Vardenafil induzierter Schutz vor Ischämie ... · Aus der Klinik für Innere Medizin B der...

Aus der Klinik für Innere Medizin B

der Universitätsmedizin

der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

Vardenafil induzierter Schutz

vor Ischämie-Reperfusionsschäden

–

Untersuchung der Signalkaskade am isolierten

Rattenherzen

Inaugural – Dissertation

zur

Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Medizin

(Dr.med.)

der

Universitätsmedizin

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität

Greifswald

2012

vorgelegt von: Ole Christopher Maas

geb. am: 11. September 1982

in: Hamburg

Dekan: Prof. Dr. med. dent. Reiner Biffar

1. Gutachter: Prof. Dr. med. Stephan B. Felix

2. Gutachter: Prof. Dr. Reiner Schulz

Ort, Raum: Greifswald, Besprechungsraum 334, Klinik für Anaesthesiologie und

Intensivmedizin, 3. OG, Fleischmannstr. 42-44

Tag der Disputation: 10.09.2012

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

Seite

Abkürzungslexikon……………………………………………………… IV-V

1. Einleitung……………………………………………………………… 1

1.1. Myokardinfarkt…………………………………………….. 1

1.1.1. Definition………………………………………… 1

1.1.2. Klinik…………………………………………….. 1

1.1.3. Therapie………………………………………….. 2

1.1.4. Epidemiologie……………………………………. 3

1.2. Ischämie……………………………………………………. 4

1.2.1. Definition………………………………………… 4

1.2.2. Anaerobe Energiegewinnung…………………….. 4

1.2.3. Nährstoffverlust………………………………….. 5

1.2.4. Prozesse während der Ischämie………………….. 5

1.2.5. Direkte Mechanismen der Zellschädigung………. 5

1.3. Ischämie-Reperfusionsschaden…………………………….. 6

1.3.1. Definition………………………………………… 6

1.3.2. Prozesse während der Reperfusion………………. 7

1.4. Konditionierung des Myokards……………………………..10

1.4.1. Präkonditionierung……………………………….. 10

1.4.2. Während der Ischämie…………………………… 12

1.4.3. Ischämische Postkonditionierung………………... 12

1.4.4. Pharmakologische Konditionierung………………13

1.5. Kardioprotektion durch Phosphodiesterase-5 Inhibitoren…. 13

1.5.1. Phosphodiesterasen………………………………. 13

1.5.2. PDE-5-Inhibitoren………………………………...14

2. Aufgabenstellung………………………………………………………. 15

3. Material und Methoden………………………………………………… 16

3.1. Material…………………………………………………….. 16

3.1.1. Chemikalien, Medikamente, Gase……………….. 16

3.1.2. Verbrauchsmaterial………………………………. 17

3.1.3. Geräte, Instrumente………………………………. 18

3.1.4. Computersoftware………………………………... 19

Inhaltsverzeichnis

II

3.1.5. Lösungen, Medien………………………………...20

3.1.6. Tiere……………………………………………… 20

3.2. Methoden…………………………………………………... 21

3.2.1. Rattenherzen-Isolation im Langendorffmodus…... 21

3.2.2. Infarktgrößenbestimmung………………………... 23

3.2.3. Biopsie-Entnahme………………………………... 27

3.2.4. cGMP-Level-Bestimmung……………………….. 28

3.3. HL-1-Zelllinie……………………………………………… 28

3.3.1. Zellkultivierung………………………………….. 28

3.3.2. Messungen der PKG-Aktivität mittels

Westernblotting….……………………………… 29

3.4. Statistik…………………………………………………….. 29

4. Ergebnisse……………………………………………………………… 30

4.1. Kontrolle der Indexischämie und ischämische Prä- und

Postkonditionierung………………………………………. 30

4.2. Präkonditionierung durch Vardenafil……………………… 33

4.3. Postkonditionierung durch Vardenafil……………………... 34

4.4. Enzyminhibitoren…………………………………………... 38

4.4.1. L-NAME…………………………………………. 38

4.4.2. ODQ……………………………………………… 39

4.4.3. KT5823…………………………………………... 41

4.4.4. Koronarfluss Enzyminhibitoren………………...... 42

4.5. Analogon 8-pCPT-cGMP………………………………….. 44

4.6. cGMP-Level………………………………………………... 47

4.7. HL-Zellen Vardenafil VASP-Blot…………………………. 48

5. Diskussion……………………………………………………………… 49

5.1. Dosisfindung……………………………………………….. 49

5.2. eNOS……………………………………………………….. 51

5.3. Guanylatcyclase & cGMP…………………………………..51

5.4. Proteinkinase G…………………………………………….. 52

5.5. Ischämische Postkonditionierung………………………….. 53

5.6. Klinischer Nutzen………………………………………….. 54

Zusammenfassung…………………………………………………………55

Quellenverzeichnis………………………………………………………... 56

Inhaltsverzeichnis

III

Eigene Veröffentlichungen……………………………………………...... 63

Eidesstattliche Erklärung…………………………………………………. 64

Lebenslauf………………………………………………………………… 65

Danksagung………………………………………………………………..67

Abkürzungsverzeichnis

IV


Abb. -

ATP -

cAMP -

cGMP -

CK -

EDTA -

EGFR -

EKG -

ELISA -

eNOS -

GC -

GSK-3-beta -

HB-EGF -

5-HD -

HEPES -

IPC -

IPostC -

L-NAME -

Min. -

mitoKATP-Kanal -

mPTP -

NSTEMI -

ODQ -

8-pCPT-cGMP -

PI3-Kinase -

Abbildung

Adenosintriphosphat

zyklisches Adenosinmonophosphat

zyklisches Guanosinmonophosphat

Creatinin-Kinase

Ethylendiamintetraessigsäure

Endothelial Growth Factor Receptor (endothelialer

Wachstumshormonrezeptor)

Elektrokardiogramm

Enzyme-linked Immunosorbent Assay (enzymatisches

Immunadsorptionsverfahren)

endotheliale Stickstoffmonoxid Synthase

Guanylatcyclase

Glykogen-Synthase-Kinase-3-beta

Heparin-binding epidermal growth factor

(heparinbindender, epidermaler Wachstumsfaktor)

5-Hydroxydecanoat

2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazinyl)-Ethansulfonsäure

Ischämische Präkonditionierung

Ischämische Postkonditionierung

N!-Nitro-L-Arginin-Methyl-Ester-Hydrochlorid

Minute

mitochondrialer K-ATP-Kanal

mitochondrial permeability transition pore

(mitochondriale Permeabilitätsaustauscherpore)

Non ST-Elevation Myocardial Infarction (Nicht ST-

hebungs Myokardinfarkt)

1H-[1,2,4]Oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one

8-(4-Chlorophenylthio)-Guanosin 3",5"-zyklisches

Monophosphat Salz

Phosphoinosid-3-Kinase


V

PCR -

PDE -

PKC -

SEM -

sGC -

STEMI -

SR -

ROS -

rpm -

UV-Licht -

VAR -

VASP -

WHO -

Polymerase Chain Reaction (Polymerase

Kettenreaktion)

Phosphodiesterase

Proteinkinase C

Standard Error of the Mean (Standardabweichung des

Mittelwertes)

soluble (lösliche) Guanylatcyclase

ST-Elevation Myocardial Infarction (ST-hebungs

Myokardinfarkt)

Sarkoplasmatisches Retikulum

Reaktive Oxygen Spezies (reaktive Sauerstoffradikale)

Rotationen pro Minute

Ultraviolettes Licht

Vardenafil

Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein

World Health Organisation

(Weltgesundheitsorganisation)

Einleitung

1

1. Einleitung

1. 1. Myokardinfarkt

1.1.1. Definition

Unter einem akuten Myokardinfarkt wird der plötzliche Verschluss einer Koronararterie, also eines

für die Myokardversorgung zuständigen Gefäßes, verstanden

(1). Der Myokardinfarkt kann sehr unterschiedlich verlaufen.

Auf der einen Seite ist der akute Myokardinfarkt eine der

häufigsten Todesursachen in den Industrienationen – in

Deutschland weist das Bundesamt für Statistik den akuten

Myokardinfarkt als zweithäufigste Todesursache aus (23;

19). Auf der anderen Seite verlaufen etwa 20% aller nicht

tödlichen Infarkte stumm, also vom Patienten unbemerkt.

Wie ein Infarkt sich klinisch verhält, hängt unter anderem

vom Ort des Verschlusses und damit von der Größe des

betroffenen Areals ab, sowie von den kardialen und nicht

kardialen Vorerkrankungen des Patienten. Wir unterscheiden

am menschlichen Herzen zwei große Herzkranzgefäße, die

linke und rechte Koronararterie. Die linke Arterie teilt sich

kurz nach ihrem Ursprung an der Aorta ascendens in den

Ramus circumflexus und Ramus interventricularis anterior.

Die Arterien teilen sich zur Peripherie hin weiter auf. Eine

wesentliche Kollateralbildung großer Gefäße, also ein

netzartiger Gefäßaufbau besteht am Herzen nicht (5). Das

heißt, dass im Falle des Verschlusses eines Gefäßes ein Areal

von der Versorgung mit Blut abgetrennt und damit mit

Nährstoffen und Sauerstoff unzureichend versorgt ist.

1.1.2. Klinik

Neben einer zum Teil typischen Klinik aus akutem

thorakalem Vernichtungsschmerz, Luftnot, Schwindel bis hin

zur Bewusstlosigkeit und Kaltschweißigkeit, ist das Elektrokardiogramm (EKG) eine der

wichtigsten diagnostischen Maßnahmen. Oft stellt sich der akute Infarkt im EKG mit einer ST-

Abb.1 Schematische Darstellung der Anatomie der Koronargefäße am Herzen: Die Gefäße verlaufen von der Basis der Klappen mit Ursprung in der Aorta auf der Außenseite des Herzen hinunter zur Herzspitze. Der Verschluss eines Koronargefäßes (schwarzer Balken) führt zu einer konsekutiven Ischämie des Areals unterhalb des Verschlusses (grau schattiert). Wesentliche Kollateralgefäße aus dem Stromgebiet anderer Gefäße bestehen nicht. Modifiziert nach A.Micheau, e-anatomy, imaios® (48)

Einleitung

2

Streckenhebung dar. Allerdings zeigt nur ein Teil der Patienten diese EKG-Veränderungen. Nach

der neuesten WHO-Definition des Herzinfarktes ist deshalb auch das wichtigste diagnostische

Werkzeug die Analyse einer Blutprobe auf Herzenzyme. Erst der Nachweis einer Myokardnekrose,

vorzugsweise mittels erhöhter Herzenzyme in Kombination mit typischen klinischen Symptomen,

passenden EKG-Veränderungen oder weiterer Bildgebung, erlaubt die Diagnose eines

Herzinfarktes (17). Die Erhöhung herzspezifischer Muskelproteine im peripheren Blut ist durch

einen Untergang von Herzmuskelzellen mit Freisetzung intrazellulärer Proteine in den Blutkreislauf

bedingt. Es steigen mit einer zeitlichen Latenz unter anderem die Enzyme Troponin I und Creatinin-

Kinase (CK) und andere Enzyme im peripheren

Blut an. (18)

Die Nomenklatur unterscheidet deshalb zwei

Typen des akuten Myokardinfarkts anhand des

Elektrokardiogramms: Während die einen

Patienten als Zeichen einer transmuralen,

ausgeprägten Ischämie des Herzmuskels eine

ST-Hebung im EKG zeigen (ST-Elevated

Myocardial Infarction – STEMI), fällt diese bei

anderen Patienten nicht auf (Non ST-Elevated Myocardial Infarction – NSTEMI).

90% aller Infarkte betreffen den linken Ventrikel. Man unterscheidet je nach betroffenem Areal

Hinter-, Vorder- oder Seitenwandinfarkte. Diese können auch noch wieder in Subkategorien

unterteilt werden.

Ein Patient mit akutem Myokardinfarkt kann unterschiedliche Symptome zeigen, weist aber oft die

oben erwähnten Symptome auf: starker Thoraxschmerz (sog. Vernichtungsschmerz) mit

Ausstrahlung in die linke Seite, Luftnot, Schwindel bis Bewusstlosigkeit sowie Kaltschweißigkeit.

Eine vitale Bedrohung des Betroffenen geht vor allem von Herzrhythmusstörungen und einem

Verlust der Pumpfunktion des Herzens in Folge des Myokardinfarkts aus (20).

1.1.3. Therapie

Die Therapie eines akuten Myokardinfarkts beinhaltet eine Schmerztherapie mit z.B. Opioiden,

Kreislaufstabilisation bzw. Komplikationsbeherrschung (kardiogener Schock, Rhythmusstörungen)

sowie eine Begrenzung der Infarktnarbe durch möglichst rasche Rekanalisation des betroffenen

Gefäßes (4).

Zwar gehen die meisten Todesfälle in der akuten Phase des Myokardinfarkts auf

Rhythmusstörungen mit Folge von drastischer Minderung der Pumpfunktion des Herzens zurück

Abb. 2 Darstellung der QRS-Komplexe: links der physiologische QRS-Komplex; rechts deutlich zu erkennen die ST-Streckenhebung als wichtiges Indiz einer transmuralen Ischämie

Einleitung

3

(1), aber schon vor 40 Jahren konnte gezeigt werden, dass für den weiteren Verlauf der Erkrankung

die Größe der Infarktnarbe im kontraktilen Gewebe des Herzens entscheidend ist (6). Ab einem

Verlust von 10% des Myokards ist mit einer Minderung der Ejektionsfraktion zu rechnen, ab 15%

nehmen enddiastolisches Volumen bzw. enddiastolischer Druck zu, ab 25 % zeigen die Patienten

klinisch die Symptome einer Herzinsuffizienz und ab 40% ist eine Gefährdung durch einen

kardiogenen Schock gegeben.

Der Verschluss einer Koronararterie erfolgt in der Regel auf dem Boden einer Arteriosklerose. Bei

kleinen Verschlüssen ist der Körper in der Lage, den Verschluss des Gefäßes selbst zu

rekanalisieren. Entscheidend beim Infarkt ist es, möglichst schnell eine Wiedereröffnung des

betroffenen Gefäßes herzustellen, um ein weiteres Absterben von Herzmuskelgewebe zu

verhindern. Hierzu kann der Arzt versuchen, den Verschluss mittels systemischer Lyse-Therapie

aufzulösen oder im Herzkatheterlabor das Gefäß gezielt mechanisch wiederzueröffnen.

Die Ballondilatation ist eine Behandlung, bei der mit einem Katheterdraht, an dessen Spitze sich ein

Ballon befindet, bis in das betroffene Gefäß vorgegangen wird. Der bis dato zusammengefaltete

Ballon wird im Bereich der Stenose mit physiologischer Kochsalzlösung entfaltet, um die Engstelle

mechanisch aufzudehnen. Zusätzlich kann, um das Gefäß längerfristig offen zu halten,

endovaskulär ein Stent implantiert werden. Ein Stent ist, vereinfacht gesagt, eine Röhre aus

Drahtgeflecht, die über Herzkatheter in der Engstelle der Gefäße implantiert werden kann und so

einen raschen Wiederverschluss des Gefäßes verhindert.

