Aus der Abteilung für Gastroenterologie und Hepatologie
des Knappschafts-Krankenhauses Bochum-Langendreer
- Universitätsklinik -
der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. W. Schmiegel
Der Effekt von Interferon alpha auf Thrombozyten und
Thrombopoietin
in Abhängigkeit vom Fibrosegrad
bei Patienten mit chronischer Hepatitis C
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
Vorgelegt von
Stefanie Rose
aus Hagen
2004
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent: Prof. Dr. med. W. Schmiegel
Korreferent: Prof. Dr. med. S. Petrasch
Tag der mündlichen Prüfung: 14.04.2005
M e i n e n E l t e r n i n D a n k b a r k e i t g e w i d m e t
I
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung......................................................................... 1
1.1 Thrombozytopoese und Thrombopoietin.................................. 2
1.1.1 Entdeckung von Thrombopoietin................................. 3
1.1.2 Struktur von Thrombopoietin....................................... 3
1.1.3 Aufgaben von TPO und Regulation der
TPO-Produktion........................................................... 4
1.2 Therapie der chronischen Hepatitis C...................................... 8
1.3 Richtlinien zur Therapiekontrolle.............................................. 10
1.4 Fragestellung............................................................................ 11
2 Patienten, Material und Methoden................................. 12
2.1 Patientengruppe..................................................................... 12
2.2 Kontrollgruppe........................................................................ 12
2.3 Blutprobengewinnung............................................................ 13
2.3.1 Gewinnung von Blutserum.......................................... 13
2.3.2 Blutbild......................................................................... 13
2.3.3 Bestimmung von Glutamat-Pyruvat-Dehydrogenase/
-Transaminase (GPT) [entspricht Alanin-Amino-
Transferase (ALT)] und Glutamat-Oxalacetat-
Transaminase (GOT) [entspricht Aspartat-Amino-
Transferase (AST)]...................................................... 14
2.3.4 Messung von Albumin................................................. 14
2.3.5 Messung des Quickwertes (Thromboplastinzeit)......... 14
2.4 Bestimmung der HCV-RNA.................................................... 15
2.5 Bestimmung von Thrombopoietin.......................................... 16
2.5.1 Prinzip des Thrombopoietin-ELISA............................. 17
2.5.2 Ablauf des Thrombopoietin-ELISA.............................. 19
2.6 Einteilung des Fibrosegrades................................................ 21
2.7 Bestimmung der Milzgröße.................................................... 21
2.8 Statistische Methoden........................................................... 22
II
3 Ergebnisse............................................................ 24
3.1 Thrombopoetin-Konzentration und Thrombozytenzahl der
gesunden Probanden............................................................. 25
3.2 Ausgangssituation: Thrombopoietin-Serumkonzentration und
Thrombozytenzahl vor Therapiebeginn unter Beachtung des
Einflusses des Fibrosegrades................................................ 27
3.3 Kinetik der Thrombopoietin-Spiegel und der Thrombozyten-
zahl während und nach der Therapie.................................... 28
3.4 Kinetik der Thrombopoietinkonzentration und
Thrombozytenzahl in Abhängigkeit vom Fibrosegrad............ 31
3.5 Varianzanalyse: Modell mit Messwiederholung..................... 34
3.5.1 Thrombopoietinkonzentration...................................... 34
3.5.2 Thrombozytenzahl....................................................... 34
3.6 Einstichproben-t-Test angewandt auf die Differenzen
der verbundenen Stichproben................................................ 35
3.6.1 Auswertung der Ergebnisse der Thrombopoietin-
Serumkonzentration in Abhängigkeit vom
Fibrosegrad und von der Zeit...................................... 35
3.6.2 Auswertung der Ergebnisse der Thrombozytenzahl
in Abhängigkeit vom Fibrosegrad und von der Zeit..... 35
3.7 Auswirkung der Interferon-Therapie auf weitere Parameter
des Blutbildes......................................................................... 37
3.7.1 Kinetik der Leukozyten................................................ 37
3.7.2 Kinetik des Hämoglobinwertes.................................... 39
3.7.3 Kinetik von GOT und GPT........................................... 40
3.7.4 Kinetik von Albumin..................................................... 43
3.7.5 Kinetik des Quickwertes.............................................. 44
3.7.6 Einfluss der Milzgröße................................................. 45
III
4 Diskussion....................................................................... 47
4.1 Fibrosegrad, Thrombozytenzahl und Thrombopoietin........... 48
4.2 Einfluss von Interferon........................................................... 53
4.3 Thrombozyten und Thrombopoietin nach Abschluss der
Interferon-Therapie................................................................ 57
4.4 GOT und GPT........................................................................ 59
4.5 Leber-Synthese-Parameter Albumin und Quick.................... 59
4.5.1 Albumin....................................................................... 59
4.5.2 Quick........................................................................... 59
4.6 Hämoglobin............................................................................ 60
4.7 Fazit....................................................................................... 61
5 Zusammenfassung......................................................... 62
6 Literaturverzeichnis........................................................ 65
7 Anhang: Erhebungsbogen............................................. 82
8 Danksagung..................................................................... 83
9 Lebenslauf....................................................................... 84
IV
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Regelkreis der Thrombozytopoese.............................. 6
Abbildung 2: Prinzip des Sandwich-ELISA....................................... 18
Abbildung 3: Thrombopoietin-Konzentrationen der 20 gesunden
Probanden, gemessen mit dem ELISA
Quantikine® human Tpo, R&D Systems
(Absolutwerte dargestellt)............................................ 25
Abbildung 4: Thrombopoietin-Konzentrationen der 20 gesunden
Probanden, dargestellt als Box-and-Whiskers-Plot.... 26
Abbildung 5: Thrombozytenzahlen der 20 gesunden Probanden,
dargestellt als Box-and-Whiskers-Plot......................... 26
Abbildung 6: Thrombozytenzahl und TPO-Konzentration der 45
Patienten mit chronischer Hepatitis C zum Zeitpunkt
vor Beginn der Therapie (Darstellung der Mediane)... 27
Abbildung 7: Thrombozytenzahl und TPO-Konzentration der 45
Patienten mit chronischer Hepatitis C nach zwei
Monaten Kombinationstherapie (Darstellung der
Mediane)...................................................................... 28
Abbildung 8: Thrombozytenzahl und TPO-Konzentration der 45
Patienten mit chronischer Hepatitis C nach vier
Monaten Kombinationstherapie (Darstellung der
Mediane)..................................................................... 29
Abbildung 9: Thrombozytenzahl und TPO-Konzentration der 45
Patienten mit chronischer Hepatitis C nach sechs
Monaten Kombinationstherapie (Darstellung der
Mediane)...................................................................... 30
Abbildung 10: Thrombozytenzahl und TPO- Konzentration der 45
Patienten mit chronischer Hepatitis C nach der
Kombinationstherapie (Nachbeobachtungszeitraum:
zwei bis maximal sechs Monate nach
Therapiebeendigung).................................................. 30
V
Abbildung 11: Darstellung der Thrombozytenzahl und
Thrombopoietinkonzentration (Mediane) vor,
während und nach der antiviralen Kombinations-
therapie bei Patienten mit chronischer Hepatitis C
und ohne bzw. mit sehr leichter Fibrose
(Fibrosegrad 0 nach Metavir)...................................... 31
Abbildung 12: Darstellung der Thrombozytenzahl und
Thrombopoietinkonzentration (Mediane) vor,
während und nach der antiviralen Kombinations-
therapie bei Patienten mit chronischer Hepatitis C
und mittelschwerer Fibrose (Fibrosegrad 1+2 nach
Metavir)....................................................................... 32
Abbildung 13: Darstellung der Thrombozytenzahl und
Thrombopoietinkonzentration (Mediane) vor,
während und nach der antiviralen Kombinations-
therapie bei Patienten mit chronischer Hepatitis C
und ausgeprägter Fibrose (Fibrosegrad 3+4 nach
Metavir)....................................................................... 33
Abbildung 14: Leukozytenwerte der Patienten mit chronischer
Hepatitis C während des Beobachtungszeitraumes
(vor, während und nach Interferon-Ribavirin-Therapie)
in Abhängigkeit von dem bestehenden
Fibrosegrad (Darstellung der Mediane)....................... 37
Abbildung 15: Hämoglobinwerte der Patienten mit chronischer
Hepatitis C während des Beobachtungszeitraumes
(vor, während und nach Interferon-Ribavirin-Therapie)
in Abhängigkeit von dem bestehenden
Fibrosegrad (Darstellung der Mediane)....................... 39
Abbildung 16: Transaminasen (hier beispielhaft dargestellt für GPT)
der Patienten mit chronischer Hepatitis C während
des Beobachtungszeitraumes (vor, während und
nach Interferon-Ribavirin-Therapie) in Abhängigkeit
von dem bestehenden Fibrosegrad (Darstellung der
Mediane)...................................................................... 40
VI
Abbildung 17: Therapie-Responder (55% des Patientenkollektivs)
und die Höhe ihrer Transaminasen (hier beispielhaft
dargestellt für GPT) vor und nach der Therapie in
Abhängigkeit von ihrem Fibrosegrad (Darstellung der
Mediane)...................................................................... 41
Abbildung 18: Therapie-Non-Responder (45% des Patienten-
kollektivs) und die Höhe ihrer Transaminasen
(hier beispielhaft dargestellt für GPT) vor und nach
der Therapie in Abhängigkeit von ihrem Fibrosegrad
(Darstellung der Mediane)........................................... 42
Abbildung 19: Albuminwerte der Patienten mit chronischer
Hepatitis C während des Beobachtungszeitraumes
(vor, während und nach Interferon-Ribavirin-Therapie)
in Abhängigkeit von dem bestehenden Fibrosegrad
(Darstellung der Mediane)........................................... 43
Abbildung 20: Quickwerte der Patienten mit chronischer
Hepatitis C während des Beobachtungszeitraumes
(vor, während und nach Interferon-Ribavirin-Therapie)
in Abhängigkeit von dem bestehenden Fibrosegrad
(Darstellung der Mediane)........................................... 44
Abbildung 21: Größe der Milz der 45 Patienten mit chronischer
Hepatitis C in Abhängigkeit von dem bestehenden
Fibrosegrad................................................................. 45
Abbildung 22: Verteilung der Thrombozytenzahl (Mediane) der
Patienten mit mäßiger und schwerer Fibrose in
Abhängigkeit von der Milzgröße.................................. 46
Abbildung 23: Autoregulation der Thrombozytopoese und
der Einflussfaktor Milz................................................. 52
Abbildung 24: Darstellung der Einflüsse der Interferon-Therapie und
der Milz auf Thrombopoietin und Thrombozyten......... 55
VII
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1 Patienten-Charakteristika (Mittelwerte ±
Standardabweichung; [Median]).................................. .......... 24
Abkürzungsverzeichnis
Alb Albumin
c-Mpl cellular murine myeloproliferative leukemia virus
DNA/DNS Desoxyribonucleic acid / Desoxyribonukleinsäure
ELISA Enzyme-linked Immuno-sorbent-assay
GOT Glutamat-Oxalacetat-Transaminase, Synonym: Aspartat-
Amino-Transferase (AST)
GPT Glutamat-Pyruvat-Transaminase, Synonym: Alanin-Amino-
Transferase (ALT)
Hb Hämoglobin
HCV Hepatitis-C-Virus
HLA Human Leucocyte Antigen
IFN Interferon
INR International Normalized Ratio
ITP Idiopathische thrombozytopenische Purpura
JAK Januskinase
KDa Kilo-Dalton, atomare Masseneinheit
MDS Myelodysplastisches Syndrom
MHC Major Histocompatibility Complex
Mpl murine myeloproliferative leukemia virus
NDDIC National Digestive Diseases Information Clearinghouse
NIDDK National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney
Diseases
NIH National Institute of Health
VIII
PCR Polymerase-Chain-Reaction
RKI Robert-Koch-Institut
RNA/RNS ribonucleic acid / Ribonukleinsäure
RT-PCR Reverse-Transkriptase-PCR
STAT Signal Transduction and Activators of Transcription
TA Transaminasen
TPO Thrombopoietin
TSH Thyroidea-Stimulating-Hormon
TYK Tyrosinkinase
TZ Thrombozytenzahl
v-Mpl viral murine myeloproliferative leukemia virus
WBC White Blood Cells
WHO World Health Organization
1 Einleitung
1
1 Einleitung
Die Leber spielt eine zentrale Rolle im menschlichen Stoffwechsel. Sie erfüllt
zahlreiche Synthese-, Exkretions- und Entgiftungs-Funktionen, zu denen
beispielhaft die Synthese der Gerinnungsfaktoren, Lipide, Kohlenhydrate und
des Albumins, die Bildung und Exkretion von Gallensäuren, sowie die
Entgiftung endo- und exogener toxischer Stoffe gezählt werden.
Die gemeinsame Endstrecke einer Vielzahl chronischer Lebererkrankungen
ist die Leberzirrhose.
Neben der alkoholtoxischen Hepatopathie stellt die chronische Virushepatitis,
in der westlichen Welt die Infektion mit dem Hepatitis C-Virus, die häufigste
Ursache der Leberzirrhose dar. Heute ist die Hepatitis C-assoziierte
Leberzirrhose die häufigste Indikation für eine Lebertransplantation (NIDDK,
2003; Lauer and Walker, 2001; Fishman et al., 1996; Detre et al., 1996).
Nach Angaben der WHO sind etwa 170 Millionen Menschen, d.h. 3% der
Weltbevölkerung, mit dem Hepatitis C-Virus infiziert; in Deutschland wird die
Zahl chronisch infizierter Hepatitis-C-Virusträger auf 800.000 geschätzt
(Reiser et al., 2003; Schreier and Höhne, 2001).
Die chronische Entzündungsreaktion im Rahmen der Hepatitis führt zur
Bindegewebsvermehrung (Fibrose), die letztlich in einem irreparablen
Umbau des Leberparenchyms mit Zerstörung der Architektur mündet. Dies
führt zum Ausfall essentieller Leberfunktionen mit Entwicklung zahlreicher
Komplikationen wie Ikterus, Koagulopathie, Hypoalbuminämie, Aszites und
Enzephalopathie.
Der Schweregrad einer Zirrhose wird mit Hilfe des Child-Pugh-Scores
angegeben, der aus den Serumwerten für Albumin, Bilirubin und Quickwert
sowie dem Ausmaß von Aszites und hepatischer Enzephalopathie ermittelt
wird und eine Prognoseeinschätzung erlaubt.
Regelhaft wird die Leberzirrhose von einer Leukozytopenie und
Thrombozytopenie begleitet (Goulis et al., 1999). Die Thrombozytopenie ist
eine schwerwiegende Komplikation, die eine Koagulopathie verstärken und
1 Einleitung
2
zu ausgedehnten Blutungen führen kann (Peck-Radosavljevic et al., 1997
u.1998; Bartley et al., 1994).
Eine wesentliche Ursache für die zirrhoseassoziierte Thrombozytopenie wird
in einer vermehrten Sequestration der Thrombozyten in der Milz gesehen.
Hiermit übereinstimmend zeigen mehrere Studien zur Thrombozytopenie bei
chronischen Lebererkrankungen, dass der vergrößerte Thrombozyten-
milzpool und die beschleunigte Zerstörung wichtige Mechanismen der
Thrombozytopenie sind (Aster, 1966; Harker and Finch, 1969; Toghill et al.,
1977; Peck-Radosavljevic et al., 1997; Adinolfi et al., 2001).
