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Christian Vidal, Medizinische Hochschule Hannover – Klinische ChemieCarl-Neuberg-Str. 1 – 30625 Hannover – vidal.christian@mh-hannover.de
Drogenscreening mittels Enzym-Immunoassays:
Möglichkeiten und Grenzen
Dr. Christian Vidal
Medizinische Hochschule Hannover, Klinische Chemie
2. Februar 2006, Gelsenkirchen
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Das toxikologische Notfall-Labor der MHH
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Das toxikologische Notfall-Labor der MHH
• 24 h-Betrieb
• Einzugsgebiet: Norddeutschland
• 8 TAs, je 1 Wissenschaftler in Rufbereitschaft
• Drogenscreeningspezielle toxikologische Analysen (Amanitin, Cyanid, ...)systematische Suchanalyse (GC/MS)BestätigungsanalysenTher. Drug Monitoring (z.B. Clozapin, Thiopental, Midazolam)
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Der Vortrag im Überblick
Einsatzgebiete für Drogenscreening
Technik des Drogenscreenings
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Einsatzgebiete für Drogenscreening:Der Problemkreis
• Gesunde und Kranke nehmen eine Vielzahl von Pharmaka ein,die unterschiedlich stark metabolisiert und eliminiert werden
• Drogennachweis: - verschreibungspflichtige Arzneimittel (Benzodiazepine, Opiate) - illegale Drogen (nicht verkehrsfähige, nicht verschreibungsfähige Pharmaka)
• ca. 200 verschiedene Substanzen (+ Abbauprodukte/renal eliminierte Metabolite: besondere Rolle beim Drogennachweis im Urin!)
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Drogenscreening im Urin
• Amphetamine
• Barbiturate
• Benzodiazepine
• Cannabinoide (THC)
• Cocain/-metabolit (Benzoylecgonin)
• LSD
• Methadon/-metabolit (EDDP)
• (Methaqualon)
• Opiate, 6-Acetylmorphin
• (Phencyclidin)
• (Propoxyphen)
• Trizyklische Antidepressiva
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Drogenscreening im Serum
• Trizyklische Antidepressiva
• Benzodiazepine
• Barbiturate
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Wo wird Drogenscreening eingesetzt?
• in stationären Einrichtungen: ZNA, Psychiatrie, Intensivmedizin
• bei niedergelassenen Ärzten/ambulanten Einrichtungen, z.B. Methadon-Substitutionsprogramm: Erkennung von Beigebrauch, Überwachung der Entzugsbehandlung)
• im Strafvollzug
• bei Verkehrskontrollen
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Technik des Drogenscreenings: Instrumentelle Verfahren
• CEDIA (ClonedEnzyme Donor Immunoassay)
• FPIA (Fluoreszenz-polarisations-immunoassay)
• KIMS(kinetic inter-action of micro-particles in a solution)
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Drogenschnelltests („Streifentests“)
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Funktionsprinzip
• qualitativer immunchromato-graphischer Test
• Kompetition um Gold-Anti-körper-Konjugat zwischen membrangebundener Droge und Droge im Urin
• Urin wird in Testkarte ge-sogenDroge bindet an Konjugat
• ist Konzentration > Cut-off, verbleibt kein Konjugat, um an membrangebundene Droge zu binden Testlinie fehlt
• Kontroll-Linie: spezifischer membrangebundener Anti-körper bindet Konjugat Quelle: Mahsan Diagnostika Vertriebsgesellschaft mbH, Produktinformation
fehlt vorhanden
vorhandenvorhanden
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Drogenschnelltests fehlerhaft - Polizei nutzt sie aber weiter Leipziger Volkszeitung,
02.12.2003
Drogenschnelltests müssen dringend zur Ausrüstung der Polizei gehören Gesamtverband der Dt. Versicherungswirtschaft, 07.09.2001
„Drogenschnelltests sollen flächendeckend eingeführt werden.“ Drogenbeauftragte der Bundesregierung, Juli 2003
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Verfügbarkeit von Drogenschnelltests
• Teststreifen, die offizielles EU-Genehmigungsverfahren durchlaufen haben
• daneben im Internet erhältlich: Schnelltests ohne offizielle Zulassung, lückenhafte Informationen über Eigenschaften und Qualität, vom Einsatz abzuraten
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Drogenschnelltests:„schnell“, aber auch „gut“?
