Aus der Klinik und Poliklinik für Innere Medizin A
-Direktor Univ.- Prof. Dr. med. Markus M. Lerch- der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Die Rolle von Sequenzvarianten im Cathepsin L als Risikofaktoren der
chronischen Pankreatitis
Inaugural - Dissertation zur
Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Medizin
(Dr. med.)
der Universitätsmedizin
der Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Greifswald
2016
vorgelegt von: Claas-Olsen Behn geb. am: 11. Februar 1983 in: Hamburg
Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Max P. Baur
1. Gutachter: Prof. Dr. med. M. M. Lerch
2. Gutachter: Prof. Dr. med. J. Rosendahl
Ort, Raum Klinik für Innere Medizin A Universitätsmedizin Greifswald
Raum O 0.66
Tag der Disputation: 07.12.2016
Zusammenfassung
Die chronische Pankreatitis ist meist eine wiederkehrende Entzündung der
Bauchspeicheldrüse mit intrapankreatischer Aktivierung der Verdauungsenzyme.
Mutationen im pankreatischen sekretorischen Trypsin Inhibitor (PSTI = SPINK1) finden sich
häufig bei Patienten mit chronischer Pankreatitis. Die häufigste SPINK1 Mutation p.N34S ist
aber auch bei 1-2 % der gesunden Normalbevölkerung nachweisbar. Experimentelle Daten
belegen, dass das p.N34S mutierte Protein durch CTSL schneller degradiert wird. In dieser
Arbeit wird untersucht, ob Mutationen im CTSL Gen das Risiko von p.N34S+ Individuen
erhöhen, an einer Entzündung der Bauchspeicheldrüse zu erkranken.
Hierfür werden mittels TaqMan-Analyse die Probanden der SHIP-Studie (SHIP-0 n=4308, im
Weiteren Kontrollen) und Individuen mit chronischer ideopathischer Pankreatitis (n=2299,
im Weiteren Patienten) für N34S-Mutation in SPINK1 genotypisiert. Hiernach wird bei den
p.N34S+ Individuen das CTSL mittels bidirektionaler Sanger-Sequenzierung untersucht.
Wir finden eine nichtsynonyme Mutation (c.5A>C, p.N2T), eine Mutation mit Verschiebung
des Leserasters (c.98delA, p.K33fs) und einen SNP c.-461C>A (rs3118869), für den eine
Modifikation der Expression in anderem Zusammenhang publiziert ist. Die p.N2T Mutation
wird bei einem Patienten und zwei Kontrollen nachgewiesen, die Verschiebung des
Leserasters nur bei einem Patienten. Der SNP kann bei 42 Patienten und 46 Kontrollen
nachgewiesen werden. Für keine der gefundenen Varianten zeigt sich ein signifikanter
Unterschied in der Verteilung. Auch in der Haplotypenanalyse kann kein signifikanter
Verteilungsunterschied gezeigt werden.
Ein Einfluss von CTSL Mutationen auf das Risiko an einer Pankreatitis zu erkranken, erscheint
für Träger der p.N34S Mutation im SPINK1 Gen möglich, kann an dem untersuchten Kollektiv
aber nicht bewiesen werden.
4
Inhaltsverzeichnis
ZUSAMMENFASSUNG 5
INHALTSVERZEICHNIS 4
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 7
ABBILDUNGSVERZEICHNIS 9
TABELLENVERZEICHNIS 10
1 EINLEITUNG 11
1.1 PANKREAS 11
1.2 PANKREATITIS 11
1.3 AKUTE PANKREATITIS 12
1.4 CHRONISCHE PANKREATITIS 12
1.4.1 Epidemiologie der chronischen Pankreatitis 13
1.5 HEREDITÄRE PANKREATITIS 13
1.5.1 Trypsinmutationen in der Pankreatitis 14
1.5.2 SPINK1 Mutationen in der Pankreatitis 15
1.6 CATHEPSINE 17
1.6.1 Cathepsin B 17
1.6.2 Cathepsin L 17
1.6.3 Cathepsine in der Pankreatitis 20
1.7 ZIELSETZUNG 23
2 MATERIAL UND METHODEN 24
2.1 STUDIENTEILNEHMER 24
2.1.1 Patienten mit idiopathischer chronischer Pankreatitis und N34S Mutation im SPINK1 24
2.1.2 SPINK1 N34S Mutations-Träger ohne Pankreatitis 25
2.2 MATERIAL 26
2.2.1 Verbrauchsmaterialien 26
2.2.2 Gebrauchslösungen 26
2.2.3 Geräte 27
2.2.4 Software 28
2.3 METHODEN 28
2.3.1 DNA Extraktion 28
2.3.2 Gelelektrophorese 29
2.3.3 Herstellung von Agarosegelen 29
2.3.4 Beladung von Agarosegelen 30
2.3.5 Genotypisierung von Sequenzvarianten mittels TaqMan-Analyse 30
2.3.6 Durchführung TaqMan Assay 32
5
2.3.7 Polymerasekettenreaktion (PCR) 34
2.3.8 Primerdesign 34
2.3.9 Primersequenzen 35
2.3.10 Etablierung der Reaktionsbedingungen PCR 35
2.3.11 PCR Protokolle 36
2.3.12 Durchführung Amplifikation 36
2.3.13 Aufreinigung der PCR Produkte 37
2.3.14 Sequenzierungsreaktion 38
2.3.15 Aufreinigung der Sequenzierungsreaktion 39
2.3.16 Auswertung der Sequenzierung 40
2.3.17 Promotor Analyse 42
2.4 STATISTIK 43
2.4.1 Haplotypenanalyse 43
2.4.2 Powerberechnung 44
3 ERGEBNISSE 45
3.1 STUDIENTEILNEHMER 45
3.1.1 Amplifikations PCR Etablierung und Optimierung 46
3.2 PCR ZUR AMPLIFIKATION UND SEQUENZIERUNG 49
3.3 VARIANTEN IM CTSL 51
3.3.1 Typisches Elektropherogramm einer heterozygoten Mutation 53
3.3.2 Einteilung nach Häufigkeit der gefundenen Varianten 53
3.4 ALLELHÄUFIGKEITEN 54
3.4.1 Verteilung der Varianten bei Fällen und Kontrollen 55
3.5 HÄUFIGE VARIANTEN MAF > 5 % 56
3.5.1 Hardy-Weinberg-Equilibrium 57
3.5.2 Seltene Varianten MAF < 5 % 58
3.6 HAPLOTYPENANALYSE 59
3.7 POWERANALYSE 61
4 DISKUSSION 62
4.1 POWERBERECHNUNG UND PATIENTENKOHORTE 62
4.2 LOKALE PRÄVALENZ DER SPINK N34S MUTATIONEN 63
4.3 CATHEPSINE IN DER PANKREATITIS 63
4.3.1 Sequenzvarianten von Cathepsin B in der Pankreatitis 63
4.3.2 Cathepsin L 63
4.4 CTSL EXPRESSION 66
4.5 CATHEPSIN L VARIANTEN BEI TRÄGERN DER SPINK1 P.N34S MUTATION 68
4.5.1 Exonische Varianten 68
4.6 NICHTEXONISCHE VARIANTEN 71
6
4.6.1 Seltene Varianten MAF < 5 % 71
4.6.2 Häufige Varianten MAF > 5 % 72
4.6.3 Häufigkeit und Validität 74
4.7 FAZIT 75
4.8 AUSBLICK 77
LITERATURVERZEICHNIS 79
ERKLÄRUNG 87
LEBENSLAUF 88
PUBLIKATIONEN 89
DANKSAGUNG 91
7
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung Bedeutung
A. Arteria Abb. Abbildung AHR Aryl hydrocarbon receptor AP Akute Pankreatitis ARNT Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator AS Aminosäure(n)
cM Centimorgan (cM) genetische Entfernung von gekoppelten Genloci nach Rekombinationshäufigkeit
CNV Copy number variations engl. Variation der Kopienzahl CP Chronische Pankreatitis CpG-Insel Cytosin-phosphatidyl-Guanin-Insel CT Computer Tomographie ddNTP Didesoxyribonukleosidtriphosphat DNA Desoxyribonucleic acid engl. Desoxyribonucleinsäure dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat engl. Englisch ER Endoplasmatisches Retikulum ERCP Endoskopische retrograde Cholangiopankreatikographie EUS Endoskopischer Ultraschall FRET Förster-Resonanzenergietransfers griech. Griechisch HGNC HUGO Gene Nomenclature Committee HUGO Human Genome Organisation HWE Hardy Weinberg Equilibrium
ICD10 International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems engl. Internationale statistische Klassifikation der Krankheiten und verwandter Gesundheitsprobleme
IRES Internal ribosomal entry site engl. interne ribosomale Eintrittsstelle IUBMB International Union of Biochemistry and Molecular Biology kDa Kilodalton LAD Left anterior descending
8
lat. Latein MAF Minor allel frequency engl. Häufigkeit des Minor Allels MEP Major excreted polypeptide = SPINK1 Mr Relative Molekülmasse MRCP Magnetresonanz-Cholangiopankreatikographie mRNA messengerRNA engl. Boten-RNA MRT Magnetresonanz Tomographie n.d. nicht detektiert NCBI National Center for Biotechnology Information, USA NTC None Template Control engl. Kontrolle ohne Vorlage (keine DNA) NTP Nukleosidtriphosphat
OMIM Online Mendelian Inheritance in Man, Onlinedatenbank humaner Gene und genetischer Erkrankungen
PCR Polymerase Chain Reaction engl. Polymerasekettenreaktion Pe Probability of error PSTI Pancreatic Secretory Trypsin Inhibitor PUP Peak under peak RFLP Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus RIVA Ramus interventricularis anterior RNA Ribonucleic acid engl. Ribonukleinsäure rpm Revolutions per minute engl. Umdrehungen/min RT Raumtemperatur S Svedberg, Sedimentationskoeffizient ~10-13 s SDS Sodium dodecyl sulfate engl. Natriumdodecylsulfat SNP Single nucleotide polymorphism engl. SPINK1 Serin Protease Inhibitor Kazal Typ 1 TATI Tumor assoziierter Trypsin Inhibitor = SPINK1 UniProt Universal protein database, Onlinedatenbank für Proteine V. Vena XRE Xenobiotic response element
9
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 SPINK1 Schnittstellen Cathepsin B und Cathepsin L ............................................ 16
Abbildung 2 Splicevarianten von Cathepsin L .......................................................................... 19
Abbildung 3 Schematische Darstellung des TaqMan Assays ................................................... 32
Abbildung 4 Adenosintriphosphat (ATP) protoniert ................................................................ 38
Abbildung 5 Desoxyadenosintriphosphat (dATP) protoniert ................................................... 38
Abbildung 6 Didesoxyadenosintriphosphat (ddATP) protoniert ............................................. 38
Abbildung 7 Agencourt CleanSEQ ............................................................................................ 40
Abbildung 8 Skizze Plattenbelegung für Annealing-Gradienten .............................................. 46
Abbildung 9 Agarosegel Annealing-Gradient ........................................................................... 47
Abbildung 10 Primer für die kodierende Sequenz ................................................................... 49
Abbildung 11 Primer Promotor und Intron1 ............................................................................ 50
Abbildung 12 Agarosegel Promotorfragment .......................................................................... 51
Abbildung 13 Elektropherogramm heterozygote Variante c.-461C>A .................................... 53
Abbildung 14 Haplotypenverteilung ........................................................................................ 60
Abbildung 15 Strukturformel L-Threonin ................................................................................. 69
Abbildung 16 Strukturformel L-Asparagin ............................................................................... 69
10
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1 Verbrauchsmaterialien ............................................................................................. 26
Tabelle 2 Gebrauchslösungen .................................................................................................. 26
Tabelle 3 Geräte ....................................................................................................................... 27
Tabelle 4 Software .................................................................................................................... 28
Tabelle 5 Genotypisierung TaqMan Thermocyclerprotokoll ................................................... 33
Tabelle 6 Genotypsierung TaqMan Reaktionsansatz ............................................................... 33
Tabelle 7 Primer ....................................................................................................................... 35
Tabelle 8 Amplifikation Thermocyclerprotokoll Allgemein ..................................................... 36
Tabelle 9 Amplifikation Reaktionsansatz Qiagen ..................................................................... 37
Tabelle 10 Amplifikation Reaktionsansatz Fermentas 2x Master ............................................ 37
Tabelle 11 Amplifikation alternativer Reaktionsansatz 2x Master .......................................... 37
Tabelle 12 Sequenzierung Reaktionsansatz ............................................................................. 39
Tabelle 13 Sequenzierung Thermocyclerprotokoll .................................................................. 39
Tabelle 14 Mapper2 Variablen ................................................................................................. 42
Tabelle 15 PCR Bedingungen zur Amplifikation ....................................................................... 48
Tabelle 16: Ergebnisse Alle Varianten ...................................................................................... 52
Tabelle 17: Ergebnisse Allelhäufigkeiten ................................................................................. 54
Tabelle 18: Ergebnisse Häufige Varianten im dominanten Vererbungsmodell ....................... 56
Tabelle 19: Ergebnisse Häufige Varianten im rezessiven Vererbungsmodell .......................... 57
Tabelle 20: Ergebnisse Seltene Varianten ................................................................................ 58
Tabelle 21: Ergebnisse Haplotypen .......................................................................................... 60
Tabelle 22 Diskussion Verteilung c.-461C>A ............................................................................ 73
11
1 Einleitung
1.1 Pankreas
Das ca. 13-18 cm große Pankreas (griech.: pán = alles, kréas = Fleisch) liegt sekundär
retroperitoneal in Höhe des zweiten Lendenwirbelkörpers und erstreckt sich vom
duodenalen C auf der rechten Seite bis zum Milzhilus auf der linken Seite. Die Form wird oft
mit einem quer liegenden Angelhaken bzw. einem Keil verglichen. Makroskopisch unterteilt
man das Organ in drei Abschnitte, das Caput (lat. Kopf), das Corpus (lat. Körper) und die
Cauda (lat. Schwanz) pancreatis. Der Vergleich mit einem Haken geht auf die Form zurück, in
der sich das Pankreas der Lendenwirbelsäule anschmiegt. Das Caput pancreatis liegt
eingebettet im duodenalen C und umfasst mit seinem kaudal distalen Anteil die V. und A.
mesenterica superior. Das Corpus verläuft nahezu horizontal und überkreuzt die Aorta
abdominalis zwischen dem Truncus coeliacus und der A. mesenterica superior. Die Cauda
pancreatis setzt diesen Verlauf fort und endet im Milzhilus. Vom Corpus zur Cauda nimmt
der Querdurchmesser der Bauchspeicheldrüse in den meisten Fällen kontinuierlich ab,
weshalb das Pankreas auch als keilförmig beschrieben wird. Es zeigen sich viele
Formvarianten von größtenteils geringer klinischer Relevanz (s. Chronische Pankreatitis).
1.2 Pankreatitis
Eine Pankreatitis ist eine Entzündung der Bauchspeicheldrüse. Man unterscheidet nach der
Verlaufsform die akute von der chronischen Pankreatitis und je nach Autor werden hier noch
weitere Subklassifizierungen vorgenommen, beispielhaft sei hier der von Whitcomb
geprägte Begriff der rekurrierenden akuten Pankreatitis genannt1.
Des Weiteren unterscheidet man nach der Ätiologie der Pankreatitis. Bis zu 80 % aller
Erkrankungen lassen sich durch biliäre oder alkoholische Faktoren erklären. Es gibt darüber
hinaus noch eine ganze Reihe weiterer krankheitsauslösender Faktoren mit deutlich
niedrigerer Prävalenz. So können Obstruktionen nicht nur durch Gallensteine hervorgerufen
werden, sondern unter anderem auch durch Neoplasien, anatomische Variationen oder auch
verschiedene Parasiten. Auch einige Infektionen können zur Pankreatitis führen, so z.B.
Salmonellen, Typhus, Mykoplasmen, Leptospiren, Lues, Mumps, Virushepatitiden,
12
Cytomegalievirus, Coxsackie B-Virus, HI-Virus. Auch verschiedene Giftstoffe und
Medikamente können in seltenen Fällen eine Pankreatitis auslösen2 3.
1.3 Akute Pankreatitis
Unter der akuten Pankreatitis versteht man eine entzündliche Erkrankung der
Bauchspeicheldrüse, die sich unterschiedlich manifestieren kann. Die Bandbreite der
klinischen Bilder reicht von einer leichten ödematösen Form, die mit Schmerzen und
erhöhten Serum-Werten für die Pankreasenzyme einhergeht bis hin zur schweren,
lebensbedrohlichen, nekrotisierenden Pankreatitis. Die Mortalität unterscheidet sich hierbei
essentiell: Bei der ödematösen Form liegt sie < 1 %, bei der hämorrhagisch nekrotisierenden
Pankreatitis (je nach Studie und in Abhängigkeit von der behandelnden Institution) von 10-
24 %3. Ein Übergang in chronische Formen ist möglich.
1.4 Chronische Pankreatitis
Die chronische Pankreatitis ist eine Erkrankung der Bauchspeicheldrüse, bei der meist durch
rezidivierende Entzündungsschübe das Pankreasparenchym im Sinne einer Nekrose-Fibrose-
Sequenz4 durch fibrotisches Bindegewebe ersetzt wird5. Man unterteilt die chronische
Pankreatitis (CP) nach der Pathogenese in die alkoholische CP, hereditäre CP, autoimmune
CP, metabolische CP, tropische CP und idiopathische CP. Davon abzugrenzen sind die
Formen einer CP, die mit einer anatomischen Anomalie einhergehen. Hier sind insbesondere
die paraduodenale Pankreatitis und die obstruktive chronische Pankreatitis zu erwähnen.
Es kommt im Krankheitsverlauf zu einem konsekutiven progredienten Verlust der exokrinen
und endokrinen Pankreasfunktion, häufig begleitet von typischen Komplikationen wie
Pseudozystenbildungen, Pankreasgangveränderungen im Sinne von Stenosen und
Dilatationen, Duodenalstenosen, aber auch Arrosionen der benachbarten Gefäße,
Kompression der Gallenwege, Pseudotumoren, Mangelernährung und in erster Linie
ausgeprägten Schmerzen. Das Risiko für ein Pankreaskarzinom ist deutlich erhöht6, die
Lebenserwartung der Patienten ist reduziert7.
13
1.4.1 Epidemiologie der chronischen Pankreatitis Die Inzidenz der chronischen Pankreatitis liegt zwischen 4/100 000 (Minnesota, USA) und
14/100 000 (in Japan), die Prävalenz bei ca. 50/100 000 in Japan und den Vereinigten
Staaten8 9. Die gesundheitsökonomische Bedeutung der Pankreatitis in Deutschland zeigt
sich auch an der Zahl der 10.213 Krankenhausaufnahmen wegen chronischer Pankreatitis
(K86.0 Alkoholinduzierte chronische Pankreatitis + K86.1 Sonstige chronische Pankreatitis
2.823 + 7.390) im Jahr 2014 (einzusehen über die Onlineabfrage der
Gesundheitsberichterstattung des Bundes, www.gbe-bund.de) zuzüglich derjenigen
Patienten mit chronischer Pankreatitis, die im Schub als akute Pankreatitis kodiert wurden
(K85 Akute Pankreatitis, insgesamt 55.624). Zum Vergleich, die Fallzahl der akuten
Appendizitis (ICD10: K35) beträgt für diesen Zeitraum 100.214.
1.5 Hereditäre Pankreatitis
Die hereditäre (lat. hereditas = Erbschaft) Pankreatitis ist als eine Unterform der Pankreatitis
anzusehen. Die Diagnose der hereditären Pankreatitis (OMIM® 167800) beinhaltet entweder
den Nachweis einer bekannten krankheitsauslösenden Mutation oder zwei oder mehr
erkrankte Individuen in zwei oder mehr Generationen einer Familie mit Pankreatitis. Sie
zeichnet sich insbesondere durch eine frühere Erstmanifestation, oft bereits im
Kindesalter10, aus. Die ersten Fallberichte einer familiären chronischen Pankreatitis reichen
zurück bis in das Jahr 1952 11. 1996 gelang die genetische Zuordnung der autosomal
dominant vererbten Pankreatitis zu der Region 35 auf dem langen Arm des Chromosoms 7 12. Pandya gelang es, diesen Bereich in drei anderen Familien zu bestätigen und auf einen
Bereich von 16-cM einzugrenzen13. Zur weiteren Eingrenzung führten dann die folgenden
funktionellen Überlegungen.
Bereits Ende des 19. Jahrhunderts vertrat Hans Chiari die These, die Pankreatitis sei ein
Selbstverdau des Organes 14. Aus diesem mittlerweile vielfach bestätigtem Wissen heraus
suchte man dann in der zuvor eingegrenzten genetischen Region nach entsprechenden
Verdauungsenzymen. Zwischen den Mikrosatelliten-Markern, die den wahrscheinlichsten
Bereich der DNA eingrenzen, liegen neben dem Gen für die T-Zell-Rezeptor Beta Kette noch
acht Trypsin-Gene, von denen drei als Pseudogene erkannt wurden 15. Noch im Jahr dieser
14
Entdeckung (1996) gelang der Gruppe um David Whitcomb der Nachweis einer Mutation im
kationischen Trypsin als Ursache der hereditären Pankreatitis16.
