Demonstrationsprojekt Arzneipflanzen (KAMEL):

Entwicklung einer sterilen Kamillensorte

Lars-Gernot Otto, IPK Gatersleben,

Pharmaplant GmbH Artern,

Vetmeduni Wien

BMEL / FNR:

FKZ 22038911 / 22006314

Foto: IPK Gatersleben Copyright: All rights reserved © 2017

Echte Kamille (Matricaria recutita L. syn. Chamomilla

recutita) ist eine wichtige Arzneipflanze,

Deutschland (2011)1: ~ 65 pharmazeutische Produkte,

Fläche: 1.150 ha; Bedarf: ~ 4,500 t/Jahr

Breiter Anwendungsbereich:

Infektionen und Entzündungen

der Haut,

gastrointestinale Beschwerden,

Atemwegsprobleme

1 Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe, 2. Tagung Arzneipflanzen 2013

Projektziel

Züchtung einer sterilen Kamillesorte (Matricaria recutita L.)

mit hoher Ertragsfähigkeit bei arzneibuchkonformer Qualität durch

Verhinderung der Samenbildung (Samen bis zu 15 Jahre im Boden

keimfähig)

→ kein Fruchtwechsel

→ kaum neue Anbauflächen

→ Akkumulation von Kamillekrankheiten

Selbstaussaat 4 Wochen nach Flächenumbruch

Maschinelle Ernte der Blütenköpfe

Photos: wikipedia

Photo: Steve Hopson, Lizenz: Creative Commons

Attribution-Share Alike 2.5 Generic

Photo: Sven Teschke, Lizenz: Creative

Commons 3.0

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Chris 73 and is freely available at

//commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Oyster_Lyon_market.J

PG under the creative commons cc-by-sa 3.0 license.

Sterilität durch

Triploidie

Photos: wikipedia

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Commons 3.0

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Struktur des Vorhabens

Phase 1: Erarbeitung der Voraussetzungen zur Entwicklung

steriler Sorten der Echten Kamille

Phase 2: Entwicklung der Elternkomponenten

Phase 3: Testung der Kombinationseignung und

Sortenentwicklung

Phase 1: Erarbeitung der Voraussetzungen zur Entwicklung

steriler Sorten der Echten Kamille

Struktur des Vorhabens

2x 4x ×

3x

durch:

Entwicklung und Prüfung von Triploiden als ein Weg für sterile

Sorten

Entwicklung von Ausgangsmaterial mit männlicher Sterilität und

weiblicher Fertilität

durch:

Entwicklung und Prüfung von Triploiden als ein Weg für sterile

Sorten

Entwicklung von Ausgangsmaterial mit männlicher Sterilität und

weiblicher Fertilität

Phase 1: Erarbeitung der Voraussetzungen zur Entwicklung

steriler Sorten der Echten Kamille

2x 4x ×

3x

männlich sterile

Mutter

Struktur des Vorhabens

durch:

Phase 1: Erarbeitung der Voraussetzungen zur Entwicklung

steriler Sorten der Echten Kamille

Entwicklung und Prüfung von Triploiden als ein Weg für sterile

Sorten

Entwicklung von Ausgangsmaterial mit männlicher Sterilität und

weiblicher Fertilität

Auffinden von Quellen für SI

Induktion, Selektion und Charakterisierung von sterilem

Ausgangsmaterial für männliche Sterilität (MS)

Auffinden von Quellen für CMS

Struktur des Vorhabens

Selektion/Erzeugung eines Mechanismus zur

Bestäubungslenkung bei Kamille

Selektion und Prüfung von triploiden Pflanzen

Otto et al. 2015, Pl. Breed. J.

Mittels Durchflusszytometrie und mikroskopischer Analyse

Identifizierung von diploiden, triploiden, tetraploiden und

aneuploiden Pflanzen

Chromosomenzahl:

18 27 36 41

3x aneupl. 4x 2x

V. faba

V. faba

V. faba V. faba

Durchflusszytometrische Analyse von Kamillesamen (Embryonen)

Ploidie von Embryonen

unterschiedlicher Sorten

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

aneu.

4x

3x

2x

Otto et al. 2015, Pl. Breed. J.

Durchflusszytometrische Analyse von Kamillesamen (Embryonen)

Ploidie von Embryonen

unterschiedlicher Sorten

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

aneu.

