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Experimentelle Methoden zur Experimentelle Methoden zur Bestimmung von Protein-Protein Bestimmung von Protein-Protein
WechselwirkungenWechselwirkungen
Presented byPresented by
Stefan NickelsStefan Nickels
(stefan-nickels@arcor.de)(stefan-nickels@arcor.de)
Proseminar: Proseminar: Theoretical Analysis of Protein-Protein Interactions Theoretical Analysis of Protein-Protein Interactions SS04SS04
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ÜbersichtÜbersicht
EinführungEinführung
3 Arten von experimentellen Methoden3 Arten von experimentellen Methoden Physikalische MethodenPhysikalische Methoden Library basierte MethodenLibrary basierte Methoden Genetische MethodenGenetische Methoden
3 ausgewählte experimentelle Methoden3 ausgewählte experimentelle Methoden FRETFRET NMR chemical shiftsNMR chemical shifts NMR-based protein dockingNMR-based protein docking
ReferenzenReferenzen
DiskussionDiskussion
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Was will man bestimmen?Was will man bestimmen?
Auffinden von Proteinen, welche mit anderen Auffinden von Proteinen, welche mit anderen wechselwirkenwechselwirken durch meist transiente aber auch persistente Bindungdurch meist transiente aber auch persistente Bindung
Bindungskonstante KBindungskonstante Kii
Thermodynamische GleichgewichtsgrößeThermodynamische Gleichgewichtsgröße Gibt an welcher Anteil des Liganden im Mittel an Protein Gibt an welcher Anteil des Liganden im Mittel an Protein
gebundengebunden
Je kleiner KJe kleiner Kii desto stärker Protein-Ligand Bindung desto stärker Protein-Ligand Bindung
Freie Bindungsenthalpie ∆GFreie Bindungsenthalpie ∆G
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Physikalische Methoden IPhysikalische Methoden I
MethodikMethodik Bestimmung von Wechselwirkungen unter Zuhilfenahme von Bestimmung von Wechselwirkungen unter Zuhilfenahme von
physiko-chemischen Eigenschaften der physiko-chemischen Eigenschaften der WechselwirkungspartnerWechselwirkungspartner
BeispieleBeispiele Protein Affinity ChromatographyProtein Affinity Chromatography Affinity BlottingAffinity Blotting ImunnoprecipitationImunnoprecipitation Cross-LinkingCross-Linking
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Physikalische Methoden IIPhysikalische Methoden II
AffinitätschromatographieAffinitätschromatographie Um bindende Liganden zu Um bindende Liganden zu
findenfinden Immobilisierung des Proteins Immobilisierung des Proteins
in der Säule auf einer Matrixin der Säule auf einer Matrix z.B. mittels GST z.B. mittels GST
FusionsproteineFusionsproteine Proteine werden mit GluthationProteine werden mit Gluthation
S-Transferase markiertS-Transferase markiert Dieses bindet an Gluthation-Dieses bindet an Gluthation-
Agarose-MatrixAgarose-Matrix
Zugabe des LigandengemischsZugabe des Ligandengemischs Bindende werden Bindende werden
zurückgehalten, nicht zurückgehalten, nicht bindende fließen durchbindende fließen durch
Komplexe können Komplexe können ausgewaschen werdenausgewaschen werden
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Library basierte Methoden ILibrary basierte Methoden I
MethodikMethodik Suche nach Bindungspartnern für gewisses Protein inSuche nach Bindungspartnern für gewisses Protein in
Gen-Expressions-BibliothekenGen-Expressions-Bibliotheken VorteileVorteile
Schnelles Screening einer große Menge von möglichen LigandenSchnelles Screening einer große Menge von möglichen Liganden Gensequenzen der Bindungspartner sind sofort verfügbarGensequenzen der Bindungspartner sind sofort verfügbar
NachteilNachteil Müssen i.d.R. mit Biochemischen Methoden verifiziert werdenMüssen i.d.R. mit Biochemischen Methoden verifiziert werden
BeispieleBeispiele Protein ProbingProtein Probing Phage DisplayPhage Display Two-Hybrid SytemTwo-Hybrid Sytem
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Library basierte Methoden IILibrary basierte Methoden II
Two Hybrid SystemTwo Hybrid System Modularer Aufbau von Modularer Aufbau von
TranskriptionsfaktorenTranskriptionsfaktoren DNA-binding domainDNA-binding domain Activation domainActivation domain Nicht kovalente WW hinreichend Nicht kovalente WW hinreichend
für Funktionfür Funktion
Erstellen von sog. HybridenErstellen von sog. Hybriden Protein X + DNA-binding domainProtein X + DNA-binding domain Protein Y + Activation domainProtein Y + Activation domain
Wechselwirkung von X und YWechselwirkung von X und Y Domänen bilden funktionellen Domänen bilden funktionellen
Aktivator für ReportergenAktivator für Reportergen=> Expression=> Expression
Screening von Activator domain Screening von Activator domain markierten Transkripten einermarkierten Transkripten einercDNA-LibrarycDNA-Library
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Genetische Methoden IGenetische Methoden I