Zwar ist in der Akutbehandlung des Myokardinfarkts die Wiederherstellung der Perfusion im

Gewebe ein Hauptziel, dennoch ist die angestrebte Reperfusion nicht nur hilfreich. Die Größe der

Infarktnarbe bzw. der Zustand des betroffenen Myokards hängt zum einen entscheidend von der

Dauer der Ischämie ab, aber auch von der Zeit unmittelbar nach Wiedereröffnung – der so

genannten Reperfusionsphase.

In der Reperfusion laufen in den Zellen des Myokards Prozesse ab, die ein Überleben der

jeweiligen Zelle entscheidend beeinflussen können. Die Einflussnahme auf diese Prozesse zur

Minimierung der Infarktnarbe im Myokard nennen wir Konditionierung (siehe Seite 10).

1.1.4. Epidemiologie

Die Inzidenz des Myokardinfarktes zeigt regionale Unterschiede. Während in Deutschland die

Inzidenz bei ca. 300 Infarkten auf 100.000 Einwohner pro Jahr liegt, werden in Japan unter 100

Infarkte auf 100.000 Einwohner/Jahr registriert (1). Andere Länder, z.B. England oder Finnland,

kommen auf über 500 Infarkte/100.000 Einwohner/Jahr. Diese großen regionalen Unterschiede

Einleitung

4

können unter anderem mit dem regional unterschiedlichen Profil der Risikofaktoren begründet

werden. Zu den wesentlichen Risikofaktoren gehören neben der nicht beeinflussbaren familiären

Disposition, Tabakrauchen, arterielle Hypertonie, ein bestehender Diabetes mellitus (21),

Dyslipoproteinämie und Ernährungsgewohnheiten. Diese Faktoren führen alle zu einer koronaren

Gefäßerkrankung im Sinne einer Arteriosklerose der Herzkranzgefäße - die Grundlage der meisten

Myokardinfarkte (22).

Im Vergleich der Verteilung auf die Geschlechter ist festzustellen, dass der Myokardinfarkt mit

dem Faktor 2 öfter Männer als Frauen trifft. Die Lebenszeitprävalenz liegt für deutsche Männer bei

etwa 30% und für Frauen bei ca. 15%. In der Todesursachenstatistik des Bundes wurden für 2002

64.218 tödliche Infarkte registriert (23).

1.2. Ischämie

1.2.1. Definition

Der Begriff Ischämie, in Übersetzung aus dem Altgriechischen „Blutleere“, bedeutet, dass ein

Organ oder Gewebe nicht mehr oder nur unzureichend durchblutet wird. Wenn nun durch den

Verschluss einer Koronararterie Teile des Herzmuskels nicht mehr mit Blut versorgt werden,

werden verschiedene Prozesse aktiviert, welche zu einem Gewebeschaden führen können.

1.2.2. Anaerobe Energiegewinnung

Mit Unterbrechen der Durchblutung wird auch die Versorgung des Gewebes mit Sauerstoff

unterbunden. Der Sauerstoff ist für die Zellen für die Verstoffwechselung von Kohlenwasserstoffen

über die Glykolyse und die Atemkette der Mitochondrien nötig, um so die Ausbeute an

Adenosintriphosphat (ATP) pro Kohlenstoffverbindung zu maximieren. Steht kein Sauerstoff mehr

zur Verfügung, wird die ATP-Gewinnung von der aeroben auf die anaerobe Zellatmung umgestellt

(7). Bei der anaeroben Zellatmung fällt zum einen Laktat als Endprodukt der Glykolyse an, zum

anderen akkumuliert CO2 im Gewebe, da es nicht abtransportiert werden kann.

Beide Metabolite sorgen für eine Verschiebung des pH-Wertes des Gewebes ins saure Milieu. Mit

zunehmender Dauer der Ischämie kommt auch die anaerobe Glykolyse zum Erliegen. Die

akkumulierten Endprodukte der anaeroben Glykolyse verschieben die Reaktionsgleichgewichte und

hemmen so eine weitere Verstoffwechselung.

Einleitung

5

1.2.3. Nährstoffverlust

Mit Unterbrechung der Blutzufuhr fällt auch die Versorgung des Gewebes mit Nährstoffen wie

Eiweiß, Fett und Glukose aus. Die Myokardzellen verfügen zwar über einen gewissen Spiegel an

Glukose im Zytosol, dieser ist jedoch schnell verbraucht. Weitere schnelle mobilisierbare Energie

ist in Form von Glykogen und Lipiden gespeichert. Da die Verstoffwechselung dieser Reserven

aber unter anaeroben Bedingungen erfolgt, ist die Ausbeute an ATP, Energieäquivalent für die

Umsetzung Energie fordernder Prozesse der Zelle, geringer.

1.2.4. Prozesse während der Ischämie

Auch wenn unter der Ischämie die aktive Kontraktion der Myokardzelle bald zum Erliegen kommt,

wird dadurch der Energiebedarf der Zelle nur reduziert, nicht aber beseitigt. Die Zelle benötigt zur

Aufrechterhaltung des gesonderten, in Bezug auf Molarität und pH-Wert stabilen, Milieus im

Zytosol Energie (11). Um die Milieudifferenzen zwischen Intra- und Extrazellulärraum zu erhalten,

verfügt die Zelle über ein spezielles System verschiedener Ionenpumpen und Ionenkanäle. Einige

dieser Membranproteine, unter anderem die Na-K-ATPase, sind primär aktive, das heißt direkt ATP

verbrauchende „Pumpen“. Die Na-K-ATPase transportiert Natriumionen im Austausch gegen

Kaliumionen aus dem Inneren der Zelle heraus und baut so einen Natriumgradienten über der

Plasmamembran auf. Andere, die so genannten sekundär aktiven Transporter, benutzen nun diesen

Natriumgradienten, um wieder weitere Ionen über die Zellmembran zu transportieren und so ein

konstantes Milieu im Inneren der Zelle aufzubauen. Reguliert wird die Na-K-ATPase über die

Menge des intrazellulären Natriums.

Der Ausfall der Na-K-ATPase in der Ischämie hat nun zwei Folgen: Als erstes steigt der

intrazelluläre Natriumspiegel an, was einen vermehrten Antrieb der Pumpe und damit einen

weiteren Anstieg des ATP-Bedarfs zur Folge hat. Zum anderen bricht der Natriumgradient über der

Plasmamembran zusammen. Die sekundär aktiven Ionentransporter fallen so ebenfalls aus. In der

Folge ist die Zelle nicht in der Lage, ihr besonderes intrazelluläres Milieu zu erhalten (25).

1.2.5. Direkte Mechanismen der Zellschädigung

Die in den vorangegangenen Absätzen beschriebenen Prozesse führen zu einer Schädigung der

Zelle. Im Wesentlichen sind zwei Mechanismen verantwortlich.

Einleitung

6

Zum einen führt der vermehrte Einstrom von

Ionen, beziehungsweise der Verlust einer

kompensierenden Pumpleistung von Ionen

aus der Zelle heraus, zu einem Anstieg der

Osmolarität des Zytosols. Konsekutiv

strömen Wassermoleküle ins Zellinnere.

Diese Zunahme von intrazellulärer

Flüssigkeit geht mit einer Volumenzunahme

der Zelle einher. Die Schwellung kann die

Plasmamembran der Zelle nur bedingt

ausgleichen, ehe es zu Schäden der Zellwand

führt (11).

Neben diesem passiven Schädigungsmuster

werden aktive Prozesse der Zelle initiiert.

Unter physiologischen Bedingungen ist der

Calciumspiegel des Zytosols gering und nur

einigen Schwankungen zur Aktivierung

einer Myokardkontraktion unterlegen. In der

ischämischen Zelle steigt durch den Ausfall

der plasmalemmalen Transporter auch der

intrazelluläre Calciumspiegel an. Ein großer Teil des in der Ischämie einströmenden Calciums

kommt jedoch aus den intrazellulären Speichern der Zelle. Ein stark erhöhter intrazellulärer

Calciumspiegel führt zur Aktivierung von Caspasen und anderen Enzymen, die die Apoptose der

Zelle einleiten (45).

1.3. Ischämie-Reperfusionsschaden

1.3.1. Definition

Unter dem Ischämieschaden wird der Defekt verstanden, der direkt durch die Mangelversorgung

des Gewebes verursacht wird und im Abschnitt „Ischämie“ geschildert wird.

Der Reperfusionsschaden bezeichnet den Gewebeschaden, der durch Prozesse in der Reperfusion,

also erst im Anschluss an die Ischämie, verursacht wird.

Abb.3 Vereinfachte Darstellung der Prozesse während der Ischämie, die zur Schädigung des Gewebes führen: Ein Mangel von Nährstoffen und Sauerstoff führt zum Mangel an ATP. Dadurch kann die Na-K-ATPase das Membranpotential nicht mehr aufrechterhalten. Calcium und Wasser strömen ins Zellinnere. Der erhöhte Calciumspiegel aktiviert die Caspasen, welche eine Apoptose einleiten.

Einleitung

7

Nach der Ischämie am Beginn der Reperfusion

unterteilt man die Zellen im betroffenen Areal in drei

Gruppen. Die erste Gruppe ist durch die Ischämie

irreversibel geschädigt und ist zu Grunde gegangen

oder wird während der Reperfusionsphase mit

Sicherheit absterben. Die zweite Gruppe umfasst

Zellen, die die Ischämie überlebt haben und auch ohne

weitere Beeinflussung die Reperfusionsphase

überstehen werden. Die dritte Gruppe ist letztlich die,

mit der sich diese Arbeit auseinander setzt. Diese

Zellen sind durch die Ischämie soweit geschädigt, dass

sie durch die Reperfusion absterben würden. Dennoch

lassen sich diese Zellen durch Beeinflussung der

Prozesse in der Reperfusion bzw. durch Aktivierung

protektiver Signalkaskaden retten (31; 8).

Es wird angenommen, dass der Reperfusionsschaden

im wesentlichen durch oxidativen Stress und die damit

verbundenen reaktiven Sauerstoffradikale, durch eine

Veränderung der Calciumionenhomöostase sowie

durch exzessive Zellkontraktionen verursacht wird. Diese Stressoren haben ihren Ursprung in der

Normalisierung des Energiehaushalts und Gewebsosmolarität der Zelle sowie in Verschiebungen

des pH-Wertes im Gewebe.

1.3.2. Prozesse während der Reperfusion

1.3.2.1. Normalisierung des Energiehaushalts

Wenn das Gewebe nach einer ischämischen Phase wieder mit Sauerstoff versorgt wird, kommt es

zum so genannten „Sauerstoff-Paradoxon“ (10). Darunter versteht man eine ernsthafte Schädigung

des Gewebes durch die erneute Zufuhr des lebenswichtigen Sauerstoffs. Während der

Reoxygenierung kommt es zu einer myofibrillären Hyperkontraktur und einer sarkolemmalen

Disruptur, die in der Reperfusion zu Schäden am Gewebe führen (46; 47).

Der Sauerstoff ermöglicht es der Zelle, über die Mitochondrien den während der Ischämie

ausgeschöpften ATP-Vorrat wieder aufzufüllen.

Abb.4 Beitrag zur Sterblichkeit der Myokardzellen, aufgegliedert nach Schaden durch die Ischämie, Reperfusion bzw. der erzielbare Effekt der Myokardprotektion Modifiziert nach Yellon et. al.(8)

Einleitung

8

Das neu synthetisierte ATP wird von der Zelle in der Reperfusion für diverse Prozesse benötigt. Da

sich während der Ischämie die Ionengleichgewichte über der Zellmembran verschoben haben, ist

die Zelle mittels der Ionentransporter bestrebt, dieses Gleichgewicht wieder herzustellen. Eine

wichtige Rolle kommt hier der Na-K-ATPase zu, die das während der Ischämie gestiegene

intrazelluläre Natrium im Austausch gegen Kalium wieder nach extrazellulär pumpt. Da ein

Natriumeinstrom bei vielen sekundär aktiven Transportern der treibende Gradient ist, ist eine

Normalisierung des Natriumgleichgewichts über der Zellmembran essentiell.

Unter anderem werden in der gesunden Zelle Calciumionen im Austausch gegen Natriumionen

nach extrazellulär gepumpt und so ein niedriger intrazellulärer Calciumspiegel gesichert.

In der gesunden Zelle steigt zur Initiation einer Kontraktion das intrazelluläre Calcium. Ein

schneller Abfall des Calciumspiegels verhindert eine dauerhafte, pathologische Kontraktur des

Gewebes (11). Für den Abfall des Calciumspiegels ist am sarkoplasmatischen Retikulum eine direkt

ATP-abhängige Calciumpumpe zuständig (63). An der Zellmembran wird das Calcium in einem

sekundär aktiven Transport im Austausch gegen Natrium nach extrazellulär gepumpt und so ein

Absinken des Calciumspiegels gesichert.

Während der Ischämie ist der Calciumspiegel intrazellulär angestiegen. Der hohe Calciumspiegel

führt nun, wie in der gesunden Zelle, zur Aktivierung verschiedener zellulärer Enzyme. Dazu

gehören die für die Kontraktion der Zelle zuständigen Myofibrillen sowie sarkolemmale

Calciumpumpen.

Zu Beginn der Reperfusion liegt nun ein sehr hoher intrazellulärer Calciumspiegel zusammen mit

ATP vor. Dadurch wird eine Kontraktion initiiert und Calcium ins sarkoplasmatische Retikulum

(SR) gepumpt. Doch kann im Gegensatz zur physiologischen Myokardkontraktion nicht Calcium an

der Zellmembran gegen Natrium ausgetauscht werden, da der intrazelluläre Natriumspiegel nach

der Ischämie erst wieder normalisiert werden muss. Zwar kann der ATP-abhängige Transport von

Calcium in das SR arbeiten, jedoch ist die Calciumkapazität des SR begrenzt. Bei Überbeladung

des SR mit Calcium wird dieses wieder freigesetzt und damit eine Oszillation des Calciumspiegels

und eine Kontraktur der Zelle ausgelöst. Diese Oszillation kann nur durch ein Einsetzen des

plasmalemmalen Calciumtransports beendet werden (27; 28).

Ob der Natriumspiegel normalisiert werden kann und damit ein Absinken des intrazellulären

Calciums möglich ist, hängt vom Ausmaß der ischämischen Schädigung der Na-K-ATPase ab.

Einleitung

9

1.3.2.2. Normalisierung der Gewebsosmolarität

Durch den Funktionsverlust der plasmalemmalen Pumpen wie der Na-K-ATPase während der

Ischämie kann das Gleichgewicht der Ionen zwischen Intra- und Extrazellulärraum nicht

aufrechterhalten werden. Insbesondere Natriumionen sammeln sich im Inneren der Zelle.

In der ischämischen Phase stellen die Zellen ihren Stoffwechsel zunächst auf eine anaerobe

Energiegewinnung um. Dabei entstehen Stoffwechselprodukte wie Laktat, die in der Zelle

akkumulieren.

