Aus der Klinik und Poliklinik für Innere Medizin A

-Direktor Univ.- Prof. Dr. med. Markus M. Lerch- der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

Die Rolle von Sequenzvarianten im Cathepsin L als Risikofaktoren der

chronischen Pankreatitis

Inaugural - Dissertation zur

Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Medizin

(Dr. med.)

der Universitätsmedizin

der Ernst-Moritz-Arndt-Universität

Greifswald

2016

vorgelegt von: Claas-Olsen Behn geb. am: 11. Februar 1983 in: Hamburg

Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Max P. Baur

1. Gutachter: Prof. Dr. med. M. M. Lerch

2. Gutachter: Prof. Dr. med. J. Rosendahl

Ort, Raum Klinik für Innere Medizin A Universitätsmedizin Greifswald

Raum O 0.66

Tag der Disputation: 07.12.2016

Zusammenfassung

Die chronische Pankreatitis ist meist eine wiederkehrende Entzündung der

Bauchspeicheldrüse mit intrapankreatischer Aktivierung der Verdauungsenzyme.

Mutationen im pankreatischen sekretorischen Trypsin Inhibitor (PSTI = SPINK1) finden sich

häufig bei Patienten mit chronischer Pankreatitis. Die häufigste SPINK1 Mutation p.N34S ist

aber auch bei 1-2 % der gesunden Normalbevölkerung nachweisbar. Experimentelle Daten

belegen, dass das p.N34S mutierte Protein durch CTSL schneller degradiert wird. In dieser

Arbeit wird untersucht, ob Mutationen im CTSL Gen das Risiko von p.N34S+ Individuen

erhöhen, an einer Entzündung der Bauchspeicheldrüse zu erkranken.

Hierfür werden mittels TaqMan-Analyse die Probanden der SHIP-Studie (SHIP-0 n=4308, im

Weiteren Kontrollen) und Individuen mit chronischer ideopathischer Pankreatitis (n=2299,

im Weiteren Patienten) für N34S-Mutation in SPINK1 genotypisiert. Hiernach wird bei den

p.N34S+ Individuen das CTSL mittels bidirektionaler Sanger-Sequenzierung untersucht.

Wir finden eine nichtsynonyme Mutation (c.5A>C, p.N2T), eine Mutation mit Verschiebung

des Leserasters (c.98delA, p.K33fs) und einen SNP c.-461C>A (rs3118869), für den eine

Modifikation der Expression in anderem Zusammenhang publiziert ist. Die p.N2T Mutation

wird bei einem Patienten und zwei Kontrollen nachgewiesen, die Verschiebung des

Leserasters nur bei einem Patienten. Der SNP kann bei 42 Patienten und 46 Kontrollen

nachgewiesen werden. Für keine der gefundenen Varianten zeigt sich ein signifikanter

Unterschied in der Verteilung. Auch in der Haplotypenanalyse kann kein signifikanter

Verteilungsunterschied gezeigt werden.

Ein Einfluss von CTSL Mutationen auf das Risiko an einer Pankreatitis zu erkranken, erscheint

für Träger der p.N34S Mutation im SPINK1 Gen möglich, kann an dem untersuchten Kollektiv

aber nicht bewiesen werden.

4

Inhaltsverzeichnis

ZUSAMMENFASSUNG 5

INHALTSVERZEICHNIS 4

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 7

ABBILDUNGSVERZEICHNIS 9

TABELLENVERZEICHNIS 10

1 EINLEITUNG 11

1.1 PANKREAS 11

1.2 PANKREATITIS 11

1.3 AKUTE PANKREATITIS 12

1.4 CHRONISCHE PANKREATITIS 12

1.4.1 Epidemiologie der chronischen Pankreatitis 13

1.5 HEREDITÄRE PANKREATITIS 13

1.5.1 Trypsinmutationen in der Pankreatitis 14

1.5.2 SPINK1 Mutationen in der Pankreatitis 15

1.6 CATHEPSINE 17

1.6.1 Cathepsin B 17

1.6.2 Cathepsin L 17

1.6.3 Cathepsine in der Pankreatitis 20

1.7 ZIELSETZUNG 23

2 MATERIAL UND METHODEN 24

2.1 STUDIENTEILNEHMER 24

2.1.1 Patienten mit idiopathischer chronischer Pankreatitis und N34S Mutation im SPINK1 24

2.1.2 SPINK1 N34S Mutations-Träger ohne Pankreatitis 25

2.2 MATERIAL 26

2.2.1 Verbrauchsmaterialien 26

2.2.2 Gebrauchslösungen 26

2.2.3 Geräte 27

2.2.4 Software 28

2.3 METHODEN 28

2.3.1 DNA Extraktion 28

2.3.2 Gelelektrophorese 29

2.3.3 Herstellung von Agarosegelen 29

2.3.4 Beladung von Agarosegelen 30

2.3.5 Genotypisierung von Sequenzvarianten mittels TaqMan-Analyse 30

2.3.6 Durchführung TaqMan Assay 32

5

2.3.7 Polymerasekettenreaktion (PCR) 34

2.3.8 Primerdesign 34

2.3.9 Primersequenzen 35

2.3.10 Etablierung der Reaktionsbedingungen PCR 35

2.3.11 PCR Protokolle 36

2.3.12 Durchführung Amplifikation 36

2.3.13 Aufreinigung der PCR Produkte 37

2.3.14 Sequenzierungsreaktion 38

2.3.15 Aufreinigung der Sequenzierungsreaktion 39

2.3.16 Auswertung der Sequenzierung 40

2.3.17 Promotor Analyse 42

2.4 STATISTIK 43

2.4.1 Haplotypenanalyse 43

2.4.2 Powerberechnung 44

3 ERGEBNISSE 45

3.1 STUDIENTEILNEHMER 45

3.1.1 Amplifikations PCR Etablierung und Optimierung 46

3.2 PCR ZUR AMPLIFIKATION UND SEQUENZIERUNG 49

3.3 VARIANTEN IM CTSL 51

3.3.1 Typisches Elektropherogramm einer heterozygoten Mutation 53

3.3.2 Einteilung nach Häufigkeit der gefundenen Varianten 53

3.4 ALLELHÄUFIGKEITEN 54

3.4.1 Verteilung der Varianten bei Fällen und Kontrollen 55

3.5 HÄUFIGE VARIANTEN MAF > 5 % 56

3.5.1 Hardy-Weinberg-Equilibrium 57

3.5.2 Seltene Varianten MAF < 5 % 58

3.6 HAPLOTYPENANALYSE 59

3.7 POWERANALYSE 61

4 DISKUSSION 62

4.1 POWERBERECHNUNG UND PATIENTENKOHORTE 62

4.2 LOKALE PRÄVALENZ DER SPINK N34S MUTATIONEN 63

4.3 CATHEPSINE IN DER PANKREATITIS 63

4.3.1 Sequenzvarianten von Cathepsin B in der Pankreatitis 63

4.3.2 Cathepsin L 63

4.4 CTSL EXPRESSION 66

4.5 CATHEPSIN L VARIANTEN BEI TRÄGERN DER SPINK1 P.N34S MUTATION 68

4.5.1 Exonische Varianten 68

4.6 NICHTEXONISCHE VARIANTEN 71

6

4.6.1 Seltene Varianten MAF < 5 % 71

4.6.2 Häufige Varianten MAF > 5 % 72

4.6.3 Häufigkeit und Validität 74

4.7 FAZIT 75

4.8 AUSBLICK 77

LITERATURVERZEICHNIS 79

ERKLÄRUNG 87

LEBENSLAUF 88

PUBLIKATIONEN 89

DANKSAGUNG 91

7

Abkürzungsverzeichnis

Abkürzung Bedeutung

A. Arteria Abb. Abbildung AHR Aryl hydrocarbon receptor AP Akute Pankreatitis ARNT Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator AS Aminosäure(n)

cM Centimorgan (cM) genetische Entfernung von gekoppelten Genloci nach Rekombinationshäufigkeit

CNV Copy number variations engl. Variation der Kopienzahl CP Chronische Pankreatitis CpG-Insel Cytosin-phosphatidyl-Guanin-Insel CT Computer Tomographie ddNTP Didesoxyribonukleosidtriphosphat DNA Desoxyribonucleic acid engl. Desoxyribonucleinsäure dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat engl. Englisch ER Endoplasmatisches Retikulum ERCP Endoskopische retrograde Cholangiopankreatikographie EUS Endoskopischer Ultraschall FRET Förster-Resonanzenergietransfers griech. Griechisch HGNC HUGO Gene Nomenclature Committee HUGO Human Genome Organisation HWE Hardy Weinberg Equilibrium

ICD10 International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems engl. Internationale statistische Klassifikation der Krankheiten und verwandter Gesundheitsprobleme

IRES Internal ribosomal entry site engl. interne ribosomale Eintrittsstelle IUBMB International Union of Biochemistry and Molecular Biology kDa Kilodalton LAD Left anterior descending

8

lat. Latein MAF Minor allel frequency engl. Häufigkeit des Minor Allels MEP Major excreted polypeptide = SPINK1 Mr Relative Molekülmasse MRCP Magnetresonanz-Cholangiopankreatikographie mRNA messengerRNA engl. Boten-RNA MRT Magnetresonanz Tomographie n.d. nicht detektiert NCBI National Center for Biotechnology Information, USA NTC None Template Control engl. Kontrolle ohne Vorlage (keine DNA) NTP Nukleosidtriphosphat

OMIM Online Mendelian Inheritance in Man, Onlinedatenbank humaner Gene und genetischer Erkrankungen

PCR Polymerase Chain Reaction engl. Polymerasekettenreaktion Pe Probability of error PSTI Pancreatic Secretory Trypsin Inhibitor PUP Peak under peak RFLP Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus RIVA Ramus interventricularis anterior RNA Ribonucleic acid engl. Ribonukleinsäure rpm Revolutions per minute engl. Umdrehungen/min RT Raumtemperatur S Svedberg, Sedimentationskoeffizient ~10-13 s SDS Sodium dodecyl sulfate engl. Natriumdodecylsulfat SNP Single nucleotide polymorphism engl. SPINK1 Serin Protease Inhibitor Kazal Typ 1 TATI Tumor assoziierter Trypsin Inhibitor = SPINK1 UniProt Universal protein database, Onlinedatenbank für Proteine V. Vena XRE Xenobiotic response element

9

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1 SPINK1 Schnittstellen Cathepsin B und Cathepsin L ............................................ 16

Abbildung 2 Splicevarianten von Cathepsin L .......................................................................... 19

Abbildung 3 Schematische Darstellung des TaqMan Assays ................................................... 32

Abbildung 4 Adenosintriphosphat (ATP) protoniert ................................................................ 38

Abbildung 5 Desoxyadenosintriphosphat (dATP) protoniert ................................................... 38

Abbildung 6 Didesoxyadenosintriphosphat (ddATP) protoniert ............................................. 38

Abbildung 7 Agencourt CleanSEQ ............................................................................................ 40

Abbildung 8 Skizze Plattenbelegung für Annealing-Gradienten .............................................. 46

Abbildung 9 Agarosegel Annealing-Gradient ........................................................................... 47

Abbildung 10 Primer für die kodierende Sequenz ................................................................... 49

Abbildung 11 Primer Promotor und Intron1 ............................................................................ 50

Abbildung 12 Agarosegel Promotorfragment .......................................................................... 51

Abbildung 13 Elektropherogramm heterozygote Variante c.-461C>A .................................... 53

Abbildung 14 Haplotypenverteilung ........................................................................................ 60

Abbildung 15 Strukturformel L-Threonin ................................................................................. 69

Abbildung 16 Strukturformel L-Asparagin ............................................................................... 69

10

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1 Verbrauchsmaterialien ............................................................................................. 26

Tabelle 2 Gebrauchslösungen .................................................................................................. 26

Tabelle 3 Geräte ....................................................................................................................... 27

Tabelle 4 Software .................................................................................................................... 28

Tabelle 5 Genotypisierung TaqMan Thermocyclerprotokoll ................................................... 33

Tabelle 6 Genotypsierung TaqMan Reaktionsansatz ............................................................... 33

Tabelle 7 Primer ....................................................................................................................... 35

Tabelle 8 Amplifikation Thermocyclerprotokoll Allgemein ..................................................... 36

Tabelle 9 Amplifikation Reaktionsansatz Qiagen ..................................................................... 37

Tabelle 10 Amplifikation Reaktionsansatz Fermentas 2x Master ............................................ 37

Tabelle 11 Amplifikation alternativer Reaktionsansatz 2x Master .......................................... 37

Tabelle 12 Sequenzierung Reaktionsansatz ............................................................................. 39

Tabelle 13 Sequenzierung Thermocyclerprotokoll .................................................................. 39

Tabelle 14 Mapper2 Variablen ................................................................................................. 42

Tabelle 15 PCR Bedingungen zur Amplifikation ....................................................................... 48

Tabelle 16: Ergebnisse Alle Varianten ...................................................................................... 52

Tabelle 17: Ergebnisse Allelhäufigkeiten ................................................................................. 54

Tabelle 18: Ergebnisse Häufige Varianten im dominanten Vererbungsmodell ....................... 56

Tabelle 19: Ergebnisse Häufige Varianten im rezessiven Vererbungsmodell .......................... 57

Tabelle 20: Ergebnisse Seltene Varianten ................................................................................ 58

Tabelle 21: Ergebnisse Haplotypen .......................................................................................... 60

Tabelle 22 Diskussion Verteilung c.-461C>A ............................................................................ 73

11

1 Einleitung

1.1 Pankreas

Das ca. 13-18 cm große Pankreas (griech.: pán = alles, kréas = Fleisch) liegt sekundär

retroperitoneal in Höhe des zweiten Lendenwirbelkörpers und erstreckt sich vom

duodenalen C auf der rechten Seite bis zum Milzhilus auf der linken Seite. Die Form wird oft

mit einem quer liegenden Angelhaken bzw. einem Keil verglichen. Makroskopisch unterteilt

man das Organ in drei Abschnitte, das Caput (lat. Kopf), das Corpus (lat. Körper) und die

Cauda (lat. Schwanz) pancreatis. Der Vergleich mit einem Haken geht auf die Form zurück, in

der sich das Pankreas der Lendenwirbelsäule anschmiegt. Das Caput pancreatis liegt

eingebettet im duodenalen C und umfasst mit seinem kaudal distalen Anteil die V. und A.

mesenterica superior. Das Corpus verläuft nahezu horizontal und überkreuzt die Aorta

abdominalis zwischen dem Truncus coeliacus und der A. mesenterica superior. Die Cauda

pancreatis setzt diesen Verlauf fort und endet im Milzhilus. Vom Corpus zur Cauda nimmt

der Querdurchmesser der Bauchspeicheldrüse in den meisten Fällen kontinuierlich ab,

weshalb das Pankreas auch als keilförmig beschrieben wird. Es zeigen sich viele

Formvarianten von größtenteils geringer klinischer Relevanz (s. Chronische Pankreatitis).

1.2 Pankreatitis

Eine Pankreatitis ist eine Entzündung der Bauchspeicheldrüse. Man unterscheidet nach der

Verlaufsform die akute von der chronischen Pankreatitis und je nach Autor werden hier noch

weitere Subklassifizierungen vorgenommen, beispielhaft sei hier der von Whitcomb

geprägte Begriff der rekurrierenden akuten Pankreatitis genannt1.

Des Weiteren unterscheidet man nach der Ätiologie der Pankreatitis. Bis zu 80 % aller

Erkrankungen lassen sich durch biliäre oder alkoholische Faktoren erklären. Es gibt darüber

hinaus noch eine ganze Reihe weiterer krankheitsauslösender Faktoren mit deutlich

niedrigerer Prävalenz. So können Obstruktionen nicht nur durch Gallensteine hervorgerufen

werden, sondern unter anderem auch durch Neoplasien, anatomische Variationen oder auch

verschiedene Parasiten. Auch einige Infektionen können zur Pankreatitis führen, so z.B.

Salmonellen, Typhus, Mykoplasmen, Leptospiren, Lues, Mumps, Virushepatitiden,

12

Cytomegalievirus, Coxsackie B-Virus, HI-Virus. Auch verschiedene Giftstoffe und

Medikamente können in seltenen Fällen eine Pankreatitis auslösen2 3.

1.3 Akute Pankreatitis

Unter der akuten Pankreatitis versteht man eine entzündliche Erkrankung der

Bauchspeicheldrüse, die sich unterschiedlich manifestieren kann. Die Bandbreite der

klinischen Bilder reicht von einer leichten ödematösen Form, die mit Schmerzen und

erhöhten Serum-Werten für die Pankreasenzyme einhergeht bis hin zur schweren,

lebensbedrohlichen, nekrotisierenden Pankreatitis. Die Mortalität unterscheidet sich hierbei

essentiell: Bei der ödematösen Form liegt sie < 1 %, bei der hämorrhagisch nekrotisierenden

Pankreatitis (je nach Studie und in Abhängigkeit von der behandelnden Institution) von 10-

24 %3. Ein Übergang in chronische Formen ist möglich.

1.4 Chronische Pankreatitis

Die chronische Pankreatitis ist eine Erkrankung der Bauchspeicheldrüse, bei der meist durch

rezidivierende Entzündungsschübe das Pankreasparenchym im Sinne einer Nekrose-Fibrose-

Sequenz4 durch fibrotisches Bindegewebe ersetzt wird5. Man unterteilt die chronische

Pankreatitis (CP) nach der Pathogenese in die alkoholische CP, hereditäre CP, autoimmune

CP, metabolische CP, tropische CP und idiopathische CP. Davon abzugrenzen sind die

Formen einer CP, die mit einer anatomischen Anomalie einhergehen. Hier sind insbesondere

die paraduodenale Pankreatitis und die obstruktive chronische Pankreatitis zu erwähnen.

Es kommt im Krankheitsverlauf zu einem konsekutiven progredienten Verlust der exokrinen

und endokrinen Pankreasfunktion, häufig begleitet von typischen Komplikationen wie

Pseudozystenbildungen, Pankreasgangveränderungen im Sinne von Stenosen und

Dilatationen, Duodenalstenosen, aber auch Arrosionen der benachbarten Gefäße,

Kompression der Gallenwege, Pseudotumoren, Mangelernährung und in erster Linie

ausgeprägten Schmerzen. Das Risiko für ein Pankreaskarzinom ist deutlich erhöht6, die

Lebenserwartung der Patienten ist reduziert7.

13

1.4.1 Epidemiologie der chronischen Pankreatitis Die Inzidenz der chronischen Pankreatitis liegt zwischen 4/100 000 (Minnesota, USA) und

14/100 000 (in Japan), die Prävalenz bei ca. 50/100 000 in Japan und den Vereinigten

Staaten8 9. Die gesundheitsökonomische Bedeutung der Pankreatitis in Deutschland zeigt

sich auch an der Zahl der 10.213 Krankenhausaufnahmen wegen chronischer Pankreatitis

(K86.0 Alkoholinduzierte chronische Pankreatitis + K86.1 Sonstige chronische Pankreatitis

2.823 + 7.390) im Jahr 2014 (einzusehen über die Onlineabfrage der

Gesundheitsberichterstattung des Bundes, www.gbe-bund.de) zuzüglich derjenigen

Patienten mit chronischer Pankreatitis, die im Schub als akute Pankreatitis kodiert wurden

(K85 Akute Pankreatitis, insgesamt 55.624). Zum Vergleich, die Fallzahl der akuten

Appendizitis (ICD10: K35) beträgt für diesen Zeitraum 100.214.

1.5 Hereditäre Pankreatitis

Die hereditäre (lat. hereditas = Erbschaft) Pankreatitis ist als eine Unterform der Pankreatitis

anzusehen. Die Diagnose der hereditären Pankreatitis (OMIM® 167800) beinhaltet entweder

den Nachweis einer bekannten krankheitsauslösenden Mutation oder zwei oder mehr

erkrankte Individuen in zwei oder mehr Generationen einer Familie mit Pankreatitis. Sie

zeichnet sich insbesondere durch eine frühere Erstmanifestation, oft bereits im

Kindesalter10, aus. Die ersten Fallberichte einer familiären chronischen Pankreatitis reichen

zurück bis in das Jahr 1952 11. 1996 gelang die genetische Zuordnung der autosomal

dominant vererbten Pankreatitis zu der Region 35 auf dem langen Arm des Chromosoms 7 12. Pandya gelang es, diesen Bereich in drei anderen Familien zu bestätigen und auf einen

Bereich von 16-cM einzugrenzen13. Zur weiteren Eingrenzung führten dann die folgenden

funktionellen Überlegungen.

Bereits Ende des 19. Jahrhunderts vertrat Hans Chiari die These, die Pankreatitis sei ein

Selbstverdau des Organes 14. Aus diesem mittlerweile vielfach bestätigtem Wissen heraus

suchte man dann in der zuvor eingegrenzten genetischen Region nach entsprechenden

Verdauungsenzymen. Zwischen den Mikrosatelliten-Markern, die den wahrscheinlichsten

Bereich der DNA eingrenzen, liegen neben dem Gen für die T-Zell-Rezeptor Beta Kette noch

acht Trypsin-Gene, von denen drei als Pseudogene erkannt wurden 15. Noch im Jahr dieser

14

Entdeckung (1996) gelang der Gruppe um David Whitcomb der Nachweis einer Mutation im

kationischen Trypsin als Ursache der hereditären Pankreatitis16.

