Untersuchungen zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes ...

Aus dem

Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Untersuchungen zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes

Metamizol hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer

DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Helga Levens

aus Bremervörde

Hannover 2005

Wissenschaftliche Betreuung:

Universitätsprofessor Dr. Manfred Kietzmann

1. Gutachter: Universitätsprofessor Dr. M. Kietzmann

2. Gutachter: Universitätsprofessor Dr. Dr. hc. E. Deegen

Tag der mündlichen Prüfung: 02. Juni 2005

Meiner Familie und meinen immer zu mir haltenden Freunden

Abkürzungsverzeichnis ...........................................................................1 1. Einleitung.................................................................................................1 2. Literaturübersicht ..................................................................................3

2.1. Definition des Dopingbegriffs ..................................................................3 2.1.1. Gründe zur Erstellung von Dopingreglementierungen ...................................... 4

2.2. Dopingbestimmungen der Pferdesportverbände ......................................4 2.2.1. Satzung und Ordnungen des Hauptverbandes für Traber-Zucht und –Rennen

e.V. (HVT) ......................................................................................................... 4 2.2.2. Rennordnung (RO) des Direktoriums für Vollblutzucht und Rennen (DVR) mit

Vorschriften für die Leistungsprüfungen der Vollblutzucht (2002) .................. 5 2.2.3. Leistungsprüfungsordnung (LPO) der Deutschen Reiterlichen Vereinigung

e.V. (Fédération Nationale, FN)......................................................................... 6 2.2.4. Internationale Reiterliche Vereinigung (FEI - Fédération Équistre

Internationale) .................................................................................................... 9 2.3. Aspekte des Tierschutzes........................................................................10 2.4. Zusätzliche gesetzliche Aspekte für den Tierarzt im Zusammenhang mit

Doping.....................................................................................................12 2.4.1. Mögliche Strafrechtliche Konsequenzen für den behandelnden Tierarzt ........ 12 2.4.2. Mögliche Zivilrechtliche Konsequenzen für den behandelnden Tierarzt ........ 14

2.5. Formen des Dopings ...............................................................................15 2.6. Allgemeine Grundprinzipien der Pharmakokinetik................................21

2.6.1. Einkompartiment-Modell – Kinetik nach einmaliger intravenöser (i.v.) Injektion ........................................................................................................... 23

2.6.2. Zweikompartiment-Modell – Kinetik nach i.v. Injektion ................................ 24 2.6.3. Bioverfügbarkeit............................................................................................... 26 2.6.4. Verteilungsvolumen ......................................................................................... 27 2.6.5. Clearance.......................................................................................................... 29

2.7. Nichtsteroidale Antiphlogistika (NSAID) ..............................................31 2.7.1. Mediatoren der Entzündung ............................................................................. 32 2.7.2. Wirkungsmechanismus der NSAID ................................................................. 35 2.7.3. Pharmakokinetik der NSAID ........................................................................... 35 2.7.4. Nebenwirkungen der NSAID ........................................................................... 36 2.7.5. Metamizol......................................................................................................... 38

2.7.5.1. Metamizol - Pharmakodynamik ............................................................... 38 2.7.5.2. Metamizol – Pharmakokinetik ................................................................. 39 2.7.5.3. Metamizol – Arzneimitteleinsatz bei Pferden.......................................... 44 2.7.5.4. Dopingrelevanz des Einsatz von Metamizol............................................ 45

2.8. Analytik...................................................................................................45 3. Eigene Untersuchungen........................................................................50

3.1. Versuchsplanung.....................................................................................50 3.2. Material und Methode.............................................................................50

3.2.1. Pferde und Haltungsbedingungen .................................................................... 50 3.2.2. Applikation des Arzneimittels und Probengewinnung..................................... 52 3.2.3. Eingesetztes Arzneimittel................................................................................. 53 3.2.4. Aufbereitung und Aufbewahrung der Blut- und Urinproben........................... 53 3.2.5. Material, Geräte und Entwicklung analytischer Methoden für die Bestimmung

des Hauptmetaboliten 4-Methylaminoantipyrin (4-MAA) von Metamizol ..... 54 3.2.5.1. Chemikalien ............................................................................................. 54 3.2.5.2. HPLC/MS/MS.......................................................................................... 55

Inhaltsverzeichnis

3.2.5.3. Eichlösungen ............................................................................................ 55 3.2.5.4. Entwicklung analytischer Methoden....................................................... 56 3.2.5.5. Proben mit 4-MAA und DMAP............................................................... 56 3.2.5.6. Chromatographie...................................................................................... 57 3.2.5.7. Extraktion von 4-MAA und DMAP aus Probenmaterial ......................... 58 3.2.5.8. Aufarbeitung des Urins mit Hydrolyseschritt .......................................... 59 3.2.5.9. Aufarbeitung des Probenmaterials einschließlich der Proben für die

Validierung............................................................................................... 60 3.3. Validierung der Methode ........................................................................63

3.3.1. Grundlagen der Validierung............................................................................. 63 3.3.1.1. Selektivität, Spezifität .............................................................................. 63 3.3.1.2. Linearität .................................................................................................. 64 3.3.1.3. Richtigkeit ................................................................................................ 65 3.3.1.4. Präzision ................................................................................................... 65 3.3.1.5. Nachweis- und Quantifizierungsgrenze ................................................... 66 3.3.1.6. Stabilität ................................................................................................... 67 3.3.1.7. Wiederfindung.......................................................................................... 68

3.4. Messung der Proben aus dem Hauptversuch..........................................69 3.4.1. Kalibrationsreihe im Plasma zur Quantifizierung des Ausscheidungsversuches

.......................................................................................................................... 69 3.4.2. Kalibrationsreihe im Urin zur Quantifizierung des Ausscheidungsversuches. 70

3.5. Pharmakokinetische Auswertung ...........................................................71 4. Ergebnisse..............................................................................................72

4.1. Massenspektren und Strukturformel von 4-MAA (Analyt) und DMAP (interner Standard) ..................................................................................72

4.2. Validierung der Analysenmethode .........................................................74 4.2.1. Selektivität und Spezifität ................................................................................ 74 4.2.2. Prüfung auf Linearität ...................................................................................... 76 4.2.3. Richtigkeit ........................................................................................................ 77 4.2.4. Präzision ........................................................................................................... 79 4.2.5. Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, Limit of detection, LOD)....................... 80 4.2.6. Quantifizierungsgrenze (Bestimmungsgrenze, Limit of quantification, LOQ) 80 4.2.7. Stabilität ........................................................................................................... 80 4.2.8. Wiederfindung (Recovery)............................................................................... 81

4.3. Ergebnisse des Hauptversuchs................................................................82 4.3.1. Konzentrationen von 4-MAA im Plasma......................................................... 82 4.3.2. Pharmakokinetische Daten von 4-MAA im Plasma ........................................ 84 4.3.3. Aufarbeitung der Urinproben ohne Hydrolyse................................................. 86 4.3.4. Konzentrationen von 4-MAA im Urin ............................................................. 87

4.4. Berechnung der effektiven und irrelevanten Plasma- und Urinkonzentrationen ...............................................................................90

4.5. Berechnung von Ausscheidungszeiten von 4-MAA aus Plasma und Urin.................................................................................................................92

5. Diskussion ..............................................................................................95 5.1. Eignung der erarbeiteten Analysenmethode (HPLC/MS/MS) für den

Nachweis von 4-MAA im Plasma und Urin von Pferden .....................95 5.2. Pharmakokinetik von 4-MAA im Plasma...............................................99 5.3. 4-MAA im Urin ....................................................................................101

Inhaltsverzeichnis

5.4. Berechnungen zur effektiven und irrelevanten Plasmakonzentration und zur irrelevanten Urinkonzentration nach TOUTAIN und LASSOURD (2002); Berechnungen zur Ermittlung der Ausscheidungszeit.............103

5.5. Bewertung der Ergebnisse ....................................................................106 6. Zusammenfassung ..............................................................................109 7. Summary..............................................................................................111 8. Literaturverzeichnis ...........................................................................113 9. Anhang.................................................................................................125 Danksagung .........................................................................................131

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis


� Hybridkonstante der Verteilung

Abb. Abbildung

APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation

AUC Area under the curve

AA 4-Aminoantipyrin

AAA N-4-Acetylaminoantipyrine

� Hybridkonstante der Elimination

BC Back Calculation

BGB Bürgerliches Gesetzbuch

C Konzentration

Cl Clearance

ClH hepatische Clearance

ClOrgan Organclearance

ClR renale Clearance

ClT totale Clearance

Cmax maximal gemessene Konzentration

C0 Plasmakonzentration zum Zeitpunkt t0 (unmittelbar nach

der i.v. Injektion)

CPlasmaø durchschnittliche Plasmakonzentration

COX Cyclooxygenase

CUrinø durchschnittliche Urinkonzentration

D Dosierung

DIR Direktorium für Vollblutzucht und Rennen

DMAP Dihydrodimethyldimethylaminophenylpyrazolone

EHSLC European Horserace Scientific Liason Committee

EPC effektive Plasmakonzentration

F Bioverfügbarkeit

FAA 4-Formylaminoantipyrin

FEI Fédération Équestre Internationale

FN Fédération Nationale – Deutsche Reiterliche Vereinigung

e.V. Warendorf


g Gramm

GC Gaschromatographie

h Stunde

HETE Hydroxyarachidonsäure

HPETE Hydroxyperoxyarachidonsäure

HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

HQC High Quality Control Standard

HVT Hauptverband für Traber-Zucht und –Rennen e.V.

HWZ Halbwertzeit

i.a. intraarticulär

i.m. intramuskulär

IPC irrelevante Plasmakonzentration

ISTD interner Standard

IUC irrelevante Urinkonzentration

i.v. intravenös

kg Kilogramm

KGW Körpergewicht

l Liter

ln natürlicher Logarithmus

LOD Limit of detection

LOQ Limit of quantification

LPO Leistungsprüfungsordnung

LQC Low Quality Control Standard

4-MAA 4-Methylaminoantipyrin

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

max. maximal

mg Milligramm

min. Minute

ml Milliliter

mmol Millimol

MQC Midrange Quality Control Standard

MRL Maximum Residue Limit - Rückstandshöchstmenge

MRT Mean Residence Time – mittlere Verweildauer


MS Massenspektrometrie

m/z Quotient aus Masse und Ladung

NSAID nichtsteriodales Antiphlogistikum

p.a. post applicationem

PB Phenylbutazon

PK/PD pharmakokinetisch/pharmakodynamisch

p.o. per oral, per os

QC Qualitätskontrolle

R2 Regressionskoeffizient

RE relativer Fehler, relative Abweichung

RO Rennordnung des DIR

Rss Urin/Plasmaverhältnis im steady state

S Standardabweichung

t Zeit

Tab. Tabelle

ta(IPC) Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der IPC

ta(LOD) Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der LOD

ta(LOQ) Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der LOQ

TBME tertiär-Butylmethylether

t50(�) HWZ der Verteilungsphase

t50(�) HWZ der Elimination

Tmax. Zeitpunkt der max. gemessenen Plasmakonzentration

TschG Tierschutzgesetz

Vd scheinbares Verteilungsvolumen

Vss Verteilungsvolumen im Steady State

1 Einleitung

1. Einleitung

Bei Sportpferden kann der im Rahmen einer tierärztlichen Therapie erfolgte Einsatz von

Arzneimitteln dazu führen, dass eine Dopingkontrolle positiv ausfällt, wenn zwischen

Arzneimittelapplikation und Entnahme der Dopingprobe nicht genügend Zeit verstrichen ist.

Allein der Nachweis von Substanzen mit pharmakologischer Wirkung wird beanstandet, auch

wenn dabei keine bewusste Leistungsbeeinflussung vorliegt. Der Wissensstand über die

Nachweisdauer in Blut und Urin des Pferdes ist auch bei bereits langjährig etablierten

Arzneimitteln oft unzureichend. Tierärzte, die Sportpferde behandeln, können nicht mit

ausreichender Sicherheit abschätzen, wann welche Medikamente eingesetzt werden können,

ohne gegen Dopingreglementierungen der Pferdesportverbände zu verstoßen. Diese

Vorschriften fordern, dass zum Turnier- bzw. Rennzeitpunkt keine therapeutisch wirksamen,

leistungsbeeinflussenden - und damit dopingrelevanten - Substanzen nachgewiesen werden

können. Für einige Substanzen sind von einigen Pferdesportverbänden Grenzwerte festgelegt.

Reiter, Trainer und Pferdebesitzer stellen immer wieder die Frage, wie lange ein zu

Therapiezwecken eingesetztes Medikament vor einer Leistungsprüfung abgesetzt sein muss,

damit im Falle einer möglichen Dopingkontrolle kein positives Ergebnis resultiert. Sowohl

unter diesem Aspekt, als auch unter Berücksichtigung des deutschen Tierschutzgesetzes, nach

dem der Tierarzt verpflichtet ist, ein erkranktes Tier zu behandeln, um ihm Schmerzen zu

ersparen und es vor nachhaltigen Schäden zu bewahren, gerät der Pferdepraktiker zunehmend

in Konfliktsituationen, wenn ihm nicht ausreichend valide Daten zur Verfügung stehen,

anhand derer er seine Aussagen absichern kann.

Das European Horserace Scientific Liaison Committee (EHSLC), eine Vereinigung von

Pferdesportverbänden aus fünf der europäischen Gemeinschaft angehörenden Staaten

(Deutschland, Frankreich, Großbritannien, Italien und Spanien) ist bemüht, mit den in

Dopinglisten aufgeführten Substanzen pharmakologische Untersuchungen unter

standardisierten Bedingungen durchzuführen. Es wird beabsichtigt, gewonnene klinische und

pharmakologische Daten in ein PK/PD-Modell nach TOUTAIN und LASSOURD (2002)

einzubringen. Gemäß diesem Model durchgeführte Berechnungen zielen darauf ab, für

therapeutisch eingesetzte Substanzen Plasma- und Urinkonzentrationen zu ermitteln, in denen

die einzelne Substanz keine Wirkung auf den Organismus aufweist, so dass eine (Leistungs-)

Beeinflussung des Pferdes durch diesen Wirkstoff auszuschließen ist.

Das Ziel dieser Arbeit bestand daher einerseits darin, eine geeignete Analysenmethode zur

Quantifizierung auf einem High Pressure Liquid Chromatographen (HPLC) zu erarbeiten, und

2 Einleitung

andererseits Ausscheidungszeiten und die Eliminationskinetik für das häufig bei Pferden

eingesetzte nichtsteroidale Antiphlogistikum Metamizol aus Blut und Urin von Pferden zu

bestimmen.

Grundlage für die Entwicklung einer praktikablen Analysenmethode war das derzeit

bestehende Routineverfahren im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln.

Die erhaltenen Daten wurden pharmakokinetischen Berechnungen (TOUTAIN und

LASSOURD 2002) unterzogen, nach denen nicht mehr dopingrelevante Plasma- und

Urinkonzentrationen errechnet wurden, bei denen eine pharmakologische Wirkung von

Metamizol auf den Organismus ausgeschlossen werden kann. Die ermittelten

Ausscheidungszeiten geben an, über welchen Zeitraum das Metamizol im Pferdeorganismus

verweilt.

Die Ergebnisse der hier vorgestellten Untersuchungen sollen es dem Tierarzt erleichtern, den

Zeitpunkt zu bestimmen, ab dem ein Pferd nach erfolgreicher Therapie wieder an einer

Leistungsprüfung teilnehmen kann, ohne mit doping- und tierschutzrechtlichen

Bestimmungen zu kollidieren.

3 Literaturübersicht

2. Literaturübersicht

2.1. Definition des Dopingbegriffs

Ähnlich vielfältig wie die Definitionen des Wortes Doping sind auch seine

Übersetzungsmöglichkeiten: Erstmalige Erwähnung findet das Wort Doping in einem

englischen Lexikon 1899. Es wird dort als ein Gemisch aus Opium und Morphinderivaten,

welches an Pferde verabreicht wurde, definiert. Ursprünglich soll das Verb „doopen“ aus dem

Niederländischen kommen; es bedeutet eintauchen bzw. das Wort „doop“ soviel wie „dicke

Soße“. In den USA wurde „doping“ alsbald für eine unerlaubte Verabreichung von

Medikamenten an Rennpferde gebraucht. Laut UNGEMACH (1985) ist Doping im

Pferdesport definiert als unerlaubte Verabreichung eines jeden Mittels, außer normaler

Ernährung, das geeignet sein kann, die natürliche und aktuelle Leistungsfähigkeit eines

Pferdes zum Zeitpunkt eines Wettkampfes zu beeinflussen. Von BÜSCHER (1972) sind 42

Definitionen zusammengestellt, die alle mehr oder weniger den selben Inhalt versuchen

darzustellen, aber sehr unterschiedlich formuliert sind. Dieses zeigt die Schwierigkeit einer

juristisch brauchbaren Formulierung, die keine möglichen Hintertüten offenläßt (GRAHWIT

1995). SCHOENE (1996) nimmt die Essenzen der Dopingreglementierungen der

verschiedenen Pferdesportorganisationen und kombiniert diese zu einer Definition: „Doping

ist die Anwendung verbotener Substanzen/unerlaubter Mittel (siehe Dopinglisten) sowie der

Versuch, die Mitwirkung bei oder die Duldung einer solchen Anwendung beim Pferd zu

jedem Zeitpunkt. Ferner wird die pharmakologische, chemische und physikalische

Manipulation einer Probe als Doping bezeichnet. Auch die Anwendung jeglicher technischer

Mittel, sowohl im Training als auch im Wettkampf, gilt als Doping.“

Bis zum heutigen Tage gibt es keine allgemeingültige Definition des Dopingbegriffes für den

gesamten Bereich des pferdesportlichen Wettkampfes. Selbst in Gesetzestexten, wie

beispielsweise dem Tierschutzgesetz, fehlt eine Legaldefinition des Begriffes „Doping“. Der

Gesetzgeber setzt ihn offenbar als bekannt voraus (HIRT 1997). Statt dessen geben die

Pferdesportorganisationen für die von ihnen repräsentierten Disziplinen jeweils eigene

Definitionen des Dopingbegriffes in von ihnen erlassenen Dopingreglementierungen

(SCHOENE 1996).


2.1.1. Gründe zur Erstellung von Dopingreglementierungen

Laut UNGEMACH (1985) sind Grundlagen für die Berechtigung des Dopingverbotes im

Pferdesport:

- der sportethische Gedanke eines fairen Wettkampfes,

- der Tierschutz,

- die Verhinderung einer falschen Zuchtauslese durch Vortäuschung falscher

Leistungsstandards unter dem Einfluß von Dopingmitteln,

- der Schutz des zahlenden und wettenden Publikums, das entscheidend zur Erhaltung

und Förderung des Pferdesports beiträgt,

- der Schutz der anderen Rennteilnehmer vor Gefährdungen, die von gedopten, leichter

außer Kontrolle geratenden Tieren ausgehen.

2.2. Dopingbestimmungen der Pferdesportverbände

Nachfolgend soll ein kurzer Überblick über die Dopingbestimmungen der wichtigsten

deutschen Pferdesportorganisationen sowie der FEI (Fédération Équistre Internationale/

Internationale Reiterliche Vereinigung) gegeben werden. Auffallend ist, dass auch in jeder

dieser Bestimmungen eine genaue Definition des Dopingbegriffes fehlt.

2.2.1. Satzung und Ordnungen des Hauptverbandes für Traber-Zucht und –

Rennen e.V. (HVT)

Der Tatbestand des Dopings wird in § 93 der Trabrennordnung (TRO) auf die Anwendung

„ verbotener Substanzen“ , welche in einer „ Dopingliste“ in den Durchführungsbestimmungen

zur Feststellung und Verhinderung von Doping gesondert aufgeführt sind, bezogen.

„ Ein Pferd darf in seinen Geweben, seinen Körperflüssigkeiten oder seinen Ausscheidungen

in der Zeit zwischen dem Beginn der Rennveranstaltung und dem Ende des Rennens, an dem

das Pferd teilgenommen hat oder für welches das Pferd als Starter angegeben worden ist,

keine gemäß der Dopingliste verbotenen Substanzen aufweisen... . Die Dopingliste in der

jeweils gültigen Fassung ist Bestandteil der Trabrennordnung... .“ (TRO §93,1)


„ Ein positiver Dopingbefund liegt vor, wenn der qualitative Nachweis einer Substanz im

Sinne von Ziffer 1 der vom HVT veröffentlichten Dopingliste oder einer ihrer

Umwandlungsprodukte erbracht ist oder wenn gegen das Verbot gemäß Ziffer 2 der

Dopingliste verstoßen wurde. ...“ (TRO §93,2)

„ Unabhängig von dem generellen Verbot der Verabreichung von Substanzen oder Mitteln, die

in Absatz 1 (Auflistung der verbotenen Substanzen) genannt sind, dürfen Pferde innerhalb

von 72 Stunden vor Beginn des Rennens keine Injektionen oder Infusionen erhalten.“

(Durchführungsbestimmungen zur Feststellung und Verhinderung von Doping gemäß §93

der TRO, Ziffer 2)

2.2.2. Rennordnung (RO) des Direktoriums für Vollblutzucht und Rennen

(DVR) mit Vorschriften für die Leistungsprüfungen der Vollblutzucht

(2002)

Im Abschnitt XIV „ Unerlaubte Mittel – Doping“ der Rennordnung (2002) sind die

entsprechenden Bestimmungen aufgeführt. Auch hier wird nur eine indirekte Definition des

Dopingbegriffes gegeben.

Unter „ 1. Allgemeines“ und den Nummern 529 und 530 sind folgende Bestimmungen zu

finden:

- 529. Kein Pferd darf zum Zeitpunkt des Rennens in seinem Gewebe, seinen

Körperflüssigkeiten oder seinen Ausscheidungen ein unerlaubtes Mittel aufweisen.

- 530. Einen Verstoß begeht, wer diese Mittel anwendet, deren Anwendung versucht,

bei ihr mitwirkt oder sie pflichtwidrig ermöglicht. Einen Verstoß begeht ein Trainer,

bei dessen von ihm trainierten Pferden Substanzen solcher Mittel nachgewiesen

werden.

Der Tatbestand des Dopings wird hier nicht nur als direkter, persönlicher Verstoß gegen das

Verbot der Anwendung unerlaubter Mittel verstanden, sondern weitet sich auf einen Versuch,

einer Mitwirkung und Duldung eines solchen aus. Zudem untersagt die Rennordnung des

DVR generell, unter Einbeziehung des Trainings, die Anwendung verbotener Substanzen.


- 532. Das Direktorium ist befugt, durch Beauftragte von allen im Training befindlichen

Pferden jederzeit Dopingproben entnehmen zu lassen.

Mit dieser Regelung versucht das DVR einerseits Pferde vor unerlaubten Medikamenten zu

schützen, andererseits nur absolut gesunde Pferde am Training und Wettkampf teilnehmen zu

lassen. Ein im Training verabreichtes unerlaubtes Mittel ist zum Zeitpunkt des Rennens unter

Umständen nicht mehr nachzuweisen. Kranke Pferde sollen somit auch im Training vor einer

Überbelastung geschützt werden.

Unter „ 2. Erlaubte und unerlaubte Mittel“ sind diese unter den Nummern 539 bis 541

aufgelistet.

2.2.3. Leistungsprüfungsordnung (LPO) der Deutschen Reiterlichen

Vereinigung e.V. (Fédération Nationale, FN)

Im Vergleich zu den anderen Pferdesportverbänden ist durch die LPO der FN der Begriff des

Dopings insoweit direkt definiert, indem dort in §66 3.7 und 3.8 jeglicher Eingriff oder

Manipulationen bei an Wettbewerben/ Leistungsprüfungen teilnehmenden Pferden/Ponys zur

Nichtzulassung bzw. Disqualifizierung führt, der geeignet ist, die Leistung,

Leistungsfähigkeit oder Leistungsbereitschaft derer zu beeinflussen. Wie dieses kontrolliert

werden soll, ist durch den §67 und entsprechenden Durchführungsbestimmungen geregelt.

Der §67a gibt eine genaue Definition der Begriffe „ Dopingsubstanzen“ und „ Verbotene

Arzneimittel“ . Durch die Grenzwertangaben in diesem Paragraphen gibt die FN Sportpferde

behandelnden Tierärzten die Möglichkeit dort aufgeführte Medikamente im Rahmen einer

notwendigen Therapie einzusetzen.

Die FN hat im Teil A §66 Allgemeine Teilnahmebeschränkungen von Pferden und Ponys

unter Punkt 3 der Leistungsprüfungsordnung (LPO), gültig ab 1. Januar 2004 Zustände

aufgelistet, die zur Nichtzulassung bzw. zur Disqualifizierung von Pferden/Ponys in

Wettbewerben/ Leistungsprüfungen führen:

§66 3.3.7 Pferde/Ponys bei denen eine vorübergehende lokale Schmerzausschaltung oder

Neurektomie vorgenommen wurde oder bei denen eine akute Veränderung der Haut bestehen

sowie Pferde/Ponys mit implantierten Tracheotubus


§ 66 3.3.8 Pferde/Ponys denen gemäß §920.2.e) eine Dopingsubstanz oder ein verbotenes

Arzneimittel verabreicht oder an denen eine verbotene Methode angewendet oder zur

Beeinflussung der Leistung, Leistungsfähigkeit oder Leistungsbereitschaft irgendein Eingriff

oder Manipulation vorgenommen wurde.

§ 67 regelt Medikationskontrollen, Verfassungsprüfungen und Pferde- und Fitnesskontrollen.

Eine Liste verbotener Substanzen ist in § 67a aufgeführt:

§67a

1. Dopingsubstanzen

sind Substanzen, die geeignet sind, die Leistung eines Pferdes/Ponys im Wettkampf zu

beeinflussen. Das sind:

- Stimulantia

- Sedativa und Narkotika

- Anabolika

- Diuretika

- Peptidhormone und Analoge

Grenzwerte gelten für:

- Testosteron:

* bei Wallachen: freies und gekoppeltes Testosteron in einer Konzentration von 0,02

µg/ml Urin

* bei Stuten: freies und gekoppeltes Testosteron in einem Verhältnis zu Epitestosteron

von 12:1

- Nandrolon:

frei und gekoppelt 5�-estrane-3�, 17�-diol bis5(10)-estrene-3�, 17�-diol im Urin in

einem Verhältnis von 1

- Theobromin:

in einer Konzentration ab 2,0 µg/ml Urin

- Cortisol:


Ausserdem gilt die Verabreichung von Vollblut und/oder Zubereitungen, die rote

Blutkörperchen enthalten, sowie jede Manipulation einer Probe als Doping.

2. Verbotene Arzneimittel


sind Substanzen, die als Arzneimittel eingesetzt werden, jedoch im Wettkampf verboten sind,

und zwar solche, die

- auf das Nervensystem

- auf das Herz-Kreislauf-System

- auf das Atmungssystem

- auf das Verdauungssystem

- auf das Harn-System

- auf die Geschlechtsorgane

- auf das Muskel- und Skelettsystem

- auf die Haut

- gegen Infektionserreger

wirken.

Grenzwerte gelten für:

- Salizylsäure:

in einer Konzentration ab 750,0 µg/ml Urin oder 6,5 µg/ml Blutplasma

- Arsen:


- Dimethylsulfoxyd (DMSO):

in einer Konzentration ab 15,0 µg/ml Urin oder

in einer Konzentration ab 1,0 µg/ml Blutplasma

- Verfügbares CO2 :

in einer Konzentration ab 37 Millimol pro Liter Blutplasma

3. Ausnahmen

Die Anwendung/ Verabreichung folgender Substanzen in zeitlichem Zusammenhang mit

Wettkampfteilnahme ist erlaubt (dies betrifft nur die Anwendung von für Pferde/Ponys in

Deutschland zugelassener Substanzen), da sie der Vorbeugung und Pflege dienen und

unterstützend bei der Gesunderhaltung des Pferdes/Ponys wirken:

- Impfstoffe gemäß Durchführungsbestimmungen zu §66.3.10 (Impfung gegen

Influenza-Viren)

- Substanzen zur Bekämpfung von Endoparasiten

- Paraimmunitäts-Inducer

- externe Desinfektionsmittel und Insektenschutzmittel


Im Teil D der LPO „ Durchführungsbestimmungen“ finden sich Einzelheiten zur Neurektomie

(zur Zeit keine gesichterte Methode des Nachweises), zum Impfschutz und zu

Medikationskontrollen.

2.2.4. Internationale Reiterliche Vereinigung (FEI - Fédération Équistre

Internationale)

Die Dopingreglementierungen der FEI sind aktuell in den Veterinary Regulations, 9th edition

und den General Regulations, 21th edition (mit Inkrafttreten vom 01. Januar 2005) enthalten

(www.horsesport.org). Sie entsprechen weitgehend den Dopingreglementierungen der FN;

jedoch führt die FEI bei den verbotenen Substanzen zusätzlich solche auf, die Wirkung auf

das Blutsystem und das endokrine System haben können. Zudem gelten nach der FEI

antipyretische, analgetische und antiinflammatorische Substanzen, als auch endokrine Sekrete

einschließlich ihrer synthetischen Duplikate und maskierende Substanzen als verbotene

Substanzen. Abweichend zur FN gilt nach FEI-Bestimmungen für Salicylsäure ein Grenzwert

von 625 µg/ml Urin, bzw. 5,4 µg/ml Plasma. Annex VII der Veterinary Regulations enthält

Bestimmungen (drei Medikationsformen) zur tierärztlichen Behandlung von Sportpferden und

deren Genehmigung während einer FEI-Veranstaltung. In Bestimmungen der

Medikationsform 1 ist die Notfallbehandlung einschließlich der dazu eventuell notwendigen

Verabreichung verbotener Substanzen geregelt. Die Anwendung von Altrenogest (z.B.

Regumate®) bei Stuten mit oestrusbedingetem Verhaltenproblem ist durch das Reglement der

Medikationsform 2 festgelegt. Die Genehmigung der Anwendung nicht verbotener

Substanzen ist durch Vorschriften der Medikationsform 3 geregelt.

Bei einem zusammenfassenden Vergleich der Dopingbestimmungen der oben genannten

deutschen Pferdesportorganisationen bleibt festzustellen, dass diese viele

Übereinstimmungen, aber auch deutliche Unterschiede aufweisen. Jede Organisation führt

eine eigene Liste, in der u.a. unerlaubte/ verbotene Substanzen aufgeführt sind. Die

Substanzen sind aufgrund bereits in einer Vielzahl vorhandener und ständig neu

hinzukommender Arzneimittel nicht nach Wirkstoff- oder Warenname sondern nach

Wirkstoffgruppen aufgelistet. In der Rennordnung des DVR und der LPO der FN sind für

einige Wirkstoffe Grenzwerte angegeben. Der HVT hat keine Liste über Substanzen mit


Grenzwert erstellt und ist diesbezüglich der Verband mit den striktesten

Dopingreglementierungen, da er jeglichen Nachweis einer Substanz seiner Dopingliste und/

oder ihrer Metaboliten als positiven Dopingbefund ansieht (Dopingbestimmungen des HVT

2003, SCHOENE 1996, UNGEMACH und NÜRNBERGER 1999).

Der DVR hält in der Rennordnung fest, dass nicht allein der Einsatz eines dort aufgeführten

Wirkstoffes geahndet werden kann, sondern bereits der Versuch, die Mitwirkung und

Duldung desselben.

Laut der TRO des HVT besteht, unabhängig von dem generellen Verbot der Verabreichung

unerlaubter Mittel, ein Verbot, nach dem Pferden 72 Stunden vor Rennbeginn keine Injektion

oder Infusion gegeben werden darf. Hierdurch soll verhindert werden, dass Pferden kurz vor

dem Start leistungsfördernde Infusionen, wie z.B. Elektrolytlösungen, verabreicht werden,

deren Nachweis nicht möglich ist.

Der Begriff „ Doping“ wird in den Reglementierungen aller hier genannten

Pferdesportorganisationen benutzt, allerdings nur in der LPO der FN definiert. Hier wird

Doping als Tatsache des Vorhandenseins eines Wirkstoffes bezeichnet. Der Einsatz eines

behandelten Pferdes/ Ponys im Wettkampf stellt erst ein aktives Vergehen dar und kann

entsprechend geahndet werden.

Neben der Verabreichung von Pharmaka fallen bei dem DVR und der FN auch Maßnahmen

unter den Tatbestand des Dopings, die geeignet sind die Leistung eines Pferdes/Ponys zu

beeinflussen. Die LPO zählt dazu gestartete Pferde mit neurektomierten Gliedmaßen,

implantierten Tracheotuben und akuten Hautveränderungen. Die Rennordnung versteht

darunter den Einsatz technischer Mittel, die im Rennen mitgeführt oder angewendet werden,

wie z.B. den Einsatz von Strom oder Ohrenstopfen (LPO 2004, RO 2002, SCHOENE 1996).

2.3. Aspekte des Tierschutzes

GRAHWIT (1995) stellt den Einfluss von Doping auf die Leistungsphysiologie durch ein

Schema dar, worin gezeigt wird, dass Dopingmittel eine Aufhebung physiologischer

Leistungsblockaden auf verschiedenen Ebenen der Leistungsentfaltung bewirken können. Ein

Beispiel für einen solchen Schutzmechanismus ist die laktatbedingte Muskelermüdung und

Schmerzentfaltung. Ein in bestem Gesundheitszustand befindlicher Organismus kann allein

durch angepasste Ernährung und optimales Training die obere Grenze der natürlichen

Leistungsfähigkeit erreichen. Diese obere Grenze stellt nur ca. 60% der gesamten


Leistungsfähigkeit dar. Der Übergang zum nächsthöheren Bereich innerhalb dieser 60%

erfordert bereits die Überschreitung von gewissen Barrieren, die aber mit dem Willen

steuerbar ist. Die oberen 40% der möglichen Leistungspotenz sind durch autonome

Schutzmechanismen blockiert. In diese kann nur durch bestimmte Substanzen unter

Aufhebung der Schutzbarrieren eingedrungen werden, wobei das Individuum zumindest

teilweise nicht mehr seinem bewussten Einfluss unterliegt. Das Eindringen in diesen

Risikobereich kann mit schweren Schädigungen des Organismus bis hin zum Tod

einhergehen. GRAHWIT (1995) setzt bei der Überschreitung der Barrieren in autonom

geschützte Leistungsreserven die Grenze, ab der der Tierschutzgedanke sinnvoll erscheint und

das Gesetz eintreten muss. Eine zusätzliche Gabe physiologischer Futterinhaltsstoffe, mit

Ausnahme des Thiamin, die geeignet sind, in einem Organismus das volle genetisch fixierte

Leistungspotential zu aktivieren, sollte nicht tierschutzrelevant sein, da durch diese

physiologische Leistungsgrenzen nicht aufgehoben werden können.

