Demonstrationsprojekt Arzneipflanzen (KAMEL): Entwicklung ... · Methode: STRUCTURE (Pritchard et...
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Demonstrationsprojekt Arzneipflanzen (KAMEL):
Entwicklung einer sterilen Kamillensorte
Lars-Gernot Otto, IPK Gatersleben,
Pharmaplant GmbH Artern,
Vetmeduni Wien
BMEL / FNR:
FKZ 22038911 / 22006314
Foto: IPK Gatersleben Copyright: All rights reserved © 2017
Echte Kamille (Matricaria recutita L. syn. Chamomilla
recutita) ist eine wichtige Arzneipflanze,
Deutschland (2011)1: ~ 65 pharmazeutische Produkte,
Fläche: 1.150 ha; Bedarf: ~ 4,500 t/Jahr
Breiter Anwendungsbereich:
Infektionen und Entzündungen
der Haut,
gastrointestinale Beschwerden,
Atemwegsprobleme
1 Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe, 2. Tagung Arzneipflanzen 2013
Projektziel
Züchtung einer sterilen Kamillesorte (Matricaria recutita L.)
mit hoher Ertragsfähigkeit bei arzneibuchkonformer Qualität durch
Verhinderung der Samenbildung (Samen bis zu 15 Jahre im Boden
keimfähig)
→ kein Fruchtwechsel
→ kaum neue Anbauflächen
→ Akkumulation von Kamillekrankheiten
Selbstaussaat 4 Wochen nach Flächenumbruch
Maschinelle Ernte der Blütenköpfe
Photos: wikipedia
Photo: Steve Hopson, Lizenz: Creative Commons
Attribution-Share Alike 2.5 Generic
Photo: Sven Teschke, Lizenz: Creative
Commons 3.0
This Wikipedia and Wikimedia Commons image is from the user
Chris 73 and is freely available at
//commons.wikimedia.org/wiki/File:Open_Oyster_Lyon_market.J
PG under the creative commons cc-by-sa 3.0 license.
Sterilität durch
Triploidie
Photos: wikipedia
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Commons 3.0
Photo: Steve Hopson, Lizenz: Creative Commons
Attribution-Share Alike 2.5 Generic
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Struktur des Vorhabens
Phase 1: Erarbeitung der Voraussetzungen zur Entwicklung
steriler Sorten der Echten Kamille
Phase 2: Entwicklung der Elternkomponenten
Phase 3: Testung der Kombinationseignung und
Sortenentwicklung
Phase 1: Erarbeitung der Voraussetzungen zur Entwicklung
steriler Sorten der Echten Kamille
Struktur des Vorhabens
2x 4x ×
3x
durch:
Entwicklung und Prüfung von Triploiden als ein Weg für sterile
Sorten
Entwicklung von Ausgangsmaterial mit männlicher Sterilität und
weiblicher Fertilität
durch:
Entwicklung und Prüfung von Triploiden als ein Weg für sterile
Sorten
Entwicklung von Ausgangsmaterial mit männlicher Sterilität und
weiblicher Fertilität
Phase 1: Erarbeitung der Voraussetzungen zur Entwicklung
steriler Sorten der Echten Kamille
2x 4x ×
3x
männlich sterile
Mutter
Struktur des Vorhabens
durch:
Phase 1: Erarbeitung der Voraussetzungen zur Entwicklung
steriler Sorten der Echten Kamille
Entwicklung und Prüfung von Triploiden als ein Weg für sterile
Sorten
Entwicklung von Ausgangsmaterial mit männlicher Sterilität und
weiblicher Fertilität
Auffinden von Quellen für SI
Induktion, Selektion und Charakterisierung von sterilem
Ausgangsmaterial für männliche Sterilität (MS)
Auffinden von Quellen für CMS
Struktur des Vorhabens
Selektion/Erzeugung eines Mechanismus zur
Bestäubungslenkung bei Kamille
Selektion und Prüfung von triploiden Pflanzen
Otto et al. 2015, Pl. Breed. J.
Mittels Durchflusszytometrie und mikroskopischer Analyse
Identifizierung von diploiden, triploiden, tetraploiden und
aneuploiden Pflanzen
Chromosomenzahl:
18 27 36 41
3x aneupl. 4x 2x
V. faba
V. faba
V. faba V. faba
Durchflusszytometrische Analyse von Kamillesamen (Embryonen)
Ploidie von Embryonen
unterschiedlicher Sorten
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
aneu.
4x
3x
2x
Otto et al. 2015, Pl. Breed. J.