1.5.1 Trypsinmutationen in der Pankreatitis

Bei der beschriebenen Mutation handelt es sich um einen Aminosäureaustausch von Arginin

durch Histidin an Position 122 (p.R122H) im kationischen Trypsin (PRSS1). Das

Erklärungsmodell der Pankreatitis postuliert eine Trypsinschnittstelle, durch die es zu einer

Autodegradation kommt, an dieser Position. Diese Schnittstelle wird nach Austausch des

Arginins durch Histidin nicht mehr erkannt und es findet keine proteolytische Spaltung statt.

Hierdurch kann der autolytische Kontrollmechanismus der Aktivierung nicht mehr greifen.

Das Gleichgewicht zwischen Aktivierung und Deaktivierung des Trypsins verschiebt sich in

Richtung des aktivierten Enzyms. 1997 konnten Gorry et al. eine weitere Pankreatitis

auslösende Mutation zeigen. Es zeigte sich im PRSS1 Gen mehrerer Patienten, die keine

Mutation an Position p.R122 aufwiesen, eine Mutation an Position p.2917. Hier konnte ein

Austausch von Asparagin nach Isoleucin gezeigt werden.

Mittlerweile sind für viele Mutationen in diversen Genen Assoziationen mit der chronischen

Pankreatitis gezeigt worden, allerdings wird bislang nur für die Trypsinmutationen und hier

im engeren Sinne die p.R122H und p.N29I Mutationen von einer eindeutigen – in diesem

Zusammenhang monokausalen – Ursache der Pankreatitis ausgegangen. Im PRSS1-Gen

konnten in der Folge noch weitere unterschiedliche krankheitsauslösende Mutationen

identifiziert werden. Die Gemeinsamkeit dieser Mutationen beruht in den meisten Fällen

entweder auf einer erhöhten Trypsinaktivität durch vermehrte Sekretion, verstärkte

Aktivierung bzw. verminderte Degradation oder der Induktion von intrazellulärem,

insbesondere endosplasmatischem Stress durch eine Fehlfaltung der Enzyme. Es wurden

auch verschiedene CNV (copy number variations = Variation der Kopienzahl) berichtet, die

am ehesten mit einer Erhöhung der Trypsinaktivität einhergehen18-20. Die häufigste und

damit wahrscheinlichste Ursache für Mutationen sind Punktmutationen21. Es gibt aber in

Einzelfällen auch Hinweise auf eine alternative Entstehung der Trypsinmutationen. Die

Mutationen p.A16V, p.N29I, und p.R122H haben sich möglicherweise aus Genkonversionen

entwickelt22. Es wurden auch vereinzelt Fälle von Genkonversionen berichtet, die in eine

p.N29I Mutation 23 24 oder eine Kombination von p.R122H Mutation und p.R116P Mutation25

münden.

15

Die Trypsinmutationen p.N29I und p.R122H führen mit einer Wahrscheinlichkeit von ca. 80%

zur Pankreatitis. Bei vielen weiteren Mutationen, insbesondere in anderen Genen, gibt es

anhaltende Diskussionen darüber, ob diese als krankheitsauslösende – oder eher als

modifizierende Cofaktoren zu werten sind.

1.5.2 SPINK1 Mutationen in der Pankreatitis

Der krankheitsauslösende Effekt der Trypsinmutationen ist in den allermeisten Fällen eine

Aktivitätssteigerung des Trypsins. Funktionell ist es naheliegend, auch die Trypsininhibitoren

zu untersuchen. Ein wichtiger Inhibitor ist SPINK1 (SERINE PROTEASE INHIBITOR KAZAL-TYPE

1 kurz SPINK1 (OMIM 167790; Uniprot P00995). Mutationen imSPINK1 Gen sind mit der

chronischen Pankreatitis assoziiert26. Es zeigen sich allerdings Unterschiede in der Stärke der

Assoziation in Abhängigkeit von der Ätiologie der Pankreatitis. So ist die Assoziation von

N34S Mutationen mit der Pankreatitis am niedrigsten bei der chronischen alkoholischen

Pankreatitis, etwas höher bei der idiopathischen Pankreatitis und am höchsten bei der

tropisch kalzifizierenden Pankreatitis27. (OMIM 167790; Uniprot P00995)N34S Mutationen

im SPINK1 Gen sind nach der größten Metaanalyse mit einer Prävalenz von 18 %28 relativ

häufig bei Patienten mit idiopathischer chronischer Pankreatitis anzutreffen. Für die

chronische Pankreatitis konnte an einem Kollektiv aus Virginia/USA eine Assoziation mit der

N34S Mutation in 5,4 % der Fälle demonstriert werden. Für die Untergruppe der

idiopathischen chronischen Pankreatitis zeigt sich diese Assoziation mit 37,1 % 29. In der

Allgemeinbevölkerung liegt die Häufigkeit der in dieser Arbeit untersuchten N34S-Mutation

bei 1-2 %30 31. Die Erstbeschreibung der Assoziation dieses Aminosäureaustausches mit

chronischer Pankreatitis geht auf Witt et al. 26 zurück. Für die hereditäre Pankreatitis mit

Mutationen im PRSS1 Gen konnten Weiss et al. zeigen, dass weder die Penetranz noch der

Schweregrad der Erkrankung oder die Erstmanifestation eines Diabetes mellitus mit dem

Mutationsstatus vom SPINK1 Gen korrelieren.32 Das untersuchte Kollektiv ist gut mit der

Kohorte dieser Arbeit vergleichbar, es fanden sich bei zwei von siebzehn (12 %) Individuen

mit PRSS1 Mutationen ohne klinisch apparente Pankreatitis N34S Mutationen im SPINK1

Gen. Unter den 70 Individuen mit PRSS1 Mutation und Pankreatitis fanden sich fünf (7 %)

mit einer N34S Mutation im SPINK1 Gen. 32

16

Die häufigste Mutation im SPINK1, p.N34S geht nicht mit einer verminderten Trypsin

Inhibition einher33. Ein anderer Erklärungsansatz ist daher eine beschleunigte Degradation

des mutierten SPINK1 Proteins, die auch zu einer verminderten Trypsin Inhibition führen

würde. Gestützt wird diese These durch die relative Nähe der N34S Mutation zu potentiellen

Schnittstellen durch die SPINK1 degradierenden Enzyme Cathepsin B und Cathepsin L (s.

Abbildung 1).

Die Arbeitsgruppe um W. Halangk, insbesondere T. Wartmann34 konnte eine beschleunigte

Degradation von N34S mutiertem SPINK1 durch Cathepsin L zeigen. Die Experimente sind

bislang nur als Abstract veröffentlicht und werden gemeinsam mit den Ergebnissen dieser

Arbeit als Originalartikel publiziert. Aus den Daten von T. Wartmann ergibt sich der erste

Hinweis auf die Bedeutung der Interaktion von SPINK1 und Cathepsin L in der Entstehung

der N34S+ Pankreatitis.

Abbildung 1 SPINK1 Schnittstellen Cathepsin B und Cathepsin L Schematische Darstellung von SPINK1 modifiziert nach T. Wartmann. Es finden sich drei potentielle Schnittstellen für Cathepsin B und zwei für Cathepsin L. Die erste Schnittstelle von CTSL liegt eine Aminosäure von der N34S Mutation entfernt. Die Disulfidbrückenbindungen zwischen den Cystein-Molekülen werden in der Graphik durch S··S, in der ausgeschriebenen Aminosäuresequenz durch eine eckige, nach oben offene Klammer repräsentiert.

CTSB

CTSB

CTSB

reaktivesZentrum

AS-Positionen bezogen auf Spink1-Precursor

DSLGREAK C YNELNGCT KI YDPVCGTDGNTYPNECVLCFENRKR QTSILIQ K SGPC

CTSB CTSB CTSB

31 33 67 68 74 76

CTSL

CTSL

CTSLCTSL

17

1.6 Cathepsine

Neben Trypsin (PRSS1) und Spink (SPINK1) konnten in weiteren Genen krankheits-assoziierte

Mutationen gezeigt werden. In vielen Fällen handelte es sich hierbei um Proteasen. Für diese

Arbeit sind insbesondere die Cathepsine von näherem Interesse. Der Begriff Kathepsin bzw.

Cathepsin leitet sich ab von griechisch κατά (katá) „von ... herab, gegen, völlig“ und ἕψειν -

hepsein „kochen“. Es handelt sich bei den Cathepsinen um Proteinasen, also

eiweißspaltende Enzyme.

Die ersten Daten zu Cathepsinen in der Pankreatitis wurden am Cathepsin B erhoben, der

Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf dem Cathepsin L, im Folgenden werden beide Proteine

kurz vorgestellt.

1.6.1 Cathepsin B

Cathepsin B (OMIM 116810; Uniprot P07858; IUBMB EC 3.4.22.1) ist eine lysosomale

Cysteinpeptidase. Der offizielle Name des Gens nach HUGO Gene Nomenclature Committee

(HGNC) lautet CTSB.

Das Proenzym besteht aus 339 Aminosäuren und wird durch Abspaltung eines 62

Aminosäuren langen Propeptides aktiviert 35. Dieses Propeptid fungiert danach als Cathepsin

B Inhibitor und blockiert das aktive Zentrum des Cathepsin B 36 bei neutralem pH. Je

niedriger der pH, desto mehr dissoziiert diese Bindung und desto schwächer wird die

Inhibierung durch das Propeptid.

1.6.2 Cathepsin L

Cathepsin L (OMIM 116880; Uniprot P07711; IUBMB EC 3.4.22.15) ist eine lysosomale

Cysteinproteinase. Der offizielle Name des Gens nach HUGO Gene Nomenclature Committee

(HGNC) lautet CTSL. Die Hauptfunktion dieses Enzyms liegt in der intrazellulären

Proteindegradation.

Das Protein hat eine relative Molekülmasse (Mr) von 37.564. In der SDS Polyacrylamid Gel

Elektrophorese zeigt sich für Procathepsin L eine Masse von 38-41 kDa, 28 kDa für die

Einzelketten-Form, 24 kDa für die schwere Kette und ca. 4 kDa für die leichte Kette.

18

Preprocathepsin L ist ein Polypeptid von 333 Aminosäuren. Es setzt sich zusammen aus

einem Signalpeptid [Pre-] (p.1 – 17 Länge 17 AS), einem Aktivierungspeptid [-pro-] (p.18 –

113 Länge 96 AS), einer schweren Kette (p.114 – 288 Länge 175 AS), einem weiteren

Propeptid (p.289 – 291 Länge 3 AS) und einer leichten Kette (p.292 – 333 Länge 42 AS).

Die Schnittstelle zwischen leichter und schwerer Kette liegt bei Asn291-Asn. Es finden sich

drei Disulfidbrücken-Bindungen (Cys135/Cys178, Cys169/Cys211, Cys269/Cys322). Die

Aminosäuren Cys138, His276 und Asn300 sind von besonderer Bedeutung für die

katalytische Aktivität, sie bilden die aktiven Zentren. Der isoelektrische Punkt liegt für

Cathepsin L bei einem pH von 5,0-6,3.

1986 wurden erstmalig Teile der Aminosäuresequenz von Cathepsin L entschlüsselt37. Joseph

et al. 38 haben 1988 die vollständige Nukleotidsequenz von murinem und humanem

Cathepsin L beschrieben.

Das CTSL Gen liegt auf dem langen Arm des Chromosoms 9 in der Region 21.33. Es besteht

aus acht Exons und sieben Introns. Bislang wurden fünf unterschiedliche Splicevarianten mit

zwei unterschiedlichen Promotoren beschrieben, die unterschiedliche Expressionsraten

derselben Aminosäuresequenz zeigen39-42.

19

Abbildung 2 Splicevarianten von Cathepsin L Splicevarianten von Cathepsin L stark modifiziert nach Caserman43. Das CTSL Gen ist durch einen grauen Rahmen gekennzeichnet. In hellblau sind die Exone in rot die kodierenden Sequenzen dargestellt. Das erste Exon enthält keine kodierende Sequenz, somit liegt das Startcodon und die mit 1 gekennzeichnete kodierende Sequenz in Exon zwei. Die Variante hCATL-A umfasst das gesamte erste Exon. Die Varianten hCATL-A1, hCATL-A2 und hCATL-A3 unterscheiden sich von hCATL-A in der Länge von Exon 1. In 3‘ Richtung wird hier das Exon beim Spleißen unterschiedlich gekürzt. Die Variante hCATL-B startet von einem alternativen Promotor40 in Intron1 und ein Teil des Intron 1 (schwarzer Rahmen) wird transkribiert. CAVE! DARSTELLUNG IN GEBRÄUCHLICHER NOMENKLATUR DER PUBLIKATIONEN; WEICHT VON GENEBANK UND HGNC AB

Nach und nach wurden immer mehr der mannigfaltigen Funktionen und Interaktionen von

Cathepsin L aufgedeckt. Cathepsin L wurde zuerst in Lysosomen der Rattenleber

nachgewiesen, das L steht hierbei für die lysosomale Lokalisation 44. Bereits in den 70er

Jahren konnte auch eine Expression in maligne transformierten Zellen nachgewiesen

werden. In den ersten Experimenten konnte nur eine starke Expression eines Proteins

nachgewiesen werden, das man auf Grund seiner starken Expression in Tumorzellen MEP

(Major excreted polypeptide) taufte.

Noch bevor bekannt wurde, dass es sich bei MEP auch um Cathepsin L handelt 45 46, schlug

Gottesmann 1978 vor, MEP als Marker für maligne Entartung und die Kanzerogenität von

Zellen zu verwenden, da dieses Protein von vielen malignen Zellen überexprimiert wird.

Seitdem konnte in vielen Tumoren eine erhöhte Expression von CTSL nachgewiesen

werden47-49. Auch beim duktalen Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse konnte eine

Expression von CTSL im Tumor nachgewiesen werden, die bei erhöhtem Nachweis im

CTSL1 Gen

1 2 3 4 5 6 7

3001 4001 5001200110011

1

1

1

1

1

hCATL-A

hCATL-A1

hCATL-A2

hCATL-A3

hCATL-B

20

Resektat50 und bei erhöhtem Cathepsin L Serum Level51 mit schlechter Prognose assoziiert

ist.

In der akuten Pankreatitis fungiert Cathepsin L wahrscheinlich als Gegenspieler vom

Cathepsin B und inaktiviert Trypsinogen und Trypsin durch proteolytische Spaltung52 53.

1.6.3 Cathepsine in der Pankreatitis

In den pankreatischen Azinuszellen werden die Proteasen, so auch Trypsin, als inaktive

Vorstufen, sogenannte Zymogene synthetisiert, die durch Abspaltung eines Polypeptides

aktiviert werden. Die physiologische Aktivierung von Trypsin erfolgt erst nach Sekretion in

das Duodenum durch Enterokinase, ein Enzym, welches im Bürstensaum des Dünndarmes

lokalisiert ist54. Die Verdauungsenzyme werden als inaktive Proteasen in Zymogengranula

gespeichert und in ihrer inaktiven Form sezerniert. Außer den Verdauungsenzymen

produzieren die Azinuszellen, wenn auch in etwas geringerer Menge, unter anderem saure

Hydrolasen, die für die Zellhomöostase von Bedeutung sind. Zu den sauren Hydrolasen

zählen unter anderem Cathepsin B und Cathepsin L, die in Lysosomen sortiert werden.

Sowohl die sekretorischen Verdauungsenzyme als auch die lysosomalen Proteasen werden

in das raue Endoplasmatische Retikulum (ER) synthetisiert.

Die sekretorischen Enzyme werden dann über den Golgi Apparat in Vakuolen transportiert,

aus denen sich die Zymogengranula entwickeln. Eine Fusion dieser Zymogengranula mit der

apikalen Zellmembran der Azinuszellen führt zur Sekretion der enthaltenen Proteine.

Die lysosomalen Hydrolasen werden im Golgi Apparat über eine Mannose-6-Phosphat

Markierung55 in prälysosomale Kompartimente mit niedrigem pH sortiert56. Die Lysosomen

sind im Zusammenspiel mit anderen Zellorganellen wie z.B. den Endosomen, Phagosomen

und Autophagosomen an der Verwertung von Zellmetaboliten wie Kohlenhydraten, Fetten,

Eiweißen und Nukleinsäuren beteiligt57.

Im Rahmen einer akuten Pankreatitis kommt es bereits in frühen Stadien in den Azinuszellen

zu einer Sekretionsblockade und intrazellulären Aktivierung der digestiven Enzyme mit

einem konsekutiven Selbstverdau des Organes14. Eine besondere Rolle scheint hier dem

Trypsin zuzukommen, das die meisten anderen Proteasen im Pankreassekret aktivieren

kann58.

21

Eine Theorie, die verfrühte Aktivierung – also noch vor Sekretion in den Dünndarm – zu

erklären, ist die Kolokalisationshypothese59. Sie besagt, dass die im Pankreas produzierten

Proteasen mit lysosomalen Hydrolasen in zytoplasmatischen Vakuolen aufeinander treffen

und somit Trypsinogen z.B. durch CTSB aktiviert werden kann60.

Im gesunden Pankreas kommt die Aktivierung von Trypsinogen durch Cathepsin B schon

deswegen nicht zum Tragen, weil die Enzyme in unterschiedliche subzelluläre

Kompartimente verteilt werden.

In mehreren voneinander unabhängigen Studien konnte in unterschiedlichen Tiermodellen

der Pankreatitis gezeigt werden, dass diese Trennung in frühen Stadien der Pankreatitis

aufgehoben wird61-65. Während in den frühen Phasen der Pankreatitis weiterhin

Verdauungsenzyme gebildet werden, kommt es zu einem Stopp der Sekretion dieser Enzyme

aus den Azinuszellen. Die Kolokalisationshypothese wird von van Acker et al. als dreistufige

Hypothese zusammengefasst (übersetztes Zitat):

„(A) dass die Störung der normalen intrazellulären Sortierung von Verdauungs Zymogenen

und lysosomalen Hydrolasen ein sehr frühes Ereignis in der Entwicklung der Pankreatitis ist,

und daß in Folge dieser Störung, Verdauungsenzym Zymogene mit lysosomalen Hydrolasen

innerhalb von zytoplasmatischen Vakuolen der Azinuszellen kolokalisiert werden;

(B) dass als Ergebnis dieses Kolokalisierungsphänomens, die lysosomale Hydrolase Cathepsin

B (und höchstwahrscheinlich andere lysosomale Hydrolasen) Trypsinogen aktiviert und

Trypsin die anderen Zymogene aktiviert; und

(C) dass die Organellen, die intrazellulär aktivierte Verdauungs-Zymogene enthalten, fragil

werden und ihren Gehalt an aktivierten Enzymen in das Cytoplasma abgeben, wo diese

Enzyme Veränderungen auslösen, die zu Zellschädigung und -tod führen.“60

Möglicherweise tritt diese Kolokalisitation auch physiologisch im gesunden Pankreas auf,

Tooze et. al. beschreiben den Nachweis von Cathepsin B neben dem erwarteten Vorkommen

in Lysosomen in etwa halbierter Konzentration auch im sekretorischen Kompartiment des

gesunden Pankreas in der Ratte66. Neuere Daten zeigen, dass CTSB auch im sekretorischen

Kompartiment vorhanden ist und dort auch aktiviert wird. Eine Fusion ist nicht zwingend

nötig um Trypsinogen zu Trypsin zu aktivieren.52 Ebenso gibt es auch schon ältere Daten, die

aufzeigen, dass CTSB für eine Sekretion von Zymogenen essentiell ist und zusammen mit den

Zymogenen sekretiert wird. Dies ist zumindest ein sehr starker Hinweis darauf, dass sich

beide Enzyme im selben Kompartiment befinden.67 Es ist daher davon auszugehen, dass

22

noch weitere Mechanismen außer der räumlichen Verteilung der Enzyme an der Regulation

der Proteaseaktivierung beteiligt sind.

Die vorzeitige Aktivierung von Trypsinogen als Auslöser einer akuten Pankreatitis ist

insbesondere im Zusammenspiel mit Cathepsin B gut untersucht. Cathepsin B kann Trypsin

aktivieren68 69, die Gabe eines CTSB Inhibitors verringert die Trypsinaktivität und den

Schweregrad der experimentellen Pankreatitis in vitro70 und in vivo71. Bei CTSB -/- Mäusen

zeigt sich eine deutlich verringerte Trypsinaktivität mit weniger schwerem Verlauf der

experimentellen Pankreatitis72.

Ein weiteres Indiz für die zentrale Rolle von Trypsin in der Pankreatitis sind die Auswirkungen

von Mutationen im Trypsin. Autosomal dominante Trypsinogen Mutationen sind in den

meisten Fällen über eine vermehrte Trypsinaktivität mit einer Penetranz von bis zu 93 % 73

kausal an der Entstehung einer hereditären Pankreatitis beteiligt16.

Trypsinogen mit der p.N29I Mutation wird durch CTSB zweieinhalb bis dreimal so schnell

aktiviert, wie das Wildtyp Trypsinogen74. PRSS1 (kationisches Trypsinogen) mit der p.R122C

Mutation wird durch Cathepsin B langsamer aktiviert, als der Wildtyp 75, zeigt aber eine

verringerte Autolyse und eine verstärkte Autoaktivierung.

Zu der Aktivierung von mutiertem Trypsin durch Cathepsin B gibt es allerdings auch

widersprechende Daten, die darauf hinweisen, dass die häufigsten Mutationen im PRSS1

Gen keine veränderte Aktivierung durch Cathepsin B zur Folge haben76.

