Aus der Medizinischen Klinik I der Universität zu Lübeck

Direktor: Prof. Dr. med. H.L. Fehm

Wirkprofil und zytotoxisches Potential von Trofosfamid im Vergleich zu den

Oxazaphosphorinanaloga Cyclophosphamid und Ifosfamid

Inauguraldissertation zur

Erlangung der Doktorwürde der Universität zu Lübeck

- aus der Medizinischen Fakultät -

vorgelegt von Carola Letsch

aus Bad Segeberg

Lübeck 2004

1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Thomas Wagner

2. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Heiko Iven

Tag der mündlichen Prüfung: 29.04.05

Zum Druck genehmigt: Lübeck, den 29.04.05

Gez. Prof. Dr. med. Peter Dominiak

- Dekan der Medizinischen Fakultät -

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis Seite

I. Einleitung 5

II. Material und Methoden

1. Material und Geräte 13

2. Methoden

2.1 Zellkultur 18

2.2 Zytostatika-Aufbereitung 19

2.3 MTT-Assay 20

2.4.1 Trypanblau-Färbung 22

2.4.2 Comet-Assay 23

2.5 DNA-Isolation 27

2.6 Fluorometrischer Cross-link-Assay 30

2.7 Biometrie und Statistik 33

III. Ergebnisse 1. MTT-Assay 34

2.1 Trypanblau-Färbung 38

2.2 Comet-Assay (Einzelzellgelelektrophorese) 39

3.1 Validierung der Messung am Spectralfluorophotometer 44

3.2 Fluorometrischer Cross-link-Assay 47

IV. Diskussion 49

1. Zytotoxisches Potential von 4-OH-Trofosfamid 51

2. Detektion von DNA-Schäden 54

3. klinische Relevanz der Arbeit 59

V. Zusammenfassung 60

VI. Literaturverzeichnis 62

Inhaltsverzeichnis

VII. Anhang

1. Abbildungsverzeichnis 74

2. Tabellenverzeichnis 75

3. Tabellen 76

4. Abkürzungsverzeichnis 78

VIII. Danksagung 80

IX. Lebenslauf 81

Einleitung

5

I. Einleitung

Trotz des großen Fortschrittes in der Therapie der Tumorerkrankungen sind die

Krebserkrankungen neben den Herz-Kreislauferkrankungen zu den häufigsten

Todesursachen geworden (Becker, 1998). In der Behandlung von Krebs nimmt die

Chemotherapie neben der Operation, der Strahlentherapie und der Immuntherapie

eine wichtige Rolle ein. Die derzeit gebräuchlichen Chemotherapeutika, die

Zytostatika, führen zur Apoptose oder zur Schädigung von Tumorzellen. Je nach

Art und Stadium der Krebserkrankung erfolgt der Einsatz der Chemotherapie mit

verschiedenen Zielsetzungen. Bei der Behandlung von malignen Lymphomen, des

Morbus Hodgkin, der akuten Leukämien im Kindesalter oder der Karzinome des

Hodens wird eine kurative Therapie angestrebt. Zudem kann die Chemotherapie

auch eingesetzt werden, um die Lebensqualität betroffener Patienten zu

verbessern oder ihr Leiden zu mindern, also unter palliativen Gesichtspunkten.

Um sekundäre Resistenzen zu verhindern und die Wirksamkeit zu erhöhen,

werden häufig Polychemotherapien angewendet (Teicher, 1997).

Von den unterschiedlichen Gruppen der Chemotherapeutika, die zur Anwendung

kommen, sind die Alkylantien die ältesten. Sie gehören zusammen mit den

Antimetaboliten, wie zum Beispiel dem Methotrexat, zu denen, die nach wie vor

am häufigsten angewendet werden (Teicher, 1997). Alkylantien werden sowohl in

Kombinationschemotherapien, als auch als Hochdosistherapeutika bei

Knochenmark- oder Stammzelltransplantationen eingesetzt (Colvin, 1999; Teicher,

1997).

Die Entdeckung der Chemotherapie kann zurückverfolgt werden bis in Zeiten des

ersten Weltkrieges, als nach dem Einsatz von Gelbkreuzkampfstoff (z.B.

Dichlordiethylsulfid = Lost = Senfgas) bei der Autopsie der Gefallenen neben

schweren Reizungen der Haut und des Respirationstraktes eine Hypoplasie des

Knochenmarks und des lymphatischen Gewebes feststellt wurde (Kohn und

Bruce, 1996; DeVita 1997; Teicher, 1997). Diese Erkenntnisse wurden erst nach

dem zweiten Weltkrieg veröffentlicht, weil es sich bei dem Senfgas um ein

Kampfgas handelte (Goodman et al., 1946). Da sich Senfgas als zu toxisch erwies

Einleitung

6

und man eine stabilere Verbindung verwenden wollte, wurde das Stickstofflost (s.

Abb.1) entwickelt.

Abb.1: Diese beiden Verbindungen bildeten die Grundlage bei der Entwicklung der Oxazaphosphorine.

Die heute verwendeten Stickstofflost-Derivate zeichnen sich dadurch aus, dass sie

wesentlich weniger toxisch sind, kaum noch zu lokalen Reizwirkungen führen und

somit auch oral gegeben werden können ( Blomqvist et al., 1995; Gunsilius et al.,

2001). Die Oxazaphosphorine stellen heute die bedeutendsten Wirkstoffe aus der

Gruppe der alkylierenden Zytostatika dar. Die bekannteste und zugleich am

meisten verwendete Substanz dieser Reihe ist das Cyclophosphamid (Brock,

1989).

Cyclophosphamid wurde 1958 von Arnold, Bourseaux und Brock synthetisiert und

ist eines der am gründlichsten untersuchten Alkylantien (Arnold et. al; 1958;

Sladeck, 1988). Neben seinen tumorreduzierenden Eigenschaften besitzt es auch

eine hämatopoetische Toxizität, die eine Leukopenie und unter Hochdosistherapie

eine Knochenmarksaplasie nach sich ziehen kann. Auf der Suche nach einem

nebenwirkungsärmeren Zytostatikum entdeckten Arnold und Bourseaux zwei

weitere interessante Oxazaphosphorine (Arnold und Bourseaux, 1958). Zunächst

das Trofosfamid, das eng mit Cyclophosphamid verwandt ist, sich aber durch die

dritte Chlorethylgruppe, die am Stickstoffatom des Sechseringes liegt,

unterscheidet (siehe Abb.2). Als weitere Verbindung entdeckten sie das Ifosfamid,

welches nicht mehr die typische N-Mustard-Struktur aufweist. Seine beiden

Chlorethylgruppen liegen nicht am selben Stickstoffatom, sondern befinden sich

die eine Gruppe intra- und die andere extrazyklisch (Semont et al., 1981).

Cl CH2 CH2

S

Cl CH2 CH2

a) Lost

Cl CH2 CH2 N - CH3

Cl CH2 CH2

b) Stickstofflost

Einleitung

7

Alle drei Oxazaphosphorine sind so genannte Prodrugs und benötigen eine

Biotransformation, um zytotoxisch zu wirken. In vivo geschieht dieses mit Hilfe des

multifunktionellen Oxidase-Systems der Leber (Cytochrom P450 Isoenzyme),

welches den Ring an Position 4 hydroxyliert. Für die Hydroxylierung von

Trofosfamid wurde das Cytochrom P450 3A4 Isoenzym identifiziert (May-Manke et

al., 1999). Die 4-OH-Verbindungen stehen im Gleichgewicht mit ihrer Aldoform,

die spontan zu Acrolein und einer alkylierenden Mustardverbindung zerfällt.

Weiterhin können Ifosfamid und Cyclophosphamid auch an den

Chlorethylseitenketten oxidiert werden. Hierbei entstehen Chloracetaldehyd (CAA)

und die pharmakologisch inaktiven Verbindungen 2- /3- Dechloroethyl-Ifosfamid

bzw. 3-Dechloroethyl-Cyclophosphamid (siehe Abb. 2).

Die eigentlich alkylierenden Substanzen, die Mustardverbindungen, entstehen aus

den 4-OH-Metaboliten unter Abspaltung von Acrolein, das für die Nebenwirkungen

an der Blase (hämorrhagische Zystitis) verantwortlich gemacht wird (Brock et al.,

1979; Cox und Abel, 1979; Wagner, 1994). Um Folgen wie zum Beispiel

Blutungen der Blasenwand zu verhindern, wird bei dem Einsatz der

Oxazaphosphorine den Patienten Mesna zugeführt. Mesna ist ein

Sulfhydrylgruppendonator, der 1981 von Brock et al. als ein klinisch gut

einsetzbarer Uroprotektor entdeckt wurde (Brock et al. 1981; Brock und Pohl

1983). Als anionische Verbindung wird Mesna einerseits von den meisten Zellen

nicht aufgenommen und andererseits im Blut schnell zum inaktiven Dimesna

oxidiert. Dieses wird in der Niere glomerulär filtriert, tubulär reabsorbiert, in den

Nierenzellen erneut zu Mesna reduziert und schließlich über den Urin

ausgeschieden. Es gelangt so in die Blase, wo seine freie Sulfhydrylgruppe mit

Acrolein reagiert und dieses somit inaktiviert. Darüber hinaus wird aber auch die

Umwandlung der 4-Hydroxymetabolite zu Acrolein blockiert (Brock et al 1981;

Dorr, 1991).

Die drei verschiedenen Mustardverbindungen mit ihren chemischen Strukturen

haben je nach Substrat unterschiedliche alkylierende Aktivitäten. Trotz dieser

Unterschiede in der chemischen Struktur wird die unterschiedliche Aktivität dem

spezifischen metabolischen Abbau zugeschrieben (Zalupski und Baker, 1988;

Wagner, 1997). Alkylierende Substanzen sind hoch reaktive Verbindungen, die in

Einleitung

8

der Lage sind, Hydrogengruppen von organischen Substanzen durch

Alkylgruppen zu ersetzen (Wagner, 1997). Die zytotoxische Wirkung beruht

vornehmlich auf der Alkylierung der Nucleinsäuren, insbesondere der DNA. In vitro

Ergebnisse haben gezeigt, dass die primären Angriffspunkte von Trofosfamid die

Phosphodiester-Bindungen in der DNA und die Orthophosphatgruppen der freien

Nukleotide sind (Lindemann und Harbers, 1980). Aus der Lokalisation des

alkylierenden Angriffspunktes an der DNA wurde der Schluss gezogen, dass der

Hauptmechanismus die intermolekulare Bildung von so genannten „Cross-links“

sei (Wagner, 1997). Hierbei handelt es sich um kovalente Bindungen zwischen

einem komplementären Basenpaar der DNA, die zum Zelltod führen können, da

die DNA an diesen Stellen nicht mehr abgelesen werden kann.

R.F. Struck hat die Bildung von Cross-links an Oligonucleotiden für

Isophosphoramid Mustard, Nitrogen Mustard und Phosphoramid Mustard

nachgewiesen (Struck et al., 2000). Darüber hinaus deckte Hartley an

Patientenleukozyten, die mit Ifosfamid behandelt worden waren, mit Hilfe des

Comet-Assays Cross-links auf (Hartley et al., 1999). Mit Hilfe des „alkalischen

Elution-Assays“ wurden neben der Fähigkeit von Cyclophosphamid zur Bildung

von Cross-links auch DNA-Strangbrüche an Lungenfibroblasten nachgewiesen

(Hengstler et al., 1997). Bisher konnte noch niemand nachweisen, dass auch

Trofosfamid in der Lage ist, DNA-Schäden hervorzurufen.

Obwohl Trofosfamid 1973 zugelassen wurde, ist nur wenig über dieses

Oxazaphosphorin bekannt. Im Vergleich mit seinen Verwandten Cyclophosphamid

und Ifosfamid konnte Trofosfamid bisher in der klinischen Praxis kaum Akzeptanz

gewinnen. Die Therapie mit Trofosfamid ist ausschließlich oral möglich. Dies

wurde von den behandelten Patienten als weniger belastend empfunden im

Vergleich zur intravenösen Chemotherapie (Mross et al., 1998; Hartmann, 2003).

Insbesondere wird Trofosfamid z. Zt. bei palliativen Behandlungsansätzen oder in

Langzeittherapien eingesetzt (Blomqvist et al., 1995; Salminen et al., 1995;

Salminen et al., 1997; Helsing, 1996; Enk und Knop, 2000; Reichardt et al., 2002;

Andersson et al., 2002; Hartmann et al., 2003;). Anwendungsgebiete für

Trofosfamid sind unter anderem die Erhaltungstherapie bei lymphoretikulären

Tumoren, Hämoblastosen und malignen soliden Tumoren mit disseminiertem

Einleitung

9

Wachstum sowie bei Karzinomen der Ovarien, der Mammae, beim kleinzelligen

Bronchialkarzinom und beim Seminom. Die antineoplastische Wirkung wurde

zuerst am Yoshida ascites sarcoma bei der Ratte nachgewiesen (Brock und

Hohorst, 1967). Bei der Festlegung der kurativen Dosis und der LD50 (letale Dosis,

bei der 50% der Tiere sterben) zeigte sich, dass Trofosfamid toxischer ist als

Cyclophosphamid.

Lange wurde angenommen, dass der Hauptmetabolit von Trofosfamid das

Ifosfamid sei, weshalb Trofosfamid oft als orales Ifosfamid eingesetzt wurde.

Tatsächlich konnte unsere Arbeitsgruppe beweisen, dass sich das Trofosfamid

strukturell (s.Abb2), pharmakokinetisch und in seinen zytotoxischen Eigenschaften

von Ifosfamid unterscheidet (Brinker et al., 2002). Klinische Studien über die

Therapie mit Ifosfamid zeigten die erheblichen Nebenwirkungen, wie zum Beispiel

die Neuro- und Nephrotoxizität auf (van Dyk et al., 1972; Goren et al., 1987; Bern

et al., 1995; Goren et al., 1996). In der Studie von Brinker konnte festgestellt

werden, dass sich dagegen unter der Therapie mit Trofosfamid (160mg/m²) nur

geringe Nebenwirkungen einstellten. In einer früheren Arbeit wurde eine Dosis von

50mg/kg (1700mg/m²) appliziert, aber es konnte auch hier keine Neurotoxizität

festgestellt werden. (Flakson und Falkson, 1978).

Da es keine komplette Kreuzresistenz zwischen Ifosfamid und Cyclophosphamid

gibt, erschien es K. Mross möglich, Patienten mit Trofosfamid zu therapieren,

auch wenn sie bereits mit Cyclophosphamid vorbehandelt wurden (Becher et al.,

1996; Mross et al., 1998). Er konnte belegen, dass Trofosfamid auch bei mehrfach

vorbehandelten Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom eine sinnvolle

Therapieoption darstellt. Wirkungen am Tumor und unerwünschte

Nebenwirkungen stehen insgesamt in einem guten Verhältnis zueinander (Mross

et al., 1998). Die Tatsache, dass gegen Cyclophosphamid resistente Tumoren

noch sensibel auf Trofosfamid reagierten, könnte darin begründet sein, dass die

aktiven Metabolite des Trofosfamids wegen ihrer höheren Lipophilie besser durch

die Zellmembranen permeieren (Wagner, 1997). Selbst bei Patientinnen, die mit

drei und mehr Chemotherapien vorbehandelt worden waren, erwies sich

Trofosfamid noch als wirksam (Mross et al., 1998). Des Weiteren beschrieben die

Patientinnen die orale Darreichungsform als weniger belastend als eine

Einleitung

10

intravenöse Therapie. Schon andere Arbeitsgruppen beschrieben den palliativen

Einsatz der oralen Trofosfamidtherapie als eine interessante Therapiemöglichkeit

mit milden Nebenwirkungen, zum Beispiel bei Knochen- oder Weichteilsarkomen,

bei Lymphomen und Ovarialkarzinomen (Salminen et al., 1997; Gunsilius et al.,

2001; Hartmann et al., 2003). Um die Nebenwirkungen des CMF-Schemas

(Cyclophosphamid, Methotrexat und 5-Fluorouracil) zu mindern, tauschten

Albrecht und Mitarbeiter Cyclophosphamid gegen Trofosfamid aus (Albrecht et al.,

1984). Der zytotoxische Effekt auf Stammzellen wurde bereits untersucht. Es hat

sich gezeigt, dass Trofosfamid im Gegensatz zu Ifosfamid und Cyclophosphamid,

die lediglich toxisch auf proliferierende Stammzellen wirken, auch auf ruhende

Stammzellen Einfluss nimmt (Wagner, 1997).

Da in der Studie von Brinker nachgewiesen wurde, dass nach oraler Gabe von

Trofosfamid nicht nur ein Abbau zu Ifosfamid und Cyclophosphamid (Boos et al.,

1993), sondern auch eine direkte Hydroxylierung zu 4-OH-Trofosfamid erfolgt

(Brinker et al., 2002), erscheint die genauere Untersuchung der Wirkung von 4-

OH-Trofosfamid auf die Tumorzelle noch bedeutsamer.