1.5.1 Trypsinmutationen in der Pankreatitis
Bei der beschriebenen Mutation handelt es sich um einen Aminosäureaustausch von Arginin
durch Histidin an Position 122 (p.R122H) im kationischen Trypsin (PRSS1). Das
Erklärungsmodell der Pankreatitis postuliert eine Trypsinschnittstelle, durch die es zu einer
Autodegradation kommt, an dieser Position. Diese Schnittstelle wird nach Austausch des
Arginins durch Histidin nicht mehr erkannt und es findet keine proteolytische Spaltung statt.
Hierdurch kann der autolytische Kontrollmechanismus der Aktivierung nicht mehr greifen.
Das Gleichgewicht zwischen Aktivierung und Deaktivierung des Trypsins verschiebt sich in
Richtung des aktivierten Enzyms. 1997 konnten Gorry et al. eine weitere Pankreatitis
auslösende Mutation zeigen. Es zeigte sich im PRSS1 Gen mehrerer Patienten, die keine
Mutation an Position p.R122 aufwiesen, eine Mutation an Position p.2917. Hier konnte ein
Austausch von Asparagin nach Isoleucin gezeigt werden.
Mittlerweile sind für viele Mutationen in diversen Genen Assoziationen mit der chronischen
Pankreatitis gezeigt worden, allerdings wird bislang nur für die Trypsinmutationen und hier
im engeren Sinne die p.R122H und p.N29I Mutationen von einer eindeutigen – in diesem
Zusammenhang monokausalen – Ursache der Pankreatitis ausgegangen. Im PRSS1-Gen
konnten in der Folge noch weitere unterschiedliche krankheitsauslösende Mutationen
identifiziert werden. Die Gemeinsamkeit dieser Mutationen beruht in den meisten Fällen
entweder auf einer erhöhten Trypsinaktivität durch vermehrte Sekretion, verstärkte
Aktivierung bzw. verminderte Degradation oder der Induktion von intrazellulärem,
insbesondere endosplasmatischem Stress durch eine Fehlfaltung der Enzyme. Es wurden
auch verschiedene CNV (copy number variations = Variation der Kopienzahl) berichtet, die
am ehesten mit einer Erhöhung der Trypsinaktivität einhergehen18-20. Die häufigste und
damit wahrscheinlichste Ursache für Mutationen sind Punktmutationen21. Es gibt aber in
Einzelfällen auch Hinweise auf eine alternative Entstehung der Trypsinmutationen. Die
Mutationen p.A16V, p.N29I, und p.R122H haben sich möglicherweise aus Genkonversionen
entwickelt22. Es wurden auch vereinzelt Fälle von Genkonversionen berichtet, die in eine
p.N29I Mutation 23 24 oder eine Kombination von p.R122H Mutation und p.R116P Mutation25
münden.
15
Die Trypsinmutationen p.N29I und p.R122H führen mit einer Wahrscheinlichkeit von ca. 80%
zur Pankreatitis. Bei vielen weiteren Mutationen, insbesondere in anderen Genen, gibt es
anhaltende Diskussionen darüber, ob diese als krankheitsauslösende – oder eher als
modifizierende Cofaktoren zu werten sind.
1.5.2 SPINK1 Mutationen in der Pankreatitis
Der krankheitsauslösende Effekt der Trypsinmutationen ist in den allermeisten Fällen eine
Aktivitätssteigerung des Trypsins. Funktionell ist es naheliegend, auch die Trypsininhibitoren
zu untersuchen. Ein wichtiger Inhibitor ist SPINK1 (SERINE PROTEASE INHIBITOR KAZAL-TYPE
1 kurz SPINK1 (OMIM 167790; Uniprot P00995). Mutationen imSPINK1 Gen sind mit der
chronischen Pankreatitis assoziiert26. Es zeigen sich allerdings Unterschiede in der Stärke der
Assoziation in Abhängigkeit von der Ätiologie der Pankreatitis. So ist die Assoziation von
N34S Mutationen mit der Pankreatitis am niedrigsten bei der chronischen alkoholischen
Pankreatitis, etwas höher bei der idiopathischen Pankreatitis und am höchsten bei der
tropisch kalzifizierenden Pankreatitis27. (OMIM 167790; Uniprot P00995)N34S Mutationen
im SPINK1 Gen sind nach der größten Metaanalyse mit einer Prävalenz von 18 %28 relativ
häufig bei Patienten mit idiopathischer chronischer Pankreatitis anzutreffen. Für die
chronische Pankreatitis konnte an einem Kollektiv aus Virginia/USA eine Assoziation mit der
N34S Mutation in 5,4 % der Fälle demonstriert werden. Für die Untergruppe der
idiopathischen chronischen Pankreatitis zeigt sich diese Assoziation mit 37,1 % 29. In der
Allgemeinbevölkerung liegt die Häufigkeit der in dieser Arbeit untersuchten N34S-Mutation
bei 1-2 %30 31. Die Erstbeschreibung der Assoziation dieses Aminosäureaustausches mit
chronischer Pankreatitis geht auf Witt et al. 26 zurück. Für die hereditäre Pankreatitis mit
Mutationen im PRSS1 Gen konnten Weiss et al. zeigen, dass weder die Penetranz noch der
Schweregrad der Erkrankung oder die Erstmanifestation eines Diabetes mellitus mit dem
Mutationsstatus vom SPINK1 Gen korrelieren.32 Das untersuchte Kollektiv ist gut mit der
Kohorte dieser Arbeit vergleichbar, es fanden sich bei zwei von siebzehn (12 %) Individuen
mit PRSS1 Mutationen ohne klinisch apparente Pankreatitis N34S Mutationen im SPINK1
Gen. Unter den 70 Individuen mit PRSS1 Mutation und Pankreatitis fanden sich fünf (7 %)
mit einer N34S Mutation im SPINK1 Gen. 32
16
Die häufigste Mutation im SPINK1, p.N34S geht nicht mit einer verminderten Trypsin
Inhibition einher33. Ein anderer Erklärungsansatz ist daher eine beschleunigte Degradation
des mutierten SPINK1 Proteins, die auch zu einer verminderten Trypsin Inhibition führen
würde. Gestützt wird diese These durch die relative Nähe der N34S Mutation zu potentiellen
Schnittstellen durch die SPINK1 degradierenden Enzyme Cathepsin B und Cathepsin L (s.
Abbildung 1).
Die Arbeitsgruppe um W. Halangk, insbesondere T. Wartmann34 konnte eine beschleunigte
Degradation von N34S mutiertem SPINK1 durch Cathepsin L zeigen. Die Experimente sind
bislang nur als Abstract veröffentlicht und werden gemeinsam mit den Ergebnissen dieser
Arbeit als Originalartikel publiziert. Aus den Daten von T. Wartmann ergibt sich der erste
Hinweis auf die Bedeutung der Interaktion von SPINK1 und Cathepsin L in der Entstehung
der N34S+ Pankreatitis.
Abbildung 1 SPINK1 Schnittstellen Cathepsin B und Cathepsin L Schematische Darstellung von SPINK1 modifiziert nach T. Wartmann. Es finden sich drei potentielle Schnittstellen für Cathepsin B und zwei für Cathepsin L. Die erste Schnittstelle von CTSL liegt eine Aminosäure von der N34S Mutation entfernt. Die Disulfidbrückenbindungen zwischen den Cystein-Molekülen werden in der Graphik durch S··S, in der ausgeschriebenen Aminosäuresequenz durch eine eckige, nach oben offene Klammer repräsentiert.
CTSB
CTSB
CTSB
reaktivesZentrum
AS-Positionen bezogen auf Spink1-Precursor
DSLGREAK C YNELNGCT KI YDPVCGTDGNTYPNECVLCFENRKR QTSILIQ K SGPC
CTSB CTSB CTSB
31 33 67 68 74 76
CTSL
CTSL
CTSLCTSL
17
1.6 Cathepsine
Neben Trypsin (PRSS1) und Spink (SPINK1) konnten in weiteren Genen krankheits-assoziierte
Mutationen gezeigt werden. In vielen Fällen handelte es sich hierbei um Proteasen. Für diese
Arbeit sind insbesondere die Cathepsine von näherem Interesse. Der Begriff Kathepsin bzw.
Cathepsin leitet sich ab von griechisch κατά (katá) „von ... herab, gegen, völlig“ und ἕψειν -
hepsein „kochen“. Es handelt sich bei den Cathepsinen um Proteinasen, also
eiweißspaltende Enzyme.
Die ersten Daten zu Cathepsinen in der Pankreatitis wurden am Cathepsin B erhoben, der
Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf dem Cathepsin L, im Folgenden werden beide Proteine
kurz vorgestellt.
1.6.1 Cathepsin B
Cathepsin B (OMIM 116810; Uniprot P07858; IUBMB EC 3.4.22.1) ist eine lysosomale
Cysteinpeptidase. Der offizielle Name des Gens nach HUGO Gene Nomenclature Committee
(HGNC) lautet CTSB.
Das Proenzym besteht aus 339 Aminosäuren und wird durch Abspaltung eines 62
Aminosäuren langen Propeptides aktiviert 35. Dieses Propeptid fungiert danach als Cathepsin
B Inhibitor und blockiert das aktive Zentrum des Cathepsin B 36 bei neutralem pH. Je
niedriger der pH, desto mehr dissoziiert diese Bindung und desto schwächer wird die
Inhibierung durch das Propeptid.
1.6.2 Cathepsin L
Cathepsin L (OMIM 116880; Uniprot P07711; IUBMB EC 3.4.22.15) ist eine lysosomale
Cysteinproteinase. Der offizielle Name des Gens nach HUGO Gene Nomenclature Committee
(HGNC) lautet CTSL. Die Hauptfunktion dieses Enzyms liegt in der intrazellulären
Proteindegradation.
Das Protein hat eine relative Molekülmasse (Mr) von 37.564. In der SDS Polyacrylamid Gel
Elektrophorese zeigt sich für Procathepsin L eine Masse von 38-41 kDa, 28 kDa für die
Einzelketten-Form, 24 kDa für die schwere Kette und ca. 4 kDa für die leichte Kette.
18
Preprocathepsin L ist ein Polypeptid von 333 Aminosäuren. Es setzt sich zusammen aus
einem Signalpeptid [Pre-] (p.1 – 17 Länge 17 AS), einem Aktivierungspeptid [-pro-] (p.18 –
113 Länge 96 AS), einer schweren Kette (p.114 – 288 Länge 175 AS), einem weiteren
Propeptid (p.289 – 291 Länge 3 AS) und einer leichten Kette (p.292 – 333 Länge 42 AS).
Die Schnittstelle zwischen leichter und schwerer Kette liegt bei Asn291-Asn. Es finden sich
drei Disulfidbrücken-Bindungen (Cys135/Cys178, Cys169/Cys211, Cys269/Cys322). Die
Aminosäuren Cys138, His276 und Asn300 sind von besonderer Bedeutung für die
katalytische Aktivität, sie bilden die aktiven Zentren. Der isoelektrische Punkt liegt für
Cathepsin L bei einem pH von 5,0-6,3.
1986 wurden erstmalig Teile der Aminosäuresequenz von Cathepsin L entschlüsselt37. Joseph
et al. 38 haben 1988 die vollständige Nukleotidsequenz von murinem und humanem
Cathepsin L beschrieben.
Das CTSL Gen liegt auf dem langen Arm des Chromosoms 9 in der Region 21.33. Es besteht
aus acht Exons und sieben Introns. Bislang wurden fünf unterschiedliche Splicevarianten mit
zwei unterschiedlichen Promotoren beschrieben, die unterschiedliche Expressionsraten
derselben Aminosäuresequenz zeigen39-42.
19
Abbildung 2 Splicevarianten von Cathepsin L Splicevarianten von Cathepsin L stark modifiziert nach Caserman43. Das CTSL Gen ist durch einen grauen Rahmen gekennzeichnet. In hellblau sind die Exone in rot die kodierenden Sequenzen dargestellt. Das erste Exon enthält keine kodierende Sequenz, somit liegt das Startcodon und die mit 1 gekennzeichnete kodierende Sequenz in Exon zwei. Die Variante hCATL-A umfasst das gesamte erste Exon. Die Varianten hCATL-A1, hCATL-A2 und hCATL-A3 unterscheiden sich von hCATL-A in der Länge von Exon 1. In 3‘ Richtung wird hier das Exon beim Spleißen unterschiedlich gekürzt. Die Variante hCATL-B startet von einem alternativen Promotor40 in Intron1 und ein Teil des Intron 1 (schwarzer Rahmen) wird transkribiert. CAVE! DARSTELLUNG IN GEBRÄUCHLICHER NOMENKLATUR DER PUBLIKATIONEN; WEICHT VON GENEBANK UND HGNC AB
Nach und nach wurden immer mehr der mannigfaltigen Funktionen und Interaktionen von
Cathepsin L aufgedeckt. Cathepsin L wurde zuerst in Lysosomen der Rattenleber
nachgewiesen, das L steht hierbei für die lysosomale Lokalisation 44. Bereits in den 70er
Jahren konnte auch eine Expression in maligne transformierten Zellen nachgewiesen
werden. In den ersten Experimenten konnte nur eine starke Expression eines Proteins
nachgewiesen werden, das man auf Grund seiner starken Expression in Tumorzellen MEP
(Major excreted polypeptide) taufte.
Noch bevor bekannt wurde, dass es sich bei MEP auch um Cathepsin L handelt 45 46, schlug
Gottesmann 1978 vor, MEP als Marker für maligne Entartung und die Kanzerogenität von
Zellen zu verwenden, da dieses Protein von vielen malignen Zellen überexprimiert wird.
Seitdem konnte in vielen Tumoren eine erhöhte Expression von CTSL nachgewiesen
werden47-49. Auch beim duktalen Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse konnte eine
Expression von CTSL im Tumor nachgewiesen werden, die bei erhöhtem Nachweis im
CTSL1 Gen
1 2 3 4 5 6 7
3001 4001 5001200110011
1
1
1
1
1
hCATL-A
hCATL-A1
hCATL-A2
hCATL-A3
hCATL-B
20
Resektat50 und bei erhöhtem Cathepsin L Serum Level51 mit schlechter Prognose assoziiert
ist.
In der akuten Pankreatitis fungiert Cathepsin L wahrscheinlich als Gegenspieler vom
Cathepsin B und inaktiviert Trypsinogen und Trypsin durch proteolytische Spaltung52 53.
1.6.3 Cathepsine in der Pankreatitis
In den pankreatischen Azinuszellen werden die Proteasen, so auch Trypsin, als inaktive
Vorstufen, sogenannte Zymogene synthetisiert, die durch Abspaltung eines Polypeptides
aktiviert werden. Die physiologische Aktivierung von Trypsin erfolgt erst nach Sekretion in
das Duodenum durch Enterokinase, ein Enzym, welches im Bürstensaum des Dünndarmes
lokalisiert ist54. Die Verdauungsenzyme werden als inaktive Proteasen in Zymogengranula
gespeichert und in ihrer inaktiven Form sezerniert. Außer den Verdauungsenzymen
produzieren die Azinuszellen, wenn auch in etwas geringerer Menge, unter anderem saure
Hydrolasen, die für die Zellhomöostase von Bedeutung sind. Zu den sauren Hydrolasen
zählen unter anderem Cathepsin B und Cathepsin L, die in Lysosomen sortiert werden.
Sowohl die sekretorischen Verdauungsenzyme als auch die lysosomalen Proteasen werden
in das raue Endoplasmatische Retikulum (ER) synthetisiert.
Die sekretorischen Enzyme werden dann über den Golgi Apparat in Vakuolen transportiert,
aus denen sich die Zymogengranula entwickeln. Eine Fusion dieser Zymogengranula mit der
apikalen Zellmembran der Azinuszellen führt zur Sekretion der enthaltenen Proteine.
Die lysosomalen Hydrolasen werden im Golgi Apparat über eine Mannose-6-Phosphat
Markierung55 in prälysosomale Kompartimente mit niedrigem pH sortiert56. Die Lysosomen
sind im Zusammenspiel mit anderen Zellorganellen wie z.B. den Endosomen, Phagosomen
und Autophagosomen an der Verwertung von Zellmetaboliten wie Kohlenhydraten, Fetten,
Eiweißen und Nukleinsäuren beteiligt57.
Im Rahmen einer akuten Pankreatitis kommt es bereits in frühen Stadien in den Azinuszellen
zu einer Sekretionsblockade und intrazellulären Aktivierung der digestiven Enzyme mit
einem konsekutiven Selbstverdau des Organes14. Eine besondere Rolle scheint hier dem
Trypsin zuzukommen, das die meisten anderen Proteasen im Pankreassekret aktivieren
kann58.
21
Eine Theorie, die verfrühte Aktivierung – also noch vor Sekretion in den Dünndarm – zu
erklären, ist die Kolokalisationshypothese59. Sie besagt, dass die im Pankreas produzierten
Proteasen mit lysosomalen Hydrolasen in zytoplasmatischen Vakuolen aufeinander treffen
und somit Trypsinogen z.B. durch CTSB aktiviert werden kann60.
Im gesunden Pankreas kommt die Aktivierung von Trypsinogen durch Cathepsin B schon
deswegen nicht zum Tragen, weil die Enzyme in unterschiedliche subzelluläre
Kompartimente verteilt werden.
In mehreren voneinander unabhängigen Studien konnte in unterschiedlichen Tiermodellen
der Pankreatitis gezeigt werden, dass diese Trennung in frühen Stadien der Pankreatitis
aufgehoben wird61-65. Während in den frühen Phasen der Pankreatitis weiterhin
Verdauungsenzyme gebildet werden, kommt es zu einem Stopp der Sekretion dieser Enzyme
aus den Azinuszellen. Die Kolokalisationshypothese wird von van Acker et al. als dreistufige
Hypothese zusammengefasst (übersetztes Zitat):
„(A) dass die Störung der normalen intrazellulären Sortierung von Verdauungs Zymogenen
und lysosomalen Hydrolasen ein sehr frühes Ereignis in der Entwicklung der Pankreatitis ist,
und daß in Folge dieser Störung, Verdauungsenzym Zymogene mit lysosomalen Hydrolasen
innerhalb von zytoplasmatischen Vakuolen der Azinuszellen kolokalisiert werden;
(B) dass als Ergebnis dieses Kolokalisierungsphänomens, die lysosomale Hydrolase Cathepsin
B (und höchstwahrscheinlich andere lysosomale Hydrolasen) Trypsinogen aktiviert und
Trypsin die anderen Zymogene aktiviert; und
(C) dass die Organellen, die intrazellulär aktivierte Verdauungs-Zymogene enthalten, fragil
werden und ihren Gehalt an aktivierten Enzymen in das Cytoplasma abgeben, wo diese
Enzyme Veränderungen auslösen, die zu Zellschädigung und -tod führen.“60
Möglicherweise tritt diese Kolokalisitation auch physiologisch im gesunden Pankreas auf,
Tooze et. al. beschreiben den Nachweis von Cathepsin B neben dem erwarteten Vorkommen
in Lysosomen in etwa halbierter Konzentration auch im sekretorischen Kompartiment des
gesunden Pankreas in der Ratte66. Neuere Daten zeigen, dass CTSB auch im sekretorischen
Kompartiment vorhanden ist und dort auch aktiviert wird. Eine Fusion ist nicht zwingend
nötig um Trypsinogen zu Trypsin zu aktivieren.52 Ebenso gibt es auch schon ältere Daten, die
aufzeigen, dass CTSB für eine Sekretion von Zymogenen essentiell ist und zusammen mit den
Zymogenen sekretiert wird. Dies ist zumindest ein sehr starker Hinweis darauf, dass sich
beide Enzyme im selben Kompartiment befinden.67 Es ist daher davon auszugehen, dass
22
noch weitere Mechanismen außer der räumlichen Verteilung der Enzyme an der Regulation
der Proteaseaktivierung beteiligt sind.
Die vorzeitige Aktivierung von Trypsinogen als Auslöser einer akuten Pankreatitis ist
insbesondere im Zusammenspiel mit Cathepsin B gut untersucht. Cathepsin B kann Trypsin
aktivieren68 69, die Gabe eines CTSB Inhibitors verringert die Trypsinaktivität und den
Schweregrad der experimentellen Pankreatitis in vitro70 und in vivo71. Bei CTSB -/- Mäusen
zeigt sich eine deutlich verringerte Trypsinaktivität mit weniger schwerem Verlauf der
experimentellen Pankreatitis72.
Ein weiteres Indiz für die zentrale Rolle von Trypsin in der Pankreatitis sind die Auswirkungen
von Mutationen im Trypsin. Autosomal dominante Trypsinogen Mutationen sind in den
meisten Fällen über eine vermehrte Trypsinaktivität mit einer Penetranz von bis zu 93 % 73
kausal an der Entstehung einer hereditären Pankreatitis beteiligt16.
Trypsinogen mit der p.N29I Mutation wird durch CTSB zweieinhalb bis dreimal so schnell
aktiviert, wie das Wildtyp Trypsinogen74. PRSS1 (kationisches Trypsinogen) mit der p.R122C
Mutation wird durch Cathepsin B langsamer aktiviert, als der Wildtyp 75, zeigt aber eine
verringerte Autolyse und eine verstärkte Autoaktivierung.
Zu der Aktivierung von mutiertem Trypsin durch Cathepsin B gibt es allerdings auch
widersprechende Daten, die darauf hinweisen, dass die häufigsten Mutationen im PRSS1
Gen keine veränderte Aktivierung durch Cathepsin B zur Folge haben76.
