Botanisches Institut der Universitiit Heidelberg

Wirkung von FdUrd:~) auf die Neusynthese von Nucleinsauren wahrend des Sukkulenzwachstums bei Lobularia maritima

The Influence of FdUrd on the de novo Synthesis of Nucleic Acids Accompanying Growth of Lobularia maritima

INGRID CAPESIUS

Mit 1 Abbildung

Eingegangen am 28. Februar 1974

Summary

Leaves of Lobularia mari~ima floating on 0,2 M NaCl show a greater increase in fresh weight than leaves on water.

The synthesis of nucleic acids - studied by incorporation of 3H-Thymidin and 32p_ Phosphate - was lower on NaCl than on H 20.

The synthesis of DNA and RNA was strongly inhibited by 8 . 10-5 M FdUrd; during a experimental duration of 21 hours DNA-synthesis was inhibited by 90 Ofo, RNA by 67 Ofo.

In 21 hours fresh weight is not influenced by FdUrd. The lag phase of the FdUrd effect on DNA synthesis was about 4-8 hours.

Einleitung

Untersuchungen an Keimlingen von Sinapis alba (Bopp, 1967; Bopp und CAPESI­us, 1970) und KalanchoebHittern (Bopp und CATARINO, 1968; Bopp, 1970) haben wiederholt gezeigt, dag FdUrd das Wachs tum ihemmt. Aus gleichzeitigen Untersu­chungen der DNA-Synthese und der Hemmung der Streckung durch FdUrd war ein Zusammenhang zwischen beiden Prozessen erschlossen worden (CAPESIUS und Bopp, 1970 h; CAPES IUS et aI., 1972).

Bei differenzierten Blattern von Lobularia maritima kann durch Besprlihen mit NaCI (20 gil) Sukkulenz auftreten, welche mit einer Erhohung des Polyploidiegra­des im Mesophyll verhunden ist (CATARINO, 1968). Eine Reihe von Untersuchungen liegen vor, die Endopolyploidisierung pflanzlicher Zellen auf den Einflug von Au­genhedingungen zurlickflihren (v. WITSCH und FLt.iGEL, 1951, 1952; TSCHER­MAK-WOESS und HASITSCHKA, 1954; BUTTERFASS, 1964; RESENDE et aI., 1964; CATA­

RINO, 1965, und SCHLAYER, 1971).

,:.) 5-FdUrd = 5-Fluordesoxyuridin.

Z. PJlanzenphysiol. Ed. 73. S. 266-272. 1974.

Wirkung von FdUrd auf die Neusynthese von Nucleinsauren 267

Es war desihalb von Interesse, die Wirkung von FdUrd auf Wachstumsprozesse und auf die DNA-Synthese einer genauen Analyse zu unterziehen, urn aufzuzeigen, ob auch bei diesen System Zusammenhange zwischen beiden Parametern bestehen.

Material und Methoden

Als Versuchsobjekt diente Lobularia maritima (Cruciferae), die wir von Prof. F. CATARI­NO (Lissabon) erhielten. Die Anzucht der Pflanzen erfolgte im Gewachshaus. Vor Versuchs­beginn wurden Blattchen vom 4.-6 . Knoten abgenommen, fur 2 Minuten mit Chloramphe­nicol 50 flg/ml behandelt und anschlieBend dreimal mit H 20 dest. gewassert, danach auf die Fliissigkeitsoberflache einer Petrischale mit der Epidermisunterseite gelegt. In anderen Serien wurden jeweils 50 Blattchen mit der Blattbasis durch die Bohrungen eines Plastik­deckels in die Fliissigkeit eingetaucht.

Die Versuchsdauer betrug zwischen 4 und 21 Stunden. Die Raumtemperatur lag zwismen 19-25° C bei Dauerbelichtung. Die Konzentration an FdUrd betrug 5 X 10-· M bei Ein­bauversuchen mit 32P-Orthophosphat. Die radioaktiven Substanzen wurden den Blattchen entweder in H 20 oder 0,2 M NaCl in An- oder Abwesenheit (Kontrolle) von FdUrd angebo­ten.