MethodikMethodik Nicht WW zwischen Proteinen werden bestimmtNicht WW zwischen Proteinen werden bestimmt Sondern WW zwischen Genen werden betrachtetSondern WW zwischen Genen werden betrachtet
In vielen Fällen interagieren dann auch die GenprodukteIn vielen Fällen interagieren dann auch die Genprodukte
Oder Suche nach Gen-Gen-WW um Protein-Protein-WWOder Suche nach Gen-Gen-WW um Protein-Protein-WWzu bestätigenzu bestätigen
BeispieleBeispiele Extragenic SuppressorsExtragenic Suppressors Synthetic Lethal EffectsSynthetic Lethal Effects Overproduction PhenotypesOverproduction Phenotypes Unlinked NoncomplementationUnlinked Noncomplementation
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Genetische Methoden IIGenetische Methoden II
Extragenic SuppressorsExtragenic Suppressors Suppressormutationen gleichen durch natürliche Mutationen Suppressormutationen gleichen durch natürliche Mutationen
hervorgerufene phenotypische Defekte aushervorgerufene phenotypische Defekte aus Beobachtung:Beobachtung:
Suppressormutationen treten bei Genen auf, deren Genprodukte mit Suppressormutationen treten bei Genen auf, deren Genprodukte mit Genprodukten der mutierten Gene wechselwirkenGenprodukten der mutierten Gene wechselwirken
Aufspürung wegen Suppressormutationen interagierenden Aufspürung wegen Suppressormutationen interagierenden GenproduktenGenproduktendurch z.B.:durch z.B.:
Kontrolle der ZellzyklenKontrolle der Zellzyklen
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Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy IMicroscopy I
ZielsetzungZielsetzung Beobachtung von Protein-Protein WW bei Abständen > 100 ÅBeobachtung von Protein-Protein WW bei Abständen > 100 Å Betrachtung von Proteinen in Zellen in vivoBetrachtung von Proteinen in Zellen in vivo Proteine müssen mit Flurophoren gelabelt werdenProteine müssen mit Flurophoren gelabelt werden
FRETFRET ““molecular ruler” molecular ruler” Bestimmung von Distanzen zwischen MolekülenBestimmung von Distanzen zwischen Molekülen Viele verschiedene FRET-MethodenViele verschiedene FRET-Methoden Hier:Bestimmung der Interaktion von kolokalisierten Proteinen Hier:Bestimmung der Interaktion von kolokalisierten Proteinen
imimlichtmikroskopisch detektierbaren Bereichlichtmikroskopisch detektierbaren Bereich
Detektion Normalerweise spektroskopischDetektion Normalerweise spektroskopisch Hier lichtmikroskopischHier lichtmikroskopisch
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Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy IIMicroscopy II
FunktionsprinzipFunktionsprinzip Man macht sich den Effekt des Energie Transfers zwischen zwei Man macht sich den Effekt des Energie Transfers zwischen zwei
bestimmten benachbarten Fluorophorpaaren zu nutzenbestimmten benachbarten Fluorophorpaaren zu nutzen Wird ein Fluorophor (Donor) durch Licht bestimmter Wird ein Fluorophor (Donor) durch Licht bestimmter
Wellenlänge angeregt, so fluoresziert erWellenlänge angeregt, so fluoresziert er In gewissem Abstand zu einem sog. Akzeptor-Fluorophor, In gewissem Abstand zu einem sog. Akzeptor-Fluorophor,
überträgt der Donor Energie (Photon) auf diesen Akzeptorüberträgt der Donor Energie (Photon) auf diesen Akzeptor Durch den Transfer Unterbindung der Fluoreszenz-Resonanz Durch den Transfer Unterbindung der Fluoreszenz-Resonanz
des Donors, stattdessen Fluoreszenz des Akzeptors (Quenching)des Donors, stattdessen Fluoreszenz des Akzeptors (Quenching) Mittels Fluoreszenz-Mikroskopischen Aufnahmen kann die Mittels Fluoreszenz-Mikroskopischen Aufnahmen kann die
Löschung der Fluoreszenz-Resonanz des Donors dokumentiert Löschung der Fluoreszenz-Resonanz des Donors dokumentiert werdenwerden
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Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy IIIMicroscopy III
Die Effizienz dieses Enegie-Transfers ist abhängig von der Die Effizienz dieses Enegie-Transfers ist abhängig von der Distanz r der beiden FluorophoreDistanz r der beiden Fluorophore
RR00 ist der sog. Förster-Radius ist der sog. Förster-Radius spezifisch für jedes Donor-Akzeptor-Paar, i.d.R. zwischen 10 und 70 spezifisch für jedes Donor-Akzeptor-Paar, i.d.R. zwischen 10 und 70 ÅÅ Maß für den Grad der Überlappung von Donoremission und Maß für den Grad der Überlappung von Donoremission und
AkzeptoranregungsspektrumAkzeptoranregungsspektrum kein FRET bei Abständen > 2Rkein FRET bei Abständen > 2R00
Quantifizierung der Transfer-Effizienz über das Ausmaß der Quantifizierung der Transfer-Effizienz über das Ausmaß der Donor-Emissions-LöschungDonor-Emissions-Löschung
IIDADA = Intensität der Donor Fluoreszenz in Anwesenheit des Akzeptors = Intensität der Donor Fluoreszenz in Anwesenheit des Akzeptors IIDA†DA†= Intensität der D. Fluoreszenz in Anwesenheit von = Intensität der D. Fluoreszenz in Anwesenheit von
photogebleichtem A.photogebleichtem A.