Pharmakokinetische Untersuchungen ergaben, dass bei der Metabolisierung von

Trofosfamid durch den ersten Dechlorethylierungsschritt hauptsächlich Ifosfamid

und zu einem geringeren Teil Cyclophosphamid entsteht (Boos et al., 1993). In

beiden Fällen wird Chloracetaldehyd (CAA) freigesetzt (s. Abb.2), und bei dem

weiteren Abbau von Ifosfamid entsteht nochmals CAA. Jüngere Ergebnisse

belegen eine eigene zytotoxische Aktivität bzw. Antitumorwirkung von CAA

(Brüggemann et al, 1997; Börner et al., 2000). Dadurch bekommt diese quantitativ

erhebliche CAA-Freisetzung bei der Metabolisierung von Trofosfamid eine

besondere Bedeutung.

Bislang wurden in verschiedenen Studien die zytotoxischen und klinischen

Wirkungen von Cyclophosphamid und Ifosfamid untersucht (Kurowski et al., 1991;

Hengstler et al., 1997; Schlenke et al., 1999; Johnstone et al., 2000). Obwohl das

Trofosfamid immer größere klinische Akzeptanz gewinnt, gibt es bisher keine

vergleichenden Studien zur Zytotoxizität zwischen Trofosfamid, Ifosfamid und

Cyclophosphamid. Vor diesem Hintergrund wird in der vorliegenden Arbeit die

Einleitung

11

halbmaximale letale Dosis (IC50) von 4-OH-Trofosfamid im direkten Vergleich zu 4-

OH-Cyclophosphamid und 4-OH-Ifosfamid in vitro an Tumorzelllinien ermittelt. Da

die Oxazaphosphorine im klinischen Alltag stets in Kombination mit Mesna

eingesetzt werden und da in Studien ermittelt wurde, dass Mesna selbst einen

tumorprotektiven Effekt besitzen kann, wurden die Versuchsreihen jeweils

zusätzlich in Gegenwart von Mesna durchgeführt (Dissertation Brüggemann,

1999; Kisro et al.,2000; Kisro et al., 2001).

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Hypothese zu überprüfen,

dass Trofosfamid die DNA alkyliert, die in Folge dessen durch DNA-Strangbrüche

und Cross-links geschädigt wird. Zum Nachweis von DNA-Strangbrüchen und

DNA-DNA-Cross-links wurde eine Einzelzellgelelektrophorese bzw. ein

fluorometrischer Assay an zwei etablierten humanen Tumorzelllinien angewendet.

Um einen Bezug zur Klinik zu erhalten, wurden die Untersuchungen mit

Dosierungen im Bereich der von Brinker ermittelten Plasmaspitzenspiegel des 4-

Hydroxymetaboliten durchgeführt.

Einleitung

12

Abb.2: Aktivierung und Inaktivierung des Oxazaphosphorins Trofosfamid CAA = Chloracetaldehyd

C2H4Cl

H

P O

H

C2H4Cl

H

Isophosphoramid-Mustard

C2H4Cl

N

P O

H

C2H4Cl

HO C2H4Cl

Trofosfamid-Mustard

C2H4Cl

N

P O

NH

H C2H4Cl

Phosphoramid-Mustard

COOH H

R

Carboxy-Derivat Aldo-Derivat

CH H

RO

4-Hydroxymetabolit

NOH R

Keto-Derivat

N

O R R = H4C2H4Cl

C2H4Cl

H

P O N

C2H4Cl

O

Ifosfamid Trofosfamid

C2H4Cl

C2H4Cl

H

P O

N

OC2H4Cl C2H4Cl

H

P

N

O

Cyclophosphamid

C2H4Cl

- Acrolein - Acrolein - Acrolein

- CAA - CAA

3- Dechloroethyl-Ifosfamid

C2H4Cl HN

P ONH

O

2- Dechloroethyl-Ifosfamid

NH

P O

N

C2H4Cl

O

Material und Methoden

13

II.1 Material und Geräte II.1.1 Zytostatika und Reagenzien II.1.1.1 Mafosfamid: cis-2s-(bis (-2chlorethyl) amino) tetrahydro-2-oxid-2H-1,3,2-

oxazaphosphorin-4yl-thio-ethansulfonsäure. Mafosfamid zerfällt im Medium

spontan zu 4-OH-Cyclophosphamid und Mesna (Mercaptoethansulfonsäure). Es

wurde als Mafosfamid L-Lysine (50 mg) mit einem Molekulargewicht von 547,46

freundlicherweise von Asta Medica AG (Frankfurt) zur Verfügung gestellt und bei

4°C trocken gelagert.

II.1.1.2. 4-Hydroxyperoxy-Ifosfamid (4-OOH-Ifosfamid): 3-/2-chlorethyl)-2-( (2-chlorethyl)

amino) tetrahydro-2-oxid-2H-1,3,2-oxazaphosphorin-4-yl-hydroperoxid. Das 4-

OOH-Ifosfamid mit einem Molekulargewicht von 293,1 wurde freundlicherweise

von Asta Medica AG (Frankfurt) zur Verfügung gestellt und bei –70°C trocken

gelagert. Bei der Lösung im Medium kommt es zu einem spontanen Zerfall zu 4-

OH-Ifosfamid, dem eigentlich in vivo vorkommenden Metaboliten.

II.1.1.3. 4-Hydroxyperoxy-Trofosfamid (4-OOH-Trofosfamid): cis-(+-)-3-(2-chloroethyl)-2-

(bis(2-chloroethyl) amino) tetrahydro-2-oxide-2H-1,3,2-oxazaphosphorine-4-yl-

hydroperoxide. Das 4-OOH-Trofosfamid mit einem Molekulargewicht von 355,6

wurde freundlicherweise von Asta Medica zur Verfügung gestellt und bei –70°C

trocken gelagert. Bei der Lösung im Medium kommt es zu einem spontanen Zerfall

zu 4-OH-Trofosfamid, dem eigentlich in vivo vorkommenden Metaboliten.

II.1.1.4 MMS: Methylmetansulfonat (Merck)

Material und Methoden

14

II.1.1.5 Cisplatin: Platinex-Lösung (10mg / 20ml) Bristol-Meyers Squibb GmbH

II.1.1.6 Mesna: Mercaptoethansulfonsäure-Natrium. Es wurde von Asta Medica in Form

von „Uromitexan 400mg“ freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Gelagert wurde

es bei Raumtemperatur. Das Molekulargewicht beträgt 164,18 g/mol.

II.1.2 Material der Zellkultur 1. Zelllinien: Weichteilsarkom der Schilddrüse S117

Mammakarzinom MX1

Beide Tumorzelllinien wurden vom Deutschen Krebsforschungszentrum in

Heidelberg (Deutschland) bezogen.

2. Tumorzellmedium: RMPI (Roswell Memorial Park Institute) 1640 (25mM

Hepes, L Glutamine) (Bio Whittaker Europe)

3. fetales Kälberserum (Biochrom KG Berlin)

4. Penicillin-Streptomycin (Roche Diagnostiks GmbH)

5. Trypsin – EDTA (GIBCO)

6. Zellkulturflaschen: (Nunclon™)

7. Einfriermedium: cryo-safe 1 (c-c-pro GmbH)

II.1.2.1Geräte der Zellkultur: 1. Hämocytometer: (Sysmex KX21)

2. Neubauer Zählkammer

3. Zentrifuge: (Heraeus Sepatech, Megafuge 1,0)

4. Brutschrank (Heraeus) (37°C, pH2O 47mmHg, 95%O2, 5% CO2)

Material und Methoden

15

II.1.3 Material des MTT-Assays

1. MTT: (Sigma) 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl Tetrazolium Bromid. 2. Mikrotiterplatten: NUNC Brand Products, NUNCLEON TM Surface

3. DMSO (Dimethylsulfoxid) (Sigma)

II.1.3.1 Geräte des MTT-Assays: 1. Plattenreader Spectralphotometer (Titertek Multiscan Plus, Flow, Irvine, UK)

II.1.4 Material des Comet-Assays 1. Kulturflaschen, 25 cm², Nunclon

2. Falkon 50ml

3. Objektträger, aufgeraut: Labkraft, Dakin Fully Frosted (Curtin Metheson

Scientific Inc., Houston, Texas)

4. Deckgläser: 24 x 40mm IDL (Marienfeld)

5. Phosphat-Natriumchlorid (PBS)-Puffer: Dulbecco Biochrom KG w/o Ca2+, Mg2+

6. Lysepuffer: pH11,5-12 400ml PBS-Puffer

73g NaCl (Pulver) (Sigma)

18,6g EDTA (Ethylenediaminetertaacetic acid) (Pulver)

(Sigma)

0,6g Trizma Base (tris(Hydroymethyl)aminomethan)

(Sigma)

5g N-Lauroyl-Sarcosinat (Sigma)

Vor Gebrauch Zugabe von 1% TritonX (Sigma) und

10% DMSO (Sigma)

Einstellung des pH-Wertes mit NaOH bzw. HCl

7. Elektrophoresepuffer: pH10 2l aqua dest (Apotheke UKL)

24g NaOH (Merck) (Natriumhydroxidplätzchen)

Vor Gebrauch Zugabe von 10ml EDTA (1mM) (Sigma)

8. Ethidiumbromid (Sigma)

9. NMA: Normal Meltingpoint Agarose (Sigma)

10. LMA: Low Meltingpoint Agarose (Sigma)

11. Trypanblau (Sigma) 0,4%ig

Material und Methoden

16

II.1.4.1 Geräte 1. Wärmeblock: Eppendorf Thermomixer 5436

2. Elektrophoresekammer: Werner Hassa GmbH Maxicell Primo EC340

3. Zentrifuge: Heraeus Sepatech, Megafuge 1,0

4. Biofuge A (Heraeus Sepatech)

5. Fluoreszenzmikroskop Axioskop (Zeiss)

6. Software: isis 3 (in situ imaging system) (Meta systems)

II.1.5 DNA-Isolation 1. Kulturflaschen, 25 cm², Nunclon

2. Reaktionsgefäß 50ml (Falkon)

3. Reaktionsgefäß 1,5ml (Eppendorf) Safe-Lock Tubes 1,5ml

4. Reagenz B: pH8 500ml aqua dest.

24,23g Tris (Trishydroxymethylaminomethan) (Sigma)

11,17g EDTA (Sigma)

4,38g NaCl (Sigma)

5g SDS (Biomol) Dodecylsulfate sodium salt

HCl

NaOH

5. Polypropylenröhrchen 5ml (Becton Dickinson) Polypropylene round bottom

tube 12x75mm

6. Filterpapier (Schleicher & Schüll)

7. Ethanol 96% (Apotheke UKL)

8. Ethanol 70% hergestellt aus Ethanol 96%

9. NaClO4 (Merck) Natriumperchlorat-Monohydrat

10. Chloroform (Merck)

11. TE-Puffer: Tris/EDTA-Puffer pH8:

10mM Tris-HCl

1mM EDTA

Material und Methoden

17

II.1.5.1 Geräte 1. DNA-RNA-Calculator: Spektralfluorophotometer zur Quantifizierung der DNA

(Gene Quant II - Photometer)

2. Wasserbad

II.1.6 Fluorometrischer Assay zur Aufdeckung von DNA-Interstrang-Cross-links 1. Höchstfarbstoff 33258 (Bisbenzimide H) (Sigma)

2. Reaktionsgefäße 1,5ml (Lichtgeschützt, ambra) (Eppendorf) Safe-lock Tubes

3. TE-Puffer: Tris/EDTA-Puffer pH8:

5mM Tris (Trishydroxymethylaminomethan)

0,5mM EDTA

4. Tris (Trishydroxymethylaminomethan) (Sigma)

5. EDTA (Sigma)

6. Analysepuffer: TE-Hoechst-Puffer:

TE-Puffer 5mM

Hoechstfarbstoff 33258 0,1µg/ml

II.1.6.1 Geräte 1. Wasserbad

2. Spektralfluorophotometer (Shimadzu RF1501)

3. Software: Hyper RF 1,57

Material und Methoden

18

II. 2. Zellkultur Prinzip:

Es wurden die humanen Zelllinien MX1, eine Mammakarzinomzelllinie, und S117,

ein polymorphkerniges Weichteilsarkom aus der Schilddrüse, verwendet. Beide

Zelllinien wurden aus dem Deutschen Krebsforschungszentrum in Heidelberg

bezogen. Die Tumorzellen wurden als Aliquots von je ca. 2 Mio. Zellen in

flüssigem Stickstoff gelagert. Um ausreichend Zellen für die Versuchsansätze zu

erhalten, mußten sie zunächst aufgetaut und in Kulturflaschen subkultiviert

werden. Zur Vermehrung wurden die Zellen ab einer Konfluenz von 95 bis 100%

von einer Kulturflasche auf mehrere aufgeteilt.

Durchführung:

Die in flüssigem Stickstoff kryokonservierten Tumorzellen wurden in einem 37°C

warmen Wasserbad aufgetaut und in einem speziellen Medium (RPMI 1640

Kulturmedium (25 mM Hepes, L-Glutamin) (Bio Whittaker Europe) mit 10%igem

Zusatz von fetalem Kälberserum (fKS) (Biochrom KG Berlin) und 0,2%igem

Zusatz von Penicillin - Streptomycin (Roche)) aufgenommen. Um die Tumorzellen

von dem Gefriermedium (cryo-safe, c-c-pro) zu befreien, wurden sie nach ihrer

Suspension zentrifugiert und das Pellet im oben genannten Medium in 80 cm²

Zellkulturflaschen (Nunclon) im Brutschrank (Heraeus) bei 37°C in

wasserdampfgesättigter Atmosphäre mit 5% CO2 kultiviert. Während die MX1-

Zellen alle vier Tage subkultiviert wurden, reichten für die Vermehrung der S117 –

Zellen drei Tage aus. Für die Umsetzung der Zellen wurde zunächst das

Nährmedium abgesaugt, der Boden der Zellkulturflasche einmalig mit 10 ml NaCl

– Lösung gewaschen und nach Zugabe einer 10%igen Trypsin-Lösung für 5

Minuten bei 37°C inkubiert. Durch Beklopfen der Kulturflasche lösten sich die

Zellen vom Boden. Nach Zugabe von 5 ml Antitrypsinmedium (RPMI 1640

Kulturmedium (25 mM Hepes, L-Glutamin) (Bio Whittaker Europe)) mit 10%igem

Zusatz von fetalem Kälberserum (fKS) (Biochrom KG Berlin) und 0,2%igem

Zusatz von Penicillin - Streptomycin (Roche) wurden die Zellen in einem 50 ml

Falkonröhrchen mit 1000 U/min (S117) bzw. mit 1500 U/min (MX1) für 3 Minuten

zentrifugiert. Das Pellet wurde in Tumorzellmedium resuspendiert, anschließend

die Zellzahl bestimmt und pro Kulturflasche 4–6x106 Tumorzellen eingesät.

Material und Methoden

19

II.2.2 Zytostatika-Aufbereitung:

Die pulverförmigen Zytostatika wurden im Medium (RMPI 1640, 10% fetales

Kälberserum, 0,2% Penicillin - Streptomycin) suspendiert und für 2 Minuten im

verschlossenen Reagenzglas in ein Ultraschallbad gestellt. 4-Hydroxyperoxy-

Ifosfamid und 4-Hydroxyperoxy-Trofosfamid zerfällt im Medium spontan zu 4-OH-

Ifosfamid bzw. 4-OH-Trofosfamid. Im Medium spaltet sich Mafosfamid spontan zu

4-OH-Cyclophosfamid und Mesna im äquimolaren Verhältnis (Pohl, 1983). Es

wurden verschiedene Zytostatikakonzentrationen durch Verdünnung mit Medium

hergestellt.

Material und Methoden

20

II. 2.3 MTT-Assay Prinzip:

Der MTT-Assay wurde erstmals von Mosman beschrieben und in einer von

unserer Arbeitsgruppe erarbeiteten Modifikation durchgeführt (Wiedemann et al.,

1993; Mosman, 1983). Mit dem MTT-Assay ist eine kolorimetrische Messung

lebender Zellen aufgrund ihrer Stoffwechselaktivität in Korrelation zur Zellzahl

möglich. Stoffwechselaktive Zellen reduzieren mit ihrer NADH-abhängigen

Succinatdehydrogenase (SDH) der Mitochondrien das gelbe Tetrazoliumsalz MTT

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl Tetrazolium Bromid) zu einem

blauvioletten Formazanprodukt. Die Menge des gebildeten Formazans steht in

direkter Beziehung mit der Anzahl an lebenden Zellen. Durch Zugabe von DMSO

werden die Zellen lysiert, das gebildete Formazan wird dabei gelöst und kann

spektralphotometrisch bei 540nm gemessen werden. Hierbei ist die Absorption

direkt proportional zur Zahl der lebenden Zellen. Die Zellüberlebensrate wurde

nach folgender Formel berechnet:

100 * OD Probe = % Zellüberleben OD Kontrolle OD = optische Dichte

Es handelt sich bei dem MTT-Assay um eine bereits für verschiedene Zelllinien

etablierte Methode. Es wurden von unserer Arbeitsgruppe Wachstumsstudien

durchgeführt, um die optimale Zellzahl und Dauer der Inkubation zu ermitteln und

so eine ausreichende Extinktion zu erhalten. So erzielte man eine Optimierung der

Meßergebnisse und stellte Standardbedingungen für die Versuche mit den

verschiedenen Zelllinien auf (Wössmann et al. 1996). Konzentrationen von 5*104

Zellen / ml hatten sich für beide Zelllinien als optimal erwiesen. Die ermittelte

Inkubationszeit für das Weichteilsarkom betrug drei Tage, die des

Mammakarzinoms vier Tage.