Nach Versuchsende wurde nicht eingebautes Substrat durch wiederholtes Waschen mit eiskaltem dest. H 20 entfernt, das anhaftende Wasser abgetupft und die Blattchen gewogen. Die Extraktion und Aufarbeitung der Nucleinsauren erfolgte nach der fruher beschriebenen Methode (CAPESIUS und Bopp, 1970 a, b). Die Trennung erfolgte an kleinen MAK-Saulen, wobei zur Erhohung der DurchfluBgeschwindigkeit als Tragermaterial Celite 535 verwendet wurde. Als Saulen dienten 10 ml Enzympipetten, die Hohe der Saulenfullung betrug 16 cm, eluierc wurde mit einem dem Saulenvolumen angepaBten Gradienten von 0,1 gegen 1,5 M NaCI in Phosphatpuffer. Nach Fraktion 35 wurde die 1,5 M NaCl-Losung gegen 2 M NaCl ausgetauscht. Das Volumen der einzelnen Fraktionen betrug 3 ml. Die Radioaktivitat wurde im Tricarb Szintillationszahler gemessen (PPO- und POPOP-Toluol).

Chemikalien

H3_ Thymidin (spez. Aktivitat 20 C/mMol) und 32P-Orthophosphat stammten von The Radiochemical Centre Amersham. 5-FdUrd war eine Gabe der Firma Hoffmann-La Roche, Celite 535 war von Lehmann & Voss, Hamburg. Aile weiteren Substanzen waren p. a. Che­mikalien von Merck.

Ergebnisse

Die Wirkung von 0,2 M NaCl und FdUrd auf das Frischgewicht wurde tiber einen Zeitraum von 21 Stunden untersucht. Die Frischgewichtszunahme erreichte den gleichen Wert unabhangig ob die Blattchen in H 20 eingetaucht waren oder auf

der Wasserflache schwammen, wahrend bei 0,2 M NaCl die Gewichtszunahme bei den schwimmenden Blattchen wahrend der Versuchszeit etwa verdoppelt war. FdUrd hatte auf die Frischgewichtsanderung keinen EinfluB (Tabelle 1). Actidion hingegen blockierte die Zunahme des Frischgewichtes bei schwimmenden Blattchen. Das erhohte Frischgewicht - Sukkulenz - der schwimmenden Blattchen in 0,2 M

NaCl beruht auf einer zusatzlichen Wasseraufnahme durch die untere Epidermis.

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Tab. 1 : Die Versuchszeit betrug 21 Stunden, die Blattzahl50; Ausgangsgewicht war 1 ± 0,02 g.

Behandlung

H 20 0,2 M NaCI 0,2 M NaCI 8 . 10-5 M FdUrd

Frischgewichtszunahme in g

schwimmend

0,25 ± 0,01 0,49 ± 0,02

0,48 ± 0,02

stehend

0,25 ± 0,01 0,25 ± 0,01

0,24 ± 0,02

Die an hand des 3H -Thymidineinbaus gemessene DNA-Synthese ergab fiir H 20-Kontrollen eine gesteigerte DNA-Neusynthese gegeniiber Behandlung mit 0,2 M

NaCI (Tabelle 2). Da Thymidineinbau unter Umstanden kein zuverlassiges Mag fiir

Tab. 2: Aufnahme von 3H-Thymidin 2 ftC/ml iiber 23 h bei 20° C durch den Blattstiel von Lobularia maritima.

Abb. 1 a

Behandlung DNA

ftg Spez. Aktiv.

cpm/ftg DNA

E c: ~

1</'"

1.0

0.8

0.6

0.2

15

nRNA DNA

14,28 14,20

t\ .. 1\ : ...

I \ i \ : ~

: ~

i \ I \ i :

!lh~:NA \ ! \ : \ .

919 . 10· 581 . 10·

I!~· . \ ,.-... j \ \ :.. Ii· ~ f '~ , :. \ \ .~ . : . ., : .. '~ l' .. 'j '-_. ~'-.: . \ ..

