Příprava předmětu byla podpořena

projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie High-Performance Liquid Chromatography

(HPLC)

Kapalinová chromatografie (LC)

1.1. Teorie kapalinové chromatografie

� Difúzní koeficienty jsou v LC o ~5 řádů menší než v GC(~10-5 oproti ~1 cm2/s)

� V důsledku tohoto faktu je molekulární difúzezanedbatelná a na druhé straně roste význam odporuproti přenosu hmoty v mobilní fázi

� Viskozita je pro kapaliny asi 100x vyšší než pro plyny

� Důsledkem je nezbytnost pracovat s vysokými tlaky~20 MPa pro dosažení rozumné průtokové rychlosti

� Snaha po zmenšení nežádoucího efektu pomalého přenosuhmoty v mobilní fázi vede ke zmenšování průměru částicsorbentu, to ovšem přináší nutnost užívání vysokých tlakůna koloně

� Rozšiřování zóny analytu v průběhu postupu kolonou můžebýt ovlivňováno (stejně jako v GC) dvěmi faktory,termodynamickýma kinetickým

� Faktor termodynamický se v LC podílí na rozmývání píkůčasto

Pokud KD a k jsou nezávislé na koncentraci složky, pakvšechny části zóny složky procházejí kolonou stejně rychlea je získán symetrický pík

Pokud ale pracujeme v nelineární oblasti adsorpčníizotermy, pak v případě obvyklého konvexního průběhuizotermy, obdržíme chvostující píky

Retenční(kapacitní) faktor k přitom klesá s rostoucíkoncentrací složky v nástřiku

� Vhodné je pracovat pokud možno v oblasti lineárníizotermy sorbentu

Kvantitativním parametrem je zatížení sorbentu vyjádřenév gramech dávkovaného vzorku na 1g stacionární fáze

Zatížení sorbentu, které vede ke snížení retenčníhofaktoru o 10% je označováno lineární kapacitasorbentu

Lineární oblast bývá do ~10-4 g vzorku na 1 g sorbentu

� Při přetížení kolony je vhodné snížit koncentraci (neboobjem) nastřikovaného vzorku

� V adsorpční chromatografii se stává, že snížení koncentracinevede k odpovídajícímu zlepšení tvaru píku, je tomuvětšinou tehdy, když má sorbent nehomogenní povrch,nese centra s různou aktivitouObvykle je nutno velmi aktivní centra „vysytit“ např. H2O ,izopropanolem apod.

Faktor kinetický v LC popisuje Giddingsova rovnice respektujícívzájemnou závislost vířivé difúze HF a odporu proti přenosuhmoty v mobil. fázi HM :

S

MF

H

H

1

H

1

1H +

+

= (5)

HS je odpor proti přenosu hmoty ve stacionární fázi

V rozepsaném tvaru je vztah (5) pro kapalinovou rozdělovacíchromatografii roven:

2

S

2

f

2

p

m

p

1)(kD

ku d q

u d ω

D

d λ 2

1

1H

++

+

= (6)

kde l, ωωωω, q jsou konstanty závislé na geometrii náplně kolony, Dm

a DS jsou difúzní koeficienty dané složky v mobilní a stacionárnífázi, dp je průměr částic sorbentu, df je síla filmu stacionárnífáze

Pro kapalinovou adsorpční chromatografii a iontově výměnouchromatografii je nutno poslední člen rovnice (6) substituovatvýrazem pro HS :

( )2dS1k

ku t2qH

+= (7)

kde td je čas potřebný k desorpci molekuly daného analytu

Pro gelovou chromatografii se nahradí poslední člen rovnicí:

( )2m

2

p

SM1k

k

D 30

u dH

+= (8)

kde Dm je difúzní koeficient složky v mobilní fázi

V praxi je často možno členy HS a HSM zanedbat

Pro popsání závislosti H versus u se v kapalinovéchromatografii používá i jednoduchý vztah odvozený Snyderem:

au DH = (9)

D je pro jistý chromatografický systém konstanta odpovídající Hpro u=1 cm/s. Konstanta D zahrnuje velikost částic sorbentu,hodnotu difúzního koeficientu atd.