23

1.7 Zielsetzung

SPINK1 mit der N34S Mutation wird von Cathepsin L schneller degradiert, als die

Wildtypvariante. Nach unserer Hypothese könnte eine verstärkte Aktivität von Cathepsin L

zu einer noch schnelleren Degradation von SPINK1 führen und damit die Entstehung einer

Pankreatitis begünstigen. Eine herabgesetzte Aktivität von Cathepsin L könnte den Abbau

von SPINK1 verlangsamen und damit eine protektive Wirkung entfalten.

Eine wahrscheinliche Erklärung für eine Änderung der Aktivität von Cathepsin L wäre eine

Mutation auf DNA Ebene.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist herauszufinden, ob Mutationen im CTSL Gen die

Penetranz der Pankreatitis bei Trägern einer p.N34S Mutation beeinflussen.

Hierfür werden zunächst entsprechende Vergleichskollektive definiert. Es werden Patienten

mit einer p.N34S Mutation und idiopathischer Pankreatitis gegen gesunde Individuen mit

einer p.N34S Mutation verglichen.

Eine lokale Kohortenstudie wird für die p.N34S Mutation genotypisiert, um die lokale

Prävalenz zu bestimmen und aus den p.N34S+ Individuen die Kontrollgruppe ohne

Pankreatitis zu rekrutieren. Aus zwei deutschen Pankreasreferenzzentren werden die

p.N34S+ Patienten mit idiopathischer Pankreatitis rekrutiert, hierfür wird, sofern noch nicht

vorhanden, der p.N34S Mutationsstatus erhoben. Um Veränderungen in der enzymatischen

Aktivität durch eine Alteration der genomischen DNA (und somit eine veränderte

Genexpression oder eine Änderung der Aminosäuresequenz) zu detektieren, wurde die

gesamte exonische Sequenz mit Exon/Intron Übergängen, die 5‘ UTR sowie die ersten vier

Introns von Cathepsin L in beiden Gruppen untersucht. Hieraus ergeben sich die Kernfragen:

1. Gibt es in den beiden Kollektiven überhaupt genetische Alterationen im CTSL Gen?

2. Falls ja, sind diese zwischen den beiden Gruppen unterschiedlich verteilt? Gibt es eine

signifikante Häufung von CTSL-Sequenzvarianten bei Patienten mit Pankreatitis im Sinne

krankheitsprädispositionierender Mutationen? Oder gibt es eine signifikante Häufung von

CTSL-Sequenzvarianten bei gesunden Trägern der Spink1 p.N34S Mutation im Sinne

protektiver Mutationen?

3. Lässt sich aus den Varianten ein möglicher Effekt auf die CTSL-Aktivität ableiten?

24

2 Material und Methoden

2.1 Studienteilnehmer

Alle Studienteilnehmer haben nach erfolgter Aufklärung schriftlich in die Untersuchung

eingewilligt, im Falle von minderjährigen Patienten erfolgte die Zustimmung durch die

Eltern. Ein positives Ethikvotum liegt vor.

2.1.1 Patienten mit idiopathischer chronischer Pankreatitis und N34S Mutation im SPINK1

Von 1998 bis in das Jahr 2008 wurden Patienten mit Pankreatitis in zwei

Pankreasreferenzzentren (Münster und Greifswald) rekrutiert. Aus diesen wurde im

Rahmen dieser Arbeit das Patientenkollektiv mit idiopathischer chronischer Pankreatitis und

N34S Mutation im SPINK1 selektiert. Die Patienten mit Pankreatitis wurden durch TaqMan

Analyse auf Vorliegen der SPINK1 N34S Mutation genotypisiert. Die Identifikation der N34S

Träger per Realtime PCR wurde durch Sanger Sequenzierung validiert.

Die Diagnose der chronischen Pankreatitis umfasste neben wiederkehrenden

Entzündungsschüben (n>3), entsprechenden Laborwerten (Amylase oder Lipase > 3x oberer

Norm in der Entzündung) auch eindeutige Zeichen in der bildgebenden Diagnostik im

Ultraschall, dem endoskopischen Ultraschall (EUS), der Computertomographie (CT), der

Magnetresonanztomographie (MRT), der endoskopischen retrograden

Cholangiopankreatikographie (ERCP) oder der Magnetresonanz-

Cholangiopankreatikographie (MRCP). Eine idiopathische Pankreatitis wurde diagnostiziert,

wenn keine anderen Risikofaktoren identifiziert werden konnten.

Im Einzelnen ergeben sich hieraus folgende Ausschlusskriterien: Riskanter Alkoholkonsum

(Männer > 24g/d; Frauen >12g/d), die Anamnese oder der Nachweis von Gallensteinen,

Mutationen im Trypsin (PRSS1) und Hinweise auf chronische Lungenerkrankungen oder

direkte Hinweise auf zystische Fibrose.

Im Falle von mehreren betroffenen Familienangehörigen wurden alle bis auf den

Indexpatienten von der weiteren Analyse ausgeschlossen.

Die Genotypsierung für Trypsinmutationen erfolgte größtenteils per

Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) im Rahmen der Routinediagnostik und

war kein Bestandteil dieser Arbeit.

25

2.1.2 SPINK1 N34S Mutations-Träger ohne Pankreatitis

Um gesunde SPINK1 N34S Mutationsträger zu identifizieren, wurden die Probanden der

SHIP-Studie (Study of health in Pomerania)77 mit TaqMan Analysen auf N34S-Mutationen in

SPINK1 untersucht. Ausschlusskriterien für diese Studie waren eine Pankreatitis in der

Vorgeschichte sowie rezidivierende Bauchschmerzen und erhöhte Serum Lipase.

26

2.2 Material

2.2.1 Verbrauchsmaterialien

BigDye Sequencing Puffer (5x) Applied Biosystems® Life Technologies GmbH, Frankfurter Straße 129B, 64293, Darmstadt, Deutschland BigDye Terminator v3.1

Agencourt AMPure XP - PCR Purification Beckman Coulter GmbH, Europark Fichtenhain B 13, 47807, Krefeld, Deutschland Agencourt CleanSEQ - Dye Terminator

Removal Agarose (Roti®Garose) Carl Roth GmbH, Schoemperlenstraße 1, 76185 Karlsruhe,

Deutschland Ethanol PCR-Gefäße 0.2 mL, farblos Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH, Peter-Henlein-Straße 2,

50389, Wesseling/Berzdorf, Deutschland Safe-Lock Tubes, 0,5 mL Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Safe-Lock Tubes, 2.0 mL 6X DNA Loading Dye Fermentas UAB, V.Graiciuno 8, LT-02241 Vilnius, Litauen GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder GeneRuler™ DNA Ladder, Low Range PCR Master Mix (2X) 96-well Platten Greiner Bio-One GmbH, Maybachstraße 2, 72636

Frickenhausen, Deutschland Zentrifugenröhrchen, Spitzboden 15 ml, 50 ml ZR Genomic DNA II KitTM (Zymoresearch) Hiss Diagnostics GmbH, Tullastraße 70, 79108 Freiburg im

Breisgau, Deutschland Primer Invitrogen GmbH, Emmy-Noether Straße 10, 76131 Karlsruhe,

Deutschland Taq DNA Polymerase Kit QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, 40724 Hilden, Deutschland QIAamp® DNA Mini Kit QIAquick PCR Purification Kit FastRuler Low Range DNA Ladder Thermo Scientific™ molecular biology and protein biology

products, Fisher Scientific GmbH, Im Heiligen Feld 17, 58239 Schwerte, Deutschland

Tabelle 1 Verbrauchsmaterialien

2.2.2 Gebrauchslösungen

Agarose Gel Ladepuffer (6x) 0,25 % Bromphenolblau 0,25 % Xylocyanol 30 % Glycerol 50 mM EDTA Aqua dest.

TAE-Puffer 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA Aqua dest.

Tabelle 2 Gebrauchslösungen

27

2.2.3 Geräte

Electrophoresis Power Supply EPS 301 Transformator

Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Munzinger Str. 9, 79111, Freiburg im Breisgau, Deutschland

3130 XL Genetic Analyzer 16 Kapillar Sequencer

Applied Biosystems® Life Technologies GmbH, Frankfurter Straße 129B, 64293, Darmstadt, Deutschland 7500 Real-Time PCR System RT

Thermocycler 96-Well Magnet Beckman Coulter GmbH, Europark Fichtenhain B 13, 47807,

Krefeld, Germany

Beckman GS-6KR Kühlzentrifuge Biomek® 3000 Labratory Automation Workstation Labroboter Stuart® block heater SBH200D/3 Heizblock Bibby Scientific Limited (Group HQ), Beacon Road, Stone, ST15

OSA, Staffordshire, United Kingdom PowerPac Basic™ Power Supply Transformator für Agarosegele

BIO-RAD Laboratories GmbH, Heidemannstr. 164, 80939, München, Deutschland

CMC 2895 DS Mikrowelle Candy S.p.A., Via comolli 16, 20861, Brugherio (MB), Italien Mastercycler epgradient S Eppendorf AG, Barkhausenweg 1, 22339, Hamburg, Deutschland

Eppendorf Thermomixer compact Heizblock mit Schüttler 5415R Kühlzentrifuge 5417R Kühlzentrifuge 100 - 1000 µl Research® Pipette 12-Kanal Research® Pipette 2 – 20 µl Research® Pipette Pipette 20 - 200 µl Research® Pipette 8-Kanal Research® Pipette Multipette® Pipette LaminAir® HB2436 Sterilwerkbank Heraeus instruments GmbH, Postfach 1561, 63450, Hanau,

Deutschland Magnetrührer IKA®-Werke GmbH & CO KG, Janke & Kunkel-Str. 10, 79219,

Staufen, Deutschland

MS2 Minishaker Vortexer

UV-Transilluminator LTF - Labortechnik GmbH & CO KG, Hattnauer Str. 18 , 88142, Wasserburg (Bodensee), Deutschland

Feinwaage Explorer Pro Feinwage Ohaus Europe GmbH, Heuwinkelstrasse 3, CH-8606, Nänikon, Schweiz

Gel Wannen Agarosegelapparatur peqLab Biotechnologie GmbH - VWR International GmbH, Hilpertstraße 20a, 64295, Darmstadt, Deutschland

peqSTAR 96 Universal Gradient

Tabelle 3 Geräte

28

2.2.4 Software

Software Hersteller 7500 System Sequence detection Software 1.3.1

http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/support/software/real-time-pcr/ab-7500.html

Applied Biosystems

Acrobat XI Pro https://www.acrobat.com Adobe Biomek® Software 3.3 http://www.beckmancoulter.com Beckman Coulter Endnote X7 http://www.endnote.com Thomson Reuters Excel 2007 http://www.microsoftstore.com Microsoft Gentle 1.9.4 http://gentle.magnusmanske.de Magnus Manske GPower 3.1.9 http://www.gpower.hhu.de Heinrich Heine

Universität Düsseldorf

PHASE 2.1 http://stephenslab.uchicago.edu/software.html#phase University of Washington

Primer Blast http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ NCBI Prism 6.04 http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ GraphPad

Software Variant Reporter 1.1 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/

4385270 Applied Biosystems

Word 2007 http://www.microsoftstore.com Microsoft Χ²-Test http://www.tufts.edu/~mcourt01/Documents/Court lab -

HW calculator.xls Michael Court

Tabelle 4 Software

2.3 Methoden

2.3.1 DNA Extraktion

Die Gewinnung der DNA erfolgte aus EDTA Vollblutproben der Patienten mit Hilfe des

QIAamp® DNA Mini Kits entsprechend den Vorgaben des Herstellers. Die Blutproben wurden

zumeist frisch verarbeitet, andernfalls bei -20°C gelagert und zur weiteren Verarbeitung bei

Raumtemperatur aufgetaut.

Als erster Schritt wurden 1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäße mit 20 µl Proteinase K befüllt.

Diese wurden dann mit 200 µl Buffy Coat oder, im Falle einer Hämolyse, 200 µl Blut befüllt.

Nach Hinzugabe des Lysepuffers (Buffer AL) wurde das Reaktionsgefäß verschlossen und für

15 s auf dem Vortexer geschüttelt. Nach diesem mechanischen Lyseschritt erfolgte eine

Inkubation bei 56 °C im Heizblock für 10 Minuten. Zur Fällung der DNA wurden hierauf 200

µl hochreinen Alkohols (>96 %) hinzugefügt und erneut mit dem Vortexer vermischt. Die

Probe wurde dann in eine QIAamp Mini spin column überführt, die in einem

Eppendorfreaktionsgefäß platziert wurde. Mit einem Zentrifugationsschritt von 6.000 g für

eine Minute wurde die Probe durch die Säule in das Auffanggefäß überführt und die

Flüssigkeit verworfen. Die DNA bindet in diesem Schritt reversibel an der Säule. Zur weiteren

29

Aufreinigung erfolgte eine erneute Zentrifugation mit 6.000 g für eine Minute nach

Hinzugabe von 500 µl Waschpuffer (Buffer AW1) und eine dritte Zentrifugation nach

Hinzugabe des zweiten Waschpuffers (Buffer AW2) mit 20.000 g für drei Minuten. Die

Flüssigkeit wird erneut verworfen und die Probe in einem weiteren Zentrifugtionsschritt bei

höchster Umdrehungszahl getrocknet, um eine Verschleppung der Waschpuffer zu

vermeiden. Um die DNA von der Säule wieder zu lösen, erfolgte eine Inkubation über 5 min

bei Raumtemperatur mit dem Lösungspuffer (Buffer AE). Mit einem letzten

Zentrifugationsschritt bei 6.000 g für eine Minute wurde die DNA dann in

Eppendorfreaktionsgefäße überführt. Die Lagerung erfolgt bei -20 °C.

2.3.2 Gelelektrophorese

Zur Erfolgskontrolle der DNA Aufreinigung und der Polymerasekettenreaktionen wurden

Agarose Gelelektrophoresen durchgeführt. Das Prinzip einer Gelelektrophorese beruht auf

einem Molekularsiebeffekt des jeweiligen Gels. Die aufzutrennenden Moleküle, in diesem

Fall die DNA, können sich in Abhängigkeit von der Molekülgröße unterschiedlich schnell

durch das Gel bewegen. Um eine Bewegung durch das Gel zu induzieren, wird eine

elektrische Spannung angelegt. Die negativ geladene DNA bewegt sich in diesem Feld zur

Anode. Größere Moleküle bewegen sich langsamer als kleinere, somit ist eine Auftrennung

nach der Größe möglich.

Zum Nachweis der DNA enthalten die Agarosegele Ethidiumbromid, einen Farbstoff, der

zwischen den Basen der DNA interkaliert (lat. Intercalare = einschieben). Bei Anregung mit

UV-Licht verstärkt sich die Fluoreszenz von Ethidiumbromid nach Interkalation um den

Faktor ~ 75. Somit erscheinen DNA Moleküle gleicher Größe als leuchtende Bande im

Agarosegel. Je nach erwarteter Molekülgröße wurden für die Gele unterschiedliche

Agaroseanteile verwandt. Je höher der Agaroseanteil des Gels ist, desto langsamer wandern

die DNA-Moleküle.

2.3.3 Herstellung von Agarosegelen

Zur Herstellung von 1%igen Agarosegelen wurden ein Liter 1xTAE Puffer (Tabelle 2

Gebrauchslösungen) und 10 g Agarose (respektive 20 g für 2%ige Gele) in einer Mikrowelle

30

erhitzt und zu einer homogenen Flüssigkeit verrührt. Nach leichtem Abkühlen wurden 2 µl

Ethidiumbromid hinzugefügt.

Diese Flüssigkeit wurde in die Gelelektrophoresekammern gegossen und ist dort zu

Auftrennungsgelen ausgehärtet. Durch eingehängte Kämme wurden entsprechende

Geltaschen im Gel geformt, die der späteren Probenbeladung dienten. In den meisten Fällen

kamen 1%ige Agarosegele zum Einsatz, bei Molekülgrößen < 500 bp wurden regelhaft 2%ige

Agarosegele benutzt.

2.3.4 Beladung von Agarosegelen

Die Gele wurden in den Gelektrophoresekammern mit dem Laufpuffer (1x TAE Puffer)

übergossen und mit den entsprechenden PCR Produkten beladen. Der Kamm wurde

entfernt, nachdem die Kammer mit Puffer gefüllt wurde. Auf diese Weise werden Luftblasen

in den Kammern vermieden. Zur Größeneinordnung der PCR Produkte wurde immer ein

DNA-Marker mitgeführt.

2.3.5 Genotypisierung von Sequenzvarianten mittels TaqMan-Analyse

Die Genotypisierung dieser Studie basiert auf einem kommerziell zu erwerbenden Kit

(TaqMan® Assay C__11157434_10 von Applied Biosystems (jetzt lifeTechnologies)). Das

Grundprinzip der TaqMan® Assays ist die Ausnutzung des Förster-Resonanzenergietransfers78

79 (kurz FRET), manchmal auch Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer genannt. Wird ein

Fluorochrom mit Licht einer bestimmten Wellenlänge (A1) angeregt, emittiert es Licht mit

einer spezifischen Wellenlänge (E1). Die Anregungs- und Emissionsspektren sind individuelle

Charakteristika der Fluorochrome. Wenn E1 dem Anregungsspektrum eines zweiten

Fluorochromes (A2) entspricht, kann bei ausreichend niedrigem Abstand der Moleküle

zueinander die gesamte Energie vom zweiten Molekül in dessen Emissionsspektrum E2

umgewandelt werden. E1 wird in diesem Fall nicht mehr messbar emittiert. Beim TaqMan

Genotypisierungs-Assay kommen im Rahmen der PCR zusätzlich zu den Primern

sequenzspezifische Sonden zum Einsatz, die mit am 5‘-Ende und am 3‘-Ende jeweils mit

einem entsprechenden Fluorochrom gekoppelt sind. Das Emissionsspektrum des

Fluorochroms am 5‘-Ende (E1) entspricht dem Anregungsspektrum des Fluorochroms am 3‘-

Ende (A2). Durch die geringe Länge dieses Oligomeres liegen die beiden Fluorochrome im

31

Ausgangszustand dicht genug beieinander für den Förster-Resonanzenergietransfer. Das

Fluorochrom am 3‘-Ende wird hierbei als Quencher (engl. = Löscher) bezeichnet, da das

Emissionsspektrum (E2) außerhalb des detektierbaren Bereiches liegt. Es kommt also bei

Anregung nicht zu einer messbaren Fluoreszenz. Das 3‘-Ende der Sonde ist zudem durch ein

weiteres Molekül blockiert, damit die Sonde nicht als Primer fungieren kann. Wenn diese

Sonde nun im Annealing der PCR an die DNA bindet, wird sie durch die 5‘->3‘

Exonukleaseaktivität der DNA Polymerase abgebaut. Somit wird der vorher definierte

geringe Abstand des ersten Fluorochromes (Reporter) vom zweiten (Quencher) erhöht, was

in einer entsprechenden Fluoreszenz bei Anregung resultiert. Mit zwei unterschiedlichen

Reporter Fluorochromen, die jeweils an eine entsprechende Sonde gekoppelt sind, ist somit

die Unterscheidung zwischen zwei Allelen im Rahmen einer PCR-Reaktion möglich. Ein

weiteres drittes Fluorochrom, welches nicht an der Reaktion teilnimmt, dient als

Normalisierung, um eventuelle Volumenschwankungen – wie z.B. durch Pipettierfehler –

auszugleichen. Bei diesem Setting ist lediglich eine relative Quantifizierung notwendig, da

nur drei unterschiedliche Genotypen bestimmt werden (homozygot AA, heterozygot AB,

wildtype BB).

32

Abbildung 3 Schematische Darstellung des TaqMan Assays Modifiziert nach Abbildung des Herstellers. Die Sonden sind jeweils mit einem Farbstoff und einem Quencher markiert. Bei Anregung leuchtet VIC® grün und FAM™ blau. Bei intakter Sonde können jedoch weder grünes noch blaues Licht detektiert werden, da das emittierte Licht jeweils dem Anregungsspektrum des Quenchers entspricht, der durch wenige Nukleotide in räumlicher Nähe zu dem Farbstoff gehalten wird. Kommt es zum matching der Sonde im Rahmen der PCR wird durch die Exonuklease-Aktivität der DNA Polymerase die räumliche Verbindung von Farbstoff und Quencher aufgehoben.

2.3.6 Durchführung TaqMan Assay

Für ein Reaktionsvolumen von 5 µl wurden 0,25 µl TaqMan Genotyping Assay Mix mit 2,5 µl

Genotyping Master Mix und 2,25 µl Template DNA vermengt. Dies entspricht einer

Konzentration der Primer von 900 nM und der Proben von 250 nM bei ca. 1-10 ng DNA

Template.

Der Thermocycler (7500 Real-Time PCR System Applied Biosystems®) wurde mit folgendem

Protokoll programmiert: Beginn mit einem modifizierten Hot-Start (Aufheizen des Cyclers

auf 95°C und Pausieren bei dieser Temperatur). Nach Einsetzen der Proben dann 10 min

initiale Denaturierung bei 95°C und 40 Zyklen mit einer Denaturierung bei 95 °C für 15 s,

Annealing und Elongation bei 60 °C für 60 s. Dann wurde die Reaktion durch Abkühlen auf

4°C unterbrochen.

