Agilent 1260 Infinity bioinertes LC-SystemLeitfaden • SäurehaltigeProteine:SAX(starkerAnionenaustausch)oderWAX(schwacherAnionenaustausch)

• BeiderAuswahldespH-WertsdermobilenPhasedenisoelektrischenPunkt(pl)desProteinsbeachten.WennpH>pI,istdasProteinnegativgeladen.

• DerpH-WertdesStartpufferssollte0,5bis1EinheitvompIabweichen(überdempIzumAnionenaustausch)

• MitpH8,0fürdenAnionenaustauschbeginnen,wennpIunbekanntist

• MitSAX-Säulenbeginnen,diedenweitestenEinsatzbereichhaben.WAXkannverwendetwerden,umeinenUnterschiedinderSelektivitätzuermöglichen.

• PufferfürdenAnionenaustausch(pH7bis10)be-inhaltenBisTris,TRIS,Diethanolamin,Piperazin

Mobile PhasenDiemobilePhasesollteeinenPufferenthalten,umdengewünschtenpH-Wert,üblicherweise20mM,aufrechterhaltenzukönnen.DieSalzkonzentrationbeträgtüblicherweise400bis500mM.

Der Agilent Buffer AdvisorwirdzurEntwicklungdesbenötigtenGradientenprofilsverwendet,indemverschiedeneAnteileausdenvierStammlösungenvermischtwerden.ProbenaufgabeInjektionmit1bis10 µlfürmaximaleAuflösung.DieProbemussindermobilenPhasezueinergeringerenIonenstärkelöslichseinalszudenStartbedingungen.

SäulentemperaturMaximaltemperatur80°C.DieLebensdauerderSäuleistfür10bis50°Coptimiert.

DetektionUV,G1315Dmiteinerbioinerten10-mm-Standarddurchflusszelle.

FlussrateDieüblicheFlussratemitSäulenvon4,6mmIDbeträgt0,5bis1,0ml/min.

ARBEITSABLAUF FÜR DIE ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE AGILENT BIO IEX HPLC-SäULEN AGILENT PL-SAX STARkE ANIONENAUSTAUSCHSäULEN AGILENT BIO-MONOLITH HPLC-SäULEN

IndiesemDokumentgebenApplikationschemikervonAgilentihreEmpfehlungenfüreinoptimalesLC-SystemunddieKonfigurationfürdieCharakterisierungvonBiomolekülen.DieseEmpfehlungeneignensichauchalsAnleitungfüreineallgemeineMethode,mitderSiebeginnenunddieSieweiteroptimierenkönnen,umspezifischeZielebeiderTrennungzuerreichen.ZusätzlicheInformationenzudenApplikationenfindenSieunterwww.agilent.com/chem/advancebio

Säulenauswahl Bio IEX HPLC-Säulen, PEEk

Beschreibung Bio SAX Bestellnummer Bio WAX Bestellnummer4,6x250mm,10µm 5190-2475 5190-24954,6x50mm,10µm 5190-2476 5190-24964,6x250mm,5µm 5190-2467 5190-24874,6x50mm,5µm 5190-2468 5190-24882,1x250mm,10µm 5190-2479 5190-24992,1x50mm,10µm 5190-2480 5190-24002,1x250mm,5µm 5190-2471 5190-24912,1x50mm,5µm 5190-2472 5190-2492

Bio IEX HPLC-Säulen, EdelstahlBeschreibung Bio SAX Bestellnummer Bio WAX Bestellnummer21,2x250mm,5µm 5190-6883 5190-687710x250mm,5µm 5190-6882 5190-68764,6x250mm,10µm 5190-2473 5190-24934,6x150mm,3µm 5190-68754,6x250mm,5µm 5190-2465 5190-24854,6x50mm,3µm 5190-2463 5190-24834,6x50mm,1,7µm 5190-2461 5190-2481

Agilent haftet weder für hierin enthaltene Fehler noch für Neben- oder Folgeschäden in Zusammenhang mit der Bereitstellung, Leistung oder Verwendung dieses

Materials.

Änderungen vorbehalten.