1.1 Thrombozytopoese und Thrombopoietin
Die Bildung und Entwicklung der Thrombozyten (Thrombozytopoese) findet
im Knochenmark statt. Aus Knochenmarkstammzellen entstehen durch
Differenzierung erst Megakaryoblasten, dann durch mitotische Teilung
Promegakaryozyten und schließlich die reifen Megakaryozyten. Diese geben
durch Cytoplasmaabschnürung in den Knochenmarksinus Thrombozyten an
das Blut ab. Die Thrombozytopoese wird durch den Einfluss verschiedener
stimulierender Faktoren geregelt.
Eine wichtige Rolle in der Regulation der Thrombozyto- und
Megakaryozytopoese spielt das Thrombopoietin (TPO) (Kaushansky, 2003;
Kaushansky, 1995).
Erst mit der Entdeckung von TPO im Jahre 1994 und der Identifizierung der
Hepatozyten als den hauptsächlichen TPO-Produktionsorten kam der Leber
eine zentrale Stellung in der Thrombozytopoese und Thrombozytenregulation
zu (De Sauvage et al., 1994; Lok et al., 1994; Bartley et al., 1994; Kuter and
Rosenberg, 1994; Kuter et al., 1994; Sohma et al., 1994; Broudy and
Kaushansky, 1998).
1 Einleitung
3
1.1.1 Entdeckung von Thrombopoietin
Im Jahre 1958 wurde der Ausdruck „Thrombopoietin“ zum ersten Mal
gebraucht, um einen Faktor zu beschreiben, der nach dem Einsetzen einer
Thrombozytopenie für das Ansteigen der Thrombozyten-Produktion
verantwortlich zu sein schien (Kelemen et al., 1958).
Viele Versuche in den 70er und 80er Jahren, Thrombopoietin (TPO) genauer
zu charakterisieren, blieben aufgrund der hohen biochemischen Komplexität
des Moleküls erfolglos.
Erst im Jahre 1992 eröffnete die Beschreibung des viralen Proto-Onkogens
v-Mpl und des dazu homologen zellulären Onkogens c-Mpl (murine
myeloproliferative leukemia virus) neue Perspektiven in der Suche nach TPO
(Vigon et al., 1992).
Eine detaillierte Studie des c-Mpl Genes ergab, dass es einen bisher nicht
beachteten hämatopoietischen Zytokin-Rezeptor kodierte.
Mehrere Gruppen (De Sauvage et al., 1994; Lok et al., 1994; Bartley et al.,
1994; Kuter et al., 1994; Kuter and Rosenberg, 1994; Sohma et al., 1994)
hatten schließlich Erfolg, das Protein zu isolieren und die cDNA für
Thrombopoietin zu klonieren.
1.1.2 Struktur von Thrombopoietin
Thrombopoietin (TPO) ist ein 60-70 kDa schweres Polypeptid aus 353
Aminosäuren. Es lassen sich zwei Domänen unterscheiden, die auf der
Ähnlichkeit mit der Primärstruktur von Erythropoietin (EPO) basieren (Gurney
et al., 1994; De Sauvage et al., 1994; Lok et al., 1994; Metcalf, 1994).
Der Amino-N-terminale Abschnitt des Peptids (155 Aminosäuren) hat große
Ähnlichkeit mit Erythropoietin: 21% der Aminosäuren sind identisch und es ist
strukturell zu 46% analog aufgebaut wie EPO, was die beiden Hormone zu
den am meisten miteinander verwandten aller hämatopoietischen
Wachstumsfaktoren macht (Kaushansky, 1998a; Broudy and Kaushansky,
1998). Außerdem enthält diese Region einen großen Cystein-Anteil und
1 Einleitung
4
diese ist für die Bindung an den spezifischen Rezeptor (c-Mpl) und somit für
die thrombopoetische Wirkung verantwortlich (Bartley et al., 1994).
Im Gegensatz dazu ist der C-terminale Abschnitt des Moleküls (die zweite
178 Aminosäuren enthaltende Domäne) mit keinem anderen Protein
verwandt. Dieser ist charakterisiert durch einen hohen Prozentsatz von
Serin- und Prolin-Resten und enthält viele glykosylierte Seitenketten und
scheint für die Stabilität des Moleküls eine Rolle zu spielen (Kaushansky,
1998a; Broudy and Kaushansky,1998).
1.1.3 Aufgaben von TPO und Regulation der TPO-Produktion
Thrombopoietin ist der hauptsächliche Regulator der Megakaryozyto- und
Thrombozytopoese. Es steigert die Menge an Megakaryozyten-
Vorläuferzellen, stimuliert die Proliferation und Maturation der
Megakaryozyten und lässt die Plättchen- und Megakaryozyten-Anzahl und -
Größe anwachsen (Kaushansky et al., 1994; Kaushansky, 1995; Wendling et
al., 1994; Zucker-Franklin and Kaushansky, 1996).
In verschiedenen Versuchen an Mäusen, Affen und Menschen wurde
gezeigt, dass bei Gabe von TPO die peripheren Thrombozytenzahlen
innerhalb von 3-5 Tagen auf das 5-10fache der Normalwerte ansteigen (Lok
et al., 1994).
Andere Zytokine wie Interleukin 3 und 11, Erythropoietin und Steel Factor,
wirken synergistisch, indem sie das Megakaryozyten-Wachstum positiv
beeinflussen und das Überleben aller hämatopoetischen Stammzellen und
Blutzellvorläufern verlängern (Broudy et al., 1995; Kaushansky et al., 1995;
Kobayashi et al., 1996; Kaushansky et al., 1996; Kaushansky, 1998b;
Kaushansky, 1999b).
TPO unterstützt darüber hinaus Erythropoietin bei der Entwicklung von
Erythrozyten-Vorläuferzellen (Kaushansky et al., 1996).
Kaushansky konnte 1997 in einer seiner Arbeiten zeigen, dass bei
genetischer Elimination von TPO oder des TPO-Rezeptors die Spiegel der
1 Einleitung
5
Vorläuferzellen aller Zelllinien reduziert sind und die Thrombozyten-
Produktion stark beeinträchtigt ist (Kaushansky, 1997).
Diese Befunde bestätigen die Stellung von TPO als hauptverantwortlichem
Faktor für die Thrombozytopoese und als nicht zelllinienspezifischer
Wachstumsfaktor aller hämatopoietischen Vorläuferzellen (Kaushansky,
2003 u. 1999a; Geddis et al., 2002).
Außerdem sensibilisiert Thrombopoietin die Thrombozyten für Faktoren
(Thrombin, Kollagen), die für die Plättchen-Aggregation verantwortlich sind
(Kaushansky, 1998a+b; Alexander et al., 1996; Chen et al., 1995).
Thrombopoietin wird in verschiedenen Organen (in den Nieren, im glatten
Muskel, in Knochenmarkstromazellen) gebildet; der größte Anteil wird jedoch
in der Leber durch die Hepatozyten produziert (De Sauvage et al., 1994 ; Lok
et al., 1994; Shimada et al., 1995; Guerriero et al., 1997; Qian et al., 1998;
Broudy and Kaushansky, 1998; Kaushansky, 1998a).
TPO entfaltet seine Wirkung durch die Bindung an seinen Zell-
Oberflächenrezeptor, c-Mpl (Bartley et al., 1994; Gurney et al., 1994). Der
TPO-Rezeptor (c-Mpl) gehört zu der hämatopoetischen Zytokin-Rezeptor-
Familie Typ I, die ihre biologischen Effekte über die Aktivierung der
Januskinase (JAK) ausübt. Durch Bindung des Liganden TPO an den
Rezeptor c-Mpl wird eine Signalkaskade ausgelöst: Es kommt zur Rezeptor-
Oligomerisation und -Konformationsänderung, wodurch die JAK
phosphoryliert und in der Folge die TAK (Tyrosinkinase), STAT (Signal
transduction and activators of transcription) und weitere kritische
intrazelluläre Substanzen aktiviert werden (Wang et al., 2000; Drachman et
al., 1999; Miyakawa et al., 1996; Drachman et al., 1995; Tortolani et al.,
1995; Gurney et al., 1995; Miyakawa et al., 1995; Sattler et al., 1995; Morella
et al., 1995; Ihle et al., 1994).
Die zirkulierende Menge an Thrombopoietin unterliegt einem komplexen
Regelkreis (Abb. 1). Mehrere Studien haben gezeigt, dass Megakaryozyten
und Thrombozyten hoch-affine Thrombopoietin-Rezeptoren haben, mittels
derer sie das Zytokin binden und wieder aus dem Blutkreislauf entfernen (Li
et al., 1999; Sato et al., 1998; Fielder et al., 1997; Folman et al., 1997;
Broudy et al., 1997; Nagata et al., 1997; Fielder et al., 1996; Kuter and
1 Einleitung
6
Rosenberg, 1995). Wenn die Thrombozytenzahlen normal hoch sind,
zirkuliert deshalb nur wenig Thrombopoietin. In thrombozytopenischen
Zuständen kann von den weniger vorhandenen Plättchen und Mpl-
Rezeptoren nur eine geringe Menge des freigesetzten Thrombopoietins aus
der Zirkulation entfernt werden. Deswegen steigt die Konzentration von
löslichem TPO an. Der daraus resultierende hohe Thrombopoietin-Spiegel
stimuliert das Knochenmark. Auf diese Weise wird das Knochenmark zur
erneuten Megakaryo- und Thrombozytopoese angeregt. Wenn die
Thrombozytenzahl wieder steigt, entfernen die Thrombozyten mittels ihrer
Rezeptoren den größten Anteil des Thrombopoietins aus dem Plasma, der
Thrombopoietin-Spiegel sinkt daraufhin wieder ab und die Knochenmark-
Ausschüttung von Thrombozyten kommt fast zum Erliegen (Geddis et al.,
2002; Kaushansky, 1998a; Kuter and Rosenberg, 1995).
Betrachtet man nur diesen Regelkreis, dann resultiert ein umgekehrt
proportionales Verhältnis von Thrombozyten und Thrombopoietin zueinander
(Jelkmann, 2001; Espanol et al., 2000; Peck-Radosavljevic et al., 1997; Kuter
and Rosenberg, 1995).
Autoregulation von Thrombozyten und
Thrombopoietin
Megakaryozyten
im Knochenmark
TPO-mRNA
TPO im SerumTPO im Serum
Thrombozyten binden TPO
mit Mpl-Rezeptoren
Fördernder Einfluss
Hemmender Einfluss
Leber
Abbildung 1: Regelkreis der Thrombozytopoese (angelehnt an Geddis et al., 2002)
1 Einleitung
7
In der Tat konnten Folman et al. in ihrer Studie (Folman et al., 2001) zeigen,
dass thrombozytopenische Patienten einen hohen Thrombopoietin-Spiegel
hatten, der nach Thrombozyten-Transfusion zunächst abfiel, mit erneut
sinkender Thrombozyten-Zahl jedoch wieder anstieg. Ebenfalls zeigten
Moller et al., dass nach Thrombozyten-Transfusionen signifikante Senkungen
in der mittleren TPO-Konzentration eintraten (Moller et al., 2000).
Die hepatische Thrombopoietinproduktion scheint dagegen keiner
transkriptionellen oder posttranskriptionellen Regulation zu unterliegen und
wird daher als konstant (konstitutiv) angesehen (Geddis et al., 2002; Cardier
and Dempsey, 1998; Stoffel et al., 1996). Auch Jelkmann kam zu dem
Schluss, dass die Leber gleichbleibend und wenig beeinflusst von äußeren
Umständen, wie z.B. dem Thrombozyten-Spiegel im Blut, konstante Mengen
an Thrombopoietin produziert (Jelkmann, 2001).
Bei gesunden Erwachsenen mit normaler Thrombozytenzahl liegen die TPO-
Plasmaspiegel unter 200 pg/ml und damit in einem niedrigen Bereich
(Jelkmann, 2001; Emmons et al.,1996; Chang et al., 1996; Tahara et al.,
1996).
Die Studiengruppen um Hou und Stockelberg (Hou et al., 1998; Stockelberg
et al., 1999) fanden bei ihren Untersuchungen von gesunden Probanden
Mittelwerte für Thrombopoietin von 50 ± 14 pg/ml.
1 Einleitung
8
1.2 Therapie der chronischen Hepatitis C
Die Therapie der Wahl der chronischen Hepatitis C besteht in einer
Kombinationstherapie mit Interferon alpha und Ribavirin (Konsensus der
DGVS/Hep-Net, 2003; Reiser et al., 2003; Tran and Martin, 2001; Reiser and
Schmiegel, 1999; Peck-Radosavljevic et al., 1998; Hoofnagle and di
Bisceglie, 1997; Poynard et al., 1995).
Interferone sind Bestandteile eines Zytokinnetzwerkes, welches im Rahmen
einer Virusinfektion für die Regulation zellulärer Funktionen, der Replikation
und der Immunantwort verantwortlich ist.
Interferon alpha gehört zu den Klasse-I-Interferonen und wird von
Makrophagen produziert. Die Genstruktur der Alpha-Interferone ist komplex
und umfasst mehr als 20 Gene. Für die Therapie wurden verschiedene
Typen von rekombinantem Interferon alpha entwickelt, die unterschiedliche
antiproliferative und immunmodulatorische Eigenschaften besitzen.
Durch Hemmung der Viruspenetration und Virusreplikation wirkt Interferon
alpha direkt antiviral auf DNA- und RNA-Viren. Dabei wird sowohl zelluläre
als auch virale RNA abgebaut. Die Aktivierung einer Proteinkinase führt zur
weiteren Inhibition der Proteinsynthese, wodurch die Entwicklung weiterer
Viruspartikel behindert wird.
Interferon moduliert weiterhin die zelluläre Immunantwort durch vermehrte
Expression von MHC-I-Antigen. Es fördert somit die Präsentation viraler
Antigene durch HLA-Klasse-I-Moleküle auf der Hepatozytenoberfläche und
begünstigt damit die Zerstörung infizierter Leberzellen durch zytotoxische T-
Zellen. Hierdurch wird neben der direkten Wirkung auf zytotoxische T-Zellen
und natürliche Killerzellen die spezifische T-Zell-vermittelte (zytotoxische und
Suppressor-T-Zellen) Immunantwort verstärkt (Gutterman, 1994).
Eine Hauptnebenwirkung unter Interferon-Therapie ist die Thrombozytopenie
(Fried, 2002; Peck-Radosavljevic et al., 1998; Hoofnagle and di Bisceglie,
1997; Poynard et al., 1995).
Verschiedene Formen von Interferon stehen heute zur Verfügung: Die
Standard-Interferone alpha-2a und -2b, sowie das nicht natürlich
1 Einleitung
9
vorkommende (synthetische) Consensus-Interferon. Sie werden dreimal pro
Woche subkutan appliziert. Die pegylierten Interferone alpha-2a und -2b
stellen eine Weiterentwicklung der Standardinterferone dar. Sie bestehen
aus Interferon alpha, das durch Zufügen von Polyethylen-Glycol „retardiert“
wurde; das Ergebnis ist ein lang-wirksames Interferon, das nur einmal pro
Woche gegeben werden muss (Konsensus der DGVS/Hep-Net, 2003;
NIDDK, 2003; Tran and Martin, 2001; Manns et al., 2001; Zeuzem et al.,
2000; McHutchison et al., 1998).
Ribavirin ist ein antivirales (virostatisch wirkendes) Agens, das zweimal am
Tag in einer körpergewichtsabhängigen Gesamt-Dosis von 800 mg bis
1200 mg oral eingenommen wird (Konsensus der DGVS/Hep-Net, 2003;
Lauer and Walker, 2001). Ribavirin hat keinen Einfluss auf die
Thrombozytopoese und auf die Höhe der zirkulierenden
Thrombozytenzahlen.
