Fortgeschrittenen-Praktikum der Fakultat fur

Physik,

Universitat Gottingen

Versuch B7

Bakterielle Motilitat

Praktikant: Magdalena KerstingVersuchspartner: Stephan Hannig, Johannes AuthE-Mail: magdalena.kersting@googlemail.comBetreuer: Teresa KaufeldVersuchsdatum: 17.11.2010Abgabedatum: 24.11.2010

Unterschrift:

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 3

2 Theorie 32.1 Bakterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32.2 Die optische Falle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32.3 Detektion der Teilchen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72.4 Kalibrierung der Falle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

3 Durchfuhrung 83.1 Versuchsaufbau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83.2 Versuchsdurchfuhrung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

4 Auswertung 104.1 Bestimmung der maximalen Kraft eines Bakteriums . . . . . . . . . . . . 104.2 Bestimmung der Rotationsfrequenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124.3 Deutung der Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

4.3.1 Rotationsfrequenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134.3.2 Kraft . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

4.4 Mogliche Fehlerquellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

5 Diskussion 14

6 Quellenangaben und Abbildungsverzeichnis 156.1 Quellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156.2 Abbildungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

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1 Einleitung

Im folgenden Versuch soll mit Hilfe einer optischen Falle die Bewegung von Bakterienuntersucht werden.Im Speziellen interessiert uns dabei zum einen die maximale Kraft, die ein Bakteri-um bei der Fortbewegung aufbringen kann und zum anderen die Rotationsfrequenz derFlagellen, die zur Fortbewegung dienen.

2 Theorie

2.1 Bakterien

Bakterien sind einzellige, prokariotische Mikroorganismen in der Großenordnung wenigerMikrometer.Um zu uberleben, nutzen Bakterien das Prinzip der Chemotaxis, also der von chemischenKonzentrationen abhangigen Bewegung, z.B. in Richtung von Nahrung oder weg vongiftigen Stoffen.Fur den Bewegungsprozess bedienen sich die meisten Bakterien sog. Flagellen.Flagellen sind Proteinfaden, die durch einen Motor an der Zellmembran in Bewegungversetzt werden.Man unterscheidet dabei zwei Arten der Fortbewegung (vgl. Abb. 1):

• die gerichtete Bewegung: Hierbei bewegen sich die Flagellen alle in die gleicheDrehrichtung und verbinden sich zu einem ’Zopf’, der wie ein Propeller wirkt unddas Bakterium in eine einzige Richtung bewegt.

• das Taumeln: Andert sich die Drehrichtung einer oder mehrerer Flagellen, solosen sich diese aus dem Flagellen-Propeller und das Bakterium taumelt zufalligin verschiedene Richtungen. (Diese Richtungsanderungen sind die Grundlage derChemotaxis.)

2.2 Die optische Falle

Wir betrachten den Laserstrahl als Strahl von einzelnen Photonen mit der EnergieE = hν und dem Impuls p = E

c, wobei h das Planksche Wirkungsquantum, ν die

Frequenz und c die Lichtgeschwindigkeit ist.Der Laserstrahl wird in guter Naherung durch ein Gauß-Profil beschrieben, das in Ab-bildung 2 veranschaulicht ist.Trifft der Strahl auf ein Teilchen (z.B. ein Bakterium oder auch eine Silikonperle), sowird er aufgrund der unterschiedlichen Brechungsindizes der Losung und des Teilchensgebrochen.

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Abbildung 1: Position der Flagellen bei der gerichteten Fortbewegung und beimTaumeln

Abbildung 2: Veranschaulichung eines Gauß-Strahls

4

Abbildung 3: Auftretende Krafte in der optischen Falle

Abbildung 4: Gleichgewichtszustand im Brennpunkt

Im Photonenbild entspricht das einer Impulsanderung ∆p, die uber den bekannten Zu-sammenhang

F =∆p

∆t

eine Kraft auf das Teilchen erzeugt.Diese Kraft kann in zwei Komponenten zerlegt werden:

• Die Streukraft ist die Kraft, die aufgrund von Reflexion in Richtung des einfal-lenden Lichts wirkt und das Teilchen aus der optischen Falle wegbewegt. DieseKraft sollte daher moglichst klein sein.