Bestandteile des TaqMan Assays

Denaturierte DNA und Bestandteile des Assays

Signalentstehung durch räumliche Trennung von Fluoreszenzfarbstoff und Quencher

G

Sonde

A

Sonde

G

SondeSense Primer

DNA Template

DNA Template

DNA Template

Antisense Primer

A

Sonde

A

Nicht komplementäre Sonde

Sense Primer

Antisense Primer

5'3' [C]

5'3'

3'5'[G]

[C]

CPassende Bindung

GSense Primer Neu synthetisierter Strang

P

P

P

V

V

VF

VIC® dye

FAM™ dye

Quencher

Minor Groove Binder

AmpliTaq Gold®DNA Polymerase, UP

V

P

F

Q

MGB

Q

Q

QQ

Q Q

F

F

33

2.3.6.1 Thermocyclerprotokoll für TaqMan PCR

Thermocycler 95°C " 95°C 10 min 95°C 15 s

40 Zyklen 60°C 60 s 04°C "

Tabelle 5 Genotypisierung TaqMan Thermocyclerprotokoll 7500 Real-Time PCR System Applied Biosystems® Life Technologies GmbH

2.3.6.2 Pipettierprotokoll für TaqMan PCR

Taq Man Genotyping Assay Mix 0,25 µl

Genotyping Master Mix 2,5 µl DNA Template 4 ng/µl 2,25 µl 5 µl

Tabelle 6 Genotypsierung TaqMan Reaktionsansatz Die Genotypisierung für die Spink N34S Mutation erfolgte mit dem TaqMan® Assay C__11157434_10.

34

2.3.7 Polymerasekettenreaktion (PCR)

Die Polymerasekettenreaktion ist ein Verfahren, um definierte Abschnitte der DNA zu

vervielfältigen. Sie basiert auf einer Reproduktion des DNA Doppelstranges anhand eines

DNA Einzelstranges. Um einen definierten DNA Abschnitt zu amplifizieren, benötigt man:

Spezifische Primer für beide Stränge der DNA, Desoxyribonukleosidtriphosphate, eine

Ausgangssequenz, die vervielfältigt wird und ein Enzym(DNA-Polymerase), welches diese

Reaktion ermöglicht. Das Protokoll besteht dann aus repetitiven Schritten mit spezifischer

Dauer und Temperatur. Das Grundprinzip ist hierbei immer ein Dreischritt aus

Denaturierung, Hybridisierung und Elongation. In der Denaturierungsphase wird die

doppelsträngige DNA durch Temperaturen um 95°C in Einzelstränge aufgetrennt. In der

Hypbridisierungsphase binden jetzt die Primer an die Einzelstränge, damit die DNA-

Polymerase in der folgenden Elongationsphase die DNA am 3‘-Ende des Primers

komplementär zu dem vorliegenden Einzelstrang fortschreiben kann.

2.3.8 Primerdesign

Das Primerdesign erfolgte mit der Software gentle (s. Tabelle 4 Software). Als

Referenzsequenz diente das NCBI RefSeq transcript NM_001912.4 contig/assembly

NC_000009. GC-reiche Regionen wurden bevorzugt ausgewählt, um eine hohe Spezifität zu

erreichen. Eine Kontrolle möglicher Fehlpaarungen (durch Sequenzhomologien) erfolgte mit

der Web Applikation Primer Blast vom NCBI (National Center for Biotechnology Information).

Die Primer wurden vom Hersteller (Invitrogen GmbH) als Lyophilisat geliefert, im Labor auf

eine Konzentration von 100 µmol/l eingestellt und bei -20°C gelagert.

35

2.3.9 Primersequenzen

Lokalisation Interne Bezeichnung Sequenz 5’UTR und Exon 1-2 92'08 CTSLPro-S1 5’-GGTGATTGTGCTTCTAAAAGAGTT-‘3 96'08 CTSLPro-AS1 5’-GGGTGCAGCTGGGCTTTAGA-‘3 93'08 CTSLPro-S2 5’-TCTAAAGCCCAGCTGCACCC-‘3 97'08 CTSLPro-AS2 5’-GGGCTGGTGCACACCTACTC-‘3 94'08 CTSLPro-S3 5’-GAGTAGGTGTGCACCAGCCC-‘3 98'08 hsCTSLPro-AS3 5’-CCATGTTGGCCAGGCTGGTC-‘3 95'08 CTSLPro-S4 5’-GACCAGCCTGGCCAACATGG-‘3 99'08 CTSLPro-AS4 5’-AAGGCAGCAAGGATGAGTGT-‘3 Exon 2-3 11'07 CTSB-CDS1-S 5’-CCTTGGCCTCTTCCACAGTCCTTGGG-‘3 12'07 CTSB-CDS1-AS 5’-CATCACCTGCCTGAATTCTTCACTGGTCT-‘3 Exon 4-5 13'07 CTSB-CDS2-S 5’-TGAACGCCTTTGGAGACATGGTAAGTGTGC-‘3 14'07 CTSB-CDS2-AS 5’-GCCTGGCTCAGCCTCCTAAAGGGC-‘3 Exon 6 15'07 CTSB-CDS3-S 5’-ACCCAGAGGTCTCATTGAAGAGACTGGAG-‘3 22'07 CTSB-CDS3-AS 5’-CTATGATGCTAAGCACCTAAATATCTACACT-‘3 Exon 7 23'07 CTSB-CDS4-S 5’-TAAATGAGAGCTTAAATCCCTGGCCTTCTTA-‘3 24'07 CTSB-CDS4-AS 5’-GGATGTCTTTGCAGCCAGATATGCCTCA-‘3 Exon 8 16'07 CTSB-CDS-5S 5’-TGGAGGCTGGGATGGAAATTATGTCCAGG-‘3 17'07 CTSB-CDS-5AS 5’-CACTCGGATCTTCAATGATTCGAGTGTGTA-‘3 Sequenzierungsprimer Exon 4 72'07 CTSL-34S 5’-CTGTGGACTGCCGAGCTCTG-‘3 76'07 CTSL-CDS3AS 5’-GACTTTGACAACAGCTCACACATC-‘3 Exon 5 75'07 CTSL-CDS4S 5’-GTGGATGACAGCTTTTTTTAATTCCC-‘3 71'07 CTSL-34AS 5’-GGGCTGGGATTACAGGCGTGAG-‘3 Exon 8 74'07 CTSL-5-S 5’-CAGGAACATTGCCTGTCCTGATTC-‘3 73'07 CTSL-5-AS 5’-GAGTGTGTATCCGACACAGCGG-‘3

Tabelle 7 Primer Primer für Amplifikation und Sequenzierung, die laborinterne Bezeichnung der Primer für die kodierende Sequenz enthält die in diesem Fall inkorrekte Bezeichnung CTSB-CDS. Aus Gründen der Konsistenz wurde diese Bezeichnung beibehalten.

2.3.10 Etablierung der Reaktionsbedingungen PCR

Vor Beginn der Amplifikation beider Kohorten wurden die PCR Protokolle getestet und

optimiert. Mit Hilfe eines Temperaturgradienten wurde die beste Annealing-Temperatur

bestimmt. Hierzu wurde die Annealing-Temperatur über die 96-Well Platte des

Thermocyclers mit einem von links nach rechts verlaufenden Gradienten beheizt, um die

optimale Annealing-Temperatur approximativ zu finden.

36

2.3.11 PCR Protokolle

Der Heizblock wurde jeweils vor Einsetzen der Proben auf die Denaturierungstemperatur

vorgeheizt und dann auf dieser Temperatur gehalten. Dies ist durch das Pause Symbol "

(typographisches Anführungszeichen) gekennzeichnet. Hierauf folgte regelhaft eine initiale

Denaturierung, dann der Hauptzyklus mit Denaturierung, Annealing und Elongation sowie

eine terminale Elongationsphase. Um weitere ungewollte Reaktionen zu vermindern, wurde

der Heizblock nach der PCR abgekühlt und bis zur Entnahme der Proben kühl gehalten.

Zur Qualitätskontrolle wurde auch bei jeder PCR mindestens ein None Template Control,

mitgeführt. In dieser ist keine DNA enthalten, so dass eine Amplifikation von DNA in der NTC

auf eine Verunreinigung, genauer gesagt auf eine Kontamination mit DNA, schließen lässt.

Ausgenommen hiervon sind kleinste DNA Bruchstücke, die unter entsprechenden PCR

Bedingungen auch aus Primerdimeren entstehen können.

2.3.11.1 PCR Protokoll

Temperatur Zeit Zyklen Hot Start 95°C " Intiale Denaturierung 95°C 5 min Denaturierung 95°C 30-35 s }

} 35-40 Zyklen }

Annealing 55,4-70°C 30-45 s Elongation 70-72°C 1:10-2 min Terminale Elongation 72° 5 min Kühlung 04°C " Tabelle 8 Amplifikation Thermocyclerprotokoll Allgemein Die Zeiten, Temperaturen und Zyklenzahl wurde jeweils für die entsprechenden Abschnitte optimiert.

2.3.12 Durchführung Amplifikation

Die Amplifikations PCRs wurden auf einem peqSTAR 96 Universal Gradient (peqLab

Biotechnologie GmbH) oder einem Mastercycler epgradient S (Eppendorf Vertrieb

Deutschland GmbH) mit dem Qiagen Taq DNA Polymerase Kit oder Fermentas 2x PCR

Mastermix nach unten stehenden Protokollen mit durchgeführt. Für den Fall einer

unzureichenden Spezifität und bei der Amplifikation des Promotors wurde die Konzentration

der Template DNA verdoppelt und die Konzentration der Primer um 25 % reduziert.

37

2.3.12.1 Pipettierprotokoll für Amplifikations PCRs Qiagen

Endkonzentration H2O 39,5 µl Qiagen PCR Puffer (10x) 5 µl 1x Sense Primer 1 µl 2 nM Anti-S Primer 1 µl 2 nM dNTPs 1 µl 0,2 mM (jeweils) Taq-Polymerase 0,5 µl 2,5 U DNA Template ~2 µl 5 – 50 ng 50 µl

Tabelle 9 Amplifikation Reaktionsansatz Qiagen

2.3.12.2 Pipettierprotokoll für Amplifikations PCRs

Fermentas 2x PCR Mastermix 12,5 µl

Primer Sense 100 µmol/l 1 µl Primer Antisense 100 µmol/l 1 µl H2O 9,5 µl Template DNA 30 ng/µl 1 µl

25 µl Tabelle 10 Amplifikation Reaktionsansatz Fermentas 2x Master

2.3.12.3 Alternatives Pipettierprotokoll für Amplifikations PCRs

Fermentas 2x PCR Mastermix 12,5 µl

Primer Sense 100 µmol/l 0,75 µl Primer Antisense 100 µmol/l 0,75 µl H2O 9 µl Template DNA 30 ng/µl 2 µl

25 µl Tabelle 11 Amplifikation alternativer Reaktionsansatz 2x Master

2.3.13 Aufreinigung der PCR Produkte

Um die amplifizierte DNA als Template für die weitere folgende Sequenzierungsreaktion zu

nutzen, erfolgte eine Aufreinigung mittels alkoholischer Fällung unter Nutzung magnetischer

Mikropartikel, Agencourt AMPure von Beckman Coulter nach den Anweisungen des

Herstellers. Das Prinzip entspricht der Aufreinigung der Sequenzierungsreaktion und wird für

diese im Folgenden genauer beschrieben.

38

2.3.14 Sequenzierungsreaktion

Abbildung 4 Adenosintriphosphat (ATP) protoniert Ribonukleosidtriphosphat, die 5‘-OH-Gruppe ist mit drei Phosphatgruppen verestert. An dem C1‘ Atom findet sich Adenin, die Pentose ist in diesem Fall Ribose, sowohl am C2‘- als auch am C3‘-Atom findet sich eine Hydroxygruppe. Aus diesen Bausteinen wird die RNA gebildet, wobei zwei Phosphatrese lediglich als Energiespeicher dienen und beim Anbau abgespalten werden. Der Phosphatrest an der 5’-OH-Gruppe bindet kovalent an die 3‘-Hydroxygruppe des vorherigen Nukleosids.

Abbildung 5 Desoxyadenosintriphosphat (dATP) protoniert Desoxyribonukleosidtriphosphat, die 5‘-OH-Gruppe ist mit drei Phosphatgruppen verestert. An dem C1‘ Atom findet sich Adenin, die Pentose ist in diesem Fall Desoxyribose, am C3‘-Atom findet sich eine Hydroxygruppe, am C2‘-Atom fehlt ein Sauerstoffatom (Desoxy-). Aus diesen Bausteinen wird die DNA gebildet, wobei zwei Phosphatrese lediglich als Energiespeicher dienen und beim Anbau abgespalten werden. Der Phosphatrest an der 5’-OH-Gruppe bindet kovalent an die 3‘-Hydroxygruppe des vorherigen Nukleosids.

Abbildung 6 Didesoxyadenosintriphosphat (ddATP) protoniert Desoxyribonukleosidtriphosphat, die 5‘-OH-Gruppe ist mit drei Phosphatgruppen verestert. An dem C1‘ Atom findet sich Adenin, die Pentose ist in diesem Fall Desoxyribose, am C3‘-Atom findet sich eine Hydroxygruppe, am C2‘-Atom und am C3‘Atom fehlt jeweils ein Sauerstoffatom (Didesoxy-). Bei dem Einbau von Didesoxynukleosiden kommt es zu einem Kettenabbruch, da die Hydroxygruppe an C3‘ fehlt, an der das nächste Nukleosid angebaut werden würde.

Die Sequenzierung erfolgte nach der Kettenabbruchmethode nach Sanger80. Es handelt sich

bei der Sequenzierreaktion um eine modifizierte PCR. Hierbei werden zum Reaktionsansatz

2’,3’-Didesoxynucleosidtriphosphate hinzugefügt. Die Untersuchung des CTSL erfolgte auf

einen 16 Kapillar Sequencer (3130 XL 16 Kapillar Sequencer Applied Biosystems).

Die Sequenzierungsreaktion erfolgte mit dem BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit

von Applied Biosystems nach folgendem Ansatz: Für ein Reaktionsvolumen von 10 µl wurden

39

5,45 µl H2O mit 2 µl Sequenzierungspuffer, 0,3 µl (0,1 mM) Sequenzierungs Primer, 0,25 µl

RR-Premix (Applie Biosystems) und ~ 2µl Template DNA vermengt. Dies entspricht einer

Konzentration des Primers von 0,003 mM und ~ 5-50 ng DNA Template.

Sequenzierung Endkonzentration H2O 5,45 µl Puffer 2 µl Seq-Primer 0,3 µl 3 nM RR-Premix (40x) 0,25 µl 1 x DNA Template ~2 µl PCR 5 – 50 ng 10 µl

Tabelle 12 Sequenzierung Reaktionsansatz

Der Thermocycler wurde mit folgendem Protokoll programmiert: Beginn mit einem

modifizierten Hot-Start (Aufheizen des Cyclers auf 96°C und pausieren bei dieser

Temperatur). Nach Einsetzen der Proben dann 2 min initiale Denaturierung bei 96°C und 30

Zyklen mit einer Denaturierung bei 96°C für 10 s, Annealing bei 50°C für 10s und einer

Elongation bei 60°C für 3 min. Dieser Zyklus wurde 30-mal wiederholt, dann wurde die

Reaktion durch Abkühlen auf 4°C beendet.

Thermocycler 96°C " 96°C 2 min 96°C 10 s

30 Zyklen 50°C 10 s 60°C 3 min 04°C "

Tabelle 13 Sequenzierung Thermocyclerprotokoll

2.3.15 Aufreinigung der Sequenzierungsreaktion

Die Aufreinigung der Sequenzierungsreaktion erfolgte mittels Agencourt CleanSEQ - Dye

Terminator Removal von Beckman Coulter GmbH nach dem Herstellerprotokoll.

Zuerst wurde die CleanSEQ-Lösung auf Raumtemperatur (RT) gebracht (Lagerung bei 4°C)

und vollständig resuspendiert. Danach wurden zu jedem Reaktionsvolumen aus der

vorangegangenen Sequenzierungsreaktion je 10 µl CleanSEQ hinzugefügt. Danach wurde die

DNA mit 42 µl 85%-Ethanol gefällt. Der Ansatz wurde dann bis zur vollständigen

Homogenität gemischt und danach für mindestens 3 min auf der Magnetplatte inkubiert.

Durch die Ethanolfällung bindet die DNA in diesem Schritt an die magnetic Beads, die sich

wiederum durch die Magnetplatte an der Außenwand der Reaktionsgefäße sammeln. Die

40

nun klare Lösung wurde abpipettiert und verworfen. Es erfolgte ein zweiter Waschschritt mit

30 s Inkubation von 100 µl 85%-Ethanol, der anschließend abpipettiert wurde. Danach

wurde das Reaktionsgefäß bei RT ca. 10 min getrocknet. Nach dem vollständigen Trocknen

des Alkohols wurden 60 µl Wasser dispensiert, es erfolgte eine erneute manuelle

Durchmischung mit der Pipette und 3-5 min Inkubation bei RT. In diesem Schritt wurde die

DNA wieder von den Beads gelöst. Der Ansatz wurde dann wieder für ca. 3 min auf der

Magnetplatte inkubiert und danach 40 µl des klaren Eluats in eine neue Auftragsplatte

transferiert. Ein Restvolumen von Wasser in der Platte verhindert den Transfer von

magnetischen Beads in die Auftragsplatte.

Diese Schritte erfolgten entweder von Hand mit einer 12-Kanal Pipette von Eppendorf oder

mit Hilfe eines Laborroboters (Beckman Coulter Biomek 3000).

Abbildung 7 Agencourt CleanSEQ Schematische Darstellung des Aufreinigungsprozesses, Abbildung des Herstellers.

2.3.16 Auswertung der Sequenzierung

Die Elektropherogramme wurden mit Variant Reporter® Software v1.1 zuerst einer strengen

Qualitätskontrolle unterzogen, danach erfolgte das Alignment an die Referenzsequenz für

Cathepsin L.

Zur Qualitätskontrolle erfolgte die automatische Auswertung der Signal to noise Ratio der

Elektropherogramme. In der Nomenklatur der benutzten Software (Variant Reporter)

handelt es sich hierbei um den PUP (peak under peak) Score. Hierbei wird das Verhältnis der

Signalstärke der gewerteten Base zum zweithöchsten Peak berechnet. Alle

Elektropherogramme mit einem Wert < 4 wurden von der weiteren Untersuchung

ausgeschlossen und die Sequenzierung wiederholt.

Weiterhin wurde die durchschnittliche Qualität der einzelnen Basecalls (automatischen

Zuordnungen des optischen Signals zu einer DNA Base) ausgewertet. Jeder Base wurde ein

Qualtitätswert (QV = Quality Value) zugeordnet. Für diesen Wert gilt Quality Value (QV) = -

41

10Log10 Pe (Pe = Probability of error). Bei einem QV von 20 ist mit einer

Fehlerwahrscheinlichkeit von ca. 1 % zu rechnen.

Für die Elektropherogramme wurde aus dem QV der einzelnen Basen im weiterverwendeten

Anteil des Elektropherogrammes dann ein Durchschnittswert errechnet, der sogenannte

Trace Score. Elektropherogramme mit einem Trace Score < 25 entsprechend einer

durchschnittlichen Fehlerwahrscheinlichkeit von > 0,31 % wurden von der weiteren

Untersuchung ausgeschlossen und die Sequenzierung wiederholt.

Auch die erreichte Leseweite wurde automatisiert ausgewertet. In Variant Reporter wird

durch Softwarealgorithmen der Anfang und das Ende des Elektropherogrammes von der

weiteren Analyse ausgeschlossen, wenn die Sequenzierungsqualität zu schlecht ist. Für den

Fall, dass durch dieses sogenannte Trimming die erwartete Leseweite um mehr als 50 %

unterschritten wurde, wurden die entsprechenden Elektropherogramme von der weiteren

Untersuchung ausgeschlossen und die Sequenzierung wiederholt.

Alle Elektropherogramme wurden von einem Untersucher gesichtet, alle gefundenen

Varianten wurden zudem durch mindestens zwei unabhängige Untersucher bestätigt. Für

den Fall, dass in erster Sichtung die Genotypisierung nicht sicher möglich war, wurden die

zuvor ausgefilterten Elektropherogramme gesichtet und in die Entscheidung einbezogen,

sofern die entsprechenden Teilabschnitte von ausreichender Qualität waren. Bei nicht

ausreichender Qualität oder nicht übereinstimmender Bewertung durch die auswertenden

Untersucher wurde die Sequenzierung wiederholt.

Die Daten wurden pseudonymisiert ausgewertet, zu internen Kontrollzwecken wurden fünf

zufällig ausgewählte Patienten zweimal in die Sequenzierung einbezogen. Hier ergaben sich

keine widersprüchlichen Daten.

42

2.3.17 Promotor Analyse

Um potentielle Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren zu identifizieren führten wir eine

Analyse der sequenzierten 5‘ Region mittels Mapper281 82 durch. Die Variablen wurden wie

folgt definiert:

Gene: CTSL (cathepsin L1)

Gene ID: 1514 mRNA accession: NM_001912

Organism: Homo sapiens

Scanned region: 3000bp upstream of transcript start

Models: JASPAR models, MAPPER models, TRANSFAC models

Tabelle 14 Mapper2 Variablen

Entsprechend den Empfehlungen der Entwickler wurde ein Schwellenwert oberhalb der

neunzigsten Perzentile ausgewählt, um zu viele Falschpositive zu vermeiden.

In einem weiteren Ansatz wurden die gefundenen SNPs noch mit dem rSNPs MAPPER

untersucht. Die gefundenen potentiellen Bindungsstellen wurden dann in die

Referenzsequenz in gentle übertragen und auf Überschneidungen mit den gefundenen

Varianten geprüft.

