Extrahierbarkeit toxikologisch relevanter Verbindungen in

der Systematischen Toxischen Analyse

Teil 1:

Bestimmung der Extraktionsausbeute toxikologisch relevanter Arzneimittel

mit dem Lösungsmittel n-Chlorbutan bei pH 9

Teil 2:

Die Systematische Toxische Analyse in der DDR

Auswertung von unveröffentlichten Forschungsergebnissen aus den achtziger

Jahren: Verteilungsquotienten und pH –Abhängigkeit toxikologisch

relevanter Verbindungen

Abschlussarbeit für das

Postgradualstudium Toxikologie und Umweltschutz

an der Universität Leipzig

Von Claudia Michael

Leipzig, den 14.04.2003

2

Die Abschlussarbeit wurde im Zeitraum vom Februar 2003 bis April 2004 am Institut für

Rechtsmedizin der Universität Leipzig in Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis

„Extraktion“ der GTFCh angefertigt. Ich erkläre hiermit, die vorliegende Arbeit selbständig

und nur unter Verwendung der angegebenen Literatur und Hilfsmittel angefertigt zu haben.

Es bestehen keine Einwände gegen den Verleih oder der Weitergabe der Arbeit.

Claudia Michael

Danksagung

Ich möchte mich bei Herrn Prof. R.K. Müller, Frau DI A.Gräfe und Herrn Dr. U. Demme

für die Bereitstellung des Themas und für die Unterstützung bedanken.

Außerdem gilt mein Dank allen Mitarbeitern der toxikologischen Abteilung, die es mir

ermöglichten, die experimentellen Versuche im Labor durchzuführen.

Ein besonders großes Dankeschön geht natürlich an Markus und an meine Familie, weil ihr

mich die ganze Zeit unterstützt habt. Außerdem danke ich Markus für die hilfreiche

Korrektur meiner Arbeit.

3

4

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis .................................................................................................................. 5

Zusammenfassung ................................................................................................................. 7

1 Einleitung .................................................................................................................. 9

2 Bestimmung der Extraktionsausbeute toxikologisch relevanter Verbindungen mit dem Lösungsmittel n-Chlorbutan bei pH 9

2.1 Grundlagen der Flüssig-Flüssig-Extraktion .............................................................. 15

2.2 Ergebnisse................................................................................................................... 20

2.2.1 Ergebnisse aus Puffer................................................................................................. 20

2.2.2 Ergebnisse aus Serum................................................................................................. 23

2.3 Diskussion................................................................................................................... 24

2.3.1 Extraktion aus Puffer.................................................................................................. 24

2.3.2 Extraktion aus Serum.................................................................................................. 28

2.3.3 Bedeutung für die STA............................................................................................... 28

2.4 Schlussfolgerung......................................................................................................... 30

2.5 Experimentelles……………………………………………………………………… 31

2.5.1 Geräte und Chemikalien…………………………………………………………….. 31

2.5.2 Durchführung………………………………………………………………………… 32

3 Auswertung von unveröffentlichten Forschungsergebnissen aus den achtziger Jahren: Verteilungsquotienten und pH-Abhängigkeit toxikologisch relevanter Verbindungen

3.1 Einleitung.................................................................................................................... 35

3.2 Grundlagen der Verteilung......................................................................................... 35

3.3 Ergebnisse................................................................................................................... 39

3.4 Auswertung................................................................................................................. 45

3.4.1 Saure Verbindungen................................................................................................... 47

3.4.2 Neutrale Verbindungen............................................................................................... 48

3.4.3 Amphotere Verbindungen.......................................................................................... 49

3.4.4 Basische Verbindungen.............................................................................................. 50

3.5 Diskussion................................................................................................................... 51

3.6 Zusammenfassung....................................................................................................... 54

3.7 Experimenteller Teil................................................................................................... 55

4 Literatur....................................................................................................................... 57

5 Anhang........................................................................................................................ 67

5.1 Abkürzungsverzeichnis............................................................................................... 67

5.2 Saure Verbindungen.................................................................................................... 69

5.3 Neutrale Verbindungen............................................................................................... 79

5.4 Amphotere Verbindungen........................................................................................... 82

5.5 Basische Verbindungen.............................................................................................. 84

5

6

Zusammenfassung Die Flüssig-Flüssig-Extraktion ist eine einfache, kostengünstige und weit verbreitete

Probenvorbereitung zur Isolation körperfremder Stoffe aus biologischem Material. In der

vorliegenden Arbeit wurden 33 Arzneimittel aus einer basischen wässrigen Pufferlösung

(pH 9) mit n-Chlorbutan extrahiert und die Ausbeuten in der organischen Phase mit Hilfe

der UV-Spektrophotometrie und der HPLC ermittelt. Zur Überprüfung der verwendeten

Extraktionsmethode auf ihre Anwendbarkeit auf biologisches Material wurde die

Extraktion bei drei Arzneimitteln parallel auch mit Serum durchgeführt. Die ermittelten

Extraktionsausbeuten konnten mit den Ergebnissen aus Ringversuchen bestätigt werden.

Mit den aus den Ringversuchen vorliegenden Extraktionsergebnissen von über 300

Arzneistoffen kann die Extraktionsmethode gezielt und effektiv für diese Stoffe in der

Systematischen Toxischen Analyse angewendet werden. Zusätzlich ist der Einsatz einer

ergänzenden Extraktionsmethode von Vorteil, um die Anzahl der bestimmbaren Wirkstoffe

zu erhöhen. Mit dieser Arbeit wurde eine Grundlage geschaffen, zukünftig die Probleme

bei den sogenannten „General Unknown“-Fällen zu verringern, die durch die Vielzahl der

in Frage kommenden Stoffe zustande kommen.

Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die experimentellen Daten über

Verteilungsquotienten und pH-Abhängigkeit von über 90 Verbindungen (vorwiegend

Arzneimittelwirkstoffe) ausgewertet. Die Daten wurden Ende der 80er Jahre in der

Rechtsmedizin Leipzig experimentell ermittelt, aber nie ausgewertet. Für die Lösungsmittel

Chloroform und Diethylether, und teilweise auch für Ethylacetat, liegen jetzt die

Extraktionsausbeuten (pH 1 bis 13) von über 300 organischen Verbindungen vor (siehe

auch Müller et al. 1982 / 1983). Für jede dieser Verbindung kann nun im Rahmen eines

Extraktionsverfahren festgestellt werden, ob sie bei einem bestimmten pH-Wert

befriedigend isoliert werden kann oder nicht. Obwohl sich die STA in den letzten 20 Jahren

enorm weiterentwickelt hat, können die Ergebnisse über die Verteilungsquotienten dieser

Verbindungen und deren pH-Abhängigkeit auch heute noch für bestimmte Fragestellungen

hilfreich sein. Mit der genauen Kenntnis der maximalen Extrahierbarkeit und dem

entsprechenden pH-Bereich ist es möglich, das Extraktionsverfahren aus wässriger Phase

zu optimieren. Z.B. können die Ergebnisse für spezielle toxikologische Untersuchungen

eines Stoffes hilfreich sein. Außerdem können aus den Ergebnissen Rückschlüsse auf die

Eignung anderer Lösungsmittel abgeleitet werden.

7

8

1 Einleitung Das Ziel der Systematischen Toxischen Analyse (STA) ist die Aufklärung von unklaren

Krankheitsbildern und Todesfällen, bei denen eine Vergiftung als Ursache in Betracht

gezogen wird. Ohne konkrete Hinweise auf die Art der Vergiftung ergibt sich das Problem,

dass eine Vielzahl von toxischen Stoffen in Frage kommen kann. Aus diesem Grund bedarf

es einer logisch – schematischen Vorgehensweise und besonderen analytischen Strategien

zur Erkennung der vorliegenden Vergiftung (Müller et al. 1991). Diese sprichwörtliche

Suche nach der „Nadel im Heuhaufen“ wird auch als General Unknown Analysis

bezeichnet (Müller 1990, Madea und Brinkmann 2003).

Die Systematische Toxische Analyse ist eine nicht zielgerichtete Untersuchung auf die in

Frage kommenden, potentiell schädlichen Substanzen. Die Aufgabe der chemisch

toxikologischen Analyse beinhaltet nicht nur die schnelle und sichere Erkennung der

Identität der Stoffe, die für die Vergiftung verantwortlich sind, sondern nach Möglichkeit

auch noch eine wenigstens semiquantitative Abschätzung der aufgenommenen Mengen.

Auch wenn konkrete Hinweise bzw. Verdachtsmomente (durch Anamnese, aufgefundene

Medikamente, Zeugenaussagen) vorhanden sind, wird neben der gezielten chemischen

Bestimmung auch eine Durchführung der STA empfohlen (Maurer 1993). Nach einer

Untersuchung von Köppel und Tenczer (1995) konnte nämlich festgestellt werden, dass in

40 Prozent der Fälle sich die Angaben von Seiten des Patienten selbst oder von

Angehörigen als falsch oder zumindest als unvollständig erwiesen hatten.

Welche Stoffe als toxikologisch relevant eingestuft werden und bei einem Verdachtsfall in

der STA überprüft werden sollten, ist nach Müller und Thieme (1995) eine Frage der

Abwägung der Verbreitungs- und Verfügbarkeitswahrscheinlichkeiten für die

Allgemeinbevölkerung. Auf dem Markt sind eine Vielzahl von potentiell schädlichen

Stoffen kommerziell erhältlich, die einen Umfang von mehreren Millionen ausmachen.

Eine STA stellt daher immer einen Kompromiss zwischen der unüberschaubaren Anzahl

der toxisch relevanten Stoffe und dem zeitlichen und ökonomischen Aufwand dar. Aus

diesem Grund wird die Anzahl der toxikologisch bedeutsamen Subtanzen bei einer General

Unknown Analysis stark eingeschränkt. Sie umfasst Stoffe, die im Rahmen der toxischen

Analyse regelmäßig gefunden werden. Zum Beispiel stehen die Medikamentenwirkstoffe,

Reinigungschemikalien oder Kosmetika im Vordergrund, da sie für die Allgemeinheit zur

Verfügung stehen. Insgesamt wird die Anzahl der im engeren Sinne toxikologisch

9

bedeutsamen Substanzen immerhin noch auf mehrere Tausend geschätzt (Müller et al.

1991). Hinzu kommen vermutlich noch einmal so viele Begleitstoffe (de Zeeuw 1997) und

probeneigene Matrixbestandteile (Müller et al. 1992), die als potentielle Störstoffe die

chemische Identifikation der toxisch wirkenden Substanzen erschweren können.

Jährlich ereignen sich ca. 250.000 Vergiftungsunfälle in Deutschland. Mehr als die Hälfte

der Vergiftungen betreffen Kinder bis 5 Jahre. Dabei handelt es sich in den meisten Fällen

um einen akzidentellen Kontakt mit Arzneimitteln (33%), Haushaltschemikalien (37%)

oder giftigen Pflanzen, Pilzen und Tieren (24%). Die Vergiftungshäufigkeit mit

Arzneimitteln steht bei den Erwachsenen mit fast 60 Prozent an erster Stelle, die

überwiegend aus suizidaler Absicht eingenommen werden (Giftinformationszentrum der

Länder Mecklenburg-Vorpommern, Sachsen, Sachsen-Anhalt und Thüringen, Thomas

1992).

Vor allem Arzneimittel mit Wirkung auf das Zentralnervensystem (Benzodiazepine,

Sedativa, Antidepressiva, Analgetika, Antiepileptika) und auf das Herz-Kreislaufsystem

(Betablocker, Calciumantagonisten, Herzglykoside) sind verantwortlich für die

Vergiftungen, die oft auch in Kombination mit Alkohol oder als Mischintoxikation mit

anderen Arzneimitteln vorliegen. De Zeeuw (1998) stellte fest, dass Vergiftungen mit

einem Gemisch verschiedener Wirkstoffe eher die Regel als die Ausnahme darstellen.

Bevorzugtes Untersuchungsmaterial ist Vollblut, Serum oder Plasma, da die

Substanzkonzentrationen in Blutproben oft mit der toxischen Wirkung korrelieren und der

Schweregrad einer Vergiftung besser eingeschätzt werden kann. Die analytische

Bestimmung von Post-Mortem-Blut kann aber durch die erhöhe Viskosität des Blutes und

störenden Abbauprodukten (Autolyseprozesse) problematisch sein (Müller et al. 2000).

Alternativ können Urin, Magenspülflüssigkeit, Gallenflüssigkeit oder Gewebeproben

untersucht werden, wenn auch die Konzentrationsbestimmung weniger aussagefähig ist.

Anderseits bringt die Urinbestimmung auch einige Vorteile mit sich. Es werden in der

Regel höhere Substanzkonzentrationen und eine größere Anzahl von Metaboliten gefunden,

so dass auch Substanzen mit einer geringen Halbwertszeit im Blut erfasst werden können.

Eine Urinbestimmung erfordert in der Regel eine vorhergehende Hydrolyse der

vorliegenden Konjugate.

Die Entwicklung der Systematischen Toxischen Analyse begann in den 50-iger Jahren..

1954 wurde von Curry und Powell eine Methode beschrieben, bei der es zum ersten Mal

10

gelang, eine größere Gruppe von toxikologisch interessanten Verbindungen mit Hilfe der

Papierchromatographie zu analysieren (Curry und Powell, 1954). Seit diesen ersten

Versuchen mit Papier- und Dünnschichtchromatographie setzte innerhalb weniger Jahre

eine rasante Entwicklung der verschiedenen chromatographischen Techniken ein. Der

weitverbreitete Einsatz der High Performance Liquid Chromatography (HPLC) und der

Gaschromatographie (GC) führte die Entwicklung der STA voran. Mit der Einführung von

Retentionszeiten (Kovats, 1958) zur Standardisierung der Daten und der Errichtung

umfangreicher Referenzdatenbänke (de Zeeuw et al. 1992, Hill et al 1994) wurden die

Grundlagen für eine weltweite und brauchbare Informationsquelle geschaffen. Mit der

Entwicklung der Massenspektrometrie (MS) und des UV-Diodenarray-Spektrophotometer

(DAD) ab den 70-er Jahren standen sensitive Detektoren für die toxikologische Analyse

zur Verfügung.