Die Natriumionen und die Stoffwechselprodukte sind osmotisch aktive Substanzen. Durch ihre

übermäßige Ansammlung in den Zellen ist das osmotische Gleichgewicht gestört, sie ziehen Wasser

ins Innere der Zellen.

In der Reperfusion werden die in der ischämischen Phase akkumulierten Stoffe nun ausgewaschen.

Das Wasser kann die Zelle aber nicht so schnell wieder verlassen. Zurück bleibt eine mit Wasser

überladene Zelle, welche angeschwollen ist (29).

Die Zellschwellung erhöht in Kombination mit ischämischen Hyperkontrakturen des Zytoskeletts,

dem Mangel an Energie und anderen Stressfaktoren das Risiko einer Zellschädigung.

1.3.2.3. Normalisierung des pH-Werts

Wird ein Gewebe durch eine Ischämie gezwungen auf anaeroben Stoffwechsel umzustellen, fällt

dabei Laktat an. Da dieses in der Ischämie nicht abtransportiert oder weiter verstoffwechselt wird,

sammelt es sich an. Laktat senkt während der Ischämie den pH-Wert in den Zellen sowie im

Extrazellulärraum.

Da ein saures Milieu hemmend auf den kontraktilen Apparat der Myozyten wirkt, hat es während

der Ischämie durchaus protektive Effekte auf die Zelle. Es senkt den Stress durch die

Hyperkontraktilität der Myofibrillen auf die Zellmembran (52).

Wird das Gewebe in der Reperfusion wieder durchblutet, werden die Wasserstoffprotonen im

Extrazellulärraum zwischen den Zellen rasch ausgeschwemmt. Durch die in den Zellen

verbleibenden Protonen entsteht ein Gradient über der Zellmembran. Entlang des

Konzentrationsgefälles zieht es die Wasserstoffionen aus den Zellen heraus in den alkalischeren

Extrazellulärraum. Dabei nutzen die Wasserstoffionen unter anderem einen Na-H-Antiporter, der

Natriumionen im Austausch mit Wasserstoffionen in die Zelle transportiert (53).

Ein weiterer Mechanismus, um die Differenz des pH-Wertes von Intra- und Extrazellulärraum

auszugleichen, ist die Aktivierung des Na-Bicarbonat-Symports. Dieser bringt HCO3- mit Natrium

in die Zelle hinein. Beide Transporter gleichen zwar den pH-Wert von intra- und extrazellulär an,

bringen jedoch Natriumionen in die Zelle hinein.

Einleitung

10

In der Folge kommt es zu einer Überladung der Zelle mit Natriumionen. Diese Überladung aktiviert

den Na-Ca-Antiport in „verkehrter Richtung“. Bei der physiologischen Muskelarbeit bringt dieser

Transporter die Calciumionen, deren Einstrom die Kontraktion initiiert hatte, im Tausch gegen

Natriumionen wieder aus der Zelle heraus. Die Überladung des Zytoplasmas mit Natrium lässt

diesen Na-Ca-Antiport nun Calcium in die Zellen hinein transportieren, um Natrium entlang des

herrschenden Gradienten aus der Zelle herauszufördern (11).

Dieser Einstrom von Calcium in die Zellen verstärkt die oben beschriebene Hyperkontraktilität der

Myofibrillen und erhöht so den Stress für die Myozyten (26).

1.4. Konditionierung des Myokards

1.4.1. Präkonditionierung

Unter Konditionierung wird die Aktivierung von Schutzmechanismen des Myokards gegen die

beschriebenen Ischämie-Reperfusionsschäden verstanden. Entdeckt wurde dieses Phänomen 1986

durch Murry et al. (3).

Ihnen gelang es, den Schaden, der durch eine lange andauernde Ischämie, der so genannten

Indexischämie, am Myokard verursacht wird durch alternierende, kurze Phasen von Ischämie und

Perfusion vor der Indexischämie zu

verringern.

Abbildung 5 zeigt die

schematische Erläuterung des

Versuchsprotokolls aus Murrys

Publikation. An aus Hunden

isolierten Herzen wurden 5 Min.

Ischämie mit 5 Min. Reperfusion

in 4 Zyklen abgewechselt, bevor

die Versorgung des Myokards für

40 Min. unterbunden wurde.

Dieses Vorgehen reduzierte die

Infarktgröße im Vergleich zu 40

Min. Indexischämie ohne weitere

Behandlung signifikant (3).

Abb.5 Aus der Publikation von Murry et al.: Graphische Darstellung des Versuchprotokolls: Repetitive Ischämien verringerten die Infarktgröße.

Einleitung

11

Auch wenn das Phänomen der ischämischen Präkonditionierung mittlerweile über 20 Jahre bekannt

ist, sind noch nicht alle Schritte der Signalvermittlung in der Myokardzelle verstanden.

Verschiedene Signaltransduktionswege sind untersucht worden. Mehrere protektive Signalkaskaden

konnten identifiziert werden (8).

Als Zielstruktur zum Schutz der Myokardzelle wird vielfach die mitochondriale Membranpore

mPTP (mitochondrial permeability transition pore) angenommen. In der vitalen Myokardzelle liegt

die mPTP in der mitochondrialen Membran in dissoziiertem Zustand vor. Auch während der

Ischämie ist die mPTP noch geschlossen (9). Finden sich die Bestandteile der Pore jedoch

zusammen, bildet sich ein Kanal in der Membran, der einen Zusammenbruch des

Membranpotentials am Mitochondrium zur Folge hat. Die Mitochondrien sind nicht weiter in der

Lage ATP zu produzieren. Sie gehen zugrunde. Diese Formation der mPTP gilt es zum Schutz des

Myokards zu verhindern.

Derzeit sind mehrere Wege bekannt, die einen hemmenden Einfluss auf die Formation der mPTP

ausüben. Eine zentrale Rolle scheint die Aktivierung der Proteinkinase C zu spielen. Die PKC wird

bei der Präkonditionierung vor Beginn der Ischämie aktiviert und bildet das „Gedächtnis“ der

Konditionierung. Das heißt, die PKC wird vor der Ischämie aktiviert, aber ihr Effekt kommt erst

nach der Zeit der Ischämie zum Tragen (54).

Es gibt mehrere bekannte Wege, um die PKC zu aktivieren. Alle diese Signalkaskaden beginnen an

der Zellmembran mit der Aktivierung von Gi-Protein gekoppelten Rezeptoren, u.a. Rezeptoren für

Adenosin, Bradykinin oder Opioide (55; 56).

Bradykinin und die Opioide vermitteln ihr Signal über die PI3-Kinase, welche direkt (Bradykinin-

Rezeptor) oder indirekt aktiviert wird. Die PI3-Kinase stimuliert unter anderem die Kinase Akt. Die

aktive Akt stimuliert die endotheliale NO-Synthase (eNOS), welche Stickstoffmonoxid (NO) als

Botenstoff produziert.

NO stimuliert die lösliche Guanylatcyclase (soluble guanyl cyclase - sGC). Die sGC spaltet cGMP

aus GTP ab. Das so entstandene cGMP ist in der Lage, verschiedene Prozesse in der Zelle zu

aktivieren. Unter anderem wird die cGMP-abhängige Proteinkinase G aktiviert.

Die PKG scheint ein entscheidender Schritt zu sein, um das protektive Signal vom Zytosol auf die

Mitochondrien zu übertragen. Nach Aktivierung der PKG kommt es zur Öffnung von Kanälen in

der mitochondrialen Membran. Es handelt sich hier um einen Adenosintriphosphat-abhängigen

Kaliumkanal (mitoKATP-Kanal). Eine Öffnung des mitoKATP-Kanals hat einen Einstrom von

Kaliumionen ins Innere der Mitochondrien und konsekutiv einen Aufbau eines osmotischen

Gradienten über die mitochondriale Membran zur Folge. Dem Gradienten folgende

Einleitung

12

Wassermoleküle bewirken eine Schwellung der Mitochondrien. Dieses Anschwellen der

Mitochondrien stimuliert die Produktion von reaktiven Sauerstoffradikalen (reaktive oxygen species

– ROS) an der Mitochondrienmembran. Dieses ist ein entscheidender Schritt, denn ein chemisches

Abfangen der ROS hemmt eine Aktivierung dieses Signalweges. Die ROS scheinen die PKC zu

aktivieren, welche dann wieder den Beginn der gemeinsamen Signalkaskade darstellt (44).

1.4.2. Während der Ischämie

Eine Aktivierung der Proteinkinase C vor der Ischämie bedingt, dass während der ischämischen

Phase der Adenosin A2b Rezeptor durch die PKC aktiviert wird (58). Der A2b Rezeptor aktiviert

mehrere protektive Kinasen, was letztlich zu einer Phosphorylierung der Glykogen-Synthase-

Kinase-3-beta (GSK-3-beta) führt (57; 59).

Im normalen, physiologischen Zustand der Myozyten liegt die GSK-3-beta dephosphoryliert und

somit konstitutiv aktiv vor. Durch Phosphorylierung wird sie inaktiviert. Eine Inaktivierung der

GSK-3-beta verhindert die Bildung der mPTP, welches einen Schutz gegen Ischämie-

Reperfusionsschäden bietet (59).

1.4.3. Ischämische Postkonditionierung

Zwar wurde die ischämische Präkonditionierung zuerst entdeckt und ist auch noch weiterhin

Gegenstand der Forschung, dennoch ist die Postkonditionierung aus einfachen klinischen Gründen

relevanter. Da es bis auf wenige Situationen, zum Beispiel einer Herzoperation, wenig Situationen

gibt, in denen dem Arzt bekannt ist, dass das Herz des Patienten in Kürze einer Ischämie ausgesetzt

sein wird, ist die Postkonditionierung interessanter. Die Patienten erreichen den Arzt nachdem der

Infarkt eingetreten ist und während der ischämischen Phase. Der Arzt könnte nun während der

Wiedereröffnung des Verschlusses in den Herzkranzgefäßen Maßnahmen ergreifen, die eine

Postkonditionierung des Myokards initiieren und eventuell das Outcome des Patienten verbessern.

In vielen wesentlichen Schritten entspricht die Signalkaskade, die eine Postkonditionierung bewirkt,

der der Präkonditionierung. Ein wesentlicher Unterschied ist aber nötig, wenn man die grobe

Unterteilung der Präkonditionierung in Initialisierung, Memory-Phase und Effektor-Phase

berücksichtigt. Bei der Postkonditionierung ist keine Memory-Phase nötig, da Initialisierung und

Effekt zeitlich nicht durch eine Ischämiephase getrennt werden.

Wie bei der Präkonditionierung wird der Schutz des Myokards auch bei der Postkonditionierung

durch eine Beeinflussung der mPTP vermittelt (60).

Einleitung

13

1.4.4. Pharmakologische Konditionierung

Die oben beschriebenen Phänomene der Prä- bzw. Postkonditionierung haben die kurzen repetitiven

ischämischen Episoden als Auslöser des kardioprotektiven Signals. Neben diesen als ischämische

Prä- und Postkonditionierung bekannten Verfahren sind auch pharmakologische Auslöser bekannt.

Es ist möglich, auf verschiedenen Stufen der involvierten Signalkaskade durch exogene Gabe der

Botenstoffe oder ihrer Analoga und Mimetika die protektive Signalkaskade zu stimulieren und so

einen Schutz im Myokard hervorzurufen.

Beispiele sind die Gabe von Opioiden oder Adenosin, welche schon auf der Ebene der

Zellmembranrezeptoren die Signalkaskade aktivieren, oder andere Pharmaka, wie die

Phosphodiesterase-5 Inhibitoren.

Applikationsdauer und -zeitpunkt variieren je nach Substanz. Generell unterscheidet man auch bei

der pharmakologischen Konditionierung eine Prä- und Postkonditionierung.

1.5. Kardioprotektion durch Phosphodiesterase-5 Inhibitoren

1.5.1. Phosphodiesterasen

Die zyklischen Nukleotide cAMP oder cGMP sind in viele Reaktionen in Zellen involviert und

stellen eine wichtige Gruppe von Botenstoffen dar. Synthetisiert werden sie aus ihren

entsprechenden Triphosphaten, ATP oder GTP. Die zyklischen Nukleotide werden von

Phosphodiesterasen (PDE) abgebaut. Diese hydrolysieren die zyklischen Nukleotide (38).

Es sind unterschiedliche Phosphodiesterasen bekannt. Sie werden in drei Klassen unterteilt, wobei

alle in Wirbeltieren exprimierten Phosphodiesterasen der Klasse 1 angehören. Die im menschlichen

Organismus vorkommenden Phosphodiesterasen werden wiederum in zwölf Familien unterteilt und

durchnummeriert. Innerhalb dieser Familien gibt es noch einige Splicevarianten. Zum einen

unterscheiden sich die PDEs in Affinität und Aktivität, Regulation und im bevorzugten Substrat.

Zum anderen werden sie in den Geweben des Körpers unterschiedlich exprimiert (61). Da sich

diese Arbeit mit einem Hemmstoff der Phosphodiesterase-5 beschäftigt, wird im Folgenden nur

genauer auf die Phosphodiesterase-5 eingegangen.

Die PDE-5 gehört wie die PDEs 6 und 9 zu den cGMP spezifischen Phosphodiesterasen. Sie wird in

den glatten Muskelzellen, im Corpus cavernosum des Penis und in den Zellen des Myokards

exprimiert. Die PDE-5 ist im Zytosol lokalisiert; in Myozyten konnte eine Lokalisation in den Z-

Banden nachgewiesen werden (15).

Einleitung

14

1.5.2. PDE-5-Inhibitoren

Bekannt wurden die PDE-5-Inhibitoren durch die Indikation der erektilen Dysfunktion (12). Eine

weitere Indikation ist der pulmonale Hochdruck (42).

Durch eine Hemmung der PDE-5 wird der Abbau des cGMP gebremst und somit der intrazelluläre

cGMP-Spiegel erhöht. Durch diesen Effekt verstärken die PDE-5-Inhibitoren die Wirkung des

cGMP im Organismus. Im Penis bedeutet dies, dass eine verstärkte und verlängerte cGMP-

Konzentrationserhöhung die Arteriolen des Schwellkörpers weiter und länger dilatieren und den

Einstrom des Blutes in den Schwellkörper fördert (39). Dadurch wird eine Erektion bei Patienten

mit erektiler Dysfunktion unterstützt. Unter dieser Indikation sind die PDE-5-Inhibitoren zu einer

etablierten, in den Massenmedien vielfach diskutierten Therapie geworden.

Der erste auf dem Markt verfügbare PDE-5-Inhibitor war Sildenafil (Viagra®, Pfizer AG).

Mittlerweile sind zwei weitere Substanzen erhältlich: Taldalafil (Cialis®, Lilly Pharma) und

Vardenafil (Levitra®, Bayer Healthcare). Die Substanzen sind nach einer Arbeit von Carson et al.

(13) auch bei Patienten mit kardiologischen Vorerkrankungen einsetzbar.