• Die Gradientenkraft stellt den erwunschten und uberwiegenden Kraftanteil dar,der das Teilchen in Richtung des Intensitatsmaximums (also entlang des Inten-sitatsgradienten) bewegt.

Die resultierende Kraft wirkt letztendlich zum Brennpunkt (vgl. hierzu Abb. 3), derauch gleichzeitig den Gleichgewichtspunkt (Abb. 4) darstellt.

Ist das Teilchen gefangen, so kann man sich des Federmodells bedienen, um die auf-tretenden Krafte zu beschreiben:Bewegt sich das Teilchen aus dem Gleichgewichtszustand, also dem Brennpunkt, soerfahrt es eine rucktreibende Kraft (durch in unserem Fall verallgemeinerte ’Federn’),

5

Abbildung 5: Darstellung der Potentialbarriere

die proportional zur zuruckgelegten Strecke ist. Diesen linearen Zusammenhang zwischenKraft F und Strecke x beschreibt das Hooksche Gesetz durch

F (x) = −kx.

Hierbei ist k die Federkonstante, die in unserem konkreten Fall naturlich von derLaserintensitat abhangt, d.h.

F (I, x) = −k(I)x.

Betrachtet man Abbildung 5, das das Teilchen in einem Potentialtopf zeigt, so erkenntman, dass es einen kritischen Abstand xmax gibt, ab dem die optische Falle keinenEinfluss mehr auf das Teilchen hat.Dieser Abstand hangt nicht von der Laserintensitat ab, sondern nur von der geringstenAusdehnung des Strahls (vgl. hierzu auch Abbildung 6), der sog. beam-waist, die vonder Wellenlange des Lichts bestimmt wird.

Mit dieser Erkenntnis konnen wir obige Gleichung umformulieren zu

F (I) = −k(I)xmax

und erkennen, dass die ausgeubte Kraft linear von der Laserintensitat abhangt.Diesen Zusammenhang werden wir fur unsere Versuchsdurchfuhrung und insbesondereAuswertung nutzen.

Unsere bisherigen Uberlegungen sind noch sehr allgemein gehalten, da wir noch nichtdas Verhaltnis der Wellenlange zur Teilchausdehnung d berucksichtigt haben.Hier unterscheidet man drei Falle:

6

Abbildung 6: Positionsbestimmung uber einen 4-Segment-Photodetektor

• optisches Regime (d� λ)Ist der Teilchendurchmesser sehr viel großer als die Wellenlange, so kann das Zu-standekommen der Fallenkraft alleine durch geometrische Uberlegungen der Optikbeschrieben werden.

• Rayleigh-Regime (λ� d)Ist der Teilchendurchmesser sehr viel kleiner als die Wellenlange, so muss man diezu fangenden Teilchen als Dipole beschreiben und die Fallenkraft wird uber dieLorentz-Kraft ermittelt.

• Ubergangsregime (λ ≈ d)In unserem Versuch haben wir keinen der beiden obigen Grenzfalle, sondern ar-beiten mit Teilchen deren Ausdehnung ungefahr der Wellenlange des Lichts ent-spricht. Hier ist eine mathematisch korrekte Beschreibung sehr aufwendig und esreicht meistens, sich nur mit den obigen Grenzfallen zu beschaftigen.

2.3 Detektion der Teilchen

Um eine genaue Detektion der eingefangenen Teilchen zu ermoglichen, nutzen wir einenPhotodetektor mit 4 Segmenten wie in Abbildung 6 dargestellt.Jedes Segment wandelt die Lichtreize in elektrische Signale um und uber die Stromunter-schiede jedes einzelnen Segments lasst sich die Position des Teilchens Nanometer-genauund mit einer Detektions-Geschwindigkeit von einigen dutzend kHz1 bestimmen.

