Vortrag MH 2012.ppt [Kompatibilitätsmodus] · 2013. 6. 18. · Schwämme (Porifera) Axinella...
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L E B ENSM I T T E LCHEM I E HAMBURG | F E S TVERANSTA LTUNG14 . J u n i 2013
COMPETENCE FOR FOODAWARDS 2012
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Washington DC
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U.S. Food and Drug Adminstration
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U.S. Food and Drug Adminstration
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DEVELOPMENT OF A MOLECULAR SUBTYPING METHOD &
PHYLOGENETIC AND GENETIC ANALYSIS OF VIBRIOISOLATES ASSOCIATED WITH MARINE SPONGE
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Gattung Vibrio
Vibrionaceae 91 Spezies
Gram‐negativ
Fakultativ anaerob
Stäbchenförmig
Polar begeißelte Bakterien
Halophil (salzliebend)
Natürlicher Bewohner der Meeresumwelt
Gelangen über Muscheln, Krebse und Fische in die Nahrungskette des Menschen
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Gattung Vibrio
Pathogen für Menschen, Fische, Korallen und Krusten‐ und Schalentiere
USA: jährlich 8028 Vibrio‐Infektionen (davon 5218 Lebensmittelinfektionen)
In Europa treten Vibrio‐Infektionen seltener auf
Erkrankungen an Vibrionen bedingten Wundinfektionen in
Mecklenburg‐Vorpommen, Schleswig Holstein, Dänemark,
Südschweden und den Niederlanden
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Gattung Vibrio
Gastroenteritische Infektionen
Wundinfektionen
Sepsis
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Gattung Vibrio
Verzehr von rohem oder unzureichend gegarten Meeresfrüchten oder kontaminiertem rohen Fisch
Sushi Garnelen Austern
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Vibrio cholerae
Weltgesundheitsorganisation schätzt 3‐5 Millionen Cholera‐Infektionen mit 100.000‐120.000 Toten jährlich
Haiti: Oktober 2010 ‐ Oktober 2011 464.000 Infektionen und
6.500 Tote
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Vibrio cholerae Ausbruch Hamburg 1892
16.956 Infektionen und 8.605 Tote
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Vibrio vulnificus
50% Gesamtmortalität
USA 237 von 459 erkrankten Personen sterben jährlich
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Vibrio parahaemolyticus
Weltweit bedeutendster Krankheitserreger im Zusammenhang mit Meeresfrüchten
USA: 4.500 Infektionen, davon 2.800 verursacht durch den Verzehr von rohen Austern
2005: erstmalig Infektionen durch ursprünglich aus Alaska stammende Austern
500‐800 Ausbrüche pro Jahr in Japan; ca. 10.000 Menschen/a betroffen
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Gattung Vibrio
Gefahr von Vibrio‐Infektionen nimmt durch die Erhöhung der Wassertemperaturen zu ( Klimaveränderung?)
Zunahme des Verzehrs und des Handels mit Fischereiprodukten und Meeresfrüchten erhöhen das Risiko für Vibrio‐Infektionen
Entdeckung neuer Vibrio Spezies
Ausgeprägte Homologien: 16S rRNA Gen Sequenzierung kann eine Unterscheidung aller Vibrio Spezies nicht mehr gewährleisten
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Zielsetzung
Entwicklung eines Nachweisverfahrens Zuverlässig
Schnell
Einfach
Verfahren muss allerdings in der Lage sein, alle Vibrio Spezies zu differenzieren
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Intergenic Spacer Region (ISR1)
16S, 23S und 5S rRNA Gene sind aufgebaut als ein Operon
ISR1 trennt 16S und 23S rRNA, ISR2 trennt 23S und 5S rRNA
rRNA ist hochkonserviert während ISR variabel ist
Vibrionen besitzen mehrere Kopien dieses Operons
Variable Länge der ISR kann für Identifizierungs‐ und Evolutions‐Studien genutzt werden
rRNA 23SISR1rRNA 16S rRNA 5SISR2
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Vibrio parahaemolyticus ISR 1 PCR product (bp)
782 640 637 544 819 391 391 391 637 782
Vibrio parahaemolyticus ISR 1 PCR product (bp)
782 640 637 544 819 391 391 391 637 782 814
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PCR Amplifikation des ISR1
Vibrio parahaemolyticus ISR 1 PCR product (bp)
782 640 637 544 819 391 391 391 637 782 814
MW (bp)
1,500
1,000900800700600
500
400
300
200
100
V p
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69 Vibrio Isolate (48 verschiedene Spezies)
-80 °C
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MW (bp)
1,500
1,000900800700600
500
400
300
200
100
V p
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V.c. V.c. V.c. V.c.V.v. V.v. V.v. V.v.V.p. V.p. V.p. V.p.