• Nachweis von Pharmaka mit Schnelltests scheinbar leicht durchführbar
ABER: falsch-positive und falsch-negative Befunde vermeiden!
• Präanalytik?
• Entscheidungsgrenze?
• Empfindlichkeit gegenüber Metaboliten?
• Qualitätssicherung der Resultate?
• Auswertung und Beurteilung?
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Beispiel: TCA-Schnelltest
„kalibriert“ auf Imipramin, Cut-off: 750 µg/l, abgelesen nach 10 min
1000 µg/l 750 µg/l 500 µg/l Blindprobe
negativnegativ?
1x „keine Linie“5x „schwache Linie“
?4x „keine Linie“
2x „schwache Linie“
positiv?5x „keine Linie“
1x „schwache Linie“
„Selbst wenn die Testlinie auch nur schwach erkennbar ist, ist der Urin negativ.“
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Schnelltests: Auswertung
• überwiegend subjektiv-visuell
• positive Befunde bei Fehlen einer BandeABER: auch bei schwach gefärbten Banden: „negativ“ an unerfahrenen Untersucher hohe Anforderungen gestellt
• Feldeinsatz mit ungenügender Beleuchtung (Verkehrskontrollen): Fehlablesungen möglich
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Schnelltests: Qualitätssicherung
• Kontroll-Linie: Auftreten zeigt, dass Analysenvorgang regelrecht abgelaufen ist
• Kontrollmaterial: arbeitstägliche Verwendung empfohlen, aber vom Untersucher selbst zu beschaffen (Kosten!)
• richtig-positive Kontrolle bedeutet lediglich, dass aktuell eingesetzter Streifen in Ordnung war
• nicht überprüfte Streifen könnten dennoch fehlerhafte Befunde ergeben (Produktionsmängel, unsachgemäße Lagerung)
• Ergebnis-Dokumentation: keine „Datenspeicherung“ möglich
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Instrumenteller Immunoassay
• CEDIA (ClonedEnzyme Donor Immunoassay)
• FPIA (Fluoreszenz-polarisations-immunoassay)
• KIMS(kinetic inter-action of micro-particles in a solution)
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Instrumenteller Immunoassay
• liefert quantitatives Mess-Signal (Rohwert dokumentiert)
• Wert oberhalb der Entscheidungsgrenze (Cut-off-Wert) Probe gilt als verdächtig
• Verdachtsbereich („fraglicher“ Bereich): Messwert zwischen Cut-off und Nachweisgrenze
• Cut-off kann an die jeweilige Fragestellung angepasst werden:Akut-Toxikologie, Überwachung Drogenentzug, ...
• nach Rücksprache mit dem behandelnden Arzt weitere Untersuchung (Bestätigungsanalyse, Differenzierung)
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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EDV-gestützte maschinelle Auswertung
» z.B. TCA aus Serum Cut-off: 20 ng/mL (Imipramin)
9986/04 (Blindprobe)9987/04 dotiert: 10 ng/mL9988/04 dotiert: 20 ng/mL9989/04 dotiert: 50 ng/mL
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Instrumentelle Verfahren:Qualitätskontrolle
• quantitatives Mess-Signal, Impräzision ca. 7-11%
• Richtigkeit mit Kontrollmaterial prüfen
• externe Qualitätskontrolle (Ringversuche):
DGKLINSTANDGTFCh
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Verfahren im Vergleich
Schnelltests Instrumentelle Tests Bestätigungs-analysen (GC/MS)
feldtauglich ortsgebunden ortsgebunden
keine Geräte nötig medizin. Labor Speziallabor
kein Hydrolyseschritt Hydrolyse möglich Hydrolyse möglich
subjektiv-visuelle Auswertung
maschinelle Auswertung
Auswertung über Datenbank
Dokumentation? EDV-Dokumentation EDV-Dokumentation
kurze Einarbeitungszeit
MTA, CTA speziell geschulte CTA/MTA
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Analytische Aspekte:Möglichkeit der Probenverfälschung
• Möglichkeit der Probenverfälschung in Betracht zu ziehen bei:
Drogenabhängigenarbeitsmedizinischen UntersuchungenVerkehrskontrollen
• Verfälschungs-“Techniken“:
Verdünnung des Urins (Kreatinin < 2,7 mmol/l !?) Kreatin-Zusatz (enzymat. Nachw. unspezif.; Jaffe-Rkt.!)