Material und Methoden

21

Abb.3: Das gelbe Tetratrazoliumsalz MTT wird in vitalen Zellen im Mitochondrium durch die Succinatdehydrogenase (SDH) zu einem blauvioletten Formazankristall umgewandelt.

Durchführung:

Wie unter (II.2.1) beschrieben, wurden die Zellen aus den Kulturflaschen

gewonnen, die Zellzahl bestimmt und auf 5*104 Zellen / ml eingestellt. Pro

Versuchsansatz wurden sechs Vertiefungen einer 96-Loch-Mikrotiterplatte

(Nuncleon) befüllt. Um eine Verdunstung aus den mit Testansätzen befüllten

Vertiefungen zu verhindern, wurden zunächst in die randständigen Vertiefungen

100µl Medium gegeben. Anschließend wurden 100µl Zellsuspension in die

Vertiefungen pipettiert und je 50µl Zytostatika - Lösung und 50µl Mesna – Lösung

in äquimolarer Konzentration nach Belegplan befüllt. Die Mikrotiterplatten wurden

im Brutschrank (37°C, pH2O 47mmHg: 95% O2, 5% CO2) inkubiert. Während die

MX1-Zelllinie vier Tage inkubiert wurde, reichten für das Weichteilsarkom S117

entsprechend dem Vermehrungsverhalten drei Tage Inkubationzeit aus. Als

Kontrollansatz wurden bei einer weiteren Mikrotiterplatte fünf Reihen à sechs

Vertiefungen mit 100µl Zellsuspension und 100µl Medium bestückt. Nach der

Inkubation wurde zu jeder Vertiefung 25µl MTT (2mg / ml) pipettiert. Nach weiterer

vierstündiger Inkubation im Brutschrank wurde die flüssige Phase aus den

Vertiefungen vorsichtig bis auf 10µl aspiriert, ohne die Formazankristalle vom

Boden abzulösen. Unter Zugabe von 100µl DMSO und nach fünfminütigem

seitlichen Beklopfen der Platten wurde die Lösung der Kristalle erreicht. Die

Absorption wurde direkt im Anschluß mittels des

Mikrotiterplattenspektralphotometers (Titertek Multiscan Plus, Flow, Irvine, UK) bei

einer Wellenlänge von 540nm gemessen.

MTT Formazankristall

SDH

Material und Methoden

22

II.2.4.1 Trypanblau - Färbung Prinzip:

Für Routineuntersuchungen auf die Vitalität von Zellen haben sich Tests bewährt, die

darauf basieren, dass bei lebenden Zellen bestimmte Farbstoffe nicht in das

Zellinnere gelangen können, während tote Zellen sich mit dem entsprechenden

Farbstoff anfärben. Der am weitesten verbreitete Test auf Lebensfähigkeit von Zellen

ist der sogenannte „Trypanblaufärbetest“, der als Routinetest einfach und schnell

anzuwenden ist. Trypanblau ist ein saurer Farbstoff, der als Anion sehr leicht

Proteine binden kann. Die Farbstoffaufnahme ist stark abhängig von der Färbedauer

sowie temperatur- und pH-abhängig. Es ist weiterhin zu berücksichtigen, dass mit

möglichst wenig Serum im Medium gearbeitet werden sollte, da sich die Anzahl der

gefärbten Zellen bei hoher Serumkonzentration drastisch vermindert und so eine

vorhandene Lebensfähigkeit vorgetäuscht wird.

Durchführung:

Es wurden 2,5x105 Zellen der jeweiligen Testansätze in Eppendorfreaktionsgefäße

(1,5ml) pipettiert und in der Biofuge A (Heraeus Sepatech) zenrifugiert (S117: 3 min

1000U (174xg), MX1 4 min 1500U (390xg)). Anschließend wurde der Überstand

dekantiert und die Zellen in 50µl PBS resuspendiert. Die vorgewärmte 0,4%ige

Trypanblaulösung wurde nun in einem Verhältnis von 1:1 mit der Zellsuspension

vermengt und für 3 Minuten bei 37°C inkubiert, um danach mit der Auszählung in der

Neubauer-Zählkammer zu beginnen. Hierbei wurden die nicht gefärbten Zellen als

lebendig und durchgängig blau gefärbte Zellen als tot betrachtet. Der Prozentsatz an

toten Zellen wurde nach folgender Formel ermittelt:

tote Zellen in % = Anzahl blau gefärbter Zellen x 100

Gesamtzellzahl

Material und Methoden

23

II.2.4.2 Comet – Assay Prinzip:

Der Comet-Assay, auch Einzelzellgelelektrophorese genannt, hat sich als eine

sensitive und zuverlässige Methode bewährt, um DNA-Schäden wie DNA-

Strangbrüche oder DNA-Cross-links an einzelnen Zellen nachzuweisen. Erstmals

wurde er von Östling und Johannson beschrieben (Östling und Johannson, 1984).

In einer modifizierten Version nach Singh wurde der Assay in einem alkalischen

Milieu durchgeführt (Singh et al., 1988). Dieser erleichtert die Denaturierung und

Entspiralisierung der DNA. Die Zellen werden in einer Agaroseschicht auf einen

Objektträger gegeben und lysiert. In der Elektrophorese wandert die negativ

geladene DNA zur Anode. Je kürzer die DNA-Einzelstränge sind, um so weiter

und schneller wandern sie, d.h. je kleiner die Bruchstücke sind, um so länger ist

die zurückgelegte Strecke und damit der Cometschweif. Nach Schweiflänge

wurden die Cometen in verschiedene Klassen eingeteilt. In der „Klasse 1“ stellt

sich nur der Kern der Tumorzelle dar, welcher als „Kopf“ bezeichnet wird. Bei der

„Klasse 2“ sind wenige DNA-Bruchstücke gewandert, der Schweif ist kürzer als

der Kopf. In der „Klasse 3“ sind die Cometschweife länger als der Kopf, und bei

der „Klasse 4“ liegt eine maximale Schweifbildung vor (siehe Abb. 4-7).

Neben den Versuchsansätzen mit verschiedenen Konzentrationen von 4-OH-

Trofosfamid wurde stets eine Probe ohne jegliche Zugabevon Zytostatika - Lösung

und eine weitere mit 200µM Methylmethansulfonat (MMS) angesetzt. MMS ist ein

bekannter direkter DNA-Alkylierer, der als Standardreagenz zur

Strangbruchbildung eingesetzt wird (Pfuhler, 1996; Speit, 1999).

Bei jeder Probe wurde die Lebensfähigkeit der Zellen mit dem

„Trypanblaufärbetest“ ermittelt. Der Anteil der toten Zellen sollte 15% (bezogen auf

die unbehandelte Kontrollgruppe) nicht überschreiten, da ansonsten nicht zu

differenzieren wäre, ob die Cometschweifbildung auf eine DNA-Fragmentation im

Verlauf der Zellapoptose zurückzuführen ist oder ob in der lebenden Tumorzelle

DNA-Strangbrüche durch das Zytostatikum entstanden sind.

Material und Methoden

24

Abb.4: Klasse 1 – Comet ohne erkenn-bare Schweifbildung (400fache Vergrößerung)

Abb.5: Klasse 2 – Comet mit beginnender Schweifbildung (400fache Vergrößerung)

Abb.6: Klasse 3 – Comet mit fort-geschrittener Schweifbildung(400fache Vergrößerung)

Abb.7: Klasse 4 – Comet mit maximal ausgebildetem Schweif (400fache Vergrößerung)

Material und Methoden

25

Durchführung:

Es wurden 2x106 Tumorzellen pro Kulturflasche (25cm2 Nunclon) eingesät. Nach

24 Stunden erfolgte ein Mediumwechsel und die Zugabe der Zytostatika. Hierzu

wurde das Medium und die nicht adhärenten Zellen abgesaugt, die Kulturflaschen

mit 5ml NaCl – Lösung gespült und 9ml frisches Medium auf die Zellen gegeben.

Im Anschluss wurde jeweils 1ml Zytostatika - Lösung hinzupipettiert. Die Kontrolle

erhielt entsprechend 1ml Medium. Die Zellkulturansätze wurden vier Stunden im

Zellkulturschrank (Hera Cell, Heraeus) inkubiert (37°C, pH2O 47mmHg, 95%O2,

5%CO2). Anschließend wurden die Zellen (wie unter II.2.1 beschrieben) trypsiniert

und in Falkonröhrchen (50ml, Sarstedt) bei 1000 bzw. 1500 U/min (174xg bzw.

390xg) für 3 Minuten zentrifugiert (Megafuge 1,0 Heraeus). Nach der

Resuspension der Zellen im Medium wurde die Zellzahl, wie unter (II.2.1)

beschrieben, bestimmt. Es wurden jeweils 175 000 Zellen in ein Reaktionsgefäß

(Eppendorf 1,5ml) pipettiert, nochmals zenrifugiert, der Überstand dekantiert und

die Zellen in 50µl PBS resuspendiert.

Abb.8: Objektträgerbeschichtung: schematische Darstellung des so genannten Sandwichgels LMP = low melting point = niedriger Schmelzpunkt NMP = normal melting point = normaler Schmelzpunkt

Objektträgerbeschichtung:

NMP-Agarose (Sigma) wurde in PBS 0,75%ig aufgelöst und bei 60°C im

Wärmeblock in 1,5ml-Reaktionsgefäßen warm gehalten, um das Aushärten zu

verhindern. Aufgeraute Objektträger (Dakin Fully Frosted) wurden mit 250µl der

flüssigen Agarose beschichtet, mit einem Deckglas (24x60mm) luftblasenfrei

eingedeckelt und 15 Minuten im Kühlschrank (4°C) ausgehärtet. Anschließend

wurde das Deckglas vorsichtig entfernt. 333µl 0,5%iger LMP-Agarose (40°C, in

PBS) wurden mit 50µl Zellsuspension (s.o.) vermischt, hiervon wurden 75µl als 2.

aufgerauter Objektträger

Grundschicht (250µl NMP-Agarose)

Zellschicht (75µl LMP-Agarose)

Deckschicht (100µl LMP-Agarose)

Material und Methoden

26

Schicht auf die Objektträger pipettiert und mit einem Deckglas bedeckt, damit sich

die Zellen gleichmäßig auf der ersten Schicht verteilten. Wieder erhärtete das Gel

innerhalb von 15 Minuten im Kühlschrank. Die letzte Schicht, 100µl LMP-Agarose,

wurde nach vorsichtiger Entfernung des Deckglases aufgetragen, eingedeckt und

weitere 15 Minuten im Kühlschrank gefestigt. Nach erneuter Entfernung des

Deckglases wurden die Objektträger in eine Küvette gestellt und mit frisch fertig

gestelltem Lysepuffer (4°C) (2,5M NaCl, 100mM EDTA, 10mM Tris, 1% Na-

Sarcosinat, in PBS gelöst, pH 11, mit Zugabe von 1%Triton x 100, 10% DMSO

direkt vor Gebrauch) im Kühlschrank bei 4°C für eine Stunde inkubiert. Im

Anschluss folgte eine 20 minütige Inkubation mit Elektrophoresepuffer (4°C)

(300mM NaOH, 1mM EDTA in H2O, pH10). Danach wurde die

Elektrophoresekammer (Werner Hassa GmbH Maxicel Primo EC 340) mit den

Objektträgern bestückt und anschließend mit dem Elektrophoresepuffer aufgefüllt,

bis die Objektträger ca. 2mm hoch bedeckt waren. Die elektrische Spannung (U)

wurde auf 25 Volt und die Stromstärke auf 300 mA eingestellt. Schwankungen in

der Stromstärke wurden durch Zugabe oder Abnahme von Elektrophoresepuffer

ausgeglichen. Hierbei wurde Widerstand durch Zugabe von Elektrophoresepuffer

vermindert, d.h. Stromstärke bei konstanter Spannung entsprechend vergrößert.

Nach 20 minütiger Elektrophorese wurden die Objektträger wieder in die Küvette

gestellt und dreimal gewaschen. Dazu wurde die Küvette mit 4°C - kaltem PBS

gefüllt und fünf Minuten lang im Kühlschrank inkubiert. Die DNA wurde mit

Ethidiumbromid (EB) in einem abgedunkelten Raum gefärbt, da EB UV-instabil ist.

40µl EB-Lösung (Sigma, 4%ig in PBS gelöst) wurden auf die 3. Agaroseschicht

pipettiert und mit einem Deckglas abgedeckt und am Fluoreszensmikroskop

(Zeiss) mit einem CY-3 Filter ausgewertet. Pro Versuchsansatz wurden zwei

Objektträger manuell durch mäanderförmiges Absuchen unter dem Mikroskop

ausgewertet. Hierbei wurden ca. 100 Cometen ausgezählt und klassifiziert. Dieses

wurde durch beispielhafte Fotos dokumentiert (Software: „isis3“ Meta systems).

Material und Methoden

27

II.2.5 DNA-Isolation Prinzip:

Aus den beiden Tumorzelllinien S117 und MX1 wurde die DNA durch eine

modifizierte Version des Nuncleon Protokolls (Scotlab GmbH) isoliert, um sie auf

DNA-DNA-Cross-links zu untersuchen. Mit dieser Methode wird sowohl eine hohe

Quantität als auch ein hoher Reinheitsgrad der DNA erreicht. Dafür wurden die

Zellen in einem Puffer lysiert und anschließend in 3 Phasen aufgetrennt. Die DNA

wurde mittels Ethanol ausgefällt und in einem Puffer gelöst. Die DNA-Menge

wurde photometrisch ermittelt.

Abb.9: Die DNA-haltige Phase wird in ein Falkonröhrchen pipettiert, die DNA durch Ethanol ausgefällt und so makroskopisch sichtbar gemacht, um sie für die nachfolgende Analyse in ein weiteres Reaktionsgefäß überführen zu können.

DNA

Ethanol 96%ig

DNA

Ethanol 96%ig

Chl

orof

orm P

rote

in

DNA

Material und Methoden

28

Durchführung:

24 Stunden nach der Einsaat von mindestens 2x106 Tumorzellen pro Kulturflasche

(Nunclon 25 cm2) folgte nach Entfernung des Mediums die 4 stündige Inkubation

mit dem Zytostatikum im Brutschrank (Heraeus) (37°C, pH2O 47mmHg; 95% O2,

5% CO2). Anschließend wurden die Zellen (wie unter II.2.1 beschrieben) aus den

Kulturflaschen entfernt, jede Probe in ein Falkonröhrchen (50ml) überführt und bei

1000 bzw. 1500 U/min (174xg bzw. 390xg) drei Minuten zentrifugiert. Das so

entstandene Pellet wurde durch Resuspension in NaCl-Lösung (0,9%) und

Zentrifugation gewaschen. Die Tumorzellen wurden in 2ml Reagenz B (400mM

Tris-HCl, pH 8, 60mM EDTA, 150mM NaCl, 1% SDS in H2O) lysiert und in ein

Polypropylen-Röhrchen (Becton-Dickinson) (5ml Falkon) überführt.

Nach Zugabe von 500µl NaClO4 und 15 minütigem Invertieren erfolgte eine 25

minütige Inkubation im Wasserbad bei 65°C, währenddessen die Reagenzgefäße

alle 5 Minuten geschwenkt wurden. Nach Zugabe von 2ml Chloroform (-20°C)

folgte ein Inversionsvorgang von 10 Minuten. Durch 4 minütige Zentrifugation bei

1400xg entstanden 3 Phasen. Die obere DNA–haltige Phase wurde in ein

Falkonröhrchen (50ml) pipettiert. Nach Zugabe von 5ml eiskaltem 96%igen

Ethanol fiel die DNA aus, so dass sie makroskopisch sichtbar wurde. Durch

Schütteln des Röhrchens bildete sich aus dem DNA-Faden ein Knäuel, welches

aus dem Alkohol entfernt und in ein Reaktionsgefäß (1,5 ml Eppendorf) überführt

wurde. Nach dreimaligem Waschen der DNA mit eiskaltem 70%igen Ethanol

wurde der Alkohol dekantiert. Nach ca. 15 minütiger Verdunstung letzter

Ethanoltropfen wurde die DNA in 150µl TE-Puffer (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,

pH 8,0) gelöst und über Nacht im Kühlschrank bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag

wurden die Proben je nach Viskosität bis zur Pipettierfähigkeit durch Zugabe von

TE-Puffer verdünnt.

Der DNA-Gehalt wurde mit einem DNA-RNA-Kalkulator (Gene Quant II-

Photometer) spektralphotometrisch bestimmt, um sicherzustellen, dass eine

möglichst geringe Verunreinigung vorliegt. Dazu wurde die DNA-Probe in einem

Verhältnis 50:1 mit 10 molarem TE-Puffer verdünnt, gut durchmischt und in die

Küvette des Kalkulators gegeben. Bei einer Wellenlänge von 260nm wurde der

Gehalt an doppelsträngiger DNA bestimmt, dabei wurde ein Abgleich von 260nm

Material und Methoden

29

gegen 280nm durchgeführt. Alle Proben wurden doppelt gemessen, und anhand

der Ergebnisse wurde die DNA-Konzentration in 1,5 ml-Reaktionsgefäßen auf

75µg pro ml eingestellt.