1. Durchgang 2. Durchgang 3. Durchgang 4. Durchgang
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Zusammenfassung
ISR Typisierungs‐Methode Vermeidung von zeitaufwändiger Agarose‐Gelelektrophorese
Hohe Sensitivität und hohe Spezifität
Kann Vibrionen auf Spezies Level differenzieren
Anwendung Charakterisierung von Ausbruch‐Stämmen und anlegen einer Datenbank
Untersuchung von Kulturen aus Umwelt‐ und Lebensmittel‐Proben
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Gattung Vibrio
In aquatischer Umgebung
Eukaryotischer Wirt: Korallen, Schalentiere, Zooplankton und Schwämme
Schwämme
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Submarine
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Schwämme (Porifera)
Axinella
Bubaris
Corallistes
ErylusHalichondrida
Higginsia
Scleritoderma
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Zielsetzung
Identität der Vibrionen aus Schwämmen bestimmen
Vergleich von phylogenetischen und genetischen Beziehungen von den schwamm‐assoziierten Vibrio‐Isolaten zu ihren entsprechenden Spezies von Küstengewässern
Methoden 16S rRNA Gen Sequenzierung
ISR‐Typisierung
Multilocus‐Sequence‐Analysis (MLSA) 6 Housekeeping‐Gene
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Sequenzierung
Alignment: Untereinanderstellen homologer Positionen von Nukleotidsequenzen verschiedener Sequenzstränge
Vibrio Isolate 1
Vibrio Isolate 2Vibrio Isolate 3Vibrio Isolate 4Vibrio Isolate 5Vibrio Isolate 6Vibrio Isolate 7Vibrio Isolate 8Vibrio Isolate 9Vibrio Isolate 10
Vibrio Isolate 12Vibrio Isolate 11
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Referenzstämme entsprachen nicht ihrer Deklaration
V. communis und V. owensii konnten der gleichen Art zugeordnet werden
Enthaltene Daten‐Matrizen weisen auf horizontalen Gentransfer (HGT) hin
Austausch von DNA Panmiktische Populationsstruktur
Ergebnisse
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Ergebnisse
Das Ökosystem Schwamm fördert die Artenselektion
Neue Spezies
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Kernäquivalent I Kernäquivalent II
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Neue Vibrio Spezies
Neue Spezies: Vibrio caribbeanicus
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Publikationen
• Hoffmann, M.,Monday, S. R., McCarthy, P. J., Lopez, J. V., Fischer, M. & Brown, E. W. (2013). Genetic and phylo‐genetic evidence for horizontal gene transfer among ecologically groups of marine Vibrio. Cladistics 29(1), 46‐64.
• Hoffmann, M., Monday, S. R., Fischer, M. & Brown, E. W. (2012). Genetic and phylogenetic evidence for misidentification of Vibrio species within the Harveyi clade. Lett Appl Microbiol 54, 160‐165.
• Hoffmann, M., Monday, S. R., McCarthy, P. J., Lopez, J. V., Whittaker P., NaumM., Fischer, M. and Brown, E. W., (2012). Vibrio caribbeanicus sp. nov., isolated from marine sponge Scleritoderma cyanea. Int J SystEvol Micr 62, 1736‐1743.
• Hoffmann, M., Fischer, M., Ottesen, A., McCarthy, P. J., Lopez, J. V., Brown, E. W. and Monday, S. R. (2010). Population dynamics of Vibrio spp. associated with marine sponge microcosms. ISME J 4, 1608‐1612.
• Hoffmann, M., Fischer, M. and Whittaker, P. (2010). Evaluating the use of fatty acid profiles identify deep‐sea Vibrio isolates. Food Chem 122, 943‐950.
• Hoffmann, M., Brown, E. W., Feng, P. C. H., Keys, C. E., Fischer, M. and Monday, S. R. (2010). PCR‐Based method for targeting 16S‐23S rRNA intergenic spacer regions among Vibrio species. BMC Microbiol 10:90.
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Dr. Eric Brown Dr. Steven Monday
Prof. Dr. Jose V. LopezNova Southeastern University
Dr. Peter J. McCarthyHarbor Branch Oceanographic Institute
Prof. Dr. Markus Fischer Dr. Paul Whittaker