23
1.7 Zielsetzung
SPINK1 mit der N34S Mutation wird von Cathepsin L schneller degradiert, als die
Wildtypvariante. Nach unserer Hypothese könnte eine verstärkte Aktivität von Cathepsin L
zu einer noch schnelleren Degradation von SPINK1 führen und damit die Entstehung einer
Pankreatitis begünstigen. Eine herabgesetzte Aktivität von Cathepsin L könnte den Abbau
von SPINK1 verlangsamen und damit eine protektive Wirkung entfalten.
Eine wahrscheinliche Erklärung für eine Änderung der Aktivität von Cathepsin L wäre eine
Mutation auf DNA Ebene.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist herauszufinden, ob Mutationen im CTSL Gen die
Penetranz der Pankreatitis bei Trägern einer p.N34S Mutation beeinflussen.
Hierfür werden zunächst entsprechende Vergleichskollektive definiert. Es werden Patienten
mit einer p.N34S Mutation und idiopathischer Pankreatitis gegen gesunde Individuen mit
einer p.N34S Mutation verglichen.
Eine lokale Kohortenstudie wird für die p.N34S Mutation genotypisiert, um die lokale
Prävalenz zu bestimmen und aus den p.N34S+ Individuen die Kontrollgruppe ohne
Pankreatitis zu rekrutieren. Aus zwei deutschen Pankreasreferenzzentren werden die
p.N34S+ Patienten mit idiopathischer Pankreatitis rekrutiert, hierfür wird, sofern noch nicht
vorhanden, der p.N34S Mutationsstatus erhoben. Um Veränderungen in der enzymatischen
Aktivität durch eine Alteration der genomischen DNA (und somit eine veränderte
Genexpression oder eine Änderung der Aminosäuresequenz) zu detektieren, wurde die
gesamte exonische Sequenz mit Exon/Intron Übergängen, die 5‘ UTR sowie die ersten vier
Introns von Cathepsin L in beiden Gruppen untersucht. Hieraus ergeben sich die Kernfragen:
1. Gibt es in den beiden Kollektiven überhaupt genetische Alterationen im CTSL Gen?
2. Falls ja, sind diese zwischen den beiden Gruppen unterschiedlich verteilt? Gibt es eine
signifikante Häufung von CTSL-Sequenzvarianten bei Patienten mit Pankreatitis im Sinne
krankheitsprädispositionierender Mutationen? Oder gibt es eine signifikante Häufung von
CTSL-Sequenzvarianten bei gesunden Trägern der Spink1 p.N34S Mutation im Sinne
protektiver Mutationen?
3. Lässt sich aus den Varianten ein möglicher Effekt auf die CTSL-Aktivität ableiten?
24
2 Material und Methoden
2.1 Studienteilnehmer
Alle Studienteilnehmer haben nach erfolgter Aufklärung schriftlich in die Untersuchung
eingewilligt, im Falle von minderjährigen Patienten erfolgte die Zustimmung durch die
Eltern. Ein positives Ethikvotum liegt vor.
2.1.1 Patienten mit idiopathischer chronischer Pankreatitis und N34S Mutation im SPINK1
Von 1998 bis in das Jahr 2008 wurden Patienten mit Pankreatitis in zwei
Pankreasreferenzzentren (Münster und Greifswald) rekrutiert. Aus diesen wurde im
Rahmen dieser Arbeit das Patientenkollektiv mit idiopathischer chronischer Pankreatitis und
N34S Mutation im SPINK1 selektiert. Die Patienten mit Pankreatitis wurden durch TaqMan
Analyse auf Vorliegen der SPINK1 N34S Mutation genotypisiert. Die Identifikation der N34S
Träger per Realtime PCR wurde durch Sanger Sequenzierung validiert.
Die Diagnose der chronischen Pankreatitis umfasste neben wiederkehrenden
Entzündungsschüben (n>3), entsprechenden Laborwerten (Amylase oder Lipase > 3x oberer
Norm in der Entzündung) auch eindeutige Zeichen in der bildgebenden Diagnostik im
Ultraschall, dem endoskopischen Ultraschall (EUS), der Computertomographie (CT), der
Magnetresonanztomographie (MRT), der endoskopischen retrograden
Cholangiopankreatikographie (ERCP) oder der Magnetresonanz-
Cholangiopankreatikographie (MRCP). Eine idiopathische Pankreatitis wurde diagnostiziert,
wenn keine anderen Risikofaktoren identifiziert werden konnten.
Im Einzelnen ergeben sich hieraus folgende Ausschlusskriterien: Riskanter Alkoholkonsum
(Männer > 24g/d; Frauen >12g/d), die Anamnese oder der Nachweis von Gallensteinen,
Mutationen im Trypsin (PRSS1) und Hinweise auf chronische Lungenerkrankungen oder
direkte Hinweise auf zystische Fibrose.
Im Falle von mehreren betroffenen Familienangehörigen wurden alle bis auf den
Indexpatienten von der weiteren Analyse ausgeschlossen.
Die Genotypsierung für Trypsinmutationen erfolgte größtenteils per
Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) im Rahmen der Routinediagnostik und
war kein Bestandteil dieser Arbeit.
25
2.1.2 SPINK1 N34S Mutations-Träger ohne Pankreatitis
Um gesunde SPINK1 N34S Mutationsträger zu identifizieren, wurden die Probanden der
SHIP-Studie (Study of health in Pomerania)77 mit TaqMan Analysen auf N34S-Mutationen in
SPINK1 untersucht. Ausschlusskriterien für diese Studie waren eine Pankreatitis in der
Vorgeschichte sowie rezidivierende Bauchschmerzen und erhöhte Serum Lipase.
26
2.2 Material
2.2.1 Verbrauchsmaterialien
BigDye Sequencing Puffer (5x) Applied Biosystems® Life Technologies GmbH, Frankfurter Straße 129B, 64293, Darmstadt, Deutschland BigDye Terminator v3.1
Agencourt AMPure XP - PCR Purification Beckman Coulter GmbH, Europark Fichtenhain B 13, 47807, Krefeld, Deutschland Agencourt CleanSEQ - Dye Terminator
Removal Agarose (Roti®Garose) Carl Roth GmbH, Schoemperlenstraße 1, 76185 Karlsruhe,
Deutschland Ethanol PCR-Gefäße 0.2 mL, farblos Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH, Peter-Henlein-Straße 2,
50389, Wesseling/Berzdorf, Deutschland Safe-Lock Tubes, 0,5 mL Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Safe-Lock Tubes, 2.0 mL 6X DNA Loading Dye Fermentas UAB, V.Graiciuno 8, LT-02241 Vilnius, Litauen GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder GeneRuler™ DNA Ladder, Low Range PCR Master Mix (2X) 96-well Platten Greiner Bio-One GmbH, Maybachstraße 2, 72636
Frickenhausen, Deutschland Zentrifugenröhrchen, Spitzboden 15 ml, 50 ml ZR Genomic DNA II KitTM (Zymoresearch) Hiss Diagnostics GmbH, Tullastraße 70, 79108 Freiburg im
Breisgau, Deutschland Primer Invitrogen GmbH, Emmy-Noether Straße 10, 76131 Karlsruhe,
Deutschland Taq DNA Polymerase Kit QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, 40724 Hilden, Deutschland QIAamp® DNA Mini Kit QIAquick PCR Purification Kit FastRuler Low Range DNA Ladder Thermo Scientific™ molecular biology and protein biology
products, Fisher Scientific GmbH, Im Heiligen Feld 17, 58239 Schwerte, Deutschland
Tabelle 1 Verbrauchsmaterialien
2.2.2 Gebrauchslösungen
Agarose Gel Ladepuffer (6x) 0,25 % Bromphenolblau 0,25 % Xylocyanol 30 % Glycerol 50 mM EDTA Aqua dest.
TAE-Puffer 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA Aqua dest.
Tabelle 2 Gebrauchslösungen
27
2.2.3 Geräte
Electrophoresis Power Supply EPS 301 Transformator
Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Munzinger Str. 9, 79111, Freiburg im Breisgau, Deutschland
3130 XL Genetic Analyzer 16 Kapillar Sequencer
Applied Biosystems® Life Technologies GmbH, Frankfurter Straße 129B, 64293, Darmstadt, Deutschland 7500 Real-Time PCR System RT
Thermocycler 96-Well Magnet Beckman Coulter GmbH, Europark Fichtenhain B 13, 47807,
Krefeld, Germany
Beckman GS-6KR Kühlzentrifuge Biomek® 3000 Labratory Automation Workstation Labroboter Stuart® block heater SBH200D/3 Heizblock Bibby Scientific Limited (Group HQ), Beacon Road, Stone, ST15
OSA, Staffordshire, United Kingdom PowerPac Basic™ Power Supply Transformator für Agarosegele
BIO-RAD Laboratories GmbH, Heidemannstr. 164, 80939, München, Deutschland
CMC 2895 DS Mikrowelle Candy S.p.A., Via comolli 16, 20861, Brugherio (MB), Italien Mastercycler epgradient S Eppendorf AG, Barkhausenweg 1, 22339, Hamburg, Deutschland
Eppendorf Thermomixer compact Heizblock mit Schüttler 5415R Kühlzentrifuge 5417R Kühlzentrifuge 100 - 1000 µl Research® Pipette 12-Kanal Research® Pipette 2 – 20 µl Research® Pipette Pipette 20 - 200 µl Research® Pipette 8-Kanal Research® Pipette Multipette® Pipette LaminAir® HB2436 Sterilwerkbank Heraeus instruments GmbH, Postfach 1561, 63450, Hanau,
Deutschland Magnetrührer IKA®-Werke GmbH & CO KG, Janke & Kunkel-Str. 10, 79219,
Staufen, Deutschland
MS2 Minishaker Vortexer
UV-Transilluminator LTF - Labortechnik GmbH & CO KG, Hattnauer Str. 18 , 88142, Wasserburg (Bodensee), Deutschland
Feinwaage Explorer Pro Feinwage Ohaus Europe GmbH, Heuwinkelstrasse 3, CH-8606, Nänikon, Schweiz
Gel Wannen Agarosegelapparatur peqLab Biotechnologie GmbH - VWR International GmbH, Hilpertstraße 20a, 64295, Darmstadt, Deutschland
peqSTAR 96 Universal Gradient
Tabelle 3 Geräte
28
2.2.4 Software
Software Hersteller 7500 System Sequence detection Software 1.3.1
http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/support/software/real-time-pcr/ab-7500.html
Applied Biosystems
Acrobat XI Pro https://www.acrobat.com Adobe Biomek® Software 3.3 http://www.beckmancoulter.com Beckman Coulter Endnote X7 http://www.endnote.com Thomson Reuters Excel 2007 http://www.microsoftstore.com Microsoft Gentle 1.9.4 http://gentle.magnusmanske.de Magnus Manske GPower 3.1.9 http://www.gpower.hhu.de Heinrich Heine
Universität Düsseldorf
PHASE 2.1 http://stephenslab.uchicago.edu/software.html#phase University of Washington
Primer Blast http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ NCBI Prism 6.04 http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ GraphPad
Software Variant Reporter 1.1 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/
4385270 Applied Biosystems
Word 2007 http://www.microsoftstore.com Microsoft Χ²-Test http://www.tufts.edu/~mcourt01/Documents/Court lab -
HW calculator.xls Michael Court
Tabelle 4 Software
2.3 Methoden
2.3.1 DNA Extraktion
Die Gewinnung der DNA erfolgte aus EDTA Vollblutproben der Patienten mit Hilfe des
QIAamp® DNA Mini Kits entsprechend den Vorgaben des Herstellers. Die Blutproben wurden
zumeist frisch verarbeitet, andernfalls bei -20°C gelagert und zur weiteren Verarbeitung bei
Raumtemperatur aufgetaut.
Als erster Schritt wurden 1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäße mit 20 µl Proteinase K befüllt.
Diese wurden dann mit 200 µl Buffy Coat oder, im Falle einer Hämolyse, 200 µl Blut befüllt.
Nach Hinzugabe des Lysepuffers (Buffer AL) wurde das Reaktionsgefäß verschlossen und für
15 s auf dem Vortexer geschüttelt. Nach diesem mechanischen Lyseschritt erfolgte eine
Inkubation bei 56 °C im Heizblock für 10 Minuten. Zur Fällung der DNA wurden hierauf 200
µl hochreinen Alkohols (>96 %) hinzugefügt und erneut mit dem Vortexer vermischt. Die
Probe wurde dann in eine QIAamp Mini spin column überführt, die in einem
Eppendorfreaktionsgefäß platziert wurde. Mit einem Zentrifugationsschritt von 6.000 g für
eine Minute wurde die Probe durch die Säule in das Auffanggefäß überführt und die
Flüssigkeit verworfen. Die DNA bindet in diesem Schritt reversibel an der Säule. Zur weiteren
29
Aufreinigung erfolgte eine erneute Zentrifugation mit 6.000 g für eine Minute nach
Hinzugabe von 500 µl Waschpuffer (Buffer AW1) und eine dritte Zentrifugation nach
Hinzugabe des zweiten Waschpuffers (Buffer AW2) mit 20.000 g für drei Minuten. Die
Flüssigkeit wird erneut verworfen und die Probe in einem weiteren Zentrifugtionsschritt bei
höchster Umdrehungszahl getrocknet, um eine Verschleppung der Waschpuffer zu
vermeiden. Um die DNA von der Säule wieder zu lösen, erfolgte eine Inkubation über 5 min
bei Raumtemperatur mit dem Lösungspuffer (Buffer AE). Mit einem letzten
Zentrifugationsschritt bei 6.000 g für eine Minute wurde die DNA dann in
Eppendorfreaktionsgefäße überführt. Die Lagerung erfolgt bei -20 °C.
2.3.2 Gelelektrophorese
Zur Erfolgskontrolle der DNA Aufreinigung und der Polymerasekettenreaktionen wurden
Agarose Gelelektrophoresen durchgeführt. Das Prinzip einer Gelelektrophorese beruht auf
einem Molekularsiebeffekt des jeweiligen Gels. Die aufzutrennenden Moleküle, in diesem
Fall die DNA, können sich in Abhängigkeit von der Molekülgröße unterschiedlich schnell
durch das Gel bewegen. Um eine Bewegung durch das Gel zu induzieren, wird eine
elektrische Spannung angelegt. Die negativ geladene DNA bewegt sich in diesem Feld zur
Anode. Größere Moleküle bewegen sich langsamer als kleinere, somit ist eine Auftrennung
nach der Größe möglich.
Zum Nachweis der DNA enthalten die Agarosegele Ethidiumbromid, einen Farbstoff, der
zwischen den Basen der DNA interkaliert (lat. Intercalare = einschieben). Bei Anregung mit
UV-Licht verstärkt sich die Fluoreszenz von Ethidiumbromid nach Interkalation um den
Faktor ~ 75. Somit erscheinen DNA Moleküle gleicher Größe als leuchtende Bande im
Agarosegel. Je nach erwarteter Molekülgröße wurden für die Gele unterschiedliche
Agaroseanteile verwandt. Je höher der Agaroseanteil des Gels ist, desto langsamer wandern
die DNA-Moleküle.
2.3.3 Herstellung von Agarosegelen
Zur Herstellung von 1%igen Agarosegelen wurden ein Liter 1xTAE Puffer (Tabelle 2
Gebrauchslösungen) und 10 g Agarose (respektive 20 g für 2%ige Gele) in einer Mikrowelle
30
erhitzt und zu einer homogenen Flüssigkeit verrührt. Nach leichtem Abkühlen wurden 2 µl
Ethidiumbromid hinzugefügt.
Diese Flüssigkeit wurde in die Gelelektrophoresekammern gegossen und ist dort zu
Auftrennungsgelen ausgehärtet. Durch eingehängte Kämme wurden entsprechende
Geltaschen im Gel geformt, die der späteren Probenbeladung dienten. In den meisten Fällen
kamen 1%ige Agarosegele zum Einsatz, bei Molekülgrößen < 500 bp wurden regelhaft 2%ige
Agarosegele benutzt.
2.3.4 Beladung von Agarosegelen
Die Gele wurden in den Gelektrophoresekammern mit dem Laufpuffer (1x TAE Puffer)
übergossen und mit den entsprechenden PCR Produkten beladen. Der Kamm wurde
entfernt, nachdem die Kammer mit Puffer gefüllt wurde. Auf diese Weise werden Luftblasen
in den Kammern vermieden. Zur Größeneinordnung der PCR Produkte wurde immer ein
DNA-Marker mitgeführt.
2.3.5 Genotypisierung von Sequenzvarianten mittels TaqMan-Analyse
Die Genotypisierung dieser Studie basiert auf einem kommerziell zu erwerbenden Kit
(TaqMan® Assay C__11157434_10 von Applied Biosystems (jetzt lifeTechnologies)). Das
Grundprinzip der TaqMan® Assays ist die Ausnutzung des Förster-Resonanzenergietransfers78
79 (kurz FRET), manchmal auch Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer genannt. Wird ein
Fluorochrom mit Licht einer bestimmten Wellenlänge (A1) angeregt, emittiert es Licht mit
einer spezifischen Wellenlänge (E1). Die Anregungs- und Emissionsspektren sind individuelle
Charakteristika der Fluorochrome. Wenn E1 dem Anregungsspektrum eines zweiten
Fluorochromes (A2) entspricht, kann bei ausreichend niedrigem Abstand der Moleküle
zueinander die gesamte Energie vom zweiten Molekül in dessen Emissionsspektrum E2
umgewandelt werden. E1 wird in diesem Fall nicht mehr messbar emittiert. Beim TaqMan
Genotypisierungs-Assay kommen im Rahmen der PCR zusätzlich zu den Primern
sequenzspezifische Sonden zum Einsatz, die mit am 5‘-Ende und am 3‘-Ende jeweils mit
einem entsprechenden Fluorochrom gekoppelt sind. Das Emissionsspektrum des
Fluorochroms am 5‘-Ende (E1) entspricht dem Anregungsspektrum des Fluorochroms am 3‘-
Ende (A2). Durch die geringe Länge dieses Oligomeres liegen die beiden Fluorochrome im
31
Ausgangszustand dicht genug beieinander für den Förster-Resonanzenergietransfer. Das
Fluorochrom am 3‘-Ende wird hierbei als Quencher (engl. = Löscher) bezeichnet, da das
Emissionsspektrum (E2) außerhalb des detektierbaren Bereiches liegt. Es kommt also bei
Anregung nicht zu einer messbaren Fluoreszenz. Das 3‘-Ende der Sonde ist zudem durch ein
weiteres Molekül blockiert, damit die Sonde nicht als Primer fungieren kann. Wenn diese
Sonde nun im Annealing der PCR an die DNA bindet, wird sie durch die 5‘->3‘
Exonukleaseaktivität der DNA Polymerase abgebaut. Somit wird der vorher definierte
geringe Abstand des ersten Fluorochromes (Reporter) vom zweiten (Quencher) erhöht, was
in einer entsprechenden Fluoreszenz bei Anregung resultiert. Mit zwei unterschiedlichen
Reporter Fluorochromen, die jeweils an eine entsprechende Sonde gekoppelt sind, ist somit
die Unterscheidung zwischen zwei Allelen im Rahmen einer PCR-Reaktion möglich. Ein
weiteres drittes Fluorochrom, welches nicht an der Reaktion teilnimmt, dient als
Normalisierung, um eventuelle Volumenschwankungen – wie z.B. durch Pipettierfehler –
auszugleichen. Bei diesem Setting ist lediglich eine relative Quantifizierung notwendig, da
nur drei unterschiedliche Genotypen bestimmt werden (homozygot AA, heterozygot AB,
wildtype BB).
32
Abbildung 3 Schematische Darstellung des TaqMan Assays Modifiziert nach Abbildung des Herstellers. Die Sonden sind jeweils mit einem Farbstoff und einem Quencher markiert. Bei Anregung leuchtet VIC® grün und FAM™ blau. Bei intakter Sonde können jedoch weder grünes noch blaues Licht detektiert werden, da das emittierte Licht jeweils dem Anregungsspektrum des Quenchers entspricht, der durch wenige Nukleotide in räumlicher Nähe zu dem Farbstoff gehalten wird. Kommt es zum matching der Sonde im Rahmen der PCR wird durch die Exonuklease-Aktivität der DNA Polymerase die räumliche Verbindung von Farbstoff und Quencher aufgehoben.
2.3.6 Durchführung TaqMan Assay
Für ein Reaktionsvolumen von 5 µl wurden 0,25 µl TaqMan Genotyping Assay Mix mit 2,5 µl
Genotyping Master Mix und 2,25 µl Template DNA vermengt. Dies entspricht einer
Konzentration der Primer von 900 nM und der Proben von 250 nM bei ca. 1-10 ng DNA
Template.
Der Thermocycler (7500 Real-Time PCR System Applied Biosystems®) wurde mit folgendem
Protokoll programmiert: Beginn mit einem modifizierten Hot-Start (Aufheizen des Cyclers
auf 95°C und Pausieren bei dieser Temperatur). Nach Einsetzen der Proben dann 10 min
initiale Denaturierung bei 95°C und 40 Zyklen mit einer Denaturierung bei 95 °C für 15 s,
Annealing und Elongation bei 60 °C für 60 s. Dann wurde die Reaktion durch Abkühlen auf
4°C unterbrochen.