43

2.4 Statistik

Für alle Varianten wurden die Verteilungen im dominanten und im rezessiven Modell

untersucht. Bei dem dominanten Modell wurde die Anzahl der Mutationsträger (homozygot

mutierte + heterozygot Mutierte) gegen die Anzahl der Wildtypen gerechnet. Im rezessiven

Modell wurde die Anzahl der homozygot Mutierten gegen Heterozygote + Wildtypen

gerechnet. Des Weiteren wurde die Allelhäufigkeit und deren Verteilung berechnet.

Aufgrund der niedrigen Fallzahlen wurden die p-Werte mit dem Fisher’s exact test83

berechnet. Die Berechnung erfolgte mit der Statistiksoftware Prism 6.04 (GraphPad

Software, Inc.). Geprüft wurde zuerst auf dem Signifikanzniveau α = 0,05. Für den Fall, dass

ein P < 0,05 errechnet wurde, erfolgte aufgrund multipler Testung noch eine Bonferroni

Korrektur.

Ferner wurde für alle Verteilungen der häufigen Varianten – definiert als Minor Allel

Frequenz (MAF) > 5 % – geprüft, ob sie im Hardy-Weinberg-Equilibrium liegen. Dies erfolgte

mit Excel 2007 (Microsoft) als Χ²-Test mit der frei zugänglichen Software von Michael Court

(s. Tabelle 4 Software).

2.4.1 Haplotypenanalyse

Auf der Basis der häufigen Varianten (MAF > 5 %) wurde mit der Software PHASE 2.184 85 eine

Haplotypenanalyse erstellt. Diese Analyse bezieht sich somit auf die 8 häufigsten Varianten

in dieser Untersuchung (Vergleiche Tabelle 18). Des Weiteren wurde mittels

Permutationstest nach signifikanten Unterschieden zwischen den Haplotypfrequenzen in der

Patienten- und der Kontrollgruppe gesucht. Mit Hilfe von PHASE 2.1 wurde die Null-

Hypothese, dass Patienten und Kontrollen einer zufälligen Stichprobe aus einer

Gesamtmenge entstammen, gegen die Alternative, dass die Patienten sich untereinander

mehr ähneln als den Kontrollen, getestet. Unter der Berücksichtigung von Ähnlichkeiten von

Haplotypen kann dieser Test noch Unterschiede detektieren, wenn die errechneten

Haplotypen sich alle voneinander unterscheiden und ist damit dem Vergleich von rein

dichotom unterschiedenen gleichen oder eben ungleichen Haplotypen überlegen.

44

2.4.2 Powerberechnung

Die Powerberechnung erfolgte mit GPOWER 3.1.9 86 87 als nachträgliche Testung der

erreichten Power.

45

3 Ergebnisse

Die Hypothese dieser Arbeit ist, dass Mutationen im Cathepsin L Gen die Penetranz der

Pankreatitis bei Trägern der N34S Mutation im SPINK1 modifizieren. Hierfür wurden N34S

Mutationsträger mit dem Phänotyp „chronisch idiopathische Pankreatitis“ gegen Individuen

mit dem Phänotyp „keine Pankreatitis“ für Mutationen im Cathepsin L Gen genotypisiert und

die Häufigkeitsverteilung von Mutationen verglichen.

3.1 Studienteilnehmer

Für den Phänotypen „chronisch idiopathische Pankreatitis“ wurden 2299 Patienten mit

Pankreatitis untersucht. Durch Nachweis einer chronischen Pankreatitis, Ausschluss von

anderen möglichen Ursachen einer Pankreatitis und Genotypisierung für die Spink1 N34S

Mutation verblieben in der Patienten Kohorte 68 Individuen (8-86 Jahre, Durchschnittsalter

33,32 Jahre, 64,7% männlich).

Die Kontrollgruppe mit dem Phänotyp „keine Pankreatitis“ wurde aus der SHIP-0 Kohorte

rekrutiert. Diese umfasst 4308 freiwillige Teilnehmer (2008 hiervon männlich,

Altersverteilung 20–81 Jahre) mit deutscher Staatsbürgerschaft und europäischer

Abstammung aus Mecklenburg Vorpommern. Unter 4308 Individuen fanden sich insgesamt

68 Merkmalsträger mit einer p.N34S Mutation im SPINK1, ohne Anamnese von

rezidivierenden Bauchschmerzen oder Pankreatitis. Dies entspricht einer Prävalenz von

1,6%.

Die Genotypisierung beider Kollektive für die p.N34S Mutation im SPINK1 wurde mit einer

TaqMan Analyse durchgeführt.

46

3.1.1 Amplifikations PCR Etablierung und Optimierung

Für den Vergleich der Mutationen im Cathepsin L wurde das Gen bidirektional sequenziert.

Hierfür wurden zunächst die Amplifikations PCRs etabliert. Die optimalen

Annealingtemperaturen für die jeweiligen Primer wurden mittels Temperaturgradienten PCR

bestimmt (Siehe Abbildung 8).

T in °C 50,00 51,82 53,64 55,45 57,27 59,09 60,91 62,73 64,55 66,36 68,18 70,00

DNA

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 001 A

002 B 003 C 004 D 005 E 006 F 007 G NTC H Abbildung 8 Skizze Plattenbelegung für Annealing-Gradienten

Schematische Darstellung einer 96-Well plate mit Temperaturgradienten und sieben unterschiedlichen Ausgangs-DNAs, um die optimale Annealing-Temperatur zu bestimmen.

Ein beispielhaftes Versuchsergebnis für die Auswertung einer Temperaturgradienten PCR

zeigt Abbildung 9. Aus dem Bild geht hervor, dass der optimale Ertrag zwischen den

Laufreihen aus Geltasche 9 bis 11 liegt. Basierend auf diesem Ergebnis wurde als

Annealingtemperatur 66°C gewählt, was in etwa Lane 10 (rechnerisch 66,36 °C, bei

kontinuierlichem Gradienten) entspricht.

1500

850

400

200

50

47

Abbildung 9 Agarosegel Annealing-Gradient Experimentelles Ergebnis zu Abbildung 8 1% Agarose Gel, 70 V, 45 min Laufzeit in 1xTAE Puffer. Belegung: In der ersten Lane ist der Größenstandard (FastRuler Low Range DNA Ladder, Größe in bp jeweils unter der Bande) aufgetragen, gefolgt von dem Cathepsin L Fragment 5 (beinhaltet Exon 8, Primer 16’07 & 17’07, Lane 1-12; 411 bp). Ganz rechts ist eine Non Template Control (NTC) aufgetragen. Von Lane 1 mit 50 °C steigt die Temperatur bis Lane 12 mit 70 °C kontinuierlich an.

Die Ergebnisse dieser Etablierung sind die in der folgenden Tabelle 15 PCR Bedingungen zur

Amplifikation zusammengefassten Protokolle.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

1500

850

400

200

50

48

Amplikon Annealing Elongation Zyklen Genomischer Kontext

5‘ UTR 55,4°C* 70°C# 35

PCR mit den Primern 92‘08 & 99‘08, Promotorfragment 2689

bp, umfasst den Bereich 1115 bp upstream von Exon 1, Exon 1

und Intron 1 sowie die entsprechenden Exon-Intron

Übergänge bis Beginn Exon 2.

1 69°C 72°C 35

PCR mit den Primern 11’07 & 12’07, Fragment 1 833 bp,

umfasst Exon 2 und 3 sowie die entsprechenden Exon-Intron

Übergänge. Intron 2 und 3 werden vollständig erfasst, lediglich

die letzten beiden Basen von Intron 3 werden vom Primer

überlappt, diese werden in dem Fragment 2a mit abgebildet.

2a 70°C 72°C 40

PCR mit den Primern 13’07 & 14’07, Fragment 2a 831 bp,

umfasst Exon 4 und 5 sowie die entsprechenden Exon-Intron

Übergänge. Intron 3 und 4 werden vollständig mit erfasst,

wobei der Primer die ersten 10 bp des Introns überlappt. Diese

sind in Fragment 1 mit erfasst. Von Intron 5 werden die ersten

127 bp erfasst. Da die Sequenzierung von Exon 5 in Sense

Richtung an einem Poly-A Signal zwischen Exon 4 und 5 immer

wieder artefaktbehaftet war, und diese Artefakte am ehesten

auf die Amplifikations PCR zurückzuführen waren, erfolgte eine

erneute Amplifikation von Exon 5 mit einem Sense Primer

downstream des Poly A Signals (s. Fragment 2b).

2b 58,3°C 72°C 30

PCR mit den Primern 75’07 & 14’07, Fragment 2b 409 bp,

umfasst Exon 5 sowie die entsprechenden Exon-Intron

Übergänge. Von Intron 5 werden die ersten 127 bp erfasst.

3 61°C 72°C 30

PCR mit den Primern 15’07 & 22’07, Fragment 3 484 bp,

umfasst Exon 6 sowie die entsprechenden Exon-Intron

Übergänge (172 bp upstream und 89 bp downstream von

Exon6).

4 66°C 72°C 30

PCR mit den Primern 23’07 & 24’07, Fragment 4 558 bp,

umfasst Exon 7 sowie die entsprechenden Exon-Intron

Übergänge (136 bp upstream und 245 bp downstream von

Exon7).

5 66°C 72°C 30

PCR mit den Primern 16’07 & 17’07, Fragment 5 411 bp,

umfasst Exon 8 sowie die entsprechenden Exon-Intron

Übergänge (160 bp upstream von Exon8 und 92 bp

downstream der kodierenden Sequenz).

Tabelle 15 PCR Bedingungen zur Amplifikation Ausgehend von den gleichen Grundeinstellungen waren in der Annealingzeit (45 s) und in der Elongationszeit (Elongation 70 s) nur in der Amplifikation des Promotorfragmentes Abweichungen notwendig.*Annealingzeit 30s, #Elongation 120s

49

3.2 PCR zur Amplifikation und Sequenzierung

Mit den etablierten PCR Protokollen erfolgte dann die die Amplifikation und Sequenzierung

des Cathepsin L Gens.

Die Primer 11’07 bis 24‘07 umfassen die komplette codierende Sequenz des Cathepsin L

Genes. Diese initial gewählten Primer waren zur Amplifikation und Sequenzierung der

entsprechenden DNA Abschnitte geplant (Vergl. Abbildung 10), in der Abbildung sind diese

oberhalb der codierenden Regionen dargestellt. In den meisten Fällen konnten für die

Amplifikation und die Sequenzierung dieselben Primer eingesetzt werden.

Bei den Amplifikationsfragmenten 2 (Exon vier und fünf) und Fragment 5 (Exon acht) waren

die Leseweite und Sequenzierungsqualität unter Nutzung der Amplifikationsprimer zur

Sequenzierung nicht ausreichend. Durch neu designte, weiter innen liegende

Sequenzierungsprimer konnte dieses Problem gelöst werden.

Das Fragment 5 wurde mit den Primern 73’07 und 74’07 erfolgreich sequenziert. Ein

weiteres Problem ergab sich in der Sequenzierung von Fragment 2. Bei der Nutzung der neu

designten Sequenzierungsprimer 72’07 und 71’07 war die Leseweite in der Sequenzierung

weiterhin nicht ausreichend.

Bei den Exons vier und fünf liegt zwischen der kodierenden Sequenz 3 und 4 ein Poly-A

Signal, ab dem sich in beide Richtungen trotz sehr umfangreicher Modifikation der

Reaktionsbedingungen und -ansätze reproduzierbare Lesefehler ergaben. Mit den

Sequenzierungsprimern 75’07 und 76’07 und einer jeweils einzelnen Amplifikation der

kodierenden Sequenz 4 mit den Primern 75’07 und 14’07 konnte auch dieses Problem gelöst

werden (vergl. Abbildung 10).

Abbildung 10 Primer für die kodierende Sequenz Das CTSL Gen ist durch einen grauen Rahmen gekennzeichnet. In hellblau sind die Exone, in rot die kodierenden Sequenzen dargestellt. Das erste Exon enthält keine kodierende Sequenz, somit liegt das Startcodon und die mit 1 gekennzeichnete kodierende Sequenz in Exon zwei. Die dünnen schwarzen Pfeile repräsentieren die Primer.

CTSL1 Gen

1 2 3 4 5 6 7

3001 4001 5001200110011

75‘07

76‘07 73‘07

74‘07

71‘07

72‘07

22‘07

23‘07

24‘07 17‘0714‘07 15‘07 16‘0711‘07

12‘07

13‘07

50

Zur Detektion von möglicherweise expressionsmodifizierenden Mutationen wurde die

Sequenzierung um die 5’UTR des Cathepsin L Gens erweitert.

Die Primer 92‘08 bis 99‘08 umfassen die 5‘UTR sowie das nicht kodierende Exon eins, Teile

von Exon zwei und das erste Intron.

Im Bereich des Promotors und des ersten Introns konnte die Effizienz deutlich gesteigert

werden, indem mit den Primern 92’08 und 99’08 eine PCR von 2689 Basenpaaren etabliert

werden konnte. Somit war mit einer Amplifikationsreaktion ein Template für acht

Sequenzierungsreaktionen erzeugt (Vergl. Abbildung 12 Agarosegel Promotorfragment).

Zur Sequenzierung dieses Amplikons wurden zusätzlich zu den o.g. sechs weitere Primer

93’08 bis 98’08 eingesetzt. Somit ergaben sich vier Teilstücke von einer jeweiligen Länge von

ca. 670 bp. Teilweise waren höhere Leseweiten möglich, was durch Überlappung zu erhöhter

Redundanz verringerter Fehlerwahrscheinlichkeit führte.

Abbildung 11 Primer Promotor und Intron1 Das CTSL Gen ist durch einen grauen Rahmen gekennzeichnet. In hellblau sind die Exone, in rot die kodierenden Sequenzen dargestellt. Die kurzen schwarzen Pfeile markieren den Startpunkt der Primer, die langen schwarzen Pfeile markieren die Amplifikationsstrecke der Primer 92’08 (Sense) und 99’08 (Antisense).

CTSL1 Gen

3001 4001 5001200110011

1 2 3 4 5 6 7

-100192‘08 93‘08 94‘08 95‘08

96‘08 97‘08 98‘08 99‘08

51

Nach Amplifikation erfolgte immer eine Qualitätskontrolle der PCR auf einem Agarosegel vor

Aufreinigung und Sequenzierungsreaktion. Beispielhaft sei hier die Amplifikationskontrolle

des Promotorbereiches gezeigt. Die Helligkeit der DNA Banden lässt auf eine gute Ausbeute

schließen. Die Spezifität der Reaktion ist daran zu erkennen, dass sich nur eine distinkte

Bande zeigt.

Abbildung 12 Agarosegel Promotorfragment 1% Agarose Gel, 70 V, 45 min Laufzeit in 1xTAE Puffer. Belegung: In der ersten Lane ist der Größenstandard (GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder) aufgetragen, gefolgt von dem Promotorfragment von 12 unterschiedlichen Probanden, welches zur Sequenzierung amplifiziert wurde (Lane 1-12; 2689 bp).

3.3 Varianten im CTSL

Es wurden alle kodierenden Abschnitte, der gesamte Bereich mit beschriebener Promotor-

Aktivität sowie flankierende Exon-Intron Übergänge des CTSL Gens bei 68 Patienten mit

chronischer idiopathischer Pankreatitis und 68 Kontrollen mit N34S Mutation im SPINK1 Gen

ohne Pankreatitis bidirektional sequenziert.

Insgesamt konnten bei der Sequenzierung 22 unterschiedliche Varianten detektiert werden.

Von den gefundenen Varianten kamen 14 in beiden Gruppen vor, vier der gefundenen

Varianten kamen nur bei Patienten mit chronisch idiopathischer Pankreatitis vor, weitere

vier nur in der Kontrollgruppe. Von den 22 sind sechs im Bereich des Promotors, sechs in

Exons und weitere zehn in den Introns lokalisiert. Die sechs exonischen Varianten beinhalten

zwei Varianten im Exon 1 und somit in nicht kodierender Sequenz, zwei synonyme Varianten

und zwei nicht-synonyme Varianten. Bei den nicht synonymen Varianten handelt es sich um

eine Missense-Mutation und eine Frameshift-Mutation, die eine Verschiebung des

Leserasters verursacht.

Eine Übersicht über alle gefundenen Varianten liefert Tabelle 16: Ergebnisse Alle Varianten.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

52

Position Nukleotid Austausch AS-

Austausch dbSNP Referenz Patienten (n = 68) Kontrollen (n = 68)

wt ht ho wt ht ho

5’ region

c.-984T>C - 67 1 0 68 0 0 c.-953A>T - rs56952354 68 0 0 65 2 1 c.-461C>A - rs3118869 26 30 12 22 25 21 c.-408C>A - rs41307457 63 3 2 60 4 4 c.-382G>A - 68 0 0 67 0 1 c.-379C>G - rs41304236 66 2 0 67 1 0

Exon 1 (5‘UTR)

c.-272delA - 67 1 0 68 0 0 c.-258C>T - rs41312184 67 1 0 67 1 0

Intron 1 c.-11+176C>T - rs58218735 68 0 0 67 1 0 c.-11+198G>T - rs57446091 44 22 2 42 24 2 c.-10-33C>G - rs10123692 63 5 0 65 2 1

Exon 2 c.5A>C, p.N2T rs112682750 67 1 0 66 2 0 c.97delA, p.K33fs 67 1 0 68 0 0

Intron 2 c.126+11C>T - rs184253842 67 1 0 66 2 0 c.126+31C>T - rs2274611 18 38 12 16 32 20 c.127-139T>C - rs188488647 68 0 0 67 1 0

Intron 4 c.397-34delT - 64 4 0 58 10 0 Exon 5 c.402G>A, p.Q134Q rs11541204 57 11 0 66 2 0

Intron 5 c.621+56A>C - rs2378757 6 35 27 5 25 38 c.621+62T>G - rs76587987 66 2 0 63 4 1

Exon 7 c.852A>C, p.G284G 67 1 0 68 0 0 Intron 7 c.902+195A>C - rs3128510 18 38 12 15 32 21

Tabelle 16: Ergebnisse Alle Varianten Die Nomenklatur der Mutationen erfolgte nach den Vorgaben der HGVS (Human Genome Variation Society)88 , einsehbar unter http://www.hgvs.org/mutnomen. Sofern diese in der dbSNP gelistet sind, werden die rs Nummern angegeben.

53

3.3.1 Typisches Elektropherogramm einer heterozygoten Mutation

3.3.2 Einteilung nach Häufigkeit der gefundenen Varianten

Zur weiteren statistischen Auswertung wurden die gefundenen Varianten in ihrer Häufigkeit

beurteilt. Definitionsgemäß beschreibt die MAF (minor allele frequency) die Häufigkeit des

zweithäufigsten Allels. Diese Festlegung ist wichtig, da eine Position in der DNA maximal vier

unterschiedliche Werte (=Basen) annehmen kann. Vereinfachend formuliert beschreibt die

MAF somit die Frequenz der häufigsten Mutation an einer Position. Das häufigste Allel wird

in dieser Betrachtung als Wildtyp angenommen.

Für die weitere statistische Auswertung wurden alle Varianten mit einer MAF > 5 % als

häufig definiert und zur weiteren Auswertung zusammengefasst. Die Varianten mit einer

MAF < 5 % wurden als selten definiert und in einer zweiten Gruppe zusammengefasst. Diese

Abweichung von der üblichen Definition, ein SNP sei mit einer Allelfrequenz von > 1% häufig,

ist der Zahl von 68 Individuen pro Gruppe geschuldet. 1% entspricht rechnerisch 1,36 Allelen

und damit funktionell 2 Allelen pro Kohorte. 5 % entspricht rechnerisch 6,8 und somit 7

Allelen pro Kohorte. Die Aussagekraft eines vier Felder Tests, in diesem Fall Fisher’s exact

Test, ist damit in der Gruppe MAF < 5 % sehr gering.

C 310 T G A G G C A G G C 320

A C G A C C A G C T 330

Abbildung 13 Elektropherogramm heterozygote Variante c.-461C>A Elektropherogramm eines Patienten mit heterozygoter Variante c.-461C>A an Position 324 im basecall der Sequenzierung (Pfeil). Das Signal für Adenosin und Cytosin ist an dieser Position in etwa gleich stark.

54

3.4 Allelhäufigkeiten

Die Allelhäufigkeiten sind für einundzwanzig der gefundenen zweiundzwanzig Varianten

gleichverteilt. Es zeigt sich lediglich bei der synonymen Variante c.402G>A (p.Q134Q)

ein signifikanter Unterschied, der auch schon im dominanten Vererbungsmodell beobachtet

wurde. Nach Bonferroni Korrektur (α/Anzahl der Tests, entsprechend 0,05/22 = 0,002) ist

kein signifikanter Unterschied mehr festzustellen.