Für UNGEMACH (1985) stellt der Tierschutzgedanke den Hauptgrund für das Dopingverbot

im Pferdesport dar. Ein zentraler gesetzlicher Punkt dafür besteht im § 3 des

Tierschutzgesetzes (TSchG) in der Neufassung vom 1. Juni 1998. Nach Absatz 1 ist es

verboten, „ einem Tier außer in Notfällen Leistungen abzuverlangen, denen es wegen seines

Zustandes offensichtlich nicht gewachsen ist oder die offensichtlich seine Kräfte

übersteigern“ . Absatz 1b besagt: „ Es ist verboten, an einem Tier im Training oder bei

sportlichen Wettkämpfen oder ähnlichen Veranstaltungen Maßnahmen, die mit erheblichen

Schmerzen, Leiden oder Schäden verbunden sind und die Leistungsfähigkeit von Tieren

beeinflussen können, sowie an einem Tier bei sportlichen Wettkämpfen oder ähnlichen

Veranstaltungen Dopingmittel anzuwenden.“ Der Abschnitt 11 des § 3 des TSchG verbietet

das sogenannte physikalische Doping, indem es das Verbot beinhaltet, ein Gerät anzuwenden,

das durch elektrische Reize das artgerechte Verhalten des Pferde beeinflusst und die

Bewegung erheblich einschränkt oder aber außergewöhnliche Bewegungen erzwingt, die dem

Tier Schmerzen, Leiden oder Schäden zufügen können. In den Paragraphen 17 und 18 wird

aufgeführt, wie ein Verstoß gegen oben beschriebene Gesetze als Ordnungswidrigkeit oder

Straftat geahndet wird. UNGEMACH (1985) betrachtet es als Tierquälerei, sowohl ein

krankes Pferd durch Verabreichung von Medikamenten rennfähig zu machen, als auch den

Versuch, bei einem gesunden Pferd durch Dopingmaßnahmen physiologische Schutzbarrieren

auszuschalten und dadurch in unphysiologische Leistungsbereiche vorzustoßen. Beides sei

geeignet, als Folge einer Verschlimmerung bestehender Krankheitsprozesse bzw. einer

extremen Überbelastung, Pferden länger anhaltende und sich wiederholende erhebliche


Schmerzen und Leiden zuzufügen. Dieses führt zudem zu einem frühzeitigen und unnötigen

Verschleiß und Verbrauch eines Pferdes (SCHOENE 1996). Gedopte Pferde können schwerer

kontrollierbar sein und dadurch, z.B. durch plötzliches Niederbrechen während eines

Rennens/des Trainings, andere Pferde und Reiter zu Sturz bringen und diese verletzen.

2.4. Zusätzliche gesetzliche Aspekte für den Tierarzt im Zusammenhang

mit Doping

Überlegungen, welche Konsequenzen das Dopingverbot nach § 3 Nr. 11 TSchG für den

(sport)pferdebehandelnden Tierarzt hat, wurden von HIRT (1997) zusammengefasst.

Verstöße gegen das o.g. Gesetz können strafrechtliche und zivilrechtliche Konsequenzen für

den pferdebehandelnden Tierarzt nach sich ziehen.

2.4.1. Mögliche Strafrechtliche Konsequenzen für den behandelnden Tierarzt

Nach § 18 Abs. 1 Nr. 4 TSchG begeht ein Tierarzt, der selbst einem Tier vorsätzlich ein

Dopingmittel bei einer sportlichen Veranstaltung verabreicht, eine Ordnungswidrigkeit, für

die er belangt werden kann. Gleiches gilt, wenn er das Mittel einem Dritten überlässt, der es

mit dem Wissen des Tierarztes verabreicht. In diesem Fall macht sich der Tierarzt nach § 14

Abs. 1 Ordnungswidrigkeitsgesetz (OwiG) als Beteiligter einer Ordnungswidrigkeit schuldig.

Der Vorsatz ist gegeben, wenn der Tierarzt weiß, dass es sich um ein Dopingmittel handelt

(ausreichend ist dabei das Wissen um eine leistungsbeeinflussende Wirkung) und dass das

Tier an einem Wettkampf teilnimmt. Um sich einer Ordnungswidrigkeit schuldig zu

machen, genügt der bedingte Vorsatz. Dieser ist gegeben, wenn der Tierarzt zwar nicht

definitiv weiß, dass es sich bei dem angewendeten Mittel um ein Dopingmittel handelt oder

das Tier bei einem Wettkampf starten soll, aufgrund der gesamten Umstände beides aber für

möglich hält und trotzdem das Mittel anwendet oder es Dritten zur Anwendung überlässt.

Fahrlässigkeit kann einem Tierarzt vorgeworfen werden, wenn er die

Tatbestandsverwirklichung nicht will, sie aber aufgrund einer vermeidbaren

Sorgfaltspflichtverletzung verursacht und dieses vorhersehbar war. Der Tierarzt muss hierzu

einem Irrtum unterliegen, indem er ein angewendetes oder verschriebenes Mittel nicht für ein


Dopingmittel hält, er nicht von einer leistungsbeeinflussenden Wirkung zu Zeitpunkt der

Wettkampfteilnahme des Pferdes ausgeht oder er nicht davon ausgeht, dass das Pferd an

einem Wettkampf teilnimmt. In den Fällen, in denen der Tierarzt den Irrtum hätte vermeiden

können, kann er zur Rechenschaft gezogen werden. Ob dieses der Fall ist, richtet sich nach

den Umständen des Einzelfalls, wodurch unterschiedliche gerichtliche Rechtsprechungen in

ähnlichen Fällen entstehen können. Der Tierarzt kann nicht haftbar gemacht werden, wenn er

von dem Tierbesitzer über den wettkampfsportlichen Einsatz eines Pferdes falsch informiert

wurde und keine Anhaltspunkte dafür vorliegen, dass die Information unrichtig ist.

Ebensowenig wird ein Tierarzt haftbar sein, wenn er ein Pferd behandelt, das nach seinem

Wissen immer nur als Freizeitpferd spazierengeritten wird. Um den Vorwurf einer

Fahrlässigkeit zu vermeiden, stellt sich die Frage, welche Sorgfaltspflichten der Tierarzt im

Rahmen der Feststellung eines Mittels als Dopingmittel und seiner Abbauzeit hat. Der

Tierarzt muss die für seinen Berufskreis geltenden Rechtssätze und Verkehrsgeflogenheiten

beachten. Die Durchschnittsanforderungen sind an dem engen sozialen Bereich, in dem der

einzelne tätig ist zu orientieren, d.h., von einem Fachtierarzt für Pferde ist mehr zu erwarten

als von einem Allgemeinmediziner. Ein Fachtierarzt, der Sportpferde behandelt muss die

Dopingwirkstoffe und ihre Karenzzeiten kennen. Um dazu seine Leistungen dem zeitlichen

Wandel anzupassen, muss er sich fortbilden (einschlägige Fachzeitschriften, Tagungen).

Wenn bei den Abbauzeiten der Wirkstoffe Unsicherheiten bestehen, muss der Tierarzt den

Tierbesitzer über diese und auf das Risiko entsprechender Unwagbarkeiten aufklären. Der

Tierarzt, der kein Fachtierarzt ist und nur gelegentlich Sportpferde behandelt, kann sich

diesbezüglich nicht erfolgreich auf Unkenntnis berufen. Der Sorgfaltsmangel, der die

Fahrlässigkeit begründet, liegt hier in einem Übernahmeverschulden, indem er eine Aufgabe

übernimmt, der er nicht gewachsen ist. Gleiches gilt, wenn er hinsichtlich den

Dopingwirkstoffen und deren Abbauzeiten einem Irrtum unterliegt, der bei einem

Fachkollegen vermeidbar gewesen wäre. Verursacht ein Tierarzt vorsätzlich oder bedingt

vorsätzlich durch die Verabreichung eines Dopingmittels den Tod oder länger anhaltende

oder sich wiederholende erhebliche Schmerzen und Leiden eines Tieres, so begeht er nach §

17 Nr. 1 und 2b) TSchG eine Straftat. Im Falle eines vorsätzlichen Vergehens macht er sich

im Fall der Tötung oder Schädigung des Tieres nach § 303 Strafgesetzbuches (StGB) einer

Sachbeschädigung strafbar. Straffrei bleibt der Tierarzt, wenn er zuvor den Besitzer über

mögliche Konsequenzen (Tod/ Schädigung des Tieres) des Einsatzes von Dopingmitteln

aufgeklärt hat.


2.4.2. Mögliche Zivilrechtliche Konsequenzen für den behandelnden Tierarzt

Nach § 134 Bürgerlichen Gesetzbuches (BGB) ist ein Vertrag zwischen einem Tierarzt und

einem Trainer oder Tiereigentümer nichtig, wenn er darauf zielt, einem Tier für einen

sportlichen Wettkampf gesetzeswidrig Dopingmittel zu verabreichen. Dem zu Folge hat der

Tierarzt für seine erbrachte Leistung keinen Vergütungsanspruch. Gleiches gilt, wenn der

Tierarzt das Dopingmittel einem Dritten zu o.g. Zweck überlässt. Wenn der Einsatz eines

Dopingmittels wie zuvor erwähnt, zum Tod oder zur Schädigung des Tieres führt und der

Tierarzt über diese Konsequenzen den Tiereigentümer nicht aufgeklärt hat, macht er sich nach

§ 823 BGB wegen Eigentumsverletzung schadensersatzpflichtig. Ein Tierarzt kann ebenfalls

schadensersatzpflichtig werden, wenn er zur nur auf Heilung gerichteten Behandlung Mittel

einsetzt, die auf den Dopinglisten der Verbände stehen oder die über die medizinische

Indikation hinaus leistungsbeeinflussend wirken. Gleiches gilt, wenn der Tierarzt

versehentlich ein Dopingmittel anstatt eines anderen Medikamentes anwendet. Grundsätzlich

ist ein Tierarzt verpflichtet, über Risiken und Alternativen einer Behandlung zu informieren,

wenn dieses für einen Tierbesitzer entscheidungserheblich sein kann.

Aus dem bisher Gesagten ergibt sich die Dopingproblematik, indem dem generell

legitimierten Bedürfnis nach tierärztlicher Versorgung von Sportpferden das Verbot der

Anwendung von pharmakologisch wirksamen Substanzen vor einem Wettkampf bzw. zum

Wettkampfzeitpunkt gegenübersteht. Aus diesem Grund, d.h. um die notwendige

medikamentelle Behandlung von Sportpferden zu sichern, wird es unumgänglich sein, für

jeden einsetzbaren Wirkstoff eine Karenzzeit festzulegen. Der Zeitraum zwischen der letzten

Arzneimittelgabe und dem Tag des Wettkampfes wird hier als Karenzzeit definiert (KLAUS

und HAPKE 1994). Eine Schwierigkeit ergibt sich dabei, dass über den Zusammenhang von

Nachweis und Wirkkonzentration bis heute sehr wenig oder sehr unterschiedliche Daten

vorliegen, so dass bisweilen mit sogenannten „ withdrawal times“ gearbeitet werden muss.

Diese Karenzzeiten sind definiert als der Zeitraum, in dem ein Pferd nach einmaliger Gabe

eines Wirkstoffes nicht an den Start gehen darf. Diese Daten sind durch Untersuchungen

gestützt, die die Pharmakologie, das Eliminationsverhalten und die Nachweisdauer im Blut

und Urin berücksichtigen. Ein maßgebender Faktor bei der Erstellung dieser Zeiten, ist die

Kompetenz/Kapazität der Analytik. In dem „ Handbuch Medikation“ (FN 1997), das gerade

überarbeitet wird, hat die FN Karenzzeiten für eine Auswahl von Substanzen, die häufig in

der Pferdepraxis eingesetzt werden, erstellt, die aus eigenen Untersuchungen der FN und


durch Auswertung internationaler Literatur entstanden sind. Diese Liste wird fortgeschrieben

und regelmäßig überarbeitet (DÜE 1998).

2.5. Formen des Dopings

Unter Berücksichtigung der Zielsetzung kann Doping in unterschiedliche Formen unterteilt

werden:

- Doping auf Sieg

- Doping auf Niederlage

- Doping zur Wiederherstellung der natürlichen Leistungsfähigkeit

- Versehentliches oder unbeabsichtigtes Doping

- Doping zur Maskierung und zur Verdünnung anderer Substanzen (Maßnahmen zur

Erschwerung des Dopingnachweises)

- Doping mit körpereigenen Substanzen

- Physikalisch-technisches Doping.

Die Formen des absichtlichen Dopings lassen sich in positives und negatives Doping

unterteilen. Zu dem positiven Doping zählt das Doping auf Sieg, das Doping zur

Wiederherstellung der normalen Leistungsfähigkeit, das Doping mit körpereigenen

Substanzen und das physikalisch- technische Doping. Das Doping auf Niederlage wird als

negatives Doping angesehen (UNGEMACH 1985).

Das Doping auf Sieg soll die natürliche Leistungsfähigkeit eines Pferdes positiv beeinflussen,

d.h., es hat zum Ziel physiologisch vorgegebene und autonom geschützte Leistungsbarrieren

zu überwinden (UNGEMACH 1985). Diese Dopingform lässt sich weiter unterteilen in

akutes, chronisches und paradoxes Doping. Bei dem akuten Doping, welches auch als „ short

term medication“ bezeichnet wird, werden verbotene leistungssteigernde Substanzen kurz vor

dem Wettkampf appliziert (SCHOENE 1996). Zur Anwendung kommen hierzu in erster Linie

Stimulantien, wie z.B. Phenylalkylamine (z.B. Amphetamin, Ephedrin), Cocain,

Methylxanthine (z.B. Coffein, Theophyllin), Opiate (z.B. Morphin, Fentanyl, Levomethadon)

und Apomorphin. Trotz unterschiedlicher Wirkungsmechanismen resultiert ein Dopingeffekt,

der durch Euphorisierung mit erhöhter Leistungsbereitschaft und Konzentration als auch

durch Steigerung der lokomotorischen Aktivität gekennzeichnet ist. Charakteristisch für


Stimulantien ist eine relativ kleine therapeutische Breite, d.h. geringfügige Dosisänderungen

können nicht zu einer erwünschten stimulierenden Wirkung, sondern zu unerwünschten

Wirkungen, wie z.B. Unruhe bis hin zu nicht kontrollierbaren Erregungszuständen, führen.

Auf Grund einer kurzen Wirkungsdauer werden Stimulantien unmittelbar vor einem

Wettkampf verabreicht. Zudem kommt eine individuelle Reaktionslage auf Stimulantien, die

zusätzlich Tagesschwankungen unterliegen kann, was bedeutet, dass diese Dopingform nur

von Personen ausgeführt werden kann, die eine genaue Kenntnis der Reaktionslage des

entsprechenden Pferdes besitzen. Folglich wird diese Form des Dopings auch als „ inside job“

bezeichnet (UNGEMACH 1985, SCHOENE, 1996). Unter chronischem Doping versteht man

eine Langzeitverabreichung über Wochen und Monate z.B. von anabolen Steroiden und

bestimmten Vitaminen. In Verbindung mit optimalem Training und Fütterung, kommt es so

u.a. zu einer Zunahme der Skelettmuskulatur, woraus eine erhöhte Leistungssteigerung

resultieren kann. Die Zunahme der Skelettmuskulatur beruht nicht auf Vermehrung, sondern

auf Hypertrophie der Muskelfasern. Diese Substanzen werden meist zeitig vor dem

Wettkampf abgesetzt, dass sie zum dem Zeitpunkt nicht mehr nachweisbar sind, und nur noch

das Resultat ihrer Wirkung in Form von erstaunlicher Rennleistung und Exterieurentwicklung

erkennbar ist. Solche Machenschaften haben negativen Einfluss auf die Zuchtauswahl

beispielsweise in der Voll- und Warmblutzucht, indem Rennleistungen und Exterieur

vorgetäuscht werden, die ohne Anabolikaeinsatz nicht erreicht worden wären. Der

Anabolikaeinsatz zu Dopingzwecken kann schwerwiegende Folgen für die Pferde haben, wie

z.B. Störungen des Zyklus und der Spermatogenese bis hin zu irreversiblen

Fruchtbarkeitsstörungen, verfrühter Epiphysenfugenschluß bei Jungtieren und Gefahr von

Sehnen- und Bänderrupturen durch überproportionale Entwicklung der Muskulatur im

Vergleich zum Bandapparat. Ein langzeitiger Einsatz von Vitamin B1 und Vitamin E zur

Steigerung der Effizienz der Glykogenmobilisierung und –verwendung wird ebenfalls als

chronisches Doping angesehen. Die paradoxe Form des Dopings beinhaltet die

Verabreichung kleinster Dosen Neuroleptika und Minor-Tranquilizer über einen längeren

Zeitraum, um übermäßig erregbare und sehr nervöse Pferde wettkampffähig zu machen.

Hierzu finden heutzutage moderne Psychopharmaka aus der Humanmedizin Anwendung, die

eine Lösung von Angst- und Spannungszuständen bewirken und dabei nicht wesentlich den

Wachzustand und die Reaktions- und Leistungsfähigkeit negativ verändern (UNGEMACH

1985, SCHOENE 1996).

Doping auf Niederlage soll die Leistung eines Pferdes im Wettkampf mindern. Zu diesem

Zweck werden Neuroleptika und Minor-Tranquilizer in höheren Dosierungen als beim


paradoxen Doping, als auch Sedativa eingesetzt. Mit steigender Konzentration dieser

Substanzen wird zunehmend eine psychomotorische Antriebshemmung mit ausgeprägter

lokomotorischer Hemmung und Ausfall bedingter Reflexe bewirkt. Die negative

Dopingwirkung beruht darauf, dass die Pferde den für die Rennleistung entscheidenden

Fluchtreflex verlieren sollen und schwerer anzutreiben sind. Anwendung findet diese

Dopingform, auch als „outside job“ bezeichnet, zur Ausschaltung und Beeinflussung von

Wettkampfgegnern und somit zur Manipulation von Pferdewetten (UNGEMACH 1985,

SCHOENE 1996).

Bei Doping zur Wiederherstellung der natürlichen Leistungsfähigkeit soll keine

Leistungssteigerung im Sinne der Überschreitung physiologischer Schutzbarrieren und

Vordringen in autonom geschützte Leistungsbereiche durch Verabreichung von

Medikamenten erzielt, sondern „ lediglich“ die uneingeschränkte, schmerzfreie

Leistungsfähigkeit eines Pferdes im gesunden Zustand garantiert werden. Im engeren Sinne

gehören zu dieser Form des Dopings alle medikamentösen therapeutischen Maßnahmen, da

zum Zeitpunkt des Wettkampfes kein Unterschied zwischen Therapie und Doping gemacht

wird. Praktische Anwendung finden hier in erster Linie nichtsteroidale Antiphlogistika

(NSAID), aber auch Lokalanästhetika und Glukokortikoide, um besonders bei

Hochleistungspferden den (weiteren) sportlichen Einsatz trotz kleinerer Verletzungen oder

Lahmheiten zu gewährleisten. Von Bedeutung sind ebenfalls NSAID, die aufgrund ihrer

spasmolytischen Wirkkomponente bei Koliken eingesetzt werden, wie z.B. Metamizol und

Flunixin. Die periphere analgetische Wirkung der NSAID bewirkt, dass die Pferde näher an

ihrer natürlichen absoluten Leistungsgrenze laufen. Der entzündungshemmende Teilaspekt

der Prostaglandinsynthesehemmung durch NSAID kann durch fehlende Ruhigstellung der

Hochleistungssportpferde nicht zum Tragen kommen, wodurch der eigentliche

antiphlogistische Effekt antagonisiert wird. Durch Ausschalten des Schmerzes als

leistungsbegrenzende Schutzbarriere, ist bei weiterem Sporteinsatz mit einer

Verschlimmerung der Krankheitsprozesse und frühzeitigen Verschleiß der Pferde zu rechnen

(UNGEMACH 1985). Für Phenylbutazon und Oxyphenbutazon bestand bis vor Kurzem ein

Grenzwert, durch den der Einsatz dieser antiphlogistischen Wirkstoffe gewissermaßen legitim

war (SCHOENE 1996). Unter Berücksichtigung der bereits bei therapeutischen Dosierungen

auftretenden Nebenwirkungen besitzen NSAID als Dopingmittel ein sehr ungünstiges

Nutzen-Risiko-Verhältnis (Ungemach 1985). Die Anwendung von Lokalanästhetika zur

peripheren Schmerzausschaltung zu Dopingzwecken, die von UNGEMACH (1985), als

„ chemische Neurektomie“ bezeichnet wurde, birgt neben der Verschlimmerung der


Krankheitsprozesse zudem die Gefahr von Stürzen von Pferd und Reiter mit zusätzlicher

Gefährdung anderer Wettkampfteilnehmer.

Die Infusion von Elektrolytlösungen mit Zusatz von Natriumhydrogencarbonat, soll zumeist

eine erhöhte Pufferkapazität des Blutes bewirken, so dass durch erhöhte Muskeltätigkeit

anfallendes Laktat nicht so schnell zu einer Ermüdung und Schmerzentfaltung in der

Muskulatur führt. Dieses Verfahren stellt ebenfalls eine Form des Dopings zur

Wiederherstellung der natürlichen Leistungsfähigkeit dar (SCHOENE 1996).

Versehentliches oder unbeabsichtigtes Doping stellt das größte Problem für alle am

Pferdesport beteiligten Personenkreise dar (UNGEMACH 1985). Diese Form des Dopings

kommt nicht durch vorsätzliches Handeln zustande, sondern durch Unkenntnis über

Pharmakologie und –kinetik der entsprechenden Substanz (UNGEMACH 1985;

UNGEMACH et al. 1999). Viele Arzneimittel können bei einer völlig unverdächtigen

Hauptwirkung als Nebenwirkung eine klassische Dopingwirkung besitzen. Ein Beispiel

hierfür ist eine Antibiose mit Depot-Penicillin, welches das Lokalanästhetikum Procain

enthält. Dieser Zusatz wird noch für Wochen über den Urin ausgeschieden und ist im

Organismus viel länger nachweisbar als das Antibiotikum selbst und kann zudem eine zentral

stimulierende Wirkung ausüben (SCHOENE 1996, UNGEMACH 1985). Ein weiteres

Problem besteht darin, dass eine dopingrelevante Substanz sowohl Wirkstoff als auch

pharmazeutischer Hilfsstoff sein kann. Die häufigste Ursache unbeabsichtigten Dopings liegt

aber in der Unkenntnis von Ausscheidungszeiten und den daraus resultierenden Absatzfristen

vor einem Wettkampf. Solche „ Wartezeiten“ werden von vielen Faktoren beeinflusst. Ein

entscheidender Faktor ist die Sensitivität der Laboranalytik, d.h., je empfindlicher die

Nachweismethode, desto niedriger ist die Nachweisgrenze. Somit verlängert sich die

Absatzfrist für eine bestimmte Substanz. Weitere Faktoren, die Einfluss auf die

Ausscheidungszeiten einer Substanz haben sind u.a. Dosierung, Art der Verabreichung, der

Gesundheits- und Trainingszustand eines Pferdes, pH-Wert des Harnes, die

Metabolisierungsrate in der Leber und Wechselwirkungen mit anderen gleichzeitig

verabreichten Präparaten (MOSS und CLARKE 1977, UNGEMACH 1985, TOBIN und

WOOD 1989).

Unter Doping zur Maskierung anderer Substanzen versteht man die Verabreichung

zusätzlicher und gleichzeitig mit der potenten Dopingsubstanz applizierter Mittel, die den

Nachweis der eigentlich dopingrelevanten Substanz maskieren sollen oder ihre Ausscheidung

verzögern, verringern oder beschleunigen (SCHOENE 1996). Anwendung fanden dabei z.B.

Metamizol und Thiamin. Beide Substanzen sollten andere Wirkstoffe bei bestimmten


laboranalytischen Nachweisverfahren überlagern. Ein weiteres Beispiel ist in diesem

Zusammenhang die Substanz Probenecid, welche durch tubuläre Sekretionshemmung zu

einem Zurückhalten eines unerwünschten Wirkstoffes im Blut führt und ein negatives

Dopingergebnis im Urin bewirken soll (FORTH et al. 1996). Zum Doping zur Verdünnung

anderer Substanzen finden in erster Linie Diuretika Einsatz, die durch erhöhte Ausscheidung

von Körperwasser einen Verdünnungseffekt anderer Substanzen im Urin zur Folge haben

sollen. Diuretika besitzen nicht die Fähigkeit die Ausscheidung von anderen Substanzen zu

beschleunigen (SCHOENE 1996). All diese Maßnahmen zur Erschwerung des analytischen

Dopingnachweises stellen für die heute routinemäßig genutzten Nachweisverfahren kein

Problem mehr dar (UNGEMACH 1985).

Unter Doping mit körpereigenen Substanzen fällt hauptsächlich das Blutdoping. Die

Vorgehensweise besteht darin, dem Pferd einige Tage vor dem sportlichen Wettkampf eine

möglichst große Menge Blut zu entnehmen, die Erythrozyten zu separieren, ihnen eventuell

noch Ozon zuzusetzen und dem Pferd kurz vor Wettkampfbeginn die eigenen Erythrozyten zu

infundieren. Dieses soll eine zusätzliche Bereitstellung an Sauerstoff und damit eine erhöhte

Leistungsfähigkeit des Pferdes bewirken. Anzuzweifeln bleibt, ob die Erythrozytenmenge

ausreicht, um tatsächlich ein erhöhtes Sauerstoffreservoir zu schaffen (SCHOENE 1996).

Die Übergänge zwischen den einzelnen Dopingformen sind teilweise fließend. All diese

Methoden beruhen auf der Anwendung von Arzneimitteln, weshalb sie auch als „ chemisches

Doping“ bezeichnet werden. Ihnen stehen die ebenfalls verbotenen physikalisch- technischen

Methoden des Dopings gegenüber. Beispiele hierfür sind Neurektomien, Einsatz eines

ständigen Tracheotubus, Einsatz von Strom (z.B. durch Konstruktionen an Sporen, Gerte),

Anbringen spitzer Gegenstände an die Reitausrüstung, Fixation der Pferdezunge und vieles

mehr. Verbote zur Anwendung entsprechender Maßnahmen finden sich in den

Dopingbestimmungen des HVT, des DRV, der FN und FEI und im Tierschutzgesetz

(SCHOENE 1996).

Unter die in den Dopinglisten der Pferdesportverbände aufgeführten Wirkstoffgruppen fällt

ein Großteil der in der täglichen Pferdepraxis zu Therapiezwecken eingesetzten Substanzen.

Für den sportpferdebehandelnden Tierarzt ergibt sich demnach die Frage nach Absatzfristen,

damit von ihnen behandelte Sportpferde bei Dopingkontrollen Grenzwerte für bestimmte

Substanzen nicht überschreiten, bzw. nicht noch Spuren einer verbotenen Substanz im Plasma

und Urin aufweisen. In dem Handbuch zur Medikation (FN 2002) sind Karenzzeiten einiger

Wirkstoffe aufgeführt. Diese Karenzzeiten stellen eine Sperrfrist dar, innerhalb der ein Pferd


nach Gabe einer Substanz nicht an einem Wettkampf teilnehmen darf (DÜE 1998). Diese

Karenzzeiten haben keine Verbindlichkeit und sollen nur näherungsweise als Richtwerte

verstanden werden. Gleiches gilt für eine empfohlene Karenzzeit von 14 Tagen für alle nicht

in der Liste enthaltenen Wirkstoffe. Rechtsvorschriften zur Festlegung von Karenzzeiten im

Pferdesport bestehen derzeit nicht (UNGEMACH et al. 1999). Nach den zur Zeit geltenden

Dopingreglementierungen der deutschen Pferdesportverbände, gilt der Nachweis eines

Wirkstoffes unabhängig von der Konzentration, mit Ausnahme der Substanzen für die

Grenzwerte festgelegt wurden, als Versuch der Leistungsbeeinflussung eines Pferdes und

wird dem Doping gleichgesetzt (UNGEMACH 1988, DÜE 1998). Bei dieser sogenannten

„Nulllösung“ ist es unbedeutend, ob wirklich eine Leistungsbeeinflussung erfolgt oder nicht

(KLAUS und HAPKE 1994, UNGEMACH und NÜRNBERGER 1999). DÜE (1998)

hinterfragt, wie und wodurch „ Null“ bestimmt wird. „ Null“ kann einerseits bedeuten, dass es

keine geeignete Nachweismethode gibt, oder andererseits die Konzentration einer Substanz

unterhalb der durch die Analytik vorgegebenen Nachweisgrenze liegt. Durch immer sensibler

werdende Analytik wird vermutlich irgendwann der Nachweis eines Moleküls möglich

werden (TOBIN 1981), weshalb künftig ein sinnvoller Zusammenhang zwischen Nachweis

und Wirksamkeit pharmakologisch wirksamer Substanzen Gegenstand der Forschung sein

sollte. In diesem Zusammenhang spricht DÜE (1998) von einer sogenannten Highest Non

Effect Dosis (HNED). Die „ Nulllösung“ scheint somit keine dauerhafte Alternative zu sein.

KLAUS und HAPKE (1994) diskutieren unter Berücksichtigung der oben aufgeführten

Problematik und hinsichtlich der therapeutisch notwendigen medikamentösen Behandlung

von Sportpferden, ob nicht eine „ gesplittete Dopingliste“ erstellt werden oder eine begrenzte

Anzahl von Wirkstoffen zum Wettkampfzeitpunkt zulässig sein sollte. Eine derartige Liste

könnte verbotene Dopingmittel in eigentlichen Sinn ohne therapeutische Indikation, erlaubte

Stoffe in vorschriftsmäßiger Anwendung ohne Einfluss auf die Leistung des Pferdes und

letztendlich Tierarzneimittel enthalten, für die Karenzzeiten und Grenzwerte festgelegt

werden. Karenzzeit wäre hier der Zeitraum zwischen dem Tag der letzten

Arzneimittelapplikation und dem Wettkampftag (KLAUS und HAPKE 1994).

Mit fortschreitender Steigerung der Empfindlichkeit der Analytik geraten die

Pferdesportverbände zunehmend unter Druck, ob sie geringste Konzentrationen bzw. Spuren

eines zu therapeutischen Zwecken verabreichten Pharmakons in einer Dopingkontrolle positiv

bewerten sollen oder nicht. TOBIN (1989) hob bereits hervor, dass besonders im Urin

Wirkstoffspuren noch Tage nach einer therapeutisch notwendigen Behandlung und dem

Abklingen der pharmakologischen Effekte gefunden werden können. Gerade diese Situation


erschwert den Sportverbänden eine geradlinige und bei verschiedenen Fällen wiederholt

gerechte Bewertung und Ahndung. Eine Entscheidung kann nur dahingehend getroffen

werden, dass entweder jegliches Vorhandensein eines Wirkstoffes, wobei die von der

Analytik vorgegebene Nachweisgrenze limitierend wirkt, geahndet wird, oder nur

Konzentrationen oberhalb eines festgelegten Grenzwertes. Einen Lösungsansatz beschrieben

TOUTAIN und LASSOURD (2002) mit einem PK/PD-Modell, welches gerade in Bereichen

sehr niedriger Wirkstoffkonzentrationen Entscheidungen bezüglich der Dopingrelevanz

ermöglichen soll. Diesem Modell liegt eine mathematische Ermittlung sogenannter

irrelevanter Plasma (IPC)- und Urinkonzentrationen (IUC) zugrunde. Diese sind definiert als

Plasma- und Urinkonzentrationen eines bestimmten Wirkstoffes, die das Fehlen jeglicher

Auswirkungen auf den Organismus garantieren und die seitens der Pferdesportverbände nicht

geahndet werden müssten. Die Anwendung des Modells zuzüglich klinischer und

pharmakologischer Daten soll die Berechnung der IPC und IUC einer bestimmten

systemische wirkenden Substanz ermöglichen, wenn ausreichende pharmakologische Daten

zu diesem Wirkstoff vorhanden sind (TOUTAIN und LASSOURD 2002).

2.6. Allgemeine Grundprinzipien der Pharmakokinetik

Die Pharmakokinetik befasst sich als Teilgebiet der Pharmakologie mit

Konzentrationsveränderungen von Arzneistoffen im Organismus in Abhängigkeit von der

Zeit und deren mathematischer Beschreibung (MUTSCHLER 1991). Über den

Konzentrationsverlauf eines Pharmakons nach der Applikation bzw. seine Verweildauer im

Organismus bestimmen nach BAGGOT (1978), KOCH und RITSCHEL (1986),

MUTSCHLER (1991):

- Liberation- Freisetzung des Wirkstoffes aus der Arzneiform

- Absorption- Resorption

- Distribution- Verteilung im Organismus

- Metabolisierung- Biotransformation

- Elimination

Wichtige pharmakokinetische Parameter sind in diesem Zusammenhang die Bioverfügbarkeit,

scheinbares Verteilungsvolumen, Halbwertzeit und Clearance (FICHTL 2001). Sie werden


aus Konzentrations-Zeit-Verläufen von Arzneistoffen und gegebenenfalls deren Metaboliten

in der Kreislaufflüssigkeit (Blut, Plasma, Serum) und dem Harn ermittelt (MUTSCHLER

1991).

Um den zeitlichen Konzentrationsverlauf eines Arzneistoffes im Blut, Plasma und Urin zu

veranschaulichen, werden oft pharmakokinetische Modelle benutzt. Diese sogenannten

Kompartiment-Modelle erlauben eine mathematische Beschreibung der komplexen

Verteilungs- und Eliminationsvorgänge eines Pharmakons im Organismus (DYKE und

SAMS 1994). Dabei wird der Organismus in Kompartimente (Verteilungsräume) unterteilt,

die kinetisch als einheitlich betrachtet werden und in denen von einer gleichmäßigen

Verteilung einer Substanz ausgegangen wird, z.B. Blut, Gastrointestinaltrakt oder bestimmte

Gewebe (KIETZMANN 1983). Je nach Applikationsart, Verteilungsverhalten,

Metabolisierungs- und Eliminatonsverhalten können Ein- oder Mehrkompartimentsysteme

angewendet werden (KIETZMANN 1983).

Erfolgt der Übergang einer Substanz von einem Kompartiment in ein anderes

konzentrationsabhängig, so wird pro Zeiteinheit ein konstanter prozentualer Anteil der

Substanzmenge überführt. Hierbei bleibt die Zeitspanne, in der die Konzentration jeweils um

die Hälfte abnimmt oder sich verdoppelt, gleich. Diese Zeit wird als Halbwertzeit (HWZ)

bezeichnet (KIETZMANN 1983). Wird die exponentielle Abnahme der Stoffkonzentration im

Verhältnis zur Zeit halblogarithmisch dargestellt, so ergibt sich ein linearer Kurvenverlauf.