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Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy IVMicroscopy IV
ExperimentExperiment Untersuchung von WW zwischen Proteinen in der PlasmamembranUntersuchung von WW zwischen Proteinen in der Plasmamembran Fluorophor-PaarFluorophor-Paar
Labeling entweder direkt oder mittels Immun-Fluoreszenz-Labeling entweder direkt oder mittels Immun-Fluoreszenz-MarkierungMarkierung
Hier Transfektion von Kaninchen-Nieren-Zellen mit der 5‘-Hier Transfektion von Kaninchen-Nieren-Zellen mit der 5‘-Nucleotidase aus der Leber von RattenNucleotidase aus der Leber von Ratten
Markierung der Nucleotidasen mit einer Mischung aus Cy3 / Cy5 Markierung der Nucleotidasen mit einer Mischung aus Cy3 / Cy5 markiertenmarkiertenIgG-AntiKörpernIgG-AntiKörpern
RR00 = 53 Å = 53 Å Donor Cy3Donor Cy3 Akzeptor Akzeptor Cy5Cy5
AbsorptionsmaximAbsorptionsmaximumum
550 nm550 nm 650 nm650 nm
EmissionsmaximuEmissionsmaximumm
570 nm570 nm 670 nm670 nm
1414
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy VMicroscopy V
Aufnahme von 4 BildernAufnahme von 4 Bildern Cy3-Emission vor dem BleichenCy3-Emission vor dem Bleichen
Auftreten des FRETAuftreten des FRET Wenig Donor FluoreszenzWenig Donor Fluoreszenz
Cy5-Emission vor dem BleichenCy5-Emission vor dem Bleichen Zur Überprüfung, ob Kolokalisierung Zur Überprüfung, ob Kolokalisierung
mit Cy3 stattgefunden hatmit Cy3 stattgefunden hat
Cy3-Emission nach dem BleichenCy3-Emission nach dem Bleichen Kein FRET mehrKein FRET mehr Donor Fluoreszenz ist stärker (Pfeile)Donor Fluoreszenz ist stärker (Pfeile)
Cy5-Emission nach dem BleichenCy5-Emission nach dem Bleichen Keine Emission wegen vollständiger Keine Emission wegen vollständiger
AusbleichungAusbleichung
DatenanalyseDatenanalyse Nach Hintergrund-Korrektur mittels Aufnahme von unmarkierten Zellen:Nach Hintergrund-Korrektur mittels Aufnahme von unmarkierten Zellen:
Berechnung eines Transfer-Effizienz-BildesBerechnung eines Transfer-Effizienz-Bildes
a= Scaling Factor für die Umrechnung der Pixelwerte in Effizienzwertea= Scaling Factor für die Umrechnung der Pixelwerte in Effizienzwerte
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Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy VIMicroscopy VI
AuswertungAuswertung Im Beispiel Effizienz-Werte zwischen Im Beispiel Effizienz-Werte zwischen
0 und 40%0 und 40% lassen hier nicht auf spezifische WW lassen hier nicht auf spezifische WW
zwischen den Nucleotidasen zwischen den Nucleotidasen schliessenschliessen
Effizienz hängt ab von der Effizienz hängt ab von der Oberflächendichte der Proteine in Oberflächendichte der Proteine in der Membran (Zufällige Nähe)der Membran (Zufällige Nähe)
FazitFazit Transfer Effizienz reflektiert nicht Transfer Effizienz reflektiert nicht
unbedingt eine spezifische WWunbedingt eine spezifische WW E abhängig von vielen Parametern:E abhängig von vielen Parametern:
Größe des gelabelten ProteinsGröße des gelabelten Proteins Sättigung des Antigens mit Sättigung des Antigens mit
AntikörperAntikörper Orientierung der FluorophoreOrientierung der Fluorophore
Durch systematische Veränderung von experimentellen Parametern können spezifische WW unterschieden Durch systematische Veränderung von experimentellen Parametern können spezifische WW unterschieden werdenwerden