Position Nukleotid Austausch Patienten (%)

Kontrollen (%) P

Odds ratio

MAF (%) EUR_AF (%)

(n = 136 Allele) (n = 136 Allele) [95% CI]

5’ region

c.-984T>C 0,7 0 1 - - - c.-953A>T 0 2,9 0,122 - 1,0 1 c.-461C>A 39,7 49,3 0,143 - 41,8 47 c.-408C>A 5,1 8,8 0,342 - 6,0 3 c.-382G>A 0 1,5 0,498 - - - c.-379C>G 1,5 0,7 1 - 0,3 1

Exon 1 (5‘UTR)

c.-272delA 0,7 0 1 - - - c.-258C>T 0,7 0,7 1 - 1,1 2

Intron 1 c.-11+176C>T 0 0,7 1 - 3,6 n.d. c.-11+198G>T 19,1 20,6 0,879 - 34,9 17 c.-10-33C>G 3,7 2,9 1 - 37,0 4

Exon 2 c.5A>C, (p.N2T) 0,7 1,5 1 - 0,1 0,13 c.97delA, (p.K33fs) 0,7 0 1 - - -

Intron 2 c.126+11C>T 0,7 1,5 1 - 0,2 0,40 c.126+31C>T 45,6 52,9 0,275 - 43,7 47 c.127-139T>C 0 0,7 1 - 0,0 n.d.

Intron 4 c.397-34delT 2,9 7,4 0,168 - - -

Exon 5 c.402G>A, (p.Q134Q) 8,1 1,5 0,0195* 5,896

[1,3-27,1] 2,6 5

Intron 5 c.621+56A>C 65,4 74,3 0,146 - 22,5 65 c.621+62T>G 1,5 4,4 0,282 - 3,8 4

Exon 7 c.852A>C, (p.G284G) 0,7 0 1 - - -

Intron 7 c.902+195A>C 45,6 54,4 0,182 - 41 47 Tabelle 17: Ergebnisse Allelhäufigkeiten Aufgeführt sind die relativen Allelhäufigkeiten. P-Werte wurden mit dem Fisher’s exact Test ermittelt. Odds ratio und 95 % Konfidenzintervall sind nur bei statistisch signifikantem Unterschied spezifiziert. MAF und EUR_AF sind Vergleichsdaten aus dem 1000 Genome Projekt89 sofern die Varianten dort erfasst sind. Unter MAF erfolgt die Angabe des selteneren Allels mit seiner relativen Häufigkeit. Unter EUR_AF ist die relative Häufigkeit des selteneren Allels in der europäischen Population aufgelistet. n.d. = nicht detektiert.

55

3.4.1 Verteilung der Varianten bei Fällen und Kontrollen

Eine Manifestation der gefundenen Varianten ist sowohl als dominanter als auch als

rezessiver Erbgang vorstellbar. Bei einer dominanten Vererbung reicht ein Allel und somit

eine heterozygote Variante zur Ausprägung des Phänotyps. Bei der rezessiven Vererbung

kommt es nur bei Vorhandensein von zwei veränderten Allelen und somit einer

homozygoten Variante zur Ausprägung des Phänotyps.

Die Verteilung der gefundenen Varianten wurde gegen die Nullhypothese, dass diese in

beiden Gruppen gleich verteilt seien, getestet. Aufgrund der niedrigen Zahlen (regelhaft n <

5 für einzelne Felder der 4-Felder Tafel erfolgte die Testung mit dem Fisher’s exact Test.

In Unkenntnis einer eventuellen funktionellen Relevanz der gefundenen Varianten erfolgte

die Testung jeweils im dominanten Modell (Anzahl der Mutationsträger gegen Wildtypen)

und im rezessiven Modell (Anzahl der homozygot Mutierten gegen Heterozygote und

Wildtypen).

56

3.5 Häufige Varianten MAF > 5 %

Unter den gefundenen Varianten haben acht eine Minor Allel Frequenz von > 5 %. Es handelt

sich hier um zwei Varianten im Promotorbereich, fünf Varianten liegen jeweils im Intron und

ein synonymer SNP liegt im Exon 5 (Vergl. Tabelle 18).

Im dominanten Vererbungsmodell zeigt sich hier lediglich für einen synonymen SNP im Exon

5 c.402G>A (p.Q134Q) eine signifikant unterschiedliche Verteilung. Die Merkmalsträger

sind mit 16,2 % bei den Patienten im Vergleich zu den Kontrollen (2,9 %) deutlich

überrepräsentiert (P = 0,02). Nach Bonferroni Korrektur für achtfache Testung muss das

Signifikanzniveau auf P < 0,05/8 = 0,00625 adjustiert werden. Nach konservativer Lesart ist

damit von einer Gleichverteilung auszugehen.

Die weiteren häufigen Varianten c.-461C>A, c.-408C>A (beide jeweils 5’UTR), c.-

11+198G>T (Intron 1), c.126+31C>T (Intron 2), c.397-34delT (Intron 4),

c.621+56A>C (Intron 5) und c.902+195A>C (Intron 7) zeigen im dominanten

Vererbungsmodell keine signifikanten Unterschiede in der Verteilung zwischen Patienten

und Kontrollen.

Position Nukleotid Austausch Patienten

(n = 68) Kontrollen

(n = 68) P Odds ratio

[95% CI]

Mutationsträger (%)

Mutationsträger (%)

5’ region c.-461C>A 42 (61,8) 46 (67,6)# 0,591 0,77

[0,38-1,56]

c.-408C>A 5 (7,4)# 8 (11,8)# 0,561 0,60 [0,18 - 1,92]

Intron 1 c.-11+198G>T 24 (35,3) 26 (38,2) 0,859 0,88 [0,44 - 1,77]

Intron 2 c.126+31C>T 50 (73,5) 52 (76,5) 0,843 0,85 [0,39 - 1,86]

Intron 4 c.397-34delT 4 (5,9) 10 (14,7) 0,156 0,36 [0,11 - 1,22]

Exon 5 c.402G>A (p.Q134Q) 11 (16,2) 2 (2,9) 0,0166* 6,37 [1,35 - 29,95]

Intron 5 c.621+56A>C 62 (91,2) 63 (92,6) 1 0,82 [0,24 - 2,83]

Intron 7 c.902+195A>C 50 (73,5) 53 (77,9) 0,690 0,79 [0,36 - 1,73]

Tabelle 18: Ergebnisse Häufige Varianten im dominanten Vererbungsmodell P-Werte wurden mit dem Fisher’s exact Test ermittelt. P-Werte und prozentuale Häufigkeiten wurden im dominanten Modell (Anzahl der Mutationsträger gegen Wildtypen) berechnet. #Werte nicht im HDW-Equilibrium

57

Im rezessiven Modell können für die zwei Varianten c.397-34delT (Intron 4) und

c.402G>A (p.Q134Q) (Exon 5) keine Aussagen getroffen werden, da keine homozygot

mutierten Individuen detektiert worden sind. Für c.-11+198G>T (Intron 1) zeigt sich eine

Gleichverteilung mit je 2,9 % homozygot Mutierten in beiden Gruppen. Bei den weiteren

fünf Varianten c.-461C>A, c.-408C>A (beide jeweils 5’UTR), c.126+31C>T

(Intron 2), c.621+56A>C (Intron 5) und c.902+195A>C (Intron 7) sind die

prozentualen Abweichungen in der Verteilung im Fisher’s exact Test statistisch nicht

signifikant unterschiedlich (Vergl. Tabelle 19).

Position Nukleotid Austausch Patienten (n = 68) Kontrollen (n = 68) P

Homozygote (%) Homozygote (%)

5’ region

c.-461C>A 12 (17,6 %) 21 (30,9 %) 0,109 c.-408C>A 2 (2,9 %) 4 (5,9 %) 0,680

Intron 1 c.-11+198G>T 2 (2,9 %) 2 (2,9 %) 1 Intron 2 c.126+31C>T 12 (17,6 %) 20 (29,4 %) 0,156 Intron 4 c.397-34delT 0 0 1 Exon 5 c.402G>A (p.Q134Q) 0 0 1 Intron 5 c.621+56A>C 27 (39,7 %) 38 (55,9 %) 0,086 Intron 7 c.902+195A>C 12 (17,6 %) 21 (30,9 %) 0,109 Tabelle 19: Ergebnisse Häufige Varianten im rezessiven Vererbungsmodell P-Werte wurden mit dem Fisher’s exact Test ermittelt. P-Werte und prozentuale Häufigkeiten wurden im rezessiven Modell (Anzahl der homozygot Mutierten gegen Heterozygote und Wildtypen) berechnet.

3.5.1 Hardy-Weinberg-Equilibrium

Zur Qualitätskontrolle der Genotypisierung wurde getestet, ob die gefundene Verteilung der

Varianten dem Hardy Weinberg Equilibrium (HWE) entspricht. Eine Abweichung vom HWE

ist ein Indiz für einen Datenfehler und damit einen möglichen Genotypisierungsfehler. In

einer Fall-Kontrollstudie kann aber auch die Anreicherung eines disponierenden Allels in

einer Gruppe zur Abweichung vom HWE führen90. Bei beiden häufigen Varianten im

Promotorbereich gab es Abweichungen vom Hardy-Weinberg Equilibrium. Für c.-461C>A

zeigte sich in den Kontrollen eine Abweichung (P = 0,03) und für c.-408C>A zeigte sich in

Patienten (P = 6 *10-6) und Kontrollen (P = 2 *10-7) eine Abweichung.

58

3.5.2 Seltene Varianten MAF < 5 % Von den detektierten Varianten hatten vierzehn eine MAF < 5 % und wurden für die weitere

statistische Auswertung als selten definiert. Sieben dieser seltenen Varianten wurden jeweils

nur bei einem Individuum nachgewiesen. Die genaue Aufschlüsselung ist der Tabelle 20 zu

entnehmen. Die vier Varianten c.-984T>C, c.-272delA (beide 5‘UTR), c.97delA

(p.K33fs) (Exon 2) und c.852A>C (p.G284G) (Exon 7) wurden nur bei den

Patienten gefunden. Die drei Varianten c.-953A>T, c.-382G>A (beide 5‘UTR) und

c.127-139T>C (Intron 2) konnten nur bei den Kontrollen nachgewiesen werden. Es

liegen weder im dominanten noch im rezessiven Vererbungsmodell statistisch signifikante

Unterschiede in der Verteilung dieser seltenen Varianten zwischen Patienten und Kontrollen

vor .

Position Nukleotid Austausch Patienten (n = 68) Kontrollen (n = 68) P dominant P rezessiv wt ht ho wt ht ho

5’region

c.-984T>C 67 1 0 68 0 0 1 1 c.-953A>T 68 0 0 65 2 1 0,244 1 c.-382G>A 68 0 0 67 0 1 1 1 c.-379C>G 66 2 0 67 1 0 1 1

Exon 1 (5‘UTR) c.-272delA 67 1 0 68 0 0 1 1 c.-258C>T 67 1 0 67 1 0 1 1

Intron 1 c.-11+176C>T 68 0 0 67 1 0 1 1 c.-10-33C>G 63 5 0 65 2 1 0,718 1

Exon 2 c.5A>C, (p.N2T) 67 1 0 66 2 0 1 1 c.97delA, (p.K33fs) 67 1 0 68 0 0 1 1

Intron 2 c.126+11C>T 67 1 0 66 2 0 1 1 c.127-139T>C 68 0 0 67 1 0 0,441 1

Intron 5 c.621+62T>G 66 2 0 63 4 1 1 1 Exon 7 c.852A>C, (p.G284G) 67 1 0 68 0 0 1 1

Tabelle 20: Ergebnisse Seltene Varianten P-Werte wurden mit dem Fisher’s exact Test ermittelt. P-dominant wurde im dominanten Modell (Anzahl der Mutationsträger gegen Wildtypen), P rezessiv im rezessiven Modell (Anzahl der homozygot Mutierten gegen Heterozygote und Wildtypen) berechnet.

59

3.6 Haplotypenanalyse

Die Gene des Menschen liegen in redundanter Form vor, der Chromosomensatz wird jeweils

einmal von der Mutter und einmal vom Vater vererbt. Eine experimentelle Zuordnung der

Varianten zu jeweils dem väterlichen oder dem mütterlichen Chromosom ist theoretisch

möglich, wird aber aufgrund des hohen Aufwandes in praxi nicht durchgeführt. Mit einer

wahrscheinlichkeitsbasierten Analyse, die den Abstand der untersuchten Varianten auf dem

Chromosom mit einbezieht, können die Haplotypen mit einer geringen

Fehlerwahrscheinlichkeit berechnet werden. Da das menschliche Genom in Blöcken vererbt

wird, dienen in dieser Untersuchung die gefundenen Varianten als Marker der

entsprechenden Region. Aus der Haplotypenanalyse können also indirekt Rückschlüsse auf

den Bereich der verwendeten Marker gezogen werden, ohne die vollständige genomische

Sequenz untersucht zu haben.

Unter Berücksichtigung aller Varianten mit einer MAF > 5 % (n = 8, vergl. Tabelle 18) wurde

eine wahrscheinlichkeitsbasierte Haplotypenanalyse mit PHASE 2.184 85 durchgeführt. Sieben

der acht untersuchten Varianten waren SNPs, die unter der jeweils angegebenen reference

snp ID (rs) in der dbSNP91hinterlegt sind. Die Reihenfolge der Nukleotide entspricht der

Reihenfolge der Varianten auf dem Chromosom und somit c.-461C>A rs3118869, c.-

408C>A rs41307457, c.-11+198G>T rs57446091, c.126+31C>T rs2274611,

c.397-34delT (nicht gelistet in dbSNP), c.402G>A (p.Q134Q) rs11541204,

c.621+56A>C rs2378757, c.902+195A>C rs3128510.

Es konnten 17 Haplotypen (vergl. Tabelle 21) identifiziert werden, sechs dieser Haplotypen

kamen nur bei den Kontrollen vor, zwei nur bei den Patienten. Neun dieser Haplotypen

kamen sowohl bei Patienten, als auch bei den Kontrollen vor. Sie entsprachen 96 % aller

Chromosomen, bzw. 98,5 % aller Chromosomen der Patienten und 93,4 % aller

Chromosomen der Kontrollen.

Die Haplotypen zeigten sich in Patienten und Kontrollen gleich verteilt, mit Ausnahme des

Haplotyps Nummer 12, der als einziger das mutierte Allel c.402G>A enthielt. Dies zeigte

sich hier, wie auch schon im dominanten Vererbungsmodell, gehäuft bei den Patienten.

Nach Bonferroni Korrektur (α/Anzahl der Tests, entsprechend 0,05/17=0,003) war mit einem

P Wert von 0,0195 kein signifikanter Unterschied mehr zu konstatieren.

60

Im Permutationstest zeigte sich ein signifikanter Unterschied zwischen der Ähnlichkeit der

Haplotypen innerhalb der untersuchten Gruppen und der Ähnlichkeit der Haplotypen von

Patienten und Kontrollen P = 0.05.

Nukleotid Patienten (%) Kontrollen (%) P Odds ratio (n = 136) (n = 136) [95% CI] 1 A…C…G…T…T…G…C…C 51 (37,5) 60 (44,1) 0,324 - 2 A…C…G…T…-…G…C…C 3 (2,2) 4 (2,9) 1 - 3 A…C…G…T…-…G…A…C 0 1 (0,7) 1 - 4 A…C…G…C…T…G…C…C 0 1 (0,7) 1 - 5 A…C…T…C…T…G…C…A 0 1 (0,7) 1 - 6 C…C…G…T…T…G…C…C 6 (4,4) 4 (2,9) 0,749 - 7 C…C…G…T…-…G…C…C 1 (0,7) 0 1 - 8 C…C…G…C…T…G…C…C 0 1 (0,7) 1 - 9 C…C…G…C…T…G…C…A 1 (0,7) 0 1 -

10 C…C…G…C…T…G…A…A 46 (33,8) 33 (24,3) 0,109 - 11 C…C…T…C…T…G…C…A 10 (7,4) 14 (10,3) 0,522 -

12 C…C…T…C…T…A…C…A 11 (8,1) 2 (1,5) 0,0195* 5,9 [1,3-27,1]

13 C…C…T…C…-…G…C…A 0 3 (2,2) 0,247 - 14 C…A…G…T…T…G…C…C 1 (0,7) 1 (0,7) 1 - 15 C…A…G…T…-…G…C…C 0 2 (1,5) 0,498 - 16 C…A…G…C…T…G…A…A 1 (0,7) 1 (0,7) 1 - 17 C…A…T…C…T…G…C…A 5 (3,7) 8 (5,9) 0,572 -

Tabelle 21: Ergebnisse Haplotypen Berechnung der Haplotypen mit PHASE 2.1. Die Nukleotidreihenfolge der Varianten entspricht c.-461C>A, c.-408C>A, c.-11+198G>T, c.126+31C>T, c.397-34delT, c.402G>A (p.Q134Q), c.621+56A>C, c.902+195A>C. Die relative Position der Varianten zueinander ist in bp 1-54-649-1807-2595-2637-2912-4740. Die dem Wildtyp entsprechenden Basen sind grün, mutierte rot dargestellt. Die prozentuale Häufigkeit in Klammern bezieht sich auf alle Chromosomen der jeweiligen Kohorte (n = 136). Verteilungsunterschiede wurden mittels Fisher’s exact Test untersucht. Odds ratio und 95 % Konfidenzintervall sind nur bei statistisch signifikantem Unterschied spezifiziert.

Abbildung 14 Haplotypenverteilung Aufgetragen auf der x-Achse ist die Bezeichnung der Haplotypen, auf der y-Achse die absolute Häufigkeit (n=136 für beide Gruppen). ICP = ideopathisch chronische Pankreatitis, SHIP = Study of health in Pomerania.

0

10

20

30

40

50

60

70

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12* 13 14 15 16 17

ICP

SHIP

61

3.7 Poweranalyse

Sowohl das Patientenkollektiv als auch die Kontrollgruppe wurden so groß wie möglich

gewählt. Insgesamt wurden 4308 + 2299 = 6607 Individuen für den Einschluss in die Studie

überprüft. Eine Vergrößerung dieses Kollektives war nicht möglich, auf eine vorangestellte

Poweranalyse wurde daher verzichtet, da sie ohne Konsequenz verblieben wäre. Anders

verhält es sich allerdings für die nachträgliche Bewertung der Studie, insbesondere für die

Variante c.-461C>A (rs3118869). Für diesen SNP ist eine funktionelle Relevanz bereits

beschrieben 92 und bestätigt 93. In Kenntnis der Verteilung homozygoter Träger von 17,6 %

vs. 30,9 % ist unsere Power einen signifikanten Unterschied in 68 versus 68 Individuen mit

einem α < 0,05 zu detektieren für eine Abweichung in bekannte Richtung (one-tailed) 48,7%.

Für die synonyme Variante c.402G>A, (p.Q134Q) ergibt sich im Modell der

dominanten Vererbung in Kenntnis der Verteilung 16,2 % Mutationsträger bei den Patienten

und 2,9 % Mutationsträger bei den Gesunden folgende Teststärke: Mit einer Power von 81,7

% kann ein signifikanter Unterschied in 68 versus 68 Individuen mit einem α < 0,05 detektiert

werden für eine Abweichung in bekannte Richtung (one-tailed).

62

4 Diskussion

Die Mutation im SPINK1 p.N34S zeigt in vitro keine Veränderung der inhibitorischen

Aktivität33 94. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass SPINK1 mit p.N34S Mutation durch

Cathepsin L schneller degradiert wird, daher gehen wir bei der p.N34S Mutation von einem

Funktionsverlust aus. Die Prävalenz dieser Mutation beträgt ca. 1 % 33 94, die Inzidenz der

chronischen Pankreatitis beträgt 0,001-0,02 % in Europa 95. Das bedeutet, ungefähr jeder

Hundertste in unserer Gesellschaft ist Mutationsträger, es entwickelt aber jährlich nur ca.

jeder 20.000-100.000ste eine chronische Pankreatitis. Es sind also sehr wahrscheinlich

weitere krankheitsauslösende Faktoren beteiligt, die darüber entscheiden ob ein N34S

Mutationsträger erkrankt oder nicht.

Zur Überprüfung der Frage, ob CTSL Mutationen als weitere modifizierende Faktoren der

Pankreatitis bei Individuen mit p.N34S Mutationen eine Rolle spielen, wurde bei jeweils 68

Mutationsträgern mit und ohne Pankreatitis das CTSL Gen sequenziert.

4.1 Powerberechnung und Patientenkohorte

Aus 4308 zufällig ausgewählten Individuen (Teilnehmer von SHIP), die alle einer

Genotypisierung für die SPINK1 N34S Mutation unterzogen wurden, verblieben als

Kontrollgruppe 68 Individuen, die die Einschlusskriterien für diese Studie erfüllten.

Eine vorherige Powerberechnung war somit erstens nicht möglich und hätte zweitens keine

Konsequenz gezeitigt, da außerhalb der Study of Health in Pomerania keine vergleichbaren

Kollektive zur Verfügung standen. Zudem hätten rechnerisch jeweils 64 weitere Individuen

untersucht werden müssen, um einen weiteren Kandidaten für die Kontrollgruppe zu

akquirieren. Daher kann diese Kontrollgruppe nicht mit vertretbarem Aufwand vergrößert

werden.

Das Ausschlusskriterium Mutationen im kationischen Trypsin (PRSS1) ist anfänglich nur per

RFLP-Analyse untersucht worden, jedoch wurden später per Sanger-Sequenzierung die

häufigsten Mutationen in den Exons 2 und 3 ausgeschlossen. Es ergibt sich also fast keine

diagnostische Lücke für die PRSS1 Mutationen.