Die pharmakodynamischen Eigenschaften der genannten PDE-5-Inhibitoren sind bezüglich der

Rezeptorselektivität und Rezeptoraffinität unterschiedlich. Vardenafil zeigt die beste Selektivität

und grösste pharmakologische Potenz.

Das die PDE-5-Inhibitoren auch zur Konditionierung von Myokardzellen geeignet sind, konnte

Ockailis Gruppe (14; 15) erstmals nachweisen. Es wird davon ausgegangen, dass die erhöhten

cGMP-Spiegel in den Zellen eine Aktivierung der Proteinkinase G zur Folge haben (37). Diese

initiiert dann die weiteren Signale der oben beschriebenen Kaskade und sollte so einen Schutz des

Myokards gegen Ischämie-Reperfusionsschäden verursachen. Salloum et al. konnten diesen

protektiven Effekt für die Reperfusion nachweisen. Weiterhin gelang es ihnen, diese

Postkonditionierung durch 5-Hydroxydecanoat (5-HD), einen mitoKATP-Kanal-Blocker, zu

hemmen. Dies legt nahe, dass der mitoKATP-Kanal an der Signalvermittlung durch PDE-5-

Inhibitoren beteiligt ist (66).

Zuvor wurde gezeigt, dass die Öffnung des mitoKATP-Kanals durch die PKG vermittelt wird (16).

Zusammengefasst kann man davon ausgehen, dass der Effekt des Vardenafil über eine cGMP-

Erhöhung mit konsekutiver Aktivierung der PKG und dadurch bedingter Öffnung des mitoKATP-

Kanals vermittelt wird.

Aufgabenstellung

15

2. Aufgabenstellung

Mit dieser Studie wollten wir die Wirkungsweise der PDE-5-Inhibitoren präzisieren.

Zum einen galt es, eine maximale Wirkdosis für isolierte Rattenherzen zu finden. Bisher waren in

der Literatur nur Dosisangaben zur Anwendung von Vardenafil in der Prä- oder

Postkonditionierung im in-vivo-Modell des Rattenherzens zu finden. Dabei handelt es sich um

Bolusgaben oder kontinuierliche intravenöse Infusion in eine periphere Vene des Versuchstiers.

Das heißt, Informationen über die letztliche Zieldosis an der Effektorzelle sind nicht bekannt.

Zum anderen haben wir die Wirkungsweise von Vardenafil durch den Einsatz verschiedener

Enzyminhibitoren untersucht. Die Arbeitsgruppen um Yellon und Salloum haben die Applikation

von Vardenafil mit verschiedenen Enzyminhibitoren kombiniert und so Teile der Signalkaskade,

über die die PDE-5-Inhibitoren ihre schützende Wirkung entfalten, identifiziert. So ist bekannt, dass

die PDE-5-Inhibitoren ihre Wirkung über den mitochondrialen ATP-abhängigen Kaliumkanal

mitoKATP-Kanal entfalten. Die genauen Schritte zur Aktivierung des mitoKATP-Kanal waren noch

zu beweisen.

Da cGMP-Analoga einen protektiven Effekt bezüglich Ischämie-Reperfusionsschäden auf das

Myokard haben, ist unsere Hypothese, dass Vardenafil seine schützende Wirkung durch die

Erhöhung des intrazellulären cGMP-Spiegels vermittelt.

Es gibt oft Situationen des Stoffwechsels, in denen eine cGMP-Erhöhung mit einer cAMP-

Erniedrigung einhergeht. Es ist ungeklärt, ob der cAMP/PKA-Signalweg zur Vermittlung des

schützenden Signals benötigt wird oder die cGMP-Level alleine für das schützende Signal

verantwortlich sind.

Material & Methoden

16

3. Material und Methoden

3.1. Materialien

3.1.1. Chemikalien, Medikamente, Gase

Stoff Firma, Sitz

Heparin-Natrium (25 000 I.E./5ml) B Braun Melsungen AG, Melsungen,

Deutschland

Thiopental-Natrium (Trapanal®, 0,5g/20ml

Durchstechflasche)

Altana Pharma Deutschland GmbH,

Konstanz, Deutschland

Aqua ad injectabile, 10ml B Braun Melsungen AG, Melsungen,

Deutschland

Natrium-Chlorid (NaCl) Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe,

Deutschland

Claycomb-Medium SAFC Bioscience; Lenaxa, USA

Glucose Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe,

Deutschland

2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazinyl)-

Ethansulfonsäure (HEPES)

Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe,

Deutschland

Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe,

Deutschland

Magnesiumsulfat (MgSO4) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Steinheim, Deutschland

Calciumchlorid (CaCl2) Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe,

Deutschland

Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4) Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe,

Deutschland

Kaliumchlorid (KCl) Carl Roth GmbH+Co. KG, Karlsruhe,

Deutschland

Vardenafil-Chlorid (Levitra®) Bayer Health Care, Leverkusen,

Deutschland

1H-[1,2,4]Oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one (ODQ) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,


Material & Methoden

17

N!-Nitro-L-Arginin Methyl Ester Hydrochlorid (L-

NAME)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH,


KT5823 Sigma-Aldrich Chemie GmbH,


8-(4-Chlorophenylthio)-Guanosin 3",5"-zyklisches

Monophosphat Salz (8-pCPT-cGMP)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH,


2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (Tetrazolium) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,


Flourescent Polymer Microspheres (Diam. 3-8#m), 1g Duke Scientific Corp., Palo Alto, CA,

USA

Carbogen (5%O2, 95%CO2) Air Liquide Deutschland GmbH,

Düsseldorf, Deutschland

Ethanol (96%, MEK-vergällt) Universitätsapotheke Greifswald

Formaldehyd, 70% Sigma-Aldrich Chemie GmbH,


3.1.2. Verbrauchsmaterial

Chirurgische Naht, Greenfil, PET-Faden,

geflochten, unbeschichtet 2/0 USP, DRT18, 70cm

Catgut GMBH, Markneukirchen,

Deutschland

Chirurgischer Faden, Greenfil PET-Faden,

geflochten, unbeschichtet 3/0 USP 50cm

Catgut GMBH, Markneukirchen,

Deutschland

Aluminium-Folie Toppits Melitta GmbH, Minden,

Deutschland

Druckerfolie, Lumocolor Ink Jet Transparent Film Staedtler, Nürnberg, Deutschland

Falcons 50ml Becton Dickinson Labware Europe, Le

Pont De Claix, Frankreich

Einmalspritze 5ml B Braun Melsungen AG, Melsungen,

Deutschland

Einmalspritze 20ml B Braun Melsungen AG, Melsungen,

Deutschland

Klebepflaster von der Rolle Leukosilk

Pipettenspitzen Becton Dickinson Labware Europe, Le

Pont De Claix, Frankreich

Material & Methoden

18

3.1.3. Geräte, Instrumente

3.1.3.1. Langendorffanlage

Die Langendorffanlage dient der

Simulation eines Kreislaufs für ein

isoliertes Versuchstierherz. Die

Anlage muss die notwendigsten

Bedingungen des Kreislaufs

ersetzen, die das Herz benötigt. Das

heißt, es müssen Nährstoffzufuhr,

also die Perfusion der

Koronargefäße, und eine

Organtemperatur von 37°C, der

Körpertemperatur entsprechend,

sichergestellt werden. Außerdem

muss ein physiologischer pH-Wert

im Gewebe erhalten werden.

Nach der nachfolgend

Abb.6 Schematische Darstellung der Langendorffanlage A-C: Reservoirgefäße mit Pufferlösung D: Zufuhr für die Begasung der Puffer mit Carbogen E: Heizspirale F: 3-Wege-Hahn G: Gefäß mit isoliertem Herzen H: Auslass des Puffers dunkles Grau: Wasser in der Doppelwand der Analge, in Zirkulation durch eine Wärmepumpe (aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht mit dargestellt) helles Grau: Pufferlösung zur Perfusion des Herzens

Material & Methoden

19

beschriebenen Operation zur raschen Isolation des Herzens aus der Ratte wird das Herz in eine

Langendorffanlage, wie in Abbildung 6 schematisch dargestellt, eingespannt. Die Anlage besteht

aus drei Reservoirgefäßen (A bis C) die mit Pufferlösung befüllt werden. Die Gefäße haben eine

Doppelwand. Das Lumen der Wand ist an einen zirkulierenden Fluss einer Wärmepumpe (Haake

DC10-P5 open Bath Circulator Thermo Scientific, Waltham, USA) angeschlossen, so dass die

Pufferlösung temperiert werden kann. In jedem Puffergefäß ist ein Glaslöffel (D) mit einer porösen

Fläche platziert, über den Carbogen-Gas in feinen Blasen in die Pufferlösung geleitet werden kann.

Die Begasung mit Carbogen dient in Kombination mit dem im Puffer enthaltenen Puffersystem aus

Bicarbonat der Konstanz des pH-Wertes. Über ein Schlauchsystem sind alle drei Reservoire mit

einer Heizspirale (E) verbunden. Durch Abklemmen der Schläuche wird die Zufuhr aus den

verschiedenen Reservoiren geregelt. In der Heizspirale durchläuft der Puffer eine Glasspirale, die

wiederum von dem temperierten Wasser des Kreislaufs der Wärmepumpe umspült wird. Unterhalb

der Heizspirale befindet sich ein 3-Wege-Hahn (F). Dieser dient der Entnahme von Puffer zu

Analysezwecken. Beim Befüllen der Anlage ist es wichtig, keine Luftblasen im Schlauchsystem

zuzulassen. Luftblasen können während des Versuchs in das Herz geschwemmt werden und dort

eine unkontrollierte Ischämie induzieren. Das Herz, unterhalb des 3-Wege-Hahns befestigt, befindet

sich ebenfalls in einem beheizten doppelwandigen Behältnis mit Deckel, um die Organtemperatur

zu sichern. Das Behältnis ist mobil, so dass zur Montage des Herzens oder Biopsieentnahme ein

Zugang zum Herz geschaffen werden kann. Die Höhe der Reservoirgefäße von ca. 90cm oberhalb

des Herzens sorgt für den Perfusionsdruck.

Wurden lichtempfindliche Substanzen in den Versuchen eingesetzt, wurden die gläsernen

Reservoirgefäße, die Heizspindel und Schlauchsysteme mit Alu-Folie umwickelt.

Herstellung der Glasbehälter: Medizinisch-Glastechnische-Werkstätte, Berlin

3.1.4. Computersoftware

SigmaStat SPSS inc., Chicago USA

SigmaPlot SPSS inc., Chicago USA

MicrosoftExcel Microsoft Deutschland GmbH; Unterschleissheim,

Deutschland

ImageTool University of Texas Health Science Center, San

Antonio, TX, USA

Material & Methoden

20

3.1.5. Lösungen, Medien

Krebs-Henseleit-Puffer

modifiziert für Rattenherzen

- 117 mM Natriumchlorid (NaCl)

- 2,6 mM Kaliumchlorid (KCl)

- 1,2 mM Magnesiumsulfat (MgSO4)

- 1,2 mM Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4-)

- 25 mM HEPES

- 11mM Glukose

TBS (10x) - 80g Natriumchlorid (NaCl)

- 2 g Kaliumchlorid (KCl)

- 30g Tris-Base

- ad 1 l Aqua dest.

- einstellen auf pH 7,6

TBST - 100 ml TBS (10x)

- 1 ml Tween 20

- ad 1 l Aqua dest.

Mircospheren gelöst 125mg fluoreszierende polymere Microspheren in 50ml

physiologischer Kochsalzlösung

Physiologische Kochsalzlösung

(NaCl 0,9%)

- 9g Natriumchlorid (NaCl)

- ad 1 l Aqua dest.

PBS phosphate buffered saline, PAA, Pasching, Österreich

Fixierer Tetanal, Norderstedt

Blotentwickler Tetanal, Norderstedt

3.1.6. Tiere

Für die Studien wurden Ratten der Firma Harlan Laboratories Inc., Indianapolis, Indiana, USA,

verwendet. Die Tiere waren vom Stamm Wistar, weiblich und zum Zeitpunkt des Versuchs 3-4

Monate alt. Sie hatten ein Körpergewicht von 180 bis 200g.

Material & Methoden

21

3.2. Methoden

3.2.1. Rattenherzen-Isolation im Langendorffmodus

3.2.1.1. Vorbereitung der Langendorffanlage und des Operationsfeldes

Bevor das Herz aus der Ratte heraus isoliert werden kann, muss die Langendorffanlage vorbereitet

werden.

Modifizierter Krebs-Henseleit-Puffer (24) wird in den Reservebehältern der Anlage erwärmt und

mit Carbogen-Gas für 30 Min. begast. Dies dient der Anreicherung des Puffers mit Sauerstoff sowie

der pH-Regulation über die CO2-Zufuhr zu dem Natriumbicarbonat-haltigen Puffer. Nach 30 Min.

werden die Schläuche der Anlage mit Puffer gefüllt. Besondere Achtung gilt hier den Luftblasen in

den Schläuchen der Anlage. Diese müssen unbedingt herausgespült werden, um die Gefahr einer

Luftembolie im isolierten Herzen zu minimieren. Klemmen an den Schläuchen der Anlage

verschließen die Zufuhr des Puffers vorerst.

Eine Flasche mit 300ml physiologischer Kochsalzlösung wird im Tiefkühlschrank abgekühlt und

unmittelbar vor Beginn der Operation in die zwei Petrischälchen gefüllt.

3.2.1.2. Betäubung

Die Ratten wurden mit einer intraperitonealen Thiopental-Injektion betäubt (60mg/kg). Der

Thiopental-Injektion wurden 1000 Einheiten Heparin zugesetzt.

3.2.1.3. Operation

Zur Operation wurde die betäubte Ratte auf dem Rücken liegend an beiden Vorderläufen fixiert.

Der Thorax wurde mit Ethanol befeuchtet. Dies machte die Schnitte durch das Fell leichter und

besser steuerbar.

Das Fell wurde beginnend vom Processus xiphoideus beidseits bis in die Fossae axillares

eingeschnitten. Über dem Thorax wurde das Fell bis zum Halsansatz stumpf gelöst. Der nun frei

liegende Thorax und das Epigastrium wurden ebenfalls von kaudal her eröffnet. Zuerst wurde der

Bauchraum zwischen den beiden Rippenbögen geöffnet. Durch Erweitern der Öffnung nach lateral

durch die unteren Rippen und den Rippenbogen, wurde auch das Diaphragma pelvis lateral

beidseitig eingeschnitten. Die beiden lateralen Einschnitte im Diaphragma pelvis wurden nun

entlang des Ansatzes des Diaphragmas an der vorderen Brustwand verbunden.

Die Rippen wurden in der Axillarlinie durchtrennt. Der Thorax ließ sich nun durch Umschlagen der

ventralen Thoraxwand nach kranial leicht öffnen.

Das freiliegende Herz wurde mit zwei Fingern angehoben. Starker Druck auf das Herz war dabei zu

vermeiden. In zwei groben Schnitten durch das obere Mediastinum wurde das Herz mitsamt

Material & Methoden

22

Thymus und angrenzenden Lungenteilen aus dem Thorax herausgeschnitten und in bereitstehende

Petrischälchen mit eisgekühlter physiologischer Kochsalzlösung gegeben.