Allgemeine Nachweisuntersuchungen der STA:

Immunchemisch auf bestimmte Substanzgruppen (z.B. Opiate, Benzodiazepine)

HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) in Kombination mit selektiven

Detektoren (UV, elektrochemisch, MS)

GC-MS (Gaschromatographie – Massenspektrometrie)

HS-GC (Headspace-Gaschromatographie) zur Bestimmung flüchtiger Substanzen

CE (Kapillarelektrophorese) in Kombination mit UV-Detektion bzw. MS

DC (Dünnschichtchromatographie)

Atomabsorptionsspektrometrie (AAS, Metalle)

Immunchemische Methoden können als Vortest zur Selektion in negative und potentiell

positive Proben verwendet werden. Diese Tests werden in der Regel mit Urin durchgeführt.

Es gewinnt aber auch die immunchemische Bestimmung von Serumproben zunehmend an

Bedeutung. Das Ergebnis des immunchemischen Vortests muss anschließend mit einem

spezifischen Untersuchungsverfahren (z.B. HPLC/DAD, GC-MS) bestätigt werden.

Der Einsatz sensitiver Detektoren setzt eine effektive Probenvorbereitung voraus, um eine

möglichst hohe Ausbeute der toxischen Stoffe zu ermöglichen. Wegen der Vielzahl der

chemisch sehr unterschiedlichen Substanzen sind bei der General Unknown Analysis

immer Kompromisse in Bezug auf die Aufbereitung / Extraktion des biologischen

Materials notwendig (Madea und Brinkmann 2003). Grundsätzlich kommen folgende

Probenaufbereitungen zur Anwendung:

11

Flüssig – Flüssig – Extraktion (LLE, „liquid – liquid extraction“)

Festphasen – Extraktion (SPE, „solid phase extraction“).

Andere Methoden (SPME, ”solid phase microextraktion”; Eiweißfällung)

Für die STA zum Nachweis körperfremder Substanzen ohne gerichteten Verdacht besitzen

chromatographische Methoden die höchste Aussagekraft. Sehr oft wird die GC-MS

(Maurer et al. 1992 / 1997/ 1998b / 1999, Solans et al. 1995, Polettini, 1996) oder die

HPLC/DAD (Drummer et al. 1993, Koves 1995, Maier et al. 1995, Gaillard et al. 1997, Lo

et al. 1997, Lai et al. 1997) verwendet. Für die HPLC wird die Flüssig-Flüssig-Extraktion

bevorzugt, während bei der GC oft die SPE zum Einsatz kommt.

In den letzten Jahren wurden häufig Extraktionsmethoden mit der Verwendung von

Festphasen veröffentlicht. Oft wird mit der GC-MS gekoppelt, die eine etwas höhere

Selektivität und Empfindlichkeit als die HPLC/DAD erzielt (Drummer 1999). Jedoch

wurden sowohl die Empfindlichkeit, als auch die spektrale Auflösung der

Photodiodenarraydetektoren in den letzten Jahren erheblich verbessert (Hertzler et al.

2000). Für den Einsatz in der STA ergänzen sich HPLC/DAD und GC/MS eher, als dass

sie als konkurrierende Methoden aufzufassen wären. Bei der LC-MS wird die

Trennungseffizienz der HPLC mit der Sensitivität und Spezifität der MS kombiniert. In

Zukunft wird diese Technik voraussichtlich eine wichtige Rolle in der STA spielen

(Weinmann et al. 1999, 2000). Einige Methoden zur Bestimmung von Drogen mit LC-MS

sind bei Bogusz et al. (1998) und Maurer (1998a) beschrieben.

Im Allgemeinen wird die Flüssig – Flüssig – Extraktion zur Isolation körperfremder Stoffe

aus biologischem Material bevorzugt. Das liegt vor allem an der geringen Störanfälligkeit,

den besseren reproduzierbaren Extraktionsausbeuten und an dem geringeren

Arbeitsaufwand für die Einzelprobe. Universelle LLE werden oft für die General Unkown

Analyse verwendet, wenn die Substanzen mit verschiedenen physikochemischen

Eigenschaften von einer heterogenen Matrix isoliert werden müssen. Bei der SPE ist die

Probenbehandlung abhängig vom Probentyp. Blut und Gewebe können nicht direkt in die

Röhrchen gegeben werden, während für Urin oftmals eine Verdünnung und Zentrifugation

ausreichend ist (Maurer 1999). In den letzten Jahren wurden bei der Festphasenextraktion

erhebliche Fortschritte sowohl bezüglich der Reproduzierbarkeit der Extraktionsausbeuten

als auch bei der Reinheit der Extrakte erzielt. Die Vor – und Nachteile der SPE werden bei

Franke und De Zeeuw diskutiert (1998).

12

SPME (Solid-phase microextaction) ist eine neue Alternative zur SPE und LLE. Die

Verwendung von Lösungsmitteln und Konzentrationsschritten wird vermieden. Einige

Methoden wurden schon für spezielle Verbindungen publiziert (Maurer 1999, Hall et al

1997, Li et al. 1997).

Andere Verfahren wie die Kapillarelektrophorese (Maurer 1999, Drummer 1999) werden

wahrscheinlich in Zukunft in der forensischen Toxikologie vermehrt eine Rolle spielen. Die

Vorteile bei der CE liegen einerseits an dem geringen Bedarf an Probevolumen und

anderseits an der Erfassung eines weiten Spektrums von Verbindungen. Nachteilig wirkt

sich das Problem mit der ungenügenden Empfindlichkeit aus. In der Übersicht von Tagliaro

et al. (1998) wird die Methode der Kapillarelektrophorese diskutiert.

Nur noch selten wird die TLC in der STA verwendet (Maurer 1999, Drummer 1999). Ein

Screeningverfahren für verschiedene Drogen (Barbiturate, Diuretika, NSAID, saure

Antikoagulantien) ist bei Iten und Mueller (1994) beschrieben. Einzelne

Veröffentlichungen befassen sich mit der Kopplung von Dünnschichtchromatographie und

leistungsfähigen Detektoren wie der Remissionsspektrometrie (Demme et al. 2000) oder

einem Diodenarraydetektor (Ahrens et al. 2002).

13

14

2 Bestimmung der Extraktionsausbeute toxikologisch relevanter

Arzneimittel mit dem Lösungsmittel n-Chlorbutan bei pH 9

2.1 Grundlagen der Flüssig-Flüssig-Extraktion

Die Flüssig-Flüssig-Extraktion ist eine einfache, kostengünstige und weit verbreitete

Methode zur Isolation körperfremder Stoffe aus biologischem Material. Dabei wird die

wässrige biologische Matrix (Blut, Serum, Urin, Magenspülflüssigkeit) mit einem mit

Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert. Das Probenmaterial stellt immer ein

wässriges System dar, in welchem die Stoffe gelöst, emulgiert oder suspendiert vorliegen

können. Die Extrahierbarkeit der nachzuweisenden Stoffe beruht auf deren höheren

Lipophilie im Vergleich zur biologischen Matrix. Für schwer extrahierbare Verbindungen

(z.B. Salicylsäure, Paracetamol, einige Antibiotika), die aufgrund ihrer hydrophilen

Eigenschaften oder einer relativ großen Molekülmasse nicht mit einem organischen

Lösungsmittel extrahiert werden können, bietet sich die Proteinfällung z.B. mit Acetonitril

an. Allerdings werden niedermolekulare UV-absorbierende Blutbestandteile bei dieser

Methode nicht abgetrennt, die zu einer hohen Matrixbelastung des Chromatogramms

(besonders bei kurzen Retentionszeiten) führen können. Diese Probenaufbereitung

beinhaltet auch keinen Anreicherungsschritt (die Probe wird sogar verdünnt), so dass

höhere Bestimmungsgrenzen resultieren.

Die Höhe der Extraktionsausbeute der organischen Stoffe wird im wesentlichen von ihrem

Verteilungsgleichgewicht zwischen wässriger und organischer Phase, sowie ihrer

elektrolytischen Dissoziation, die ihrerseits wieder von dem pH-Wert abhängig ist,

bestimmt (Madea und Brinkmann 2003).

Neutrale, nicht-ionisierte, organische Substanzen verteilen sich nach dem NERNSTschen

Gesetz zwischen einer wässrigen Phase und einem nicht mit Wasser mischbaren

organischen Lösungsmittel in einem stets gleichbleibenden Verhältnis.

W

LK C

CV =

LC = Konzentration in der Lipidphase [mol/l]

= Konzentration in der Wasserphase [mol/l]WC

KV = Verteilungskoeffizient

15

Die Verteilungskonstante ist eine charakteristische Stoffkonstante, die nur für ideale

Bedingungen gilt:

Temperatur ist konstant

beide Phasen sind völlig unmischbar

der gelöste Stoff ist in keiner der Phasen assoziiert / dissoziiert

Gesamtkonzentration an gelösten Stoff ist in jeder Phase gering

Sehr viele Arzneistoffe sind organische Basen, Säuren oder amphotere Wirkstoffe und

unterliegen in der wässrigen Phase der elektrolytischen Dissoziation. Sie liegen in

Abhängigkeit von dem pH-Wert entweder als freie, undissoziierte Verbindungen oder als

Salze vor. Am Verteilungsgleichgewicht nehmen nur die Neutralmoleküle teil (seltene

Ausnahme: Ionenpaar-Assoziation). Somit bestimmt auch das Dissoziationsgleichgewicht

die Konzentration der Wirkstoffe in der organischen und wässrigen Phase. Eine

elektrolytische Dissoziation in der organischen Phase findet bei den meisten

Lösungsmitteln praktisch nicht statt. Bei organischen Basen wird das biologische Material

alkalisiert (pH >7), um höhere Extraktionsausbeuten zu erzielen und im Fall von Säuren

wird angesäuert (pH <7). Für neutrale Wirkstoffe ist der pH-Wert von geringem Einfluss

(Müller, 1991). Die Praxis beinhaltet daher im allgemeinen je eine Extraktion bei saurem

und bei basischen pH-Wert und zusätzlich eine Proteinfällung zur Erfassung schwer

extrahierbarer Verbindungen.

Natürlich unterliegen auch körpereigene Substanzen dem Verteilungs- und Dissoziations-

gleichgewicht und können anteilmäßig in die organische Phase übergehen. Vor allem

Lipide (Fettsäuren, Cholesterol) werden als Neutralstoffe gut extrahiert und können als

Verunreinigung die Analyse erschweren. Mit sehr polaren Lösungsmitteln wie Ethylacetat

oder dem oft verwendeten Dreiergemisch aus Dichlormethan, Ethylacetat und iso-Propanol

60:3:10 (Pfleger et al. 1992) kann man zwar eine sehr große Anzahl von toxikologisch

interessanten Verbindungen mit hoher Ausbeute extrahieren, aber auch die Höhe des in

erster Linie durch körpereigene Substanzen verursachenden Untergrundes liegt höher.

Weniger polare Lösungsmittel haben den Vorteil, dass weniger Störsignale auftreten, sich

aber Probleme mit einer ungenügenden Extraktionsausbeute ergeben können (Madea und

Brinkmann 2003, Demme et al. 1998).

16

Extraktion mit n-Chlorbutan In den Untersuchungen vom Arbeitskreis „Extraktion“ der GTFCh wurde nachgewiesen,

dass n-Chlorbutan bei pH 9 fast matrixfreie Chromatogramme (mit Ausnahme des

Cholesterols) sowohl für die GC-MS als auch für HPLC und DC erzielt (Demme et al

1999). Durch den deutlich geringeren Untergrund (kleinste Gesamtfläche der Störpeaks) im

Vergleich zu anderen Lösungsmitteln wird eine Überlagerung von Substanzsignalen und

eine stärkere Verschmutzung von Säulen und Detektoren vermieden. Aus dem Grund war

es von besonderem Interesse, die Substanzen zu ermitteln, die sich mit diesem

mittelpolaren Lösungsmittel und dem basischen pH-Wert ausreichend extrahieren lassen

und sich für ein Screening in „general unknown“-Fällen eignen.

Deshalb werden derzeitig die Extraktionsausbeuten von einer möglichst großen Zahl

toxikologisch relevanter Verbindungen mit der Flüssig–Flüssig–Extraktion in

Ringversuchen bestimmt.

In der vorliegenden Arbeit wurden 33 Arzneimittel aus einer basischen wässrigen

Pufferlösung (pH 9) mit n-Chlorbutan extrahiert und die Ausbeuten in der organischen

Phase mit Hilfe der UV-Spektrophotometrie und der HPLC ermittelt. Zur Überprüfung der

verwendeten Extraktionsmethode auf ihre Anwendbarkeit auf biologisches Material wurde

die Extraktion bei drei Arzneimittel parallel auch mit Serum durchgeführt.

Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über die Medikamente, die im Rahmen dieser

Arbeit untersucht wurden:

Arzneimittelgruppe n Beispiele

Abmagerungsmittel/

Appetitzügler

2 Cathin, Phenylpropanolamin

Analgetika 1 Hydromorphon

Antiarrhythmika 3 Aprindin, Adenosin, Procainamid

Antidiabetika 1 Glibenclamid

Antidota 3 Flumazenil, Nalorphin, Physostigmin

Antiepileptika 1 Mesuximid

Antimykotika 1 Fluconazol

Betablocker/

Calciumantagonisten

5 Celiprolol, Lisinopril, Nicardipin, Nifedipin,

Pindolol

17

Gichtmittel 1 Colchicin

Laxantia 1 Bisacodyl

Lokalanäthetika 3 Prilocain, Procain, Ropivacain

Narkosemittel 1 Pentobarbital

Parkinsonmittel 4 Benseracid, Levodopa, Metixen, Procyclidin

Psychopharmaka 6 Amitriptylinoxid, Cyamemazin, Fluspirilen,

Kavain, Lofepramin, Pimozid Tabelle 1

Die folgende tabellarische Übersicht gibt orientierende therapeutische und / oder toxische

Plasma- / Serumkonzentrationen der untersuchten Arzneimittel beim Menschen wieder

(Regenthal et al., 1999). Die komatös-letalen Plasma- / Serumkonzentrationen, die zum

Teil auf Einzelfallbeschreibungen basieren, orientieren sich an unteren Werten, auch wenn

deutlich höhere Spiegel bei Vergiftungen überlebt wurden. Toxikologisch wichtige aktive

Metabolite (*) sind auch aufgeführt.

