Post on 21-Jan-2016
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Biotechnologische Laborübungen2004
Ziele des Seminars
• Aseptisch Arbeiten lernen
• Richtige Nährmedienbereitung und Kontrolle
• Lebensmittel mikrobiologisch und chemisch untersuchen
• Untersuchungsergebnisse richtig beurteilen können
• Kontrolle von Hygienemaßnahmen durchführen können
• Beschaffung wichtiger Materialien
Biologie, Chemie und Technik
Bildungs- und Lehraufgabe
Der Schüler soll elementare mikrobiologische Arbeitsmethoden selbstständig
durchführen können.
die hygienische Unbedenklichkeit von Lebensmitteln und daraus abgeleiteten Erzeugnissen in allen Produktions- und Vermarktungsstufen beurteilen können.
aufbauend auf den Kenntnissen der Biologie und Chemie den interdisziplinären Charakter der Biotechnologie kennen lernen.
die Ergebnisse seiner Untersuchungen interpretieren können.
sich seiner Verantwortung für die menschliche Gesundheit bewusst sein.
Überblick
Theorie zu den einzelnen Workshops Bereitung der Nährmedien Rohmilch / past. Milch Mittagessen Wasser, Frischkäse Stammhaltung, Hygiene
Begriffe und Definition des aseptischen Arbeitens: Keim: vermehrungsfähiger Mikroorganismus Steril: frei von vermehrungsfähigen Mikroorganismen
jeglicher Art (Phagen, Viren, Sporen miteinbezogen) Aseptisch: arbeiten unter Bedingungen, die
Fremdorganismen ausschalten Kontamination: Anwesenheit von Fremdorganismen Desinfektion: weitgehende Abtötung von Mikro-
organismen auf Oberflächen Dekontamination: weitgehende Abtötung von Mikro-
organismen in Nährmedien
Nährmedienbereitung - Fehler
Unterscheide: autoklavierbare und nicht autoklavierbare Substanzen
Achtung: auch autoklavierbare NM halten Hitze nur begrenzt aus
Erhitzung: Selektivitätsverlust des NMs durch zu langes oder zu hohes Erhitzen bzw. durch mehrmaliges Aufschmelzen des NMs
Wasser: entionisiert (Ionen des Wassers + Peptone Trübung) frisch zubereitet (Achtung vor Aufnahme von CO2 und anderen Substanzen aus der Luft) pH-Wert-Verschiebung, durch Trübung erschwerte Auswertung, durch Ausfällen der Salze ev. Wachstumshemmung der MO
Nährmedienbereitung - Fehler
Agar: zu starke Erhitzung Gelstruktur des Agars wird zerstört Erhitzung im sauren Bereich Depolymerisation
• Lösungen neigen zum Sedimentieren bei Herstellung von NM ist auf die Homogenität durch Rühren zu achten (Gefahr des Anbrennens, ev. nicht Festwerden des NMs bei Inhomogenität)
Peptone: sind hygroskopisch Verklumpung enthalten Phosphate + Ca /Mg Trübung, Ausfällung durch zu starke Erhitzung chem. Veränderungen
Salze: Gallensalze empfindlich bei zu tiefen pH Sulfit wird zu Sulfat oxidiert unwirksam
Azid zersetzt sich bei stärkerer Hitzeeinwirkung
Nährmedienbereitung - Fehler
Kohlenhydrate: Karamelisierung, Maillardreaktion, Hydroxymethylfurfurolbildung
pH-Wert: deionisiertes Wasser falsche Einwaage des NM-Pulvers falsche Lagerung des NMs (hohe Luftfeuchtigkeit) pH-Verschiebung
Lagerung des fertig hergestellten NMs: zu lang Austrocknungsgefahr, Kontamination durch psychrotrophe MO, Verlust der Wirksamkeit
Einfluss der Temperatur des Wasserbades:
zu heiß MO sterben ab zu kalt Festwerden des NMs Inhomogenität, schlechte Verteilung der Nährstoffe
zu lange Lagerung Selektivitätsverlust des NMs
Arbeitsablauf Vorbereitungen - saubere Ansatzgefäße Nährmedienansatz
ausreichend großes Ansatzgefäß,
Pulver genau einwiegen, dest. Wasser genau abmessen, gut mischen und quellen lassen, NM vollständig lösen ~100°C,
portionieren und abfüllen Autoklavieren pH-Wert überprüfen Supplementierung Gießen von Platten bei <50°C Qualitätskontrolle, Lagerung, ev. Trocknung Protokoll
Kultivierung von MO
Bouillonkulturen Agarstrich-/Stichkultur Kultivierung auf Agarplatten Koch`sches Plattengussverfahren Spatel-Verfahren Petrifilm-Methode MPN-Technik / Titer
Fraktionierter Ausstrich
1
2
3
45
1 2
3
Koch´sches Plattengussverfahren
Most probable number MPN
1 ml 1 ml 1 ml
1 ml1 ml1 ml
V0
V1 V2 V3
V1 V2 V3
Probe
1 ml
1 ml 1 ml
Titer - Presence/Absence
1 ml
V0
Probe
Beispiel Milch
GKZ: Koch, PCA, 150.000K/ml Psychrotrophe: Koch, PCA, 10.000K/ml Coliforme: Koch, VRB+OL, 2.000K/ml Coliforme: MPN, LS-B, 2.000K/ml Antibiotika-Nachweis
Beispiel Wasser
Untersuchtes Produkt: Trinkwasser nicht aufbereitet
Kriterium Grenzwerte
Gesamtkeimzahl bei 22°C 100/mlGesamtkeimzahl bei 37°C 20/mlColiforme Negativ/100mlE. coli Negativ/100mlEnterokokken Negativ/100ml
Frischkäse
Probenvorbereitung: 10±1g Probe mit Citratlösung auf 100g auffüllen, 2min stomachen
Säurebildner: Koch, CBL, >100.000K/g Coliforme/E.coli: MPN, FC-LS, <10K/g He + SchiPi: Koch, YGC, <1.000K/g
Methoden zur Bestimmung der KZ von Oberflächen
Abklatschverfahren: Schwämmen,
RODAC-Platten, Bacto-Strip-Streifen,
Agaroid-Stangen
Abstrichverfahren
Abschwemmverfahren
Überschichtungsverfahren
Bestimmung der Luftkeimzahl
Sedimentationsverfahren
Impaction-Verfahren
DANKE
für ihre Aufmerksamkeit