Bestandteile des TaqMan Assays
Denaturierte DNA und Bestandteile des Assays
Signalentstehung durch räumliche Trennung von Fluoreszenzfarbstoff und Quencher
G
Sonde
A
Sonde
G
SondeSense Primer
DNA Template
DNA Template
DNA Template
Antisense Primer
A
Sonde
A
Nicht komplementäre Sonde
Sense Primer
Antisense Primer
5'3' [C]
5'3'
3'5'[G]
[C]
CPassende Bindung
GSense Primer Neu synthetisierter Strang
P
P
P
V
V
VF
VIC® dye
FAM™ dye
Quencher
Minor Groove Binder
AmpliTaq Gold®DNA Polymerase, UP
V
P
F
Q
MGB
Q
Q
Q Q
F
F
33
2.3.6.1 Thermocyclerprotokoll für TaqMan PCR
Thermocycler 95°C " 95°C 10 min 95°C 15 s
40 Zyklen 60°C 60 s 04°C "
Tabelle 5 Genotypisierung TaqMan Thermocyclerprotokoll 7500 Real-Time PCR System Applied Biosystems® Life Technologies GmbH
2.3.6.2 Pipettierprotokoll für TaqMan PCR
Taq Man Genotyping Assay Mix 0,25 µl
Genotyping Master Mix 2,5 µl DNA Template 4 ng/µl 2,25 µl 5 µl
Tabelle 6 Genotypsierung TaqMan Reaktionsansatz Die Genotypisierung für die Spink N34S Mutation erfolgte mit dem TaqMan® Assay C__11157434_10.
34
2.3.7 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die Polymerasekettenreaktion ist ein Verfahren, um definierte Abschnitte der DNA zu
vervielfältigen. Sie basiert auf einer Reproduktion des DNA Doppelstranges anhand eines
DNA Einzelstranges. Um einen definierten DNA Abschnitt zu amplifizieren, benötigt man:
Spezifische Primer für beide Stränge der DNA, Desoxyribonukleosidtriphosphate, eine
Ausgangssequenz, die vervielfältigt wird und ein Enzym(DNA-Polymerase), welches diese
Reaktion ermöglicht. Das Protokoll besteht dann aus repetitiven Schritten mit spezifischer
Dauer und Temperatur. Das Grundprinzip ist hierbei immer ein Dreischritt aus
Denaturierung, Hybridisierung und Elongation. In der Denaturierungsphase wird die
doppelsträngige DNA durch Temperaturen um 95°C in Einzelstränge aufgetrennt. In der
Hypbridisierungsphase binden jetzt die Primer an die Einzelstränge, damit die DNA-
Polymerase in der folgenden Elongationsphase die DNA am 3‘-Ende des Primers
komplementär zu dem vorliegenden Einzelstrang fortschreiben kann.
2.3.8 Primerdesign
Das Primerdesign erfolgte mit der Software gentle (s. Tabelle 4 Software). Als
Referenzsequenz diente das NCBI RefSeq transcript NM_001912.4 contig/assembly
NC_000009. GC-reiche Regionen wurden bevorzugt ausgewählt, um eine hohe Spezifität zu
erreichen. Eine Kontrolle möglicher Fehlpaarungen (durch Sequenzhomologien) erfolgte mit
der Web Applikation Primer Blast vom NCBI (National Center for Biotechnology Information).
Die Primer wurden vom Hersteller (Invitrogen GmbH) als Lyophilisat geliefert, im Labor auf
eine Konzentration von 100 µmol/l eingestellt und bei -20°C gelagert.
35
2.3.9 Primersequenzen
Lokalisation Interne Bezeichnung Sequenz 5’UTR und Exon 1-2 92'08 CTSLPro-S1 5’-GGTGATTGTGCTTCTAAAAGAGTT-‘3 96'08 CTSLPro-AS1 5’-GGGTGCAGCTGGGCTTTAGA-‘3 93'08 CTSLPro-S2 5’-TCTAAAGCCCAGCTGCACCC-‘3 97'08 CTSLPro-AS2 5’-GGGCTGGTGCACACCTACTC-‘3 94'08 CTSLPro-S3 5’-GAGTAGGTGTGCACCAGCCC-‘3 98'08 hsCTSLPro-AS3 5’-CCATGTTGGCCAGGCTGGTC-‘3 95'08 CTSLPro-S4 5’-GACCAGCCTGGCCAACATGG-‘3 99'08 CTSLPro-AS4 5’-AAGGCAGCAAGGATGAGTGT-‘3 Exon 2-3 11'07 CTSB-CDS1-S 5’-CCTTGGCCTCTTCCACAGTCCTTGGG-‘3 12'07 CTSB-CDS1-AS 5’-CATCACCTGCCTGAATTCTTCACTGGTCT-‘3 Exon 4-5 13'07 CTSB-CDS2-S 5’-TGAACGCCTTTGGAGACATGGTAAGTGTGC-‘3 14'07 CTSB-CDS2-AS 5’-GCCTGGCTCAGCCTCCTAAAGGGC-‘3 Exon 6 15'07 CTSB-CDS3-S 5’-ACCCAGAGGTCTCATTGAAGAGACTGGAG-‘3 22'07 CTSB-CDS3-AS 5’-CTATGATGCTAAGCACCTAAATATCTACACT-‘3 Exon 7 23'07 CTSB-CDS4-S 5’-TAAATGAGAGCTTAAATCCCTGGCCTTCTTA-‘3 24'07 CTSB-CDS4-AS 5’-GGATGTCTTTGCAGCCAGATATGCCTCA-‘3 Exon 8 16'07 CTSB-CDS-5S 5’-TGGAGGCTGGGATGGAAATTATGTCCAGG-‘3 17'07 CTSB-CDS-5AS 5’-CACTCGGATCTTCAATGATTCGAGTGTGTA-‘3 Sequenzierungsprimer Exon 4 72'07 CTSL-34S 5’-CTGTGGACTGCCGAGCTCTG-‘3 76'07 CTSL-CDS3AS 5’-GACTTTGACAACAGCTCACACATC-‘3 Exon 5 75'07 CTSL-CDS4S 5’-GTGGATGACAGCTTTTTTTAATTCCC-‘3 71'07 CTSL-34AS 5’-GGGCTGGGATTACAGGCGTGAG-‘3 Exon 8 74'07 CTSL-5-S 5’-CAGGAACATTGCCTGTCCTGATTC-‘3 73'07 CTSL-5-AS 5’-GAGTGTGTATCCGACACAGCGG-‘3
Tabelle 7 Primer Primer für Amplifikation und Sequenzierung, die laborinterne Bezeichnung der Primer für die kodierende Sequenz enthält die in diesem Fall inkorrekte Bezeichnung CTSB-CDS. Aus Gründen der Konsistenz wurde diese Bezeichnung beibehalten.
2.3.10 Etablierung der Reaktionsbedingungen PCR
Vor Beginn der Amplifikation beider Kohorten wurden die PCR Protokolle getestet und
optimiert. Mit Hilfe eines Temperaturgradienten wurde die beste Annealing-Temperatur
bestimmt. Hierzu wurde die Annealing-Temperatur über die 96-Well Platte des
Thermocyclers mit einem von links nach rechts verlaufenden Gradienten beheizt, um die
optimale Annealing-Temperatur approximativ zu finden.
36
2.3.11 PCR Protokolle
Der Heizblock wurde jeweils vor Einsetzen der Proben auf die Denaturierungstemperatur
vorgeheizt und dann auf dieser Temperatur gehalten. Dies ist durch das Pause Symbol "
(typographisches Anführungszeichen) gekennzeichnet. Hierauf folgte regelhaft eine initiale
Denaturierung, dann der Hauptzyklus mit Denaturierung, Annealing und Elongation sowie
eine terminale Elongationsphase. Um weitere ungewollte Reaktionen zu vermindern, wurde
der Heizblock nach der PCR abgekühlt und bis zur Entnahme der Proben kühl gehalten.
Zur Qualitätskontrolle wurde auch bei jeder PCR mindestens ein None Template Control,
mitgeführt. In dieser ist keine DNA enthalten, so dass eine Amplifikation von DNA in der NTC
auf eine Verunreinigung, genauer gesagt auf eine Kontamination mit DNA, schließen lässt.
Ausgenommen hiervon sind kleinste DNA Bruchstücke, die unter entsprechenden PCR
Bedingungen auch aus Primerdimeren entstehen können.
2.3.11.1 PCR Protokoll
Temperatur Zeit Zyklen Hot Start 95°C " Intiale Denaturierung 95°C 5 min Denaturierung 95°C 30-35 s }
} 35-40 Zyklen }
Annealing 55,4-70°C 30-45 s Elongation 70-72°C 1:10-2 min Terminale Elongation 72° 5 min Kühlung 04°C " Tabelle 8 Amplifikation Thermocyclerprotokoll Allgemein Die Zeiten, Temperaturen und Zyklenzahl wurde jeweils für die entsprechenden Abschnitte optimiert.
2.3.12 Durchführung Amplifikation
Die Amplifikations PCRs wurden auf einem peqSTAR 96 Universal Gradient (peqLab
Biotechnologie GmbH) oder einem Mastercycler epgradient S (Eppendorf Vertrieb
Deutschland GmbH) mit dem Qiagen Taq DNA Polymerase Kit oder Fermentas 2x PCR
Mastermix nach unten stehenden Protokollen mit durchgeführt. Für den Fall einer
unzureichenden Spezifität und bei der Amplifikation des Promotors wurde die Konzentration
der Template DNA verdoppelt und die Konzentration der Primer um 25 % reduziert.
37
2.3.12.1 Pipettierprotokoll für Amplifikations PCRs Qiagen
Endkonzentration H2O 39,5 µl Qiagen PCR Puffer (10x) 5 µl 1x Sense Primer 1 µl 2 nM Anti-S Primer 1 µl 2 nM dNTPs 1 µl 0,2 mM (jeweils) Taq-Polymerase 0,5 µl 2,5 U DNA Template ~2 µl 5 – 50 ng 50 µl
Tabelle 9 Amplifikation Reaktionsansatz Qiagen
2.3.12.2 Pipettierprotokoll für Amplifikations PCRs
Fermentas 2x PCR Mastermix 12,5 µl
Primer Sense 100 µmol/l 1 µl Primer Antisense 100 µmol/l 1 µl H2O 9,5 µl Template DNA 30 ng/µl 1 µl
25 µl Tabelle 10 Amplifikation Reaktionsansatz Fermentas 2x Master
2.3.12.3 Alternatives Pipettierprotokoll für Amplifikations PCRs
Fermentas 2x PCR Mastermix 12,5 µl
Primer Sense 100 µmol/l 0,75 µl Primer Antisense 100 µmol/l 0,75 µl H2O 9 µl Template DNA 30 ng/µl 2 µl
25 µl Tabelle 11 Amplifikation alternativer Reaktionsansatz 2x Master
2.3.13 Aufreinigung der PCR Produkte
Um die amplifizierte DNA als Template für die weitere folgende Sequenzierungsreaktion zu
nutzen, erfolgte eine Aufreinigung mittels alkoholischer Fällung unter Nutzung magnetischer
Mikropartikel, Agencourt AMPure von Beckman Coulter nach den Anweisungen des
Herstellers. Das Prinzip entspricht der Aufreinigung der Sequenzierungsreaktion und wird für
diese im Folgenden genauer beschrieben.
38
2.3.14 Sequenzierungsreaktion
Abbildung 4 Adenosintriphosphat (ATP) protoniert Ribonukleosidtriphosphat, die 5‘-OH-Gruppe ist mit drei Phosphatgruppen verestert. An dem C1‘ Atom findet sich Adenin, die Pentose ist in diesem Fall Ribose, sowohl am C2‘- als auch am C3‘-Atom findet sich eine Hydroxygruppe. Aus diesen Bausteinen wird die RNA gebildet, wobei zwei Phosphatrese lediglich als Energiespeicher dienen und beim Anbau abgespalten werden. Der Phosphatrest an der 5’-OH-Gruppe bindet kovalent an die 3‘-Hydroxygruppe des vorherigen Nukleosids.
Abbildung 5 Desoxyadenosintriphosphat (dATP) protoniert Desoxyribonukleosidtriphosphat, die 5‘-OH-Gruppe ist mit drei Phosphatgruppen verestert. An dem C1‘ Atom findet sich Adenin, die Pentose ist in diesem Fall Desoxyribose, am C3‘-Atom findet sich eine Hydroxygruppe, am C2‘-Atom fehlt ein Sauerstoffatom (Desoxy-). Aus diesen Bausteinen wird die DNA gebildet, wobei zwei Phosphatrese lediglich als Energiespeicher dienen und beim Anbau abgespalten werden. Der Phosphatrest an der 5’-OH-Gruppe bindet kovalent an die 3‘-Hydroxygruppe des vorherigen Nukleosids.
Abbildung 6 Didesoxyadenosintriphosphat (ddATP) protoniert Desoxyribonukleosidtriphosphat, die 5‘-OH-Gruppe ist mit drei Phosphatgruppen verestert. An dem C1‘ Atom findet sich Adenin, die Pentose ist in diesem Fall Desoxyribose, am C3‘-Atom findet sich eine Hydroxygruppe, am C2‘-Atom und am C3‘Atom fehlt jeweils ein Sauerstoffatom (Didesoxy-). Bei dem Einbau von Didesoxynukleosiden kommt es zu einem Kettenabbruch, da die Hydroxygruppe an C3‘ fehlt, an der das nächste Nukleosid angebaut werden würde.
Die Sequenzierung erfolgte nach der Kettenabbruchmethode nach Sanger80. Es handelt sich
bei der Sequenzierreaktion um eine modifizierte PCR. Hierbei werden zum Reaktionsansatz
2’,3’-Didesoxynucleosidtriphosphate hinzugefügt. Die Untersuchung des CTSL erfolgte auf
einen 16 Kapillar Sequencer (3130 XL 16 Kapillar Sequencer Applied Biosystems).
Die Sequenzierungsreaktion erfolgte mit dem BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit
von Applied Biosystems nach folgendem Ansatz: Für ein Reaktionsvolumen von 10 µl wurden
39
5,45 µl H2O mit 2 µl Sequenzierungspuffer, 0,3 µl (0,1 mM) Sequenzierungs Primer, 0,25 µl
RR-Premix (Applie Biosystems) und ~ 2µl Template DNA vermengt. Dies entspricht einer
Konzentration des Primers von 0,003 mM und ~ 5-50 ng DNA Template.
Sequenzierung Endkonzentration H2O 5,45 µl Puffer 2 µl Seq-Primer 0,3 µl 3 nM RR-Premix (40x) 0,25 µl 1 x DNA Template ~2 µl PCR 5 – 50 ng 10 µl
Tabelle 12 Sequenzierung Reaktionsansatz
Der Thermocycler wurde mit folgendem Protokoll programmiert: Beginn mit einem
modifizierten Hot-Start (Aufheizen des Cyclers auf 96°C und pausieren bei dieser
Temperatur). Nach Einsetzen der Proben dann 2 min initiale Denaturierung bei 96°C und 30
Zyklen mit einer Denaturierung bei 96°C für 10 s, Annealing bei 50°C für 10s und einer
Elongation bei 60°C für 3 min. Dieser Zyklus wurde 30-mal wiederholt, dann wurde die
Reaktion durch Abkühlen auf 4°C beendet.
Thermocycler 96°C " 96°C 2 min 96°C 10 s
30 Zyklen 50°C 10 s 60°C 3 min 04°C "
Tabelle 13 Sequenzierung Thermocyclerprotokoll
2.3.15 Aufreinigung der Sequenzierungsreaktion
Die Aufreinigung der Sequenzierungsreaktion erfolgte mittels Agencourt CleanSEQ - Dye
Terminator Removal von Beckman Coulter GmbH nach dem Herstellerprotokoll.
Zuerst wurde die CleanSEQ-Lösung auf Raumtemperatur (RT) gebracht (Lagerung bei 4°C)
und vollständig resuspendiert. Danach wurden zu jedem Reaktionsvolumen aus der
vorangegangenen Sequenzierungsreaktion je 10 µl CleanSEQ hinzugefügt. Danach wurde die
DNA mit 42 µl 85%-Ethanol gefällt. Der Ansatz wurde dann bis zur vollständigen
Homogenität gemischt und danach für mindestens 3 min auf der Magnetplatte inkubiert.
Durch die Ethanolfällung bindet die DNA in diesem Schritt an die magnetic Beads, die sich
wiederum durch die Magnetplatte an der Außenwand der Reaktionsgefäße sammeln. Die
40
nun klare Lösung wurde abpipettiert und verworfen. Es erfolgte ein zweiter Waschschritt mit
30 s Inkubation von 100 µl 85%-Ethanol, der anschließend abpipettiert wurde. Danach
wurde das Reaktionsgefäß bei RT ca. 10 min getrocknet. Nach dem vollständigen Trocknen
des Alkohols wurden 60 µl Wasser dispensiert, es erfolgte eine erneute manuelle
Durchmischung mit der Pipette und 3-5 min Inkubation bei RT. In diesem Schritt wurde die
DNA wieder von den Beads gelöst. Der Ansatz wurde dann wieder für ca. 3 min auf der
Magnetplatte inkubiert und danach 40 µl des klaren Eluats in eine neue Auftragsplatte
transferiert. Ein Restvolumen von Wasser in der Platte verhindert den Transfer von
magnetischen Beads in die Auftragsplatte.
Diese Schritte erfolgten entweder von Hand mit einer 12-Kanal Pipette von Eppendorf oder
mit Hilfe eines Laborroboters (Beckman Coulter Biomek 3000).
Abbildung 7 Agencourt CleanSEQ Schematische Darstellung des Aufreinigungsprozesses, Abbildung des Herstellers.
2.3.16 Auswertung der Sequenzierung
Die Elektropherogramme wurden mit Variant Reporter® Software v1.1 zuerst einer strengen
Qualitätskontrolle unterzogen, danach erfolgte das Alignment an die Referenzsequenz für
Cathepsin L.
Zur Qualitätskontrolle erfolgte die automatische Auswertung der Signal to noise Ratio der
Elektropherogramme. In der Nomenklatur der benutzten Software (Variant Reporter)
handelt es sich hierbei um den PUP (peak under peak) Score. Hierbei wird das Verhältnis der
Signalstärke der gewerteten Base zum zweithöchsten Peak berechnet. Alle
Elektropherogramme mit einem Wert < 4 wurden von der weiteren Untersuchung
ausgeschlossen und die Sequenzierung wiederholt.
Weiterhin wurde die durchschnittliche Qualität der einzelnen Basecalls (automatischen
Zuordnungen des optischen Signals zu einer DNA Base) ausgewertet. Jeder Base wurde ein
Qualtitätswert (QV = Quality Value) zugeordnet. Für diesen Wert gilt Quality Value (QV) = -
41
10Log10 Pe (Pe = Probability of error). Bei einem QV von 20 ist mit einer
Fehlerwahrscheinlichkeit von ca. 1 % zu rechnen.
Für die Elektropherogramme wurde aus dem QV der einzelnen Basen im weiterverwendeten
Anteil des Elektropherogrammes dann ein Durchschnittswert errechnet, der sogenannte
Trace Score. Elektropherogramme mit einem Trace Score < 25 entsprechend einer
durchschnittlichen Fehlerwahrscheinlichkeit von > 0,31 % wurden von der weiteren
Untersuchung ausgeschlossen und die Sequenzierung wiederholt.
Auch die erreichte Leseweite wurde automatisiert ausgewertet. In Variant Reporter wird
durch Softwarealgorithmen der Anfang und das Ende des Elektropherogrammes von der
weiteren Analyse ausgeschlossen, wenn die Sequenzierungsqualität zu schlecht ist. Für den
Fall, dass durch dieses sogenannte Trimming die erwartete Leseweite um mehr als 50 %
unterschritten wurde, wurden die entsprechenden Elektropherogramme von der weiteren
Untersuchung ausgeschlossen und die Sequenzierung wiederholt.
Alle Elektropherogramme wurden von einem Untersucher gesichtet, alle gefundenen
Varianten wurden zudem durch mindestens zwei unabhängige Untersucher bestätigt. Für
den Fall, dass in erster Sichtung die Genotypisierung nicht sicher möglich war, wurden die
zuvor ausgefilterten Elektropherogramme gesichtet und in die Entscheidung einbezogen,
sofern die entsprechenden Teilabschnitte von ausreichender Qualität waren. Bei nicht
ausreichender Qualität oder nicht übereinstimmender Bewertung durch die auswertenden
Untersucher wurde die Sequenzierung wiederholt.
Die Daten wurden pseudonymisiert ausgewertet, zu internen Kontrollzwecken wurden fünf
zufällig ausgewählte Patienten zweimal in die Sequenzierung einbezogen. Hier ergaben sich
keine widersprüchlichen Daten.
42
2.3.17 Promotor Analyse
Um potentielle Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren zu identifizieren führten wir eine
Analyse der sequenzierten 5‘ Region mittels Mapper281 82 durch. Die Variablen wurden wie
folgt definiert:
Gene: CTSL (cathepsin L1)
Gene ID: 1514 mRNA accession: NM_001912
Organism: Homo sapiens
Scanned region: 3000bp upstream of transcript start
Models: JASPAR models, MAPPER models, TRANSFAC models
Tabelle 14 Mapper2 Variablen
Entsprechend den Empfehlungen der Entwickler wurde ein Schwellenwert oberhalb der
neunzigsten Perzentile ausgewählt, um zu viele Falschpositive zu vermeiden.
In einem weiteren Ansatz wurden die gefundenen SNPs noch mit dem rSNPs MAPPER
untersucht. Die gefundenen potentiellen Bindungsstellen wurden dann in die
Referenzsequenz in gentle übertragen und auf Überschneidungen mit den gefundenen
Varianten geprüft.