Verhältnis von Donor- zu Akzeptor-MarkierungVerhältnis von Donor- zu Akzeptor-Markierung Gesamtkonzentration von markierten Molekülen Gesamtkonzentration von markierten Molekülen
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NMR chemical shift mapping INMR chemical shift mapping I
ZielsetzungZielsetzung Bestimmung von Wechselwirkungen und Interaktionsstellen zwischen Bestimmung von Wechselwirkungen und Interaktionsstellen zwischen
Proteinen mittels zweidimensionaler (Proteinen mittels zweidimensionaler (11H, H, 1515N)-HSQC-NMR-N)-HSQC-NMR-SpektroskopieSpektroskopie
Grundlagen der H-NMR SpektroskopieGrundlagen der H-NMR Spektroskopie Im Magnetfeld: Parallele Ausrichtung von ProtonenkernenIm Magnetfeld: Parallele Ausrichtung von Protonenkernen Erhöhung der Feldstärke => Umorientierung der Kerne, antiparallel Erhöhung der Feldstärke => Umorientierung der Kerne, antiparallel
zum Magnetfeldzum Magnetfeld Hierbei Resonanzphänomen: Absorption von EnergieHierbei Resonanzphänomen: Absorption von Energie
=> NMR-Signal=> NMR-Signal Identifizierung aller Protonen in einem MolekülIdentifizierung aller Protonen in einem Molekül
oder ein Komplex aus Molekülenoder ein Komplex aus Molekülen
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NMR chemical shift mapping IINMR chemical shift mapping II
Die chemische VerschiebungDie chemische Verschiebung AbschirmungAbschirmung
Elektronen um den Kern erzeugen Magnetfeld, entgegengesetzt zum äußern Elektronen um den Kern erzeugen Magnetfeld, entgegengesetzt zum äußern Magnetfeld => AbschirmungseffektMagnetfeld => Abschirmungseffekt
Höhere Magnetfeldstärke benötigt um Abschirmung zu umgehenHöhere Magnetfeldstärke benötigt um Abschirmung zu umgehen Signal im niedrigeren Frequenzbereich => diamagnetischSignal im niedrigeren Frequenzbereich => diamagnetisch
EntschirmungEntschirmung z.B. durch elektronegative Bindungspartner (Halogene, O, N)z.B. durch elektronegative Bindungspartner (Halogene, O, N)
diese ziehen die Elektronen zu sichdiese ziehen die Elektronen zu sich Niedrigere Feldstärke benötigtNiedrigere Feldstärke benötigt Signal im höheren Frequenzbereich => paramagnetischSignal im höheren Frequenzbereich => paramagnetisch
Signalverschiebung relativ zu Referenzsignal TMS (Tetramethylsilan)Signalverschiebung relativ zu Referenzsignal TMS (Tetramethylsilan) Alle Protonen in TMS gleiche chem. UmgebungAlle Protonen in TMS gleiche chem. Umgebung
=> nur ein Signal=> nur ein Signal Alle Protonen maximal abgeschirmtAlle Protonen maximal abgeschirmt
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NMR chemical shift mapping IIINMR chemical shift mapping III
Die J-KopplungDie J-Kopplung Spin-Spin KopplungSpin-Spin Kopplung
Benachbarte Protonen beeinflussen sich gegenseitig bzgl. lokaler Benachbarte Protonen beeinflussen sich gegenseitig bzgl. lokaler MagnetfeldstärkeMagnetfeldstärke
Je nach Spinrichtung eines benachbarten Protons, Je nach Spinrichtung eines benachbarten Protons, ↑ oder ↓=> Schwächung oder Verstärkung des äußeren Magnetfelds=> Schwächung oder Verstärkung des äußeren Magnetfelds
Da beide Zustände gleichwahrscheinlichDa beide Zustände gleichwahrscheinlich=> Aufspaltung des Signals in Multipletts=> Aufspaltung des Signals in Multipletts
1 benachbartes Proton => 2 Signale1 benachbartes Proton => 2 Signale2 benachbarte Protonen => 3 Signale mit unterschiedlichen Intensitäten2 benachbarte Protonen => 3 Signale mit unterschiedlichen Intensitätenusw.usw.