2.4 Kalibrierung der Falle

Um die Federkonstante k(I) und die Detektorempfindlichkeit ermitteln zu konnen, mussenwir die optische Falle kalibrieren.Hierzu nutzen wir Silikon-Perlen, deren Brownsche Bewegung man relativ gut berechnenkann.

1Angaben aus [7]

7

Abbildung 7: Beispielhaftes Powerspektrum eines Teilchens in einer optischen Falle

Innherhalb der Laser-Falle wirkt neben der zufalligen Brownschen Bewegung auch dieRuckstellkraft der Falle.Im Power-Spektrum wird mittels Fouriertransformation die Teilchenbewegung vom Zeit-in den Frequenzraum transformiert und dargestellt. Man erwartet eine Lorentz-Kurveund fuhrt daher einen Lorentz-Fit durch, um die Federkonstante der Falle sowie die De-tektorempfindlichkeit zu bestimmen.Von besonderer Bedeutung ist hierbei die ’Eckfrequenz’ fc, die bei bekannter Dampfungskonstanteproportional zur gesuchten Federkonstante ist.2

3 Durchfuhrung

3.1 Versuchsaufbau

Abbildung 8 veranschaulicht den Versuchsaufbau:Die optische Falle ist eine Kombination aus einem gewohnlichen optischen Mikroskop(gruner Strahlengang) und der Laser-Falle (roter Strahlengang).Uber eine Spiegelanordnung trifft das Laserlicht auf einen dichroidischen Spiegel, der dasLicht in den Strahlengang des Mikroskops leitet. Das Objektiv fokussiert das Laserlichtauf die Probe und hinter dem Kondensor trifft das Licht auf einen zweiten dichroidischenSpiegel, der das Licht auf die vierfach-Photodiode lenkt, von wo die Signale an denComputer weitergegeben werden.Uber eine LED-Lichtquelle wird die Probe von unten beleuchtet und uber das Objektivwird das Licht auf den dichroidischen Spiegel gelenkt, der es zu einer CCD-Kameradurchlasst, so dass wir ein Bild der Probe am Monitor erhalten.

2Zur genauen Herleitung vgl. Appendix A in [7]

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Abbildung 8: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus

3.2 Versuchsdurchfuhrung

Unsere Versuchsdurchfuhrung gliedert sich in folgende Teile:

• Wir bauen Fließkammern, indem wir mit Hilfe von doppelseitigem Klebeband klei-ne Kanale auf Objekttrager setzen, die mit einem Deckglaschen abgedeckt werden.

• Etwa 10µm einer verdunnten Silikon-Perlen-Losung (die zuvor zur Trennung derPerlen in einem Ultraschallbad war) werden in die Kanale gegeben, ein TropfenImmersionsol auf die Kammer gesetzt und diese dann in das Mikroskop gespannt.

• Nachdem man auf die Perlen fokussiert hat, kann man diese mit Hilfe des Laserseinfangen - hierbei sollte man darauf achten, nur einzelne und nicht mehrere Perlenin der Laserfalle zu haben.

• Um die optische Falle zu kalibrieren, nehmen wir fur funf verschiedene Laserinten-sitaten und jeweils drei verschiedene Perlen fur etwa 10 Sekunden das Powerspek-trum auf und lassen das integrierte Programm einen Lorentz-Fit berechnen, deruns sowohl die Federkonstante als auch die Detektor-Empfindlichkeit ausgibt.

• Um die maximale Fallenreichweite zu bestimmen, suchen wir eine Perle, die an demDeckglaschen fest sitzt und fahren mehrere Male mit der Perle durch die optischeFalle. Wir erhalten einen (im Idealfall sinusformigen) Ausschlag, dessen Amplitudedie Fallenreichweite angibt.