Zusatz von Fremdsubstanzen, die Analytik stören
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Möglichkeit der Probenverfälschung
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Nachweis von Verfälschungsstoffen
• „Sample Check“ (microgenics)
Nachweis von Verfälschungsstoffen, die mit Testverfahren interferieren (Bleich-/Oxidationsmittel, Tenside, ...)
Test, ob immunchemische Reaktion in der Probenmatrix ablaufen kann.
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Präanalytik: Markersubstanzen
• Identifikation derProbe durch oraleGabe von Marker-substanzen(Polyethylenglykole)
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Analytische Aspekte:Entscheidungsgrenzen
• Entscheidungsgrenze (Cut-off) Nachweisgrenze
• Cut-off : mehr falsch-positive ErgebnisseCut-off : mehr falsch-negative Ergebnisse
• Cut-off ist je nach Indikation adaptierbar:akute Intoxikation?chronischer Abusus?Überwachung des Drogenentzugs?
z.B. Opiatnachweis: üblich bisher 300 µg/L, in der Diskussion: 2000 µg/L (Verzehr von Mohnsamen kann zu positivem Opiatnachweis führen)
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Entscheidungsgrenzen
Orientierung an Vorgaben von SAMHSA (Substance Abuse and Mental Health Services Administration, USA)
ABER:
• Vorgaben häufig nur für eine bestimmte Substanz der Gruppe realisiert
• Empfindlichkeit für andere Vertreter der Substanzgruppe (und Metabolite!) oft schlechter
• Unterschiede auch bei Tests verschiedener Hersteller!
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Spezifität: Mono-/Gruppentests
• nur wenige Immunoassays erfassen spezifisch nur eine Substanz, z.B. Benzoylecgonin (Kokain-Metabolit)Monotest
• überwiegend „Gruppentests“: erfassen verschiedene Vertreter einer Gruppe (z.B. Benzodiazepine) und deren MetabolitenGruppentest
hohe Anforderungen an Tests und an Untersucher!
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Kreuzreaktivitäten
• Kreuzreaktivität von Substanzen aus einer Gruppe kann sehr viel geringer (oder größer) sein als die der kalibrierten Substanz
• stark wirksame Substanzen in niedriger Konzentration können dem Nachweis leicht entgehen
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
Kreuzreaktivität steht nicht in Beziehung zur Pharmako-
dynamik einer Substanz: wenig wirksame Substanz kann
ein hohes Mess-Signal erzeugen und umgekehrt
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Beispiel: Benzodiazepine
therapeut. Bereich (Serum)200-1500 µg/l200-2000 µg/l 20- 800 µg/l200- 700 µg/l
• Schnelltest Mahsan® BENZOCut-off: 300 µg/l
„positiv“ ab Konzentration im Urin:
Oxazepam (Durazepam®) 300 µg/l Diazepam (Valium®) 700 µg/lNordazepam (Tranxilium®) 300 µg/lPrazepam (Demetrin®) 100000 µg/l
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Beispiel:Europäische Besonderheiten
therapeut. Bereich (Serum)200-1500 µg/l200-2000 µg/l 20- 800 µg/l 5- 15 µg/l
• amerikanische (!) Vorgaben Europa: vielfach neuere Benzodiazepine mit viel stärkerer Wirkung eingesetzt
• z.B. Flunitrazepam: niedrig dosiert! niedrige Konzentration im Urin entgeht leicht dem Nachweis
• Urinkonzentrationen „positiv“Oxazepam (Durazepam®) 300 µg/l Diazepam (Valium®) 700 µg/lNordazepam (Tranxilium®) 300 µg/lFlunitrazepam (Rohypnol®) 700 µg/l
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Hydrolyse: Erfassung von Glukuroniden
• z.B. Morphin, Benzodiazepine: überwiegend als Glukuronide ausgeschieden, automatisierte Hydrolyse empfohlen!