Kopplungskonstante JKopplungskonstante J Abstand zwischen gekoppelten Signalen in Hz: Kopplungskonstante JAbstand zwischen gekoppelten Signalen in Hz: Kopplungskonstante J Je nach Wert: AbschätzungJe nach Wert: Abschätzung
wie viele Bindungenwie viele Bindungenvoneinander entferntvoneinander entfernt
2 Bindungen, geminal, 2 Bindungen, geminal, 22JJ 3 Bindungen, vicinal, 3 Bindungen, vicinal, 33JJ
1919
NMR chemical shift mapping IVNMR chemical shift mapping IV
((11H, H, 1515N)-HSQC-NMR-SpektroskopieN)-HSQC-NMR-Spektroskopie HSQC = Heteronuclear single quantum coherenceHSQC = Heteronuclear single quantum coherence 2D-NMR2D-NMR
x-Achse: Verschiebung von Hx-Achse: Verschiebung von H y-Achse: Verschiebung von Ny-Achse: Verschiebung von N
Heteronuclear Single quantum:Heteronuclear Single quantum: Bestimmung der Bestimmung der 11J Kopplung zwischen H und NJ Kopplung zwischen H und N
=> direkt verbundene Atome=> direkt verbundene Atome Kreuzpunkte: Kopplung von H und NKreuzpunkte: Kopplung von H und N
Untersuchung von ProteinenUntersuchung von Proteinen Jede Aminosäure außer Prolin:Jede Aminosäure außer Prolin:
Kopplungssignal der AmidgruppeKopplungssignal der Amidgruppe Ebenso AS-Ketten wegen PeptidbindungEbenso AS-Ketten wegen Peptidbindung
WW zwischen ProteinenWW zwischen Proteinen Bindung von Ligand an Bindung von Ligand an 1515N markiertes ProteinN markiertes Protein
=> Änderung der chem. Verschiebungen=> Änderung der chem. Verschiebungen Möglichkeit der Identifizierung der ww. AS beiMöglichkeit der Identifizierung der ww. AS bei
zugewiesenem Spektrumzugewiesenem Spektrum
2020
NMR chemical shift mapping VINMR chemical shift mapping VI
ExperimentExperiment Bacterial phosphoenolpyruvate sugar transport system (PTS)Bacterial phosphoenolpyruvate sugar transport system (PTS)
Teilreaktion:Teilreaktion: Übertragung von PhosphorÜbertragung von Phosphor
Bekannt: Spezifisch für verschiedene SpeziesBekannt: Spezifisch für verschiedene Spezies Betrachtung von B. subtilis und E. coliBetrachtung von B. subtilis und E. coli
große Ähnlichkeit in 3D Strukturgroße Ähnlichkeit in 3D Struktur Homologe WW Homologe WW stark:stark: bsHPR + bsEIIAbsHPR + bsEIIAglcglc ecHPR + ecEIIAecHPR + ecEIIAglcglc
Heterologe WW Heterologe WW stark:stark: ecHPR + bsEIIAecHPR + bsEIIAglcglc
schwach: schwach: bsHPR + ecEIIAbsHPR + ecEIIAglcglc
Fragestellung:Fragestellung: Kann „NMR chemical shift mapping“Kann „NMR chemical shift mapping“
Spezifität der ReaktionenSpezifität der Reaktionenwiderspiegeln?widerspiegeln?