Substanz Plasmakonzentration [µg/ml] HWZ

Therapeutisch Toxisch Komatös-letal (h)

Amitriptylinoxid 0,2 – 0,9 10 – 20

Aprindin 0,75 – 2,5 2 – 3 13 – 50

Celiprolol 0,05 – 0,5 – 1 3 – 6

Colchicin 0,0003 – 0,0025

(-0,004)

0,005 1 – 2

Flumazenil (0,01 -) 0,02 –

0,1

0,5 1 – 2

Glibenclamid 0,1 – 0,2 0,6 2 4 – 10

Hydromorphon 0,001 – 0,03 0,1 2 – 3

Levodopa 0,2 – 4 1 – 3

Lisinoprol 0,001 – 0,14 13

Lofepramin 0,003 – 0,01 10 – 20

Mesuximid

*N-Desmethylsuximid

2,5 – 7,5

10 – 40

10

40

25

2 – 4 (* - 80)

Nicardipin 0,07 – 0,1 7 – 12

18

Nifedipin 0,025 – 0,1 0,1 2 – 5

Pentobarbital 1 – 5 (- 10) 10 15 20 – 48

Phenylpropanolamin 0,1 – 0,5 2 2 – 5

Physostigmin < 0,001 – 0,005 1 – 2

Pimozid Ca. 0,004 – 0,01

(- 0,02)

50 – 60

Pindolol 0,02 – 0,15 0,7 2 – 5

Prilocain 0,5 – 1,5 (-2) 5 – 6 ca. 20 10

Procain 0,2 – 2,5 (- 15) 20 20 - 0,5

Procainamid

* N-Acetylprocainamid

2,5 – 10

5 – 30

8

20

20

2 – 5

3 – 7

Procyclidin - 1 2 7 – 16 Tabelle 2 (entnommen aus Regenthal et al., 1999)

19

2.2 Ergebnisse

2.2.1 Extraktion aus Puffer

Es wurden 33 Arzneimittel aus einer basischen wässrigen Pufferlösung (pH 9) mit n-Chlor-

butan extrahiert und die Ausbeuten in der organischen Phase mittels UV-VIS-

Spektroskopie (UV-VIS-Spektrophotometer CARY 1E, Firma Varian) und HPLC/DAD

(Photodiodenarray-Detektor HP Series 1100) ermittelt. Die HPLC-Messung erfolgte in

einem isokratischen System mit einer RP-8- (Lichrospher 100 RP 8, 5µm ) bzw RP-18-

Säule (Prontosil 120–5 C18 H 5,0µm). Als Bezugssubstanz ist MPPH (5-p-Methylphenyl-

hyndantoin) eingesetzt worden, dass unter den chromatographischen Bedingungen eine

mittlere Retentionszeit aufweist. Der Vorteil der isokratischen Elution gegenüber der

Gradientenelution ist neben der Einsparung von Lösungsmitteln und der ständigen

Einsatzbereitschaft (Konditionierung der Säule nicht notwendig) die hohe

Reproduzierbarkeit der Retentionsparameter.

Die Extraktionsausbeute in der organischen Phase wurde nach den folgenden Formeln

berechnet:

n

vw

nw

vw

EEE

A−

=0

bzw.:

nw

no

EE

A ≈0

Ausbeute in der organischen Phase

Extinktion der wässrige Phase vor der Extraktion

Extinktion der wässrigen Phase nach der Extraktio

0A

vwE

nwE

noE Extinktion der organischen Phase nach Extraktion

ca. Wert, da die Extinktionskoeffizienten in den Phasen unter-

schiedlich sein können 0A

20

Die Extraktionsausbeute R in der organischen Phase ist von Interesse, weil sie für ein

Isolationsverfahren ein wichtiges Kriterium darstellt.

HA

OHAHA Q

QR

)(=

Eine Verbindung mit einer Extraktionsausbeute von R = 1,0 wird vollständig in der

organischen Phase angereichert. Für eine bessere Darstellung der Werte wird oft der

Ausdruck 100R verwendet, der den prozentualen Anteil wiederspiegelt.

Tabelle 3 : Extraktionsausbeuten 100R der Arzneistoffe mit n-Chlorbutan aus Puffer bei

pH 9

Stoff UV-Spektrometermessung HPLC Extraktionsausbeute

Wellenlänge

[nm]

100RUV

100RHPLC

100R

Adenosin 259 0 1 0

Amitriptylinoxid 250 0 30/15 15

Aprindin 255/261 100*/100* 100 100

Benseracid-HCl 210/212 0/7 0 2

Bisacodyl 264 52 34 48

Cathin 208/256 4/0 12/10 6

Celiprolol-HCl 324/335 11*/16* 7/6 10

Colchicin 351 12 9 10

Cyamemazin 269 100 100 100

Fluconazol 208 14 0 7

Flumazenil 245 67 80 73

Fluspirilen 254 100* 100 100

Glibenclamid 301 5 8 7

Hydromorphon 286 7 14 10

Kavain 291 100 99 100

Levodopa 284 0 0 0

HAR Extraktionsausbeute in der organischen Phase

OHAQ )( Anteil der verteilten Verbindung in der organischen Phase

HAQ Gesamtmenge (Einwaage) der Substanz HA

21

Lisinopril 210 0 0 0

Lofepramin-HCl 253 92* 100 96

Mesuximid 208 100 97 98

Metixen-HCl 267 100 100 100

Nalorphin-HBr 287 20 23 21

Nicardipin 347 100* 100 100

Nifedipin 338 100 100 100

Pentobarbital 240 6 18 12 Phenylpropanolamin-HCl 208 0 0 0

Physostigminsulfat 305 77 67 72

Pimozid 294 100 100 100

Pindolol 286 33 37 35

Prilocain 208/245 100 93 96

Procain 289 100 99 100

Procainamid 276 3 7 5

Procyclidin-HCl 257 100* 100 100

Ropivacain 208 100 94 97

* Alternativ: Chlorbutanmethode (S. 33) Tabelle 3

Für die Bestimmung der Extraktionsausbeute wurden für die UV- und HPLC-Messung

jeweils Doppelbestimmungen durchgeführt und daraus das arithmetische Mittel errechnet.

Die HPLC-Ergebnisse sind über die Peakflächen ausgewertet wurden. Die

Gesamtextraktionsausbeute ergibt sich aus dem arithmetischen Mittel der UV- und HPLC-

Messung.

22

2.2.2 Extraktion aus Serum

Zur Überprüfung der Extraktionsmethode mit n-Chlorbutan auf ihre Anwendbarkeit auf

biologisches Material wurde die Extraktion bei drei Arzneimittel zusätzlich mit Serum

durchgeführt. Es wurden drei verschiedene Testseren eingesetzt und Doppelbestimmungen

durchgeführt. Mittels HPLC wurden die Peakflächen der gleich behandelten Wasser- und

Serumproben ermittelt und ins Verhältnis gesetzt. Die ermittelten Werte geben die

prozentuale Wiederfindung der Extraktionsausbeute an. Das Ergebnis der

Extraktionsmethode aus Wasser wurde 100 Prozent gesetzt.

W (Prozentuale Wiederfindung) = 100 * Peakfläche Serumprobe / Peakfläche Wasserprobe

Substanz

W – Serum 1 [%]

W – Serum 2 [%]

W – Serum 3 [%]

Mesuximid 97 99 113

Prilocain 87 104 102

Procyclidin 103 105 115 Tabelle 4

23

2.3 Diskussion

2.3.1 Extraktion aus Puffer

Die getesteten Arzneimittel wurden aus einer Pufferlösung mit dem Lösungsmittel n-

Chlorbutan bei pH 9 extrahiert (Ergebnisse: siehe Tabelle 3).

Bei einer Extraktionsausbeute 100R 80% ist die Substanz mit dieser Methode sehr gut

isolierbar (Demme et al. 2003). Für diese Arzneimittel ist die Extraktion mit n-Chlorbutan

empfehlenswert. Die Probe kann dann mit gängigen Methoden wie der HPLC in

Kombination mit sensitiven Detektoren oder der GC-MS qualitativ und quantitativ

bestimmt werden.

≥

Der Vorteil der Isolation der Wirkstoffe mit n-Chlorbutan bei pH 9 im Vergleich zu

polareren Lösungsmitteln wie z.B. Ethylacetat liegt in einer deutlich geringeren

Mitextraktion von Matrixbestandteilen. Dadurch ist in vielen Fällen auch eine

Empfindlichkeitssteigerung möglich. Es resultieren sehr saubere Chromatogramme. Es

können Fettsäuren und Cholesterol mitextrahiert werden, diese stören aber wegen fehlender

UV-Absorption die Untersuchung nicht. Im Gegensatz zu z.B. polaren Lösungsmitteln

werden Säulen und Detektoren weniger verschmutzt (Demme et al. 1998).

Voraussetzung für einen generellen Einsatz einer Extraktionsmethode bei der

Systematischen Toxischen Analyse ist neben einem erwünschten geringen Untergrund auch

eine hohe Ausbeute vieler Wirkstoffe. Mit dieser Arbeit wurden die Extraktionsausbeuten

von 33 Wirkstoffen bestimmt.

In der folgenden Tabelle sind die Arzneistoffe mit einer Extraktionsausbeute 100R ≥ 80%

aufgelistet:

Nr.

Arzneistoff

Extraktionsausbeute 100R

1 Aprindin 100

2 Cyamemazin 100

3 Fluspirilen 100

24

4 Kavain 100

5 Lofepramin-HCl 96

6 Mesuximid 98

7 Metixen-HCl 100

8 Nicardipin 100

9 Nifedipin 100

10 Pimozid 100

11 Prilocain 96

12 Procain 100

13 Procyclidin-HCl 100

14 Ropivacain 97 Tabelle 5

Von den getestete Wirkstoffen sind 14 Arzneimittel sehr gut extrahierbar (100R ≥ 80%).

Zusätzlich sind die Arzneistoffe Flumazenil (73%) und Physostigminsulfat (72%)

ausreichend isolierbar. Das bedeutet, dass eine ausreichende Extraktionsausbeute bei der

Hälfte der hier untersuchten Arzneimitteln vorhanden ist.

Vergleich mit anderen Laborergebnisse

Da es sich um einen Ringversuch handelt, wurden die meisten Substanzen parallel auch in

anderen Laboren bestimmt. Zum Vergleich wurden die ermittelten Extraktionsausbeuten

den Ergebnissen der anderen Labore gegenübergestellt (Demme et al 2003).

Wirkstoff

Leipzig

1

Labor

2

Labor

3

Labor

4

Labor

5/6

Mittel-

wert

s n

100 R (%)

Aprindin 100 100 88 96 7 3

Cyamemazin 100 100 100 0 2

Fluspirilen 100 80 75 102 90 89 12 5

Kavain 100 100 71/60 77 100 /90 85 16 7

Lofepramin-HCl 96 60 / 80 96 100 87 17 5

Mesuximid 98 100 99 1 2

Metixen-HCl 100 100 100 0 2

25

Nicardipin 100 59 80 28 2

Nifedipin 100 100 100 43 91 87 25 5

Pimozid 100 93 100 98 4 3

Prilocain 96 100 93 96 4 3

Procain 100 93 77 81 88 11 4

Procyclidin-HCl 100 100 100 0 2

Ropivacain 97 100 99 2 2

Adenosin 0 0 0 0 0 3

Amitriptylinoxid 15 16 3 11 7 3

Benseracid-HCl 2 0 0 1 1 3

Bisacodyl 48 64 101 34 81/100 71 28 6

Cathin 6 6 9 10 8 2 4

Celiprolol-HCl 10 ~10 10 0 2

Colchicin 10 12 96 15 17 30 37 5

Fluconazol 7 90 7,4 35 48 2

Flumazenil 73 85 80 79 6 3

Glibenclamid 7 27 41 6 20 16 4

Hydromorphon 10 17 0 13 10 7 4

Levodopa 0 0 0 0 2

Lisinopril 0 0 1 1 1 1 4

Nalorphin-HBr 21 36 7 30 24 13 4

Pentobarbital 12 45 37 24 30 15 4 Phenylpropanol-

amin-HCl 0 - - 1

Physostigminsulfat 72 72 - 1

Pindolol 35 36/38 15 20 16 27 9 6

Procainamid 5 10 28 4 12 11 4 Tabelle 6

Die Ringversuche zur Bestimmung der Extraktionsausbeuten sind notwendig, um

verlässlichere Ergebnisse zu erzielen, da mögliche Einflussfaktoren und Fehlerquellen von

den einzelnen Laboren dadurch minimiert werden können. Aus diesem Grund wurde die

26

Standardabweichung zur Charakterisierung der Ergebnisse mitangegeben (siehe Tabelle 6).

Man schätzt die Standardabweichung ausgehend von der Stichprobe. Sie ist ein Maß dafür,

wie weit die jeweiligen Werte um den Mittelwert streuen (Berechnung S. 34).

Die Streuung um die Mittelwerte ist bei den meisten Substanzen gering (≤ 10). Große

Abweichungen (s 20%) konnten bei den Arzneimitteln Bisacodyl, Nicardipin, Nifedipin,

Colchicin und Fluconazol festgestellt werden. Diese Streuung wird wahrscheinlich durch

Ausreißerwerte verursacht. Z.B. wurde bei Fluconazol in zwei Laboren ein Extraktion unter

10% gemessen, während im dritten Labor eine Extraktionshöhe von 90% ermittelt wurde.

≥

Diese Arzneimittel sollten in ergänzenden Versuchen noch einmal untersucht werden, um

ein verlässlicheres Ergebnis zu erhalten.

Mit der Einbeziehung der Extraktionswerte aus anderen Laboren wird deutlich, dass sich

die Teilergebnisse aus dem Labor Leipzig bestätigen lassen. Auch hier sind die 16

Arzneimittel (siehe auch Tabelle 6) mit einer Extraktionsausbeute ≥ 70% ausreichend mit

dieser Methode isolierbar. Zusätzlich wurde für Bisacodyl insgesamt eine Ausbeute von

71% erreicht.

Insgesamt ergibt sich damit eine ausreichend hohe Extraktionsausbeute mit n-Chlorbutan

und pH 9 bei 17 von 33 Arzneimitteln. Das bedeutet, dass eine ausreichende

Extraktionsausbeute bei 52 Prozent der hier untersuchten Arzneimittel ermittelt wurde.

Ein wenig anders sieht das Verhältnis aus, wenn die Ergebnisse aller bisher untersuchten

Stoffe mit einbezogen werden. In den Ringversuchen wurden insgesamt 332 toxikologisch

interessante Verbindungen untersucht. Davon sind 225 Verbindungen (entspricht 68

Prozent) sehr gut extrahierbar.

2.3.2 Extraktion aus Serum

Parallel zur Extraktionsmethode mit n-Chlorbutan aus Puffer wurden drei Arzneimittel

(Mesuximid, Prilocain, Procyclidin) zusätzlich aus Serum isoliert. Es wurden drei

verschiedene Testseren eingesetzt.