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• Nach der Kalibrierung pipettieren wir wieder etwa 10µm einer verdunnten Bakterien-Losung3 in eine Fließkammer und geben die Probe in das Mikroskop.

• Wir fangen einzelne Bakterien und messen durch langsames Senken der Laserleis-tung, die Leistung, bei der das Bakterium entkommen kann. Hierbei sollte dasBakterium nicht zu lange hohen Intensitaten ausgesetzt sein und nach dem Verlas-sen der Falle noch weiter schwimmen. Das wiederholen wir fur etwa 10 Bakterien.

• Wahrend dem Einfangen der Bakterien nehmen wir gleichzeitig fur kurze Zeit einPowerspektrum auf, aus dem wir die Rotationsfrequenz als kleinen Peak zwischen50Hz und 300Hz entnehmen konnen.

4 Auswertung

4.1 Bestimmung der maximalen Kraft eines Bakteriums

Die bei der Kalibrierung der optischen Falle erhaltenen Werte fur die Detektorempfind-lichkeit und Federkonstante sind leider ohne Fehlerangabe, so dass eine Fehlerrechnungnicht moglich ist.Deshalb rechnen wir im folgenden ohne Fehler und schatzen diesen dann am Ende sinn-voll ab.Pro Laserintensitat haben wir fur 3 Perlen jeweils 2 Powerspektren (einmal fur die x-und einmal fur die y-Achse) aufgenommen, so dass wir pro Intensitat 6 Werte fur dieFederkonstante und Empfindlichkeit haben, aus denen wir den arithmetischen Mittel-wert bilden.Das ist in Tabelle 1 dargestellt.

Intensitat I [V] Federkonstante k [N/m] Empfindlichkeit E [m/V]1,4 8,52·10−6 1,96·10−6

1 1,29·10−5 9,90·10−7

0,75 7,74·10−6 6,67·10−6

0,5 6,50·10−6 2,44·10−6

0,25 4,38·10−6 4,62·10−6

Tabelle 1: Federkonstante und Detektorempfindlichkeit in Abhangigkeit der Intensitat

Aus den elf gemessenen Werten fur die maximale Fallenreichweite wahlen wir dengroßten mit 0,3V aus und konnen aus dem Produkt mit der Empfindlichkeit schließlichxmax bestimmen.Wir erhalten also fur jede Intensitat einen xmax-Wert, da die Empfindlichkeit ebenfallsintensitatsabhangig war und bilden am Ende das arithmetische Mittel von xmax, da xmax

3In dem Versuch arbeiten wir mit Pseudomona syringae.

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Abbildung 9: Federkonstante in Abhangigkeit der Laserintensitat

theoretisch nur von der Wellenlange des Lasers, aber nicht von der Intensitat abhangt.In Tabelle 2 sind die berechneten Werte aufgelistet.

Intensitat I [V] xmax(I) [m]1,4 5,89·10−7

1,0 2,97·10−7

0,75 2,00·10−6

0,5 7,32·10−6

0,25 1,39·10−6

xmax 1,00·10−6 m

Tabelle 2: Bestimmung von xmax mittels Detektorempfindlichkeit und Fallenreichweite

Um den allgemeinen Zusammenhang zwischen Federkonstante und Laserintensitatzu bestimmen, erstellen wir einen linearen Fit, der in Abbildung 9 dargestellt ist undbeschrieben wird durch

k(I) = 4, 72 · 10−6 · I + 4, 32 · 10−6.

Die Fehler sind hierbei gegeben durch σa = 3, 04 · 10−6 und σb = 2, 66 · 10−6.

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Mit der Kenntnis von k(I) sind wir nun in der Lage, die maximale Kraft, die einBakterium aufbringen kann, zu berechnen.Dies geschieht uber folgenden Zusammenhang:

F (I) = k(I) · xmax

D.h. bei bekanntem xmax hangt die Kraft linear von der Laserintensitat ab.Mit dem Fehlerfortpflanzungsgesetz erhalten wir

σF = xmax

√σ2aI

2 + σ2b .