43
2.4 Statistik
Für alle Varianten wurden die Verteilungen im dominanten und im rezessiven Modell
untersucht. Bei dem dominanten Modell wurde die Anzahl der Mutationsträger (homozygot
mutierte + heterozygot Mutierte) gegen die Anzahl der Wildtypen gerechnet. Im rezessiven
Modell wurde die Anzahl der homozygot Mutierten gegen Heterozygote + Wildtypen
gerechnet. Des Weiteren wurde die Allelhäufigkeit und deren Verteilung berechnet.
Aufgrund der niedrigen Fallzahlen wurden die p-Werte mit dem Fisher’s exact test83
berechnet. Die Berechnung erfolgte mit der Statistiksoftware Prism 6.04 (GraphPad
Software, Inc.). Geprüft wurde zuerst auf dem Signifikanzniveau α = 0,05. Für den Fall, dass
ein P < 0,05 errechnet wurde, erfolgte aufgrund multipler Testung noch eine Bonferroni
Korrektur.
Ferner wurde für alle Verteilungen der häufigen Varianten – definiert als Minor Allel
Frequenz (MAF) > 5 % – geprüft, ob sie im Hardy-Weinberg-Equilibrium liegen. Dies erfolgte
mit Excel 2007 (Microsoft) als Χ²-Test mit der frei zugänglichen Software von Michael Court
(s. Tabelle 4 Software).
2.4.1 Haplotypenanalyse
Auf der Basis der häufigen Varianten (MAF > 5 %) wurde mit der Software PHASE 2.184 85 eine
Haplotypenanalyse erstellt. Diese Analyse bezieht sich somit auf die 8 häufigsten Varianten
in dieser Untersuchung (Vergleiche Tabelle 18). Des Weiteren wurde mittels
Permutationstest nach signifikanten Unterschieden zwischen den Haplotypfrequenzen in der
Patienten- und der Kontrollgruppe gesucht. Mit Hilfe von PHASE 2.1 wurde die Null-
Hypothese, dass Patienten und Kontrollen einer zufälligen Stichprobe aus einer
Gesamtmenge entstammen, gegen die Alternative, dass die Patienten sich untereinander
mehr ähneln als den Kontrollen, getestet. Unter der Berücksichtigung von Ähnlichkeiten von
Haplotypen kann dieser Test noch Unterschiede detektieren, wenn die errechneten
Haplotypen sich alle voneinander unterscheiden und ist damit dem Vergleich von rein
dichotom unterschiedenen gleichen oder eben ungleichen Haplotypen überlegen.
44
2.4.2 Powerberechnung
Die Powerberechnung erfolgte mit GPOWER 3.1.9 86 87 als nachträgliche Testung der
erreichten Power.
45
3 Ergebnisse
Die Hypothese dieser Arbeit ist, dass Mutationen im Cathepsin L Gen die Penetranz der
Pankreatitis bei Trägern der N34S Mutation im SPINK1 modifizieren. Hierfür wurden N34S
Mutationsträger mit dem Phänotyp „chronisch idiopathische Pankreatitis“ gegen Individuen
mit dem Phänotyp „keine Pankreatitis“ für Mutationen im Cathepsin L Gen genotypisiert und
die Häufigkeitsverteilung von Mutationen verglichen.
3.1 Studienteilnehmer
Für den Phänotypen „chronisch idiopathische Pankreatitis“ wurden 2299 Patienten mit
Pankreatitis untersucht. Durch Nachweis einer chronischen Pankreatitis, Ausschluss von
anderen möglichen Ursachen einer Pankreatitis und Genotypisierung für die Spink1 N34S
Mutation verblieben in der Patienten Kohorte 68 Individuen (8-86 Jahre, Durchschnittsalter
33,32 Jahre, 64,7% männlich).
Die Kontrollgruppe mit dem Phänotyp „keine Pankreatitis“ wurde aus der SHIP-0 Kohorte
rekrutiert. Diese umfasst 4308 freiwillige Teilnehmer (2008 hiervon männlich,
Altersverteilung 20–81 Jahre) mit deutscher Staatsbürgerschaft und europäischer
Abstammung aus Mecklenburg Vorpommern. Unter 4308 Individuen fanden sich insgesamt
68 Merkmalsträger mit einer p.N34S Mutation im SPINK1, ohne Anamnese von
rezidivierenden Bauchschmerzen oder Pankreatitis. Dies entspricht einer Prävalenz von
1,6%.
Die Genotypisierung beider Kollektive für die p.N34S Mutation im SPINK1 wurde mit einer
TaqMan Analyse durchgeführt.
46
3.1.1 Amplifikations PCR Etablierung und Optimierung
Für den Vergleich der Mutationen im Cathepsin L wurde das Gen bidirektional sequenziert.
Hierfür wurden zunächst die Amplifikations PCRs etabliert. Die optimalen
Annealingtemperaturen für die jeweiligen Primer wurden mittels Temperaturgradienten PCR
bestimmt (Siehe Abbildung 8).
T in °C 50,00 51,82 53,64 55,45 57,27 59,09 60,91 62,73 64,55 66,36 68,18 70,00
DNA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 001 A
002 B 003 C 004 D 005 E 006 F 007 G NTC H Abbildung 8 Skizze Plattenbelegung für Annealing-Gradienten
Schematische Darstellung einer 96-Well plate mit Temperaturgradienten und sieben unterschiedlichen Ausgangs-DNAs, um die optimale Annealing-Temperatur zu bestimmen.
Ein beispielhaftes Versuchsergebnis für die Auswertung einer Temperaturgradienten PCR
zeigt Abbildung 9. Aus dem Bild geht hervor, dass der optimale Ertrag zwischen den
Laufreihen aus Geltasche 9 bis 11 liegt. Basierend auf diesem Ergebnis wurde als
Annealingtemperatur 66°C gewählt, was in etwa Lane 10 (rechnerisch 66,36 °C, bei
kontinuierlichem Gradienten) entspricht.
1500
850
400
200
50
47
Abbildung 9 Agarosegel Annealing-Gradient Experimentelles Ergebnis zu Abbildung 8 1% Agarose Gel, 70 V, 45 min Laufzeit in 1xTAE Puffer. Belegung: In der ersten Lane ist der Größenstandard (FastRuler Low Range DNA Ladder, Größe in bp jeweils unter der Bande) aufgetragen, gefolgt von dem Cathepsin L Fragment 5 (beinhaltet Exon 8, Primer 16’07 & 17’07, Lane 1-12; 411 bp). Ganz rechts ist eine Non Template Control (NTC) aufgetragen. Von Lane 1 mit 50 °C steigt die Temperatur bis Lane 12 mit 70 °C kontinuierlich an.
Die Ergebnisse dieser Etablierung sind die in der folgenden Tabelle 15 PCR Bedingungen zur
Amplifikation zusammengefassten Protokolle.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1500
850
400
200
50
48
Amplikon Annealing Elongation Zyklen Genomischer Kontext
5‘ UTR 55,4°C* 70°C# 35
PCR mit den Primern 92‘08 & 99‘08, Promotorfragment 2689
bp, umfasst den Bereich 1115 bp upstream von Exon 1, Exon 1
und Intron 1 sowie die entsprechenden Exon-Intron
Übergänge bis Beginn Exon 2.
1 69°C 72°C 35
PCR mit den Primern 11’07 & 12’07, Fragment 1 833 bp,
umfasst Exon 2 und 3 sowie die entsprechenden Exon-Intron
Übergänge. Intron 2 und 3 werden vollständig erfasst, lediglich
die letzten beiden Basen von Intron 3 werden vom Primer
überlappt, diese werden in dem Fragment 2a mit abgebildet.
2a 70°C 72°C 40
PCR mit den Primern 13’07 & 14’07, Fragment 2a 831 bp,
umfasst Exon 4 und 5 sowie die entsprechenden Exon-Intron
Übergänge. Intron 3 und 4 werden vollständig mit erfasst,
wobei der Primer die ersten 10 bp des Introns überlappt. Diese
sind in Fragment 1 mit erfasst. Von Intron 5 werden die ersten
127 bp erfasst. Da die Sequenzierung von Exon 5 in Sense
Richtung an einem Poly-A Signal zwischen Exon 4 und 5 immer
wieder artefaktbehaftet war, und diese Artefakte am ehesten
auf die Amplifikations PCR zurückzuführen waren, erfolgte eine
erneute Amplifikation von Exon 5 mit einem Sense Primer
downstream des Poly A Signals (s. Fragment 2b).
2b 58,3°C 72°C 30
PCR mit den Primern 75’07 & 14’07, Fragment 2b 409 bp,
umfasst Exon 5 sowie die entsprechenden Exon-Intron
Übergänge. Von Intron 5 werden die ersten 127 bp erfasst.
3 61°C 72°C 30
PCR mit den Primern 15’07 & 22’07, Fragment 3 484 bp,
umfasst Exon 6 sowie die entsprechenden Exon-Intron
Übergänge (172 bp upstream und 89 bp downstream von
Exon6).
4 66°C 72°C 30
PCR mit den Primern 23’07 & 24’07, Fragment 4 558 bp,
umfasst Exon 7 sowie die entsprechenden Exon-Intron
Übergänge (136 bp upstream und 245 bp downstream von
Exon7).
5 66°C 72°C 30
PCR mit den Primern 16’07 & 17’07, Fragment 5 411 bp,
umfasst Exon 8 sowie die entsprechenden Exon-Intron
Übergänge (160 bp upstream von Exon8 und 92 bp
downstream der kodierenden Sequenz).
Tabelle 15 PCR Bedingungen zur Amplifikation Ausgehend von den gleichen Grundeinstellungen waren in der Annealingzeit (45 s) und in der Elongationszeit (Elongation 70 s) nur in der Amplifikation des Promotorfragmentes Abweichungen notwendig.*Annealingzeit 30s, #Elongation 120s
49
3.2 PCR zur Amplifikation und Sequenzierung
Mit den etablierten PCR Protokollen erfolgte dann die die Amplifikation und Sequenzierung
des Cathepsin L Gens.
Die Primer 11’07 bis 24‘07 umfassen die komplette codierende Sequenz des Cathepsin L
Genes. Diese initial gewählten Primer waren zur Amplifikation und Sequenzierung der
entsprechenden DNA Abschnitte geplant (Vergl. Abbildung 10), in der Abbildung sind diese
oberhalb der codierenden Regionen dargestellt. In den meisten Fällen konnten für die
Amplifikation und die Sequenzierung dieselben Primer eingesetzt werden.
Bei den Amplifikationsfragmenten 2 (Exon vier und fünf) und Fragment 5 (Exon acht) waren
die Leseweite und Sequenzierungsqualität unter Nutzung der Amplifikationsprimer zur
Sequenzierung nicht ausreichend. Durch neu designte, weiter innen liegende
Sequenzierungsprimer konnte dieses Problem gelöst werden.
Das Fragment 5 wurde mit den Primern 73’07 und 74’07 erfolgreich sequenziert. Ein
weiteres Problem ergab sich in der Sequenzierung von Fragment 2. Bei der Nutzung der neu
designten Sequenzierungsprimer 72’07 und 71’07 war die Leseweite in der Sequenzierung
weiterhin nicht ausreichend.
Bei den Exons vier und fünf liegt zwischen der kodierenden Sequenz 3 und 4 ein Poly-A
Signal, ab dem sich in beide Richtungen trotz sehr umfangreicher Modifikation der
Reaktionsbedingungen und -ansätze reproduzierbare Lesefehler ergaben. Mit den
Sequenzierungsprimern 75’07 und 76’07 und einer jeweils einzelnen Amplifikation der
kodierenden Sequenz 4 mit den Primern 75’07 und 14’07 konnte auch dieses Problem gelöst
werden (vergl. Abbildung 10).
Abbildung 10 Primer für die kodierende Sequenz Das CTSL Gen ist durch einen grauen Rahmen gekennzeichnet. In hellblau sind die Exone, in rot die kodierenden Sequenzen dargestellt. Das erste Exon enthält keine kodierende Sequenz, somit liegt das Startcodon und die mit 1 gekennzeichnete kodierende Sequenz in Exon zwei. Die dünnen schwarzen Pfeile repräsentieren die Primer.
CTSL1 Gen
1 2 3 4 5 6 7
3001 4001 5001200110011
75‘07
76‘07 73‘07
74‘07
71‘07
72‘07
22‘07
23‘07
24‘07 17‘0714‘07 15‘07 16‘0711‘07
12‘07
13‘07
50
Zur Detektion von möglicherweise expressionsmodifizierenden Mutationen wurde die
Sequenzierung um die 5’UTR des Cathepsin L Gens erweitert.
Die Primer 92‘08 bis 99‘08 umfassen die 5‘UTR sowie das nicht kodierende Exon eins, Teile
von Exon zwei und das erste Intron.
Im Bereich des Promotors und des ersten Introns konnte die Effizienz deutlich gesteigert
werden, indem mit den Primern 92’08 und 99’08 eine PCR von 2689 Basenpaaren etabliert
werden konnte. Somit war mit einer Amplifikationsreaktion ein Template für acht
Sequenzierungsreaktionen erzeugt (Vergl. Abbildung 12 Agarosegel Promotorfragment).
Zur Sequenzierung dieses Amplikons wurden zusätzlich zu den o.g. sechs weitere Primer
93’08 bis 98’08 eingesetzt. Somit ergaben sich vier Teilstücke von einer jeweiligen Länge von
ca. 670 bp. Teilweise waren höhere Leseweiten möglich, was durch Überlappung zu erhöhter
Redundanz verringerter Fehlerwahrscheinlichkeit führte.
Abbildung 11 Primer Promotor und Intron1 Das CTSL Gen ist durch einen grauen Rahmen gekennzeichnet. In hellblau sind die Exone, in rot die kodierenden Sequenzen dargestellt. Die kurzen schwarzen Pfeile markieren den Startpunkt der Primer, die langen schwarzen Pfeile markieren die Amplifikationsstrecke der Primer 92’08 (Sense) und 99’08 (Antisense).
CTSL1 Gen
3001 4001 5001200110011
1 2 3 4 5 6 7
-100192‘08 93‘08 94‘08 95‘08
96‘08 97‘08 98‘08 99‘08
51
Nach Amplifikation erfolgte immer eine Qualitätskontrolle der PCR auf einem Agarosegel vor
Aufreinigung und Sequenzierungsreaktion. Beispielhaft sei hier die Amplifikationskontrolle
des Promotorbereiches gezeigt. Die Helligkeit der DNA Banden lässt auf eine gute Ausbeute
schließen. Die Spezifität der Reaktion ist daran zu erkennen, dass sich nur eine distinkte
Bande zeigt.
Abbildung 12 Agarosegel Promotorfragment 1% Agarose Gel, 70 V, 45 min Laufzeit in 1xTAE Puffer. Belegung: In der ersten Lane ist der Größenstandard (GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder) aufgetragen, gefolgt von dem Promotorfragment von 12 unterschiedlichen Probanden, welches zur Sequenzierung amplifiziert wurde (Lane 1-12; 2689 bp).
3.3 Varianten im CTSL
Es wurden alle kodierenden Abschnitte, der gesamte Bereich mit beschriebener Promotor-
Aktivität sowie flankierende Exon-Intron Übergänge des CTSL Gens bei 68 Patienten mit
chronischer idiopathischer Pankreatitis und 68 Kontrollen mit N34S Mutation im SPINK1 Gen
ohne Pankreatitis bidirektional sequenziert.
Insgesamt konnten bei der Sequenzierung 22 unterschiedliche Varianten detektiert werden.
Von den gefundenen Varianten kamen 14 in beiden Gruppen vor, vier der gefundenen
Varianten kamen nur bei Patienten mit chronisch idiopathischer Pankreatitis vor, weitere
vier nur in der Kontrollgruppe. Von den 22 sind sechs im Bereich des Promotors, sechs in
Exons und weitere zehn in den Introns lokalisiert. Die sechs exonischen Varianten beinhalten
zwei Varianten im Exon 1 und somit in nicht kodierender Sequenz, zwei synonyme Varianten
und zwei nicht-synonyme Varianten. Bei den nicht synonymen Varianten handelt es sich um
eine Missense-Mutation und eine Frameshift-Mutation, die eine Verschiebung des
Leserasters verursacht.
Eine Übersicht über alle gefundenen Varianten liefert Tabelle 16: Ergebnisse Alle Varianten.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
52
Position Nukleotid Austausch AS-
Austausch dbSNP Referenz Patienten (n = 68) Kontrollen (n = 68)
wt ht ho wt ht ho
5’ region
c.-984T>C - 67 1 0 68 0 0 c.-953A>T - rs56952354 68 0 0 65 2 1 c.-461C>A - rs3118869 26 30 12 22 25 21 c.-408C>A - rs41307457 63 3 2 60 4 4 c.-382G>A - 68 0 0 67 0 1 c.-379C>G - rs41304236 66 2 0 67 1 0
Exon 1 (5‘UTR)
c.-272delA - 67 1 0 68 0 0 c.-258C>T - rs41312184 67 1 0 67 1 0
Intron 1 c.-11+176C>T - rs58218735 68 0 0 67 1 0 c.-11+198G>T - rs57446091 44 22 2 42 24 2 c.-10-33C>G - rs10123692 63 5 0 65 2 1
Exon 2 c.5A>C, p.N2T rs112682750 67 1 0 66 2 0 c.97delA, p.K33fs 67 1 0 68 0 0
Intron 2 c.126+11C>T - rs184253842 67 1 0 66 2 0 c.126+31C>T - rs2274611 18 38 12 16 32 20 c.127-139T>C - rs188488647 68 0 0 67 1 0
Intron 4 c.397-34delT - 64 4 0 58 10 0 Exon 5 c.402G>A, p.Q134Q rs11541204 57 11 0 66 2 0
Intron 5 c.621+56A>C - rs2378757 6 35 27 5 25 38 c.621+62T>G - rs76587987 66 2 0 63 4 1
Exon 7 c.852A>C, p.G284G 67 1 0 68 0 0 Intron 7 c.902+195A>C - rs3128510 18 38 12 15 32 21
Tabelle 16: Ergebnisse Alle Varianten Die Nomenklatur der Mutationen erfolgte nach den Vorgaben der HGVS (Human Genome Variation Society)88 , einsehbar unter http://www.hgvs.org/mutnomen. Sofern diese in der dbSNP gelistet sind, werden die rs Nummern angegeben.
53
3.3.1 Typisches Elektropherogramm einer heterozygoten Mutation
3.3.2 Einteilung nach Häufigkeit der gefundenen Varianten
Zur weiteren statistischen Auswertung wurden die gefundenen Varianten in ihrer Häufigkeit
beurteilt. Definitionsgemäß beschreibt die MAF (minor allele frequency) die Häufigkeit des
zweithäufigsten Allels. Diese Festlegung ist wichtig, da eine Position in der DNA maximal vier
unterschiedliche Werte (=Basen) annehmen kann. Vereinfachend formuliert beschreibt die
MAF somit die Frequenz der häufigsten Mutation an einer Position. Das häufigste Allel wird
in dieser Betrachtung als Wildtyp angenommen.
Für die weitere statistische Auswertung wurden alle Varianten mit einer MAF > 5 % als
häufig definiert und zur weiteren Auswertung zusammengefasst. Die Varianten mit einer
MAF < 5 % wurden als selten definiert und in einer zweiten Gruppe zusammengefasst. Diese
Abweichung von der üblichen Definition, ein SNP sei mit einer Allelfrequenz von > 1% häufig,
ist der Zahl von 68 Individuen pro Gruppe geschuldet. 1% entspricht rechnerisch 1,36 Allelen
und damit funktionell 2 Allelen pro Kohorte. 5 % entspricht rechnerisch 6,8 und somit 7
Allelen pro Kohorte. Die Aussagekraft eines vier Felder Tests, in diesem Fall Fisher’s exact
Test, ist damit in der Gruppe MAF < 5 % sehr gering.
C 310 T G A G G C A G G C 320
A C G A C C A G C T 330
Abbildung 13 Elektropherogramm heterozygote Variante c.-461C>A Elektropherogramm eines Patienten mit heterozygoter Variante c.-461C>A an Position 324 im basecall der Sequenzierung (Pfeil). Das Signal für Adenosin und Cytosin ist an dieser Position in etwa gleich stark.
54
3.4 Allelhäufigkeiten
Die Allelhäufigkeiten sind für einundzwanzig der gefundenen zweiundzwanzig Varianten
gleichverteilt. Es zeigt sich lediglich bei der synonymen Variante c.402G>A (p.Q134Q)
ein signifikanter Unterschied, der auch schon im dominanten Vererbungsmodell beobachtet
wurde. Nach Bonferroni Korrektur (α/Anzahl der Tests, entsprechend 0,05/22 = 0,002) ist
kein signifikanter Unterschied mehr festzustellen.
Position Nukleotid Austausch Patienten (%)
Kontrollen (%) P
Odds ratio
MAF (%) EUR_AF (%)
(n = 136 Allele) (n = 136 Allele) [95% CI]
5’ region
c.-984T>C 0,7 0 1 - - - c.-953A>T 0 2,9 0,122 - 1,0 1 c.-461C>A 39,7 49,3 0,143 - 41,8 47 c.-408C>A 5,1 8,8 0,342 - 6,0 3 c.-382G>A 0 1,5 0,498 - - - c.-379C>G 1,5 0,7 1 - 0,3 1
Exon 1 (5‘UTR)
c.-272delA 0,7 0 1 - - - c.-258C>T 0,7 0,7 1 - 1,1 2
Intron 1 c.-11+176C>T 0 0,7 1 - 3,6 n.d. c.-11+198G>T 19,1 20,6 0,879 - 34,9 17 c.-10-33C>G 3,7 2,9 1 - 37,0 4
Exon 2 c.5A>C, (p.N2T) 0,7 1,5 1 - 0,1 0,13 c.97delA, (p.K33fs) 0,7 0 1 - - -
Intron 2 c.126+11C>T 0,7 1,5 1 - 0,2 0,40 c.126+31C>T 45,6 52,9 0,275 - 43,7 47 c.127-139T>C 0 0,7 1 - 0,0 n.d.