Die Kombinationstherapie mit Interferon und Ribavirin erzielt höhere Raten
einer anhaltenden Therapieantwort als die Interferon-Monotherapie.
Das primäre Therapieziel in der Behandlung der chronischen Hepatitis C
besteht in der dauerhaften Elimination des HC-Virus, welche durch einen
negativen Serum-HCV-RNA-Nachweis 6 Monate nach Beendigung der
Therapie definiert wird (anhaltende Therapieantwort).
Zu den sekundären Therapiezielen zählen die Verzögerung der
Krankheitsprogression, die Verbesserung der Leber-Histologie, die
Minderung der Infektiösität und die Reduktion des Risikos für das Auftreten
eines hepatozellulären Karzinoms (Tran and Martin, 2001; Gramenzi et al.,
2001; Di Bisceglie, 1998; Hoofnagle and di Bisceglie, 1997).
Der Erfolg der Therapie mit Interferon und Ribavirin ist sowohl von
Virusfaktoren (Genotyp, Viruslast) als auch von Wirtsfaktoren
(Fibrosestadium, Alter, Körpergewicht) abhängig. Die Chance einer
anhaltenden Therapieantwort (normale Transaminasen und fehlender HCV-
RNA-Nachweis im Serum 6 Monate nach Ende der Therapie) liegt bei
ungünstiger Konstellation (lange Krankheitsdauer, fortgeschrittenes
Fibrosestadium, hoher Viruslast) um 40%, bei günstiger Konstellation ist sie
1 Einleitung
10
größer 80% (Poynard et al., 2001; Reiser et al., 2003; Reiser and Schmiegel,
1999).
1.3 Richtlinien zur Therapiekontrolle
Alle 4 Wochen sollte eine klinische Untersuchung (im ersten Monat alle 2
Wochen), sowie eine Laborkontrolle von Transaminasen, Blutbild mit
Thrombozyten, Leukozyten und Hämoglobin und ggf. der
Nierenretentionswerte (Kreatinin) und der Glukose erfolgen. TSH-Messungen
sollten in 12-wöchigen Abständen erfolgen, um frühzeitig eine
Schilddrüsendysfunktion zu erkennen und ggf. zu therapieren.
Eine Bestimmung der HCV-RNA mittels PCR (quantitativ und qualitativ) wird
vor Beginn der Therapie, sowie 12 und 24 Wochen nach Therapiebeginn
empfohlen.
Nach Beendigung der Therapie sollten die Patienten für mindestens weitere
24 Wochen überwacht werden. Nach dieser Zeit ist eine erneute Prüfung auf
Vorhandensein und Menge von HCV-RNA vorzunehmen.
Als Kontraindikation gegen eine Therapie mit Interferon gilt eine
Thrombozytenzahl unter 50.000/µl. Weitere Gegenanzeigen einer Therapie
mit Interferon sind schwere psychische Erkrankungen, Alkohol- oder
Drogenabusus, oder eine bestehende oder geplante Schwangerschaft
(Konsensus der DGVS/Hep-Net, 2003; NIDDK, 2003).
1 Einleitung
11
1.4 Fragestellung
Aus den vorherigen Ausführungen ist erkennbar, dass die Thrombozytenzahl
einer komplexen Regulation unterliegt. Die Sequestration und Zerstörung der
Thrombozyten in der Milz sowie die Produktion der Thrombozyten im
Knochenmark stellen kritische Grössen in der Balance des
Thrombozytenhaushaltes dar. Die Leber, als Hauptproduktionsort für TPO,
und ihre Funktion ist ein weiterer sensibler Parameter im Regelkreis der
Thrombozytopoese.
Eine Thrombozytopenie tritt häufig als Komplikation bei chronischen
Lebererkrankungen auf und exazerbiert oftmals unter Therapie mit Interferon
und Ribavirin.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, den Einfluss des Leberfibrosegrades
sowie den Effekt einer Interferon-Ribavirin-Kombinationstherapie auf die
TPO-Serumkonzentration und Thrombozytenzahl bei Patienten mit
chronischer Hepatitis C zu untersuchen.
Hierzu sollten folgende Fragen beantwortet werden:
1. Wie verhält sich die TPO-Serumkonzentration bei verschiedenen
Fibrosegraden und welche Beziehung besteht zur Thrombozytenzahl?
2. Welche Auswirkung hat die Interferon-Therapie auf die TPO-Spiegel?
3. Ist der Einfluss der Interferontherapie auf die TPO-Spiegel vom
Fibrosegrad abhängig?
2 Patienten, Material und Methoden
12
2 Patienten, Material und Methoden
2.1 Patientengruppe
In der Medizinischen Universitätsklinik des Knappschaftskrankenhauses
Bochum-Langendreer wurde in der Zeit von Januar 1997 bis Januar 2002
das Blut von mehr als 300 Patienten mit chronischer HCV-Infektion
untersucht.
Vom untersuchten Patientenkollektiv lag bei 45 Patienten ein adäquater
Serumsatz (Serumproben zum Zeitpunkt vor Beginn, zu den
Untersuchungszeitpunkten zwei, vier und sechs Monate während und
mindestens zwei Monate nach Beendigung der Interferon-Ribavirin-Therapie)
zur Aufnahme in diese Studie vor. Bei den übrigen Patienten waren keine
ausreichenden klinischen Daten bzw. zu wenig Probenmaterial zur
Bestimmung der TPO-Konzentration vorhanden.
Aus den vorliegenden Patientenakten wurden ermittelt:
♦ Alter und Geschlecht der Probanden
♦ Genotyp des HC-Virus
♦ der Zeitpunkt der Erstdiagnose
♦ der mögliche Infektionszeitpunkt und Infektionsweg
♦ die Histologie der Leber (Einteilung nach Metavir)
♦ Leber- und Milzgröße
♦ die zu den jeweiligen Untersuchungszeitpunkten bestimmten
Blutbilder
♦ PCR-Daten
♦ stattgefundene bzw. angewandte Therapien
Die klinisch relevanten Daten der einzelnen Patienten wurden in einem
Erhebungsbogen (s. Anhang) zusammengestellt.
2.2 Kontrollgruppe
Eine aus 20 gesunden Personen bestehende Kontrollgruppe wurde im Juli
2002 auf ihre Thrombopoietin- und Thrombozyten-Spiegel untersucht.
2 Patienten, Material und Methoden
13
2.3 Blutprobengewinnung
Für diese Studie wurden nur routinemäßig angefallene Patientenblutproben
der internistischen Stationen, die vom Zentrallabor des
Knappschaftskrankenhauses Bochum-Langendreer analysiert worden waren,
genutzt. Zusätzliche Blutentnahmen an den Patienten waren nicht
erforderlich. Die Blutentnahmen wurden durch Mitarbeiter der
entsprechenden Stationen mit Vacutainer® der Firma BD Vacutainer
Systems, Plymouth, UK, vorgenommen.
Die 20 gesunden Probanden stellten sich freiwillig zur Blutentnahme
(ebenfalls mittels Vacutainer-System) im Rahmen dieser Studie zur
Verfügung.
2.3.1 Gewinnung von Blutserum1
Zur Herstellung von Serum wurden 5 ml des durch einen
Gerinnungsaktivator gerinnenden Blutes 10 Minuten bei 3500 Umdrehungen
pro Minute bei Raumtemperatur zentrifugiert (Zentrifuge Rotanta 96 RSC,
Hettich). Das entstandene Serum konnte nun abgesert und bei -80º C
eingefroren werden.
Diese Serumproben wurden zur Bestimmung der Thrombopoietin-
Konzentrationen herangezogen.
2.3.2 Blutbild1
Das Blutbild wurde mit dem Gerät Cell-Dyn 4000 der Firma Abbott, welches
nach dem Widerstandsmessprinzip arbeitet, erstellt.
2 Patienten, Material und Methoden
14
2.3.3 Bestimmung von Glutamat-Pyruvat-Dehydrogenase/-
Transaminase (GPT) [entspricht Alanin-Amino-Transferase (ALT)]
und Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) [entspricht
Aspartat-Amino-Transferase (AST)]1
Die oben genannten Transaminasen wurden mit dem Gerät Roche/Hitachi
917 nach dem Prinzip der Photometrie automatisch bestimmt.
2.3.4 Messung von Albumin1
Der Albuminwert wurde mit dem Analyse-Automaten Roche/Hitachi 912
ermittelt.
Das Messprinzip beruht auf der Turbidimetrie (Trübungsmessung): Albumin-
Antikörper (Tina-quant Albumin, Roche) reagieren mit dem Antigen aus
der Probe unter der Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes. Die
Trübung, die vom Gehalt an suspendierten Ag-AK-Konglomeraten abhängig
ist, wird in einem Turbidimeter gemessen und durch den dekadischen
Logarithmus von einfallender zu durchgelassener Lichtintensität definiert.
2.3.5 Messung des Quickwertes (Thromboplastinzeit)1
Der Quickwert wurde mit dem STA-Gerinnungsanalyzer der Firma Roche
(ehemals Boehringer-Mannheim) automatisch bestimmt.
Testprinzip: Die Probe wird mit STA Hepato Quick-Reagenz versetzt und
das Gemisch bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von Calcium-Ionen wird die
Gerinnungskaskade in Gang gesetzt. Gemessen wird die Zeit von der
Zugabe der CaCl2-Lösung bis zum Auftreten eines Fibringerinnsels.
2 Patienten, Material und Methoden
15
2.4 Bestimmung der HCV-RNA1
HCV-RNA wurde aus den Serumproben des untersuchten Patientenkollektivs
mittels QIAamp Viral RNA mini Kit der Firma Qiagen isoliert. Anschließend
erfolgte die Umschreibung von RNA in DNA sowie die Durchführung des
qualitativen Nachweises von HCV-RNA mit einer hauseigenen RT-PCR,
welche durch regelmäßige Ringversuche des RKI validiert wird.
1 Sämtliche verwendeten Geräte und Analyseautomaten zur Erstellung des Blutbildes und Messung
der verschiedenen oben genannten Laborparameter wurden durch das Personal des Zentrallabors des
Knappschaftskrankenhauses Bochum-Langendreer bedient.
2 Patienten, Material und Methoden
16
2.5 Bestimmung von Thrombopoietin
Zur Messung der Thrombopoietin-Konzentration wurde ein gebrauchsfertiges
ELISA-Kit eingesetzt (Quantikine human Tpo, R&D Systems, Minneapolis,
Minnesota, USA).
In diesem Kit waren folgende Reagenzien und Materialien enthalten:
1) 12 Mikrotiterstreifen mit je 8 Vertiefungen, beschichtet mit einem
spezifischen monoklonalen Antikörper gegen Thrombopoietin
2) 1 Fläschchen TPO-Konjugat, 21 ml, enthält monoklonale Thrombopoietin-
Antikörper, gekoppelt an „horseradish peroxidase“, und ein
Konservierungsmittel
3) 3 Fläschchen TPO Standard-Lyophilisate (2ng/Fläschen), enthalten
Thrombopoietin in proteinhaltigem Puffer und Konservierungsmittel
4) Assay-Diluent RD 1-20: 6 ml eines proteinhaltigen Puffers mit einem
Konservierungsmittel (Enthält ein Präzipitat.)
5) Calibrator Diluent RD5R: 21 ml eines proteinhaltigen Puffers mit
Konservierungsmittel, für Zellkulturüberstände geeignet (Die Substanz
wurde in dieser Studie nicht verwendet.)
6) Calibrator Diluent RD6P: 21 ml eines tierischen Serums mit
Konservierungsmittel, für Serum- und Plasmaproben geeignet
7) 21 ml Waschpuffer-Konzentrat, eine 25-fach konzentrierte gepufferte
Lösung mit Konservierungsmittel
8) 12,5 ml Color reagent A, stabilisiertes Hydrogen-Peroxid
9) 12,5 ml Color reagent B, stabilisiertes Chromogen (Tetramethylbenzidin)
10) Stopp-Lösung, 6 ml Schwefelsäure (2 N)
11) Vier selbstklebende Folien zum Abdecken der Mikrotiterplatte
2 Patienten, Material und Methoden
17
2.5.1 Prinzip des Thrombopoietin-ELISA
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) lautet die Bezeichnung für ein
sowohl immunchemisches als auch enzymatisches, sehr sensitives
Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von Substanzen geringer
Konzentration.
Grundlage des Verfahrens ist die Antigen-Antikörper-Reaktion, d.h. die
Bindungsfähigkeit einer zu bestimmenden Substanz (Antigen) an spezifische
Antikörper.
Der hier verwendete Thrombopoietin-ELISA ist ein sog. Sandwich-
Immunoassay zur direkten quantitativen Bestimmung von Thrombopoietin in
humanem Serum, Plasma und in Zellkulturen.
Bei diesem Sandwich-ELISA wurde bereits durch den Hersteller ein für
Thrombopoietin-spezifischer monoklonaler Antikörper auf einer Mikroplatte
(Polystyrol) fixiert. Nach Zugabe von Standard- und Serum-Proben bindet
das vorhandene Thrombopoietin an den immobilisierten Antikörper. Die
ungebundenen Substanzen werden abgewaschen und ein spezifischer
enzymgekoppelter monoklonaler Antiköper wird hinzugegeben, welcher sich
an die gebildeten Immunkomplexe anlagert (sog. Sandwichmethode, s. Abb.
2). Durch den nächsten Waschschritt wird die überschüssige Reagenzlösung
entfernt. Im Anschluss daran werden sämtliche Vertiefungen mit einer
Farblösung beschickt. Dadurch färben sich die Vertiefungen proportional zu
dem im ersten Schritt gebundenen Thrombopoietin.
Danach wird die Reaktion mit der sog. Stopplösung (hier Schwefelsäure)
angehalten und die Farbintensität mit einem Photometer (hier: Labsystems
Multiscan Plus) gemessen und mittels einer Standardreihe in die
entsprechenden Thrombopoietin-Konzentrationen umgerechnet.
2 Patienten, Material und Methoden
18
Antikörper an
die
Mikrotiterplatte
gebunden
Antigen-
haltige Probe
wird dazu
gegeben
Antigen bindet an
feststehenden
Antikörper
Der zweite
Enzym-
gekoppelte
(Horseradish-
Peroxidase) AK
wird zugefügt
Nach Substratzugabe
wird die
Konzentration des
entstandenen
farbigen Produktes
bestimmt
Abbildung 2: Prinzip des Sandwich-ELISA
2 Patienten, Material und Methoden
19
2.5.2 Ablauf des Thrombopoietin-ELISA
Die Beschichtung der für diesen ELISA verwendeten Polystyrol-Platten mit
einem spezifischen monoklonalen Antikörper gegen Thrombopoietin erfolgte
bereits durch den Hersteller.
Im ersten Arbeitsgang wurden die Testreagenzien durch Anpassung an die
Raumtemperatur vorbereitet. Allein die Konjugat-Lösung musste bis zu ihrem
Gebrauch zu einem späteren Zeitpunkt weiterhin bei 2-8°C gelagert werden.
Durch Verdünnung von 20 ml des Wasch-Puffer-Konzentrats mit 480 ml
Aqua dest. entstanden 500 ml Waschpuffer.
Zur Herstellung eines Standards von 2000 pg TPO/ml wurde ein Fläschchen
des gefriergetrockneten TPO-Standard´s in 1 ml Calibrator-Diluent RD6P (für
Serum und Plasma-Proben) gelöst und unter leichtem Schütteln 15 Minuten
vermischt.