Konstanta a obvykle nabývá hodnot 0.3 - 0.7. Pro pelikulárnínáplně je hodnota a ~ 0.4 a pro porézní a ~ 0.6

Rovnici se dvěma parametry navrhli také Kennedy a Knox provyjádření závislosti redukované výšky patra h na redukovanélineární rychlosti νννν:

ν Cν Ah31+= (10)

h=H/dp a νννν=udp/Dm

A, C jsou konstanty

První člen vztahu (10) reprezentuje vliv turbulentní difúze

Konstanta A má vztah ke kvalitě naplněné kolony, u dobrýchkolon je A < 1Člen C νννν představuje odpor proti přenosu hmoty v mobilníi stacionární fázi, pro konstantu C platí zpravidla C < 0.1

2.1. Technika sloupcové chromatografie

1. Systém otevřený – nízkotlaký

Low(Medium) Pressure Liquid Chromatography

2. Systém uzavřený – vysokotlaký

High Performance Liquid Chromatography

2.1.1. Čerpadla

Zásobník mobilní fáze

Filtrace kapalin – membránové filtry 0.45 µm

Frita 2 µm

Odplynění - helium, vakuum, ultrazvuk

Požadavky kladené na čerpadlo pro analytickou HPLC:

� Konstantní průtok s přesností lepší než 0.5 %

� Bezpulzní provoz

� Průtok regulovatelný v rozsahu od desítek mikrolitrůdo 10 ml/min, správnost a přesnost

� Malý objem hlav => umožní rychlé změny složení kapalin

� Inertnost čerpadla k mobilní fázi – rubín, safír, titan,polymery-teflon, PEEK

� Provozní tlaky do 40 MPa

2.1.1.1. Čerpadla s konstantním průtokem

a) Čerpadla reciprokační

Průtok se nastavuje volbou délky zdvihu nebo frekvence

Objem hlavy čerpadla ~10-100 µl

Výhody: Nepřetržitá dodávka mobilní fáze, snadná změnamobilní fáze

Nevýhoda: Pulzní chod => detektor-šum => dvoupístovéuspořádání, tlumič pulzů

b) Lineární dávkovače

Objem ~ 200 – 500 ml

Výhoda: Konstantní průtok mobilní fáze-bezpulzní čerpadlo =>velmi vhodné pro mikrokolonové aplikace

Nevýhoda: Nutnost plnit zásobník čerpadla, diskontinuálníprovoz, nesnadná změna fází

2.1.1.2. Čerpadla s konstantním tlakem

Pneumatické membránové čerpadlo

Výhody: Vysoké tlaky (kolem 70 MPa), stabilita tlaku, vhodnépro plnění kolon a pro vysoké průtoky-pro preparativníHPLC, nízká cena

Nevýhody: Konstantní tlak-ne průtok! Průtok závisí na viskozitěmobilní fáze

2.1.2. Zařízení pro tvorbu gradientu

• V řadě případů je nutno nahradit izokratickou eluci elucígradientovou

• Gradientová eluce:

� Definovaná změna složení mobilní fáze v průběhu analýzy

� Měnit se může polarita solventu, iontová síla, pH, atd.

� Změny složení mohou být skokové, lineárnínebo nelineární

� Míchání složek mobilní fáze v mixérech-pasivní, aktivní

� Gradienty-binární, ternární, kvartérní

• V současné době se pro HPLC užívají především dva typygradientových systémů:

� 1) Nízkotlaký

� 2) Vysokotlaký

ad 1) Nízkotlaký gradient

ad 2) Vysokotlaký gradient

2.1.3 Nástřik vzorku

• Pro aplikace v HPLC se již nepoužívá technika nástřikustříkačkou přes septum, ani technika nástřiku na kolonuse zastaveným tokem mobilní fázeNástřik stříkačkou má v současnosti význam jenu otevřených systémů

• Téměř výlučně se vzorek nastřikuje pomocí ventilů:(Rheodyne, Valco)

� Nástřik bez zastavení toku mobilní fáze

� Ventily mají vysokou tlakovou odolnost přes 40 MPa

� Chemická odolnost je dobrá, odolnost vzhledemk vysokému pH se může zvýšit volbou materiálů –Vespel; PEEK

� Vysoká reprodukovatelnost nástřiku ~ 0.2%

� Plnění smyčky-úplné, částečné

� Smyčka-interní, externí

2.1.4. Kolony pro HPLC

• Typy HPLC kolon: ID vnitřní průměr

� Kapilární kolony ~ stovky, desítky mikrometrů

� Mikrokolony 1 mm

� “Narrow-bore” kolony 2 mm

� Analytické kolony ~2 mm do ~10 mm

� Semipreparativní kolony~10 mm do ~25 mm

� Preparativní kolony nad 25 mm

• Materiály:

� Nerezová ocel-pasivace povrchu

� Sklo-tvrzené (odolnost do ~20MPa)

� Ti-Zr

� PEEK-nižší odolnost vzhledem ke koncentrovanýmanorganickým kyselinám a THF

∗ Rozměry analytických kolon - trendy

∗ Nekompatibilita kolon a částí

∗ “Cartridge“ systém

∗ Radiální a axiální komprese

∗ Minimalizace mimokolonových objemů, rozmytí (směrodatná odchylka)

∗ Plnění kolon - za sucha vs. “slurry“ metoda