Bei allen drei Arzneimitteln wurde bei der Extraktion aus Puffer eine gute Ausbeute in der

organischen Phase (100R ≥ 80) festgestellt. Mit der Extraktion aus Serum sollte die

Übertragbarkeit der Ergebnisse auf biologisches Material überprüft werden. Dabei können

27

auch Einflüsse wie Eiweißbindung, Komplexbildung, Emulsionsbildung und andere

Faktoren auf die Verteilung des Arzneimittels zwischen der wässrigen und organischen

Phase eine Rolle spielen.

In der Tabelle 4 sind die Werte der prozentualen Wiederfindung aufgeführt. Alle

Ergebnisse liegen in einem Bereich von 87 bis 115 Prozent. Zwei Drittel der Werte ergaben

sogar eine Übereinstimmung von 97 bis 105 Prozent.

Daraus ist für die drei Arzneimittel eine gute Übertragbarkeit der Ergebnisse auf

biologisches Material erkennbar. Zwar kann man aus diesen Ergebnissen keine

übergreifenden Schlüsse auf die andere Stoffe ziehen, aber in der Regel wird eine

Übertragung der Ergebnisse auf biologisches Material in den meisten Fällen sehr gut

möglich sein.

2.3.3 Bedeutung für die STA

In der General Unknown Analysis sind die zu untersuchenden Stoffe unbekannt. Die

Screening-Strategie muß sehr umfassend sein, weil einige tausend relevante toxische Stoffe

berücksichtigt werden müssen. In der Systematischen Toxischen Analyse existiert bis heute

keine Extraktionsmethode, mit der man die Vielzahl der in Frage kommenden, relevant

toxischen Stoffe in einem umfassenden Verfahren isolieren könnte. Zwei oder mehr

Verfahren sind notwendig, um eine respektable Anzahl an toxischen Stoffen ausreichend zu

extrahieren. Oft werden basische/neutrale und saure/neutrale Verbindungen getrennt

voneinander bestimmt.

Auch bei der hier untersuchten Methode wird deutlich, dass sie als alleiniges Screening-

Verfahren nicht ausreichend ist. Die Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Chlorbutan bei pH 9 ist

eine Methode, die bei ausreichender Extraktionsausbeute der Wirkstoffe sehr gute Resultate

liefert. Das äußert sich in fast matrixfreien und dadurch sehr sauberen Chromatogrammen

und dadurch einer geringen Verschmutzung von Säulen und Detektoren.

Die Ergebnisse machen aber deutlich, dass eine ausreichende Extraktionsausbeute bei mehr

als einem Drittel der untersuchten Arzneimitteln nicht gegeben ist. Letztendlich ist aber

gerade die ausreichende Extraktion einer Vielzahl von Wirkstoffen Voraussetzung für den

28

generellen Einsatz einer Extraktionsmethode in der Systematischen Toxischen Analyse.

Somit ist der alleinige Einsatz dieser Isolationsmethode für ein Screening in General

Unknown Fällen nicht empfehlenswert.

Für Arzneimittel, die nur ungenügend mit n-Chlorbutan extrahiert werden konnten, ist der

Einsatz eines polareren Lösungsmittel wie z.B. Ethylacetat oder Dichlormethan/Ether 7:3

vielversprechend. Die Extraktionsausbeute wird mit der Erhöhung der Polarität des

Lösungsmittels gesteigert, gleichzeitig wird aber auch die Höhe des in erster Linie durch

körpereigene Substanzen verursachenden Untergrundes höher liegen.

Eine andere Möglichkeit zur Isolation dieser Stoffe ist z.B. die Verwendung der

Festphasenextraktion, die aber im Verhältnis zur FFE relativ teuer ist.

Von der Firma Biorad wird ein Remedi hs System angebotenen, bei welchem die gesamte

Analyse, d.h. Probenvorbereitung, chromatographische Trennung und Bibliothekssuche

automatisiert ist. Der manuelle Aufwand wird dadurch vermindert, aber weder die

Extraktions- (Festphasenextraktion) noch die Trennbedingungen (HPLC) können verändert

werden.

29

2.4 Schlussfolgerung

Für die Systematische Toxische Analyse ist eine logisch - schematische Vorgehensweise in

Kombination mit effizienten und leistungsstarken analytischen Strategien notwendig, um

unklare Krankheitsbilder und Todesfälle aufzuklären, bei denen eine Vergiftung in Betracht

gezogen wird. Durch die Vielzahl der toxisch wirkenden Substanzen ist es heutzutage

unmöglich, ein alleiniges Screeningverfahren für die STA zu etablieren. Das

Vorhandensein von sauen, neutralen und basischen Stoffen und deren unterschiedlichen

physiko-chemischen Eigenschaften führen z.B. dazu, das kein umfassendes

Extraktionsverfahren für die Systematische Toxische Analyse existiert, welche eine

Vielzahl toxikologisch interessanter Verbindungen zu analysieren vermag. Nur die

Kombination verschiedener Extraktionsmethoden führt zu einer respektablen Anzahl von

Wirkstoffen mit ausreichender Ausbeute, die dann mit gängigen Methoden bestimmt

werden können.

Mit den vorliegenden Extraktionsergebnissen von über 300 Arzneistoffen wurde die

Eignung der Methode für 225 Stoffe bestätigt. Dadurch kann die Screeningmethode gezielt

und effektiv für diese Stoffe in der STA angewendet werden. Zusätzlich ist der Einsatz

einer ergänzenden Extraktionsmethode von Vorteil, um die Anzahl der bestimmbaren

Wirkstoffe zu erhöhen. Mit diesen Arbeiten wurde eine Grundlage geschaffen, um

zukünftig die Probleme, die bei den sogenannten General Unknown Fällen durch die

Vielzahl der in Frage kommenden Stoffe zustande kommen, zu verringern. Auch können

jetzt bei der Analyse gezielt die Stoffe ausgeschlossen werden, die nicht detektiert wurden,

welches bei Nichtkenntnis der Extraktionsausbeute nicht möglich war, weil nicht eindeutig

eine vorhergehende ausreichende Extraktionsausbeute belegt werden konnte.

Eine Vorgehensweise für die STA wäre z.B. die Extraktion der toxischen Stoffe bei zwei

verschiedenen pH-Werten (4 und 9) mit n-Chlorbutan und für die nicht ausreichend

extrahierbaren Wirkstoffe zusätzlich der Einsatz eines wesentlich polareren Lösungsmittels.

Der Aufgabe hat sich der Arbeitskreis der GTFCh (Gesellschaft für Toxikologische und

Forensische Chemie) gestellt, um diese Möglichkeit für die Systematische Toxische

Analyse zu überprüfen.

30

2.5 Experimentelles

2.5.1 Geräte und Chemikalien

Geräte:

UV-VIS- Spektrophotometer CARY 1E, FirmaVarian; Quarzküvetten

HPLC / Photodiodenarray-Detektor HP Series 1100

Säule (System 1): Prontosil 120–5 C18 H 5,0µm

Säule (System 2): Lichrospher 100 RP 8 5µm

Substanzen (Reinsubstanzen):

1. Adenosin 18. Lofepramin-HCl

2. Amitriptylinoxid 19. Mesuximid

3. Aprindin 20. Metixen-HCl

4. Benseracid-HCl 21. Nalorphin-HBr

5. Bisacodyl 22. Nicardipin

6. Cathin 23. Nifedipin

7. Celiprolol-HCl 24. Pentobarbital

8. Colchicin 25. Phenylpropanolamin-HCl

9. Cyamemazin 26. Physostigminsulfat

10. Fluconazol 27. Pimozid

11. Flumazenil (1) 28. Pindolol

12. Fluspirilen 29. Prilocain (2)

13. Glibenclamid 30. Procain

14. Hydromorphon 31. Procainamid

15. Kavain 32. Procyclidin-HCl

16. Levodopa 33. Ropivacain (3)

17. Lisinopril

(1) AnexateR 0,5 mg / Ampulle, Injektionslösung

(2) XylonestR 1% ,Injektionslösung

(3) Naropin 2 mg/ml, Injektionslösung

31

Lösungsmittel:

n-Chlorbutan, Baker Analyzed Reagent, Dichte bei 25°C: 0,882 g/ml

Phosphatpuffer pH 9 (2 Teile Na2HPO4-Lösung [10g/100 ml aqua dest] + 1 Teil

aqua dest)

HPLC-Eluent (System 1): Acetonitril / Phosphatpuffer verdünnt (37:63)

HPLC-Eluent (System 2): Acetonitril / Phosphatpuffer verdünnt (63:37)

Daldrup: Acetonitril / Phosphatpuffer verd. (35:65)

MPPH (5-[4-Methylphenyl–phenylhydantoin]) 1µg/ml (1:4 bzw. 1:5 mit Methanol

verdünnt)

2.5.2 Durchführung

Es wurden 33 Arzneimittel aus einer Phosphatpufferlösung (pH 9) mit n-Chlorbutan

extrahiert und die Ausbeuten in der organischen Phase mit Hilfe der UV-

Spektrophotometrie und der HPLC ermittelt. Bei drei Arzneimitteln wurde parallel mit

Serum gearbeitet.

Extraktion aus Puffer

Zur Herstellung der Lösungen der Wirkstoffe wurden die Reinsubstanzen oder vorhandene

Medikamente (Injektionslösungen) verwendet. Die Substanzen wurden in Puffer mit einer

Wirkstoffkonzentration von 1 mg/ml gelöst oder bei Unlöslichkeit in Puffer auf dem

Ultraschallbad homogen suspendiert. Alternativ wurde auch die Chlorbutanmethode (s.

unten) angewandt.

150 µl dieser Lösung wurde mit einem Phosphatpuffer pH 9 auf 15 ml aufgefüllt

(Puffermethode). Die entstandene Lösung wurde in einem Vorversuch spektroskopisch

vermessen, um einen optimalen Extinktionsbereich (ε ≥ 0,5) zu gewährleisten. Je nach

Bedarf wurde die optimale Konzentration der Lösung eingestellt.

Zur Herstellung der Extraktionslösungen wurden jeweils 3,5 ml der obigen Lösung in die

Reagenzgläser A,B,C und D überführt. Anschließend wurden 3,5 ml n-Chlorbutan zu den

Reagenzgläsern C und D zugegeben. Alle 4 Untersuchungslösungen wurden danach zwei

Minuten geschüttelt und zwei Minuten bei 3200 Umdrehungen zentrifugiert. Die obere

32

organische Phase (Dichte 0,882 g/ml) und die untere wässrige Phase (Dichte 1 g/ml ) von C

und D wurden sauber abgetrennt und in neue Reagenzgläser überführt.

Die sechs Untersuchungslösungen wurden anschließend am Photospektrometer gegen einen

Leerwert (Phosphatpuffer bzw. n-Chlorbutan) einmal vermessen. Für die Aufnahme der

UV-Spektren wurde ein Wellenbereich von 200 bis 400 nm gewählt.

Alternativ wurde bei einigen Substanzen (Aprindin, Celiprolol-HCl, Fluspirilen,

Lofepramin-HCl, Nicardipin, Procyclidin-HCl) wegen der Unlöslichkeit in Phosphatpuffer

wie folgt vorgegangen:

1 ml der Substanzlösung wurde mit n-Chlorbutan auf 15 ml aufgefüllt

(Chlorbutanmethode). Auch mit dieser entstandenen Lösung wurde im Vorversuch die

optimale Konzentration eingestellt. Zur Herstellung der Extraktionslösungen wurden

jeweils 3,5 ml der Lösung in die Reagenzgläser A,B,C und D überführt. Anschließend

wurden 3,5 ml Phosphatpuffer pH 9 zu den Reagenzgläsern C und D zugegeben. Analog

zur Puffermethode wurde dann weiter verfahren.

Zur Kontrolle wurden alle Extraktionslösungen mit der HPLC bei 220 nm vermessen. Es

wurden jeweils 0,5 ml der Lösung mit 1 ml Daldrup versetzt und 50 µl externer Standard

(MPPH) zugegeben.

Extraktion aus Serum

Zur Testung der Extraktionsmethode mit n-Chlorbutan auf Serum wurde wie folgt

vorgegangen:

1 ml Serum bzw. Wasser (als Vergleich) wurde mit einer Spatelspitze Natriumhydrogen-

carbonat zur pH-Wert Einstellung versetzt. Für biologisches Material wird diese Methode

wegen einer geringeren Emulsionsbildung verwendet.

Anschließend wurde die entsprechende Menge Arzneistoff (siehe Tabelle 7) zugesetzt .

Nach Zugabe von 3 ml n-Chlorbutan wurde das Schliffglas vorsichtig einige Minuten

geschüttelt. Ein Überschuss des organischen Lösungsmittels ist meistens vorteilhaft, um

eine Emulsionsbildung zurückzudrängen.

Nach zweiminütigen Zentrifugieren bei 3200 Umdrehungen und der Abtrennung der

organischen Phase vom Serum bzw. von der Wasserphase wurden 1 ml der

Chlorbutanphase entnommen, mit 10 µl externen Standard MPPH versetzt und unter

33

Stickstoff im Eppendorfgefäß eingedampft. Zur Vorbereitung der HPLC-Probe wurden 200

µl Phosphatpuffer und 400 µl Daldrup zugegeben. Mit der HPLC wurden bei 220 nm die

Peakflächen der Substanz und des externen Standard ermittelt.

Insgesamt sind drei verschiedene Seren zum Einsatz gekommen. Es wurden Doppelbe-

stimmungen durchgeführt.

Tabelle 7 verschafft einen Überblick über die eingesetzte Arzneistoffmenge in Bezug auf

ihre therapeutischen und toxischen Plasmakonzentrationen.

Substanz Plasmakonzentration [µg/ml] Eingesetzte

Therapeutisch Toxisch Komatös-letal Konzentration

[µg/ml]

Mesuximid 2,5 – 7,5 10 25 10

Prilocain 0,5 – 1,5 (-2) 5 – 6 ca. 20 10

Procyclidin 1 2 1 Tabelle 7

Berechnung:

Die Standardabweichung wurde nach folgender Formel berechnet:

( )( )1

)22

−∑−∑

=nn

xxns

34

3 Auswertung von unveröffentlichten Forschungsergebnissen aus den

achtziger Jahren: Verteilungsquotienten und pH – Abhängigkeit

toxikologisch relevanter Verbindungen

3.1 Einleitung

Es wurden die experimentellen Daten über die Verteilungsquotienten und pH-Abhängigkeit

von über 90 Verbindungen ausgewertet. Die Daten wurden Ende der 80er Jahre in der

Rechtsmedizin Leipzig ermittelt. Durch die politischen, wirtschaftlichen und

wissenschaftlich/technischen Umstellungen, die im Zusammenhang durch die

Wiedervereinigung Deutschlands im Jahre 1989 entstanden, wurden die experimentell

gewonnenen Daten nie ausgewertet. Obwohl sich die STA in den letzten 20 Jahren enorm

weiterentwickelt hat, können die Ergebnisse über Verteilungsquotienten und pH–

Abhängigkeit von toxikologisch relevanten organischen Verbindungen auch heute noch für

bestimmte Fragestellungen hilfreich sein.

