V2: Aktivitätsbestimmung von Enzymen · Molekularbiologie 06/9 Begriffe Spezifische Aktivität...
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V2: Aktivitätsbestimmung von Enzymen
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Methodik:
• Beobachtung des zeitlichen Verlaufs einer Enzymreaktion über denNachweis von Substraten und Produkten
• Ermittlung von Rahmenbedingungen zur Bestimmung derspezifischen Aktivität der Hefe-ADH auf der Basis des optischen Tests
• Nachweis der Substratspezifität von Enzymen am Beispiel von Proteasen
Messung von Enzymaktivitäten: Warum?
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• Charakterisierung von Enzymen, Aufklärung von Stoffwechselvorgängen
• Labordiagnostik (Vermehrung eines bestimmten Enzyms oftmals Hinweis auf Schädigung eines bestimmten Organs)
z.B. Alkalische Phosphatase → TumormarkerProteasen (Trypsin, Chymotrypsin) → PankreaserkrankungenTransaminasen → Leber- und GallenwegserkrankungenHBDH → Myocardinfarkt
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Enzyme: Katalysatoren des Stoffwechsels
• Enzyme sind Proteine
• Enzyme sind Biokatalysatoren, die den
Stoffwechsel einer Zelle regulieren und organisieren
• Enzyme binden an Substrate und wandeln sie in
chemisch veränderte Produkte um
• Enzyme arbeiten hocheffektiv: Sie beschleunigen
Reaktionen um den Faktor 106 bis 1012
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Unkatalysierte Reaktionen
• Zusammenstoß von A und B äußerst unwahrscheinlich
• Bildung des Übergangszustandes: Aktivierungsenergie notwendig
Was macht ein Enzym?• Komplementäre Bindungsstelle im aktiven Zentrum
• Annäherung und Orientierung der Substrate
• Erreichen des Übergangszustandes ist erleichtert
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Enzyme verringern Aktivierungsenergie
Aktivierungsenergie für Einzelschritte der enzymkatalisiertenReaktion ist geringer
als für die gesamte unkatalysierte Reaktion
Unkatalysiert Enzymkatalysiert
S P
Enzyme kinetics - basics
Rate2 = k2[ES]
E + S ES E + Pk1
k-1
k2
Geschwindigkeits-bestimmender
Schritt
k-1[ES] = k1[E][S]
Gleichgewicht
[ES] = Konstant
“Steady state” BedingungenLineare Änderung von [S] und [P]
Molekularbiologie 06/7
Wovon hängt die Gesamtgeschwindigkeit ab?
Rate2 = k2[ES]
E + S ES E + Pk1
k-1
k2
k-1 [ES]= k1[E][S]
𝑉∆ 𝑃
∆𝑡 𝑘2 ES
V hängt von [S] und [E] abBeide beeinflussen das Gleichgewicht und damit [ES]
Geschwindigkeits-bestimmender
SchrittGleichgewicht
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Die Maximale Geschwindigkeit
je 10 Reaktionen/min
[E]T = [ES]Das Enzym ist gesättigt
For [E] = constant, and [S]>>>[E]
Vmax = 40 Reaktionen/min
𝑉 𝑉∆ 𝑃
∆𝑡 𝑘2 ES ≅ 𝑘2 E T 𝑉 𝑘𝑐𝑎𝑡 E T
Sättigung Sättigung Reaktionsgeschwindigkeit ist unabhängig von [S]
Molekularbiologie 06/9
Begriffe
Spezifische AktivitätMaximale Substratmenge, die pro mg Enzym über eine gewisse Zeit ins Produkt gewandelt wird.
mmol of substrate
min x mg enzyme
Turnover number (kcat)Maximale Substratmenge (Mol), die 1 Mole Enzyme innerhalb 1 Zeiteinheit ins Produkt umwandeln kann.