• viele Tests unempfindlich für Glukuronide
• Beispiel: Instrumenteller IA mit/ohne enzymatische HydrolyseCEDIA Benzodiazepine, Cut-off 300 µg/l
ohne Glukuronidase mit GlukuronidaseProbe A: 189 µg/l „negativ“ 588 µg/l „positiv“Probe B: 12 µg/l „negativ“ 395 µg/l „positiv“
Entscheidungsgrenzen gelten stets für die unkonjugierte Muttersubstanz
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Substanzgruppen:Amphetamine
• Nachweisbarkeit:Ecstasy – Urin: ca. 1-4 Tage, Serum: ca. 1 TagSpeed – Urin: ca. 2-4 Tage, Serum: ca. 2-4 Tage
• IA sollte spezifisch Amphetamine und Ihre gefährlichsten und am meisten genutzten Derivate erfassen (Amphetamin, Methamphetamin, „Ecstasy“ (MDA, MDMA, ...), ...)
• weitere Tests nützlich für weniger gefährliche Substanzen aus der Amphetamingruppe (z.B. Fenfluramin, Ephedrin)
• CAVE: einige Pharmaka (z.B. Selegilin, M. Parkinson) metabolisieren zu Methamphetamin
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Beispiel: Test auf Amphetamine
• Ringversuch Drogenscreening DS1/05 der DGKLProbe A: dotiert 1300 µg/l AmphetaminProbe B: dotiert 1300 µg/l 3,4-Methylendioxymethamphetamin MDMA
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Benzodiazepine
• Assays sollten missbräuchlich eingesetzte Benzodiazepine erfassen (z.B. Rohypnol® (Flunitrazepam))
• Messmethoden mit höherer Sensitivität erforderlich, z.B. für Flunitrazepam und renal eliminierte Metabolite (z.B. 7-Amino-Flunitrazepam)
• Assays sollten Hydrolyseschritt beinhalten, um Konjugate zu erfassen
• Antagonisten (z.B. Flumazenil/Anexate®) sollten nicht-reaktiv sein
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Cannabinoide
• Nachweisbarkeit:Urin – ca. 7-10 Tage, (häufiger Konsum: bis 8 Wochen)Serum – ca. 6 h, THC-COOH 2-3 Tage
• IA für Cannabinoide kommerziell verfügbar mit verschiedenen Cut-offs: 25, 50, 100 µg/l
• positiver Befund in der Regel nur für Raucher, nicht für Passivraucher
• Assays nicht geeignet für Entscheidung zwischen akutem und chronischem Missbrauch
THC/Kreatinin-Quotient zur Verlaufskontrolle einsetzen
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Cocain und Cocainmetabolit
• Nachweisbarkeit:Urin – ca. 2-4 Tage, Serum – ca. 1 Tag
• bevorzugt Assay einsetzen, der spezifisch einen Cocainmetaboliten (z.B. Benzoylecgonin) in Urin detektiert
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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LSD (Lysergsäure-Diethylamid)
• Nachweisbarkeit:Urin – bis ca. 3 TageSerum – bis ca. 12 h
• LSD-Konzentrationen eher niedrig
• verfügbare Assays bieten ausreichende Sensitivität, sind aber relativ unspezifisch
• Kreuzreaktivität mit anderen Drogen muss ausgeschlossen werden, da Bestätigungsanalyse im entsprechenden Konzentrationsbereich schwierig ist
• CAVE: z.Zt. sind positive Befunde eher auf eine Interferenz mit Ambroxol (auch Bromhexin, Fentanyl) zurückzuführen, da LSD-Missbrauch selten ist
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
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Methadon & Methadonmetabolit
• positiver Befund durch einen spezifischen Assay für einen Methadonmetaboliten (z.B. EDDP) ist ein starker Hinweis auf die Einnahme von Methadon
• spezifischer Assay für Methadon kann in die Irre führen: positiver Befund kann durch Zusatz einer kleinen Menge Methadons zur Urinprobe vom Probanden erzeugt werden, während der Hauptanteil in der Szene verkauft wird
• nur L-Methadon ist aktiv: Enantiomeren-Gemisch verabreicht? Unterschiedliche Kreuzreaktivität zwischen L- und D-Form im verwendeten Test?