Durchflusszytometrische Analyse von Kamillesamen (Embryonen)
Ploidie von Embryonen
unterschiedlicher Sorten
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
aneu.
4x
3x
2x
Otto et al. 2015, Pl. Breed. J.
Durchflusszytometrische Analyse von Kamillesamen (Embryonen)
Ploidie von Embryonen
unterschiedlicher Sorten
Ploidie von Embryonen der
Sorte ´Bodegold‘
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Bg. leicht, n=150
Bg. mittel, n=134
Bg. schwer =199
Bg. sehr schwer,
=220
Bg. Obersieb,
n=93
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
aneu.
4x
3x
2x
Otto et al. 2015, Pl. Breed. J.
Vorkommen triploider Kamillesamen in tetraploiden Herkünften
Ploidie der Embryonen: 5 Samen gepoolt
0%
10%
20%
30%
40%
50%
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70%
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aneu.
4x
3x
2x
diploide Sorten tetraploide Sorten / Herkünfte Fraktionen Bodegold
Otto et al. 2015, Pl. Breed. J.
Vorkommen triploider Kamillesamen in tetraploiden Herkünften
Ploidie der Embryonen: 5 Samen gepoolt
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
aneu.
4x
3x
2x
diploide Sorten tetraploide Sorten / Herkünfte Fraktionen Bodegold
Anzucht von Pflanzen der schweren Fraktion ´Bodegold´
Identifizierung von triploiden Pflanzen in ´Bodegold´
Otto et al. 2015, Pl. Breed. J.
90 Kreuzungskombinationen zwischen 39 verschiedenen di-
und tetraploiden Kamillepopulationen (GWH)
0 - 285 Nachkommen pro Kreuzung, gesamt 2742 analysiert:
→ 556 diploid, 4 triploid, 2109 tetraploid, 73 aneuploid
Nachkommen meist gleiche
Ploidie wie Mutter – Selbstung?
4 Triploide identifiziert
Otto et al. 2015, Pl. Breed. J.
Foto: Pharmaplant GmbH, Copyright:
All rights reserved © 2017
Nachkommen:
tetraploid × diploid: 9 triploide (5.8%), 144 tetraploide,
1 aneuploide
diploid × tetraploid: 57 diploide, 5 triploide (7.5 %),
4 tetraploide, 1 aneuploide
Gezielte interploide Kreuzung in freier isolierter Abblüte
(Isolierstandort Freiland)
Prüfung triploider Kamillepflanzen
16 triploide Genotypen verschiedener Herkunft nach in-
vitro Verklonung/Vermehrung untersucht:
Parzellen-Freilandversuch (Ertragsprüfung) mit di- und
tetraploiden Vergleichspflanzen
Populationsversuch von Triploiden
Isolierstandorte
Prüfung triploider Kamillepflanzen
Parzellen-Freilandversuch
Populationsversuch von Triploiden
Isolierstandorte
Parzellen-Freilandversuch
Photo: Anne Lümkemann
Blü
ten
grö
ße [
mm
]
Ploidiestufe
Blütengröße im Parzellen-Freilandversuch
0
2
4
6
8
10
12
2x 3x 4x
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Genotypen
Blü
hd
au
er
[d]
3x
2x
4x
Konfidenzintervall: σ
Blühdauer im Parzellen-Freilandversuch
‘Bodegold‘ gezielte Kreuzungen
Genotypen
Hö
he
[c
m]
3x
2x
4x
Konfidenzintervall: σ
Bestandeshöhe im Parzellen-Freilandversuch
0
10
20
30
40
50
60
70 ‘Bodegold‘ gezielte Kreuzungen
Genotypen
3x
2x
4x
0
5
10
15
20
25
Ert
rag
[d
t/h
a]
Konfidenzintervall: σ
Ertrag im Parzellen-Freilandversuch 2016
Genotypen
‘Bodegold‘ gezielte Kreuzungen
Prüfung triploider Kamillepflanzen
Parzellen-Freilandversuch
Populationsversuch von Triploiden
Isolierstandorte
Population triploider Kamillepflanzen
Photo: IPK Gatersleben, Lizenz: Creative Commons by 4.0
Vergleich Kamille (2x/4x): ca. 100 – 200 Keimlinge pro Blütenkopf
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Ke
imlin
ge
pro
Blü
ten
ko
pf
Triploide Populationsabblüte
Genotypen Konfidenzintervall: σ
Triploide Kamillepflanzen hatten keine oder wenig
Nachkommen bei Abblüte in Population
Prüfung triploider Kamillepflanzen
Parzellen-Freilandversuch
Populationsversuch von Triploiden
Isolierstandorte
0
1
2
3
4
5
6
7
Ke
imlin
ge
pro
Blü
ten
ko
pf
Isolierte Abblüte
Genotypen Konfidenzintervall: σ
Wenige Keimpflanzen von einzelnen Triploiden bei
isolierter Abblüte
Triploide sind zur Entwicklung steriler
Kamillensorten geeignet!