2121
NMR chemical shift mapping VIINMR chemical shift mapping VII
VersuchsdurchführungVersuchsdurchführung Untersuchung von nicht Untersuchung von nicht
phosphorylierten Proteinen phosphorylierten Proteinen umum
Mögliche Rückreaktion Mögliche Rückreaktion auszuschließenauszuschließen
Phosphohydrolysis Phosphohydrolysis auszuschließenauszuschließen
Phosphorylierung hat keinePhosphorylierung hat keinerelevanten Auswirkungen auf relevanten Auswirkungen auf WWWW
4 NMR-Experimente4 NMR-Experimente NMR-Spektren von NMR-Spektren von 1515N-HPR N-HPR
vor (blau) und nach Zugabe vor (blau) und nach Zugabe (rot) von unmarkiertem (rot) von unmarkiertem EIIAEIIAglcglc
A: ecHPR + ecEIIAA: ecHPR + ecEIIAglcglc
B: bsHPR + bsEIIAB: bsHPR + bsEIIAglcglc
C: ecHPR + bsEIIAC: ecHPR + bsEIIAglcglc
D: bsHPR + ecEIIAD: bsHPR + ecEIIAglcglc
2222
NMR chemical shift mapping VIIINMR chemical shift mapping VIII
AuswertungAuswertung Keine VerschiebungKeine Verschiebung
bei bsHPR + ecEIIAbei bsHPR + ecEIIAglcglc (D) (D)=> Überlagerung der Kreuzpunkte=> Überlagerung der Kreuzpunkte=> keine WW=> keine WW
Durch Zuordnung der SpektrenDurch Zuordnung der Spektren=> Identifizierung von ähnlichen=> Identifizierung von ähnlichen
Bindungstellen (schwarz) Bindungstellen (schwarz)
FazitFazit Methode geeignet um spezifische WW zu detektierenMethode geeignet um spezifische WW zu detektieren Trotz hoher Konzentrationen (>200 Trotz hoher Konzentrationen (>200 μμm) von gereinigtem Protein beim) von gereinigtem Protein bei
NMR-Experimenten, keine Verunreinigung der Spektren durch NMR-Experimenten, keine Verunreinigung der Spektren durch unspezifische WWunspezifische WW
2323
Structure prediction of protein-complexes by an Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm INMR-based protein docking algorithm I
IdeeIdee Protein-Protein Docking ProblemProtein-Protein Docking Problem
Gegeben 3D Struktur von komplexbildenden Proteinen A u. BGegeben 3D Struktur von komplexbildenden Proteinen A u. B Ermittle 3D-Struktur des Komplexes ABErmittle 3D-Struktur des Komplexes AB
Abwandlung: zusätzlich unzugewiesenes experimentelles 1D Abwandlung: zusätzlich unzugewiesenes experimentelles 1D 11H-NMR-H-NMR-Spektrum als InputSpektrum als Input
Verwendung des Rigid Body Docking Algortihmus von Lenhof Verwendung des Rigid Body Docking Algortihmus von Lenhof (1995,1997)(1995,1997)
Generiert Liste möglicher KomplexeGeneriert Liste möglicher Komplexe Bewertung mittels geometrisch energetischer Scoring-FunktionBewertung mittels geometrisch energetischer Scoring-Funktion
ZielZiel Bewertung der Komplexe mittels Neuer Scoring-Funktion, die Daten des Bewertung der Komplexe mittels Neuer Scoring-Funktion, die Daten des
experimentellen H-NMR-Spektrums miteinbeziehtexperimentellen H-NMR-Spektrums miteinbezieht
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Structure prediction of protein-complexes by an Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm IINMR-based protein docking algorithm II
Neue Scoring FunktionNeue Scoring Funktion Berechnet theoretisches H-NMR-Spektrum für jeden möglichen KomplexBerechnet theoretisches H-NMR-Spektrum für jeden möglichen Komplex Abweichung des simulierten Spektrums vom experimentellen SpektrumAbweichung des simulierten Spektrums vom experimentellen Spektrum
=> Bewertung der Komplexe=> Bewertung der Komplexe Berechnung der Chemischen Verschiebung des KomplexesBerechnung der Chemischen Verschiebung des Komplexes Zerlegt Chemische Verschiebung Zerlegt Chemische Verschiebung δδ in 4 Teile: in 4 Teile:
δδRCRC: Random Coil shift: Random Coil shift
δδAA: Magnetic Anisotropy: Magnetic Anisotropy
δδJBJB: Ring current, Ringstromeffekt: Ring current, Ringstromeffekt
δδEFEF: Electric field effect: Electric field effect
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Structure prediction of protein-complexes by an Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm IIINMR-based protein docking algorithm III
δδJBJB - Electric field effect - Electric field effect Einfache chemische Verschiebung aufgrund von umgebenden Einfache chemische Verschiebung aufgrund von umgebenden
ElektronenElektronen Spezifisch für jede Bindung, C-H, N-HSpezifisch für jede Bindung, C-H, N-H