Intron 4 c.397-34delT 2,9 7,4 0,168 - - -
Exon 5 c.402G>A, (p.Q134Q) 8,1 1,5 0,0195* 5,896
[1,3-27,1] 2,6 5
Intron 5 c.621+56A>C 65,4 74,3 0,146 - 22,5 65 c.621+62T>G 1,5 4,4 0,282 - 3,8 4
Exon 7 c.852A>C, (p.G284G) 0,7 0 1 - - -
Intron 7 c.902+195A>C 45,6 54,4 0,182 - 41 47 Tabelle 17: Ergebnisse Allelhäufigkeiten Aufgeführt sind die relativen Allelhäufigkeiten. P-Werte wurden mit dem Fisher’s exact Test ermittelt. Odds ratio und 95 % Konfidenzintervall sind nur bei statistisch signifikantem Unterschied spezifiziert. MAF und EUR_AF sind Vergleichsdaten aus dem 1000 Genome Projekt89 sofern die Varianten dort erfasst sind. Unter MAF erfolgt die Angabe des selteneren Allels mit seiner relativen Häufigkeit. Unter EUR_AF ist die relative Häufigkeit des selteneren Allels in der europäischen Population aufgelistet. n.d. = nicht detektiert.
55
3.4.1 Verteilung der Varianten bei Fällen und Kontrollen
Eine Manifestation der gefundenen Varianten ist sowohl als dominanter als auch als
rezessiver Erbgang vorstellbar. Bei einer dominanten Vererbung reicht ein Allel und somit
eine heterozygote Variante zur Ausprägung des Phänotyps. Bei der rezessiven Vererbung
kommt es nur bei Vorhandensein von zwei veränderten Allelen und somit einer
homozygoten Variante zur Ausprägung des Phänotyps.
Die Verteilung der gefundenen Varianten wurde gegen die Nullhypothese, dass diese in
beiden Gruppen gleich verteilt seien, getestet. Aufgrund der niedrigen Zahlen (regelhaft n <
5 für einzelne Felder der 4-Felder Tafel erfolgte die Testung mit dem Fisher’s exact Test.
In Unkenntnis einer eventuellen funktionellen Relevanz der gefundenen Varianten erfolgte
die Testung jeweils im dominanten Modell (Anzahl der Mutationsträger gegen Wildtypen)
und im rezessiven Modell (Anzahl der homozygot Mutierten gegen Heterozygote und
Wildtypen).
56
3.5 Häufige Varianten MAF > 5 %
Unter den gefundenen Varianten haben acht eine Minor Allel Frequenz von > 5 %. Es handelt
sich hier um zwei Varianten im Promotorbereich, fünf Varianten liegen jeweils im Intron und
ein synonymer SNP liegt im Exon 5 (Vergl. Tabelle 18).
Im dominanten Vererbungsmodell zeigt sich hier lediglich für einen synonymen SNP im Exon
5 c.402G>A (p.Q134Q) eine signifikant unterschiedliche Verteilung. Die Merkmalsträger
sind mit 16,2 % bei den Patienten im Vergleich zu den Kontrollen (2,9 %) deutlich
überrepräsentiert (P = 0,02). Nach Bonferroni Korrektur für achtfache Testung muss das
Signifikanzniveau auf P < 0,05/8 = 0,00625 adjustiert werden. Nach konservativer Lesart ist
damit von einer Gleichverteilung auszugehen.
Die weiteren häufigen Varianten c.-461C>A, c.-408C>A (beide jeweils 5’UTR), c.-
11+198G>T (Intron 1), c.126+31C>T (Intron 2), c.397-34delT (Intron 4),
c.621+56A>C (Intron 5) und c.902+195A>C (Intron 7) zeigen im dominanten
Vererbungsmodell keine signifikanten Unterschiede in der Verteilung zwischen Patienten
und Kontrollen.
Position Nukleotid Austausch Patienten
(n = 68) Kontrollen
(n = 68) P Odds ratio
[95% CI]
Mutationsträger (%)
Mutationsträger (%)
5’ region c.-461C>A 42 (61,8) 46 (67,6)# 0,591 0,77
[0,38-1,56]
c.-408C>A 5 (7,4)# 8 (11,8)# 0,561 0,60 [0,18 - 1,92]
Intron 1 c.-11+198G>T 24 (35,3) 26 (38,2) 0,859 0,88 [0,44 - 1,77]
Intron 2 c.126+31C>T 50 (73,5) 52 (76,5) 0,843 0,85 [0,39 - 1,86]
Intron 4 c.397-34delT 4 (5,9) 10 (14,7) 0,156 0,36 [0,11 - 1,22]
Exon 5 c.402G>A (p.Q134Q) 11 (16,2) 2 (2,9) 0,0166* 6,37 [1,35 - 29,95]
Intron 5 c.621+56A>C 62 (91,2) 63 (92,6) 1 0,82 [0,24 - 2,83]
Intron 7 c.902+195A>C 50 (73,5) 53 (77,9) 0,690 0,79 [0,36 - 1,73]
Tabelle 18: Ergebnisse Häufige Varianten im dominanten Vererbungsmodell P-Werte wurden mit dem Fisher’s exact Test ermittelt. P-Werte und prozentuale Häufigkeiten wurden im dominanten Modell (Anzahl der Mutationsträger gegen Wildtypen) berechnet. #Werte nicht im HDW-Equilibrium
57
Im rezessiven Modell können für die zwei Varianten c.397-34delT (Intron 4) und
c.402G>A (p.Q134Q) (Exon 5) keine Aussagen getroffen werden, da keine homozygot
mutierten Individuen detektiert worden sind. Für c.-11+198G>T (Intron 1) zeigt sich eine
Gleichverteilung mit je 2,9 % homozygot Mutierten in beiden Gruppen. Bei den weiteren
fünf Varianten c.-461C>A, c.-408C>A (beide jeweils 5’UTR), c.126+31C>T
(Intron 2), c.621+56A>C (Intron 5) und c.902+195A>C (Intron 7) sind die
prozentualen Abweichungen in der Verteilung im Fisher’s exact Test statistisch nicht
signifikant unterschiedlich (Vergl. Tabelle 19).
Position Nukleotid Austausch Patienten (n = 68) Kontrollen (n = 68) P
Homozygote (%) Homozygote (%)
5’ region
c.-461C>A 12 (17,6 %) 21 (30,9 %) 0,109 c.-408C>A 2 (2,9 %) 4 (5,9 %) 0,680
Intron 1 c.-11+198G>T 2 (2,9 %) 2 (2,9 %) 1 Intron 2 c.126+31C>T 12 (17,6 %) 20 (29,4 %) 0,156 Intron 4 c.397-34delT 0 0 1 Exon 5 c.402G>A (p.Q134Q) 0 0 1 Intron 5 c.621+56A>C 27 (39,7 %) 38 (55,9 %) 0,086 Intron 7 c.902+195A>C 12 (17,6 %) 21 (30,9 %) 0,109 Tabelle 19: Ergebnisse Häufige Varianten im rezessiven Vererbungsmodell P-Werte wurden mit dem Fisher’s exact Test ermittelt. P-Werte und prozentuale Häufigkeiten wurden im rezessiven Modell (Anzahl der homozygot Mutierten gegen Heterozygote und Wildtypen) berechnet.
3.5.1 Hardy-Weinberg-Equilibrium
Zur Qualitätskontrolle der Genotypisierung wurde getestet, ob die gefundene Verteilung der
Varianten dem Hardy Weinberg Equilibrium (HWE) entspricht. Eine Abweichung vom HWE
ist ein Indiz für einen Datenfehler und damit einen möglichen Genotypisierungsfehler. In
einer Fall-Kontrollstudie kann aber auch die Anreicherung eines disponierenden Allels in
einer Gruppe zur Abweichung vom HWE führen90. Bei beiden häufigen Varianten im
Promotorbereich gab es Abweichungen vom Hardy-Weinberg Equilibrium. Für c.-461C>A
zeigte sich in den Kontrollen eine Abweichung (P = 0,03) und für c.-408C>A zeigte sich in
Patienten (P = 6 *10-6) und Kontrollen (P = 2 *10-7) eine Abweichung.
58
3.5.2 Seltene Varianten MAF < 5 % Von den detektierten Varianten hatten vierzehn eine MAF < 5 % und wurden für die weitere
statistische Auswertung als selten definiert. Sieben dieser seltenen Varianten wurden jeweils
nur bei einem Individuum nachgewiesen. Die genaue Aufschlüsselung ist der Tabelle 20 zu
entnehmen. Die vier Varianten c.-984T>C, c.-272delA (beide 5‘UTR), c.97delA
(p.K33fs) (Exon 2) und c.852A>C (p.G284G) (Exon 7) wurden nur bei den
Patienten gefunden. Die drei Varianten c.-953A>T, c.-382G>A (beide 5‘UTR) und
c.127-139T>C (Intron 2) konnten nur bei den Kontrollen nachgewiesen werden. Es
liegen weder im dominanten noch im rezessiven Vererbungsmodell statistisch signifikante
Unterschiede in der Verteilung dieser seltenen Varianten zwischen Patienten und Kontrollen
vor .
Position Nukleotid Austausch Patienten (n = 68) Kontrollen (n = 68) P dominant P rezessiv wt ht ho wt ht ho
5’region
c.-984T>C 67 1 0 68 0 0 1 1 c.-953A>T 68 0 0 65 2 1 0,244 1 c.-382G>A 68 0 0 67 0 1 1 1 c.-379C>G 66 2 0 67 1 0 1 1
Exon 1 (5‘UTR) c.-272delA 67 1 0 68 0 0 1 1 c.-258C>T 67 1 0 67 1 0 1 1
Intron 1 c.-11+176C>T 68 0 0 67 1 0 1 1 c.-10-33C>G 63 5 0 65 2 1 0,718 1
Exon 2 c.5A>C, (p.N2T) 67 1 0 66 2 0 1 1 c.97delA, (p.K33fs) 67 1 0 68 0 0 1 1
Intron 2 c.126+11C>T 67 1 0 66 2 0 1 1 c.127-139T>C 68 0 0 67 1 0 0,441 1
Intron 5 c.621+62T>G 66 2 0 63 4 1 1 1 Exon 7 c.852A>C, (p.G284G) 67 1 0 68 0 0 1 1
Tabelle 20: Ergebnisse Seltene Varianten P-Werte wurden mit dem Fisher’s exact Test ermittelt. P-dominant wurde im dominanten Modell (Anzahl der Mutationsträger gegen Wildtypen), P rezessiv im rezessiven Modell (Anzahl der homozygot Mutierten gegen Heterozygote und Wildtypen) berechnet.
59
3.6 Haplotypenanalyse
Die Gene des Menschen liegen in redundanter Form vor, der Chromosomensatz wird jeweils
einmal von der Mutter und einmal vom Vater vererbt. Eine experimentelle Zuordnung der
Varianten zu jeweils dem väterlichen oder dem mütterlichen Chromosom ist theoretisch
möglich, wird aber aufgrund des hohen Aufwandes in praxi nicht durchgeführt. Mit einer
wahrscheinlichkeitsbasierten Analyse, die den Abstand der untersuchten Varianten auf dem
Chromosom mit einbezieht, können die Haplotypen mit einer geringen
Fehlerwahrscheinlichkeit berechnet werden. Da das menschliche Genom in Blöcken vererbt
wird, dienen in dieser Untersuchung die gefundenen Varianten als Marker der
entsprechenden Region. Aus der Haplotypenanalyse können also indirekt Rückschlüsse auf
den Bereich der verwendeten Marker gezogen werden, ohne die vollständige genomische
Sequenz untersucht zu haben.
Unter Berücksichtigung aller Varianten mit einer MAF > 5 % (n = 8, vergl. Tabelle 18) wurde
eine wahrscheinlichkeitsbasierte Haplotypenanalyse mit PHASE 2.184 85 durchgeführt. Sieben
der acht untersuchten Varianten waren SNPs, die unter der jeweils angegebenen reference
snp ID (rs) in der dbSNP91hinterlegt sind. Die Reihenfolge der Nukleotide entspricht der
Reihenfolge der Varianten auf dem Chromosom und somit c.-461C>A rs3118869, c.-
408C>A rs41307457, c.-11+198G>T rs57446091, c.126+31C>T rs2274611,
c.397-34delT (nicht gelistet in dbSNP), c.402G>A (p.Q134Q) rs11541204,
c.621+56A>C rs2378757, c.902+195A>C rs3128510.
Es konnten 17 Haplotypen (vergl. Tabelle 21) identifiziert werden, sechs dieser Haplotypen
kamen nur bei den Kontrollen vor, zwei nur bei den Patienten. Neun dieser Haplotypen
kamen sowohl bei Patienten, als auch bei den Kontrollen vor. Sie entsprachen 96 % aller
Chromosomen, bzw. 98,5 % aller Chromosomen der Patienten und 93,4 % aller
Chromosomen der Kontrollen.
Die Haplotypen zeigten sich in Patienten und Kontrollen gleich verteilt, mit Ausnahme des
Haplotyps Nummer 12, der als einziger das mutierte Allel c.402G>A enthielt. Dies zeigte
sich hier, wie auch schon im dominanten Vererbungsmodell, gehäuft bei den Patienten.
Nach Bonferroni Korrektur (α/Anzahl der Tests, entsprechend 0,05/17=0,003) war mit einem
P Wert von 0,0195 kein signifikanter Unterschied mehr zu konstatieren.
60
Im Permutationstest zeigte sich ein signifikanter Unterschied zwischen der Ähnlichkeit der
Haplotypen innerhalb der untersuchten Gruppen und der Ähnlichkeit der Haplotypen von
Patienten und Kontrollen P = 0.05.
Nukleotid Patienten (%) Kontrollen (%) P Odds ratio (n = 136) (n = 136) [95% CI] 1 A…C…G…T…T…G…C…C 51 (37,5) 60 (44,1) 0,324 - 2 A…C…G…T…-…G…C…C 3 (2,2) 4 (2,9) 1 - 3 A…C…G…T…-…G…A…C 0 1 (0,7) 1 - 4 A…C…G…C…T…G…C…C 0 1 (0,7) 1 - 5 A…C…T…C…T…G…C…A 0 1 (0,7) 1 - 6 C…C…G…T…T…G…C…C 6 (4,4) 4 (2,9) 0,749 - 7 C…C…G…T…-…G…C…C 1 (0,7) 0 1 - 8 C…C…G…C…T…G…C…C 0 1 (0,7) 1 - 9 C…C…G…C…T…G…C…A 1 (0,7) 0 1 -
10 C…C…G…C…T…G…A…A 46 (33,8) 33 (24,3) 0,109 - 11 C…C…T…C…T…G…C…A 10 (7,4) 14 (10,3) 0,522 -
12 C…C…T…C…T…A…C…A 11 (8,1) 2 (1,5) 0,0195* 5,9 [1,3-27,1]
13 C…C…T…C…-…G…C…A 0 3 (2,2) 0,247 - 14 C…A…G…T…T…G…C…C 1 (0,7) 1 (0,7) 1 - 15 C…A…G…T…-…G…C…C 0 2 (1,5) 0,498 - 16 C…A…G…C…T…G…A…A 1 (0,7) 1 (0,7) 1 - 17 C…A…T…C…T…G…C…A 5 (3,7) 8 (5,9) 0,572 -
Tabelle 21: Ergebnisse Haplotypen Berechnung der Haplotypen mit PHASE 2.1. Die Nukleotidreihenfolge der Varianten entspricht c.-461C>A, c.-408C>A, c.-11+198G>T, c.126+31C>T, c.397-34delT, c.402G>A (p.Q134Q), c.621+56A>C, c.902+195A>C. Die relative Position der Varianten zueinander ist in bp 1-54-649-1807-2595-2637-2912-4740. Die dem Wildtyp entsprechenden Basen sind grün, mutierte rot dargestellt. Die prozentuale Häufigkeit in Klammern bezieht sich auf alle Chromosomen der jeweiligen Kohorte (n = 136). Verteilungsunterschiede wurden mittels Fisher’s exact Test untersucht. Odds ratio und 95 % Konfidenzintervall sind nur bei statistisch signifikantem Unterschied spezifiziert.
Abbildung 14 Haplotypenverteilung Aufgetragen auf der x-Achse ist die Bezeichnung der Haplotypen, auf der y-Achse die absolute Häufigkeit (n=136 für beide Gruppen). ICP = ideopathisch chronische Pankreatitis, SHIP = Study of health in Pomerania.
0
10
20
30
40
50
60
70
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12* 13 14 15 16 17
ICP
SHIP
61
3.7 Poweranalyse
Sowohl das Patientenkollektiv als auch die Kontrollgruppe wurden so groß wie möglich
gewählt. Insgesamt wurden 4308 + 2299 = 6607 Individuen für den Einschluss in die Studie
überprüft. Eine Vergrößerung dieses Kollektives war nicht möglich, auf eine vorangestellte
Poweranalyse wurde daher verzichtet, da sie ohne Konsequenz verblieben wäre. Anders
verhält es sich allerdings für die nachträgliche Bewertung der Studie, insbesondere für die
Variante c.-461C>A (rs3118869). Für diesen SNP ist eine funktionelle Relevanz bereits
beschrieben 92 und bestätigt 93. In Kenntnis der Verteilung homozygoter Träger von 17,6 %
vs. 30,9 % ist unsere Power einen signifikanten Unterschied in 68 versus 68 Individuen mit
einem α < 0,05 zu detektieren für eine Abweichung in bekannte Richtung (one-tailed) 48,7%.
Für die synonyme Variante c.402G>A, (p.Q134Q) ergibt sich im Modell der
dominanten Vererbung in Kenntnis der Verteilung 16,2 % Mutationsträger bei den Patienten
und 2,9 % Mutationsträger bei den Gesunden folgende Teststärke: Mit einer Power von 81,7
% kann ein signifikanter Unterschied in 68 versus 68 Individuen mit einem α < 0,05 detektiert
werden für eine Abweichung in bekannte Richtung (one-tailed).
62
4 Diskussion
Die Mutation im SPINK1 p.N34S zeigt in vitro keine Veränderung der inhibitorischen
Aktivität33 94. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass SPINK1 mit p.N34S Mutation durch
Cathepsin L schneller degradiert wird, daher gehen wir bei der p.N34S Mutation von einem
Funktionsverlust aus. Die Prävalenz dieser Mutation beträgt ca. 1 % 33 94, die Inzidenz der
chronischen Pankreatitis beträgt 0,001-0,02 % in Europa 95. Das bedeutet, ungefähr jeder
Hundertste in unserer Gesellschaft ist Mutationsträger, es entwickelt aber jährlich nur ca.
jeder 20.000-100.000ste eine chronische Pankreatitis. Es sind also sehr wahrscheinlich
weitere krankheitsauslösende Faktoren beteiligt, die darüber entscheiden ob ein N34S
Mutationsträger erkrankt oder nicht.
Zur Überprüfung der Frage, ob CTSL Mutationen als weitere modifizierende Faktoren der
Pankreatitis bei Individuen mit p.N34S Mutationen eine Rolle spielen, wurde bei jeweils 68
Mutationsträgern mit und ohne Pankreatitis das CTSL Gen sequenziert.
4.1 Powerberechnung und Patientenkohorte
Aus 4308 zufällig ausgewählten Individuen (Teilnehmer von SHIP), die alle einer
Genotypisierung für die SPINK1 N34S Mutation unterzogen wurden, verblieben als
Kontrollgruppe 68 Individuen, die die Einschlusskriterien für diese Studie erfüllten.
Eine vorherige Powerberechnung war somit erstens nicht möglich und hätte zweitens keine
Konsequenz gezeitigt, da außerhalb der Study of Health in Pomerania keine vergleichbaren
Kollektive zur Verfügung standen. Zudem hätten rechnerisch jeweils 64 weitere Individuen
untersucht werden müssen, um einen weiteren Kandidaten für die Kontrollgruppe zu
akquirieren. Daher kann diese Kontrollgruppe nicht mit vertretbarem Aufwand vergrößert
werden.
Das Ausschlusskriterium Mutationen im kationischen Trypsin (PRSS1) ist anfänglich nur per
RFLP-Analyse untersucht worden, jedoch wurden später per Sanger-Sequenzierung die
häufigsten Mutationen in den Exons 2 und 3 ausgeschlossen. Es ergibt sich also fast keine
diagnostische Lücke für die PRSS1 Mutationen.
63
4.2 Lokale Prävalenz der Spink N34S Mutationen
Die N34S Mutation ist unter der Referenz rs17107315 in der dbSNP96 (The Single Nucleotide
Polymorphism Database of Nucleotide Sequence Variation) des NCBI (The National Center
for Biotechnology Information) verzeichnet. Für die N34S Mutation ist die publizierte MAF
C=0.006 (MinorAlleleCount 13 /(1094x2)). Die Häufigkeitsangabe dort bezieht sich auf das
Projekt 1000 Genome der Phase 1 und wird auf der Grundlage von 1094 weltweit
ausgesuchten Individuen berechnet. Die Zahlen beziehen sich auf die Veröffentlichung vom
Mai 2011. Die Prävalenz der SPINK1 N34S Mutation in der SHIP Kohorte (1,6 %) liegt in dem
Bereich mehrfacher Publikationen27 97 der Prävalenz einer gesunden europäischen
Bevölkerung.