Sterilität der Triploiden sehr hoch bis vollständig ausgeprägt
(vereinzelte oder keine Nachkommen)
Ploidie stabil
Ertrag der Triploiden mindestens auf dem gleichen Niveau wie
bei Tetraploiden, einzelne triploide Genotypen höherer Ertrag
Blühdauer von di-, tri- und tetraploiden Pflanzen im Durchschnitt
gleich, d. h. keine längere Blühdauer bei Triploiden beobachtet
Selektion/Erzeugung eines Mechanismus zur
Bestäubungslenkung bei Kamille
Selektion und Prüfung von triploiden Pflanzen
Selektion/Erzeugung eines Mechanismus zur
Bestäubungslenkung bei Kamille
Selektion von SI-Pflanzen (Selbstinkompatibilität)
Erzeugung/Identifizierung von MS-Kamillepflanzen
Entwicklung von CMS-Kamillepflanzen
(cytoplasmatisch-männliche Sterilität)
Zusätzlich:
Test von hohen Temperaturen (29 °C) zur Induktion von
MS
Test einer systemisch wirkenden Chemikalie zur
Kastration (Clofencet)
Selektion/Erzeugung eines Mechanismus zur
Bestäubungslenkung bei Kamille
Selektion von SI-Pflanzen (Selbstinkompatibilität)
Erzeugung/Identifizierung von MS-Kamillepflanzen
Entwicklung von CMS-Kamillepflanzen
(cytoplasmatisch-männliche Sterilität)
Wiederholte Untersuchungen zur Überprüfung:
• Untersuchung von 300 Individuen aus sechs di- und tetraploiden
Sorten
• Isolierung mit Crispac-Beutel (GWH)
• 3 x im Abstand von 3 Tagen manuelle Bestäubung, Auszählung 3
Blütenköpfchen/Pflanze, Wiederholung im folgenden Jahr
• Kein Kornansatz => SI
Selektion von SI-Pflanzen
Fähnrich et al. J. Appl. Bot. Food Qual. 2013, Fähnrich et al. Euphytica 2015
Selektion von SI-Pflanzen
6
8
2 1
2 2
6
7
3 4
1
4
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Degumille Bona Germania USA Manzana Lutea
SI SK
Selektion von SI-Pflanzen
• 8 Kamilleherkünfte mit je 30-35 Einzelpflanzen (250 Pflanzen)
• Isolierkäfige im Freiland, Fliegen als Bestäuber
• 3 Blütenköpfe pro Pflanze für Keimfähigkeitstest
Photo: IPK Gatersleben, Lizenz: Creative Commons by 4.0
Photo: IPK Gatersleben, Lizenz: Creative Commons by 4.0
Selektion von SI-Pflanzen
• zwischen 0 und 82 Keimpflanzen/Blütenkopf erhalten
• freie Abblüte: ca. 100 – 200 Keimlinge pro Blütenkopf
Herkunft-Nr. Genotypen ohne Keimpflanzen
1 3 2 1 3 4 4 3 5 3 6 1 7 0 8 1
Selektion von SI-Pflanzen
Erhaltung/Vermehrung von SI-Pflanzen durch:
Verklonung (in-vitro Kultur, Stecklinge)
Temporäre Überwindung der SI?
(hohe Temperatur, Chemikalien)
Schätzung der Anzahl der SI-Allele
• 9 SI-Pflanzen diallel gekreuzt (74 Kreuzungen,
Bestäuber: Fliegen)
• Kreuzungen mit Samenansatz haben
unterschiedliche SI-Allele.
• Falls Samenansatz unklar (nur wenige Samen) =>
Wiederholung
• Bisher 20 unterschiedliche Allelpaare identifiziert
(24 Kreuzungspaare)
• Tapetumzellen: Pollenernährung
und Pollenkit (Erkennung Pollen – Narbe)
• Auffinden Unterschiede zwischen
SI/SK-Pflanzen
• 3 SI und 3 SK Individuen der Sorte ‘Bona‘
• LAM (Laser assisted microdissection)
=> Auffinden verantwortlicher mRNA, Proteine
• Genomweite Assoziationsstudie (GWAS):
DNA-Sequenz signifikant assoziiert mit Blütezeit - deren Ortholog ist
für Arabidopsis thaliana in Zusammenhang mit Selbstung beschrieben
=> Sequenzunterschiede zwischen SI/SK?