Die Reste der Lunge wurden entfernt. Dann wurde mit den zwei anatomischen Pinzetten je ein

Lappen des großen, juvenilen Thymus gegriffen und vorsichtig durch Zug entfernt.

Unter dem Thymus lag nun der Aortenbogen mit den großen Gefäßabgängen von Truncus

brachiocephalicus, A. carotis communis sinistra und A. cephalica frei. Unmittelbar proximal des

Abgangs des Truncus brachiocephalicus wurde die Aorta etwa im 90° Winkel zur Gefäßwand mit

der Schere durchtrennt.

Die so aufpräparierte Aorta ascendens wurde mit den beiden anatomischen Pinzetten gegriffen und

aus dem Eiswasser heraus über den Konus der Langendorffanlage gezogen. Zu beachten war, dass

die Aorta nur wenige Millimeter über den Konus gezogen werden durfte, um nicht die

Aortenklappen mit dem Konus zu verletzen. Eine intakte, funktionsfähige Aortenklappe war

zwingend nötig, damit bei retrograder Perfusion der Aorta der Druck der Wassersäule der

Langendorffanlage nicht durch die defekte Aortenklappe entweichen konnte, sondern den Puffer in

den Abgang der Koronargefäße gedrückt hat.

Mit einer Pinzette wurden die Aorta und das Herz in Position gehalten, um dann mit der Bulldog-

Clamp die Aorta am Konus passager festzuklemmen. Der chirurgische Faden (3-0) wurde

genommen, um dann die Aorta um den Konus zu fixieren. Nun wurde die Klemme, die den

Schlauch der Reservoirgefäße verschloss, geöffnet. Schon nach wenigen Augenblicken Perfusion

mit Krebs-Henseleit-Puffer begann das Herz wieder zu schlagen. Stimulierende Maßnahmen waren

nicht nötig.

3.2.1.4. Handhabung an der Langendorffanlage

Während des Versuchs wurden die Umgebungsbedingungen für den Versuch regelmäßig

kontrolliert. Dazu gehörten Temperaturmessung am Herzen, pH-Wert-Kontrollen im Puffer und

Füllstand der Reservoirgefäße.

Je nach Protokoll wurde der Fluss in den Koronararterien gemessen. Da durch die retrograde

Versorgung des Herzens der gesamte Puffer, der den Abfluss der Anlage passierte, durch die

Koronarien geflossen sein musste, konnte man den Koronararterienfluss unterhalb der Anlage

messen. Dazu wurde ein Messzylinder (25ml) verwendet und so der Fluss in ml/Min. bestimmt.

Material & Methoden

23

3.2.1.5. Simulation der Ischämie

3.2.1.5.1. Global

Zur Simulation einer globalen Ischämie wurde der Zufluss zum isolierten Herzen komplett für 30

Min. verschlossen.

3.2.1.5.2. Regional

Mit der chirurgischen Naht (2-0) wurde ein Koronargefäß umstochen. Da am isolierten Herzen die

mit farblosem Puffer gefüllten Koronargefäße nicht sichtbar waren, habe ich mich beim Umstechen

am Auricula cordis sinistra orientiert. So wurde versucht, eine möglichst hohe Vergleichbarkeit

beim Umstechen zu erreichen. Da aber je nach Herz unterschiedlich große Areale von der

regionalen Ischämie betroffen waren, wurde dies auch bei der Auswertung berücksichtigt. Der

Faden wurde dann 3-4cm oberhalb der Ein- bzw. Ausstichstelle abgeschnitten.

Zum Verschluss des Koronargefäßes wurden beide Enden des Fadens durch einen ca. 5mm langen

Polyethylenschlauch gefädelt. Dieser Schlauch wurde dann mit leichtem Druck auf das Myokard

gezogen und mit einem Nadelhalter festgeklemmt.

Eine erste Kontrolle, ob ein Koronargefäß erfolgreich verschlossen wurde, war die Veränderung des

Koronarflusses. Dieser wurde

immer vor und nach Beginn der

Ischämie gemessen und sollte

deutlich abfallen.

Durch Lösen des Nadelhalters

konnte die regionale Ischämie

leicht wieder aufgehoben

werden.

Nach der 30minütigen

Indexischämie wurden die

Herzen für 120 Min. an der Anlage reperfundiert. In dieser Zeit konnte sich der

Reperfusionsschaden ausprägen. Nach 120 Min. wurden die Herzen ausgewertet.

3.2.2. Infarktgrößenbestimmung

3.2.2.1. Regional

Am Ende des Versuchs wurde die Koronararterie mittels Polyethylenschlauch erneut verschlossen.

Dazu wurde zur Simulation der Ischämie wie oben beschrieben vorgegangen. 2,5ml der

Micropheres-Lösung wurden auf eine 5ml Einmalspritze gezogen. Die Spritze wurde an den 3-

Wege-Hahn über dem Konus der Langendorffanlage angesetzt und dort dann auf 5ml mit Puffer aus

Abb.7 Schematische Darstellung des Grundprotokolls der Infarktgrößenbestimmung an der Langendorffanlage. Nach einer 30minütigen Einschlagphase schließt sich die 30 Min. Indexischämie an, gefolgt von 120 Min. Reperfusion.

Material & Methoden

24

der Anlage aufgezogen. Die Zufuhr von Krebs-Henseleit-Puffer wurde unmittelbar über der

Wärmespirale der Anlage abgeklemmt und die Microspheres in das Herz gespritzt. Sie verteilten

sich nun in dem Gewebe, welches der regionalen Ischämie nicht ausgesetzt war (32).

Das Herz wurde nun abgenommen, und mit handelsüblicher Aluminium-Folie eingewickelt, und für

30-45 Min. bei -20°C gefroren.

Mit einer Rasierklinge wurde das Herz in ca. 1mm dicke Scheiben geschnitten. Die Herzscheiben

wurden in einer Lösung aus 125mg Tetrazolium in 25ml PBS in einem Erlenmeyerkolben für 8

Min. im Wasserbad bei 37°C inkubiert. Da Tetrazolium von vitalem Gewebe reduziert wird, färbte

sich das vitale Gewebe dabei tief rot. Infarziertes Gewebe war nicht in der Lage, das Tetrazolium zu

reduzieren und stellte sich daher nach der

Färbung weiß bis beige dar (30).

Zur Fixierung der Färbung wurden die

Herzscheiben in 70%igem Formaldehyd

für mindestens 1 Stunde inkubiert.

Zur exakten Auswertung wurden die

Herzscheiben zwischen zwei

Glasscheiben fixiert. Dabei wurden die

Scheiben so angeordnet, dass jeweils die

dem Apex abgewandte Seite nach oben

zeigte.

Um eine Auswertung von Gesamtgröße

des Herzen, Größe des Risikoareals, und

Größe des letztlich an der Ischämie zu

Grunde gegangenen Areals zu bestimmen, wurde auf die Glasscheibe eine transparente Folie gelegt,

auf die mit verschiedenen Farben die genannten Areale übertragen wurden. Das Risikoareal wurde

unter UV-Licht angezeichnet. Im UV-Licht fluoreszierten die am Ende des Versuches in den Nicht-

Risikoteil eingespritzten polymeren Microspheres. Das Risikoareal stellte sich also als der nicht

fluoreszierende Teil der Herzscheiben dar.

Die Herzscheiben und die Folie mit den übertragenden Arealen wurden mit einem Referenzmaßstab

mittels eines Scanners digitalisiert und mit dem Programm ImageTool® quantitativ ausgewertet.

Die Zielgröße des Infarkts wurde in Prozent am Risikoareal angegeben, um so Unterschiede in der

Größe des Risikoareals gegenüber einer Angabe in Quadratzentimetern auszugleichen. Für diese

Auswertung wurde eine mit MicrosoftExcel entwickelte Auswertevorlage verwendet.

Abb.8 Oben vor blauem Grund: eingescannte Herzschnitte; unten die dazu gehörige Folie mit den zur Auswertung übertragenden Arealen. Zur Skalierung ist ein mit eingescanntes Zentimetermaß abgebildet. Das linke Bild zeigt ein ischämisch konditioniertes Myokard, das rechte einen Infarkt ohne Konditionierung.

Material & Methoden

25

3.2.2.2. Global

Die Auswertung erfolgte wie die der regionalen Ischämie, nur war eine Bestimmung und

Berücksichtigung des Risikoareals natürlich nicht nötig. D.h. das Einspritzen von Microspheres am

Ende des Versuchs entfiel. Der Infarkt wurde in Prozent am linken Ventrikel angegeben.

3.2.2.3. Durchgeführte Protokolle

Infarktgrößenbestimmung bei regional induzierter Ischämie wurde mit folgenden Protokollen

durchgeführt.

Zum einen wurden Herzen, wie oben geschildert, nach einer Einschlagphase von 30 Min. und einer

Indexischämie ohne weitere Intervention nach 120 Min. Reperfusionsphase analysiert

(schematische Darstellung in Abbildung 9).

Abb.9

Neben dieser Kontrollgruppe wurde Vardenafil in verschiedenen Dosierungen vor und nach der

Ischämie infundiert. Präischämische Behandlung erfolgte für 20 Min. unmittelbar vor der Ischämie,

postischämische Gabe wurde 5 Min. vor Ende der Indexischämie begonnen und für die Dauer der

Reperfusion fortgesetzt. Eingesetzt wurden in Prä- und Postkonditionierung die Dosierungen 1, 10,

100nM sowie 1µM (schematische Darstellung in Abbildung 10).

Material & Methoden

26

Abb.10

Diese Gabe von Vardenafil in der Dosierung 10nM wurde durch verschiedene Enzyminhibitoren

ergänzt: N!-Nitro-L-Arginin-Methyl-Ester-Hydrochlorid (L-NAME), ein Inhibitor der eNOS in

200#M (49), 1H-(1,2,4)oxadiazolo(4,3-a)quinoxalin-1-one (ODQ), einen Guanylatcyclase-Blocker

in 10µM (50) sowie KT5823 in 1µM einen Inhibitor der PKG (51). Die Infusion des Blockers

wurde 5 Min. vor Beginn der Vardenafil-Gabe, also 10 Min. vor Ende der Indexischämie begonnen.

Die Inhibitoren wurden alle auch ohne gleichzeitige Vardenafil-Gabe analysiert (schematische

Darstellung in Abbildung 11).

Abb.11

Material & Methoden

27

Das cGMP-Analogon 8-pCPT-cGMP wurde in einer Konzentration von 10µM und 100µM für die

ersten 20 Min. der Reperfusion, begin nend 10 Min. vor Ende der Indexischämie eingesetzt. Die

Konzentration von 10µM wurde mit einer Gabe von 1µM Vardenafil für die Dauer der Reperfusion

ergänzt (schematische Darstellung in Abbildung 12).

Abb.12

3.2.3. Biopsie-Entnahme

Die Entnahme von Biopsien aus dem isolierten Rattenherzen erweitert die Möglichkeiten zur

Analyse der untersuchten Phänomene erheblich. Wir haben die entnommenen Biopsien zur cGMP-

Level Bestimmung verwendet. Die Entnahme der Biopsien erfolgte dabei immer mit der gleichen

Technik. Zum einen ist es mit unserer Methode möglich, in einem Herzen zu zwei

unterschiedlichen Zeitpunkten eine Probe zu entnehmen, zum anderen ist es möglich mehrere

Herzen nach unterschiedlichen Protokollen zu einem definierten Zeitpunkt zu vergleichen.

Die Isolationsoperation unterschied sich nicht von der oben beschriebenen Technik zur

Infarktgrößenbestimmung. Da aber am isolierten Herzen bei regional induzierter Ischämie nicht

während des laufenden Versuches das Risikoareal markiert werden konnte, war nur eine global

induzierte Ischämie sinnvoll. Proben konnten vor, während oder nach der Ischämie entnommen

werden.

Zur Entnahme haben wir einen modifizierten Zahnarztbohrer verwendet. Der Bohrkopf wurde

durch einen angeschliffenen Hohlzylinder mit 3mm Durchmesser ersetzt. Im Inneren des

Bohrzylinders konnte durch über eine angeschlossene elektrische Pumpe ein Über- bzw.

Unterdruck erzeugt werden. Dies diente der Entnahme bzw. Abgabe der Probe.

Material & Methoden

28

Wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten Biopsien entnommen, so war die erste Biopsie nahe dem

Apex zu entnehmen. Da die Herzkranzgefäße aus der Aorta in der Ebene der Herzklappen

entspringen und von dort aus bis zur Herzspitze herunterziehen, war mit einer Entnahme der ersten

Biopsie am Apex des Herzens eine Versorgungsstörung des Areals der zweiten, später entnommen

Probe minimiert.

Die Biopsien wurden unmittelbar nach Entnahme in flüssigem Stickstoff gefroren und je nach

Fragestellung weiter aufgearbeitet.

Für diese Arbeit haben wir nach 30 Min. Einschlagphase und 30 Min. Ischämie bei Minute 20 der

Reperfusion die Biopsien entnommen. Dabei wurde zum einen ein Protokoll ohne weitere

Pharmakazugabe verwendet, zum anderen haben wir den cGMP-Level bei einer Zugabe von 10nM

und 1µM Vardenafil analysiert.

3.2.4. cGMP-Level Bestimmung

Die Proben für die cGMP-Level Bestimmung hat in freundlicher Zusammenarbeit das Labor von

Bayer Healthcare, Wuppertal analysiert. Wir haben die Proben entnommen und auf Trockeneis

gekühlt per Expresskurier verschickt.

3.3. HL-1-Zelllinie

3.3.1. Zellkultivierung

Die Kultivierung der HL-1-Zellen (41) wurde mit Claycomb-Medium durchgeführt, welches mit

10% (v/v) FCS, 100#g/ml Streptomycin, 100u/ml Penicillin und 1nM L-Glutamin angereichert

wurde. Zur Kultivierung wurden 75cm3 große Kulturflaschen verwendet, wobei die 20ml Medium

pro Flasche täglich gewechselt wurden. Die Kulturflaschen wurden in einem Brutschrank bei 37°C

und Begasung mit 95% O2 und 5% CO2 bebrütet.

Das Splitten der Zellkultur haben wir durchgeführt, sobald der Boden der Flasche mikroskopisch

dicht mit Zellen bewachsen war, also circa alle vier bis fünf Tage. Zum Splitten einer Kulturflasche

wurde nach Entfernung des Kulturmediums im nächsten Schritt mehrfach mit 10ml D-PBS

gewaschen. Um die Zellen trennen zu können, wurden sie mit Trypsin vom Flaschenboden gelöst.

Dazu wurden 5ml Trypsin-EDTA bei 37°C für 10 bis 15 Min. appliziert. Durch gründliches

Resuspensieren wurde die Zellablösung mechanisch unterstützt. Je 0,5ml der Suspension aus Zellen

und Trypsin wurden dann in eine frische Kulturflasche, in der 20ml angereichertes Kulturmedium

vorgelegt waren, übertragen. Das Medium stoppte die Aktivität des Trypsins und verhinderte so

Zellschäden durch zu lange Einwirkdauer des Trypsins.