Die Steigung der erhaltenen Gerade entspricht der Geschwindigkeitskonstanten der

Elimination, aus der die Plasma-HWZ berechnet werden kann. Der Verlauf einer solchen

Konzentrationskurve wird als Kinetik 1. Ordnung bezeichnet (KIETZMANN 1983).

In Fällen von Sättigungserscheinungen gehorcht die Pharmakokinetik einer Kinetik 0.

Ordnung, bei der pro Zeiteinheit ein konstanter Anteil der Substanzmenge von einem zum

anderen Kompartiment transportiert wird. Die Abnahme der Stoffkonzentration stellt sich

bereits bei linearer Darstellung als Gerade dar (KIETZMANN 1983, FORTH et al. 1996).


2.6.1. Einkompartiment-Modell – Kinetik nach einmaliger intravenöser (i.v.)

Injektion

Hierbei wird angenommen, dass sich eine Substanz nach intravenöser Applikation im Körper

als in einem einzigen Kompartiment gleichmäßig verteilt. Folgt die Elimination dabei einer

Kinetik 1. Ordnung, so gehorcht die Konzentration folgender Funktion:

C = C0 � e-ke � t [1] ln C = ln C0 – ke � t [2]

C0 = Plasmakonzentration zum Zeitpunkt 0, unmittelbar nach der Injektion

ke = Eliminationsgeschwindigkeitskonstante

t = Zeit

Die graphische Darstellung von Gleichung [1], in der die Konzentration gegen die Zeit

aufgetragen wird, ergibt eine Exponentialkurve (s. Abb. 1.1). Diese Exponentialkurve kann

durch Logarithmieren in die Form einer Geradengleichung [2] transponiert werden (s. Abb.

1.2), wobei die Eliminationskonstante der Steigung der Geraden der logarithmischen Funktion

entspricht (MUTSCHLER 1991).

Abb. 1.1: exponentielle Darstellung des Abb. 1.2: halblogarithmische Darstellung des

Konzentrations-Zeit-Verhältnisses Konzentrations-Zeit-Verhältnisses

Die Eliminationshalbwertzeit (Plasma-HWZ, t1/2) ist die Zeit, in der die Plasmakonzentration

um die Hälfte des ursprünglichen Wertes abfällt. Sie ist nach folgender Gleichung zu

errechnen:


t1/2 = ek2ln

[3]

Die HWZ ist ein wichtiger pharmakokinetischer Parameter. Sie liefert die Grundlage für die

Dosierungsberechnung und Dosierungsintervallen bei wiederholten Arzneimittelgaben

(MUTSCHLER 1991). Mit Kenntnis der HWZ kann ungefähr die Zeitspanne abgeschätzt

werden, innerhalb der eine Substanz ausgeschieden ist und bei einer Wettkampfteilnahme

nicht zu einem positiven Dopingergebnis führen sollte. Nach TOBIN und WOODS (1989)

soll theoretisch nach der ersten HWZ 50% einer Dosis und innerhalb der zweiten HWZ 75%

einer Dosis ausgeschieden sein. Zur völligen Clearance benötigt das Pferd ca. 70

Eliminationshalbwertzeiten (KLAUS und HAPKE 1994).

2.6.2. Zweikompartiment-Modell – Kinetik nach i.v. Injektion

Bei einem Zweikompartiment-Modell wird angenommen, dass sich das Pharmakon nach der

Applikation zunächst gleichmäßig in einem zentralen Kompartiment (Plasma oder gut

durchblutete Organe) verteilt, und von dort in das periphere Kompartiment (schlechter

durchblutete Gewebe, wie z.B. Muskulatur, Fettgewebe) übergeht. Die Elimination findet

nach Rücktransfer der Substanz in das zentrale Kompartiment ausschließlich aus diesem statt.

Charakteristisch für die Kinetik nach einer i.v. Injektion, die mit dem Zweikompartiment-

Modell beschrieben werden soll, ist, dass bei halblogarithmischer Darstellung die

Plasmakonzentrationswerte zunächst rasch abfallen und anschließend auf einer weniger steil

verlaufenden Geraden liegen (MUTSCHLER 1991).

Abbildung 2 und die Gleichung [4] beschreiben die Blutspiegelkonzentration (C) im

Zweikompartiment-Modell:

C = C1 � e- �1� t + C2 � e- �z� t [4]


Abb. 2: lineare (linke Abb.) und halblogarithmische (rechte Abb.) Darstellung der

Plasmakonzentration (C) nach einmaliger intravenöser Applikation eines Pharmakons als Funktion der

Zeit (t) im Zweikompartiment-Modell

Nach Abbildung 2 sind �1 und �z sogenannte Hybridkonstanten, d.h., sie gehen sowohl –

daher die Bezeichnung – auf Verteilungs- als auch auf Eliminationsprozesse ein; �1

charakterisiert vorwiegend die Geschwindigkeit der Verteilung und Elimination und �z

vorwiegend die Geschwindigkeit der Elimination nach Erreichen sogenannter Steady-State-

Bedingungen. Durch Einsetzen der Eliminationskonstanten �z in Gleichung [4] kann die

terminale HWZ errechnet werden. Extrapoliert man die durch �z beschriebene Gerade auf die

Ordinate, so stellt der Schnittpunkt die Konzentration C2 nach Erreichen des

Verteilungsgleichgewichtes dar. Die initiale Phase der Verteilung und die beginnende

Ausscheidung werden durch den Schnittpunkt der Geraden mit der Steigung �1 und der

Ordinate durch die Konzentration C1 in Abb. 2 dargestellt. Addiert man die Konzentrationen

C1 und C2 erhält man die fiktive Anfangskonzentration C0 im Plasma (Konzentration im

zentralen Kompartiment) unmittelbar nach intravenöser Applikation.

Von DERENDORF et al. (2002) wird ein Dreikompartiment-Model beschrieben. Hierbei wird

zusätzlich ein „ tiefes“ Kompartiment angenommen, wenn der Substanzaustausch zwischen

einem peripheren und zentralen Kompartiment sehr lange dauert. Bei einem „ flachen“

Kompartiment stellt sich hingegen schnell ein Verteilungsgleichgewicht mit dem zentralen

Kompartiment ein.

Die pharmakokinetischen Kompartimente entsprechen in den meisten Fällen nicht einem

anatomisch definierten Verteilungsraum im Organismus, sondern stellen zumeist fiktive

Größen dar. Demzufolge wurde versucht, physiologisch realistischere kinetische Modelle,

sogenannte physiologische pharmakokinetische Modelle, zu entwickeln. Bei diesen wurden


anatomische, physiologische und physikochemische Parameter deutlicher berücksichtigt. Ein

solches Modell besteht aus einer Reihe hinter- oder nebeneinander geschalteter

Kompartimente (Organe, Körperregionen), die reine Verteilungsräume darstellen oder

zusätzlich eleminierende Funktion aufweisen können. Hierbei wird der Konzentrations-Zeit-

Verlauf in den einzelnen Organen in erster Linie durch den sie versorgenden Blutfluss und die

jeweilige Exkretionsrate bestimmt (MUTSCHLER 1991).

2.6.3. Bioverfügbarkeit

Geschwindigkeit und Ausmaß, womit ein Wirkstoff aus einer Arzneiform freigesetzt,

resorbiert und am Wirkort verfügbar wird, wird als Bioverfügbarkeit (F) bezeichnet. Da die

Bioverfügbarkeit in den meisten Fällen am Wirkort nicht bestimmt werden kann, wird sie aus

im Plasma oder Urin gemessenen Konzentrationen ermittelt. Bei intravenöser Applikation ist

die Bioverfügbarkeit mit 100% anzunehmen. Wird ein Arzneimittel extravasal (z.B. peroral

(p.o.), intramuskulär (i.m.), subkutan (s.c.)) verabreicht, müssen Faktoren, die die

Bioverfügbarkeit beeinflussen berücksichtigt werden. Dazu zählen beispielsweise

Geschwindigkeit der Wirkstofffreisetzung aus der galenischen Zubereitung, die

Resorptionsgeschwindigkeit und die Resorptionsquote des freigesetzten Wirkstoffs sowie das

Ausmaß des sogenannten First-pass-Effekts. In welchem Ausmaß ein Wirkstoff aus dem

Gastrointestinaltrakt resorbiert wird, ist von seinen physikalisch-chemischen Eigenschaften,

der intestinalen Durchblutung, der Größe der Resorptionsoberfläche des Darmes, der

Darmenzymaktivität oder der Interaktion mit anderen die Resorption beeinflussenden

Substanzen abhängig (BENET et al. 1996). Bevor ein durch die Magen- und

Dünndarmschleimhaut resorbierter Wirkstoff das Herz und somit Lungen- und

Körperkreislauf erreicht, gelangt er über die Pfortader in die Leber. Der First-pass-Effekt

bestimmt den Wirkstoffanteil, der bei dieser ersten Passage metabolisiert oder von der Leber

zurückgehalten wird. Folglich ist die Bioverfügbarkeit nach extravasaler Applikation geringer

als 100% (MUTSCHLER 1991). Praktisch bestimmt man die Bioverfügbarkeit, indem ein

Wirkstoff zunächst i.v. appliziert wird, um die volle Bioverfügbarkeit zu erhalten. Die gleiche

Dosis dieses Wirkstoffes wird dann extravasal, z.B. oral appliziert. Nach Berechnung der

Flächen unter beiden Plasma-Konzentrations-Zeit-Kurven (Area under the curve – AUC), die

ein Maß für die Konzentration im Organismus darstellen, kann die Bioverfügbarkeit nach

folgender Gleichung berechnet werden:


F = [%]100..⋅

vAUCiAUCx

[5]

AUCx = Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve bei extravasaler, z.B. oraler

Applikationsweise

AUCi.v. = Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve nach i.v. Injektion

Die AUC kann nach Gleichung [6] wie folgt berechnet werden, indem die in die Blutbahn

gelangte Substanzmenge (M) durch die totale Clearance (Cl) (siehe 2.6.5) dividiert wird:

AUC = ClM

[µg/ml*h] [6]

2.6.4. Verteilungsvolumen

Das Verteilungsvolumen ( Vd ) gibt an, in welchem Volumen sich eine Substanz bei einer

gemessenen Konzentration verteilen würde (scheinbares Verteilungsvolumen) (GLADTKE

und VON HATTINGBERG 1977). Unter Annahme eines Einkompartiment-Modells (bei

Kinetik 1. Ordnung), bei dem sich der gesamte Organismus wie ein Verteilungsraum verhält,

entspricht es bei rascher intravenöser Injektion dem Quotienten aus der applizierten

Wirkstoffmenge (D) [g] und der initialen Anfangskonzentration (C0) [g/l] (MUTSCHLER

1991).

Vd = ][0

lCD

[7]

Allgemein ist es aufgrund der Speziesvielfalt günstiger, ein relatives Verteilungsvolumen

(V`d) zu erheben. Dieses berechnet sich entsprechend der Gleichung [7] mit dem Unterschied,

dass die Dosierung in mg/kg KGW und demzufolge V`d in l/kg angegeben wird (FREY

2002).

Das Verteilungsvolumen kann identisch sein mit dem Plasmavolumen, der extrazellulären

Flüssigkeit oder dem Gasamtkörperwasser. Es kann aber auch vielfach größer sein als das

Gesamtvolumen des Körpers, wenn eine Substanz sich in einem bestimmten Gewebe

anreichert (KIETZMANN 1983). Somit ist das Verteilungsvolumen initial nach intravenöser


Applikation gering, da sich die gesamte Substanzmenge in der Blutbahn befindet. Es

vergrößert sich mit zunehmender Verteilung in die verschiedenen Gewebe (MUTSCHLER

1991). Demzufolge stellt es einen Proportionalitätsfaktor zwischen der applizierten

Wirkstoffmenge (D) und der Plasmakonzentration (C) dar (FICHTL 2001). Desweiteren

verteilt sich eine intravenös verabreichte Substanz aus der Blutbahn in die Gewebe. Nach

Abschluss der Verteilungsphase stellt sich ein Konzentrationsgleichgewicht zwischen Plasma

und Gewebe ein, das als Verteilungsvolumen im Steady State (Vss) bezeichnet wird. Das

Verteilungsvolumen im Steady Stae ist höher als das Verteilungsvolumen der Initialphase, da

sich nur noch ein geringer Teil der Substanz im Plasma (zentrales Kompartiment) und ein

größerer Teil in den Geweben (peripheres Kompartiment) befindet. Das Verteilungsvolumen

im Steady State (Vss) wird entsprechend Gleichung [8] berechnet. kcp und kpc stellen dabei

sogenannte Transferkonstanten zwischen dem zentralen und dem peripheren Kompartiment

dar.

Vss = ��

�

�

��

�

�+

pc

cp

k

k1 * Vc [l/kg] [8]

Durch Verteilung der Substanz in ein peripheres Kompartiment, kommt es im zentralen

Kompartiment zur Abnahme der Konzentration, wodurch sich ein Konzentrationsgradient

zwischen beiden Verteilungsräumen bildet. Folglich diffundiert die Substanz aus dem

peripheren in den zentralen Verteilungsraum, wobei es zu einem linearen

Konzentrationsabfall im peripheren Kompartiment kommt, der wiederum durch die

Hybridkonstante der Elimination (�) dargestellt wird. Dieser Zustand wird als sogenannter

Pseudo-Steady-State bezeichnet. Das entsprechende Verteilungsvolumen in der

Eliminationsphase (Vd�) wird nach Gleichung [9], in der CL der Clearance entspricht, wie

folgt berechnet (DERENDORF et al. 2002):

Vd� = β

CL[l/kg] [9]


2.6.5. Clearance

Die Ausscheidung eines Pharmakons und/oder seiner Metaboliten führt zu einer

Konzentrationsabnahme des Wirkstoffes im Organismus. Vorgegeben durch die physikalisch-

chemischen Eigenschaften (Molekulargewicht, pKa-Wert, Löslichkeit, Dampfdruck) der zu

eliminierenden Substanz, erfolgt die Ausscheidung renal (mit dem Urin), biliär und intestinal

(mit den Fäzes) oder pulmonal (mit der Atemluft). Bei laktierenden Tieren kann die Substanz

zudem mit der Milch ausgeschieden werden (MUTSCHLER 1991). Weitere

Ausscheidungswege, wie z.B. über die Haut, Einbau in Haaren, Schweiß oder Speichel sind

quantitativ meist zu vernachlässigen (BENET et al. 1996).

Die Clearance (CL) bezeichnet das Plasmavolumen, das pro Zeiteinheit von einem

Pharmakon befreit wird. Sie wird entsprechend der Gleichung [10] bestimmt durch den

Quotienten der Dosis und der Fläche unter der Kurve (MUTSCHLER 1991):

CL = AUC

D [10]

Da zumeist mehrere Organe an der Elimination eines Pharmakons aus dem Organismus

beteiligt sind, setzt sich die totale Körperclearance (CLT) aus mehreren Clearances

zusammen. Die wichtigsten sind die hepatische (CLH) und die renale Clearance (CLR).

CLT = CLR + CLH + CLX [11]

CLX = weitere Clearances

Die Organclearance stellt das Produkt der Organdurchblutung (Q) und dem

Extraktionsquotienten (E) dar:

CLOrgan = Q � E [12]

Der Extraktionsquotient (E) kann wie folgt bestimmt werden:

E = (Carteriell – Cvenös)/Carteriell [13]


Demnach ergibt sich für die hepatische Clearance:

CLH = QH � EH [14]

Da vor allem lipophile Substanzen nur sehr langsam oder kaum renal ausgeschieden werden,

werden sie im Organismus durch verschiedene Enzymsysteme in hydrophilere, leichter

ausscheidbare Stoffe metabolisiert. Diese Umwandlungsprozesse von Fremdstoffen werden

als Biotransformation bezeichnet; sie laufen hauptsächlich in der Leber ab. In sogenannten

Phase-I-Reaktionen werden Wirkstoffmoleküle enzymatisch (oxidativ, reduktiv oder

hydrolytisch) verändert. Bei den Phase-II-Reaktionen erfolgt eine Konjugation (Kopplung)

des Wirkstoffmoleküls bzw. eines durch Phase-I-Reaktion entstandenen Metaboliten an eine

körpereigene Substanz (z.B. Glucuron-, Essig- oder Schwefelsäure, Aminosäuren)

(MUTSCHLER 1991). Die Konjugationsprodukte können aufgrund ihrer Hydrophilie

schneller ausgeschieden werden (FREY 2002). Die hepatische Clearance wird durch das Maß

der Metabolisierung und der biliären Sekretion bestimmt (SAMS 1996).

Die renale Clearance (CLR) ist der Anteil des renalen Plasmaflusses, der pro Zeiteinheit von

einem Wirkstoff befreit wird (MUTSCHLER 1991). Sie ist abhängig von der Konzentration

des Pharmakons im Plasma (CP) und im Urin (CU) sowie vom Umfang der Harnbildung (urine

flow rate) und wird nach folgender Gleichung bestimmt (SCHOENE 1996):

CLR = (CU � urine flow rate)/CP [ml/min] [15]

Theoretisch besteht nach dieser Gleichung eine Proportionalität zwischen der

Wirkstoffkonzentration im Plasma und Urin bei konstanter renaler Clearance und konstanter

Flussrate des Urins. Praktisch werden bei Blasenentleerungen nicht immer konstant gleiche

Mengen Urin abgesetzt, so dass unterschiedliche Urinkonzentrationen in der Blase

„ gespeichert“ werden (SAMS 1996, TOBIN et al. 1999). Daher ist ein Rückschluß von der

Urinkonzentration auf die Plasmakonzentration oft ungenau. Zudem ist das Ausmaß der

renalen Elimination oft Schwankungen, beispielsweise bedingt durch Veränderung der

Nierendurchblutung, des pH-Wertes und gegebenenfalls nach Diuretikaverabreichung,

unterlegen. Der physiologische pH-Wert liegt beim Pferd im Stand der Ruhe im leicht

alkalischen Bereich von pH 7 bis 8 (SCHOENE 1996). Der Urin-pH-Wert ist von

verschiedenen Faktoren, wie z.B. der Ernährung oder intensiver körperlicher Anstrengung


abhängig (UNGEMACH und NÜRNBERGER 1999). Nach MOOS und HAYWOOD (1973)

produzieren im Training stehende Vollblutpferde eher einen sauren Harn, der durch vermehrte

Bildung und Ausscheidung saurer Stoffwechselendprodukte bedingt ist. Über einen Zeitraum

von 1 bis 1,5 Stunden nach intensivem Training soll es nach GERKEN et al. (1991) zu einem

pH-Wertabfall um ein bis drei Einheiten kommen. Zahlreiche Arzneimittel sind schwache

Säuren oder Basen, deren Ionisierungsgrad pH-abhängig ist (FREY 2002). Je niedriger der

Urin-pH-Wert ist, um so langsamer werden „ saure“ Arzneimittel ausgeschieden, während

„ basische“ Arzneimittel dann vermehrt ionisiert vorliegen, nicht rückresorbiert und somit

schneller ausgeschieden werden (UNGEMACH und NÜRNBERGER 1999, FREY 2002,

MUTSCHLER 1991, SCHOENE 1996). Nach körperlicher Anstrengung kommt es

physiologisch zu einer kurzzeitig gesteigerten Diurese. Die Ausscheidung von normalerweise

stark rückresorbierter Pharmaka steigt, was aber bei gleichzeitig vermehrter

Flüssigkeitsausscheidung keine Konzentrationsänderung dieser Substanzen im Urin bewirkt.

Normalerweise nicht tubulär rückresorbierten Pharmaka sind aufgrund einer

leistungsinduzierten Diurese vorübergehend verringert im Urin vorhanden. Damit ergibt sich

für „ saure“ Arzneimittel eine eventuelle Verdeckung eines positiven Dopingbefundes, da

Dopingproben gewöhnlich unmittelbar nach dem Wettkampf gewonnen werden (SCHOENE

1996).

2.7. Nichtsteroidale Antiphlogistika (NSAID)

Pharmaka zur Beeinflussung von Entzündungen werden unter dem Begriff Antiphlogistika

zusammengefasst. In Abgrenzung zu den Kortikosteroiden gehören aromatische organische

Säuren ohne Steroidgerüst zu den nicht-steroidalen Antiphlogistika. Entzündungshemmende

Wirkstoffe greifen auf unterschiedlichen Ebenen in die „ Pathophysiologie“ der Entzündung

ein, indem sie beispielsweise die Freisetzung von Entzündungsmediatoren beeinflussen,

überschießende Immunreaktionen unterdrücken oder degenerative Prozesse abschwächen.

Entzündungen sind primär eine physiologische Antwort des Organismus auf bestimmte Reize.

Sie zeigen zumeist ohne Einsatz von Antiphlogistika eine hohe Spontanheilungsrate, wenn

die auslösende Noxe beseitigt wird. Da die Anwendung entzündungshemmender Wirkstoffe

eine rein symptomatische Therapie darstellt, ist sie indiziert, wenn die eigentliche Ursache

nicht zu beheben ist und/oder überschießende Entzündungsreaktionen eine Verschlimmerung


des Krankheitszustandes herbeiführen würden (UNGEMACH 2002). Aufgrund einzelner

Wirkkomponenten können die NSAID in zwei Gruppen eingeteilt werden:

- Wirkstoffe mit deutlicher zentraler analgetischer und antipyretischer, aber nur geringer

entzündungshemmender Wirkung, und

- Wirkstoffe mit vorwiegend peripher entzündungshemmenden Eigenschaften, aber nur

geringer antipyretischer Wirkung

Anwendungsgebiete für NSAID sind in der Veterinärmedizin akute schmerzhafte

Entzündungsprozesse besonders des Bewegungsapparates und auch durch Endotoxine

bedingte Krankheitszustände. Hier werden sie in erster Linie bei Pferden und Hunden zur

Behandung entzündlich muskuloskelettaler Erkrankungen, wie Arthritiden, Myalgien,

Erkrankungen des Bänderapparates, als auch zur Fiebersenkung und Kolikbehandlung

eingesetzt (UNGEMACH 2002). Seit Beginn der Anwendung der NSAID besteht eine

fortwährende Diskussion um Vor- und Nachteile ihres Gebrauchs (KLAUS und HAPKE

1994). Zu den NSAID gehören vorwiegend folgende Substanzgruppen: Pyrazolidine und

Pyrazolone (Phenylbutazon, Oxyphenbutazon, Suxibuzon, Metamizol),

Indolessigsäurederivate (Indometacin, Diclofenac), Arylpropionsäurederivate (Naproxen,

Ibuprofen, Ketoprofen, Carprofen, Vedaprofen), Fenamate (Meclofenaminsäure, Flunixin-

Meglumin, Tolfenaminsäure), Oxicame (Meloxicam, Piroxicam), Salicylsäure-Derivate

(Acetylsalicylsäure), Anilin-Derivate (Paracetamol) (KLAUS und HAPKE 1994,

KIETZMANN et al. 2002, UNGEMACH 2002).

2.7.1. Mediatoren der Entzündung

Die Entzündung (Inflammatio) ist eine Reaktion des Organismus auf vorrangig von außen

einwirkende Noxen. Nach Reizung kommt es zu Störungen des Gewebestoffwechsels, in

dessen Gefolge die Kardinalsymptome einer Entzündung zu beobachten sind:

• Rubor - Rötung durch Hyperämie

• Calor - Temperaturanstieg

• Tumor – Schwellung durch Exsudation

• Dolor - Schmerz

• Functio laesa - Funktionsbeeinträchtigung


Bei der Entstehung dieser Symptome spielen Mediatoren der Entzündung eine große Rolle

(GOLBS und SCHERKL 1996). Als Reaktion auf eine Zellschädigung wird das Enzym

Phosholipase A2 aktiviert, welches Arachidonsäure aus Phospholipiden der Zellmembran

freisetzt (KLAUS und HAPKE 1994). Arachidonsäure kann auf zwei enzymatischen

Hauptwegen, dem Cyclooxygenase- und dem Lipoxygenase-Weg, zu zahlreichen

Mediatorsubstanzen umgewandelt werden (MUTSCHLER 1991).

Von dem Enzym Cyclooxgenase existieren Isoformen, von denen die COX-1

physiologischerweise (konstitutiv) in hohen Konzentrationen, beispielsweise in der

Magenschleimhaut und in der Niere gebildet wird. Die COX-2 entspricht einem durch

entzündliche Faktoren induzierbaren Enzym, welches sich durch fortschreitende entzündliche

Prozesse fortlaufend im peripheren Entzündungsgebiet anreichert. Dieses Phänomen hat die

Forschung auf Entwicklung selektiver COX-2-Hemmstoffe ausgerichtet, die die durch

NSAID hervorgerufenen Nebenwirkungen möglichst gering halten sollen (KIETZMANN et

al. 2002).

Nach Katalyse durch die Cyclooxygenase entsteht zunächst das Prostaglandinendoperoxid

PGG2, welches wiederum durch eine Peroxidase zu einem weiteren

Prostaglandinendoperoxid, dem PGH2 , umgewandelt wird. Aus PGH2 entstehen

verschiedene Prostaglandine, Thromboxan A2 und Prostacyclin. Die Wirkungen der in fast

allen Geweben vorkommenden Prostaglandine sind außerordentlich komplex, wobei die

verschiedenen Substanzen teilweise synergistisches, teilweise antagonistisches Verhalten

zeigen. Beispiele für ihre Wirkungen sind: Dilatation/Kontraktion glatter Muskulatur (z.B.

Gefäße, Bronchien, Gastrointestinal-Trakt, Uterus), Hemmung/Förderung der

Thrombozytenaggregation, Hemmung der Magensaftsekretion, Verstärkung der Effekte

anderer Mediatoren bezüglich der Gefäßpermeabilität und Schmerzempfindung,

Fieberentstehung durch Wirkung auf den Hypothalamus, Förderung der Nierendurchblutung,

Luteolyse, Steigerung der Spermienaktivität (MUTSCHLER 1991). Thromboxan A2 wird von

Thrombozyten produziert und fördert ihre Aggregation. Zudem werden ihm vaso- und

bronchokonstriktorische Wirksamkeit zugeschrieben, wodurch es einen Antagonisten des

Prostacyclins darstellt. Das im Gefäßendothel vorkommende Prostacyclin besitzt zudem

broncho- und vasodilatatorische und thrombozytenaggregationshemmende Wirkung

(MUTSCHLER 1991).

Wird die Arachidonsäure durch das Enzym Lipoxygenase katalysiert, entsteht zunächst

Hydroxyperoxyarachidonsäure, die wiederum enzymatisch zu Hydroxyperoxy- (HPETE) und


weiter zu Hydroxyarachidonsäure (HETE) sowie zu Leukotrienen umgesetzt wird (KLAUS

und HAPKE 1994). Das Leukotrien B4 wirkt leukotaktisch, die Leukotriene C4, D4 und E4

hingegen bronchokonstriktorisch. Letztere besitzen diesbezüglich im Vergleich zu Histamin

eine 1000-fach stärkere Wirksamkeit. Allerdings tritt ihre Wirkung langsamer ein als die

anderer Mediatoren. Desweiteren werden ihnen vasokonstriktorische Effekte zugeschrieben.

Beim enzymatischen Abbau der Hydroperoxide entstehen Sauerstoffradikale, die zu

Denaturierung von Enzymen, Schädigung von Zellmembranen, Depolimerisation von

Bindegewebssubstanzen (Kollagen, Hyaluronsäure) sowie zu erhöhter Gefäßpermeabilität

führen können (MUTSCHLER 1991). Abbildung (3) stellt die Arachidonsäurekaskade dar.

Abb. 3: Biosynthese von Produkten der Arachidonsäure (Arachidonsäurekaskade) nach GOLBS und

SCHERKL (1996)


2.7.2. Wirkungsmechanismus der NSAID

Die NSAID besitzen antiphlogistische, analgetische und antipyretische Wirkqualitäten, wobei

die einzelnen Wirkkomponenten bei den verschiedenen NSAID sehr unterschiedlich

ausgeprägt sind. Die wichtigste pharmakodynamische Wirkung besteht in der Hemmung der

Cyclooxygenase (COX) und damit der Synthese von Prostaglandinen, Thromboxan A2 und

Prostacyclin (KIETZMANN et al. 2002). Folglich werden die Kardinalsymptome der

Entzündung durch Reduktion der Vasodilatation, Kapilarpermeabilität, der Chemotaxis und

der Sensibilisierung der Schmerzrezeptoren gegenüber Kininen und Histamin abgeschwächt

oder beseitigt (UNGEMACH 2002). Durch Blockade der Thromboxan A2 –Bildung werden

hämostatische Prozesse verhindert und eine antithrombotische Wirksamkeit erzielt (KLAUS

und HAPKE 1994).

Ein weiterer antiinflammatorischer Mechanismus, der nicht auf Hemmung der

Prostaglandinsynthese beruht, sondern der eine Einlagerung der NSAID in zelluläre

Membranen und das Abfangen von Sauerstoffradikalen darstellt, wird diskutiert. Dieses soll

u.a. eine Aggregationshemmung von Granulozyten und Stabilisierung von

Lysosomenmembranen bewirken. Zusätzlich soll einer übermäßigen Bildung von

Mucopolysacchariden und damit einer Bindegewebsproliferation entgegengewirkt werden

(KIETZMANN et al. 2002, UNGEMACH 2002).

2.7.3. Pharmakokinetik der NSAID

Nach oraler Verabreichung werden NSAID im Gastrointestinaltrakt im allgemeinen gut

resorbiert und besitzen eine hohe Bioverfügbarkeit. Bei zeitgleicher Fütterung kann die

Resorption verzögert sein (KLAUS und HAPKE 1994, KIETZMANN et al. 2002). NSAID

zeigen aufgrund ihrer physikochemischen Eigenschaften eine hohe Bindung an

Plasmaproteine (über 90%) und damit ein geringes scheinbares Verteilungsvolumen.

Chemisch stellen die meisten NSAID schwache Säuren dar, deren pKa-Wert zwischen 3 bis 5

liegt und eine gute Penetration in entzündliches Gewebe ermöglicht (KLAUS und HAPKE

1994, UNGEMACH 2002). NSAID sind in diesen Geweben noch vorhanden, wenn sie im

Plasma nicht mehr nachgewiesen werden können (KLAUS und HAPKE 1994). Die

Elimination aus entzündlichem Gewebe, welches kinetisch ein tiefes Kompartiment darstellt,


erfolgt entsprechend langsam, so dass direkt am Ort der Wirkung über längere Zeit wirksame

Konzentrationen aufrechterhalten werden, während die Konzentration im Plasma (besonders

beim Pferd) relativ schnell absinkt. Im Entzündungsexsudat und in der Synovia von

Gelenken konnten beim Pferd für Phenylbutazon und Flunixin Konzentrationen festgestellt

werden, die über denen im Plasma lagen und zudem länger als 24 Stunden wirksam waren

(KLAUS und HAPKE 1994, UNGEMACH 2002). NSAID-Plasmaspiegel sind somit kein

eindeutiger Hinweis auf das Maß ihrer therapeutischen Aktivität (KLAUS und HAPKE

1994). Die Diskrepanz zwischen kurzer Halbwertzeit im Plasma und längerer Wirksamkeit

der NSAID lässt sich auch durch teilweise irreversible Hemmung der Cyclooxygenase und

der besonderen Affinität dieser Substanzen zu bestimmten (entzündeten) Geweben erklären

(UNGEMACH 2002). Zudem kommt es zu einer Akkumulation in entzündetem Geweben.

Nach KLAUS und HAPKE (1994) ist die Wirkdauer der NSAID kürzer als die Zeit für die

Neubildung der Cyclooxygenase. Dosierungen der NSAID dürfen nicht allein aufgrund der

Plasmahalbwertzeit berechnet werden, sondern vorwiegend nach der Gewebekinetik bzw.

Wirkung (KIETZMANN et al. 2002).

Flunixin ist in therapeutischer Dosierung beim Pferd das NSAID mit der größten relativen

Wirksamkeit, die dann weiter über Meclofenaminsäure, Phenylbutazon, Naproxen bis hin zu

den Salicylaten abnimmt (LEES und HIGGENS 1985).

Die Elimination der NSAID erfolgt größtenteils renal, wobei Speziesunterschiede bestehen.

Allgemein ist die renale Elimination aller NSAID bei Absinken des Harn-pH-Wertes in den

sauren Bereich verzögert.

2.7.4. Nebenwirkungen der NSAID

Wichtige unerwünschte Wirkungen begründen sich auf die Hemmung der COX-1 und damit

auf Hemmung der systemischen Prostaglandinsynthese, die von der erwünschten Hemmung

der COX-2 lokal im Entzündungsgebiet nicht komplett zu trennen ist. Alle Cyclooxygenase-

Hemmstoffe besitzen demnach ein gleiches qualitatives Spektrum an Nebenwirkungen

(KIETZMANN et al. 2002). Als Nebenwirkungen können auftreten:

• Reizungen bis hin zu Ulzerationen der Schleimhaut des Gastrointestinal-Traktes: Das

Vorhandensein vasodilatatorisch wirksamer Prostaglandine ist deutlich herabgesetzt,


so dass es zu lokaler Ischämie in diesem Bereich kommt, die hier eine

Gewebeschädigung begünstigt. Geringere Konzentration des Prostaglandin E2 und

des zytoprotektiv wirkenden Prostacyclins bewirken eine vermehrte Sekretion von

Magensäure und eine verminderte Schleimsekretion. Beides verstärkt die

Schleimhautreizung. Zudem führt die Anreicherung der NSAID aufgrund ihres pKa-

Wertes in den Mukosazellen (pH-Falle) zu einer weiteren Reizung der Schleimhaut.

Mit dieser Nebenwirkung ist sowohl nach oraler als auch nach parenteraler

Applikation der NSAID bereits im therapeutischen Dosierungsbereich (besonders bei

Endoparasitenbefall) zu rechnen (UNGEMACH 2002). Diese Art der Nebenwirkung

äußert sich in Erbrechen, abdominalen Schmerzerscheinungen, Durchfällen,

Verstopfung, punktförmige Blutungen der Schleimhaut bis hin zu Ulzeration und

Perforation.

• Gefahr von Blutungen: Durch Hemmung der Thromboxansynthese ist durch

Hemmung der Thrombozytenaggregation die Blutgerinnung verzögert/ herabgesetzt.

Dieses betrifft besonders die Schleimhaut des Magen-Darm-Traktes. Ein weiteres

Risiko stellen Notfalloperationen, wie z.B. eine Kolikoperation dar, wenn zuvor ein

NSAID in hoher Dosierung über einen längeren Zeitraum verabreicht wurde kann es

bis hin zum Verbluten des Patienten führen (SCHOENE 1996).

