

17 ml Substratlösung sh. Substratpuffer

340 µl TMB – Lösung AppliChem, Darmstadt

Stoppreagenz

1 M Oxalsäure Roth, Karlsruhe

RNA-Extraktion

DEPC-Wasser

1,0 ml DEPC AppliChem, Darmstadt

999 ml Reinstwasser

autoklavieren

Anhang 117

0,75 M Na-Citrat-Lösung pH 7,0 AppliChem, Darmstadt

mit Reinstwasser auf 100ml auffüllen

autoklavieren

Denaturierungslösung („GTC-Lösung“)

4 M GTC (Guanidinthiocyanat) Roth, Karlsruhe

0,25 M Na-Citrat, pH 7,0

0,1 M 2-Mercaptoethanol Roth, Karlsruhe

0,5 % N-Lauroylsarcosin Sigma-Aldrich,Taufkirchen

2 M Natriumacetatstammlösung pH 4,0

2 M Na-Acetat (wasserfrei) AppliChem, Darmstadt

Einstellung von pH 4,0 mit Eisessig

mit Reinstwasser auf 100 ml auffüllen

autoklavieren

1-Brom-3-Chlorpropan AppliChem, Darmstadt

Isoamylalkohol (1:49) AppliChem, Darmstadt

Phenol, wassergesättigt, nicht stabilisiert Roth, Karlsruhe

Isopropanol (100%) Roth, Karlsruhe

Ethanol (70%) KMF Laborchemie Handels

GmbH, Lohmar

Anhang 118

Fließschema zur Lipidextraktion aus Fettgewebe in der RNA-Extraktion

(Durchführung der Arbeitsschritte auf Eis)

1. Einwaage und mechanische Homogenisierung des Gewebes mit Mörser und Pistill

in flüssigem Stickstoff

2. Zugabe von 5 ml GTC-Lösung

3. Zugabe von 5 ml Chloroform

4. Zentrifugation (20 min, 4°C, 5500g)

5. Isolierung der oberen wässerigen GTC-Phase mit der Pipette (Zellbestandteile)

Wiederholung der Schritte 2. bis 5.

Lagerung bei -80°C

Extraktion der Gesamt-RNA

Anhang 119

Fließschema zur Extraktion der Gesamt-RNA der Muskel-, Leber- oder

vorbehandelten Fettgewebsproben (Durchführung der Arbeitsschritte auf Eis)

Einwaage des Leber- und Lipidentfernung aus Fettgewebe /

Muskelgewebes mit zehnfachem Lagerung der Gewebsextrakte

Volumen GTC-Lösung bei -80°C

Mechanische Homogenisation

Zugabe von (je ml GTC-Lösung): 1 ml saures Phenol (wassergesättigt)

0,8 ml 1-Brom-3-Chlorpropan (1:49 Isoamylalkohol)

0,2 ml Na-Azetat (2M pH 4)

Zentrifugation (30 min, 4°C, 5000 g)

Isolierung der oberen wässerigen GTC-Phase mit der Pipette

Zugabe von 100% Isopropanol (1ml/ml GTC-Lösung)

Inkubation (5 min, -80°C)

Zentrifugation (30 min, 4°C, 5000 g); Überstand dekantieren

Zugabe von 100% Isopropanol (0,1ml/ml GTC-Lösung)

Inkubation (5 min, -80°C)

Zentrifugation (20 min, 4°C, 10000 g); Überstand dekantieren

Anhang 120

2malige Waschung des Pellets mit 70% Ethanol (Zentrifugation 15min, RT, 10000g)

Trocknung des Pellets

Lösen in DEPC-H2O

DNase-Verdau der Muskel-Gesamt-RNA (50 µµµµl-Ansatz)

5 µl DNase I Puffer 10X MBI Fermentas, St. Leon-Rot

0,5 µl DTT 0,1 M MBI Fermentas, St. Leon-Rot

10 U Ribonuclease Inhibitor MBI Fermentas, St. Leon-Rot

100 U DNase I MBI Fermentas, St. Leon-Rot

RNA-Stocklösung (entsprechend 50 µg RNA), DEPC-H2O ad 50 µl

Inkubation 30 min, 37°C

Inaktivierung 5 min, 75°C

Denaturierende (RNA)-Gelelektrophorese

10X Laufpuffer (MOPS-Puffer, pH 8,0)

0,2 M MOPS (3-N-Morphlino-Propansulfonsäure)