Zur Erzeugung der Standard-Verdünnungsreihe wurden jeweils 500 µl der
Calibratorlösung RD6P in sieben Eppendorfgefäße pipettiert. Aus dem zuvor
hergestellten höchsten Standard von 2000 pg TPO/ml wurden 500 µl in das
erste Eppendorfgefäß überführt, dieses gut gemischt und aus diesem
wiederum 500 µl in das nächste gegeben usw., so dass eine
Verdünnungsreihe von 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,2 und 0 pg/ml
(bestehend aus der unverdünnten Calibrator-Lösung RD6P) entstand.
Anschließend wurde jede Vertiefung der Mikrotiterplatte mit 50 µl der Assay
Diluent RD1-20 abgesättigt.
Im nächsten Schritt wurden jeweils 200 µl der Standard- und Serum-Proben
in die Vertiefungen pipettiert.
Dann wurde die Platte für 3 Stunden bei 2-8°C inkubiert.
Das in der Probe vorhandene Thrombopoietin hatte sich während dieser Zeit
an den immobilisierten Antikörper gebunden.
Im Anschluss an die Inkubationszeit wurden die Gruben der Mikrotiterplatte
4 mal für jeweils 30 Sekunden mit 400 µl Waschpuffer gewaschen und nach
dem letzten Waschgang gut ausgeklopft, so dass in den Vertiefungen kein
Waschpuffer mehr zurückbleiben konnte. Durch diesen Vorgang wurden alle
ungebundenen Substanzen entfernt.
2 Patienten, Material und Methoden
20
Die Platten wurden mit 200 µl Thrombopoietin Konjugat, dem für
Thrombopoietin-spezifischen monoklonalen Antikörper, welcher an das
Enzym „horseradish“- Peroxidase gebunden ist, pro Vertiefung versetzt. Es
folgte nochmals eine Inkubationszeit von einer Stunde bei 2-8°C.
Anschließend wurden die Platten erneut 4 mal mit dem Waschpuffer
gewaschen, um jede ungebundene Antikörper-Enzym-Reagenz zu entfernen.
Durch die Mischung der Color Reagenzien A und B, maximal 15 Minuten vor
Gebrauch, entstand eine Farblösung, mit der die Mikrotiterplatte - mit jeweils
200 µl pro Grube - im nächsten Arbeitsgang beschickt wurde. Die Farbe
entwickelte sich direkt proportional zu der Menge des im ersten Schritt
gebundenen Thrombopoietins (Antigen) während der nächsten 30 Minuten
Inkubationszeit im Dunklen bei Raumtemperatur.
Danach wurde die Reaktion mit jeweils 50 µl der Stopplösung
(Schwefelsäure) pro Vertiefung angehalten.
Nun wurde die Farbintensität (optische Dichte) jeder Vertiefung durch
Gebrauch eines Mikroplatten-Lesers (hier: Synelisa, Labsystems Multiscan
Plus) bei 450 nm innerhalb der folgenden 30 Minuten bestimmt.
Die Quantifizierung erfolgte mittels Standardreihen.
Alle Proben wurden in Doppelbestimmung gemessen.
Die Durchführung des ELISAs erfolgte nach Angaben des Herstellers.
2 Patienten, Material und Methoden
21
2.6 Einteilung des Fibrosegrades
Die Bestimmung der entzündlichen Aktivität (Grading) und des
Fibrosegrades (Staging) eines jeden Patienten erfolgte durch eine
Leberbiopsie vor Beginn der Therapie. Die Einteilung in die verschiedenen
Schweregrade nach Metavir wurde durch die Referenz-Pathologie für
Virushepatitis, Prof. H. P. Dienes, Institut für Pathologie der Universität zu
Köln, vorgenommen. Metavir bewertet den Fibrosegrad in einer 5-Punkte-
Skala (F0 = keine Fibrose, F1 = periportal begrenzte Fibrose, F2 = vereinzelt
bindegewebige Septen, F3 = viele bindegewebige Septen, F4 = Leber-
Zirrhose) und den Aktivitätsgrad in einer 4-Punkte-Skala (A0 = keine
Entzündungsaktivität bis zu A3 = starke Aktivität) (Poynard et al., 1997;
Bedossa and Poynard, 1996).
2.7 Bestimmung der Milzgröße
Die Größe der Milz der untersuchten Probanden wurde sonographisch durch
das betreuende Ärzteteam ermittelt. Zur Unterscheidung zwischen normal
großer Milz und Splenomegalie wurde als Grenze ein axialer
Längsdurchmesser größer 12 cm festgelegt.
2 Patienten, Material und Methoden
22
2.8 Statistische Methoden
Die zu Beginn aus den einzelnen Krankenakten erfassten Patientendaten
wurden in einem Erhebungsbogen gesammelt, verschlüsselt und statistisch
ausgewertet.
Die Auswertung der erfassten Daten und der Messergebnisse wurde mit den
Statistikprogrammen SPSS (SPSS für Windows 11.0) und Microsoft Excel
(Excel für Windows 98, Firma Microsoft) durchgeführt.
Die statistische Bearbeitung fand in Zusammenarbeit mit dem Institut für
Medizinische Informatik, Biometrie und Epidemiologie der Ruhr-Universität
Bochum statt.
Angewendet wurden verschiedene biomathematische Methoden:
• Mittelwert (arithmetisches Mittel) x = n
1 ∑
=
n
i
ix
1
= n
xxx n+++ ...21
• Median (Zentralwert) ~
x : wenn n ungerade ⇒ )(2
1+nx =
~
x
wenn n gerade ⇒ 2
)()(2
2
2
++
nnxx
=~
x
n =Anzahl
• Standardabweichung s = ∑=
−−
n
i
ixx
n 1
2)(1
1
• t-Test für zwei verbundene Stichproben bzw. Einstichproben-t-Test:
Der t-Test ist eine auf normalverteilten Grundgesamtheiten basierende
Methode. Mit diesem Test werden Hypothesen über den
Erwartungswert einer Normalverteilung geprüft.
Der Zweistichproben-t-Test für verbundene Stichproben ist
rechnerisch identisch mit dem Einstichproben-t-Test angewandt auf
die Differenzen aus den verbundenen Stichproben.
Mit dem t-Test für verbundene Stichproben wurde geprüft, ob die
Behandlung (IFN+Ribavirin) in Abhängigkeit vom Fibrosegrad die
2 Patienten, Material und Methoden
23
Thrombopoietin-Konzentration bzw. die Thrombozytenzahl während
der Therapie und nach Beendigung der Therapie beeinflusst hat.
Die Null- und Alternativhypothese für die zweiseitige Fragestellung in
der für den t-Test angemessenen Form lautet:
H0: µd = 0
H1: µd ≠ 0 (µd ist der Erwartungswert der Differenzen)
Die Irrtumswahrscheinlichkeit wurde mit α= 0,05 angenommen. Die
Berechnung der Prüfgröße erfolgte nach der folgenden Formel:
ns
dt
d
•=
t = Prüfgröße
d = Mittelwert der Differenz d
sd = Standardabweichung der Differenz d
n = Anzahl der Werte
Getestet wird, ob der Erwartungswert µd mit Null übereinstimmt.
Das Statistikprogramm liefert dazu einen p-Wert. Dieser Wert
quantifiziert die Wahrscheinlichkeit, dass das gefundene Testergebnis
zustande kommt, wenn in Wirklichkeit die Nullhypothese richtig ist.
Wenn p kleiner ist als das festgelegte Signifikanzniveau α, wird die
Alternativhypothese angenommen und das Testergebnis gilt als
signifikant.
• ANOVA-Varianzanalyse:
Die Varianzanalyse ersetzt den t-Test bei mehr als zwei Stichproben.
Auch bei diesem Verfahren werden normalverteilte Daten
vorausgesetzt.
Modell mit Messwiederholung:
In diesem Modell werden alle vorliegenden Messungen und Daten
berücksichtigt. Zudem wird einbezogen, dass es sich um
Messwiederholungen an einzelnen Personen handelt. Innerhalb der
Personen wird eine bestimmte Kovarianzstruktur angenommen,
zwischen den Personen soll Unabhängigkeit herrschen.
3 Ergebnisse
24
3 Ergebnisse
Um den Einfluss der Interferontherapie und des Fibrosegrades auf die
Thrombopoietin - Serumkonzentration und Thrombozytenzahl zu
untersuchen, wurden Blutseren von Patienten mit chronischer Hepatitis C
(n = 45) (Tab. 1) und einer gesunden Kontrollgruppe (n = 20) (Abb. 3-5)
untersucht.
Zur Verlaufsbeurteilung der Thrombopoietin-Konzentration wurden zum
Zeitpunkt vor Therapiebeginn, nach zwei, vier und sechs Monaten unter
Interferon-Ribavirin-Kombinationstherapie und nach Abschluss der Therapie
Bestimmungen vorgenommen.
Tabelle 1: Patienten-Charakteristika (Mittelwerte ±±±± Standardabweichung; [Median])
Alle Keine bis milde
Fibrose
(Fibrosegrad 0)
Mäßige Fibrose
(Fibrosegr. 1/2)
Ausgeprägte
Fibrose
(Fibrosegr. 3/4)
Anzahl (m/f) 45 (32/13) 9 (5/4) 18 (12/6) 18 (15/3)
Alter (Jahren) 43,3± 12,4 [44] 36,8± 13,2 [32] 41,1± 13,2 [40] 48,8 ± 9,1 [49]
Albumin (g/dl) 44,4 ± 5,4
[46,5]
47,5 ± 2,6
[47,9]
44,3 ± 5,9
[46,4]
43,2 ± 5,6
[45,5]
GOT (U/l) 32 ± 21,6 [26] 21 ± 11,2 [18] 28 ± 17,0 [24] 42 ± 25,4 [37]
GPT (U/l) 64 ± 43,6 [48] 55 ± 40,5 [38] 66 ± 48,4 [46] 67 ± 41,9 [54]
Quick (%) 92 ± 0,12 [97] 94 ± 0.06 [93] 98 ± 0,03 [99] 88 ± 0,15 [91]
Leukozyten
(10e3/µl)
6,6 ± 2,35 [6,2] 6,1 ± 2,08 [5,5] 7,0 ± 2,69 [7,2] 6,5 ± 2,17 [5,9]
Thrombozyten
(10e3/µl)
186,8 ± 66,3
[188,5]
212,7 ± 65,7
[192,5]
209,1 ± 58,4
[216,5]
149,4 ± 62,4
[120]
Hämoglobin
(g/dl)
15,0 ± 1,33
[15,1]
14,5 ± 1,23
[14,8]
15,0 ± 1,41
[14,9]
15,2 ± 1,3
[15,2]
Vergrößerung
von Leber und
Milz
11/45 0/9 3/18 8/18
Genotyp
(1/2/3/4)
31/3/10/1 7/0/1/1 11/0/7/0 13/3/2/0
3 Ergebnisse
25
3.1 Thrombopoietin-Konzentration und Thrombozytenzahl der
gesunden Probanden
TPO-Konzentrationen der gesunden Probanden
0
20
40
60
80
100
120
140
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Anzahl der Probanden (1-20)
TP
O-S
eru
mw
ert
e (
pg
/ml)
TPO-Serumwert
Abbildung 3: Thrombopoietin-Konzentrationen der 20 gesunden Probanden, gemessen mit dem ELISA Quantikine® human Tpo, R&D Systems (Absolutwerte dargestellt).
Die Thrombopoietin-Konzentrationen der gesunden Probanden lagen alle
unter 120 pg/ml. Der Median betrug 47 pg/ml und der Mittelwert
51,55 ± 31,78 pg/ml. Aus den Abbildungen ist ersichtlich, dass die
Thrombopoietinwerte der gesunden Probanden mit einem Range von
3-118 pg/ml stark differierten.
3 Ergebnisse
26
Abbildung 4: Thrombopoietin-Konzentrationen der 20 gesunden Probanden, dargestellt als Box-and-Whiskers-Plot.
Die Thrombozytenzahl lag bei allen Probanden im Normalbereich
(150-400.000/µl). Der Mittelwert betrug 270.000 ± 87,98 /µl und der Median
lautete 256.000 Thrombozyten/µl.
Abbildung 5: Thrombozytenzahlen der 20 gesunden Probanden, dargestellt als Box-and-Whiskers-Plot.
20 N =
Thrombopoietinkonzentrationen
der gesunden Probanden
gesunde Probanden
140
120
100
80
60
40
20
0
20 N =
Thrombozytenzahlen
der gesunden Probanden
gesunde Probanden (n=20)
500
400
300
200
100
Thrombozyten (10e3/µl)
Thrombo-poietin (pg/ml)
3 Ergebnisse
27
3.2 Ausgangssituation: Thrombopoietin-Serumkonzentration und
Thrombozytenzahl vor Therapiebeginn unter Beachtung des
Einflusses des Fibrosegrades
In der Analyse der Anfangsdaten zeigte sich ein signifikanter Unterschied der
Thrombozytenzahl in Abhängigkeit vom Fibrosegrad (p=0,0109), wobei nur
die Thrombozytenzahl der Patienten mit fortgeschrittener Leberfibrose
niedriger waren als die Normalwerte (Median von 120.000/µl, Normalwert:
150.000-400.000 Thrombozyten/µl) (Abb. 6). Aus den Berechnungen ergab
sich: Je höher der Fibrosegrad, desto niedriger die Thrombozytenzahl (TZ).
Die Thrombopoietin-Spiegel (TPO) lagen vor Therapiebeginn bei den
Patienten mit geringer Fibrose (Grad 0) bei 140 pg/ml (Median), bei den
Patienten mit mäßiger Fibrose bei 74,5 pg/ml (Median) und bei den Patienten
mit weit fortgeschrittener Fibrose bei 44,5 pg/ml (Median) (Abb. 6). Je stärker
der Grad der Leberfibrose ausgeprägt war, desto weniger TPO konnte im
Serum nachgewiesen werden.
Diese Unterschiede zwischen den Thrombopoietin-Ausgangswerten der
verschiedenen Fibrosegrade erreichten jedoch keine statistische Signifikanz
(p=0,1673). Sämtliche TPO-Werte lagen im Normalbereich (unter 200 pg/ml).
Thrombozyten und Thrombopoietin vor Therapiebeginn
0
50
100
150
200
250
Grad 0 Grad 1+2 Grad 3+4
Fibrosegrade (nach Metavir)
Th
rom
bo
zy
ten
(1
0e
3/µ
l) /
TP
O (
pg
/ml)
TZ
TPO
Abbildung 6: Thrombozytenzahl und TPO-Konzentration der 45 Patienten mit chronischer Hepatitis C zum Zeitpunkt vor Beginn der Therapie (Darstellung der Mediane).
3 Ergebnisse
28
3.3 Kinetik der Thrombopoietin-Spiegel und der Thrombozytenzahl
während und nach der Therapie
Nach zwei Monaten Therapie mit Interferon und Ribavirin blieben die Spiegel
der Thrombozyten normal bei den Patienten mit keiner bis mäßiger Fibrose,
allerdings sanken sie bei den Patienten mit fortgeschrittener Fibrose weiter
ab (Median von 93.000/µl) (Abb. 7).
Nach zwei Monaten Therapiedauer lagen die Thrombopoietinspiegel bei den
Patienten mit milder Fibrose bei 50 pg/ml (Median), bei den Patienten mit
mäßiger Fibrose betrugen die TPO-Werte im Median 77,5 pg/ml und bei den
Patienten mit ausgeprägter Fibrose im Median 91,5 pg/ml (Abb. 7).
Thrombopoietin und Thrombozyten verhielten sich demnach gegensätzlich:
Während die Thrombozytenzahl mit zunehmender Fibroseschwere absank,
stieg die TPO-Konzentration mit zunehmender Fibroseschwere an.