Plan: Auffinden des Mechanismus von SI bei Kamille
Selektion/Erzeugung eines Mechanismus zur
Bestäubungslenkung bei Kamille
Selektion von SI-Pflanzen (Selbstinkompatibilität)
Erzeugung/Identifizierung von MS-Kamillepflanzen
Entwicklung von CMS-Kamillepflanzen
(cytoplasmatisch-männliche Sterilität)
Identifizierter MS-Genotyp (‘Bona‘)
männlich fertil männlich steril
Foto: IPK Gatersleben Copyright: All rights reserved © 2017 Foto: IPK Gatersleben Copyright: All rights reserved © 2017
Selektion/Erzeugung eines Mechanismus zur
Bestäubungslenkung bei Kamille
Selektion von SI-Pflanzen (Selbstinkompatibilität)
Erzeugung/Identifizierung von MS-Kamillepflanzen
Entwicklung von CMS-Kamillepflanzen
(cytoplasmatisch-männliche Sterilität)
4x
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
019_01
024_02
008_04
014_04
021_03
032_05
021_02
023_01
033_05
022_01
024_07
023_02
007_03
011_04
027_04
011_01
024_05
033_03
014_05
032_01
021_05
022_02
011_05
032_04
022_04
008_05
013_06
019_03
016_04
013_04
007_04
022_06
024_03
023_03
007_02
027_02
027_03
008_02
016_02
002_02
002_04
717_03
717_04
003_03
005_01
005_02
2x
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
005_03
005_04
006_01
006_02
006_03
006_04
007_01
004_04
009_03
009_02
515_04
003_01
009_01
066_04
066_07
003_02
003_04
026_01
026_02
026_05
515_01
064_01
064_03
721_03
722_04
722_03
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020_04
020_01
715_06
004_03
715_04
026_04
004_01
010_02
010_03
010_06
029_03
029_04
029_07
067_02
067_04
516_01
516_04
516_07
Methode: STRUCTURE (Pritchard et al. 2000)
Genetische Diversität innerhalb Echter Kamille: Identifizierung von Untergruppen an 91 Genotypen/30 Populationen
mittels 6495 SNPs (Genotyping-by-Sequencing)
4x
Otto et al. 2017, BMC Genomics eingereicht
• Erhöhter Anteil steriler Pollenkörner Bona x HUN 2:
=> F2 und BC1; Überprüfung der Pollensterilität
• Kreuzungen genetisch weit entfernter Sorten (11) und nah verwandter
Arten (5)
• Erhalt steriler Individuen unabhängig vom Mechanismus
• CMS in Mitochondrien-DNA verankert: Isolation von Mitochondrien,
Extraktion und Anreicherung der mtDNA
=> mtDNA Sequenzierung; Entwicklung eines Routine PCR-
Protokolls zum Auffinden geeigneter Kreuzungspartner
Entwicklung von CMS-Kamillepflanzen
Selektion/Erzeugung eines Mechanismus zur
Bestäubungslenkung bei Kamille
verschiedene SI-Genotypen identifiziert,
Erhaltung mittels Klonpflanzen
Zahlreiche SI-Allele vorhanden
Untersuchungen zur Aufklärung der Grundlagen der SI
Ein MS-Genotyp identifiziert
► Leibniz-Institut für Pflanzengenetik
und Kulturpflanzenforschung
Gatersleben,
Dr. Jonathan Brassac, Prof. Timothy F.
Sharbel, ► Veterinärmedizinische Universität
Wien,
Prof. Chlodwig Franz, Prof. Johannes
Novak, Dr. Bettina Fähnrich, Dr. Joana
Ruzicka
► PHARMAPLANT GmbH
Dr. Andreas Plescher, Marlis
Sonnenschein, Anne Lümkemann,
Bartolome Plocharski
Förderung ► Bundesministerium für Ernährung und Landwirtschaft (BMEL)
► Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe (FNR)
Prof. Dr. Jürgen Grunewaldt,
Dr. Wolfram Junghanns,
Forschungsvereinigung der
Arzneimittelhersteller e.V. (FAH)
Foto: Johannes Kittler, Copyright: All rights reserved © 2016
Herzlichen Dank für Ihre
Aufmerksamkeit !
Foto: Johannes Kittler, Copyright: All rights reserved © 2016