3.2 Grundlagen der Verteilung

Die Grundlagen der Systematischen Toxischen Analyse (Bedeutung, Methoden,

Verteilungs -und Dissoziationsverhalten) wurden schon im ersten Teil dieser Arbeit

besprochen und sollen hier nicht wiederholt werden. In diesem Teil sollen kurz die

Grundlagen über Verteilungungsquotienten und pH-Abhängigkeit betrachtet werden.

Es wurden die experimentellen Daten über die Verteilungsquotienten und pH-Abhängigkeit

von über 90 Verbindungen ausgewertet. Der untersuchte pH-Bereich liegt bei den meisten

Verbindungen zwischen pH 1 bis 13.

Die pH-abhängige (scheinbare) Verteilungskonstante DC ist das Verhältnis der

Konzentration der verteilten Substanz [HA] in der organischen und wässrigen Phase.

WHA

OHA

WW

OC c

cAHA

HAD)()(

][][][

=+

= −

35

Falls die Verteilung einer Substanz pH-abhängig ist, kann die pH-abhängige

Verteilungskonstante DC aus der pH-unabhängigen (wahren) Verteilungskonstante KD unter

Berücksichtigung des Dissoziationsgrades α errechnet werden, denn nur die

Neutralmoleküle können an der Verteilung teilnehmen.

)1()( , α−⋅== DDC KpHKfD

D

K

α

C pH-abhängiger Verteilungsqoutient

Verteilungskonstante (pH-unabhängig) D

Extinktion der wässrigen Phase nach der Extraktion

Menge der Substanz HA in der organischen Phase

Menge der Substanz HA in der wässrigen Phase

Menge der Substanz A- in der wässrigen Phase

Konzentration der verteilten Substanz in der organischen Phase

Konzentration der verteilten Substanz in der wässrigen Phase

OHA][

[ ]WHA

[ ]−WA

OHAc )(

( WHAc )

Berechnung:

Berechnung der Extraktionsausbeute R (nur gültig für ein Phasenverhältnis 1:1):

ι

ι

OOHA

OOHA

VQVQR⋅⋅

=)()( Abdampfrückstand aus dem abpipettierten Anteil der

organischen Phase

Anteil der verteilten Verbindung in der organischen Phase

Volumen der org. Phase (nach der Gleichgewichtseinstellung)

abpipettiertes Aliquot der org. Phase mit dem Anteil

der verteilten Verbindung

ιOHAQ )( ι

OV

OHAQ )(

OV

ι

OV ιOHAQ )(

HA

OHA

QQ

R)(

100100 ⋅= ι

ι

OOHA

OOHA

VQVQ⋅⋅

=)()(

36

Berechnung der Verteilungskonstante KD:

111

−=

R

K D

Die Darstellung der Ergebnisse erfolgte mittels der Bestimmung der Extraktionsausbeute

100R.

Die experimentellen Ergebnisse über die Verteilungsquotienten und deren pH-

Abhängigkeit von 91 toxikologisch relevanten Verbindungen wurden mit dem

Statistikprogramm SPSS ausgewertet.

37

38

3.3 Ergebnisse Die Extraktionsausbeuten 100R von 91 Wirkstoffen in Abhängigkeit von dem pH-Wert sowie die maximale Ausbeute mit der entsprechenden Dissoziationskonstante sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Verbindung LM 100 R bei pH 100R KD

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Max

Acetylsalicylsäure

Et 1

Clf 97,5 47 24,6 3,4 0 2,7

5,8 5,1 97,5 39,00 Acetyl-Sulfafurazol

Clf 30,2 38,9 29,7 39,6 41,7

29,5 35,9 36,7

20,8

16,2

41,7 0,72 Eto 26,6 23,9

23,1 31,1

25 25,8

13,4 15,9

1,3 1 31,1 0,45

Acetyl-Sulfamerazin, N4-

Eto 15,2 13,3 21,4 5,1 1,1 0 21,4 0,27 Clf 8,6 44,5

33,1 35,4 29,5 11,5

2,6 0 44,5 0,80

Acetyl-Sulfanilamid, N4-

Clf 0 0 0 0 0 0,5

0,5 0,01 Eto 6,4 16,9 15,5 18,6 13,2 6,6

2,6 18,6 0,23

Eta 52,7 63,4 66,4 75,6 66,6 39 41,2 75,6 3,10 Acetyl-Sulfisomidin, N4-

Eto 7,7 1,1 19,4 24,6 1,9 6,9 8,9

6,7

1,3

24,6 0,33 Clf 1,5

8,6 12,6 8,7 6,6 5,8 21,8 8,4 0 0 21,8 0,28

Allobarbital

Eto 86,9 98,6 94,4

69 4,4 98,6 70,43 Clf 74,8 77,6 23,2 0 77,6 3,46

Allopurinol Eto 0 0 0,16 0,1 0,85 1 0,2 1 0,01 Allylethylbarbitursäure

Eto 93,2

97 93,3 91,8 58,9 2,4 0,2 97 32,33 Clf 63,1 63,2 70 16,4 1,1 70 2,33

Amobarbital

Clf 103,3 104,2 104,4 94,1 5,5 ~ 100 ~ 99 Eto 100 102,3 99,7 99,1 98 22,7

4,2 ~ 100 ~ 99

Aprobarbital Clf 93,2 92,8 90,4 91,2 85,6

38,8

6,3 0,4 4,60

3,8 93,2 13,71 Azidamphenicol Eto 28,8 33,7

46,4 41,4 42 35,2

14,8

46,4 0,87

Barbital

Clf 40,88

48,4

50,1

53,1

50,6

35,1

10,8

0,6 2,1 2,3 53,1 1,13 o

81 4,26

Eta 88,5 86 88,5 7,70 Benzylhydrogenphthalat

Clf 100 95,8 15,1 1,5 1,7 100 ~ 99

Biperiden

Clf 105,3

113,9

97,7

103 99 97,2 103,2

~ 100 ~ 99 Eto 0 0,1 15,4 13,4 41

101,1 104,2 99,8

96,6 ~ 100 ~ 99

Bisacodyl Clf 98,7

84,7 94,7 101,3 102,9 101,7 96 90,6 ~ 100 ~ 99 Bromhexin Clf 112,1 102,3 97,9 105 107,7 99,8 108,7 ~ 100 ~ 99

39

Fortsetzung von Tabelle 8 Verbindung LM 100R bei pH 100R K D

1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Max

Eto 0 8,1 103,3 97,9

91,4 87,9 96,1 95,8

~ 100 ~ 99 Bromisoval Clf 86,4 93 95,8 88,4 92,1

72,9 7,30

1,1 95,8 22,81

Bromsalicylsäureisopropylamid

Clf 98,8 100,5 99 104 93,4

39,7 0 ~ 100 ~ 99 Buformin

Clf 0 5,8 3 1,6 6,2 5,8 0,06 Eto 2,8 31,7 0 0 0 0 0 31,7 0,46

Busulfan

Eto 14 14,2 14,3 16,5

14,4 12 13,8 16,5 0,20 Clf 100,7 98,5 101,6 99,7 101,6 ~ 100 ~ 99

Carbamazepin

Clf 106,8

106,7

105,2

103,6

107,7

107,9

108,6

~ 100 ~ 99 Eto 68,8 78,8 73,4 79,3

88,6 81,3 82,8 78 88,6 7,77

Clenbuterol

Eto 0,32,8 5,7 0,4 0 19,3 80,1

96,2 94,6 96,8 96,8 30,25 Clf 1,3 2,2 56,6

100,5

93,4

90,8 ~ 100 ~ 99 Clomethiazol

Eto 0,7 1,4 2,1

2,1 0,02 Clf 3,1 4,6 5,7 4,3 5,3 5,1 5,7 0,06 Eta 2,5 2,8 0 0 0 13,1 0 13,1 0,15

Clomipramin Clf 128 115,5

11 102,6

103 99,2 104 ~ 100 ~ 99 Eto 2,9 6,8 45,4 104,5

96,6 108,1

101,2

100,9 94,5 ~ 100 ~ 99 Clonazepam

Eto 60,8 95,2

94,6 96 102,2

96 5,6 ~ 100 ~ 99 Clf 102,4

103,1

107,2

104,6

37,5

~ 100 ~ 99 Coff a 2,4 0,02 Cytisin

Clf 0,07

0,05

7,7 10,9

24,2

62,1 64,9 75,4 75,4 3,07 2,1 3,6 3,8 3,8 0,04

EtA 6,1 0,06 Demoxepam

Eto 60,4

63,4 83,4 80 47,6 83,4 5,02

Clf 95 101,3 102,5

97,8 102,8

101,2

3,4

~ 100 ~ 99 Denaverin

Eto 64,4

34,2 60,5 97,4

97,5 85,1

85,2 79,1

97,5 39,00 Clf 107,2

111,1 100,6 109,1 103,7 ~ 100 ~ 99

Desipramin

Eto

4,9 2,5 5,3

37 89

111,1 120,6 ~ 100 ~ 99 Clf 94,3 106,9 61,6 113,7 115,5 106,7 110,6 ~ 100 ~ 99

Detajmium

Eto 3 3,2 1,4 0 11,3 19,1

68 62,2 63,3 68 2,13 Clf 2,2 46,4 69,3 68,5

69,3 2,26

Diacetyl-Sulfanilamid, N1, N4- Eto 14,7 15,8 13 7,1 7,1 5,4 0,1 0,8 15,8 0,19

3

ein Et 2,4

c 4,1 6,1

77,2 92,5

1,6

Eto

40

Fortsetzung von Tabelle 8 Verbindung LM 100R bei pH 100R KD

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Max

Clf 2 3 7 0,1 0 0,18 7 0,08 Eta 76,1 73,9 86,1 3,1 2 0 1,6 86,1 6,19

Diclofenac

Eto 83,9 99,7 94,9 97,2100,5

74,4

51,2 2,1 9,7 1,7 ~ 100 ~ 99 Clf 92,4 107

91,7 77,1 7 0,9 0,4 ~ 100 ~ 99

2,4-Dioxo-5,5-dimethyloxazolidin

Eto 42,4 66,1

70 81,5

54,2 58,1

20,2 0 7,7 3,9 81,5 4,41 Clf 15,6 24,5 28,4 1,2 0 28,4 0,40

Dipyridamol

Clf 11,1

92,9

99,2 100,3

100,4

99,2 ~ 99 Eto 0 27,7

41,6 69,1 67,8 72,2 65,8

72,2 2,60

Diuron

Eto 97,4 99,5

105,5

111,9 103,8

100,4

101 ~ 100 ~ 99 Clf 102,9

105,1

103 ~ 100 ~ 99 Ergometrin

Eta 104,3

100,4 75 ~ 100 ~ 99 Clf 2,8

1,8 6 100,5 110,8 ~ 100 ~ 99

Eto 7 4,5 11,5

11 8,9 33,40

24,8 33,4 0,50 Ergotamin

Clf 18,2

51,8 79,8 86,5 101,1

66,5 ~ 100 ~ 99 Eto 4,4 11,7 19,7 20,1 11,1 20,1 0,25 Eta 59,9 65,4 62,4 78,5 80,6 96,4