63

4.2 Lokale Prävalenz der Spink N34S Mutationen

Die N34S Mutation ist unter der Referenz rs17107315 in der dbSNP96 (The Single Nucleotide

Polymorphism Database of Nucleotide Sequence Variation) des NCBI (The National Center

for Biotechnology Information) verzeichnet. Für die N34S Mutation ist die publizierte MAF

C=0.006 (MinorAlleleCount 13 /(1094x2)). Die Häufigkeitsangabe dort bezieht sich auf das

Projekt 1000 Genome der Phase 1 und wird auf der Grundlage von 1094 weltweit

ausgesuchten Individuen berechnet. Die Zahlen beziehen sich auf die Veröffentlichung vom

Mai 2011. Die Prävalenz der SPINK1 N34S Mutation in der SHIP Kohorte (1,6 %) liegt in dem

Bereich mehrfacher Publikationen27 97 der Prävalenz einer gesunden europäischen

Bevölkerung.

4.3 Cathepsine in der Pankreatitis

4.3.1 Sequenzvarianten von Cathepsin B in der Pankreatitis

Cathepsin B kann, wie in der Einleitung erwähnt, Trypsin aktivieren. Auf der Grundlage der

Arbeiten zur Trypsinogenaktivierung durch Cathepsin B wurde Cathepsin B als wichtiges

Kandidatengen bei der Pankreatitis an einem indischen Kollektiv mit tropischer

kalzifizierender Pankreatitis auf assoziierte Sequenzvarianten untersucht. Es konnte eine

Assoziation der Mutation p.L26V (rs12338) mit der Erkrankung gezeigt werden 98, eine

Assoziation der Mutation p.L26V mit der SPINK1 p.N34S Mutation besteht nicht.

In einer früheren Publikation (Daten hier nicht gezeigt, Publikation im Anhang) konnten wir

(Weiß, F.U, Behn C.O. et al.) zeigen, dass diese Mutation bei Patienten mit kaukasischem

Hintergrund nicht mit der idiopathischen Pankreatitis assoziiert ist 99. Daten aus dem 1000

Genome Projekt 89 bestätigen die von uns gefundene hohe Allelfrequenz in der europäischen

Bevölkerung nachträglich. Die in der Arbeit von Mahurkar et. al. gefundene hohe Prävalenz

der Mutation p.L26V entspricht in etwa der Prävalenz in unserer Normalbevölkerung.

4.3.2 Cathepsin L

Die Rolle von Cathepsin L in der akuten Pankreatitis ist weitaus schlechter erforscht und

verstanden, als die von Cathepsin B. Cathepsin L wird im exokrinen Pankreas exprimiert und

64

in sowohl in lysosomale als auch in sekretorische Kompartimente sortiert. Ein gut etablierter

Aktivierungsmechanismus für Trypsinogen ist die Kolokalisation mit Cathepsin B. Die

Kolokalisation von CTSL und Trypsinogen scheint im Rahmen der induzierten Pankreatitis im

Tiermodell weiter zuzunehmen. Im Gegensatz zu Cathepsin B inaktiviert Cathepsin L

Trypsinogen durch eine Schnittstelle im Proenzym, die um drei Aminosäuren in Richtung des

C-Terminus verschoben ist. Hieraus resultiert ein verkürztes, inaktives Trypsin. Im CTSL

Knockout Mausmodell kommt es im Rahmen einer Taurocholatpankreatitis zur vermehrten

Apoptose und reduzierten Nekrose 53.

Im Tiermodell korreliert der Schweregrad der experimentellen Pankreatitis direkt mit dem

Ausmaß der Nekrose und es gibt eine inverse Korrelation mit dem Ausmaß der Apoptose100.

In der Zusammenschau der aktuellen Literatur muss man von einem pro-apoptotischen

Effekt von CTSB und einem anti-apoptotischen Effekt von CTSL in pankreatischen

Aszinuszellen ausgehen52.

Cathepsin L spaltet nicht nur Trypsinogen zu einem verlängerten TAP und einem funktionell

inaktivem, verkürztem Trypsin; es spaltet und inaktiviert auch Trypsin an der Position E82-

G83. Somit kann Cathepsin L als funktioneller Gegenspieler von Cathepsin B angesehen

werden. Während Cathepsin B Trypsin aktiviert, hat Cathepsin L eine inaktivierende Wirkung

auf Trypsin und Trypsinogen52 53.

Auf der einen Seite wird somit die funktionelle Relevanz von Cathepsin L in den Arbeiten von

Wartmann et. al.53 und Sendler et al.52 als eine Verschiebung der Effekte der Pankreatitis zu

verstärkter Nekrose und erhöhter Schwere der Erkrankung aufgezeigt und dieser Effekt kann

möglicherweise über verringerte Trypsinaktivität erklärt werden.

Auf der anderen Seite wird durch W. Halangk34 und in dieser Arbeit postuliert, dass die N34S

Mutation in Spink1 über einen beschleunigten Abbau von N34S mutiertem Spink1 durch

Cathepsin L möglicherweise über eine verminderte Trypsinhemmung zur Pankreatitis

präsdispositioniert. In einem Fall ist eine vermehrte Trypsinaktivität also schädlich und

erhöht die Wahrscheinlichkeit an einer Pankreatitis zu erkranken, im anderen Fall führt die

vermehrte Trypsinaktivität zu einer Verschiebung der Effekte der Pankreatitis zu vermehrter

Apoptose und verringerter Schwere der Erkrankung. Dieser scheinbare Widerspruch spiegelt

das noch immer lückenhaftes Verständnis der Enzymaktivierung in der Pankreatitis wider.

Wahrscheinlich ist die Trypsinaktivität per se nicht eindeutig als protektiv oder schädlich zu

65

werten, sondern muss immer im Kontext mindestens zum Zeitpunkt und zur subzellulären

Lokalisation gewertet werden.

In beiden Fällen scheint Cathepsin L in der Pankreatitis eine weit wichtigere Rolle zuzufallen

als bislang angenommen, auch wenn Mausmodelle nicht zwangsläufig die humane

Biochemie widerspiegeln.

Ein Effekt auf die Pankreatitis ist auch über vermehrte Invasion von neutrophilen Leukozyten

denkbar. Cathepsin L inaktiviert (unter anderem) den α1 Proteinase Inhibitor und damit ein

zentrales Steuerelement der humanen neutrophilen Elastase, die insbesondere für die frühe

Invasion der Leukozyten in der Pankreatitis von großer Bedeutung ist101, durch katalytische

Spaltung102. Auch secretory leukocyte protease inhibitor wird von CTSL gespalten103. Damit

unterstützt Cathepsin L die Leukozyteninvasion durch spezifische Spaltung von Inhibitoren

der Invasionsenzyme.

Möglicherweise liegt die krankheitsmodifizierende Rolle von Cathepsin L also nicht nur in der

Proteaseaktivierung sondern auch in der Unterstützung der Leukozyteninfiltration durch

katalytische Prozessierung von SLPI und α1 Proteinase Inhibitor. Dies wäre eine alternative

Möglichkeit, die von Wartmann et. al gefundene verringerte MPO Aktivität in der Lunge bei

CTSL Knockout Tieren in der Pankreatitis zu begründen53.

Änderungen im Pro-Anteil des Enzyms könnten die Autoinhibition104 des Enzyms

modifizieren.

Die Kolokalisation von CTSL und Trypsinogen nimmt im Verlauf der tierexperimentellen

Pankreatitis zu. Ob es sich um eine Folge oder einen auslösenden Mechanismus der

Pankreatitis handelt, ist nicht sicher zu beantworten. Auch bei einer Schädigung der

vesikulären Membranen kann es zu einer Umverteilung von Cathepsin L in die anderen

subzellulären Kompartimente kommen, dieser Mechanismus ist im Wesentlichen auf den

Zelltod beschränkt.105

Änderungen im Präpro-Anteil des Proteins könnten über fehlerhafte Sortierung relevant

werden. Eine fehlerhafte Sortierung von Cathepsin L in die subzellulären Kompartimente

kann z.B. durch leaky scanning106 erfolgen. Wenn bei der Translation das erste AUG Signal

der mRNA übersprungen wird, resultiert ein verkürztes Cathepsin L Protein, das nicht in das

lysosomale Kompartiment sortiert wird107. In vivo im Mausmodell kann diese Beobachtung

aber nicht bestätigt werden.108

66

4.4 CTSL Expression

In der Sequenzierung des Cathepsin L Gens wurde die 5’UTR ab 1115 Basenpaare upstream

von Exon 1 mit einbezogen, um eventuelle Expressionsänderungen durch Varianten im

Promotorbereich zu detektieren. Assoziationen mit der CTSL Expression sind für einige

Erkrankungen beschrieben.

Die basale Expression von Cathepsin L wird unter anderem durch die Transkriptionsfaktoren

SP1, SP3 und NF-Y reguliert109, die beobachteten Expressionsunterschiede zwischen

unterschiedlichen Malignomzelllinien lassen sich allerdings nicht immer über diese

Mechanismen erklären110. Eine Regulation von Cathepsin L über verschiedene

Wachstumsfaktoren ist schon seit geraumer Zeit bekannt111. So kann zum Beispiel eine

Überexpression von VEGF über AP-4 und über SP1 Motive im Promotor zu einer vermehrten

Expression führen112.

Es konnte darüber hinaus von Liu et. al. eine starke Korrelation zwischen dem Prozentsatz

der Stenose der linken vorderen absteigenden Koronararterie (LAD = RIVA) und dem Serum

Cathepsin L-Spiegel bei Patienten mit einer Stenose gezeigt werden. Die Beteiligung von

Cathepsin L an der koronaren Herzkrankheit über Mechanismen der Entzündung im Rahmen

der Artherosklerose scheint naheliegend.113 Somit ist eine weitere funktionelle Relevanz der

Expression belegt. In der Arbeit von Liu wurde die Ursache der erhöhten Cathepsin L

Expression als Antwort auf erhöhte proinflammatorische Mediatoren gewertet und nicht

molekularbiologisch untersucht. Eine weitere Transkriptionsregulation erfolgt durch ein XRE

(xenobiotic response element)92 in Zusammenspiel mit den Proteinen AHR und ARNT, hierfür

migriert AHR in den Zellkern und bindet dann in Form eines Heterodimers mit ARNT an die

DNA 114. Die funktionelle Relevanz dieser Transkripitionsmodulation wurde in einer multi-

ethnischen chinesischen Population bestätigt. Wie von Mbewe-Campbell in einem

amerikanischen Kollektiv beschrieben, korreliert auch in der chinesischen Bevölkerung der

SNP rs3118869 mit der Höhe des Blutdrucks93.

Auch der Methylierungsstatus des CTSL Promotors hat eine Auswirkung auf die Expression.

Bei Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie (CML) konnte gezeigt werden, dass in

der chronischen Phase der Erkrankung eine Hypomethylierung des Promotors mit einer

67

erhöhten CTSL Expression einhergeht, wohingegen in der akuten Phase der CML und der

Blastenkrise eine Hypermethylierung des CTSL Promotors mit einer Abnahme der Expression

korreliert 115. Der Bereich c.-944 bis c.-10-570 im Cathepsin L Gen ist als CpG-Insel

beschrieben. Hier finden sich 106 CpG-sites, also potentielle Methylierungsstellen im

Promotor110. Eine Hypomethylierung dieser CpG -Insel korreliert mit einer CTSL -

Überexpression in Melanomzellen110.

Zudem sind für die unterschiedlichen mRNA Varianten eine unterschiedliche

Expressionshäufigkeit und eine unterschiedliche Stabilität beschrieben worden. Für hCATL A

wurde eine interne ribosomale Eintrittsstelle, engl. internal ribosomal entry site (IRES)

beschrieben, die zu einer vermehrten Expression führt 116 117. Für die unterschiedlichen

mRNAs (hCATL-A, hCATL-AI, hCATL-AII, hCATL-AIII, hCATL-B; s. Abbildung 2 Splicevarianten

von Cathepsin L) sind unterschiedliche Halbwertszeiten publiziert, hCATL-A hat zwar die

geringste Halbwertszeit, aber die höchste Transkriptionseffizienz117.

Im Regelfall wird während der Transkription (beim Eukaryoten) die mRNA am 5‘-Ende mit

einer 7-Methylguanosin-„Kappe“ (5’-Cap) versehen, um den Transport aus dem Zellkern und

die ribosomale Translation zu initiieren. Zudem erhöht die 5‘-Cap die Stabiliät der RNA und

inhibiert den Abbau in 5‘-3‘-Richtung durch Exonukleasen. Der Beginn der Translation erfolgt

dann über die Bindung der mRNA mit der 5‘-Kappe an die 40S Untereinheit des Ribosoms.

Eine IRES bezeichnet eine Sekundärstruktur innerhalb der mRNA, die ein direktes Andocken

an die 40S Untereinheit des Ribosoms und somit einen Translationsstart unabhängig von der

5‘-Kappe ermöglicht.

Es gibt Hinweise, dass die Expression in Brustkrebszellen durch posttranskriptionale

Regulation beeinflusst wird. Die mRNA Variante hCATLA 3 scheint mit der höchsten

Invasivität beim Brustkrebs und einer erhöhten Expression von CTSL einherzugehen 43.

Im Zusammenhang mit der Pankreatitis ist die Expressionsregulation von Cathepsin L bislang

nicht ausreichend untersucht.

68

4.5 Cathepsin L Varianten bei Trägern der SPINK1 p.N34S Mutation

4.5.1 Exonische Varianten

Zwei der sechs exonischen Varianten liegen im Exon 1 in der 5‘ UTR (c.-272delA und

c.-258C>T, rs41312184). Da das erste Exon noch keine kodierende Information enthält

– das Startcodon ATG liegt im zweiten Exon – haben diese Varianten keine Änderung der

Peptidstruktur zur Folge. Auswirkungen auf den Phänotyp wären möglicherweise im Rahmen

von mRNA Effekten erklärbar. Auswirkungen auf die mRNA Stabilität sind möglich, beide

Mutationen liegen in der Nähe einer IRES (internen ribosomalen Eintrittstelle) 116 117, so dass

auch durch diese Varianten bedingte Änderungen der Sekundärstruktur zu einer

veränderten Expression führen könnten. Zudem ist für einen Teilabschnitt der 5’UTR ein

alternativer Promotor beschrieben und durch Reporterkonstrukt Experimente belegt116. Eine

Veränderung dieses alternativen Promotors kann auch die Expression modifizieren.

Funktionell wären an diesen beiden Mutationsstellen durchaus relevante Effekte vorstellbar,

die zahlenmäßige Verteilung in den untersuchten Kollektiven spricht aber gegen eine

klinische Relevanz. Erstens sind beide Varianten äußerst selten, c.-272delA kommt nur

einmal bei den Patienten vor, und c.-258C>T kommt jeweils einmal bei Patienten und

Kontrollen vor. Zweitens sind hierdurch keine signifikanten Unterschiede zwischen Patienten

und Kontrollen belegbar.

Zwei weitere exonische Sequenzvarianten liegen im Exon 2, beide sind nicht synonyme

Mutationen (c.5A>C, (p.N2T) rs112682750 und c.97delA, (p.K33fs)).

Die frameshift Mutation c.97delA, (p.K33fs)ist nur einmal heterozygot bei einem

Patienten nachgewiesen worden und somit zu selten, um eine funktionelle Relevanz zu

beweisen. Jedoch ist die Wahrscheinlichkeit eines vollständigen Funktionsausfalls des

mutierten Proteins bei einer frameshift Mutation sehr hoch. Die Aminosäureposition 33 liegt

im Aktivierungspeptid, das katalytische Zentrum liegt deutlich dahinter. Diese Tatsache

macht einen Funktionsausfall noch wahrscheinlicher. Es käme bei einem heterozygoten

Funktionsausfall zu einer verringerten CTSL Aktivität, die zu einer verzögerten Degradation

von N34S mutiertem Spink durch CTSL führen müsste. Nach dem postulierten Modell einer

durch beschleunigten SPINK Abbau getriggerten Pankreatitis müsste diese Mutation einen

protektiven Charakter haben und wäre damit eher bei den Kontrollen zu erwarten. Eine

69

(kausale) Assoziation dieser frameshift Mutation mit der Pankreatitis wäre durch

Fehlfaltungen und damit erhöhten Stress am endoplasmatischen Retikulum vorstellbar. 118

Der SNP rs112682750 c.5A>C, (p.N2T)ist statistisch gleich verteilt (zweimal heterozygot

bei den Kontrollen, einmal heterozygot bei einem Patienten).

Die Region um das Startcodon ist für die Translationsinitiierung von besonderer Bedeutung.

Der genomische Kontext ist bei Proteinen generell mitverantwortlich für die

Expressionshäufigkeit. Die häufigste genomische Start Sequenz ist als Kozak Konsensus

Sequenz bekannt. Abweichungen von dieser Konsensus Sequenz führen zu einer

verminderten Translation. Besonders stark ist dieser Effekt an der Position -3, etwas

schwächer an den Positionen +4, -1 und -2, wobei die drei letztgenannten sich stärker

auswirken, wenn an Position -3 eine Pyrimidinbase vorliegt 119. Die in dieser Arbeit

gefundene Mutation c.5A>C, (p.N2T) liegt an Position 5 und hat nach aktueller Einschätzung

keinen Effekt auf den Translationsstart.

5‘-GCC GCC(A/G)CCAUG G-3‘ Kozak consensus

5‘-UUU UAA A ACAUG A-3‘ Cathepsin L

Der Austausch N>T, also Asparagin zu Threonin, bedeutet den Austausch von einer

amidierten gegen eine hydroxylierte Aminosäure. Die Position 2, an der diese Mutation

vorkommt, liegt im Prä- Anteil des Proteins und somit im Signalpeptid. Eine Auswirkung auf

das spätere Protein ist daher nicht anzunehmen, eine veränderte Sortierung in subzelluläre

Kompartimente erscheint aber möglich.44

Abbildung 16 Strukturformel L-Asparagin

Abbildung 15 Strukturformel L-Threonin

70

Für beide Mutationen ist eine krankheitsmodifizierende bis hin zu einer

krankheitsauslösenden Auswirkung im Individuum denkbar, der Beweis wäre nur indirekt

über experimentelle Untersuchungen des mutierten Cathepsin L in vitro oder im Tiermodell

zu führen.

Beide Mutationen können lediglich heterozygot nachgewiesen werden, so dass es bei den

Patienten mutmaßlich nur zu einer Modifikation der Cathepsin L Aktivität kommt, ein totaler

Ausfall ist nicht anzunehmen. Aufgrund dieser Ausgangslage erscheint auch die weitere

experimentelle Überprüfung der von hier gefundenen Mutationen nicht sehr aussichtsreich.

Eine fünfte exonische Alteration liegt im Exon 7 c.852A>C, (p.G284G). Bei einer

synonymen Mutation ist die funktionelle Relevanz am ehesten vor Translation, also im

Rahmen von mRNA Effekten zu erwarten. Auch diese Mutation kann nur bei einem

Patienten heterozygot nachgewiesen werden. Eine funktionelle Relevanz bleibt damit auch

an dieser Stelle fraglich.

Lediglich eine der exonischen Mutationen kann mit einer MAF > 5 % gefunden werden. Die

Variante c.402G>A (p.Q134Q) rs11541204 liegt im Exon 5 und repräsentiert ebenfalls

eine synonyme Mutation mit fraglicher funktioneller Relevanz. In der Signifikanzprüfung ist

mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von 0,02 eine Häufung dieser synonymen Mutation bei

den Patienten anzunehmen. Auch in der Auswertung der Allelhäufigkeiten ergibt sich ein

initial signifikanter Unterschied für die Variante c.402G>A (p.Q134Q). Nach Bonferroni

Korrektur für mehrfache Testung ist aber nicht mehr von einem signifikanten Unterschied

auszugehen. Trotzdem bleibt zu bemerken, dass diese Sequenzvariante den größten

gefundenen Verteilungsunterschied zwischen beiden Kollektiven darstellt. Beide Kohorten

liegen im Hardy-Weinberg-Equilibrium, somit ist ein Genotypisierungsfehler

unwahrscheinlich.

In einer externen Untersuchung wurde die Häufigkeit dieser Silent Mutation (p.Q134Q)bei

Patienten mit Pankreatitis im Vergleich zu gesunden Individuen als gleichverteilt beurteilt

(Jonas Rosendahl, nicht publizierte Untersuchung). Diese externe Untersuchung bezieht sich

allerdings auf Patienten und Kontrollen mit unbekanntem N34S Mutationsstatus des Spink

Gens. Eine Übertragbarkeit der Ergebnisse ist somit nicht gegeben. Man kann spekulieren,

71

dass eine mögliche Bedeutung dieser Mutation in der Pankreatitis nur im Zusammenspiel mit

einer N34S Mutation im Spink eine funktionelle Bedeutung erlangt. Unter diesem Postulat ist

im Vergleich von Pankreatitikern gegen eine gesunde Normalbevölkerung unabhängig vom

N34S Status eine Gleichverteilung sogar zu erwarten.

Für eine Variante im Spink1 und eine Variante im CTRC Gen konnten Beer und Sahin-Tóth120

zeigen, dass Änderungen eines Codons in der Nähe der Splicing Site zu verringerter mRNA

Expression und verringerter Proteinexpression führt. Im Fall der CTRC Variante handelt es

sich um eine synonyme Mutation (c.132G>A, p.Q44=), bei der SPINK1 Mutation handelt es

sich um eine nicht-synonyme Mutation (c.194G>A, p.R65Q). In beiden beschriebenen

Fällen betrifft die Änderung jeweils das letzte Codon eines Exons, die Autoren erklären die

reduzierte Expression über pre-mRNA Splicing Defekte. Die in der Sequenzierung gefundene

Variante c.402G>A (p.Q134Q)entspricht vom Codon der beschriebenen CAG>CAA

Änderung im CTRC, liegt aber nicht an der letzten, sondern an der zweiten Stelle eines Exons.