In Tabelle 3 haben wir fur jedes Bakterium die maximale Kraft berechnet und schlus-sendlich durch Ubergang zum gewichteten Mittel die durchschnittliche Kraft, die einBakterium aufbringen kann, bestimmt.

Intensitat [V] F(I) [N] σF [N]0,15 5,04·10−12 2,70·10−12

0,05 4,56·10−12 2,67·10−12

0,3 5,74·10−12 2,82·10−12

0,05 4,56·10−12 2,67·10−12

0,15 5,04·10−12 2,70·10−12

0,15 5,04·10−12 2,70·10−12

0,2 5,27·10−12 2,73·10−12

0,15 5,04·10−12 2,70·10−12

0,05 4,56·10−12 2,67·10−12

0,25 5,51·10−12 2,77·10−12

Mittelwert F 5, 02 · 10−12 9 · 10−13

Tabelle 3: Kraft eines Bakteriums in Abhangigkeit der Intensitat

4.2 Bestimmung der Rotationsfrequenz

Insgesamt haben wir fur 15 eingefangene Bakterien die Rotationsfrequenz der Flagellenbestimmt.Wir gehen von einem Ablesefehler σs am Powerspektrum von 0,05 Skaleneinheiten aus,wobei man beachten muss, dass die Einteilung logarithmisch war, d.h. die Frequenz νvon der abgelesenen Strecke s gegeben ist durch

ν(s) = 10s

= es·ln(10).

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Damit erhalten wir mittels Fehlerfortpflanzung einen Frequenzfehler σν von

σν = σs · ln(10) · ν(s).

In Tabelle 4 sind unsere Messwerte sowie der gewichtete Mittelwert der Frequenzaufgelistet.

Frequenz ν [Hz] σν [Hz]60 6,91330 37,99280 32,24190 21,87110 12,6680 9,21112 12,89110 12,66110 12,66122 14,05133 15,3180 9,21125 14,39108 12,43130 14,97

Mittelwert ν (100±4)Hz

Tabelle 4: Rotationsfrequenz

4.3 Deutung der Ergebnisse

4.3.1 Rotationsfrequenz

In der Literatur findet man unterschiedliche Angaben zur Flagellen-Rotationsfrequenzeines Bakteriums.Diese variiert naturlich je nach Bakterienart und naturlich auch je nach Energiezufuhr,in Tabelle 5 ist unser Ergebnis mit Vergleichswerten aufgelistet.Man erkennt, dass wir sowohl mit unserer durchschnittlichen Rotationsfrequenz als auchmit unserem gemessenen Frequenzbereich (60Hz-330Hz) in einem guten Bereich liegenund sich unsere Ergebnisse mit den Literaturwerten decken.

4.3.2 Kraft

Ahnlich wie die Rotationsfrequenz wird auch die maximale Schubkraft eines Bakteriumssowohl von der Bakterienart als auch den außeren Umstanden (Energiezufuhr, Umge-

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Frequenz ν [Hz] Quelle100± 4 unser Messergebnis

270 fur E.Coli-Bakterien von [1], S.12100 Bakterienart nicht angegeben, [2], S.318

40-50 Bakterienart nicht angegeben, [3]100-280 Bakterienart nicht angegeben, [4]

Tabelle 5: Flagellen-Rotationsfrequenzen

bungsmedium,...) abhangen.[5] ermittelt fur die Bakterienart S. marcescens eine durchschnittliche Kraft von 0,45pNund [6] gibt fur Neisseria gonorrhoeae eine Kraft von 80pN an, die auch durch das Ver-fahren einer optischen Falle ermittelt wurde.Damit liegen wir mit ca. 5pN ebenfalls in einer realistischen Großenordnung.