© Agilent Technologies, Inc., 2015 Gedruckt in den USA, 1. August 2015

Publikationsnummer 5991-6106DEE

PL-SAX Starke Anionenaustauschsäulen1000 Å 4000 Å

Beschreibung Bestellnummer Bestellnummer100x300mm,10µm PL1851-2102 PL1851-210350x150mm,30µm PL1751-3702 PL1751-370350x150mm,10µm PL1751-3102 PL1751-310325x150mm,30µm PL1251-3702 PL1251-370325x150mm,10µm PL1251-3102 PL1251-310325x50mm,10µm PL1251-1102 PL1251-11034,6x250mm,30µm PL1551-5702 PL1551-57034,6x150mm,30µm PL1551-3702 PL1551-37034,6x250mm,10µm PL1551-5102 PL1551-51034,6x150mm,10µm PL1551-3102 PL1551-31034,6x250mm,8µm PL1551-3802 PL1551-38034,6x150mm,8µm PL1551-1802 PL1551-18034,6x50mm,5µm PL1551-1502 PL1551-15032,1x150mm,8µm PL1951-3802 PL1951-38032,1x50mm,8µm PL1951-1802 PL1951-18032,1x50mm,5µm PL1951-1502 PL1951-15031x50mm,5µm PL1351-1502 PL1351-1503

Bio-Monolith HPLC-SäulenBeschreibung BestellnummerBio-MonolithQA 5069-3635Bio-MonolithDEAE 5069-3636

Protokolle für schnelle Trennungen Säule: BioWAX,4,6×250mm,5μmPufferA: 20mMTris-HCL,pH-Wert8,5PufferB: A+500mMNaClGradient: 1bis100 %Bin30minfür50mmSäulen, 60minfür250mmSäulenFlussrate: 0,5ml/minTemperatur: UmgebungstemperaturInjektion: 10μlProbe: 1mg/ml(inmobilerPhase)Detektion: UV,220/280nmHinweis: AlternativkanneinpH-Gradient(hoherbisniedrigerpH)fürdieElutionverwendetwerden.

Myoglobin, pl 6,9

Conalbumin Isoform A, pl 6,24

Conalbumin Isoform B, pl 6,09

a-Lactalbumin, pl 4,5

Trypsin Inhibitor, pl 4,5

Min.0 5 10 15 20 25

mAU

0

10

20

30

40

50

60

70

-10

s

Resp

onse

0

500

1000

1500

2000

0 1000 2000 3000

10 15

30 50

ProteintrennungdurchAEXdurcheinenlinearenGradientenunterVerwendungvon2MNaClalsElutionssalz.Säule: BioWAX,4,6×250mm,5μmPufferA: 20mMTris,pH-Wert7,6PufferB: 20mMTris,pH7,6+2MNaClGradient: 5min–100 %A,20min–70 %B,25min–100 %BTemperatur: 25°CFlussrate: 0,5ml/minInjektionsvolumen: 5μl

HochauflösendeTrennungeinesPoly-T-Oligonukleotid-Größenstandards,versetztmit10,15,30und50mer(Hauptpeaks).Säule: PL-SAX1000 Å,4,6x50mm,8μmPufferA: 7:93v/vACN:100mMTEAA,pH8,5PufferB: 7:93v/vACN:100mMTEAA,1MNH4Cl,pH8,5Gradient: 0bis40 %Bin10min,gefolgtvon40bis70 %B in14minund70bis100 %Bin25minTemperatur: 60°CFlussrate: 1,5 ml/minDetektor: 220nm

SäulenauswahlGebundene Phase

SAX(starkerAnionenaustausch)–N(CH3)3WAX(schwacherKationenaustausch)–N(C2H5)2

Proben SäulePeptideundProteine BioSAXundWAXGlobuläreProteineundPeptide PL-SAX1000 ÅSehrgroßeBiomoleküle/Hochgeschwindigkeit

PL-SAX4000 Å

Viren,DNA,großeProteine,Plasmid Bio-MonolithQADNS,Bakteriophagen Bio-MonolithDEAE