Lipide

Grundlagen• Was sind Lipide?

• Arten und Funktionen von Lipiden• Glycerophospholipide• Mono-, Di- und Triglycerine• Ergosteriol und Ergosterylester• Freie Fettsäuren• Sphingolipide

• Isolierung• Auftrennung• Wieso 2D DC?• Nachweis

Arbeiten mit radioaktiven Substanzen• Eigener Bereich für radioaktives Arbeiten• Art der Strahler • Umgang mit radioaktiven Substanzen• Substanzen gesondert entsorgen• Nach abgeschloßener Arbeit: Dekontamination des

Arbeitsplatzes

Durchführung

Vorbereitung der Hefekultur

Zellkonzentration mittels OD bestimmen

Zellen in Minimalmedium

vorinkubieren

Zugabe von 1-14C-Palmitinsäure

Lösung inkubieren

BSA-Lösungzugeben

Zellpellet waschen

Zellen

aufschließen

Lipide extrahieren

Mittels DC auftrennen

Aktivität der Fraktionen bestimmen

Durchführung des Aktivitätsassays

Vorbereitung des Reaktionsansatzes

Zuagen von Stopplösung nach 0, 10, 20 Minuten

Bestimmen der Aktivität

ZählausbeuteProbe Cocktail cpmLE cpmBW dpmLE dpmBW cpm*/dpm* %Zählausbeute

6 Safety Cocktail MW Probe 6 MW Probe 9 MW Probe 6 MW Probe 9 (Probe6-Probe9)/(Probe6-Probe9) cpm*/dpm*100

7 Safety Cocktail + H2O MW Probe 7 MW Probe 10 MW Probe 6 MW Probe 9 (Probe7-Probe10)/(Probe6-Probe9) cpm*/dpm*100

8 Safety Cocktail + H2O + Kieselgel MW Probe 8 MW Probe 11 MW Probe 6 MW Probe 9 (Probe8-Probe11)/(Probe6-Probe9) cpm*/dpm*100

Berechnungen

Spezifische Aktivität der Palmitinsäure

GBq/mmol dpm/mmol cpm/mmol

2,1 2,1*60 *10^9 dpm*Zählausbeute

Theoretische Totalaktivität

MBq/100ml fV dpm/10ml

37 10 37*60/fV*10^6

Bilanz

Probe Messvolumen µl cpm/Messung cpm*/Messung Gesamtvolumen ml Gesamtaktivität dpm

Totalaktivität 100 MWProbe 1 Probe1-Probe6 10,1 cpm*/Zählausbeute*Messvolumen/Gesamtvolumen

Medium 100 MWProbe2 Probe2-Probe6 11 cpm*/Zählausbeute*Messvolumen/Gesamtvolumen

Waschwasser1 100 MWProbe 3 Probe3-Probe6 5 cpm*/Zählausbeute*Messvolumen/Gesamtvolumen

Waschwasser2 100 MWProbe 4 Probe4-Probe6 10 cpm*/Zählausbeute*Messvolumen/Gesamtvolumen

Zellen 100 MWProbe 5 Probe5-Probe6 10 cpm*/Zählausbeute*Messvolumen/Gesamtvolumen

Aufnahmerate

theorethische Konzentration 37000*60*1000/10,1/132000000 µmol/l

tatsächliche Konzentration cpm*Totalaktivität/Zählausbeute*10000/132000000 µmol/l

Zellkonzentration 1 mg/ml

Inkubationszeit 10 min

Einbau GesamtaktivitätZellen/GesamtaktivitätTotalaktivität*100 %

Aufnahmerate GesamtaktivitätZellen/100*Zählausbeute cpm*/(mg*min)

GesamtaktivitätZellen/100 dpm*/(mg*min)

GesamtaktivitätZellen/100/1,32*10^8 nmol/(mg*min)

Gesamtlipide

cpm cpm* % AktivitätLSC % Gesamtaktivität

Phospholipide MW MW-BW MW-BW/Summe MW-BW MW-BW/MW-BW

Diacylglycerine MW MW-BW MW-BW/Summe MW-BW MW-BW/MW-BW

freie Fettsäuren MW MW-BW MW-BW/Summe MW-BW MW-BW/MW-BW

Triacylglycerine MW MW-BW MW-BW/Summe MW-BW MW-BW/MW-BW

Sterolester MW MW-BW MW-BW/Summe MW-BW MW-BW/MW-BW

Summe Summe MW Summe MW-BW Summe=100% Summe MW-BW/MW-BW

Gemessene Gesamtaktivität MW MW-BW

Phospholipide

cpm cpm* % Aktivität 1.Dim % Aktivität 2.Dim % Gesamtaktivität

PC 2421 2345 42,6 30,8 28,8

PS 481 405 7,4 5,3 5,0

PI 1958 1882 34,2 24,8 23,1

PE 826 750 13,6 9,9 9,2

DMPE 57 0 0,0 0,0 0,0

PA 439 363 6,6 4,8 4,5

LP 152 76 1,4 1,0 0,9

CL 25 0 0,0 0,0 0,0

FS 536 460 8,3 6,1 5,6

JVL 1398 1322 24,0 17,4 16,2

Summe 8293 7603 138,0 100,0 93,4

Gemessene Gesamtaktivität 8219 8143

0 10 200

0.5

1

1.5

2

2.5

f(x) = 0.100118243243243 x − 0.0562049549549546R² = 0.986391545948243

Aktivitätsassay

Zeit [min]

Men

ge [n

mol

*f]

Anfangsgeschwindigkeitzeit dpm mmol nmol nmol*f zeit dpm mmol nmol nmol*f

0 173 2,64E-11 2,64E-05 0,01 0 MW MW/6,55E+12 mmol *E+6 nmol*442,2510 11976 1,83E-09 0,00183 0,81 10 MW MW/6,55E+13 mmol *E+6 nmol*442,2520 29808 4,55E-09 0,00455 2,01 20 MW MW/6,55E+14 mmol *E+6 nmol*442,25

Serin konz.Ci/ml Ci/mmol Bq/mmol dpm/mmol

0,001 29,5 1,0915E+11 6,549E+12 1Ci 3,7E+10Bq

Diskussion

Phospholipide Diacylglycerine freie Fettsäuren Triacylglycerine Sterolester Sterole0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Gesamtlipide

Wildtyp Mutante psd1psd2 Vergleich WildtypVergleich Mutante

% d

er G

esam

takti

vitä

t des

Coc

ktai

ls

PC PS PI PE DMPE PA LP0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

Phospholipide

Wildtyp Mutante psd1psd2 Vergleich Wildtyp

% d

er G

esam

takti

vitä

t des

Coc

ktai

ls

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

PS : PE

Wildtyp

Mutante psd1psd2

Vergleich Wildtyp

Vergleich Mutante

Aktivitätsassay

0 5 10 15 20 250

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

f(x) = 0.197280405405405 x + 0.194695945945947R² = 0.981465973602446

f(x) = 0.100118243243243 x − 0.0562049549549546R² = 0.986391545948243

Wildtyp

Zeit [min]

Konz

entr

ation

[nm

ol]