52,2

96,4 26,78

Ethosuximid

Eto 63,2

50,8 60 54,9 52,8

49,3 55,9

44,9 33,6

1,5 4,7

60 1,50 Clf 55,7 69,1 55,5 55,7 41,5 5,5

8,5 4 69,1 2,24

Etilefrin

Eto 4,82,8 3,8 5,82,2 1,3 0 2,5 5,4 4,6 5,8 0,06 Clf 0

2,2

1,2 1,7 1,2 5,9 4,5

5,9 0,06 Euparen Eto 73,7 48,8

49,8 48 44,3 73,7 2,80

Fenuron

Eto 47,9 51,1 57,8

65,2

55,3

57,6 65,2 1,87 Clf 98,2 93,4 101,7 ~ 100 ~ 99

Fominoben

Clf 81 104 100,1

101,8

98,5 ~ 100 ~ 99 Eto 0,8 6 41,4 85,4

78,7 79,8 87,4 80,6 96,3 98,6

94,8 98,6 70,43

Furosemid

Eto 70,3 68,7 86,7 85,7 18 5 0,4 0,4 86,7 6,52 Clf 7,4 11,8 8,5 8,5

5,2 0,6 2,9 11,8 0,13

Eta 84,3 116,2 104,1 82,4 5,5 9,5 ~ 100 ~ 99 Glibenclamid

Clf 113,2

110,4

104,9

106,2

99,8 27,6 8,2

~ 100 ~ 99 Eto 20,2 20,7 20 16,5 26,2

24,5 0 26,2 0,36

Guajacolglycerolether

Eto 26,5 31,8 32,6 30,8

23,1 21 32,6 0,48 Clf 61,7 69,1 70,9 67,2 60,9 70,9 2,44

41

Fortsetzung von Tabelle 8 Verbindung LM 100R bei pH 100R KD

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Max

Histapyrrodin

zol t 4,6

Clf 94,5 111,4 95,693,9 101,3 102,5 102,4

101,6 ~ 100 ~ 99 Eto 0 3,1 0 31 96,4 102,1 92,2 ~ 100 ~ 99

Homatropin

Clf 3,3 1,2 1,6 18,3 97,5 67 38,60 8,5 97,5 39,00 Eto 0 4,5 2,5 47,8 55,1 11,60

5,4 55,1 1,23

Hydrastin

Eto 0,3 1,6 38,9 103,2

100,6

102,1

98,9 ~ 100 ~ 99 Clf 77,6

108,9

100,9

102 ~ 100 ~ 99 Hydrastinin

Eto 1,4 3,8 11,4 57,10 62,8 62,8 1,69 Clf 2,9

5,8

95,40

91

95,4 20,74

4-Hydroxyphenazon

Eto 39,9 72,3 60,3

67,2

47,6 22,8

0 0,00

0 72,3 2,61 Clf 92,5 96,7

92,6 10,3 96,7 29,30

Kebuzon

Eto 45 38,1 5,5 6,4 5 45 0,82 Clf 93,3 56 99,1 96,4 16,2 99,1 ~ 99

MCPA

Eto 79,3 83 72,4 58,6

8,6 1,3 0,3 1,4 83 4,88 Clf 78,8 85 29,9

9,8 78,8 3,72

MCPB Clf 81,7 73,2 4,1 0 0 81,7 4,46 Eto 100,6 103

98,8 108,8 69,2

114,6 27,6 9,2 6,9 0,70

2,7 ~ 100 ~ 99

Meclozin

Eto 14,1 59,2

85,2 75,5 86 94,9

91 75,5 94,9 18,61 Clf 10,9 99,5 85,4 91,9 81,2

81 99,5 ~ 99

Medazepam

Eto 0,3 5,9

90,6 104,2 101,3

106 ~ 100 ~ 99 Clf 116,4

, 99 100,7

104

~ 100 ~ 99 Metami E a 2 24,6 0,33 Metoclopramid

Eto 0,5 1 1,2 3 47,7 95,7

97

90,3 95,7 22,26 Clf 1,5 8,8 2,5 3,9 13,6

74,7 93,8

96 95,5 96 24,00

α-Naphtyl-2,3-dihydroxypropylether

Clf 98,8 97,4 102,1 ~ 100 ~ 99 Eto 93,7 87,3 101,4 99,3 ~ 100 ~ 99

Naptalam Clf 57,2 47,3 34,1 6 5,3 4,1 57,2 1,34 Niclosamid

Clf 63,1 59,5 51 56,4 38,1 63,1 1,71 Eto 88,8 96,4 95,1 99,5

88,4 28 1,4 96,4 26,78

Nifedipin

Clf 103,6

95,2 96,2 103,1 97,1 ~ 100 ~ 99 Eto 85,9 96,4

91,8 96,4 100,7

100,4

92,5 97,5 96,9 ~ 100 ~ 99

Noxiptilin

Clf 119,3

115,3

98,1 96,8 100,2

99,6 101,2

~ 100 ~ 99 Eto 0,4 3 12,6 70,8 95,1 92 85,6 93,9 96 96 24

42

Fortsetzung von Tabelle 8 Verbindung LM 100R bei pH 100R KD

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Max

Osalmid

Clf 77,1 76,3

76,9 78,1

19,1 3,7 5,00 0,6 78,1 3,57 Eto 106 98,5 93,8 33,8

7,2 3,80

0,73

~ 100 ~ 99

Oxyphenbutazon

Eto 112,9 104,1

98,1

86,4 45 11,4 0 4,8 ~ 100 ~ 99 Clf 103,8 98,4 60,1

9,1 0,23

2,0 ~ 100 ~ 99

Pentoxyfyllin Clf 103,7 104,2 104 101,4

99,2 97,0

~ 100 ~ 99 Eto 8,6 17,8 23,05 25,2

27,6 30,2

15,6 16,8 8,8 30,2 0,43

Periciacin

Clf 87,5

53,2

87,1

86,2 104 109,3

105,2 106,1 ~ 100 ~ 99

Eto 1 4,5 34,8

90,4

102,8

109 108,9

103,0

102,0

~ 100 ~ 99 Phenazon Eta 1,5 0,6 1,5 0,02 Phenprocoumon

Clf 100,7 101,2

103,1

101,8 108,5 87,6 46,8 9,2 4,8 4,5 5,8 ~ 100 ~ 99 Eto 101,7 101,4

96,8

68,1

19,9 1,9 2,6 ~ 100 ~ 99 α-Phenyl-α-ethyl-glutaconimid

Eto 101,3 116,3 90,5 93 24,4

0,5 ~ 100 ~ 99 Clf 102 101,9 102,7 104 102,7

93,2 8,6 ~ 100 ~ 99

α-Phenylglutarimid

Clf 103,5

99,3 100,3

100,6

93,2 90 42,9 9,9 1,7 ~ 100 ~ 99 Eto 66,6 70,6 74,9 79,9 74,8 56,7 25,4

0,0 2,3 79,9 3,98

Phenylindandion

Clf 90,6

93,8

100,6

98,3 100,5

57,8

28,8 13,5

6,5

5,1

5,6 ~ 100 ~ 99 Eto 92,1

90,6 47,2 14,9 5 12,8

92,1 11,66

1-Phenyl-3-methylpyrazolon

Clf 78,4 95,5

105,7 97,9

95,4 96,4

68,9 10,7

0,9 2,4 ~ 100 ~ 99 Eto 59

90,6

80,8

96,8

14 0 13,5 96,8 30,25 Phenytoin

Eto 99,4

1,3 99,4 ~ 99 Clf 97,4

93,7

91 43,7

19 1,3 97,4 37,46

Promazin 3,1

63,1 63,1 1,71 Promethazinsulfoxid

Eto 0,9 1 0 4,5 39,2

35,2

39,6

46,9 52,0

57,6 57,6 1,36 Clf 4,1 2,3 82,7 88,1

85,6 88,1 7,40

Prometryn

Clf 112,7118,3 101,2 100,4

98,1 101,9 ~ 100 ~ 99 Eto 39,8 83,8

110,4

98,8 97 99,4

102,9 ~ 100 ~ 99

Propiverin

Clf 109 90,4 92,4 91,8 ~ 100 ~ 99 Eto 4,1 6,4 18 35 78,8 95,1

88,4 97,3

97,2 93,8

96,1

90,0

92,7 97,3 36,04 Propyphenazon

Clf 97 109 105,5 103,2 102,5 ~ 100 ~ 99 Eto 71,7 95

105,7

92,4 96,1 89,4

96 93,4 ~ 100 ~ 99

Pyritinol

Clf 0,1

0 0,1 7,3 15,5

17 2,8

0 0,0 17 0,20 Eto 1,6 1,8 0,8 4,6 2 3,2 4,6 0,05

43

Fortsetzung von Tabelle 8 Verbindung LM 100R bei pH 100R KD

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Max

Eta 0

14 25,8

12,2 11,3

10,8 2,9 4,7 25,8 0,35 Rubazon-Säure

Eto 114 99,8 92 30,7 12,2 ~ 100 ~ 99 Clf 111,1 99,8 104,1

104,5

97,8

73,5

0,0

~ 100 ~ 99 Sulfadimethoxin

Eto 64,2 90,2

94,9 94,4 95,9

93,3

41,1 2,3 0,2 95,9 23,39 Clf 83 99,6

104,2

69,4

14,5

2,5 0,97 1,9 ~ 100 ~ 99 Sulfaethidol

Eto 20,4 0 0,0 20,4 0,26 Clf 15,2 84,4 1,3 1,0 84,4 5,41 Eta 49,9 94,4

0 0,0 94,4 16,86

Sulfamerazin

Eto 2,6 3,7 2,6 3,7 0,04 Clf 6,8 30,2 71,1 70 63,3 35,6 5,9 8,2 71,1 2,46

Sulfamethoxazol

Eto 51,7 85,4 90,4 90 97,4 63,4 14,2 1,2

0,3

1,7 90,4 9,42 Clf 31,3 62,1 78,9 81,2 71,5 35,4 3,2 0 0 1,8 81,2 4,32

Sulfatolamid

Eto 40,9

24,2 37,6 36,3 9,7

1,4 0 40,9 0,69 Clf 1,9 4,8 1,9 1,2 2,2 0 0,0 4,8 0,05 Eta 46,9

41 12,8 9,9 9,5 46,9 0,88

Talindol

Clf 4,6 12,3

31,1

93,4

104,8

108 99,6 ~ 100 ~ 99 Eto 2,2 0,7 1,4 6,9

58,9

91,3

95,8

95,0 95,8 22,81 Thioridazin

Eto 12,7

6,9 24,2

10,7

51,7

96,5

96,5 91 84,8 96,5 27,57 Clf 123,3 103 98,7 99,9 ~ 100 ~ 99

Triamteren

Clf 0,6 1 9,6 9,5 6,3 8,6 9,6 0,11 Eto 3,6 1,4 3,2 0,25 6,3 5,4 6,3 0,07

Trimethoprim

Eto 3,2

5 5,3 11

11,9 11,4 11,9 0,14 Clf 0 2 16,7 48,4

92,8 101,6 100,0 ~ 100 ~ 99

Trimipramin

Clf 116,3

93,1 11,7 93,9

101,8

~ 100 ~ 99 Eto 4,1 9,4 31,4

66,2 96,2

96,1

84,8

87,2

76,2 96,2 25,32 Trioxopiperidin-Natrium

Eto 0 0,9 0 0,0 0,9 0,01 Clf 5,6 5,2 10,2

9,6 9 6,3 4,6 10,2 0,11

iso-Valerianylharnstoff

Clf 52,9 64,4 70,9 66,1 54,8

2,7 70,9 2,44 Eto 45,9 61,5

57,8 57,2

53,8

11,5 61,5 1,60

Verapamil

Clf 105,7

92,2

94,6 ~ 100 ~ 99 Eto 0 2,8 14,1 7,9 29,8 77,9 85 92,8 96 96,0 96 24

Abkürzungen: 100R-Extraktionsausbeute in der org. Phase; Berechnung S. 36, KD-Verteilungskonstante, LM-Lösungsmittel, Eto-Ether, Clf-Chloroform, Eta-Ethylacetat

44

3.4 Auswertung

Es wurden die Verteilungsquotienten und pH-Abhängigkeit von 91 toxikologisch relevanten

Wirkstoffen im Zweiphasensystem wässrige Pufferlösung / nichtwassermischbares

Lösungsmittel bestimmt (siehe auch Tabelle 8).

Als Lösungsmittel kamen Ether und Chloroform zum Einsatz, in einigen Fällen wurde bei

ungenügender Extraktionsausbeute zusätzlich noch mit dem wesentlich polareren Ethylacetat

gearbeitet. Einen Überblick über die Höhe der Extraktionsausbeute in Abhängigkeit vom

verwendeten Lösungsmittel verschafft Tabelle 9. Es wurden nur die Werte der maximalen

Extraktionsausbeute (100R-Max) einbezogen.

Tabelle 9: Lösungsmittelvergleich unter Einordnung der Wirkstoffe (100R-Max) in den

dargestellten Extraktionsbereichen

Lösungsmittel n Bereich der Höhe der Extraktionsausbeute 100R (von – bis)

80 – 100 Prozent 60 – 80 Prozent 40 – 60 Prozent > 40 Prozent

Chloroform 87 60 (69%) 11 (13%) 4 (5%) 12 (13%)

Ether 83 47 (57%) 9 (11%) 5 (6%) 22 (26%)

Ethylacetat 14 6 (43%) 1 (7%) 1 (7%) 6 (43%) Tabelle 9

Eine sehr gute Extraktionsausbeute (100R 80) wurde mit dem Lösungsmittel Chloroform

bei 69% und mit Ether bei 57% der Stoffe erzielt. Bei einer ausreichenden Ausbeute (100R

60) konnten sogar 82% der Substanzen mit Chloroform und 68% mit Ether isoliert

werden.

≥

≥

Insgesamt konnten mit Chloroform höhere Extraktionsausbeuten als mit Ether ermittelt

werden. Außerdem ist die Anzahl der schlecht isolierbaren Wirkstoffe (100R ≤ 40; entspricht

40 Prozent) geringer. Ethylacetat wurde zusätzlich bei 14 Wirkstoffen eingesetzt, bei denen

eine unzureichende Isolierung mit Chloroform oder Ether festgestellt wurde. Ethylacetat ist

im Gegensatz zu Chloroform und Ether polarer und konnte in vielen Fällen die

Extraktionsausbeute noch steigern. Bei 50% der Stoffe konnten sogar ausreichende

Extraktionsausbeuten erzielt werden.

45

Im Anhang sind die Extraktionsausbeuten (100R) in Abhängigkeit vom pH-Wert für 87

Wirkstoffe graphisch dargestellt. Dafür wurde das Statistikprogramm SPSS verwendet. Die

Stoffe sind jeweils in einem High-Low-Diagramm dargestellt, welches die Streuung um die

Mittelwerte (Mittelwert Standardabweichung) berücksichtigt. ±

Diese Wirkstoffe wurden in 4 Gruppen eingeteilt:

1. Saure Verbindungen (39)

2. Neutrale Verbindungen (12)

3. Amphotere Verbindungen (5)

4. Basische Verbindungen (31)

Im Allgemeinen gelangen nur die undissoziierten Verbindungen messbar in die organische

Phase (seltene Ausnahme: Ionenpaarextraktion). Da die meisten organischen Arzneimittel

oder Gifte zur elektolytischen Dissoziation fähig sind, kann die Verteilung durch eine

Veränderung des pH-Wertes zu Gunsten der organischen Phase verschoben werden, die damit

letztendlich zu einer erhöhten Extraktionsausbeute führt. Aus diesem Grund wird bei sauren

Verbindungen das biologische Material angesäuert (pH <7), während bei organischen Basen

dieses alkalisiert wird (pH >7). Für neutrale Wirkstoffe ist der pH-Wert von geringem

Einfluss (Müller, 1991). Amphotere Verbindungen besitzen eine oder mehrere basische bzw.

saure Gruppen im Molekül.

Auf den folgenden Seiten sind Übersichtsdiagramme von Substanzbeispielen aufgeführt, die

grundsätzlich das Extraktionsverhalten der vier verschiedenen Gruppen deutlich machen

sollen.

46

3.4.1 Saure Verbindungen

Relevante saure Verbindungen in der klinischen und forensischen Toxikologie sind z.B.

Barbiturate (Aprobarbital, Barbital), nichtsteroidale Antiphlogistika (Diclofenac), Coumarine

(Phenprocoumon) und Diuretika (Furosemid).

Überblick: Saure Verbindungen - LM Chloroform

Überblick: Saure Verbindungen – LM Ether

Überblick: Saure Verbindungen – LM Chloroform

Überblick: Saure Verbindungen – LM Ether

47

3.4.2 Neutrale Verbindungen

Neutrale Verbindungen zeigen über den gesamten pH-Bereich kaum eine Veränderung der

Verteilungskonstanten. Relevante neutrale Verbindungen in der klinischen und forensischen

Toxikologie sind z.B. die Herbizide Fenuron und Diuron und das Antiepileptikum

Carbamazepin.