Thrombozyten und Thrombopoietin nach zwei Monaten
Therapie
0
50
100
150
200
250
Grad 0 Grad 1+2 Grad 3+4
Fibrosegrade (nach Metavir)
Th
rom
bo
zy
ten
(1
0e
3/µ
l)
/ T
PO
(p
g/m
l)
TZ
TPO
Abbildung 7: Thrombozytenzahl und TPO-Konzentration der 45 Patienten mit chronischer Hepatitis C nach zwei Monaten Kombinationstherapie (Darstellung der Mediane).
3 Ergebnisse
29
Auch nach weiteren zwei und vier Monaten Therapiedauer und nach
Beendigung der Therapie blieb die Thrombozytenzahl bei den Patienten mit
keiner bis mäßiger Fibrose normal (Median von ~200.000/µl); die
Thrombozytenzahl bei den Patienten mit fortgeschrittener Fibrose blieb
konstant zu niedrig (Median von ~100.000/µl) (Abb. 8-10).
Vier und sechs Monate nach Therapiebeginn blieben die medianen TPO-
Spiegel bei allen drei Fibrosegraden ungefähr gleich zwischen 85 bis
100 pg/ml (Abb. 8, 9).
Nach Beendigung der antiviralen Therapie betrug die
Thrombopoietinkonzentration der Patienten mit milder Fibrose (Grad 0 nach
Metavir) 48 pg/ml, der Patienten mit mäßig ausgeprägter Fibrose 97 pg/ml
und derjenigen mit schwerer Fibrose 150 pg/ml im Median (Abb.10). Hier
zeigte sich ebenfalls: Je schwerer die Leberschädigung fortgeschritten war,
desto höher war auch der Thrombopoietinspiegel.
Thrombozyten und Thrombopoietin nach vier Monaten
Therapie
0
50
100
150
200
Grad 0 Grad 1+2 Grad 3+4
Fibrosegrade (nach Metavir)
Th
rom
bo
zy
ten
(1
0e
3/µ
l) /
TP
O (
pg
/ml)
TZ
TPO
Abbildung 8: Thrombozytenzahl und TPO-Konzentration der 45 Patienten mit chronischer Hepatitis C nach vier Monaten Kombinationstherapie (Darstellung der Mediane).
3 Ergebnisse
30
Thrombozyten und Thrombopoietin nach sechs
Monaten Therapie
0
50
100
150
200
250
Grad 0 Grad 1+2 Grad 3+4
Fibrosegrade (nach Metavir)
Th
rom
bo
zy
ten
(1
0e
3/µ
l)
/ T
PO
(p
g/m
l)
TZ
TPO
Abbildung 9: Thrombozytenzahl und TPO-Konzentration der 45 Patienten mit chronischer Hepatitis C nach sechs Monaten Kombinationstherapie (Darstellung der Mediane).
Thrombozyten und Thrombopoietin nach der Therapie
(zwei- max. sechs Monate nach Therapieende)
0
50
100
150
200
250
Grad 0 Grad 1+2 Grad 3+4
Fibrosegrade (nach Metavir)
Th
rom
bo
zy
ten
(1
0e
3/µ
l)
/ T
PO
(p
g/m
l)
TZ
TPO
Abbildung 10: Thrombozytenzahl und TPO-Konzentration der 45 Patienten mit chronischer Hepatitis C nach der Kombinationstherapie (Darstellung der Mediane) (Nachbeobachtungszeitraum: zwei bis max. sechs Monate nach Therapiebeendigung).
3 Ergebnisse
31
3.4 Kinetik der Thrombopoietinkonzentration und Thrombozytenzahl
in Abhängigkeit vom Fibrosegrad
Bei Patienten mit nicht vorhandener bis sehr leichter Fibrose (Grad 0 nach
Metavir) (Abb. 11) blieb die Thrombozytenzahl über die Zeit konstant
(Median: 175-210.000/µl; Mittelwert: 190-215.000 ± 60.000/µl).
Die Thrombopoietinkonzentration lag ohne Therapie im hoch-normalen
Bereich (Median: 140 pg/ml), fiel im zweiten Monat nach Therapiebeginn auf
50 pg/ml (Median) ab, stieg im vierten und im sechsten Monat auf ~ 85 pg/ml
(Median) und sank anschließend wieder auf 50 pg/ml (Median).
Thrombozyten und Thrombopoietin bei Patienten ohne
Fibrose (Fibrosegrad 0 nach Metavir)
0
50
100
150
200
250
vorTherapie
2 Mon.Ther.
4 Mon.Ther.
6 Mon.Ther.
nachTherapie
Therapiezeitraum (Monate)
Th
rom
bo
zyte
n (
10e3/µ
l) /
TP
O (
pg
/ml)
TZ
TPO
Abbildung 11: Darstellung der Thrombozytenzahl und Thrombopoietinkonzentration (Mediane) vor, während und nach der antiviralen Kombinationstherapie bei Patienten mit chronischer Hepatitis C und ohne bzw. mit sehr leichter Fibrose (Fibrosegrad 0 nach Metavir).
3 Ergebnisse
32
Die Patienten mit chronischer Hepatitis C und mittelschwerer Fibrose (Grad
1+2 nach Metavir) (Abb. 12) zeigten während und nach der
Kombinationstherapie stabile Thrombozytenzahlen zwischen 190.000 und
220.000 Thrombozyten/µl im Median, lediglich nach vier Monaten Therapie
ergab sich eine geringere Thrombozytenzahl von 170.000/µl im Median.
Die Thrombopoietin-Spiegel verhielten sich tendenziell leicht ansteigend: Sie
nahmen von 75 pg/ml (Median) vor Therapiebeginn auf 100 pg/ml (Median)
nach Therapieabschluss zu.
Thrombozyten und Thrombopoietin bei Patienten mit
mäßiger Fibrose (Fibrosegrade 1+2 nach Metavir)
0
50
100
150
200
250
vorTherapie
2 Mon.Ther.
4 Mon.Ther.
6 Mon.Ther.
nachTherapie
Therapiezeitraum (Monate)
Tro
mb
ozyte
n (
10e3/µ
l) /
TP
O (
pg
/ml)
TZ
TPO
Abbildung 12: Darstellung der Thrombozytenzahl und Thrombopoietinkonzentration (Mediane) vor, während und nach der antiviralen Kombinationstherapie bei Patienten mit chronischer Hepatitis C und mittelschwerer Fibrose (Fibrosegrad 1+2 nach Metavir).
3 Ergebnisse
33
Die Patienten mit chronischer Hepatitis C und stark ausgeprägter
Leberfibrose (Grad 3+4 nach Metavir) (Abb. 13) wiesen eine ohnehin sehr
niedrige Thrombozytenzahl auf, sie schwankte zwischen 90.000 und 110.000
Thrombozyten/µl. Lediglich vor der Interferon-Ribavirin-Therapie und danach
kam es zu einer leichten Erholung der Thrombozytenzahl auf Werte von
120.000/µl und 150.000/µl.
Thrombopoietin startete in dieser Patientengruppe mit einem niedrig-
normalen Spiegel von 40 pg/ml, erreichte während der Therapie einen
Spiegel um 100 pg/ml, um dann nach der Therapie auf einen Spiegel von
150 pg/ml anzusteigen. (Hier sind jeweils die Mediane angegeben.)
Thrombozyten und Thrombopoietin bei Patienten mit
ausgeprägter Fibrose (Fibrosegrade 3+4 nach Metavir)
020406080
100120140160
vorTherapie
2 Mon.Ther.
4 Mon.Ther.
6 Mon.Ther.
nachTherapie
Therapiezeitraum (Monate)
Th
rom
bo
zyte
n (
10e3/µ
l) /
TP
O (
pg
/ml)
TZ
TPO
Abbildung 13: Darstellung der Thrombozytenzahl und Thrombopoietinkonzentration (Mediane) vor, während und nach der antiviralen Kombinationstherapie bei Patienten mit chronischer Hepatitis C und ausgeprägter Fibrose (Fibrosegrad 3+4 nach Metavir).
3 Ergebnisse
34
3.5 Varianzanalyse: Modell mit Messwiederholung
3.5.1 Thrombopoietinkonzentration
Bei Betrachtung der Thrombopoietinkonzentration nach dem Modell mit
Messwiederholung (in der Varianzanalyse ANOVA) ergab sich zwischen den
einzelnen Messzeitpunkten (vor der Therapie, zwei, vier, sechs, acht, zwölf,
sechzehn und dreiundzwanzig Monate nach Therapiebeginn) kein Hinweis
auf einen signifikanten Unterschied (p=0,2496).
Der Fibrosegrad übte einen signifikanten Einfluss auf die
Thrombopoietinkonzentration aus (p=0,0265). Dieser Effekt war allerdings
nur im Vergleich von Fibrosegrad 1 mit Fibrosegrad 0 signifikant (p=0,0395)
und könnte aufgrund der geringen Stichprobenzahl zufällig entstanden sein,
da bei den anderen Fibrosegraden kein signifikanter Unterschied (p > 0,05)
festgestellt wurde.
Des Weiteren gibt es keinen Hinweis auf eine Wechselwirkung zwischen
Fibrosegrad und Zeit auf die Thrombopoietinkonzentration (p=0,7274).
3.5.2 Thrombozytenzahl
Es zeigte sich ein statistisch signifikanter Einfluss sowohl der Zeit (p=0,0101)
als auch des Fibrosegrades (p=0,0001) auf die Thrombozytenzahl.
Von Fibrosegrad Null bis hin zum Fibrosegrad Vier zeigte sich eine statistisch
signifikante Reduktion der Thrombozytenzahl von 189.000/µl (Mittel: 210.000
± 62.470/µl) auf 112.000/µl (Mittel: 122.000 ± 49.190/µl) im Median.
Die Thrombozytenzahl reagierte in Abhängigkeit von der Therapiezeit mit
einem wellenförmigen Verlauf: Zunächst fiel sie während der Therapie stark
ab (von 200.000/µl auf 170.000/µl), nach Beendigung der Therapie (d.h.
spätestens 12 Monate nach Therapiebeginn) stieg sie wieder auf einen
Median von 191.000/µl an.
Auch bei der Thrombozytenzahl ergab sich ebenso wie bei dem
Thrombopoietinspiegel kein Hinweis auf einen signifikanten
Wechselwirkungseffekt (p=0,4860) zwischen Messzeitpunkt und Fibrosegrad
auf die Thrombozytenzahl, daraus folgte, dass der Fibrosegrad den zeitlichen
Verlauf nicht beeinflusst hat.
3 Ergebnisse
35
3.6 Einstichproben-t-Test angewandt auf die Differenzen der
verbundenen Stichproben
3.6.1 Auswertung der Ergebnisse der Thrombopoietin-
Serumkonzentration in Abhängigkeit vom Fibrosegrad und von
der Zeit
Die Berechnungen für die Thrombopoietinkonzentration, gemessen mit Hilfe
eines ELISAs zu den Zeitpunkten zwei, vier und sechs Monate nach
Therapiebeginn sowie nach Therapieabschluss, ergaben weder in der
Patientengruppe mit leichter Fibrose (Grad 0 nach Metavir) noch in der mit
mäßiger Fibrose (Grad 1+2) signifikante Veränderungen während dieser Zeit
(Fibrosegrad 0: p2Mon=0,637, n=3, p4Mon=0,979, n=6, p6Mon=0,778, n=5 bzw.
bei Fibrosegrad 1+2: p2Mon=0,215, n=11, p4Mon=0,253, n=11, p6Mon=0,165, n=
12, pnachTher.=0,281, n=5).
Daraus folgte, dass sich die Thrombopoietinkonzentration in diesen
einzelnen Gruppen über die Therapiedauer nicht veränderte.
In der Patientengruppe mit stark ausgeprägter Fibrose (Grad 3+4) konnte
eine signifikant erhöhte TPO-Konzentration für die Zeitpunkte zwei Monate
nach Therapiebeginn (p2Mon=0,006, n=13), sechs Monate nach
Therapiebeginn (p6Mon=0,045, n=8) und acht Monate nach Therapiebeginn
(pnachTher.=0,016, n=5) im Vergleich zum Zeitpunkt vor der Therapie
festgestellt werden.
3.6.2 Auswertung der Ergebnisse der Thrombozytenzahl in
Abhängigkeit vom Fibrosegrad und von der Zeit
Die statistische Auswertung bei den Patienten mit leichter Leberschädigung
(Fibrosegrad 0 nach Metavir) ergab zu allen untersuchten Zeitpunkten keine
signifikante Veränderung der Thrombozytenkonzentration (p2Mon.=0,409, n=6,
p4Mon.=0,116, n=9, p6Mon.=0,784, n=8, p8Mon.=0,094, n=6, p12Mon.=0,499, n=5).
Im Gegensatz dazu, zeigten sich bei den von Leberfibrose stärker
betroffenen Patientengruppen (Fibrosegrade 1-4 nach Metavir) bis
einschließlich sechs Monate nach Therapiebeginn signifikante
3 Ergebnisse
36
Veränderungen der Thrombozytenkonzentration über die Zeit (Fibrosegrad
1+2: p2Mon.=0,016, n= 17, p4Mon.=0,000, n=17, p6Mon.=0,002, n=16;
Fibrosegrad 3+4: p2Mon.=0,001, n=15, p4Mon.=0,000, n= 16, p6Mon.=0,011, n=
17).
Danach konnte keine signifikante Veränderung mehr verzeichnet werden,
weder bei den Zeitpunkten acht Monate nach Therapiebeginn (Grad 1+2:
p8Mon= 0,091, n=11; Grad 3+4: p8Mon=0,158, n=10) noch zwölf Monate nach
Therapiebeginn (Grad 1+2: p12Mon=0,186, n=5; Grad 3+4: p12Mon=0,712, n=3).
Der Zeitpunkt zwölf Monate nach Therapiebeginn war aufgrund des geringen
Stichprobenumfangs nicht mehr als präzise anzusehen.
Spätestens nach zwölf Monaten gab es keine statistisch signifikante
Veränderung mehr.
3 Ergebnisse
37
3.7 Auswirkung der Interferon-Therapie auf weitere Parameter des
Blutbildes
3.7.1 Kinetik der Leukozyten
Leukozytenspiegel in Abhängigkeit von der
Schwere der Leberfibrose
0
1
2
3
4
5
6
7
8
vor Therapie 2 Monate 4 Monate 6 Monate nach Therapie
Therapiezeitraum (Monate)
Leu
ko
zyte
n (
10e3/µ
l)
Fibrosegrad 0
Fibrosegrad 1+2
Fibrosegrad 3+4
Abbildung 14: Leukozytenwerte der Patienten mit chronischer Hepatitis C während des Beobachtungszeitraumes (vor, während und nach Interferon-Ribavirin-Therapie) in Abhängigkeit von dem bestehenden Fibrosegrad (Darstellung der Mediane).