• Blutbildveränderungen: Besonders bei Mensch und Pferd kann es nach längerer

Anwendung (hoher Dosierungen) zu Blutbildveränderungen in Form von

Thrombozytopenie und Leukozytopenie kommen, so dass bei längerer

Behandlungsdauer eine Kontrolle des Blutbildes erforderlich ist (UNGEMACH 2002).

• Beeinträchtigung der Nierenfunktion: Vermutlich kommt es durch eine verminderte

Prostacyclin- und Prostaglandin E2-Konzentration zu einer verminderten

Durchblutung der Nieren. Wasser- und Salzretention können gelegentlich zu

Nierenschäden (Papillarnekrose) und sekundär zu Ödembildung oder zur

Dekompensation einer bestehenden Herzinsuffizienz führen (KIETZMANN et al.

2002, UNGEMACH 2002).

• Bronchospasmus: Durch Hemmung der Prostaglandinsynthese aus der Arachidonsäure

läuft kompensatorisch der Lipoxygenaseweg verstärkt, wodurch vermehrt

bronchokonstriktorisch wirksame Leukotriene gebildet werden. Dieses Phänomen

wird in der Humanmedizin als „ Aspirin-Asthma“ bezeichnet (UNGEMACH 1997).

• Wirkungsbeeinträchtigung anderer Arzneimittel: NSAID gehen eine hohe

Plasmaproteinbindung ein, wodurch sie andere Arzneimittel aus der Proteinbindung


verdrängen und dadurch deren Wirksamheit letztlich verstärken können

(KIETZMANN et al. 2002).

Mit Entwicklung von selektiven COX-2-Hemmstoffen, wie sie in der Humanmedizin,

vertreten durch die Wirkstoffe Celeccoxib und Rofecoxib, bei aktivierter Arthrose und

Polyarthritis angewendet werden, erhofft sich die Tiermedizin eine Reduzierung der durch die

COX-1 bedingten gastrointestinalen Nebenwirkungen (KIETZMANN et al. 2002). Beispiel

einer Neuzulassung im Veterinärbereich ist der Wirkstoff Firocoxib, der sich jedoch noch

nicht im Handel befindet (persönliche Mitteilung Prof. Dr. KIETZMANN).

2.7.5. Metamizol

2.7.5.1. Metamizol - Pharmakodynamik

Synonyme für Metamizol sind Noraminopyrinmethansulfonat und Novaminsulfon. Im

Englischen wird es als Dipyron bezeichnet (EBERT et al. 2002). Metamizol ist ein

wasserlösliches Pyrazolon-Derivat, welches seit 1922 für seine gute analgetische,

antipyretische und spasmolytische Wirksamkeit bekannt ist (LEVY et al. 1995). Die

klinische Relevanz einer antiinflammatorischen Wirksamkeit, die auf die Hemmung der

COX-2 zurückgeführt wird, ist nach CAMPOS et al. (1999) und LEVY et al. (1995) fraglich.

Aufgrund seiner analgetischen und spasmolytischen Wirkkomponente wird Metamizol zur

Behandlung von Spasmen der glatten Muskulatur des Magen- und Darm-Traktes (besonders

bei Kolik) und anderer Bauchhöhlenorgane (Gallengänge, Gallenblase, Harnapparat) als auch

zur Behebung eines Spasmus bei Schlundverstopfung angewendet (LEVY et al. 1995,

LÖSCHER 2002). Weitere Indikationen sind Fieber, geringgradige Schmerzzustände bei

Muskel- und Gelenkerkrankungen, postoperative Wundschmerzen als auch Schmerzkontrolle

bei Tumorpatienten (LEVY et al. 1995, EBERT et al. 2002). Im humanmedizinischen Bereich

steht Metamizol in Form von Tabletten, Sirup, Tropfen, Zäpfchen und Injektionslösung zur

Verfügung (LEVY et al. 1995). In der Veterinärmedizin ist es als Monopräparat in Form einer

50%igen Injektionslösung für Pferd, Rind, Schwein, Hund und Katze, als auch in

Tablettenform für Hunde zugelassen. Bei Rindern, Schweinen und Equiden darf Metamizol

laut EU-Höchstmengenverordnung angewendet werden. Die Dosierung beträgt bei allen

Tierarten 20 – 50 mg/kg KGW und wird i.m. oder langsam i.v. verabreicht. Bei Bedarf kann

die Applikation ein- oder zweimal täglich im Intervall von 8 Stunden wiederholt werden


(EBERT et al. 2002). Metamizol besitzt im Vergleich zu anderen NSAID eine relativ große

therapeutische Breite. Bei Überdosierung kann es zu im Folgenden aufgezählten

Erscheinungen kommen, die symptomatisch zu behandeln sind: starker Speichelfluß,

Erbrechen, Kreislaufkollaps, zunächst erhöhte Atemfrequenz und Krämpfe, später Koma und

Atemlähmung (EBERT et al. 2002). Neben den für NSAID typischen Nebenwirkungen sind

beim Mensch Blutbildschäden bis hin zur Agranolozytose und anaphylaktischen Reaktionen

während/ unmittelbar nach intravenöser Injektion aufgetreten (LEVY et al. 1995, EBERT et

al. 2002). Aufgrund möglicher Nebenwirkungen ist der Wirkstoff Metamizol beispielsweise

in Schweden und den USA nicht zugelassen (LEVY et al. 1995). Laut EBERT et al. (2002)

sind nach mehrmaliger täglicher Applikation hoher Dosen Metamizol über mehrere Tage

beim Pferd Leukozytopenien aufgetreten. In einer Studie von BENTUR und COHNEN

(2004) ist beim Mensch auch nach längerer Verabreichung von Metamizol kein Fall von

Agranulozytose aufgetreten; das Auftreten einer Agranulozytose bringen die Autoren mit

geographischen Unterschieden in Zusammenhang. IBANEZ et al. (2004) erlangten ähnliche

Ergebnisse bezüglich der Ausbildung einer Agranulozytose nach Verbreichung von

Metamizol und machten sie zudem abhängig von Dosierungsmustern, Dauer der Anwendung

und Wechselwirkungen mit gleichzeitig verabreichten Wirkstoffen. TANYILDIZI und

BOZKURT (2003) untersuchten nach Verabreichung von 50 mg/kg Metamizol die

Hyaluronidase-Aktivität und Auswirkungen auf Spermien beim Widder mit dem Ergebnis,

das die Hyaluronidase-Aktivität und die Spermatozoenmobitlität zunahmen wobei die

Spermakonzentration und das Ejakulatvolumen über 6 Tage geringer waren. Folglich

erscheint der Einsatz von Metamizol bei Zuchttieren dieser Spezies während der Decksaison

ungeeignet.

SANZ et al. (2004) entwickelten ein flußzytometrisches Nachweisverfahren zur Bestimmung

der Basophilenaktivität und Sulfidoleukotriene im Blut für eine Invitro-Diagnose der

Hypersensitivität gegenüber Acetylsalicylsäure und anderen NSAID (u.a. Metamizol). Sollte

dieses Testverfahren mit einer Spezifität von über 90% klinisch zum Einsatz kommen, könnte

es hilfreich sein, allergische Reaktionen auf diese Substanzen im Vorfeld zu vermeiden.

2.7.5.2. Metamizol – Pharmakokinetik

Mit oral verabreichtem 14C-markierten Metamizol konnte gezeigt werden, dass es im Magen

sofort zu 4-Methylaminoantipyrin (4-MAA) hydrolysiert und in dieser Form im Dünndarm


resorbiert wird (LEVY et al. 1995). Sowohl nach oraler als auch nach i.v. Applikation wurden

ca. 90% der verabreichten Dosis mit dem Harn und ca. 10% mit den Faeces ausgeschieden.

Insgesamt waren mehr als 20 Metaboliten nachweisbar, von denen die 4 Hauptmetaboliten 4-

MAA, 4-Aminoantipyrin (AA), 4-Acetylaminoantipyrin (AAA) und 4-Formylaminoantipyrin

(FAA) ca. 60% der verabreichten Dosis darstellten.

Mit Einführung der HPLC konnten die 4 Hauptmetaboliten des Metamizols gleichzeitig im

Plasma bzw. Urin nachgewiesen werden (ASMARDI und JAMALIE 1983, DAMM 1989).

Nachfolgend wurden Studien bezüglich ihrer Pharmakokinetik durchgeführt (ROHDEWALD

et al. 1983, DAMM 1989). Im Humanbereich wurden die vier Hauptmetaboliten des

Metamizol vorwiegend mittels HPLC und UV-Detektion im Plasma, Urin und Speichel

nachgewiesen (LEVY et al.1995), während in Studien am Tier (insbesondere

Dopingnachweis) die Gaschromatographie mit Massenspektroskopie zur Untersuchung von

Pferde-Plasmaproben (SCHLINGLOFF 1997), bzw. Pferde-Urinproben (POPOT et al. 2000)

Anwendung fand.

Beim Mensch konnte nach oraler Applikation vom Metamizol dieses nicht in unveränderter

Form im Plasma und Urin nachgewiesen werden, während nach i.v. Injektion sehr geringe

Mengen unverändertes Metamizol zu finden waren (VOLZ und KELLNER 1980, ASMARDI

und JAMALIE 1985). Metamizol wird unmittelbar nach oraler Aufnahme im Magen

komplett, bzw. nach i.v. Injektion „ nur“ nahezu vollständig nichtenzymatisch zu 4-MAA

hydrolysiert. Somit beruhen pharmakokinetische Untersuchungen auf dem quantitativen

Nachweis des 4-MAA und weiterer Metaboliten (ASMARDI und JAMALI 1985, LEVY et

al. 1995, SCHLINGLOFF 1997). Abbildung 4 zeigt die chemische Struktur von Metamizol

und seiner vier Hauptmetaboliten.


Abb. 4: Strukturformel von Metamizol (Dipyrone), 4-MAA, AA, FAA und AAA

Metamizol unterliegt zu einem hohen Prozentsatz einem First-pass-Effekt, in den ein bislang

nicht genau identifiziertes Cytochrome-P450-Isoenzym involviert ist (LEVY et al. 1995). 4-

MAA wird einerseits durch Desalkylierung zu AA, welches nach AGUNDEZ et al. (1994)

und LEVY et al. (1995) analgetische, antipyretische und antiphlogistische Wirksamkeit

besitzt, metabolisiert und weiter zu AAA alkyliert. Andererseits kann 4-MAA zu FAA

oxydiert werden (DAMM 1989, VLAHOV et al. 1990). Nach LEVY et al. (1995) sind für die

Bioverfügbarkeit von 4-MAA je nach Darreichungsform und Applikationsweise folgende

Werte ermittelt worden: 85% bei Tabletten, 89% bei Tropfen, 54% bei Zäpfchen, 87% nach

intramuskulärer Injektion. Die Absorption von 4-MAA erfolgt bei oraler Verabreichung und

gleichzeitiger Nahrungsaufnahme im Vergleich zur Nüchterneinnahme geringgradig

langsamer (FLUSSER et al. 1988). Die Plasmaproteinbindung, die mittels Ultrafiltration

ermittelt wurde, beträgt für 4-MAA 58%, 48% für AA, 18% für FAA und 14% für AAA

(ZYLBER-KATZ et al. 1985). Die höhere Proteinbindung von 4-MAA und AA im Vergleich

zu FAA und AAA ist durch ihre chemische Struktur erklärbar. Das geringe

Verteilungsvolumen ist von LEVY et al. (1995) nach intravenöser Injektion von Metamizol

mit 33,5 l bzw. nach oraler Applikation mit 1,19 l/kg angeben. ASMARDI und JAMALI


(1985), SCHLINGLOFF (1997) und KLAUS et al. (1997) beschreiben nach i.v. Injektion

von Metamizol die Konzentrations-Zeit-Verhältisse von 4-MAA im Plasma mit einem

offenem Zweikompartiment-Modell. Nach unveröffentlichten Studien von LEVY et al.

(1995) passieren die Metaboliten des Metamizol die Blut-Hirn-Schranke und sind in der

Cerebrospinalflüssigkeit nachweisbar. Die vier Hauptmetaboliten konnten nach einmaliger

oraler Verabreichung einer therapeutischen Dosis bis 48 Stunden nach der Applikation (post

applicationem – p.a.) in der Muttermilch quantifiziert werden. Dabei wurde gezeigt, dass die

Konzentrationen der Metaboliten im Plasma und der Muttermilch korrelieren.

Untersuchungen von NEDDERMANN und ROHDEWALD (1988) zeigen, dass 4-MAA nach

oraler Gabe niedriger Metamizol-Dosierung als einziger der vier Hauptmetaboliten im

Speichel erscheint, wohingegen die übrigen erst nach höheren Dosierungen nachgewiesen

werden konnten. Die Metamizol-Konzentrationen des Speichels korrelieren mit dem Anteil

nichtproteingebundener Metaboliten im Plasma. Die HWZ der Elimination von 4-MAA aus

Plasma und Speichel ist nahezu identisch. Metamizol bzw. seine Metaboliten werden zu 90%

in nicht glucuronidierter Form mit dem Urin ausgeschieden. 4-MAA erscheint als erster der

Metaboliten im Urin und ist nicht mehr nachweisbar, während die anderen Hauptmetaboliten

noch detektierbar sind (ZYLBER-KATZ et al.1992). AAA und FAA sind beim Menschen

noch 48 Stunden nach der Applikation im Plasma und entsprechend länger im Urin messbar.

Die Prozentanteile der Gesamt-Metamizol-Dosis, die nach oraler Applikation im Urin

nachgewiesen wurden sind 2 – 4% für 4-MAA, 5 – 9% für AA, 21 – 27% für AAA und 11 –

23% für FAA (LEVY et al. 1995). Die HWZ von 4-MAA im Urin ist im Vergleich zu der im

Plasma länger (ZYLBER-KATZ et al. 1992). Es wird angenommen, dass nach i.v.

Applikation von Metamizol dieses zu einem geringen Teil im Plasma unverändert vorhanden

ist und erst in den Nieren zu 4-MAA verstoffwechselt wird. Beides erklärt eine „ kumulative“

renale Elimination von 4-MAA (LEVY et al. 1995). Kinder im Alter von 1 bis 11 Jahren

scheiden Metamizol-Metabliten schneller aus als Erwachsene, wobei ältere Menschen 4-

MAA zu 33% langsamer ausscheiden als jüngere. Geschlechtsspezifische Unterschiede in der

Kinetik nach einmaliger Gabe von Metamizol sind nicht bekannt, obwohl LEVY et al. (1995)

eine unveröffentlichte Studie erwähnen, nach der Frauen 4-MAA und AA langsamer

eliminieren als Männer. Einfluss auf das Ausscheidungsverhalten wurden zudem bei Leber-

und Nierenerkrankungen diskutiert. Bei Patienten mit Leberzirrhose verläuft die

Metabolisierung von 4-MAA zu den weiteren Metaboliten in geringerem Maße, bedingt durch

die Reduktion der Demethylierungs-, Oxidierungs- und Acetylierungsreaktionen, ab.

Signifikante Unterschiede im Vergleich zu Gesunden sind durch folgende Veränderungen


dargestellt: die Plasma-HWZ ist nahezu um einen Faktor 2 – 3 länger, die maximale

Plasmakonzentration ist geringer, die Zeit bis zum Erreichen maximaler Plasmaspiegel ist

annähernd verdoppelt, die nichtrenale Clearance ist deutlich herabgesetzt ( ca. um die Hälfte),

die renale Clearance ist ebenfalls geringer. Bei Lebererkrankungen korreliert (linear) die

verlängerte Plasma-HWZ mit leberspezifischen Parametern im Blut, wie z.B. dem

Serumalbumin, der Aspartat-Aminotransfersae (AST), der Alanin-Aminotransferase (ALT),

der Lactat-Dehydrogenase (LDH), der Alkalischen Phosphatase (ALKP), dem Total-Bilirubin

(TBil), dem Prothrombinwert (ZYLBER-KATZ et al. 1995). Bei Patienten mit chronischer

Niereninsuffizienz konnte nach i.v. Applikation von Metamizol eine geringgradig verlängerte

renale Clearance beobachtet werden. Dieses soll auf den unverstoffwechselt vorliegenden 4-

MAA Anteil nach i.v. Verabreichung, der erst in den Nieren metabolisiert wird,

zurückzuführen sein. Kardiovaskuläre Erkrankungen und Schocksymptomatik können eine

verminderte renale Eliminierung bedingen. Ansonsten ist eine verzögerte Gesamtclearance

zumeist in einer Beeinträchtigungen des Leberstoffwechsels begründet (HEINEMEYER et al.

1993, LEVY et al. 1995). Werden gleichzeitig mit Metamizol Neuroleptika, insbesondere

Phenothiazinderivate verabreicht, kann es zu schwerer Hypothermie kommen. Metamizol

reduziert beim Menschen die Furosemid-Clearance signifikant (ROSENKRANZ et al. 1992).

In Untersuchungen von BACRACHEVA et al. (1997) wurde der Einfluss einer

Verabreichung von Cimetidin auf die Pharmakokinetik der Metamizol-Metaboliten betrachtet.

Die Ergebnisse zeigten, dass Cimetidin mit Metamizol interagiert, indem es die systemische

Verfügbarkeit von Metamizol steigert, die Eliminations-HWZ verlängert und die systemische

Clearance verzögert, wobei die renale Elimination von 4-MAA unverändert erscheint.

Nach SCHLINGLOFF (1997) variierte das Verteilungsvolumen beim Pferd zwischen 0,64

und 1,44 l/kg und lag im Mittel bei 1,0 ± 0,23 l/kg; nach KLAUS et al. (1997) lag das

Verteilungsvolumen bei 1,85 l/kg. Die Plasmahalbwertzeit ist von EBERT et al. (2002) für

Hund und Pferd mit 4 – 5 Stunden festgelegt. SCHLINGLOFF (1997) gibt eine Plasma-HWZ

von 5,4 ± 1,3 Stunden für das Pferd an, wobei individuelle Schwankungen zwischen 4,1 und

7,8 Stunden lagen. Eine Kombination von Metamizol mit Induktoren der

Lebermikrosomenenzyme (Barbiturate, Phenylbutazon) führt zu einer verkürzten HWZ von

Metamizol und damit zu einer verkürzten Wirkungsdauer (EBERT et al. 2002). Nach

SCHLINGLOFF (1997) beträgt die totale Clearance im statistischen Mittel 2,14 ± 0,35

ml/min/kg beim Pferd.


2.7.5.3. Metamizol – Arzneimitteleinsatz bei Pferden

Metamizol wird beim Pferd als Monopräparat (Vetalgin®) und in Kombination mit dem

Spasmolytikum Butylscopolamin (Buscupan compositum®) besonders zur

Schmerzbehandlung bei Koliken unterschiedlicher Genese und anderen spastischen

Zuständen der Bauchhöhlenorgane als auch bei Schlundverstopfung angewendet. Als

Monopräparat dient es zudem zur Fierbersenkung, seltener bei rheumatischen Zuständen der

Muskulatur und Gelenken, Lumbago, Neuritiden, Neuralgien und Tendovaginitiden. In

beiden Präparateformen ist es in einer Konzentration von 500 mg/ml hoch konzentriert

enthalten. Beim Pferd empfiehlt sich eine intravenöse Applikation in einer Dosierung von 20

– 50 mg/kg KGW (EBERT et al. 2002). Dieses entspricht zumeist einer ein- bis zweimaligen

Gabe von 10 ml Vetalgin® pro 100 kg Pferd bzw. 3 – 6 ml Buscupan compositum® pro 100

kg Pferd ausreichend, um eine spastische Kolik erfolgreich zu therapieren (HUSKAMP et al.

1999). Die spastische Kolik gehört mit einem Anteil von etwa 40% aller Kolikerkrankungen

mit Abstand zur häufigsten Kolikform des Pferdes. Erfolgt zügig nach Einsetzen der

Symptome eine gezielte Behandlung, ist die Prognose günstig. Anderenfalls können heftige

klonische Darmkrämpfe zu Invaginationen und Darmverschlingungen führen, als auch die

Entstehung von Gekröseläsionen als spätere Strangulationsursache begünstigen. Bei nicht

genau diagnostizierten Koliken können Spasmoanalgetika sowohl therapeutischen als auch

diagnostischen Zweck erfüllen. Verbergen sich hinter einer Koliksymptomatik Kolikformen,

die eventuell einer chirurgischen Behandlung bedürfen, wirken Spasmoanalgetika nicht oder

nur für kurze Zeit. Im Falle einer spastischen Kolik setzt die spasmoanalgetische Wirkung

des Metamizol nach kurzer Zeit ein (Minuten) und hält über Stunden an. Oft ist eine

einmalige Behandlung ausreichend nach der die Pferde kurzfristig wieder zu Sportzwecken

einsetzbar erscheinen (HUSKAMP et al. 1999).

Die Firma Intervet ermittelte Rückstandshöchstmengen (MRL- Maximum Residue Limits)

des Wirkstoffes Metamizol für die Anwendung bei lebensmitteliefernden Tieren, so dass

dieser Wirkstoff wieder uneingeschränkt der Tiermedizin zur Verfügung steht. Die

Wartezeiten für essbare Gewebe des Pferdes betragen nach i.v. Applikation des Präparates

Vetalgin® 12 Tage.


2.7.5.4. Dopingrelevanz des Einsatz von Metamizol

Ein absichtlicher Einsatz von Metamizol zu Dopingzwecken könnte auf einer

Wiederherstellung der normalen Leistungsfähigkeit eines Pferdes beruhen. Bei Pferden, die

national oder international im Leistungssport eingesetzt werden, geht die körperliche

Belastung meistens mit einer gewissen natürlichen „ Abnutzung“ einher, so dass gerade

Hochleistungssportpferde nach langjährigen, hochfrequenten Einsätzen während der

Turniersaison oft mehr oder weniger geringgradige Lahmheiten oder Unreinheiten im

Bewegungsablauf zeigen. Allen am sportlichen Einsatz eines Hochleistungspferdes

Beteiligten ist daran gelegen, ein erfolgreiches Sportpferd möglichst lange einsetzten zu

können. Zur Erfüllung dieses Zweckes kommen oft Lokalanästhetika, Glukokortikoide und

NSAID zum Einsatz, damit betroffene Pferde wieder oder überhaupt erst an ihre

Leistungsgrenze laufen können. Diese genannten Substanzen stehen bereits seit Jahren an der

Spitze der aufgedeckten Dopingmittel (UNGEMACH 1985). Zum Teil fallen darunter auch

Substanzen wie Metamizol (und Flunixin), die aufgrund ihrer spasmolytisch-analgetischen

Wirkung bei Kolikern zum Einsatz kommen. Bei der Anwendung dieser Wirkstoffgruppen

bedingt die analgetische Wirksamkeit eine Besserung der Symptome, wobei der eigentlich

sinnvolle antiphlogistische und antiexsudative Effekt aufgrund fehlender Ruhigstellung der

Pferde nicht zum Tragen kommt. Somit ergibt sich langfristig gesehen eher eine

Verschlimmerung bestehender Krankheitsprozesse (UNGEMACH 1985).

2.8. Analytik

Analysenmethoden, die in der modernen Dopinganalytik zum Einsatz kommen, sind neben

immunologischen Methoden (wie z.B. Radioimmunassay (RIA), Enzyme-linked

Immunosorbant Assay (ELISA)) in erster Linie chromatographische Trennverfahren. Unter

dem Begriff der Chromatographie sind verschiedene physikalische Trennmethoden

zusammengefasst, die alle nach einem einheitlichen Prinzip funktionieren. Es beruht darauf,

dass das zu trennende Stoffgemischgemisch mit einer beweglichen (mobilen) Phase über eine

ruhende (stationäre) Phase transportiert wird, wobei eine Wechsel der Komponenten

zwischen den beiden Phasen stattfindet, der zu einer Trennung des Gemisches aufgrund

unterschiedlicher Polarität führt. Die mobile Phase kann flüssig oder gasförmig sein, die


stationäre Phase fest oder flüssig (SCHWEDT 1986). Nach dem Trennprinzip bzw. der

Ausführungstechnik werden folgende chromatographische Trennmethoden unterschieden:

• Papierchromatographie (PC)

• Dünnschichtchromatographie (DC, engl.: TLC – thin layer chromatography)

• Gas-Chromatographie (GC)

• Säulen- oder auch Flüssigchromatographie (LC)

Da in dieser Studie ein Verfahren der Flüssigchromatographie angewendet wurde, soll

nachfolgend nur diese chromatographische Methode beschrieben werden.

Die LC wird zum Auftrennen verschiedener in Lösung befindlicher Substanzen genutzt.

Vorteile gegenüber einer GC-Methode liegen u.a. darin, dass auch Substanzen mit hohem

Siedepunkt als auch sehr polarer Substanzen nachgewiesen werden können (SCHOENE

1996). In der LC ist die stationäre Phase in einem langgestreckten Trennbett in einem Rohr

als Säule angeordnet. Das zu trennende Gemisch wird auf das eine Ende der Säule gegeben,

die mobile Phase fließt mit Hilfe einer Pumpe unter Überdruck durch die Säule. Je nach

Säulendurchmesser und mittlerem Durchmesser der Teilchen der stationären Phase

unterscheidet man zwei apparativ unterschiedlich ausgestattete Techniken (SCHWEDT

1986):

• Klassische Säulenchromatographie: innerer Säulendurchmesser ca. 1 cm und größer,

Teilchendurchmesser zwischen 100 und 200 µm, Durchfluss der mobilen Phase unter

Atmosphärendruck oder maximal bis 5 bar

• Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC- High Pressure Liquid

Chromatography): Teilchendurchmesser kleiner als 50 µm, Säulendurchmesser ca. 2

– 6 mm, Gefäßmaterial meist Stahl

Nach UNGER et al. (1995) eignet sich die HPLC-Methode zur Analyse von

schwerflüchtigen, stark polaren und ionische (z.B. Säuren, Basen), thermisch instabilen und

leicht zersetzlichen Substanzen, als auch von solchen mit hoher Molmasse innerhalb kurzer

Zeit (Dauer der Analyse zwischen einer Minute bis zu ca. einer Stunde). Ein Hochdruck-

Flüssigkeits-Chromatograph besteht aus 4 Haupt-Elementen (SCHWEDT 1986):

1. Pumpe: dient der konstanten pulsationsfreien Strömung des Lösungsmittels;

befördert das Lösungsmittel aus einem Vorratsgefäß in die Säule; hält einen

bestimmten Druck aufrecht


2. Einspritzsystem: gibt die Probe (1 bis 2000 µl) in den Strom der mobilen

Phase

3. Trennsäule mit Füllung

4. Detektor

Die Ummantelung der Säulen besteht zumeist aus Edelstahl aber auch aus Tantal oder Kupfer.

Das Innere der Trennsäule, welches die stationäre Phase darstellt, besteht aus einem stabilen

dichten Verband kleiner poröser Teilchen (Durchmesser kleiner als 20 µm), wodurch ein

hohes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen hergestellt und hohe Druckstabilität

gewährleistet wird (UNGER et al. 1995). Als stationäre Phase werden Substanzen,

ausgerichtet nach physikalischen Eigenschaften (Polarität, Löslichkeit) der zu extrahierenden

Substanz, wie Kieselgel, Aluminium, Nitrite, Oktadecylsilane und Sulfonate verwendet. Als

mobile Phase stehen verschiedene Lösungsmittel, auch in Konzentrationen und

Kombinationen, wie z.B. Petrolether, Hexan, Diethylether, Chloroform, Acetonitril, Ethanol,

Methanol und Wasser zur Auswahl (SCHOENE 1996). Die HPLC bietet die Möglichkeit der

einfachen Adsorbtionschromatographie, geeignet für Moleküle mit geringer Polarität, als auch

die der Ionenaustauscher-Chromatographie für positiv oder negativ geladene Teilchen

(SCHOENE 1996).

Die mobile Phase wird nach Verlassen der Trennsäule durch einen Detektor geführt, der die

Aufgabe besitzt, ein chromatographisches Konzentrationsprofil sichtbar zu machen. Aus den

Chromatogrammen soll die Retentionszeit, das Retentionsvolumen und die Konzentration der

zu analysierenden Substanz zu entnehmen sein. Ultraviolett- (UV-), Fluoreszenz- oder

Ionenstrom-Detektoren finden zumeist Anwendung. Eine sensiblere und spezifischer

Identifizierung einer Substanz ist jedoch über die Detektion eines Massenspektrometers

gegeben. Anforderungen an einen Detektor sind ein geringer Rauschpegel, um Substanzen

auch im niedrigen Konzentrationsbereich noch sicher darzustellen und hohe Empfindlichkeit

für nachzuweisende Substanzen. Zudem muss er geringe Drift aufzeigen, was bedeutet, dass

die Nulllinie über längere Zeit stabil zu halten ist, damit Änderungen des Messwertes in

einem Zeitintervall möglichst gering sind (SCHWEDT 1986).

In dieser Studie wird ein MS/MS-Tandem-System verwendet. Dieses erzeugt aus einer

Substanzprobe einen gasförmigen Ionenstrahl, trennt die Ionen nach Masse und Ladungen

und erzeugt so ein Massenspektrum. Dabei werden die pro Zeiteinheit gebildeten

Ionenmengen als Ionenströme bezeichnet, die in der Summe den Gesamt- oder


Totalionenstrom ergeben (BUDZIKIEWICZ 1998). Es werden verschieden Methoden der

Ionisation, die unter atmosphärischem Druck ablaufen unterschieden:

- Chemische Ionisation unter atmosphärischem Druck (Atomsperic Pressure Chemical

Ionisation, APCI)

- Photoionisation unter atmosphärischem Druck (Atomspheric Pressure Photoionisation,

APPI)

- Elektrospray-Ionisation (ESI)

Bei diesen Methoden werden Substanzmoleküle im Lösungsmittel zunächst unter

atmosphärischem Druck in substanzspezifische Ionen (Fragment-Ionen) zerlegt und

anschließend von den Molekülen des Lösungsmittels getrennt. In dieser Studie wird die

Methode der APCI verwendet. Der aus der LC-Säule austretende Eluent wird unter

atmosphärischem Druck über eine geheizte Kapillare geleitet und in eine geheizte evakuierte

Kammer versprüht. Eine in der Verdampfungskammer befindliche Glühkathode ionisiert die

in der Gasphase befindlichen Moleküle, dass entstehende geladene Teilchen über eine kleine

Öffnung der Gaskammer in das Massenspektrum geleitet werden. Dem Massenspektrum sind

ein System zur Trennung der geladenen Teilchen und ein Detektor angeschlossen

(LEHMANN 1996).

In dem verwendeten Tandem-Massenspektrometer werden durch vier hintereinander

geschaltete Quadrupole die Ionen zunächst getrennt, dann zum Zerfall gebracht und letztlich

die entstehenden Tochterionen erneut getrennt. Der erste Quadrupol, der zu einer

Aufreinigung und Selektion der Ionen des Analyten führt, besteht aus vier parallel im Quadrat

angeordneten Metallstäben, von denen kreuzweise jeweils zwei miteinander leitend

verbunden sind. Es wird an zwei einander gegenüberliegenden Stäben eine Wechselspannung

angebracht, dass abwechselnd positive und negative Felder relativ zur Mittelachse erzeugt

werden, die eine Ionentrennung bewirken. Die angelegte Spannung kann so eingestellt

werden, dass nur die Ionen der zu analysierenden Substanz gerade durch das elektrische Feld

geleitet werden und andere Ionen aus dem Feld in die Umgebung abgeleitet und neutralisiert

werden. Im zweiten, auch als Stoßkammer bezeichneten Quadrupol, kommt es zur

Fragmentierung der Ionen des Analyten durch Kollisionsaktivierung mittels

Stickstoffmolekülen. Entstandene Tochterionen gelangen in ein weiteres Stabquadrat, dem

ebenfalls eine bestimmte Spannung angelegt ist, um bestimmte Ionen zu selektieren und

andere zu neutralisieren und zu eliminieren. Die selektierten Tochterionen werden in den


Detektor weitergeleitet. In diesem Fall wird der Detektor als Reaktionsdetektor bezeichnet, da

die in der Trennsäule eluierten Substanzen in chemischen Reaktionen verändert und danach

erst detektiert werden. Für die bei diesen chemischen Reaktionen entstanden Ionen besitzt der

Detektor im Vergleich zum ursprünglichen Molekül eine bessere Selektivität und

Empfindlichkeit (BUDZIKIEWICZ 1998).

50 Eigene Untersuchungen

3. Eigene Untersuchungen

3.1. Versuchsplanung

Um die Eliminationskinetik von Metamizol im Plasma und Urin des Pferdes zu ermitteln und

bezugnehmend auf das Dopingverbot zu prüfen, ob eine Karenzzeit für Sportpferde zu

bestimmen ist, wurde die Substanz einmalig in mittlerer therapeutischer Dosierung in Form

einer handelsüblichen Injektionslösung intravenös appliziert.

In einem Vorversuch wurden die Blut- und Urinproben eines Pferdes nach einem zuvor

festgelegten Zeitschema durch Venenpunktion entnommen bzw. durch Auffangen von

Spontanurin gewonnen. In diesem Vorversuch sollte überprüft werden, ob die Durchführung

zeitlich und labortechnisch praktikabel ist. Da sich der Vorversuchablauf als gut durchführbar

erwies, konnte der Hauptversuch in gleicher Weise stattfinden. Im Labor des Institutes für

Biochemie der Deutschen Sporthochschule in Köln wurde eine Methode zur Extraktion der

Substanz aus dem Probenmaterial und Nachweis mittels HPLC/MS/MS geprüft, nach der alle

Plasma- und Urinproben aufgearbeitet und gemessen wurden. In dem sich anschließenden

Hauptversuch wurden insgesamt 10 Pferde beprobt. Die Ergebnisse der

Laboruntersuchungen wurden pharmakokinetischen Berechnungen unterzogen.

Der Tierversuch ist unter dem Aktenzeichen 509a-42502-02A149 bei der Bezirksregierung

Hannover angezeigt.

Der Versuchsablauf der Studie und die Zeitpläne der Probenentnahme sind in Anlehnung an

die Vorgaben des European Horserace Scientific Liasion Committee (EHSLC) als

Standardprotokoll für intravenöse pharmakokinetische Studien vom Mai 2002 erstellt worden.

3.2. Material und Methode

3.2.1. Pferde und Haltungsbedingungen

Für den Versuch stand eine Gruppe von 10 Wallachen - 6 Warmblüter und 4 Vollblüter -

unterschiedlichen Alters, Gewichts und Trainingzustandes zur Verfügung. Die Pferde waren

für diesen Versuch im Institut für Tierzucht der Forschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL)

in 31535 Neustadt/Mariensee untergebracht. An dieser Pferdegruppe sollen nacheinander

Untersuchungen zur Pharmakokinetik weiterer Substanzen hinsichtlich der Dopingrelevanz


durchgeführt werden. Zwischen diesen Versuchsdurchgängen liegt jeweils eine Wash-Out-

Phase.