Material & Methoden

29

3.3.2. Messungen der PKG-Aktivität mittels Westernblotting

Zur Durchführung der Westernblot-Analysen wurden die HL-1 Zellen in 6-Well-Platten ausgesät

und über 24 Stunden dort angewachsen. Zuvor sind die Zellen wie zum Splitten der

ausgewaschenen Zellkulturflaschen mittels Trypsin-EDTA vom Flaschenboden gelöst worden.

Wirkstoffe konnten direkt mit dem Medium auf die Zellen gegeben werden. In dieser Arbeit

wurden neben einer Kontrollgruppe ohne Wirkstoffzugabe, Gruppen nach Zugabe von je Vardenafil

oder KT5823 alleine sowie Vardenafil in Kombination mit KT5823 untersucht.

Nach 80 Min. Einwirkdauer wurde das (mit Wirkstoff versehene) Medium entfernt und durch 200#l

eiskalten Lysispuffer ersetzt. Der Lysispuffer wurde zuvor mit 1mM PMSF versetzt. Die Wells

wurden mit einem Zellschaber geerntet. Zum Abtrennen der zytosolischen Proteine wurde die

geerntete Suspension in Eppendorfgefäßen 15 Min. bei 13000rpm unter 4°C zentrifugiert. Der

Überstand, der die zytosolischen Proteine enthielt, wurde dann in ein weiteres Eppendorfgefäß

übertragen.

Mittels eines BCA-Protein-Analyse-Kits wurde im Vergleich zu einer Eichreihe der Proteingehalt

der Proben gemessen. Auf dieser Grundlage wurde jede Probe zum Westernblotting auf 50#g

standardisiert, um einen quantitativen Vergleich in der Auswertung zu ermöglichen. Durch

Gelelektrophorese im SDS-PAGE Gel wurden die Proteine nach ihrer molekularen Masse

aufgetrennt. Durch Anlegen eines elektrischen Gradienten wurden die aufgetrennten Proteine auf

die Nitrozellulosemembran übertragen und so immobilisiert.

Auf den Nitrozellulosemembranen konnten nun durch den Einsatz spezifischer Antikörper Proteine

detektiert werden. Durch den Einsatz eines sekundären Fluoreszenz-Antikörpers gegen das Fc-

Fragment des primären Antikörpers konnten nun durch Chemilumineszenz die Banden des Proteins,

gegen das sich der primäre Antikörper richtete, detektiert werden. Die Fluoreszenz war direkt

proportional zur Menge des Proteins in der Probe. Bei identischer Gesamtproteinmenge in jeder

Gel-Tasche war auch eine direkte Relation zum Anteil am zytosolischen Protein der Zellkultur

gegeben.

Wir haben Antikörper gegen das Vasodilatator-stimulierte Phosphoprotein verwendet. Dieses

Protein wird durch die PKG phosphoryliert (64).

3.4. Statistik

Die statistische Auswertung wurde mittels SPSS SigmaStat durchgeführt. Zum Vergleich der

Versuchsgruppen wurden ein One-Way-ANOVA mit Fisher`s LSD post hoc angewendet. Als

statistisch signifikant wurde ein P < 0,05 angesehen. Die Mittelwerte der Gruppen sind jeweils mit

dem Standardfehler (Standard Error of the Mean, SEM) angegeben.

Ergebnisse

30

4. Ergebnisse

4.1. Kontrolle der Indexischämie und ischämische Prä- und

Postkonditionierung


Zur Etablierung des Modells in der Ratte wurde eine Serie von Herzen nur der Indexischämie von

30 Min. ausgesetzt und keiner schützenden Behandlung zugeführt. Diese Gruppe diente dem

Nachweis der Wirksamkeit der Indexischämie in dem Modell der isolierten Rattenherzen an der

Langendorffanlage. Die alleinige Indexischämie hatte eine Infarktgröße von 45,76 +/- 2,03% am

Risikoareal zur Folge.

Wurden die Herzen mit einer ischämischen Präkonditionierung (IPC) durch 5 Zyklen von 30 Sek.

globaler Ischämie und 30 Sek. Perfusion vorbehandelt, so konnte die mittlere Infarktgröße im

Risikoareal auf 14,85 +/- 1,88% gesenkt werden, was einer statistisch signifikanten Reduktion

entsprach (P <0,001).

Ein Protokoll, um eine ischämische Postkonditionierung auszulösen, wurde mit einer repetitiven

Ischämie von 12 x 30 Sek. nach der Indexischämie durchgeführt. Allerdings konnte die

Infarktgröße durch dieses Protokoll nicht gesenkt werden und lag bei 42,16 +/- 3,60% am

Risikoareal.

Graphische Darstellung in Abbildung 13; tabellarische Übersicht der Daten in Tabelle 1.

Kontrolle Ischämische

Präkonditionierung

Ischämische

Postkonditionierung

49,2 15,8 43,5

36,7 18,4 32,0

54,7 13,8 41,8

43,8 22,1 31,7

52,6 9,1 54,9

45,3 11,9 53,1

41,1 12,5 38,1

49,0 14,2

39,5 5,3 Infa

rktg

röße

in

% a

m R

isik

oare

al

25,4

Durchschnitt

+/- SEM

45,76

+/- 2,03

14,85

+/- 1,88

42,16

+/- 3,60

Tabelle 1

Ergebnisse

31

4.1.2. Koronarfluss

Durch die ischämische Präkonditionierung wurde der koronare Fluss zu Beginn der Ischämie

gegenüber den anderen Gruppen angehoben. Unmittelbar nach Beendigung der Ischämie zeigten

die konditionierten Herzen einen gesteigerten Koronarfluss. Es ergab sich zu den jeweiligen

Messzeitpunkten keine statistisch signifikante Differenz, lediglich ein Trend war erkennbar. Im

weiteren Verlauf glichen sich die Flussraten an.


Abb.13 Dargestellt sind die Einzelwerte und der jeweilige Gruppendurchschnitt mit Standardfehler der unbehandelten Kontrollgruppe und der Gruppen der ischämischen Prä- (IPC) und Postkonditionierung (IPostC).

= Einzelwert eines Versuchs = Gruppendurchschnitt mit Standardfehler

= Signifikante Reduktion gegenüber der Kontrollgruppe Eine ischämische Präkonditionierung verringert die Infarktgröße signifikant zur Kontrollgruppe, die durchgeführten Postkonditionierung nicht.

Ergebnisse

32

Zeitpunkt

Protokoll

Beg

inn

Ein

schl

agen

End

e

Ein

schl

agen

Beg

inn

Isch

ämie

End

e

Isch

ämie

Rep

erfu

sion

5’

Rep

erfu

sion

60’

Rep

erfu

sion

120’

Kontrolle 12,3 ± 0,7 8,4 ± 1,4 4,9 ± 0,7 4,6 ± 0,7 8,6 ± 0,7 6,3 ± 1,0 5,5 ± 0,8

IPC 11,5 ± 0,5 8,2 ± 0,5 7,6 ± 0,9 5,6 ± 0,9 10,9 ± 0,6 6,5 ± 0,6 0,58 ± 0,6

IPostC 10,8 ± 2,1 6,3 ± 1,7 4,2 ± 1,4 4,0 ± 1,3 9,7 ± 1,7 6,0 ± 1,8 4,6 ± 1,7

Tabelle 2

Abb.14 Darstellung der Veränderungen des durchschnittlichen Koronarflusses unter ischämischer Prä- und Postkonditionierung. Statistisch signifikante Unterschiede bestanden nicht.

regionale

Ischämie

Ergebnisse

33

4.2. Präkonditionierung durch Vardenafil


Es wurden verschiedene Konzentrationen von Vardenafil für 20 Min. unmittelbar vor der

Indexischämie gegeben. Beginnend mit 1nM wurden 10nM, 100nM und 1!M appliziert. Es konnte

gezeigt werden, dass man mit der Gabe von 10nM Vardenafil für 20 Min. vor der ischämischen

Phase einen sicheren Schutz für das Myokard erzeugen kann. Wurde die Konzentration von

Vardenafil verringert oder erhöht, so verringerte sich die protektive Wirkung des Vardenafils.

Allerdings waren gegenüber der alleinigen Ischämie die Reduktionen der Infarktgröße in allen

Gruppen statistisch signifikant. Ein signifikanter Unterschied war auch zwischen der Gabe von

10nM Vardenafil und der Gabe von 100nM oder 1µM Vardenafil gegeben.


Vardenafil 20’ vor regionaler Indexischämie Globale

Ischämie

1nM 10nM 100nM 1µM 10nM

25,7 19,9 37,4 31,5 30,0

13,0 24,6 22,7 25,2 24,0

29,6 24,7 19,1 41,7 23,6

38,4 16,5 32,5 35,5 15,2

38,4 17,9 32,2 42,2

25,7 24,5

Infa

rktg

röße

in

% a

m

Ris

ikoa

real

25,0

Durchschnitt

+/- SEM

28,47

+/- 3,89

21,87

+/- 1,39

30,98

+/- 3,11

33,47

+/- 3,47

27,00

+/- 4,47

Tabelle 3

Ergebnisse

34

4.3. Postkonditionierung durch Vardenafil


Wurde Vardenafil für die Zeit der Reperfusion nach der Indexischämie appliziert, zeigte sich eine

ähnliche Dosis-Wirkungskurve wie bei Gabe vor der Indexischämie. Ein Maximum an protektiver

Wirkung konnte wieder für 10nM Vardenafil in der Pufferlösung gezeigt werden, welche als

einzige Dosis eine signifikante Reduktion der Infarktgröße zur Kontrolle zeigte (P<0,001).

Abb.15 Dargestellt sind die Einzelwerte und der jeweilige Gruppendurchschnitt mit Standardfehler der unbehandelten Kontrollgruppe, der Gruppe der ischämischen Präkonditionierung sowie der Gruppen der unterschiedlichen Vardenafildosis bei regional induzierter Ischämie. Ganz rechts dargestellt ist die Gruppe mit 10nM Vardenafil bei global induzierter Ischämie.


= Signifikante Reduktion gegenüber der Kontrollgruppe

Ergebnisse

35

Erhöhung bzw. Verminderung der Konzentration führte ebenfalls zu einer signifikanten Zunahme

der durchschnittlichen Infarktgröße in Prozent am Risikoareal.


Vardenafil Kontrolle

1nM 10nM 100nM 1µM

49,2 34,9 33,8 51,1 45,0

36,7 46,7 28,8 40,0 56,6

54,7 29,3 33,3 26,3 43,0

43,8 33,3 18,0 44,8 52,3

52,6 34,9 22,2 35,1 35,5

45,3 51,8 21,0 33,7 30,9

41,1

49,0

Infa

rktg

röße

in

% a

m R

isik

oare

al

39,5

Durchschnitt

+/- SEM

45,76

+/- 2,03

38,48

+/- 3,57

26,18

+/- 2,74

38,50

+/- 3,58

43,88

+/- 3,97

Tabelle 4

Ergebnisse

36

4.3.2. Koronarfluss

Die Analyse der durchschnittlichen Flüsse in den Koronargefäßen zeigte, dass die schützende Dosis

Vardenafil (10nM) den Koronarfluss leicht gesteigert hat. Bei weiterer Dosiserhöhung konnte ein

weiterer Anstieg des Koronarflusses beobachtet werden. Gegenüber der Kontrollgruppe ergab sich

ein statistisch signifikanter Unterschied für die Gruppe mit 1!M Vardenafil zum Ende der

Ischämiephase (p=0,007), Minute 5 der Reperfusion (p=0,008) und Minute 60 der Reperfusion

(p<0,001). Gegenüber 10nM Vardenafil war die Gruppe mit 1!M Vardenafil zu Minute 5 der

Reperfusion (p=0,047) signifikant different.


Abb.16 Darstellung der Infarktgrößen gegenüber der nicht konditionierten Kontrollgruppe. Vardenafil erreicht die durchschnittlich kleinsten Infarktgrößen bei einer Dosis von 10nM. Höhere oder niedrigere Dosen reduzieren die Infarktgröße nicht signifikant.


= Signifikante Reduktion gegenüber der Kontrollgruppe = Signifikante Differenz zur Gruppe mit 10nM Vardenafil

Ergebnisse

37

Zeitpunkt

Protokoll

Beg

inn

Ein

schl

agen

End

e

Ein

schl

agen

Beg

inn

Isch

ämie

End

e

Isch

ämie

Rep

erfu

sion

5’

Rep

erfu

sion

60’

Rep

erfu

sion

120’

Vardenafil 1nM 13,3 +/- 0,3

9,6 +/- 1,7 6,2 +/- 0,5 5,8 +/- 0,8 10,6 +/- 2,2

7,6 +/- 1,2 5,6 +/- 0,8


7,6 +/- 0,9 6,0 +/- 1,9 5,8 +/- 1,9 9,2 +/- 1,6 8,3 +/-1,7 6,6 +/- 2,0


9,1 +/- 1,0 5,5 +/- 0,5 6,7 +/- 0,9 11,1 +/- 1,5

9,3 +/- 1,1 8,2 +/- 1,3

Vardenafil 1µM 12,5 +/- 0,9

8,8 +/- 1,1 4,8 +/- 0,4 9,1 +/- 0,8 13,9 +/- 1,1

12,2 +/- 1,4

10,3 +/- 1,7

Tabelle 5

Abb.17 Darstellung des durchschnittlichen Koronarflusses unter der Gabe von Vardenafil in unterschiedlichen Dosen. Vardenafil erhöht den Fluss im Vergleich zur Kontrollgruppe.

regionale Ischämie

Ergebnisse

38

4.4. Enzyminhibitoren

4.4.1. L-NAME

Durch Blockade der endothelialen NO-Synthase durch Gabe von L-NAME war es nicht möglich,

ein durch Vardenafil ausgelöstes protektives Signal zu blockieren. Die Gabe von 200!M L-NAME

während der Reperfusion mit 10nM Vardenafil führte weiterhin zu einer signifikant kleineren

Infarktgröße (35,33%) im Vergleich zu der Gabe von Vardenafil allein.

Die alleinige Infusion von 200!M L-NAME in der Reperfusion beeinflusste die Infarktgröße nicht

(43,57%).


L-NAME VAR + L-NAME

39,2 36,4

40,6 26,4

50,9 42,4

31,8

30,2

Infa

rktg

röße

in

% a

m

Ris

ikoa

real

44,8

Durchschnitt +/- SEM

43,57 +/- 3,69

35,33 +/- 2,94

Tabelle 6

Ergebnisse

39

4.4.2. ODQ

Die Applikation von ODQ in der Reperfusion zur Inhibition der NO-sensitiven Guanylatcyclase hat

den Schutz durch Vardenafil blockiert. Im Vergleich zur alleinigen Gabe von Vardenafil war die

durchschnittliche Infarktgröße mit 43,97 +/- 1,78% signifikant (P<0,001) erhöht. Die alleinige Gabe

von ODQ in der Reperfusion (39,92 +/- 3,93%) hat die Infarktgröße nicht beeinflusst.