4x

3x

2x

Otto et al. 2015, Pl. Breed. J.

Durchflusszytometrische Analyse von Kamillesamen (Embryonen)

Ploidie von Embryonen

unterschiedlicher Sorten

Ploidie von Embryonen der

Sorte ´Bodegold‘

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Bg. leicht, n=150

Bg. mittel, n=134

Bg. schwer =199

Bg. sehr schwer,

=220

Bg. Obersieb,

n=93

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

aneu.

4x

3x

2x

Otto et al. 2015, Pl. Breed. J.

Vorkommen triploider Kamillesamen in tetraploiden Herkünften

Ploidie der Embryonen: 5 Samen gepoolt

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

aneu.

4x

3x

2x

diploide Sorten tetraploide Sorten / Herkünfte Fraktionen Bodegold

Otto et al. 2015, Pl. Breed. J.

Vorkommen triploider Kamillesamen in tetraploiden Herkünften

Ploidie der Embryonen: 5 Samen gepoolt

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

aneu.

4x

3x

2x

diploide Sorten tetraploide Sorten / Herkünfte Fraktionen Bodegold

Anzucht von Pflanzen der schweren Fraktion ´Bodegold´

Identifizierung von triploiden Pflanzen in ´Bodegold´

Otto et al. 2015, Pl. Breed. J.

90 Kreuzungskombinationen zwischen 39 verschiedenen di-

und tetraploiden Kamillepopulationen (GWH)

0 - 285 Nachkommen pro Kreuzung, gesamt 2742 analysiert:

→ 556 diploid, 4 triploid, 2109 tetraploid, 73 aneuploid

Nachkommen meist gleiche

Ploidie wie Mutter – Selbstung?

4 Triploide identifiziert

Otto et al. 2015, Pl. Breed. J.

Foto: Pharmaplant GmbH, Copyright:

All rights reserved © 2017

Nachkommen:

tetraploid × diploid: 9 triploide (5.8%), 144 tetraploide,

1 aneuploide

diploid × tetraploid: 57 diploide, 5 triploide (7.5 %),

4 tetraploide, 1 aneuploide

Gezielte interploide Kreuzung in freier isolierter Abblüte

(Isolierstandort Freiland)

Prüfung triploider Kamillepflanzen

16 triploide Genotypen verschiedener Herkunft nach in-

vitro Verklonung/Vermehrung untersucht:

Parzellen-Freilandversuch (Ertragsprüfung) mit di- und

tetraploiden Vergleichspflanzen

Populationsversuch von Triploiden

Isolierstandorte

Prüfung triploider Kamillepflanzen

Parzellen-Freilandversuch

Populationsversuch von Triploiden

Isolierstandorte

Parzellen-Freilandversuch

Photo: Anne Lümkemann

Blü

ten

grö

ße [

mm

]

Ploidiestufe

Blütengröße im Parzellen-Freilandversuch

0

2

4

6

8

10

12

2x 3x 4x

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Genotypen

Blü

hd

au

er

[d]

3x

2x

4x

Konfidenzintervall: σ

Blühdauer im Parzellen-Freilandversuch

‘Bodegold‘ gezielte Kreuzungen

Genotypen

Hö

he

[c

m]

3x

2x

4x

Konfidenzintervall: σ

Bestandeshöhe im Parzellen-Freilandversuch

0

10

20

30

40

50

60

70 ‘Bodegold‘ gezielte Kreuzungen

Genotypen

3x

2x

4x

0

5

10

15

20

25

Ert

rag

[d

t/h

a]

Konfidenzintervall: σ

Ertrag im Parzellen-Freilandversuch 2016

Genotypen

‘Bodegold‘ gezielte Kreuzungen

Prüfung triploider Kamillepflanzen

Parzellen-Freilandversuch

Populationsversuch von Triploiden

Isolierstandorte

Population triploider Kamillepflanzen

Photo: IPK Gatersleben, Lizenz: Creative Commons by 4.0

Vergleich Kamille (2x/4x): ca. 100 – 200 Keimlinge pro Blütenkopf

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Ke

imlin

ge

pro

Blü

ten

ko

pf

Triploide Populationsabblüte

Genotypen Konfidenzintervall: σ

Triploide Kamillepflanzen hatten keine oder wenig

Nachkommen bei Abblüte in Population

Prüfung triploider Kamillepflanzen

Parzellen-Freilandversuch

Populationsversuch von Triploiden

Isolierstandorte

0

1

2

3

4

5

6

7

Ke

imlin

ge

pro

Blü

ten

ko

pf

Isolierte Abblüte

Genotypen Konfidenzintervall: σ

Wenige Keimpflanzen von einzelnen Triploiden bei

isolierter Abblüte

Triploide sind zur Entwicklung steriler

Kamillensorten geeignet!