/. '..... ....... .~ .' -" " ... .if .... ..;:;.-- .......... ..... .....

20 25 30 35 '0 50 55 Fraktion

20

10

5

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die DNA-Synthese ergibt (CAPESIUS und Bopp, 1974; KNOOP, 1974), wurden weitere Versuche mit 32P-Orthophosphat durchgeftihrt. Vorteil dieser Einbauversuche ist, daB gleichzeitig die Wirkung von FdUrd auf DNA- und RNA-Neusynthese zu mess en ist. Wurde die Neusyntihese von Nucleinsauren bei schwimmenden Blattchen in 32P-Orthop'hosphat tiber einen 2eitraum von 21 Stunden gemessen, so war bei 0,2 M NaCI behandelten Blattchen trotz h6:herer Frischgewichtszunahme gegentiber H 20-Kontrollen eine geringere Neusynthese an DNA und RNA festzustellen. FdUrd konnte zusatzlich die DNA- und RNA-Neusynthese hemmen (Tabelle 3).

Tab. 3: Aufnahme von 32P-Orthophosphat 5 ,uC/ml bei schwimmenden Blattchen von Lobularia maritima iiber 21 Stun den bei einer Raumtemperatur von 23-25° C.

Behandlung Nucleinsauren ,ug/50 Blattchen Spez. Aktivitat

nRNA DNA hmRNA nRNA DNA hmRNA

HP 45,26 17,12 325,34 178 . 104 349 . 104 164 . 104

0,2 M NaCI 45,80 17,94 327,15 121 . 104 73 . 104 102 . 104

0,2 M NaCI 45,20 17,65 321,68 36,5 . 104 19 . 104 31 . 104 8 . 10-5 M FdUrd

Die Gesamtmenge an extrahierten Nucleinsauren war in allen Fallen etwa gleich. 2ur Berechnung der spezifischen Aktivitat wurde die gemessene Radioaktivitat auf

15

0.8

0.6

5

0.'

0.2

15 20 25 30 35 '0 50 55 Abb.l b

'5 Fraktion

Abb. 1: Chromatographische Trennung der Nucleinsauren nach Einbau von 32p (5 ,uC/ml) in 0,2 M NaCl fiir 21 Stunden aus Lobularia maritima an einer MAK-Saule. a) schwim­mende Blattchen, b) stehende Blattchen .. -- . Absorption bei 260 nm; 0 --- 0 Radio­aktivitat (cpm/ml).

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die Menge an Nucleinsauren bezogen: 260

1 OD26onm = 40 ,ug/ml Nucleinsauren, Quotient OD 28cl nm betrug 1,9-2.

Wird radioaktives Phosphat in 0,2 M NaCl den Blattchen mal schwimmend, mal stehend angeboten, so ist die Gewichtszunahme der schwimmenden Blattchen (Suk­kulenz) tatsachlich mit einer erhahten Nucleinsauresynthese verbunden (Abbildung 1). Da NaCl in allen Fallen eine Verminderung der Nucleinsaure Neusynthese er­gab, wurde die Wirkung von FdUrd auf H 20-Kontrollen bezogen. Die Aufnahme von Fllissigkeit erfolgte in diesem Falle nur durch den Blattstiel. Die Versuchszeit betrug 4, 8 und 21 Stunden. Bei einer Versuchszeit von 4 Stunden hemmte FdUrd liberhaupt nicht, bei 8 Stunden war die DNA-Synthese zu 65 Ofo und die RNA zu 50 Ofo gegenliber H 20-Kontrollen gehcmmt. Bei einer Einwirkungszeit von 21 Stun­den verursachte FdUrd eine Hemmung der DNA-Neusynthese von 90 Ofo (Tabelle 4).

Tab. 4: Aufnahme von 32P-Orthophosphat 5 ,uC/ml iiber den Blattstiel von Lobularia mari­tima. Temperatur 23-25° C.