4.4 Mogliche Fehlerquellen

Als Fehlerquellen im Versuch sind vor allem statistische Fehler durch Ableseungenau-igkeiten in der Intensitatsanzeige (die so klein und in nicht genugend Unterheinheiteneingeteilt war, dass man gerade den Betrag kleiner Ausschlage eher erraten als genauablesen konnte) und im Powerspektrum zu nennen, sowie die statistischen Fehler, diedurch den Versuchsaufbau selbst gegeben waren: das Mikroskop war nicht ausreichendvor Stoßen (z.B. durch einen dampfenden Tisch) geschutzt, die naturlich beim Mikro-skopieren und Ablesen der Werte unvermeidbar sind, so dass wir auch hier zusatzlicheFehler in den Ausschlagen erwarten.Zusatzlich kann eine mogliche Fehlerquelle im ungewollten Einfangen mehrerer Bakteri-en bzw. Perlen liegen, was wir aber versucht haben, zu vermeiden.Uber die Gute der systematischen Fehler bzw. mogliche Fehlerquellen der aus demLorentz-Fit erhaltenen Federkonstante und Empfindlichkeit konnen wir leider keine Aus-sage treffen, da diese Werte von vorneherein ohne Fehlerangabe ausgegeben werden.

5 Diskussion

Alles in allem bin ich mit dem Versuch und unseren erhaltenen Ergebnissen zufrieden.Die Versuchsdurchfuhrung und die Bedienung des Mikroskops waren einfach und intuitivund wir hatten keine großeren Probleme beim Einfangen der Silikon-Perlen/ Bakterien.Als negativen Punkt wurde ich hierbei nur die ungenaue Anzeige der Laserintensitaterwahnen, die es schwer gemacht hat, differenzierte Werte fur die Laserintensitat, die jafur viele Auswertungspunkte gebraucht wurde, abzulesen.Hinzu kommt naturlich auch die fehlende Angabe eines Fehlers fur die aus dem Lorentz-Fit ermittelten Werte fur Federkonstante und Empfindlichkeit, die eine sinnvolle Ein-

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ordnung der Ergebnisse durch eine genaue Fehlerrechnung erschweren.Das konnte und sollte in diesem Versuch verbessert werden.Ansonsten hat der Versuch gute Einblicke in die Funktionsweise einer optischen Falleund die biologischen Grundlagen der Bakterienfortbewegung gegeben.

6 Quellenangaben und Abbildungsverzeichnis

6.1 Quellen

• [1] ’Motion analysis of living cells’, David R. Soll, Deborah Wessels

• [2] ’Advances in Microbial Physiology’, Band 41, Robert K. Poole

• [3] http://de.wikipedia.org/wiki/Flagellum, 22.11.10, 8.21h

• [4] http://en.wikipedia.org/wiki/Flagellum, 22.11.10, 8.27h

• [5] ’Bacterial Flagella-Based Propulsion and On/Off Motion Control of Micros-cale Objects’, Bahareh Behkam and Metin Sitti, NanoRobotics Laboratory, De-partment of Mechanical Engineering, Carnegie Mellon University, Pittsburgh, PA15213, USA

• [6] ’Pilus retraction powers bacterial twitching motility’, Merz A, So M, Sheetz M(2000), Nature 407 (6800): 98–102.

• [7] ’How much force can one bacterium generate?’, Iwan Schaap, 3rd Institute ofPhysics, Georg August Universitat, Gottingen

6.2 Abbildungen

• Abbildung 1:http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/4/41/Bakterienperitrich Fortbewegung Taumeln.png, 22.11.10, 20.36h

• Abbildung 2:http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a9/Laser gaussian profile.svg,23.11.10, 12.16h

• Abbildung 3-8: ’How much force can one bacterium generate?’, Iwan Schaap, 3rdInstitute of Physics, Georg August Universitat, Gottingen

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