Überblick: Neutrale Verbindungen – LM Ether

Neutrale Verbindungen – LM Chloroform

48

3.4.3 Amphotere Verbindungen

Relevante amphotere Verbindungen in der klinischen und forensischen Toxikologie sind z.B.

das Parasymphatolytika Homatropin (ein halbsynthetisches Derivat des Atropins, in welchem

der Tropasäure-Anteil durch racemische Mandelsäure ersetzt ist), das Antibiotikum

Sulfamerazin (Sulfanilamid-Derivat mit Sechsringheterocyclus) und das N(4)-Acetyl-Derivat

des Sulfaisomerins, welches wegen der schlechteren Wasserlöslichkeit im Vergleich zum

unveränderten Wirkstoff Nierenschäden durch kristalline Ablagerungen hervorrufen kann.

Amphotere Verbindungen – LM Ether

Amphotere Verbindungen – LM Chloroform

49

3.4.4 Basische Verbindungen

Viele toxikologisch relevanten Verbindungen sind organische Basen. Bedeutend für die STA

sind z.B. Antidepressiva (Desipramin, Trimipramin, Clomipramin), Benzodiazepine

(Medazepam), Hypnotika (Clomethiazol), Mutterkornalkaloide (Ergotamin, Ergometrin),

Morphin, Codein und Cocain.

Basische Verbindungen – LM Ether

Basische Verbindungen – LM Chloroform

50

3.5 Diskussion

Die Verteilungsausbeuten wurden im proteinfreien wässrigen Puffermedium ermittelt. In der

Praxis wird die Extraktion des biologischen Materials durch verschiedene Parameter

beeinflusst. So können z.B. Proteine die Extraktionsausbeuten vermindern. Daher stellen die

ermittelten Ausbeuten meist Maximalwerte dar.

Ein Vergleich zur Extraktionsmethode mit Chlorbutan (siehe Teil 1: Extraktion von toxisch

relevanten Stoffen mit Chlorbutan bei pH 9) kann bei dem folgenden Beispiel aufgezeigt

werden: Es wurden die Extraktionsausbeten der Arzneimittel Bisacodyl, Glibenclamid und

Nifedipin für das Lösungsmittel Chlorbutan im ersten Teil dieser Arbeit ermittelt und für

Chloroform bzw. Ether im zweiten Teil ausgewertet. Bei der Gegenüberstellung wird

deutlich, dass Bisacodyl und Glibenclamid mit Chlorbutan nicht ausreichend isolierbar sind,

dafür aber sehr gut mit Chloroform. Der Calciumblocker Nifedipin geht bei allen drei

Lösungsmitteln sehr gut in die organische Phase über.

Extraktionsausbeute 100R bei pH 9 Arzneimittel

Chloroform Ether Chlorbutan

Bisacodyl 100 48

Glibenclamid 100 26 7

Nifedipin 100 93 100 Tabelle 10

Während Ende der 80er und Anfang der 90er Jahre in der STA oft Chloroform oder

Diethylether als Extraktionsmittel verwendet wurden, wird man heute vor allem

Lösungsmittel wie Dichlormethan, Chlorbutan, Propan, Hexan, Ethylacetat oder Toluol

einzeln oder im Gemisch vorfinden. Damals waren zusätzlich die niedrigen Siedepunkte der

Lösungsmittel Chloroform und Ether vom Vorteil, um die Extraktionsparameter zu

bestimmen.

Es können zwar gute Extraktionsergebnisse mit Chloroform und Ether erzielt werden, aber

der Umgang (Einatmen, Hautkontakt) mit diesen Lösungsmitteln kann zu einer

Beeinträchtigung des Wohlbefindens und zu einer Schädigung der Gesundheit führen. Aus

diesem Grund werden diese Extraktionsmittel heute nur noch selten eingesetzt. Einatmen von

Chloroformdämpfe führt z.B. zu Erregungszuständen, denen sich Empfindungslosigkeit,

Bewusstlosigkeit und tiefe Narkose anschließen. Weitere Chloroformaufnahme verursacht

51

Atemlähmung. Schnelle Zufuhr konzentrierter Dämpfe kann schon nach wenigen Atemzügen

zu Herzkammerflimmern und Herztod führen. Ferner ist Chloroform in der Kategorie 4

(krebserzeugender Arbeitsstoff, nicht-linearen Dosis-Wirkungs-Beziehung, Vorhandensein

einer Wirkungsschwelle) eingestuft (MAK- und BAT-Werte-Liste 2003). Zellschädigende

Effekte sind wahrscheinlich für die Entstehung der im Tierversuch nachgewiesenen Tumore

verantwortlich. Die zellschädigenden Effekte lassen sich aufgrund der Umsetzung von

Chloroform zu reaktiven Stoffwechselprodukten erklären (MAK- und BAT-Werte-Liste

1999).

Ethylacetat wird auch heute noch oft eingesetzt, meistens im Gemisch mit anderen

Lösungsmittels.

Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über Flüssig-Flüssig-Extraktionsverfahren in der

Systemtischen Toxischen Analyse.

Referenz Extraktionsbedingungen Zusätzliche Informationen

Müller et al. 1982 / 1983

Extraktion mit Chloroform, Ether und teilweise Ethylacetat bei pH 3-11 (1-13)

Ermittlung der Verteilungsquotienten und deren pH-Abhängigkeit von über 300 Substanzen (überwiegend Arzneimittelwirkstoffe)

Cox et al. 1989

Bicarbonatpuffer, Extraktion mit Butylacetat

Blut; Wiederfindung: Amitriptylin 73%, Cocain 74% Codein 70%, Diazepam 82%

Drummer et al. 1990

Fällung mit Acetonitril Blut, HPLC/DAD

Franke et al. 1990

Ultraschallbad, Extrelutextraktion mit Dichlormethan bzw. Chloroform

Organe, TLC

Sims et al. 1991

Ammoniaklösung, Extraktion mit Diethylether

Blut; Wiederfindung: Amitriptylin 86%, Diazepam 92%, Thioridazin 70%

Puopolo et al. 1991

Bicarbonat, Extraktion mit Hexan Plasma, Wiederfindung: Amitriptylin 90%, Thioridazin 90%, Propoxyphen 86%

Koves et al. 1992

Ammoniak, Extraktion mit Toluol Reextraktion in mehreren Schritten bei wechselnden pH

Blut; Wiederfindung: Codein79%, Diazepam 84%, Haloperidol 80%, Propanolol 83%

Drummer et al. 1993

Extraktion mit Acetonitril Blut; Wiederfindung: Paracetamol 75%, Salicylsäure 100%, Carbamazepin 90%, Diazepam 50%

52

Drummer et al. 1994

Tris-Puffer pH 9,2, Extraktion mit n-Butylchlorid

Blut; Wiederfindung: Amphetamin 67%, Pentobarbital 18%, Promethazin 90 %

Tracqui et al. 1995

Ammoniumchlorid pH 9,5 Extraktion mit Chloroform/ Propan-2-ol / Heptan (60 :14.26)

Blut, Wiederfindung : Benzodiazepine, Barbiturate, Antidepressiva, Opiate und Neuroleptika über 60%

Kalasinsky et al. 1995

KCl und Phosphatpuffer pH 8, Extraktion mit Butanol / Ethylacetat (1:5)

Blut, Gewebe, Urin ; REMEDi HS (Bio-Rad)

Lambert et al. 1995

1 M K2CO3, Extraktion mit 1-Hexan / Ethylacetat (7:3)

Blut, Urin ; über 130 v.a. basische Drogen detektierbar, aber nicht Morphin

Lillsunde et al. 1996

Saure Verb. : Extraktion mit NaH2PO4-Puffer und Toluol / Ethylacetat (4:1) Bas. Verb.: Extraktion mit Dichlormethan / Toluol (1:9)

Blut; Wiederfindung: Codein 92%, Morphin 66%, Cocain 81%, Benzoylecgonin 84%

Lo et al. 1997

NH4Cl, Extraktion mit Ethylacetat

Blut, Detektion von sauren und neutralen Subsanzen z.B. Analgetika, Barbiturate, Theophyllin

Elliot et al. 1998

Bas. Verb.: Na2CO3, Extraktion mit Butylchlorid und Rückextraktion mit 0,1 M H2SO4 Saure Verb.: H2SO4, Extraktion mit Chloroform

Blut, Plasma, Urin Bibliothek mit über 250 Verbindungen, schnelles HPLC-Screening

Brau et al. 1998

Pufferzugabe, Extraktion mit Dichlorethan / Dichlormethan / Heptan / i-Propanol (96:52:132:20)

Serum, HPLC-DAD

Weinmann et al. 1998

Puffer, Extraktion mit Ethylacetat/ Butylchlorid/ t-Butylmethylether

Serum, HPLC-DAD GC-MS

Pfleger et al. 2000

gesättigte Na2SO4, Extraktion mit Ether/ Ethylacetat (1:1), eindampfen, aufnehmen in Methanol

Plasma, Mageninhalt GC-MS

Boone et al. 2001

Acetonitril (Serum), 2M HCl bzw. 2M NaOH, Extraktion mit Dichormethan

Serum, Urin Kapillarelektropherese

Pragst et al. 2003

ACN und Puffer (Tris-Puffer pH 9 oder Phosphatpuffer pH 2,3,), vortexen, eindampfen, aufnehmen in mobiler Phase

Blut, Serum, Plasma HPLC-DAD

Tabelle 11

53

3.6 Zusammenfassung

Es wurden die Verteilungsquotienten und deren pH-Abhängigkeit von über 90 Verbindungen

(vorwiegend Arzneimittelwirkstoffe) ausgewertet.

Für die Lösungsmittel Chloroform und Diethylether, und teilweise auch für Ethylacetat,

liegen jetzt die Extraktionsausbeuten (pH 1 bis 13) von über 300 organische Verbindungen

vor (siehe auch Müller et al. 1982 / 1983). Für jede dieser Verbindung kann nun im Rahmen

eines Extraktionsverfahren festgestellt werden, ob sie bei einem bestimmten pH – Wert

befriedigend isoliert werden kann oder nicht.

Mit der genauen Kenntnis der maximalen Extrahierbarkeit und dem entsprechenden pH-

Bereich ist es auch möglich, das Extraktionsverfahren aus wässriger Phase zu optimieren.

Z.B. können die Ergebnisse für spezielle toxikologische Untersuchungen eines Stoffes

hilfreich sein. Außerdem lassen sich Verbindungen, die sich gut mit Chloroform oder Ether

extrahieren lassen, voraussichtlich auch ausreichend mit anderen, ähnlich lipophilen

Lösungsmitteln (z.B. Dichlormethan) isolieren. Das Gleiche gilt auch für Ethylacetat, welches

als relativ polares Lösungsmittel eingesetzt wurde, um schwer extrahierbare Verbindungen zu

untersuchen. Aus den Ergebnissen können damit Rückschlüsse auf die Eignung anderer

Lösungsmittel abgeleitet werden.

54

3.7 Experimenteller Teil

Durchführung:

(entnommen aus Müller RK., 1982, Die Pharmazie 37)

Die Verteilungsgleichgewichte wurden in Form von Serienmessungen in speziellen

Reagenzgläsern mit Schliffstopfen ermittelt. Nach der Einwaage der Substanzen ( 20 mg) in

diese Reagenzgläser wurden gleiche Volumina (bei den verschiedenen Messserien zwischen 5

und 25 ml) der wässrigen Pufferlösung (Zusammensetzung s.?) und des organischen

Lösungsmittels einpipettiert.

≈

Die Reagenzgläser wurden dann auf einer Schüttelmaschine (Frequenz 4 s-1 in waagerechter

oder schräger Lage) 10 Minuten geschüttelt. Diese Schüttelzeit war in Vorversuchen für eine

ausreichende Gleichgewichtseinstellung ermittelt wurden.

Unter Beachtung einer sauberen Phasentrennung wurden aliquote Teile der organischen Phase

in Wägegläschen abpipettiert und das Lösungsmittel auf temperierbaren Wärmeplatten bei

Temperaturen unterhalb des Siedepunktes verdampft.

Bei flüchtigen Basen wurden vorher durch Hinzufügen von HCl (1 Tropfen konz. Salzsäure)

die Hydrochloride gebildet.

Die Rückstände wurden nach Trocknen über P4O10 gewogen. Aus den ermittelten Werten des

Abdampfrückstandes und der Extrakt-Aliquote ιV konnte die Extraktionsausbeute

100R berechnet werden.

ιOHAQ )( O

Die Werte für die Extraktionsausbeuten 100R und Verteilungskonstanten KD (Berechnung S.

36) wurden aus 2 bis 10 (meist 5) Messungen einzelner Verteilungsgleichgewichte

arithmetisch gemittelt.

Die Analysenfehler für 100R und KD sind von der Größenordnung des Verteilungsquotienten

abhängig:

im Bereich 0,1 < KD < 10 ist RR∆≤ 0,04

55

kleinere und größere Werte für KD konnten (zumindest gravimetrisch) weniger genau

bestimmt werden

Bei den eingesetzten niedrigen Konzentrationen der Verbindungen (etwa 0,02 bis 0,1 mol)

waren die Verteilungsquotienten konzentrationsunabhängig. Die Pufferkapazität betrug

zwischen 0,5 bis 0,8 Mol. Dadurch änderte sich der pH-Wert nach Substanzeinwaage und

Verteilung kaum.

Zusammensetzung der verwendeten Pufferlösung:

pH 1: HCl (0,2 mol/l)

pH 2: Glykokoll 19,513 g; NaCl 15,210 g; HCl (1 mol/l) 240 ml

pH 3: Glykokoll 30,770 g; NaCl 23,985 g; HCl (1 mol/l) 90 ml

pH 4: Citronensäure 32,274 g; Na2HPO4 x 2H2O 34,329 g

pH 5: Citronensäure 25,472 g; Na2HPO4 x 2H2O 45,861 g

pH 6: KH2PO4 59,914 g; Na2HPO4 x 2H2O 10,688 g

pH 7: KH2PO4 26,553 g; Na2HPO4 x 2H2O 54,333 g

pH 8: KH2PO4 3,745 g; Na2HPO4 x 2H2O 84,171 g

pH 9: Glykokoll 33,397 g; NaCl 26,032 g, NaOH (1 mol/l) 55 ml

pH 10: Glykokoll 23,453 g; NaCl 18,281 g, NaOH (1 mol/l) 187,5 ml

pH 11: Glykokoll 19,325 g; NaCl 15,064 g, NaOH (1 mol/l) 242,5 ml

pH 12: Glykokoll 17,262 g; NaCl 13,455g, NaOH (1 mol/l) 270 ml

pH 13: Glykokoll 2,814 g; NaCl 2,194 g; NaOH (1 mol/l) 462,5 ml

56

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konstante, Phasenverhältnis und Stufenzahl; (Ergebnisse für neutrale Verbindungen). Die

Pharmazie 38, H. 7, 462 - 466.