Sterilität der Triploiden sehr hoch bis vollständig ausgeprägt

(vereinzelte oder keine Nachkommen)

Ploidie stabil

Ertrag der Triploiden mindestens auf dem gleichen Niveau wie

bei Tetraploiden, einzelne triploide Genotypen höherer Ertrag

Blühdauer von di-, tri- und tetraploiden Pflanzen im Durchschnitt

gleich, d. h. keine längere Blühdauer bei Triploiden beobachtet

Selektion/Erzeugung eines Mechanismus zur

Bestäubungslenkung bei Kamille

Selektion und Prüfung von triploiden Pflanzen

Selektion/Erzeugung eines Mechanismus zur

Bestäubungslenkung bei Kamille

Selektion von SI-Pflanzen (Selbstinkompatibilität)

Erzeugung/Identifizierung von MS-Kamillepflanzen

Entwicklung von CMS-Kamillepflanzen

(cytoplasmatisch-männliche Sterilität)

Zusätzlich:

Test von hohen Temperaturen (29 °C) zur Induktion von

MS

Test einer systemisch wirkenden Chemikalie zur

Kastration (Clofencet)

Selektion/Erzeugung eines Mechanismus zur

Bestäubungslenkung bei Kamille

Selektion von SI-Pflanzen (Selbstinkompatibilität)

Erzeugung/Identifizierung von MS-Kamillepflanzen

Entwicklung von CMS-Kamillepflanzen

(cytoplasmatisch-männliche Sterilität)

Wiederholte Untersuchungen zur Überprüfung:

• Untersuchung von 300 Individuen aus sechs di- und tetraploiden

Sorten

• Isolierung mit Crispac-Beutel (GWH)

• 3 x im Abstand von 3 Tagen manuelle Bestäubung, Auszählung 3

Blütenköpfchen/Pflanze, Wiederholung im folgenden Jahr

• Kein Kornansatz => SI

Selektion von SI-Pflanzen

Fähnrich et al. J. Appl. Bot. Food Qual. 2013, Fähnrich et al. Euphytica 2015

Selektion von SI-Pflanzen

6

8

2 1

2 2

6

7

3 4

1

4

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Degumille Bona Germania USA Manzana Lutea

SI SK

Selektion von SI-Pflanzen

• 8 Kamilleherkünfte mit je 30-35 Einzelpflanzen (250 Pflanzen)

• Isolierkäfige im Freiland, Fliegen als Bestäuber

• 3 Blütenköpfe pro Pflanze für Keimfähigkeitstest

Photo: IPK Gatersleben, Lizenz: Creative Commons by 4.0

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Selektion von SI-Pflanzen

• zwischen 0 und 82 Keimpflanzen/Blütenkopf erhalten

• freie Abblüte: ca. 100 – 200 Keimlinge pro Blütenkopf

Herkunft-Nr. Genotypen ohne Keimpflanzen

1 3 2 1 3 4 4 3 5 3 6 1 7 0 8 1

Selektion von SI-Pflanzen

Erhaltung/Vermehrung von SI-Pflanzen durch:

Verklonung (in-vitro Kultur, Stecklinge)

Temporäre Überwindung der SI?

(hohe Temperatur, Chemikalien)

Schätzung der Anzahl der SI-Allele

• 9 SI-Pflanzen diallel gekreuzt (74 Kreuzungen,

Bestäuber: Fliegen)

• Kreuzungen mit Samenansatz haben

unterschiedliche SI-Allele.