Während der Zeit der Versuchsdurchführung wurden acht Pferde auf der Weide gehalten. Sie

wurden mit Heu oder Grassilage zugefüttert und hatten Zugang zu einem mit Stroh

eingestreuten Laufstall, in dem sich Selbsttränken und Einzelständerfutterplätze befanden.

Zwei Vollblutpferde wurden in Boxen von ca. 16 m² Größe auf Stroh gehalten und zweimal

täglich mit Heu und Hafer gefüttert; die Wasseraufnahme erfolgte ad libitum. Ein besonderes

Training fand während des Versuchs nicht statt. Vor Versuchsbeginn wurde bei allen Pferden

eine klinische Allgemeinuntersuchung durchgeführt, die bei allen Pferden ohne besonderen

Befund blieb. Mit einer Viehwaage wurde das Gewicht jedes Pferdes am ersten Versuchstag

festgestellt, um die individuelle Metamizol-Dosis zu errechnen. Für alle Pferde sind in

Tabelle 1 Angaben zu Alter, Haltungsbedingungen, Rasse, Gewicht und Dosis

zusammengefasst.

Tabelle 1: Angaben zu Alter, Haltungsbedingungen, Rasse, Gewicht und Dosis

Pferd

A

Pferd

B

Pferd

C

Pferd

D

Pferd

E

Pferd

F

Pferd

G

Pferd

H

Pferd

I

Pferd

J

Alter

(Jahre)

7

9 7 7 9 9 8 4 7 3

Haltung Weide/Laufstall Boxen-

haltung

Weide/

Laufstall

Boxen-

haltung

Rasse Hannoversches Warmblut Vollblut

Gewicht

[kg]

668 666 680 776 684 754 438 475 524 518

Metamizol-

Dosis [mg]

20040 19980 20400 23280 20520 22620 13140 14250 15720 15540

Vetalgin®-

Menge [ml]

40,1 40,0 40,8 46,6 41,0 45,2 26,3 28,5 31,4 31,1


3.2.2. Applikation des Arzneimittels und Probengewinnung

Jeweils 45 Minuten vor Versuchsbeginn (t0 = Zeitpunkt der Injektion) wurde bei jedem Pferd

ein Venenverweilkatheter (Braunüle MT®; Größe: 3/G14, Stichlänge 8 cm) in die linke und

rechte Vena jugularis gelegt und an der Haut fixiert. Die Haut in dem Punktionsbereich wurde

zuvor rasiert und mit 70%igem Alkohol desinfiziert. Über den Katheter in der Vena jugularis

sinister wurde den Pferden Blutproben von je 54 ml entnommen, wofür sechs Sarstedt-

Monovetten® (Lithium-Heparin beschichtet; 15 I.E Heparin/ml Blut; 9 ml Fassungsvermögen)

verwendet wurden. Von jedem Pferd wurde 15 Minuten vor der Medikamentenapplikation

eine Blank-Blutprobe entnommen, in der die zu untersuchende Substanz nicht enthalten ist.

Vor Versuchsbeginn wurde die errechnete Medikamentendosis in Einwegspritzen

aufgezogen. Die Injektionsflaschen wurden jeweils an dem Tag des Versuchsbeginns frisch

angestochen. Die Injektion erfolgte langsam und streng i.v. in den Katheter in der Vena

jugularis dexter. Hierbei wurden Einmalhandschuhe getragen, um einer Verschleppung des

Wirkstoffes der Injektionslösung vorzubeugen.

Blutproben wurden nach der Injektion nach 2, 5, 10, 15, 30, 60 Minuten und 2, 4, 6, 8, 12, 24,

36, 48, 72 und 96 Stunden entnommen. Zwischen den Blutentnahmen wurden die Braunülen

mit einem Mandrin (Vasofix®) verschlossen. Zwölf Stunden nach Versuchsbeginn wurden die

Venenverweilkatheter entfernt. Die weiteren Blutproben wurden durch Venenpunktion mit

einer 1,2x40mm (18Gx1,5") Einmalkanüle gewonnen.

Urinproben wurden durch Auffangen von Spontanurin 2, 4, 6, 10, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144

und 168 Stunden nach der Injektion gewonnen. Einwegplastikbecher, die in einer

Aufhängevorrichtung an einem ca. 50 cm langen Stab befestigt waren, dienten zum

Auffangen des Urins. Alle Pferde der Versuchsgruppe wurden vor dem Versuch auf den

spontanen Urinabsatz konditioniert. Am Morgen des jeweils ersten Versuchstages wurde vor

Versuchsbeginn von jedem Pferd eine Urinprobe gewonnen, in der die zu untersuchende

Substanz nicht enthalten ist.


3.2.3. Eingesetztes Arzneimittel

Testsubstanz:

Vetalgin® (Wirkstoff: Metamizol- Natrium)

Hersteller: Intervet Deutschland GmbH, Postfach 1130, D-85701 Unterschleißheim

Handelsform: 50%ige Injektionslösung in 100 ml Flaschen

Chargen Nr.: 03W030; Zulassungsnummer: N127; verwendbar bis: 11.2006

Metamizol wurde den Tieren als Monopräparat (Vetalgin® ad us. vet.) in einer Dosierung von

30 mg/kg KGW intravenös injiziert. Das Präparat enthält 500 mg Metamizol-Natrium pro

Milliliter Injektionslösung. Metamizol kann beim Pferd in einer Dosierung von 20-50 mg/kg

KGW bei intravenöser Injektion appliziert werden.

3.2.4. Aufbereitung und Aufbewahrung der Blut- und Urinproben

Die mit Lithium-Heparin beschichteten Monovetten® gesammelten Blutproben wurden

innerhalb einer Stunde nach Entnahme bei 1000 g 10 Minuten zentrifugiert (Zentrifuge

Rotana IS, Hettich). Das gewonnene Blutplasma wurde in einer Einwegspritze aufgezogen,

gemischt und in vier 6 ml Glasgefäße mit Plastikschraubdeckel umgefüllt. Diese wurden

unmittelbar im Kühlschrank stehend bei 4 °C bis zum Abend des jeweiligen Versuchstages

aufbewahrt und dann bei –20 °C eingefroren. Der Transport in das Analysenlabor erfolgte in

mit Trockeneis befüllten Styroporbehältern.

Die in Plastikbechern aufgefangenen Urinproben wurden unmittelbar in zwei

Kunststoffbehälter mit Schraubdeckel (100 ml) aliqoutiert. Die Dichte des Urin wurde mit

einer Harnspindel (Firma Heiland, Hamburg), der pH-Wert mit Indikatorpapier (Merck®

Universalindikator pH 0-14) bestimmt. Anschließend wurden die Urinproben bis zum Abend

des jeweiligen Versuchstages im Kühlschrank bei 4 °C aufbewahrt und dann bei –20 °C

eingefroren. Der Transport in das Labor erfolgte wie bei den Plasmaproben.


3.2.5. Material, Geräte und Entwicklung analytischer Methoden für die

Bestimmung des Hauptmetaboliten 4-Methylaminoantipyrin (4-MAA)

von Metamizol

Die Plasma- und Urinproben wurden im Institut für Biochemie der Deutschen

Sporthochschule in Köln auf den Gehalt von 4-MAA untersucht. Metamizol konnte als

solches nicht in den Proben nachgewiesen werden, da es unmittelbar nach Applikation im

Pferd metabolisiert wird. Zur Ermittlung der Eliminationskinetik von Metamizol wurde der

Hauptmetabolit 4-MAA bestimmt. Für die Bestimmung der Konzentration von 4-MAA im

Pferdeplasma und –urin wurde je eine Methode zur Aufarbeitung der Proben mit basischer

Extraktion und Trennung mittels HPLC (High Performance Liquid Chromatography) mit

anschließender Detektion mit einem Massenspektrometer (MS) erarbeitet.

3.2.5.1. Chemikalien

Acetonitril, Supragradient HPLC grade J.T. Baker, Deventer, Holland

Ammoniumacetatpuffer

• Ammoniumacetat Merck, Darmstadt

• Bidestilliertes Wasser (Milli-Q-Wasser) Institut für Biochemie, Köln

• Eisessig Merck, Darmstadt

Aqua destillata Institut für Biochemie, Köln

Dimethylaminoantipyrin Aventis Pharma, Frankfurt/ Main

Kaliumhydroxid Merck, Darmstadt

Mercaptoethanol Fluka-Chemikalien,

CH-9470 Buchs

Methanol, destilliert Institut für Biochemie, Köln

4-Methylaminoantipyrin Aventis Pharma, Frankfurt/ Main

Salzsäure 0,06 N Merck, Darmstadt

Tertiär-Butylmethylether (TBME), vor Gebrauch destilliert KMF, Laborchemie Handels

GmbH, Sankt Augustin


3.2.5.2. HPLC/MS/MS

Die 4-MAA Analyse wurde mit einer HPLC API 2000, gekoppelt an einen Agilent Series

1100 Liquid Chromatographen, durchgeführt. Folgende Geräteeinstellungen wurden benutzt:

HPLC:

• Säule: Merck Li Chro CART® 55x4 Purospher® Star, 3 µm

• Eluenten: A = 5 mmol/l Ammoniumacetat in H20, 0,1% Eisessig

B = Acetonitril

• Gradienten: 5 % B � 50 % B in 5 Minuten, 50% B � 100 % B in 6.

Minute, 1 Minute 100 % B zur Reinigung der Säule,

Reequilibrierung mit 5% B für 2 Minuten

• Flussrate: 1 ml/Minute

• Injektionsvolumen: 10 µl

Massenspektrometer (APCI 2000 Triple-Quadrupol Massenspektometer, Perkin-Elmer Sciex

Instruments):

• Ionenquelle: APCI bei 400 °C

• Ionisationseinstellung: positiv

• Aquisitionseinstellung: Multiple Reaction Monitoring, MRM

• Kollisionsgas: Stickstoff (N2), 2,0 x 10E-5 torr

• Kollisionsenergie: optimiert für jedes Ionenprodukt

3.2.5.3. Eichlösungen

Zur Durchführung einer quantitativen Bestimmung wurden Lösungen der zu untersuchenden

Substanz Metamizol bzw. 4-MAA, und dem internen Standard Dimethylaminophenazon,

DMAP, hergestellt. Die 4-MAA-Stammlösung wurde durch Einwaage von 10 mg

Reinsubstanz in einen 10 ml fassenden Erlenmeyerkolben und Auffüllung mit 1 %iger

Mercaptoethanollösung in 0,06 N HCl hergestellt. Diese Lösung hatte eine Konzentration von

1mg/ml. Von dieser Stammlösung wurde 1 ml abgenommen, in den zuvor mehrfach mit

Methanol gespülten und getrockneten Erlenmeyerkolben gegeben und wieder auf 10 ml mit 1

%iger Mercaptoethanollösung in 0,06 N HCl aufgefüllt, so dass eine Arbeitslösung der

Konzentration 100 µg/ml entstand. In weiteren Verdünnungsschritten von 1:10 entstanden


Arbeitslösungen mit Konzentrationen von 10 µg/ml und 1 µg/ml. Zur Herstellung der 10

mg/ml Stammlösung wurden 10 mg der 4-MAA-Reinsubstanz direkt in ein spitzes

Zentrifugenschliffglas eingewogen, in einem Milliliter der 1 %igen Mercaptoethanollösung

angelöst und auf dem Schüttler (Vortex®) bis zur vollständigen Auflösung der Reinsubstanz

geschüttelt.

Analog zur Herstellung der 4-MAA-Stammlösung (1 µg/ml) wurde eine DMAP-

Stammlösung in gleicher Konzentration erstellt. Aus dieser DMAP-Stammlösung wurden

durch 1:10- Verdünnung mit 1 %iger Mercaptoethanollösung in 0,06 N HCl Arbeitslösungen

der Konzentrationen 100 µg/ml, 10 µg/ml und 1 µg/ml erstellt. Zusätzlich wurde eine

Arbeitslösung der Konzentration 20 µg/ml hergestellt. Hierfür wurden 200 µl der 1 mg/ml in

einen Erlenmeyerkolben gegeben und mit der oben genannten Mercaptoethanollösung auf 10

ml aufgefüllt.

Anfänglich wurde als Lösungsmittel Methanol verwendet. Die Standardlösungen waren

allerdings in dem wässrigen Milieu nur über wenige Tage stabil, so dass ein Oxidationsschutz

verwendet werden musste. Als Oxidationsschutz eignete sich 1%ige Mercaptoethanollösung

in 0,06 N HCl.

3.2.5.4. Entwicklung analytischer Methoden

Mit den erstellten Stamm- und Arbeitslösungen wurden wie unter 3.2.5.5 beschrieben Proben

erstellt, die zunächst mit einer HPLC mit UV-Detektion (Hewlett Packard HP 1090 Liquid

Chromatograph) gemessen wurden. Anfänglich galt es, eine geeignete Säule zur

chromatographischen Darstellung des 4-MAA und DMAP zu finden. Weiterhin musste für

jede der beiden Substanzen ein Wellenlängenbereich gefunden werden, bei dem eine

deutliche Peakformen entstanden und von deren Flächen ein sauberes Integral gebildet

werden konnte. Zudem mussten geeignete Eluenten und Gradienten gefunden werden.

3.2.5.5. Proben mit 4-MAA und DMAP

Den Stamm- und Arbeitslösungen wurden Mengen von 10, 25, 50, und 100 µl entnommen,

diese in je ein spitzes Zentrifugenschliffglas gegeben und am Rotationsverdampfer unter

Vakuum über einem auf 50 °C erhitzten Wasserbad eingedampft. Die eingeengte Substanz


wurde in 100 µl Milli-Q-Wasser angelöst, mit einer Glasspritze in gläserne Probeneinsätze

der Autosamplervials überführt und mittels HPLC/UV gemessen.

3.2.5.6. Chromatographie

Bei der HPLC/UV-Messung wurden unter Bezug auf Literaturangaben (ASMARDI und

JAMALI 1983, ZYLBER-KATZ et al. 1984, DAMM 1989, AGUNDEZ et al. 1994,

AGUNDEZ u. BENITEZ 1996) anfangs verschiedene Säulen eingesetzt: LC-Säule CC 125/3

Nucleosil 120-3 C18 (Machery und Nagel), 5 µm LiChrCART® 250-4 RP-18 encapped Säule

(Merck®), Supercosil TM LC-18-DB Säule 7,5 x 4,6 x 3.

Als Lösungsmittel wurden zu Beginn der Methodenentwicklung zunächst Acetonitril und

Milli-Q-Wasser benutzt. Die Gradienteneinstellung war wie folgt: 30% Acetonitril und 70%

Milli-Q-Wasser bis zur 15. Minute, dann für 3 Minuten 100% Acetonitril, Wiederherstellung

der Ausgangsgradienten innerhalb von 2 Minuten und Equilibrierung über 4 Minuten. Das

Injektionsvolumen der Probenlösung betrug 25 µl. Für 4-MAA wurden bei der Wellenlänge

von 245 nm und für DMAP bei 255 nm die besten Messergebnisse an der eingesetzten HPLC-

UV erzielt.

Die Messergebnisse waren hinsichtlich der Reproduzierbarkeit und somit der eindeutigen

Identifizierung beider Substanzen nicht zufriedenstellend. Statt eines scharfen vom

Untergrund gut abgesetzten Peaks wurden die Substanzen zwar nach einer ihnen

zuzuordnenden Retentionszeit detektiert, jedoch als nicht auswertbarer Peak. Deutliche, aber

noch nicht zufriedenstellende Verbesserung zeigte der Wechsel der Eluenten: das Milli-Q-

Wasser wurde gegen einen Ammoniumacetat-Puffer getauscht. Zusätzlich wurde die

Gradienteneinstellung verändert: innerhalb von fünf Minuten wurde von 95 %

Ammoniumacetat-Puffer (Eluent A) und 5 % Acetonitril (Eluent B) auf 10 %

Ammoniumacetat-Puffer und 90 % Acetonitril gewechselt und der Anfangsgradient von 95 %

A und 5 % B nach sieben Minuten wieder erreicht und bis zur achten Minute gehalten. Die

Flussrate der Lösungsmittel betrug 1 ml/Minute. Auswertbare Messergebnisse, dass heißt

reproduzierbare Messungen mit scharf von dem Untergrund und gegeneinander abgesetzten

Peaks beider Substanzen erbrachte der Wechsel der HPLC-Säule. Verwendung fand

schließlich eine LiChroCART® HPLC-Cartridge Purosper® STAR RP-18 endcapped (3 µm)

(Merck, Darmstadt), die laut Herstellerangaben zur Messung amphoterer Moleküle besonders

geeignet ist.


3.2.5.7. Extraktion von 4-MAA und DMAP aus Probenmaterial

Nachdem sowohl das 4-MAA als auch der interne Standard der Stamm- und Arbeitslösungen

durch oben beschriebene Analysenmethode qualitativ und quantitativ nachzuweisen war,

musste eine geeignete Methode zur Extraktion des 4-MAA aus Wasser sowie aus Plasma und

Urin erarbeitet werden. Mit dem Ziel, eine möglichst große Extraktionsausbeute zu erhalten,

wurden Ergebnisse der Festphasen-Extraktion und der Flüssig-Flüssig-Extraktion bei

unterschiedlichen pH-Werten verglichen.

Bei der Festphasen-Extraktion wurden Wasserproben mit verschiedenen Konzentrationen der

4-MAA- und DMAP- Lösungen versehen (gespikt) und jeweils auf eine Säule (Chromabond®

C18, Macherey und Nagel) aufgetragen. Die Substanzen wurden mit Methanol von den

Säulen gewaschen und am Rotationsverdampfer über einem 50 °C warmen Wasserbad

eingeengt. Die eingeengten Substanzen wurden in je 100 µl des Ammoniumacetat-Puffers

angelöst, in HPLC-Messröhrchen (Vials) überführt und mittels HPLC/UV-Detektion

gemessen. Im Vergleich zu vorherigen Messungen war die Extraktionsausbeute jedoch zu

gering.

Für die Flüssig-Flüssig-Extraktion wurden vier Reagensgläser mit je 5 ml bidestilliertem

Wasser und gleicher Menge des internen Standards angesetzt. Zu drei dieser Ansätze wurde

4-MAA in unterschiedlichen Konzentrationen zugegeben. Um ein pH-Optimum

herauszufinden, bei dem die Extraktionsausbeute der Substanzen am größten ist, wurde die

eben beschriebene Versuchsreihe drei Mal angesetzt: bei pH 7, 9,6 und 14. Der pH-Wert 7

wurde durch Zugabe von 250 µl einer 0,8 molaren Natrium-Phosphatpuffer-Stammlösung, pH

9,6 durch Zusatz von 5 g geglühtem Natriumsulfat als Festpuffer und pH 14 durch

Hinzufügen von 10 bis 12 Tropfen einer 1 molaren Kaliumhydroxidlösung bzw. alternativ

durch 4 Tropfen einer 5 molaren Kaliumhydroxidlösung eingestellt. Durch

Universalindikatorpapier wurde die Einstellung des pH-Wertes jeder einzelnen Probe

überprüft. Anschließend wurden zu jeder Probe 5 ml tertiär-Butylmethylether (TBME)

gegeben. Die mit Glasstopfen verschlossenen Reagensgläser wurden in horizontaler Ebene 20

Minuten auf einen Schüttler verbracht, dass die zu untersuchenden Substanzen durch den

Ether aus der wässrigen Phase extrahiert wurden. Die geschüttelten Proben wurden bei 1000

g 5 Minuten zentrifugiert, die die Testsubstanzen enthaltende Etherphase mit Pasteurpipetten

in spitze Zentrifugenschliffgläser überführt und am Rotationsverdampfer eingeengt. Die

eingedampften Substanzen wurden in 100 µl Ammoniumacetatpuffer angelöst und zur


Messung an der HPLC-UV in Autosamplervials überführt. Gute Extraktionsausbeuten wurden

bei pH 9,6 und 14 erzielt.

Zur Ermittlung des Extraktionsverhaltens von 4-MAA und DMAP aus biologischer Matrix

wurden nach oben beschriebenem Aufarbeitungsschema anstelle der Wasserproben Urin und

Plasma bei den drei verschiedenen pH-Werten aufgearbeitet und gemessen. Auch hier wurden

bei 9,6 und 14 gute Ausbeuten der Extraktion erhalten. Die bei pH 9,6 extrahierten Proben

zeigten deutliches Untergrundrauschen in ihren Chromatogrammen. Diese entsteht dadurch,

dass im sauren und neutralen Milieu Störfaktoren der biologischen Matrix in die Etherphase

übergehen und in den Chromatogrammen die genaue Identifizierung der zu untersuchenden

Substanz stören, indem sie deren Peakformen basal durch An- und Überlagerung verändern.

Bei pH 14 stellen sich diese Störfaktoren nicht dar, dass die Aufarbeitung der im Folgenden

zu messenden Proben bei pH 14 durchgeführt wurde.

3.2.5.8. Aufarbeitung des Urins mit Hydrolyseschritt

Zur Prüfung, ob 4-MAA in konjugierter (glucuronidierter oder sulfatierter) Form mit dem

Urin ausgeschieden wird, wurden Hydrolyseschritte in die Flüssig-Flüssig-Aufarbeitung

einbezogen.

Hierzu wurden jeweils 5 ml einer 4-MAA enthaltenden Urinprobe aus dem Vorversuch mit

dem internen Standard versetzt und einer Hydrolyse mit ß-Glucuronidase von Escherichia

coli, Glucuronidase/Arylsulfatase von Helix pomatia und Cystein bei derem jeweiligen pH-

Optimum unterzogen. Nach den enzymspezifischen Inkubationszeiten und –bedingungen

wurden die Urinproben auf pH 14 eingestellt und wie oben beschrieben mittels Flüssig-

Flüssig-Extraktion weiter aufgearbeitet. Zum Vergleich wurden 5 ml der ersten Urinprobe des

Vorversuchs ohne Hydrolyse entsprechend aufgearbeitet und alle Proben mittels HPLC-UV

gemessen. Aufgrund des Ergebnisses, dass eine Aufarbeitung mit Hydrolyse keine größeren

Extraktionsausbeuten ergab, war davon auszugehen, dass 4-MAA in freier Form mit dem

Urin ausgeschieden wird. Somit wurden alle weiteren Aufarbeitungen ohne Hydrolyseschritt

durchgeführt.


3.2.5.9. Aufarbeitung des Probenmaterials einschließlich der Proben für die

Validierung

Die Aufarbeitung der Proben erfolgte für Plasmaproben nach dem Schema der Abbildung 5

und für Urinproben nach dem Schema der Abbildung 6 ohne Hydrolyse. Für Urinproben im

Konzentrationsbereich von Null bis 100 µg/ml 4-MAA wurde die Aufarbeitung modifiziert:

es wurden 5 ml Urin mit 2 µg DMAP (20 µl der 100 µg/ml Arbeitslösung) versetzt, die

gesamte Etherphase eingeengt und in 200 µl Anfangspuffer aufgenommen. Nach der

Aufarbeitung waren einige Plasmaproben stark getrübt. Vermutlich führten ausgefallene

Proteine und Lipide zu dieser Trübung. Um einer im Vorversuch mehrfach beobachteten

Verstopfung der zur Säule des Chromatographen zuführenden Kapillare vorzubeugen, wurden

diese aufgearbeiteten Plasmaproben nochmals bei 3000 g für 15 Minuten zentrifugiert. Der

Überstand konnte vorsichtig, ohne den Bodensatz aufzuwirbeln, mit einer Glasspritze in

Autosamplervials überführt werden. Die Messung aller Proben des Hauptversuches

einschließlich derer für die Validierung, wurde mit HPLC/MS/MS wie unter 3.2.5.2 und

3.2.5.6 beschrieben durchgeführt.

Nach Aufarbeitung aller Plasma- und Urinproben des Vorversuches wurde die Dauer der

Probenentnahme für den Hauptversuch festgelegt. Im Vorversuch zeigte sich, dass Metamizol

bzw. 4-MAA im Plasma nach 24 Stunden und im Urin nach 96 Stunden nicht mehr

nachgewiesen werden konnte. Unter Berücksichtigung einer Sicherheitszeitspanne wurden die

Entnahmezeiten für Plasma bis zu 96 Stunden und für Urin bis zu 168 Stunden nach der

Arzneimittelinjektion festgelegt. Im Vorversuch wurde Metamizol in einer Dosierung von 40

mg/kg Körpergewicht verabreicht. Sowohl die erste Plasma- als auch die erste Urinprobe war

bei einer aufgearbeiteten Probenmenge von 5 ml nicht messbar. Es schien, als wäre die

Chromatographiesäule bei der hohen 4-MAA-Konzentration überladen. Folglich ergaben sich

undeutliche Chromatogramme. Somit wurde die Dosierung des Metamizol für den

Hauptversuch auf 30 mg/kg Körpergewicht und das aufzuarbeitende Probenaliquot auf einen

Milliliter reduziert.

Bei dem ersten Versuch der Validierung der Methode konnten keine annehmbaren

Kalibrationsreihen mit methanolischen 4-MAA- und DMAP-Standard- und Arbeitslösungen

erzielt werden. Das 4-MAA erschien instabil zu sein. Die Standard- und Arbeitslösungen

verfärbten sich mit zunehmender Lagerzeit gelblich. Laut MERCK-INDEX (1989) soll das

4-MAA unter Lichteinfluss und im wässrigen Milieu oxidieren. Um dem entgegenzukommen


wurden die Standard- und Arbeitslösungen mit 1%-iger Mercaptoethanol- Lösung in 0,06 N

Salzsäure als Oxidationsschutz hergestellt und dadurch akzeptable Eichkurven erhalten.

Die Abbildungen (5) und (6) stellen das Schema der Aufarbeitung von Plasma- bzw. von Urin

proben dar, nach denen auch die Proben des Hauptversuchs bearbeitet wurden.

Probenvorbereitung:

��

1 ml Plasma im Zentrifugenschliffglas

��

+ 1,0µg Dimethylaminophenazon als interner Standard

(50µl einer 1%igen Mercaptoethanol-Lösung (in 0,06N HCL),

die 20µg/ml Dimethylaminophenazon enthält)

+ 50µl 5 M KOH, schütteln (Vortex),

mit pH-Papier überprüfen,

gegebenenfalls mit KOH (5M ) einstellen auf pH 14

+ 5 ml tert.-Butylmethylether,

mit Stopfen versehen

��

�

Etherphase mit Pasteurpipette in Spitzglas überführen,

am Rotationsverdampfer einengen

�

Etherphase trocknen,

in 200µl Ammoniumacetatpuffer anlösen (Vortex),

evtl. bei 3000rpm für 15 Minuten zentrifugieren,

mit Pasteurpipette aufnehmen (Vorsicht Bodensatz)

und in Autosamplervials überführen und

10µl pro Messung in das LC/MS injizieren

Abb. 5: Nachweis von Metamizol im Pferdeplasma mittels LC/MS

20 Minuten schütteln und

anschließend 5 Minuten bei 1800 rpm zentrifugieren


Probenvorbereitung (Konzentrationsbereich 100-8000µg/ml):

��

1 ml Urin im Zentrifugenschliffglas

��

+ 50µg Dimethylaminophenazon als interner Standard

(50µl einer 0,1%igen Mercaptoethanol-Lösung (in 0,06 N

HCL), die

1 mg/ml Dimethylaminophenazom enthält)

+ 75µl 5 M KOH, schütteln (Vortex),

mit pH-Papier überprüfen,

gegebenenfalls mit KOH (5M ) einstellen auf pH 14

+ 5 ml tert.-Butylmethylether,

mit Stopfen versehen

��

20 Minuten schütteln und

anschließend 5 Minuten bei 1800 rpm zentrifugieren

�

1ml der Etherphase mit Eppendorfpipette in Spitzglas

überführen,

am Rotationsverdampfer einengen

�

in 1ml Ammoniumacetatpuffer anlösen (Vortex), mit

Pasteurpipette in Autosamplervials überführen,

10µl pro Messung in das LC/MS injizieren

Abb. 6: Nachweis von Metamizol im Pferdeurin mittels LC/MS


3.3. Validierung der Methode

3.3.1. Grundlagen der Validierung

Unter Validierung versteht man den Nachweis und die Dokumentation der Zuverlässigkeit

einer analytischen Methode zur Erzeugung reproduzierbarer Daten. Als ein Instrument der

Qualitätssicherung ist sie Voraussetzung für die quantitative Bestimmung unterschiedlicher

Substanzen. Sie umfasst alle Teilschritte der Bestimmungsmethode, d. h. sie zeigt, dass die

Methode der Probenaufarbeitung und Messung für den beabsichtigten Zweck, der Erzeugung

ergebnissicherer pharmakokinetischer Daten für den Wirkstoff Metamizol, geeignet ist. In

dieser Studie sind folgende Elemente in die Validierung einbezogen:

• Selektivität, Spezifität

• Linearität

• Richtigkeit

• Präzision

• Nachweis- und Quantifizierungsgrenze

• Stabilität

• Wiederfindungsrate

3.3.1.1. Selektivität, Spezifität

Die Selektivität bzw. Spezifität gibt an, inwieweit ein Verfahren hier die HPLC/MS/MS-

Methode für eine bestimmte Substanz in Gegenwart anderer Substanzen präzise Ergebnisse

liefert, d. h. inwieweit es zwei Substanzen unterscheiden und trennen kann. Jede Substanz

muss zu einer für sie charakteristischen Retentionszeit von der Säule getragen werden und im

Chromatogramm einen deutlichen von Störpeaks zu trennenden Peak darstellen.

Wie in Kapitel 3.2.5.7 beschrieben, wurden Leerplasma und –urinproben mit Proben, denen

4-MAA zugesetzt wurde, verglichen. Es konnte festgestellt werden, dass die Analyten (4-

MAA und DMAP) ohne Verfälschung durch Serum- bzw. Urininhaltsstoffe (Spezifität) und

ohne gegenseitige Störung bei ausreichender Trennung (Selektivität) darzustellen sind.


3.3.1.2. Linearität

Die Linearität beschreibt die Proportionalität zwischen den Messergebnissen und den

theoretischen Konzentrationen. Sie gilt nur für einen bestimmten Konzentrationsbereich.

Nach DIN 38402 A51 (1986) erfolgt die Überprüfung der Linearität der Methode an

mindestens 5 Leerproben, denen unterschiedliche Konzentrationen der zu untersuchenden

Substanz zugesetzt werden. Diese fünf Konzentrationen müssen äquidistant fortlaufend den

gesamten Kalibrationsbereich abdecken. Jede Konzentrationsstufe wurde doppelt

aufgearbeitet und gemessen. Laut DIN 32645 (1994) werden Blankproben und

Konzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze hierfür nicht berücksichtigt. Die Messreihe

muss mindestens drei Mal an unterschiedlichen und voneinander unabhängigen Tagen

aufgearbeitet und gemessen werden. Da sich der Kalibierbereich sowohl im Plasma als auch

im Urin über zwei bzw. drei Zehnerpotenzen erstreckte, wurde für beide Matrices die

Linearität im niedrigen und hohen Konzentrationsbereich überprüft. Die gewählten

Konzentrationen sind in den Tabellen 2 und 3 aufgeführt.

Tabelle 2: Konzentrationen 4-MAA im Leerplasma zur Bestimmung der Kalibrationskurve

Konzentrationsbereich Konzentration in µg/ml

Niedrig

0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10

Hoch

10, 50, 100, 150, 200, 250

Tabelle 3: Konzentrationen 4-MAA im Leerurin zur Bestimmung der Kalibrationskurve

Konzentrationsbereich Konzentration in µg/ml

Niedrig

0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 75, 100

Hoch

100, 500, 1000, 2000, 4000, 6000, 8000

Aus dem Integral der erhaltenen Peakflächen des Analyten (4-MAA) und des internen

Standards (DMAP) wurde der Quotient errechnet und gegen die Konzentration der

Kalibratoren aufgetragen. Die entstehende Kalibriergerade wurde visuell auf Ausreißer und

Linearität untersucht. Unter Einbezug der Steigung dieser Geraden wurde auf die


„ gemessene“ Konzentration zurückgerechnet (back calculation, BC). Die BC durfte dabei um

maximal 15% und die Konzentration an der unteren Bestimmungsgrenze (lower limit of

quantification, LLQC) um maximal 20% von der theoretischen Konzentration abweichen

(EHSLC 2002).

3.3.1.3. Richtigkeit

Die Richtigkeit gibt die Abweichung des Mittelwertes von einem erwarteten Referenzwert

(wahren Wert) an. Sie hängt von der Größe systematischer Fehler, wie z.B. unkorrektes

Einwiegen des Analyten zur Herstellung einer Stammlösung oder Pipettierfehlern bei der

Erstellung der Kalibierreihe, ab.

Um die Richtigkeit zu überprüfen, wurden an drei unterschiedlichen Tagen jeweils fünf

Blankproben beider Matrices innerhalb des Messbereiches mit einer niedrigen (low quality

control standard, LQC), einer mittleren (midrange quality control standard, MQC) und einer

hohen (high quality control standard, HQC) Konzentration der nachzuweisenden Substanz

gespikt, aufgearbeitet und quantifiziert (EHSLC 2002). Im niedrigen Konzentrationsbereich

sind Abweichungen von den erwarteten Ergebnissen von bis zu 20% und im mittleren und

hohen Konzentrationsbereich von bis zu 15% zulässig. Zur Ermittlung der relativen

Abweichung (relativer Fehler, RE) des gemessenen Wertes von dem theoretisch zu

erwartenden Wert wird der Mittelwert aller fünf Konzentrationen eines

Konzentrationsbereiches (A) und die theoretische Konzentration (B) zueinander in

Beziehung gesetzt und wie folgt berechnet (EHSLC 2002):

RE (%) = (A-B)/B x 100 [16]

3.3.1.4. Präzision

Die Präzision ist das Maß für die Streuung eines Analysenergebnisses bei wiederholter

Durchführung der Messung gleicher Proben . Die Standardabweichung (S) bzw. die relative

Standardabweichung (Variationskoeffizient) wiederspiegeln die Präzision des Verfahrens


zahlenmäßig. Bei der Präzision unterscheidet man Wiederholpräzision sw (intraday

repeatability oder Tagespräzision) und Zwischenpräzision sb (interday repeatability).