AppliChem, Darmstadt

50 mM Na-Acetat AppliChem, Darmstadt

1 mM EDTA AppliChem, Darmstadt

NaOH Roth, Karlsruhe

5X Ladepuffer

226 µl Bromphenolblau (gesättigt) Sigma-Aldrich,Taufkirchen

20 µl 500 mM EDTA pH 8,0 AppliChem, Darmstadt

12 µl Ethidiumbromid (10 mg/ml) Eurobio, Les Ulis Cedex B,

Frankreich

500 µl Glycerin 100% Sigma-Aldrich,Taufkirchen

180 µl Formaldehyd 37% (pH >4, deionisiert) Roth, Karlsruhe

771µl Formamid (deionisiert) AppliChem, Darmstadt

1000 µl 10X MOPS-Puffer

Anhang 121

1,2% Formaldehydgel

1,4 g Agarose Invitrogen, Karlsruhe

11,7 ml 10X MOPS-Puffer

101,5 ml DEPC-Wasser

3,5 ml Formaldehyd (37%, pH>4, deionisiert) Roth, Karlsruhe

Native (DNA-)Gelelektrophorese

5X Ladepuffer

50 mg Orange G Chroma-Gesellschaft, Münster

2 ml Glycerin Roth, Karlsruhe

400 µl EDTA (0,5 M, pH 8,0) AppliChem, Darmstadt

auffüllen auf 10 ml mit Reinstwasser

Laufpuffer 10x TBE-Puffer

0,89 M Tris-Base (Tris-Hydroxymethylaminomethan)

AppliChem, Darmstadt

0,89 M Borsäure AppliChem, Darmstadt

0,02M EDTA (pH 8,0) AppliChem, Darmstadt

ad 1000 ml Reinstwasser

Gel

Es wurde ein 2%iges Agarose-Gel mit 30 µl Ethidiumbromid (1g/ml) (Eurobio, Les

Ulis Cedex, Frankreich) je 100 ml verwendet.

Marker

50 ng/µl ΦX174 DNA/BsuRI (HaeIII)Marker, 9 MBI Fermentas, St. Leon-Rot

Reverse Transkription

RT-Ansatz

RNA-Menge Äquivalent 1,8 µg

1 µl random hexamer (50 pmol) Invitrogen, Karlsruhe

4 µl 5X Puffer Invitrogen, Karlsruhe

Anhang 122

2 µl DTT (100 mM) MBI Fermentas, St. Leon-Rot

1 µl dNTP (je 500 µM) MBI Fermentas, St. Leon-Rot

0,5 µl RNAse Inhibitor (20 U) MBI Fermentas, St. Leon-Rot

0,5 µl Superscript IITM (100U) Invitrogen, Karlsruhe

ad 20 µl Reinstwasser

Cyclerprotokoll : 65°C 5 min Vorinkubation

(RNA und Primer)

27°C 10 min

42°C 60 min

99°C 60 s

PCR für Standardverdünnungsreihen

PCR-Ansatz

1,5 µl cDNA

17,25 µl Reinstwasser

2,5 µl 10X Puffer ((NH4)2 SO4) MBI Fermentas, St. Leon-Rot

2 µl MgCl2, 2,0 mM MBI Fermentas, St. Leon-Rot

0,25 µl dNTP's, je 100 µM MBI Fermentas, St. Leon-Rot

1 µl Primer FOR/REV je 20 pmol 1 / 1 Invitrogen, Karlsruhe

1 µl Taq-Polymerase 1,0 U MBI Fermentas, St. Leon-Rot

Leptin

Cyclerprotokoll: 95°C 1 min

(simplified hot start 72°C) 40 Zyklen

94°C 40 s

58°C 30 s

72°C 20 s

72°C 5 min

18S rRNA



Anhang 123

94°C 40 s

52°C 40 s

72°C 30 s

72°C 5 min

Leptinrezeptor



94°C 40 s

53°C 40 s

72°C 30 s

72°C 5 min

G-Protein gekoppelter Rezeptor 41



94°C 40 s

55°C 30 s

72°C 20 s

72°C 5 min

Real-time PCR

PCR-Ansatz

Leptin: 4,0 µl cDNA (1:4)


18S rRNA: 2,0 µl cDNA (1:40)


10,0 µl SybrGreen JumpStartTM Sigma, Saint Louis,

Taq ReadyMixTM Missouri, USA

0,2 µl Referenzfarbstoff (ROX) Sigma, Saint Louis,

Missouri, USA

2,0 µl Primer FOR/REV: Invitrogen, Karlsruhe

je 2 pmol (1 / 1)

Anhang 124

Leptinrezeptor und G-Protein gekoppelter Rezeptor 41:

4,0 µl cDNA (1:4)


10,0 µl TaqManUniversal PCR Applied Biosystems,

Master Mix Foster CITY; CA, USA

1,0 µl Custom TaqMan Applied Biosystems,

Gene Expression Assay Foster CITY; CA, USA

Primer FOR/REV: je 18 pmol (1 / 1)

Sonde 5 pmol

Leptin:

Cyclerprotokoll: 50°C 1 s

95°C 10 min

40 Zyklen

95°C 15 s

60°C 40 s

Leptinrezeptor und G-proteingekoppelter Rezeptor 41:


95°C 10 min

40 Zyklen

95°C 15 s

60°C 60 s

18S rRNA:


95°C 10 min

28 Zyklen

95°C 15 s

60°C 60 s

Anhang 125

Tab. 5: Vergleichende Übersicht der Mittelwerte und Quotienten aus der relativen RNA-Quantifizierung in den verschiedenen Geweben (Mittelwerte ± SEM).

mRNA Gewebe

Mittelwert

Propionat-

gruppe

(MW ± SEM)

Mittelwert

Kontrollgruppe

(MW ± SEM)

MW

Propionat

/ MW

Kontrolle;

Faktor

(1/x)

p-

Wert

perirenales

Fett (5,50 ± 1,78) · 10-3 (1,71 ± 1,05) · 10-3 3,2 0,081

Leptin subkutanes

Fett (7,56 ± 2,07) · 10-3 (3,99 ± 0,47) · 10-3 1,9 0,106

perirenales

Fett (6,71 ± 2,09) · 10-6 (2,82 ± 0,76) · 10-5 4,2 0,042

subkutanes

Fett (5,94 ± 1,36) · 10-5 (2,65 ± 1,71) · 10-4 4,5 0,286

Leber (3,58 ± 1,71) · 10-4 (9,29 ± 2,55) · 10-4 0,38 (2,6) 0,127

Leptin-

rezeptor

(obRb)

Muskel (2,01 ± 1,08) · 10-5 (3,48 ± 1,01) · 10-5 0,57 (1,7) 0,338

perirenales

Fett (2,01 ± 0,83) · 10-5 (2,35 ± 0,84) · 10-5 0,85 (1,2) 0,756

GPR41 subkutanes

Fett (1,02 ± 0,39) · 10-4 (8,51 ± 1,59) · 10-6 12 0,029

Tab. 6: Freie Fettsäuren im Blutserum. Ergebnisse der Messungen in jeweils den ersten und letzten drei Blutproben eines Versuchsteiles (Miitelwert mit SEM; n=6)


Hypergly-

kämischer

Clamp

Euglykämisch/

hyperinsulin-

ämischer Clamp

Hypergly-

kämischer

Clamp

Euglykämisch/

hyperinsulin-

ämischer Clamp

Versuchs-

beginn 0,52 ± 0,05 mM 0,52 ± 0,04 mM 0,57 ± 0,08 mM 0,98 ± 0,12 mM

Versuchs-

ende 0,21 ± 0,02 mM 0,25 ± 0,00 mM 0,23 ± 0,04 mM 0,31 ± 0,05 mM

Danksagung

Frau Prof. Dr. Dr. Helga Sauerwein danke ich ganz herzlich für die Überlassung des

Themas zur Anfertigung meiner Dissertation. Insbesondere bedanke ich mich für

ihren Rat und die Unterstützung, mit denen sie jederzeit zur Seite stand, sowie für

ihre Motivation, Geduld und Vertrauen in allen Phasen dieser Arbeit.

Herrn Prof. Dr. Gerhard Breves danke ich für die Übernahme des Referates.

Der H. Wilhelm Schaumann Stiftung danke ich für die finanzielle Unterstützung.

Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Manfred Mielenz für seine große Unterstützung

in allen inhaltlichen und methodischen Fragen. Mit unerschöpflicher Begeisterung

gab er mir in vielen fruchtbaren Diskussionen Anregungen und Ideen für meine

Studien.

Ich danke allen Mitarbeitern des Instituts für ihre enorme Mithilfe in Rat und Tat,

Hannelore Brüssel, Iris Gockel-Böhner, Barbara Heitkönig, Inga Hofs, Isabella Israel,

Birgit Mielenz, Ulrike Patzwaldt und Karin Strack, sowie den ehemaligen

Auszubildenden Pascal Paschenda, Daniela Wanzek, Ursula Daniels, Tanja Wiegel

und Jens Wohlmann für ihre Einsatzfreude auch bei Frost und Kälte.

Meinen Doktorandenkommilitoninnen Barbara, Claudia, Maria, Sabrina, Simone und

Ute danke ich für Zuspruch und offene Ohren bei freudvollen Zusammenkünften und

hilfreichen Diskussionen.

Außerdem möchte ich mich bei Herrn Jark, Frau Hieronymus und Herrn Hauser für

die moralische Unterstützung bedanken.

Meiner Familie und Freunden möchte ich danken, da jeder in seiner Art zum

Gelingen der Arbeit beigetragen hat, und vor allem Sybille, für ihre Liebe, Kraft und

Vertrauen.

Untersuchungen zur energetischen Regulation des ... · Angiotensinogen, Transforming Growth...

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