Behandlung

HP 8 . 10-5 M FdUrd 4h

8h HP 8 . 10-5 M FdUrd H 20 8 . 10-5 M FdUrd 21 h

Diskussion

Spez. Aktiv. cpmiflg Nucleinsauren n RNA DNA hm RNA

6,5 . 104

6,6 . 104

287,2 . 104

147,1 . 104

325,8 . 104

152,2 . 104

8,5 . 104

8,4 . 104

76,0 . 104

22,1 . 104

528,4 . 104

53,3 . 104

5,7 . 104

5,8 . 104

199,2 . 104

93,1 . 104

245,3 . 104

104,3 . 104

Markierungsversuche an Lobularia mantlma ergaben flir 3H-Thymidin und ra­dioaktives Orthophosphat eine erhahte Neusynthese an Nucleinsauren in dest. H 20 gegenliber 0,2 M NaCl. Die Einbaurate von radioaktiven Substanzen er'hahte sich in dest. H 20, wenn die Blattchen mit dem Blattstiel senkrecht in der Lasung standen (vgl. Tabelle 3 und 4 bei 21 Stunden).

0,2 M NaCl verursachte nur bei schwimmenden Blattchen zusatzlich eine Sukku­lenz, hatte aber trotzdem einen verminderten Einbau an radioaktivem Phosphat in samtlichen Nucleinsaurefraktionen gegenliber Wasserkontrollen bei einer Versuchs­zeit von 21 Stunden (Tab. 3) zur Folge. Wird als Kontrolle flir die durch NaCl her­vorgerufene Sukkulenz die Aufnahme von radioaktivem Phosphat in beiden Fallen in 0,2 M NaCl-Lasung durchgeflihrt, mit dem einzigen Unterschied, dag die Blattchen mal stehen und mal schwimmen, so war die Gewichtszunahme (Sukkulenz) in die­sem Falle tatsachlich mit einer erhahten Nucleinsauresynthese verbunden (Abb. 1).

CATARINO (1968) berichtet, dag durch Besprlihen von ganzen Pflanzen mit einer 2 Ofo NaCl Lasung Sukkulenz der ausdifferenzierten Blattchen verbunden mit einer

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Gewichtszunahme durch Wasseraufnahme und Zellwanddehnung auftritt. Diese ist mit einer Hemmwirkung des Spitzenmeristems verhunden. CATARINO und TREWA­VAS (1970) fanden hei einstlindigem Einhau von in H 20 gelostem 3H Adenin, daB die vorher mit NaCI hespriihten Pflanzen hohere RNA-Synthese aufweisen als die mit Wasser hespriihten.

Unsere Ergehnisse lassen sich nicht direkt mit denen von CATARINO vergleichen, da wir das Versuchsmaterial anders ausgewihlt hatten, namlich teilweise noch nicht vollstandig ausdifferenzierte Blattchen verwendeten. Festgestellt werden konnte, daB FdUrd in jedem Faile DNA- und RNA-Neusynthese hemmt sowohl gegeniiher H 20 als auch gegen NaCI als Kontrolle. Die Wirkung dieser Suhstanz auf den Nu­cleinsauremetaholismus hat aher eine wesentlich langere lag-Phase als hei Sinapis alba (CAPESIUS et a!., 1972).

Dort hetragt die lag-Phase der DNA-Hemmung ungefahr 30 Minuten, hier war erst zwischen 4-8 Stunden die DNA-Synt'hese gehemmt. Sollte die lag-Phase der Wachstumshemmung in ahnlicher Weise wie hei Sinapis alba urn ein Vielfaches lan­ger sein, so kann sie hei einer Versuchszeit von 21 Stunden nicht erfaBt werden. Es handelt sich demnach urn kurzfristige Wirkungen, wahrend die Endopolyploidie von CATARINO (1968) erst nach 24 Tagen gemessen wurde.

Mein Dank gilt Frau M. HILBIG fUr technische Assistenz, der Deutschen Forschungsge­meinschaft fur Sachbeihilfe und Herrn Prof. Dr. M. Bopp fur Diskussionsbeitrage.

Literatur

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Dr. INGRID CAPES IUS, Botanisches Institut der Universitat D-69 Heidelberg, Hofmeisterweg 4.

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