Material und Methoden

30

II.2. 6. Fluorometrischer Cross-link-Assay Prinzip:

Der Nachweis von Interstrang-Cross-links erfolgte nach dem Prinzip von P.G.

Penketh, der 1997 einen Assay beschrieb, der bei einem physiologischen pH-Wert

durchführbar ist (Penketh et al., 1997). Interstrang-Cross-links sind kovalente

Bindungen zwischen einem komplementären Basenpaar der DNA. Um die aus

den Tumorzellen gewonnene DNA auf Cross-links zu untersuchen, wird sie mit

einem blau fluoreszierenden Bisbenzimidfarbstoff Hoechst 33258 gefärbt, der

vornehmlich an doppelsträngiger DNA (ds DNA) bindet. Der Nachweis von DNA-

DNA-Interstrang-Cross-links basiert auf den unterschiedlichen

Reaktionsmechanismen von DNA, die durch Cross-links verbunden ist, im

Vergleich zu Cross-link-freier DNA. Bei einem Erhitzungsvorgang wird die

doppelsträngige DNA in Einzelstränge aufgetrennt. Bei der anschließenden

Abkühlung der DNA unterliegt die Cross-link-freie DNA einer Fehlpaarung der

Basen, so dass die komplementären DNA-Stränge nicht mehr zusammenfinden

können. Im Gegensatz dazu finden die DNA-Stränge der durch Cross-links

teilweise verbundenen DNA sehr schnell wieder zusammen. An diesen Stellen

kann nun der Farbstoff wieder binden. Die so angefärbte DNA wird von Licht der

Wellenlänge 365nm angeregt. Die Emission wird mit einem

Spektralfluorophotometer (Shimadzu RF-1501) vor und nach dem Erhitzen bei

460nm gemessen. Bei Negativkontrolle werden die Tumorzellen ohne Zytostatika

inkubiert und bei der Positivkontrolle mit Cisplatin vorbehandelt, das nachweislich

Cross-links hervorruft (Roberts und Pascoe, 1972; Sullivan et al., 2002). Bei der

Negativprobe sinkt die Fluoreszenzintensität nach dem Erhitzen auf ein Minimum.

Bei den behandelten Proben, die Cross-links aufweisen, fällt die

Fluoreszenzintensität weniger stark ab. Um die erhobenen Daten zu normalisieren

und das Ausmaß der Crosslinkbildung zu verdeutlichen, wurde die folgende

Formel angewendet:

Material und Methoden

31

(E N / E V) – (K N / K V) = %-Anteil Cross-links

( 1- (K N / K V))

E N = Fluoreszenzintensität der Probe nach dem Hitze-Kälte-Zyklus

E V = Fluoreszenzintensität der Probe vor dem Hitze-Kälte-Zyklus

K N = Fluoreszenzintensität der Kontrollprobe nach dem Hitze-Kälte-Zyklus

K V = Fluoreszenzintensität der Kontrollprobe vor dem Hitze-Kälte-Zyklus

DNA ohne Cross-links: DNA mit Cross-links:

Abb.10: Auftrennung der DNA in Einzelstränge durch den Erhitzungs- und Abkühlungsvorgang aufgezeigt an DNA mit und ohne DNA-Interstrang-Cross-links

dsDNA vor dem Erhitzen

ssDNA nach dem Erhitzen

ssDNA nach dem Abkühlen

dsDNA nach dem Erhitzen

dsDNA vor dem Erhitzen

dsDNA nach dem Abkühlen

Material und Methoden

32

Durchführung:

Die DNA aus den Tumorzellen wurde in TE-Puffer (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,

pH 8,0 in H2O) gelöst und auf eine Konzentration von 75 µg/ml eingestellt. 15µl

aus jedem Ansatz wurden nun in 1,5 ml der Farbstofflösung (0,1µg/ml Höchst

33258 in 1,5 ml 5 mM Tris-HCL, 0,5mM EDTA) transferiert, um eine DNA-

Konzentration von 0,75 µg/ml zu erhalten. Da der verwendete Fluoreszenzfarbstoff

(2´-(4-hydroxyphenyl)-5-(4-methyl-1piperazinyl)-2,5´bi-1H-benzimidazol, Sigma),

bei UV-Licht instabil wird, mussten die Gefäße mit Aluminiumfolie umwickelt

werden. Zunächst wurde die Fluoreszenz mit dem Spektralfluorophotometer

gemessen, dann wurden die Proben für jeweils fünf Minuten im Wasserbad bei

96°C erhitzt, in ein Eiswasserbad gestellt und anschließend in einem Wasserbad

bei 21°C inkubiert. Danach folgte die zweite Fluoreszenzmessung aller Proben am

Spektralfluorophotometer, und der prozentuale Crosslinkanteil wurde durch die

oben genannte Formel ermittelt.

Material und Methoden

33

II.7 Biometrie und Statistik

Die Erstellung der Graphiken und die statistische Analyse folgender Parameter

erfolgte mit dem Computerprogramm ExcelTM: Mittelwert, Median,

Standardabweichung, Standardfehler. Zum Vergleich der Mittelwerte der zu

untersuchenden Größen zweier unabhängiger Gruppen wurde der Mann-Whitney

U-Test verwendet. Ein Signifikanzniveau (p) von <0,05 wurde als statistisch

signifikant gewertet. Sämtliche Daten wurden zuvor per Hand in den Computer

eingegeben.

Ergebnisse

34

III. Ergebnisse

III.1. MTT-Assay Beide Tumorzelllinien, das Weichteilsarkom aus der Schilddrüse S117 und das

Mammakarzinom MX1, wurden mit den drei verschiedenen aktiven

Oxazaphosphorinmetaboliten Mafosfamid, 4-OH-Ifosfamid und 4-OH-Trofosfamid

drei bzw. vier Tage im Brutschrank inkubiert. Da Mafosfamid im Tumorzellmedium

im äquimolaren Verhältnis zu 4-OH-Cyclofosfamid und Mesna zerfällt, wurde auch

zu 4-OH-Trofosfamid und 4-OH-Ifosfamid Mesna im äquimolaren Verhältnis

zugefügt.

Im Vergleich der drei aktiven 4-OH-Metabolite der Oxazaphosphorine läßt sich bei

beiden Zelllinien beobachten, dass 4-OH-Trofosfamid (+Mesna) ein signifikant

höheres zytotoxisches Potential aufweist als 4-OH-Ifosfamid (+Mesna). Besonders

ausgeprägt ist dieser Effekt auf die Zelllinie MX1. Hier liegt die IC50 (inhibierende

Konzentration, bei der 50% der Zellen sterben) von 4-OH-Ifosfamid (+Mesna) fast

doppelt so hoch wie die von 4-OH-Trofosfamid (+Mesna) (IC50: 4-OH-

Ifosfamid+Mesna = 3,2µM, 4-OH-Trofosfamid + Mesna = 1,7µM). Zudem wird

deutlich, dass - verglichen mit Mafosfamid - sogar noch geringere Konzentrationen

von 4-OH-Trofosfamid (+Mesna) genügen, um die Zellzahl des Mammakarzinoms

auf die Hälfte zu reduzieren (IC50 Mafosfamid = 2,8µM).

Bei allen Oxazaphosphorinmetaboliten ist zu beobachten, dass die IC50–Werte

des Mammakarzinoms wesentlich niedriger sind als für das Weichteilsarkom der

Schilddrüse. Hier liegt die IC50 für 4-OH-Trofosfamid (+Mesna) um das Achtfache

höher als beim Mammakarzinom (IC50 = 13,99µM) und damit über dem Wert von

Mafosfamid (IC50 = 11,05), das an der Zelllinie S117 am stärksten zytotoxisch

wirkt. Auch hier ist Ifosfamid (+Mesna) mit einer IC50 von 19,95µM am wenigsten

zytotoxisch wirksam (siehe Abb.11 und 12).

Die gleichzeitige Gabe von Mesna in äquimolaren Konzentrationen ergab bei der

Gabe von 4-OH-Trofosfamid in den Konzentrationen von 5 bis 50µM (S117) bzw.

0,5 bis 30µM (MX1) und der IC50 keinen signifikanten Unterschied bezüglich der

Zytotoxizität auf beide Zelllinien (P>0,5). Ebenfalls ergibt sich keine Signifikanz

Ergebnisse

35

(P>0,05) beim Vergleich der Zytotoxizität von 4-OH-Ifosfamid als Einzelsubstanz

bzw. in Kombination mit Mesna. Im Verlauf des Zellüberlebens der S117

Tumorzellen wurde bei einer einzigen Konzentration (20µM 4-OH-Ifosfamid) ein

signifikanter Unterschied gemessen (P = 0,034). Ansonsten konnte durch Zugabe

von Mesna bei beiden Zelllinien kein signifikanter Unterschied in der Zytotoxizität

bestimmt werden (siehe Abb.13 und 14).

Ergebnisse

36

0 20 40 60 80

100

0 5 10 15 20 25 30 40 50

4OH-Trofosfamid + Mesna

4OH-Ifosfamid + Mesna

Mafosfamid

Zellü

berle

bens

rate

in %

Zytostatikakonzentration [µM]

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20 25 30 35 40

4OH-Trofosfamid + Mesna

4OH-Ifosfamid + Mesna

Mafosfamid

Zellü

berle

bens

rate

in %

Zytostatikakonzentration [µM]

Abb.11: Zellüberlebensrate im Vergleich für die Zelllinie MX1 nach viertägiger Inkubation, Mittelwerte mit SEM, n = 30

Abb.12: Vergleich der Zellüberlebensrate für die Zelllinie S117 nach dreitätiger Inkubation, Mittelwert mit SEM, n = 23

Ergebnisse

37

Abb.13: Vergleich der IC50 – Werte für die Zelllinie MX1 nach viertägiger Inkubation. n = 30, Mittelwerte mit SEM (M = Mesna, T = 4-OH-Trofosfamid, I = 4OH-Ifosfamid, * = signifikant gegen 4-OH-Trofosfamid+Mesna (= P < 0,05), n.s. = nicht signifikant untereinander (= P > 0,05))

0 1 2 3 4

T + M T I + M I Mafo

Zyto

stat

ikak

onze

ntra

tion

[µM

] *

*

5 n.s.

n.s.

Abb.14: IC50 – Werte im Vergleich für die Zelllinie S117 nach dreitägiger Inkubation. n = 23, Mittelwerte mit SEM (M = Mesna, T = 4-OH-Trofosfamid, I = 4-OH-Ifosfamid, * = signifikant gegen 4-OH-Trofosfamid+Mesna (= P < 0,05), n.s. = nicht signifikant untereinander (= P > 0,05))

0

5

10

15

20

25

30

I + M T I Mafo T + M

*

*

n.s. n.s.

Zyto

stat

ikak

onze

ntra

tion

[µM

]

Ergebnisse

38

III.2.1 Trypanblau-Färbung

Diese Färbung erfolgte zur Überprüfung der Überlebensrate der verwendeten

Zellen des Comet-Assays. Vollständig blau gefärbte Zellen wurden als tot

betrachtet. In den Versuchsansätzen ergaben sich die in den Tabellen 3 und 4 (s.

VII.3 im Anhang) aufgeführten Überlebensraten. Es wurden niemals Werte über

15% erreicht, so dass davon ausgegangen werden kann, dass die Bildung der

Cometen auf die Wirkung der Zytostatika zurückzuführen ist. So konnte vermieden

werden, dass die beim Zelltod auftretende DNA-Fragmentation die

Beobachtungen verfälscht.

Ergebnisse

39

III.2.2 Comet – Assay - Einzelzellgelelektrophorese

Jeder Objektträger wurde manuell mäanderförmig unter dem

Fluoreszensmikroskop betrachtet und die Anzahl der verschiedenen Arten der

Cometen - Klasse eins bis vier bestimmt (Klassifizierung siehe unter II.2.4).

Als Kontrollgruppen wurden unbehandelte Zellen der jeweiligen Tumorzelllinie

sowie mit 200µM Methylmethansulfonat (MMS) behandelte Zellen untersucht. Wie

bereits mehrfach nachgewiesen (Miyamae et al., 1998; Pfuhler und Wolf, 1996,

Speit et al. 1999), zeigte sich durch MMS auch in diesen Versuchsreihen eine

maximale Strangbruchbildung. Die mit MMS inkubierten Proben wiesen zu 100%

Klasse 4–Cometen auf. Bei beiden Tumoren stellte sich heraus, dass fast 90% der

Zellen in der unbehandelten Gruppe keinen DNA-Schaden aufwiesen, d.h.

hauptsächlich Cometen der Klasse 1 zu sehen waren. Im Mittel zeigten sich im

Kontrollansatz ohne Zugabe eines Zytostatikums zu etwa 7% Klasse 4–Cometen

(siehe Abb.15 und 16).

Die verwendeten Konzentrationen an 4-OH-Trofosfamid lagen bei dem MX1-

Tumor zwischen dem 0,4 und dem 94 fachen IC50 (inhibiting concentration, durch

den MTT-Assay ermittelt, siehe III.2). Bei der S117 Zelllinie ergab sich ein Bereich

zwischen der 0,04 und 5,7 fachen Konzentration der IC50. Es zeigte sich, dass 4-

OH-Trofosfamid mit steigender Konzentration mehr Strangbrüche verursachte. Die

Anzahl der Zellen, bei denen Schweife sichtbar wurden, stieg an und es

vergrößerte sich zudem die Schweiflänge. Das heißt, der Anteil an Klasse 1-

Cometen nahm zugunsten der Klasse 2- und Klasse 3-Cometen stetig ab, wobei

die Klasse 4–Cometen meist unter 20% blieben.

Bei dem Mammakarzinom MX1 waren die ersten Cometschweife ab einer

Konzentration von 2,5µM zu beobachten. Dies entspricht in etwa dem

anderthalbfachen der IC50. Bei der höchsten Konzentration von 160µM hatten sich

aus der DNA von über 85% der Zellen Cometschweife der Klasse 2 und 3 gebildet

(siehe Abb. 17 und 19).

Das Sarkom S117 zeigte schon bei einer Konzentration von 80µM einen

maximalen Anteil der Cometschweif-Bildung in der Klasse 2 und 3 von über 95%.

Ergebnisse

40

Ein erster deutlicher Anstieg der Cometen der Klasse 2 und 3 ergab sich schon ab

dem 0,4 fachen der im MTT-Assay ermittelten IC50 bei 5µM (siehe Abb.18 und 20).

Abb.15 zeigt eine repräsentative Aufnahme der Cometen am Beispiel des Weichteilsarkoms S117, wie sie in der unbehandelten Kontrollgruppe hauptsächlich zu beobachten waren (400fache Vergrößerung).

Abb.16 zeigt ein beispielhaftes Bild der Cometen nach Inkubation der S117 Zellen mit MMS (200µM), das hauptsächlich Klasse 4 – Cometen aufweist (200fache Vergrößerung).

Ergebnisse

41

Abb.17 zeigt die typische Schweifbildung nach Behandlung der MX1 – Zelllinie mit 160 µM 4-OH-Trofosfamid. Oben rechtsliegen 2 Cometen der Klasse 3, unten links ein Klasse 4 –Comet und oben einer der Klasse 2 (400fache Vergrößerung).

Abb.18 zeigt ein typisches Comet-Bild der S117 – Zelllinie nach Behandlung mit 40 µM 4-OH-Trofosfamid. Klassifizierung: Oben links ist ein Klasse 4-, mittig und rechts oben ein Klasse 3- und rechts unten ein Klasse 2 – Comet zusehen (400fache Vergrößerung).

Ergebnisse

42

Darüber hinaus konnte bei dem Vergleich von 4-OH-Trofosfamid mit der

Kombination aus 4-OH-Trofosfamid und Mesna (im äquimolaren Verhältnis) bei

beiden Tumoren kaum ein Unterschied in der Schweifbildung erkannt werden.

Ergebnisse

43

C

omet

- K

lass

en -

Ant

eil i

n %

Klasse 2 Klasse 1

Klasse 3 Klasse 4

4-OH-Trofosfamid + Mesna (äquimolar) [µM]

0

20

40

60

80

100

Kontrolle 0,6 1,25 2,5 5 10 20 40 80 160

Abb.19: Mammakarzinom MX1 Prozentualer Anstieg der Cometenbildung unter ansteigender Dosis von 4-OH-Trofosfamid + Mesna (n = 3) im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe (n = 12), Mittelwerte

Klasse 2 Klasse 1

Klasse 3 Klasse 4

Com

et -

Kla

ssen

- A

ntei

l in

%

4-OH-Trofosfamid + Mesna (äquimolar) [µM]

0

20

40

60

80

100

Kontrolle 0,6 1,25 2,5 5 10 20 40 80

Abb.20: Weichteilsarkom der Schilddrüse S117 Prozentualer Anstieg der Cometenbildung unter ansteigender Dosis von 4-OH-Trofosfamid + Mesna (n = 3) im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe (n = 8), Mittelwerte

Ergebnisse

44

III.3.1 Validierung des Cross-link-Assays am Spectralfluorophotometer

Zunächst wurde ermittelt, wie stark die Schwankungen innerhalb eines

Versuchsansatzes, d.h. innerhalb einer Zellpassage sind (Tab.1). Dazu wurde die

DNA aus den Tumorzellen (MX1) nach dem Protokoll von II.2.5 isoliert und

hieraus sechs verschiedene Proben angesetzt. Die Extinktionen wurden, wie unter

II.2.6 beschrieben, vor und nach dem Hitze-Kälte-Zyklus ermittelt. Anschließend

wurden mit Hilfe der Computersoftware ExcelTM die Mittelwerte, die

Standardabweichungen, der Standardfehler und die Variationskoeffizienten

berechnet.