Konstante Konstante εε übernommen von Williamson und Asakura(1993) übernommen von Williamson und Asakura(1993) Elektrisches Feld berechnet mittels Gesetz von CoulombElektrisches Feld berechnet mittels Gesetz von Coulomb Atomladungen aus dem AMBER 94 KraftfeldAtomladungen aus dem AMBER 94 Kraftfeld
(Connell et al. 1995)(Connell et al. 1995)
δδRC RC – Random coil shifts– Random coil shifts Verschiebungen vonVerschiebungen von
nicht definiert gefaltetennicht definiert gefaltetenAs-KettenAs-Ketten
Übernommen ausÜbernommen ausder BRMB Datenbankder BRMB Datenbank
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Structure prediction of protein-complexes by an Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm IVNMR-based protein docking algorithm IV
δδAA – Magnetische Anisotropie der Peptidbindung – Magnetische Anisotropie der Peptidbindung Anisotropieeffekt: Doppelbindungen C=O hat nicht in alle Richtungen Anisotropieeffekt: Doppelbindungen C=O hat nicht in alle Richtungen
die gleiche Elektronenverteilungdie gleiche Elektronenverteilung Oberhalb der Bindungsebene stärker abgeschirmt als in der EbeneOberhalb der Bindungsebene stärker abgeschirmt als in der Ebene
Modelliert nach McConnell (1957) mittels Suszeptibilitäts-Tensor Modelliert nach McConnell (1957) mittels Suszeptibilitäts-Tensor (Matrix)(Matrix)
Kennzeichnet Orientierung eines Protons zur anisotropen BindungKennzeichnet Orientierung eines Protons zur anisotropen Bindung
R: Abstand Proton-Anistropische BindungR: Abstand Proton-Anistropische Bindung NNaa: Avogadrosche Zahl: Avogadrosche Zahl θθii: Winkel zwischen i-Achse und Distanz-Vektor R: Winkel zwischen i-Achse und Distanz-Vektor R ΧΧii: Suszeptibilitätstensor für Carbonylgruppe der Peptidbindung: Suszeptibilitätstensor für Carbonylgruppe der Peptidbindung
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Structure prediction of protein-complexes by an Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm VNMR-based protein docking algorithm V
δδJBJB – Ringstromeffekt – Ringstromeffekt Ebenfalls Anisotropieeffekt: Aromatische Ringsysteme verursachen Ebenfalls Anisotropieeffekt: Aromatische Ringsysteme verursachen
ungleiche Elektronenverteilung durch ungleiche Elektronenverteilung durch ππ-Elektronen-System-Elektronen-System Oberhalb der Ringebene stärkerOberhalb der Ringebene stärker
abgeschirmt als in der Ebeneabgeschirmt als in der Ebene Äußeres Magnetfeld erzeugtÄußeres Magnetfeld erzeugt
Ringstrom im AromatenRingstrom im Aromaten Erzeugt seinerseits entgegenErzeugt seinerseits entgegen
gesetztes Magnetfeldgesetztes Magnetfeld
Modelliert nach Johnson and Bovey (1958):Modelliert nach Johnson and Bovey (1958):
n = Anzahl der n = Anzahl der ππ-Elektronen-Elektronen ee00, m = elektrische Ladung und Masse, m = elektrische Ladung und Masse e = Lichtgeschwindigkeite = Lichtgeschwindigkeit a = Ring Radius (5-Ring 1,182a = Ring Radius (5-Ring 1,182Å ; 6-Ring 1,39ÅÅ ; 6-Ring 1,39Å)) p, z = geben die Position des Kerns relativ zum Ring-Zentrum wiederp, z = geben die Position des Kerns relativ zum Ring-Zentrum wieder K,E = komplett elliptische Integrale K,E = komplett elliptische Integrale
2828
Structure prediction of protein-complexes by an Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm VINMR-based protein docking algorithm VI
Bestimmung eines theoretischen NMR-SpektrumsBestimmung eines theoretischen NMR-Spektrums Simulation mittels Lorentzschen LinienSimulation mittels Lorentzschen Linien Gesamtspektrum = Linearkombination derGesamtspektrum = Linearkombination der
LorentzlinienLorentzlinien W = LinienbreiteW = Linienbreite
( 0.0032 ppm( 0.0032 ppm22 ) ) PPii = Peakposition = Peakposition
Entfernung der Peaks für austauschbare Protonen (OH, NH), nicht in Entfernung der Peaks für austauschbare Protonen (OH, NH), nicht in wässriger Lösung vorhandenwässriger Lösung vorhanden
Bestimmung der Differenz zwischen experimentellem (SBestimmung der Differenz zwischen experimentellem (Sexpexp) und ) und simuliertem Spektrum (Ssimuliertem Spektrum (Sepxepx) an 5000 verteilten Positionen x) an 5000 verteilten Positionen xii im Bereich im Bereich (-2 bis +12 ppm)(-2 bis +12 ppm)
Normalisierte Werte werden zum Bewerten der Strukturen verwendetNormalisierte Werte werden zum Bewerten der Strukturen verwendet
2929
Structure prediction of protein-complexes by an Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm VIINMR-based protein docking algorithm VII