Die Mediane der Leukozytenspiegel zum Zeitpunkt vor der Therapie zeigten
bei allen Fibrosegraden normale Werte (Median: 6.200/µl, Mittelwert: 6.600 ±
2350/µl). Nach zwei und vier Monaten Therapie fielen alle Leukozytenspiegel
unter die Normalwerte unabhängig vom Fibrosegrad (Median gesamt: 4.000/µl,
Mittelwert: 4100 ± 1600/µl). Der stärkste Rückgang der Leukozytenzahlen
fand allerdings bei den Patienten mit Fibrosegrad 3+4 statt (Median2Monate:
3200/µl, Median4Monate: 3350/µl). Nach sechs Monaten Therapie kam es
wieder zu einem leichten Anstieg der Leukozytenwerte (Mediangesamt:
4200/µl, Mittelwertgesamt:4400 ± 1900/µl). Nach Beendigung der Interferon-
Ribavirin-Kombinationstherapie (Nachbeobachtungszeitraum: zwei bis
maximal sechs Monate nach Therapieende) hatten sich die
Leukozytenzahlen der Patienten mit Fibrosegrad 3+4 (Median: 5200/µl) und
1+2 (Median: 6500/µl) wieder vollständig erholt, während die
Leukozytenwerte der Patienten mit geringer bis nicht vorhandener Fibrose
3 Ergebnisse
38
(Grad 0) weiterhin geringfügig unterhalb des Normalspiegels lagen (Median:
4500/µl) (Abb. 14).
3 Ergebnisse
39
3.7.2 Kinetik des Hämoglobin-Wertes
Hämoglobin in Abhängigkeit von der
Schwere der Leberfibrose
0
2
4
6
8
10
12
14
16
vor Therapie 2 Monate 4 Monate 6 Monate nach Therapie
Therapiezeitraum (Monate)
Häm
og
lob
in (
g/d
l)
Fibrosegrad 0
Fibrosegrad 1+2
Fibrosegrad 3+4
Abbildung 15: Hämoglobinwerte der Patienten mit chronischer Hepatitis C während des Beobachtungszeitraumes (vor, während und nach Interferon-Ribavirin-Therapie) in Abhängigkeit von dem bestehenden Fibrosegrad (Darstellung der Mediane).
Die Mediane der Hämoglobinwerte waren vor Therapiebeginn unabhängig
vom Schweregrad der Leberschädigung normal (Mediangesamt: 15,1g/dl).
Nach zwei Monaten Kombinations-Therapie war eine Abnahme der
Hämoglobinwerte zu verzeichnen. Die stärkste Verminderung betraf den
Fibrosegrad 0 mit Werten geringfügig unter dem Normalbereich (Median:
11,7g/dl; Mittelwert: 11,8 ± 0,96 g/dl). Dieser Trend blieb während der
restlichen Therapiedauer bestehen. Erst nach Therapieabschluss erholten
sich die Hämoglobinwerte aller Patienten unabhängig vom Grad der
Leberschädigung. Dabei erreichten die Hämoglobinwerte der
Patientengruppe mit schwerer Fibrose (Grad 3+4) ihre Ausgangswerte
vollständig (Medianvorher: 15,1g/dl, Mediandanach: 15,1g/dl; Mittelwertvorher:
15,2 ± 1,3 g/dl, Mittelwertdanach: 14,9 ± 1,6 g/dl). Die Hämoglobin-Werte der
Patientengruppe mit milder Fibrose (Grad 0) blieben stark (Medianvorher:
14,8g/dl, Median danach:12,5g/dl) und die Hb-Werte der Patienten mit
mittelschwerer Fibrose (Grad 1+2) mäßig (Medianvorher: 14,95 g/dl, Median
danach: 13,8 g/dl) unter ihren Ausgangswerten (Abb. 15).
3 Ergebnisse
40
3.7.3 Kinetik von GOT und GPT
GPT in Abhängigkeit von der Schwere der Leberfibrose
0
10
20
30
40
50
60
vor Therapie 2 Monate 4 Monate 6 Monate nach Therapie
Therapiezeitraum (Monate)
GP
T (
U/l)
Fibrosegrad 0
Fibrosegrad 1+2
Fibrosegrad 3+4
Abbildung 16: Transaminasen (hier beispielhaft dargestellt für GPT) der Patienten mit chronischer Hepatitis C während des Beobachtungszeitraums (vor, während und nach Interferon-Ribavirin-Therapie) in Abhängigkeit von dem bestehenden Fibrosegrad (Darstellung der Mediane).
Die Höhe der Transaminasen-Ausgangswerte (Abb. 16) differierte in
Abhängigkeit von dem Schweregrad der Fibrose: Die am stärksten erhöhten
Transaminasen wiesen die Patienten mit stark ausgeprägter Fibrose
(Fibrosegrad 3+4) (Median: GOT 37 U/l, GPT 54 U/l) auf; mäßig erhöhte
Werte (Median: GOT 23,5 U/l, GPT 46 U/l) zeigten die Patienten mit
mittelgradigem Leberschaden (Fibrosegrad 1+2) und gering erhöhte
Transaminasen (Median: GOT 18 U/l; GPT 38 U/l) kennzeichneten die
Patienten ohne Fibrose bzw. mit nur milder Fibroseausprägung
(Fibrosegrad 0). Dieser Trend blieb über den gesamten
Beobachtungszeitraum erhalten. Allerdings nahmen die Absolut-Werte
therapiebedingt während des Beobachtungszeitraumes stark ab, so dass
nach Therapieabschluss (maximal 3 Monate nach Therapiebeendigung) die
Transaminasen aller Fibrosegrade im Normalbereich lagen
(Mediannach Therapie: GOT: Grad 0: 8,5 U/l, Grad 1+2: 11 U/l Grad 3+4: 15 U/l;
GPT: Grad 0: 7,5 U/l, Grad 1+2: 15 U/l; Grad 3+4: 30 U/l) (Abb. 16).
3 Ergebnisse
41
Responder GPT-Mediane
0
10
20
30
40
50
60
70
Grad 0 Grad 1+2 Grad 3+4
Fibrosegrade
U/lvor Therapie
nach Therapie
Abbildung 17: Therapie-Responder (55% des Patientenkollektivs) und die Höhe ihrer Transaminasen (hier beispielhaft dargestellt für GPT) vor und nach der Therapie in Abhängigkeit von ihrem Fibrosegrad (Darstellung der Mediane).
Die Patienten mit chronischer Hepatitis C, die auf die antivirale Interferon-
Ribavirin-Kombinationstherapie angesprochen hatten (Responder, 55% der
untersuchten Patienten) (Abb. 17), reagierten, unabhängig von ihrem
Fibrosegrad, mit einem Rückgang der Transaminasen in den Normalbereich.
3 Ergebnisse
42
Non-Responder GPT-Mediane
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Grad 0 Grad 1+2 Grad 3+4
Fibrosegrade
U/lvor Therapie
nach Therapie
Abbildung 18: Therapie-Non-Responder (45% des Patientenkollektivs) und die Höhe ihrer Transaminasen (hier beispielhaft dargestellt für GPT) vor und nach der Therapie in Abhängigkeit von ihrem Fibrosegrad (Darstellung der Mediane).
Die Patienten mit chronischer Hepatitis C, die auf die antivirale Interferon-
Ribavirin-Kombinationstherapie nicht ansprachen (Non-Responder, 45 % der
untersuchten Patienten) (Abb. 18), zeigten ein unterschiedliches Verhalten
ihrer Transaminasenspiegel in Abhängigkeit von der Schwere ihres
Leberschadens. Patienten ohne/mit milder Fibrose (Fibrosegrad 0) wiesen
nach Beendigung der antiviralen Therapie einen Rückgang in der Höhe ihrer
Transaminasen-Konzentration auf. Die Patienten mit chronischer Hepatitis C
und einem höhergradigen Leberschaden zeigten eine höhere
Transaminasen-Konzentration als vor dem Therapiebeginn (Fibrosegrad
1+2: 1,2-fach höhere Transaminasen, Fibrosegrad 3+4: 1,4-fach höhere
Transaminasen).
3 Ergebnisse
43
3.7.4 Kinetik von Albumin
Albumin in Abhängigkeit von der
Schwere der Leberfibrose
38
40
42
4446
48
50
52
vorTherapie
2 Monate 4 Monate 6 Monate
Albumin (g/l)
Ze
it (
Mo
na
te)
Fibrosegrad 0
Fibrosegrad 1+2
Fibrosegrad 3+4
Abbildung 19: Albuminwerte der Patienten mit chronischer Hepatitis C während des Beobachtungszeitraumes (vor, während und nach Interferon-Ribavirin-Therapie) in Abhängigkeit von dem bestehenden Fibrosegrad (Darstellung der Mediane).
Die Albuminwerte lagen zu allen Zeitpunkten und bei allen Fibrosestadien im
Normalbereich (35-52 g/l) (Abb. 19). Zum Zeitpunkt vor Therapiebeginn
bestand eine deutliche Staffelung der Albuminwerte, abnehmend von
Fibrosegrad 0 (Median von 47,8 g/l) bis zum Fibrosegrad 3+4 (schwerste
Leberfibrose) (Median: 45,5 g/l). Nach zwei Monaten Therapie mit Interferon
und Ribavirin war die Albuminkonzentration insgesamt zurückgegangen, sie
befand sich noch im Normalbereich, war aber nicht mehr eindeutig nach dem
Fibrosegrad gestaffelt. Nach vier Monaten Therapie war der Albuminwert der
Patienten mit leichter Fibrose stark angestiegen (Median: 50,6 g/l), während
die Albuminkonzentration der Patienten mit mäßiger (Grad 1+2) (Median:
44,8 g/l) und schwerer Fibrose (Grad 3+4) (Median: 44,4 g/l) annähernd
konstant blieb. Nach sechs Monaten war der Albuminwert der Fibrosegrade
1+2 (Median: 42,4 g/l) und des Grades 0 (Median: 47,3 g/l) noch etwas
gesunken, während die Konzentration der Grade 3+4 stabil blieb (Median:
43,9 g/l).
3 Ergebnisse
44
3.7.5 Kinetik des Quickwertes
Quickwert in Abhängigkeit von der
Schwere der Leberfibrose
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
vor Therapie 2 Monate 4 Monate 6 Monate nach Therapie
Therapiezeit (Monate)
Qu
ickw
ert
(%
)
Fibrosegrad 0
Fibrosegrad 1+2
Fibrosegrad 3+4
Abbildung 20: Quickwerte der Patienten mit chronischer Hepatitis C während des Beobachtungszeitraumes (vor, während und nach der Interferon-Ribavirin-Therapie) in Abhängigkeit von dem bestehenden Fibrosegrad (Darstellung der Mediane).
Die Mediane der Quickwerte aller Fibrosegrade blieben während des
gesamten Therapiezeitraums relativ konstant im Normalbereich (Abb. 20).
Alle starteten bei Werten um 90%-95%. Die Quickwerte der Patienten mit
den Fibrosegraden 0 und 3+4 sanken während der Therapie auf einen
Median-Quickwert von ca. 75%. Die Patienten mit chronischer Hepatitis C
und dem Fibrosegrad 1+2 wiesen (im Median) einen gleichbleibend hohen
Quick-Wert auf. Nach Beendigung der Interferon-Ribavirin-
Kombinationstherapie stiegen die Quickwerte sämtlicher Fibrosegrade
wieder an und erreichten ihre Ausgangswerte.
3 Ergebnisse
45
3.7.6 Einfluss der Milzgröße
Anteil der Splenomegalie in den verschiedenen Fibroseschweregraden
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Fibrosegrad 0 Fibrosegrad 1+2 Fibrosegrad 3+4
Fibrosegrade (nach Metavir)
An
zah
l d
er
betr
off
en
en
Pati
en
ten
Splenomegalie
normale Milzgröße
Abbildung 21: Größe der Milz der 45 Patienten mit chronischer Hepatitis C in Abhängigkeit von dem bestehenden Fibrosegrad.
Auf dieser Graphik (Abb. 21) zeigt sich ein Zusammenhang zwischen dem
Schweregrad der Fibrose und der Milzgröße. Bei den Patienten mit
chronischer Hepatitis C und ohne Fibrose (Fibrosegrad 0) wies kein Patient
eine Vergrößerung der Milz auf. Bei den Patienten mit mäßiger Fibrose
(Fibrosegrad 1+2) wurde ein Anteil von 17 % mit vergrößerter Milz
festgestellt, und bei den Patienten mit stark ausgeprägter Fibrose
(Fibrosegrad 3+4) hatten 42 % eine Splenomegalie.
3 Ergebnisse
46
Thrombozyten-Verteilung (Mediane) in Abhängigkeit von
vorliegender Splenomegalie
0
50
100
150
200
250
Fibrosegrad 1+2 Fibrosegrad 3+4 gesamt
Fibrosegrade (1-4 nach Metavir)
Th
rom
bo
zyte
n (
10e3/µ
l) (
Med
ian
e)
Patienten mit Splenomegalie
Patienten mit normaler Milzgröße
Abbildung 22: Verteilung der Thrombozytenzahl (Mediane) der Patienten mit mäßiger und schwerer Fibrose in Abhängigkeit von der Milzgröße (Patienten ohne Fibrose wurden hier nicht aufgeführt, weil sie keine Splenomegalie aufwiesen).
Der Einfluss der Milzgröße auf die Höhe der Thrombozytenzahl stellt sich in
Abbildung 22 dar: Bei vergrößerter Milz war die Thrombozytenzahl im
Vergleich zu Patienten mit chronischer Hepatitis C und normaler Milzgröße
stark erniedrigt. Milzgröße und Thrombozytenzahl verhielten sich umgekehrt
proportional zueinander. In dieser Studie wurde festgestellt, dass bei
Patienten ohne Milzvergrößerung der Grad der Leberschädigung die Höhe
der Thrombozytenzahl beeinflusst.
4 Diskussion
47
4 Diskussion
Nach Angaben der WHO sind ca. 170 Millionen Menschen (3% der
Weltbevölkerung) mit dem Hepatitis-C-Virus infiziert und laufen damit
potentiell Gefahr, an einer Leberzirrhose und/oder einem Leberzellkarzinom
zu erkranken.
Da davon ausgegangen werden muss, dass eine große Zahl infizierter
Personen bisher nicht untersucht wurde, jedoch im Laufe der nächsten 10
Jahre mehr Infektionen durch verbesserte Screening-Strategien
diagnostiziert werden, muss mit einer deutlichen Zunahme der Zahl
chronisch HCV-infizierter Patienten bis 2015 gerechnet werden.
Eine typische Komplikation der fortschreitenden Leberfibrose stellt die
Thrombozytopenie dar. Interferon alpha, in der Therapie der chronischen
Hepatitis C etabliert, kann eine Thrombozytopenie auslösen oder verstärken
und somit therapielimitierend sein. Ursächlich werden hierbei ein vermehrter
Abbau und eine verminderte Synthese von Thrombozyten diskutiert.
Thrombopoietin (TPO), der 1994 identifizierte Thrombozyten-
wachstumsfaktor, nimmt eine zentrale Stellung im Gleichgewicht des
Thrombozytenhaushaltes ein (De Sauvage et al., 1994; Lok et al., 1994;
Bartley et al., 1994; Sohma et al., 1994; Kuter et al., 1994).
In der vorliegenden Arbeit wurden die Zusammenhänge zwischen
Fibrosegrad und TPO-Serumkonzentration, sowie der Einfluss der antiviralen
Therapie mit Interferon und Ribavirin untersucht.
4 Diskussion
48
4.1 Fibrosegrad, Thrombozytenzahl und Thrombopoietin
Bei den Patienten mit chronischer Hepatitis C, jedoch ohne Leberfibrose
(Fibrosestadium 0 nach Metavir), wurden vor Beginn der Therapie normale
Thrombozytenzahlen gemessen (Referenzbereich: 150-400.000
Thrombozyten/µl).
Patienten mit einer mäßig ausgeprägten Leberfibrose (Fibrosegrad 1+2)
wiesen ebenfalls eine normale Thrombozytenzahl (TZ) auf.
Im Gegensatz dazu wurden bei Patienten mit fortgeschrittener Fibrose
(Fibrosegrad 3+4) erniedrigte Thrombozytenzahlen gemessen. Hier zeigte
sich deutlich die Abhängigkeit der Thrombozytenzahl vom Fibrosegrad.
Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit Untersuchungen von Adinolfi und
Giannini, die ebenfalls eine abfallende Thrombozytenzahl mit steigendem
Fibrosegrad beobachteten (Adinolfi et al., 2001; Giannini et al., 2002).
In der vorliegenden Arbeit fanden sich bei gesunden Probanden mit normaler
Thrombozytenzahl TPO-Serumspiegel von im Mittel 51,6 ± 31,8 pg/ml
(Median: 47 pg/ml); dabei war die Streuung mit einem Range von
3-118 pg/ml außerordentlich breit. Übereinstimmend mit den Mittelwerten des
in dieser Studie verwendeten Probandenkollektivs fanden Hou sowie
Stockelberg „Normalwerte“ für TPO von 52 ± 12 pg/ml resp. 50 ± 14 pg/ml
(Hou et al., 1998; Stockelberg et al., 1999).
In mehreren vorangegangenen Studien (Jelkmann, 2001; Emmons et al.,
1996; Chang et al., 1996; Tahara et al., 1996) wurde ein normaler TPO-
Spiegel unter 200 pg/ml postuliert. In unserer Studie lagen ebenfalls
sämtliche TPO-Serumspiegel der gesunden Probanden unter 200 pg/ml. In
dieser Studie konnte somit eine weitere Bestätigung für den diskutierten
Normalbereich der anderen Studien gefunden werden.
Sämtliche TPO-Konzentrationen der hier untersuchten Hepatitis C-Patienten
lagen vor Beginn der Therapie im erwarteten Normalbereich unter 200 pg/ml.
Allerdings waren dabei die Thrombopoietinspiegel der Patienten mit
fortgeschrittener Fibrose 67 % niedriger als bei den Patienten ohne bzw. mit
milder Fibrose.
4 Diskussion
49
Diese Ergebnisse weisen auf eine Korrelationskette zwischen
Fibrosestadium, TPO-Serumkonzentration und Thrombozytenzahl hin:
Patienten ohne bzw. mit milder Fibrose (Grad 0, 1+2 nach Metavir) haben
normale Thrombopoietin-Konzentrationen und normale Thrombozyten-
zahlen, während Patienten mit ausgeprägter Fibrose (Grad 3+4) stark
erniedrigte (aber noch im Normalbereich liegende) TPO-Spiegel und niedrige
Thrombozytenzahlen aufweisen. TPO und Thrombozyten sind bei diesem
Schädigungsgrad der Leber also gleichsinnig verändert. Übereinstimmend
mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit fanden auch Adinolfi
sowie Giannini bei Patienten mit schwerer Fibrose und niedrigen
Thrombozytenzahlen erniedrigte TPO-Spiegel (Adinolfi et al., 2001; Giannini
et al., 2002).
Diese gleichsinnige Veränderung von Thrombozyten-Zahl und TPO-
Serumspiegel widerspricht zunächst der von Geddis, Broudy und Fielder
(Geddis et al., 2002; Broudy et al., 1997; Fielder et al., 1996) postulierten
Theorie des autoregulatorischen Regelkreises der Thrombopoese mit
umgekehrt proportionalen Verhältnis von Thrombozyten und Thrombopoietin,
erklärt durch die Bindung von TPO an die Thrombozyten (s. Abb. 1).
Das heißt, der erwartete Anstieg der TPO-Serumspiegel als Antwort auf eine
fallende Thrombozytenzahl blieb bei diesen Patienten mit Hepatitis C
assoziierter fortgeschrittener Fibrose aus.
Zur Erklärung dieser Befunde stellten wir folgende Überlegungen an:
1. Aufgrund der fortgeschrittenen Leberschädigung wird die intrahepatische
TPO-Expression im Sinne einer Lebersynthesestörung eingeschränkt, die
TPO-Serumspiegel sinken und verursachen daraufhin niedrige
Thrombozytenzahlen.
2. Die vermehrte Sequestration von Thrombozyten in einer vergrösserten
Milz geht obligat mit einem vermehrten Abbau von gebundenem TPO
einher.
4 Diskussion
50
zu 1.
Zum Zeitpunkt vor Beginn der antiviralen Therapie zeigte sich bei der
Prüfung der Syntheseparameter Albumin und Quick: Eine fortgeschrittene
Leberschädigung geht mit abfallenden Syntheseparametern, d.h. mit einer
nachlassenden Leberproduktionsfähigkeit, einher.
Giannini et al. entdeckten 2002, dass niedrige TPO-Spiegel mit einer
Verschlechterung der Leberfunktion (gemessen mit dem [(13)C]-Aminopyrin-
Atem-Test) assoziiert sind. Die von ihnen 2003 durchgeführten
Untersuchungen und die Studien von Vyzantiadis, Espanol, Okubo und
Shimodaira (Giannini et al., 2003; Vyzantiadis et al., 2002; Espanol et al.,
2000; Okubo et al., 2000; Shimodaira et al., 1996) bestätigten: Die
niedrigeren TPO-Spiegel bei fortgeschrittener Leberschädigung entstehen
durch die weniger vorhandene funktionsfähige Lebermasse.
Aus diesen und unseren Ergebnissen folgt: Erniedrigte TPO-Serumspiegel
sind mit einem funktionellem Unvermögen der Leber und mit dem
Schädigungsgrad der Leberfibrose korreliert. Daraus folgt: Thrombopoietin
könnte einen frühen und sehr sensitiven Parameter zur Beurteilung der
Lebersyntheseleistung darstellen.
zu 2.
Die Milzgröße der untersuchten Patienten zeigte eine positive Korrelation mit
dem Fibrosestadium. Die sonographische Größenbestimmung der Milz ergab
bei Patienten ohne Fibrose keine Splenomegalie. Bei 17 % der Patienten mit
mäßiger Fibrose wurde eine Vergrößerung der Milz nachgewiesen. Patienten
mit fortgeschrittener Fibrose hatten einen Splenomegalie-Anteil von 42%.
In dieser Studie konnte eine negative Korrelation zwischen Milzgröße und
Thrombozytenzahl nachgewiesen werden: Patienten mit Splenomegalie
hatten weitaus geringere Thrombozytenzahlen als Patienten mit normal
großer Milz.
Peck-Radosavljevic, Aster, Harker und Toghill sahen eine vermehrte
Sequestration der Thrombozyten in der Milz bei Hypersplenismus als
Hauptursache der Thrombozytopenie an (Peck-Radosavljevic et al., 1997;
Aster, 1966; Harker and Finch, 1969; Toghill et al., 1977).
4 Diskussion
51
Vyzantiadis sowie Schoffski, Adinolfi, Faeh und Goulis stellten fest, dass bei
thrombozytopenischen Patienten mit chronischer Hepatitis C das
Vorhandensein einer Splenomegalie eine Rolle spielt: Patienten mit
Splenomegalie hatten geringere Thrombozytenzahlen als Hepatitis-Patienten
mit normal großer Milz (Vyzantiadis et al., 2002; Schoffski et al., 2002;
Adinolfi et al., 2001; Faeh et al., 2001; Goulis et al., 1999).
In verschiedenen Studien konnte ein Wiederanstieg der Thrombozytenzahl
nach Splenektomie bei anderer Grunderkrankung mit Splenomegalie (ITP,
MDS) nachgewiesen werden (Steensma et al., 2003; Bourgeois et al., 2003;
Kumar et al., 2002; Kraemer et al., 2002). (In diesen Studien fanden leider
keine Untersuchungen zum Verhalten von TPO statt.)
Schlussfolgerung:
Da nach den Erkenntnissen von Vyzantiadis (Vyzantiadis et al., 2002) keine
Korrelation zwischen der zirkulierenden TPO-Menge und der Milzgröße
existiert, ist nach unseren Überlegungen am ehesten folgende Erklärung für
die gefundenen Ergebnisse wahrscheinlich: Die gesteigerte Thrombozyten-
Sequestration in der vergrößerten Milz (Hypothese 2) führt zur
Thrombozytopenie. Die daraufhin - in einem normal funktionierenden
Regelkreis - stattfindende verstärkte Synthese und Freisetzung von TPO wird
durch die ausgeprägte Leberschädigung (Hypothese 1) verhindert (Abb. 23).
4 Diskussion
52
TPO im Serum
Megakaryozyten
im Knochenmark
Thrombozyten
TPO-mRNA
Leber
Milz
Positiver/
fördernder Einfluss
Negativer/
hemmender Einfluss
Abbildung 23: Autoregulation der Thrombozytopoese und der Einflussfaktor Milz: Bei Splenomegalie kommt es zu einem vermehrten Abbau von Thrombozyten (TZ) und gebundenem TPO. Eine gesunde Leber kann auf einen TZ- und TPO-Verlust mit verstärkter TPO-Synthese reagieren, bei ausgeprägter Leberschädigung ist dies nicht möglich.
4 Diskussion
53
4.2 Einfluss von Interferon
Zur weiteren Klärung dieser Annahmen schloss sich die Untersuchung des
Einflusses von Interferon als Thrombozyten-Produktionshemmer an. Dabei
wurde davon ausgegangen, dass Interferon keine Auswirkungen auf die
TPO-Synthese in der Leber hat, sondern einen direkt myelosuppressiven
Effekt ausübt (NIDDK, 2003; Lauer and Walker, 2001; Tran and Martin, 2001;
di Bisceglie, 1998). Eine Hemmung der Thrombozytenproduktion im
Knochenmark sollte zu einem Anstieg von Thrombopoietin führen, da erstens
weniger Thrombozyten zur Bindung von TPO zur Verfügung stehen und
zweitens die Synthese und Freisetzung von TPO durch eine
Thrombozytopenie stimuliert wird (s. Regelkreis Abb.1).
Zwei Monate nach Therapiebeginn wurden erste Auswirkungen des
Interferons auf Thrombozyten und Thrombopoietin deutlich: Die
Thrombozytenzahl der Patienten mit schwerer Fibrose (Grade 3+4) sank
unter den Wert der Ausgangsposition, während die Thrombopoietin-
Konzentration anstieg. Nach weiteren zwei bzw. vier Behandlungsmonaten
blieb dieser Trend erhalten: Die Thrombopoietinspiegel waren - im Vergleich
zu den Ausgangswerten - höher (überstiegen jedoch zu keinen Zeitpunkt den
normalen Referenzbereich) und die Thrombozytenzahlen weiterhin
erniedrigt.
Die hier festgestellte Thrombozytopenie und die erhöhten
Thrombopoietinspiegel können durch folgende Mechanismen erklärt werden:
1. Interferon führt durch seine myelosuppressive Nebenwirkung zu
Thrombozytopenie, als Reaktion steigt Thrombopoietin an (Abb. 24).
Diesen Befund stellten ebenfalls Peck-Radosavljevic und Shiota in
ihren Studien fest (Peck-Radosavljevic et al., 2002; Shiota et al.,
1997).
Diese myelosuppressive Wirkung konnte durch den Rückgang der
Leukozyten (Leukopenie) während der Therapie (Abb. 14) bestätigt
werden.
4 Diskussion
54
Die Leber scheint hier auf die (durch Interferon verstärkte)
Thrombozytopenie mit einem TPO-Anstieg – entsprechend dem
bereits vorgestellten Regelkreis (Abb. 1) – reagieren zu können. Damit
wird die von Stoffel, Cardier, Jelkmann und Geddis (Stoffel et al.,
1996; Cardier and Dempsey, 1998; Jelkmann, 2001; Geddis et al.,
2002) aufgestellte Theorie, TPO würde unbeeinflusst von äußeren
Umständen konstitutiv produziert, widerlegt.
2. Die in dieser Patientengruppe häufig vorliegende Splenomegalie löst
über die verstärkte Thrombozyten-Sequestration eine
Thrombozytopenie aus, daraufhin steigt Thrombopoietin an.
Hier zeigt sich ein Widerspruch zum Verhalten von TPO vor der
Interferon-Therapie: Da sich an der Splenomegalie während der
Therapie nichts ändert, hätten die TPO-Konzentrationen auch bereits
vor dem Einsatz von Interferon auf eine Thrombozytopenie reagieren
müssen.
Daher erscheint diese Annahme als eher unwahrscheinlich. Es
bestätigt sich dagegen die Vermutung von Vyzantiadis (Vyzantiadis et
al., 2002): Die Synthese und Freisetzung von TPO wird durch die
Größe der Milz nicht beeinflusst.
3. Es existiert eine „TPO-Resistenz“ des Knochenmarkes.
Unter Interferon-Therapie kommt es zu einem relativen Mehrbedarf an
TPO, um die Thrombozytenzahl stabil zu halten.
4. Durch die Interferon-Therapie kommt es zu einer Verbesserung der
Lebersyntheseleistung: Die Thrombopoietin-Konzentrationen steigen.
Eine gesteigerte hepatische TPO-Synthese - durch die antifibrotische
Wirkung des Interferons - ist zu diesem Zeitpunkt aufgrund eines zu
kurzen Therapiezeitraumes noch nicht zu erwarten. Hinweise dafür
lassen sich auch an dem Verhalten der Syntheseparameter Albumin
und Quick erkennen: Sie zeigen - während des gesamten
Therapiezeitraumes - keine signifikante Veränderung.
4 Diskussion
55
Andererseits könnte auch hier erneut ein Hinweis dafür vorliegen,
dass es sich bei TPO um einen sehr sensitiven
Leberfunktionsparameter handelt. Dieser könnte eventuell den Beginn
einer verbesserten Syntheseleistung der Leber sehr frühzeitig
anzeigen, wenn die anderen Leberfunktions-Parameter noch keine
Veränderung zeigen (Abb. 24).
TPO im Serum
Megakaryozyten
im Knochenmark
Thrombozyten
TPO-mRNA
Leber
Milz
Interferon
Positiver/
fördernder
Einfluss
Negativer/hemmender
Einfluss
Abbildung 24: Darstellung der Einflüsse der Interferon-Therapie und der Milz auf Thrombopoietin und Thrombozyten. Der Einfluss von Interferon und Milz führt zu einem Absinken der Thrombozytenzahl. Interferon verbessert die Lebersyntheseleistung, es kommt zu einem Anstieg von TPO.
4 Diskussion
56
Im Gegensatz zu den Ergebnissen bei Patienten mit fortgeschrittener Fibrose
befanden sich sowohl Thrombozyten als auch Thrombopoietin bei den
Patienten ohne bzw. mit mäßiger Fibrose (Grade 0,1+2 nach Metavir) -
während der Interferon-Ribavirin-Kombinationstherapie - im Normalbereich.
Die nur gering geschädigte Leber dieser Patienten scheint genug Reserven
zu haben, um ausreichende Mengen von TPO zu synthetisieren. Der
komplexe Regelkreis zwischen Thrombozyten und Thrombopoietin (Abb. 1)
wird deshalb nicht gestört. Darüber hinaus wiesen nur 17% der Patienten mit
milder Fibrose eine Splenomegalie auf, so dass sich eine vermehrte
Sequestration von Thrombozyten nicht auswirken konnte.
Daraus folgt: Patienten mit chronischer Hepatitis C, aber mit gesunder oder
nur leicht geschädigter Leber, sind auch bei äußerer Störung (hier:
Interferon-Ribavirin-Therapie) in der Lage, das komplexe Zusammenspiel
von Thrombopoietin und Thrombozyten aufrecht zu erhalten. Damit wird die
Vermutung von Stoffel, Cardier, Jelkmann und Geddis (Stoffel et al., 1996;
Cardier and Dempsey, 1998; Jelkmann, 2001; Geddis et al., 2002)
unterstützt, dass die Leber konstant und unbeeinflusst von äußeren Faktoren
TPO produzieren kann. Dies gilt aber nur für die Patienten mit leichtem
Leberschaden.