Tabelle 1: ermittelter Extinktionsabfall der unbehandelten Kontrolle

Extinktion vor dem

Erhitzungszyklus

Extinktion nach dem

Erhitzungszyklus

Extinktion nach dem

Erhitzungszyklus in %

803,55 82,55 10,27

781,4 63,95 8,18

814,8 68,1 8,36

830,35 70,7 8,51

773,2 92,15 11,91

758,15 74,9 9,88

Mittelwert 793,58 75,39 9,52

Standardabweichung 24,9 9,95 1,328

Standardfehler 9,96 3,79 0,53

Variationskoeffizient 3,1 % 12,6 % 13,96 %

Die Fluoreszenz nicht behandelter DNA fällt nach dem Erhitzungsvorgang stark ab

(auf 9,52% des Ausgangswertes), da sich ohne Zugabe von Zytostatika keine

Cross-links gebildet haben. Die Standardabweichung, der Standardfehler und der

Variationskoeffizient (Präzision) sind sehr gering und entsprechen somit unseren

Akzeptanzkriterien.

Tabelle 1 zeigt den Extinktionsabfall und dessen Streuungen innerhalb eines Versuchansatzes anhand unbehandelter DNA der Zelllinie MX 1. (n = 6)

Ergebnisse

45

Um zu ermitteln, wie groß die Streuung der gemessenen Extinktionen zwischen

den einzelnen Versuchstagen ist, wurden an acht verschiedenen Passagen der

Zelllinie MX1 an unterschiedlichen Tagen die Extinktion ermittelt. Es wurde jeweils

die unbehandelte Kontrollgruppe untersucht.

Tabelle 2: Streuung der Extinktion an acht unterschiedlichen Tagen (MX1)

Extinktion vor dem

Erhitzungszyklus

Extinktion nach dem

Erhitzungszyklus

Extinktion nach dem

Erhitzungszyklus in %

753,26 84,43 11,2

816 82,7 10,13

506,4 74,51 14,7

538,96 95,8 17,77

848,2 116,8 13,77

641,2 74,35 11,6

619,25 70,15 11,33

825,75 69,65 8,43

Mittelwert 693,6275 83,54875 12,36625 Standardabweichung 126,064 14,984 2,742 Standardfehler 44,577 5,299 0,969 Variationskoeffizient 18,2 % 17,9 % 22,2 %

Die Streuung zwischen den Messtagen erweist sich als gering und entspricht

somit unseren Kriterien, die Messgenauigkeit zu akzeptieren.

Tabelle 2 zeigt den Extinktionsabfall und dessen Streuung an acht verschiedenen Versuchansätzen anhand unbehandelter DNA der Zelllinie MX 1. (n = 8)

Ergebnisse

46

Tabelle 3: Streuung der Extinktion an fünf unterschiedlichen Tagen (S117)

Extinktion vor dem

Erhitzungszyklus

Extinktion nach dem

Erhitzungszyklus

Extinktion nach dem

Erhitzungszyklus in % 630.675 51,55 8,17

827,47 98,92 11,95

370,35 53,2 14,36

514,55 112,1 21,79

528 67,5 12,78

Mittelwert 574 77 14 Standardabweichung 151,382 24,561 4,479 Standardfehler 67,702 10,984 2,003 Variationskoeffizient 26,4 % 32,0 % 32,4 %

Tabelle 3 zeigt den Extinktionsabfall und dessen Streuungen an fünf verschiedenen Versuchansätzen anhand unbehandelter DNA der Zelllinie S117. (n = 5)

Ergebnisse

47

III.3.2 Fluorometrischer Cross-link-Assay

Als Kontrollgruppen wurden unbehandelte Zellen der jeweiligen Tumorzelllinie

sowie mit 100µM Cisplatin behandelte Zellen untersucht. Bei der unbehandelten

Kontrollgruppe fiel die Extinktion nach dem Erhitzen bei MX1 im Mittel auf 12,36 %

und bei S117 auf 14 % ab. (siehe Validierung unter III.3.1)

(EN / EV) – (KN / KV)

= %-Anteil Cross-links

(1- KN / KV)

EN = Fluoreszenzintensität der Probe nach dem Hitze-Kälte-Zyklus

EV = Fluoreszenzintensität der Probe vor dem Hitze-Kälte-Zyklus

KN = Fluoreszenzintensität der Kontrolle nach dem Hitze-Kälte-Zyklus

KV = Fluoreszenzintensität der Kontrolle vor dem Hitze-Kälte-Zyklus

Bei beiden Tumoren kam es nach Gabe von Cisplatin zu einer deutlichen Bildung

von Cross-links, da die Fluoreszenzintensität nur auf ca. 40% der

Ausgangsfluoreszenz abfiel. Dies ergibt unter Einbezug der unbehandelten

Kontrollgruppe durch die oben genannte Formel einen prozentualen Cross–link–

Anteil von über 30% (siehe Abb.21 und 22).

4-OH-Trofosfamid konnte nach der vierstündigen Inkubationszeit mit dem

Weichteilsarkom S117 in den Konzentrationen von 20 bis 320µM keine

nachweisbaren Cross-links erzeugen (siehe Abb.21). Die gemessenen Werte

überschreiten nicht den Bereich der zu erwartenden Streuungen eines

Kontrollansatzes. Da in der Literatur bereits die Bildung von Cross-links durch

Metabolite der Oxazaphosphorine beschrieben wurde, sollten sehr hohe

Konzentrationen verwendet und die Induktion von Cross-links nochmals überprüft

werden. Selbst bei diesen Einzelversuchen mit extrem hohen zytotoxischen

Konzentrationen von 3,2mM und 6,5mM 4-OH-Trofosfamid wurde nur ein geringer

prozentualer Cross-link-Anteil gemessen (6,8% und 5,9%).

Auch bei dem Mammakarzinom konnte in den Konzentrationen von 20 bis 80 µM

keine Bildung von Cross-links gemessen werden. Lediglich bei einer

Ergebnisse

48

Konzentration von 160µM wurde ein Crosslinkanteil von über 5% nachgewiesen

(siehe Abb.22). Die Fluoreszenzintensität fiel auf 16,6% des Ausgangswertes ab.

Dieser Wert liegt knapp über dem Streubereich der Kontrolle (12,37 +- 1.94 =

Mittelwert ± 2 fache Standardabweichung), unterscheidet sich aber von ihr durch

eine Signifikanz von < 0.05 und ist somit als Crosslinkbildung zu interpretieren.

-10

0

10

20

30

40

Cisplatin 20µM 40µM 80µM 160µM 320µM

% *

Abb.21: prozentualer Crosslinkanteil an der DNA der Zelllinie S117 nach vierstündiger Inkubation mit Cisplatin (100µM) bzw. 4-OH-Trofosfamid 20 – 320µM * = signifikant gegen die Kontrolle (P = < 0,05)

-10 0

10 20 30 40

Cisplatin 20µM 40µM 80µM 160µM

*

*

Abb.22: prozentualer Crosslinkanteil an der DNA der Zelllinie MX1 nach vierstündiger Inkubation mit Cisplatin (100µM) bzw. 4-OH-Trofosfamid 20-160µM * = signifikant gegen die Kontrolle (P = < 0,05)

%

Diskussion

49

IV. Diskussion

Die Oxazaphosphorine verfügen über ein breites Indikationsspektrum und gehören

zu den am häufigsten verwendeten und wirkungsvollsten Zytostatika. Trotz

jahrzehntelanger effektiver Anwendung dieser Substanzen sind ihr molekularer

Wirkmechanismus sowie die Antitumorwirkung noch immer nicht genau bekannt.

Trofosfamid ist seit über 30 Jahren als Arzneimittel zugelassen. Zunächst wurde

davon ausgegangen, dass Trofosfamid zu seinen beiden Schwestersubstanzen

abgebaut wird, hauptsächlich zu Ifosfamid und in einem geringeren Teil zu

Cyclophosphamid (Hempel et al., 1997; Kollmannsberger et al., 1999). Da

Trofosfamid nur als orale Formulierung in Tablettenform verfügbar ist, wurde es

lediglich als eine Art orales Ifosfamid betrachtet. Somit schien es nicht notwendig

zu sein, Trofosfamid weiter und genauer zu untersuchen. Jüngste Ergebnisse

unserer Arbeitsgruppe identifizierten allerdings 4-OH-Trofosfamid als

eigenständigen Metaboliten im Abbau von Trofosfamid (Brinker et al., 2002).

Trofosfamid hat bis jetzt im klinischen Einsatz und in experimentellen Arbeiten

wenig Beachtung gefunden, obwohl es erhebliche Vorteile gegenüber anderen

Chemotherapien besitzt. Zum einen ist es für die ambulante Behandlung

besonders gut geeignet, da es zu den wenigen Zytostatika gehört, die oral

appliziert werden. Bei Versuchen, Trofosfamid intravenös zu applizieren, wurden

neben Phlebitis auch andere Nebenwirkungen beobachtet (Drings et al., 1970).

Zum anderen zeigt sich unter der oralen Therapie eine gute Verträglichkeit mit

relativ wenigen Nebenwirkungen (Wist und Risberg, 1991; Wolff et al., 1991;

Mross et al., 1998; Marschner et al., 1999; Brinker et al., 2002). Erst jüngste

Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe an mit Trofosfamid behandelten Patienten

beschrieben bei dem weitaus überwiegenden Teil der Patienten ein Fehlen von

Nebenwirkungen (Dissertation Brinker, 2004; Preiss et al., 2004). Darüber hinaus

konnten Tumorpatienten, die bereits auf die üblicherweise verwendeten

Chemotherapeutika resistente Tumoren aufwiesen, mit Trofosfamid erfolgreich

behandelt werden (Blomquist et al., 1995; Reichardt et al., 2002; Hartmann et al.,

2003).

Diskussion

50

Vor dem Hintergrund dieser außergewöhnlichen Eigenschaften von Trofosfamid

und der Tatsache, dass es noch keine direkt vergleichenden Studien der drei

Oxazaphosphorine gab, war es Ziel dieser Arbeit, die Toxizität von 4-OH-

Trofosfamid, 4-OH-Ifosfamid und 4-OH-Cyclophosphamid zu vergleichen.

Weiterhin sollte das Wirkprofil von 4-OH-Trofosfamid in Bezug auf DNA-Schäden

untersucht werden. Es galt festzustellen, inwiefern DNA-Strangbrüche bzw.

Interstrang-Cross-links für die Toxizität verantwortlich sind.

Da die Oxazaphosphorine so genannte Prodrugs sind, die in vivo erst durch die

mischfunktionellen Oxidasen der Leber zu den 4-OH-Verbindungen hydroxyliert

werden, wurden in den Versuchen die 4-OH-Metabolite eingesetzt. 4-OH-

Cyclophosphamid ist aufgrund seiner Instabilität nur in Form von Mafosfamid

erhältlich. Dies zerfällt nach Lösung im Medium in äquimolarem Verhältnis zu 4-

OH-Cyclophosphamid und Mesna (Mercaptoethansulfonsäure-Natrium) (Pohl,

1983). Um die drei Oxazaphosphorine miteinander vergleichen zu können, wurde

zu den 4-OH-Metaboliten von Trofosfamid und Ifosfamid Mesna in einem

äquimolaren Verhältnis zugefügt.

Diskussion

51

IV.1 Zytotoxisches Potential von 4-OH-Trofosfamid

1995 forderte Barton A. Kamen, einen unmittelbaren Vergleich der verschiedenen

Oxazaphosphorine durchzuführen. Das Ziel sollte es sein, festzustellen, inwiefern

sich die Oxazaphosphosphorine Ifosfamid und Cyclophosphamid in der Stärke

ihrer Zytotoxizität und im Wirkprofil voneinander unterscheiden (Kamen et al.,

1995). Da für Trofosfamid ein eigenständiger Metabolit - das 4-OH-Trofosfamid -

ermittelt wurde, galt es das Wirkspektrum und die Wirkstärke von diesem zu

ermitteln und mit den aktiven Metaboliten von Ifosfamid und Cyclophosphamid zu

vergleichen (Brinker et al., 2002; Preiss et al., 2004).

Die im MTT-Assay ermittelten Daten zeigten deutlich, dass 4-OH-Trofosfamid

wesentlich toxischer auf beide untersuchten Tumorzelllinien wirkt als der 4-OH-

Metabolit von Ifosfamid. Beim Mammakarzinom zeigte sich, dass die Toxizität von

4-OH-Trofosfamid sogar doppelt so hoch ist wie die von 4-OH-Ifosfamid und

ebenfalls stärker ist als die von Mafosfamid. Da die ermittelte benötigte

Konzentration im Bereich der Plasmaspitzenspiegel liegt, ist davon auszugehen,

dass 4-OH-Trofosfamid auch in vivo einen zytotoxischen Effekt gegenüber

Karzinomzellen ausübt. Klinische Studien, die den Einsatz von Trofosfamid an

Patientinnen mit Mammakarzinom untersuchten, bestätigen die von mir in vitro

erhobene Empfindlichkeit dieses Tumors für Trofosfamid (Mross, 1998).

Klinische Studien belegen, dass Weichteilsarkome im Allgemeinen zu den weniger

sensiblen Tumoren gehören. Bei den angewendeten Chemotherapien hat sich

bisher gezeigt, dass Ifosfamid neben Doxorubicin zu den wirksamsten Substanzen

zählt. Diese Arbeit bestätigte die geringere Empfindlichkeit des Weichteilsarkoms

im Vergleich zu dem Mammakarzinom. Die benötigte zytotoxisch wirksame

Konzentration von 4-OH-Trofosfamid liegt deutlich höher als bei dem

Mammakarzinom. In vitro wird etwa die achtfache Menge der gemessenen

Spitzenspiegel im Blut benötigt, um die Sarkomzellen auf die Hälfte zu reduzieren.

Es stellt sich die Frage, ob 4-OH-Trofosfamid auch bei Sarkomen in vivo einen

effektiven zytotoxischen Effekt ausüben kann. Die bisher veröffentlichten Studien

über die Therapie bei Weichteilsarkomen belegen durchaus eine Empfindlichkeit

dieser Tumoren für Trofosfamid (Kollmannberger et al., 1999; Hartmann et al.,

Diskussion

52

2003). Im Vergleich der Zytotoxizität erweist sich Cyclophosphamid am

Weichteilsarkom am wirkungsvollsten, wobei Trofosfamid seiner Wirkung sehr

nahe kommt. Ifosfamid wirkt hingegen am wenigsten zytotoxisch. Es ergibt sich

nach diesen in vitro Ergebnissen ein großer Bedarf, in Studien in vivo zu

untersuchen, ob Trofosfamid nicht sogar dem Ifosfamid vorzuziehen wäre. Es hat

sich in klinischen Studien mit palliativen Therapiezielen bereits gezeigt, dass

Trofosfamid das Überleben der Patienten signifikant verlängern kann, wenn sie

bereits chemotherapeutisch vorbehandelt sind bzw. ein Sarkom schon Metastasen

ausgebildet hat (Blomquist et al., 1995; Reichardt et al., 2002; Hartmann et al.,

2003; Laws et al., 2003).

Die stärkere Wirksamkeit von Trofosfamid auf die Tumorzelle lässt sich vermutlich

zum einen dadurch erklären, dass es lipophiler ist als Cyclophosphamid. Zum

anderen entstehen bei der Metabolisierung drei verschiedene 4-OH-Metabolite,

die alle zytotoxisch wirksam werden, wobei die Menge an 4-OH-Trofosfamid am

größten ist (Brinker et al., 2002; Preiss et al., 2004). Dieser Metabolit hat im

Gegensatz zu den 4-OH-Metaboliten von Ifosfamid und Cyclophosphamid eine

dritte Chlorethylgruppe. Studien konnten belegen, dass es keine komplette

Kreuzresistenz zwischen den Oxazaphosphorinen Ifosfamid und

Cyclophosphamid gibt. Es wurde gezeigt, dass sie mit unterschiedlichen

Abschnitten der DNA reagieren, was vermutlich an der unterschiedlichen

Anordnung der Chlorethylgruppen innerhalb der Moleküle liegt (Burchenal und

Riley, 1949; Dong et al., 1995; Struck et al., 2000). Die dritte Chlorethylgruppe des

Trofosfamids könnte erklären, warum bereits vorbehandelte Tumoren noch

sensibel auf Trofosfamid reagieren. Darüber hinaus könnte dies auch der Grund

für das unterschiedliche Wirkprofil der verschiedenen Oxazaphosphorine sein. 4-

OH-Trofosfamid erwies sich zwar an beiden Tumorzelllinien als zytotoxischer als

Ifosfamid, bei dem Weichteilsarkom war Mafosfamid allerdings etwas wirksamer.