4.3 Cathepsine in der Pankreatitis
4.3.1 Sequenzvarianten von Cathepsin B in der Pankreatitis
Cathepsin B kann, wie in der Einleitung erwähnt, Trypsin aktivieren. Auf der Grundlage der
Arbeiten zur Trypsinogenaktivierung durch Cathepsin B wurde Cathepsin B als wichtiges
Kandidatengen bei der Pankreatitis an einem indischen Kollektiv mit tropischer
kalzifizierender Pankreatitis auf assoziierte Sequenzvarianten untersucht. Es konnte eine
Assoziation der Mutation p.L26V (rs12338) mit der Erkrankung gezeigt werden 98, eine
Assoziation der Mutation p.L26V mit der SPINK1 p.N34S Mutation besteht nicht.
In einer früheren Publikation (Daten hier nicht gezeigt, Publikation im Anhang) konnten wir
(Weiß, F.U, Behn C.O. et al.) zeigen, dass diese Mutation bei Patienten mit kaukasischem
Hintergrund nicht mit der idiopathischen Pankreatitis assoziiert ist 99. Daten aus dem 1000
Genome Projekt 89 bestätigen die von uns gefundene hohe Allelfrequenz in der europäischen
Bevölkerung nachträglich. Die in der Arbeit von Mahurkar et. al. gefundene hohe Prävalenz
der Mutation p.L26V entspricht in etwa der Prävalenz in unserer Normalbevölkerung.
4.3.2 Cathepsin L
Die Rolle von Cathepsin L in der akuten Pankreatitis ist weitaus schlechter erforscht und
verstanden, als die von Cathepsin B. Cathepsin L wird im exokrinen Pankreas exprimiert und
64
in sowohl in lysosomale als auch in sekretorische Kompartimente sortiert. Ein gut etablierter
Aktivierungsmechanismus für Trypsinogen ist die Kolokalisation mit Cathepsin B. Die
Kolokalisation von CTSL und Trypsinogen scheint im Rahmen der induzierten Pankreatitis im
Tiermodell weiter zuzunehmen. Im Gegensatz zu Cathepsin B inaktiviert Cathepsin L
Trypsinogen durch eine Schnittstelle im Proenzym, die um drei Aminosäuren in Richtung des
C-Terminus verschoben ist. Hieraus resultiert ein verkürztes, inaktives Trypsin. Im CTSL
Knockout Mausmodell kommt es im Rahmen einer Taurocholatpankreatitis zur vermehrten
Apoptose und reduzierten Nekrose 53.
Im Tiermodell korreliert der Schweregrad der experimentellen Pankreatitis direkt mit dem
Ausmaß der Nekrose und es gibt eine inverse Korrelation mit dem Ausmaß der Apoptose100.
In der Zusammenschau der aktuellen Literatur muss man von einem pro-apoptotischen
Effekt von CTSB und einem anti-apoptotischen Effekt von CTSL in pankreatischen
Aszinuszellen ausgehen52.
Cathepsin L spaltet nicht nur Trypsinogen zu einem verlängerten TAP und einem funktionell
inaktivem, verkürztem Trypsin; es spaltet und inaktiviert auch Trypsin an der Position E82-
G83. Somit kann Cathepsin L als funktioneller Gegenspieler von Cathepsin B angesehen
werden. Während Cathepsin B Trypsin aktiviert, hat Cathepsin L eine inaktivierende Wirkung
auf Trypsin und Trypsinogen52 53.
Auf der einen Seite wird somit die funktionelle Relevanz von Cathepsin L in den Arbeiten von
Wartmann et. al.53 und Sendler et al.52 als eine Verschiebung der Effekte der Pankreatitis zu
verstärkter Nekrose und erhöhter Schwere der Erkrankung aufgezeigt und dieser Effekt kann
möglicherweise über verringerte Trypsinaktivität erklärt werden.
Auf der anderen Seite wird durch W. Halangk34 und in dieser Arbeit postuliert, dass die N34S
Mutation in Spink1 über einen beschleunigten Abbau von N34S mutiertem Spink1 durch
Cathepsin L möglicherweise über eine verminderte Trypsinhemmung zur Pankreatitis
präsdispositioniert. In einem Fall ist eine vermehrte Trypsinaktivität also schädlich und
erhöht die Wahrscheinlichkeit an einer Pankreatitis zu erkranken, im anderen Fall führt die
vermehrte Trypsinaktivität zu einer Verschiebung der Effekte der Pankreatitis zu vermehrter
Apoptose und verringerter Schwere der Erkrankung. Dieser scheinbare Widerspruch spiegelt
das noch immer lückenhaftes Verständnis der Enzymaktivierung in der Pankreatitis wider.
Wahrscheinlich ist die Trypsinaktivität per se nicht eindeutig als protektiv oder schädlich zu
65
werten, sondern muss immer im Kontext mindestens zum Zeitpunkt und zur subzellulären
Lokalisation gewertet werden.
In beiden Fällen scheint Cathepsin L in der Pankreatitis eine weit wichtigere Rolle zuzufallen
als bislang angenommen, auch wenn Mausmodelle nicht zwangsläufig die humane
Biochemie widerspiegeln.
Ein Effekt auf die Pankreatitis ist auch über vermehrte Invasion von neutrophilen Leukozyten
denkbar. Cathepsin L inaktiviert (unter anderem) den α1 Proteinase Inhibitor und damit ein
zentrales Steuerelement der humanen neutrophilen Elastase, die insbesondere für die frühe
Invasion der Leukozyten in der Pankreatitis von großer Bedeutung ist101, durch katalytische
Spaltung102. Auch secretory leukocyte protease inhibitor wird von CTSL gespalten103. Damit
unterstützt Cathepsin L die Leukozyteninvasion durch spezifische Spaltung von Inhibitoren
der Invasionsenzyme.
Möglicherweise liegt die krankheitsmodifizierende Rolle von Cathepsin L also nicht nur in der
Proteaseaktivierung sondern auch in der Unterstützung der Leukozyteninfiltration durch
katalytische Prozessierung von SLPI und α1 Proteinase Inhibitor. Dies wäre eine alternative
Möglichkeit, die von Wartmann et. al gefundene verringerte MPO Aktivität in der Lunge bei
CTSL Knockout Tieren in der Pankreatitis zu begründen53.
Änderungen im Pro-Anteil des Enzyms könnten die Autoinhibition104 des Enzyms
modifizieren.
Die Kolokalisation von CTSL und Trypsinogen nimmt im Verlauf der tierexperimentellen
Pankreatitis zu. Ob es sich um eine Folge oder einen auslösenden Mechanismus der
Pankreatitis handelt, ist nicht sicher zu beantworten. Auch bei einer Schädigung der
vesikulären Membranen kann es zu einer Umverteilung von Cathepsin L in die anderen
subzellulären Kompartimente kommen, dieser Mechanismus ist im Wesentlichen auf den
Zelltod beschränkt.105
Änderungen im Präpro-Anteil des Proteins könnten über fehlerhafte Sortierung relevant
werden. Eine fehlerhafte Sortierung von Cathepsin L in die subzellulären Kompartimente
kann z.B. durch leaky scanning106 erfolgen. Wenn bei der Translation das erste AUG Signal
der mRNA übersprungen wird, resultiert ein verkürztes Cathepsin L Protein, das nicht in das
lysosomale Kompartiment sortiert wird107. In vivo im Mausmodell kann diese Beobachtung
aber nicht bestätigt werden.108
66
4.4 CTSL Expression
In der Sequenzierung des Cathepsin L Gens wurde die 5’UTR ab 1115 Basenpaare upstream
von Exon 1 mit einbezogen, um eventuelle Expressionsänderungen durch Varianten im
Promotorbereich zu detektieren. Assoziationen mit der CTSL Expression sind für einige
Erkrankungen beschrieben.
Die basale Expression von Cathepsin L wird unter anderem durch die Transkriptionsfaktoren
SP1, SP3 und NF-Y reguliert109, die beobachteten Expressionsunterschiede zwischen
unterschiedlichen Malignomzelllinien lassen sich allerdings nicht immer über diese
Mechanismen erklären110. Eine Regulation von Cathepsin L über verschiedene
Wachstumsfaktoren ist schon seit geraumer Zeit bekannt111. So kann zum Beispiel eine
Überexpression von VEGF über AP-4 und über SP1 Motive im Promotor zu einer vermehrten
Expression führen112.
Es konnte darüber hinaus von Liu et. al. eine starke Korrelation zwischen dem Prozentsatz
der Stenose der linken vorderen absteigenden Koronararterie (LAD = RIVA) und dem Serum
Cathepsin L-Spiegel bei Patienten mit einer Stenose gezeigt werden. Die Beteiligung von
Cathepsin L an der koronaren Herzkrankheit über Mechanismen der Entzündung im Rahmen
der Artherosklerose scheint naheliegend.113 Somit ist eine weitere funktionelle Relevanz der
Expression belegt. In der Arbeit von Liu wurde die Ursache der erhöhten Cathepsin L
Expression als Antwort auf erhöhte proinflammatorische Mediatoren gewertet und nicht
molekularbiologisch untersucht. Eine weitere Transkriptionsregulation erfolgt durch ein XRE
(xenobiotic response element)92 in Zusammenspiel mit den Proteinen AHR und ARNT, hierfür
migriert AHR in den Zellkern und bindet dann in Form eines Heterodimers mit ARNT an die
DNA 114. Die funktionelle Relevanz dieser Transkripitionsmodulation wurde in einer multi-
ethnischen chinesischen Population bestätigt. Wie von Mbewe-Campbell in einem
amerikanischen Kollektiv beschrieben, korreliert auch in der chinesischen Bevölkerung der
SNP rs3118869 mit der Höhe des Blutdrucks93.
Auch der Methylierungsstatus des CTSL Promotors hat eine Auswirkung auf die Expression.
Bei Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie (CML) konnte gezeigt werden, dass in
der chronischen Phase der Erkrankung eine Hypomethylierung des Promotors mit einer
67
erhöhten CTSL Expression einhergeht, wohingegen in der akuten Phase der CML und der
Blastenkrise eine Hypermethylierung des CTSL Promotors mit einer Abnahme der Expression
korreliert 115. Der Bereich c.-944 bis c.-10-570 im Cathepsin L Gen ist als CpG-Insel
beschrieben. Hier finden sich 106 CpG-sites, also potentielle Methylierungsstellen im
Promotor110. Eine Hypomethylierung dieser CpG -Insel korreliert mit einer CTSL -
Überexpression in Melanomzellen110.
Zudem sind für die unterschiedlichen mRNA Varianten eine unterschiedliche
Expressionshäufigkeit und eine unterschiedliche Stabilität beschrieben worden. Für hCATL A
wurde eine interne ribosomale Eintrittsstelle, engl. internal ribosomal entry site (IRES)
beschrieben, die zu einer vermehrten Expression führt 116 117. Für die unterschiedlichen
mRNAs (hCATL-A, hCATL-AI, hCATL-AII, hCATL-AIII, hCATL-B; s. Abbildung 2 Splicevarianten
von Cathepsin L) sind unterschiedliche Halbwertszeiten publiziert, hCATL-A hat zwar die
geringste Halbwertszeit, aber die höchste Transkriptionseffizienz117.
Im Regelfall wird während der Transkription (beim Eukaryoten) die mRNA am 5‘-Ende mit
einer 7-Methylguanosin-„Kappe“ (5’-Cap) versehen, um den Transport aus dem Zellkern und
die ribosomale Translation zu initiieren. Zudem erhöht die 5‘-Cap die Stabiliät der RNA und
inhibiert den Abbau in 5‘-3‘-Richtung durch Exonukleasen. Der Beginn der Translation erfolgt
dann über die Bindung der mRNA mit der 5‘-Kappe an die 40S Untereinheit des Ribosoms.
Eine IRES bezeichnet eine Sekundärstruktur innerhalb der mRNA, die ein direktes Andocken
an die 40S Untereinheit des Ribosoms und somit einen Translationsstart unabhängig von der
5‘-Kappe ermöglicht.
Es gibt Hinweise, dass die Expression in Brustkrebszellen durch posttranskriptionale
Regulation beeinflusst wird. Die mRNA Variante hCATLA 3 scheint mit der höchsten
Invasivität beim Brustkrebs und einer erhöhten Expression von CTSL einherzugehen 43.
Im Zusammenhang mit der Pankreatitis ist die Expressionsregulation von Cathepsin L bislang
nicht ausreichend untersucht.
68
4.5 Cathepsin L Varianten bei Trägern der SPINK1 p.N34S Mutation
4.5.1 Exonische Varianten
Zwei der sechs exonischen Varianten liegen im Exon 1 in der 5‘ UTR (c.-272delA und
c.-258C>T, rs41312184). Da das erste Exon noch keine kodierende Information enthält
– das Startcodon ATG liegt im zweiten Exon – haben diese Varianten keine Änderung der
Peptidstruktur zur Folge. Auswirkungen auf den Phänotyp wären möglicherweise im Rahmen
von mRNA Effekten erklärbar. Auswirkungen auf die mRNA Stabilität sind möglich, beide
Mutationen liegen in der Nähe einer IRES (internen ribosomalen Eintrittstelle) 116 117, so dass
auch durch diese Varianten bedingte Änderungen der Sekundärstruktur zu einer
veränderten Expression führen könnten. Zudem ist für einen Teilabschnitt der 5’UTR ein
alternativer Promotor beschrieben und durch Reporterkonstrukt Experimente belegt116. Eine
Veränderung dieses alternativen Promotors kann auch die Expression modifizieren.
Funktionell wären an diesen beiden Mutationsstellen durchaus relevante Effekte vorstellbar,
die zahlenmäßige Verteilung in den untersuchten Kollektiven spricht aber gegen eine
klinische Relevanz. Erstens sind beide Varianten äußerst selten, c.-272delA kommt nur
einmal bei den Patienten vor, und c.-258C>T kommt jeweils einmal bei Patienten und
Kontrollen vor. Zweitens sind hierdurch keine signifikanten Unterschiede zwischen Patienten
und Kontrollen belegbar.
Zwei weitere exonische Sequenzvarianten liegen im Exon 2, beide sind nicht synonyme
Mutationen (c.5A>C, (p.N2T) rs112682750 und c.97delA, (p.K33fs)).
Die frameshift Mutation c.97delA, (p.K33fs)ist nur einmal heterozygot bei einem
Patienten nachgewiesen worden und somit zu selten, um eine funktionelle Relevanz zu
beweisen. Jedoch ist die Wahrscheinlichkeit eines vollständigen Funktionsausfalls des
mutierten Proteins bei einer frameshift Mutation sehr hoch. Die Aminosäureposition 33 liegt
im Aktivierungspeptid, das katalytische Zentrum liegt deutlich dahinter. Diese Tatsache
macht einen Funktionsausfall noch wahrscheinlicher. Es käme bei einem heterozygoten
Funktionsausfall zu einer verringerten CTSL Aktivität, die zu einer verzögerten Degradation
von N34S mutiertem Spink durch CTSL führen müsste. Nach dem postulierten Modell einer
durch beschleunigten SPINK Abbau getriggerten Pankreatitis müsste diese Mutation einen
protektiven Charakter haben und wäre damit eher bei den Kontrollen zu erwarten. Eine
69
(kausale) Assoziation dieser frameshift Mutation mit der Pankreatitis wäre durch
Fehlfaltungen und damit erhöhten Stress am endoplasmatischen Retikulum vorstellbar. 118
Der SNP rs112682750 c.5A>C, (p.N2T)ist statistisch gleich verteilt (zweimal heterozygot
bei den Kontrollen, einmal heterozygot bei einem Patienten).
Die Region um das Startcodon ist für die Translationsinitiierung von besonderer Bedeutung.
Der genomische Kontext ist bei Proteinen generell mitverantwortlich für die
Expressionshäufigkeit. Die häufigste genomische Start Sequenz ist als Kozak Konsensus
Sequenz bekannt. Abweichungen von dieser Konsensus Sequenz führen zu einer
verminderten Translation. Besonders stark ist dieser Effekt an der Position -3, etwas
schwächer an den Positionen +4, -1 und -2, wobei die drei letztgenannten sich stärker
auswirken, wenn an Position -3 eine Pyrimidinbase vorliegt 119. Die in dieser Arbeit
gefundene Mutation c.5A>C, (p.N2T) liegt an Position 5 und hat nach aktueller Einschätzung
keinen Effekt auf den Translationsstart.
5‘-GCC GCC(A/G)CCAUG G-3‘ Kozak consensus
5‘-UUU UAA A ACAUG A-3‘ Cathepsin L
Der Austausch N>T, also Asparagin zu Threonin, bedeutet den Austausch von einer
amidierten gegen eine hydroxylierte Aminosäure. Die Position 2, an der diese Mutation
vorkommt, liegt im Prä- Anteil des Proteins und somit im Signalpeptid. Eine Auswirkung auf
das spätere Protein ist daher nicht anzunehmen, eine veränderte Sortierung in subzelluläre
Kompartimente erscheint aber möglich.44
Abbildung 16 Strukturformel L-Asparagin
Abbildung 15 Strukturformel L-Threonin
70
Für beide Mutationen ist eine krankheitsmodifizierende bis hin zu einer
krankheitsauslösenden Auswirkung im Individuum denkbar, der Beweis wäre nur indirekt
über experimentelle Untersuchungen des mutierten Cathepsin L in vitro oder im Tiermodell
zu führen.
Beide Mutationen können lediglich heterozygot nachgewiesen werden, so dass es bei den
Patienten mutmaßlich nur zu einer Modifikation der Cathepsin L Aktivität kommt, ein totaler
Ausfall ist nicht anzunehmen. Aufgrund dieser Ausgangslage erscheint auch die weitere
experimentelle Überprüfung der von hier gefundenen Mutationen nicht sehr aussichtsreich.
Eine fünfte exonische Alteration liegt im Exon 7 c.852A>C, (p.G284G). Bei einer
synonymen Mutation ist die funktionelle Relevanz am ehesten vor Translation, also im
Rahmen von mRNA Effekten zu erwarten. Auch diese Mutation kann nur bei einem
Patienten heterozygot nachgewiesen werden. Eine funktionelle Relevanz bleibt damit auch
an dieser Stelle fraglich.
Lediglich eine der exonischen Mutationen kann mit einer MAF > 5 % gefunden werden. Die
Variante c.402G>A (p.Q134Q) rs11541204 liegt im Exon 5 und repräsentiert ebenfalls
eine synonyme Mutation mit fraglicher funktioneller Relevanz. In der Signifikanzprüfung ist
mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von 0,02 eine Häufung dieser synonymen Mutation bei
den Patienten anzunehmen. Auch in der Auswertung der Allelhäufigkeiten ergibt sich ein
initial signifikanter Unterschied für die Variante c.402G>A (p.Q134Q). Nach Bonferroni
Korrektur für mehrfache Testung ist aber nicht mehr von einem signifikanten Unterschied
auszugehen. Trotzdem bleibt zu bemerken, dass diese Sequenzvariante den größten
gefundenen Verteilungsunterschied zwischen beiden Kollektiven darstellt. Beide Kohorten
liegen im Hardy-Weinberg-Equilibrium, somit ist ein Genotypisierungsfehler
unwahrscheinlich.
In einer externen Untersuchung wurde die Häufigkeit dieser Silent Mutation (p.Q134Q)bei
Patienten mit Pankreatitis im Vergleich zu gesunden Individuen als gleichverteilt beurteilt
(Jonas Rosendahl, nicht publizierte Untersuchung). Diese externe Untersuchung bezieht sich
allerdings auf Patienten und Kontrollen mit unbekanntem N34S Mutationsstatus des Spink
Gens. Eine Übertragbarkeit der Ergebnisse ist somit nicht gegeben. Man kann spekulieren,
71
dass eine mögliche Bedeutung dieser Mutation in der Pankreatitis nur im Zusammenspiel mit
einer N34S Mutation im Spink eine funktionelle Bedeutung erlangt. Unter diesem Postulat ist
im Vergleich von Pankreatitikern gegen eine gesunde Normalbevölkerung unabhängig vom
N34S Status eine Gleichverteilung sogar zu erwarten.
Für eine Variante im Spink1 und eine Variante im CTRC Gen konnten Beer und Sahin-Tóth120
zeigen, dass Änderungen eines Codons in der Nähe der Splicing Site zu verringerter mRNA
Expression und verringerter Proteinexpression führt. Im Fall der CTRC Variante handelt es
sich um eine synonyme Mutation (c.132G>A, p.Q44=), bei der SPINK1 Mutation handelt es
sich um eine nicht-synonyme Mutation (c.194G>A, p.R65Q). In beiden beschriebenen
Fällen betrifft die Änderung jeweils das letzte Codon eines Exons, die Autoren erklären die
reduzierte Expression über pre-mRNA Splicing Defekte. Die in der Sequenzierung gefundene
Variante c.402G>A (p.Q134Q)entspricht vom Codon der beschriebenen CAG>CAA
Änderung im CTRC, liegt aber nicht an der letzten, sondern an der zweiten Stelle eines Exons.