Abb.18 Darstellung der Infarktgrößen nach Gabe von L-NAME. Vardenafil 10nM zeigt in Kombination mit L-NAME einen signifikanten unterschied zur Gabe von Vardenafil 10nM alleine. Die Gabe von L-NAME alleine beeinflusst die Infarktgröße nicht.


= Signifikante Differenz gegenüber 10nM Vardenafil

Ergebnisse

40

Vardenafil 10nM + ODQ ODQ

50,6 31,6

40,9 36,5

47,0 50,0

42,7 41,6

38,4

Infa

rktg

röße

in

% a

m

Ris

ikoa

real

44,2

Durchschnitt

+/- SEM 43,97

+/- 1,78 39,92

+/- 3,93

Tabelle 7

Abb.19 Darstellung der Versuchsgruppen unter Gabe von ODQ. Die Kombination von Vardenafil 10nM mit ODQ zeigte einen signifikanten Unterschied zur Gabe von Vardenafil 10nM alleine.



Ergebnisse

41

4.4.3. KT5823

Die Inhibition der PKG durch Gabe von KT5823 in der Reperfusion hat den durch Vardenafil-

Applikation induzierten Schutz blockiert. Die durchschnittliche Infarktgröße am Risikoareal war

mit 42,53 +/- 1,85% signifikant verändert zur Gabe von Vardenafil alleine, aber nicht verändert zur

Kontrollgruppe. Die isolierte KT5823 Gabe während der Reperfusion hat die Infarktgröße nicht

signifikant beeinflusst (45,33 +/- 1,34%).


KT5823 Vardenafil + KT5823

48,9 35,4

44,6 42,3

42,5 41,5

44,7 49,3

41,9

Infa

rktg

röße

in

% a

m

Ris

ikoa

real

44,7

Durchschnitt +/-

SEM 45,33

+/- 1,34

42,53 +/- 1,85

Tabelle 8

Ergebnisse

42

4.4.4. Koronarfluss Enzyminhibitoren

Die Zugabe der Enzyminhibitoren in Kombination mit Vardenafil (10nM) oder alleine veränderte

die Flussrate der Pufferlösung in den Koronarien nicht signifikant gegenüber der Gruppe Vardenafil

(10nM) oder der unbehandelten Kontrollgruppe.


Abb.20 Darstellung der Versuche mit der Kombination von Vardenafil 10nM und KT5823. Signifikant größere Infarkte waren durch die Kombination von KT5823 mit Vardenafil 10nM im Vergleich zu Vardenafil 10nM alleine zu beobachten.



Ergebnisse

43

Zeitpunkt

Protokoll

Beg

inn

Ein

schl

agen

End

e

Ein

schl

agen

Beg

inn

Isch

ämie

End

e

Isch

ämie

Rep

erfu

sion

5’

Rep

erfu

sion

60’

Rep

erfu

sion

120’

L-NAME 13,7 +/- 0,7

8,8 +/- 1,4 5,7 +/- 1,2 5,2 +/- 1,2 7,7 +/- 1,5 5,7 +/- 1,3 4,5 +/- 0,9

L-NAME + VAR 13,0 +/- 0,7

6,9 +/- 0,3 4,0 +/- 0,3 3,6 +/- 0,1 7,4 +/- 0,3 5,7 +/- 0,3 4,7 +/- 0,4

ODQ 10,8+/- 2,2

7,5 +/- 3,5 5,0 +/- 3,0 2,5 +/- 0,6 5,5 +/- 1,0 5,0 +/- 0,6 3,8 +/- 0,2

ODQ + VAR 11,3 +/- 1,0

5,8 +/- 0,6 3,9 +/- 0,5 3,8 +/- 0,4 7,2 +/- 0,6 5,4 +/- 0,5 4,3 +/- 0,2

KT5823 11,6 +/- 1,5

5,4 +/- 0,5 3,8 +/- 0,4 3,3 +/- 0,2 6,5 +/- 0,5 3,1 +/- 0,3 2,3 +/- 0,2

KT5823 + VAR 12,0 +/- 0,9

8,2 +/- 1,7 4,8 +/- 0,9 3,9 +/- 0,5 7,5 +/- 0,5 3,6 +/- 0,3 2,5 +/- 0,1

Tabelle 9

Abb.21 Darstellung der Entwicklung des Koronarflusses unter Gabe der Enzymblocker alleine und in Kombination mit Vardenafil 10nM.

regionale Ischämie

Ergebnisse

44

4.5. Analogon 8-pCPT-cGMP

Die Gabe von 10!M 8-pCPT-cGMP für 20 Min. nach der Indexischämie senkte die Infarktgröße im

Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant (26,45 +/- 4,15%). Eine Erhöhung der Dosis auf 100!M

zeigte eine Reduktion dieses Effektes (34,82 +/- 3,16). Die Kombination von Vardenafil 1!M mit

10!M 8-pCPT-cGMP hatte keine Reduktion der Infarktgröße zur Folge (42,53 +/- 3,75).

Bezüglich des Koronarflusses ergab sich eine statistisch signifikante Differenz im Vergleich zur

unbehandelten Kontrollgruppe für die mit 100!M 8-pCPT-cGMP behandelten Herzen zum Ende

der Ischämiephase (p=0,011), zu Minute 5 der Reperfusion (p= 0,002) und zu Minute 60 der

Reperfusion, sowie für die Gruppe der Kombination aus Vardenafil 1!M und 8-pCPT-cGMP 10!M

zum Ende der Ischämiephase (p=0,009) und Minute 5 der Reperfusionsphase (p=0,011). Statistisch

signifikant unterschiedlich im Vergleich zur Gruppe mit 10nM Vardenafil war lediglich die Gruppe

mit 100!M 8-pCPT-cGMP zu Minute 5 der Reperfusion (p=0,014).

Graphische Darstellung in Abbildung 22 & 23; tabellarische Übersicht der Daten in Tabelle 10 &

11.

8-pCPT-cGMP 10µM 8-pCPT-cGMP

100µM

8-pCPT-cGMP 10µM

+ VAR1µM

22,3 43,0 55,5

30,6 28,8 39,3

36,4 45,2

31,1 39,3

Infa

rktg

röße

in

%

am R

isik

oare

al

33,3

Durchschnitt +/- SEM 26,45 +/- 4,15

34,82 +/- 3,16

42,53 +/- 3,75

Tabelle 10

Ergebnisse

45

Zeitpunkt

Protokoll

Beg

inn

Ein

schl

agen

End

e

Ein

schl

agen

Beg

inn

Isch

ämie

End

e

Isch

ämie

Rep

erfu

sion

5’

Rep

erfu

sion

60’

Rep

erfu

sion

120’

8pCPT-cGMP 10µM 13,0 +/- 1,0

6,3 +/- 1,2

4,0 +/- 0,5

5,3 +/- 0,7

11,5 +/- 1,0

6,8 +/- 0,7

4,3 +/- 0,2

8pCPT-cGMP 100µM 12,4 +/- 1,1

6,6 +/- 0,2

4,8 +/- 0,2

9,6 +/- 0,6

15,4 +/- 0,9

6,6 +/- 0,2

4,5 +/- 0,3

Vardenafil 1µM +

8pCPT-cGMP 10µM

12,8 +/- 0,9

7,6 +/- 0,7

4,5 +/- 0,2

9,3 +/- 1,1

13,9 +/- 1,1

7,1 +/- 0,2

5,3 +/- 0,3

Tabelle 11

Abb.22 Darstellung der Versuchsgruppen mit dem cGMP-Analogon 8-pCPT-cGMP.



Ergebnisse

46

Abb.23 Entwicklung des Koronarflusses der Versuchsserien mit dem cGMP-Analogon 8-pCPT-cGMP.

regionale Ischämie

Ergebnisse

47

4.6. cGMP-Level

Die Analyse der Biopsien der Ventrikel mittels eines ELISAs in den Laboren der Bayer Health Care

AG Wuppertal ergab, dass der intrazelluläre cGMP-Level im Vergleich zur Kontrolle bei Gabe von

1µM Vardenafil signifikant ansteigt (p<0,001). Die in der Infarktgrößenanalyse protektive Dosis

von 10nM verursachte keinen signifikanten Anstieg des intrazellulären cGMPs.

Graphische Darstellung in Abbildung 24.

Kontrolle Vardenafil 10nM Vardenafil 1!M

Abb.24 Durchschnittliche intrazelluläre cGMP-Level: ganz links die Kontrollgruppe ( ) ohne

Vardenafilzugabe im Puffer. In der Mitte unter Zugabe vom 10nM Vardenafil ( ) und rechts unter Applikation von 1!M Vardenafil ( ).

= statistisch signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe.

Ergebnisse

48

4.7. HL-1 Zellen Vardenafil VASP-Blot

Die Behandlung von HL-1 Myozyten mit Vardenafil führte zu einem signifikanten Anstieg der

Phosphorylierung von VASP an Ser239 am Gesamt-VASP im Vergleich zur Kontrollgruppe

(p=0,03).

Die gleichzeitige Gabe von KT5823, einem PKG-Inhibitor, verhinderte einen Anstieg der

VASP-Phosphorylierung als Zeichen der PKG-Aktivität.

Applikation von KT5823 alleine verursachte keine Veränderungen zur Kontrollgruppe ohne

Behandlung.

Graphische Darstellung in Abbildung 25.

Abb.25 Signifikanter Anstieg des Anteils von phosphoryliertem VASP unter Applikation von Vardenafil. Die Gabe von KT5823 in Kombination mit Vardenafil und die Gabe von KT5823 allein zeigten keinen signifikanten Unterschied zur Kontrollmessung.

Diskussion

49

5. Diskussion

5.1. Dosisfindung

Vardenafil hat einen schützenden Effekt auf das Myokard gegenüber einem Ischämie-

Reperfusionsschaden. Dass die Klasse der PDE-5-Inhibitoren protektiv wirkt, wurde erstmals 2002

von Ockailis Gruppe am Wirkstoff Sildenafil gezeigt (14; 65). In der Literatur sind mit Vardenafil

bisher nur in vivo Versuche am Rattenherzen durchgeführt worden (66). Eine Ermittlung der an der

Myokardzelle protektiv wirkenden Dosis in einem isolierten Herzmodell fehlte. Die Dosis-

Wirkungsbeziehung zeigte kein einfach proportionales Verhältnis. Es konnte ein maximaler Effekt

für die Dosis von 10nM Vardenafil demonstriert werden. Eine Reduktion der Dosis auf 1nM bzw.

eine Erhöhung auf 1!M zeigte keinen protektiven Effekt mehr. Diese Dosis-Wirkungsbeziehung

unterstreicht, dass die Konditionierung des Myokards ein sehr sensitiver Prozess ist. Ein möglicher

Zusammenhang kann hier mit der koronaren Flussrate gesehen werden. Unsere Messungen zeigten,

dass eine weitere Erhöhung der Vardenafil-Dosis über die maximal protektive Dosis von 10nM

hinaus zu einer weiteren Steigerung des Koronarflusses führt. Möglicherweise wird durch zu hohe

Flussraten in der Reperfusion eine zu schnelle Normalisierung der Homöostase des Gewebes

hervorgerufen. Diese könnte, unter Berücksichtigung der in der Einführung dargelegten Prozesse,

während der Reperfusion einen Zellschaden begünstigen.

Zur Verwendung der PDE-5-Inhibitoren im Bereich der Myokardprotektion gegen Ischämie-

Reperfusionsschäden kam es, da gezeigt wurde, dass die Gabe von cGMP-Analoga die Infarktgröße

signifikant reduzieren kann (62).

Die Inhibitoren der PDE-5 sind eine Medikamentenklasse, die mittlerweile über eine breite

klinische Erprobung verfügt. Unter der Indikation der erektilen Dysfunktion werden diese

Medikamente nun seit einigen Jahren weit verbreitet eingesetzt und konnten in diesem Bereich

einen therapeutischen Erfolg erzielen. Durch die breite Anwendung von Sildenafil und seinen

Analoga in der Praxis kann man nun davon ausgehen, dass dies ein klinisch sicher anzuwendender

Wirkstoff ist. Auch wenn die medikamentöse Myokardprotektion noch lange nicht in der Klinik

angekommen ist, schien es Erfolg versprechend, gerade diese klinisch sicheren Medikamente auf

myokardprotektive Effekte zu untersuchen.

Einige vorausgehende Arbeiten zeigten, dass die Expression der PDE-5 im Myokard erfolgt. Dies

wurde an Myokardzellen der Ventrikel von Mäuse- und Kaninchenherzen gezeigt (38; 69; 70). Die

Phosphodiesterasen sind Enzyme, die in vielen Geweben des Körpers in unterschiedlichen

Isoformen exprimiert werden. Sie alle hydrolysieren zyklische Triphosphate, welche an diversen

intrazellulären Signalwegen beteiligt sind, um diese abzubauen. Die PDE-5 besitzt eine relativ hohe

Diskussion

50

Spezifität für zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP). Eine Hemmung der PDE-5 hat daher

eine Erhöhung des intrazellulären cGMP-Spiegels zur Folge.

In Kombination mit der Tatsache, dass die Gabe von zellmembranpermeablen cGMP-Analoga

einen Schutz vor Ischämie-Reperfusionsschäden induziert und dem Nachweis der PDE-5 im

Herzmuskelgewebe schien es logische Konsequenz, dass die PDE-5-Hemmer protektiv wirken

könnten. Dieser Nachweis erfolgte dann durch Ockaili et al. mit Sildenafil als Vertreter der PDE-5-

Inhibitoren.

Nachdem 2002 erstmals der protektive Effekt der PDE-5-Inhibitoren gezeigt wurde, wurden weitere

Studien angeschlossen. Für andere Wirkstoffe der PDE-5-Hemmer, unter anderem Vardenafil,

konnte der myokardprotektive Effekt nachgewiesen werden. Die PDE-5-Inhibitoren wurden in

diesen Studien aber vor Induktion einer Ischämie, also als Präkonditionierung, gegeben.

Nun ist aus schon in der Einleitung dieser Arbeit dargelegten Gründen die Postkonditionierung

interessanter als die Präkonditionierung. 2007 konnten Salloum et al. nachweisen, dass die Gabe der

PDE-5-Inhibitoren auch bei Applikation in der Reperfusion wirkt.