Ein weiterer Grund für den Unterschied hinsichtlich Wirkstärke und Wirkprofil der

4-OH-Metabolite liegt in der anfallenden Menge an Chloracetaldehyd während der

Metabolisierung. Beim Abbau von Trofosfamid entstehen große Mengen an

Chloracetaldehyd, dem eine ganz eigene Zytotoxizität nachgewiesen wurde

(Dissertation Brüggemann 1999; Börner et al., 2000). Im Gegensatz dazu kommen

Diskussion

53

beim Cyclophosphamid nur quantitativ zu vernachlässigende Mengen an

Chloracetaldehyd vor.

Es zeigte sich, dass sich die im MTT-Assay ermittelte halbmaximale inhibierende

Konzentration (IC50) von 4-OH-Trofosfamid durch die Kombination mit Mesna in

äquimolaren Konzentrationen nicht signifikant verändert - weder am

Weichteilsarkom noch am Mammakarzinom. Der von einigen Autoren

angenommene zytoprotektive Effekt von Mesna auf die Tumorzelle scheint erst

bei mehrfach molarem Überschuss aufzutreten (Dissertation Brüggemann, 1999;

Kisro et al., 2000; Kisro et al., 2001). Bei den Untersuchungen von S. Brüggemann

ist außerdem zu bedenken, dass die Tumorzellen dem Mesna längere Zeit

ausgesetzt waren, als dies in vivo zuträfe, da es relativ schnell renal eliminiert

wird. Eine mögliche Erklärung, weshalb Mesna die zytotoxische Wirkung der

Oxazaphosphorinen nicht beeinflusst, ist, dass es aufgrund seines anionischen

Charakters die meisten Zellmembranen nicht durchdringen kann, wobei die

eigentlich wirksamen Metabolite erst intrazellulär entstehen. Allerdings bleibt zu

bedenken, dass Mesna den endogenen Thiolmetabolismus indirekt beeinflusst,

indem es die Freisetzung von Cystein aus Cystin steigert. Dieses kann die

Zellmembran durchdringen und damit intrazelluläre Reaktionen wie zum Beispiel

die Wirkung der Oxazaphosphorine beeinflussen (Kempgens et al., 2003).

Bei der höheren toxischen Wirkung von Trofosfamid im Gegensatz zu Ifosfamid

und Cyclophosphamid besteht zwangsläufig die Gefahr, dass es bei einer in vivo-

Therapie auch auf den ganzen Organismus toxischer wirkt, das heißt mehr oder

schwerwiegendere Nebenwirkungen erzeugen könnte. Als Brock die

halbmaximale letale Dosis (LD50) für Ratten mit einem Yoshida Aszites Sarkom

ermittelte, erwies sich Trofosfamid im Vergleich zu Cyclophosphamid als toxischer

(Brock, 1967). Im Gegensatz dazu wurde in den bisher veröffentlichten Studien

eine gute Verträglichkeit von Trofosfamid mit wenigen unerwünschten Wirkungen

beschrieben (Strumberg et al., 1997; Mross, 1998; Schmidt-Sandte et al., 1999;

Brinker et al., 2002). Da Trofosfamid ein stärkeres tumortoxisches Potential

aufweist, können geringere Dosierungen eingesetzt werden als bei seinen

Schwestersubstanzen, was wiederum weniger Nebenwirkungen nach sich zieht.

Diskussion

54

IV.2 Detektion von DNA-Schäden

Bisher wurde angenommen, dass Ifosfamid der Hauptmetabolit im

Trofosfamidabbau sei. Da erst seit kurzem bekannt ist, dass Trofosfamid einen

eigenen wirksamen 4-OH-Metaboliten besitzt, gab es noch keine Untersuchungen

über seine Wirkung auf die DNA. So ist es zur Lehrmeinung geworden, dass

Trofosfamid genauso wie Ifosfamid als alkylierendes Zytostatikum DNA-

Strangbrüche und Cross-links verursacht, obwohl dies nie untersucht wurde (Boos

et al., 1993; Hartley et al., 1999; Struck et al., 2000).

4-OH-Trofosfamid erwies sich im MTT-Assay als wesentlich zytotoxischer als

seine beiden Schwestersubstanzen. Aus diesem Grunde wurden weitere

Untersuchungen durchgeführt, um zu ermitteln, auf welchem Mechanismus diese

Zytotoxizität beruht. Dazu dienten als Methode der Comet-Assay

(Einzelzellgelelektrophorese) und ein fluorometrischer Assay zur Detektion von

Interstrang-Cross-links. Dabei beschränkte sich die Arbeit auf die Untersuchung

von 4-OH-Trofosfamid, da die Wirkung von 4-OH-Ifosfamid und 4-OH-

Cyclophosphamid auf die DNA bereits in unserer Arbeitsgruppe untersucht wurde

(Dissertation Kistner, 2003). Es konnte hierbei eine konzentrationsabhängige

Strangbruchbildung, jedoch keine Entstehung von Cross-links nachgewiesen

werden.

Es stellte sich die Aufgabe zu untersuchen, ob 4-OH-Trofosfamid in den klinisch

relevanten Konzentrationen bzw. im Bereich der halbmaximal inhibierenden

Konzentration (IC50) an der DNA der Tumorzellen Cross-links bzw. Strangbrüche

verursacht. Die verwendeten Konzentrationen und Inkubationszeiten orientierten

sich an den in unserer Arbeitsgruppe ermittelten Plasmaspitzenspiegeln und der

Halbwertzeit von 4-OH-Trofosfamid in vivo nach der Gabe von täglich 450mg

Trofosfamid über 7 Tage (Brinker et al., 2002). Zum Nachweis von DNA-

Strangbrüchen hat sich der Comet-Assay (II.2.4.2) als eine sensitive und

zuverlässige Methode bewährt. Es ließ sich eine konzentrationsabhängige

Fragmentierung der DNA in Form von Strangbrüchen durch 4-OH-Trofosfamid

nachweisen. Die DNA-Strangbrüche werden über die Ausbildung von

Cometschweifen detektiert. Im Comet-Assay zeigten sich beim Mammakarzinom

Diskussion

55

die ersten Strangbrüche etwa ab dem anderthalbfachen der gemessenen

Plasmaspitzenspiegel bei 2,5µM. Zur maximalen Cometausbildung kam es bei

160µM. Im Vergleich mit den Ergebnissen unserer Arbeitsgruppe zeigt sich auch

hier eine stärkere Wirksamkeit von Trofosfamid, da bei der Behandlung mit 4-OH-

Ifosfamid bzw. 4-OH-Cyclophosphamid sich die ersten Cometschweife erst ab

einer Konzentration von 20µM bildeten (Dissertation Kistner, 2003).

Beim Weichteilsarkom der Schilddrüse traten im Bereich der dreifachen Höhe der

gemessenen Plasmakonzentrationen von 4-OH-Trofosfamid die ersten DNA-

Strangbrüche auf (5µM). Bei einer Konzentration von 80µM (ca. 47-fache der

Plasmawerte) waren über 95% der Zellkerne zerstört. Wiederum zeigt sich 4-OH-

Trofosfamid im Vergleich mit den 4-OH-Metaboliten seiner beiden

Schwestersubstanzen als wirksamer, da diese erst ab einer Konzentration von

20µM eine geringe Zunahme der Schweiflänge bewirkten (Dissertation Kistner

2003).

Um die Vermutung von Hartley zu untersuchen (Hartley et al., 1999), dass Mesna

die von Acrolein induzierte Strangbruchbildung verhindern könnte, wurden stets

zusätzlich Proben mit Mesna im äquimolaren Verhältnis zu 4-OH-Trofosfamid

angesetzt. Es ist zwar bekannt, dass Mesna das Acrolein inaktiviert (Brock et al.,

1982), jedoch konnten keine Unterschiede in den verschiedenen Ansätzen

ermittelt werden. Dies begründet sich vermutlich darin, dass Mesna aufgrund

seines anionischen Charakters nicht in die Zelle aufgenommen wird. Acrolein

entsteht jedoch erst innerhalb der Zelle beim Zerfall von 4-OH-Trofosfamid über

seine Aldo-Form zu Trofosfamid-Mustard und Acrolein (siehe Abb.2). In den

verwendeten äquimolaren Konzentrationen kann Mensa die Strangbruchbildung

auch nicht durch die intrazelluläre Steigerung der Cysteinkonzentration

beeinflussen.

In dieser Arbeit wurde zur Detektion von Interstrang-Cross-links der unter II.2.6

beschriebene fluorometrische Assay nach P.G. Penketh angewendet (Penketh et

al., 1997). Er ist unter physiologischen pH-Bedingungen durchführbar und kommt

so den Verhältnissen in vivo am nächsten. Viele Assays zur Aufdeckung von

Cross-links finden unter alkalischen Bedingungen statt. In diesem Milieu alkylieren

Diskussion

56

z.B. Nitrogenmustard-Verbindungen wesentlich leichter, weil das Nitrogenatom

unprotoniert ist. Die so gewonnenen Ergebnisse sind jedoch wegen dieses

unphysiologischen pH-Wertes nur bedingt auf die Verhältnisse in vivo übertragbar.

Die Versuchsbedingungen wurden so gewählt, dass ein Bezug zur Klinik möglichst

ersichtlich bleibt.

Es konnte keine konzentrationsabhängige Crosslinkbildung gemessen werden.

Lediglich bei einer Konzentration von 160µM 4-OH-Trofosfamid (+Mesna) konnten

an der DNA des Mammakarzinoms 16,6% Cross-links festgestellt werden. Beim

Weichteilsarkom wurden bis 320µM keine Cross-links entdeckt. Selbst in den

durchgeführten Einzelmessungen mit extrem hohen zytotoxischen Dosierungen in

Bereichen mehrerer Millimolar konnte keine signifikante Crosslinksbildung

beobachtet werden. Dies bedeutet, dass die Entstehung von Cross-links nicht

entscheidend zur Antitumorwirkung von Trofosfamid im Rahmen einer Therapie

beiträgt, da hierzu Konzentrationen nötig wären, welche die gemessenen

Plasmaspitzenspiegel um ein Vielfaches übersteigen würden.

In verschiedenen Studien wurde bewiesen, dass Cisplatin Cross-links verursacht

(Costa et al., 1997; Samuel et al., 1998). Roberts und Pascoe wiesen nach, dass

Cisplatin kovalente Brücken zwischen zwei komplementären DNA-Strängen

hervorruft, die als Interstrang-Crosslinks bezeichnet werden (Roberts und Pascoe,

1972; Marzilli et al., 2001; Sullivan et al., 2002). Auch in meinen Versuchsreihen

konnte nach der Inkubation mit Cisplatin (100µM) ein deutlicher Cross-link-Anteil

(ca.30%) an beiden Zelllinien detektiert werden. Dieser Versuchsteil galt für diesen

Assay als interne Kontrolle und beweist, dass gebildete Interstrang-Cross-links

prinzipiell erfasst werden.

Es stellt sich die Frage, ob durch 4-OH-Trofosfamid tatsächlich keine Cross-links

hervorgerufen wurden, ob sie eventuell labil waren oder von der Zelle innerhalb

der Inkubationszeit von vier Stunden repariert werden konnten. Dies müsste

allerdings den Schluss nach sich ziehen, dass die von 4-OH-Trofosfamid

verursachten Cross-links sich von denen, die Cisplatin hervorruft, unterscheiden.

Es ist zu bedenken, dass in der von mir verwendeten Methode nur DNA-

Interstrang-Cross-links detektiert werden. Zwischen Protein und DNA gebildete

Diskussion

57

Cross-links werden in diesem Test nicht ermittelt. Dies liegt unter anderem daran,

dass bei der DNA-Gewinnung (siehe II.2.5) die Proteine von der DNA getrennt

werden. Dem steht jedoch entgegen, dass sich im Comet-Assay im Rahmen von

Einzelversuchen auch keine Cross-links zeigten. Die Zellen wurden mit MMS

vorbehandelt, um Strangbrüche zu erzeugen. Substanzen, die Cross-links

ausbilden, führen zu einer Verkürzung des Cometschweifes im Vergleich zu der

Kontrollgruppe, die nur mit MMS behandelt wurde. Der Cometschweif verlängerte

sich trotz Zugabe von 4-OH-Trofosfamid konzentrationsabhängig, was Cross-links

verhindert hätten. Es zeigte sich sogar ein additiver Effekt bei der

Strangbruchbildung, da der Cometschweif noch länger wurde als bei der mit MMS

behandelten Kontrollgruppe. Angenommen, die Anzahl der Strangbrüche

überschreitet die der Interstrang-Cross-links, so könnten diese sehr geringen

Mengen an Cross-links laut Penketh nicht mehr detektiert werden, da mehr als ein

Cross-link benötigt wird, um die beiden DNA-Stränge wieder zusammen zu fügen.

Hartley et al. untersuchten mittels Comet-Assay und dem alkalischen

Elutionsassay die Fähigkeit von Ifosfamid, Cross-links bzw. DNA-Strangbrüche zu

bilden (Hartley et al., 1999). Sie entdeckten in den Lymphozyten der mit Ifosfamid

therapierten Patienten Cross-links, jedoch keine Strangbrüche. Darüber hinaus

behandelten sie Patientenlymphozyten ex vivo mit 4-OH-Ifosfamid bzw. mit der

eigentlich alkylierenden Verbindung aus dem Ifosfamidstoffwechsel, dem

Isophosphoramidmustard. Nach Behandlung mit 4-OH-Ifosfamid konnten keine

Cross-links, jedoch ein hoher Anteil an Strangbrüchen gemessen werden. Im

gegensatz dazu wurden nach Isophosphoramidmustard-Gabe Cross-links

detektiert. So machten sie das Acrolein, das beim Zerfall von 4-OH-Ifosfamid

entsteht, für die Strangbrüche verantwortlich. Die Fähigkeit von Acrolein,

Strangbrüche zu verursachen, wurde schon 1986 von Crook et al. entdeckt

(Crook, 1986). Das Hartley et al. keine Strangbrüche in den Patientenlymphozyten

fanden, begründeten sie mit dem gleichzeitigen Einsatz des Uroprotektors Mesna,

der Acrolein inaktiviert (Brock et al., 1982). Leider sind dem Artikel von Hartley et

al. keine Konzentrationsangaben von 4-OH-Ifosfamid bzw.

Isophosphoramidmustard zu entnehmen (Hartley et al., 1999). Zudem ist es

fraglich, ob Mesna tatsächlich die Strangbruchbildung verhindern kann, da es als

anionische Verbindung in die meisten Zellen nicht aufgenommen wird, Acrolein

Diskussion

58

aber erst innerhalb der Zelle entsteht. Meine Ergebnisse zeigten dagegen, dass

die Menge an Strangbrüchen durch Mesna nicht beeinträchtigt wird. Vielmehr

kommt die Möglichkeit in Betracht, dass die von Acrolein induzierten Strangbrüche

den Cross-links mengenmäßig so sehr überlegen sind, dass die Sensitivität der

Messmethoden zu gering ist, um die Cross-links zu erfassen.

Diskussion

59

IV. 3 Klinische Relevanz der Arbeit In der Therapie der malignen Tumorerkrankungen ist man auf der Suche nach

weiteren Behandlungsmöglichkeiten. Insbesondere gilt dies für Patientengruppen

mit vorbehandelten Tumorrezidiven, mit Metastasen oder für Krebserkrankungen

im hohen Alter mit Sekundärkomplikationen, wie zum Beispiel Nieren- oder

Herzinsuffizienz, welche eine herkömmliche Chemotherapie nicht mehr zulassen.

Eine gute palliative Behandlungsmöglichkeit bietet die Therapie mit Trofosfamid,

da es in Form von Tabletten verabreicht wird und nicht - wie zum Beispiel

Ifosfamid - intravenös injiziert werden muss. Auch Cyclophosphamid ist in Form

von Dragees verfügbar, es wird jedoch im klinischen Alltag in der Tumortherapie

insbesondere bei der Kombination mit anderen Zytostatika hauptsächlich

intravenös appliziert. Ein weiterer großer Vorteil liegt darin, dass Trofosfamid bei

einer hohen Zytotoxizität gegenüber den Tumorzellen nur relativ wenige

Nebenwirkungen aufzeigt (Strumberg et al., 1997; Schmidt-Sandte et al., 1999;

Wiedemann et al., 1999; Brinker et al., 2002).