• Falls Samenansatz unklar (nur wenige Samen) =>

Wiederholung

• Bisher 20 unterschiedliche Allelpaare identifiziert

(24 Kreuzungspaare)

• Tapetumzellen: Pollenernährung

und Pollenkit (Erkennung Pollen – Narbe)

• Auffinden Unterschiede zwischen

SI/SK-Pflanzen

• 3 SI und 3 SK Individuen der Sorte ‘Bona‘

• LAM (Laser assisted microdissection)

=> Auffinden verantwortlicher mRNA, Proteine

• Genomweite Assoziationsstudie (GWAS):

DNA-Sequenz signifikant assoziiert mit Blütezeit - deren Ortholog ist

für Arabidopsis thaliana in Zusammenhang mit Selbstung beschrieben

=> Sequenzunterschiede zwischen SI/SK?

Plan: Auffinden des Mechanismus von SI bei Kamille

Selektion/Erzeugung eines Mechanismus zur

Bestäubungslenkung bei Kamille

Selektion von SI-Pflanzen (Selbstinkompatibilität)

Erzeugung/Identifizierung von MS-Kamillepflanzen

Entwicklung von CMS-Kamillepflanzen

(cytoplasmatisch-männliche Sterilität)

Identifizierter MS-Genotyp (‘Bona‘)

männlich fertil männlich steril

Foto: IPK Gatersleben Copyright: All rights reserved © 2017 Foto: IPK Gatersleben Copyright: All rights reserved © 2017

Selektion/Erzeugung eines Mechanismus zur

Bestäubungslenkung bei Kamille

Selektion von SI-Pflanzen (Selbstinkompatibilität)

Erzeugung/Identifizierung von MS-Kamillepflanzen

Entwicklung von CMS-Kamillepflanzen

(cytoplasmatisch-männliche Sterilität)

4x

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

019_01

024_02

008_04

014_04

021_03

032_05

021_02

023_01

033_05

022_01

024_07

023_02

007_03

011_04

027_04

011_01

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014_05

032_01

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022_04

008_05

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016_04

013_04

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022_06

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027_02

027_03

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717_03

717_04

003_03

005_01

005_02

2x

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

005_03

005_04

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009_02

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003_01

009_01

066_04

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003_02

003_04

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026_02

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515_01

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722_03

721_04

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004_01

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516_04

516_07

Methode: STRUCTURE (Pritchard et al. 2000)

Genetische Diversität innerhalb Echter Kamille: Identifizierung von Untergruppen an 91 Genotypen/30 Populationen

mittels 6495 SNPs (Genotyping-by-Sequencing)

4x

Otto et al. 2017, BMC Genomics eingereicht

• Erhöhter Anteil steriler Pollenkörner Bona x HUN 2:

=> F2 und BC1; Überprüfung der Pollensterilität

• Kreuzungen genetisch weit entfernter Sorten (11) und nah verwandter

Arten (5)

• Erhalt steriler Individuen unabhängig vom Mechanismus

• CMS in Mitochondrien-DNA verankert: Isolation von Mitochondrien,

Extraktion und Anreicherung der mtDNA

=> mtDNA Sequenzierung; Entwicklung eines Routine PCR-

Protokolls zum Auffinden geeigneter Kreuzungspartner

Entwicklung von CMS-Kamillepflanzen

Selektion/Erzeugung eines Mechanismus zur

Bestäubungslenkung bei Kamille

verschiedene SI-Genotypen identifiziert,

Erhaltung mittels Klonpflanzen

Zahlreiche SI-Allele vorhanden

Untersuchungen zur Aufklärung der Grundlagen der SI

Ein MS-Genotyp identifiziert

► Leibniz-Institut für Pflanzengenetik

und Kulturpflanzenforschung

Gatersleben,

Dr. Jonathan Brassac, Prof. Timothy F.

Sharbel, ► Veterinärmedizinische Universität

Wien,

Prof. Chlodwig Franz, Prof. Johannes

Novak, Dr. Bettina Fähnrich, Dr. Joana

Ruzicka

► PHARMAPLANT GmbH

Dr. Andreas Plescher, Marlis

Sonnenschein, Anne Lümkemann,

Bartolome Plocharski

Förderung ► Bundesministerium für Ernährung und Landwirtschaft (BMEL)

► Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe (FNR)

Prof. Dr. Jürgen Grunewaldt,

Dr. Wolfram Junghanns,

Forschungsvereinigung der

Arzneimittelhersteller e.V. (FAH)

Foto: Johannes Kittler, Copyright: All rights reserved © 2016

Herzlichen Dank für Ihre

Aufmerksamkeit !

Foto: Johannes Kittler, Copyright: All rights reserved © 2016