Zur praktischen Ermittlung der Präzision werden jeweils fünf LQC-, MQC- und HQC-

Proben des Kalibrationsbereiches beider Matrices an drei unterschiedlichen Tagen

aufgearbeit und mittels HPLC/MS/MS quantifiziert. In Relation zum gemessenen Mittelwert

dürfen die Präzisionen im niedrigen Kalibrationsbereich nicht mehr als 20% bzw. im

mittleren und hohen Kalibrationsbereich nicht mehr als 15% abweichen (EHSLC 2002). Die

Präzisionen können wie folgt berechnet werden (EHSLC 2002):

Sw = )(

�� ⋅

Tagesrate

TagesrateTagesrate

f

Sf 2

[17]

Sb = ( )

Tage

gesamtTagesrate

f

XX� −2

[18]

In den Gleichungen entspricht „ f“ der Anzahl der Messungen –1 (bzw. den Freiheitsgraden),

„ X“ dem Mittelwert gleicher Konzentrationen und „ s“ der Standardabweichung.

3.3.1.5. Nachweis- und Quantifizierungsgrenze

Unter Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, limit of detection, LOD) versteht man die niedrigste

Konzentration, bei der sich eine Substanz unter den angegebenen Messbedingungen noch

qualitativ bestimmen lässt, indem ein vom Untergrundrauschen der Blankproben deutlich zu

unterscheidendes Instrumentensignal detektiert wird.

Für diese Studie wurde die Nachweisgrenze durch Ermittlung des Signal-Rausch-

Verhältnisses empirisch bestimmt. Hierzu wurde zunächst 4-MAA in drei verschiedenen

Konzentrationen des unteren Konzentrationsbereiches in Plasma- und Urin-Leerproben

gegeben. Für Plasma wurden die 4-MAA Konzentrationen 25, 100 und 250 ng/ml und für

Urin 100, 250 und 500 ng/ml gewählt. Jede Probe wurde dreifach aufgearbeitet und


gemessen. An zwei Ionenübergängen (218/97 und 187/57) wurde von den Peakhöhen der

niedrigsten, sich vom Untergrundrauschen abhebenden Konzentrationsstufe der Mittelwert

und die Standardabweichung gebildet. Dann wurde die Peakhöhe des Untergrundrauschens

von 10 Blankproben in Plasma und Urin ermittelt und daraus jeweils ein Mittelwert gebildet.

Nach Addition des 4-MAA-Signal-Mittelwertes zu dem dreifachen der Standardabweichung

muss sich ein Verhältnis zum Mittelwert der Peakhöhen des Untergrundrauschens von

mindestens 3:1 ergeben.

Die Bestimmungsgrenze (Quantifizierungsgrenze, limit of quantification, LOQ) legt die

niedrigste mit akzeptabler Präzision und Richtigkeit quantitativ bestimmbare Konzentration

einer zu analysierenden Substanz fest.

Zur Bestimmung der Quantifizierungsgrenze sind mindestens fünf Proben im gewählten

Konzentrationsbereich aufzuarbeiten und mittels HPLC/MS/MS zu quantifizieren. Die

Abweichung zwischen einem mittleren Messergebnis und dem erwarteten Referenzwert darf

nicht mehr als 20% betragen. Die Bestimmungsgrenze (BG) kann annähernd errechnet

werden: BG � 3 · NG [19]

3.3.1.6. Stabilität

Es ist für die gesamte Dauer des Ausscheidungsversuches, von der Probenentnahme bis zum

Abschluss der Analytik, zu gewährleisten, dass die zu quantifizierende Substanz bei der

Lagerung stabil ist. Zur Ermittlung der Stabilität im Plasma wurden 24 Blankplasmaproben

mit 4-MAA versetzt, so dass jeweils 12 Ansätze mit Konzentrationen 10 µg/ml bzw. 100

µg/ml erstellt wurden. Zur Ermittlung der Lagerstabilität von 4-MAA im Urin wurden

ebenfalls 24 Blankurinproben mit 4-MAA versetzt (12 Proben einer 100 µg/ml und 12 Proben

einer 1000 µg/ml Konzentration). Proben gleicher Konzentrationen wurden gepoolt und auf

12 Reagensgläser zu gleichen Mengen verteilt. Sechs Proben jeder Konzentration wurden

sofort mit internem Standard versetzt, aufgearbeitet und zusammen mit einer

Kalibrationsreihe mittels HPLC/MS/MS quantifiziert. Die restlichen Proben wurden unter

gleichen Bedingungen wie die Proben des Ausscheidungsversuches der Pferde über acht

Wochen bei minus 20 ºC tiefgefroren. Nach diesem Zeitraum, der der maximalen

Lagerungsdauer der Versuchsproben entspricht, werden diese Proben mit einer frisch

erstellten Kalibrationsreihe gemessen.


Für Plasma und Urin getrennt werden die Mittelwerte der zwei Messreihen mit dem T-Test

bei einseitiger Fragestellung verglichen. Von den Messreihen werden die Mittelwerte (X1 und

X2), die Standardabweichungen (s1 und s2), die Anzahl der Messungen (n1 und n2) sowie die

Freiheitsgerade (f1 und f2) bestimmt. Die Prüfgröße PGT wird wie folgt berechnet:

PGT = 21

21

21

22

212

1

21

nnnn

fffsfs

XX

+⋅

⋅

+⋅+⋅

− [20]

Der kritische Wert KWt kann aus statistischen Tabellen entnommen oder wie folgt berechnet

werden:

KWt = TINV (� · 2/f1+f2) [21]

Ist die Prüfgröße PGT kleiner als der kritische Wert KWt liegen zwischen den Mittelwerten

der Messreihen mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von 0,01 keine Unterschiede vor.

3.3.1.7. Wiederfindung

Die Bestimmung der Wiederfindungsrate von 4-MAA wurde mit einer Konzentration von 50

µg/ml im Plasma und 100 µg/ml im Urin durchgeführt. Für beide Matrices wurden jeweils 12

Proben aufgearbeitet. Den Blank-Proben 1 bis 6 wurde nur die 4-MAA Standardlösung in

entsprechender Konzentration zu Beginn der Aufarbeitung zugegeben. Abweichend von dem

gewohnten Aufarbeitungsschema wurde den Proben der interne Standard, das DMAP, in

entsprechender Konzentration erst nach dem Einengen am Rotationsverdampfer zugegeben

und die Proben anschließend bis zu vollständigen Trockne für zwei Stunden in einen

Exsikator verbracht wurden. Anschließend wurden die Proben mit Anfangspuffer gelöst und

in Autosamplervials überführt und quantifiziert. Den Proben 7 bis 12 wurde sowohl das 4-

MAA als auch der interne Standard erst nach dem Einengen am Rotationsverdampfer

zugegeben. Die weitere Behandlung erfolgte entsprechend den Proben 1 bis 6. Nach der

Messung wurde die Wiederfindungsrate des 4-MAA aus Plasma und Urin wie folgt

berechnet:


Wiederfindung [%] = 100127Pr)/(61Pr)/(

•−−

obenAreaAreaMWobenAreaAreaMW

ISTDS

ISTDS [22]

3.4. Messung der Proben aus dem Hauptversuch

3.4.1. Kalibrationsreihe im Plasma zur Quantifizierung des

Ausscheidungsversuches

Mit jeder Aufarbeitung von Plasmaproben des Ausscheidungsversuches wurde zu deren

Quantifizierung eine Kalibrationsreihe mit mindestens fünf verschiedenen 4-MAA-

Konzentrationen durch spiken von Blankplasma angefertigt. Eine Leerplasmaprobe, der nur

der interne Standard zugesetzt wurde, gehört zu jeder Kalibrationsreihe und ist nicht in den

fünf Konzentrationen enthalten. Diese fünf Konzentrationen decken den erwarteten

Substanzmengenbereich der Proben des Ausscheidungsversuches. Für niedrige und hohe

Konzentrationsbereiche wurde je eine eigene Kalibrierreihe erstellt. Jede Konzentration der

Kalibrierung wurde doppelt aufgearbeitet und gemessen. Die 4-MAA-Konzentrationen der

Kalibrierkurven, die Konzentration der verwendeten Standard- und Arbeitslösungen sowie die

jeweils zugegebene Menge sind in den Tabellen 4 und 5 dargestellt.

Tabelle 4: Eichwerte für die Kalibrierung im Plasma -niedrige Konzentrationen-

zur Quantifizierung der Plasmaproben p09 bis p16 und p00

Konzentration in µg/ml

Verwendete

Standard-/ Arbeitslösung

in µg/ml

zugegebene Menge in µl

0,5 10 50

1,0 100 10

2,5 100 25

5,0 100 50

7,5 100 75

10,0 1000 10

25,0 1000 25


Tabelle 5: Eichwerte für die Kalibrierung im Plasma -hohe Konzentrationen-

zur Quantifizierung der Plasmaproben p01 bis p08


Verwendete


in µg/ml


10 1000 10

25 1000 25

50 1000 50

75 1000 75

100 1000 100

125 10000 12,5

150 10000 15

3.4.2. Kalibrationsreihe im Urin zur Quantifizierung des

Ausscheidungsversuches

Die Prinzipien zur Erstellung von Eichkurven im Plasma wie unter 3.4 beschrieben gelten

gleichfalls für die Erstellung von Eichkurven im Urin. Die 4-MAA-Konzentrationen der

Eichkurven, die Konzentration der verwendeten Standard- und Arbeitslösungen sowie die

jeweils zugegebene Menge sind in den Tabellen 6 und 7 dargestellt.

Tabelle 6: Eichwerte für die Kalibrierung im Urin -niedrige Konzentrationen-

zur Quantifizierung der Urinroben u08 bis u11 und u00


Verwendete


in µg/ml


0,25 10 25

0.5 10 50

1,0 100 10

2,0 100 20


4,0 100 40

5,0 100 50

6,0 100 60

7,5 100 75

8,0 100 80

10,0 1000 10

Tabelle 7: Eichwerte für die Kalibrierung im Urin -hohe Konzentrationen- zur Quantifizierung der

Urinproben u01 bis u07


Verwendete


in µg/ml


50 1000 50

250 10000 25

500 10000 50

750 10000 75

1000 10000 100

2500 10000 250

3750 10000 350

5000 10000 500

3.5. Pharmakokinetische Auswertung

Pharmakokinetische Berechnungen erfolgten mit dem Programm Pharsight WinNonLin 4.1

der Firma Pharsight Corporation unter Verwendung eines offenen Zwei-Kompartiment-

Modells.

72 Ergebnisse

4. Ergebnisse

4.1. Massenspektren und Strukturformel von 4-MAA (Analyt) und

DMAP (interner Standard)

Die Massenspektren von 4-MAA und DMAP, die nach Ionisation und Aufreinigung im

Tandem-Massenspektrum durch den Detektor aufgezeichnet wurden, sind in den Abbildungen

7 und 8 dargestellt. Unter den in 3.2.5.2 und 3.2.5.6 beschriebenen HPLC-Bedingungen hat 4-

MAA eine Retentionszeit von 3,1 ± 0,1 Minuten und wird im Massenspektrum mit den

Massen m/z = 218 und m/z = 187 detektiert. DMAP gelangt nach einer Retentionszeit von 3,4

± 0,1 Minuten von der Chromatographiesäule und wird im Massenspektrum mit den Massen

m/z = 232 und m/z = 97 aufgezeichnet. Unter den Messbedingungen waren die

Retentionszeiten bei Berücksichtigung tagesabhängiger Schwankungen (± 0,1 Minuten) über

den gesamten Verlauf der Studie konstant. In die Massenspektren ist die Strukturformeln der

jeweiligen Substanz integriert. Gleichzeitig ist beispielhaft dargestellt, an welcher Stelle des

4-MAA-Moleküls ein für die Substanz charakteristisches Fragment mit einer bestimmten

Molmasse abgespalten wird. Nach Abspaltung entsteht aus dem 4-MAA ein Fragment mit der

Masse 97 bzw. 56 mol. Neben diesen Hauptfragmenten entstehen noch eine Vielzahl

zusätzlicher Fragmente, die ebenfalls molekülspezifisch sind, auf die hier aber nicht

eingegangen werden soll.

73 Ergebnisse

Die Abbildung 9 zeigt ein in dieser Studie erhaltenes Chromatogramm, auf dem links 4-MAA

und rechts DMAP detektiert wurde.

74 Ergebnisse

Abb. 9: Chromatogramm einer 4-MAA und DMAP enthaltenen Plasmaprobe

4.2. Validierung der Analysenmethode

4.2.1. Selektivität und Spezifität

Wie unter 3.2.5.7 beschrieben wurden Leerplasma und –urinproben, denen 4-MAA und

DMAP zugesetzt wurde, untersucht, um die Spezifität der Methode für die zu untersuchende

Substanz (4-MAA) und den internen Standard (DMAP) zu prüfen. Es konnte festgestellt

werden, dass diese Substanzen ohne Verfälschung durch Serum- bzw. Urininhaltsstoffe

(Spezifität) und ohne gegenseitige Störung bei ausreichender Trennung (Selektivität) mit der

verwendeten Messmethode erfasst werden.

Die Abbildungen 10 und 11 zeigen vergleichend Ausschnitte aus Gesamtchromatogrammen

von Plasma- und Urinproben zum Zeitpunkt der Retention von 4-MAA, die kein 4-MAA

(Leermatrixprobe) und 4-MAA in verschiedenen Konzentrationen enthalten.

75 Ergebnisse

4-MAA 217,8/97,0 4-MAA 217, 8/97,0 4-MAA 217,8/97,0

(Area=217,0) (Intensity=91,1) (Area=200857,8) (Intensity=60339,7) (Area=8926730,1) (Intensity=2426494,4)

a) b) c)

Abb. 10: HPLC/MS/MS-Chromatogramm von Plasmaproben, denen (a) kein 4-MAA, (b) 1µg

4-MAA/ml und (c) 100 µg 4-MAA/ml zugesetzt wurde

4-MAA 217,8/97,0 4-MAA 217, 8/97,0 4-MAA 217,8/97,0

(Area=255) (Intensity=98,1) (Area=50232) (Intensity=9488) (Area=3020032) (Intensity=865890)

a) b) c)

Abb. 11: HPLC/MS/MS-Chromatogramm von Urinproben, denen (a) kein 4-MAA, (b) 0,5

µg 4-MAA/ml und (c) 1000 µg 4-MAA/ml zugesetzt wurde

76 Ergebnisse

4.2.2. Prüfung auf Linearität

Die Kalibrationskurven für 4-MAA wurden im Plasma im Bereich von 0,25 bis 10 µg/ml

bzw. von 10 bis 250 µg/ml und im Urin im Bereich von 0,5 bis 100 µg/ml bzw. von 100 bis

8000 µg/ml an verschiedenen Tagen überprüft. In einem Graphen wurde die theoretisch zu

erwartende Konzentration des 4-MAA gegen den Quotienten des gemessenen

Peakflächenverhältnisses von 4-MAA zu DMAP aufgetragen (siehe Abbildungen 12 und 13).

Die Kalibrationsgleichungen aller Messungen folgen einer quadratischen Regression der

Form y = ax2 + cx + b, die neben dem Korrelationskoeffizienten (Bestimmtheitsmaß = R2)

immer im jeweiligen Graphen angezeigt werden. Die Abweichungen der gemessenen von der

theoretisch zu erwartenden Konzentration betrugen an allen Messtagen im Durchschnitt

weniger als 15% bzw. im Bereich der Quantifizierungsgrenze weniger als 20%. Das

Bestimmtheitsmaß der quadratischen Regression erreicht bei allen Kalibrationskurven einen

Wert von R2 > 0,994 im Plasma bzw. von R2 > 0,995 im Urin.

y = -0,0001201441x2 + 0,1173098011x - 0,0632107525R2 = 0,9980957133

-5

0

5

10

15

20

25

0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250

Konzentration 4-MAA [µg/ml]

Quo

tien

t (2

18/2

32)

Abb. 12: Kalibrationskurve, Kalibrationsgleichung und Regressionskoeffizient für 4-MAA im

Plasma (ermittelt nach Messung der unter 3.3.1.2 beschriebenen Proben)

77 Ergebnisse

y = -0,0000000216x2 + 0,0010349686x - 0,0395396089R2 = 0,9993694945

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

Konzentration 4-MAA in µg/ml

Quo

tien

t (2

18/2

32

Abb. 13: Kalibrationskurve, Kalibrationsgleichung und Regressionskoeffizient für 4-MAA im

Urin (ermittelt nach Messung der unter 3.3.1.2 beschriebenen Proben)

4.2.3. Richtigkeit

In Tabelle 8 sind die Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit der verwendeten Methode

im Plasma dargestellt. Dabei wurde an drei verschiedenen Messtagen die Richtigkeit als

relative Abweichung [RE (%)] der Mittelwerte der gemessenen Konzentrationen eines Tages

von den erwarteten Konzentrationen bestimmt. Die Ergebnisse liegen alle unterhalb der

maximal zulässigen Abweichung von 15% im oberen und 20% im mittleren und niedrigen

(nahe dem LLOQ) Kalibrationsbereich.

Tabelle 8: relative Abweichung (RE) als Beweis der Richtigkeit der Methode für

4-MAA im Plasma

Tag Anzahl

der

Proben

Erwartete

Konzentration

4-MAA [µg/ml]

Mittelwert der gemessenen

Konzentrationen 4-MAA [µg/ml]

Relative

Abweichung

RE [%]

1 6 1 0,99 0,51

78 Ergebnisse

6

6

10

100

10,49

102,32

4,87

2,32

2 6

6

6

1

10

100

0,98

9,96

100,35

1,78

0,44

0,35

3 6

6

6

1

10

100

0,99

9,78

92,13

0,84

2,24

7,87

In Tabelle 9 sind die Abweichungen der Mittelwerte der gemessenen von der theoretisch

erwarteten Konzentration als relative Abweichung [RE (%)] der Messungen für Urin

dargestellt. Die Ergebnisse liegen ebenfalls alle unterhalb der maximal zulässigen

Abweichung von 15% im oberen bzw. 20% im unteren (nahe dem LLOQ)

Konzentrationsbereich.

Tabelle 9: relative Abweichung (RE) als Beweis der Richtigkeit der Methode für 4-MAA im Urin

Tag Anzahl

der

Proben

Erwartete

Konzentration

4-MAA [µg/ml]

Mittelwert der gemessenen

Konzentrationen 4-MAA

[µg/ml]

Relative

Abweichung

RE [%]

1 6

6

6

10

100

1000

10,03

108,07

930,00

0,28

8,07

7,00

2 6

6

6

10

100

1000

9,95

91,40

929,01

0,47

8,6

7,10

3 6

6

6

10

100

1000

9,41

91,80

917,99

5,88

8,20

8,20

79 Ergebnisse

4.2.4. Präzision

Die Wiederholpräzision (Tagespräzision, intraday repeatability) und die Zwischenpräzision

(interday repeatability) wurden wie unter 3.3.1.4 beschrieben errechnet. Die Ergebnisse zur

Bestimmung der Präzision der Analysenmethode der Studie sind den Tabellen 10 (für Plasma)

und 11 (für Urin) aufgeführt. Alle Ergebnisse liegen innerhalb der maximal zulässigen

Abweichung von 15% im oberen Kalibrationsbereich bzw. 20% im Bereich der

Quantifizierungsgrenze.

Tabelle 10: Intraday und Interday Präzision der Methode für Plasma

Erwartete Konzentration

4-MAA [µg/ml]

Wiederholpräzision

(intraday repeatability) [%]

Zwischenpräzision

(interday repeatability) [%]

1 5,22 0,67

10 3,15 3,67

100 5,77 5,50

Tabelle 11: Intraday und Interday Präzision der Methode für Urin

Erwartete Konzentration

4-MAA [µg/ml]

Wiederholpräzision

(intraday repeatability) [%]

Zwischenpräzision

(interday repeatability) [%]

10 4,09 3,43

100 7,96 9,50

1000 1,77 0,72

80 Ergebnisse

4.2.5. Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, Limit of detection, LOD)

Die Nachweisgrenze von 4-MAA im liegt bei der in dieser Studie verwendeten Methode bei

0,25 µg/ml Plasma und bei 0,5 µg/ml Urin. Diese Werte wurden gemäß der Angaben unter

3.3.1.5 ermittelt.

4.2.6. Quantifizierungsgrenze (Bestimmungsgrenze, Limit of quantification,

LOQ)

Die Quantifizierungsgrenze für 4-MAA beträgt für die in der Studie angewendete Methode

aufgrund der Ergebnisse für Präzision und Richtigkeit 1 µg/ml Plasma und 10 µg/ml Urin.

Diese Werte wurden wie unter 3.3.1.5 beschrieben festgelegt.

4.2.7. Stabilität

Zur Überprüfung der Lagerstabilität von 4-MAA im Plasma und Urin wurden für jede Matrix

zwei Messreihen mit 2 Konzentrationen zu je 12 Proben erstellt. Sechs Proben jeder

Konzentration wurden in der ersten Messreihe am Tag Null zusammen mit einer

tagesaktuellen Kalibrationsreihe aufgearbeitet und gemessen, die restlichen Proben in einer

zweiten Messreihe acht Wochen später nach Lagerung bei –20° C. In den Tabellen 12 und 13

sind die Ergebnisse dargestellt.

81 Ergebnisse

Tabelle 12: Stabilität von 4-MAA im Plasma;

Vergleich der Daten am Tag Null mit denen nach Lagerung bei –20° C nach 8 Wochen

Messreihe

erwartete

Konzentration

4-MAA[µg/ml]

Anzahl der

Messungen

Mittelwert

[µg/ml]

Standard-

abweichung

[µg/ml]

Variations-

koeffizient

[%]

1 10 6 10,02 0,22 2,22

2 10 6 10,49 0,33 3,13

1 100 6 109,82 1,70 1,56

2 100 6 118,10 2,12 1,80

Tabelle 13: Stabilität von 4-MAA im Urin;

Vergleich der Daten am Tag Null mit denen nach Lagerung bei –20° C nach 8 Wochen

Messreihe

erwartete

Konzentration

4-MAA[µg/ml]

Anzahl der

Messungen

Mittelwert

Standard-

abweichung

[µg/ml]

Variations-

koeffizient

[%]

1 100 6 113,13 2,14 1,89

2 100 6 106,56 3,72 3,49

1 1000 6 907,22 35,48 3,91

2 1000 6 1044,51 59,44 5,69

Aufgrund der Ergebnisse konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den

Messreihen gezeigt werden. 4-MAA gilt in beiden Matrices als lagerstabil.

4.2.8. Wiederfindung (Recovery)

Die Wiederfindung gibt den Prozentsatz der nach der Probenaufarbeitung und Extraktion

tatsächlich „ wiedergefunden“ Substanzmenge im Vergleich zur ursprünglich vorhandenen

Menge an. Die Bestimmung der Wiederfindung des 4-MAA im Plasma und Urin wurde wie

unter 3.3.1.7 beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse der Prüfung auf Wiederfindung sind

82 Ergebnisse

in der Tabellen 14 aufgeführt. Im Plasma wird 4-MAA zu 29,84% und im Urin zu 9,5%

wiedergefunden.

Tabelle 14:

Wiederfindung von 4-MAA im Plasma und Urin

Matrix

Anzahl der

Proben

Mittlere

Wiederfindungsrate

[%]

Plasma 12 29,84

Urin 12 9,5

4.3. Ergebnisse des Hauptversuchs

4.3.1. Konzentrationen von 4-MAA im Plasma

In Abbildung 14 ist der Konzentrationsverlauf von 4-MAA im Plasma nach einmaliger

intravenöser Applikation von 30 mg/kg KGW Metamizol bei allen 10 Pferden dargestellt. Die

Abbildung zeigt nur Konzentrationen, die oberhalb der Quantifizierungsgrenze liegen. Der

Konzentrationsverlauf während der ersten 30 Minuten p.a. ist in der Ausschnittsgraphik

verdeutlicht. Zum ersten Entnahmezeitpunkt, zwei Minuten nach der intravenösen

Applikation, wird bei allen Pferden die höchste Konzentration gemessen. Diese lag bei den

Pferden zwischen 128,8 und 208,8 µg/ml Plasma. Bei allen Pferden sind die

Plasmakonzentrationen nach 24 Stunden unter die Quantifizierungsgrenze von 1 µg/ml

gesunken. Das Unterschreiten der Nachweisgrenze von 0,25 µg/ml Plasma ist bei neun

Pferden ebenfalls nach 24 Stunden post applicationem (p.a.) erfolgt. Bei einem Pferd ist der

Plasmaspiegel erst 36 Stunden p.a. unter die Nachweisgrenze abgesunken.

83 Ergebnisse

0

50

100

150

200

250

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Zeit nach i.v. Applikation [h]

Kon

zent

ratio

n 4-

MA

A [µ

g/m

l Pla

sma]

Pferd APferd BPferd C

Pferd DPferd EPferd F

Pferd GPferd HPferd IPferd J

0

50

100

150

200

250

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Abb. 14: Plasmakonzentrationsverlauf von 4-MAA nach einmaliger intravenöser Applikation von

30 mg/kg Metamizol bei 10 Pferden

Abbildung 15 zeigt die halblogarithmische Darstellung des Plasmakonzentrationsverlaufs

innerhalb der ersten 12 Stunden nach intravenöser Applikation von 30 mg/kg KGW bei den

Pferden der Studie.

84 Ergebnisse

Abb. 15: halblogarithmische Darstellung des Plasmakonzentrationsverlaufs innerhalb der ersten 12

Stunden nach intravenöser Applikation von 30 mg/kg KGW Metamizol bei 10 Pferden

4.3.2. Pharmakokinetische Daten von 4-MAA im Plasma

Die pharmakokinetischen Berechnungen erfolgten unter Annahme eines offenen Zwei-

Kompartiment-Modells. Der Konzentrationsbereich von der maximal erreichten

Konzentration (Cmax) bis zur Quantifizierungsgrenze wurde in die Berechnungen einbezogen.

Tabelle 15 zeigt eine Zusammenfassung der errechneten Daten.

1

10

100

1000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12


Kon

zent

ratio

n 4-

MA

A [µ

g/m

l Pla

sma]

Pferd APferd BPferd CPferd DPferd EPferd FPferd GPferd HPferd IPferd J

85 Ergebnisse

Tabelle 15: Pharmakokinetische Daten von 4-MAA im Plasma nach einmaliger intravenöser

Applikation von 30 mg/kg KGW bei 10 Pferden (der niedrigste und der höchste

Wert sind hervorgehoben)

Parameter Einheit Pferd

A

Pferd

B

Pferd

C

Pferd

D

Pferd

E

Pferd

F

Pferd

G

Pferd

H

Pferd

I

Pferd

J

� [1/h] 8,8 5,5 9,2 15,7 22,1 10,5 17,5 22,5 8,6 9,4

t50 (�) [h] 0,08 0,12 0,08 0,04 0,03 0,07 0,04 0,03 0,08 0,07

ß [1/h] 0,3 0,2 0,4 0,6 0,8 0,3 0,8 1,3 0,3 0,3

t50 (�) [h] 2,6 2,9 1,7 1,2 0,8 2,1 0,9 0,6 2,1 2,2

MRT [h] 3,2 3,5 2,1 1,4 1,1 2,6 1,0 0,7 2,4 2,6

Vss [ml/kg] 997,0 802,3 564,3 422,4 464,9 684,5 481,0 336,2 762,6 807,2

Clearance [ml/h/kg] 312,3 232,2 267,1 297,3 427,4 263,8 463,7 495,3 314,6 310,3

AUC [µg/ml*h] 96,1 129,2 112,3 100,9 70,2 113,7 64,7 60,6 95,4 96,7

Cmax [µg/ml] 164,2 146,0 209,1 300,5 220,4 212,2 255,9 277,4 190,8 192,7

Erläuterung der in den Tabellen 15 und 16 verwendeten Abkürzungen:

� , � = Hybridkonstante der Verteilungs- bzw. Eliminationsphase

t50 (�) = Halbwertzeit der Verteilungsphase

t50 (�) = Halbwertzeit der Eliminationsphase

MRT = Mean Residue Time - mittlere Verweildauer eines Substanzmoleküls im Organismus

Vss = Verteilungsvolumen im Steady State

AUC = Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve

Cmax = maximal gemessene Konzentration im Plasma

86 Ergebnisse

In der folgenden Tabelle 16 sind Mittelwerte, Standardabweichungen und

Variationskoeffizienten für die in Tabelle 15 aufgeführten Parameter als Ergebnisse der

pharmakokinetischen Berechnungen für 4-MAA im Plasma angegeben.

Tabelle 16: Mittelwert, Standardabweichung und Variationskoeffizient pharmakokinetischer Daten

von 4-MAA nach einmaliger intravenöser Applikation von 30 mg/kg KGW Metamizol (die

Erläuterungen der Abkürzungen entsprechen denen der Tabelle 15)

Parameter Einheit Mittelwert bei

n = 10

Standard-

abweichung

Variations-

koeffizient

� [1/h] 12,98 6,03 46,47

T50 (�) [h] 0,064 0,028 44,92

� [1/h] 0,53 0,35 65,39

T50 (�) [h] 1,71 0,80 46,66

MRT [h] 2,06 0,97 46,91

Vss [ml/kg] 632,24 210,68 33,32

Clearance [ml/min] 338,4 90,61 26,78

AUC [µg/ml*h] 93,98 22,52 23,96

Cmax [µg/ml] 216,92 48,69 22,45

4.3.3. Aufarbeitung der Urinproben ohne Hydrolyse

Bei der Analyse der Urinproben aus dem Vorversuch wurde geprüft, ob 4-MAA in

glucuronidierter und/oder sulfatierter Form mit dem Pferdeurin ausgeschieden wird. Dazu

wurde die erste Urinprobe (ca. 2 Stunden nach Versuchsbeginn gewonnen) eines Pferdes

dreifach unterschiedlich mit Hydrolyseschritt aufgearbeitet und zwar mit

• ß-Glucuronidase von Escherichia coli,

• ß-Glucuronidase/ Arylsulfatase von Helix pomatia, sowie

• Cystein.

Zusätzlich wurde die gleiche Urinprobe dreifach ohne Hydrolyse aufgearbeitet. Die

Extraktionsausbeuten, die durch die Quotienten der integrierten Flächen von 4-MAA zu

87 Ergebnisse

DMAP dargestellt werden, waren ohne Hydrolyseschritt größer. Dementsprechend wurden

alle Urinproben des Hauptversuches ohne Hydrolyse aufgearbeitet.

4.3.4. Konzentrationen von 4-MAA im Urin

Abbildung 16 zeigt den Konzentrationsverlauf von 4-MAA im Urin bis 180 Stunden nach

einmaliger intravenöser Applikation von 30 mg/kg KGW Metamizol von allen 10 Pferden.

Die Ausschnittsgraphik ergibt eine deutlichere Darstellung des Konzentrationsverlaufs

innerhalb der ersten 24 Stunden. Für die erste Urinprobe, zwei Stunden nach der Applikation,

konnten bei den Pferden A, D und I keine Daten ermittelt werden. Gleiches gilt für die Daten

der fünften Urinprobe nach 36 Stunden des Pferdes D. Bei allen Pferden, für die eine

Konzentration der ersten Urinprobe ermittelt werden konnte, ist diese die höchste gemessene

Konzentration im Urin. Sie lag bei den Pferden zwischen 1209,7 und 5021,7 µg/ml Urin. Bei

vier Pferden sind die Urinkonzentrationen nach 24 Stunden unter die Quantifizierungsgrenze

von 10 µg/ml gesunken, wohingegen bei fünf Pferden diese erst nach 36 Stunden

unterschritten wurde. Bei Pferd D kann diesbezüglich auf Grund des Fehlens der Probe (nach

36 h) keine Aussage getroffen werden; in der Urinprobe 49,1 Stunden p.a. liegt die 4-MAA-

Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze von 0,5 µg/ml. Bei einem Pferd ist die

Nachweisgrenze des 4-MAA im Urin bereits nach 30,3 Stunden unterschritten. Die 4-MAA-

Urinkonzentration von vier Pferden liegen 36 Stunden p.a. unterhalb der Nachweisgrenze.

Demgegenüber benötigt ein Pferd 50,1 und ein weiteres Pferd 94,2 Stunden bis zum

Unterschreiten der Nachweisgrenze.

88 Ergebnisse

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180


Kon

zent

ratio

n 4-

MA

A [µ

g/m

l Urin

]

Pferd APferd B

Pferd CPferd DPferd EPferd FPferd GPferd HPferd IPferd J

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36

Abb. 16: Urinkonzentrationsverlauf von 4-MAA nach einmaliger intravenöser Applikation von

30 mg/kg Metamizol bei 10 Pferden

In Abbildung 17 ist der Urinkonzentrationsverlauf nach intravenöser Applikation von 30

mg/kg KGW Metamizol bei allen 10 Pferden der Ausscheidungsstudie bis zum Erreichen der

Nachweisgrenze in halblogarithmischer Form dargestellt. Abbildung 18 zeigt in kumulativer

Darstellung die 4-MAA-Ausscheidung mit dem Urin bei Annahme einer produzierten

Urinmenge von 1 ml/kg KGW pro Stunde.

89 Ergebnisse

1

10

100

1000

10000

5,33 9,50 25,00


Kon

zent

ratio

n 4-

MA

A [

µg/m

l Uri

n]

Pferd A

Pferd BPferd C

Pferd D

Pferd EPferd F

Pferd G

Pferd HPferd I

Pferd J

Abb. 17: halblogarithmische Darstellung des Urinkonzentrationsverlaufs innerhalb der ersten 10

Stunden nach intravenöser Applikation von 30 mg/kg KGW Metamizol bei 10 Pferden

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

0 10 20 30 40 50 60 70 80


Men

ge 4

-MA

A im

Uri

n [m

g]

Pferd BPferd CPferd EPferd F

Pferd GPferd HPferd J

Abb. 18: Kumulative Darstellung der 4-MAA-Ausscheidung mit dem Urin bei Annahme einer

produzierten Urinmenge von 1 ml/kg KGW pro Stunde

90 Ergebnisse

4.4. Berechnung der effektiven und irrelevanten Plasma- und

Urinkonzentrationen

TOUTAIN und LASSOURD (2002) entwickelten ein PK/PD-Modell, mit dessen Hilfe aus

erhobenen pharmakokinetischen Daten effektive bzw. irrelevante Plasma- und

Urinkonzentrationen berechnet werden können. Die effektive Plasmakonzentration (EPC) pro

Dosierungsintervall wird unter Berücksichtigung der Dosierung (D) und der Clearance (Cl)

nach folgender Gleichung ermittelt.

EPC = ClearanceDosierung

[µg/ml] [23]

Bei parenteraler Applikationsweise müßte in o.g. Gleichung die Dosis mit der

Bioverfügbarkeit multipliziert werden. Da bei intravenöser Verabreichung die

Bioverfügbarkeit einen Wert von 1 annimmt, wird sie in der Formel nicht aufgeführt.

Die irrelevante Plasmakonzentration (IPC) läst sich aus der EPC unter Annahme eines

Sicherheitsfaktors (SF) nach Gleichung [24] berechnen. Der von TOUTAIN und

LASSOURD (2002) eingesetzte Sicherheitsfaktor soll dem Ausgleich interindividueller

Schwankungen und der Gewährleistung der Validität der Daten dienen und wurde auf den

Zahlenwert 500 festgelegt.