Die vorliegende Arbeit konnte zum einen zeigen, welche Arten von DNA-Schäden

durch Trofosfamid hervorgerufen werden. Zum anderen wurde belegt, dass der 4-

OH-Metabolit von Trofosfamid insbesondere im Vergleich mit den eng verwandten

Verbindungen 4-OH-Ifosfamid und 4-OH-Cyclophosphamid sowohl ein anderes

Wirkprofil als auch ein hohes zytotoxisches Potential aufweist. Vor dem

Hintergrund dieser Ergebnisse ist das Interesse an Trofosfamid für die palliative

Krebstherapie gestiegen, so dass noch weitere Untersuchungen zur

Aufschlüsselung des Wirkprofils unternommen worden sind. Wie neuere

Ergebnisse zeigen, lässt sich für Trofosfamid bei oraler Dauergabe, der so

genannten metronomischen Therapie, auch ein antiangiogentisches Potential

nachweisen (Vogt et al., 2003; Klink et al., 2004). Sollte sich ein weiterer

Angriffspunkt an Tumoren mit maligner Vaskularisierung herauskristallisieren,

würde sich Trofosfamid wegen seiner guten Verträglichkeit als ausgezeichnet

anwendbare Substanz anbieten.

Es erscheint daher sehr wahrscheinlich, dass Trofosfamid in Zukunft eine höhere

klinische Akzeptanz erlangen und einer wachsenden Patientenzahl zur Verfügung

stehen wird.

Zusammenfassung

60

V. Zusammenfassung

Trofosfamid gehört - wie seine beiden Schwestersubstanzen Ifosfamid und

Cyclophosphamid - zu den Oxazaphosphorinen, die in vivo durch

mischfunktionelle Oxidasen der Leber zu ihren 4-OH-Metaboliten aktiviert werden.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Zytotoxizität und dem Wirkprofil von 4-OH-

Trofosfamid auf die DNA von Tumorzellen im Vergleich mit den 4-OH-Metaboliten

von Ifosfamid und Cyclophosphamid. Dies wurde an zwei humanen

Tumorzelllinien untersucht, zum einen am Weichteilsarkom der Schilddrüse

(S117) und zum anderen an einem Mammakarzinom (MX1).

Die Zytotoxizität wurde mittels MTT-Assay ermittelt, bei dem die Aktivität der

mitochondrialen Succinatdehydrogenase gemessen wird und auf das

Zellüberleben geschlossen werden kann. Die Toxizität von 4-OH-Trofosfamid war

deutlich höher als die von 4-OH-Ifosfamid, kam der von 4-OH-Cyclophosphamid

nahe und übertraf diese sogar an der MX1 Zelllinie (Mammakarzinom). Es konnte

im Rahmen der in vivo zu erwartenden Plasmaspiegel ein

konzentrationsabhängiger Zelltod gemessen werden. Es zeigten sich Differenzen

im Wirkprofil und der Wirkstärke von 4-OH-Trofosfamid auf der einen und 4-OH-

Ifosfamid bzw. 4-OH-Cyclophosphamid auf der anderen Seite. Durch äquimolare

Konzentrationen von Mesna, einem Uroprotektor, der bei der in vivo Therapie

zusammen mit Trofosfamid eingesetzt wird, wurde die Zytotoxizität nicht

beeinträchtigt.

Mit Hilfe des Comet-Assays, auch Einzelzellgelelektrophorese genannt, konnte

zum ersten Mal gezeigt werden, dass 4-OH-Trofosfamid konzentrationsabhängig

DNA-Strangbrüche verursacht. Mesna konnte auch hier die Wirkung nicht

beeinflussen. Im Vergleich mit den Ergebnissen unserer Arbeitsgruppe zeigt sich,

dass 4-OH-Trofosfamid schon in wesentlich geringeren Konzentrationen DNA-

Strangbrüche induziert als die 4-OH-Metabolite von Ifosfamid und

Cyclophosphamid.

Mittels fluorometrischem Assay wurde die Fähigkeit von 4-OH-Trofosfamid

untersucht, kovalente Brücken zwischen zwei komplementären DNA-Strängen zu

bilden. Diese so genannten Interstrang-Cross-links konnten nicht nachgewiesen

werden, so dass davon auszugehen ist, dass der Untergang der Tumorzellen am

ehesten durch Brüche in der DNA und nicht durch irreversible Verschmelzung

Zusammenfassung

61

(Cross-links) zustande kommt. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass

die vorliegenden Daten dazu beitragen, Trofosfamid hinsichtlich der Wirkstärke

und dem Wirkprofil von seinen beiden Schwestersubstanzen zu unterscheiden.

Die Ergebnisse beweisen, dass Trofosfamid nicht nur die orale Form des

Ifosfamids darstellt. Gerade vor dem Hintergrund der guten Verträglichkeit im

klinischen Einsatz, insbesondere bei resistenten Tumoren, bei palliativen

Therapieansätzen oder bei Langzeittherapien, scheint Trofosfamid nicht mehr nur

eine Alternative zu sein.

Literaturverzeichnis

62

VI. Literaturverzeichnis Albrecht M, Kleinhauf-Houken A, Trams G, Thomsen K: 5 years experiences with

adjuvant chemotherapy in primary breast cancer.

Geburtsh. u. Frauenheilk. 44: 550-556 (1984)

Andersson PO, Braide I, Nilsson-Ehle H: Trofosfamide as a salvage therapy for

anaplastic large cell lymphoma relapsing after high-dose chemotherapy.

Leuk Lymphoma 43: 2351-2353 (2002)

Arnold H, Bourseaux F: Synthese und Abbau zytostatisch wirksamer zyklischer N-

Phosphoramidester des Bis-(β-chloräthyl)-amins

Angew. Chem. 70: 539-544 (1958)

Arnold H, Bourseaux F, Brock N: Neuartige Krebs-Chemotherapeutika aus der

Gruppe der zyklischen N-Lostphosphoramidester.

Naturwiss.45: 64-66 (1958)

Becher R, Kloke O, Hyungs J, Hartwich G, Bartels H, Szanto J, Wolf E, Illinger HJ,

Halabi S, Rieche K, Hering KG, Ohl S, DeDycker R, Huhn R, Hofeler H, Pielken

HJ, Hawig I, Hirche H, Seeber S: Epirubicin and ifosfamide in metastatic breast

cancer.

Semin Oncol 23: 28-33 (1996)

Becker N: Cancer mortality and prevention in the European Union.

Eur. J. Surg. Oncol. 24: 370-374 (1998)

Berns JS, Haghighat A, Staddon A, Cohen RM, Schmidt R, Fisher S, Rudnick MR,

Tomaszewski JE: Severe, irreversible renal failure after ifosfamide treatment. A

clinicopathologic report of two patients.

Cancer Res. 76: 497-500 (1995)

Literaturverzeichnis

63

Blomqvist C, Wiklund T, Pajunen M, Virolainen M, Elomaa I: Oral trofosfamide: an

active drug in the treatment of soft-tissue sarcoma.

Cancer Chemother. Pharmacol. 36: 263-265 (1995)

Boos J, Küpker F, Blaschke G, Jürgens H: Trofosfamide metabolism in different

species-ifosfamide is the predominant metabolite.

Cancer Chemother. Pharmacol. 33: 71-76 (1993)

Börner K, Kisro J, Brüggemann SK, Hagenah W, Peters SO, Wagner T:

Metabolism of ifosfamide to chloroacetaldehyde contributes to antitumor activity in

vivo.

Drug Metab. Dispos. 28: 573-576 (2000)

Brinker A, Kisro J, Letsch C, Brüggemann SK und Wagner T: New insights into the

clinical pharmacokinetics of trofosfamide.

Int. J. Clin. Pharm. and Ther. 40: 376-381 (2002)

Brinker A. Pharmakokinetik und Toxizität von oralem Trofosfamid bei Patienten mit

soliden Tumoren und Non Hodgkin Lymphom

Med. Diss. Lübeck (2004)

Brock N: Oxazaphosphorine cytostatics: past-present-future. seventh cain

memorial award lecture.

Cancer Res. 49: 1-7 (1989)

Brock N, Stekar J, Pohl J; Antidote against the urotoxic effects of the

oxazaphosphorine derivates cyclophosphamide, ifosfamide and trofosfamide.

Naturwissenschaften: 66 (1): 60-61 (1979)

Brock N, Hohorst HJ: Metabolism of cyclophosphamide.

Cancer 20: 900-904 (1967)

Literaturverzeichnis

64

Brock N, Pohl J, Steckar J, Scheef W: Studies on the urotoxizity of

oxazaphosphorine cytostatics and its prevention III. Profile of action of sodium 2-

mercaptoethane sulfonate (Mesna).

Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 18: 1377-1387 (1982)

Brock N, Pohl J, Stekar J: Detoxification of urotoxic oxazaphosphorines by

sulfhydryl compounds.

J. Cancer Res. and Clin. Oncol. 100: 311-320 (1981)

Brock N, Pohl J: The development of mesna for regional detoxification.

Cancer Treatment Reviews 10: 33-43 (1983)

Brock N, Steckar J, Pohl J, Niemeyer U, Scheffler G: Acrolein, the causative factor

of urotoxic side-effects of cyclophosphamide, ifosfamide, trofosfamide and

sufosfamide.

Arzneimittelforschung 29: 659-661 (1979)

Brüggeman SK: Chloracetaldehyd – Entdeckung einer eigenständigen

Tumorzelltoxizität des Ifosfamidmetaboliten.

Med. Diss. Lübeck (1999)

Brüggemann SK, Kisro J, Wagner T: Ifosfamide cytotoxicity on human tumor and

renal cells: role of chloroacetaldehyde in comparison to 4-hydroxyifosfamide.

Cancer Res. 57: 2676-2680 (1997)

Burchenal JH and Riley JB: Nitrogen mustards: the relationship between chemical

structure and chemotherapeutic activity.

Cancer Res. 9: 553-554 (1949)

Colvin OM: An overview of Cyclophosphamid development and clinical

applications.

Curr. Pharm. Des.5: 555-560 (1999)

Literaturverzeichnis

65

Costa M, Zhitkovich A, Harris M, Paustenbach D, Gargas M: DNA-Protein Cross-

links produced by various chemicals in cultured human lymphoma cells.

J. Toxicol. Envir. Health 50: 433-449 (1997)

Cox PJ, Abel G: Cyclophosphamide cystitis studies aimed at its minimisation.

Biochem. Pharmacol. 28: 3499-3502 (1979)

Cox PJ; Cyclophosphamide cystitis and bladder cancer. A hypothesis.

Eur. J. Cancer 15: 1071-1072 (1979)

Cox PJ; Cyclophosphamide cystitis—identification of acrolein as the causative

agent

Biochem. Pharmacol. 28: 2045-2049 (1979)

Crook TR, Souhami RL, Mc Lean AEM: Cytotoxicity, DNA crosslinking and single

strand brake induced by activated cyclophosphamide and acrolein in human

leukemia cells.

Cancer Res. 46: 5029-5034 (1986)

DeNeve W, Valeriote F, Edlestein M, Everett C, Bischoff M: In vivo DNA cross-

linking by cyclophosphamide: comparison of human chronic lymphatic leukemia

cells with mouse L1210 leukemia and normal bone marrow cells.

Cancer Res. 49: 3452-3456 (1989)

DeVita V Jr: Principles of Cancer management: chemotherapy. In: Vincent T.

DeVita Jr, Samuel Hellman, Steven a. Rosenberg.

Cancer. Principles & Practice of Oncology. 5th Edition (17): 333-347, Lippincott-

Raven, Philadelphia, New York (1997)

Dong Q, Barsky D, Colvin ME, Melius CF, Ludeman SM, Moravek JF, Colvin OM,

Bigner DD, Modrich P, Friedman HS: A structural basis for a phosphoramide

mustard-induces DNA interstrand cross-link at 5´-d(GAC).

Poc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 12170-12174 (1995)

Literaturverzeichnis

66

Dorr RT: Chemoprotectants for cancer chemotherapy.

Semin.Oncol. 18: 48-58 (1991)

Drings P, Allner R, Brock N, Burkert H, Fischer M, Folsch E, Gerhartz H, Gotzky P,

Hoppe I, Kanzler G, Klein HO, Mainzer K, Martin H, Obrecht P, Palme G, Paulisch

H, Riegg H, Schubert JC, Treske U, Weise W, Willems D, Wilmanns H, Witte S,

Wohlenberg H: Experiences with N-Lost phosphoramide esters.

Dtsch. Med. Wochenschr. 95: 491-497 (1970)

Enk AH, Knop J: Stabilizing the course of patients with stage IV advanced

malignant melanoma by trofosfamide treatment.

Der Hautarzt 51: 486-489 (2000)

Falkson G, Falkson HC: Trofosfamide in the treatment of patients with cancer. A

pilot trial.

S. Afr. Med. J. 53: 886-888 (1978)

Goodman LS, Wintrobe MM, Damashek W, Goodman MJ, Gilman MA, McLennan

MT: Nitrogen mustard therapy. Use of methyl-bis(beta-chloroethyl)amine

Hydrochloride and Tris(Beta-Chlorethyl)amine Hydrochloride for Hodgkin´s

Disease, Lymphosarcoma, Leukemia and certain allied and miscellaneous

disorders.

J.A.M.A. 132: 126-132 (1946)

Goren MP, Wright RK, Prat CB, Horowitz ME, Doge RK, Viar MJ, Kovnar EH:

Potentiation of ifosfamide neurotoxicity, hematotoxicity and tubular nephrotoxicity

by prior cis-diamminedichloroplatinum(II)therapy.

Cancer Res. 47: 1457-1460 (1987)

Goren MP, Wright RK, Prat CB, Pell FE: Dechloroethylation of ifosfamide and

neurotoxicity (letter).

Lancet 2: 1219-1220 (1986)

Literaturverzeichnis

67

Gunsilius E, Gierlich T, Mross K, Gastl G, Unger C: Palliative chemotherapy in

pretreated patients with advanced cancer: oral trofosfamide is effective in ovarian

carcinoma.

Cancer Invest. 19: 808-811 (2001)

Hartley JM, Spanswick VJ, Gander M, Giacomini G,Whelan J, Souhami RL,

Hartley AJ: Measurement of DNA cross-linking in patients on ifosfamide therapy

using the single cell electrophoresis (comet) assay.

Clin. Cancer Res. 5: 507-512, (1999)

Hartmann JT, Oechsle K, Mayer F, Kanz L, Bokemeyer C: Phase II trial of

trofosfamide in patients with advanced pretreated soft tissue sarcomas.

Anticancer Res. 23: 1899-1901 (2003)

Helsing MD: Trofosfamide as a salvage treatment with low toxicity in malignant

lymphoma. A phase II study.

Eur. J. Cancer 33: 500-502 (1997)

Hempel G, Krumpelmann S, May-Manke A, Hohenlochter B, Blaschke G,

Juergens H und Boos J: Pharmacokinetics of trofosfamide and its dechlorethylated

metabolites.

Cancer Chemother. Pharmacol. 40: 45-50 (1997)

Hengstler JG, Hengst A, Fuchs J, Tanner B, Pohl J, Oesch F: Induction of DNA

crosslinks and DNA strand lesions by cyclophosphamide after activation by

cytochrome P450 2B1.

Mutation Res. 373: 215-223 (1997)

Johnstone CJ, Lind MJ, Griffin MJ, Boddy AV: Ifosfamide metabolism and DNA

damage in tumor and peripheral blood lymphocytes of breast cancer patients.

Cancer Chemother. Pharmacol. 46: 433-441 (2000)

Literaturverzeichnis

68

Kamen BA, Frenke lE, Colvin OM: Ifosfamide: Should the honeymoon be over? J.

Clin. Oncol. 13: 307-309 (1995)

Kempgens B, Kisro J, GruberY, Bahrs H, Wagner Th: Two schedules of

application for mesna and their influence on the thiol-metabolism.

Int. J. Clin. Pharm. and Ther. 41: 608-609 (2003)

Kisro J, Brueggemann SK, Thiede S, Kim S, Wiedemann GJ, Wagner Th:

Reduction of ifosfamide cytotoxicity by Mesna depense on different cysteine

uptake capacities of human tumor cells.

Proceedings of the American Assiciation for Cancer Research 41 (2000)

Kisro J, Brueggemann SK, Thiede S, Kuepper S, Wagner Th: Mechanism of

Mesna interference with oxazaphosphorines in vitro. Correlation to

pharmacokinetics of mesna and other thiols in patients with ifosfamide or

cyclophosphamide chemotherapy.

Proceedings of the American Assiciation for Cancer Research 42 (2001)

Kistner K: Wirkung der Oxazaphosphorinmetaboliten Chloracetaldehyd, 4-OH-

Ifosfamid und 4-OH-Cyclohosphamid auf die DNA humaner Tumorzellen in vitro.

Med. Diss. Lübeck (2003)

Klink T,Bela C, Engels C, Brüggemann S, Marxsen J, Stölting S, Kisro J, Vollmert

M, Wagner T: Metronomic scheduling of trofosfamide chemotherapy in human

NSCL xenografts highly increases therapeutic efficacy compared to conventinal

scheduling by inhibition of angionesis.

Cancer Res. 45 Abstract No. 62 (2004)

Kohn KW, Bruce F: Beyond DNA Cross-linking: history and prospects of DNA

targeted cancer treatment – fifteenth cain memorial award lecture.

Cancer Res. 56: 5533-5546 (1996)

Literaturverzeichnis

69

Kollmannberger C, Brugger W, HartmannJT, Maurer F, Bohm P, Kanz L,

Bokemeyer C: Phase II study of oral trofosfamide as palliative therapy in

pretreated patients with metastatic soft-tissue sarcoma.