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
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Opiate/Opioide
• verfügbare IA erfassen nur Opiate, nicht Opioide
• positiver Opiatassay sollte gefolgt werden von spezifischem Assay für 6-Acetylmorphin (Heroinmissbrauch?)CAVE: falsch-positiv bei hoher Morphinkonzentration
• Antidote (Naloxon, Naltrexon) sollten keine positiven Befunde liefern
• Opioide, die zur Behandlung von Süchtigen eingesetzt werden (z.B. Buprenorphin), sollten mit speziellen Assays nachgewiesen werden
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
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Tri-/Tetrazyklische Antidepressiva
• Assays für Serum und Urin kommerziell erhältlich
• Konzentrationen dieser Pharmaka meist gering, Assays sollten positiven Befund für viele Pharmaka mit sehr unterschiedlicher Struktur liefern Assays stark anfällig für Interferenzen
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Barbiturate
• toxikologische Bedeutung der Barbiturate stark gesunken
• Cut-off-Konzentration von 200 µg/l für alle Substanzen der Barbituratgruppe ist angemessen für die meisten Einsatzzwecke
• Hexobarbital, Methohexital und Thiopental werden nicht detektiert, da im Urin ausgeschiedene Menge gering und Kreuzreaktivität der gebräuchlichsten IA schwach
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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weitere Pharmaka
Pharmaka, für die Screeningtests dringend benötigt werden:
• Beta-Blocker (z.B. Metoprolol, Propanolol)
• Clozapin (Neuroleptikum, z.B. Leponex®)
• Diphenhydramin (Sedativum)
• Fentanyl (Narkotikum, Opioid)
• Tilidin (Opioidanalgetikum)
• Tramadol (Opioidanalgetikum)
• Zolpidem, Zopiclon (Hypnotika)
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Schlussfolgerungen
• Präanalytik? Verfälschungen ausschließen!
• Kreuzreaktivitäten? keine quantitativen Befunde!
• Verhalten von Metaboliten? Hydrolyseschritt!
• Indikation? Cut-off adaptieren!
• Qualitätssicherung? instrumentelle Verfahren Schnelltests vorziehen!
• Bestätigungsanalysen? Zusammenarbeit mit kompetentem Labor suchen!
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
leichte Durchführbarkeit von IA, dennoch:aussagekräftiger Befund bedarf umfassenden Know-Hows!
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Literatur
• Külpmann, W.-R.; Deutsches Ärzteblatt 100 (17): A1138-A1140 (2003)(www.aerzteblatt.de)
• Külpmann, W.-R.; J. Lab. Med. 28 (4): 317-325 (2004)
Einsatzgebiete
Technik
Analytische Aspekte
Substanzgruppen
Schlussfolgerungen
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Möglichkeiten und Grenzen
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Bestätigungsanalysen
• Bestätigungsanalyse unterbleibt oft aus Kostengründen verlässliche Daten aus Feldversuchen über Zuverlässigkeit von Schnelltestbefunden fehlen!
• negative Befunde werden prinzipiell nicht überprüft, keine Angaben über Häufigkeit falsch-negativer Befunde
• negatives Screeningergebnis sollte in Zweifelsfällen ebenfalls bestätigt werden (kein juristischer Bestand alleiniger Ergebnisse von Schnelltests)
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Umgang mit Messergebnissen
• Untersucher häufig analytisch unerfahren blindes Vertrauen auf Schnelltests falsch-negative Ergebnisse („Proband clean“) falsch-positive Ergebnisse („Proband drogenabhängig“)
messtechnische Grenzen der Tests bewusst machen!(mangelnde Kreuzreaktivität gegenüber Konjugaten, mangelnde Verfügbarkeit von Kontrollmaterial für Konjugate, ...)
• positive Ergebnisse begründen lediglich einen Verdacht! Bestätigungsanalyse: Absicherung, Mängel erkennen! muss empfindlicher/spezifischer als Screeningtest sein beruht auf anderem Messprinzip (GC/MS, nicht IA vs. IA!)