mmol of substrate
min x mmol enzyme= min-1
Aktivitätsbestimmung Geschwindigkeitsmessung
Bei Vorliegen des Enzyms in Proteingemisch , Angabe in U/mgWobei: 1U enzyme converts 1 mol of substrate per minute
mg mg total protein
1/60 = sec-1
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Teilversuche
1. Beobachtung des zeitlichen Verlaufes einer Enzymreaktion und Berechnung von Substrat- und Produktmengen aus dem Beer-Lambert Gesetz
2. Bestimmung der spezifischen Aktivität eines Enzymes
3. Nachweise der Substratspäzifität von zwei Enzymen
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Ziel von Teilversuch 2.1
• Zeitlicher Verlauf einer Gleichgewichtsreaktion• Berechnung von Substrat- und Produktmengen
aus Lambert Beerschem Gesetz
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Teilversuch 1 - Zeitlicher Verlauf einer Enzymreaktion
Sorbinalkohol + NAD+ → Sorbinaldehyd + NADH + H+
Coenzym
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Teilversuch 1 - Anzatz
1,955 ml Testpuffer10 µl NAD+
15 µl ADH20 µl Sorbinalkohol
Testansatz:
C2H5OH + NAD+ C2H4O + NADH + H+
340 nm280 nm259 nm228 nm
ADH
Bis 220 nm280 nm
ADH NAD+
Basislinie mit Gesamtansatz bloß OHNE ALKOHOL
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Teilversuch 1 - Zeitliche Umsetzung von Sorbinalkoholdurch ADH
aus maximalem Umsatz (20 min)Menge an gebildetem Sorbinaldehyd und NAD+ bestimmen
Von gelesene E
Beer-LambertE = c d
Konzentrationswerte
Volume
nmol
228 nmAlkohol
280 nmAldehyd
340 nmNADH
Bestimmung von spezifische Aktivität - Tangentenverfahren
[t]
E
t
E
[t]
E
t
E
LinearePhase
LinearePhase
NADH, Sorbinaldehyd
Sorbinalkohol Tangentenfefahren
∆𝐸 𝜀 · ∆𝑐 · 𝑑
E
𝑉0∆𝑃∆𝑡
∆𝑐 · 𝑣𝑜𝑙𝑚𝑖𝑛
∆𝐸 · 2𝑚𝑙𝑚𝑖𝑛 · 𝜀 · 𝑑
μmolmin
𝐴𝑉0
mg enzym U/mg
Von E zu A:
NADH
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Ziel von Teilversuch 2
• Bestimmung von spezifischen Aktivitäten• Vergleich der spezifischen Aktivitäten für
homologe Substrate
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Teilversuch 2: Bestimmung der spezifischen Aktivität der ADH für EtOH
• Enzymreaktion siehe Teilversuch 1, aber mit EtOH als Substrat • Messung der Reduktion von NADH bei 340 nm• Für Zeitraum von 2‘ optimalen Konzentrationsbereich der ADH finden, der eine verlässliche
Aktivitätsbestimmung zulässt (Verdopplung, Halbierung, Vorverdünnung der Enzymlösung: steadystate, Linearität!)
V ist von [S] und [E] beeinflusst. Wir arbeiten mit:- Variable Enzymkonzentration- Konstante Substratskonzentration in Sättigungsbereich
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Teilversuch 2: Bestimmung der spezifischen Aktivität der ADH für EtOH
• 5 verschiedene Enzymkonzentrationen auswählen (Verdünnung in Phosphatpuffer mit RSA) und ΔE/min bestimmen (Glasküvetten)
Start der Reaktion durch Zugabe des Enzyms (5 – 50 µl): optimale Enzymmenge bestimmen (s.o.)!
• Reaktionsgeschwindigkeit in µmol/minBerechnung der spez. Akt. in µmol/min/mg = U/mg und Berechnung der Wechselzahl
x ml Testpuffer100 µl NAD+
60 µl EthanolLeerwert (Abgleich des Photometers bei 340 nm)
y = 0,0154x ‐ 0,0098
00,010,020,030,040,050,060,070,08
0,05 0,15 0,25 0,35 0,45
Reaktio
nsge
schw
indigkeit
[µmol/m
in]
Enzymmenge [µg]
Unit/mgBeide machen!
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Auswertung Teilversuch 2.2
• Berechnung der Enzymmenge im TestansatzVerdünnung
• Berechnung der Reaktionsgeschwindigkeit P/tE/t Beer Lambert P/t
• Berechnung der spezifischen AktivitätReaktionsgeschwindigkeit /Menge von EnzymEinzelwerte E/t + Linear plot von V0 gegen g
• Vergleich der spezifischen Aktivitäten von ADH für EtOH/Sorbinalkohol
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Ziel von Teilversuch
• Nachweis der Substratspezifität von Enzymen
Durch Bestimmung von der spezifischen Aktivität mit verschiedenen Substraten
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Teilversuch 3: Substratspezifität von Enzymen
… am Beispiel der Serinproteasen Trypsin und Chymotrypsin
Superpositionof trypsin
and chymotrypsin
Wenzhe Ma, Chao Tang, Luhua Lai, Biophys J. 2005 Aug; 89(2): 1183–1193.
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Teilversuch 3: Substratspezifität von Enzymen
• Benzoyl-D,L-arginin-p-nitroanilid (BNA):
• N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-4-nitroanilid (SPNA):
Substrat für Trypsin
Substrat für Chymotrypsin
Frage: Nach welchen Aminosäuren könnten diese Proteasen spalten?
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Ablauf von Teilversuch 2.3
Substratspezifität von Proteasen und Bestimmung der spezifischen Aktivität• Enzymreaktion mit 2 synthetischen chromogenen Substraten • Farbnachweis über Nitroanilin ( = 405 nm, Einwegküvetten) • Substratspezifität: Jedes Substrat wird mit beiden Enzymen getestet
(Verdünnungen nach Angabe)• Vorversuch: Einstellung der Enzymmenge
• Messung bei 3 verschiedenen Enzymkonzentrationen (5-50 µl; entsprechende Verdünnung)Start der Reaktion durch Enzymzugabe
• Berechnung von Menge mg Enzym im Testansatz und der Reaktionsgeschwindigkeit • spez. Aktivität: aus Einzelwerten bzw. aus Grafik (V gegen Enzymmenge; Anstieg = U/mg)
ΔE/min
t