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65

66

5 Anhang

5.1 Abkürzungsverzeichnis AAS Atomabsorptionsspektrometrie

α Extinktion der wässrigen Phase nach der Extraktion

AO Ausbeute in der organischen Phase

BAT Biologischer Arbeitsstoff - Toleranzwert

CE Kapillarelektrophorese

CL Konzentration in der Lipidphase [mol/l]

Clf Chloroform

CW Konzentration in der Wasserphase [mol/l]

DAD (Photo-)Diodenarraydetektion/-detektor

DC pH-abhängige (scheinbare) Verteilungskonstante

Eto Diethylether

Eta Ethylacetat vwE Extinktion der wässrige Phase vor der Extraktion

nwE Extinktion der wässrige Phase nach der Extraktion

noE Extinktion der organischen Phase nach Extraktion

GC Gaschromatographie

GC-MS Gaschromatographie mit massensensitivem Detektor

GTFCh Gesellschaft für Toxikologische und Forensische Chemie

HCl Salzsäure

HPLC Hochleistungsflüssigchromatographie

HPLC-DAD Hochleistungsflüssigchromatographie mit Photodiodenarraydetektion

HS-GC Headspace-Gaschromatographie

H2SO4 Schwefelsäure

KCl Kaliumchlorid

K2CO3 Kaliumcarbonat

KD Verteilungskonstante (pH-unabhängig)

KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat

LC Flüssigchromatographie (liquid chromatography)

LC-MS Flüssigchromatographie mit massensensitiver Detektion

67

LLE Flüssig-Flüssig-Extraktion (Liquid Liquid Extraction)

LM Lösungsmittel

MAK Maximale Arbeitsplatz - Konzentration

MeOH Methanol

MPPH 5-(p-Methylphenyl)-5-phenylhydantoin

MS Massensensitive(r) Detektion/Detektor

NaCl Natriumchlorid

Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat

NaH2PO4 Natriumdihydrogenphosphat

NaOH Natronlauge

Na2SO4 Natriumsulfat

NH4Cl Ammoniumchlorid

pH Negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration

pKa Negativer dekadischer Logarithmus der Säuredissoziationskonstanten

R Extraktionsausbeute in der organischen Phase

100R Extraktionsausbeute (in Prozent)

RP Umkehrphase (Reversed Phase)

s Standardabweichung

SPE Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction)

SPME Festphasenmikroextrakiton

SPSS Statistical Package for the Social Sciences (Statistiksoftware)

STA Systematische Toxikologische Analyse

TLC Dünnschichtchromatographie (Thin Layer Chromatography)

UV Ultraviolett(er Teil des elektromagnetischen Spektrums), UV-Spektroskopie

VIS Sichtbares Licht (Visible Light)

VK Verteilungskoeffizient

WF Wiederfindung(srate)

68

5.2 Saure Verbindungen

Zeichenerklärung: Clf: Chloroform, Eta: Ethylacetat, Eto: Ether

100R: Extraktionsausbeute in der organischen Phase (entspricht Prozent)

Acetylsalicylsäure

Clf: 100R – Max bei pH 3 (97,5 %)

Acetyl-Sulfafurazol

Clf: 100R – Max bei pH 5 (41,7 %) Eto: 100R – Max bei pH 4 (31,1 %)

Acetyl-Sulfamerazin, N4-

Clf: 100R – Max bei pH 2 (44,5 %) Eto: 100R – Max bei pH 5 (21,4 %)

Allobarbital

Clf: 100R – Max bei pH 5 (77,6 %) Eto: 100R – Max bei pH 5 (98,6 %)

69

Allylethylbarbitursäure

Clf: 100R – Max bei pH 7 (70,0 %) Eto: 100R – Max bei pH 3 (97,0 %)

Amobarbital

Clf: 100R – Max bei pH 7 (104,4 %) Eto: 100R – Max bei pH 3 (102,3 %)

Aprobarbital

Clf: 100R – Max bei pH 1 (93,2 %)

Azidamphenicol

Eto: 100R – Max bei pH 3 (46,4 %)

70

Barbital

Clf: 100R – Max bei pH 7 (53,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 1 (81,0 %) Eta: 100R – Max bei pH 3 (88,5 %)

Benzylhydrogenphthalat

Clf: 100R – Max bei pH 3 (100 %)

Bromisoval

Clf: 100R – Max bei pH 7 (95,8 %)

Bromsalicylsäureisopropylamid

Clf: 100R – Max bei pH 7 (104 %)

71

Clonazepam

Clf: 100R – Max bei pH 5 (107,2 %) Eto: 100R – Max bei pH 7 (102,2 %)

Demoxepam

Clf: 100R – Max bei pH 9 (102,8 %) Eto: 100R – Max bei pH 7 (83,4 %)

Diacetyl-Sulfanilamid, N1, N4-

Clf: 100R – Max bei pH 5 (7 %) Eto: 100R – Max bei pH 3 (15,8 %)

Eta: 100R – Max bei pH 5 (86,1 %)

Diclofenac

Clf: 100R – Max bei pH 3 (107 %) Eto: 100R – Max bei pH 6 (100,5 %)

72

2,4-Dioxo-5,5-dimethyloxazolidin

Clf: 100R – Max bei pH 5 (28,4 %)Eto: 100R – Max bei pH 4 (81,5 %)

Ethosuximid

Clf: 100R – Max bei pH 3 (69,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 2 (63,2 %)

Euparen

Clf: 100R – Max bei pH 3 (73,7 %)

Furosemid

Clf: 100R – Max bei pH 3 (11,8 %) Eto: 100R – Max bei pH 5 (86,7 %) Eta: 100R – Max bei pH 3 (116,2%)

73

Glibenclamid

Clf: 100R – Max bei pH 1 (113,2 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 (26,2 %)

4-Hydroxyphenazon

Clf: 100R – Max bei pH 3 (96,7 %) Eto: 100R – Max bei pH 3 (72,3 %)

Kebuzon

Clf: 100R – Max bei pH 5 (99,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 1 (45 %)

MCPA

Clf: 100R – Max bei pH 3 (85 %) Eto: 100R – Max bei pH 3 (83 %)

74

MCPB

Clf: 100R – Max bei pH 1 (81,7 %) Eto: 100R – Max bei pH 7 (114,6 %)

Naptalam

Niclosamid

Clf: 100R – Max bei pH 1 (63,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 7 (99,5 %)

Osalmid

Eto: 100R – Max bei pH 1 (106 %)

Clf: 100R – Max bei pH 1 (57,2 %)

Clf: 100R – Max bei pH 7 (78,1 %)

75

Oxyphenbutazon

Eto: 100R – Max bei pH 3 (112,9 %)

Phenprocoumon

Clf: 100R – Max bei pH 7 (108,5 %) Eto: 100R – Max bei pH 1 (101,7 %)

α-Phenyl-α-ethyl-glutaconimid

Clf: 100R – Max bei pH 7 (104 %) Eto: 100R – Max bei pH 3 (116,3 %)

α-Phenylglutarimid

Clf: 100R – Max bei pH 1 (103,5 %) Eto: 100R – Max bei pH 7 (79,9 %)

Clf: 100R – Max bei pH 3 (103,8 %)

76

Phenylindandion

Clf: 100R – Max bei pH 5 (100,6 %) Eto: 100R – Max bei pH 5 (92,1 %)

1-Phenyl-3-methylpyrazolon

Clf: 100R – Max bei pH 3 (105,7 %) Eto: 100R – Max bei pH 7 (6,8 %)

Phenytoin

Clf: 100R – Max bei pH 1 (97,4 %) Eto: 100R – Max bei pH 2 (99,4 %)

Rubazonsäure

Clf: 100R – Max bei pH 1 (111,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 3 (114 %)

77

Sulfadimethoxin

Clf: 100R – Max bei pH 5 (104,2 %) Eto: 100R – Max bei pH 6 (95,9 %)

Sulfamethoxazol

Clf: 100R – Max bei pH 5 (81,2 %) Eto: 100R – Max bei pH 6 (97,4 %)

Iso-Valerianylharnstoff

Eto: 100R – Max bei pH 3.(61,5 %)

Clf: 100R – Max bei pH 9 (70,9 %)

78

5.3 Neutrale Verbindungen

Bisacodyl

Clf: 100R – Max bei pH 7 (102,9 %)

Busulfan

Clf: 100R – Max bei pH 5/13 (101,6 %) Eto: 100R – Max bei pH 7 (16,5 %)

Carbamazepin

Diuron

Clf: 100R – Max bei pH 7 (105,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 7 (111,9 %)

Clf: 100R – Max bei pH 13 (108,6 %) Eto: 100R – Max bei pH 7 (88,6 %)

79

Fenuron

Guajacolglycerolether

Clf: 100R – Max bei pH 5 (70,9 %) Eto: 100R – Max bei pH 5 (32,6 %)

α-Naphtyl-2,3-dihydroxypropylether

Clf: 100R – Max bei pH 13 (102,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 11 (101,4 %)

Nifedipin

Clf: 100R – Max bei pH 1 (103,6 %) Eto: 100R – Max bei pH 5 (100,7 %)

Clf: 100R – Max bei pH 13 (101,7 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 (65,2 %)

80

Pentoxyphyllin

Clf: 100R – Max bei pH 3 (104,2 %) Eto: 100R – Max bei pH 8 (30,2 %)

Propyphenazon

Clf: 100R – Max bei pH 5 (109 %) Eto: 100R – Max bei pH 83 (105,7 %)

Triamteren

Clf: 100R – Max bei pH 7 (9,6 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 (6,3 %)

Trioxopiperidin-Natrium

Clf: 100R – Max bei pH 7 (10,2 %) Eto: 100R – Max bei pH 5 (0,9 %)

81

5.4 Amphotere Verbindungen

Acetyl-Sulfisomidin, N4-

Clf: 100R – Max bei pH 7 (21,8 %) Eto: 100R – Max bei pH 5 (24,6 %)

Buformin

Clf: 100R – Max bei pH 13 (6,2 %) Eto: 100R – Max bei pH 3 (31,7 %)

Homatropin

Clf: 100R – Max bei pH 9 (97,5 %) Eto: 100R – Max bei pH 11 (55,1 %)

Pyritinol

Clf: 100R – Max bei pH 9 (17 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 (4,6 %)

Eta: 100R – Max bei pH 4 (25,8%)

82

Sulfamerazin

Clf: 100R – Max bei pH 3 (71,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 (3,7 %)

83

5.5 Basische Verbindungen

Eto: 100R – Max bei pH 11 (1,0 %)

Biperiden

Clf: 100R – Max bei pH 3 (113,9 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 (104,2 %)

Bromhexin

Clf: 100R – Max bei pH 1 (112,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 4 (103,3 %)

Clenbuterol

Clf: 100R – Max bei pH 9 (100,5 %) Eto: 100R – Max bei pH 13 (96,8 %)

Allopurinol

84

Clomethiazol

Clf: 100R – Max bei pH 5 (5,7 %) Eto: 100R – Max bei pH 13 (2,1 %) Eta: 100R – Max bei pH 11 (13,1 %)

Clomipramin

Clf: 100R – Max bei pH 1 (128 %) Eto: 100R – Max bei pH 8 (108,1 %)

Cytisin

Clf: 100R – Max bei pH 13 (75,4 %) Eto: 100R – Max bei pH 13 (3,8 %) Eta: 100R – Max bei pH 13 (6,1 %)

Denaverin

Clf: 100R – Max bei pH 3 (111,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 5 (97,5 %)

85

Clf: 100R – Max bei pH 9 (115,5 %) Eto: 100R – Max bei pH 13 (120,6 %)

Detajmium

Clf: 100R – Max bei pH 11 (69,3 %) Eto: 100R – Max bei pH 13 (63,3 %)

Dipyridamol

Clf: 100R – Max bei pH 13 (100,4 %) Eto: 100R – Max bei pH 11 (72,2 %)

Ergometrin

Clf: 100R – Max bei pH 11 (110,8 %) Eto: 100R – Max bei pH 12 (40 %) Eta: 100R – Max bei pH 9 (104,3%)

Desipramin

86

Ergotamin

Clf: 100R – Max bei pH 11 (101,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 (20,1 %) Eta: 100R – Max bei pH 11 (9,4%)

Etilefrin

Clf: 100R – Max bei pH 11 (5,9 %)

Clf: 100R – Max bei pH 3 (104 %) Eto: 100R – Max bei pH 11 (98,6 %)

Histpyrrodin

Clf: 100R – Max bei pH 3 (111,4 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 (102,1 %)

Eto: 100R – Max bei pH 6 (5,8 %)

Fominoben

87

Clf: 100R – Max bei pH 3 (108,9 %) Clf: 100R – Max bei pH 12 (95,4 %) Eto: 100R – Max bei pH 13 (62,8 %)

Meclozin

Clf: 100R – Max bei pH 3 (99,5 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 (94,9 %)

Medazepam

Clf: 100R – Max bei pH 1 (116,4 %) Eto: 100R – Max bei pH 13 (106 %)

Hydrastin

Eto: 100R – Max bei pH 7 (103,2 %)

Hydrastinin

88

Metoclopramid

Clf: 100R – Max bei pH 9 (96 %) Eto: 100R – Max bei pH 11 (97 %)

Noxiptilin

Clf: 100R – Max bei pH 1 (119,3 %) Eto: 100R – Max bei pH 13 (96 %)

Periciacin

Clf: 100R – Max bei pH 9 (109,3 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 (109 %)

Promethazinsulfoxid

Clf: 100R – Max bei pH 11 (88,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 13 (57,6 %)

89

Prometryn

Clf: 100R – Max bei pH 1 (118,3 %)

Propiverin

Clf: 100R – Max bei pH 1 (109 %) Eto: 100R – Max bei pH 8 (97,3 %)

Talindol

Clf: 100R – Max bei pH 9 (104,8 %) Clf: 100R – Max bei pH 1 (123,3 %) Eto: 100R – Max bei pH 6/7 (96,5 %)

Eto: 100R – Max bei pH 3 (110,4 %)

Eto: 100R – Max bei pH 11 (95,8 %)

Thioridazin

90

Clf: 100R – Max bei pH 9 (101,6 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 (11,9 %)

Trimipramin

Clf: 100R – Max bei pH 1 (116,3 %) Eto: 100R – Max bei pH 6 (96,2 %)

Verapamil

Clf: 100R – Max bei pH 1(105,7 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 /13 (96 %)

Trimethoprim

91