Eine Veränderung der Expression durch verändertes Splicing erscheint damit zwar

vorstellbar, der experimentelle Beweis ist aber nicht übertragbar.

Nach der initialen Hypothese könnte eine verstärkte Aktivität von Cathepsin L zu einem

schnelleren Abbau von SPINK1 führen und somit die Entstehung einer Pankreatitis

begünstigen. Über die Konstruktion eines Mini-Gen Modells unter Einbeziehung aller Exons

und Intron 4 könnte die funktionelle Relevanz weiter überprüft werden.

4.6 Nichtexonische Varianten

4.6.1 Seltene Varianten MAF < 5 %

Insgesamt wurden neun nicht exonische Varianten mit einer MAF < 5 % gefunden. Von

diesen neun Varianten sind sieben in der SNP database verzeichnet. Für keinen dieser sieben

SNPs ist eine funktionelle Relevanz publiziert. Für einige der gefundenen seltenen Varianten

gilt, dass ein funktioneller Zusammenhang zur Pankreatitis nicht sicher ausgeschlossen

werden kann und theoretisch zu konstruieren ist. Die absoluten Zahlen sprechen aber gegen

eine epidemiologische Relevanz.

72

4.6.2 Häufige Varianten MAF > 5 %

Acht der gefundenen Varianten hatten eine MAF > 5 % und wurden für die weitere

statistische Auswertung zusammengefasst.

Hier ist insbesondere der SNP c.-461C>A von großem Interesse. Eine funktionelle

Relevanz dieser Variante ist 2012 durch Mbewe-Campbell et al. beschrieben worden92. Es

konnte eine verminderte Cathepsin L Expression gezeigt werden, die durch die Korrelation

mit erhöhtem Blutdruck auch zu einem veränderten Phänotyp führt. Das Wildtyp c.-461C

Allel führt zu einer stärkeren Cathepsin L Expression als das mutierte c.-461A Allel. Die

Korrelation mit dem Phänotyp „hoher Blutdruck“ konnte in einer Arbeit von Chen et al.93

bestätigt werden. Auf der anderen Seite konnte eine starke Korrelation von höheren Serum

Cathepsin L Spiegeln mit Koronarstenosen im Allgemeinen und dem Stenosegrad des RIVA

im speziellen gezeigt werden.113 Die Rolle von CTSL für kardiovaskuläre Erkrankungen ist also

keineswegs abschließend geklärt.

Die Variante c.-461C>A rs3118869 wurde bereits im Rahmen des HapMap Projektes

beschrieben, zeigt aber in der Population HapMap-CEU (Einwohner Utahs mit nord- und

westeuropäischer Abstammung) eine abweichende Allelverteilung.

In dieser Untersuchung hat bei den Patienten das mutierte Allel nur einen Anteil von

39,7 %, bei den Kontrollen 49,3 %. Der Vergleich mit den Daten aus dem 1000 Genome

Projekt89 hilft bei der Einordnung der Allelfrequenz. Im aktuellen Stand des 1000 Genome

Projekt (Phase 3 May 2013 call set) findet sich bei der Untersuchung von 2504 Individuen

eine Häufigkeit von 42,55 % für das mutierte Allel (42,55 % A; 57,45 % C n=2504).

Für einen aussagekräftigen Vergleich wäre es notwendig, die gefundenen Alterationen in

den hier untersuchten Gruppen gegen passende Kontrollen zu vergleichen. Sowohl die

Patienten dieser Studie, als auch die Kontrollen, die aus der SHIP Studie generiert wurden,

sind über eine N34S Mutation im SPINK1 Gen präselektioniert. Ein direkter Vergleich der

Daten gegen die HapMap oder 1000 Genome Daten ist somit nicht möglich, da der N34S

Status für die HapMap-Individuen nicht vorliegt. Zur weiteren epidemiologischen Einordnung

der Häufigkeit des c.-461C>A SNPs in der Normalbevölkerung erscheint ein Vergleich der

N34S+ Kontrollen dieser Arbeit gegen N34S- Individuen sinnvoll.

73

Ein erster Ansatz hierzu wäre eine Genotypisierung der SHIP Kohorte für diesen SNP. Ein

Folgeantrag zur weiteren Untersuchung ist bereits gestellt.

Wildtyp CC Hetero AC Homo AA Allel C Allel A

SHIP 22 (32,4 %) 25 (36,8 %) 21 (30,9 %) 69 (50,7 %) 67 (49,3 %)

HapMap-CEU 80 (35,4 %) 94 (41,6 %) 52 (23,0 %) 254 (56,2 %) 198 (43,8 %)

HapMap 704 (35,6 %) 930 (47,0 %) 344 (17,4 %) 2338 (59,1 %) 1618 (40,9 %)

Pankreatitiker 26 (38,2 %) 30 (44,1 %) 12 (17,6 %) 82 (60,3%) 54 (39,7 %)

Tabelle 22 Diskussion Verteilung c.-461C>A Genotypisierung der HapMap Kohorte und der europäischen Subgruppe im Vergleich zu den Untersuchten Individuen

In der vorliegenden Untersuchung zeigt sich das mutierte Allel, welches mit einer geringeren

CTSL Expression einhergeht, häufiger bei den gesunden Kontrollen, als bei den Patienten mit

Pankreatitis. Daher ist nach den in vitro Daten von Mbewe et al.92 von einer vermehrten

CTSL Expression bei den Studienteilnehmern mit Pankreatitis im Vergleich zur

Kontrollkohorte auszugehen. Über den beschleunigten Abbau von N34S mutiertem Spink

durch CTSL wäre dies ein neuer Erklärungsansatz für die Entstehung der Pankreatitis in N34S

positiven Individuen. In diesem Zusammenhang ist somit dem mutierten Allel eine

protektive Wirkung zuzuschreiben. Es bleibt aber wichtig zu bemerken, dass sich hier ein

sehr plausibler Trend zeigt, der gut durch unsere Theorie erklärt werden kann, eine

statistische Signifikanz erreichen diese Zahlen aber nicht.

Die Variante c.-408C>A liegt im Bereich des Promotors 58 bp upstream von Exon 1. Eine

potentielle Bindungsstelle für Transkriptionsfaktoren konnte nicht identifiziert werden.

Aufgrund der räumlichen Nähe zum Transkriptionsstart sind Auswirkungen auf die

Expression denkbar, belastbare Hinweise für diese Hypothese ergeben sich nicht.

Die Variante c.-11+198G>T liegt in einer CpG Insel und stellt eine Mutation einer CpG

Site dar. Es fällt auf, dass es sich hier um eine G>T Mutation handelt. In einer CpG Site

erwartet man eher eine C>T Mutation im Sinne einer Desaminierung von methyliertem

Cytosin zu Thymin. Mit einer Allelfrequenz von ca. 20 % ist die Variante c.-11+198G>T in

Probanden mit Pankreatitis und Probanden ohne Pankreatitis in etwa gleich verteilt. In der

Erstbeschreibung der CpG Insel im CTSL Gen wird diese CpG Site nicht berücksichtigt, hier

wird Thymidin als Wildtyp angenommen 110. Ein Effekt auf die CTSL Expression ist über eine

74

Veränderung des Methylierungsmusters der DNA möglich, aber auf Grundlage der

erhobenen Verteilungsdaten nicht anzunehmen.

Bei den weiteren Varianten c.126+31C>T rs2274611, c.397-34delT, c.621+56A>C

rs2378757 und c.902+195A>C rs3128510 ergeben sich keine Hinweise auf eine funktionelle

Relevanz.

4.6.3 Häufigkeit und Validität

Für die Validität der in dieser Arbeit erhobenen Daten spricht die hohe Redundanz durch

bidirektionale Sequenzierung, teilweise überlappende Sequenzierungssequenzen,

verblindete Mehrfachsequenzierung von fünf Individuen und die strikte Einhaltung des Vier-

Augen Prinzips in der Benennung aller Varianten.

Zum besseren Verständnis der Größenordnung ist es hilfreich, sich die Etablierung von CPA1

als Risikogen für die frühe Manifestation der chronischen Pankreatitis anzusehen121. Hier

wurde ein deutsches Kollektiv von 944 Patienten gegen 3938 Gesunde Kontrollen verglichen.

Eine signifikante Assoziation einer einzelnen Mutation im CPA1 Gen mit der chronischen

Pankreatitis findet sich nicht. Daher wurde die funktionelle Relevanz der Mutationen

getestet und alle Mutationen mit einer Restaktivität der CPA1 von ≤20% zu einer Gruppe

gerechnet. Lediglich in der Summe ergibt sich ein signifikanter Unterschied. Es finden sich

3,1% Mutationsträger mit einer Restaktivität der CPA1 von ≤20% bei den Patienten mit

chronischer Pankreatitis vs. 0,1 % bei den Kontrollen. Die häufigste Mutation mit

Aktivitätsverlust kam in der Untersuchung der CPA1 bei 0,7% der Patienten vor. In dieser

Untersuchung kann die Frequenz heterozygoter Träger der seltensten Variante aufgrund der

Gruppengröße minimal eine Häufigkeit von 1,5 % annehmen (1/68=0,0147).

Der Ansatz, Varianten mit gleichem Effekt zur Berechnung als eine Gruppe

zusammenzufassen, ist erst in Kenntnis der Effekte gefundener Varianten sinnvoll. Somit ist

dieser Ansatz nicht ohne Weiteres nachträglich auf die gefundenen Cathepsin L Varianten

übertragbar. Selbst unter der Annahme, dass die gefundenen exonischen Varianten c.-

272del, c.-258C>T (beide Exon 1 5’UTR), c.5A>C, (p.N2T) (Exon 2), c.97delA,

(p.K33fs) (Exon 2), c.402G>A, (p.Q134Q) (Exon 5), c.852A>C, (p.G284G)

(Exon 7) einen gleichgerichteten Effekt zeigen, ergibt sich in der Berechnung im Fisher’s

75

exact Test lediglich der durch c.402G>A begründete, signifikante Unterschied. Unter

Ausschluss der häufigen Variante c.402G>A unterscheiden die Gruppen sich nicht mehr

signifikant. (Daten im Ergebnisteil nicht aufgeführt, da die Grundannahme der Berechnung –

nämlich ein gleichgerichteter Effekt der exonischen Varianten – ohne experimentellen

Beweis als Spekulation betrachtet werden muss).

4.7 Fazit

Neben Strukturveränderungen des Cathepsin L Proteins, die zu einer direkten

Aktivitätsveränderung führen, sind auch Expressionsmodifikationen oder zelluläre

Fehlsortierungen eine mögliche Erklärung für einen krankheitsmodifizierenden Effekt in der

Pankreatitis.

Von den in dieser Arbeit gefundenen Mutationen sind die folgenden vier besonders wichtig.

Der SNP c.-461C>A verändert wahrscheinlich die Expressionshäufigkeit von CTSL. Es

konnte nur eine Punktmutation mit einem Aminosäureaustausch c.5A>C, (p.N2T)

identifiziert werden, der Einfluss auf die Pathogenese der Pankreatitis bleibt offen. Die

gefundene frameshift Mutation c.97delA, (p.K33fs) führt wahrscheinlich zu einem

Funktionsverlust von Cathepsin L. Die synonyme Mutation c.402G>A, (p.Q134Q) ist im

Fisher’s exact Test (vor Korrektur auf multiple Testung) als einzige Variante signifikant

unterschiedlich zwischen Patienten und Kontrollen. Im Rahmen dieser Arbeit ist für keine

dieser vier Varianten ein Effekt auf die Penetranz der Pankreatitis bei N34S positiven

Individuen sicher zu belegen.

Die Häufigkeit der gefundenen Mutationen ist nicht ausreichend, um in diesem kleinen

Kollektiv eine Signifikanz zu beweisen. Es handelt sich bei der vorliegenden Arbeit jedoch um

das größte bisher untersuchte Kollektiv von N34S mutierten Individuen auf Mutationen im

Cathepsin L Gen. Aus den o.g. Gründen ist eine Erweiterung dieser Untersuchung auch in

naher Zukunft nicht absehbar. Nach kritischer Prüfung angenommener Effekte der

gefundenen Varianten erscheint in vielen Fällen eine funktionelle Relevanz weiterhin

vorstellbar, aufgrund der geringen Fallzahl ist die vorliegende Studie aber nicht ausreichend

gepowert um eine entsprechende Assoziation zu zeigen.

76

Aus den Ergebnissen dieser Arbeit direkte Rückschlüsse auf die Pathogenese der Pankreatitis

zu schließen ist schwierig. Wie weiter oben erläutert sind Penetranz- oder

krankheitsmodifizierende Effekte im Einzelfall durchaus plausibel, aber bezogen auf die

Pankreatitis wahrscheinlich kein häufiger Grund für die Erkrankung. Ein Screening auf diese

Mutationen ist also außerhalb von Studien aktuell sicher nicht indiziert.

Die beschleunigte Degradation von N34S mutiertem SPINK1 durch CTSL in der Pathogenese

der Pankreatitis ist bislang die beste funktionelle Erklärung für die Assoziation der SPINK1

N34S Mutation mit der Pankreatitis und durch diese Daten keinesfalls widerlegt. Im

Gegensatz zu diesem CTSL Effekt steht allerdings die durch CTSL vermittelte Degradation von

Trypsinogen und Trypsin. Möglicherweise gleichen sich daher positive und negative Effekte

von Aktivitätsänderungen des Cathepsin L aus.

Mutationen im Cathepsin L haben wahrscheinlich eine untergeordnete Bedeutung für den

postulierten Mechanismus, über eine zusätzlich beschleunigte SPINK N34S Degradation an

einer Pankreatitis zu erkranken.

77

4.8 Ausblick

Eine Möglichkeit, diese und ähnliche Untersuchungen auszuweiten, entsteht aktuell im

Rahmen der Nationalen Kohorte 122, einer populationsbasierten Studie, die in Deutschland

200.000 Teilnehmer einschließen wird. In Kombination mit SNP Arrays wird es aufgrund der

Stichprobengröße möglich werden, deutlich größere Kollektive mit dieser oder ähnlichen

Fragestellungen zu untersuchen. Neben einer Vergrößerung des untersuchten Kollektives

sind auch andere Techniken der Untersuchung vielversprechend. Über einen SNP Chip

können ein Vielzahl von Varianten in großen Kollektiven mit relativ geringem Zeitaufwand

untersucht werden. Die SNP Chips, die in der SHIP Studie zum Einsatz kamen, umfassten

leider nicht den SNP rs17107315 (Spink1 p.N34S), so dass die Genotypisierung im Rahmen

dieser Arbeit via TaqMan Assay erfolgte.

Auch für den funktionell interessanten SNP in der 5’UTR c.-461C>A rs3118869 liegen für

die SHIP Studie leider keine Daten vor, eine weitere Genotypiserung ist aber geplant.

Neben SNP Arrays sind insbesondere die besser verfügbaren Möglichkeiten des next

generation sequencing (NGS) ein enormer Hoffnungsträger für die Identifikation genetischer

Risikofaktoren allgemein.

Unter der Vorraussetzung, dass sich durch Vergrößerung des Kollektives und den Einsatz

neuer Techniken ein signifikanter Verteilungsunterschied für einzelne der gefundenen

Varianten zwischen Patienten mit Pankeatitis und N34S Mutation im Spink und

asymptomatischen Trägern der N34S Mutation zeigt, sind weitere funktionelle

Untersuchungen der gefundenen Varianten sinnvoll zum weiteren Verständnis der

Pathogenese der Pankreatitis.

Für c.-461C>A ist die Modifikation der Expression bereits gut untersucht, für c.5A>C,

(p.N2T) bietet sich insbesondere eine Untersuchung zur subzellulären Sortierung an. Für

c.97delA, (p.K33fs) ist eine Charakterisierung des resultierenden Proteins sinnvoll und für

c.402G>A, (p.Q134Q) kann eine Expressionsuntersuchung mit einem Minigen Ansatz

analog zu Beer et. al.120 erwogen werden.

78

79

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Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und keine

anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.

Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät, keiner anderen wissenschaftlichen

Einrichtung vorgelegt worden.

Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass eine

Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.

Greifswald, den 24. Juli 2016 C. Behn

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Lebenslauf Nur in der Originalversion enthalten

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Publikationen ARTIKEL: Cathepsin B gene polymorphism Val26 is not associated with idiopathic chronic pancreatitis

in European patients. Weiss FU, Behn CO et al.; Gut. 2007 Sep;56(9):1322-3.

Recruitment of histone deacetylases HDAC1 and HDAC2 by the transcriptional repressor ZEB1 downregulates E-cadherin expression in pancreatic cancer. Aghdassi A, Sendler M, Guenther A, Mayerle J, Behn CO, Heidecke CD, Friess H, Büchler M, Evert M, Lerch MM, Weiss FU.; Gut. 2012 Mar;61(3):439-48.

Environmental risk factors for chronic pancreatitis and pancreatic cancer. Nitsche C, Simon P, Weiss FU, Fluhr G, Weber E, Gärtner S, Behn CO, Kraft M, Ringel J, Aghdassi A, Mayerle J, Lerch MM;. Dig Dis. 2011;29(2):235-42

VORTRÄGE:

CTSB Val26 Mutationen sind kein Risikofaktor für die chronische Pankreatitis C. O. Behn et al.; 28. Deutscher Pankreasclub 22.-24. November 2007, Dresden

Die Aktivierung der T-Helfer Zellen in einem Modell der schweren akuten Pankreatitis ist T-Zell-Rezeptor unabhängig C. O. Behn et al.; 29. Deutscher Pankreasclub 20.-22. November 2008, Magdeburg

CTSL mutations do not modulate disease penetrance of pancreatitis in SPINK1 N34S carriers C. O. Behn et al.; 7 th ISIDOP 22.-23. Juni 2012, Prag

AUSZEICHNUNGEN: „Hans-Chiari-Preis für grundlagenwissenschaftliche Pankreasforschung“

Für den Vortrag (s.o.): „Die Aktivierung der T-Helfer Zellen in einem Modell der schweren akuten Pankreatitis ist T-Zell-Rezeptor unabhängig“ 29. Deutscher Pankreasclub 20.-22. November 2008, Magdeburg

Travel Grant for attending the 44th annual meeting of the EUROPEAN PANCREATIC CLUB 20.-22. Juni 2012, Prag, Tschechische Republik

7th International Symposium on Inherited Diseases of the Pancreas Travel Grant 22.-23. Juni 2012, Prag

ABSTRACTS:

Cathepsin B Gene Polymorphism Val26: Association with Idiopathic Chronic Pancreatitis in German Patients Weiß F U, Behn C, et al. Z GASTROENTEROL 2007, 45:122

Cathepsin B Gene Polymorphism Val26 is not associated with Idiopathic Chronic Pancreatitis in European Patients. Weiß F U, Behn C, et al. PANCREATOLOGY 2007, 7:236

ZEB1 associates with the E-Cadherin promoter and inhibits E-Cadherin expression via

recruitment of HDAC1 and HDAC2 in pancreatic cancer. A. Aghdassi, F. U. Weiss, C. O. Behn,et al. Pancreatology 2009;9:427–543

Die Bindung von ZEB1 an den E-Cadherin Promotor rekrutiert HDAC1 und HDAC2 und reprimiert die E-Cadherin Expression im Pankreaskarzinom AA Aghdassi, FU Weiss, CO Behn, et al. Z Gastroenterol 2009; 47 DOI: 10.1055/s-0029-1241501

CTSL mutations do not modulate disease penetrance of pancreatitis in SPINK1 N34S carriers CO Behn, et al. Pancreatology - November 2012 (Vol. 12, Issue 6, Page 544, DOI: 10.1016/j.pan.2012.11.145)

90

Role of Cathepsin L in Proteolytic Cleavage of SPINK1

W. Halangk, T. Wartmann, C.-O. Behn, et al. Pancreas November 2012 - Volume 41 - Issue 8 - p 1344–1416, DOI: 10.1097/MPA.0b013e318270446a

Role of Cathepsin L in Proteolytic Cleavage of SPINK1

W. Halangk, T. Wartmann, C.-O. Behn, et al. Pancreatology - March 2013 (Vol. 13, Issue 2, Page e30, DOI: 10.1016/j.pan.2012.12.159) GRADUATIONSARBEIT:

Charakterisierung immunologischer Aspekte der akuten, schweren Pankreatitis im experimentellen Tiermodell. Behn C O, Bachelor-Arbeit angenommen 02.11.2009 EMAU Greifswald

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Danksagung

Für die Überlassung des Themas und das in mich gesetzte Vertrauen gilt mein herzlicher

Dank Herrn Prof. Dr. med. Markus M. Lerch. Ihm ist gelungen mein Interesse an der

Gastroenterologie sowohl in klinischen wie auch grundlagenwissenschaftlichen

Fragestellungen zu erwecken. Vielen Dank.

Mein besonderer Dank gilt meinem Mentor Dr. rer. nat. F. U. Weiss, der mit viel

Gelassenheit und Scharfsinn meine wissenschaftliche Entwicklung begleitet, gefördert und

wenn nötig gelenkt hat. Danke Uli.

Mein weiterer Dank gilt der gesamten Arbeitsgruppe, insbesondere Dr. rer. nat. Matthias

Sendler für viele fruchtbare wissenschaftliche Diskussionen und konstruktive Kritik.

Meine Familie war mir während der letzten Jahre ein unendlicher Rückhalt und eine wichtige

Quelle der Motivation. Euch ist diese Arbeit gewidmet.

Greifswald, im Juli 2016