Hauptseminar Biophysik der Systeme

Crime Scene

DNA

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Hauptseminar Biophysik der Systeme

Konvektive Polymerase Kettenreaktion

14.11.2007

Martina BucherSebastian Karpf

Hauptseminar Biophysik der Systeme

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Englisch: Polymerase Chain Reaction Millionenfache Vervielfältigung von DNA Erzwungene, kontrollierte Replikation DNA-Polymerase „produziert“ Kopien In vitro

PCR

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Gliederung

Grundbausteine der PCR Theoretische Grundlagen Schritte des PCR-Prozesses Was ist Konvektion? Bedingungen für Konvektion Aufbauten Anwendungsgebiete Zusammenfassung

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Grundbausteine der PCR

DNA Primer DNA-Polymerase Pufferlösung dNTP-Mix

Quelle: Wikipedia.de

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DNA – Träger der Erbinformation

Doppelhelix 4 heterozyklische Nukleobasen

– Purine: Adenin und Guanin– Pyrimidine: Thymin und Cytosin

Desoxyribose Phosphatreste Wasserstoffbrückenbindungen

Quelle: Wikipedia.de

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Primer

Einsträngig Keine Wiederholung von Motiven Länge: 20-30 Nukleotide GC-Gehalt: 40-60% cfrei/cgebunden = e(-G(T)/kT)

G(T) = H-TS Schmelztemperatur Tm: G(T) = 0 Tm = 2°C•(A+T)+4°C•(C+G) (Näherung)

Quelle: Wikipedia.de, F-Praktikum, Dieter Braun

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DNA-Polymerase

Allgemein: Enzyme für Polymerisation von Nukleotiden

Mit und ohne Korrektur-Funktion Für PCR meistens Tag-Polymerase

(Bakterium Thermus aquaticus) Außerordentlich hitzebeständig

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Pufferlösung und dNTP-Mix

Volumenregulation Chemische Umgebung:

– PH-Wert– Ionenkonzentration:

Mg2+-Ionen für DNA-Polymerase

dNTP-Mix: Bausteine für DNA-Strang

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Theoretische Grundlagen

cTemplate << cPrimer

Anstieg der Zahl der Kopien exponentiell Zahl der Duplikate dominant Zahl der Kopien nach n PCR-Zyklen:

N = (2n-2n) • N0

mit 2n: Zahl der Produkte des 1. und 2. Zyklusses

Quelle: F-Praktikum

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Schritte des PCR-Prozesses

(1) Denaturierung

(2) Primerhybridisierung

(3) Elongation

(4) Ende des 1.Zyklus

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Schritte des PCR-Prozesses

(1) Denaturierung (94-96°C): Schmelzen der DNA

(2) Primerhybridisierung (Tm-5°C): Andocken der Primer an das komplementäre DNA-Stück

(3) Elongation (72°C): Verlängerung

(4) Ende des 1.Zyklus

Quelle: Wikipedia.de, F-Praktikum

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2. Teil: Konvektive PCR

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Was ist Konvektion?

Konvektion (lat. Convehere = mittragen) = Fließen von Teilchen bzw. Flüssigkeiten aufgrund von Temperaturgradienten

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PCR durch Konvektion

Für die Polymerase Kettenreaktion

werden zyklisch-periodische

Temperaturstufen benötigt

Konvektion schafft diese Zyklen!

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Konvektive PCR versus Herkömmliche PCR

Vorteile: Schnelle Amplifikation Nur 2 Temperaturen nötig Nicht so träge, da keine großen Heizelemente

benötigt werden

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Konvektionsbedingungen I

Wichtige Eckpunkte für Konvektion: Fließgeschwindigkeit v Fließlänge L Viskosität Reynolds Nummer

Quelle: Wikipedia.de

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Konvektionsbedingungen II

Für Konvektion muss die Reynoldszahl unter 1000 liegen

Dies bedeutet:– Kleines v, Kleines L– Großes

– Zur Erinnerung:

Quelle: Wikipedia.de

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Konvektionsbedingungen III

Größe der Reaktionskammern müssen zwischen 100 m und einigen cm liegenDarunter: Diffusionsprobleme

Darüber: nicht-laminarer Fluß

D.h. Konvektion kann über bis zu 6 Größenordnungen durchgeführt werden

(L3 106) Bei gutem Verlauf Verdoppelung der DNA nach

jedem Zyklus

(=Zyklusperiode)Quelle: (1), (2)