IPC = SF

EPC [µg/ml] [24]

Nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) wird die irrelevante Urinkonzentration (IUC) wie

folgt berechnet:

IUC = IPC � Rss [µg/ml] [25]

Rss stellt dabei das Konzentrationsverhältnis von Urin zu Plasma im Steady-State dar. Die

Berechnung erfolgt nach Gleichung [26].

Rss = rationsmakonzentttlichePladurchschnitionnkonzentrattlicheUridurchschni

[26]

91 Ergebnisse

Die durchschnittliche Urinkonzentration (CUrinø) wird in dieser Studie wie folgt errechnet:

Addition der Urinkonzentrationen, die in dem Zeitraum eines angenommenen

Dosierungsintervalls von 8 Stunden liegen und anschließende Division durch die Anzahl der

addierten Konzentrationen.

Die durchschnittliche Plasmakonzentration (CPlasmaø) errechnet sich nach Gleichung [27] unter

Einbeziehung der maximalen Plasmakonzentration (Cmax) und der Eliminationskonstanten (�)

(KIETZMANN, 1983).

CPlasmaø = tervallDosierung

Csin

max

•β [µg/ml] [27]

Die EPC, IPC und IUC wurden entsprechend der oben aufgeführten Gleichungen nach

Einsetzen der in Tabelle 15 aufgeführten für Plasma ermittelten pharmakokinetischen Daten

für alle 10 Pferde berechnet und sind in Tabelle 17 dargestellt. Dabei wurde ein

Dosierungsintervall von 8 Stunden angenommen (EBERT et al. 2002). Tabelle 17 zeigt die

Ergebnisse der EPC, IPC und IUC entsprechend oben beschriebener Vorgehensweise der

Berechnung nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) von 10 Pferden nach einer intravenösen

Dosierung von 30 mg/kg KGW bei einem Dosierungsintervall von 8 Stunden. Bei den Pferden

A, D und I konnten keine Werte für die IUC ermittelt werden, da bei diesen Pferden die mit in

die Berechnung einfließende Konzentration der ersten Urinprobe nicht auszuwerten war.

Tabelle 17: nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) berechnete EPC, IPC und IUC von 10 Pferden

einschließlich Mittelwert und Standardabweichung nach einer Dosierung von 30 mg/kg KGW bei

einem Dosierungsintervall von 8 Stunden (der niedrigste und der höchste Wert sind unterlegt)

Para-

meter

Ein-

heit

Pferd

A

Pferd

B

Pferd

C

Pferd

D

Pferd

E

Pferd

F

Pferd

G

Pferd

H

Pferd

I

Pferd

J MW S

EPC

(8h) µg/ml 64,17 86,05 76,38 78,30 48,01 85,75 28,34 31,74 45,30 50,08 59,41 21,65

IPC

(8h) µg/ml 0,13 0,17 0,15 0,16 0,10 0,17 0.06 0,06 0,09 0,10 0,12 0,04

IUC

(8h)

µg/ml

n.e. 2,21 2,83 n.e. 4,94 1,77 1,49 1,30 n.e 0,79 2,19 1,38

92 Ergebnisse

Erläuterung der in Tabelle 17 verwendeten Abkürzungen:

EPC = effektive Plasmakonzentration

IPC = irrelevante Plasmakonzentration

IUC = irrelevante Urinkonzentration

MW = Mittelwert

n.e. = Daten nicht ermittelt

S = Standardabweichung

Nach diesen Berechnungen ist ersichtlich, dass die EPC immer deutlich oberhalb der

Quantifizierungsgrenze (1 µg/ml Plasma) liegt. Die IPC liegt jedoch bei allen Pferden dieser

Ausscheidungsstudie unterhalb der Nachweisgrenze von 0,25 mg 4-MAA/ml Plasma.

Die IUC liegt bei allen Tieren deutlich unterhalb der Quantifizierungsgrenze von 10 µg/ml

Urin als auch deutlich oberhalb der Nachweisgrenze von 0,5 µg/ml.

4.5. Berechnung von Ausscheidungszeiten von 4-MAA aus Plasma und Urin

Die Zeit für die Ausscheidung von 4-MAA aus dem Plasma bis zum Erreichen der

irrelavanten Plasmakonzentration (ta(IPC)) kann nach Gleichung [28] berechnet werden

(KIETZMANN, 1983):

ta(IPC) = β

IPCC lnln max −[h] [28]

Um die Ausscheidungszeit von 4-MAA aus dem Plasma bis a) zum Erreichen der

Quantifizierungsgrenze (ta(LOQ)) bzw. b) der Nachweisgrenze (ta(LOD)) zu errechnen, kann die

Gleichung [28] modifiziert werden:

a): ta(LOQ) = β

LOQCC lnln max −[h] [ 29]

b): ta(LOD) = β

LODCC lnln max −[h] [30]

93 Ergebnisse

Erläuterungen zu den Gleichungen 28, 29 und 30:

C(LOQ) = Konzentration der Quantifizierungsgrenze

C(LOD) = Konzentration der Nachweisgrenze

Cmax = maximale Konzentration

ta(IPC) = Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der irrelevanten Plasmakonzentration

ta(LOQ) = Ausscheidungszeit aus dem Plasma bis zum Erreichen der

Quantifizierungsgrenze

ta(LOD) = Ausscheidungszeit aus dem Plasma bis zum Erreichen der Nachweisgrenze

� = Eliminationskonstante

Tabelle 18 zeigt die Ergebnisse der Berechnungen der Ausscheidungszeiten von 4-MAA bis

zum Erreichen der irrelevanten Plasmakonzentration (ta(IPC)) als auch bis zum Erreichen der

Quantifizierungs (ta(LOQ))- und Nachweisgrenze(ta(LOD)). Die Zeit bis zum Erreichen der

irrelevanten Plasmakonzentration betrug bei den Pferden zwischen 6,5 und 33,7 Stunden und

lag im Mittel bei 18,9 Stunden. Die Ausscheidung von 4-MAA aus dem Plasma bis zum

Erreichen der Quantifizierungsgrenze dauerte zwischen 4,3 und 24,9 Stunden bzw.

durchschnittlich 13,6 Stunden. Bis zum Erreichen der Nachweisgrenze betrug die

Ausscheidungszeit aus dem Plasma zwischen 4,8 und 27,9 Stunden. Die mittlere

Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der Nachweisgrenze liegt bei 15,1 Stunden.

94 Ergebnisse

Tabelle 18 : nach KIETZMANN (1983) berechnete Ausscheidungszeiten (ta(IPC) , ta(LOQ) , ta(LOD)) von

4-MAA bei 10 Pferden nach einer intravenösen Verabreichung von 30 mg/kg KGW Metamizol und

einem Dosierungsintervall von 8 Stunden (der niedrigste und der höchste Wert sind unterlegt)

Para-

meter

Einheit Pferd

A

Pferd

B

Pferd

C

Pferd

D

Pferd

E

Pferd

F

Pferd

G

Pferd

H

Pferd

I

Pferd

J

MW S

ta(IPC)

[h]

23,85

33,72

18,05

12,60

9,67

23,74

10,52

6,45

25,51

25,21

18,93

8,83

ta(LOQ)

[h]

17,00

24,92

13,36

9,51

6,74

17,86

6,93

4,33

17,50

17,54

13,57

6,52

ta(LOD)

[h]

19,01

27,93

14,86

10,51

7,50

19,87

7,68

4,79

19,51

19,54

15,12

7,32

Erläuterungen zu den Abkürzungen der Tabelle 18:

ta(IPC) = Ausscheidungszeit bis zum Erreichen der irrelevanten Plasmakonzentration

ta(LOQ) = Ausscheidungszeit aus dem Plasma bis zum Erreichen der

Quantifizierungsgrenze

ta(LOD) = Ausscheidungszeit aus dem Plasma bis zum Erreichen der Nachweisgrenze

95 Diskussion

5. Diskussion

Ziel dieser Arbeit war es einerseits, eine geeignete Analysenmethode zum quantitativen

Nachweis von 4-MAA, dem Hauptmetaboliten des Arzneistoffes Metamizol, im Plasma und

Urin von Pferden bei Einsatz eines Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographen und

anschließender Detektion durch ein Tandem-Massenspektrometer zu erarbeiten und zu

validieren. Andererseits sollten mit den im Pferdeplasma und –urin gemessenen 4-MAA-

Konzentrationen pharmakokinetische Berechnungen durchgeführt werden. Für 4-MAA

wurden nach Einbringen errechneter pharmakokinetischen Parameter in das PK/PD-Modell

von TOUTAIN und LASSOURD (2002) Plasma- und Urinkonzentrationen ermittelt, die

keine relevante pharmakologische Wirkung der Substanz auf den Organismus erwarten lassen

sollen. Auf Grundlage der Ergebnisse soll geprüft werden, ob eine allgemeine Aussage

getroffen werden kann, wie lange 4-MAA im Plasma und Urin von Pferden nachweisbar ist

und welche möglichen Konsequenzen sich daraus für den Einsatz von Sportpferden im

Wettkampf ergeben.

5.1. Eignung der erarbeiteten Analysenmethode (HPLC/MS/MS) für den

Nachweis von 4-MAA im Plasma und Urin von Pferden

Metamizol beziehungsweise 4-MAA wurde im Institut für Biochemie der Deutschen

Sporthochschule Köln in Plasma und Urin bislang gaschromatographisch mit nachfolgender

Massenspektrometrie qualitativ analysiert (SCHÄNZER, persönliche Mitteilung). Die dafür

zuvor verwendete Aufarbeitungsmethode, einschließlich einer basischen Extraktion der

Substanz, wurde für das HPLC/MS/MS-Verfahren modifiziert. Die aufzuarbeitende Plasma-

und Urin-Menge wurde verringert; die Aufnahme der eingeengten Etherphase erfolgte anstatt

in Methanol in einem Ammonium-Acetat-Puffergemisch, welches dem HPLC-

Anfangsfließmittel entspricht. Die bisher verwendete Analysenmethode erwies sich als

unzureichend empfindlich und lieferte zudem unbefriedigende Peakformen im

Chromatogramm, die eine ungenaue Integration bedingten. Entsprechend erfolgte keine

Quantifizierung des 4-MAA. Die Einführung einer HPLC-Methode zur Analyse von 4-MAA

war darin begründet, die Empfindlichkeit des Analyseverfahrens zu verbessern. Zudem sollte

eine schärfere Darstellung der Peakform und eine bessere Detektion die Quantifizierung

96 Diskussion

ermöglichen. In dem bestehenden Routineverfahren des Institutes für Biochemie der

Sporthochschule Köln wurde Ether als organisches Extraktionsmittel für 4-MAA aus

Pferdeplasma und –urin verwendet. Ether eignet sich besonders gut zur Extraktion basischer

Verbindungen, wie sie das Metamizol bzw. 4-MAA darstellt. Mit dem Ether werden aber

auch Substanzen aus den biologischen Matrices gelöst, die die Analytik stören. Um dem

entgegenzuwirken, wird der pH-Wert vor der Extraktion stark basisch (pH 14) eingestellt,

dass saure und neutrale Verbindungen in der entsprechenden Matrix zurückbleiben und nicht

in die Etherphase übergehen.

Im Vorversuch wurde zusätzlich überprüft, ob 4-MAA im Pferdeurin in konjugierter

(glucuronidierter, sulfatierter) Form vorliegt. Dazu wurden auf Routineverfahren des

Institutes für Biochemie der Sporthochschule Köln basierende Methoden zur Hydrolyse

verwendet. Die Hydrolyse von 4-MAA enthaltenden Pferdeurin mit ß-Glucuronidase von

Escherichia coli, ß-Glucuronidase/Arylsulfatase und Cystein vor der eigentlichen

Aufarbeitung erbrachte keine Verbesserung der Extraktionsausbeute im Vergleich zur

Aufarbeitung der Urinproben ohne Hydrolyse. Auch sind der Literatur (POPOT et al. 2000)

bezüglich der Ausscheidungsform des 4-MAA mit dem Pferdeurin keinerlei Angaben zu

entnehmen. Es ist somit anzunehmen, dass 4-MAA beim Pferd in freier Form mit dem Urin

ausgeschieden wird.

In Anlehnung an die Vorgaben der EHSLC (2002) wurde die Analysenmethode durch

Validierung auf Eignung zum Nachweis von 4-MAA in Plasma und Urin des Pferdes geprüft.

Dabei wird durch die Spezifität der Methode sichergestellt, dass sowohl das 4-MAA als auch

der interne Standard (DMAP) ohne Verfälschung von Serum- bzw. Urininhaltsstoffen

(Störpeaks) darzustellen sind. Die Selektivität bestätigt, dass bei der Methode eine

ausreichende Trennung ohne gegenseitige Störung beider Substanzen auch aufgrund

unterschiedlicher Retentionszeiten gewährleistet ist. Die Proportionalität zwischen den

Messergebnissen und den theoretisch zu erwartenden Konzentrationen wurde im Plasma im

Bereich von 0,25 bis 10 µg/ml und von 10 bis 250 µg/ml bzw. im Urin im Bereich von 0,5 bis

100 µg/ml und 100 bis 8000 µg/ml geprüft und bestätigt. Dabei folgen die

Kalibrationsgleichungen aller Messungen einer quadratischen Gleichung. Das

Bestimmtheitsmaß (R2) der quadratischen Regression erreicht bei allen Messungen im Plasma

einen Wert von R2 > 0,994, bzw. im Urin einen Wert von R2 > 0,995, so dass die Methode als

geeignet einzustufen ist. Die Richtigkeit (relativer Fehler) der Methode, repräsentiert durch

die relative Abweichung [RE (%)] der Mittelwerte der gemessenen Konzentrationen eines

Tages von den theoretisch zu erwartenden, wurde an drei Messtagen überprüft und bewiesen.

97 Diskussion

Die Kriterien für die Präzision (intraday repeatability und interday repeatability) wurden

ebenfalls erfüllt. Bei allen bisher genannten Validierungsparametern blieben die

höchstzulässigen Abweichungen bei beiden Matrices innerhalb von 15% im oberen und 20%

im mittleren und unteren Kalibrationsbereich. Die Nachweisgrenze für 4-MAA im Plasma

beträgt 0,25 µg/ml und ist vergleichend zu anderen Studien, die allerdings auf andere

Analyseverfahren beruhen, relativ hoch. Dennoch ist die erarbeitete Methode empfindlich

genug, den 4-MAA-Nachweis in dopingrelevanten Proben zu gewährleisten. Bei

gaschromatischem Nachweis und Detektion durch ein Massenspektrometer erreichte

SCHLINGLOFF (1997) eine Nachweisgrenze von 3,9 ng/ml Pferdeplasma. DAMM (1989)

erzielte mittels HPLC-Trennung und UV-Detektion bei 265 nm eine Nachweisgrenze von 0,1

µg/ml Humanplasma und 2 µg/ml Humanurin. In dieser Studie konnte im Pferdeurin eine

Nachweisgrenze von 0,5 µg/ml ermittelt werden. Weitere Vergleiche zu Studien aus dem

humanmedizinischen Bereich (AGUNDEZ et al. 1994, ASMARDI und JAMALI 1983,

ZYLBER-KATZ et al. 1984) sind nicht möglich, da diese auf andere Nachweisverfahren

(HPLC-UV) basieren und zudem keine Nachweisgrenzen genannt werden. POPOT et al.

(2000) weisen Metaboliten des Metamizols (FAA, AA, AAA, Dehydronoraminophenazon)

im Pferdeurin mittels GS/MS nach, geben jedoch keine Nachweis- und

Quantifizierungsgrenzen an.

4-MAA stellt den Hauptmetaboliten des Metamizols dar. Weitere bekannte bedeutende

Metaboliten wie z.B. 4-Formylaminoantipyrin (FAA), 4-Aminoantipyrin (AA) und 4-

Acetylaminoantipyrin (AAA) und deren Nachweis aus Plasma, Urin und anderen

Körperflüssigkeiten sind in der Literatur besonders im Humanbereich mehrfach beschrieben

(DAMM 1989, VLAHOV 1990, LEVY et al. 1995, ZYLBER-KATZ et al., 1992,

NEDDERMANN und ROHDEWALD 1988, POPOT et al. 2000), bleiben aber in

Untersuchungen dieser Studie unberücksichtigt. Die Metaboliten FAA, AA und AAA

besitzen teilweise noch pharmakologische Wirksamkeit. Allgemein wird aber 4-MAA als

Leitsubstanz in der Doping-Analytik verwendet, so dass in die Berechnungen des PK/PD-

Modell von TOUTAIN und LASSOURD (2002) weitere Metaboliten nicht einbezogen

werden und zudem für dieses Modell nur pharmakokinetische Daten der hauptsächlich

wirksamen Substanz, dem 4-MAA, benötigt werden (siehe 5.4). Da die Proben des

Ausscheidungsversuchs nach der Gewinnung z.T. bis zu 8 Wochen bei –20 °C eingefroren

waren, bevor sie aufgearbeitet und gemessen wurden, erfolgte eine Überprüfung der

Lagerstabilität von 4-MAA im Plasma und Urin unter gleichen Bedingungen. 4-MAA ist in

beiden Matrices bei –20 °C über acht Wochen stabil. Trotz der geringen Wiederfindungsrate

98 Diskussion

weisen Richtigkeit und Präzision aus, dass die Methode geeignet ist, dopingpositive Fälle zu

erkennen. Die in dieser Studie für die Analytik von 4-MAA in Plasma und Urin von Pferden

entwickelte Methode beinhaltet ein einfaches und schnelles Aufarbeitungs- und

Extraktionsverfahren. Da aufwendige Prozeduren für eine Übersichtsanalyse, wie in der

Routine der Dopinguntersuchung, unvorteilhaft sind, stellt die hier entwickelte Methode einen

Ansatz zur Entwicklung eines Routineverfahrens dar. Es bleibt jedoch zu berücksichtigen,

dass in dieser Studie ein sehr großer Konzentrationsbereich (im Urin: von Null bis 8000

µg/ml) erfasst und validiert werden musste, wodurch vergleichend zu GC/MS- und HPLC-

UV-Verfahren einerseits nicht die Empfindlichkeit mit dieser Methode erreicht wurde,

andererseits aber die Messgeräte auch bei sehr hohen Konzentrationen noch auswertbare

Chromatogramme lieferten. In dieser Studie konnten die höchsten Extraktionsausbeuten

(siehe 3.2.5.7, Abbildungen 5 und 6) mittels basischer Extraktion bei pH 14 und Verwendung

von tertiärem Butylmethylether in einer Flüssig-Flüssig-Extraktion erzielt werden.

Demgegenüber erscheinen andere in der Literatur beschriebene Aufarbeitungen eher

aufwendig. SCHLINGLOFF (1997) extrahierte ebenfalls im Basischen, führte die

Plasmaproben jedoch über eine Festphasen-Extraktionssäule und musste zur Messung an

einem Gaschromatographen derivatisieren. POPOT et al. (2000) extrahierten

Pferdeurinproben bei pH 9,5 und nutzten ebenfalls eine Festphasen-Extraktion. DAMM

(1989) führte zur Analyse von 4-MAA in Humanplasma und –urin eine Flüssig-Flüssig-

Extraktion im basischen pH-Bereich vor Messung mittels HPLC-UV-Verfahren durch.

Vergleichend stellt Aufarbeitungsprozedur der erarbeiteten Methode ein einfaches, schnelles

und praktikables Verfahren dar.

Besondere Schwierigkeiten lagen in dieser Studie während der Validierung der Methode in

der starken Oxidationsneigung des 4-MAA unter Lichteinfluss und bei Verbringung in

wässriges Milieu begründet. Dieses wurde nach Messungen von Kalibrierreihen deutlich, die

mit 4-MAA-Stamm- und Arbeitslösungen erstellt wurden, in denen das 4-MAA in Methanol

oder in 0,06 N Salzsäure gelöst war. Waren die methanolischen oder salzsäurehaltigen

wässrigen Stamm- und Arbeitslösungen älter als 24 Stunden, verfärbten sie sich zunehmend

gelblich. Zudem zeigte sich in Abhängigkeit von der Lagerzeit eine erhebliche Streuung der

Ergebnisse der Messreihen mehrerer Tage. Akzeptable Kalibrierreihen wurden erst erhalten,

nachdem die 4-MAA-Stamm- und Arbeitslösungen mit 1%-iger Mercaptoethanollösung (in

0,06 N Salzsäure) erstellt wurden. 4-MAA erschien darin für ca. 4 Wochen stabil. Unter

Berücksichtigung der erheblichen Oxidationsneigung von 4-MAA war es von Interesse, wie

lange 4-MAA nach der Aufarbeitung, gelöst in dem Ammoniumacetat-HPLC-Anfangspuffer

99 Diskussion

und in HPLC-Autosamplervials verbracht, reproduzierbare Messergebnisse liefert. Dazu

wurden Proben der Kalibrierreihen der Validierung nach 24, 48 und 72 Stunden Lagerung

bei Zimmertemperatur wiederholt gemessen und die gemessenen Konzentrationen mit denen

von Messreihen verglichen, die sofort nach der Aufarbeitung gemessen wurden. Dabei wurde

festgestellt, dass bis zu 24 Stunden reproduzierbare Messergebnisse gewährleistet sind.

Wurde die Proben wie oben beschrieben zwischenzeitlich nicht bei Zimmertemperatur,

sondern bei +4° C aufbewahrt, ist bis zu 48 Stunden die Reproduzierbarkeit der

Messergebnisse gewährleistet.

Abschließend ist zu erwähnen, dass die Wiederfindungsraten, die mit dieser Methode erzielt

wurden, durch Veränderung der Aufarbeitungsprozedur verbesserbar erscheinen. Die

Methode zeichnet sich durch das einfache Aufarbeitungsverfahren, valider Präzision und

Reproduzierbarkeit aus. Zudem kann die entwickelte Methode über einen großen

Konzentrationsbereich gleichermaßen für Plasma und Urin angewendet werden.

5.2. Pharmakokinetik von 4-MAA im Plasma

Zwei Minuten nach der intravenösen Applikation von 30 mg/kg KGW Metamizol wird die

höchste Plasmakonzentration von 4-MAA bei allen 10 Pferden gemessen. Diese liegt im

Konzentrationsbereich zwischen 128,8 und 208,8 µg/ml Plasma und beträgt im Mittel 159,4

µg/ml. Bei allen Pferden erfolgt innerhalb der ersten 15 Minuten nach der Verabreichung ein

rascher Abfall der 4-MAA-Plasmakonzentration auf weniger als die Hälfte der in der ersten,

zwei Minuten nach Versuchsbeginn gemessenen Plasmaprobe. Zwölf Stunden nach der

Metamizolapplikation war bei allen Pferden die Quantifizierungsgrenze von 1 µg/ml Plasma

unterschritten. Die Nachweisgrenze von 0,25 µg/ml war im Plasma bei 9 Pferden nach 12

Stunden erreicht. Bei einem Pferd war die Nachweisgrenze von 4-MAA im Plasma jedoch

erst nach 36 Stunden p.a. unterschritten.

In Anbetracht des Verlaufs der Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve von 4-MAA konnten

pharmakokinetische Berechnungen auf Grundlage eines offenen Zwei-Kompartiment-Modells

durchgeführt werden (HEINZEL et al. 1993). Zur Ermittlung der pharmakokinetischen

Parameter wurden nur Konzentrationen oberhalb der Quantifizierungsgrenze verwendet.

Nach pharmakokinetischen Berechnungen ergibt sich eine mittlere Clearance für 4-MAA im

Plasma von 338,4 ± 90,6 ml/min. Die Halbwertzeit der Eliminationsphase beträgt im Mittel

100 Diskussion

1,7 ± 0,8 Stunden. Das Verteilungsvolumen im Steady-State lag im Mittel bei 632,2 ± 210,7

ml/kg.

Trotz Ermittlung des Körpergewichtes jedes einzelnen Pferdes und genauer Berechnung der

individuellen Dosis, wonach jedes Pferd präzise eine Dosierung von 30 mg/kg KGW erhält,

schwanken die gemessenen Maximalkonzentrationen zwischen 128,8 und 208,8 µg/ml

Plasma. Diese Schwankungen belegen letztlich die biologische Variabilität, da aufgrund der

Verwendung eines Venenkatheters, durch den die intravenöse Applikation erfolgte, die

Möglichkeit einer paravenösen Applikation ausgeschlossen sein sollte. Ein mutmaßlicher

Erklärungsversuch wäre eine sehr rasche Umverteilung aus dem Plasma ins Gewebe. Um

Bezug auf die Fragestellung dieser Studie zu nehmen, eine allgemein gültige Aussage zur

Ausscheidungsdauer und Dopingrelevanz von Metamizol zu treffen, dürfen interindividuelle

Schwankungen nicht unerwähnt bleiben. So variieren die errechneten maximalen

Plasmakonzentrationen (Cmax) um einen Faktor 2. Die Zeiten für die HWZ der Verteilung als

auch die HWZ der Elimination zeigen interindividuelle Schwankungen um einen Faktor 4.

Die HWZ der Verteilungsphase nimmt Werte zwischen 0,03 und 0,12 Stunden und die HWZ

der �-Phase Werte zwischen 0,6 und 2,9 Stunden an. Betrachtet man die Clearance, so liegen

die berechneten Werte, variierend um einen Faktor 2, im Bereich zwischen 232,2 und 495, 3

ml/h/kg. Die Werte der Clearance sind geringeren Schwankungen unterlegen als die Werte

der HWZ. Bei relativ konstanter Clearance führt ein vergrößertes Verteilungsvolumen zur

Verlängerung der HWZ.

101 Diskussion

5.3. 4-MAA im Urin

Bei Betrachtung des Verlaufs der 4-MAA-Konzentrations-Zeit-Kurve im Urin (Abb. 16) sind

sehr deutliche interindividuelle Schwankungen ersichtlich. Die maximal gemessene 4-MAA-

Urin-Konzentration lag zwischen 1210 und 5022 µg/ml und differierte somit um den Faktor 4.

Im Mittel betrug die maximal erreichte 4-MAA-Konzentration 2740,4 µg/ml Urin. Dabei ist

zu berücksichtigen, dass von drei Pferden die erste Urinprobe ca. 2 Stunden nach

Arzneimittelapplikation nicht gewonnen werden konnte und diese entsprechend nicht zur

Berechnung des Mittelwertes der maximal erreichten 4-MAA-Urinkonzentration

herangezogen wurde. Bei den sieben Pferden, bei denen die erste Urinprobe ausgewertet

werden konnte, enthält diese die höchste im Urin gemessene 4-MAA-Konzentration. Bei

Pferd D konnte die erste Urinprobe nicht gewonnen werden; in der zweiten ca. sechs Stunden

nach Metamizolapplikation gewonnenen Urinprobe wurde eine 4-MAA-Konzentration von

4620,1 µg/ml gemessen. Dieses entspricht vergleichend zu den anderen Pferden der höchsten

4-MAA-Konzentration, die in der bis zur sechsten Stunde p.a. gewonnenen Urinprobe

gemessen wurde. Es läst sich vermuten, dass die erste Urinprobe bei Pferd D die maximal im

Urin gemessene 4-MAA-Konzentration aufgewiesen hätte.

Die Beurteilung des Ausscheidungsverhaltens einer Substanz anhand ihrer Konzentration im

Urin ist mit erheblichen Unsicherheiten verbunden. Die oben beschriebenen interindividuellen

Schwankungen in der Ausscheidungszeit verdeutlichen dieses. Differenzen in der

Ausscheidungszeit sind teilweise durch die unterschiedliche Harnproduktion der einzelnen

Pferde bedingt. Die Harnproduktion unterliegt dem Einfluss verschiedener endogener und

exogener Faktoren. Beispiele hierfür sind Flüssigkeitsaufnahme, Fütterung, diurale Kapazität

der Nieren, Haltungsbedingungen, das Maß der körperlichen Anstrengung, der

Gesundheitszustand, eventuell Wechselwirkungen mit gleichzeitig verabreichten Wirkstoffen

und vieles mehr (SCHOENE 1996). Um präzisere Aussagen bezüglich der Ausscheidungsrate

(Menge an ausgeschiedenem 4-MAA im Urin pro Zeiteinheit) zu machen, wäre es notwendig

gewesen, den gesamten Urin von jedem Pferd über die Dauer des Ausscheidungsversuches

aufzufangen und mengenmäßig zu erfassen (DYKE und SAMS 1994). Dazu hätten die Pferde

während des gesamten Ausscheidungsversuches Urinauffangschürzen tragen müssen, was

aber im Vorfeld des Versuchsvorhabens aufgrund der Paddock- und Laufstallhaltung und

eventueller Verletzungsgefahr der Pferde als praktisch nicht durchführbar abgelehnt wurde.

Mittels kumulativen Darstellung (Abb.18) der mit dem Urin ausgeschiedenen 4-MAA-

Menge, kann die Auswirkung der Harnproduktion auf die Menge der ausgeschiedenen

102 Diskussion

Substanz unter Berücksichtigung der verabreichten Dosis für jedes Pferd errechnet werden. In

der Literatur wird die vom Pferd produzierte Urinmenge hypothetisch mit 1-2 ml/kg KGW/h

angegeben (SCHÄFER 1999). Zur Ermittlung der Daten der Abbildung 18 wurde für jedes

Pferd eine Harnproduktion von 1 ml/kg KGW/h angenommen und mit zu entsprechenden

Entnahmezeitpunkten gemessenen 4-MAA-Urinkonzentrationen rechnerisch verknüpft. Ein

Pferd hat demnach bis zum Erreichen der Quantifizierungsgrenze im Zeitraum von 10 bis 24

Stunden nach der Metamizolapplikation (20520 mg Metamizol intravenös) 8378 mg 4-MAA

ausgeschieden. Dieses entspricht 40,83% der absolut verabreichten Metamizol-Menge.

Nimmt man eine produzierte Urinmenge von 2 ml/kg KGW/h an, so hat dieses Pferd in der

gleichen Zeit 16756 mg 4-MAA (81,66% der absolut verabreichten Dosis) mit dem Urin

ausgeschieden. In Anbetracht dieses Beispieles erscheinen derartige Berechnungen unter

Einbeziehung der auf eine Hypothese basierenden produzierten Urinmenge nicht sinnvoll.

Zudem ist zu berücksichtigen, dass selbst wenn der gesamte Urin gesammelt worden wäre,

die Rückberechnung der ausgeschiedenen Substanzmenge nicht absolut exakt sein kann, da

weitere rechnerisch schwer erfassbare physiologische Faktoren die Ausscheidung eines

Pharmakons mit dem Urin beeinflussen. Hierzu zählen beispielsweise die Metabolisierung

einer Substanz in verschiedenen Organen und eine Anreicherung der Substanz aufgrund ihrer

biochemischen Eigenschaften in bestimmten Geweben für längere Zeit als die der

Ausscheidungsversuch andauert. 4-MAA wird zudem zu weiteren Metaboliten

verstoffwechselt, die ebenfalls mit dem Urin ausgeschieden werden, aber in dieser Studie

nicht mitbestimmt wurden. Das Ausmaß der tubulären Rückresorption wird maßgeblich vom

pH des Urins bestimmt, da nur der unionisiert Anteil des Arzneistoffes rückresorbiert werden

kann (LÖSCHER und KROKER 1997). Änderungen des Harn-pH-Wertes können nach

TOBIN et al. (1989) entscheidenden Einfluss auf die Ausscheidung einer Substanz mit dem

Urin haben. Bei Rennpferden stellte er in Abhängigkeit von extremer körperlicher

Beanspruchung Schwankungen des Urin-pH-Wertes im Bereich von 9,0 bis 4,5 fest. Die

Urin–pH-Werte lagen bei den Pferden dieser Studie im Bereich zwischen 7,5 und 9,5, wobei

jedes einzelne Pferd einen relativ konstanten Urin-pH zeigte (siehe Anhang). GERKEN et al.

(1991) stellten über einen Zeitraum von 1 - 1,5 nach kurzem intensiven Training ein

markantes Absinken des Urin-pH-Wertes um ein bis drei Einheiten fest. Bei Substanzen wie

beispielsweise dem Metamizol chemisch ähnlichen Phenylbutazon führte dieses zu einer 20-

bis 50fachen Abnahme der ausgeschieden Menge und zur Verlängerung der

Ausscheidungszeit. Auch UNGEMACH (1988) berücksichtigt, dass besonders bei

Substanzen, die pH-abhängig mit dem Urin ausgeschieden werden, die Urinkonzentrationen

103 Diskussion

und Ausscheidungszeiten dieser Substanzen bei Harn-pH-Änderungen erheblichen

Schwankungen unterliegen können. Nach TOBIN et al. (1989) können demzufolge die

Urinkonzentrationen um das 200-fache variieren, woraufhin er festhält, dass es nahezu

unmöglich ist, von einer im Urin gemessenen Konzentration einer Substanz auf den Zeitpunkt

der Applikation zu schließen. Die bei den Pferden dieser Studie ermittelten Urin-pH-Werte

sind im Anhang aufgeführt. Nach theoretischen Betrachtungen von TOBIN und WOODS

(1989) benötigt das Pferd 70 HWZ bis zur völligen Clearance. Übertragen auf diese Studie,

wäre 4-MAA bei den Pferden des Ausscheidungsversuches frühestens nach 42 Stunden und

längstens nach 203 Stunden ausgeschieden. Entsprechend ist die HWZ separat wenig

aussagekräftig. Bei konstanter Clearance unterliegt sie dem Einfluss der Verteilung.

Beispielsweise verlängert sich die HWZ bei steigendem Verteilungsvolumen.

5.4. Berechnungen zur effektiven und irrelevanten Plasmakonzentration

und zur irrelevanten Urinkonzentration nach TOUTAIN und

LASSOURD (2002); Berechnungen zur Ermittlung der

Ausscheidungszeit

Einbringen pharmakokinetischer Daten (Cmax, Geschwindigkeitskonstante der Elimination �,

Clearance) von 4-MAA in das pharmakokinetische/pharmakodynamische Modell von

TOUTAIN und LASSOURD (2002) (siehe 4.4), sollten letztlich zur Ermittlung von 4-MAA-

Konzentrationen im Plasma und Urin führen, bei denen dieser Wirkstoff (bzw. Metamizol)

keine relevante pharmakologische Wirksamkeit mehr besitzt.