Eine Veränderung der Expression durch verändertes Splicing erscheint damit zwar
vorstellbar, der experimentelle Beweis ist aber nicht übertragbar.
Nach der initialen Hypothese könnte eine verstärkte Aktivität von Cathepsin L zu einem
schnelleren Abbau von SPINK1 führen und somit die Entstehung einer Pankreatitis
begünstigen. Über die Konstruktion eines Mini-Gen Modells unter Einbeziehung aller Exons
und Intron 4 könnte die funktionelle Relevanz weiter überprüft werden.
4.6 Nichtexonische Varianten
4.6.1 Seltene Varianten MAF < 5 %
Insgesamt wurden neun nicht exonische Varianten mit einer MAF < 5 % gefunden. Von
diesen neun Varianten sind sieben in der SNP database verzeichnet. Für keinen dieser sieben
SNPs ist eine funktionelle Relevanz publiziert. Für einige der gefundenen seltenen Varianten
gilt, dass ein funktioneller Zusammenhang zur Pankreatitis nicht sicher ausgeschlossen
werden kann und theoretisch zu konstruieren ist. Die absoluten Zahlen sprechen aber gegen
eine epidemiologische Relevanz.
72
4.6.2 Häufige Varianten MAF > 5 %
Acht der gefundenen Varianten hatten eine MAF > 5 % und wurden für die weitere
statistische Auswertung zusammengefasst.
Hier ist insbesondere der SNP c.-461C>A von großem Interesse. Eine funktionelle
Relevanz dieser Variante ist 2012 durch Mbewe-Campbell et al. beschrieben worden92. Es
konnte eine verminderte Cathepsin L Expression gezeigt werden, die durch die Korrelation
mit erhöhtem Blutdruck auch zu einem veränderten Phänotyp führt. Das Wildtyp c.-461C
Allel führt zu einer stärkeren Cathepsin L Expression als das mutierte c.-461A Allel. Die
Korrelation mit dem Phänotyp „hoher Blutdruck“ konnte in einer Arbeit von Chen et al.93
bestätigt werden. Auf der anderen Seite konnte eine starke Korrelation von höheren Serum
Cathepsin L Spiegeln mit Koronarstenosen im Allgemeinen und dem Stenosegrad des RIVA
im speziellen gezeigt werden.113 Die Rolle von CTSL für kardiovaskuläre Erkrankungen ist also
keineswegs abschließend geklärt.
Die Variante c.-461C>A rs3118869 wurde bereits im Rahmen des HapMap Projektes
beschrieben, zeigt aber in der Population HapMap-CEU (Einwohner Utahs mit nord- und
westeuropäischer Abstammung) eine abweichende Allelverteilung.
In dieser Untersuchung hat bei den Patienten das mutierte Allel nur einen Anteil von
39,7 %, bei den Kontrollen 49,3 %. Der Vergleich mit den Daten aus dem 1000 Genome
Projekt89 hilft bei der Einordnung der Allelfrequenz. Im aktuellen Stand des 1000 Genome
Projekt (Phase 3 May 2013 call set) findet sich bei der Untersuchung von 2504 Individuen
eine Häufigkeit von 42,55 % für das mutierte Allel (42,55 % A; 57,45 % C n=2504).
Für einen aussagekräftigen Vergleich wäre es notwendig, die gefundenen Alterationen in
den hier untersuchten Gruppen gegen passende Kontrollen zu vergleichen. Sowohl die
Patienten dieser Studie, als auch die Kontrollen, die aus der SHIP Studie generiert wurden,
sind über eine N34S Mutation im SPINK1 Gen präselektioniert. Ein direkter Vergleich der
Daten gegen die HapMap oder 1000 Genome Daten ist somit nicht möglich, da der N34S
Status für die HapMap-Individuen nicht vorliegt. Zur weiteren epidemiologischen Einordnung
der Häufigkeit des c.-461C>A SNPs in der Normalbevölkerung erscheint ein Vergleich der
N34S+ Kontrollen dieser Arbeit gegen N34S- Individuen sinnvoll.
73
Ein erster Ansatz hierzu wäre eine Genotypisierung der SHIP Kohorte für diesen SNP. Ein
Folgeantrag zur weiteren Untersuchung ist bereits gestellt.
Wildtyp CC Hetero AC Homo AA Allel C Allel A
SHIP 22 (32,4 %) 25 (36,8 %) 21 (30,9 %) 69 (50,7 %) 67 (49,3 %)
HapMap-CEU 80 (35,4 %) 94 (41,6 %) 52 (23,0 %) 254 (56,2 %) 198 (43,8 %)
HapMap 704 (35,6 %) 930 (47,0 %) 344 (17,4 %) 2338 (59,1 %) 1618 (40,9 %)
Pankreatitiker 26 (38,2 %) 30 (44,1 %) 12 (17,6 %) 82 (60,3%) 54 (39,7 %)
Tabelle 22 Diskussion Verteilung c.-461C>A Genotypisierung der HapMap Kohorte und der europäischen Subgruppe im Vergleich zu den Untersuchten Individuen
In der vorliegenden Untersuchung zeigt sich das mutierte Allel, welches mit einer geringeren
CTSL Expression einhergeht, häufiger bei den gesunden Kontrollen, als bei den Patienten mit
Pankreatitis. Daher ist nach den in vitro Daten von Mbewe et al.92 von einer vermehrten
CTSL Expression bei den Studienteilnehmern mit Pankreatitis im Vergleich zur
Kontrollkohorte auszugehen. Über den beschleunigten Abbau von N34S mutiertem Spink
durch CTSL wäre dies ein neuer Erklärungsansatz für die Entstehung der Pankreatitis in N34S
positiven Individuen. In diesem Zusammenhang ist somit dem mutierten Allel eine
protektive Wirkung zuzuschreiben. Es bleibt aber wichtig zu bemerken, dass sich hier ein
sehr plausibler Trend zeigt, der gut durch unsere Theorie erklärt werden kann, eine
statistische Signifikanz erreichen diese Zahlen aber nicht.
Die Variante c.-408C>A liegt im Bereich des Promotors 58 bp upstream von Exon 1. Eine
potentielle Bindungsstelle für Transkriptionsfaktoren konnte nicht identifiziert werden.
Aufgrund der räumlichen Nähe zum Transkriptionsstart sind Auswirkungen auf die
Expression denkbar, belastbare Hinweise für diese Hypothese ergeben sich nicht.
Die Variante c.-11+198G>T liegt in einer CpG Insel und stellt eine Mutation einer CpG
Site dar. Es fällt auf, dass es sich hier um eine G>T Mutation handelt. In einer CpG Site
erwartet man eher eine C>T Mutation im Sinne einer Desaminierung von methyliertem
Cytosin zu Thymin. Mit einer Allelfrequenz von ca. 20 % ist die Variante c.-11+198G>T in
Probanden mit Pankreatitis und Probanden ohne Pankreatitis in etwa gleich verteilt. In der
Erstbeschreibung der CpG Insel im CTSL Gen wird diese CpG Site nicht berücksichtigt, hier
wird Thymidin als Wildtyp angenommen 110. Ein Effekt auf die CTSL Expression ist über eine
74
Veränderung des Methylierungsmusters der DNA möglich, aber auf Grundlage der
erhobenen Verteilungsdaten nicht anzunehmen.
Bei den weiteren Varianten c.126+31C>T rs2274611, c.397-34delT, c.621+56A>C
rs2378757 und c.902+195A>C rs3128510 ergeben sich keine Hinweise auf eine funktionelle
Relevanz.
4.6.3 Häufigkeit und Validität
Für die Validität der in dieser Arbeit erhobenen Daten spricht die hohe Redundanz durch
bidirektionale Sequenzierung, teilweise überlappende Sequenzierungssequenzen,
verblindete Mehrfachsequenzierung von fünf Individuen und die strikte Einhaltung des Vier-
Augen Prinzips in der Benennung aller Varianten.
Zum besseren Verständnis der Größenordnung ist es hilfreich, sich die Etablierung von CPA1
als Risikogen für die frühe Manifestation der chronischen Pankreatitis anzusehen121. Hier
wurde ein deutsches Kollektiv von 944 Patienten gegen 3938 Gesunde Kontrollen verglichen.
Eine signifikante Assoziation einer einzelnen Mutation im CPA1 Gen mit der chronischen
Pankreatitis findet sich nicht. Daher wurde die funktionelle Relevanz der Mutationen
getestet und alle Mutationen mit einer Restaktivität der CPA1 von ≤20% zu einer Gruppe
gerechnet. Lediglich in der Summe ergibt sich ein signifikanter Unterschied. Es finden sich
3,1% Mutationsträger mit einer Restaktivität der CPA1 von ≤20% bei den Patienten mit
chronischer Pankreatitis vs. 0,1 % bei den Kontrollen. Die häufigste Mutation mit
Aktivitätsverlust kam in der Untersuchung der CPA1 bei 0,7% der Patienten vor. In dieser
Untersuchung kann die Frequenz heterozygoter Träger der seltensten Variante aufgrund der
Gruppengröße minimal eine Häufigkeit von 1,5 % annehmen (1/68=0,0147).
Der Ansatz, Varianten mit gleichem Effekt zur Berechnung als eine Gruppe
zusammenzufassen, ist erst in Kenntnis der Effekte gefundener Varianten sinnvoll. Somit ist
dieser Ansatz nicht ohne Weiteres nachträglich auf die gefundenen Cathepsin L Varianten
übertragbar. Selbst unter der Annahme, dass die gefundenen exonischen Varianten c.-
272del, c.-258C>T (beide Exon 1 5’UTR), c.5A>C, (p.N2T) (Exon 2), c.97delA,
(p.K33fs) (Exon 2), c.402G>A, (p.Q134Q) (Exon 5), c.852A>C, (p.G284G)
(Exon 7) einen gleichgerichteten Effekt zeigen, ergibt sich in der Berechnung im Fisher’s
75
exact Test lediglich der durch c.402G>A begründete, signifikante Unterschied. Unter
Ausschluss der häufigen Variante c.402G>A unterscheiden die Gruppen sich nicht mehr
signifikant. (Daten im Ergebnisteil nicht aufgeführt, da die Grundannahme der Berechnung –
nämlich ein gleichgerichteter Effekt der exonischen Varianten – ohne experimentellen
Beweis als Spekulation betrachtet werden muss).
4.7 Fazit
Neben Strukturveränderungen des Cathepsin L Proteins, die zu einer direkten
Aktivitätsveränderung führen, sind auch Expressionsmodifikationen oder zelluläre
Fehlsortierungen eine mögliche Erklärung für einen krankheitsmodifizierenden Effekt in der
Pankreatitis.
Von den in dieser Arbeit gefundenen Mutationen sind die folgenden vier besonders wichtig.
Der SNP c.-461C>A verändert wahrscheinlich die Expressionshäufigkeit von CTSL. Es
konnte nur eine Punktmutation mit einem Aminosäureaustausch c.5A>C, (p.N2T)
identifiziert werden, der Einfluss auf die Pathogenese der Pankreatitis bleibt offen. Die
gefundene frameshift Mutation c.97delA, (p.K33fs) führt wahrscheinlich zu einem
Funktionsverlust von Cathepsin L. Die synonyme Mutation c.402G>A, (p.Q134Q) ist im
Fisher’s exact Test (vor Korrektur auf multiple Testung) als einzige Variante signifikant
unterschiedlich zwischen Patienten und Kontrollen. Im Rahmen dieser Arbeit ist für keine
dieser vier Varianten ein Effekt auf die Penetranz der Pankreatitis bei N34S positiven
Individuen sicher zu belegen.
Die Häufigkeit der gefundenen Mutationen ist nicht ausreichend, um in diesem kleinen
Kollektiv eine Signifikanz zu beweisen. Es handelt sich bei der vorliegenden Arbeit jedoch um
das größte bisher untersuchte Kollektiv von N34S mutierten Individuen auf Mutationen im
Cathepsin L Gen. Aus den o.g. Gründen ist eine Erweiterung dieser Untersuchung auch in
naher Zukunft nicht absehbar. Nach kritischer Prüfung angenommener Effekte der
gefundenen Varianten erscheint in vielen Fällen eine funktionelle Relevanz weiterhin
vorstellbar, aufgrund der geringen Fallzahl ist die vorliegende Studie aber nicht ausreichend
gepowert um eine entsprechende Assoziation zu zeigen.
76
Aus den Ergebnissen dieser Arbeit direkte Rückschlüsse auf die Pathogenese der Pankreatitis
zu schließen ist schwierig. Wie weiter oben erläutert sind Penetranz- oder
krankheitsmodifizierende Effekte im Einzelfall durchaus plausibel, aber bezogen auf die
Pankreatitis wahrscheinlich kein häufiger Grund für die Erkrankung. Ein Screening auf diese
Mutationen ist also außerhalb von Studien aktuell sicher nicht indiziert.
Die beschleunigte Degradation von N34S mutiertem SPINK1 durch CTSL in der Pathogenese
der Pankreatitis ist bislang die beste funktionelle Erklärung für die Assoziation der SPINK1
N34S Mutation mit der Pankreatitis und durch diese Daten keinesfalls widerlegt. Im
Gegensatz zu diesem CTSL Effekt steht allerdings die durch CTSL vermittelte Degradation von
Trypsinogen und Trypsin. Möglicherweise gleichen sich daher positive und negative Effekte
von Aktivitätsänderungen des Cathepsin L aus.
Mutationen im Cathepsin L haben wahrscheinlich eine untergeordnete Bedeutung für den
postulierten Mechanismus, über eine zusätzlich beschleunigte SPINK N34S Degradation an
einer Pankreatitis zu erkranken.
77
4.8 Ausblick
Eine Möglichkeit, diese und ähnliche Untersuchungen auszuweiten, entsteht aktuell im
Rahmen der Nationalen Kohorte 122, einer populationsbasierten Studie, die in Deutschland
200.000 Teilnehmer einschließen wird. In Kombination mit SNP Arrays wird es aufgrund der
Stichprobengröße möglich werden, deutlich größere Kollektive mit dieser oder ähnlichen
Fragestellungen zu untersuchen. Neben einer Vergrößerung des untersuchten Kollektives
sind auch andere Techniken der Untersuchung vielversprechend. Über einen SNP Chip
können ein Vielzahl von Varianten in großen Kollektiven mit relativ geringem Zeitaufwand
untersucht werden. Die SNP Chips, die in der SHIP Studie zum Einsatz kamen, umfassten
leider nicht den SNP rs17107315 (Spink1 p.N34S), so dass die Genotypisierung im Rahmen
dieser Arbeit via TaqMan Assay erfolgte.
Auch für den funktionell interessanten SNP in der 5’UTR c.-461C>A rs3118869 liegen für
die SHIP Studie leider keine Daten vor, eine weitere Genotypiserung ist aber geplant.
Neben SNP Arrays sind insbesondere die besser verfügbaren Möglichkeiten des next
generation sequencing (NGS) ein enormer Hoffnungsträger für die Identifikation genetischer
Risikofaktoren allgemein.
Unter der Vorraussetzung, dass sich durch Vergrößerung des Kollektives und den Einsatz
neuer Techniken ein signifikanter Verteilungsunterschied für einzelne der gefundenen
Varianten zwischen Patienten mit Pankeatitis und N34S Mutation im Spink und
asymptomatischen Trägern der N34S Mutation zeigt, sind weitere funktionelle
Untersuchungen der gefundenen Varianten sinnvoll zum weiteren Verständnis der
Pathogenese der Pankreatitis.
Für c.-461C>A ist die Modifikation der Expression bereits gut untersucht, für c.5A>C,
(p.N2T) bietet sich insbesondere eine Untersuchung zur subzellulären Sortierung an. Für
c.97delA, (p.K33fs) ist eine Charakterisierung des resultierenden Proteins sinnvoll und für
c.402G>A, (p.Q134Q) kann eine Expressionsuntersuchung mit einem Minigen Ansatz
analog zu Beer et. al.120 erwogen werden.
78
79
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Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und keine
anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.
Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät, keiner anderen wissenschaftlichen
Einrichtung vorgelegt worden.
Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass eine
Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.
Greifswald, den 24. Juli 2016 C. Behn
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Lebenslauf Nur in der Originalversion enthalten
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Publikationen ARTIKEL: Cathepsin B gene polymorphism Val26 is not associated with idiopathic chronic pancreatitis
in European patients. Weiss FU, Behn CO et al.; Gut. 2007 Sep;56(9):1322-3.
Recruitment of histone deacetylases HDAC1 and HDAC2 by the transcriptional repressor ZEB1 downregulates E-cadherin expression in pancreatic cancer. Aghdassi A, Sendler M, Guenther A, Mayerle J, Behn CO, Heidecke CD, Friess H, Büchler M, Evert M, Lerch MM, Weiss FU.; Gut. 2012 Mar;61(3):439-48.
Environmental risk factors for chronic pancreatitis and pancreatic cancer. Nitsche C, Simon P, Weiss FU, Fluhr G, Weber E, Gärtner S, Behn CO, Kraft M, Ringel J, Aghdassi A, Mayerle J, Lerch MM;. Dig Dis. 2011;29(2):235-42
VORTRÄGE:
CTSB Val26 Mutationen sind kein Risikofaktor für die chronische Pankreatitis C. O. Behn et al.; 28. Deutscher Pankreasclub 22.-24. November 2007, Dresden
Die Aktivierung der T-Helfer Zellen in einem Modell der schweren akuten Pankreatitis ist T-Zell-Rezeptor unabhängig C. O. Behn et al.; 29. Deutscher Pankreasclub 20.-22. November 2008, Magdeburg
CTSL mutations do not modulate disease penetrance of pancreatitis in SPINK1 N34S carriers C. O. Behn et al.; 7 th ISIDOP 22.-23. Juni 2012, Prag
AUSZEICHNUNGEN: „Hans-Chiari-Preis für grundlagenwissenschaftliche Pankreasforschung“
Für den Vortrag (s.o.): „Die Aktivierung der T-Helfer Zellen in einem Modell der schweren akuten Pankreatitis ist T-Zell-Rezeptor unabhängig“ 29. Deutscher Pankreasclub 20.-22. November 2008, Magdeburg
Travel Grant for attending the 44th annual meeting of the EUROPEAN PANCREATIC CLUB 20.-22. Juni 2012, Prag, Tschechische Republik
7th International Symposium on Inherited Diseases of the Pancreas Travel Grant 22.-23. Juni 2012, Prag
ABSTRACTS:
Cathepsin B Gene Polymorphism Val26: Association with Idiopathic Chronic Pancreatitis in German Patients Weiß F U, Behn C, et al. Z GASTROENTEROL 2007, 45:122
Cathepsin B Gene Polymorphism Val26 is not associated with Idiopathic Chronic Pancreatitis in European Patients. Weiß F U, Behn C, et al. PANCREATOLOGY 2007, 7:236
ZEB1 associates with the E-Cadherin promoter and inhibits E-Cadherin expression via
recruitment of HDAC1 and HDAC2 in pancreatic cancer. A. Aghdassi, F. U. Weiss, C. O. Behn,et al. Pancreatology 2009;9:427–543
Die Bindung von ZEB1 an den E-Cadherin Promotor rekrutiert HDAC1 und HDAC2 und reprimiert die E-Cadherin Expression im Pankreaskarzinom AA Aghdassi, FU Weiss, CO Behn, et al. Z Gastroenterol 2009; 47 DOI: 10.1055/s-0029-1241501
CTSL mutations do not modulate disease penetrance of pancreatitis in SPINK1 N34S carriers CO Behn, et al. Pancreatology - November 2012 (Vol. 12, Issue 6, Page 544, DOI: 10.1016/j.pan.2012.11.145)
90
Role of Cathepsin L in Proteolytic Cleavage of SPINK1
W. Halangk, T. Wartmann, C.-O. Behn, et al. Pancreas November 2012 - Volume 41 - Issue 8 - p 1344–1416, DOI: 10.1097/MPA.0b013e318270446a
Role of Cathepsin L in Proteolytic Cleavage of SPINK1
W. Halangk, T. Wartmann, C.-O. Behn, et al. Pancreatology - March 2013 (Vol. 13, Issue 2, Page e30, DOI: 10.1016/j.pan.2012.12.159) GRADUATIONSARBEIT:
Charakterisierung immunologischer Aspekte der akuten, schweren Pankreatitis im experimentellen Tiermodell. Behn C O, Bachelor-Arbeit angenommen 02.11.2009 EMAU Greifswald
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Danksagung
Für die Überlassung des Themas und das in mich gesetzte Vertrauen gilt mein herzlicher
Dank Herrn Prof. Dr. med. Markus M. Lerch. Ihm ist gelungen mein Interesse an der
Gastroenterologie sowohl in klinischen wie auch grundlagenwissenschaftlichen
Fragestellungen zu erwecken. Vielen Dank.
Mein besonderer Dank gilt meinem Mentor Dr. rer. nat. F. U. Weiss, der mit viel
Gelassenheit und Scharfsinn meine wissenschaftliche Entwicklung begleitet, gefördert und
wenn nötig gelenkt hat. Danke Uli.
Mein weiterer Dank gilt der gesamten Arbeitsgruppe, insbesondere Dr. rer. nat. Matthias
Sendler für viele fruchtbare wissenschaftliche Diskussionen und konstruktive Kritik.
Meine Familie war mir während der letzten Jahre ein unendlicher Rückhalt und eine wichtige
Quelle der Motivation. Euch ist diese Arbeit gewidmet.
Greifswald, im Juli 2016
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