Bisher waren alle Studien mit Vardenafil in in-situ Modellen durchgeführt worden. Das heißt, eine

Dosis für Vardenafil im Herzen an der Langendorffanlage war bisher nicht bekannt. Unsere

Ergebnisse zur Dosisfindung zeigen einen maximalen schützenden Effekt bei der Gabe von 10nM

Vardenafil. Erstaunlicherweise wurde durch Steigerung der Dosis nicht der Anteil der überlebenden

Myozyten erhöht, sondern verringert. Wie der Verlust dieses schützenden Effekts zu erklären ist, ist

strittig. DuToit und Mitarbeiter erzielten mit der Gabe von 50nM Sildenafil einen schützenden

Effekt an Myozyten (67). Schon durch Verdoppelung der Dosis wurde aber ebenfalls ein Verlust

der schützenden Wirkung beobachtet. Durch die gefäßrelaxierende Wirkung der PDE-5-Hemmer

am ganzen Kreislauf war die Frage, ob der Verlust eines schützenden Effekts der PDE-5-Hemmer

nicht durch einen zu starken Abfall des systemischen Blutdruckes und einer damit resultierenden

verminderten Koronardurchblutung zu erklären ist. Im isolierten Herzen an der Langendorffanlage

konnten wir aber einen gegenteiligen Effekt feststellen. Zum einen ist am isolierten Herzen der

Perfusionsdruck in den Koronarien innerhalb eines kleinen Rahmens konstant. Zum anderen haben

wir durch Messung des Koronarflusses zeigen können, dass eine höhere Dosis an Vardenafil den

Koronarfluss erhöht, aber keinen schützenden Effekt mehr ausübt. Ob eine zu hohe Dosis

Vardenafil alleine eine Zelle schädigt, ist unklar. Vorstellbar wäre, dass der unter Vardenafil stark

erhöhte Koronarfluss in der Reperfusion schädigt. Wir konnten zeigen, dass eine Steigerung der

schützenden Dosis des cGMP-Analogons 8-pCPT-cGMP auch mit einem Wirkungsverlust

einhergeht. Die Zugabe der Überdosis Vardenafil (1µM) zu einer schützenden Dosis von 8-pCPT-

cGMP zeigt keine Reduktion der Infarktgröße. Ein erhöhter Koronarfluss könnte ein beschleunigtes

Diskussion

51

Auswaschen der in der Ischämie gebildeten Metabolite verursachen und so einen gesteigerten

Gradienten verschiedener Elektrolyte und des pH-Wertes zwischen intra- und extrazellulärem

Raum bedingen. Dieser würde den Stress für die Myozyten verstärken, was durch eine

Myokardkonditionierung nicht ausgeglichen werden kann. Um diese Theorie zu beweisen, wären

weitere Untersuchungen nötig.

5.2. eNOS

Es ist bekannt, dass die endotheliale NO-Synthase (eNOS) in die Signalwege der Konditionierung

des Myokards gegen Ischämie-Reperfusionsschäden eingebunden ist. Sie wird durch die Kinase

Akt aktiviert (68) und produziert dann Stickstoffmonoxid NO, welches in der Zelle verschiedene

Effekte hat. Unter anderem konnte nachgewiesen werden, dass NO die Guanylatcyclase aktiviert.

Eine aktive Guanylatcyclase und damit stattfindende Produktion von cGMP könnte als

Vorausetzung für eine Wirkung eines PDE-5-Inhibitors zur Konditionierung nötig sein. Unter

Einsatz des spezifischen eNOS-Inhibitors L-NAME reduzierte sich der schützende Effekt des

Vardenafil signifikant. Mit der bisher veröffentlichten Literatur ist dieses Ergebnis zum Teil

widersprüchlich. Nakano et al. konnten ex vivo keine Blockade eines mittels eines NO-Donator

ausgelösten Schutzes erzielen (36). Aus Untersuchungen im Rahmen einer pharmakologischen

Konditionierung mit Bradykinin ist aber bekannt, dass die eNOS-Blockade mit L-NAME eine

Infarktgrößenreduktion verhindern kann (33; 35). In Versuchen an isolierten HL-1 Zellen konnte

meine Kollegin U. Donat im Rahmen ihrer Diplomarbeit ebenfalls zeigen, dass ein durch

Vardenafil induzierter Schutz durch L-NAME induzierte eNOS Blockade gehemmt wird.

5.3. Guanylatcyclase & cGMP

Die Guanylatcyclase produziert das cGMP, deren Abbau durch Vardenafil gehemmt wird. Das

bedeutet, dass Vardenafil auf die Aktivität der Guanylatcyclase angewiesen ist, um einen Schutz in

der Zelle hervorzurufen. Sollte kein cGMP produziert werden, könnte auch eine Hemmung des

Abbaus nicht zu einem erhöhten cGMP-Spiegel führen.

In dieser Arbeit wurde die Guanylatcyclase mittels ODQ direkt gehemmt. Die Applikation von

ODQ unterdrückte das schützende Signal von Vardenafil im isolierten Rattenherzen bei einer

Konzentration von 10µM. Dies lässt zwei Schlussfolgerungen zu: Zum einen ist Vardenafil zur

Vermittlung seines protektiven Effektes auf eine aktive Guanylatcyclase angewiesen. Denn nur im

Falle einer aktiven cGMP-Produktion kann durch eine Hemmung des Abbaus von cGMP der

cGMP-Spiegel erhöht werden. Zum anderen scheint Vardenafil sein schützendes Signal nicht auf

anderem Wege als durch die Erhöhung des cGMP-Levels vermitteln zu können. Es wäre sonst

denkbar, dass Vardenafil keine absolute Spezifität für die PDE-5 besitzt und so z.B. auch den

Diskussion

52

cAMP-Spiegel anheben könnte und so einen weiteren Angriffspunkt zur Vermittlung eines

schützenden Signals hätte. Sollte dies der Fall sein, würde dieser Signalweg entweder im weiteren

Verlauf der Kaskade ebenfalls über die Guanylatcyclase vermittelt werden, oder er existiert nicht.

Die Ergebnisse der intrazellulären cGMP-Spiegelmessungen, welche einen signifikanten Anstieg

erst bei Zugabe nicht mehr protektiver Dosen zeigen, erscheinen zunächst widersprüchlich.

Entscheidend ist, in welchem Zellkompartiment der cGMP-Level sein schützendes Signal

vermittelt. Castro et al. konnten zeigen, dass die PDE-5, das Ziel des Vardenafils, vornehmlich die

löslichen, zellmembrannahen Anteile des cGMP beeinflusst (40). Eine mögliche Hypothese, welche

den Verlust des schützenden Signals durch hohe Gaben von Vardenafil erklären könnte, wäre, dass

eine exzessive Gabe, wie die Dosis von 1!M, die Selektivität des Vardenafils beeinträchtigt.

Dadurch würde der cGMP-Level in weiteren Zellkompartimenten angehoben und in Folge ein nicht

schützendes, bzw. schädigendes Signal vermittelt.

5.4. Proteinkinase G

Es gibt Studien, die zeigen konnten, dass ein durch Gabe von cGMP-Analoga induzierter

Myokardschutz gegen Ischämie-Reperfusionsschäden durch die Proteinkinase G (PKG) vermittelt

wird (62). Durch einige Versuche mit 8-pCPT-cGMP, einem zellpermeablen cGMP-Analogon

konnte gezeigt werden, dass unser Modell am isolierten Rattenherzen diese Ergebnisse bestätigt.

In weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die PKG ihr Signal wiederum auf den

mitochondrialen ATP-abhängigen Kaliumkanal (KATP) direkt überträgt (43). Der mitoKATP-Kanal

ist für die Vermittlung des schützenden Signals in der Myokardzelle essentiell und inhibiert die

Öffnung der mPTP. Durch die Verwendung des selektiven PKG-Blockers KT5823 konnten wir das

durch Vardenafil induzierte Signal aufheben.

Des Weiteren konnten wir in HL-1 Zelllinien zeigen, dass die Gabe von Vardenafil die Aktivität der

PKG direkt stimuliert. Eine Phosphorylierung des VASP an der Stelle Ser239 gilt als

hochspezifischer Marker für eine Aktivität der PKG. Wir konnten in Westernblots mit Antikörpern

gegen das SER239 des VASP zeigen, dass eine Gabe von Vardenafil zu einer Erhöhung des

phospho-VASP-Anteils am gesamten VASP im Vergleich zu einer Kontrollgruppe ohne Vardenafil

im Medium führt.

Diese Ergebnisse mit Vardenafil und KT5823 im isolierten Rattenherzen und in der HL-1 Zelllinie

beweisen, dass Vardenafil bei der Vermittlung der Konditionierung auf die PKG angewiesen ist. So

kann ein Zusammenhang zwischen Vardenafil-Gabe und vielen weiteren untersuchten

Zusammenhängen der Signaltransduktion im Rahmen der Post- und Präkonditionierung hergestellt

werden.

Diskussion

53

5.5. Ischämische Postkonditionierung

Es liegt nahe, dass die Postkonditionierung aus klinischer Sicht das größere Interesse hervorruft, da

sie die Möglichkeit bietet, bei erfolgtem Koronarverschluss in der Akutbehandlung therapeutisch

tätig zu werden.

Auf Ebene der intrazellulären Signalkaskaden ergeben sich nur geringe Unterschiede. Die Zeit nach

der Indexischämie bis zur Konditionierung scheint essentiell zu sein. Während im Falle einer

Präkonditionierung entsprechende Signalkaskaden schon aktiviert wurden, müssen nun die

Signalkaskaden aktiviert werden, um einen irreversiblen myokardialen Schaden zu verhindern.

Während die pharmakologische Postkonditionierung mittels Vardenafil in der gleichen Dosis wie in

der pharmakologischen Präkonditionierung möglich war, ist es mir nicht gelungen, an isolierten

Rattenherzen einen durch repetitive Ischämien nach der Indexischämie induzierten Myokardschutz

zu erzeugen. Verschiedene Protokolle, variiert in der Anzahl der nach der Indexischämie erfolgten

Ischämieintervalle und in der jeweiligen Dauer der Intervalle, konnten keinen stabilen Schutz

induzieren. Dies deckt sich jedoch mit anderen Studien (57). Die Stärke des Stimulus sowie die Zeit

nach Indexischämie und die Intervallraten spielen eine entscheidende Rolle und sind je nach

Spezies unterschiedlich zu wählen (60).

Abschließend kann zusammengefasst werden, dass

Vardenafil ein potenter Wirkstoff der

pharmakologischen Konditionierung ist, seinen Effekt

aber nur in bestimmter Konzentration entfalten kann.

Die durch diese Arbeit unterstützte hypothetische

Signalkaskade stellt Abbildung 26 dar. Diese

Signalkaskade wird auch durch Ergebnisse im

Zellmodell meiner Kollegin U. Donat gestützt (34).

Das durch Vardenafil induzierte Signal wird durch

eine cGMP-Level-Erhöhung vermittelt. cGMP

wiederum stimuliert die Proteinkinase G. Diese ist bei

der Übermittlung des Signals auf die Zielstruktur

mPTP essentiell.

Abb.26 Vardenafil erhöht die intrazelluläre cGMP-Konzentration und induziert so ein Signal an die PKG.

Diskussion

54

5.6. Klinischer Nutzen

Die Übertragung der Ergebnisse dieser und anderer Laborarbeiten zum Thema der Ischämie-

Reperfusionsschäden in die klinische Praxis hat schon begonnen (60). Keine der bisher

veröffentlichten klinischen Studien nutzt einen PDE-5-Inhibitor.

Vorteile des Einsatzes der PDE-5-Inhibitoren wären die breite klinische Erprobung und Erfahrung

die mit dieser Stoffklasse unter der Indikation der erektilen Dysfunktion und des

pulmonalarteriellen Hochdrucks gesammelt wurde. Des Weiteren ist davon auszugehen, dass die

Substanzklasse in naher Zukunft kostengünstig zur Verfügung stehen wird. Der Patentschutz für

Sildenafil läuft 2012 aus und Generikapräparate sind zu erwarten (71).

Eine Schwierigkeit im klinischen Einsatz ergibt sich aus der U-förmigen Konzentrations-Wirkungs-

Kurve. Eine exakte, protektive Dosis im Patienten zu erzielen ist bei dieser engen therapeutischen

Breite schwierig. Selbst bei einer körpergrößenadaptierten Gabe ist durch interindividuelle

Stoffwechselunterschiede eine Schwankungsbreite der Dosis an der Zielzelle zu erwarten.

Zwar sind die PDE-5-Inhibitoren als sicheres Medikament anzusehen, aber eine Gabe in

Kombination mit NO-Donatoren ist kontraindiziert. NO-Donatoren spielen im Management von

Herz-Kreislauf-Erkrankungen zur Blutdrucksenkung eine wichtige Rolle. Viele Patienten werden

durch den Bedarf eines NO-Donators von einer PDE-5-Inhibitor-Gabe im Akutfall eines

Herzkreislaufereignisses ausgeschlossen.

Dennoch ist, auch nach der Einschätzung von Garcia-Dorado, der cGMP-Weg ein „wertvolles Ziel“

und „Schlüsselelement“ in der protektiven Konditionierung des Myokards (2).

Zusammenfassung

55

Zusammenfassung

Der Myokardinfarkt ist eine der wesentlichen Mortalitätsursachen in den westlichen

Industrieländern. Für das Outcome der Patienten nach Myokardinfarkt ist die Größe der

Infarktnarbe von prognostischer Bedeutung. Nach therapeutischer Rekanalisation des

betroffenen Herzkranzgefäßes entsteht durch einen aktiven Prozess eine Myokardnarbe.

Durch Perfusionsmanöver oder verschiedene Pharmaka vor und auch nach einem Infarkt lässt

sich die Ausprägung der Narbe beeinflussen und die Größe der Narbe reduzieren.

Zu diesen Pharmaka gehören die PDE-5-Inhibitoren, unter anderem Vardenafil. Die

Signalkaskade, welche das protektive Signal vermittelt, ist nur zu Teilen erforscht.

Diese Arbeit etablierte ein Modell in isolierten Rattenherzen, zeichnete eine

Dosisfindungskurve des protektiven Effektes von Vardenafil und konnte unter Einsatz

verschiedener Enzymblocker nachweisen, dass Vardenafil sein Signal über eine intrazelluläre

NO-Erhöhung und eine Aktivierung der Proteinkinase G vermittelt. Ferner konnte dargestellt

werden, dass der aus einer PDE-5-Inhibitoren-Gabe resultierende cGMP-Level-Anstieg

intrazellulär ein sensibler Faktor ist und ein überschießender Anstieg eine Myokardprotektion

verhindert.

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Eidesstattliche Erklärung

64

Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und

keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.

Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät, keiner anderen

wissenschaftlichen Einrichtung vorgelegt worden.

Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und

dass eine Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.

Datum

Unterschrift

Danksagung

67

Danksagung

PD Dr.med Thomas Krieg danke ich ganz besonders für die Einführung in wissenschaftliches

Arbeiten, die Betreuung dieser Arbeit und Geduld. Meinen Arbeitskollegen, Ulrike Donat, Heike

Richter, Karina Förster, Stefanie Franke und Thomas Rütz gilt ein großer Dank für die produktive,

tolle Zusammenarbeit und gegenseitige Motivation.

Professor Tetsuji Miura, Medical School der University Sapporo, Japan, möchte ich an dieser Stelle

für seine ansteckende Begeisterung für die Wissenschaft danken.

Ermöglicht haben diese Arbeit meine Eltern, die das zusätzliche Forschungssemester getragen

haben. Vielen Dank.

Besonderer Dank gilt meiner Frau Marlene.

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