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Aufbauten

Drei Beispiele für Konvektionskammern:a) Kreisrohr (circular pipe)

b) Rayleigh-Bénard-Zelle

c) Zylinderzelle (cylindrical chamber)

zu a)

zu b)

zu c)

Quelle: (1), (2)

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a) Kreisrohr (circular pipe)

Vorteile: • gesamtes Volumen zirkuliert• niedriger Energieverbrauch

(Batteriebetrieb möglich)

Nachteile:• Parabolisches Fließprofil

stark unterschiedliche Perioden der Amplifikationszyklen

Quelle: (1), (2)

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b) Rayleigh-Bénard-Zelle

Konvektionskammer zwischen 2 geheizten Platten.

Es bilden sich Konvektions-Zirkulationen.

Quelle: (1), (2)

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b) Rayleigh-Bénard-Zelle

ΔT < ΔTkrit,1 : Viskosität überwiegt

Konvektionsströmung ΔTkrit,1 < ΔT < ΔTkrit,2 : Es treten regelmäßig

geformten Konvektionszellen auf, die Bénard-Zellen

ΔTkrit,2< ΔT : Das System gelangt ins Chaos

Quelle: Wikipedia.de

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b) Rayleigh-Bénard-Zelle

Vorteile: einfacher-kompakter Aufbau

Nachteile: Viel Energie für Heizplatten benötigt

Quelle: (1), (2)

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c) Zylinderzelle

Erklärung anhand der Versuchsaufbauten gefunden in:(1) „Exponential DNA Replication by Laminar Convection“Von Dieter Braun et al., 2003

(2) „PCR by Thermal Convection“ von Dieter Braun

Quelle: (1), (2)

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Arbeit von Dieter Braun

Infrarotlicht (1480 nm) im Zentrum des 1mm x 5mm großen Zylinders

Umgebungstemperatur 52°C

Errechnete Reynoldsnummer für: laminaren Fluss Länge L 2mm Viskosität von Wasser 1mm2/s typische Geschw. v 0,4mm/s

ergibt Re 1Quelle: (1), (2)

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Ergebnisse

Bereits nach 25 Minuten ergab sich 100.000-fache Amplifikation

DNA ließ sich durch Fluoreszenzmarker visualisieren

Gewünschte DNA-Amplifikation über Gelelektrophorese überprüft und bestätigt

Quelle: (1), (2)

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Visualisierung der DNA

• Interkalierende Fluoreszenzmarker binden nur an doppelsträngige DNA

• Man erkennt die Amplifikation der DNA• Dunkle Stellen deuten auf Einzelstränge hin• Nach Auschalten des IR-Lichtes verschwand

der schwarze Punkt im ZentrumQuelle: (1), (2)

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Visualisierung der DNA

Quelle: Dieter Braun

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Analyse durch Gelelektrophorese

Vergleich mit DNAbekannter Länge bestätigt,dass 100bp DNA-Sequenzenamplifiziert wurden.

Die Probe nach 0 min zeigt keine 100bp Sequenzen.

Quelle: (1), (2)

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Temperaturabhängigkeit

Quelle: (1), (2)

Temperaturabhängigkeit

der PCR wurde

durch kontinuierliche

Leistungsänderungen

der Infrarotquelle

bestimmt. (bei bestimmter Bahn z0=50m)

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Video der zylindrischen konvektiven PCR

Quelle: Dieter Braun

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c) Zylinderzelle

Vorteile: Sehr schnell (25 min für 100.000-fache

Amplifikation) Hohe Effizienz (50%), da gutes

Strömungsverhalten Geringe Energie benötigt

(Batteriebetrieb möglich) Nur optisch, keine Heizkontakte nötig

Quelle: (1), (2)

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Anwendungsgebiete

Genetischer Fingerabdruck Vaterschaftstest Erkennung von Krankheiten Klonierung von Genen Mutagenese Analyse alter (fossiler) DANN Geschlechtsbestimmung Pränataldiagnostik

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Zusammenfassung

PCR vermehrt exponentiell eine gewünschte DNA-Sequenz, wobei nur kurze Sequenzen amplifiziert werden können

Konvektive PCR ist high-speed PCR Einfache Designs Kostengünstige Möglichkeit Sehr kleine Versuchsaufbauten möglich