Anticancer Drugs. 10: 453-456 (1999)

Kurowski V, Cerny T, Küpfer A, Wagner T: Metabolism and pharmacokinetics of

oral and intravenous ifosfamide.

J. Cancer Res. Clin. Oncol. 117: 148-153 (1991)

Laws HJ, van Kaick B, Pape H, Paulussen M, Gobel U: Relapse after high-dose

therapy in relapsed Ewing´s tumor patients: effects of maintenance chemotherapy

in two selected patient?

Onkologie 26: 573-577 (2003)

Lindemann H, Harbers E: Interaction of the three alkylating drugs,

cyclophosphamide, ifosfamide and trofosfamide, with DNA and DNA-constituents

in vitro.

Arzneim.-Forsch./Drug. Res. 30: 2075-2080 (1980)

Marzilli LG, Saad JS, Kuklenyik Z, Keating KA, Xu Y: Relationship of solution and

protein-bound structures of DNA duplexes with the major intrastrand cross-link

lesion formed on cisplatin binding to DNA.

J. A. Chem. Soc. 123: 2764-2770 (2001)

May-Manke A, Kroemer H, Hempel G, Bohnenstenge lF, Hohenlöchter B,

Blaschke G, Boos J: Investigation of the major human hepatic cytochrome P450

involved in 4-hydroxylation and N-dechloroethylation of trofosfamide.

Cancer Chemother. Pharmacol. 44: 327- 334 (1999)

Miyamae Y, Iwasaki K, Kinae N, Tsuda S, Murakami M, Tanaka M, Sasaki YF:

Detection of DNA lesions induced by chemical mutagens using the single cell gel

electrophoresis (comet) assay, 2. Relationship between DNA migration and

alkaline condition.

Literaturverzeichnis

70

Mutat. Res. 393: 109-113 (1997)

Miyamae Y, Zaizen K, Ohara K, Mine Y, Saski YF: Detection of DNA lesions

induced by chemical mutagens using the single cell gel electrophoresis (comet)

assay, 2.Relationship between the onset of DNA damage and characteristics of

mutagens.

Mutat. Res. 393: 999-1006 (1997)

Mross K, Rüter A, Gierlich T und Unger C: Tumor growth control by oral

trofosfamide in patients with metastatic breast cancer.

Onkologie 21: 52-56 (1998)

Östling O, Johannson KJ: Microelectrophoretic study of radiatio induced DNA

damage in individual mammalian cells.

Biochem. Biophys. Res. Comun. 123: 291-298 (1984)

Pfuhler S, Wolf HU: Detection of DNA-crosslinking agents with the alkaline comet

assay.

Environ. Mol. Mutagen. 27: 196-201 (1996)

Pohl J: ASTA Z7557, Summary of Investigators.

Asta-Werke, DeGussa Pharma Gruppe, Bielefeld (1983)

Preiss R, Baumann F, Stefanovic D, Niemeyer U, Ponisch W, Niederwieser D:

Investigations on the pharmacokinetics of trofosfamide and its metabolites-first

report of 4-hydroxy-trofosfamide kinetics in humans.

Cancer Chemother. Pharmacol. 29: (2004)

Reichardt P, Pink D, Tilgner J, Kretschmar A, Thuss-Patience PC, Dorken B: Oral

trofosfamide: an active and well tolerated maintenance therapy for adult patients

with advanced bone and soft tissue sarcomas. Results of a retrospective analysis.

Onkologie 25: 541-546 (2002)

Literaturverzeichnis

71

Roberts JJ, Pascoe JM: Crosslinking of complementary strand of DNA in

mammalian cells by antitumor platinum compounds.

Nature: 235 (5336): 282-284 (1972)

Samuel SK, Spencer VA, Bajno L, Sun JM, Holth LT, Oesterreich S, Davie JR: In

situ cross-linking by cisplatin of nuclear matrix-bound transcription factors to

nuclear DNA of human breast cancer cells.

Cancer Res. 58: 3004-3008 (1998)

Salminen E, Nikkanen V, Lindholm L: Trofosfamide is effective in refractory non-

Hodgkin´s lymphoma.

Eur. J. Cancer 31A : 2419-2420 (1995)

Salminen E, Nikkanen V, Lindholm L: Palliative chemotherapy in non-Hodgkin´s

lymphoma.

Oncology 54: 108-111 (1997)

Schlenke P, Kisro J, Deeken M, Zajac S, Klich S, Wagner T: The cytotoxicity of

mafosfamide on G-CSF mobilized hematopoietic prognitors is reduced by SH

groups of albumin- implications for further purging strategies

Bone Marrow Transplantation 23: 157-161 (1999)

Schmidt-Sandte W, Dageforde J, Klapdor R, Wagner T, Wiedemann GJ:

Trofosfamide in patients with pancreatic cancer.

Anticancer Res. 19: 2485-2487 (1999)

Semont H, Hecquet C, Adolphe M, Deysson G: Effect of three alkylating antimitotic

agents and their metabolites on in vitro monogranulocytic colony forming cells

from mouse bone marrow.

Drug Res.31(I): (1981)

Literaturverzeichnis

72

Singh NP, Mc Coy MT, Tice RR, Schneider EL: A simple technique of

quantification of low levels of DNA damage in individual cells.

Exp. Cell. Res. 175: 184-191 (1988)

Sladeck NE. Metabolism of oxazaphosphorines.

Pharmacol. Ther. 37: 301-355 (1988)

Speit G, Trenz K, Schutz P, Rothfuss A, Merk O: The influence of temperature

during alkaline treatment and electrophoresis and results obtained with the comet

assay.

Toxicol. Lett. 110: 73-78 (1999)

Struck RF, Davis RL Jr, Berardini MD, Loechler EL: DNA guanine-guanine

crosslinking sequence specificity of isophosphoramide mustard, the alkylating

metabolite of the clinical antitumor agent ifosfamide.

Cancer Chemother. Pharmacol. 45: 59-62 (2000)

Strumberg D, Harstrick A, Klaasen U, Muller C, Eberhardt W, Korn MW, Wilke H,

Seeber S: Phase II trial of continuous oral trofosfamide in patients with advanced

colorectal cancer refractory to 5-fluorouracil.

Anticancer Drugs. 8: 293-295 (1997)

Sullivan ST, Saad JS, Fanizzi FP, Marzilli LG: Dramatic 5´-residue effect on

conformer distribution of short olinucleotide retro models of the cisplatin-DNA

cross-link: Implications for the lippard and cross-link distorted base pair steps

present in cisplatin-DNA duplex adducts.

J. Am. Chem. Soc. 124: 1558-1559 (2002)

Teicher BA: Pharmacology of cancer chemotherapy. Antitumor alkylating agents.

In: Vincent T. DeVitaJr, Samuel Hellman, Steven A. Rosenberg.

Cancer Principles & Practice of oncology. 5th Edition (19.4): 405-418, Lippincott-

Raven, Philadelphia, New York. (1997).

Literaturverzeichnis

73

van Dyk JJ, Falkson HC, Van-der MA, Falkson G: Unexpected toxicity in patients

treated with ifosfamide.

Cancer Res. 32: 921-924 (1972)

Vogt T, Hafner C, Bross K, Bataille F, Jauch KW, Berand A, Landthaler M,

Andreesen R, reichle A: Antiangiogenetic therapy with pioglitazone, rofecoxib, and

metronomic trofosfamide in patients with advanced malignant vascular tumors.

Cancer 98: 2251-2256 (2003)

Vrzoc M, Petras M; Comparison of DNA damage in peripheral blood and spleen

lymphocytes using the single-cell gel assay.

Mutation Res., 379: 263-269 (1997)

Wagner A, Hempel G, Boos J: Trofosfamide: a review of its pharmacodynamic and

pharmacocinetic properties and therapeutic potential in the oral treatment of

cancer.

Anticancer Drugs 8: 419-431 (1997)

Wagner Th: Ifosfamide clincal pharmacokinetics.

Clin. Pharmacokinet. 26: 439-456 (1994)

Wist E, Riberg T: Trofosfamide in Non-Hodgkin´s lymphoma.

Acta Oncologica 30: 819-821 (1991)

Wolff JEA, Mölenkamp G, Westphal S, Pietsch T, Gnekow A, Kortmann RD, Kuehl

J: Oral trofosfamide and etoposide in pediatric patients with glioblastoma

multiforme.

Cancer 89: 2131-2137 (2000)

Zalupsi M, Baker LH: Ifosfamide.

J. Natl. Cancer Inst. 80: 556-566 (1988)

Anhang

74

VII. Anhang

VII.1 Abbildungsverzeichnis Seite

Abb.1 Strukturformeln Lost und Stickstofflost 6

Abb.2 Metabolismus der Oxazaphosphorine 12

Abb.3 MTT-Metabolismus im Mitochondrium 21

Abb.4 Comet Klasse 1 24

Abb.5 Comet Klasse 2 24

Abb.6 Comet Klasse 3 24

Abb.7 Comet Klasse 4 24

Abb. 8 Objektträger mit Agarose-Sandwichgel 25

Abb.9 DNA-Isolation 27

Abb.10 DNA im Hitze-Kälte-Zyklus 31

Abb.11 Zellüberlebensrate MX1 36

Abb.12 Zellüberlebensrate S177 36

Abb.13 IC50 MX1 37

Abb.14 IC50 S117 37

Abb.15 Typische Cometenkonstellation unbehandelter S117 Zellen 40

Abb.16 Typische Cometenkonstellation nach Inkubation mit MMS 40

Abb.17 Typische Cometenkonstellation nach Inkubation mit 160µM

4-OH-Trofosfamid (MX1) 41

Abb.18 Typische Cometenkonstellation nach Inkubation mit 40µM

4-OH-Trofosfamid (S117) 41

Abb.19 Verteilung der Cometklassen MX1 43

Abb.20 Verteilung der Cometklassen S117 43

Abb.21 Prozentualer Crosslinkanteil S117 48

Abb.22 Prozentualer Crosslinkanteil MX1 48

Anhang

75

VII.2 Tabellenverzeichnis Seite

Tab.1 Extinktionsabfall und dessen Schwankungen innerhalb eines

Versuchansatzes anhand unbehandelter DNA der Zelllinie MX 1 44

Tab.2 Extinktionsschwankungen an acht unterschiedlichen Tagen (MX1) 45

Tab.3 Extinktionsschwankungen an fünf unterschiedlichen Tagen (S117) 46

Tab.4 Zellüberleben S117 Trypanblau-Färbung 76

Tab.5 Zellüberleben MX1 Trypanblau-Färbung 77

Anhang

76

VII.3 Tabellen

Zellüberleben des S117 Weichteilsarkoms zum Zeitpunkt der Durchführung des Comet-Assays

Mittelwert % Median % n Kontrolle 3,3 3 11 MMS 100µM 2,6 3 11 4-OH-Trofosfamid: 0,6 µM 3,3 3 3 0,6 µM + Mesna 3,3 4 3 1,25 µM 5 4 3 1,25 µM + Mesna 3,7 4 3 2,5 µM 4,3 3 3 2,5 µM + Mesna 3,3 2 3 5 µM 2,7 2 3 5 µM + Mesna 4,3 3 3 10 µM 5,2 5 7 10 µM + Mesna 4 4 6 20 µM 5,4 5 6 20 µM + Mesna 3,7 4 3 40 µM 6,7 7 7 40 µM + Mesna 5 5 3 80 µM 10,5 10,5 4 80 µM + Mesna 8,25 8 3 160 µM 12,3 12 3 160 µM + Mesna 9,6 9 3

Tabelle 4 zeigt den prozentualen Anteil der toten Zellen der Zelllinie S117, der im Rahmen des Comet-Assays mittels Trypanblau-Färbung ermittelt wurde. + Mesna = Mesna in äquimolarer Konzentration zu 4-OH-Trofosfamid MMS = Methylmethansulfonat

Anhang

77

Zellüberleben des MX1 Mammakarzinoms zum Zeitpunkt der Durchführung des Comet-Assays

Mittelwert % Median % n Kontrolle 3,6 4,0 8 MMS 100µM 4,4 5,0 8 4-OH-Trofosfamid: 0,6 µM 1,7 0,0 3 0,6 µM + Mesna 3,7 3,0 3 1,25 µM 3,3 3,0 3 1,25 µM + Mesna 3,7 4,0 3 2,5 µM 2,3 3,0 3 2,5 µM + Mesna 6 6 3 5 µM 2,7 3,0 3 5 µM + Mesna 4,3 3,0 3 10 µM 5,3 5,0 3 10 µM + Mesna 6,3 7,0 3 20 µM 8,8 8,5 4 20 µM + Mesna 8 8 2 40 µM 9,7 10,0 3 40 µM + Mesna 9,3 10,0 2 80 µM 6,7 8,0 2 80 µM + Mesna 7,0 6,0 3

Tabelle 5 zeigt den prozentualen Anteil der toten Zellen der Zelllinie MX1, der im Rahmen des Comet-Assays mittels Trypanblau-Färbung ermittelt wurde. + Mesna = Mesna in äquimolarer Konzentration zu 4-OH-Trofosfamid MMS = Methylmethansulfonat

Abkürzungsverzeichnis

78

VII.4 Abkürzungsverzeichnis

CAA Chloracetaldehyd

C max Maximal - Konzentration

CMF Cyclophosphamid + Methotrexat + 5- Fluorouracil

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

EB Ethidiumbromid

EDTA Ethylene Diamine Tetra-Acetat =

Äthylendiamintetraessigsäure

fKS fetales Kälberserum

IC 50 inhibiting concentration = inhibierende Konzentration

auf 50%

LD 50 letale Dosis mit 50% Zellüberleben

LMP low melting point = niedriger Schmelzpunkt

Mesna Mercaptoethansulfonsäure

MMS Methylmethansulfonat

MTT 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl Tetrazolium

Bromid

NaCl Natriumchlorid

NaOH Natriumhydroxid

NMP normal melting point = normaler Schmelzpunkt

n.s. nicht signifikant OD optische Dichte PBS Phosphat-Natriumchlorid Puffer

RMPI Roswell Memorial Park Institute

RNA Ribonukleinsäure

SDH Succinatdehydrogenase

SDS Dodecylsulfate sodium salt

SEM standard error of mean = Standardabweichung

TE Tris-HCl / EDTA

Tris Trishydroxymethylaminomethan

Abkürzungsverzeichnis

79

U/min Umdrehungen pro Minute

UV ultraviolett

WHO World health organization

(Weltgesundheitsorganisation)

Danksagung

80

VIII. Danksagung

Mein besonderer Dank gilt zunächst Herrn Prof. Dr. med. Thomas Wagner für

die Überlassung des Themas zur Promotion sowie für die hervorragende

Unterstützung und Betreuung während der gesamten Arbeit.

Für die besonders freundliche Einarbeitung in die verschiedenen Tätigkeiten im

Labor möchte ich Frau Kerstin Kistner sowie den medizinisch technischen

Assistentinnen der Arbeitsgruppe danken.

Herrn Sven Süffke danke ich, für seine Beratung und Unterstützung in Software –

Angelegenheiten.

Insbesondere möchte ich mich bei meinen Eltern für anhaltende herzliche

Unterstützung und Förderung bedanken, ohne die mir die Durchführung der Arbeit

sicher nicht gelungen wäre.

Dank gilt auch Frau Andrea Brinker für die freundschaftliche Zusammenarbeit

insbesondere bei der Durchsicht des Manuskriptes.

Für die liebevolle Geduld und für die lebhaften Diskussionen von methodischen

und inhaltlichen Fragen möchte ich mich von ganzem Herzen bei Jan Lindenkamp bedanken.

Lebenslauf

81

IX. Lebenslauf

Persönliche Daten: Name: Carola Letsch

Geburtstag: 10.12.1974

Geburtsort: Bad Segeberg

Familienstand: ledig

Staatsangehörigkeit: deutsch

Mutter: Helma Letsch, geb. Pein

Geschäftsführerin

Geb. am 27.07.1949

Vater: Rudolf Letsch

Kfz-Elektriker-Meister

Geb. am 12.08.1945

Schulbildung: 1981 - 1985 Theodor Storm-Schule in Bad Segeberg

1985 - 1991 Realschule am Seminarweg in Bad Segeberg

1991 - 1994 Kreisberufsschule Bad Oldesloe

05 / 1994 Abitur

Ausbildung: 1994 - 1997 Ausbildung zur Diätassistentin am Universitäts-

krankenhaus Eppendorf in Hamburg

Studium: 10 / 1997 Studium der Humanmedizin in Lübeck

08 / 1999 Ärztliche Vorprüfung

08 / 2000 erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung

03 / 2003 zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung

05 / 2004 dritter Abschnitt der ärztlichen Prüfung

Lebenslauf

82

Dissertation: 11/ 2000 – 05 / 2002 praktische Untersuchungen zur Dissertation

Publikation: Brinker A., Kisro J., Letsch C., Brüggemann S.K. und

Wagner T.: New insights into the clinical

pharmacokinetics of Trofosfamide, Int. J. clin. pharm.

and ther. 40/8 376 – 381 (2002)

Beruflicher Werdegang: 07/ 2004 – 10/ 2004 Gynäkologie im Marien-Krankenhaus Lübeck

11/2004 Gynäkologie AK Segeberger Kliniken