4 Diskussion
57
4.3 Thrombozyten und Thrombopoietin nach Abschluss der
Interferon-Therapie
Nach Beendigung der Therapie lagen die Thrombopoietinkonzentrationen
aller Patienten immer noch im „normalen“ Referenzbereich. Dabei ergab sich
eine Staffelung der TPO-Spiegel von niedrig, Fibrosegrad 0, nach hoch,
Fibrosegrad 3+4.
Die Patienten mit schwerer Fibrose (Fibrosegrad 3+4) wiesen den
deutlichsten TPO-Anstieg aller Patientengruppen auf.
Möglicherweise ist hier erneut der Therapieeffekt des Interferons zu
erkennen: Interferon führt zu einer Stagnation in der Fibroseprogression und
sogar zu einem Rückgang der Fibrose. Die Leber ist dadurch in der Lage,
wieder vermehrt resp. normale Mengen Thrombopoietin zu produzieren und
damit adäquat auf eine Thrombozytopenie zu reagieren.
Anhand der klassischen Syntheseparameter Quick und Albumin ist ein
Rückgang der Fibrose bzw. eine Verbesserung in der Syntheseleistung nicht
eindeutig zu erkennen; allerdings ist der Trend zu einem diskreten Anstieg
der Quickwerte zu beobachten. Hier kann also erneut ein Hinweis auf TPO
als ein früher und sensitiver Leberfunktionswert gefunden werden.
Nach Beendigung der Therapie kam es durch den Wegfall des
myelosuppressiven IFN-Effektes zu einem Anstieg der Thrombozytenzahlen
auf fast normale Werte (Median: 150.000/µl). Die erhöhten TPO-Spiegel
tragen durch Stimulation der Thrombozytopoese zu diesem Anstieg der
Thrombozytenzahl bei. Diese Befunde stimmen mit den von Peck-
Radosavljevic gefundenen Ergebnissen überein (Peck-Radosavljevic et al.,
2002). Bei den Untersuchungen von Rajan und Garcia-Suarez (Rajan and
Liebman, 2001; Garcia-Suarez et al., 2000) wurden ebenfalls erhöhte
Thrombozytenzahlen nach Interferon-alpha-Therapie von HCV-assoziierter
Thrombozytopenie festgestellt. Der Einfluss von Thrombopoietin wurde in
diesen Arbeiten nicht berücksichtigt.
Bei den Patienten mit milder Fibrose waren die Thrombozytenzahlen auch
nach Therapiebeendigung normal konstant (Mediane: 184.500/µl,
223.000/µl). Die Thrombopoietinkonzentrationen lagen ebenfalls immer noch
im Referenzbereich.
4 Diskussion
58
Durch den Wegfall von Interferon kam es nicht zu Störungen im komplexen
Thrombozyten-Thrombopoietin-Regelkreis.
Dies bestätigt erneut die auch von Stoffel, Cardier, Jelkmann und Geddis
aufgestellte Theorie: Bei Patienten mit gesunder bzw. sehr gering
geschädigter Leber wird TPO konstitutiv und unabhängig von äußeren
Faktoren produziert (Stoffel et al., 1996; Cardier and Dempsey, 1998;
Jelkmann, 2001; Geddis et al., 2002). Der Regelkreis von Thrombozyten und
TPO funktioniert.
4 Diskussion
59
4.4 GOT und GPT
Die vor Beginn der antiviralen Interferon-Ribavirin-Kombinationstherapie in
Abhängigkeit vom Schweregrad der jeweils vorliegenden Leberfibrose
erhöhten Transaminasen GOT und GPT gingen unter der Therapie zurück
und belegten mit dieser nachlassenden Leberentzündungsaktivität
(reduzierter Zelluntergang) die therapeutische Wirksamkeit von Interferon
und Ribavirin, wie es auch schon von den Autoren Lauer, Gramenzi, di
Bisceglie und Hoofnagle übereinstimmend beschrieben worden war (Lauer
and Walker, 2001; Gramenzi et al., 2001; di Bisceglie, 1998; Hoofnagle and
di Bisceglie, 1997).
Die Reaktion der Transaminasen richtete sich nach der HCV-RNA-Response
der einzelnen Patienten. Während die Transaminasen der Patienten mit
chronischer Hepatitis C und anhaltendem Therapieerfolg (mindestens 6
Monate nach Therapieende fehlender HCV-RNA-Nachweis) therapiebedingt
erwartungsgemäß stark zurückgingen, zeigten die Transaminasen der
Patienten ohne anhaltende Therapieantwort (Non-Responder) keine
Reaktion oder sogar eine leichte Zunahme.
4.5 Leber-Synthese-Parameter Albumin und Quick
4.5.1 Albumin:
Sämtliche gemessenen Albuminwerte lagen im Normalbereich (35-52 g/l).
.
4.5.2 Quick:
Bei der Untersuchung der Quickwerte der Patienten wurden zu allen
Untersuchungszeitpunkten normale Ergebnisse (70-130 % der Norm)
festgestellt.
4 Diskussion
60
4.6 Hämoglobin
Während der Interferon-Ribavirin-Kombinationstherapie kam es zu einem
leichten Rückgang der Hämoglobinwerte, die sich nach Absetzen der
Therapie sofort wieder erholten. Es bestand keine Abhängigkeit von dem
jeweils vorliegenden Fibroseschweregrad. Dieser Effekt ist am
wahrscheinlichsten durch die Wirkung des Ribavirins bedingt, da die rote
Zellreihe im Knochenmark nicht von der Interferon-Wikung beeinflusst wird.
4 Diskussion
61
4.7 Fazit
Insgesamt zeigt diese Studie, dass die bei Patienten mit chronischer
Hepatitis C oft vorhandene Thrombozytopenie durch ein kompliziertes
Zusammenspiel aus Thrombozyten-Sequestration in der Milz, Bindung von
TPO an Thrombozyten-Rezeptoren und Leberinsuffizienz entsteht (Abb. 1 u.
Abb. 23).
Dabei lässt sich ein Unterschied zwischen Patienten mit schwerem
Leberschaden und nahezu gesunden Patienten feststellen:
Die Patienten mit massivem Leberschaden werden durch die Interferon-
Therapie folgendermaßen beeinflusst: Ohne Therapie weisen sie erniedrigte
TPO-Konzentrationen und Thrombozytenzahlen auf. Während der Therapie
kommt es zu einem Anstieg von TPO, die Thrombozytenzahl bleibt niedrig.
Nach der Interferon-Ribavirin-Therapie steigen die TPO-Serumspiegel enorm
an, die Thrombozytenzahlen nehmen ebenfalls zu.
Damit ist belegt:
� Interferon führt zu einer Verbesserung der Lebersyntheseleistung
(Abb. 24).
� Nach einer Interferon-Therapie kann der TPO-Thrombozyten-
Regelkreis wieder funktionieren.
� TPO kann als ein früher und sensitiver Parameter für die
Leberfunktion angesehen werden.
Die Patienten mit einer nahezu gesunden Leber (Fibrosegrad 0, 1+2) werden
durch die Interferon-Therapie in ihrem Zusammenspiel von TPO und
Thrombozyten nicht gestört. Thrombozytenzahlen und TPO-Serumspiegel
weisen während des gesamten Beobachtungszeitraumes ausschließlich
Normalwerte auf.
Daraus folgt:
� TPO wird in einer nahezu gesunden Leber konstitutiv und
unbeeinflusst von äußeren Faktoren synthetisiert.
� Der komplexe Thrombopoietin-Thrombozyten-Regelkreis kann
ungestört funktionieren.
5 Zusammenfassung
62
5 Zusammenfassung
Die Thrombozytopenie ist eine häufige Begleiterscheinung bei chronischen
Lebererkrankungen - insbesondere bei chronischer Hepatitis C - und wird
durch die antivirale Therapie mit Interferon und Ribavirin häufig noch
verschlimmert.
Die Regulation der Thrombozytenzahl ist komplex und beinhaltet die
Sequestration und Metabolisierung von Thrombozyten in der Milz sowie das
Zusammenspiel mit dem Zytokin Thrombopoietin.
Thrombopoietin (TPO), der hauptsächliche Regulator der Megakaryozyto-
und Thrombozytopoese, wird hauptsächlich von der Leber produziert.
In dieser Studie wurde der Zusammenhang zwischen Fibrosegrad und TPO-
Serumkonzentration sowie der Einfluss der antiviralen Therapie mit Interferon
und Ribavirin untersucht.
Methode:
Bei 45 Patienten mit chronischer Hepatitis C wurden vor Beginn, während (zu
den Zeitpunkten zwei, vier und sechs Monate Therapie) und nach Abschluss
der antiviralen Therapie die Thrombozytenzahlen (TZ) und die TPO-
Serumspiegel mittels einem ELISA (Quantikine human Tpo, R&D Systems,
USA) bestimmt.
Bei jedem Patienten wurde vor Therapiebeginn eine Leber-Biopsie
durchgeführt und der Fibrosegrad wurde nach Metavir eingeteilt: Grad 0 –
keine Fibrose (n = 9), Grad 1-2 – mäßige Fibrose (n = 18), Grad 3-4 –
ausgeprägte Fibrose (n = 18) vorhanden.
Ergebnisse:
Vor Beginn der antiviralen Therapie zeigte sich ein signifikanter Unterschied
der Thrombozytenzahl in Abhängigkeit der verschiedenen Fibrosegrade
(p=0,0109). Daraus folgte: Je höher der Fibrosegrad, desto niedriger die
Thrombozytenzahl. Für die Thrombopoietinkonzentrationen konnte vor
Therapiebeginn kein signifikanter Unterschied in Abhängigkeit von dem
Fibrosegrad gefunden werden (p=0,1673); es wurde jedoch ein Trend
5 Zusammenfassung
63
erkennbar: Je stärker die Leberfibrose ausgeprägt war, desto weniger TPO
konnte im Serum nachgewiesen werden.
Während der Therapie konnten bei den Patienten mit geringer Fibrose (Grad
0,1+2) keine statistisch signifikanten Veränderungen der
Thrombopoietinserumspiegel in Abhängigkeit von der Therapiedauer
gefunden werden (p>0,05). Bei den Patienten mit ausgeprägter Fibrose
hingegen, ist ein statistisch signifikanter TPO-Anstieg feststellbar (p<0,05).
Statistisch signifikante Veränderungen der Thrombozytenzahlen in
Abhängigkeit von der Therapiedauer konnten während der Therapie bei den
Patienten ohne Fibrose nicht gefunden werden (p>0,05). Im Gegensatz dazu
konnten sie jedoch bei den Patienten mit mittelschwerer und stark
ausgeprägter Leberschädigung festgestellt werden (p<0,05).
In der Varianzanalyse zeigte sich ein statistisch signifikanter Einfluss sowohl
der Zeit (p=0,0101) als auch des Fibrosestadiums (p=0,0001) auf die
Thrombozytenzahl.
Durch diese Ergebnisse und verschiedene Überlegungen konnten in dieser
Studie folgende Schlussfolgerungen gezogen werden:
Bei Patienten mit ausgeprägter Fibrose (Grad 3+4) führt die antivirale
Kombinationstherapie zu einer verbesserten Lebersyntheseleistung. Diese
wird durch den Anstieg von Thrombopoietin deutlich. Dadurch wird das
geordnete Zusammenspiel von Thrombozyten und Thrombopoietin wieder
möglich. TPO kann als ein frühzeitig auftretender und sensitiver Parameter
für die Lebersyntheseleistung angesehen werden. Anhand der klassischen
Syntheseparameter Quick und Albumin ist diese Verbesserung der
Syntheseleistung der Leber noch nicht eindeutig zu erkennen; es zeigt sich
ein Trend zu einem diskreten Anstieg der Quickwerte.
Bei Patienten ohne bzw. mit nur gering ausgeprägter Leberfibrose (Grad
0,1+2) nimmt die Interferon-Ribavirin-Therapie keinen großen Einfluss auf
die Höhe der Thrombozytenzahl oder Thrombopoietinkonzentration. Diese
Werte befinden sich während des gesamten Beobachtungszeitraumes im
Normalbereich. Dies spricht dafür, dass in einer gesunden Leber die TPO-
Produktion unabhängig von äußeren Faktoren, und das komplizierte
Zusammenspiel von Thrombozyten und Thrombopoietin ungestört stattfinden
kann.
5 Zusammenfassung
64
Fazit:
Thrombopoietin spielt eine wichtige Rolle in der Autoregulation der
Thrombozytopoese und kann als ein sehr sensitiver Parameter zur
Beurteilung der Lebersyntheseleistung angesehen werden.
6 Literaturverzeichnis
65
6 Literaturverzeichnis
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7 Anhang: Erhebungsbogen
82
Erhebungsbogen
Name: Vorname:
Geb.datum:
Patienten-Nummer:
Erstvorstellung:
Erstdiagnose:
Möglicher Infektionszeitpunkt/-weg:
Genotyp: (1a/ 1b/ 2/ 3/ 4)
Leber-Histologie:
Biopsie vom: Aktivitätsgrad: (0-3 nach Metavir)
Fibrosegrad: (0-4 nach Metavir)
Milzgröße (sonographisch ermittelt):
Querdurchmesser:
Längsdurchmesser:
Labor: Datum:Hb (g/dl):WBC (10e3/µl):PLT (10e3/µl):PCR (+/-):GOT (U/l):GPT (U/l):Albumin (g/l):Quick (%):
Therapie: Interferon: (MIU, 3x/Woche)
Ribavirin: (mg/d)
Therapiezeitraum: (Wochen)
Therapieansprechen: (Responder = R)
(Non-Responder = NR)
8 Danksagung
83
Danksagung
Meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. med. W. Schmiegel, danke ich für die
Überlassung des Themas.
Für die Studienleitung danke ich Herrn Dr. med. U. Graeven.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. med. M. Reiser für die freundliche
Beratung und immer anregende Betreuung bei der Durchführung meiner
Promotionsarbeit.
In meinen Dank einschließen möchte ich Frau Anika Hüsing für die
Unterstützung bei der statistischen Auswertung meiner Ergebnisse sowie
Frau Sonja Karpinski und Frau Sabine Plambeck für die Hilfe bei der
Durchführung des ELISAs.
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Lebenslauf
Name: Stefanie Rose
Geburtstag und -ort: 11. August 1977 in Hagen, Westf.
Familienstand: ledig
Konfession: evangelisch
Nationalität: deutsch
Eltern: Dipl.-Ing. Horst Rose und
Inge Rose, geb. Steinweg
Anschrift: Erbenstr. 21
44309 Dortmund
Schulbildung
1984 – 1985 Vincke-Grundschule, Hagen-Boele
1985 – 1988 Reichshof-Grundschule, Dortmund-Brackel
1988 – 1997 Stadtgymnasium Dortmund (Abitur)
Studium
1997 – 2004 Studium der Humanmedizin, Ruhr-Universität
Bochum
1999 Ärztliche Vorprüfung (Physikum)
2000 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
2003 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
2003 – 2004 Praktisches Jahr: Innere Medizin, Chirurgie und
Wahlfach Orthopädie, Allgemeines Krankenhaus
Hagen
27.04.2004 Abschluss des Studiums mit Bestehen des dritten
Abschnittes der Ärztlichen Prüfung
Berufliche Tätigkeit
seit 15. Juni 2004 Ärztin im Praktikum
im Allgemeinen Krankenhaus Hagen,
Medizinische Klinik
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