Grundlage für die Entwicklung des PK/PD-Modells stellten für TOUTAIN und LASSOURD

(2002) aktuelle Doping-Reglementierungen dar, nach denen jeglicher Nachweis eines

Wirkstoffes bzw. bei wenigen Substanzen, für die ein Grenzwert festgelegt wurde, dessen

Überschreitung als doping-positiv gilt. Dabei wird nicht berücksichtigt, ob von der

festgestellten Konzentration einer Substanz noch eine pharmakologische Wirksamkeit ausgeht

oder nicht. TOBIN (1981) berücksichtigt, dass die Methoden der Dopinganalytik immer

sensibler und entsprechend die Nachweisgrenzen dopingrelevanter Substanzen immer weiter

gesenkt werden. Demzufolge versucht er mit experimenteller Festlegung einer sogenannten

Highest Non Effect Dosis (HNED) einen sinnvollen Zusammenhang zwischen Konzentration

und Wirksamkeit herzustellen. Grenzen dieser Methode bestehen durch Veränderung der

Applikationsweise und der Dosierung, als auch bei wiederholter Verabreichung in der

104 Diskussion

Änderung des Dosierungsintervalls, im Erhalt veränderter pharmakologischer Daten (TOBIN

et al. 1999). Das Modell von TOUTAIN und LASSOURD (2002) basiert auf

Literaturauswertung klinischer und pharmakokinetischer Studien. Es ist nur für systemisch

wirksame Substanzen anwendbar, die zu Therapiezwecken eingesetzt werden. Im Gegensatz

zur allgemeinen Dopinganalytik, in der Urin als Untersuchungs-Matrix der Wahl gilt,

basieren Berechnungen von TOUTAIN und LASSOURD (2002) auf im Plasma und Urin

gemessenen Wirkstoffkonzentrationen. Um irrelevante Plasmakonzentrationen festzulegen

wird in diesem Modell ein Sicherheitsfaktor (SF) integriert, dem ein Zahlenwert von 500

zugeordnet ist.

Die für 4-MAA berechneten pharmakokinetischen Parameter wurden in das Modell von

TOUTAIN und LASSOURD (2002) eingebracht und die EPC, IPC und IUC von 4-MAA bei

den Pferden dieser Aussscheidungsstudie ermittelt. Zur Berechnung der effektiven

Plasmakonzentration (EPC) wird ein Dosierungsintervall von 8 Stunden (EBERT et al. 2002)

angenommen. Somit beträgt die für 4-MAA berechnete EPC im Mittel 59 ± 21 µg/ml, wobei

der höchste Wert mit 86 und der niedrigste Wert mit 28 µg/ml errechnet wurde. Die EPC liegt

bei allen Pferden (siehe Tabelle 17) deutlich oberhalb der Quantifizierungsgrenze. In der

vorliegenden Studie wird bei Betrachtung der gemessenen Plasmakonzentrationen (Übersicht

im Anhang dieser Arbeit) die EPC bei allen Pferden durchschnittlich bereits 10 bis 15

Minuten p.a. unterschritten. Die Zeit bis zum Erreichen der EPC wäre der Wirkungsdauer

gleichzusetzen.

TOUTAIN und LASSOURD (2002) verwenden die EPC zur Berechnung der irrelevanten

Plasmakonzentration (IPC). Sie dividieren die EPC durch einen Sicherheitsfaktor. Diesem

wird ein Zahlenwert von 500 zugeordnet, der sich aus den Faktoren 10 (Berücksichtigung

interindividueller Schwankungen) und 50 (Gewährleistung der Validität der Daten) ergibt.

Entsprechend dieses Modells ergab sich in dieser Studie für 4-MAA eine durchschnittliche

IPC von 0,12 ± 0,04 µg/ml (siehe Tabelle 17). Die errechnete IPC schwankte bei den Pferden

zwischen 0,17 und 0,06 µg/ml. Alle für die IPC ermittelten Zahlenwerte liegen unterhalb der

4-MAA-Nachweisgrenze von 0,25 µg/ml Plasma.

Zur Berechnung der irrelevanten Urinkonzentration (IUC) nach TOUTAIN und LASSOURD

(2002) mussten zunächst die durchschnittliche Plasma- und die durchschnittliche

Urinkonzentration für die Pferde dieser Studie im Dosierungsintervall von 8 Stunden

errechnet werden. Pferde, bei denen eine Urinprobe nicht gewonnen wurde, wurden hier nicht

berücksichtigt. Die IPC wurde anschließend mit dem Urin-/Plasma-Konzentrationsverhältnis

im Steady-State (Rss) multipliziert, wonach sich eine durchschnittliche IUC von 2,2 ± 1,4

105 Diskussion

µg/ml ergibt. Die Werte für die IUC (siehe Tabelle 17) lagen bei allen Pferden deutlich

unterhalb der Quantifizierungsgrenze von 10 µg/ml, jedoch oberhalb der Nachweisgrenze des

4-MAA im Urin (0,5 µg/ml). Aufgrund dessen, dass die IUC-Werte unterhalb der

Quantifizierungsgrenze liegen, ist eine Bewertung vorsichtig vorzunehmen. Zudem muss

berücksichtigt werden, dass der Rss –Wert erheblichen Schwankungen unterlegen sein kann.

Der Rss –Wert errechnet sich unter Berücksichtigung der Konzentration der Substanz im Urin.

Beispielsweise können ein veränderter Urin-pH-Wert als auch Veränderungen der Diurese

(durch wechselhafte Durchblutung der Nieren-Blutdruckschwankungen, Medikamente)

diesen erheblich beeinflussen (TOUTAIN und LASSOURD, 2002). Unter Annahme einer

gesteigerten Diurese könnte die Wirkstoffkonzentration im Urin um den Faktor 10 ansteigen,

so dass die IUC-Werte anstatt im Bereich der Nachweisgrenze dann im Bereich der

Quantifizierungsgrenze lägen. Dieses Phänomen liefert die Begründung für TOUTAIN und

LASSOURD (2002), dass Urin zur Bestimmung irrelevanter Wirkstoffkonzentrationen im

Vergleich zum Plasma die weniger geeignete Matrix darstellt.

Ausscheidungszeiten für 4-MAA bis zum Erreichen der IPC (ta(IPC)), der

Quantifizierungsgrenze (ta(LOQ)) und der Nachweisgrenze (ta(LOD)) im Plasma wurden wie in

Kapitel 4 4.5 beschrieben berechnet (siehe Tabelle 18). Bei den Pferden des

Ausscheidungsversuches vergingen bis zum Erreichen der IPC im Mittel 18,9 ± 8,8 Stunden.

Die Zeiten schwankten im Bereich zwischen 6,5 und 33,7 Stunden. Bei Berücksichtigung der

IPC-Werte, die bei allen Pferden unterhalb der Nachweisgrenze liegen, und der

interindividuellen Schwankungen von über 27 Stunden, ist bezüglich der ta(IPC) das Treffen

einer allgemeingültigen Aussage nicht zulässig. Die Zeit bis zum Erreichen der

Quantifizierungsgrenze von 1 µg/ml Plasma beträgt durchschnittlich 13,6 ± 6,5 Stunden.

Auch hier sind starke interindividuelle Schwankungen zwischen 24,9 und 4,33 Stunden

auffällig. Betrachtet man die Konzentrations-Zeit-Kurve von 4-MAA im Plasma (siehe

Abbildung 14), so ist bei allen Pferden die Quantifizierungsgrenze 24 Stunden nach der

Metamizolapplikation unterschritten. 12 Stunden p.a. liegen die 4-MAA-

Plasmakonzentrationen nur knapp oberhalb der Quantifizierungsgrenze. Bei neun Pferden ist

die Nachweisgrenze ebenfalls nach 24 Stunden unterschritten Im Mittel beträgt die Zeit bis

zum Erreichen der Nachweisgrenze 15,2 ± 7,3 Stunden, wobei Schwankungen von über 23

Stunden zwischen Pferd B (27,93 Stunden) und Pferd H (4,79 Stunden) errechnet wurden. Die

errechneten Zeiten bis zum Erreichen der Quantifizierungs- und der Nachweisgrenze decken

sich mit den aus der 4-MAA-Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve (Abbildung 14) ersichtlichen

106 Diskussion

Werten. Allerdings sind die errechneten Schwankungen der Abbildung 14 nicht zu

entnehmen.

5.5. Bewertung der Ergebnisse

Ein Ziel dieser Arbeit, eine geeignete HPLC/MS/MS-Methode zum Nachweis von 4-MAA,

dem Hauptmetaboliten von Metamizol, im Plasma und Urin von Pferden zu entwickeln und

zu validieren, wurde erreicht. Bei Betrachtung der Quantifizierungs- und Nachweisgrenzen

der entwickelten Analysenmethode konnte vergleichend zu Studien, die auf anderen

Nachweisverfahren beruhen (beispielsweise DAMM, 1989: HPLC/UV-Methode;

SCHLINGLOFF, 1997: GC/MS-Methode; POPOT, 2000: GC/MS-Methode) die dort jeweils

angegebene Empfindlichkeit nicht erreicht werden. Gleiches gilt für die Wiederfindungsraten

von 4-MAA in den untersuchten Matrices. Unter dem Aspekt einer möglichen Etablierung

dieser Methode in die Routinediagnostik bleibt jedoch zu berücksichtigen, dass die hier

entwickelte Methode den 4-MAA-Nachweis in einem sehr großen Konzentrationsbereich (bis

8000 µg/ml Urin) abdeckt. Die Validierung der Methode belegt zudem die Eignung zum

Nachweis von 4-MAA aus Pferdeplasma und –urin. Der Einsatz der Methode zur

Routinediagnostik könnte als Lösungsansatz zur Einführung eines einheitlichten

Nachweisverfahrens verschiedener Laboratorien dienen.

Aufgrund der dem Metamizol zugesprochenen zentralanalgetischen, spasmolytischen,

antipyretischen, antirheumatischen und/oder antiphlogistischen Wirkung wird es

pharmakologisch den NSAID oder den schwachen Analgetika zugeordnet. Entsprechend sind

die Anwendungsgebiete von Metamizol beim Pferd die Schmerzbehandlung bei Kolikformen

unterschiedlicher Genese oder sonstige krampfartige Zuständen der Bauchhöhlenorgane,

Lumbago, akute und chronischen Arthritiden, rheumatische Zuständen der Muskulatur und

Gelenke, Neuritiden, Neuralgien und Tendovaginitiden. Zur Behandlung eben genannter

Krankheitszustände ist mittlerweile eine Reihe von Wirkstoffen im Handel, deren

Wirkungspotenz die des Metamizols um ein Vielfaches übertrifft. Dennoch wird Metamizol

nach wie vor in der Pferdepraxis eingesetzt und könnte sowohl als Ursache unbeabsichtigten

Dopings als auch absichtlichen Dopings zum Zwecke der Wiederherstellung der natürlichen

Leistungsfähigkeit fungieren. Letztgenanntes könnte zur Maskierung von Koliksymptomen,

die kurz vor einem sportlichen Einsatz auftreten als auch von klinisch sich geringgradig

darstellenden orthopädischen Krankheitzuständen dienen.

107 Diskussion

Für den Dopingnachweis pharmakologisch wirksame Substanzen gilt bis auf wenige

Ausnahmen, für die Grenzwerte festgelegt wurden, aufgrund national anwendbarer

Dopingbestimmungen, die sogenannte „ Null-Lösung“ . Folglich wird jeglicher Nachweis einer

verbotenen Substanz als dopingpositiv bewertet. Ein Beweggrund, die Null-Lösung nicht

dauerhaft gelten zu lassen, ist, dass „ Null“ durch die ständig in der Entwicklung

fortschreitende Analytik und damit einhergehender Senkung von Nachweisgrenzen bestimmt

wird. Ein weiterer Grund für die Abschaffung der in kontroverse Diskussionen geratenen

Null-Lösung ist, dass hierbei die eventuell nicht mehr vorhandene Wirksamkeit einer

geringen nachgewiesenen Substanzmenge unberücksichtigt bleibt. TOUTAIN und

LASSOURD (2002) verfolgen einen Lösungsansatz mit der Berechnung von irrelevanten

Plasma- und Urinkonzentrationen zwecks Ermittlung von Grenzwerten, die in Dopinglisten

der Pferdesportverbände aufgenommen werden könnten. Das damit von ihnen verfolgte Ziel

ist die notwendige Behandlung erkrankter Sportpferde zu sichern und einer Verschärfung der

Bewertung von Dopingproben aufgrund laufend empfindlicher werdender Nachweismethoden

entgegenzuwirken.

Die in der vorliegenden Studie nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) berechnete EPC von

4-MAA liegt bei allen Pferden deutlich oberhalb der Quantifizierungsgrenze; die EPC wird

jedoch im Mittel 10 bis 15 Minuten nach der intravenösen Applikation von Metamizol

unterschritten. Entsprechend dieser Berechnungen wäre die generelle Wirksamkeit dieser

Substanz in Frage zu stellen. Da bei dieser Studie keine Berücksichtigung

pharmakodynamischer Parameter erfolgte, kann kein praktischer Bezug zu den theoretisch

ermittelten EPC-Werten hergestellt werden. Die Werte der errechneten IPC befinden sich bei

allen Pferden dieser Studie unterhalb der Nachweisgrenze. Dieses bedeutet, dass alle bei einer

Dopingkontrolle gemessenen Werte unterhalb der Nachweisgrenze (0,25 µg/ml Plasma) als

dopingnegativ gelten würden. Anders ist es bei der Bewertung der Werte der IUC, die bei

allen Pferden zwar unterhalb der Quantifizierungsgrenze (10 µg/ml Urin), jedoch oberhalb der

Nachweisgrenze (0,5 µg/ml) liegen. Hier könnten die bei einer Dopingkontrolle gemessenen

Werte als dopingpositiv bewertet werden, solange die Substanz eindeutig identifizierbar ist

(oberhalb der Nachweisgrenze). Die Ermittlung von Grenzwerten nach Berechnung der IPC

und IUC von 4-MAA im Plasma und Urin ist aufgrund unterhalb der Quantifizierungsgrenzen

liegender Werte nicht empfehlenswert.

Die Berechnungen der Ausscheidungszeit nach KIETZMANN (1983) bis zum Erreichen der

IPC als auch der Quantifizierungs- und Nachweisgrenze im Plasma sind nahezu

deckungsgleich mit den Ergebnissen des Ausscheidungsversuches (siehe Tabelle 18 und

108 Diskussion

Anhang) vergleichend. Somit stellen diese Berechnungen ein in der Praxis geeignetes

Verfahren zur Ermittlung von Ausscheidungszeiten dar.

Interindividuelle Schwankungen pharmakokinetischer Daten bei den Pferden dieser Studie,

verdeutlichen, dass aufgrund der vorliegenden Ergebnisse und der geringen Probandenzahl

keine auf die Gesamtpopulation übertragbare allgemeingültige Aussage bezüglich der

Ausscheidungszeit und Festlegung einer Karenzzeit getroffen werden kann. Ebenso wenig

sinnvoll erscheint die Festsetzung von Grenzwerten für 4-MAA im Plasma und Urin von

Pferden aufgrund der in der eigenen Studie gefundenen Streuung der Ergebnisse.

Abschließend ist zu bemerken, dass die Schwierigkeit, die mit dem Nachweis

dopingrelevanter Substanzen verknüpft ist und die Festlegung daraus für den Pferdesport

resultierender Grundsätze, durch die Ergebnisse dieser Studie einmal mehr belegt ist.

109 Zusammenfassung

6. Zusammenfassung

Helga Levens (2005):

Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes Metamizol hinsichtlich der

Dopingrelevanz beim Pferd

Das Ziel dieser Arbeit bestand einerseits darin eine geeignete Analysenmethode zum

Nachweis von 4-MAA, dem Hauptmetaboliten des Metamizol, im Pferdeplasma und -urin

mittels HPLC/MS/MS-Verfahren zu erarbeiten und zu validieren. Grundlage für die

Entwicklung einer praktikablen Analysenmethode war ein im Institut für Biochemie der

Deutschen Sporthochschule Köln bestehendes GC/MS-Verfahren. Mit der Erarbeitung der

Messmethode ging die Entwicklung eines basischen Flüssig-Flüssig Extraktionsverfahrens

von 4-MAA aus Plasma und Urin von Pferden einher. Als Extraktionsmittel wurde tertiär-

Butylmethylether (TBME) genutzt. Nach Einengung der Etherphase wurden die Proben in

Ammoniumacetat-Puffer, dem anfänglichen HPLC-Fließmittel, wieder angelöst und der

Messung zugeführt. Als interner Standard wurde Dihydrodimethyl-

dimethylaminophenylpyrazolon (DMAP) verwendet. Nach vergleichender Aufarbeitung von

Urinproben mit und ohne Hydrolyseschritt konnte gezeigt werden, dass 4-MAA im Urin von

Pferden in freier Form ausgeschieden wird. Die Quantifizierungsgrenze für 4-MAA beträgt

bei der entwickelten Methode 1 µg/ml Plasma und 10 µg/ml Urin. Die Nachweisgrenze ist im

Plasma mit 0,25 µg/ml und im Urin mit 0,5 µg/ml ermittelt.

Ein weiteres Ziel dieser Studie bestand darin, Ausscheidungszeiten und die

Eliminationskinetik für das häufig bei Pferden eingesetzte nichtsteroidale Antiphlogistikum

Metamizol, bzw. dessen Hauptmetaboliten 4-MAA aus Plasma und Urin zu bestimmen. Einer

Gruppe von 10 Pferden wurde Metamizol in einer Dosierung von 30 mg/kg KGW intravenös

verabreicht. Die 4-MAA-Konzentrationen der zu bestimmten Zeiten p.a. gewonnenen Plasma-

und Urinproben wurden mittels HPLC/MS/MS ermittelt und anschließend

pharmakokinetischen Berechnungen unterzogen. Die mittlere Clearance beträgt im Plasma

338 ± 91 ml/min. Die HWZ der Eliminationsphase beträgt durchschnittlich 1,7 ± 0,8 Stunden.

Das Verteilungsvolumen unter Steady-State Bedingungen ist durchschnittlich mit 632 ± 210

ml/kg KGW angegeben. Mit Hilfe des multifaktoriellen Einflüssen unterlegenen und damit

nicht unumstrittenen pharmakokinetischen/pharmakodynamischen Modells von TOUTAIN

und LASSOURD (2002) wurden sogenannte irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen

110 Zusammenfassung

(IPC und IUC) ermittelt, bei denen eine Wirkung von 4-MAA auf den Organismus

ausgeschlossen sein soll. Zudem wurde eine sogenannte effektive Plasmakonzentration (EPC)

ermittelt, die bei den Pferden dieser Ausscheidungsstudie bereits 10 bis 15 Minuten p.a.

unterschritten wurde. Die IPC und IUC lagen unter Annahme eines Dosierungsintervalls von

8 Stunden im Durchschnitt jeweils unterhalb der Quantifizierungsgrenze dieser Methode, so

dass anhand der vorliegenden Ergebnisse die Festlegung eines Grenzwertes nicht sinnvoll

erscheint. Somit ist derzeit jeglicher Nachweis von 4-MAA im Plasma und Urin von Pferden

dopingrelevant.

Die Ausscheidungszeit wurde bis zum Erreichen der IPC als auch bis zum Erreichen der

Quantifizierungs- und Nachweisgrenze im Plasma berechnet. Die ermittelten

Ausscheidungszeiten sind mit den Ausscheidungszeiten, die bei Betrachtung der

Konzentrations-Zeit-Kurve erhoben werden können vergleichbar. Die Quantifizierungsgrenze

wurde im Plasma bei allen Pferden 12 Stunden p.a. unterschritten. Die Nachweisgrenze wurde

von neun Pferden ebenfalls 12 Stunden p.a. erreicht; bei einem Pferd wurde sich jedoch erst

nach 36 Stunden unterschritten. Im Urin wurde die Quantifizierungsgrenze frühestens

zwischen der 10. und 24. Stunde und spätestens zwischen der 36. und 48. Stunde p.a.

unterschritten. Das Unterschreiten der Nachweisgrenze erfolgte frühestens 33,3 Stunden p.a.

und spätestens im Zeitraum zwischen der 69. und 94. Stunde. Aufgrund der geringen Anzahl

an Probanden und der beachtenswerten Streuung der Ergebnisse sollte keine auf die

Gesamtpopulation übertragbare Aussage bezüglich der Ausscheidungszeit getroffen werden.

111 Summary

7. Summary

Helga Levens (2005):

Pharmakokinetic study of the drug dipyrone concerning its relevance of doping in

horses

The aim of the present study was to develop and validate the proof of a suitable analytical

method of 4-MAA, the main metabolite of dipyrone, in plasma- and urine samples from

horses by HPLC/S/MS-method. The basics for the development of a new practical analytical

method was an established GC/MS-routine-procedure at the Institute of Biochemistry at the

Deutsche Sporthochschule Köln. The establishment of the new analytical method by

HPLC/MS/MS went along with the development of an alcaline liquid-liquid-extraction for 4-

MAA from plasma- and urine samples of horses. Tertiär-Butylmethylether (TBME) was used

as extract solvent. After evaporation of the etherphase the residues were dissolved again in an

ammoniumacetat-buffer before they were injected to the HPLC system. The mobile phase

consists of Ammoniumacetate that is conform with the initial phase in this method.

Dihydrodimethyl-dimethylaminophenylpyrazolone (DMAP) was chosen as internal standard.

When the urine samples were analysed with or without hydrolysis it could be observed that 4-

MAA in urine of horses is excreted unbound. The limit of quantification for 4-MAA is 1

µg/ml in plasma and 10 µg/ml in urine. The limit of detection is fixed at 0,25 µg/ml in plasma

and 0,5 µg/ml in urine.

Further we investigated the kinetic of the elimination rate of dipyrone by using its main

metabolite 4-MAA in plasma and serum samples. Dipyrone is a nonsteroidal

antiinflammatory drug used as therapeutic agent in horses. This study contained a sample size

of 10 horses and dipyrone was administrated intravenously in a dose of 30 mg/ kg. Before

phamakokinetically investigated, the concentration of 4-MAA were determined via

HPLC/MS/MS and fractioned in certain time intervals. The clearance of 4-MAA from the

plasma is 338 ± 91 ml/min. The half-life of elimination is 1,7 ± 0,8 hours. During steady-state

the volume of distribution is 632 ± 210 ml/kg bodyweight. Non relevant plasma- and urine

samples (IPC and IUC) were defined by using the phamakokinetic/ phamakodynamic model

of TOUTAIN and LASSOURD (2002). Latter model is used in research to exclude 4-MAA in

organism.

112 Summary

Furthermore we analysed the EPC (effective plasmaconcentration). In this present study the

EPC is below the value earlier than 10-15 minutes p.a.

During a dosage interval of 8 hours IPC and IUC were below the quantification limit in this

used model. As a consequence of latter results it isn t̀ possible to determinate a marginal limit

for IPC and IUC and deductive any positive findings of 4-MAA in urine or plasma samples

are definitely doping relevant.

KEITZMANN (1983) calculated the elimination rate in plasma focussing the limits of IPC,

quantification and detection. In the present study it could be observed that the detected

excretion times are similar with those that are in relation to the concentration-time-curve. 12

hours after administration all detected values of all horses were under the limit of

quantification. The values of 9 horses reached the limit of detection after 12 hours. The value

of one horse was at the limit of detection after 36 hours. In urine the limit of quantification

was reached earliest 10-24 and latest 36-48 hours after administration. The limitof detection

was reached earliest 33,3 and latest 69-94 hours after administration. Because of the limited

number of hourse and wide standard deviation no conclusions can be drawn for the overall

clearance-time of 4-MAA.

113 Literaturverzeichnis

8. Literaturverzeichnis

AGÚNDEZ, J. A.G. u. J. BENÍTEZ (1996):

Determination of aminopyrine and dipyrone metabolites in urine.

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liquid chromatography.

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High-performance liquid chromatography of dipyrone and its active metabolites in biological

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125 Anhang

9. Anhang

Im Anhang sind folgende Tabellen aufgeführt:

Tabelle 19 - Teil 1 und 2: 4-MAA-Plasmakonzentrationen von 10 Pferden nach

Applikation (i.v.) von 30

mg/kg KGW Metamizol einschließlich der

Probenentnahmezeitpunkte Tabelle 20 - Teil 1 und 2: 4-MAA-Urinkonzentrationen von 10 Pferden nach Applikation

(i.v.) von 30

mg/kg KGW Metamizol einschließlich der

Probengewinnungszeitpunkte

Tabelle 21: pH-Werte der gewonnenen Urinproben

126 Anhang

Tab. 19 – Teil 1: gemessene 4-MAA-Konzentrationen im Plasma [µg/ml] nach

intravenöser Applikation von 30 mg/kg KGW Metamizol (Pferd A-E) einschließlich

der Probenentnahmezeitpunkte

Probe Zeit p.a. [h] Pferd A Pferd B Pferd C Pferd D Pferd E

p00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

p 01 0,03 134,42 128,79 169,09 208,81 138,27

p02 0,08 82,87 100,76 114,14 110,45 72,50

p03 0,16 57,38 74,41 73,25 77,32 59,40

p04 0,25 39,98 54,79 56,83 52,84 44,64

p05 0,50 21,30 32,82 30,96 30,81 24,52

p06 1,00 13,68 20,60 23,12 22,62 19,42

p07 2,00 8,30 13,94 16,02 16,40 14,59

p08 4,00 8,08 9,88 7,23 9,15 8,95

p09 6,00 5,78 6,88 5,69 6,94 5,02

p10 8,00 3,81 4,29 3,24 4,79 4,25

p11 12,00 1,96 1,92 2,25 1,73 1,81

p12 24,00 0,18 0,16 0,16 0,00 0,00

p13 36,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

p14 48,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

p15 72,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

p16 96,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

127 Anhang

Tab. 19 – Teil 2: gemessene 4-MAA-Konzentrationen im Plasma [µg/ml] nach intravenöser

Applikation von 30 mg/kg KGW Metamizol (Pferd A-E) einschließlich der

Probenentnahmezeitpunkte

Probe Zeit p.a. [h] Pferd F Pferd G Pferd H Pferd I

p00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

p 01 0,03 165,72 168,01 170,73 156,30

p02 0,08 103,04 89,26 91,47 100,49

p03 0,16 66,79 52,13 61,73 68,48

p04 0,25 46,05 40,17 49,75 46,25

p05 0,50 28,76 24,57 28,13 24,06

p06 1,00 19,71 14,53 16,83 16,03

p07 2,00 13,25 10,71 11,87 10,52

p08 4,00 8,88 7,25 7,50 7,58

p09 6,00 6,65 4,09 4,96 4,35

p10 8,00 4,50 3,00 3,41 3,52

p11 12,00 2,42 1,39 1,62 1,39

p12 24,00 0,66 0,09 0,14 0,00

p13 36,00 0,00 0,00 0,00 0,00

p14 48,00 0,00 0,00 0,00 0,00

p15 72,00 0,00 0,00 0,00 0,00

p16 96,00 0,00 0,00 0,00 0,00

128 Anhang

Tab. 20 – Teil 1: gemessene 4-MAA-Konzentrationen im Urin [µg/ml] nach intravenöser

Applikation von 30 mg/kg KGW Metamizol (Pferd A-D) einschließlich der


n.n. = nicht nachgewiesen

Probe Zeit p.a. [h] Pferd A Probe Zeit p.a. [h] Pferd B

u 00 0,00 0,00 u 00 0,00 0,00

u 01 0,00 n.n u 01 2,00 3029,48

u 02 5,33 657,29 u 02 5,58 485,71

u 03 9,50 189,89 u 03 14,00 244,74

u 04 25,00 1,79 u 04 24,00 15,63

u 05 36,00 0,00 u 05 36,00 1,41

u 06 48,00 0,00 u 06 48,00 0,00

u 07 72,00 0,00 u 07 72,00 0,00

u 08 96,00 0,00 u 08 97,05 0,00

u 09 120,00 0,00 u 09 121,25 0,31

u 10 141,42 0,54 u 10 144,00 0,00

u 11 163,66 0,49 u 11 169,08 0,00

Probe Zeit p.a. [h] Pferd C Probe Zeit p.a. [h] Pferd D

u 00 0,00 0,00 u 00 0,00 0,00

u 01 2,00 3346,93 u 01 0,00 n.n.

u 02 5,33 290,15 u 02 6,00 4620,13

u 03 10,00 236,51 u 03 10,00 191,50

u 04 24,00 19,78 u 04 24,00 13,42

u 05 36,00 1,20 u 05 36,00 n.n.

u 06 48,00 0,00 u 06 49,08 0,00

u 07 72,00 0,00 u 07 72,00 0,00

u 08 96,00 0,00 u 08 96,00 0,00

u 09 120,00 1,49 u 09 118,92 0,55

u 10 142,04 0,88 u 10 144,00 0,24

u 11 168,00 0,05 u 11 168,00 0,00

129 Anhang

Tab. 20 – Teil 2 : gemessene 4-MAA-Konzentrationen im Urin [µg/ml] nach intravenöser

Applikation von 30 mg/kg KGW Metamizol (Pferd E-J) einschließlich der


n.n.= nicht nachgewiesen

Probe Zeit p.a. [h] Pferd E Probe Zeit p.a. [h] Pferd F

u 00 0,00 0,00 u 00 0,00 0,00

u 01 2,00 5021,71 u 01 2,00 2299,81

u 02 6,00 297,39 u 02 6,00 441,25

u 03 10,00 253,89 u 03 10,00 374,68

u 04 24,00 2,30 u 04 24,00 18,74

u 05 36,00 0,00 u 05 36,00 0,00

u 06 49,05 0,00 u 06 49,03 0,00

u 07 73,01 0,40 u 07 72,00 0,44

u 08 96,00 0,01 u 08 94,38 0,16

u 09 120,93 0,00 u 09 119,53 0,00

u 10 152,36 0,00 u 10 142,07 0,00

u 11 174,36 0,28 u 11 174,95 0,20

Probe Zeit p.a. [h] Pferd G Probe Zeit p.a. [h] Pferd H

u 00 0,00 0,00 u 00 0,00 0,00

u 01 2,00 2957,97 u 01 2,00 1209,65

u 02 7,50 202,37 u 02 7,00 434,13

u 03 10,00 111,39 u 03 12,07 157,41

u 04 24,00 2,03 u 04 30,33 0,00

u 05 36,00 0,00 u 05 36,00 0,00

u 06 48,00 0,00 u 06 49,00 0,00

u 07 70,75 0,00 u 07 72,00 0,00

u 08 93,25 0,00 u 08 97,00 0,00

u 09 118,12 0,00 u 09 120,00 0,28

u 10 141,33 0,05 u 10 152,28 0,06

u 11 173,25 0,20 u 11 170,02 0,00

130 Anhang

Probe Zeit p.a. [h] Pferd I Probe Zeit p.a. [h] Pferd J

u 00 0,00 0,00 u 00 0,00 0,00

u 01 0,00 n.n. u 01 2,00 1317,34

u 02 6,00 1031,51 u 02 6,00 583,53

u 03 10,00 301,02 u 03 10,00 190,63

u 04 24,00 44,53 u 04 24,00 57,30

u 05 35,00 13,63 u 05 36,00 17,67

u 06 50,05 0,14 u 06 47,08 2,49

u 07 70,83 0,00 u 07 69,42 2,27

u 08 95,55 0,00 u 08 94,18 0,00

u 09 118,92 0,00 u 09 117,50 0,00

u 10 151,12 0,11 u 10 149,73 0,00

u 11 170,92 0,00 u 11 169,72 0,00

Tab. 21 : pH-Werte der gewonnenen Urinproben

Urin-

Probe

Pferd

A

Pferd

B

Pferd

C

Pferd

D

Pferd

E

Pferd

F

Pferd

G

Pferd

H

Pferd

I

Pferd

J

u01 9 8,75 9 9 9 8,5 8,5 9 8,75 9

u02 8,5 8,75 9 9 9 9 8,75 9 8,75 9

u03 8,5 8,75 9 9 9 9 8,75 9 9 8,5

u04 9 8,25 9 9 9 9 8,75 9 8,5 8,5

u05 8,75 8,5 9 9 8,5 9 8,75 9 8,5 9

u06 8,75 8,75 8,5 9 9 9 8,75 9 8,75 8,75

u07 9 8,75 8,5 9 8,5 9 9 9 8,5 8

u08 9 9 8,75 9 8,5 9 9 9 8,75 7,5

u09 9,25 8,5 8,5 8,75 8,5 9 8,75 8,25 9 7,5

U10 8,25 8,25 8,5 8,75 8,5 8,5 8,75 8,25 9 7,5

U11 8,25 8,25 8,5 8 9 9 8,5 8,25 8,75 8,5

u00 9 9 8 9,25 9 9 8,5 9 8,5 8,75

131 Danksagung

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Manfred Kietzmann für das Überlassen des

Themas und die außerordentlich gute Betreuung. Seine stete Unterstützung war allzeit

motivationsfördernd.

Mein Dank gilt weiterhin der Deutschen Reiterlichen Vereinigung e.V. in Warendorf, im

Besonderen Herrn Dr. Michael Düe für die Organisation der Versuchspferde und die

Übernahme der finanziellen Kosten, die die Durchführung dieser Arbeit ermöglichten.

Mein besonderer Dank gilt allen Mitarbeitern des Institutes für Biochemie der Deutschen

Sporthochschule Köln für die freundliche Aufnahme und ausdauernde Unterstützung im

Labor. Herrn Prof. Dr. W. Schänzer und Herrn Dr. Marc Machnik danke ich für den

fachlichen Beistand bei der Entwicklung der Analysenmethode und für die hervorragende

Betreuung während des gesamten Laboraufenthaltes. Herrn Opfermann, Dr. Mario Thevis

und Sven Guddert gilt mein besonderer Dank für die geduldige rund-um-die-Uhr-Betreuung

hinsichtlich jeglicher Fragestellung zur sensiblen Technik der HPLC.

Außerdem danke ich Herrn Prof. Dr. Dr. Franz Ellendorf der FAL Mariensee für die

freundliche und bereitwillige Überlassung der Versuchspferde und der Einrichtungen und

Gerätschaften der FAL. Herrn Jonny Meier und Herrn Wassmann danke ich herzlichst für die

freundliche und tatkräftige Unterstützung im Pferdestall.

Weiterhin gilt mein Dank Herrn Dr. Frank Niedorf, der durch Beseitigung aller Fragen zur

Methodenvalidierung zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat. Ebenso danke ich Herrn

Hans-Herbert Bohr für die Hilfe bei der Beschaffung aller zur Durchführung der

Ausscheidungsstudie notwendigen Utensilien.

Mein Dank gilt außerdem Severine Tobias und Irene Hammer, die hochmotiviert die

anfängliche praktische Organisation dieser Arbeit vorantrieben.

Ein besonderer Dank gilt meiner Familie, Helmut, Astrid, Alina, Andre, Freni, Ute, Wiebke,

Ines, Sandra, Swantje und allen, die ich hier noch vergessen habe, auf die ich mich immer

132 Danksagung

verlassen konnte und die durch tatkräftige und moralische Unterstützung zum Gelingen dieser

Arbeit beigetragen haben.

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