Ziele der Integration von NMR-Daten in RBD-AlgorithmenZiele der Integration von NMR-Daten in RBD-Algorithmen Erhöhung der Zuverlässigkeit der RBD-Algorithmen durch neueErhöhung der Zuverlässigkeit der RBD-Algorithmen durch neue
Scoring-FunktionScoring-Funktion Beschleunigung der Strukturaufklärung durch simulierte Beschleunigung der Strukturaufklärung durch simulierte
Verschiebungszuweisungen basierend auf Docking-ResultatenVerschiebungszuweisungen basierend auf Docking-Resultaten
EvaluierungEvaluierung 4 Komplexe4 Komplexe
Calmodulin + CaCalmodulin + Ca2+2+ abhängige Proteinkinaseabhängige Proteinkinase
Calmodulin + Bindungspeptid der CaCalmodulin + Bindungspeptid der Ca2+ 2+ PumpePumpe S100B(S100B(ββββ) + Peptid aus P53 Protein) + Peptid aus P53 Protein Homodimere Untereinheiten von S100B(Homodimere Untereinheiten von S100B(ββββ))
Einzelstrukturen aus PDBEinzelstrukturen aus PDB Generierung der exp. NMR-Spektren aus Shiftzuweisungen der BRMB-Generierung der exp. NMR-Spektren aus Shiftzuweisungen der BRMB-
DatenbankDatenbank
3030
Structure prediction of protein-complexes by an Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm VIIINMR-based protein docking algorithm VIII
AuswertungAuswertung
Auftragung derAuftragung dermöglichen Komplexemöglichen Komplexe
x-Achse: RMSDx-Achse: RMSDy-Achse: Atom-Kontakty-Achse: Atom-KontaktEnergieEnergie
Beste Ergebnisse linkeBeste Ergebnisse linkeuntere Eckeuntere Ecke
Beste Ergebnisse ohneBeste Ergebnisse ohneAnisotropieshiftAnisotropieshift=> herausgenommen,=> herausgenommen,lokaler Effektlokaler Effekt
S100 S100 dimerdimer
Cal + Cal + PumpPump
S100 S100 + p53+ p53
Cal + Cal + KinaseKinase
3131
Structure prediction of protein-complexes by an Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm IXNMR-based protein docking algorithm IX
AuswertungAuswertung Calmodulin + CaCalmodulin + Ca2+2+
abhängige Proteinkinaseabhängige Proteinkinase Sehr gutes ErgebnisSehr gutes Ergebnis
Calmodulin + Bindungspeptid der CaCalmodulin + Bindungspeptid der Ca2+ 2+ PumpePumpe Gutes ErgebnisGutes Ergebnis Allerdings falsche Struktur auf Platz 1Allerdings falsche Struktur auf Platz 1
Grund unbekanntGrund unbekannt
S100B(S100B(ββββ) + Peptid aus P53 Protein ) + Peptid aus P53 Protein Gutes ErgebnisGutes Ergebnis verwunderlich, da mit herkömmlichenverwunderlich, da mit herkömmlichen
Scoring-Funktion nicht zu docken Scoring-Funktion nicht zu docken
Untereinheiten von S100B(Untereinheiten von S100B(ββββ)) Gute Trennung zwischen zwischen True und False PositivesGute Trennung zwischen zwischen True und False Positives
FazitFazit Evaluation mit mehr Strukturen benötigtEvaluation mit mehr Strukturen benötigt Weiterer Schritt Voraussage von Komplexstrukturen ohne NMR-Weiterer Schritt Voraussage von Komplexstrukturen ohne NMR-
SpektrumSpektrum Geplant: Integration von mehrdimensionalen NMR-Spektren, welche Geplant: Integration von mehrdimensionalen NMR-Spektren, welche
mehr strukturelle Informationen enthaltenmehr strukturelle Informationen enthalten
S100 S100 + p53+ p53
3232
FazitFazit
Experimentelle Methoden oft sehr spezifischExperimentelle Methoden oft sehr spezifisch dienen zur Verifikation von theoretischen Erkenntnissendienen zur Verifikation von theoretischen Erkenntnissen unabdingbar bei der Evaluation von bioinformatischen unabdingbar bei der Evaluation von bioinformatischen
MethodenMethoden
Nachteile:Nachteile: Erfordern hohes FachwissenErfordern hohes Fachwissen FehleranfälligFehleranfällig Stark abhängig von experimentellen BedingungenStark abhängig von experimentellen Bedingungen Zeit- und KostenintensivZeit- und Kostenintensiv
Ausblick:Ausblick: Kombination von experimentellen Daten und bioinformatischen Kombination von experimentellen Daten und bioinformatischen
Methoden bringt VorteilMethoden bringt Vorteil
3333
ReferenzenReferenzen
Phizicky, E.M. and Fields, S., (1995) Microbiol. Rev., 59, Phizicky, E.M. and Fields, S., (1995) Microbiol. Rev., 59, 94-123.94-123. Protein-Protein Interactions: Methods for Detection and Analysis. Protein-Protein Interactions: Methods for Detection and Analysis.
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Docking Algorithm.Docking Algorithm.
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